TWI829014B - Clec2融合蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本揭示內容是關於一種CLEC2融合蛋白，其包含第一多肽，以及連接於該第一多肽之上游的第二多肽。依據本揭示內容的實施方式，所述第一及第二多肽分別包含序列編號：1及2的胺基酸序列。本揭示內容亦提供所述CLEC2融合蛋白於治療嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)感染及治療流行性感冒病毒感染的用途。

Description

CLEC2融合蛋白及其用途

本揭示內容是關於治療疾病的領域。更具體來說，本揭示內容是關於一種CLEC2融合蛋白，以及該CLEC2融合蛋白於治療嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)感染或流行性感冒病毒感染的用途。

SARS-CoV-2是造成冠狀病毒誘發疾病19 (coronavirus-induced disease 19, COVID-19)的病原體。與SARS-CoV相似，SARS-CoV-2會藉由棘蛋白(spike protein)的受體結合域(SARS-CoV-2 RBD)與血管張力素轉化酶(angiotensin converting enzyme 2, ACE2)結合，以進入細胞。由於嗜中性球(neutrophil)及巨噬細胞(macrophage)會廣泛浸潤肺臟組織，COVID-19病患往往會出現急性呼吸窘迫症候群(acute respiratory distress syndrome, ARDS)，導致肺部損傷及纖維化。COVID-19病患亦常出現嚴重的肺部發炎反應，並伴隨著栓塞併發症，例如微血管病變(microangiopathy)、肺栓塞(pulmonary embolism)及腦梗塞(cerebral infarction)。解剖數據指出，COVID-19患者具有極高的血栓性栓塞(thromboemboli)發生率。

COVID-19造成血栓性栓塞的致病機制仍有待釐清，惟近期有研究指出嗜中性球胞外捕捉網(neutrophil extracellular trap, NET)的過量產生與人類疾病中血栓性栓塞的形成相關。有報導指出，於COVID-19患者的血清中可觀察到較高量的游離DNA (cell-free DNA)、髓過氧化酶(myeloperoxidase, MPO)及瓜胺酸化組織蛋白3 (citrullinated histone 3)，且該些分子的高含量與疾病的嚴重程度相關。此外，由COVID-19患者分離的血清會誘發健康個體之嗜中性球形成NET。所有的證據皆指出，NET形成可能會造成COVID-19患者產生嚴重的血管內凝血病變(intravascular coagulopathy)，而標的過量的NET形成則可減少病患體內血栓的形成與COVID-19造成的臨床嚴重度。然而，SARS-CoV-2誘發NET形成的機制目前尚不清楚。

儘管研究人員在COVID-19大流行的近幾個月對該疾病已取得相當程度的進展，目前仍無治療COVID-19的方法。因此，相關領域仍需研發一種用以治療SARS-CoV-2感染的方法，據以改善COVID-19患者的壽命及生活品質。

發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

本揭示內容是基於發明人意外發現CLEC2 (亦稱為「CLEC-1B」，血小板中一種與Syk耦合的C型凝集素(C-type lectin))會專一地與SARS-CoV-2棘蛋白的受體結合域(即，SARS-CoV-2 RBD)結合，而阻斷CLEC2則會抑制SARS-CoV-2/血小板誘發的NET形成。因此，CLEC2可作為一種新穎的治療標的，據以治療或預防SARS-CoV-2感染。

本揭示內容的第一態樣因此是關於一種融合蛋白，其包含一第一多肽，以及一與該第一多肽連接的第二多肽。依據本揭示內容的實施方式，所述第一多肽是CLEC2的胞外域(extracellular domain)，且包含序列編號：1的胺基酸序列；而所述第二多肽則是一免疫球蛋白的可結晶片段(fragment crystallizable, Fc)區域，且包含序列編號：2的胺基酸序列。結構上，第二多肽(即，免疫球蛋白的Fc區域)是位於且連接於第一多肽(即，CLEC2的胞外域)的上游。

非必要地，本發明融合蛋白更包含一訊息肽(signal peptide)，其係位於且連接於第二多肽的上游。依據一實施方式，所述訊息肽包含序列編號：3的胺基酸序列。依據另一實施方式，所述訊息肽包含序列編號：4的胺基酸序列。

非必要地，本發明融合蛋白更包含一連接子，其係位於第一及第二多肽之間。依據本揭示內容某些實施方式，所述連接子包含(GGP) _1-5的胺基酸序列、序列編號：5的胺基酸序列，或是序列編號：6的胺基酸序列。在一特定實施方式中，所述連接子包含序列編號：7的胺基酸序列。

依據一較佳實施方式，本發明融合蛋白包含序列編號：8的胺基酸序列。

本揭示內容的第二態樣是關於一種用以治療一個體之SARS-CoV-2感染的方法。本發明方法包含對該個體投予一有效量之本揭示內容的融合蛋白，據以減緩或改善與SARS-CoV-2感染相關的病症。

依據本揭示內容某些實施方式，該個體是人類，其中有效量為每公斤個體體重10微克到每公斤個體體重10毫克。較佳地，對個體投予每公斤個體體重0.1毫克到每公斤個體體重1毫克的本發明融合蛋白。

本揭示內容亦提供一種用以治療一個體之流行性感冒病毒感染的方法。本發明方法包含對該個體投予一有效量之本揭示內容的融合蛋白，據以減緩或改善與流行性感冒病毒感染相關的病症。

依據本揭示內容某些實施方式，該個體是人類，其中有效量為每公斤個體體重10微克到每公斤個體體重10毫克。較佳地，對個體投予每公斤個體體重0.1毫克到每公斤個體體重1毫克的本發明融合蛋白。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

Ｉ . 定義

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。

除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。

「融合蛋白」(fusion protein)一詞在本揭示內容是指藉由任何方式或任何類型之連接、共價、靜電、疏水性作用、親和型或其他方式而結合的二種蛋白或胜肽，其可維持二種蛋白或胜肽之間的連接，防止於本發明操作過程中連接的斷裂，且不會實質改變蛋白的結合特性。適用於本發明之較佳的融合蛋白是由重組基因所製備，其中該重組基因包含二或多種不同基因的部分序列，且所述不同基因是直接或以一連接子序列相互連接，如此一來不同基因的編碼序列會位於相同的閱讀框(reading frame)中，即，轉錄分子會將融合的基因閱讀為單一個基因。此類型的融合蛋白亦稱為雜合蛋白(hybrid protein)或嵌合蛋白(chimeric protein)。

在本揭示內容中，當用以闡述一膜結合蛋白時，「胞外域」(extracellular domain)一詞是指該蛋白暴露於細胞脂雙層之細胞外側的部分。具體來說，本發明所屬技術領域具有通常知識者皆知CLEC2的「胞外域」(extracellular domain)是指CLEC2序列中延伸至胞外環境(即，位於細胞外之環境)的區域。

「Fc區域」(Fc region)及「可結晶片段區域」(fragment crystallizable region)在本揭內容為可互換的詞彙，是指一免疫球蛋白(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM)之重鏈的C端區域，包含天然序列的Fc區域及變異的Fc區域。即使免疫球蛋白重鏈之Fc區域的邊界不盡相同，但人類IgG重鏈Fc區域的邊界通常被定義是由Cys226位置之胺基酸殘基或由Pro230位置之胺基酸殘基延伸至羧基末端的區域。Fc區域亦可包含鉸鏈區域(hinge region；例如，一天然或經修飾之鉸鏈區域)的任一部分。Fc區域可以是包含人類之任何哺乳動物的Fc區域，且可以經轉譯後修飾(例如，醣化修飾)。在一例示性之實施例中，Fc區域為人類 IgG1的區域，且具有序列編號：2的胺基酸序列。

本揭示內容及請求保護之發明概念亦包含多肽(即，本揭示內容的融合蛋白)之胺基酸序列的微小變異，其中胺基酸序列的變異維持至少85%序列相似度，例如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列相似度。可藉由特定修飾來改變抗體的特性，而不影響其生理活性。舉例來說，可改變及/或刪除某些胺基酸而不影響本發明抗體的生理活性(即，與SARS-CoV-2 RBD的結合親和力，以及/或是對流行性感冒病毒的抑制功效)。特別是，保留性胺基酸取代亦包含於其中。保留性取代為具有相似/相關側鏈之胺基酸間的相互取代。一般來說，由基因編碼的胺基酸可分為四大類：(1) 酸性胺基酸，即天門冬胺酸(aspartate)、麩胺酸(glutamate)；(2)鹼性胺基酸，即離胺酸(lysine)、精胺酸(arginine)、組胺酸(histidine)；(3)非極性胺基酸，即丙胺酸(alanine)、纈胺酸(valine)、白胺酸(leucine)、異白胺酸(isoleucine)、脯胺酸(proline)、苯丙胺酸(phenylalanine)、甲硫胺酸(methionine)、色胺酸(tryptophan)；以及(4)非帶電極性胺基酸，即甘胺酸(glycine)、天門冬醯胺(asparagine)、麩醯胺酸(glutamine)、半胱胺酸(cysteine)、絲胺酸(serine)、蘇胺酸(threonine)、酪胺酸(tyrosine)。較佳的分類是：絲胺酸及蘇胺酸係屬脂肪羥基(aliphatic-hydroxy)類；天冬醯胺酸及麩醯胺係屬含醯胺(amide-containing)類；丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸係屬脂肪類；而苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸則屬芳香(aromatic)類。舉例來說，當可想見若以異白胺酸或纈胺酸取代白胺酸、以麩胺酸取代天門冬胺酸、以絲胺酸取代蘇胺酸，或是以一結構相似的胺基酸取代另一胺基酸時，並不會造成分子結合或蛋白特性的顯著改變，特別是當該取代位置不是位於骨架區域時，胺基酸之間的取代更不會影響上述特性。可藉由檢測抗體衍生物之特定活性來瞭解一胺基酸的改變是否可形成一具功能性的抗體。可利用本發明所屬技術領域具有通常知識者所知的方法來製備蛋白/胜肽的片段或類似物。片段或類似物之較佳的胺基及羧基末端是鄰近功能域的邊界。

此處針對多肽序列所述的「序列相似度百分比」(Percentage (%) sequence identity)係指候選序列的胺基酸殘基與參考多肽序列的胺基酸殘基完全相同的百分比；於進行上述比對時，可將所述的候選多肽片段與所述的特定多肽片段並排，並於必要時引入間隙，以使二序列形成最高的序列相似度；在計算相似度時，保守性置換的胺基酸殘基視為不同的殘基。相關領域已有多種方法可用以進行上述並排，譬如可公開取得的軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)等。本發明所屬技術領域中具有通常知識者在進行並排時，可選擇適當的參數與計算方式，以得到最佳的排列方式。在本說明書中，二多肽序列間的序列比較是採用美國國家生物科技資訊中心(Nation Center for Biotechnology Information, NCBI)所提供的蛋白質-蛋白質BLAST分析資料庫Blastp來進行。候選多肽序列A相較於參考多肽序列B的胺基酸序列相似度(在本說明書中亦稱之為多肽序列A與多肽序列B具有特定百分比(%)的胺基酸序列相似度)的計算方式如下： 其中X是利用BLAST序列並排程式對序列A、B進行排列後所得到的相同胺基酸殘基數目(identical matches)，而Y是A、B二序列中較短者的胺基酸殘基總數。

在本揭示內容中，「治療」(treat)一詞包含部份或完全預防、改善、減輕及/或處理與SARS-CoV-2感染或流行性感冒病毒感染相關的病徵(symptom)、次要病徵(secondary disorder)或症狀(condition)。「治療」(treat)一詞於此說明書中亦指應用或施予本揭示內容之融合蛋白至一個體，其係患有與SARS-CoV-2感染或流行性感冒病毒感染相關旳病徵、次要病徵或症狀，以達到部份或完全減輕、減緩、治癒疾病、延遲發病、抑制病程發展、降低疾病嚴重性，及/或降低一或多個與SARS-CoV-2感染或流行性感冒病毒感染相關的病徵、症狀、或次要病徵的發生。與SARS-CoV-2感染相關的病徵、次要病徵及/或症狀包含，但不限於ARDS、肺部發炎、肺部膠原蛋白沉積、肺部損傷、肺部纖維化、免疫血栓(immunothrombosis)、免疫細胞浸潤(例如，單核球、嗜中性球及/或T細胞浸潤)、血管內凝血病變、微血管病變、肺栓塞、腦梗塞及其組合。與流行性感冒病毒感染相關的病徵、次要病徵及/或症狀包含，但不限於發燒、咳嗽、喉嚨痛、流鼻水或鼻塞、肌肉或身體疼痛、頭痛、疲倦、嘔吐、腹瀉、肺部發炎、體重下降及其組合。在此「治療」亦可以是施用至患有早期該些病徵或症狀之個體，以降低該個體產生與SARS-CoV-2感染或流行性感冒病毒感染相關的病徵、次要病徵及/或症狀的風險。在此「治療」為可以有效地減少一個或多個病徵或臨床標記。亦或是，在此治療可以是降低、減緩或終止疾病病程、病徵或症狀的發展。

「投予」(administered或administering) 在本揭示內容係指一遞送模式，其包含，但不限於，靜脈內、肌肉內、腹腔內、動脈內、顱內或皮下遞送本揭示內容之藥劑(例如，CLEC2融合蛋白)。

「有效量」(effective amount) 在此處係指一藥劑的用量足以產生欲求的療效反應。有效量亦指一種化合物或組合物，其治療利益效果超越其毒性或有害影響。藥劑的有效量不必然能夠治癒疾病或病徵，但能夠延緩、阻礙或防止該疾病或病徵的發生，或是可緩減與疾病或病徵相關的病徵。可將治療有效量可分成一、二或更多劑，而以適當的劑型在指定期間內施用一次、二次或更多次。具體的治療有效量取決於多種因素，例如欲治療的特定狀況、個體的生理條件(如，個體重、年齡或性別)、接受治療的個體類型、治療持續時間、併行治療(如果有的話)的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。舉例來說，可將治療有效量表示成活性成分的總重量，譬如以克、毫克或微克來表示；或表示成活性成分重量相對於體重的比例，譬如表示為每公斤體重多少毫克(mg/kg)。或者是，可將有效量表示成活性成分(例如，本揭示內容之CLEC2融合蛋白) 的濃度，例如莫耳濃度、重量濃度、體積濃度、重量莫耳濃度、莫耳分率、重量分率及混合比值。習知技藝人士可依據動物模式的劑量來計算藥劑( 例如，本發明CLEC2融合蛋白)的人體等效劑量(human equivalent dose, HED)。舉例來說，習知技藝人士可依據美國食品藥物管理局(US Food and Drug Administration, FDA)所公告之「估算成人健康志願者在初始臨床治療測式之最大安全起始劑量」(Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)來估算人體使用之最高安全劑量。

「個體」(subject)或「病患」(patient)一詞在本揭示內容是指包含人類等可接受本發明CLEC2融合蛋白及/或方法治療的哺乳動物。除非另有所指，否則「個體」(subject)一詞在本揭示內容同時意指男性及女性。

II. 發明詳細說明

COVID-19影響全球超過一千五百萬名患者，其中多數患者死於ARDS。近期研究指出，過量形成的嗜中性球胞外捕捉網(neutrophil extracellular trap, NET)會造成免疫血栓，進而導致患者體內廣泛的血管內凝血病變及多重器官失能。COVID-19患者的解剖分析證實在患者的小血管及微血管中存在著血栓及微血管病變。了解SARS-CoV-2誘發NETosis (由NET造成的細胞死亡)的機制將有助於降低血栓及預防內臟器官梗塞的研究。本揭示內容的發明人意外發現CLEC2可專一地與SARS-CoV-2 RBD結合，其中SARS-CoV-2在血小板存在時會誘發大量的NET形成，而阻斷CLEC2則會抑制SARS-CoV-2誘發的NET形成。該些結果指出，血小板上的CLEC2在SARS-CoV-2誘發的免疫血栓中扮演著重要的角色，且阻斷CLEC2可望藉由抑制SARS-CoV-2誘發血管內凝血病變而對COVID-19患者產生治療效益。

(II-1) CLEC2 融合蛋白 (CLEC2.Fc 蛋白 )

本揭示內容的第一態樣是關於一種CLEC2融合蛋白(以下稱為「CLEC2.Fc蛋白」)，其包含一CLEC2的胞外域(作為第一多肽)，以及一與該CLEC2胞外域連接的可結晶片段(fragment crystallizable, Fc)區域(作為第二多肽)。依據使用目的之不同，該Fc區域可位於該CLEC2胞外域的上游或下游。依據某些較佳的實施方式，該Fc區域是位於且連接於該CLEC2胞外域的上游。

依據本揭示內容的實施方式，CLEC2.Fc蛋白的胞外域包含一與序列編號：1具有至少85%相似度的胺基酸序列；較佳地，與序列編號：1具有至少90%相似度的胺基酸序列；更佳地，與序列編號：1具有至少95%相似度的胺基酸序列。在一特定實施例中，本發明CLEC2.Fc蛋白的胞外域包含與序列編號：1具有100%相似度的胺基酸序列。

本發明CLEC2.Fc蛋白的Fc區域是源自人類的免疫球蛋白(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM)。較佳地，CLEC2.Fc蛋白的Fc區域是源自人類的IgG1，且包含與序列編號：2具有至少85%相似度的胺基酸序列。當可想見，Fc區域的胺基酸序列可具有些微變異(例如，以保留或非保留胺基酸殘基取代)而不會影響其特定功能，例如穩定與其結合之蛋白(例如，本發明CLEC2.Fc蛋白之CLEC2胞外域)的功能，以及/或是延長與其結合之蛋白(例如，本發明CLEC2.Fc蛋白之CLEC2胞外域)的半衰期。依據某些較佳的實施方式，Fc區域包含一與序列編號：2具有至少90%相似度的胺基酸序列。更佳地，Fc區域包含一與序列編號：2具有至少95%相似度的胺基酸序列。在本揭示內容一操作實施例中，Fc區域包含與序列編號：2具有100%相似度的胺基酸序列。

為了穩定CLEC2胞外域的功能及/或延長CLEC2胞外域的半衰期，可藉由其他具備穩定特性的分子來取代Fc區域，例如白蛋白(例如，人類血清白蛋白)、白蛋白結合域(albumin binding domain)、運鐵蛋白(transferrin)、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)、重組PEG、同胺基酸聚合物(homo-amino acid polymer, HAP)、類彈性蛋白胜肽(elastin-liked peptide, ELP)、羧基末端胜肽(carboxy-terminal peptide, CTP)及類明膠蛋白(gelatin-like protein, GLK)。

非必要地，Fc區域是藉由一連接子與CLEC2胞外域連接；依據本揭示內容某些實施方式，該連接子是一可切割連接子或不可切割連接子。非必要地，該連接子可以是一彈性(flexible)連接子或非彈性(inflexible)連接子。該連接子的長度應足夠長以使CLEC2胞外域與Fc區域連接而不會產生立體障礙，且足夠短以保留融合蛋白的預期活性。連接子較佳具有足夠的親水性以避免或最小化融合蛋白的不穩定性。連接子較佳具有足夠的親水性以避免或最小化融合蛋白的不溶性。連接子於活體內應具備足夠的穩定性(例如，不會被血清及酵素等分子所切割或分解)，以確保融合蛋白於活體內可產生預期作用。較佳地，連接子是由麩醯胺酸(glutamine, Q)、絲胺酸(serine, S)、甘胺酸(glycine, G)、麩胺酸(glutamate, E)、脯胺酸(proline, P)、組胺酸(histidine, H)及/或精胺酸(arginine, R)之胺基酸殘基所組成。更佳地，連接子絲胺酸(serine, S)、甘胺酸(glycine, G)及/或脯胺酸(proline, P)所組成。在某些實施方式中，連接子是一包含1-25個胺基酸殘基、1-20個胺基酸殘基、2-15個胺基酸殘基、3-10個胺基酸殘基、3-7個胺基酸殘基、4-25個胺基酸殘基、4-20個胺基酸殘基、4-15個胺基酸殘基、4-10個胺基酸殘基、5-25個胺基酸殘基、5-20個胺基酸殘基、5-15個胺基酸殘基或5-10個胺基酸殘基的胜肽。依據一實施方式，連接子包含1到5個單元(unit)之「GGP」(即，(GGP) _1-5)；舉例來說，連接子可以包含「GGP」、「GGPGGP」(序列編號：9)、「GGPGGPGGP」(序列編號：10)、「GGPGGPGGPGGP」(序列編號：11)或「GGPGGPGGPGGPGGP」(序列編號：12)的胺基酸序列。依據另一實施方式，連接子包含1到5個單元之「GGGGS」(序列編號：5)；舉例來說，連接子可以包含「GGGGS」(序列編號：5)、「GGGGSGGGGS」(序列編號：13)、「GGGGSGGGGSGGGGS」(序列編號：14)、「GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS」(序列編號：15)或「GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS」(序列編號：16)的胺基酸序列。依據另一實施方式，連接子包含「EPKSS」(序列編號：6)的胺基酸序列。在一例示性的實施方式中，連接子包含「GGGGSGGGGAS」 (序列編號：7)的胺基酸序列。

非必要地，CLEC2.Fc蛋白更包含一位於N端的訊息肽(亦稱為「訊息序列」(signal sequence))。依據本揭示內容某些實施方式，Fc區域是位於且連接於CLEC2胞外域的上游；在該些實施方式中，訊息肽是位於且連於Fc區域的上游，即，融合蛋白由N端到C端依序包含一訊息肽、一Fc區域、一連接子(非必要地)及一CLEC2胞外域。依據替代性的實施方式，Fc區域是位於且連接於CLEC2胞外域的下游；在該些實施方式中，訊息肽是位於且連接於CLEC2胞外域的上游，即，融合蛋白由N端到C端依序包含一訊息肽、一CLEC2胞外域、一連接子(非必要地)及一Fc區域。

已知訊息肽是一種位於分泌型蛋白或膜蛋白之N端的短胜肽，可媒介蛋白標的至內質網(endoplasmic reticulum, ER)的膜上。習知技藝人士可依據實施目的由適當來源選擇訊息肽。舉例來說，訊息肽可以源自介白素-2 (interleukin-2, IL-2)、CD5、胰蛋白酶原(trypsinogen)、血清白蛋白、IgG卡帕輕鏈(IgG kappa light chain)或泌乳素(prolactin)。依據一實施方式，CLEC2.Fc蛋白的訊息肽包含序列編號：3的胺基酸序列。依據另一實施方式，CLEC2.Fc蛋白的訊息肽包含序列編號：4的胺基酸序列。

例示性地以序列編號：8來闡述CLEC2.Fc蛋白的胺基酸序列，其中以底線標示訊息肽(序列編號：4)，以斜體標示Fc區域(序列編號：2)，以雙底線標示連接子(序列編號：7)，而以粗體標示CLEC2的胞外域(序列編號：1)。

CLEC2.Fc蛋白(序列編號：8) MEWSWVFLFFLSVTTGVHS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK GGGGSGGGGAS LGIWSVMQRNYLQGENENRTGTLQQLAKRFCQYVVKQSELKGTFKGHKCSPCDTNWRYYGDSCYGFFRHNLTWEESKQYCTDMNATLLKIDNRNIVEYIKARTHLIRWVGLSRQKSNEVWKWEDGSVISENMFEFLEDGKGNMNCAYFHNGKMHPTFCENKHYLMCERKAGMTKVDQLP

一般來說，可利用DNA技術來製備本揭示內容之CLEC2.Fc蛋白，即，建構可編碼特定多肽序列的重組DNA後，將重組DNA轉入宿主細胞以表現該多肽序列。舉例來說，可利用序列編號：17的多核苷酸來編碼序列編號：8的CLEC2.Fc蛋白。

(II-2) CLEC2 載體

為表現本揭示內容之CLEC2融合蛋白，可將編碼序列(例如，序列編號：17)選殖至適當的載體中。在依據本發明所屬技術領域所知的標準選殖及表現技術(例如，可參見Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)將載體轉入適當的宿主後，編碼序列會表現出特定的多肽。因此，本揭示內容亦關於包含本發明核酸序列的載體。

「載體」(vector)是指一種運送媒介物，可(a)促進用以編碼多肽之核酸序列的表現；(b)促進核酸序列產生多肽；(c)促進標的細胞的轉染/轉形；(d)促進核酸序列的複製；(e)促進核酸序列的穩定性；(f)促進核酸及/或轉形/轉染細胞的偵測；以及/或是(g)另外賦予用以編碼多肽之核酸序列有利的生物及/或生理化學功能。載體可以是任何適當的載體，包含染色體、非染色體及合成核酸載體(包含一組適當之表現控制元件的核酸序列)。例示性的載體包含SV40的衍生物、細菌質體、噬菌體DNA、桿狀病毒、酵母菌質體、源自質體及噬菌體DNA組合的載體，以及病毒核酸(RNA或DNA)載體。

可設計重組表現載體使原核細胞(例如，大腸桿菌)或真核細胞(例如，昆蟲細胞、酵母菌細胞或哺乳動物細胞)來表現CLEC2融合蛋白。例示性的宿主細胞包含常用以選殖及表現的宿主細胞，例如大腸桿菌及哺乳動物細胞株。或者是，可利用T7啟動子調控序列、T7聚合酶及活體外轉譯系統等方式，於活體外轉錄及轉譯重組表現載體。較佳地，載體包含一位於選殖位置(cloning site)之上游的啟動子，其中該選殖位置包含用以編碼多肽的核酸序列。例示性之可用以調控表現與否的啟動子包含lac啟動子、T7啟動子、trc啟動子、tac啟動子及trp啟動子。

因此，本揭示內容亦關於包含用以編碼CLEC2.Fc蛋白之核酸序列的載體。在不同實施方式中，載體包含一可操作連接的核苷酸序列，據以調控CLEC2.Fc蛋白的表現。載體可包含任何適當的啟動子、增強子或其他有助於表現的元件。例示性之元件包含強表現啟動子(例如，人類 CMV IE啟動子/增強子、RSV啟動子、SV40啟動子、SL3-3啟動子、MMTV啟動子、HIV LTR啟動子、EF1α啟動子或CAG啟動子)、有效的多腺苷酸(poly(A))終止序列、可使質體產物於大腸桿菌複製的起始位點、對抗生素具有抗性的基因(作為篩選標記)及/或傳統的選殖位點(例如，多重選殖位點)。載體亦可包含一種與持續型啟動子(constitutive promoter)相反的誘發型啟動子。在一態樣中，是將包含用以編碼CLEC2.Fc蛋白的核酸可操作式地連接至一組織特異性啟動子，其中該啟動子可促使序列於代謝相關組織(例如肝臟或胰臟組織)中表現。

(II-3) 宿主細胞

本揭示內容的另一態樣是關於包含CLEC2.Fc核酸及載體的宿主細胞。在不同實施方式中，是將載體或核酸整合(integrate)至宿主的基因組中；而在其他實施方式中，載體或核酸是位於染色體外(extra-chromosomal)。

本揭示內容亦關於包含核酸、載體或其組合的重組細胞，例如酵母菌、細菌(例如，大腸桿菌)及哺乳動物細胞(例如，永生化之哺乳動物細胞)。在不同實施方式中，細胞包含未整合的核酸，例如質體、黏接質體(cosmid)、噬菌體載體(phagemid)或線性表現元件，其包含用以編碼本發明CLEC2.Fc蛋白的序列。

可利用轉形或轉染的方式，將包含核酸序列(用以編碼本發明CLEC2.Fc蛋白)的載體轉入宿主細胞中。用以將表現載體轉入細胞的方法為本發明所屬技術領域所熟知的技術。

可藉由一病毒載體將用以編碼CLEC2.Fc蛋白之核酸運送至宿主細胞中。本揭示內容之方法可採用任何適當的病毒載體。病毒載體可包含任何數量的病毒多核苷酸，以及/或是一或多種病毒蛋白，其有利於將本發明核酸遞送至一特定的宿主細胞，以及/或是使本發明核酸於宿主細胞中複製及/或表現。病毒載體可以是包含全部或部分病毒基因組的多核苷酸、病毒蛋白/核酸結合物、類病毒顆粒(virus-like particle, VLP)，或是包含病毒核酸及用以編碼CLEC2.Fc蛋白之核酸的完整病毒顆粒。病毒顆粒型的病毒載體可以包含野生型病毒顆粒或經修飾的病毒顆粒。病毒載體可以是一種需要其他載體或野生型病毒存在方能進行複製及/或表現的載體(例如，病毒載體可以是輔助依賴型病毒(helper-dependent virus))，例如腺病毒載體擴增子(amplicon)。一般來說，該種病毒載體可以是野生型病毒顆粒，或是蛋白及/或核酸經修飾的病毒顆粒，據以增加轉基因的能力或有助於核酸的轉染及/或表現，例示性之此種載體包含皰疹病毒/AAV擴增子)。一般來說，病毒載體類似於及/或源自於通常感染人類的病毒。適用於本發明的病毒載體，舉例來說，包含腺病毒載體顆粒(包含任何腺病毒科的病毒或源自腺病毒科的病毒)、腺相關病毒載體顆粒(AAV載體顆粒)或其他小病毒及小病毒載體顆粒、乳突病毒載體顆粒、黃病毒載體、α病毒載體、疱疹病毒載體、痘病毒載體、反轉錄病毒載體(包含慢病毒載體)。

(II-4) 分離 CLEC2.Fc 蛋白

可利用標準蛋白純化方法(例如親和性純化)來分離本發明CLEC2.Fc蛋白。用以純化CLEC2.Fc蛋白的方法，以及純化相關的材料及試劑皆為本發明所屬技術領域所熟知的技術。例示性之用以純化本發明CLEC2.Fc蛋白的方法可見於本揭示內容之實施例。用以純化本發明CLEC2.Fc蛋白的其他方法亦可見於Bootcov M R, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11514-9, Fairlie W D, 2000, Gene 254: 67-76等文獻。

(II-5) 用以治療 SARS-CoV-2 感染的方法

棘蛋白(S蛋白)是存在於冠狀病毒的第I型跨膜蛋白，大小從禽類傳染性支氣管炎病毒的1,160個胺基酸到貓冠狀病毒的1,400個胺基酸。此外，棘蛋白由於包含21到35個N-醣化位點，因此為高度醣化蛋白。棘蛋白在病毒體表面會形成三聚體，產生獨特的冠狀或類冠狀外觀。所有冠狀病毒棘蛋白的胞外域(ectodomain)於二個區域具有相同的結構：命名為S1且與受體結合相關的N端區域，以及與融合相關的C端S2區域。SARS-CoV-2的棘蛋白具有1,255個胺基酸(序列編號：18)，包含具有222個胺基酸的受體結合域(receptor binding domain, RBD；序列編號：19) (序列編號：18之第306-527個胺基酸)，以及具有71個胺基酸的ACE2結合模體(序列編號：20) (序列編號：18之第424-494個胺基酸)。已知2019-nCoV (COVID-19)會藉由與人類ACE2受體結合而感染人類呼吸道的上皮細胞。確實，重組棘蛋白會與重組ACE2蛋白結合。

本揭示內容的發明人意外發現CLEC2.Fc蛋白會與SARS-CoV-2 棘蛋白(更具體為RBD)形成複合結構，據以抑制SARS-CoV-2感染及SARS-CoV-2誘發的NETosis。

因此，本揭示內容的另一態樣是關於一種利用本揭示內容所述之任一種CLEC2.Fc蛋白來治療SARS-CoV-2感染的方法。本發明方法包含對個體投予一有效量的CLEC2.Fc蛋白，據以減緩或改善與SARS-CoV-2感染相關的病症。

依據某些實施方式，該個體是一小鼠，其中是對該個體投予每公斤約0.1毫克到每公斤約100毫克之本發明CLEC2.Fc蛋白；舉例來說，每公斤0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100毫克。較佳地，對該個體投予每公斤約0.5毫克到每公斤約50毫克之本發明CLEC2.Fc蛋白。更佳地，對該個體投予每公斤約1毫克到每公斤約10毫克之本發明CLEC2.Fc蛋白。依據一操作實施例，投予每公斤約4毫克到每公斤約5毫克的本發明CLEC2.Fc蛋白即足以於個體體內產生預防功效(即，保護個體免於受到SARS-CoV-2感染)。依據另一操作實施例，投予每公斤約8毫克到每公斤約10毫克的本發明CLEC2.Fc蛋白即可於個體體內產生治療功效(即，減緩或改善由SARS-CoV-2感染所造成的病症)。

習知技藝人士可基於本揭示內容實施例之動物試驗所得到的數值來計算本發明CLEC2.Fc蛋白的HED。據此，本發明CLEC2.Fc蛋白適用於人類個體的有效量是介於每公斤個體體重10微克到每公斤個體體重10毫克；例如每公斤10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980或990微克，或是每公斤1、2、3、4、5、6、7、8、9或10毫克。較佳地，HED約為每公斤體重50微克到每公斤體重5毫克；更佳地，約為每公斤體重0.1毫克到每公斤體重1毫克。

依據本揭示內容某些實施方式，投予CLEC2.Fc蛋白可抑制免疫血栓、細胞浸潤及肺部的膠原蛋白沉積。

本發明方法可單獨投予至個體，或是與其他有益於預防或治療SARS-CoV-2感染的治療藥劑合併投予至個體。依據治療目的之不同，本發明方法可於投予額外治藥劑之前、同時或之後投予至個體體內。

(II-6) 用以治療流行性感冒病毒感染的方法

除了用以預防/治療SARS-CoV-2感染之外，本揭示內容的發明人亦意外發現CLEC2.Fc蛋白可用以預防性治療流行性感冒病毒感染。

因此，本揭示內容亦提供一種利用CLEC2.Fc蛋白來治療流行性感冒病毒感染的方法。本發明方法包含對個體投予一有效量之CLEC2.Fc蛋白，據以減緩或改善與流行性感冒病毒感染感染相關的病症。

依據某些實施方式，所述個體是一小鼠，其中是將每公斤約0.1毫克到每公斤約100毫克的本發明CLEC2.Fc蛋白投予至該個體體內；舉例來說，每公斤0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100毫克。較佳地，對該個體投予每公斤0.5毫克到每公斤50毫克的本發明CLEC2.Fc蛋白。更佳地，對該個體投予每公斤1毫克到每公斤10毫克的本發明CLEC2.Fc蛋白。依據一操作實施例，投予每公斤約4毫克到每公斤約5毫克的本發明CLEC2.Fc蛋白即足以於個體體內產生預防功效(即，保護個體免於受到流行性感冒病毒感染)。

習知技藝人士可基於本揭示內容實施例之動物試驗所得到的數值來計算本發明CLEC2.Fc蛋白的HED。據此，本發明CLEC2.Fc蛋白適用於人類個體的有效量是介於每公斤個體體重10微克到每公斤個體體重10毫克；例如每公斤10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980或990微克，或是每公斤1、2、3、4、5、6、7、8、9或10毫克。較佳地，HED約為每公斤體重50微克到每公斤體重5毫克；更佳地，約為每公斤體重0.1毫克到每公斤體重1毫克。

依據本揭示內容某些實施方式，投予CLEC2.Fc蛋白可預防由流行性感冒病毒所造成的體重下降及死亡。

流行性感冒病毒可以是A型流感病毒(influenza type A virus, IAV)或B型流感病毒(influenza type B virus, IBV)。依據某些實施方式，本發明CLEC2.Fc蛋白可用於治療IAV感染及/或與IAV感染相關的病症(例如，體重下降)，其中IAV可以是H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7或H7N9。在一特定實施例中，流行性感冒病毒是H5N1。

本發明方法可單獨投予至個體，或是與其他有益於預防或治療流行性感冒病毒感染的治療藥劑合併投予至個體。依據治療目的之不同，本發明方法可於投予額外治藥劑之前、同時或之後投予至個體體內。

依據所需目的之不同，本發明CLEC2.Fc蛋白可藉由適當的路徑投予至個體體內，例如皮下、腫瘤內、皮內、靜脈內或腹腔注射。依據較佳的實施方式，本發明CLEC2.Fc蛋白是以靜脈內注射的方式投予至個體體內。

適用以本發明CLEC2.Fc蛋白及/或方法治療的個體為一哺乳動物，舉例來說，人類、小鼠、大鼠、猴子、兔子、狗、貓、綿羊、山羊、馬或黑猩猩。較佳地，個體是人類。

下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。 實施例

材料及方法

製備 C 型凝集素 .Fc 蛋白

將Expi293F細胞(7.5×10 ⁷)種植於裝有25.5毫升之培養液(每毫升2.9×10 ⁶個細胞)的125毫升培養瓶中。將30微克之用以編碼C型凝集素.Fc蛋白(包含CLEC5A.Fc蛋白、CLEC2.Fc蛋白、DC-SIGN.Fc蛋白、Dectin-1.Fc蛋白、Dectin-2.Fc蛋白及Mincle.Fc蛋白)的質體DNA分析稀釋於1.5毫升之OPTI-MEM ^®溶液中，並輕輕攪拌均勻。將81微克之EXPIFECTAMINE™ 293試劑加入1.5毫升之OPTI-MEM ^®溶液中，攪拌均勻後於室溫放置5分鐘。接著，混合稀釋的質體DNA及稀釋的EXPIFECTAMINE™ 293試劑，得到3毫升的混合物。將混合物置於室溫20分鐘後，加至包含細胞的培養液中。將細胞培養於37°C及8% CO ₂的環境20小時。之後，將150微升之EXPIFECTAMINE™ 293轉染增強劑1及1.5毫升的EXPIFECTAMINE™ 293轉染增強劑2加至培養瓶中。於加入增強劑24小時後收集上清液；將細胞沉澱物懸浮於60毫升的培養液中，另培養48小時後收集上清液，以純化抗體。以蛋白A管柱純化抗體，並離心過濾來濃縮抗體。

分離人類嗜中性球及血小板

由未接受藥物治療之健康個體收集全血，以分離嗜中性球及血小板。簡單來說，將新鮮收集的血液與抗凝血劑ACD (比例為1:6，體積/體積)混合後，以230 ×g的轉速離心15分鐘，藉此分離富含血小板的血漿。以1000 ×g的轉速離心10分鐘來收集血小板，並將沉澱物懸浮於Tyrode’s緩衝液中。在分離嗜中性球時，是將血液加至FICOLL-PAQUE ^®的上方，並以500 ×g的轉速離心15分鐘。利用紅血球裂解緩衝液裂解紅血球，之後以生理食鹽水洗滌。將嗜中性球懸浮於含有10%自體血清的Roswell Park Memorial Institute (RPMI)細胞培養液中。

SARS-CoV-2 增殖

以Vero E6細胞來增殖SARS-CoV-2病毒株Taiwan/4/2020。將上清液保存於-80°C，並利用於Vero E6細胞產生的細胞病變(cytopathic effect, CPE)來評估病毒效價(titer)。

分離胞外囊泡 (extracellular vesicle, EV)

由健康個體及COVID-19患者分離血漿後，以3,500 ×g的轉速離心15分鐘以移除細胞及碎屑。進一步將上清液以100,000 ×g的轉速於4°C離心1.5小時。利用生理食鹽水洗滌沉澱物後，再次以100,000 ×g的轉速於4°C離心1.5小時，接著使沉澱物懸浮於1毫升的生理食鹽水中。依據使用者操作說明利用DC蛋白試驗來測量EV中的蛋白濃度。

誘發嗜中性球胞外捕捉網 (neutrophil extracellular trap, NET)

在進行SARS-CoV-2刺激實驗時，是以SARS-CoV-2 (MOI=0.1或1)刺激嗜中性球(4×10 ⁵)，並與自體血小板(4×10 ⁶)於37°C共同培養5或20小時。在進行CLEC2.Fc蛋白阻斷實驗時，是在自體血小板存在或不存在的情況下，投予同型對照(hIgG1，每毫升3微克)或CLEC2.Fc蛋白(每毫升3微克)，並於37°C以SARS-CoV-2 (MOI=0.1或1)刺激嗜中性球(4×10 ⁵)後，培養20小時。在進行EV刺激實驗時，是將源自健康個體之血漿的EV (HC-EV)或源自COVID-19患者之EV與嗜中性球於37°C共同培養3小時。

觀察及量化 NET 結構

利用4%之三聚甲醛固定檢體後，以0.5%之溶於磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline, PBS)的TRITON ^TMX-100處理檢體15分鐘。以抗髓過氧化酶(MPO)抗體(1:100)、抗瓜胺酸化組織蛋白抗體(1:100)及Hoechst 33342 (1:100,000)染色檢體，以觀察NET的結構。利用具有白光雷射系統的共軛焦顯微鏡補捉NET組織蛋白區域，之後藉由軟體分析實驗結果。以組織蛋白的區域(微米平方，μm ²)來計算NET的形成量。

抑制 SARS-CoV-2 感染

將經人類ACE2轉染之Vero E6細胞種植於96孔盤，並培養16-24小時。將加入連續稀釋之CLEC2.Fc蛋白(每毫升10微克)或中和抗體(RBD，每毫升10微克)的SARS-CoV-2，或是未加入CLEC2.Fc蛋白或中和抗體處理的SARS-CoV-2，於室溫放置1小時後，加至細胞。2小時後，將含有20% FBS及2%青黴素-鏈黴素(penicillin-streptomycin)的DMEM加至細胞，並於37°C培養48小時。計算病毒斑的數量，並測量中和率(%)。

建構、表現及純化重組 SARS-CoV-2 RBD 蛋白

以反轉錄PCR來擴增用以編碼SARS-CoV-2棘蛋白基因之RBD域的DNA片段，並將其次選殖至pcDNA4/V5/His/A載體，以製備SARS-CoV-2 RBD融合蛋白。利用EXPI293™表現系統來表現具有His標誌的SARS-CoV-2 RBD融合蛋白。簡單來說，以含有30微克之質體DNA及81微升之EXPIFECTAMINE™ 293試劑的OPTI-MEM ^®I (總體積為3毫升)轉染293F細胞(7.5×10 ⁷，懸浮於25.5毫升之細胞培養液)；轉染18-22小時後，加入EXPIFECTAMINE™ 293轉染增強劑1及EXPIFECTAMINE™ 293增強劑2。轉染5天後收集培養上清液，之後以管柱來純化重組SARS-CoV-2 RBD。

C 型凝集素 -SARS-CoV-2 RBD 結合試驗的 ELISA

以50微升之SARS-CoV-2 RBD (每毫升5微克，溶於PBS)塗佈96孔盤之各孔洞後，將96孔盤置於4°C至隔日。利用微盤洗滌器以PBST (含有0.05%之TWEEN ^®20的PBS)洗滌檢體一次，之後加入100微升之3%胎牛血清白蛋白(bovine serum albumin (BSA)；溶於PBST)於室溫反應1小時。洗滌後，加入50微升之重組人類C型凝集素.Fc融合蛋白(每毫升50微克，1%之溶於PBS的BSA)，並於室溫反應2小時。以PBST洗滌培養盤三次，之後加入50微升之與HRP鍵結的抗人類IgG (H+L)抗體(1:10,000)，於室溫反應1小時。加入100微升之TMB受質(3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺 (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine))作用15分鐘後，加入50微升之2N H ₂SO ₄中止反應，據以分析HRP的活性。利用吸光微盤分析儀來測量450奈米的光學密度。

測量 C 型凝集素 .Fc 融合蛋白與 SARS-CoV-2 RBD 之間的結合親和力

利用生物膜干涉技術(biolayer interferometry)來測量C型凝集素-Fc融合蛋白與SARS-CoV-2 RBD之間的結合親和力。簡單來說，於進行結合試驗之前，將抗-penta-his (HIS1K)尖端浸泡於PBS緩衝液中，並於振盪器上搖晃20分鐘。所有的步驟均在30°C的溫度下於平底96孔黑色培養盤以1,000 rpm的攪拌速度進行。將COVID-2019-棘蛋白-328-585(RBD)在PBS中以每毫升20微克的濃度固定於HIS1K尖端600秒，使反應量達到約為0.8奈米。將生物感測器的尖端置於PBS緩衝液中平衡60秒後，評估結合240秒，再解離240秒。以PBS連續二倍稀釋人類IgG1及重組CLEC2.Fc蛋白、DC-SIGN.Fc蛋白及IgG1 (50 μM、31 μM及8.8 μM)。每次測試之間，將生物感測器暴露於再生緩衝液(10 mM之甘胺酸，pH 2.0) 5秒，共暴露3次，使生物感測器再生(regenerated)。利用軟體來分析數據，並進行曲線擬合(1:1結合模式)。重複三次試驗，並以標準差± s.d.來表示測量結果。

質譜分析

以包含磷酸酶和蛋白酶抑制劑的裂解緩衝液裂解EV蛋白檢體。於進行質譜分析之前，以胰蛋白酶分解檢體，再利用質譜儀進行分析。利用IPA來分析蛋白質譜數據。

動物實驗－ SARS-CoV-2 感染

使C57BL/6小鼠接種AAV-hACE2，14天後投予SARS-CoV-2。在預防模式中，是將CLEC2.Fc蛋白(每隻小鼠100微克；每公斤約4毫克到5毫克)靜脈注射至小鼠體內；1小時後，以氣管內注射方法對小鼠投予SARS-CoV-2 (8×10 ⁴PFU)。在治療模式中，是以氣管內注射方式對小鼠投予SARS-CoV-2 (8×10 ⁴PFU)；8小時後，將CLEC2.Fc蛋白 (每隻小鼠200微克；每公斤約8毫克至10毫克)腹腔投予至小鼠體內。於感染後3天及5天收集小鼠的肺臟組織。利用定量PCR (qPCR)分別測量肺臟組織中細胞介素(cytokine)及趨化介素(chemokine)的表現量，包含介白素(interleukin, IL)-6、IL-10、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α、干擾素(interferon, IFN)-γ、C-X-C域趨化介素配體1 (C-X-C motif chemokine ligand 1, CXCL1)、CXCL2、CXCL5、C-C域趨化介素配體2 (C-C motif chemokine ligand 2, CCL2)及干擾素γ誘發蛋白10 (interferon gamma-induced protein 10, IP10；亦稱為CXCL10)。利用免疫組織化學(immunohistochemistry, IHC)染色來分析由SARS-CoV-2所造成的肺部病變，其中是以DAPI、抗MPO 抗體、抗瓜胺酸化組織蛋白H3抗體及抗CD42b抗體來染色由小鼠分離的肺臟組織。利用軟體來分析MPO及CD42b陽性染色的區域。以天狼猩紅(Picrosirius red)染色膠原蛋白沉積處。藉由軟體來定量分析膠原蛋白沉積的面積(μm ²)。

動物實驗－流行性感冒病毒感染

將C57BL/6小鼠(公鼠，8週大)麻醉後，鼻腔內投予H5N1 (800 PFU/於20微升的生理食鹽水)。於接種H5N1之前，以靜脈注射的方式對小鼠投予同型對照(hIgG1，每隻小鼠100微克)或CLEC2.Fc蛋白(每隻小鼠100微克；每公斤約4毫克到5毫克)，以進行預防性治療。於感染3天後收集肺臟組織，並以qPCR分別測量肺臟組織中病毒蛋白、細胞介素及趨化介素的表現量，包含流感M片段(influenza M segment, influenza M)、流感基質蛋白(influenza matrix protein, influenza matrix)、CXCL1、IP10、IL-1b及IL-6。持續監測小鼠的體重及存活率，直到感染後21天。

實施例 1  CLEC2.Fc 蛋白對 SARS-CoV-2 誘發 NET 形成的影響

先前研究已證實CLEC5A會與登革病毒(dengue virus, DV)作用。已知DC-SIGN可藉由與SARS-CoV之棘蛋白作用，促使病毒進入ACE2轉染的細胞。基於SARS-CoV-2 RBD會與ACE2作用，本實施例將分析SARS-CoV-2 RBD是否會與DC-SIGN及其他與Syk耦合的C型凝集素作用。

據此，本實施例分別將不同的重組C型凝集素.Fc蛋白固定至微量滴定盤中，據以補捉SARS-CoV-2 RBD。結果指出，CLEC2.Fc蛋白及DC-SIGN.Fc蛋白會專一地與SARS-CoV-2 RBD作用，而在相同條件下，CLEC5A.Fc蛋白、Dectin-1.Fc (CLEC7A)蛋白、Dectin-2.Fc (CLEC6A)蛋白及Mincle.Fc (CLEC4F)蛋白則不會與SARS-CoV-2 RBD作用(第1A圖)。以生物膜干涉技術進一步測量SARS-CoV-2 RBD及C型凝集素之間的結合親和力。表1結果指出，SARS-CoV-2 RBD與CLEC2.Fc蛋白之間的親和力為7.92×10 ^-6μM，該數值高於SARS-CoV-2 RBD與DC-SIGN.Fc蛋白之間的親和力(18.7×10 ^-6μM)。

表1  SARS-CoV-2 RBD與特定C型凝集素的結合親和力

表 1. SARS-CoV-2- 棘 蛋白 RBD 與人類 C 型凝集素 .Fc 融合蛋白 的結合親和力
	hIgG1	hCLEC2.Fc	hDC-SIGN.Fc
K on(M -1s -1)	N/A	7.22 × 10 (1.06 × 10 2± 3.67 × 10)	3.28 × 10  (3.39 × 10 2± 1.04 × 10)
K off(S -1)	N/A	5.74 × 10 -4(8.49 × 10 -4± 7.23 × 10 -4)	6.14 × 10 -4(5.88 × 10 -4± 3.89 × 10 -4)
K D(M)	N/A	7.92 × 10 -6(7.48 × 10 -6± 4.26 × 10 -6)	18.7 × 10 -6(16.05 × 10 -6± 7.25 × 10 -6)

以生物膜干涉技術來測量SARS-CoV-2-棘蛋白RBD與人類C型凝集素.Fc蛋白之間的結合親和力。K _on：結合速率常數。K _off：解離速率常數。 K _D：平衡解離常數。以平均值± s.d.來表示三次獨立試驗的分析結果。

由於人類CLEC2僅會表現於血小板上，而DV會活化血小板而增加NET的形成，因此本實驗例進一步評估血小板是否會影響SARS-CoV-2誘發NET的形成。以SARS-CoV-2 (MOI=1)感染5小時後，單獨投予SARS-CoV-2即會造成瓜胺酸化組織蛋白、染色體DNA及MPO在嗜中性球內共位表現(colocalization)，且NET不會被釋放到胞外空間(結果未顯示)。相較於模擬對照組，血小板存在時可觀察到大量聚集的NET (結果未顯示)。由SARS-CoV-2造成的NET聚集與由DV造成的網狀NET結構並不相同。

SARS-CoV-2誘發形成的NET數量會隨著時間的增加而增加，其中相較於以SARS-CoV-2 (MOI=0.1)感染5小時後的NET組織蛋白區域，在有或無血小板存在時，經SARS-CoV-2感染20小時後的NET組織蛋白區域皆會明顯增加 (結果未顯示)。如預期地，當進一步增加病毒與嗜中性球的比例(MOI=1)時，單獨投予病毒即會誘發NET形成。有趣的是，血小板的存在會使附著於培養盤上的NET形成減少(結果未顯示)，可能造成的原因為NET由培養盤上脫離，而只有微量的瓜胺酸化組織蛋白及MPO殘存於培養盤上(結果未顯示)。有趣的是，在血小板不存在的情況下，多數NET仍會附著於培養盤上(結果未顯示)。

第1B圖的結果指出，CLEC2.Fc不僅會抑制SARS-CoV-2誘發NET的形成，亦會於活體外抑制因血小板增加的NETosis。

該些數據證實，CLEC2在SARS-CoV-2/血小板誘發的NETosis反應中扮演著關鍵的角色，而投予CLEC2.Fc蛋白可抑制SARS-CoV-2誘發NET的形成。

實施例 2 CLEC2.Fc 蛋白對 SARS-CoV-2 感染的功效

本實施例將分析CLEC2.Fc蛋白於抑制及治療SARS-CoV-2感染的功效。如材料及方法所述，在預防模式中，是在投予SARS-CoV-2前1小時給予CLEC2.Fc蛋白；而在治療模式中，則是於感染後8小時給予CLEC2.Fc蛋白。於感染後3天及5天收集肺臟組織，以進行qPCR分析及IHC染色。

依據qPCR的分析數據，於感染後3天及5天可發現投予CLEC2.Fc蛋白會顯著降低發炎性細胞介素(包含IL-6、TNF-α、IFN-γ及IL-10)與趨化介素(包含CXCL1、CXCL2、CXCL5、CCL2及IP-10)的表現。於SARS-CoV-2感染後投予CLEC2.Fc蛋白仍可有效減緩肺部的發炎反應。於感染後3天及5天可發現投予CLEC2.Fc蛋白可有效抑制IL-6、CXCL2、CXCL5、CCL2及IP-10的表現，且於感染後5天可觀察到投予CLEC2.Fc蛋白仍可有效抑制TNF-α、IFN-γ、IL-10及CXCL1的表現(結果未顯示)。

如第2A圖到第2C圖的數據所示，CLEC2.Fc蛋白可有效抑制活體內NET、膠原蛋白增加及血栓的形成。

本實施例數據證實本發明CLEC2.Fc蛋白可藉由降低發炎性細胞介素及趨化介素的表現量，以及抑制肺臟組織中由SARS-CoV-2造成的免疫血栓、細胞浸潤及膠原蛋白沉積來達到治療SARS-CoV-2感染的目的。

實施例 3 COVID19-EV 中蛋白的表現

本實施例將分別由COVID-19患者及健康個體的血清中分離EV後，進行質譜分析及IPA。

如第3圖及表2的結果所示，在COVID-19患者的EV中，與去顆粒作用(degranulation)相關的蛋白(包含CD47、CD9及血小板因子4 (platelet factor 4, PF4))，以及與血小板聚集及活化相關的蛋白(包含CD9及CLEC1B/CLEC2)皆會明顯地增加，於健康個體之EV中則無法檢測到該些蛋白。由於PF4及CD47為血小板專一標誌，該些結果指出COVID-19患者體內具有強烈活化的血小板。因此，進一步將EV與嗜中性球共同培養，以分析其誘發NET形成的能力。相較於健康對照個體的EV，COVID-19-EV會以劑量相關的方式誘發大量的NET形成(結果未顯示)。

表2　COVID19-EV中特定蛋白的表現

疾病或功能之註解	分子	分子數量	-log 10 ( p值)
細胞的去顆粒作用	ACTN4、ACTR2、ADAM10、ALAD、ANPEP、APP、CALM1、CCT8、CD226、CD47、CD84、CD9、CNN2、COTL1、CYB5R3、CYFIP1、DBNL、DDOST、EEF1A1、ENDOD1、GDI2、GPI、HPSE、HSP90AB1、IQGAP2、LYN、MMRN1、NCKAP1L、PEBP1、PF4、PGRMC1、PTPN6、RAB10、RAB27B、RAB5C、RALB、SELP、SERPINB1、STX11、SYTL4、TGFB1	41	21.55752
吞噬細胞的去顆粒作用	ACTR2、ADAM10、ALAD、ANPEP、APP、CCT8、CD226、CD47、CD84、CD9、CNN2、COTL1、CYB5R3、CYFIP1、DBNL、DDOST、EEF1A1、GDI2、GPI、HPSE、HSP90AB1、IQGAP2、LYN、NCKAP1L、PEBP1、PF4、PGRMC1、PTPN6、RAB10、RAB5C、SERPINB1、STX11	32	16.71444
血小板聚集	ALOX12、ANXA7、APP、CD47、CD9、CLEC2、GNAQ、GNAZ、GP5、LYN、MPIG6B、MYLK、P4HB、PDIA4、PTPN6、RAB27B、SELP、TGFB1、TREML1、VASP	20	14.64782
嗜中性球的去顆粒作用	ACTR2、ADAM10、ALAD、ANPEP、CCT8、CD47、CNN2、COTL1、CYB5R3、CYFIP1、DBNL、DDOST、EEF1A1、GDI2、GPI、HPSE、HSP90AB1、IQGAP2、NCKAP1L、PF4、PGRMC1、PTPN6、RAB10、RAB5C、SERPINB1、STX11	26	14.03905
血小板的去顆粒作用	ACTN4、APP、CALM1 (includes others)、CD9、ENDOD1、LYN、MMRN1、PF4、RAB27B、SELP、SYTL4、TGFB1	12	9.527244
白血球的趨化性	ADAM10、APP、CD47、CD9、DNM1L、GNAZ、HPSE、HSPD1、JAM3、LYN、MYLK、NCKAP1L、PF4、PLEC、PPIB、PRKCB、PTPN6、SELP、SERPINB1、TGFB1、TXN	21	9.425969
血小板的活化	CLEC2、GNAQ、GNB1、GP1BB、GP5、LYN、MPIG6B、PF4、PRKCB、PTPN6、SELP、TREML1、VASP	13	9.191789
嗜中性球的移動	ADAM10、APP、CD47、CNN2、DNM1L、HSPB1、JAM3、LYN、MYLK、NCKAP1L、PF4、PRKCB、PTPN6、RTN4、SELP、SERPINB1、TGFB1、TXN、VASP	19	8.793174
細胞的免疫反應	ACTR2、ANPEP、ANXA11、APP、CALR、CD226、CD47、CLIC4、CNN2、CORO1C、CYFIP1、DNM1L、EHD1、HSP90B1、HSPB1、IGHA2、KIF2A、LTBP1、LYN、NCKAP1L、PF4、PRKCB、PTPN6、RAB11A、RALB、TGFB1、VASP	27	8.742321
血小板的結合	APP、CD226、CD84、CLEC2、FYB1、GP5、JAM3、PPIB、SELP、VASP	10	8.542118

表2-繼續

疾病或功能之註解	分子	分子數量	-log 10 ( p值)
發炎反應	ADAM10、APP、CD226、CD47、CD84、CD9、DNM1L、FKBP1A、GNAZ、GPX1、HPSE、HSPB1、HSPD1、JAM3、LTBP1、LYN、MAOB、MYLK、NCKAP1L、PF4、PLEC、PPIB、PRDX5、PRKCB、PTPN6、RALB、SELP、SERPINB1、TGFB1、TUBA1C、TXN	31	8.271646

以LTQ Orbitrap XL質譜分析儀(Thermo Fisher Scientific Inc.)進行質譜分析，接著以IPA軟體分析蛋白質譜數據。依據IPA的分析結果，表2列示出僅於COVID19患者之EV表現的蛋白。

實施例 4 CLEC2/SARS-CoV-2 RBD 的分子模型

依據CLEC2與SARS-CoV-2 RBD複合的電腦嵌合模型，CLEC2與SARS-CoV-2 RBD作用的位置是位於殘基151-157及186-191之間，而SARS-CoV-2 RBD與CLEC2作用的位置則位於殘基444-450及479-500之間(結果未顯示)。為視覺化與三聚SARS-CoV-2棘蛋白結合的CLEC2，利用疊加於SARS-CoV-2棘蛋白之RBD的CLEC2/SARS-CoV-2-RBD來建立與SARS-CoV-2棘蛋白結合的人工CLEC2模型(結果未顯示)。嵌合模型之RBD域幾乎與SARS-CoV-2棘蛋白的RBD完全吻合(結果未顯示)。因此，在缺乏CLEC2/SARS-CoV-2 RBD晶體結構的情況下，CLEC2/SARS-CoV-2 RBD的嵌合模型可作為適當的分析模型。

SARS-CoV2-RBD及ACE2晶體結構的分析結果指出，ACE2會利用11個氫鍵和2個鹽橋與SARS-CoV2-RBD作用。依據SARS-CoV-2 RBD/CLEC2模型複合體，CLEC2會藉由10個氫鍵和6個鹽橋與SARS-CoV-2 RBD作用(結果未顯示)。此外，ACE2會與位於SARS-CoV-2 RBD第446-456、473-476、484-489及493-505位置的胺基酸殘基作用。因此，預測SARS-CoV-2 RBD與ACE2作用的區域會與CLEC2重疊。

實施例 5  CLEC2.Fc 蛋白對流行性感冒病毒感染的功效

本實施例將分析CLEC2.Fc蛋白於抑制流行性感冒病毒感染的功效。如材料及方法所述，接種H5N1之前，靜脈內投予CLEC2.Fc蛋白。於感染後3天及5天收集肺臟組織，並以qPCR進行分析。持續觀察小鼠的體重及存活率，直到感染後21天。

如第4A圖及第4B圖的數據所示，投予CLEC2.Fc蛋白可抑制由H5N1所造成的體重下降(第4A圖)及死亡(第4B圖)。此外，依據qPCR的分析結果，相較於同型對照(hIgG)，投予CLEC2.Fc蛋白治療可減少肺臟組織中H5N1之M基因及基質蛋白的表現量，並降低由H5N1誘發之CXCL1、IP-10、IL-1β及IL-6的表現量(結果未顯示)。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

無

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：

第1A及1B圖是依據本揭示內容實施例1所繪示的柱狀圖，分別闡述CLEC2.Fc蛋白對SARS-CoV-2-誘發NET形成的影響。第1A圖：以ELISA來分析特定人類C型凝集素及重組SARS-CoV-2 RBD之間的作用。HC_血清：由健康對照個體取得的血清；COVID-19-血清：由COVID-19患者取得的血清。第1B圖：在有或無自體(autologous)血小板(PLTs)的情況下，加入同型對照(isotype control；人類 IgG1 (hIgG1))或人類 CLEC2.Fc蛋白後，將人類嗜中性球與SARS-CoV-2 (MOI= 0.1或1)於37°C培養5小時。以DNA、組織蛋白(histone)及髓過氧化酶(myeloperoxidase, MPO)的螢光染色來觀察NET形成的結構。利用組織蛋白的面積(μm ²)來計算NET的形成量。由至少三次的獨立實驗來計算分析結果，並以平均值 ± sd來表示。* p＜ 0.05，** p＜ 0.01，*** p＜ 0.001，**** p＜ 0.0001 (Student’s t-試驗)。

第2A到2C圖是依據本揭示內容實施例2所繪示的柱狀圖，分別闡述CLEC2.Fc蛋白對SARS-CoV-2感染的治療和預防功效。第2A圖：在接受特定治療之小鼠的肺臟組識中MPO陽性染色的區域。第2B圖：在接受特定治療之小鼠的肺臟組識中CD42b陽性染色的區域。第2C圖：在接受特定治療之小鼠的肺臟組識中膠原蛋白沉積(collagen deposition)的區域。由至少三次的獨立實驗來計算分析結果，並以平均值 ± sd來表示。* p＜ 0.05，*** p＜ 0.001，**** p＜ 0.0001 (Student’s t-試驗)。d.p.i.：感染後天數(day post-infection)。

第3圖是依據本揭示內容實施例3所繪示的結果，闡述COVID19-EV中蛋白的表現。利用質譜法來分析健康對照個體之EV (HCs-EV，n=2)及COVID-19患者之EV (COVID19-EV，n=3)。進一步以生物路徑分析軟體(ingenuity pathways analysis, IPA)來分析僅表現於COVID-19 EV而不會表現於HCs-EV的蛋白。

第4A及4B圖是依據本揭示內容實施例5所繪示的線性圖，分別闡述CLEC2.Fc蛋白對H5N1感染的預防功效。第4A圖：以hIgG1或CLEC2.Fc蛋白預處理(pretreatment)後，經H5N1感染之小鼠的體重改變。第4B圖：以hIgG1或CLEC2.Fc蛋白預處理後，經H5N1感染之小鼠的存活率。每組N=9。

無

               序列表
          <![CDATA[<110> 中央研究院]]>
          <![CDATA[<120> CLEC2融合蛋白及其用途]]>
          <![CDATA[<130> P4149-TW]]>
          <![CDATA[<150> PCT/US63085123]]>
          <![CDATA[<151> 2020-09-29]]>
          <![CDATA[<160> 20]]>
          <![CDATA[<170> BiSSAP 1.3]]>
          <![CDATA[<210> 1]]>
          <![CDATA[<211> 179]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_CLEC2的胞外域]]>
          <![CDATA[<400> 1]]>
          Leu Gly Ile Trp Ser Val Met Gln Arg Asn Tyr Leu Gln Gly Glu Asn 
          1               5                   10                  15      
          Glu Asn Arg Thr Gly Thr Leu Gln Gln Leu Ala Lys Arg Phe Cys Gln 
                      20                  25                  30          
          Tyr Val Val Lys Gln Ser Glu Leu Lys Gly Thr Phe Lys Gly His Lys 
                  35                  40                  45              
          Cys Ser Pro Cys Asp Thr Asn Trp Arg Tyr Tyr Gly Asp Ser Cys Tyr 
              50                  55                  60                  
          Gly Phe Phe Arg His Asn Leu Thr Trp Glu Glu Ser Lys Gln Tyr Cys 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Asp Met Asn Ala Thr Leu Leu Lys Ile Asp Asn Arg Asn Ile Val 
                          85                  90                  95      
          Glu Tyr Ile Lys Ala Arg Thr His Leu Ile Arg Trp Val Gly Leu Ser 
                      100                 105                 110         
          Arg Gln Lys Ser Asn Glu Val Trp Lys Trp Glu Asp Gly Ser Val Ile 
                  115                 120                 125             
          Ser Glu Asn Met Phe Glu Phe Leu Glu Asp Gly Lys Gly Asn Met Asn 
              130                 135                 140                 
          Cys Ala Tyr Phe His Asn Gly Lys Met His Pro Thr Phe Cys Glu Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Lys His Tyr Leu Met Cys Glu Arg Lys Ala Gly Met Thr Lys Val Asp 
                          165                 170                 175     
          Gln Leu Pro 
          <![CDATA[<210> 2]]>
          <![CDATA[<211> 227]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_Fc域]]>
          <![CDATA[<400> 2]]>
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                      20                  25                  30          
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
                  35                  40                  45              
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
              50                  55                  60                  
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
                          85                  90                  95      
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 
                      100                 105                 110         
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 
              130                 135                 140                 
          Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
                          165                 170                 175     
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                  195                 200                 205             
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
              210                 215                 220                 
          Pro Gly Lys 
          225         
          <![CDATA[<210> 3]]>
          <![CDATA[<211> 22]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_訊息肽]]>
          <![CDATA[<400> 3]]>
          Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Leu Pro Gly Ala Arg Cys 
                      20          
          <![CDATA[<210> 4]]>
          <![CDATA[<211> 19]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_訊息肽]]>
          <![CDATA[<400> 4]]>
          Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 
          1               5                   10                  15      
          Val His Ser 
          <![CDATA[<210> 5]]>
          <![CDATA[<211> 5]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_連接子]]>
          <![CDATA[<400> 5]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5   
          <![CDATA[<210> 6]]>
          <![CDATA[<211> 5]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_連接子]]>
          <![CDATA[<400> 6]]>
          Glu Pro Lys Ser Ser 
          1               5   
          <![CDATA[<210> 7]]>
          <![CDATA[<211> 11]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_連接子]]>
          <![CDATA[<400> 7]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210> 8]]>
          <![CDATA[<211> 436]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_CLEC2.Fc融合蛋白]]>
          <![CDATA[<400> 8]]>
          Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 
          1               5                   10                  15      
          Val His Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 
                      20                  25                  30          
          Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 
                  35                  40                  45              
          Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 
              50                  55                  60                  
          Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 
                          85                  90                  95      
          Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 
                      100                 105                 110         
          Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 
                  115                 120                 125             
          Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 
              130                 135                 140                 
          Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 
                          165                 170                 175     
          Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 
                      180                 185                 190         
          Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 
                  195                 200                 205             
          Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 
              210                 215                 220                 
          Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala 
                          245                 250                 255     
          Ser Leu Gly Ile Trp Ser Val Met Gln Arg Asn Tyr Leu Gln Gly Glu 
                      260                 265                 270         
          Asn Glu Asn Arg Thr Gly Thr Leu Gln Gln Leu Ala Lys Arg Phe Cys 
                  275                 280                 285             
          Gln Tyr Val Val Lys Gln Ser Glu Leu Lys Gly Thr Phe Lys Gly His 
              290                 295                 300                 
          Lys Cys Ser Pro Cys Asp Thr Asn Trp Arg Tyr Tyr Gly Asp Ser Cys 
          305                 310                 315                 320 
          Tyr Gly Phe Phe Arg His Asn Leu Thr Trp Glu Glu Ser Lys Gln Tyr 
                          325                 330                 335     
          Cys Thr Asp Met Asn Ala Thr Leu Leu Lys Ile Asp Asn Arg Asn Ile 
                      340                 345                 350         
          Val Glu Tyr Ile Lys Ala Arg Thr His Leu Ile Arg Trp Val Gly Leu 
                  355                 360                 365             
          Ser Arg Gln Lys Ser Asn Glu Val Trp Lys Trp Glu Asp Gly Ser Val 
              370                 375                 380                 
          Ile Ser Glu Asn Met Phe Glu Phe Leu Glu Asp Gly Lys Gly Asn Met 
          385                 390                 395                 400 
          Asn Cys Ala Tyr Phe His Asn Gly Lys Met His Pro Thr Phe Cys Glu 
                          405                 410                 415     
          Asn Lys His Tyr Leu Met Cys Glu Arg Lys Ala Gly Met Thr Lys Val 
                      420                 425                 430         
          Asp Gln Leu Pro 
                  435     
          <![CDATA[<210> 9]]>
          <![CDATA[<211> 6]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_連接子]]>
          <![CDATA[<400> 9]]>
          Gly Gly Pro Gly Gly Pro 
          1               5       
          <![CDATA[<210> 10]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_連接子]]>
          <![CDATA[<400> 10]]>
          Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Gly Pro 
          1               5                   
          <![CDATA[<210> 11]]>
          <![CDATA[<211> 12]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_連接子]]>
          <![CDATA[<400> 11]]>
          Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Gly Pro 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210> 12]]>
          <![CDATA[<211> 15]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_連接子]]>
          <![CDATA[<400> 12]]>
          Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Gly Pro 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210> 13]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_連接子]]>
          <![CDATA[<400> 13]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 14]]>
          <![CDATA[<211> 15]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_連接子]]>
          <![CDATA[<400> 14]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210> 15]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_連接子]]>
          <![CDATA[<400> 15]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Gly Ser 
                      20  
          <![CDATA[<210> 16]]>
          <![CDATA[<211> 25]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_連接子]]>
          <![CDATA[<400> 16]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
                      20                  25  
          <![CDATA[<210> 17]]>
          <![CDATA[<211> 1308]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_編碼CLEC2.Fc的DNA]]>
          <![CDATA[<400> 17]]>
          atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactccgac      60
          aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc     120
          ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc     180
          gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc     240
          gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt     300
          gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc     360
          aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg     420
          cagccccgag agccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac     480
          caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg     540
          gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac     600
          ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac     660
          gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc     720
          tccctgtctc cgggtaaagg aggcggtgga tctggcggag gtggagctag cgggatttgg     780
          tctgtcatgc agcgcaatta cctacaaggt gagaatgaaa atcgcacagg aactctgcaa     840
          caattagcaa agcgcttctg tcaatatgtg gtaaaacaat cagaactaaa gggcactttc     900
          aaaggtcata aatgcagccc ctgtgacaca aactggagat attatggaga tagctgctat     960
          gggttcttca ggcacaactt aacatgggaa gagagtaagc agtactgcac tgacatgaat    1020
          gctactctcc tgaagattga caaccggaac attgtggagt acatcaaagc caggactcat    1080
          ttaattcgtt gggtcggatt atctcgccag aagtcgaatg aggtctggaa gtgggaggat    1140
          ggctcggtta tctcagaaaa tatgtttgag tttttggaag atggaaaagg aaatatgaat    1200
          tgtgcttatt ttcataatgg gaaaatgcac cctaccttct gtgagaacaa acattattta    1260
          atgtgtgaga ggaaggctgg catgaccaag gtggaccaac taccttaa                 1308
          <![CDATA[<210> 18]]>
          <![CDATA[<211> 1255]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_SARS-CoV-2棘蛋白]]>
          <![CDATA[<400> 18]]>
          Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln 
                      20                  25                  30          
          His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg 
                  35                  40                  45              
          Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn 
                          85                  90                  95      
          Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln 
                      100                 105                 110         
          Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys 
                  115                 120                 125             
          Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met 
              130                 135                 140                 
          Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser 
                          165                 170                 175     
          Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly 
                      180                 185                 190         
          Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp 
                  195                 200                 205             
          Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu 
              210                 215                 220                 
          Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr 
                          245                 250                 255     
          Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile 
                      260                 265                 270         
          Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys 
                  275                 280                 285             
          Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn 
              290                 295                 300                 
          Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser 
                          325                 330                 335     
          Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr 
                      340                 345                 350         
          Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly 
                  355                 360                 365             
          Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala 
              370                 375                 380                 
          Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly 
          385                 390                 395                 400 
          Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe 
                          405                 410                 415     
          Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser 
                      420                 425                 430         
          Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu 
                  435                 440                 445             
          Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly 
              450                 455                 460                 
          Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp 
          465                 470                 475                 480 
          Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val 
                          485                 490                 495     
          Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly 
                      500                 505                 510         
          Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn 
                  515                 520                 525             
          Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg 
              530                 535                 540                 
          Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp 
          545                 550                 555                 560 
          Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys 
                          565                 570                 575     
          Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser 
                      580                 585                 590         
          Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr 
                  595                 600                 605             
          Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr 
              610                 615                 620                 
          Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu 
          625                 630                 635                 640 
          His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile 
                          645                 650                 655     
          Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys 
                      660                 665                 670         
          Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala 
                  675                 680                 685             
          Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile 
              690                 695                 700                 
          Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys 
          705                 710                 715                 720 
          Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu 
                          725                 730                 735     
          Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile 
                      740                 745                 750         
          Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys 
                  755                 760                 765             
          Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe 
              770                 775                 780                 
          Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile 
          785                 790                 795                 800 
          Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met 
                          805                 810                 815     
          Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile 
                      820                 825                 830         
          Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr 
                  835                 840                 845             
          Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala 
              850                 855                 860                 
          Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe 
          865                 870                 875                 880 
          Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn 
                          885                 890                 895     
          Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala 
                      900                 905                 910         
          Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly 
                  915                 920                 925             
          Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu 
              930                 935                 940                 
          Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn 
          945                 950                 955                 960 
          Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp 
                          965                 970                 975     
          Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln 
                      980                 985                 990         
          Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala 
                  995                 1000                1005            
          Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe 
              1010                1015                1020                
          Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala Pro His 
          1025                1030                1035                1040
          Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn 
                          1045                1050                1055    
          Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Glu Gly Lys Ala Tyr Phe Pro 
                      1060                1065                1070        
          Arg Glu Gly Val Phe Val Phe Asn Gly Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gln 
                  1075                1080                1085            
          Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val 
              1090                1095                1100                
          Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr 
          1105                1110                1115                1120
          Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys 
                          1125                1130                1135    
          Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser 
                      1140                1145                1150        
          Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu 
                  1155                1160                1165            
          Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu 
              1170                1175                1180                
          Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu 
          1185                1190                1195                1200
          Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Leu Leu 
                          1205                1210                1215    
          Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Ala Cys Ser Cys 
                      1220                1225                1230        
          Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys 
                  1235                1240                1245            
          Gly Val Lys Leu His Tyr Thr 
              1250                1255
          <![CDATA[<210> 19]]>
          <![CDATA[<211> 222]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_受體結合域]]>
          <![CDATA[<400> 19]]>
          Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn 
          1               5                   10                  15      
          Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser Val 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser 
                  35                  40                  45              
          Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln 
                          85                  90                  95      
          Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Met 
                      100                 105                 110         
          Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser Thr 
                  115                 120                 125             
          Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg 
              130                 135                 140                 
          Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp Tyr 
                          165                 170                 175     
          Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val 
                      180                 185                 190         
          Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro 
                  195                 200                 205             
          Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe 
              210                 215                 220         
          <![CDATA[<210> 20]]>
          <![CDATA[<211> 71]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成的_ACE2結合域]]>
          <![CDATA[<400> 20]]>
          Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile 
                      20                  25                  30          
          Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala 
                  35                  40                  45              
          Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr 
              50                  55                  60                  
          Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr 
          65                  70      
          

Claims (6)

1. 一種融合蛋白於製備一藥物的用途，其中該藥物是用以治療一個體之嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2感染，且該融合蛋白是由序列編號：8的胺基酸序列所組成。
2. 如請求項1所述之用途，其中該個體是一人類，且該藥物投予至該個體是劑量是每公斤個體體重10微克到每公斤個體體重10毫克。
3. 如請求項2所述之用途，其中該藥物投予至該個體是劑量是每公斤個體體重0.1毫克到每公斤個體體重1毫克。
4. 一種融合蛋白於製備一藥物的用途，其中該藥物是用以治療一個體之流行性感冒病毒感染，且該融合蛋白是由序列編號：8的胺基酸序列所組成。
5. 如請求項4所述之用途，其中該個體是一人類，且該藥物投予至該個體是劑量是每公斤個體體重10微克到每公斤個體體重10毫克。
6. 如請求項5所述之用途，其中該藥物投予至該個體是劑量是每公斤個體體重0.1毫克到每公斤個體體重1毫克。