MXPA06003666A - Gen 1 eliminado en tumores cerebrales malignos como marcador clinico, y usos del mismo. - Google Patents

Abstract

La presente invencion provee metodos para determinar la actividad estrogenica de un compuesto, que incluye poner en contacto un sistema sensible a estrogeno que tiene un gen bajo el control de una secuencia reguladora de DMBT1 con un compuesto de prueba, y determinar como el compuesto de prueba afecta la expresion del gen; la invencion provee ademas la determinacion de la actividad progestogenica de un compuesto, que incluye poner en contacto un sistema sensible a estrogeno y progesterona que tiene un gen bajo el control de una secuencia reguladora de DMBT1 con una actividad estrogenica y un compuesto de prueba y determinar como el compuesto de prueba afecta la expresion del gen; se proveen tambien acidos nucleicos y sistemas basados en celulas que incluyen una porcion de la secuencia reguladora de DMBT1 util para estos metodos.

Description

GEN 1 ELIMINADO EN TUMORES CEREBRALES MALIGNOS COMO MARCADOR CLÍNICO. Y USOS DEL MISMO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos, composiciones y compuestos útiles para la identificación y el monitoreo de compuestos que tienen un efecto estrogénico o progestogénico. En los presentes métodos, se usan secuencias reguladoras y codificantes del gen 1 eliminado en tumores cerebrales malignos (DMBT1 ), para determinar las actividades estrogénicas y progestogénicas de compuestos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La terapia de reemplazo de hormonas (HRT) representa un área de gran importancia en medicina preventiva, y afecta ampliamente al bienestar personal así como a la salud pública. Se ha usado la HRT por muchas razones, que incluyen el tratamiento de menopausia, histerectomía parcial o completa y amenorrea. Después de la menopausia, se dan con frecuencia estrógenos como una HRT para tratar o prevenir indicaciones clínicas tales como síntomas vasomotores moderados a severos y atrofia vulvovaginal y osteoporosis, y se está poniendo a prueba en enfermedad de Alzheimer y cáncer de colon. En algunas condiciones amenorreicas, puede administrarse estrógeno para restaurar la menstruación. Aunque la HRT que usa estrógeno tiene muchos beneficios para la salud comprobados, se asocia también con algunos efectos no deseables. Estos efectos incluyen un riesgo incrementado ( de cánceres uterinos y mamarios, sensibilidad de la mama y hemorragia uterina. Se han usado también terapias co-administrativas para reducir estos efectos secundarios. Para compensar el riesgo incrementado de cáncer endometrial, por ejemplo, se co-administran con frecuencia progestinas con estrógeno durante la HRT. Infortunadamente, pueden surgir otras complicaciones usando estos procedimientos co-terapéuticos. Por ejemplo, la terapia con progestina no se considera comúnmente como adecuada para mujeres sin un útero, y estudios recientes han demostrado riesgos incrementados de cánceres y ataques bajo el régimen de HRT con estrógeno y progestina. Los avances más recientes en el área de HRT incluyen el uso de compuestos denominados moduladores selectivos del receptor de estrógeno (SERMs) como alternativas al estrógeno en HRT. Los SERMs son fármacos que pueden proveer los efectos benéficos del estrógeno, mientras que evitan otros efectos no deseables. Por ejemplo, un SERM puede proveer una actividad agonista de estrógeno deseable sobre tejido óseo, mientras que provee una actividad antagonista sobre el tejido uterino. En la actualidad, dos SERMs están clínicamente disponibles. El SERM tamoxifeno se usa para la prevención y el tratamiento de cáncer de mama, y el SERM raloxifeno se usa para la prevención y el tratamiento de osteoporosis. Estos fármacos, y otros SERMs, se unen típicamente al receptor de estrógeno y afectan la actividad del mismo. Otra clase de compuestos que pueden ser útiles en regímenes de HRT incluye los moduladores del receptor de progesterona (PRMs), cuyos ejemplos incluyen mifepristona y onapristona. Se ha considerado a los PRMs como adyuvantes a la terapia de reemplazo de estrógeno y también para tratamiento independiente. Los PRMs son compuestos que se unen típicamente al receptor de progesterona y modulan la actividad del receptor, afectando de esta manera la actividad celular. Una de las propiedades importantes de los PRMs, estriba en sus efectos antiproliferativos. Por ejemplo, la administración de un PRM en la fase folicular del ciclo menstrual puede inhibir la actividad proliferativa endometrial. Los PRMs tienen muchos usos potenciales, que incluyen tratamiento de endometriosis y fibroides uterinos, contracepción y terapia de reemplazo de hormonas. A pesar de los avances en la investigación de la HRT, existe una gran necesidad por SERMs y PRMs novedosos. La identificación y el uso de SERMs y PRMs novedosos pueden proveer una terapia que sea más adecuada para condiciones particulares o para tratamiento preventivo. Estos compuestos pueden proveer potencialmente los beneficios de la terapia de reemplazo de estrógeno sin los riesgos y efectos secundarios asociados con las terapias comunes. Por ejemplo, los SERMs novedosos pueden ser capaces de promover la actividad en tejidos objetivo tales como los tejidos óseo y neural, mientras que dejan sin afectar tejido no objetivo, tales como el tejido endometrial y el tejido mamario. Además, existe una gran necesidad de composiciones y métodos novedosos útiles para la identificación de SERMs y PRMs novedosos. Estas composiciones y métodos pueden ser también valiosos para monitorear clínicamente la actividad de SERMs y PRMs conocidos o experimentales. De preferencia, dichos métodos facilitarán la determinación rápida y precisa de compuestos que son SERMs y PRMs. Claramente, marcadores útiles para la determinación de actividad estrogénica o progestogénica (demostrada por SERMs y PRMs, respectivamente), representarían una contribución valiosa a la técnica. Dichos marcadores pueden llevar en forma ventajosa al desarrollo de nuevos compuestos para su uso en terapia de reemplazo de hormonas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Como se describe en la presente, la invención provee compuestos, composiciones y métodos útiles para identificar o seleccionar compuestos que tienen una actividad estrogénica. Una base de la invención, es el hallazgo de que un compuesto que tiene actividad estrogénica es capaz de sobrerregular la expresión del gen de DMBT1. Por lo tanto, en un aspecto, se provee un método que es útil para identificar un compuesto de prueba que tiene una actividad estrogénica. El método incluye los pasos de (a) poner en contacto un sistema sensible a estrógeno con un compuesto de prueba; (b) obtener información respecto a la expresión de un gen que es controlado por una secuencia reguladora de DMBT1 del sistema sensible a estrógeno; y (c) usar la información del paso (b) para determinar si el compuesto de prueba tiene una actividad estrogénica. En algunos casos, la expresión del gen se mide respecto a un control y un incremento en la expresión del gen se correlaciona con el compuesto de prueba que tiene una actividad estrogénica. El sistema sensible a estrógeno, del cual se mide la expresión génica, puede ser un animal, una porción de un animal, tal como un tejido sensible a estrógeno, o una célula. El gen controlado por la secuencia reguladora de DMBT1 puede ser la DMBT1 misma, o puede ser un gen heterólogo enlazado operablemente a la secuencia reguladora de DMBT1. En otro aspecto, la invención provee un método para determinar si un compuesto de prueba tiene una actividad estrogénica selectiva. En este método, dos sistemas sensibles a estrógeno diferentes se ponen en contacto con el mismo compuesto de prueba, y se mide la expresión génica, que es controlada por una secuencia reguladora de DMBT1 , de cada sistema. El compuesto de prueba tiene actividad estrogénica selectiva, si uno de los sistemas sensibles a estrógeno muestra un incremento en expresión génica y el otro muestra una disminución o ninguna expresión. En otro aspecto, puede determinarse la actividad estrogénica selectiva poniendo en contacto dos sistemas sensibles a estrógeno diferentes, y midiendo la expresión génica controlada por una secuencia reguladora de DMBT1 en un sistema, y midiendo una indicación diferente de actividad estrogénica (tal como crecimiento de tejido) en el otro sistema. El compuesto de prueba tiene actividad estrogénica selectiva, si uno de los sistemas sensibles a estrógeno muestra, por ejemplo, ningún incremento en expresión génica, y el otro muestra, por ejemplo, una respuesta positiva, tal como crecimiento de tejido. En otro aspecto, la invención provee un método para determinar la actividad progestogénica o actividad anti-progestogénica de un compuesto. En este método, un sistema sensible a estrógeno y progesterona se pone en contacto con un compuesto estrogénico y también se pone en contacto con un compuesto de prueba. La expresión de un gen bajo el control de una secuencia reguladora de DMBT1 se mide del sistema que se ha puesto en contacto con los compuestos estrogénico y de prueba. La información obtenida de la medición de la expresión génica puede compararse con un estándar, y puede usarse para determinar si el compuesto de prueba tiene una actividad progestogénica o una actividad anti-progestogénica. En otros aspectos, la invención provee una forma de monitorear actividades estrogénicas y progestogénicas en un sujeto. El método incluye los pasos de tratar un sujeto, obtener información respecto a la expresión de DMBT1 del sujeto tratado, y usar la información sobre la expresión para determinar una actividad estrogénica o una actividad progestogénica. En otro aspecto, la invención provee un sistema sensible a estrógeno que incluye un ácido nucleico que tiene una secuencia reguladora de DMBT1 enlazada operablemente a un gen reportero. El sistema sensible a estrógeno puede ser una célula que incluye un ácido nucleico exógeno, tal como un plásmido, que tiene una secuencia reguladora de DMBT1 enlazada operablemente a un gen reportero. La célula expresa típicamente un receptor de estrógeno funcional, que puede expresarse endógenamente o exógenamente. En un aspecto relacionado, la invención provee también un sistema sensible a estrógeno y progesterona que incluye un ácido nucleico que tiene una secuencia reguladora de DMBT1 enlazada operablemente a un gen reportero. Las células de este sistema expresan típicamente un receptor de estrógeno funcional y un receptor de progesterona funcional. En otro aspecto, la invención provee secuencias de ácido nucleico heterólogas aisladas que incluyen una porción de la secuencia reguladora de DMBT1 enlazada operablemente a un gen reportero. En particular, los ácidos nucleicos heterólogos aislados útiles tienen una secuencia reguladora de DMBT1 que incluye por lo menos los nucleótidos 840 a 872 de SEQ ID NO: 1 enlazados operablemente a un gen reportero. Estos ácidos nucleicos pueden permitir la sobrerregulación del gen reportero en respuesta a una señal estrogénica. Otros ácidos nucleicos heterólogos aislados útiles incluyen una secuencia reguladora de DMBT1 que consiste de todos los nucleótidos 1 a 2259 de SEQ ID NO: 1 , o una porción o variante de los mismos, incluyendo los nucleótidos 840 a 872 de SEQ ID NO: 1, enlazados operablemente a un gen reportero.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. Efectos de estrona, SERMs y un antagonista de estrógeno, sobre el peso uterino en ratas (E: estrona, T: tamoxifeno, R: raloxifeno, e l: IC1 82780). Figura 2. Efectos de estrona, SERMs y un antagonista de estrógeno, sobre la expresión de DMBT1 en el útero de ratas. Figura 3A. Efectos de estrona co-administrada con SERMs y un antagonista de estrógeno, sobre la expresión de DMBT1 en el útero de ratas. Figura 3B. Efectos de concentraciones crecientes de estrógeno o progestina (MPA), sobre la expresión de DMBT1 en el útero de ratas. Figura 4. Efectos de estrona y SERMs, sobre el peso uterino en ratas (E: estrona; 5RA-DCC: 5 ?-aril-5,11dihidro-cromeno(4,3-c)cromeno; y 5SA-DCC: 5S-aril-5,11dihidro-cromeno(4,3-c)cromeno). Figura 5. Efectos de estrona y SERMs, sobre la expresión de DMBT1 en el útero de ratas. Figura 6. Inducción estrogénica de construcciones de reportero de Iuciferasa/DMBT1. Las construcciones de reportero analizadas fueron: pDMBT1-1/luc: región de promotor de DMBT1 de -1347 a +41 (triángulo que apunta hacia arriba); pDMBT1-2 (triángulo que apunta hacia abajo)/luc: región de promotor de DMBT1 de -2921 a +41 ; oligo (diamante oscuro) (pDMBTI-3/luc): región de promotor de pDMBTI de -2766 a -2734; pGL3 (cuadro claro): pGL3basic (control); pERE-luc (óvalo oscuro): secuencia de ERE de vitelogenina de pollo; y pTA (cuadro oscuro); pTAbasic (control). Figura 7. Expresión de ARN mensajero de DMBT1 en el endometrio de monos OVX tratados con estrógeno y varios PRMs. (E2: estrógeno; Mif: mifepristona; 17N11-DE: 17ß-N-sustituido-11ß- dimetilaminofenil-estra-4,9-dien-3-ona; 17ß-N-sustituido-11 ß-piperidinilfenil- estra-4,9-dien-3-ona: 17N11-PE). Los resultados se proveen como media +/-desviación estándar. La mayoría de los grupos de prueba fueron, n = 3 monos. * Se refiere a grupos en donde n = 1 , y ** se refiere a grupos en donde n = 2.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la cual esta invención pertenece. Cualquier método, dispositivo y material sustancialmente similar o equivalente a los que se describen en la presente, puede usarse en la práctica o realización de pruebas de la ¡nvención. Las publicaciones y patentes descritas en la presente se proveen solamente para su descripción. Nada en la presente se considerará como una admisión que los inventores no estén intitulando para adelantar cualquier publicación y/o patente, incluyendo cualquier publicación y/o patente citada en la presente.

En esta invención, ciertos términos se usan con frecuencia, los cuales tendrán los significados como se exponen a continuación. Estos términos pueden explicarse también en mayor detalle después en la especificación. Como se usan en la presente, los términos "que comprende", "que contiene" y "que incluye", se usan en su sentido manifiesto no limitativo. "Actividad estrogénica" se refiere a la capacidad para producir un efecto, o más de un efecto, sobre un sistema biológico, que asemeja un efecto causado por estrógeno. "Estrógeno" se refiere a estrógenos naturales (que incluyen, pero no están limitados a, estradiol, estrona y estriol) y estrógenos sintéticos (que incluyen, pero no están limitados a, etinil estradiol, dietilestilbesterol y mestranol). Dicho efecto por estrógeno se conoce típicamente como una "actividad agonista de estrógeno". Un compuesto que tiene actividad estrogénica imita por lo menos un efecto de estrógeno y produce en general el efecto por asociación con el receptor de estrógeno para iniciar el efecto. Se entiende que en un organismo complejo tal como un mamífero, el estrógeno tiene actividad sobre diferentes tipos de tejido y, por lo tanto, cualquier actividad particular de estrógeno sobre un tejido puede ser referida como una actividad estrogénica. Los compuestos referidos como SERMs tienen típicamente una actividad estrogénica. Un "efecto estrogénico" se refiere a una respuesta dentro de una célula, tejido u organismo que ocurre cuando el estrógeno se une a su receptor. Ejemplos de efectos estrogénicos incluyen, independientemente, la translocación de receptores de estrógeno hacia núcleos; expresión inducida de genes sensibles a estrógeno, incluyendo DMBT1 ; intensificación de la producción de óxido nítrico; proliferación celular que incluye, por ejemplo, proliferación de células endoteliales de mama y células endometriales; diferenciación y crecimiento celular que incluye, por ejemplo, diferenciación y crecimiento intensificados de neuritas; crecimiento de tejido y crecimiento de tejido endometrial; densidad incrementada de minerales óseos; cambios en componentes sanguíneos que incluyen incrementos en lipoproteína de alta densidad (HDL), colesterol y triglicéridos, decrementos en lipoproteína de baja densidad (LDL), colesterol y coagulación intensificada; e inflamación incrementada. "Sistema sensible a estrógeno" se usa en su sentido más amplio para referirse a un conjunto de células que inicia un cambio en expresión génica o un cambio en fosforilación de proteínas, por ejemplo, en respuesta a estrógeno. Un "sistema sensible a estrógeno", como se usa en la presente, se refiere a células individuales, conjuntos de células, y se refiere por lo tanto a tejidos, órganos o incluso organismos multicelulares complejos tales como animales que son sensibles a estrógeno, y en donde puede ponerse a prueba la sensibilidad a estrógeno. Una "respuesta estrogénica selectiva" se demuestra cuando un compuesto tiene diferentes actividades sobre dos sistemas diferentes sensibles a estrógeno o sobre dos porciones diferentes de un sistema sensible a estrógeno. Los compuestos que promueven una respuesta a estrógeno selectiva son referidos comúnmente como SERMs, de los cuales algunos ejemplos se proveen en la presente. Sin embargo, otros compuestos no conocidos comúnmente como SERMs, pero que no obstante puede mostrarse poseen una actividad estrogénica, pueden ser también capaces de promover una respuesta estrogénica selectiva. "Actividad anti-estrogénica" se refiere a la capacidad para producir un efecto que es el opuesto del causado por estrógeno, y/o produce un efecto que se opone a (reduce) un efecto producido por estrógeno. Los compuestos con "actividad anti-estrogénica" incluyen, por ejemplo, 1) compuestos que reducen la expresión de un gen o reducen el crecimiento de un tejido, en donde el estrógeno incrementa normalmente la producción del gen o incrementa el crecimiento del tejido, 2) compuestos que incrementan la expresión de un gen o incrementan el crecimiento de un tejido, en donde el estrógeno reduce normalmente la producción del gen o reduce el crecimiento de un tejido, o 3) compuestos que reducen la cantidad de una respuesta estrogénica cuando el compuesto se administra concomitantemente con estrógeno. Muchos compuestos conocidos denominados "antagonistas de estrógeno", tienen "actividad anti-estrogénica". "Actividad progestogénica" se refiere a un efecto, o más de un efecto, sobre un sistema biológico, que asemeja un efecto causado por progesterona. Como se usa en la presente, progesterona se refiere a progesterona y sus análogos sintéticos (progestinas). Dicho efecto por progesterona es típicamente una "actividad agonista de progesterona". Un compuesto que tiene actividad progestogénica imita por lo menos un efecto de progesterona y produce en general el efecto por asociación con el receptor de progesterona para iniciar el efecto. Se entiende que en un organismo complejo tal como un animal, de preferencia un mamífero, la progesterona tiene actividad sobre diferentes tipos de tejido y, por lo tanto, cualquier actividad particular de progesterona sobre un tejido puede ser referida como actividad progestogénica. "Actividad anti-progestogénica" se refiere a la capacidad para producir un efecto que es el opuesto al causado por progesterona, y/o produce un efecto que se opone a (reduce) un efecto producido por progesterona. En general, los compuestos que tienen una actividad anti-progestogénica pueden asociarse con ei receptor de progesterona y alterar su actividad. Algunos compuestos o tratamientos anti-progestogénicos pueden reducir también el efecto de estrógeno sobre un sistema. Por ejemplo, algunos compuestos anti-progestogénicos pueden asociarse con el receptor de progesterona y reducir la expresión de un compuesto o reducir el crecimiento de un tejido que es inducido por estrógeno. Muchos compuestos conocidos denominados "antagonistas de progesterona" pueden bloquear los efectos de un compuesto que tiene actividad progestogénica, y tienen actividad anti-progestogénica. Los compuestos referidos como "moduladores del receptor de progesterona" (PRMs), pueden unirse al receptor de progesterona y alterar la actividad del mismo. En algunos casos, los PRMs pueden modular los efectos de compuestos estrogénicos y progestogénicos sobre un sistema biológico. Algunos PRMs pueden tener actividad anti-progestogénica, tal como actividad antagonista de progesterona. "Sistema sensible a progesterona" se usa en su sentido más amplio y se refiere a un conjunto de células que inician un cambio en expresión génica o un cambio en fosforilación de proteínas, por ejemplo, en respuesta a progesterona. Un "sistema sensible a progesterona", como se usa en la presente, se refiere a células individuales, conjuntos de células, y se refiere por lo tanto a tejidos, órganos o incluso organismos multicelulares complejos tales como animales que son sensibles a estrógeno, y en donde puede ponerse a prueba la sensibilidad a progesterona. "Sistema sensible a estrógeno y progesterona" se usa en su sentido más amplio y se refiere a un conjunto de células que inician un cambio en expresión génica o un cambio en fosforilación de proteínas, por ejemplo, en respuesta a estrógeno y progesterona. Un "sistema sensible a estrógeno y progesterona", como se usa en la presente, se refiere a células individuales, conjuntos de células, y se refiere por lo tanto a tejidos, órganos o incluso organismos multicelulares complejos tales como animales que son sensibles a estrógeno y progesterona, y en donde puede ponerse a prueba la sensibilidad a estrógeno y progesterona. Un "gen de DMBT1", se refiere a un gen que (1) codifica para una proteína que tiene una secuencia que tiene más de aproximadamente 60%, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95% de identidad de secuencias de aminoácidos, con la proteína de DMBT1 de humano (Mollenhauer eí al. (1997) Nat. Genet. 17: 32-39; No. de acceso de proteínas del GenBank: NP_015568.1); (2) codifica para una proteína capaz de mostrar unión a anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales y policlonales, producidos contra una proteína de DMBT1 , tal como la proteína de DMBT1 de humano descrita en la presente; (3) híbrida específicamente bajo condiciones de hibridación severa con una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia que tiene más de aproximadamente 60%, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95% de identidad de secuencias de nucleótidos, con el ADNc de DMBT1 de humano (No. de acceso de nucleótidos del GenBank: NM_007329.1); o (4) puede ser amplificada por iniciadores que hibridan específicamente bajo condiciones de hibridación severa con un ADNc de DMBT1 , tal como el ADNc de DMBT1 de humano descrito anteriormente. Condiciones de hibridación severa son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989)). Un "gen de DMBT1" incluye ortólogos de DMBT1 que se han identificado en humano (números de acceso del GenBank NM_017579 y AJ243212), rata (número de acceso del GenBank U32681, 86% de identidad de nucleótidos con la secuencia de humano), ratón (número de acceso del GenBank U37438, 89% de identidad con la secuencia de humano), vaca (BF600097, 87% de identidad), y otros animales. El gen ha sido nombrado también como glucoproteína (GP) 340, CRP-ductina, hensina y ebnerina.

Una "secuencia reguladora de DMBT1" se refiere a una secuencia de ácido nucleico del gen de DMBT1 que puede controlar la expresión del marco de lectura abierto de DMBT1 (o un ortólogo de DMBT1) en respuesta a una señal estrogénica. Con relación a aspectos de la secuencia reguladora de DMBT1 , una secuencia de 3715 nucleótidos de la región 5' del gen de DMBT1 de humano es provista por SEQ ID NO: 1 (No. de acceso de EMBL AJ271916) y mostrada en el cuadro 2. Las posiciones de nucleótidos de la región reguladora 5' de DMBT1 son referidas en la presente respecto al primer nucleótido del codón de inicio de DMBT1 (+1) y la posición de acuerdo a la numeración de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 en el cuadro 2. Ejemplos de secuencias reguladoras de DMBT1 se discuten más adelante. Como se usa en la presente, una molécula de ácido nucleico "variante" de la invención, es una molécula de ácido nucleico que tiene por lo menos 80%, de preferencia por lo menos aproximadamente 90%, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 95%, pero menos de 100%, de homología o identidad de secuencias de nucleótidos contiguos con la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de tipo silvestre correspondiente. Ácidos nucleicos variantes incluyen bases de nucleótidos no presentes en la molécula de ácido nucleico de tipo silvestre correspondiente, tales como 5', 3' o deleciones o adiciones internas respecto a la molécula de ácido polinucleico de tipo silvestre correspondiente. Los ácidos polinucleicos variantes de la invención, son secuencias reguladoras de DMBT1 que son capaces de promover la expresión de DMBT1 en respuesta a una señal estrogénica. "Heterólogo" se refiere a un polinucleótido o polipéptido no presente en forma nativa en las células hospederas, o producido por las mismas. Se entiende que no se pretende que la terminología usada en la presente limite el alcance de la presente invención. Debe notarse que como se usa en la presente y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una" y "la" incluyen referencias plurales, a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. De esta manera, por ejemplo, una referencia a "una célula" es una referencia a una o más células, e incluye equivalentes de la misma conocidos por los expertos en la técnica, etc. En un aspecto general, esta invención provee métodos, composiciones y compuestos útiles para la identificación y/o el monitoreo de compuestos y tratamientos que tienen o promueven una actividad estrogénica. La invención se basa por lo menos en parte en el descubrimiento de que compuestos que tienen una actividad estrogénica, pueden sobrerregular la expresión génica controlada por la secuencia reguladora de DMBT1 , tal como la expresión del gen de DMBT1 mismo, o de un gen reportero bajo el control de una secuencia reguladora de DMBT1. En una modalidad relacionada, la invención puede usarse para identificar compuestos que no sobrerregulan, o subregulan, la expresión génica controlada por la secuencia reguladora de DMBT1 y carecen por lo tanto de una actividad estrogénica, o tienen una actividad anti-estrogénica, respectivamente. En otro aspecto, esta invención provee métodos, composiciones y compuestos útiles para la identificación y/o el monitoreo de compuestos y tratamientos que tienen o promueven una actividad progestogénica o anti- progestogénica. La invención demuestra que compuestos que tienen una actividad progestogénica o anti-progestogénica, cuando se administran con un compuesto estrogénico, pueden reducir la sobrerregulación mediada por estrógeno de una expresión génica controlada por la secuencia reguladora de DMBT1 en ciertos sistemas sensibles a estrógeno y progesterona. Por ejemplo, un compuesto que tenga una actividad progestogénica puede reducir la sobrerregulación mediada por estrógeno de una expresión génica controlada por la secuencia reguladora de DMBT1 en útero de rata; mientras que un compuesto que tenga una actividad anti-progestogénica puede reducir la sobrerregulación mediada por estrógeno de una expresión génica controlada por la secuencia reguladora de DMBT1 en útero de mono. La invención provee además sistemas sensibles a estrógeno que incluyen una secuencia reguladora de DMBT1 , que son útiles para la identificación y el monitoreo de compuestos que se sospecha tienen actividades estrogénicas o anti-estrogénicas. La invención provee también sistemas sensibles a estrógeno y progesterona que incluyen una secuencia reguladora de DMBT1 , y que son útiles para la identificación y el monitoreo de compuestos que se sospecha tienen actividades progestogénicas o anti- progestogénicas. Se proveen también ácidos nucleicos aislados que tienen una secuencia reguladora de DMBT1 enlazada operablemente a un gen reportero. Las secuencias reguladoras de DMBT1 son capaces de sobrerregular la expresión del gen reportero en respuesta a una señal estrogénica. DMBT1 es una proteína estructuralmente compleja, y su función parece ser igualmente compleja. Los trabajos hasta la fecha han mostrado que interviene en la protección de mucosas y en la diferenciación epitelial. Estas funciones se han definido en diferentes especies y en diferentes tejidos.

Por ejemplo, la expresión de DMBT1 en el pulmón se asocia con respuestas inmunes (Holmskov et al., Proc Nati Acad Sci USA 1999, 96: 10794-10799; Madsen et al., 2003, Eur. J Immunol. 33: 2327-2336; Bikker eí al., 2002, J Biol Chem 277: 32109-32115; Prakobphol eí al., 2000, J Biol Chem. 275: 39860-39866), y en el hígado, riñon e intestino se asocia con diferenciación celular (Bisgaard eí al., 2002 Am J Pathol. 161 : 1187-1198; Vijayakumar eí al., 1999, J Cell Biol. 144: 1057-1067; Cheng et al., 1996, Anat Record 244: 327-343).

No está claro si las dos funciones pueden coexistir siempre en el mismo tejido.

La presente invención demostró que DMBT1 se expresa bajo el control de estrógeno en epitelio uterino, un sitio con ciclos en curso de proliferación y diferenciación, y tiene una función importante en la simulación de la actividad inmune en secreciones de mucosas.

La presente invención demostró que DMBT1 fue sobrerregulada fuertemente por estrógeno en endometrio de mono y en epitelio uterino de rata (figuras 7 y 2). La inducción génica de la expresión de DMBT1 ocurrió rápidamente in vivo, después de un día de tratamiento con estrógeno en ratas (figura 3B). La inducción estrogénica de la expresión de DMBT1 en útero de mono fue inhibida por la mifepristona, un antagonista de progestina (figura 7). La actividad antiproliferativa de la mifepristona en útero de conejo o mono mediada por estrógeno, se correlaciona con trabajos previos (Wolf eí al., 1989, Fértil Steril. 52: 1055-1060; Slayden eí al., 1993, Endocrinology 132: 1845-1856; Chwalisz eí al., 2000, Steroids 65: 741-751). Además, la inducción estrogénica de la expresión de DMBT1 en útero de rata, fue inhibida en una forma dependiente de la dosis por una progestina. Además, el efecto anti-estrogénico de la progestina fue revertido mediante co-tratamiento de las ratas con un antagonista de progestina (figura 3B). Estas propiedades se han observado con otros genes marcadores dependientes de estrógeno, como es el caso del componente 3 del complemento (Lundeen eí al., 2001 , J Steroid Biochem Mol Biol. 78: 137-143). La inducción estrogénica de la expresión de DMBT1 en útero de rata fue inhibida también mediante co-tratamiento de las ratas con IC1 182,780, un antagonista de estrógeno (figura 3A). Además, el tamoxifeno, un SERM que incrementa el espesor epitelial en el útero (Nephew eí al., 2000, Proc Soc Exp Biol Med. 223: 288-294) y considerado como un agonista de estrógeno en ese tejido, estimuló fuertemente la expresión de DMBT1 en útero de rata (figura 2). Lo que es interesante destacar, el SERM raloxifeno estimuló también la expresión de DMBT1 en útero de rata (figura 2), en particular el epitelio uterino (datos no mostrados). El raloxifeno es un antagonista de estrógeno en el útero de rata y, en contraste al tamoxifeno, no tiene efectos estimuladores fuertes por sí mismo sobre el epitelio uterino (Buelke-Sam et al., 1998, Reprod Toxicol. 12: 217-221 ; figura 1). Mediante el uso de inmunohistoquímica, la presente invención demostró que la expresión de DMBT1 se limitó a las células epiteliales del útero de rata (datos no mostrados). Esto se correlaciona con los hallazgos de otros, en donde la DMBT1 se restringió a los epitelios de varios tejidos (Holmskov eí al., citado anteriormente; Mollenhauer, 2000, Cáncer Res. 60: 1704-1710; Bisgaard eí al., citado anteriormente; Vijayakumar eí al., citado anteriormente; Cheng eí al., citado anteriormente; Mollenhauer eí al., 2002, Cáncer Det Prev. 26: 266-274). La presente ¡nvención demostró la utilidad de DMBT1 para la identificación de compuestos que tienen actividades estrogénicas, anti-estrogénicas, progestogénicas o anti-progestogénicas. Ace y Okulicz (Ace eí al., 1998, J Clin Endocrinol Metab. 83: 3569-3573) reportaron que en monos intactos, DMBT1 fue sobrerregulada durante la fase mediada por progesterona del ciclo menstrual en monos intactos, con poca o ninguna expresión detectable en el endometrio durante la fase mediada por estrógeno. Mostraron además que la expresión génica de DMBT1 , que se analizó mediante hibridación in situ, se restringió al estroma endometrial. Recientemente, el mismo grupo publicó un nuevo artículo que indicaba que la expresión de DMBT1 de mono disminuía durante la fase mediada por progesterona (Ace y Okulicz, 2004, Reprod Biol Endocrinol. 2: 54). En una modalidad, la invención provee un método para identificar y/o seleccionar para compuestos que tienen por lo menos una actividad estrogénica. El método incluye los pasos de (a) poner en contacto un sistema sensible a estrógeno con un compuesto de prueba; y (b) detectar ia expresión génica de un gen enlazado operablemente a una secuencia reguladora de DMBT1 del sistema sensible a estrógeno, como una medida de actividad estrogénica. En ciertas modalidades, el paso (b) puede incluir medir la expresión del gen respecto a un control, e identificar además compuestos de prueba que resulten en niveles alterados de expresión génica respecto a métodos llevados a cabo sin el compuesto de prueba. En otra modalidad específica, puede obtenerse información respecto a la expresión de un gen controlado por una secuencia reguladora de DMBT1 , para determinar si un compuesto de prueba no demuestra una actividad estrogénica o demuestra una actividad anti-estrogénica. Para determinar esto, el paso (b) puede incluir además correlacionar ningún incremento detectable o una reducción en expresión génica en respuesta al compuesto de prueba sin actividad estrogénica detectable o una actividad anti-estrogénica, respectivamente. Este método puede ser particularmente útil para identificar compuestos que tienen actividad estrogénica selectiva (SERMs). Por ejemplo, compuestos que se ha mostrado previamente demuestran una actividad estrogénica (por ejemplo, la estimulación de tejido osteoide), pueden ponerse a prueba para determinar si la expresión de un gen controlado por una secuencia reguladora de DMBT1 no es cambiada o, en forma alternativa, subregulada en respuesta al compuesto de prueba en un sistema sensible a estrógeno diferente (tal como tejido endometrial o tejido mamario, o células derivadas de estos tejidos). Mediante el uso de estos métodos, es posible identificar SERMs que tienen actividad estrogénica sobre tejidos particulares. Otros métodos para la identificación de compuestos que tienen actividad estrogénica selectiva, se proveen a continuación. Como se indicó anteriormente, el sistema sensible a estrógeno usado en el presente método puede ser una célula, un conjunto de células que incluye tejidos, u organismos multicelulares complejos que sean sensibles a estrógeno. Típicamente, el sistema sensible a estrógeno incluye células que tienen receptores de estrógeno que hacen que las células sean sensibles a estrógeno, como se define en la presente. Cuando un ligando de un receptor de estrógeno (por ejemplo, un compuesto estrogénico) se une al receptor de estrógeno, puede iniciarse una señal celular. Esta señal puede afectar a la secuencia reguladora de DMBT1, causando sobrerregulación de un gen enlazado a la secuencia reguladora de DMBT1. De esta manera, el sistema sensible a estrógeno incluye células que contienen genes enlazados operablemente a secuencias reguladoras de DMBT1. Métodos para detectar la expresión del gen enlazado se miden como una función del gen particular. En donde DMBT1 es el gen, pueden monitorearse efectos de estrógeno. En donde los genes son genes reporteros, las células comprenden de preferencia construcciones recombinantes que tienen genes reporteros enlazados operablemente a secuencias reguladoras de DMBT1. En forma alternativa, las células son células que expresan endógenamente DMBT1 bajo el control de una secuencia reguladora de DMBT1 endógena. Ejemplos de genes reporteros y métodos para detectar alteraciones en la expresión de genes endógenos de DMBT1, se discuten a continuación. En el sistema sensible a estrógeno, un compuesto de prueba que se une al receptor de estrógeno puede sobrerregular, subregular o no afectar la expresión del gen que es controlado por la secuencia reguladora de DMBT1. Un "receptor de estrógeno", como se define en la presente, se refiere a cualquier proteína que se une a estrógeno, y cuya unión es capaz de incrementar o disminuir la actividad de las vías de señalización de estrógeno. De preferencia, un receptor de estrógeno es un miembro de la familia de genes del receptor nuclear que se une a estrógeno, y que (1) tiene una secuencia de aminoácidos que comparte más de aproximadamente 60%, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95% de identidad de secuencias de aminoácidos, con el receptor 1 de estrógeno de humano (alfa) (Greene eí al. (1986) Science 231 : 1150-4; No. de acceso de proteínas del GenBank: NP_000116), o receptor 2 de estrógeno de humano (beta) (Mossel an eí al. (1996) FEBS Lett 392: 49-53; No. de acceso de proteínas del GenBank: NP_001428); o (2) es capaz de mostrar unión a anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales o policlonales, producidos contra un receptor de estrógeno, tal como el receptor 1 o 2 de estrógeno de humano descrito en la presente. Como se usa en la presente, un receptor de estrógeno incluye el receptor de estrógeno de mamíferos humanos y no humanos, como se describe a continuación. Los receptores de estrógeno de humano, como son referidos en la presente, incluyen las isoformas alfa y beta como se describen en la presente, y cualquier isoforma adicional reconocida por los expertos en la técnica. Un "receptor de estrógeno funcional", como se define en la presente, es un tipo de receptor de estrógeno que es capaz de regular la expresión génica vía la transcripción. En una modalidad específica, el sistema sensible a estrógeno es un animal. Los animales incluyen animales naturales y genéticamente modificados (transgénicos). El animal puede ser un animal humano, tal como un ser humano o un animal veterinario. Los animales veterinarios incluyen, pero no están limitados a, animales no humanos de cualquier tipo, tales como animales domésticos, por ejemplo, perros y gatos; animales de granja, por ejemplo, vacas, ovejas y cerdos; animales de laboratorio, por ejemplo, ratones, ratas, monos, conejos y conejillos de Indias; y animales acuáticos, por ejemplo, peces y tortugas. Pueden usarse también animales transgénicos en los métodos de la invención. Pueden usarse animales transgénicos previamente creados o, en forma alternativa, pueden crearse animales transgénicos que sean útiles en el contexto de la presente invención. Pueden crearse animales transgénicos útiles, introduciendo un transgen en un animal. Técnicas para crear animales transgénicos se conocen en la materia y pueden encontrarse, por ejemplo, en Pinkert, C. A. (ed.) Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, 2a. edición, Academic Press (2003). Alteraciones fenotípicas útiles que pueden proveerse mediante un transgen, incluyen alteraciones en la expresión del receptor de estrógeno o progesterona, o alteraciones que provean receptores de estrógeno y/o progesterona variantes. Otros transgenes útiles proveen una secuencia reguladora de DMBT1 enlazada operablemente a una secuencia de ácido nucleico de interés. Una región reguladora es "enlazada operablemente" a una secuencia de ácido nucleico, si es capaz de controlar fa transcripción de esa secuencia. Genes que pueden ser enlazados operablemente a la región reguladora de DMBT1 incluyen, por ejemplo, secuencias detectables y genes reporteros, los cuales se describen en la presente. Los animales pueden tratarse también quirúrgicamente, farmacéuticamente o de otra manera, para producir un estado deseable en el animal antes de la administración del compuesto de prueba. Dichos tratamientos pueden usarse para eliminar o reducir niveles sistémicos de una o más sustancias de ocurrencia natural en el cuerpo. Por ejemplo, puede tratarse al animal para eliminar o reducir niveles sistémicos de hormonas que tienen un efecto sobre glándulas y órganos reproductivos. Las hormonas que tienen un efecto sobre glándulas y órganos reproductivos, incluyen gonadotropinas, por ejemplo, hormona foliculoestimulante y hormona luteinizante, prolactina, estrógenos, etc. En otros casos, pueden usarse tratamientos para incrementar la presencia de una sustancia de ocurrencia natural en el cuerpo, y pueden ser útiles cuando se examinen los efectos del compuesto de prueba en el animal. Los tratamientos quirúrgicos incluyen, por ejemplo, la remoción de órganos o glándulas que producen hormonas u otras sustancias que pueden inducir efectos autocrinos o paracrinos sobre tejidos y células en el animal. Ejemplos de procedimientos quirúrgicos que pueden proveer estos resultados, incluyen ovariectomía, adrenalectomía y remoción de testículos. En algunos casos, pueden administrarse ciertos fármacos al animal antes del tratamiento del compuesto de prueba o durante el mismo, que reduzcan o eliminen una o más sustancias de ocurrencia natural en el cuerpo. Por lo tanto, en modalidades preferidas de la invención, el sistema sensible a estrógeno es un animal que ha sido tratado para reducir niveles sistémicos de estrógeno. Un tratamiento particularmente útil para reducir niveles sistémicos de estrógeno incluye ovariectomía, y el tratamiento puede incluir opcionalmente la administración, al animal, de un compuesto que reduzca la síntesis de hormonas que tienen un efecto sobre glándulas y órganos reproductivos, como es el caso de la nafarelina. Los métodos descritos en la presente incluyen típicamente un paso de poner en contacto el sistema sensible a estrógeno, por ejemplo, un animal o un grupo aislado de células o tejidos, con un compuesto de prueba.

Los métodos de esta invención pueden llevarse a cabo in vivo o in vitro. En donde el paso de poner en contacto comprende la administración de un compuesto de prueba a un animal, el compuesto de prueba puede administrarse en cualquier forma y modo adecuado. El compuesto de prueba puede prepararse en una variedad de formas, que incluyen una forma licuada, gelificada, liofilizada, dispersada o solidificada. Se anticipa que la forma preferida dependerá de las características físicas del compuesto de prueba. El compuesto de prueba puede administrarse oralmente, intravenosamente, intracerebralmente, intramuscularmente, ¡ntraperitonealmente, ¡ntradérmicamente, subcutáneamente, intranasalmente o intrapulmonarmente. El modo de administración preferido puede depender del animal y el tipo de compuesto de prueba administrado, y será evidente para los expertos en la técnica. El compuesto de prueba se administra típicamente al animal a una dosis y por una duración de tiempo suficiente, para que el compuesto de prueba ejerza su efecto sobre el animal. Esta dosis y duración de administración dependerán también del animal y el tipo de compuesto de prueba administrado. Los efectos del compuesto de prueba pueden medirse en el animal en una variedad de formas. Se entiende que en un organismo complejo tal como un mamífero, el estrógeno tiene actividad sobre diferentes tipos de tejido y, por lo tanto, cualquier actividad particular de estrógeno sobre un tejido puede ser referida como una actividad estrogénica. Los tejidos que son sensibles a estrógeno incluyen tejido reproductivo tal como tejido uterino, por ejemplo, tejido endometrial y miometrial, tejido mamario, tejido osteoide, tejido neural y tejido vascular, tejido renal, tejido hepático, tejido pulmonar, músculo liso y músculo esquelético. Los compuestos que poseen actividad estrogénica pueden tener un efecto sobre uno, algunos o todos estos tejidos. En modalidades preferidas, el sistema sensible a estrógeno incluye tejido uterino, o células que sean de una porción del útero. Puede determinarse un efecto estrogénico, obteniendo una muestra de un tejido sensible a estrógeno que haya sido puesto en contacto con el compuesto de prueba, y midiendo entonces una o más características de la muestra contactada. Puede determinarse también un efecto estrogénico, obteniendo una muestra que incluya un componente producido de un tejido sensible a estrógeno puesto en contacto con el compuesto de prueba. Por ejemplo, puede medirse un componente de lipoproteína presente en una muestra de sangre, después de que a un mamífero se le haya administrado el compuesto de prueba. Estos tipos de muestras de un organismo pueden ser referidos como "muestras biológicas". Una muestra biológica puede incluir tejido, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejido, células y fluidos presentes dentro de un sujeto. La muestra puede ser una "muestra clínica" que sea una muestra derivada de un paciente. Dichas muestras incluyen, pero no están limitadas a, esputo, sangre, células sanguíneas (por ejemplo, glóbulos blancos), fluido amniótico, plasma, semen, médula ósea, y muestras para biopsia de tejido o por punción fina, orina, fluido peritoneal y fluido pleural, o células de los mismos. Las muestras biológicas pueden incluir también secciones de tejidos tales como secciones congeladas tomadas para propósitos histológicos. Ejemplos de muestras biológicas incluyen biopsias de tejido tomadas de los endometrios. Una muestra biológica puede ser referida también como una "muestra del paciente". Una muestra biológica de prueba es la muestra biológica que ha sido objeto de análisis, monitoreo u observación. Una muestra biológica control puede ser un control positivo o negativo para la muestra biológica de prueba. Con frecuencia, la muestra biológica control contiene los mismos tipos de tejido, células y fluidos biológicos como los de la muestra biológica de prueba. En otra modalidad de la invención, la información sobre la expresión de un gen bajo el control de una secuencia reguladora de DMBT1 , se mide a partir de dos o más diferentes tejidos o tipos de células sensibles a estrógeno en el animal. En forma ventajosa, la obtención y el análisis de esta información puede permitir la determinación de si un compuesto de prueba tiene una actividad estrogénica selectiva (por ejemplo, si el compuesto es un SERM). Por ejemplo, un compuesto demuestra actividad estrogénica selectiva, si en una muestra el compuesto de prueba causa un incremento en expresión génica controlada por la secuencia reguladora de DMBT1 , y en el otro tejido el compuesto de prueba no causa un incremento o causa una disminución en la expresión génica controlada por la secuencia reguladora de DMBT1.

Por lo tanto, de conformidad con esta modalidad, la invención provee un método para identificar o seleccionar para compuestos que tienen actividad estrogénica selectiva, que incluye los pasos de: (a) poner en contacto un primer sistema sensible a estrógeno con un compuesto de prueba; (b) poner en contacto un segundo sistema sensible a estrógeno con el compuesto de prueba; (c) obtener información indicativa de la expresión de un gen controlado por una secuencia reguladora de DMBT1 del primer sistema sensible a estrógeno, y obtener información indicativa de la expresión de un gen controlado por una secuencia reguladora de DMBT1 del segundo sistema sensible a estrógeno; y (d) correlacionar (i) un incremento en la expresión en el primer sistema sensible a estrógeno y una disminución o ninguna expresión en el segundo sistema sensible a estrógeno, o (ii) una disminución o ninguna expresión en el primer sistema sensible a estrógeno y un incremento en la expresión en el segundo sistema sensible a estrógeno, con una actividad estrogénica selectiva. En un aspecto de esta modalidad, el método incluye poner en contacto un animal con un compuesto de prueba, detectando la expresión génica de un gen enlazado operablemente a una secuencia reguladora de DMBT1 en un primer tejido sensible a estrógeno del animal, y detectando la expresión génica de un gen enlazado operablemente a una secuencia reguladora de DMBT1 en un segundo tejido sensible a estrógeno del animal o de un segundo animal, y correlacionando la expresión génica en los sistemas sensibles a estrógeno con actividad estrogénica selectiva.

En otra modalidad de la invención, puede determinarse una actividad estrogénica selectiva, midiendo la expresión de DMBT1 o la expresión génica controlada por la secuencia reguladora de DMBT1 de una célula o tejido en respuesta a un compuesto de prueba, y midiendo entonces otro efecto estrogénico producido por un diferente tejido o célula, o en el mismo. El otro efecto estrogénico puede ser cualquier tipo de efecto que sea producido por un compuesto estrogénico y que no sea expresión de DMBT1 o expresión génica controlada por la secuencia reguladora de DMBT1. Los tipos de efectos incluyen efectos intracelulares causados por la activación del receptor de estrógeno, que incluyen la translocación de receptores de estrógeno hacia núcleos; expresión inducida de genes sensibles a estrógeno; intensificación de la producción de óxido nítrico; proliferación celular que incluye proliferación de células endoteliales de mama y células endometriales; diferenciación y crecimiento celular que incluye diferenciación y crecimiento intensificados de neuritas; crecimiento de tejido, que incluye crecimiento de tejido endometrial; densidad incrementada de minerales óseos; cambios en componentes sanguíneos que incluyen incrementos en lipoproteína de alta densidad (HDL), colesterol y triglicéridos, decrementos en lipoproteína de baja densidad (LDL), colesterol y coagulación intensificada; e inflamación incrementada. En esta modalidad, la expresión de DMBT1 o la expresión génica controlada por la secuencia reguladora de DMBT1 y el otro efecto estrogénico, se miden de diferentes tipos de células y tejidos sensibles a estrógeno (es decir, de diferentes sistemas sensibles a estrógeno). De conformidad con esta modalidad, los diferentes sistemas sensibles a estrógeno pueden ser, por ejemplo, del interior del mismo animal, del interior de diferentes animales, de un animal y de una célula modificada, de dos diferentes tipos de célula modificados, etc. Puede mostrarse actividad estrogénica selectiva, en donde el compuesto de prueba (a) Incrementa la expresión de DMBT1 o la expresión génica controlada por la secuencia reguladora de DMBT1 de un sistema sensible a estrógeno y no tiene efecto estrogénico o tiene un efecto anti- estrogénico sobre el otro tejido sensible a estrógeno, o (ii) disminuye o no afecta la expresión de DMBT1 o la expresión génica controlada por la secuencia reguladora de DMBT1 de un sistema sensible a estrógeno y tiene un efecto estrogénico sobre el segundo sistema sensible a estrógeno. Por lo tanto, de conformidad con esta modalidad, la invención provee otro método para identificar o seleccionar para compuestos que tienen actividad estrogénica selectiva, que incluye los pasos de: (a) poner en contacto un primer sistema sensible a estrógeno con un compuesto de prueba; (b) poner en contacto un segundo sistema sensible a estrógeno con el compuesto de prueba; (c) medir la expresión de un gen controlado por una secuencia reguladora de DMBT1 en el primer sistema sensible a estrógeno; (d) medir otro efecto estrogénico del segundo sistema sensible a estrógeno; y (e) correlacionar (i) un incremento en expresión del primer sistema sensible a estrógeno y ningún efecto estrogénico o un efecto anti-estrogénico del segundo sistema sensible a estrógeno, o (ii) una disminución o ninguna expresión del primer sistema sensible a estrógeno y la presencia de un efecto estrogénico del segundo sistema sensible a estrógeno, con una actividad estrogénica selectiva. De conformidad con esta modalidad, se lleva a cabo en general un paso de poner en contacto antes del paso de medición para el mismo sistema sensible a estrógeno. Aparte de esta limitación, los pasos pueden llevarse a cabo en cualquier orden deseado. En algunos procedimientos, se determina primero el efecto del compuesto de prueba sobre la expresión génica controlada por la secuencia reguladora de DMBT1 ; en otros procedimientos, se determina primero el efecto del compuesto de prueba que produce otro efecto estrogénico, sobre un diferente sistema sensible a estrógeno. Se entiende que el orden de los pasos puede depender del tipo de compuesto que se va a identificar, o de otros factores relevantes para el método. La medición del efecto estrogénico del otro sistema sensible a estrógeno, puede llevarse a cabo usando cualquier técnica adecuada. En una modalidad específica, el efecto estrogénico puede medirse directamente de una muestra del otro sistema sensible a estrógeno, tal como una célula o una muestra de tejido. Por ejemplo, en respuesta al compuesto de prueba, puede medirse una muestra de tejido para un incremento en tamaño o masa, o puede analizarse usando técnicas bioquímicas, inmunoquímicas o microscópicas para evaluar, por ejemplo, proliferación celular en el tejido. En otra modalidad específica, puede medirse el efecto estrogénico determinando la producción de un componente producido por el otro sistema sensible a estrógeno, en respuesta al compuesto de prueba. Por ejemplo, un tejido sensible a estrógeno tal como el tejido osteoide, puede producir componentes que aparecen en la sangre u otro fluido corporal de un animal en respuesta al compuesto de prueba, tales como proteínas de producción ósea secretadas (por ejemplo, osteocalcina, fosfatasa alcalina y propéptidos de procolágena). Estos componentes pueden analizarse para determinar si el compuesto de prueba tiene actividad estrogénica. Los cambios causados por la actividad estrogénica de un compuesto de prueba, pueden compararse contra un control adecuado para cuantificar la actividad estrogénica. Como se indicó anteriormente, una modalidad particularmente útil incluye medir la capacidad de un compuesto de prueba para hacer que las células proliferen. La proliferación celular puede medirse, por ejemplo, en tejido mamario, osteoide, neural o vascular. Como se indicó, la proliferación puede evaluarse midiendo el incremento en el peso o tamaño de un tejido respecto a un control. La proliferación puede determinarse también microscópicamente, examinando la división celular o usando técnicas bioquímicas o inmunológicas que permitan determinar la presencia de un marcador proliferativo, tal como una proteína de la superficie de la célula o una molécula intracelular. Marcadores útiles para proliferación celular incluyen, pero no están limitados a, proteínas del ciclo celular tales como las ciclinas y el antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA), intermediarios de señalización tales como el producto génico asociado con proliferación (PAG), proteínas de unión a ácidos nucleicos, y factores de transcripción, tales como la proteína de unión a ARN mensajero HuR, y similares. En algunas modalidades de la invención, se mide la expresión de ácido nucleico de DMBT1 o proteína de DMBT1. La cantidad de ARN mensajero de DMBT1 en una muestra biológica puede medirse usando muchas técnicas. Por ejemplo, puede medirse ARN mensajero de DMBT1 , poniendo en contacto la muestra biológica con un compuesto o un agente capaz de detectar específicamente el ARN mensajero de DMBT1. Técnicas útiles incluyen poner en contacto ARN mensajero de DMBT1 con una sonda de ácido nucleico marcada capaz de hibridar específicamente con el ARN mensajero de DMBT1. Por ejemplo, la sonda de ácido nucleico específica para ARN mensajero de DMBT1 puede ser un ADNc de DMBT1 de longitud completa de humano como se describe en la presente, o una porción del mismo, tal como un oligonucleótido de por lo menos 15, 30, 50, 100, 250 o 500 nucleótidos de longitud de la DMBT1 de humano, y suficiente para hibridar con un ARN mensajero de DMBT1 bajo condiciones severas. De preferencia, una sonda de ácido nucleico específica para ARN mensajero de DMBT1 hibridará sólo con ARN mensajero de DMBT1 bajo condiciones severas, no con otros ácidos nucleicos presentes en la muestra biológica puesta a prueba. Se pretende que el término "marcado" con respecto a la sonda de ácido nucleico o anticuerpo, abarque la marcación directa de la sonda o el anticuerpo, acoplando (es decir, enlazando físicamente) una sustancia detectable con la sonda o el anticuerpo, así como marcando indirectamente la sonda o el anticuerpo por reactividad con otro reactivo que es marcado directamente. Ejemplos de marcación indirecta incluyen detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario marcado en forma fluorescente, y marcación de extremo de una sonda de ADN con biotina, de modo que pueda detectarse con estreptavidina marcada en forma fluorescente. Otras técnicas útiles para determinar la cantidad de ARN mensajero de DMBT1 en una muestra biológica, incluyen llevar a cabo una reacción en cadena de polimerasa-transcriptasa inversa (RT-PCR). Puede prepararse ADN complementario (ADNc) a partir de una muestra tratada con el compuesto de prueba y el ADNc de DMBT1 amplificado, usando oligonucleótidos iniciadores específicos para la secuencia de DMBT1 y capaces de hibridar con el ADNc de DMBT1 bajo condiciones de PCR severas. Están disponibles comercialmente equipos que facilitan la detección de productos de PCR que incorporan marcas detectables, por ejemplo, los reactivos SYBR™ Green PCR Core (Applied Biosystems, Foster City, CA). Otras técnicas útiles para determinar la cantidad de ARN mensajero de DMBT1 en una muestra, incluyen análisis de microdisposiciones de ADN e hibridaciones Northern como se describe, por ejemplo, en los ejemplos 1 y 2, respectivamente. La proteína de DMBT1 en una muestra biológica puede medirse, poniendo en contacto la muestra biológica con un compuesto o un agente capaz de detectar específicamente la proteína de DMBT1. Un agente preferido para detectar una proteína de DMBT1 , es un anticuerpo capaz de unirse específicamente a una porción del polipéptido. En un método preferido, se usa un anticuerpo específico para DMBT1 acoplado a una marca detectable, para la detección de DMBT1. Los anticuerpos específicos para DMBT1 pueden ser monoclonales o policlonales. Puede usarse una molécula de anticuerpo entera, o un fragmento de la misma (por ejemplo, Fab o F(ab')2). Técnicas para la detección de un polipéptido tal como la proteína de DMBT1, incluyen pruebas de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISAs), Western blots, inmunoprecipitaciones e ¡nmunofluorescencia. Detalles para la realización de estos métodos pueden encontrarse, por ejemplo, en Sambrook et al., citado anteriormente. Otras técnicas para la detección in vivo de moléculas de ARN mensajero o proteína, incluyen fusión de secuencias reguladoras de DMBT1 con un gen reportero descritas más adelante, hibridación in situ e inmunohistoquímica (para ARN mensajero y proteína localizados en compartimientos subcelulares y/o estructuras específicos). Además, métodos cuantitativos, tales como la formación de imágenes por tomografía por emisión de positrones (PET), hacen posible la evaluación mediante medios no invasivos, del nivel de proteínas de DMBT1 en el órgano humano vivo (Sedvall et al. (1988) Psychopharmacol. Ser., 5: 27-33). Por ejemplo, cantidades traza de los radiotrazadores de unión a proteínas de DMBT1 se inyectan intravenosamente en el sujeto, y puede formarse una imagen de la distribución de la radiomarcación en el útero, mama, hueso, sistema vascular o cerebro del sujeto. Procedimientos para la formación de imágenes por PET, así como otros medios de formación de imágenes, son conocidos por los expertos en la técnica (véase la revisión hecha por Passchier eí al. (2002) Methods 27: 278). En otras modalidades, un gen reportero se pone bajo el control de la región reguladora de DMBT1, y se mide la expresión del gen reportero.

Como se usa en la presente, "un gen reportero" es una secuencia de ácido nucleico diferente de la secuencia de ácido nucleico de la región codificante de DMBT1 , y codifica para una proteína que puede proveer una señal detectable cuando se expresa en la célula. Se contempla que una amplia variedad de secuencias de ácido nucleido puede usarse como un gen reportero. Secuencias de ácido nucleico útiles incluyen secuencias de ocurrencia natural, secuencias recombinantes, y secuencias sintéticas que pueden detectarse usando, por ejemplo, sondas de ácido nucleico, cuando la secuencia se expresa en la célula. Los genes reporteros pueden proveer señales detectables, tales como emisiones a partir de proteínas fluorescentes.

Otros genes reporteros codifican para proteínas que son capaces de catalizar una reacción específica en presencia de un reactivo, el producto de la reacción proveyendo una señal detectable. Otros genes reporteros codifican para proteínas únicas que son detectables usando una prueba de afinidad, por ejemplo, una prueba de inmunoafinidad.

En modalidades preferidas, un gen reportero se pone bajo el control de una secuencia reguladora de DMBT1 , y esta secuencia heteróloga se introduce en una célula sensible a estrógeno. Genes reporteros que pueden usarse en los métodos y las composiciones de la invención incluyen, pero no están limitados a, genes que codifican para proteína fluorescente verde (GFP), ß-galactosidasa (lacZ), luciferasa (luc), cloranfenicol acetiltransferasa (cat), ß-glucuronidasa, neomicina fosfotransferasa y guanina xantina, fosforribosil-transferasa. En otra modalidad de la invención, el sistema sensible a estrógeno es una célula que expresa un receptor de estrógeno funcional, y la célula que expresa un receptor de estrógeno funcional incluye también por lo menos una porción de una secuencia reguladora de DMBT1 que puede sobrerregular la expresión de un gen enlazado operablemente cuando el receptor de estrógeno se une a un compuesto estrogénico. Por lo tanto, de conformidad con la invención, pueden identificarse o seleccionarse compuestos para actividad estrogénica: (a) poniendo en contacto una célula con un compuesto de prueba, la célula teniendo (i) un receptor de estrógeno funcional, y (ii) un ácido nucleico que tiene un gen bajo el control de una secuencia reguladora de DMBT1 ; (b) obteniendo información indicativa de expresión del gen; y (c) usando la información del paso (b) para determinar una actividad estrogénica. Por consiguiente, compuestos de prueba que produzcan un incremento en expresión del gen bajo el control de una secuencia reguladora de DMBT1 , pueden tener una actividad estrogénica; mientras que compuestos de prueba que produzcan una disminución en expresión génica en presencia de un estrógeno, pueden correlacionarse con una actividad anti-estrogénica. En este método, pueden usarse células de ocurrencia natural o células modificadas. Las células de ocurrencia natural incluyen células que se aislan de tejido sensible a estrógeno, tal como tejido uterino, por ejemplo, tejido endometrial y miometrial, tejido mamario, tejido osteoide, tejido neural y tejido vascular. El aislamiento de estas células puede llevarse a cabo mediante biopsia u otras técnicas conocidas en la materia. "Células modificadas", se refieren a células que han sido manipuladas para cambiar un cierto rasgo genético o bioquímico de la célula. Por ejemplo, células modificadas incluyen células transfectadas y transgénicas que tienen un ácido nucleico heterólogo. Por lo tanto, en otra modalidad, la ¡nvención provee también células modificadas que son sensibles a estrógeno y tienen un ácido nucleico heterólogo que incluye una secuencia reguladora de DMBT1 enlazada operablemente a una secuencia de gen reportero. Dichos tipos de células son particularmente útiles para seleccionar compuestos para actividad estrogénica. De conformidad con la ¡nvención, puede usarse cualquier tipo de célula que pueda expresar un receptor funcional y que pueda propagar una señal estrogénica que dirija la expresión de un gen a partir de la secuencia reguladora de DMBT1. Tipos de células que expresen endógenamente un receptor de estrógeno pueden usarse y transfectarse con un ácido nucleico heterólogo que tenga una secuencia reguladora de DMBT1 enlazada operablemente, por ejemplo, a un gen reportero. Las células eucarióticas son los tipos de célula preferidos. En una modalidad preferida, la célula hospedera es de origen uterino, tal como una célula estromática endometrial tal como las células de Ishikawa. En otra modalidad preferida, la célula hospedera es de mama, tales como las células MCF-7. En otra modalidad preferida, la célula hospedera es de hueso, tales como las células MG63. En otra modalidad preferida, la célula hospedera es del sistema vascular, tales como las células HUVEC. En otra modalidad preferida, la célula hospedera es una célula del cerebro, tales como las células SK-N-MC. Además, se contempla el uso de células eucarióticas simples, tales como Saccharomyces cerevisiae como la base para un sistema de células sensibles a estrógeno (véase Jungbauer, A. y Beck, V. J. (2002) Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 777:167). Pueden transfectarse células con un ácido nucleico que sea capaz de expresar un receptor de estrógeno, como se describe en la presente. El receptor de estrógeno puede expresarse de un vector que sea transfectado establemente o transitoriamente en la célula. Vectores adecuados para expresión del receptor de estrógeno se conocen en la técnica, y están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Promega (Madison, Wl). En algunos casos, puede ser deseable expresar una variante de un receptor de estrógeno en una célula. Ciertas variantes del receptor de estrógeno pueden expresar diferentes fenotipos relevantes para su actividad, por ejemplo, actividad constitutiva, sensibilidad incrementada y sensibilidad disminuida. Algunos ejemplos de variantes del receptor de estrógeno se muestran en Chambraud et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 20686-91. Pueden transfectarse también células con un ácido nucleico heterólogo que tenga una secuencia de ácido nucleico de un gen reportero bajo el control, por transcripción, de una secuencia reguladora de DMBT1. La secuencia de ácido nucleico bajo el control de una secuencia reguladora de DMBT1 puede ser cualquier tipo de secuencia que sea detectable usando los métodos como se describen en la presente. La secuencia de ácido nucleico útil puede codificar para proteínas o enzimas como se describe en la presente, que permitan la detección de la célula cuando se exprese el gen. Se describen también en la presente genes reporteros particularmente útiles que codifican para reporteros tales como luciferasa (luc). Para determinar, por ejemplo, carácter específico y fondo, puede usarse una segunda fusión de genes que comprenda el mismo gen reportero, pero una secuencia reguladora diferente (por ejemplo, una secuencia reguladora para un gen que no sea sensible a una señal estrogénica) como un control para aumentar el carácter específico de la prueba. En una modalidad, un ácido nucleico que tenga por lo menos una porción de la región reguladora de DMBT1 (SEQ ID NO: 1; mostrada en el cuadro 2) que sea suficiente para dirigir la expresión de un gen enlazado operablemente en respuesta a una señal estrogénica, puede prepararse e introducirse en una célula.

De conformidad con la ¡nvención, una secuencia de nucleótidos de la posición -2766 a - 2734 de la secuencia reguladora DMBT1 (840-872 de SEQ ID NO: 1), es capaz de dirigir la expresión que un gen enlazado operablemente en respuesta a una señal estrogénica. Por lo tanto, en una modalidad de la invención, un ácido nucleico que incluya 840-872 de SEQ ID NO: 1 , o una variante del mismo, puede ser enlazado operablemente a un gen, puede introducirse en una célula sensible a estrógeno, y puede usarse en un método para identificar compuestos que tienen actividad estrogénica. Una variante de esta secuencia reguladora de DMBT1 puede incluir sustituciones y/o deleciones de nucleótidos que no reducen sustancialmente la capacidad de la secuencia para dirigir la expresión del gen enlazado operablemente en respuesta a una señal estrogénica. Pueden prepararse fácilmente variantes de 840-872 de SEQ ID NO: 1 usando técnicas de síntesis y recombinantes. Por ejemplo, una variante puede incluir una secuencia de ácido nucleico que tenga aproximadamente 60% de identidad de secuencias de nucleótidos, de preferencia aproximadamente 65, 70, 75, 80, 85, 90 ó 95% de identidad de secuencias de nucleótidos, con los nucleótidos 840-872 de SEQ ID NO: 1. De preferencia, la secuencia reguladora de DMBT1 de esta invención hibridará bajo condiciones de alta severidad con SEQ ID NO: 1 o que tenga por lo menos 85% de identidad de secuencias con cualquiera de 30 elementos consecutivos dentro de SEQ ID NO: 1. Además, se ha descubierto también que una porción de la secuencia reguladora de DMBT1 hacia el extremo 5' de la posición -1347 (hacia el extremo 5' del nucleótido 2259 de SEQ ID NO: 1), provee una respuesta mejorada a una señal estrogénica. Por lo tanto, en una modalidad preferida de la invención, un ácido nucleico que incluya una secuencia de los nucleótidos 1-2259 de SEQ ID NO: 1 , una porción de 1-2259 de SEQ ID NO: 1 , o una variante de las mismas, incluyendo los nucleótidos 840-872 de SEQ ID NO: 1 , puede ser enlazado operablemente a un gen, puede introducirse en una célula sensible a estrógeno, y puede usarse en un método para identificar compuestos que tengan actividad estrogénica. Más específicamente, una secuencia reguladora de DMBT1 que tenga una secuencia hacia el extremo 5' de la posición -2734, provee una respuesta mejorada a una señal estrogénica. Por lo tanto, en otra modalidad preferida de la invención, un ácido nucleico que incluya una secuencia de 1-872 de SEQ ID NO: 1 , una porción de 1-872 de SEQ ID NO: 1 , o una variante de las mismas, incluyendo los nucleótidos 840-872 de SEQ ID NO: 1, puede ser enlazado operablemente a un gen, puede introducirse en una célula sensible a estrógeno, y puede usarse en un método para identificar compuestos que tengan actividad estrogénica. En otra modalidad, la invención provee una secuencia de ácido nucleico aislada que incluye una secuencia reguladora de DMBT1 enlazada operablemente a un gen reportero. La secuencia reguladora de DMBT1 es capaz de sobrerregular la expresión de DMBT1 en repuesta a un compuesto estrogénico. En una modalidad, la secuencia reguladora de DMTB1 comprende los nucleótidos 840-872 de SEQ ID NO: 1 , o variantes de la misma (como se describe en la presente), enlazados operablemente a un gen reportero. En una modalidad más preferida, el ácido nucleico incluye una secuencia reguladora de DMBT1 de los nucleótidos 1-2259 de SEQ ID NO: 1, una porción de 1-2259 de SEQ ID NO: 1 , o una variante de los mismos, incluyendo los nucleótidos 840-872 de SEQ ID NO: 1 , enlazada operablemente a un gen reportero. En otra modalidad preferida, el ácido nucleico incluye de los nucleótidos 1-2259 de SEQ ID NO: 1 , una porción de 1-872 de SEQ ID NO: 1, o una variante de los mismos, incluyendo los nucleótidos 840-872 de SEQ ID NO: 1 , enlazados operablemente a un gen reportero. Como se establece en la presente, la invención ilustra también que compuestos que tienen una actividad progestogénica o una actividad anti-progestogénica, cuando se administran con un compuesto estrogénico, pueden reducir la sobrerregulación mediada por estrógeno de un gen controlado por la secuencia reguladora de DMBT1. Este aspecto de la invención provee una base que permite métodos para la selección, monitoreo y/o identificación de compuestos que tienen actividades progestogénicas o. anti-progestogénicas. Los moduladores del receptor de progesterona (PRMs) pueden incluir compuestos que tienen actividad progestogénica en algunos tejidos, y actividad anti-progestogénica en otros, y que pueden identificarse usando los métodos descritos en la presente. Un ejemplo de un PRM terapéuticamente útil es la mifepristona, que puede oponerse a la acción proliferativa del estrógeno en el endometrio, sin que induzca concomitantemente un estado secretorio (como lo hacen las progestinas). Se han previsto PRMs para su uso en regímenes de terapia de reemplazo de hormonas que contienen estrógeno, en donde contrarrestarían el efecto estimulador del estrógeno, y como tratamientos independientes para endometriosis, cuya sintomatología es dependiente de estrógeno. En una modalidad, los métodos descritos en la presente pueden permitir la identificación de compuestos novedosos que tienen una actividad progestogénica o anti-progestogénica, tales como PRMs. Pueden identificarse PRMs, determinando la expresión de un gen controlado por una secuencia reguladora de DMBT1. Por ejemplo, un compuesto de prueba que subregule una sobrerregulación inducida por estrógeno de un gen bajo el control de una secuencia reguladora de DMBT1 , puede tener actividad anti-progestogénica y ser un PRM. Por lo tanto, en otra modalidad, la invención provee un método para identificar o seleccionar compuestos que tienen actividad progestogénica o anti-progestogénica. El método incluye los pasos de (a) poner en contacto un sistema sensible a estrógeno y progesterona con un compuesto estrogénico; (b) poner en contacto el sistema sensible a estrógeno y progesterona con un compuesto de prueba; (c) obtener información indicativa de expresión de un gen controlado por una secuencia reguladora de DMBT1 del sistema sensible a estrógeno y progesterona; y (d) usar la información obtenida del paso (c) para determinar actividad progestogénica o anti- progestogénica. En una modalidad, el paso (c) puede incluir medir la expresión del gen respecto a un control, y el paso (d) puede incluir correlacionar una disminución en la expresión en respuesta al compuesto de prueba con una actividad progestogénica o una actividad anti-progestogénica. Específicamente, un compuesto de prueba que disminuya la sobrerregulación mediada por estrógeno de una expresión génica controlada por la secuencia reguladora de DMBT1 , puede ser progestogénico o anti-progestogénico, dependiendo del sistema sensible a estrógeno y progesterona que se use. Por ejemplo, un compuesto que tenga una actividad progestogénica puede reducir la sobrerregulación mediada por estrógeno de una expresión génica controlada por la secuencia reguladora de DMBT1 en útero de rata; mientras que un compuesto que tenga una actividad anti-progestogénica puede reducir la sobrerregulación mediada por estrógeno de una expresión génica controlada por la secuencia reguladora de DMBT1 en útero de mono. Es posible además que en algunos sistemas sensibles a estrógeno y progesterona, un agonista de progestina y un antagonista de progestina no sean distinguibles en términos de sus efectos sobre la expresión de DMTB1, es decir, ambos reducirán la sobrerregulación mediada por estrógeno de una expresión génica controlada por la secuencia reguladora de DMBT1. De preferencia, el método de la invención comprende además un paso de medir un efecto sensible a progesterona que sea diferente de la expresión de un gen controlado por una secuencia reguladora de DMBT1. Por ejemplo, en primates, agonistas y antagonistas de progestina tienen efectos distintos sobre la histología endometrial, es decir, los primeros inducen un fenotipo secretorio por diferenciación, mientras que los últimos inducen un fenotipo no proliferativo no secretorio previniendo la división celular. Por lo tanto, en algunas modalidades, el método de la invención comprende además un paso de medir cambios en histología endometrial o marcadores de secreción endometrial, o midiendo marcadores de genes dependientes de progestina específicos en glándula mamaria. En roedores, un segundo efecto progestogénico puede ponerse a prueba mediante deciduación, una prueba dependiente de progesterona que mide la aptitud del útero para aceptar un embrión. El sistema sensible a estrógeno y progesterona puede ser una célula individual, un tejido, o un organismo multicelular complejo que sea sensible a estrógeno y progesterona. Típicamente, el sistema sensible a estrógeno y progesterona incluye una célula que tiene un receptor de estrógeno y un receptor de progesterona. El sistema sensible a estrógeno y progesterona incluye también un gen bajo el control de una secuencia reguladora de DMBT1 , en donde la expresión del gen es mensurable. En el sistema sensible a estrógeno y progesterona, la sobrerregulación de la expresión del gen controlada por la secuencia reguladora de DMBT1 por una señal estrogénica, puede ser inhibida por una actividad anti-progestogénica, tal como la acción de un antagonista de progesterona sobre el receptor de progesterona. Un "receptor de progesterona", como se define la presente, se refiere a cualquier proteína que se una a progesterona, y cuya unión sea capaz de incrementar o disminuir la actividad de vías de señalización de progesterona. De preferencia, el receptor de progesterona es un miembro de la familia de genes de receptor nuclear que se une a progesterona, y que (1 ) tiene una secuencia de aminoácidos que comparte más de aproximadamente 60%, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ó 95% de identidad de secuencias de aminoácidos, con la forma B del receptor de progesterona de humano (Kasther eí al. (1990) EMBO J 9:1603-14; número de acceso de proteínas del GenBank: NP_000917); (2) es capaz de unirse a anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales o policlonales, producidos contra un receptor de progesterona, tal como la forma B del receptor de progesterona de humano descrita en la presente. Como se usa en la presente, un receptor de progesterona incluye aquel receptor de progesterona de mamíferos humanos y no humanos (por ejemplo, animales de interés veterinario, tales como caballos, vacas, ovejas y cerdos, mascotas domésticas, tales como gatos y perros, así como animales de laboratorio tales como ratas, ratones, conejos, conejillos de Indias y monos). Los receptores de progesterona de humano, como se refieren en la presente, incluyen la isoforma B descrita en la presente, la isoforma A que carece de los primeros 164 residuos de aminoácido N-terminales de la isoforma B, y cualquier ¡soforma adicional reconocida por los expertos en la técnica. Un "receptor de progesterona funcional", como se define en la presente, es un receptor de progesterona capaz de regular por transcripción la expresión génica. En una modalidad específica, el sistema sensible a estrógeno y progesterona es un animal, que incluye animales naturales y genéticamente modificados (transgénicos) como se describe en la presente. Estos animales pueden tratarse también quirúrgicamente o farmacéuticamente para producir un estado deseado en el animal antes de la administración del compuesto de prueba, descrito también en la presente. El método incluye un paso de poner en contacto el sistema sensible a estrógeno y progesterona con el compuesto de prueba. Este paso puede llevarse a cabo antes, al mismo tiempo, o después, de la puesta en contacto con el compuesto estrogénico. La regulación de la puesta en contacto o la administración del compuesto de prueba, puede depender de muchos factores, que incluyen las características del compuesto de prueba mismo, el compuesto estrogénico, las dosis del compuesto de prueba y el compuesto estrogénico, etc. El compuesto estrogénico y el compuesto de prueba pueden administrase en cualquier forma y manera adecuada, como se describe en la presente. Los efectos del compuesto de prueba pueden medirse en el animal en una variedad de formas. Se entiende que en un organismo complejo tal como un animal, tanto el estrógeno como la progesterona tienen actividad sobre diferentes tipos de tejido. Por lo tanto, de conformidad con este método, es deseable usar un sistema sensible a estrógeno y progesterona, que sea a) sensible a un compuesto estrogénico y produzca un efecto estrogénico mensurable en respuesta a un compuesto estrogénico, y también b) sensible a un compuestos progestogénico. De esta forma, puede evaluarse una actividad progestogénica o anti-progestogénica del compuesto de prueba. En otra modalidad de la invención, se mide la expresión de DMBT1 , o la expresión de un gen bajo el control de una secuencia reguladora de DMBT1 , en un tejido del animal que se ha puesto en contacto con el compuesto estrogénico y el compuesto de prueba. En algunos casos, puede ser suficiente determinar la expresión de DMBT1 o la expresión génica controlada por la secuencia reguladora de DMBT1 de sólo un tejido, por ejemplo, de tejido endometrial, para determinar si el compuesto de prueba tiene una actividad progestogénica o anti-progestogénica. En otra modalidad de la invención, se mide la expresión de DMBT1 o la expresión génica controlada por la secuencia reguladora de DMBT1 , de dos o más tejidos en el animal. Típicamente, los dos o más tejidos son diferentes, y son sensibles a estrógeno y progesterona. En esta modalidad, la medición puede permitir la determinación de si un compuesto de prueba tiene actividad progestogénica selectiva (por ejemplo, si el compuesto es un PRM/SPRM). En por lo menos un tejido, el compuesto de prueba demostrará un efecto anti-progestogénico, tal como una disminución en la expresión de DMBT1 en presencia de un compuesto estrogénico, y en el otro tejido, el compuesto de prueba no demostrará efecto alguno o un efecto progestogénico. En otra modalidad, puede determinarse actividad progestogénica selectiva, midiendo la expresión de DMBT1 o la expresión génica controlada por la secuencia reguladora de DMBT1 de un tejido, además de midiendo otro efecto progestogénico del compuesto de prueba en otro tejido, en donde ambos tejidos se ponen en contacto con un compuesto estrogénico y el compuesto de prueba. El otro efecto progestogénico puede ser cualquier tipo de efecto que sea producido por un compuesto progestogénico, y que no sea la expresión de DMBT1 o la expresión génica controlada por la secuencia reguladora de DMBT1. Los tipos de efectos incluyen efectos intracelulares causados por la activación del receptor de progesterona, incluyendo la translocación de receptores de progesterona hacia núcleos; expresión inducida de genes sensibles a progesterona; estimulación y diferenciación de células endometriales epiteliales en el útero; desarrollo del cuerpo lúteo, y mantenimiento de la función-estructura del cuerpo lúteo. Puede medirse la expresión génica de DMBT1 del tejido sensible a estrógeno y progesterona tratado con estrógeno y el compuesto de prueba, usando cualquiera de las técnicas como se describen en la presente. Además, puede realizarse también la medición de la expresión de un gen controlado por una secuencia reguladora de DMBT1 como se describe en la presente. En otra modalidad de la invención, el sistema sensible a estrógeno y progesterona es una célula que expresa un receptor de estrógeno funcional y un receptor de progesterona funcional. La célula que expresa estos receptores incluye también por lo menos, una porción de una secuencia reguladora de DMBT1 que puede dirigir la expresión de un gen enlazado operablemente cuando el receptor de estrógeno se une a un compuesto estrogénico. Por lo tanto, de conformidad con la invención, pueden identificarse o seleccionarse compuestos para actividad progestogénica o anti- progestogénica, (a) poniendo en contacto una célula con un compuesto estrogénico, la célula teniendo (i) un receptor de estrógeno funcional, (ii) un receptor de progesterona funcional, y (iii) un ácido nucleico que tiene un gen bajo el control de una secuencia reguladora de DMBT1 ; (b) poniendo en contacto la célula con un compuesto de prueba; (c) midiendo la expresión del gen respecto a un control; y (d) correlacionando una disminución en la expresión del gen en respuesta al compuesto de prueba con una actividad progestogénica o una actividad anti-progestogénica. En este método, pueden usarse células de ocurrencia natural o células modificadas. Las células de ocurrencia natural incluyen células que se aislan de tejido sensible a estrógeno y progesterona, tal como tejido uterino, por ejemplo, tejido endometrial y miometrial, tejido mamario y tejido neural. En otra modalidad, la invención provee también células modificadas que son sensibles a estrógeno y progesterona y tienen un ácido nucleico que incluye una secuencia reguladora de DMBT1 enlazada operablemente a una secuencia reportera. Dichos tipos de célula son particularmente útiles para seleccionar compuestos para actividad anti- progestogénica. De conformidad con la ¡nvención, puede usarse cualquier tipo de célula que pueda expresar un receptor funcional y que pueda propagar una señal estrogénica hacia la secuencia reguladora de DMBT1. Tipos de células que expresan endógenamente un receptor de estrógeno y un receptor de progesterona, pueden usarse y transfectarse con un ácido nucleico que tenga una secuencia reguladora de DMBT1. Tipos de células que expresan endógenamente un receptor de estrógeno y un receptor de progesterona, incluyen células T47D y ZR75-1. Se prefieren las células eucarióticas. Además, el uso de células eucarióticas simples tales como Saccharomyces cerevisiae, como se describe en la presente, se contempla como la base para un sistema de células sensibles a estrógeno y progesterona. Pueden ponerse a prueba células por su capacidad para estimular la expresión de proteínas de una secuencia reguladora de DMBT1 , transfectando las células con un ácido nucleico que codifique para un reportero enlazado operablemente a una secuencia reguladora de DMBT1 , o midiendo los efectos estrogénicos de las células o tejidos que tengan un receptor de estrógeno. En otra modalidad, pueden transfectarse células con ácidos nucleicos que sean capaces de expresar un receptor de estrógeno, un receptor de progesterona, o ambos. Se han descrito en la presente el receptor de estrógeno y el recetor de progesterona, así como vectores que pueden promover su expresión. Se contempla también la expresión de receptores de estrógeno variantes y receptores de progesterona variantes. Pueden transfectarse también células con un ácido nucleico que tenga un gen bajo el control de una secuencia reguladora de DMBT1 como se describe en la presente. Aspectos preferidos de la secuencia reguladora de DMBT1 se describen también en la presente. Los sujetos que estén tomando estrógeno para terapia de reemplazo de hormonas, corren un riesgo incrementado de desarrollar cáncer uterino debido a la estimulación no opuesta del endometrio. En una modalidad preferida, los métodos de la presente invención pueden usarse para monitorear actividades de un estrógeno, SERM o PRM en el útero del sujeto, en donde la muestra biológica descrita en la presente es del útero de los sujetos, tal como una muestra de biopsia endometrial. Pueden monitorearse también compuestos de prueba que se sospecha tienen estas actividades. Métodos para obtener una muestra de biopsia endometrial de un sujeto, son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, pueden colectase muestras de biopsia endometrial mediante canulación transcervical del cuerpo uterino craneal en etapas definidas del ciclo estral, usando fórceps para biopsia. Pueden colectase también muestras de biopsia endometrial, usando métodos tales como el método de Tao Brush (Wu eí al. (2000) Am. J. Clin. Pathol., 114: 412-418), el curetaje fraccional, o mediante incisión quirúrgica abierta. La estimulación por estrógenos o progestinas puede causar también un riesgo incrementado de desarrollo de cáncer de mama en los sujetos. En otra modalidad preferida, pueden usarse métodos de la presente invención para monitorear la actividad de un estrógeno, SERM ó PRM en glándulas mamarias del sujeto, en donde la muestra biológica descrita en la presente es de las glándulas mamarias del sujeto. Pueden monitorearse también compuestos de prueba que se sospecha tienen estas actividades. Métodos para obtener una muestra biológica de las glándulas mamarias de un sujeto, son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, puede usarse aspiración intraductal o el método convencional de colecta por compresión, para colectar descargas de la glándula mamaria. Otros métodos que pueden usarse para colectar una muestra biológica de las mamas de un sujeto incluyen, pero no están limitados a, aspiración con aguja fina ex vivo (FNA) (Eliasen et al. (1991), Mod. Pathol., 4: 196-200), biopsias por punción del núcleo de la mama (Ellis et al. (2002) Clin. Cáncer Res., 8: 1155-1166), e incisión quirúrgica abierta. Opcionalmente, pueden usarse métodos de la presente invención para monitorear la actividad de un estrógeno, SERM o PRM en tejido óseo o el sistema vascular del sujeto, de preferencia un animal de laboratorio tal como un mono, un conejo o una rata, en donde la muestra biológica descrita en la presente sea del hueso o el sistema vascular del sujeto. Pueden monitorearse también compuestos de prueba que se sospecha tienen estas actividades. Se conocen métodos para obtener una muestra biológica del hueso o el sistema vascular.

Además de que afectan el hipotálamo y otras áreas del cerebro respecto a reproducción, los esteroides ováricos tienen efectos extendidos por todo el cerebro, sobre vías de serotonina, neuronas catecolaminérgicas, y el sistema colinérgico del prosencéfalo basal, así como formación hipocámpica, una región del cerebro que interviene en la memoria espacial y declarativa (McEwen (2002) Recent Prog Horm Res. 57: 357-84). En particular, se piensa que el estrógeno protege ante el envejecimiento del cerebro, pero poco se sabe acerca de cuál puede ser el mecanismo de protección. En otra modalidad preferida, pueden usarse métodos de la presente invención para monitorear la actividad de un estrógeno, SERM o PRM en el cerebro del sujeto, en donde la muestra biológica descrita en la presente es del cerebro del sujeto. Pueden monitorearse también compuestos de prueba que se sospecha tienen estas actividades. Los expertos en la técnica conocen métodos para obtener una muestra biológica del cerebro de un sujeto. Por ejemplo, mediante el uso de una aguja para biopsia, puede obtenerse una muestra biológica del cerebro mediante biopsia guiada por formación de imágenes, tal como biopsia guiada por CT o MR. Asimismo, puede analizase tejido del cerebro durante la autopsia.

EJEMPLO 1 Identificación de expresión génica sobrerregulada mediante tratamiento con estrógeno en el endometrio de mono El siguiente ejemplo demuestra la identificación de un gen particular que tiene un patrón de expresión que fue sobrerregulado fuertemente, entre un grupo de genes sobrerregulados, en el endometrio de monos ovariectomizados en respuesta al tratamiento con estrógeno. En resumen, se tomaron muestras de tejido de monos ovariectomizados y de animales control, se preparó ADNc marcado de los tejidos, y entonces el ADNc se híbrido con una microdisposición. Los resultados de la microdisposición revelaron muchos genes que fueron sobrerregulados o subregulados en comparación con la muestra control. Un gen que fue fuertemente sobrerregulado en presencia de estrógeno, se identificó como el gen supresor de tumores putativo DMBT1.

I. Animales y administración de fármacos Todos los procedimientos que incluyen animales, se llevaron a cabo en una instalación para animales totalmente acreditada por la American Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC), y de acuerdo con The Guide for the Care and Use of Laboratory Animáis (NIH). Los protocolos fueron aprobados por el Eastern Virginia Medical School Internal Animal Care and Use Committee (IACUC).

Se obtuvieron monos Cynomolgus hembras adultas (Macaca fascicularis), de Covance Research Products. Después de un ciclo menstrual completo y en la fase folicular del ciclo menstrual subsiguiente, los animales fueron ovariectomizados mediante una laparotomía media ventral. Se sometió a los animales ovariectomizados (OVX) a tratamiento con estrógeno después de la cuarta semana después de la ovariectomía. Para estudiar el efecto del estrógeno sobre la expresión génica, se administró a grupos de tres monos OVX un implante de placebo o estrógeno (control de vehículo) en el día uno de un ciclo de tratamiento de 19 días. Se alcanzaron niveles de estradiol en suero de estado estable de 100 a 200 pg/mL mediante implantación. Después de este período, se sometió a eutanasia a los monos OVX, y se tomaron biopsias de tejido de los endometrios de los monos tratados con estrógeno y el placebo (los detalles de las características endometriales en monos OVX y monos OVX +.tratados con estrógeno, se describen en el ejemplo 4). Las biopsias se colocaron en contenedores estériles, se congelaron instantáneamente de inmediato en nitrógeno líquido, y se almacenaron a -80°C hasta su procesamiento. Se preparó ARN total de cada biopsia de tejido endometrial, como se describe a continuación.

II. Preparación de ARN total de biopsias de tejido Se preparó ARN total de biopsias de tejido endometrial (de aproximadamente 50 mg cada una) usando RNAzol™ (Tel-Test, Friendswood, TX), de la manera siguiente. Se usaron dos mililitros de RNAzol™ por 100 mg de tejido. Se homogenizaron los tejidos por 2 a 3 minutos usando un homogenizador Tissue Tearor (Modelo No. 985-370; BioSpec Products, Bartlesville, OK), y se transfirieron entonces al tazón de un mortero de vidrio. Los tejidos se molieron con por lo menos 10 carreras de la mano del mortero, hasta que se obtuviera una suspensión clara. Los homogenizados se transfirieron a un matraz cónico de polipropileno, al cual se añadieron 0.1 mL de cloroformo por 1 mL de homogenizado. Las mezclas se agitaron entonces vigorosamente por 1 minuto. Las suspensiones se transfirieron entonces a un tubo de microcentrífuga de 2 mL, y se centrifugaron por 15 minutos a 12000g y 4°C en un rotor de ángulo fijo usando una centrífuga Biofuge 17R (Baxter, Deerfield, IL). La fase acuosa se transfirió cuidadosamente a un nuevo tubo de microcentrífuga. Se añadió un volumen igual de isopropanol a la fase acuosa, se mezcló suavemente, y se incubó a 4°C por 15 minutos. El ARN se transformó a pellas centrifugando la mezcla por 15 minutos a 12000g y a 4°C, como se describió anteriormente. El sobrenadante se removió, y la pella se lavó con etanol a 75% (v/v) (Pharmco Products, Brookfield, CT), seguido de centrifugación a 7500g por 8 minutos a 4°C. El sobrenadante se removió, y entonces la pella de ARN se secó al aire por poco tiempo, y se resuspendió en agua libre de ribonucleasa (Promega, Madison, Wl). Las muestras se trataron entonces con desoxirribonucleasa I libre de ribonucleasa de calidad adecuada para amplificación, para remover cualquier ADN residual (Invitrogen, Carlsbad, CA). Específicamente, se trataron 20 µg de ARN en un volumen de reacción de 0.1 mL que contenía 1X regulador de pH de reacción de desoxirribonucleasa I y 10 unidades de desoxirribonucleasa I. La reacción continuó a temperatura ambiente por 15 minutos. Después de digestión, se añadieron 0.35 mL de regulador de pH RLT a partir de un miniequipo RNeasy (QIAGEN, Valencia, CA), y se mezclaron por completo, seguido de 0.25 mL de etanol a 100% (v/v). La mezcla se cargó sobre la columna de un miniequipo RNeasy, y se centrifugó a 10,000 rpm por 15 segundos en una microcentrífuga ALC 4214. El flujo pasante se desechó, y el ARN que quedó en la columna se lavó dos veces con regulador de pH RPE, con centrifugación cada vez a 10,000 rpm por 15 segundos en una microcentrífuga ALC 4214. El ARN se eluyó en un tubo de colecta con 30 µL de agua libre de ribonucleasa. Se llevaron a cabo precipitación con isopropanol, lavado en etanol y centrifugación, como se describió anteriormente. Se prepararon 100 a 200 microgramos de ARN de cada muestra de tejido.

III. Preparación de la sonda e hibridación de microdisposiciones de ADN Se usó una alícuota de cada preparación de ARN para generar la sonda que se va a hibridar con un primer tipo de chip que contenía secuencias de ADN complementarias de humano de 4475 identificadores de genes separados. La redundancia de este grupo de genes es de aproximadamente 25%; es decir, aproximadamente 3,400 de las moléculas de ADN manchadas representan genes (o grupos de genes) únicos. En promedio, las secuencias codificantes de humano y mono están más de 95% conservadas; por lo tanto, no se anticiparon complicaciones debidas a mal complementariedad entre el ARN de mono y los genes de humano en el chip. Se generaron chips depositando ADN amplificado por reacción en cadena de polimerasa purificado en tiocianato de sodio a 5 M sobre portaobjetos Corning GAPS (Corning, NY) con un manchador de disposiciones Genlll (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA), seguido de entrelazamiento ultravioleta a 500 mJ. Se preparó entonces una sonda de ADNc marcada a partir de las muestras de ARN endometrial. El ARN se desnaturalizó con calor, y el ADNc marcado se preparó mediante transcripción inversa en presencia de trifosfato de Cy3-desoxicitidina (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). El ARN se removió mediante digestión con ribonucleasa A (Amersham Pharmacia Biotech), seguido de purificación usando un equipo de purificación para PCR QIAquick 96 (QIAGEN). Todas las preparaciones de sondas se normalizaron mediante fluorescencia relativa media en un Cytofluor (Applied Biosystems, San Diego, CA). La preparación de sonda se secó, y se resuspendió entonces en regulador de pH Hyb versión 2 (Amersham Pharmacia Biotech) que contenía formamida a 50% (v/v) (JT Baker, Phillipsburg, NJ) y ADN de Cot-1 a 10% (v/v) (Invitrogen). Esta mezcla se calentó a 95°C por 2 minutos, se enfrío, y se colocaron 50 µL sobre dos chips. Los chips se cubrieron con un cubreobjetos, se sellaron con DPX (Fluka, Milwaukee, Wl), y se incubaron a 42°C por 14 horas. Entonces, se llevó a cabo una serie de lavados por 5 minutos, partiendo con 1X SSC que contenía dodecilsulfato de sodio a 0.2% (p/v) a 42°C, y terminando a 55°C en 0.1 X SSC que contenía dodecilsulfato de sodio a 0.2% (p/v). Los chips se secaron y se escanearon en un escáner para disposiciones Genlll (Molecular Dynamics). Los datos de intensidad general del mismo experimento se normalizaron al percentil 75 a través de todos los chips. Cada identificador de genes se manchó dos veces sobre cada chip, y se hibridaron chips duplicados con cada muestra marcada. De esta manera, se generaron puntos de datos por cuadruplicado para cada identificador de genes (n = 4).

IV. Análisis de datos de la hibridación de las microdisposiciones Se analizaron las intensidades de las manchas de las microdisposiciones normalizadas, usando el paquete de software OmniViz Pro™ (versión 1.611 ; OmniViz, Maynard, MA). Se extrajeron datos de la base de datos Chip 2.1 de ADN (La Jolla Biolnformatics Datábase, RWJPRl, La Jolla, CA). Se descargaron intensidades medias, coeficientes de variación y anotaciones para el tipo de chip usado en el experimento. Se ajustó el umbral de datos de intensidad a 35 unidades; es decir, se incrementaron valores menores de 35 unidades a 35 unidades antes de la construcción de la relación. Se crearon relaciones dividiendo los valores experimentales llevados al umbral, mediante el valor control adecuado llevado al umbral. Se procesaron los datos mediante agrupamiento de las medias de k (Quackenbush, Nat Rev Genet. (2001) 2: 418-27), usando una métrica de correlación, con el número de grupos ajustado a 65. Después, se filtraron los datos para remover cualquier relación igual a o menor de 2 veces (respecto a una de las muestras de referencia), y cualquier identificador de genes con coeficientes de variación a través de cualquiera de las cuatro intensidades de manchas mayores de 50%. Por último, los datos filtrados se procesaron mediante agrupamiento jerárquico promedio usando una métrica de correlación con el dendrograma resultante cortado para dar 50 grupos.

V. El gen supresor de tumores putativo DMBT1. fue inducido en endometrio de mono tratado con estróqeno Un total de 237 identificadores de genes fue sobrerregulado o subregulado más de dos veces en animales tratados con estrógeno (Ovx/E2) en comparación con animales ovariectomizados tratados con vehículo (Ovx/Placebo). Esto incluyó genes que se sabía previamente son regulados por estrógeno, tales como PR (Touitou et al. (1989) Mol. Cell. Endocrinol., 66: 231-238, con sobrerregulación de tres veces, y la proteína 3 de unión a factor de crecimiento tipo insulina (Liu eí al. (1997), Mol. Hum. Reprod., 3: 21-26), con subregulación de 10 veces. Están presentes otros genes que no se sabía previamente son regulados por estrógeno. Un gen de particular interés, no conocido previamente por ser regulado por estrógeno, y que se identificó por ser fuertemente inducido por estrógeno, fue el gen supresor de tumores putativo DMBT1 (gen 1 eliminado en tumores cerebrales malignos). Se encontró que la expresión de DMBT1 es sobrerregulada 37 veces por estrógeno. Los resultados de los datos de expresión génica, incluyendo sobrerregulación de DMBT1 , se confirmaron con una segunda ronda de experimentos de hibridación con un segundo tipo de chip, usando las mismas muestras de ARN. El segundo tipo de chip contiene aproximadamente 5,600 identificadores de genes únicos, incluyendo los identificadores que están en el primer tipo de chip. De acuerdo a estos datos, la expresión génica de DMBT1 fue sobrerregulada fuertemente en respuesta a estrógeno en el endometrio y, por lo tanto, un incremento en la expresión génica regulada por DMBT1 se correlaciona con actividad agonista de estrógeno. Para verificar estos resultados, se llevó a cabo RT-PCR cuantitativa en algunas de las muestras de ARN. Se encontró que la expresión de DMBT1 aumentó de 3000 a 9000 veces después del tratamiento con estrógeno. La mifepristona previno el incremento en los niveles de ARN mensajero de DMBT1 en los tres monos, según se evaluó mediante análisis de microdisposiciones y PCR (ejemplo 6). No se detectó expresión de DMBT1 en endometrios de monos tratados con gonadotropina.

EJEMPLO 2 Los moduladores del receptor de estróqeno selectivos tamoxifeno y raloxifeno, incrementan la expresión de DMBT1 en el endometrio de rata El siguiente ejemplo demuestra que la expresión de DMBT1 fue sobrerregulada en endometrio de rata en respuesta a dos compuestos, tamoxifeno y raloxifeno, que tienen actividad de estrógeno selectiva in vivo. El ejemplo demuestra también que la expresión de DMBT1 no fue sobrerregulada en endometrio de rata en respuesta a un compuesto que tiene actividad antagonista de estrógeno. Por lo tanto, estos datos muestran que la expresión génica regulada por DMBT1 puede usarse como marcador para diferenciar un compuesto que tiene actividad agonista de estrógeno, y en particular un compuesto que tiene actividad de estrógeno selectiva, de un compuesto que no tiene actividad de estrógeno alguna, por ejemplo, un antagonista de estrógeno. El tamoxifeno y el raloxifeno son SERMs que muestran actividad agonista de estrógeno sobre el hueso, mientras que demuestran actividad agonista de estrógeno débil sobre el endometrio (Miller (2002) Curr. Pharm. Des., 8: 2089-2111 ). ICI 182780 es un antagonista de estrógeno que ejerce su actividad sobre muchos tejidos que tienen receptores de estrógeno.

I. Modelos animales y tratamiento con fármacos Se usaron 10 grupos de ratas Sprague Dawley hembras de 22 días (3 animales por grupo), para evaluar los efectos de estrona, tamoxifeno, raloxifeno e ICI 182780, sobre la expresión de DMBT1 en el útero. Los siguientes grupos de ratas se trataron por 3 días, de la manera siguiente: Todos los tratamientos se suministraron oralmente en Methocel a 0.5%. Después del tratamiento, los animales fueron sometidos a eutanasia, y los úteros se colectaron, se pesaron, se congelaron en nitrógeno líquido, y se almacenaron a -20°C. Se purificó ARN de los úteros congelados usando 1.0 mL de reactivo TRIzol (Invitrogen) y un homogenizador de tejidos PowerGen 25 (Fisher Scientific), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se determinaron los pesos de los úteros en la necropsia, y se muestran en la figura 1. En ratas, los úteros se incrementan en tamaño bajo la influencia proliferativa del estrógeno, y este incremento en tamaño puede medirse pesando los tejidos. Como se muestra, el tratamiento con estrona (E) duplica el peso uterino, mientras que el tratamiento con tamoxifeno (T) incrementa el peso uterino sólo moderadamente, y el tratamiento con raloxifeno (R) no afectó en forma significativa el peso uterino, ya sea positivamente o negativamente (los pesos de los úteros control y tratados con raloxifeno, fueron equivalentes dentro de los márgenes de error calculados). El tratamiento con el antagonista de estrógeno ICI 182780 (I) resultó en un decremento significativo en el peso uterino. El co-tratamiento con estrona y tamoxifeno (E + T) y estrona y raloxifeno (E + R) resultó en menores pesos uterinos, en comparación con estrona (E), y fueron similares a los pesos uterinos de úteros tratados con tamoxifeno (T) y raloxifeno (R), respectivamente. El co-tratamiento con estrona e ICI 182780 (E + I) resultó en un peso uterino promedio que estaba aproximadamente entre el peso de los tratamientos con estrona (E) e ICI 182780 (I) solos. Estos resultados muestran que el raloxifeno e ICI 182780 son antagonistas de los incrementos del peso uterino inducidos por estrógeno, y que el tamoxifeno es un estimulador débil del peso uterino; es decir, es un agonista de estrógeno débil.

Análisis de la expresión génica A. Separación de muestras y Blotting Se llevó a cabo análisis Northern para determinar la expresión génica, incluyendo la expresión de DMBT1 , en el útero de ratas control y tratadas. Para electroforesis en gel, se añadieron muestras que contenían 2 µg de ARN total en un volumen de 2 µL de agua, a 6 µL de colorante de carga de formaldehído (Ambion), y se incubaron a 65°C por 20 minutos. Se añadió entonces a cada muestra 1 µL de una solución de 0.1 mg/mL de bromuro de etidio. Las muestras se cargaron sobre IX MOPS, geles de agarosa seguros SeaKem Gold a 1.25% (Bio Whittaker Molecular Applications), y se separaron mediante electroforesis en 1X NorthemMax, 10X regulador de pH corriente en gel MOPS (Ambion) a 70 voltios, hasta que los colorantes hubiesen migrado aproximadamente una tercera parte (xileno cianol) y dos terceras partes (azul de bromofenol), respectivamente, a través del gel. El ARN se transfirió a una membrana Hybond-N (Amersham) por 7 días mediante blotting por transferencia capilar, usando 10X SSC (citrato de sodio a 0.15 M, pH 7.0, NaCI a 1.5 M), después de lo cual las membranas se tiñeron con bromuro de etidio, se destiñeron con agua, y se fotografiaron para comparación de carga en los campos. Las membranas se secaron entonces al aire y se mantuvieron a temperatura ambiente hasta la hibridación.

B. Preparación de la sonda de DMBT1 Se obtuvo de Incyte Genomics (ID#:0000101155000011), una provisión de glicerol de un clon bacteriano que poseía un plásmido (pINCY) que contenía el gen de ebnerina de rata (DMBT1). La provisión de glicerol se sembró por estría sobre una placa de agar LB + 100 µg/mL de ampicilina (KD Medical), y se desarrolló a 37°C durante la noche. Se seleccionó una colonia y se usó para inocular 200 mL de caldo Lennox L (Sigma) + 50 µg/mL de ampicilina (Sigma). El cultivo líquido se desarrolló durante la noche a 37°C, y se colectaron las bacterias mediante centrifugación. Se llevó a cabo purificación de ADN de plásmido usando un maxiequipo de plásmidos QIAfilter (QIAgen), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se trató plNCY/DMBT1 purificado con las enzimas de restricción EcoRI y Noíl (Promega), para la preparación y el aislamiento de un fragmento de AD? de 1,174 pares de bases que contenía la sonda de ebnerina (DMBT1 ). Los productos de la reacción de las enzimas de restricción se separaron mediante electroforesis sobre un gel de agarosa seguro SeaKem Gold a 1%, IX TAE, y se separó la banda que correspondía al clon de ebnerina de AD? de 1.174 kb. La sonda de AD? de ebnerina se purificó de la rebanada de gel usando un equipo de extracción en gel QIAquick (QIAgen), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se eluyó AD? unido de la columna QIAgen con 50 µL de regulador de pH de elución. La sonda de AD? de ebnerina en el eluato se cuantificó mediante comparación con un estándar de AD? mediante electroforesis en gel. La sonda de AD? de ebnerina se diluyó entonces a una concentración final de 25 ng/µL. Se obtuvo una sonda cebada al azar a partir de 25 ng del AD? de ebnerina purificado usando un equipo DECAprime II (Ambion) y Redivue a-32P dATP (10 mCi/mL) (Amersham), de acuerdo a las instrucciones del fabricante, salvo que la reacción se incubó por 30 minutos a 37°C. Después de la adición de EDTA para detener la reacción, la sonda marcada se purificó usando un equipo de remoción de nucleótidos QIAquick (QIAgen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante, siendo 50 µL el volumen final de la sonda eluida. Se contaron 2 µL en un contador de escintilación para asegurar incorporación óptima de radionúclidos (>2x106 cpm/µL).

C. Hibridación v análisis de la sonda La membrana de transferencia descrita en la sección A se remojó en 2X regulador de pH SSC (Sigma) por 15 minutos, y se pre-hibridó entonces en 10 mL de RapidHyb (Amersham) a 65°C por 20 minutos. La sonda se hirvió por 10 minutos, y se añadieron 25 µL a 10 mL de RapidHyb, precalentado a 65°C. La membrana de transferencia se añadió a la solución diluida de la sonda y se incubó, con rotación, en un horno de hibridación por aproximadamente 10 horas. La membrana se removió de la solución que contenía a la sonda, y se enjuagó 2 veces con 2X SSPE + SDS a 0.5% + pirofosfato a 0.5% a temperatura ambiente, y se levó entonces una vez, con agitación suave, por 30 minutos a temperatura ambiente en la misma solución. La membrana se lavó entonces dos veces por 30 minutos a 65°C con agitación suave en 0.5X SSPE + SDS a 0.5% + pirofosfato a 0.5%. Después del último lavado, la membrana se transfirió sobre toallas de papel, se envolvió en Sarán Wrap, y se expuso a un tamiz de formación de imágenes de fosforescencia por 5 horas. El tamiz de fosforescencia se exploró con un STORM 840 (Molecular Dynamics) usando el software IQ Tools 2.2 (Molecular Dynamics). La sonda hibridada se visualizó y se cuantificó con Image Quant 5.2 (Molecular Dynamics).

Los efectos de los varios tratamientos sobre la expresión de DMBT1 , se muestran en las figuras 2 y 3A a 3B. La figura 2 muestra que la expresión de DMBT1 aumentó sustancialmente en los tejidos uterinos tratados con estrona (E) (aproximadamente 5 veces), así como los tejidos uterinos tratados con tamoxifeno (T) y raloxifeno (R) (aproximadamente 5 veces y aproximadamente 6.5 veces, respectivamente). Sin embargo, el tratamiento con IC1 182780 (I) resultó en niveles indetectables de expresión de DMBT1 en el tejido uterino. La figura 3A muestra que la expresión de DMBT1 aumentó ligeramente cuando se co-administró tamoxifeno con estrona (E + T), y que la combinación de estrona y raloxifeno (E + R) resultó en un incremento aditivo en la expresión de DMBT1. La expresión de DMBT1 fue reducida moderadamente cuando se incluyó ICI 182780 con el tratamiento con estrona (E + T). Estos resultados demuestran que un incremento en la expresión de DMBT1 puede ser causado por compuestos que tienen una actividad estrogénica, tal como estrona (E). En forma sorprendente, los compuestos que demuestran actividad de estrógeno selectiva, tales como tamoxifeno (T) y raloxifeno (R), estimulan también fuertemente la expresión de DMBT1 aún cuando tuvieron cuando mucho un efecto modesto sobre el crecimiento uterino. Estos resultados demuestran que puede usarse DMBT1 para identificar compuestos que tienen una actividad estrogénica, incluyendo compuestos que tienen actividad estrogénica selectiva tales como SERMs, y en particular, compuestos que tienen un efecto positivo sobre el crecimiento uterino. Este ejemplo muestra también que diferencias en la expresión de DMBT1 pueden permitir diferenciación de un compuesto que tiene una actividad estrogénica o una actividad estrogénica selectiva, de un compuesto que tiene una actividad estrogénica negativa, por ejemplo, una actividad antagonista. En general, los datos indican que la expresión de DMBT1 o la expresión regulada por la secuencia de DMBT1, puede correlacionarse con actividad estrogénica y actividad estrogénica selectiva. Además, los datos en este ejemplo que ilustran la operabilidad de la invención en un sistema de modelo de rata, junto con los datos del ejemplo 1 que detallan la operabilidad de la ¡nvención en un sistema de modelo de mono, apoyan la premisa de que un incremento en la expresión de DMBT1 o la expresión génica controlada por una secuencia reguladora de DMBT1 , puede correlacionarse con una actividad agonista de estrógeno y actividad estrogénica selectiva en mamíferos en general.

EJEMPLO 3 Un modulador del receptor de estrógeno selectivo mejorado incrementa la expresión de DMBT1 en el endometrio de rata El siguiente ejemplo demuestra que la expresión de DMBT1 fue sobrerregulada en endometrio de rata en respuesta a un compuesto recién descubierto, 5SA-DCC, que tiene actividad estrogénica selectiva in vivo. El ejemplo demuestra también que la expresión de DMBT1 no fue sobrerregulada en endometrio de rata en respuesta a un compuesto que tiene actividad estrogénica negativa y actividad bloqueadora de estrógeno en tejido endometrial, pero que tiene actividad estrogénica sobre marcadores de hueso y sangre. Por lo tanto, en forma similar al ejemplo 2, estos datos muestran que la expresión génica regulada por DMBT1 puede usarse como marcador para diferenciar un compuesto que tiene actividad estrogénica, y en particular un compuesto que tiene actividad estrogénica selectiva, de un compuesto que tiene actividad estrogénica negativa, en particular actividad estrogénica negativa sobre tejido endometrial.

I. Modelos animales v tratamiento con fármacos Mediante el uso de un procedimiento similar al descrito en el ejemplo 2, se usaron 6 grupos de ratas Sprague Dawley hembras de 22 días (tres animales por grupo) para evaluar los efectos de estrona y los SERMs 5KA-DCC (5 ?-aril-5,11dihidro-cromeno(4,3-c)cromeno) y 5SA-DCC: 5S-aril-5,11dihidro-cromeno(4,3-c)cromeno) sobre la expresión de DMBT1. 5RA-DCC y 5SA-DCC se describen en la solicitud de patente de E.U.A. comúnmente asignada No. 60/341957, titulada "Novel Heteroatom Containing Tetracyclic Derivatives as Selective Estrogen Receptor Modulators", por Kanojia, R, eí al. Los animales se trataron por 3 días de la manera siguiente: La administración de los tratamientos y la colecta de las muestras de tejidos, se llevaron a cabo de acuerdo al procedimiento descrito en el ejemplo 2. Se purificó ARN, se transfirió y se híbrido con ADNc de ebnerina de rata marcado radiactivamente, como se describe en el ejemplo 2. Los efectos del tratamiento con estrona y los SERMs 5RA-DCC y 5SA-DCC sobre los pesos uterinos de rata, corregidos para peso corporal, se muestran en la figura 4. Como se muestra en el ejemplo 2 (figura 1) y de nuevo en este ejemplo (figura 4), el tratamiento con estrona (E) más que duplicar el peso uterino, refleja la actividad agonista de la hormona sobre este tejido. 5RA-DCC estimula débilmente el peso uterino por sí mismo, y antagoniza el incremento del peso uterino en presencia de estrona. A este respecto, 5SA-DCC es similar al tamoxifeno (figura 1). En contraste a los otros compuestos estrogénicos o compuestos estrogénicos selectivos que sobrerregulan la expresión de DMBT1 , 5RA-DCC demuestra actividad estrogénica negativa y actúa también como un compuesto bloqueador estrogénico con respecto a la estimulación de la ganancia de peso uterino.

II. Expresión de DMBT1 Los efectos del tratamiento con estrona, 5RA-DCC y 5SA-DCC sobre los niveles de ARN mensajero de DMBT1 en endometrio de rata, se muestran en la figura 5. El efecto del tratamiento con estrona sobre la expresión del ARN mensajero de DMBT1 , se correlaciona con el descrito en el ejemplo 2 (figura 2). 5SA-DCC estimuló fuertemente la expresión de DMBT1 en el endometrio de rata (más de 4 veces). Lo que es interesante destacar, la combinación de 5SA-DCC y estrona proveyó un efecto sinergístico sobre la expresión de DMBT1 , estimulándola más de 8 veces. Estos resultados son similares a los efectos del tamoxifeno, y más particularmente raloxifeno sobre la expresión de DMBT1. En contraste, 5f?A-DCC, por sí mismo, no estimula la expresión génica de DMBT1. Lo que es interesante destacar, 5RA-DCC bloquea fuertemente la sobrerregulación de DMBT1 inducida por estrona, disminuyendo el nivel de expresión de DMBT1 aproximadamente 6 veces.

EJEMPLO 4 Una prueba basada en células regulada por la secuencia de DMBT1, útil para la identificación de agonistas de estróqeno El siguiente ejemplo demuestra la construcción de una célula sensible a estrógeno que posee un ácido nucleico que tiene una secuencia reguladora de DMBT1 enlazada a una secuencia reportera. En respuesta a estrógeno, la célula promovió la transcripción de la secuencia reportera que fue detectable usando reactivos de prueba. El ejemplo muestra que este sistema de células es útil para detectar compuestos que sobrerregulan la transcripción controlada por la secuencia reguladora de DMBT1 y se correlacionan con actividad agonista de estrógeno y actividad agonista de estrógeno selectiva. La secuencia de la región 5' del gen de DMBT1 que incluye secuencias reguladoras de DMBT1 y secuencias de oligonucleótidos iniciadores usados para la preparación de vectores que incluyen secuencias reguladoras de DMBT1 , se muestra en el cuadro 2.

I. Construcción de ácidos nucleicos de reporteros de luciferasa/reguladores de DMBT1 A. PDMBT1/1 Se construyó un vector de plásmido que posee una porción reguladora del gen de DMBT1 , clonando una región hacia el extremo 5' del gen de DMBT1 de humano de -1347 a +41 (nucleótidos 2259-3647 de SEQ ID NO: 1) en el plásmido pGL3basic (Promega). El plásmido resultante fue nombrado como pDMBT1-1/luc. Primero, una porción 5' del gen de DMBT1 de los nucleótidos - 1347 a +41 , fue amplificada mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) a partir de ADN genómico de humano (Clontech), usando 1X regulador de pH de ADN polimerasa VENT, 40 pmoles de cada iniciador, dATP a 40 nM, dGTP a 40 nM, dCTP a 40 nM, dTTP a 40 nM, 1 ng de ADN de molde, y 4 unidades de ADN polimerasa VENT (New England Biolabs) en una reacción de 100 µL. El molde se desnaturalizó a 94°C por 5 minutos, seguido de 5 series de 5 ciclos de PCR de contacto. Los parámetros de PCR fueron: paso 1 , desnaturalización por 30 segundos a 94°C; paso 2, unión por 1 minuto, la temperatura de unión aumentando de 60°C a 70°C en incrementos de 2 grados cada 5 ciclos; paso 3, extensión a 72°C por 2 minutos. Después de 30 ciclos, hubo una extensión final por 5 minutos a 72°C. Se usaron los oligonucleótidos oDMBT1-1 : 5'- GAATTCACGCGTGATCCCAGACCCAGCTGCATTATCATTCTC-3' (SEQ ID NO: 2) y oDMBT1-2: 5'- GAATTCAAGCTTGGTGTGTCCTCTAGGGTGGTATATTTCTGC-3' (SEQ ID NO: 3) como iniciadores de PCR. Para facilitar ia clonación molecular, se incorporaron los sitios de restricción Mlul y Hind\\\ en SEQ ID NOs: 2 y 3, respectivamente. El producto de PCR de DMBT1 de 1.4 kb se purificó de la mezcla de reacción de PCR usando un equipo de extracción en gel QIAquick (QIAGEN), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El fragmento de ADN purificado fue precipitado entonces en etanol, y ligado a pGEM-T Easy (Promega), para crear pDMBT1-1/GEM-T. La reacción de ligación fue transformada en células competentes JM109 (Promega), y sembrada sobre una placa de agar LB + 100 µg/mL de ampicilina (KD Medical) con X-gal e IPTG (Sigma). Se colectaron colonias blancas, que indican transformantes positivos, y se usaron para inocular cultivos de 3 mL de caldo Lennox L (Sigma) + 100 µg/mL de ampicilina. Los plásmidos se purificaron de las células usando un equipo de minipreparaciones de ADN QIAGEN, de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los plásmidos purificados se analizaron mediante digestión por restricción, para identificar los que contenían el producto de PCR DMBT1.

B. pDMBT1-1/luc El fragmento del promotor de DMBT1 de 1.4 kb, de -1347 a +41 (nucleótidos 2259-3647 de SEQ ID NO: 1), fue subclonado en pGL3basic (Promega), que es un vector de reportero de luciferasa que carece de secuencias de intensificador o promotor eucariótico, de la manera siguiente: el plásmido resultante fue nombrado como pDMBT1-1/luc. Se purificó pDMBTI- 1/GEM-T de un cultivo de 200 mL usando un maxiequipo QIAfilter (QIAGEN), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El fragmento de DMBT1 de 1.4 kb tratado con H/pc/lll-Mlul, se removió de pDMBT1-1/GEM-T mediante digestión por restricción, y se aisló mediante electroforesis sobre un gel de agarosa seguro SeaKem Gold a 1 %, 1X TAE, y se purificó del gel usando un equipo de extracción en gel QIAquick. El ADN se eluyó de la columna QIAGEN con 50 µL de regulador de pH de elución, y se precipitó entonces con etanol. El fragmento de ADN purificado fue ligado subsecuentemente al plásmido pGL3basic que había sido digerido con Hind\\\ y Mlul, y purificado. El ADN de las reacciones de ligación fue transformado en E. coli, y los transformantes resultantes se analizaron como se describió anteriormente. El clon de pDMBT1/1-luc se secuenció a lo largo de la región entera derivada de PCR, para verificar la secuencia del clon (Lark Technologies).

C. pDMBT1-2/luc Otro vector de plásmido que posee una porción más grande de la secuencia reguladora del gen de DMBT1 , se construyó clonando una región hacia el extremo 5' del gen de DMBT1 de humano de -2921 a +41 (nucleótidos 685-3647 de SEQ ID NO: 1) en el plásmido pGL3basic (Promega). El plásmido resultante fue nombrado como pDMBT1-2/luc. Primero, se amplificó mediante el uso de PCR una porción 5' del gen de DMBT1 de los nucleótidos -2921 a -926 (nucleótidos 685-2680 de SEQ ID NO: 1 ). Se usaron los iniciadores oDMBT1-3:5'-5'- GAATTCGGTACCGCATTCCACTGGCCTGTTTTATGTTTTGGG-3'-3' (SEQ ID NO: 4) y oDMBT1-4: 5'-GCTTCTTTGCCATGCACTGTTCATCAGTAG-3' (SEQ ID NO: 5). El producto de PCR de 2 kb fue ligado a pGEM-T Easy (Promega) como se describió anteriormente, para crear pDMBT1-2/GEM-T. Se removió el producto de PCR del vector de pGEM-T mediante digestión con Kpn\, y fue subclonado en pDMBT1-1/luc digerido con Kpn\, como se describió anteriormente. Los subclones resultantes se seleccionaron para la orientación correcta del fragmento de 2 kb, mediante digestión con Ndel. La construcción pDMBT1-2/luc resultante tiene una región reguladora que consiste de los nucleótidos -2921 a +41 del gen de DMBT1.

D. pDMBT1-3/luc Se construyó otro vector de plásmido que posee una porción pequeña de la secuencia reguladora del gen de DMBT1 , clonando una región hacia el extremo 5' del gen de DMBT1 de humano de -2766 a -2734 (nucleótidos 840-872 de SEQ ID NO: 1) en el plásmido pTA-luc (BD Biosciences Clontech). Esta región de promotor, 5'- CAAGGTCAAGAGATCGACACCATCCTGGCCAAC-3' (SEQ ID NO: 6), forma parte de una repetición Alu. Se sintetizaron oligonucleótidos con la secuencia de SEQ ID NO: 5 y su complemento 5'-GTTGGCCAGGATGGTGTCGATCTCTTGACCTTG-3' (SEQ ID NO: 7) (Sigma Genosys). Los oligonucleótidos complementarios fueron unidos entre sí mediante calentamiento a 96°C por 3 minutos, y enfriando entonces lentamente. Se purificaron los oligonucleótidos unidos sobre un gel de agarosa BlO-gel a 3% (BIO101), seguido de extracción en gel con un equipo MERmaid (BIO101), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los oligonucleótidos fueron entonces ligados en sus extremos rasurados a un vector de promotor pGL3 (Promega), que había sido digerido con Smal y purificado como se describió anteriormente para pGL3basic. Las ligaciones fueron transformadas en la cepa JM109 de E. coli, y se secuenciaron los plásmidos que se encontró contenían las inserciones de tamaño adecuado. Un clon que tenía la secuencia correcta se seleccionó para uso posterior. Este plásmido se purificó con un maxiequipo de plásmidos QIAfilter, después de lo cual la inserción se removió mediante digestión con BglW y Mlu\, y ligada a pTA-luc (BD Biosciences Clontech), que fue digerida también con BglU y Mlu\. El plásmido resultante, nombrado como pDMBT1-3/luc, fue purificado con un maxiequipo de plásmidos QIAfilter.

E. pERE-luc Para un control positivo, se construyó un vector que contenía una región reguladora que tenía dos elementos de respuesta de estrógeno (EREs) en tándem del gen de vitelogenina de pollo (Klein-Hitpass eí al. (1986) Cell 46: 1053-1061) enlazado al gen reportero de luciferasa. Cuando se transformó en una célula sensible a estrógeno, este vector fue capaz de dirigir la expresión del gen de luciferasa en respuesta a una señal iniciada por estrógeno. Este vector fue nombrado como pERE-luc. El procedimiento de clonación es similar al procedimiento para pDMBT1-3/luc, salvo que se llevó a cabo clonación direccional. El oligonucleótido oERE-1 : 5'- GGAGCTAGCTAGAGGTCACAGTGACCTACGAGTCCCTAGAGGTCACAGT GACCTACGAGATCTGGA-3' (SEQ ID NO: 8), que es flanqueado por dos sitios de digestión por restricción Nhe\ y BglU, fue unido a oERE-2: TCCAGATCTCGTAGGTCACTGTGACCTCTAGGGACTCGTAGGTCACTGTG ACCTCTAGCTAGCTCC (SEQ ID NO: 9), purificado y digerido con N?el y BglU. El oligonucleótido unido digerido fue clonado en pTA-luc digerido con Nhel y BglU.

Se usó pERE-luc como un control positivo para la inducción por estrógeno de la expresión del reportero de luciferasa. Se usaron como controles negativos pTAbasic, pGL3basic y vectores de reportero vacíos.

II. Construcción de un vector que expresa un receptor de estrógeno de humano Se construyó un vector que codifica para una proteína receptora de estrógeno de humano, para preparar células transfectadas que expresan un receptor de estrógeno funcional. Un ADNc del receptor de humano de longitud completa (0.2 kb) fue clonado de ARN de testículo mediante RT-PCR, usando los iniciadores oER-1 : 5'-ACGGACCATGACCATGACCCT-3' (SEQ ID NO: 10) y oER-2: 5'-AGCTCTCAGACTGTGGCAGGGAAA-3' (SEQ ID NO: 11 ). El ADNc purificado fue clonado en el vector de clonación de TA pCR2.1 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Después de verificación de la secuencia, fue subclonado en pCI-neo (Promega, Madison, Wl) digerido con EcoRI. pCI-neo incluye una región reguladora de citomegalovirus, una región de poli(A) de SV40, y un marcador seleccionable de neomicina. La secuencia de pCI-ERa-neo se confirmó mediante análisis de secuencias.

III. Construcción de células hospederas que expresan un receptor de estrógeno funcional y que tienen reporteros de DMBT1 -luciferasa Se sembraron células embrionarias de riñon de humano HEK293 (ATCC) en placas de cultivo de 96 cavidades, a 20,000 células por cavidad en medio de prueba (DMEM-F12 [Sigma] + FBS a 10% inactivado con calor extraído con dextrán-carbón vegetal [Hyclone] + penicilina/estreptomicina). 24 a 30 horas después, las células fueron co-transfectadas individualmente con 10 ng/cavidad de una construcción de reportero como se describe en las secciones I .A. a I.E anteriores, y con o sin (control) 55 ng/cavidad de pCI-ERa- neo, usando 1 µL por cavidad de Lipofectamine 2000 (GibcoBRL). Aproximadamente 18 horas después de la transfección, las células se trataron con varias concentraciones de 17ß-estradiol en medio de prueba fresco por 24 horas.

IV. Prueba de luciferasa La actividad de luciferasa de la célula reportera se puso a prueba entonces usando reactivo de luciferasa Steady-Glo (Promega), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Esencialmente, 100 µL de reactivo Steady-Glo se añadieron directamente a cada cavidad de células transfectadas (descritas en III) 24 horas después del tratamiento con 17ß-estradiol. Después de incubación por 1 hora, el sobrenadante entero se transfirió a placas blancas de 96 cavidades, y la actividad de luciferasa se determinó con un luminómetro de placas de microtítulo MLX o un luminómetro Luminoskan Ascent con un tiempo de lectura de dos segundos por cavidad. La actividad de luciferasa de células tratadas con estrógeno co-transfectadas con cada una de las construcciones de reportero y pCI-ERa-neo, fue normalizada a: 1) la actividad de luciferasa de células que fueron transfectadas con las construcciones de reportero, pero no la construcción de receptor, y 2) células co-transfectadas con las construcciones de reportero y pCl-ERa-neo, pero no tratadas con 17ß- estradiol. Los resultados de un experimento de co-transfección, se muestran en la figura 6. Las células fueron co-transfectadas con pCl-ERa-neo y los vectores enlistados del lado derecho de esta figura. Las células co-transfectadas con pCl-ERa-neo y los vectores control pTA y pGL3, individualmente, que no están enlazados a una región reguladora, produjeron una señal muy baja sobre una amplia gama de concentraciones de estradiol. Las células co-transfectadas con pCl-ERa-neo y pERE-luc produjeron una señal fuerte que dependió de la construcción de estradiol usada. Los datos provistos por estas transfecciones control, validan la funcionalidad del sistema de reportero basado en células. Células con-transfectadas con varios vectores de luciferasa/región reguladora de DMBT1 , produjeron los siguientes resultados. Primero, las células co-transfectadas con pCl-ERa-neo y pDMBT1-1/luc, que contienen -1347 a +41 de la región reguladora de DMBT1 (nucleótidos 2259-3647 de SEQ ID NO: 1), no fueron inducibles por estrógeno a ninguna de las concentraciones de estradiol puestas a prueba. Las células co-transfectadas con pCl-ERa-neo y pDMBT1-2/luc, que contienen -2921 a +41 de la región reguladora de DMBT1 (nucleótidos 685-3647 de SEQ ID NO: 1), fueron ligeramente inducibles por estrógeno sobre la escala de concentraciones de estradiol puestas a prueba. Por último, las células co-transfectadas con pCI- ERa-neo y pDMBT1/3-luc que contiene una porción mínima (33 pb) de la región reguladora de DMBT1 de -2766 a -2734 (nucleótidos 840-872 de SEQ ID NO: 1), fueron fuertemente inducibles por estrógeno en una forma dependiente de la dosis (mayor de cinco veces a una concentración máxima de estrógeno). Estos resultados demuestran que la porción hacia el extremo 5' de la región reguladora de DMBT1 , en particular la región de -2766 a -2734, es importante para la sensibilidad a estrógeno. En forma sorprendente, el vector DMBT1-2/luc, que contiene los nucleótidos -2921 a +41 (que incluye la región -2766 a -2734), casi no fue tan sensible a estrógeno como el vector pDMBT1-3/luc (que incluye sólo la región -2766 a -2734). Aunque sin desear que sea limitado por la teoría, es posible que uno o más elementos estén presentes en la región de la región reguladora de DMBT1 hacia el extremo 5' de -2766, y/o hacia el extremo 3' de -2734, que interfiere con la sensibilidad a estrógeno vía la secuencia Alu en por lo menos este tipo de sistema basado en células. Este ejemplo ilustra la construcción y utilidad de nuevos sistemas basados en células que expresan un receptor de estrógeno funcional y un vector que incluye una secuencia reguladora de DMBT1 enlazada operablemente a una secuencia de reportero. Más particularmente, demuestra nuevos sistemas basados en células que tienen un vector que codifica para un receptor de estrógeno funcional y un vector que incluye una secuencia reguladora de DMBT1 enlazada operablemente a una secuencia de reportero.

Este ejemplo ilustra también la construcción y utilidad de nuevas moléculas de ácido nucleico aisladas que tienen una región reguladora de DMBT1 que está enlazada operablemente a una secuencia de reportero, en donde el ácido nucleico puede ser sensible a señales inducidas por estrógeno en un sistema de células. Ácidos nucleicos útiles incluyen la secuencia -2766 a -2734 de la secuencia reguladora de DMBT1 (nucleótidos 840-872 de SEQ ID NO: 1 ). Otros ácidos nucleicos útiles incluyen una región reguladora de DMBT1 hacia el extremo 5' de -2734, y hacia el extremo 5' de -1347, incluyendo la secuencia -2766 a -2734 (nucleótidos 840-872 de SEQ ID NO: 1), y que está enlazada operablemente a una secuencia de reportero.

EJEMPLO 5 Efectos de moduladores del receptor de progesterona (PRMs) sobre tejido endometrial de mono Como un primer paso en la investigación de los efectos que tienen los PRMs sobre la expresión de DMBT1 , se llevaron a cabo estudios para examinar la expresión génica en tejido endometrial de monos OVX que fueron co-tratados con estrógeno y un PRM. Los monos OVX co-tratados con estrógeno y un PRM, mostraron en general una disminución significativa en el espesor endometrial después de un período de tratamiento, respecto a estrógeno solo.

I. Animales v administración de fármacos Los animales y el tratamiento fueron iguales a los del ejemplo 1 , con las siguientes excepciones. Para estudiar el efecto de los PRMs sobre el endometrio y la expresión génica, se les administró a grupos de tres monos ovariectomizados (OVX) un implante de estrógeno (E2), más dosis diarias orales de los siguientes PRMs por 19 días: mifepristona a 10 mg/kg/día; 17N11 -DE (17ß-N-sustituido-11 ß-dimetilaminofenil-estra-4,9-dien-3-ona) a 1.0, 3.0 ó 10 mg/kg/día; y 17N11-PE (17ß-N-sustituido-11ß-piperidiniIfenil- estra-4,9-dien-3-ona) a 1.0, 3.0 ó 10 mg/kg/día. Se administró un placebo (metilcelulosa a 0.5%) como control. 17N11-DE y 17N11-PE son dos PRMs que se han descrito en la publicación del PCT No. WO 99/62928. Se tomaron muestras de tejido de endometrios y miometrios para análisis histológico. Se tomaron también muestras de tejido de endometrios para estudios subsiguientes de la expresión génica como se describe en el ejemplo 5. Se colocaron biopsias en un contenedor estéril, y se congelaron instantáneamente de inmediato en nitrógeno líquido. Las biopsias se transfirieron entonces a un congelador a -80°C, y se almacenaron hasta que se requirieran.

II. Resultados Los espesores endometriales promedio en monos OVX tratados y control, se muestran en el cuadro 1. En animales que carecen de estrógeno, ya sea que fueran ovariectomizados o que recibieran leuprolida por 40 días, el endometrio es atrófico, con una capa estromática delgada a no existente. Con relación al cuadro 1 , el espesor del endometrio en el grupo ovariectomizado (A) es aproximadamente tres veces menor que el del endometrio tratado con leuprolida (B). Este resultado puede explicarse por diferencias en los niveles de hormonas en suero residuales entre los dos grupos, en donde el grupo tratado con leuprolida tiene niveles de estradiol dos a tres veces mayores que el grupo ovariectomizado (20 a 30 pg/mL, contra aproximadamente 10 pg/mL, respectivamente) a lo largo del estudio. Después de 19 días de tratamiento con estrógeno, se observó el efecto hiperproliferativo típico de la hormona: la capa estromática se engrosa dramáticamente, y existe formación de glándula secretoria naciente. Al obtenerse el promedio de los datos para los tres monos en cada grupo, el endometrio estimulado por estrógeno (C) es siete a ocho veces más grueso de lo que está en el control ovariectomizado (A), y 2.5 veces más grueso que el endometrio castrado químicamente (B). Cuando un PRM (por ejemplo, mifepristona, 17N11-DE o 17N11-PE) es co-administrado a una alta dosis (máximamente eficaz), el endometrio se contrae hasta casi el espesor del que se observa con tejido tratado con leuprolida (cuadro 1). Existe cierta formación de glándula secretoria, pero las glándulas aparecen planas y desorganizadas. A dosis menores, el espesor endometrial parece ser reducido más por 17N11-DE que por 17N11 -PE (cuadro 1 ).

CUADRO 1 Espesor endometrial promedio en monos tratados" *Media de datos de tres animales; salvo en donde se indica. Promedio de dos animales. Ningún endometrio presente en el tercer animal.

EJEMPLO 6 Los PRMs inhiben la expresión qénica de DMBT1 en endometrio de mono tratado con estrógeno/PRM Se tomaron muestras de tejido de endometrios de los monos ovariectomizados co-tratados con estrógeno y PRMs o un placebo, como se describe en el ejemplo 5. Se llevó a cabo la preparación de ARN total de estas muestras, preparación de la sonda e hibridación de microdisposiciones de ADN, siguiendo un procedimiento exactamente como el que se describe en el ejemplo 1. Mediante el uso de dos veces regulación a través de todos los ¡dentificadores experimentales como un punto de limitación, respecto a estrógeno sólo, se alteró la expresión de 164 identificadores de genes en presencia de 10 mg/kg/día de mifepristona 163 en presencia de 10 mg/kg/día de 17N11-PE, y 467 en presencia de 10 mg/kg/día de 17N11-DE. La mayoría de los genes adicionales que fueron alterados por 17N11-DE, fueron regulados menos de 2.5 veces. Los PRMs inhibieron la inducción de la expresión génica de DMBT1 por estrógeno, en una forma dependiente de la dosis. Con relación a la figura 7, el análisis de microdisposiciones reveló que los niveles de ARN mensajero de DMBT1 inducidos por estrógeno fueron reprimidos aproximadamente 20 veces por 10 mg/kg de mifepristona, aproximadamente 5 veces por 1 mg/kg de 17N11-DE, aproximadamente 25 veces por 3 mg/kg de 17N11-DE, aproximadamente 2 veces por 1 mg/kg de 17N11-PE, y aproximadamente 4 veces por 3 mg/kg de 17N11-PE. De acuerdo a estos datos, la expresión génica de DMBT1 fue subregulada en el endometrio en respuesta a los PRMs cuando se co-administraron con estrógeno.

EJEMPLO 7 Una prueba basada en células regulada por la secuencia de DMBT1 útil para la identificación de agonistas de progesterona (y PRM) Una célula sensible a estrógeno y progesterona que posee un ácido nucleico que tiene una secuencia reguladora de DMBT1 enlazada a una secuencia de reportero, se construye y se usa para seleccionar para compuestos de prueba que tienen actividad antagonista de progesterona, tal como los PRMs. Como se demuestra en el ejemplo 4, las células transfectadas con los vectores de reportero de DMBT1 y ER, fueron capaces de producir una señal cuando se aplicó estradiol a las mismas. Un vector que expresa un receptor de progesterona funcional es transfectado en estas células, y se usa para identificar compuestos de prueba que modulan la señal promovida por ER a través del receptor de progesterona.

I. Vector de reportero de luciferasa/DMBT1 Vectores como los que se describen en el ejemplo 4, se introducen en un tipo de célula adecuado para la prueba. Vectores de reportero particularmente útiles incluyen la secuencia Alu de la región reguladora de DMBT1 fusionada a un gen de luciferasa tal como pDMBTI-3/Iuc. Otros vectores de reportero pueden construirse y se pueden usar, por ejemplo, como es el caso de vectores que contienen secuencias reguladoras de DMBT1 , o una porción de las mismas, que están enlazadas operacionalmente a otros genes reporteros tales como cloranfenicol acetiltransferasa o galactosidasa.

II. Vectores de receptores de estrógeno y progesterona La actividad de un PRM se evalúa usando una célula que expresa receptores funcionales de estrógeno y progesterona. Vectores que codifican para un receptor de estrógeno funcional tal como pCI-Era-neo, que se han descrito en el ejemplo 4, se introducen en un tipo de célula adecuado para la prueba. Asimismo, un vector que codifica para un receptor de progesterona (PR) funcional, se construye y se introduce en la misma célula que el vector de ER. Vectores para la expresión de PR se han construido anteriormente y se describen, por ejemplo, en Conneely eí al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 149: 493-501. El receptor de PCR es clonado en un vector que permita la expresión en células eucarióticas, tales como células de mamífero. El vector de PR puede incluir secuencias de intensificador y promotor que dirigen la expresión de PR, una secuencia de señal de poliadenilación, y marcadores seleccionables para mantenimiento en células, tal como un gen de neomicina. Vectores que contienen estos elementos están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Promega (Madison, Wl), y técnicas conocidas permiten la clonación del gen de PR en un vector de expresión adecuado en cualquier forma deseada. En algunos casos, los genes de ER y PR se ponen sobre un vector de expresión, y se introducen en una célula para expresión de estos genes. Como una alternativa a la introducción de vectores que tienen genes de ER y PR, un vector individual que posea el gen de ER o PR se introduce en una célula que provea la expresión endógena de PR o ER, respectivamente. Tipos de células adecuados se describen a continuación.

III. Células que expresan ER o PR endógeno El vector de reportero de luciferasa/DMBT1 y el vector de expresión de PR o ER, se introducen en una línea de células que provea la expresión endógena de ER o PR, respectivamente. El vector de reportero y el vector de ER se introducen en la línea de células de mama, T47D (Horwitz, K. B. eí al. (1982) Cell 28: 633), que expresa PR (y bajos niveles de ER), o el vector de reportero y el vector de PR se introducen en la línea de células de mama, MCF7 (Shupnlk M A et al. (1989) Mol. Endocrinol. 3: 660), que expresa ER. En forma alternativa, y como se indicó anteriormente, los genes de reportero, ER y PR se introducen en una línea de células adecuada. Los vectores se introducen en las células usando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, precipitación con fosfato de calcio y electroporación. Equipos y dispositivos disponibles comercialmente están disponibles para llevar a cabo estas técnicas, tales como el equipo de transfección CellPhect™ de Pharmacia (Piscataway NJ), y el Cellporator y Lipofectin™ de Invitrogen Life Technologies (Gaithersburg, MD). Después de la introducción de los vectores en las células mediante cualquiera de estos métodos, las células pueden seleccionarse con base en un marcador seleccionable, producción de reportero constitutivo, inducción de expresión de reportero por estrógeno, inhibición de inducción de estrógeno por PRMs, unión satisfactoria a placas de microtítulo usadas en la selección de alto rendimiento, y desviación estándar aceptable en pruebas de expresión de reportero por inducción de estrógeno múltiple. Los clones que satisfacen los criterios necesarios para una selección de alto rendimiento, se seleccionan entonces para su uso. Como una alternativa a la generación de clones estables, se usa transfección transitoria. Se usarían células transfectadas para prueba 12 a 24 horas después.

IV. Prueba de bioluminiscencia Para poner a prueba la expresión de luciferasa en células transfectadas, las células se incuban con varias concentraciones de estrógeno, en presencia o ausencia de un compuesto de prueba que se sospecha tiene actividad anti-progestogénica. Las células tratadas se ponen a prueba entonces de acuerdo al procedimiento usado en el ejemplo 4. Específicamente, las células son Usadas en un regulador de pH que contenga reactivos de lisis y un substrato de luciferasa tal como Steady-Glo™ (Promega, Madison, Wl) o LucLite™ Plus (Packard, Meriden CT). Los lisados se incuban a temperatura ambiente. Se lleva a cabo la medición dentro de 2 horas de lisis. Se detectan fotones usando un instrumento sensible a la luz, tal como un luminómetro (por ejemplo, Luminoscan Ascent (ThermoLab Systems, Franklin, MA)), o contador de escintilación (por ejemplo, TopCount (Packard)). Típicamente, cada cavidad se lee por 0.1 a 2 segundos.

V. Selección de alto rendimiento Las células de reportero de luciferasa (clones o transfectadas transitoriamente) se lavan primero con PBS, se cosechan, y se hace el conteo de las mismas, usando un hemocitómetro y el método de exclusión por azul trípano, de acuerdo a protocolos provistos por Sigma Chemical Company, St. Louis, MO. Las células se diluyen entonces en medios, y se siembran 0.2 mL de la suspensión de células en cada cavidad de una placa de microtítulo de 96 cavidades, usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. 12 a 24 horas después, se añade estrógeno (a una concentración final de 0.1 a 10 nM) a las células sobre la placa de microtítulo. Añadido también es el compuesto de prueba o un volumen igual del solvente en el cual el compuesto de prueba se disuelve. Por lo tanto, cada cavidad de prueba en la placa de prueba contiene células de reportero de luciferasa, estrógeno y el compuesto de prueba, mientras que cada cavidad control en la placa de prueba contiene células de reportero de luciferasa, estrógeno y el control de solvente. Una serie adicional de cavidades control contiene sólo células de reportero y el control de solvente. La placa de prueba se incuba por 12 a 48 horas a 37°C en C02 a 5%. Las células son usadas entonces, y se detecta la luminiscencia como se describió anteriormente. Se procesan los datos. La señal bioluminiscente detectada en la cavidad de prueba se compara con la señal de la cavidad control que contiene estrógeno. Un compuesto de prueba con actividad anti-progestogénica resultará en una señal bioluminiscente disminuida en comparación con el último control.

EJEMPLO 8 Efectos de la progestina sobre el tejido endometrial de rata Se dosificó por 1 a 6 semanas a ratas Wistar ovariectomizadas de 6 semanas (Charles River, Wilmington, MA), con vehículo o compuestos de prueba. Todos los tratamientos se suministraron oralmente, una vez al día, en metilcelulosa a 0.5% o aceite de ajonjolí. Después del tratamiento, se removieron los úteros y se purificó ARN total de los tejidos usando reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA), según indicaciones del fabricante. Se llevaron a cabo reacciones en cadena de polimerasa-transcripción inversa cuantitativa (RT-PCR) de DMBT1 de muestras de ARN de rata, usando un equipo de mezcla maestra para RT-PCR de un paso (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un sistema de detección de secuencias ABI Prism 7000 (Applied Biosystems), según indicaciones del fabricante. Se obtuvieron iniciadores disponibles comercialmente y sondas de MGB marcadas con FAM, para DMBT1 de humano y rata (números de catálogo Hs00244827_m1 y Rn00575705_m1 , respectivamente), de Applied Biosystems (Foster City, CA). Se normalizaron los niveles de ARN mensajero contra los niveles de ARN ribosomal 18S determinados, usando iniciadores y una sonda marcada con VIC y TAMRA del mismo proveedor. Los resultados como se evalúan mediante PCR cuantitativa, se muestran en la figura 3B. El tratamiento con etinil estradiol por un día (preparación de ARN aproximadamente 24 horas después de una sola dosis), resultó en un incremento significativo en los niveles de ARN mensajero de DMBT1. La inducción fue máxima (seis veces) a una dosis de 0.3 mg/kg del estradiol. El co-tratamiento con una progestina (acetato de medroxiprogesterona) bloqueó el incremento en los niveles de ARN mensajero en una forma dependiente de la dosis, un efecto que fue bloqueado a su vez por 10 mg/kg del antagonista de progestina, mifepristona.

EJEMPLO 9 Análisis inmunohistoguímico de la expresión uterina Se dosificó a ratas Wistar (Charles River) maduras de 6 semanas, seudo-operadas u ovariectomizadas, con etinil estradiol, tamoxifeno o raloxifeno, por seis semanas. Se removieron los úteros y se seccionaron para análisis inmunohistoquímico para expresión de DMBT1 , usando un anticuerpo de cabra policlonal contra la proteína humana. Se recortaron tejidos y se procesaron para inclusión en parafina, de acuerdo a métodos convencionales. Se cortaron secciones de 5 mieras, se montaron sobre portaobjetos microscópicos SuperFrost Plus + (Fisher Scientific, Pittsburg, PA), y se secaron durante la noche. Los protocolos para inmunohistoquímica (IHC) individual de rutina, se han descrito previamente (D' Andrea eí al., 2001 , Biotechnic Histochem. 76: 97-106). En resumen, secciones de tejido sobre portaobjetos microscópicos, se desparafinaron y se rehidrataron. Los portaobjetos se trataron con microondas por 5 minutos en regulador de pH objetivo (Dako, Carpenturia, CA), se enfriaron, se colocaron en solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS, pH 7.4), y se trataron con H202 a 3% (v/v) por 10 minutos a temperatura ambiente. Todas las incubaciones (30 minutos cada una) y los lavados se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Se colocó suero de bloqueo normal de conejo (Vector Labs, Burlingame, CA) en todos los portaobjetos por 10 minutos. Después de un breve enjuague en PBS, las secciones se trataron con anticuerpo primario de DMBT1 policlonal de cabra (1 :25, Hypromatrix, Worcester, MA). Los portaobjetos se lavaron entonces en PBS, y se trataron con anticuerpos secundarios biotinilados de anti-cabra de conejo (Vector Labs). Después de lavado en PBS, se añadió el reactivo de complejo de avidina-biotina-peroxidasa de rábano picante (HRP, Vector Labs). Todos los portaobjetos se lavaron y se trataron con 3,3'-diaminobencidina (DAB, Biomeda, Foster City CA) dos veces por 5 minutos cada una, se enjuagaron en agua destilada, y se contratiñeron con hematoxilina. Protocolos para IHC dobles se han descrito previamente (D' Andrea eí al., 2001 , citado anteriormente). Se detectó el anticuerpo de PCNA (antígeno nuclear de células proliferantes) policlonal de conejo (1 :4000; Sigma, St. Louis, MO) usando el sistema de detección HRP:SG como se describió para IHC individual de rutina, salvo por el uso del cromógeno SG (Vector Labs). El segundo anticuerpo primario, específico para DMBT1 , se incubó en forma similar en los tejidos. Después de lavados, el anticuerpo anticabra de cabra secundario biotinilado (Vector Labs) se colocó sobre los portaobjetos por 30 minutos a temperatura ambiente. Después, las secciones se trataron con el reactivo ABC de fosfatasa alcalina (AP-ABC, Vector Labs) por 30 minutos. Se detectó entonces DMBT1 usando el cromógeno rojo rápido (Sigma, St. Louis, MO). Los portaobjetos se sumergieron en hematoxilina, y se les colocó un cubreobjetos con un medio de montaje basado en agua (Dako). Los controles negativos incluyeron: 1 ) reemplazo de cada anticuerpo primario con suero no inmune, 2) omisión de cada anticuerpo primario, y 3) controles negativos dobles. Se encontró que, en comparación con el sustituto (panel A) y el control ovariectomizado, el tratamiento con estrógeno produce el engrasamiento esperado del epitelio luminal, el cual fue aún más pronunciado después del tratamiento con tamoxifeno, pero no con tratamiento con raloxifeno (datos no mostrados). Este efecto sobre el epitelio se correlacionó con efectos generales sobre el peso uterino (figura 1 ). La tinción de DMBT1 se restringió al epitelio luminal, con poca o ninguna tinción en epitelios glandulares o en células estromáticas. Sin embargo, la tinción en el epitelio luminal fue variable, con algunas células teñidas intensamente, otras teñidas débilmente, y otras no teñidas en lo absoluto. El raloxifeno, y especialmente el tamoxifeno, parecieron producir niveles mayores de DMBT1 en células que el estrógeno. La tinción fue extracelular en todos los casos. En epitelio uterino tratado cono estrógeno, seudo-operado y ovariectomizado, la tinción ocurrió predominantemente en el aspecto luminal de la célula. En contraste, la tinción se distribuyó uniformemente en todas las células positivas en el epitelio de úteros tratados con SERM. Para determinar si una diferencia entre aquellas células que expresaban la proteína de DMBT1 , y aquellas que no permanecían en su estado prollferativo, los portaobjetos fueron co-teñidos con el anticuerpo de DMBT1 y el anticuerpo de PCNA. Aunque muchas células que expresaban DMBT1 se tiñeron también para PCNA, no hubo un traslape absoluto (datos no mostrados), indicando que la variabilidad de la expresión de DMBT1 se debe a más que el estado proliferativo de la célula. Aunque la especificación anterior enseña los principios de la presente invención, con ejemplos provistos con el propósito de ilustración, se entenderá que la práctica de la invención abarca todas las variaciones, adaptaciones y/o modificaciones usuales que están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes.

CUADRO 2 SEQ ID KO, 1 ggggga tga gtgaaggaag gtaggaaggg g ecccttat aaaccaattg ggaagaccgg 60 etctctgags aacaaaaatg agcgacafcta taaatafccap acataeaatg teaaaagafcfc 120 gttacaacag* taacaafegac cggcaattat ggtgtgctae tcaatgaggg taaaattaga 180 gtttggggtc agaotgaaae ctgaagggga gccatggtca dacagattac ?iggattcagg 240 gaotggaagg caaacagcag cagacggaag gtgctacagc accgaacctt cccascagg'c 300 fcaacagfccat tstgtccacc fcagtcfcgtea ggfccacaggg ctcstggctc agaaatcaga 360 gaccccfccag aggtgggagg tgggaggggc cafcgggctgc ctscctgatc tscgtcttcc 42D fcctggcttss cagggeactg gtctgtgggfc agaaagaafcc tttagaagaa ggagaacaac 4$0 gggctgtttt gggaagtdtg cctgggacee eagctaagafc tcgtggcagg gatgtgtgcc 540 tggcagcccs aggggcccfcg atgggcc±ct cagtgcdctg tsttatgaag ggaggtcttg 6Q0 gcttcccaca ggtaatccfcc ags ctgaag gcaggtggsc ctaggggagg ggcctggaag 660 aggactscst cacsaaag c aggagaattc sasfcggaefcg fcttcatgfctt tggggctfccc 720 ceatgaatfcc caafcfctagga aaggat±atg tagctttaaa aaaaaaagcc afcacatggcc 780 gggcgtggtg acfccatgaet gteafcafccag aacfcttgaga ggaagaggca ggaagatcgc 840 aaggtcaaga gatcgacace atoctggccg-acafcggtgaa acccfcgfcctc tactaaaaat 900 aaaaaagtta gctgggfcgfcg gtgatgcacg cctgtagttc agatactcg ggaggcfcgag 960 gcaggagaat cgcttgaact cg a gegg aggttgtagt gagscgagat tgcaccactg 10.20 cactccagac fcgggcgaaag aasaagactc cgtctfcaaaa taaataagfca aataaataaa 1080 taaatggasa aatafcgafccc agggggctcfc fccaccataac gascagfccct ctggtgctgg 1140 gafcttagggg cttggfccaca astcctggag tgtgctgtgg gggtgccgct ggcttaatfcg 1200 sctggggaag 'gtgctttgaa aatggggcce gggcgccgag tctctgagst fcfcaatgggct 1260 tatcttgstt catgttgttc ttcafcggcag ttstggggtg aataaaatgg aacbttgtgg 1320 ttgtggcctt ccaasccctg etgfcfctaagc agatgettct aaccagtong aaggggaaga 1380 tgagggtaat cfcggcagggg cfcgafcgctgg agaaggttgt aeccctgaac ecttctctts 1440 gtcsaaggaa agaccfccacfc aaafcggtgfcc ttatgagcea caaaatggcc ttgggacaag 1500 atgaggcaca fcgacggtgaa ggetgaggtc ccacacggtg ttggcaggfcg gccetcaaga 1560 ccattgtctt ctgcscgaat gcecaggaca gccacatccfc tccfcgttcca ctgacgtcac 1620 aoafcttcaca ccfcgggatgc ctacstggsG tggctttgaa atgácágcta ggcttcascá 1680 cttccttctt sctggtgtct cctgaacaaa aagetcaeaa accsfctattg tcteaggafcc 1740 ttfcfcctgcia actaacatgg gcaaaagatg cagtdaaaaa aacaaaaasg gggaggttac 1800 gcagttcaga aaatcccaaa cafcfccfcaaag aagggtgtac ccgaaaagct gagagataca 1B60 tgggacatca tgefcfctccfcg gaggggsagg cteccfcgecc acattcstgt acagscggga 1920 gagtcgstca fcgfctsgtcat cccatofcfcat cgcfcctcatt tgctgggstg acctctgctg isso gtatttcaag aefcgttfcggt gcsacactct cfcgagagafcg gdcfcecctca tctgafcttag 2040 atgcttttct ttaccttctc atagcagctt gtactaatac ttgcfcasccs ctg tgaaat 2100 tgtcaccagg caggtctgtc tctaagacca gacagtcfcgc ttttgtcttg gaaggacaat 2160 tattaccspa ncixfcgtteac aggtatte ?ig '.ta tcttaca afcsatcttt-c cctgatgtgc 2220 tcccggcaga caattctaat ctgtoatgae acfccfcgatga tacaagaccc agafcgaatta 2280 teattctcag tacaacaafcs .caggaaccaa,gggafc[caaaa tcpectteta agaggaatec -2340 agcatgfcgcc tggtafefeggg eatfcecafcgg fcasgfcgagfca asactgttst stcgtcaccc 2400 agfcgcfctafcc agttgstgat ctggcagtag gaggatgaaa casagtgagc cfcattctgtg 2460 fcfccetatfcct actcaagggg tgaagaggca cctggaaaea aeaggasgag fcfcgtaggafct 2520 aaaaaggaca tacaagattg aatgtsactt tcatctggat gaagccaaag gcagasttcc 2580 agccstaaat tcfcgacfcggfc ggstgacaca ggacatgggt bcatggtacc cttctagaat 2640 gsagcataga ctactgatga acagtgcatg gsaaagaagc caagtgtcat ttcatggsct 2700 cagcctctca gstgagaagc agggcacagc tcaccsaggc taggaaaaac agaggcaagt 27SO cctggaaagc tgtctgcttt taaccaagag ttactggcca tcaagtgtct tggttaaaaa 2820 ataagtgtca ggcaaccfcbc tfcggtagata gagtgtgttg ggggcgatfca fcc=gagtotg 2830 gtaafcgasfct cfcgagggtcc eaaagagfcga agtgatattt acatagcaaa tcsaaggang 2940 gggattgtgt gcaatateng tggangtggg ggcaggtttt gfcgggtfctge caagctcaaa 3000 ggtcatacaa fcgfcgcatgtc aaggacaaga aatcaaagsc atgtgaaatg gttggaggfcg 3060 gtfccagtfcfcg aggtcatgtg tttcteagct .satgttgfcgg aattagtgtg agacccagaa 3120 gactgtggec aaagctatfca tggacccafcg gtctdtgtgg aetsatccct catgccttct 3180 getststgat cacatccaca ctcatgtcat dctcgttatt csaaggtgag gttactagca 3240 ctgcacaggg gctgatgaga gsafcgfcccfcg ccaggaaaaa acatccasaa gágafcgcttt 3300 • cccacfctgga actgtgtcct gtatttgctc agcagcccac atcctgttct gccccaaacc 3360 tfcggggcaga cfctcccacag gfcgaatttga acfcccccaag attaaaatca agcctgtatt 3420 caggaaacac tfcgggagtec tcgaggttca ccgagaggga agttggaaat ttttcacfcta 3480 tgtcagtgsg tfctgcagttg ggcaasagcc agatfcgttca tatggsaatc aatcaaacac 3540 acctaagttt ttfccsacafca ttagccafccg acfcgttagca aaagccsfcca cfctcctttat 3600 attgatttat agcagcagca gaaafcafcacc aacctagagg asacaactcc tfctfcagctag 3660 gfcaccfcataa atgtscagga tfcttatattc aattgagaag aacccagcaa aatgg 3715 SEQ ID HO. 2 gaattcacgs gtgatccdag acccagcfcgc afctafcsafctc te SSQ ID' UO . 3. gaattaaagc ttggtgtgts etstagggtg gtatattfcc , ge SEQ ID* NO. 4 gaattcggta ccgcattcaa ctggecfcgtt ttatgfctttg gg SBQ ID KO . 5 gcttatttgc catecactgt tcafccagtag SEQ ?D Ero. e . caaggfceaag agatagacaa catcctggcs aas SEQ ID HO . 7 gttggcsagg afcggfcgtcga tctcfcfcgacc fcfcg SEQ ID ?to< a ggagctagcfc agaggfccaca gfcgacatacg agtecctaga ggtcacagtg acctasgaga SSQ XD KO. 9 fcasagafccts gtaggtaae .gfcgaectcfca gggaetcgta ggtcactgtg acctatagct agcfccc S3Q ID 3SO . XO aaggaaaafcg acsatgaccc fc SBQ ID HO. 11 agctctcaga sfcgfcggaagg g.aaa

Claims (48)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método que comprende los pasos de: (a) poner en contacto un sistema sensible a estrógeno con un compuesto de prueba; (b) determinar la expresión génica de un gen enlazado operablemente a una secuencia reguladora de DMBT1 en el sistema sensible a estrógeno; y (c) detectar actividad estrogénica como resultado del compuesto de prueba.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el paso (c) comprende medir la expresión génica respecto a un control, e identificar compuestos de prueba que resulten en expresión génica incrementada y tengan por lo tanto actividad estrogénica.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el gen es DMBT1.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el paso de determinación comprende medir una cantidad de un ácido nucleico de DMBT1.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el paso de medición comprende medir proteína de DMBTI .

6.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el sistema sensible a estrógeno comprende tejido uterino.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el sistema sensible a estrógeno comprende tejido mamario.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el sistema sensible a estrógeno comprende tejido osteoide.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el sistema sensible a estrógeno es un animal.

10.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el animal es un primate.

11.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el primate es un mono.

12.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el animal es un roedor.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque se ha tratado al animal para reducir niveles sistémicos de estrógeno.

14.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el sistema sensible a estrógeno comprende una célula.

15.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la célula comprende un receptor de estrógeno.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque la célula comprende un gen reportero enlazado operablemente a la secuencia reguladora de DMBT1.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el gen reportero codifica para una proteína seleccionada del grupo que consiste de proteína fluorescente verde (GFP), ß-galactosidasa (lacZ), luciferasa (luc), cloranfenicol acetiltransferasa (cat), figlucuronidasa, neomicina fosfotransferasa y guanina xantina fosforribosil-transferasa.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el control es un sistema sensible a estrógeno no puesto en contacto con el compuesto de prueba.

19.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el control comprende células y tejidos no sensibles a estrógeno.

20.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el paso (c) comprende detectar compuesto de prueba que no estimule actividad estrogénica o actividad anti-estrogénica.

21.- Un método, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto un primer sistema sensible a estrógeno con un compuesto de prueba; (b) poner en contacto un segundo sistema sensible a estrógeno con el compuesto de prueba; (c) medir la expresión de un gen controlado por una secuencia reguladora de DMBT1 del primer sistema sensible a estrógeno, y medir la expresión de un gen controlado por una secuencia reguladora de DMBT1 del segundo sistema sensible a estrógeno; y (d) correlacionar (i) un incremento en expresión en el primer sistema sensible a estrógeno y una disminución o ninguna expresión detectable en el segundo sistema sensible a estrógeno, o (ii) una disminución o ninguna expresión detectable en el primer sistema sensible a estrógeno y un incremento en expresión en el segundo sistema sensible a estrógeno, con una actividad estrogénica selectiva.

22.- Un método, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto un primer sistema sensible a estrógeno con un compuesto de prueba; (b) poner en contacto un segundo sistema sensible a estrógeno con el compuesto de prueba; (c) medir un primer efecto estrogénico que comprende la expresión de un gen controlado por una secuencia reguladora de DMBT1 en el primer sistema sensible a estrógeno; (d) medir un segundo efecto estrogénico del segundo sistema sensible a estrógeno; y (e) correlacionar (i) un incremento en expresión del primer sistema sensible a estrógeno y ningún efecto estrogénico o un efecto anti-estrogénico del segundo sistema sensible a estrógeno, o (ii) una disminución o ninguna expresión del primer sistema sensible a estrógeno y la presencia de un efecto estrogénico del segundo sistema sensible a estrógeno, con una actividad estrogénica selectiva.

23.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque el primer sistema sensible a estrógeno es un tejido o célula sensible a estrógeno de un animal, y el segundo sistema sensible a estrógeno es diferente del primer sistema sensible a estrógeno.

24.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque el primer sistema sensible a estrógeno comprende una célula que tiene un ácido nucleico que tiene una secuencia reguladora de DMBT1 enlazada operablemente a un gen reportero, y el segundo sistema sensible a estrógeno comprende un tejido o célula sensible a estrógeno de un animal.

25.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque la medición de otro efecto estrogénico del segundo sistema sensible a estrógeno, comprende medir proliferación celular o tamaño de tejido.

26.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque la medición de otro efecto estrogénico del segundo sistema sensible a estrógeno, comprende medir la cantidad de un componente producido del segundo sistema sensible a estrógeno.

27.- Un método, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto un sistema sensible a estrógeno y progesterona con un compuesto estrogénico; (b) poner en contacto el sistema sensible a estrógeno y progesterona con un compuesto de prueba; (c) obtener información indicativa de la expresión de un gen controlado por una secuencia reguladora de DMBT1 del sistema sensible a estrógeno y progesterona respecto a un control; y (d) usar la información obtenida en el paso (c) para determinar una actividad progestogénica o una actividad anti-progestogénica.

28.- Ei método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el paso (c) comprende medir la expresión del gen respecto a un control, y el paso (d) comprende correlacionar una disminución en la expresión con una actividad progestogénica o una actividad anti-progestogénica.

29.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el sistema sensible a estrógeno y progesterona comprende un receptor de estrógeno funcional y un receptor de progesterona funcional.

30.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el compuesto de prueba que tiene actividad anti-progestogénica es un modulador del receptor de progesterona.

31.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque comprende un paso de medir un efecto sensible a progesterona que es diferente de la expresión de un gen controlado por una secuencia reguladora de DMBT1.

32.- Un método que comprende el paso de: (a) detectar la expresión de DMBT1 en el sujeto que ha sido tratado con un compuesto capaz de estimular la expresión de DMBT1 , como un marcador de un efecto estrogénico.

33.- El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque el paso (a) comprende medir la expresión de DMBT1 del sujeto respecto a un control.

34.- El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque el paso (a) comprende medir la expresión de DMBT1 en una muestra biológica.

35.- Un sistema sensible a estrógeno, que comprende un ácido nucleico que tiene una secuencia reguladora de DMBT1 enlazada operablemente a un gen reportero.

36.- El sistema de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque el sistema sensible a estrógeno comprende una célula que tiene un receptor de estrógeno.

37.- El sistema de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque la célula se selecciona del grupo que consiste de células de Ishikawa, MCF-7, MG63, HUVEC y SK-N-MC.

38.- El sistema de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque el gen reportero codifica para una proteína seleccionada del grupo que consiste de proteína fluorescente verde (GFP), ß-galactosidasa (lacZ), luciferasa (luc), cloranfenicol acetiltransferasa (cat), ß-glucuronidasa, neomicina fosfotransferasa y guanina xantina fosforribosil-transferasa.

39.- El sistema de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque el gen reportero codifica para luciferasa.

40.- El sistema de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque la secuencia reguladora de DMBT1 comprende los nucleótidos 840 a 872 de SEQ ID NO: 1.

41.- El sistema de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado además porque la secuencia reguladora de DMBT1 consiste de por lo menos 50 nucleótidos consecutivos de los nucleótidos 1 a 2259 de SEQ ID NO: 1.

42.- Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia reguladora de DMBT1 enlazada operablemente a un gen reportero, en donde la secuencia reguladora de DMBT1 comprende los nucleótidos 840 a 872 de SEQ ID NO: 1.

43.- La secuencia de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque la secuencia reguladora de DMBT1 es capaz de dirigir la expresión de un gen enlazado operablemente a la misma, y tiene por lo menos 85% de identidad de secuencias con cualquiera de 30 elementos consecutivos dentro de SEQ ID NO: 1.

44.- La secuencia de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada además porque la secuencia reguladora de DMBT1 consiste de los nucleótidos 1 a 2259 de SEQ ID NO: 1.

45.- La secuencia de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque la secuencia reguladora de DMBT1 consiste de los nucleótidos 840 a 872 de SEQ ID NO: 1.

46.- El uso de un compuesto con actividad anti-progesterona y un compuesto con actividad estrogénica, para preparar un medicamento para reducir la sobrerregulación de DMBT1.

47.- Un método para identificar compuestos con actividad estrogénica, que comprende selección para sobrerregulación de la expresión génica de DMBT1.

48.- Un método para identificar compuestos con actividad anti-progesterona, que comprende selección para compuestos que producen una disminución en la expresión de DMBT1.