MXPA05011989A

MXPA05011989A - Composiciones y metodos para el tratamiento de criptococosis

Info

Publication number: MXPA05011989A
Application number: MXPA/A/2005/011989A
Authority: MX
Inventors: Pirofski Liiseanne; W Maitta Robert
Original assignee: Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University; W Maitta Robert; Pirofski Liiseanne
Priority date: 2003-05-06
Filing date: 2005-11-07
Publication date: 2007-04-10

Abstract

La invención descrita en la presente solicitud proporciona anticuerpos humanos producidos en animales no humanos, que específicamente se vinculan al Cryptocococcus neoformans capsular glucoronoxylomannan (GXM). La invención además provee de métodos para hacer los anticuerpos en un animal no humano y para expresar los anticuerpos en células que incluyan hibridomas y sistemas de células huésped recombinantes. Equipos y composiciones que comprenden los anticuerpos son también provistos además de los métodos de diagnóstico, tratamiento, inhibición o prevención de infección de C. Neoformans o condiciones o desordenes causados por dicha infección al administrar a un paciente los anticuerpos o composiciones descritas en la presente invención.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO DE CRIPTOCOCOSIS CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con composiciones y métodos para tratar o prevenir la infección por Cryptococcus neoformans y condiciones causadas por tal infección. La presente invención se relaciona con anticuerpos humanos que se unen específicamente al glucuronoxi1omanano (GXM) capsular del C. neoformans y las moléculas del ácido nucleico que codifican los anticuerpos . La invención también se relaciona con moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera, aisladas de los anticuerpos humanos para el GXM de C. neoformans . La invención se relaciona además con moléculas de ácido nucleico que codifican tales moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera. La invención comprende además anticuerpos humanos para el GXM de C. neoformans, que son anticuerpos quiméricos, biespecificos, derivados, de una sola cadena o porciones de proteínas de fusión. La invención también se relaciona con métodos para detectar o verificar la infección por C. neoformans . La invención se relaciona además con métodos para hacer los anticuerpos en un animal no humano y expresar los anticuerpos en líneas celulares, incluyendo hibridomas y sistemas celulares P05/079-AEC hospederos recombinantes . La invención también se relaciona con equipos y composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos . La invención se relaciona además con métodos para tratar o prevenir la infección por C. neoformans y las condiciones causadas por tal infección, administrando a un paciente las composiciones descritas en la presente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El Cryptococcus neoformans es un patógeno importante y una causa principal de morbilidad y mortalidad en humanos, especialmente aquellos que están inmunocompro etidos . A pesar de la disponibilidad de agentes antimicóticos activos contra el C. neoformans, la criptococosis es en gran medida incurable en pacientes inmunocomprometidos, debido a que el organismo no puede erradicarse completamente. Así, el tratamiento puede requerir profilaxis o terapia de mantenimiento antimicótico durante toda la vida, costosa, para controlar la infección. Varios tratamientos están disponibles para evitar el recrudecimiento de la enfermedad, incluyendo profilaxis con azol, que junto con una terapia antirretroviral altamente activa, ha reducido la incidencia de criptococosis asociada con el VIH en el mundo desarrollado . Sin embargo, la criptococosis es un problema emergente en P05/079-AEC otras poblaciones de pacientes inmunocomprometidos, y sigue siendo una causa principal de meningoencefalitis en el mundo desarrollado. Además, debido a las prolongadas terapias de mantenimiento con fármacos antimicóticos, la incidencia de las cepas resistentes se está incrementando. En consecuencia, existe una necesidad urgente de procedimientos adicionales para la prevención y tratamiento de la criptococosis.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona anticuerpos humanos aislados que se unen específicamente al glucuronoxilomanano (GXM) capsular de C. neoformans . En particular, la invención proporciona anticuerpos monoclonales G14F7E5, G15B4G5 y G19B9G7, que reconocen el GXM de C. neoformans . El anticuerpo monoclonal G15B4G5, protege de manera efectivamente contra el desafío con C. neoformans en inmunizaciones pasivas. La invención proporciona además métodos para hacer los anticuerpos en animales no humanos, y para la expresión de los anticuerpos en las líneas celulares incluyendo hibridomas y sistemas celulares hospederos recombinantes . La invención también proporciona equipos y composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos. Además, la invención proporciona métodos para tratar o evitar la infección por P05/079-AEC C. neoformans y condiciones causadas por tal infección, administrando a un paciente las composiciones farmacéuticas descritas en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra las curvas de inhibición para G14F7E5, G15B4G5 y G19B9G7 por el GXM soluble. Se muestra la unión por ELISA. El Panel A muestra la inhibición de los Mabs (anticuerpos monoclonales) al 24067 por el SB4 soluble; el Panel B muestra la inhibición de la unión de los Mabs a 24067 por 24067; y el Panel C muestra la inhibición de la unión de los Mabs a H99 por SB4 soluble. La unión se representa por la absorbancia (Abs) a 405 nm, como se muestra en el eje y para la concentración del Mab indicado en el eje x. La Figura 2 muestra un experimento de inmunización pasiva con los MAbs G14F7E5, G15B4G5 y G19B9G7. La Figura 3 es una tabla que compara una porción de CDR1 y CDR2 de anticuerpos monoclonales al GXM de C. neoformans. Los residuos están en negrilla y los subrayados son aquellos que se comparten por los anticuerpos monoclonales derivados de ratón XenoMouse® murino y humano; los residuos en negrilla e itálicas son mutaciones somáticas; los residuos en itálicas (sin P05/079-AEC negrillas) , son residuos que son similares entre los anticuerpos, pero en diferentes posiciones; los residuos en minúsculas están asociados con una unión disminuida al GXM. Hu - humano; Ms - ratón.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona anticuerpos completamente humanos o porciones que se unen al antígeno de los mismos, que se unen específicamente al GXM de C. neoformans . En algunas modalidades, los anticuerpos completamente humanos son monoclonales . Otras modalidades incluyen moléculas de ácidos nucleicos que comprenden secuencias nucleotídicas que codifican todas o parte de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos y los polipéptidos que comprenden las secuencias de aminoácidos codificadas por tales secuencias nucleotídicas, y en particular, secuencias que comprenden las regiones que determinan la complementariedad (CDR o Complementar i ty Determining Regions) . También se proporcionan los anticuerpos que tienen propiedades de unión similares y los anticuerpos (u otros antagonistas) que tienen funcionalidad similar a los anticuerpos descritos en la presente. También se proporcionan hibridomas que expresan tales moléculas de inmunoglobulina y los anticuerpos monoclonales.

P05/079-AEC A menos que se defina de otra manera en la presente, los términos científicos y técnicos utilizados con relación a la presente invención, tendrán los significados que se entienden comúnmente por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica. Además, a menos que se requiera de otra manera por el contexto, los términos en singular incluirán los plurales y los términos en plural incluirán los singulares. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas con relación a, y las técnicas de cultivo celular y de tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de proteínas y ácidos nucleicos y de hibridación descritas en la presente, son aquellos bien conocidos y utilizados comúnmente en la técnica. A menos que se indique de otra manera, los métodos y técnicas de la presente invención se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica, y se describen en varias referencias generales y más específicas, que son citadas y discutidas a través de la presente especificación. Véase, por ejemplo, Sambrook et al . Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2a ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) y Ausubel et al . , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992) , y Harlow and Lañe Antibodies : A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold P05/079-AEC Spring Harbor, N. Y. (1990) , las cuales se incorporan aquí como referencia. Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se realizan comúnmente en la técnica o como se describe en la presente . Las nomenclaturas utilizadas con relación a, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente, son aquellas bien conocidas y utilizadas comúnmente en la técnica. Las técnicas estándar se utilizan para las síntesis químicas, los análisis químicos, la preparación formulación y suministro farmacéutico y el tratamiento de los pacientes. Los siguientes términos pretenden tener los significados generales como se utilizan en la presente: "Células linfocíticas B o progenie de las mismas", se refiere a cualquier célula que desciende de, o destinada para el linaje linfocítico B. Los ejemplos incluyen, de manera no exclusiva, todos los linfocitos B en la trayectoria de desarrollo de los linfocitos B, iniciando desde las células germinales más tempranas de los linfocitos B hasta los linfocitos B de memoria, células de plasma y cualquier hibridoma creado in vi tro . "Anticuerpos biespecíficos" , son anticuerpos sencillos que tienen afinidades por dos antígenos P05/079-AEC separados. Por ejemplo, un anticuerpo biespecífico puede reconocer el GXM de C. neoformans utilizando una combinación de las cadenas pesada y ligera y puede reconocer un marcador de la superficie celular del leucocito, utilizando una segunda combinación de las cadenas pesada y ligera unida a la primera combinación. Véase, por ejemplo, McCormick et al . , J. Immunol . 158 : 3474-82 (1997) . "Anticuerpos quiméricos" , son anticuerpos que se han alterado de su forma original para comprender secuencias de aminoácidos de otra proteína. Los anticuerpos quiméricos retienen al menos una porción de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo original, típicamente la porción que comprende la región que se une al antígeno (Fab) . Los ejemplos de anticuerpos quiméricos incluyen, de manera no exclusiva, anticuerpos biespecíficos y fusiones con otras secuencias de la proteína que no es de inmunoglobulina . "Citocinas" , se refiere generalmente a moléculas de señalización del sistema inmune. Las citocinas incluyen, de manera no exclusiva, interleucinas (IL o Interleukins) , factores de crecimiento transformantes (TGF o Transforming Growth Factors) , factores de necrosis del tumor (TNF o Tumor Necrosis Factors) , linfotoxinas (LT o Lymphotoxins) , •interferones, factores que estimulan la P05/079-AEC colonia del granulocito-macrófago (GM-CSF) , CSF del macrófago, CSF del granulocito y factores que inhiben la migración. "Derivar" , se refiere al proceso para unir un agente que no es de inmunoglobulina a las moléculas de inmunoglobulina. Los ejemplos de agentes derivantes incluyen, de manera no exclusiva, toxinas, complementos, antibióticos, péptidos, polisacáridos, lípidos, polímeros orgánicos, radiomarcas y compuestos inorgánicos. "Proteínas de fusión", se refiere a proteínas quiméricas que comprenden secuencias de aminoácidos de dos o más proteínas diferentes. Típicamente, las proteínas de fusión resultan de las técnicas recombinatorias in vi tro bien conocidas en la técnica. Sin embargo, las proteínas de fusión pueden resultar del cruce in vivo o de otros eventos recombinatorios . El término "fragmento polipeptídico" como se utiliza en la presente, se refiere a un polipéptido que tiene una supresión aminoterminal y/o carboxiterminal, pero en donde la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia natural . Los fragmentos típicamente son de al menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos de largo, incluyendo, por ejemplo, al menos 14 aminoácidos de largo, al menos 20 aminoácidos de largo, al menos 50 aminoácidos de largo, y al menos 70 aminoácidos de P05/079-AEC largo. Los fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina pueden prepararse fácilmente por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica siguiendo las enseñanzas de esta especificación. Generalmente, los fragmentos o análogos amino y carboxiterminales aparecen cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse por comparación de los datos de la secuencia nucleotídica y/o de aminoácidos de bases de datos de secuencias públicas o patentadas. Por ejemplo, se utilizan métodos de comparación computarizada para identificar los motivos de la secuencia o los dominios predichos de la conformación de la proteína, que ocurren en otras proteínas de estructura y/o función conocidas . Se conocen métodos para identificar las secuencias de proteína que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. (Bowie et al . , Science 253 :164 (1991) ) . Las sustituciones preferidas de aminoácidos son aquéllas, las cuales: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteína, y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos. Los análogos pueden incluir varias muteínas de una secuencia P05/079-AEC diferente a la secuencia peptídica natural. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones de aminoácidos sencillas o múltiples (de manera preferida, sustituciones de aminoácidos conservadoras) , en la secuencia natural (de manera preferida, en la porción del polipéptido fuera de los dominios que forman los contactos intermoleculares) . Una sustitución de aminoácidos conservadora no debe cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia original (por ejemplo, un reemplazo de aminoácido no debe tender a romper una hélice que aparece en la secuencia original, o interrumpir otros tipos de estructuras secundarias que caracterizan la secuencia original). Los ejemplos de estructuras polipeptídicas secundarias y terciarias reconocidas en la técnica se describe en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed. , W. H. Freeman and Company, New York (1984) ) ; Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds . , Garland Publishing, New York, N. Y. (1991) ) ; y Thornton et al . , Nature 354 :105 (1991) , las cuales se incorporan aquí como referencia. Como se utiliza en la presente, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology - A Synthesis (2a Edición, E. S. Golub y D. R . Gren, Eds . , Sinauer Associates, Sunderland, Mass . (1991) ) , la cual se incorpora aquí como P05/079-AEC referencia. Los estereisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos a, a disustituidos, aminoácidos de N alquilo, ácido láctico y otros aminoácido no convencionales pueden ser también componentes adecuados para los polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-N,N,N-trimetillisina, e-N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N~formilmetionina, 3-metilh.istidina, 5-hidroxilisina, s-N-metilarginina, y otros aminoácidos e aminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina) . En la notación polipeptídica utilizada en la presente, la dirección hacia la izquierda es la dirección aminoterminal y la posición hacia la derecha es la dirección carboxiterminal , de acuerdo con el uso y convenciones estándar . "Moléculas de inmunoglobulina humana" , se refiere a proteínas de inmunoglobulina que tienen una secuencia codificada por las secuencias del gen de la inmunoglobulina humana. En algunas modalidades, la proteína está codificada por la secuencia del gen humano de la línea gu , en otras modalidades, la proteína puede comprender mutaciones de la secuencia de la línea germinal humana. "Anticuerpos monoclonales humanos", se refiere a P05/079-AEC anticuerpos que son miembros de una población de anticuerpos humanos con especificidades idénticas . La población de anticuerpos humanos puede producirse en un hibridoma u otra línea celular inmortalizada, así como en líneas celulares recombinantes que expresan las secuencias exógenas del gen del anticuerpo humano. "Pacientes inmunocomprometidos" , se refiere a pacientes cuyas respuestas inmunes a los antígenos o agentes extraños está disminuida, por ejemplo, por enfermedad (por ejemplo, SIDA) , por cirugía invasiva, por terapias con fármacos con relación a tratamientos para otras condiciones (por ejemplo, pacientes con transplante de órganos) o debido a defectos genéticos. "Toxinas" , se refiere a compuestos de proteína o no de proteína que pueden unirse a los anticuerpos con el propósito de destruir las células a las cuales se han unido los anticuerpos. Los ejemplos de toxinas incluyen, de manera no exclusiva, complementos, antibióticos, péptidos, polisacáridos, lípidos, polímeros orgánicos, radiomarcas y compuestos inorgánicos. "Vectores" , se refiere a moléculas de ácido nucleico que permiten que las secuencias de ácidos nucleicos de interés se clonen, propaguen, recombinen, imiten o expresen fuera de sus células nativas . Con frecuencia los vectores tienen secuencias que permiten P05/079-AEC controlar la expresión de las secuencias génicas bajo condiciones específicas o en células específicas. Para expresar los anticuerpos o las porciones de anticuerpos de la invención, los ADN que codifican las cadenas ligera y pesada parciales o de longitud completa, obtenidas como se describió anteriormente, se insertan en los vectores de expresión, de manera que los genes están enlazados de manera operativa a las secuencias de control transcripcional y traduccional . Los vectores de expresión incluyen plásmidos, virus, retrovirus, cósmicos, YAC, epitomas derivados de EBV y lo similar. El gen del anticuerpo está ligado a un vector, de manera que las secuencias de control transcripcional y traduccional dentro del vector sirven para su función pretendida de regular la transcripción y traducción del gen del anticuerpo . El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se eligen para que sean compatibles con la célula hospedera de expresión utilizada. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en vectores separados. En una modalidad preferida, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante métodos estándar (por ejemplo, ligación de los sitios complementarios de restricción del fragmento del gen del anticuerpo y el P05/079-AEC vector, o ligación del extremo romo si no están presentes sitios de restricción) . Un vector conveniente es uno que codifica una secuencia de inmunoglobulina CH o CL humana, funcionalmente completa, con sitios de restricción apropiados, diseñados de manera que cualquier secuencia VH o VL puede insertarse y expresarse fácilmente, como se describió anteriormente. En tales vectores, usualmente ocurre un empalme entre el sitio donador del empalme en la región J insertada y el sitio aceptor del empalme que precede el dominio C humano, y también en las regiones del empalme que ocurren dentro de los exones CH humanos . La terminación de la poliadenilación y la transcripción ocurre en los sitios cromosomales nativos corriente abajo de las regiones codificantes. El vector de expresión recombinante también puede codificar un péptido de señal que facilita la secreción de la cadena del anticuerpo de una célula hospedera. El gen de la cadena del anticuerpo puede clonarse en el vector, de manera que el péptido de la señal se enlaza en el marco al término amino de la cadena de inmunoglobulina. El péptido de la señal puede ser un péptido de la señal de inmunoglobulina o un péptido de la señal, heterólogo (es decir, un péptido de la señal de una proteína que no es inmunoglobulina) . Además de los genes de la cadena del anticuerpo, P05/079-AEC los vectores de expresión recombinante de la invención portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de la cadena del anticuerpo en una célula hospedera. Se apreciará por aquellos con experiencia en la técnica, que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de las secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedera a ser transformada, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras ejemplares para la expresión de células hospederas de mamíferos incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de la proteína en células de mamífero, tales como promotores y/o mejoradores derivados de LTR retrovirales, citomegalovirus (CMV o Cytomegalovirus) (tales como el promotor/mej orador del CMV) , Virus Simiano 40 (SV40) (tal como el promotor/mejorador del SV40) , adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío principal del adenovirus (AdMLP) ) , polioma y promotores fuertes de mamífero, tales como promotores de la inmunoglobulina nativa y la actina. Para una descripción adicional de los elementos reguladores virales y las secuencias de los mismos, véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,168,062 de Stinski, la Patente de los Estados Unidos No. 4,510,245 de Bell et al., y la Patente de los Estados Unidos No. 4,968,615 de Schaffner et al.

P05/079-AEC Además de los genes de la cadena del anticuerpo y las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden portar secuencias adicionales, tales como las secuencias que regulan la replicación del vector en las células hospederas (por e emplo, orígenes de replicación) , y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de las células hospederas, en las cuales se ha introducido el vector (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017, todas de Axel et al . ) . Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a los fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedera en la cual se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables ejemplares incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR o Dihydrof oíate Reductase) (para utilizarse en células hospederas del dhfr con selección/amplificación del metotrexato) , el gen neo (para la sección de G418) , y el gen de la glutamato sintetasa. Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos anti-GXM y los vectores que comprenden estas moléculas de ácidos nucleicos, pueden utilizarse para la transfección de una célula hospedera de mamífero adecuada. La transformación puede ser mediante cualquier P05/079-AEC método conocido para la introducción de polinucleótidos a una célula hospedera. Los métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero, son bien conocidos en la técnica e incluyen transfección medida por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión del protoplasto, electroporación, encapsulación de los polinucleótidos en liposomas y microinyección dirigida del ADN en los núcleos. Además, las moléculas de ácido nucleico pueden introducirse en las células de mamífero mediante vectores virales. Los métodos para transformar las células son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 y 4,959,455 (patentes las cuales se incorporan aquí como referencia) . Las líneas celulares de mamífero disponibles como hospederos para la expresión, son bien conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC o American Type Cul ture Collection) . Estas incluyen, inter alia, células de ovario de hámster Chino (CHO) , NSO, células SP2 , células HeLa, células de riñon de hámster bebé (BHK) , células de riñon de mono (COS) , células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2) , células A549 y varias otras líneas celulares. Las líneas celulares de P05/079-AEC preferencia particular se seleccionan mediante la determinación de cuáles líneas celulares tienen altos niveles de expresión. Otras líneas celulares que pueden utilizarse, son líneas celulares de insecto, tales como las células Sf9. Cuando los vectores de expresión recombinantes que codifican los genes del anticuerpo se introducen en las células hospederas de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células hospederas durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospederas o, de manera más preferida, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual se cultivan las células hospederas. Los anticuerpos pueden recuperase del medio de cultivo utilizado métodos estándar de purificación de las proteínas. Además, la expresión de los anticuerpos de la invención (u otras porciones de los mismos) , para la producción de las líneas celulares, puede mejorarse utilizando varias técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresión de la glutamina sintetasa (el sistema GS o Glutamine Synthetase) , es un procedimiento común para mejorar la expresión bajo ciertas condiciones. El sistema GS se discute todo o en parte con relación a las Patentes Europeas Nos. 0 216 846, 0 256 055 y 0 323 997 y la Solicitud de Patente Europea No. 89303964.4.

P05/079-AEC Las secuencias "enlazadas de manera operable" , incluyen tanto las secuencias de control de la expresión que están contiguas con el gen de interés como las secuencias de control de la expresión que actúan in trans o a distancia para controlar el gen de interés. El término "secuencia de control de la expresión", como se utiliza en la presente, se refiere a secuencias que permiten la expresión inducible o constitutiva de las secuencias de gen bajo condiciones específicas o en células específicas. Los ejemplos de procesos celulares que regulan las secuencias de control de la expresión incluyen, de manera no exclusiva, transcripción del gen, traducción de la proteína, empalme del ARN mensajero, conmutación del isotipo de la inmunoglobulina, glucosilación de la proteína, secreción de la proteína, localización de la proteína intracelular y guía de la proteína extracelular. Las secuencias de control de la expresión incluyen secuencias apropiadas de inicio, terminación de la transcripción, del promotor y del mejorador; señales eficientes del procesamiento del ARN tales como señales de empalme y poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que mejoran la eficiencia de la traducción (es decir, secuencia de consenso de Kozak) ; secuencias que mejoran la estabilidad de la proteína; y cuando se desee, las secuencias que mejoran la secreción de P05/079-AEC la proteína. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedero. En los procariontes , tales secuencias de control incluyen generalmente un promotor, un sitio de unión ribosomal y una secuencia de terminación de la transcripción. En los eucariontes, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores y la secuencia de terminación de la transcripción. El término "secuencias de control" pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y puede incluir también componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líderes y secuencias de la contraparte de fusión. El término "célula hospedera recombinante" (o simplemente "célula hospedera"), como se utiliza en la presente, pretende referirse a una célula en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante . Deberá entenderse que tales términos pretenden referirse no sólo a la célula objeto particular, sino a la progenie de tal célula. Debido a que pueden ocurrir ciertas modificaciones en las generaciones subsiguientes debido a mutación o influencias del medio ambiente, tal progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula original, pero todavía se incluye dentro del alcance del término "célula hospedera" como se utiliza en la presente.

P05/079-AEC Ratones "XenoMouse"" , se refieren a ratones que portan un sitio de inmunoglobulina endógeno inactivado, que los vuelve incapaces de expresar la inmunoglobulina murina endógena, pero que portan porciones sustanciales de un sitio de inmunoglobulina humana. Los ratones de la línea XenoMouse son capaces del rearreglo somático de los genes de inmunoglobulina humana, hipermutación de las regiones variables de la inmunoglobulina humana y conmutación del isotipo de la inmunoglobulina. Por lo tanto, los ratones de la línea XenoMouse" son capaces de montar respuestas humorales efectivas al desafío antigénico utilizando las secuencias del gen de la inmunoglobulina humana. Los anticuerpos resultantes son completamente humanos y pueden aislarse de los animales mismos, de las células cultivadas extraídas de los animales o de hibridomas creados de las líneas linfocíticas de ratón XenoMouse o la progenie de las mismas. Además. El rearreglo de las secuencias del gen humano que codifican las inmunoglobulinas, que surgen contra los desafíos antigénicos específicos, pueden aislarse por medios recombinantes bien conocidos en la técnica. Estructura del Anticuerpo . La unidad básica estructural del anticuerpo comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares de cadenas polipeptídicas, cada par tiene una cadena "ligera" P05/079-AEC (aproximadamente de 25 kDa) , y una cadena "pesada" (aproximadamente de 50-70 kDa) . La porción aminoterminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos, responsables principalmente del reconocimiento del antígeno. La porción carboxiterminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función del efecto. Las cadenas ligeras humanas se clasifican en las cadenas kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o epsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variables y constantes se unen mediante una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada también que incluye una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase, generalmente, Immunology, Cap. 4 (Roitt, I. , et al . , eds . , 6a ed. , Harcourt Publishers Ltd. , Londres (2001) ) (incorporada como referencia en su totalidad para todos los propósitos) . Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo. Así, un anticuerpo IgG intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en los anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son los mismos. Las cadenas exhiben todas, la misma estructura P05/079-AEC general de regiones del marco (FR o Framework Regions) relativamente conservadas, unidas por tres regiones hipervariables, también llamadas CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par, están alineadas por regiones del marco, permitiendo la unión a un epitopo específico. De N terminal a C terminal, ambas cadenas ligera y pesada, comprenden los dominios FRl, CDRl, FR2 , CDR2 , FR3 , CDR3 y FR4. La asignación de los aminoácidos a cada dominio, es de acuerdo con las definiciones de la Base de Datos Kabat de las Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico {Johnson & Wu, Nucí. Acids Res. 29:205-06 (2001); o Chothia & Lesk, J Mol. Biol. 196:901-17 (1987); Chothia et al. Nature 342:878-83 (1989)). Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial, que tiene dos diferentes pares de cadenas pesada/ligera y dos diferentes sitios de unión. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse mediante una variedad de métodos, incluyendo la fusión de hibridomas o el enlace de fragmentos Fab' . Véase, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-21 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-53 (1992) . Además, los anticuerpos biespecíficos pueden formarse como "diacuerpos" (Holliger et al., Proc. Nati.

Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-48 (1993)); o "Janusinas" (Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-59 (1991) y Traunecker P05/079-AEC et al . , Intl . J. Cáncer Suppl . 7 : 51-52 (1992) ) . La producción de anticuerpos biespecíficos puede ser un proceso de trabajo relativamente intenso, en comparación con la producción de anticuerpos convencionales y rendimientos y grados de pureza que son generalmente menores para los anticuerpos biespecíficos . Los anticuerpos biespecíficos no existen en la forma de fragmentos que tienen un solo sitio de unión (por ejemplo, Fab, Fab' y Fv) . Anticuerpos Humanos de Animales no Humanos. Los anticuerpos con regiones variables y/o constantes, murinas o de rata son menos útiles que los anticuerpos humanos para ciertos usos terapéuticos. La presencia de tales proteínas derivadas de murinos o de rata, pueden conducir la rápida eliminación de los anticuerpos o puede conducir a la degeneración de una respuesta inmune contra el anticuerpo por un paciente. Para evitar estos problemas con los anticuerpos derivados de murino o de rata, uno puede, por ejemplo, desarrollar anticuerpos humanizados o generar anticuerpos completamente humanos a través de la introducción de una función del anticuerpo humano en roedores, de manera que el roedor produciría anticuerpos completamente humanos . La capacidad para clonar y reconstruir los sitios humanos con tamaños de megabase en YAC e introducirlos en P05/079-AEC la línea germinal de ratón, proporciona un procedimiento poderoso para determinar los componentes funcionales de sitios muy grandes o con un mapa rudimentario, así como para generar modelos útiles de la enfermedad humana. Además, el uso de tal tecnología para la sustitución de los sitios del ratón con sus equivalentes humanos, proporcionaría una compresión única en la expresión y regulación de los productos génicos humanos durante el desarrollo, su comunicación con otros sistemas, y su implicación en la inducción y progresión de la enfermedad. Una aplicación práctica importante de tal estrategia es la "humanización" del sistema inmune humoral del ratón. La introducción de los sitios de inmunoglobulina (Ig o Immunoglobuli?) humana en los ratones, en los cuales los genes Ig endógenos se han inactivado, ofrece la oportunidad de estudiar los mecanismos subyacentes a la expresión programada y el montaje de anticuerpos, así como su papel en el desarrollo de los linfocitos B. Además, tal estrategia podría proporcionar una fuente ideal de producción de anticuerpos monoclonales completamente humanos (Mabs) , un hito hacia el cumplimiento de la promesa de una terapia con anticuerpos en la enfermedad humana. Se espera que los anticuerpos completamente humanos reduzcan al mínimo las respuestas inmunogénicas y alérgicas intrínsecas de los Mabs de ratón P05/079-AEC o derivados de ratón, y por lo tanto, incrementen la eficacia y seguridad de los anticuerpos administrados. Por lo tanto, puede esperarse que el uso de anticuerpos completamente humanos proporcione una ventaja sustancial en el tratamiento de enfermedades crónicas o recurrentes humanas, tales como inflamación, autoinmunidad, cáncer e infecciones bacterianas, las cuales requieren potencialmente administraciones repetidas de anticuerpos. Un procedimiento hacia este objetivo fue diseñar cepas de ratones deficientes en la producción de anticuerpos de ratones con grandes fragmentos de los sitios Ig humanos, anticipando que tales ratones producirían un gran repertorio de anticuerpos humanos en la ausencia de anticuerpos de ratón. Los grandes fragmentos de Ig humana preservarían la gran diversidad genética variable, así como la regulación apropiada de la producción y expresión del anticuerpo. Explotando la maquinaria del ratón para la diversificación y selección del anticuerpo y la falta de tolerancia inmunológica a las proteínas humanas, el repertorio reproducido de anticuerpos humanos en estas cepas de ratón proporcionarían anticuerpos con alta afinidad contra cualquier antígeno de interés, incluyendo los antígenos humanos. Utilizando la tecnología del hibridoma, pueden producirse y seleccionarse fácilmente Mabs humanos específicos del antígeno con la especificidad P05/079-AEC deseada. Esta estrategia general se demostró con relación a la generación de las primeras cepas animales de XenoMouse . Véase, Green et al., Nature Genet . 7:13-21 (1994) . Las cepas animales de XenoMouse se diseñaron con cromosomas artificiales de levadura (YAC o yeast Artificial Chromosomes) , que contienen fragmentos con la configuración de la línea germinal con un tamaño de 245 kb y 190 kb del sitio de la cadena pesada humana y el sitio de la cadena ligera kappa, respectivamente, que contienen las secuencias de la región del núcleo variable y constante. Id. Los YAC que contienen la Ig humana, fueron compatibles con el sistema de ratón para el rearreglo y la expresión de anticuerpos, y fueron capaces de sustituir los genes de Ig inactivados del ratón. Esto se demostró por su capacidad para inducir el desarrollo de los linfocitos B, para producir un repertorio humano similar al adulto, o anticuerpos completamente humanos, para generar los anticuerpos monoclonales humanos específicos del antígeno. Estos resultados también sugirieron que la introducción de porciones mayores del sitio de Ig humana que contienen mayores números de genes V, elementos reguladores adicionales y regiones constantes de Ig humana, pueden recapitular sustancialmente el repertorio completo que es característico de la respuesta humoral humana a la P05/079-AEC infección y la inmunización. El trabajo de Green et al., se extendió recientemente a la introducción de más que aproximadamente 80% del repertorio de anticuerpos humanos a través de la introducción de fragmentos de YAC con configuración de la línea germinal, con un tamaño de megabase, del sitio de la cadena pesada humana y el sitio de la cadena ligera kappa, respectivamente, para producir nuevos ratones XenoMouse ® .

Véase, Méndez et al., Nature Genet . 15:146-56 (1997) y Green & Jakobovits, J. Exp. Med. 188:483-95 (1998), las descripciones de la cual se incorporan aquí como referencia. Tal procedimiento se discute además y se delinea en las Patentes de los Estados Unidos 5,916,771, 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598 y 6,130,364. Véase también la WO 91/10741, publicada en julio 25, de 1991, la WO 94/02602, publicada en febrero 3, de 1994, la WO 96/34096 y la WO 96/33735, ambas publicadas en octubre 31, de 1996, la WO 98/16654, publicada en abril 23, de 1998, la WO 98/24893, publicada en junio 11, de 1998, la WO 98/50433, publicada en noviembre 12, de 1998, la WO 99/45031, publicada en septiembre 10, de 1999, la WO 99/53049, publicada en octubre 21, de 1999, WO 0009560, publicada en febrero 24, del 2000 y la WO 00/037504, publicada en junio 29, del 2000. Las descripciones de cada P05/079-AEC una de las patentes, solicitudes y referencias citadas anteriormente, se incorporan aquí como referencia en su totalidad. Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención, se preparan de manera preferida a través del uso de un ratón transgénico, que tiene una porción sustancial del genoma que produce el anticuerpo humano insertado, pero que se vuelve deficiente en la producción de anticuerpos murinos endógenos. Tales ratones, por lo tanto, son capaces de producir moléculas y anticuerpos de inmunoglobulina humana, y son deficientes en la producción de moléculas y anticuerpos de inmunoglobulina murina. Las tecnologías utilizadas para alcanzar lo mismo, se describen en las patentes, solicitudes y referencias mencionadas anteriormente. A través del uso de tal tecnología, se produjeron anticuerpos monoclonales completamente humanos del GXM de C. neoformans, o las porciones que se unen al antígeno de los mismos. Esencialmente, inmunizamos líneas de XenoMouse" de ratones con GXM de C. neoformans, se recuperaron las células del bazo y de los nodulos linfáticos (tales como los linfocitos B) de los ratones que expresan los anticuerpos específicos del GXM de C. neoformans, se fusionaron tales células recuperadas con células de mieloma no secretante para preparar líneas P05/079-AEC celulares inmortales de hibridoma y se seleccionaron las líneas celulares de hibridoma para identificar aquéllas que producen los anticuerpos específicos para el GXM de C. neoformans . Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención, también pueden expresarse en líneas celulares diferentes de las líneas celulares del hibridoma. Las secuencias que codifican los anticuerpos particulares, pueden utilizarse para la transformación de una célula hospedera adecuada. La transformación puede ser mediante cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula hospedera, por ejemplo, empacando en polinucleótido en un virus (o en un vector viral) , y transduciendo una célula hospedera con el virus (o vector) , o mediante procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como se ejemplifica en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 y 4,959,455 (patentes las cuales se incorporan aquí como referencia) .

El procedimiento de transformación utilizado en un caso dado, depende del hospedero a ser transformado. Por ejemplo, los métodos para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen transfección mediada con dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión del protoplasto, electroporación, P05/079-AEC encapsulación de los polinucleótidos en los liposomas, y microinyección directa del ADN en los núcleos . Las líneas celulares de mamífero disponibles como hospederos para la expresión, son bien conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas de células inmortalizadas disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) , incluyendo, de manera no exclusiva, células de ovario de hámster Chino (CHO) , NS/O, células HeLa, células de riñon de hámster bebé (BHK) , células de riñon de mono (COS) , células del carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2) , y varias de otras líneas celulares. Las líneas celulares de preferencia particular se seleccionan a través de la determinación de cuáles líneas celulares tienen altos niveles de expresión y producen anticuerpos con las propiedades de unión deseadas al GXM de C. neoformans . Además, la expresión de los anticuerpos de la invención (y otras porciones de los mismos) de las líneas celulares de producción, puede mejorarse utilizando varias técnicas conocidas. Por ejemplo, la expresión mejorada puede realizarse mediante un sistema de expresión de coamplificación utilizando dihidrofolato reductasa (DHFR o Dihydrof oíate Reductase) o el sistema de expresión del gen de la glutamina sintetasa (el sistema GS) . Véase, por ejemplo, Kaufman y Sharp, J. Mol . Biol . 159:601-21 (1982); P05/079-AEC Patente Europeas Nos. 0 216 846, 0 256 055 y 0 323 997; y Solicitud de Patente Europea No. 89303964.4. Los anticuerpos de la invención también pueden producirse a través de la generación de un animal o una planta que es transgénico para las secuencias de la cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina de interés y la producción del anticuerpo en una forma recuperable del mismo. Con relación a la producción transgénica en animales, por ejemplo, los anticuerpos pueden producirse en, y recuperarse de, la leche de cabras, vacas u otros mamíferos. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172 y 5,741,957. La invención contempla un anticuerpo monoclonal aislado humano o una porción que se une al antígeno del mismo, que se une específicamente al GXM de C. neoformans . En algunas modalidades, el anticuerpo humano aislado o la porción que se une al antígeno del mismo se une al GXM de C. neoformans y mejora la resistencia de un sujeto al C. neoformans . La invención contempla un anticuerpo humano aislado o una porción que se une al antígeno del mismo, que se une específicamente al GXM de C. neoformans, en donde el anticuerpo o la porción que se une al antígeno del mismo evita o reduce la severidad de las condiciones o trastornos P05/079-AEC causados por infección por C. neoformans . El anticuerpo humano aislado o la porción que se une al antígeno del mismo, que se une específicamente al GXM de C. neoformans de la invención, puede ser la inmunoglobulina G (IgG) , IgM, IgE, IgA o IgD. En algunas modalidades, la IgA puede ser un subtipo de IgAl o IgA2 y la IgG puede ser un subtipo de IgGl, IgG2 , IgG3 o IgG4. La invención contempla un anticuerpo humano aislado o una porción que se une al antígeno del mismo, que se une específicamente al GXM de C. neoformans y que está marcado. En una modalidad preferida, la marca es una radiomarca, una marca enzimática, una marca fluorescente, una toxina, un agente magnético, un segundo anticuerpo, una marca de afinidad, una marca de epitopo, un antibiótico, una proteína complementaria o una citocina. La invención contempla un anticuerpo humano aislado o una porción que se une al antígeno del mismo, que se une específicamente al GXM de C. neoformans y comprende una cadena ligera kappa. En algunas modalidades, la región variable (V) de la cadena ligera kappa que comprende secuencias de aminoácidos, es codificada por un gen humano VKIII DPK22/A27 con hasta 5 mutaciones de la línea de la secuencia germinal. En algunas modalidades, la región de unión (J) de la cadena ligera kappa comprende una secuencia de aminoácidos que es codificada por un gen humano J? 1.

P05/079-AEC En donde la secuencia de aminoácidos comprende mutaciones de las secuencias V? y/o J? de la línea germinal, las mutaciones pueden estar en las regiones del marco, CDR5 o ambas . La invención contempla un anticuerpo humano aislado o una porción que se une al antígeno del mismo, que se une específicamente al GXM de C. neoformans y comprende una cadena ligera kappa que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 3 (SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 9) o una región variable de la misma. La invención también contempla un anticuerpo humano aislado o una porción que se une' al antígeno del mismo, que se une específicamente al GXM de C. neoformans y comprende una cadena ligera kappa que comprende las secuencias de aminoácidos CDRl y CDR3 mostradas para los Mabs G14F7E5, G15B4G5 y G19B9G7 en la Tabla 3 (SEQ ID NO: 2 y 4; SEQ ID NO: 6 y 8; y las SEQ ID NO: 10 y 12, respectivamente) . En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una cadena ligera kappa que comprende la secuencia de aminoácidos de inicio de CDRl hasta el final de CDR3 de una secuencias de aminoácidos mostrada en la Tabla 3 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO : 9) . En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una cadena ligera kappa que comprende las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NOS: 2-4, 6-8 ó 10-12. La invención contempla además un P05/079-AEC anticuerpo anti-GXM de C. neoformans que comprende las secuencias de aminoácidos FRl, FR2 , FR3 y/o FR4 en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1, 5 ó 9. La invención contempla además un anticuerpo humano aislado o una porción que se une al antígeno del mismo, que se une específicamente al GXM de C. neoformans y comprende una cadena ligera kappa que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 17; o SEQ ID NO: 21) o la región variable de la secuencia de aminoácidos . Una secuencia de señal puede o no estar presente en cualquiera de los anticuerpos de la invención. La invención también contempla un anticuerpo humano aislado o una porción que se une al antígeno del mismo, que se une específicamente al GXM de C. neoformans y comprende una cadena ligera lambda. La invención contempla un anticuerpo humano aislado o una porción que se une al antígeno del mismo, que se une específicamente al GXM de C. neoformans, que comprende una cadena pesada compuesta de las regiones variables (V) , de diversidad (D) y de unión (J) de los anticuerpos G14F7E5, G15B4G5 o G19B9G7. La invención contempla un anticuerpo humano aislado o una porción que se une al antígeno del mismo, que se une específicamente al GXM de C. neoformans, y que comprende una o más de las P05/079-AEC regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de una cadena pesada de los anticuerpos G14F7E5, G15B4G5 o G19B9G7. Más específicamente, la invención contempla un anticuerpo humano aislado o una porción que se une al antígeno del mismo, que se une específicamente al GXM de C. neoformans y que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es codificada por un gen humano de la familia VH3 humano o un gen VH6 humano. En algunas modalidades, el gen humano es un gen VH3-64 o un gen VH6-1. En los anticuerpos que utilizan un gen de la familia VH3 , la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada es, de manera preferida, la secuencia VH3 de la línea germinal, aunque la invención incluye VH3 humanos que utilizan anticuerpos con hasta 3 mutaciones de la secuencia de la línea germinal. En algunas modalidades, la cadena pesada comprende además una secuencia de aminoácidos codificada por un gen D3-9 o D3-10 humano. En algunas modalidades, la cadena pesada comprende además una secuencia de aminoácidos codificada por un gen JH4b o JH5b humano o la secuencia con 1 mutación de la secuencia de la línea germinal . En el caso de anticuerpos que utilizan un gen VH6-1 humano, la secuencia del anticuerpo puede tener de 0-6 mutaciones de la línea germinal. En donde las secuencias de aminoácidos comprenden mutaciones de las secuencias de VH1, D y/o JH de la línea germinal, las P05/079-AEC mutaciones pueden ser en las regiones del marco CDR5 o ambas . En una modalidad preferida, la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos codificada por el gen VH3-65 humano, un gen D3-9 humano y un gen JH4b humano. En otras modalidades, la región variable de la cadena pesada está codificada por un gen VH64 humano, un gen D3-10 humano y un gen JH5b humano. La invención proporciona además un anticuerpo anti-C. neoformans que comprende las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada CDRl, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 43 (G14F7E5) , SEQ ID NO: 47 (G15B4G5) o la SEQ ID NO: 51 (G19B9G7) , la secuencia de aminoácidos del inicio de CDRl hasta el final de CDR3 de cualquiera de las SEQ ID NO:, o la secuencia de aminoácidos de la región variable de cualquiera de las SEQ ID NO: . La invención proporciona además un anticuerpo que se une específicamente al GXM de C. neoformans, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de FRl, F2 , F3 y/o F4 de cualquiera de las SEQ ID NOS 43, 47 ó 51. En algunas modalidades, la afinidad de los anticuerpos anti-GXM, expresada como aKa del GXM 24067, es de 1 x 103 Mx o mayor. En algunas modalidades, aKa es de 1.3 x 103 M~A 2 x 103 M"1 o 2.1 x 103 M"1. Como se utiliza P05/079-AEC en la presente, aKa es el inverso de la concentración del antígeno soluble de GXM a un 50% de unión máxima al antígeno de la fase sólida. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-GXM de la invención se unen al GXM soluble unido a la superficie celular del serotipo A de C. neoformans, por ejemplo, el GXM de la cepa SB4 y H99. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-GXM de la invención, median la deposición del complemento de C3. En algunas modalidades los anticuerpos anti-GXM de la invención muestran protección contra la infección por C. neoformans . La invención contempla un anticuerpo humano aislado o una porción que se une al antígeno del mismo, que se une específicamente al GXM de C. neoformans y que comprende un dominio que se une al antígeno, elegido de la lista que consiste de un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 y un fragmento Fv. La invención contempla un anticuerpo humano aislado o una porción que se une al antígeno del mismo, que se une específicamente al GXM de C. neoformans y el anticuerpo es un anticuerpo de una sola cadena. La invención contempla un anticuerpo humano aislado o una porción que se une al antígeno del mismo, que P05/079-AEC se une específicamente al GXM de C. neoformans y el anticuerpo es un anticuerpo quimérico. En una modalidad preferida, el anticuerpo quimérico comprende regiones del marco y regiones de CDR de diferentes anticuerpos humanos. En una modalidad más preferida, el anticuerpo quimérico es biespecífico. En una modalidad más preferida, el anticuerpo quimérico es biespecífico para el GXM de C. neoformans y una marca seleccionada de la lista que consiste de una molécula radiomarcada, una marca enzimática, una marca fluorescente, una toxina, un agente magnético, un segundo anticuerpo, una marca de afinidad, una marca de epitopo, un antibiótico, una proteína complementaria y una citocina. La invención contempla un anticuerpo humano aislado o una porción que se une al antígeno del mismo, que se une específicamente al GXM de C. neoformans, en donde el anticuerpo o la porción del mismo está derivado. En una modalidad preferida, el anticuerpo o la porción del mismo se deriva con polietilenglicol, al menos un grupo metilo o etilo o al menos una porción carbohidrato. Uno puede utilizar moléculas de ácido nucleico de la invención para generar los derivados de anticuerpos utilizando las técnicas y métodos conocidos por alguien con experiencia ordinaria en la técnica. En otra modalidad, las moléculas de ácido P05/079-AEC nucleico, vectores y células hospederas pueden utilizarse para hacer anticuerpos anti-GXM mutados . Los anticuerpos pueden mutarse en los dominios variables de las cadenas pesada y/o ligera, para alterar una propiedad de unión del anticuerpo. Por ejemplo, puede hacerse una mutación en una o más de las regiones CDR para incrementar o disminuir la d del anticuerpo para la GXM, para incrementar o disminuir la Koff, o para alterar la especificidad de la unión del anticuerpo. Las técnicas en la mutagénesis dirigida al sitio son bien conocidas en el campo. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. y Ausubel et al., supra . Si se desea introducir mutaciones en los anticuerpos, de manera preferida, las mutaciones se hacen en un residuo de aminoácido que se sabe va a cambiar, en comparación con la línea germinal en una región variable de un anticuerpo anti-GXM. De manera más preferida, se hacen una o más mutaciones en el residuo de aminoácidos que se sabe van a cambiar en comparación con la línea germinal en una región variable de uno de los anticuerpos anti-GXM de la invención. En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico se mutan en una o más de las regiones del marco. Puede hacerse una mutación en la región del marco o un dominio constante para incrementar la vida media del anticuerpo anti-GXM. También puede hacerse una mutación en la región del marco o el dominio constante para alterar la P05/079-AEC inmunogenicidad del anticuerpo, para eliminar los sitios de deanudación o los sitios de glicosilación para proporcionar un sitio para la unión covalente o no covalente a otra molécula o para alterar tales propiedades como una fijación del complemento . Las mutaciones pueden hacerse en cada una de las regiones del marco, el dominio constante y las regiones variables en un solo anticuerpo mutado. De manera alterna, pueden hacerse mutaciones en sólo una de las regiones del marco, las regiones variables o el dominio constante en un solo anticuerpo mutado. En otra modalidad, puede hacerse un anticuerpo de fusión o de inmunoadhesina que comprende todo o una porción de un anticuerpo anti-GXM enlazado a otro polipéptido. En una modalidad preferida, sólo las regiones variables del anticuerpo anti-GXM están enlazadas al polipéptido. En otra modalidad preferida, el dominio VH de un anticuerpo anti-GXM está enlazado a un primer polipéptido, mientras que el dominio VL de un anticuerpo anti-GXM está enlazado a un segundo polipéptido que se asocia con el primer polipéptido en una manera en la cual los dominios VH y VL pueden interactuar uno con el otro para formar un sitio que se une al anticuerpo. En otra modalidad preferida, el dominio VH está separado del dominio VL por un enlazante tal, que los dominios VH y VL pueden interactuar uno con el otro (véase también, Anticuerpos de Cadena Sencilla) . El P05/079-AEC anticuerpo VH-enlazante-VL se enlaza a continuación al polipéptido de interés. El anticuerpo de fusión es útil para detectar el GXM. Además, pueden crearse anticuerpos de fusión en los cuales dos (o más) anticuerpos de una sola cadena, se enlazan unos con otros. Esto es útil si uno quiere crear un anticuerpo divalente o polivalente en una sola cadena polipeptídica o si uno desea crear un anticuerpo biespecífico. En una modalidad, el anticuerpo de fusión o inmunoadhesina se prepara utilizando una o más regiones CDR de un anticuerpo anti-GXM. La invención contempla una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y un anticuerpo humano aislado o una porción que se une al antígeno del mismo, que se une específicamente al GXM de C. neoformans . La invención contempla además un equipo que comprende el anticuerpo o la porción que se une al antígeno del mismo, un portador farmacéuticamente aceptable del mismo y un recipiente. En algunas modalidades, el equipo comprende además instrucciones para el uso. La invención contempla un método para tratar o prevenir o inhibir la infección por C. neoformans o disminuir la severidad de una condición o trastorno causado por tal infección, que comprende el paso de administrar un anticuerpo de la invención o una porción que se une al P05/079-AEC antígeno del mismo o una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o una porción a un paciente en necesidad del mismo, tal como un paciente que está en riesgo de ser infectado con, o infectado actualmente con C. neoformans . En algunas modalidades, el paciente es un paciente inmunocomprometido . Los pacientes inmunocomprometidos pueden ser pacientes cuyas respuestas inmunes están disminuidas por la edad, enfermedad o tratamiento con fármacos, incluyendo el tratamiento con agentes inmunosupresores o con agentes antineoplásicos u otros agentes quimioterapéuticos. En algunas modalidades, los pacientes inmunocomprometidos, sufren de defectos del repertorio génico del anticuerpo, particularmente defectos o déficit en los genes de la familia VH3 humana. Los pacientes que pueden beneficiarse del tratamiento con un anti-Ab de GXM de la invención pueden ser de cualquier edad, es decir, infantes y niños hasta pacientes más ancianos . En una modalidad preferida, el anticuerpo humano se obtiene de un animal no humano. En una modalidad más preferida, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En otra modalidad preferida, la composición farmacéutica se administra vía inyección, transmucosal, oral, inhalación, ocular, rectal, implante que actúa a largo plazo, P05/079-AEC liposomas, emulsión, crema, tópica o medios de liberación sostenida. En otra modalidad preferida, el anticuerpo es una fusión con una segunda proteína. En una modalidad más preferida, la segunda proteína se elige de la lista que consiste de una porción peptídica tóxica, una proteína complementaria, una proteína radiomarcada, una citocina o una proteína de antibiótico. En otra modalidad preferida, el anticuerpo se marca con una radiomarca, una toxina, una proteína complementaria, una citocina o un antibiótico. En otra modalidad preferida, la composición farmacéutica comprende además una toxina, proteína complementaria, proteína radiomarcada, citocina, antibiótico o cualquier combinación de los mismos . La invención contempla una célula aislada que produce un anticuerpo humano o una porción que se une al antígeno del mismo, que se une específicamente al GXM de C. neoformans . En algunas modalidades, la célula se elige de la lista que consiste de una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de insecto, una célula de anfibio o una célula de mamífero. En las modalidades específicas, la célula de mamífero se selecciona de la lista que consiste de una célula humana, una célula de ratón, una célula de rata, una célula de perro, una célula de mono, una célula de cabra, una célula de cerdo, una célula de bovino y una célula de hámster. En otras modalidades específicas, la P05/079-AEC célula de mamífero se selecciona de la lista que consiste de una célula HeLa, una célula NIH 3T3, una célula CHO, una célula BHK, una célula VERO, una célula CV-1, una célula NS/0 y una célula COS. En otras modalidades, la línea celular es un hibridoma. La invención contempla un método para traducir un anticuerpo humano aislado o una porción que se une al antígeno del mismo, que se une específicamente al GXM de C. neoformans, que comprende: a) cultivar una célula no humana capaz de producir el anticuerpo bajo condiciones en las cuales se produce el anticuerpo; b) aislar el anticuerpo del cultivo celular . En algunas modalidades, el método para producir un anticuerpo humano aislado o una porción que se une al antígeno del mismo, que se une específicamente al GXM de C. neoformans, utiliza una línea celular inmortalizada. En algunas modalidades, la línea celular inmortalizada es un hibridoma. La invención contempla la producción de un anticuerpo humano adicional o una porción que se une al antígeno del mismo, que se unen específicamente al GXM de C. neoformans, que comprende: a) inmunizar un animal no humano que comprende un sitio de inmunoglobulina humana con una composición antigénica de C. neoformans; b) permitir que el animal no humano monte una respuesta humoral a la P05/079-AEC composición antigénica; y c) aislar el anticuerpo humano del animal no humano . La invención contempla una molécula de ácido nucleico aislada de un animal no humano, que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una cadena pesada del anticuerpo humano o la porción del mismo que se une específicamente al GXM de C. neoformans . En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico se aisla de un hibridoma que produce el anticuerpo humano. La invención contempla una molécula de ácido nucleico aislada, o un fragmento de la misma, que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una cadena pesada del anticuerpo humano o una porción que se une al antígeno del mismo, que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la cadena pesada del Mab G14F7E5, G15B4G5 o G19B9G7, en donde el anticuerpo humano se une específicamente al GXM de C. neoformans . En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico aislada, comprende la secuencia que codifica entre una a tres de las regiones CDR del anticuerpo humano. La invención contempla además una molécula de ácido nucleico aislada o un fragmento de la misma, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo humano o una porción que se une al antígeno del mismo, que comprende una secuencia de aminoácidos de CDR3 del Mab de G14F7E5, P05/079-AEC G15B4G5 o G19B9G7, en donde el anticuerpo humano se une específicamente al GXM de C. neoformans . La invención contempla una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una cadena pesada y/o una cadena ligera de un anticuerpo anti-C. neoformans o una porción que se une al antígeno del mismo . En algunas modalidades, el ácido nucleico comprende secuencias nucleotídicas que codifican una o más secuencias de aminoácidos de CDR de la cadena pesada o la cadena ligera, seleccionadas de las SEQ ID NOS: 44, 45, 46, 48, 49, 50, 52, 53 ó 54. En algunas modalidades, el ácido nucleico comprende secuencias nucleotídicas que codifican la CDRl, CDR2 y CDR3 encontradas en cualquiera de las SEQ ID NOS: 43, 47 ó 51. En otras modalidades, el ácido nucleico comprende una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 43, 47 ó 51 o de la porción de la región variable de la secuencia. En algunas modalidades, el ácido nucleico comprende una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de las regiones FRl, FR2 , FR3 y/o FR4 de cualquiera de las SEQ ID NOS: 43, 47 ó 51. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia nucleotídica seleccionada P05/079-AEC del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 35 y la SEQ ID NO: 39 o la secuencia nucleotídica de la región variable, una o más CDR y/o una o más FR de la misma. La invención contempla un vector que comprende una molécula de ácido nucleico, o un fragmento de la misma, que codifica una cadena pesada del anticuerpo humano o una porción que se une al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo se une específicamente al C. neoformans . En una modalidad preferida, el vector comprende además, las secuencias de control de la expresión enlazadas de manera operable al ácido nucleico. La invención contempla una molécula de ácido nucleico aislada o un fragmento de la misma, que codifica una cadena ligera del anticuerpo humano o una porción que se une al antígeno del mismo, que comprende una secuencia nucleotídica como se indica en la Tabla 2 (SEQ ID: 13, SEQ ID: 17 o SEQ ID: 21) o la secuencia nucleotídica de la región variable o una o más regiones FR de la misma, en donde el anticuerpo se une específicamente al GXM de C. neoformans . En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico aislada, comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica entre una a tres de las regiones CDR del anticuerpo humano. La invención contempla además una molécula de ácido nucleico aislada, o un fragmento de la misma, que comprende una secuencia de ácido nucleico que P05/079-AEC codifica la cadena ligera del anticuerpo humano o una porción que se une al antígeno del mismo, que comprende la secuencia de aminoácidos CDRl y CDR3 como se indica en la Tabla 3 (SEQ ID: 2 y 4; SEQ ID NO : 6 y 8; o SEQ ID NO: 10 y 12) , en donde el anticuerpo humano se une específicamente al GXM de C. neoformans . La invención contempla una molécula de ácido nucleico aislada o un fragmento de la misma, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo humano o una porción que se une al antígeno del mismo, que comprende las secuencias de aminoácidos CDRl y CDR3 como se indica en la Tabla 2 para los Mabs G14F7E5, G15B4G5 o G19B9G7 (SEQ ID NO: 14 y 16; SEQ ID NO : 18 y 20; o SEQ ID NO: 22 y 24, respectivamente) , en donde el anticuerpo humano se une específicamente al GXM de C. neoformans . La invención contempla un vector que comprende una molécula de ácido nucleico o un fragmento de la misma, que codifica la cadena ligera del anticuerpo humano o una porción que se une al antígeno del mismo, que se une específicamente al C. neoformans . En una modalidad preferida, el vector comprende además, una secuencia de control de la expresión enlazada de manera operable al ácido nucleico. La invención contempla una célula hospedera aislada que comprende: a) una molécula de ácido nucleico P05/079-AEC que se aisló de un animal no humano, que codifica una cadena ligera o una porción que se une al antígeno de la misma de un anticuerpo humano que se une específicamente al GXM de C. neoformans; o b) un vector que comprende la molécula de ácido nucleico. La invención contempla una célula hospedera aislada que comprende: a) una molécula de ácido nucleico que se aisló de un animal no humano y que codifica una cadena pesada o la porción que se une al antígeno de la misma, de un anticuerpo humano que se une específicamente al GXM de C. neoformans; o b) un vector que comprende la molécula de ácido nucleico. La invención contempla una célula hospedera aislada que comprende: a) una molécula de ácido nucleico que se aisló de un animal no humano y que codifica una cadena pesada o la porción que se une al antígeno de la misma y una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una cadena ligera o una porción que se une al antígeno de la misma, de un anticuerpo humano que se une específicamente al GXM de C. neoformans; o b) un vector o vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico. La invención contempla un método para producir de manera recombinante la cadena pesada o la porción que se une al antígeno de la misma, la cadena ligera o la porción que se une al antígeno de la misma, o tanto la cadena P05/079-AEC ligera como la cadena pesada o las porciones que se unen al antígeno de las mismas, o un anticuerpo humano que se identificó de un animal no humano y que se une específicamente al GXM de C. neoformans, que comprende el paso de cultivar las células hospederas descritas anteriormente, bajo condiciones en las cuales se expresan las moléculas de ácido nucleico. La invención contempla una cadena pesada del anticuerpo humano aislado o una porción que se une al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo se une específicamente al GXM de C. neoformans, codificada por cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena pesada descrita anteriormente o aislada de cualquiera de las células hospederas descritas anteriormente . La invención contempla una cadena ligera de un anticuerpo humano aislado o una porción que se une al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo se une específicamente al GXM de C. neoformans, codificada por cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena pesada descrita anteriormente o aislada de cualquiera de las células hospederas descritas anteriormente . La invención contempla un animal transgénico no humano que comprende cualquiera de las moléculas de ácido P05/079-AEC nucleico descritas anteriormente. En una modalidad preferida, el animal transgénico no humano expresa la molécula o moléculas de ácido nucleico. En una modalidad más preferida, el animal transgénico no humano comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una cadena pesada o la porción que se une al antígeno de la misma y una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una cadena ligera o la porción que se une al antígeno de la misma de un anticuerpo humano que se une específicamente al GXM de C. neoformans, el animal no humano expresa ambas moléculas de ácido nucleico. En una modalidad más preferida, el animal no humano se selecciona de la lista que consiste de un ratón, una rata, un hámster, una vaca, una oveja, un primate, un caballo y un cerdo. En una modalidad más preferida, el anticuerpo humano que resulta de la expresión de las moléculas de ácido nucleico aisladas o porciones de las mismas, se expresa en la superficie de las células derivadas de las células linfocíticas B del animal o la progenie de las mismas. En otra modalidad preferida, el anticuerpo humano que resulta de la expresión de las moléculas de ácido nucleico aisladas o una porción de las mismas, se secreta en la linfa, sangre, leche, saliva o ascitos del animal . La invención contempla una proteína de fusión que comprende un anticuerpo humano aislado o una porción que se P05/079-AEC une al antígeno del mismo, que se une específicamente al GXM de C. neoformans y una segunda secuencia polipeptídica.

En varias modalidades, la segunda secuencia polipeptídica se elige de la lista que consiste de una marca de epitopo, una marca de afinidad, un polipéptido tóxico, un antibiótico, una enzima, una segunda secuencia del anticuerpo, una proteína complementaria y una citocina. La invención contempla un anticuerpo humano aislado o una porción que se une al antígeno del mismo, que se une específicamente al GXM de C. neoformans, en donde el isotipo de la cadena pesada del anticuerpo es mu, gamma, delta, epsilon o alfa. La invención contempla un anticuerpo humano aislado o una porción que se une al antígeno del mismo, que se une específicamente al GXM de C. neoformans , en donde el anticuerpo o la porción que se une al antígeno del mismo se produce mediante un proceso que comprende los pasos de : a) inmunizar un animal no humano que comprende un sitio de inmunoglobulina humana con un antígeno seleccionado del grupo que consiste de una preparación de GXM de C. neoformans, una preparación celular virulenta de C. neoformans, una preparación celular atenuada de C. neoformans y una preparación celular destruida de C. neoformans; b) permitir que el animal no humano monte una respuesta inmune al antígeno, y c) aislara el anticuerpo P05/079-AEC del animal no humano . La invención contempla un anticuerpo humano aislado o una porción que se une al antígeno del mismo, aislado de un animal o célula que estaba libre de biomateriales humanos contaminantes, tales como virus, enzimas, hormonas, citocinas, receptores, ligandos del receptor, inmunoglobulinas, complementos, proteínas nucleares y proteínas de señalización citoplásmica. En particular, los anticuerpos humanos de la invención están libres de virus o retrovirus de Epstein-Barr. Las composiciones farmacéuticas pueden fabricarse por medio de procesos convencionales de mezclado, disolución, granulación, formación de grageas, levigación, emulsificación, encapsulación, inclusión o liofilización. Las composiciones farmacéuticas para utilizarse de acuerdo con la presente invención, pueden formularse entonces de una manera convencional, utilizando uno o más portadores fisiológicamente aceptables, que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden utilizarse farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la ruta de administración elegida. Para inyección, los agentes de la invención pueden formularse en soluciones acuosas, de manera preferida en amortiguadores fisiológicamente compatibles, P05/079-AEC tales como solución de Hanks, solución de Ringer o amortiguador de suero fisiológico. Para la administración transmucosal, se utilizan penetrantes apropiados para la barrera a ser perneada, en la formulación. Tales penetrantes se conocen generalmente en la técnica. Para la administración ocular, se utilizan suspensiones en una solución salina apropiada, como es bien sabido en la técnica. Para la administración oral, los compuestos pueden formularse fácilmente combinando los compuestos activos con portadores farmacéuticamente aceptables, bien conocidos en la técnica. Tales portadores permiten que los compuestos de la invención se formulen como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y lo similar, para la ingestión oral por un paciente a ser tratado. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse como un excipiente sólido, triturando opcionalmente una mezcla resultante y procesando la mezcla de granulos, después de agregar auxiliares adecuados, si se desea, para obtener núcleos de tabletas o grageas. Los excipientes adecuados incluyen rellenos tales como azúcares, incluyendo lactosa, sucrosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de papa, gelatina, goma de P05/079-AEC tragacanto, metil celulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona (PVP) . Si se desea, pueden agregarse agentes desintegrantes, tales como polivinil pirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato de sodio. Los núcleos de las grageas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para este propósito, pueden utilizarse soluciones concentradas de azúcar, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinil pirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y solventes o mezclas de solventes orgánicos adecuados . Pueden agregarse tintes o pigmentos a los recubrimientos de las tabletas o grageas para la identificación o caracterización de diferentes combinaciones de dosis del compuesto activo. Las preparaciones farmacéuticas que pueden utilizarse oralmente incluyen cápsulas de ajuste suave {push- fi t) hechas de gelatina, así como cápsulas selladas blandas, suaves, hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste suave pueden contener los ingredientes activos en mezcla con rellenos tales como lactosa, aglutinantes tales como almidones y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas de gelatina blanda, los compuestos activos pueden P05/079-AEC disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, pueden agregarse estabilizantes. Todas las formulaciones para la administración oral deben estar en dosis adecuadas para tal administración. Para la administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o cápsulas formuladas de la manera convencional . Para la administración mediante inhalación, los compuestos para utilizarse de acuerdo con la presente invención, se suministran de manera conveniente en la forma de una presentación de rocío en aerosol desde paquetes presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para suministrar una cantidad dosificada. Las cápsulas o cartuchos de, por ejemplo, gelatina, para utilizarse en un inhalador o insuflador, pueden formularse para que contengan una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón . Los compuestos pueden formularse para la administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, P05/079-AEC mediante inyección de un bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes con múltiples dosis, con un conservador agregado. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o de dispersión. Las formulaciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Además, las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse como suspensiones oleosas para inyección apropiadas. Los solventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo o esteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetil celulosa sódica, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizantes o agentes adecuados que incrementen la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.

P05/079-AEC De manera alterna, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para la constitución con un vehículo adecuado, tal como agua libre de pirógenos, antes del uso . Los compuestos pueden formularse también en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases para supositorio convencionales, tales como manteca de cacao u otros triglicéridos. Además de las formulaciones descritas previamente, los compuestos también pueden formularse como una preparación de depósito. Tales formulaciones que actúan a largo plazo pueden administrarse mediante implante (por ejemplo, subcutánea o intramusculármente) o mediante inyección intramuscular. Así, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble. Un portador farmacéutico para los compuestos hidrofóbicos de la invención, es un sistema cosolvente que comprende alcohol bencílico, un tensoactivo no polar, un polímero orgánico miscible en agua y una fase acuosa. El sistema cosolvente puede ser el sistema cosolvente VPD. El P05/079-AEC VPD es una solución de alcohol bencílico al 3% en peso/volumen, tensoactivo no polar polisorbato 80 al 8% en peso/volumen y polietilenglicol 300 al 65% en peso/volumen, aforado al volumen en etanol absoluto. El sistema cosolvente VPD (VPD:5W) consiste de VPD diluido 1:1 con dextrosa al 5% en una solución acuosa. Este sistema cosolvente disuelve bien los compuestos hidrofóbicos y por sí mismo, produce baja toxicidad tras la administración sistémica. Naturalmente, las proporciones de un sistema cosolvente pueden variarse considerablemente sin destruir sus características de solubilidad y toxicidad. Además, la identidad de los componentes del cosolvente puede variarse: por ejemplo, pueden utilizarse otros tensoactivos no polares de baja toxicidad, en lugar del polisorbato 80; el tamaño de la fracción de polietilenglicol puede variarse; otros polímeros biocompatibles pueden reemplazar al polietilenglicol, por ejemplo, polivinil pirrolidona y otros azúcares o polisacáridos pueden sustituirse por la dextrosa . De manera alterna, pueden emplearse otros sistemas de suministro para compuestos farmacéuticos hidrofóbicos. Los liposomas y emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos o portadores de suministro para los fármacos hidrofóbicos. Ciertos solventes orgánicos, tales como sulfóxido de dimetilo también pueden emplearse, aunque P05/079-AEC usualmente con mayor toxicidad. Adicionalmente, los compuestos pueden suministrarse utilizando un sistema de liberación sostenida, tal como matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el agente terapéutico. Se han establecido varios materiales de liberación sostenida y son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Las cápsulas de liberación sostenida pueden, dependiendo de su naturaleza química, liberar los compuestos durante pocas semanas hasta más de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y de la estabilidad biológica del reactivo terapéutico, pueden emplearse estrategias adicionales para la estabilización de la proteína. Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender portadores o excipientes sólidos o en fase gel, adecuados. Los ejemplos de tales portadores o excipientes incluyen de manera no exclusiva, carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros tales como polietilenglicoles . El anticuerpo humano aislado o una porción que se une al antígeno del mismo, que se une específicamente al GXM de C. neoformans de la invención, puede proporcionarse como sales con contraiones farmacéuticamente aceptables.

P05/079-AEC Las sales farmacéuticamente compatibles pueden formarse con muchos ácidos, incluyendo, de manera no exclusiva, clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en solventes acuosos o protónicos, que son las formas de la base libre correspondientes. Los equipos de la presente invención comprenden instrucciones para utilizar las composiciones de la presente invención para la inhibición, prevención o tratamiento de infecciones por C. neoformans o condiciones o trastornos causados por tal infección. Las instrucciones impresas en el equipo permiten a alguien con experiencia en la técnica, utilizar el equipo para practicar los métodos de la presente invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a manera de ilustración únicamente . No pretenden limitar el alcance de la invención descrita en la presente .

Ejemplo 1 - Generación de Anticuerpos Monoclonales para ßl glucuronoxilomanano (GXM o Glucuronoxylomannan) del polisacárido capsular de Cryptococcus neoformans Vacunamos ratones transgénicos con inmunoglobulina humana IgG2 -kappa (ratones XenoMouse®; Méndez et al., Nat . Genet . 15, pp. 146-56 (1997)) con glucuronoxilomanano de C. neoformans serotipo D (Cepa P05/079-AEC 24067, ATCC) conjugado con el toxoide diftérico (GXM-DT) . Las vacunas se realizaron subcutáneamente en la base de la cola. Se administró una inyección de 100 µl de 10 µg de GXM-DT con 50 µl de Alhydrogel y 10 µl de CpG a cada ratón tres veces: en los días 0, 14 y 28. Los esplenocitos se aislaron de los ratones en el día 42 y se produjeron los hibridomas mediante fusión de los esplenocitos con la línea celular del mieloma de ratón NSO, de acuerdo con las técnicas bien conocidas en el campo (Pirofski et al . , Infect. Immun. 63: 3005-14,1995; Chang et . al. Infect Immun . 70: 4977-86, 2002). Las células de hibridoma se clonaron en agar suave y se propagaron utilizando medio de hibridoma enriquecido . Se seleccionaron más de 500 líneas celulares del hibridoma para la secreción de anticuerpos que reaccionaron con el GXM 24067. Los sobrenadantes de las células que muestran crecimiento se incubaron con placas ELISA de poliestireno (Corning™ Glass Works, Corning, NY) recubiertas con 10 µg/ml de GXM 24067 a 37°C durante 1 hora; las placas se lavaron y se incubaron a 37°C durante 1 hora con reactivos anti-humano de cabra conjugados con fosfatasa alcalina (AP) a IgG, IgM, cadenas ligeras kappa y reactivo anti-ratón de cabra específico para las cadenas ligeras lambda (FisherBiotech®, Fisher Scientific™, Pittsburgh, PA) . Las placas se lavaron y la unión se P05/079-AEC detectó con sustrato de fosfato de p-nitrofenilo (Sigma, St . Louis, MO) . Las densidades ópticas se midieron a 405 nm con un Lector de Microplaca MRX (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) . El control negativo fue anticuerpo del mieloma de IgM (Calbiochem, San Francisco, CA) . Los hibridomas que se unen al GXM se probaron para la unión a varios antígenos, incluyendo el mimotopo de GXM (P13) como se describió en (Zhang et al., Infect . Immun . 65 1158-64, 1997 y Fleuridor, et al., J Infect . Dis . 180: 1526-35 (1999), proteína A de estafilococos (SPA; Sigma) , DT y BSA, utilizando técnicas estándar como se describe en (Russell et al., Infect . Immun. 68: 1820-26, 2000, Pirofski et al., Infect . Immun . 63: 3005-14, 1995 y Chang et al., Infect . Immun . 68: 1820-26, 2002).

Ejemplo 2 - Caracterización de los MAbs para el GMX de criptococos Después de selecciones repetidas para probar la especificidad, se encontraron que tres líneas celulares de hibridomas tienen la reactividad más alta con el GXM y que son reactivos con el GXM únicamente . Los tres MAbs humanos producidos por estos hibridomas, G14F7E5, G15B4G5 y G19B9G7, se estudiaron adicionalmente. Los tres anticuerpos son IgM y reaccionan con el GXM 24067 y no exhiben una unión significativa (por encima del fondo) a DT, BSA o al P05/079-AEC mimotopo de GXM P13, mediante ELISA directo. Los tres MAbs se unen al GXM en las células de C. neoformans de la cepa 24067 basándose en la tinción inmunofluorescente. Los tres hibridomas se depositaron en Mayo 1, del 2003 con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) , 10801 University Blvd. , Manassas, VA 20110-2209, E. U. A. bajo las condiciones del Tratado de Budapest para el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Propósitos del Procedimiento de las Patentes. Se asignaron los siguientes números de acceso ATCC: G14F7E5 PTA-5170 15B4G5 PTA-5171 G19B9G7 PTA-5172 La especificidad de los MAbs para el C. neoformans serotipo A también se determinó. El serotipo A es la causa más común de criptococosis en Norteamérica; mientras que el serotipo D es el segundo serotipo más común en Norteamérica y es una causa común de enfermedad en Europa. Los estudios de especificidad del serotipo se realizaron utilizando GXM purificado y ELISA de células completas como sigue .

ELISA del GSM purificado: Se incubaron diluciones en serie de cada uno de los MAbs (comenzando a 10 µg/ml) P05/079-AEC con placas de ELISA recubiertas con 10 µg/ml de GXM de C. neoformans cepa 24067, serotipo A cepas SB4 y H99 (proporcionadas por el Dr. Arturo Casadevall, Colegio de Medicina Albert Einstein) o P13 -dextrano en PBS; las placas se lavaron e incubaron con un IgM-AP anti-humano de cabra (Fisher) durante 1 hora, se lavaron y revelaron como en lo anterior. Los MAbs G14F7E5 y G19B9G7 reaccionaron con ambas cepas del serotipo A, mientras que G15B4G5 no se unió de manera apreciable a ninguna cepa del serotipo A, indicando que los MAbs tienen diferente especificidad por la cepa. Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1: Especificidad de la Cepa de la Reactividad de los Mabs G14F7E5, G15B4G5 y G19B9G7 con GXM soluble ELISA de células completas: Las cepas de C. neoformans 24067, SB4 y H99 se cultivaron en caldo de cultivo Saboraud (Becton Dickinson, Sparks MD) durante 2 P05/079-AEC días, después de lo cual las células se lavaron en PBS, se contaron y se destruyeron con calor a 68°C durante 2 horas. La muerte celular se verificó incubando las células destruidas con calor en caldo de dextrosa Saboraud durante la noche a 31°C. Las células se diluyeron en PBS, se emplacaron en placas para ELISA a una concentración de lxlO7 cfu/ml (50 µl/pozo) y las placas se incubaron durante la noche a 4°C. Como controles se utilizaron una IgM de mieloma (Calbiochem) e IgM monoclonal anti-PPS8, Dll . Las células no unidas se eliminaron y las células unidas de fijaron a las placas mediante incubación con 150 µl/pozo de metanol durante 30 minutos. Las placas se lavaron y bloquearon con BSA/PBS al 1% durante 1 hora a 37°C. Después de lavar, los MAbs o la IgM de mieloma de control (Calbiochem, San Diego, CA) se agregaron a las placas a una concentración inicial de 10 µg/ml, diluidos 1:3 y se incubaron durante 1 hora a 37°C. Después de lavar, las placas se incubaron con una dilución 1:1000 (en BSA/PBS al 0.1%) de IgM anti-humano de cabra conjugada con AP durante 1 hora a 37°C. Las placas se revelaron como en lo anterior y se leyeron a una longitud de onda de 405 nm. Los tres MAbs se unieron a ambas cepas del serotipo A, aunque el mAb G15B4G5 se unió a un menor grado que los otros dos mAbs .

P05/079-AEC Ejemplo 3 - Especificidad del Antígßno La especificidad al GXM de los MAbs se confirmó con un ELISA de inhibición. Como controles, se utilizaron una IgM de mieloma humano (véase lo anterior) y Dll, que es una IgM específica para el serotipo 8 de Streptococcus pneumoniae (Zhong et al., Infect . Immun . 67: 4119-27, 1999) . Las placas de ELISA, recubiertas con 10 µg/ml de los GXM (24067 SB4 o H99) o 10 µg/ml de P13-DEX (un conjugado de dextrano de un mimetopo polipeptídico del GXM previamente reportado; Fleuridor et al., J. I munol . 166: 1087-96 (2001); Maitta et al., Infection Immun. 72: 196-208 (2004) ) durante 3 horas a temperatura ambiente, se lavaron y bloquearon con BSA/PBS al 1% durante la noche a 4°C. Las placas se incubaron con diluciones en serie de los GXM solubles mezclados (comenzando con 100 µg/ml) con los MAbs 10 ó 1 µg/ml; las placas se lavaron, se incubaron con IgM-AP anti-humana de cabra (Fisher) durante 1 hora a 37°C y se revelaron y leyeron como en lo anterior . Como se muestra en la Figura 1, el GXM soluble de la cepa SB4 no inhibió la unión de ninguno de los mAbs al GXM de la cepa 24067 (panel A) .

Ejemplo 4 - Análisis de la Secuencia de los MAbs al GXM de C. neoformans 24067 P05/079-AEC Obtuvimos las secuencias nucleotídicas para las regiones variables (VL) de la cadena ligera de los MAbs, secuenciando el ADNc de VL amplificado con PCR el ADNc de VL de los hibridomas . Generamos el ADNc de VL mediante transcripción inversa del ARN utilizando los cebadores específicos de VL: V? sentido, 5' -GAA(CT) TC (T) GAGCTCACC (GT)CAGTCTCCA-3' (SEQ ID NO: 25; (CT) indica que la posición 3 tiene una frecuencia igual de ser A, C o T; la (T) indica que la posición 6 tiene una frecuencia igual de ser C o T; (GT) indica que la posición 15 tiene una frecuencia igual de ser C, G o T) ; VK anti-sentido, 5'-CCTGTTGAAGCTCTTTGTGAC-3' (SEQ ID NO : 26) . Los productos de la PCR se secuenciaron de dos experimentos independientes y se encontró que son idénticos . Las secuencias nucleotídicas que comprenden las regiones variables y las CDR de G14F7E5, G15B4G5 y G19B9G7 se indican a continuación en la Tabla 2. Las secuencias de aminoácidos que comprenden las regiones variables y las CDR de G14F7E5, G15B4G5 y G19B9G7 se muestran a continuación en la Tabla 3. Comparamos las secuencias de la región variable con la base de datos de las secuencias de inmunoglobulina humana utilizando DNA PLOT (índice de la Base V; Centro MRC para la Concepción Tecnológica de Proteínas, Cambridge, Reino Unido; Mukherjee et al., J. Exp. Med. 177: 1105-16(1993)).

P05/079-AEC Tabla 2 ; Secuencias de los Ácidos Nucleicos de las Cadenas Ligeras de los Mabs G14F7E5, G15B4G5 y G19B9G7.

Identidad Secuencia de los Ácidos Nucleicos SEQ ID de la NO: Secuencia región 5'-GGCACCCTGT CTTTGTCTCC AGGGGAAAGA 13 variable GCCACCCTCT CCTGCAGGGC CAGTCAGAGT del GTTATCAGCA GCTACTTAGC CTGGTACCAG G14F7E5 CAGAAACCTG GCCAGGCTCC CAGGCTCCTC ATCTATGGTG CATCCAGCAG GGCCACTGGC ATCCCAGACA GGTTCAGTGG CAGTGGGTCT GGGACAGACT TCACTCTCAC CATCAGCAGA CTGGAGCCTG AAGATTTTGC AGTGTATTAC TGTCAGCAGT ATGGTAACTC ACGGACGTTC GGCCAAGGGA CCAAGGTGGA AATCAAACGA ACTGTGGCTG CACCATCTGT CTTCATCTTC CCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGA ACTGCCTCTG TTGTGTGCCT GCTGAATAAC TTCTATCCCA GAGAGGCCAA AGTACAGTGG AAGGTGGATA ACGCCCTCCA ATCGGGTAAC TCCCAGGAGA GTGTCACAGA GCAGGACAGC AAGGACAGCA CCTACAGCCT CAGCAGCACC CTGACGCTGA GCAAAGCAGA CTACGAAGAA ACACAAAGTT CTACGCCTGC GAAGGTNANN NATCAG-3' CDRl de 5 ' -AGGGCCAGTC AGAGTGTTAT CAGCAGCTAC 14 G14F7E5 TTAGCC-3' CDR2 de 5'-GGTGCATCCA GCAGGGCCAC T-3' 15 G14F7E5 CDR3 de 5'-CAGCAGTATG GTAACTCACG GACG-3' 16 G14F7E5 región 5'-CAGTCTCCAG GCACCCTGTC TTTGTCTCCA 17 variable GGGGAAAGAG CCACCCTCTC CTGCAGGGCC del AGTCAGAGTG TTAGCAGCAG CTACTTAGCC G15B4G5 TGGTACCAGC AGAAACCTGG CCAGGCTCCC AGGCTCCTCA TCTATGGTGC ATCCAGCAGG GCCACTGGCA TCCCAGACAG GTTCAGTGGC AGTGGGTCTG GGACAGACTT CACTCTCACC ATCAGCAGAC TGGAGCCTGA AGATTTTGCA GTGTATTACT GTCAGCAGTA TGGTAGCTCA CGGACGTTCG GCCAAGGGAC CAAGGTGGAA P05/079-AEC Identidad Secuencia de los Ácidos Nucleicos SEQ ID de la NO: Secuencia ATCAAACGAA CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG AGAGGCCAAA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCCT CAGCAGCACC CTGACGCTGA AGCAAAAGCA GACTACGAAG AAACACAAAG GTTCTACGCC TGCGAANGGT CAANACCAT-3' CDRl de 5 ' -AGGGCCAGTC AGAGTGTTAG CAGCAGCTAC 18 G15B4G5 TTAGCC-3' CDR2 de 5 ' -GGTGCATCCA GCAGGGCCACT -3' 19 G15B4G5 CDR3 de 5'-CAGCAGTATG GTAGCTCACG GACG-3' 20 G15B4G5 región 5 '-TCTTTGTCTC CAGGGGAAAG AGCCACCCTC 21 variable TCCTGCAGGA CCAGTCAGAG TATTACCAAC del AGCTACTTAG CCTGGTACCA GCAGAAACCT G19B9G7 GGCCAGGCTC CCAGGCTCCT CATCTATGGT GCATCCAGCA GGGCCACTGG CATCCCAGAC AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC TGGGACAGAC TTCACTCTCA CCATCAGCAG ACTGGAGCCT GAAGATTTTG CAGTGTATTA CTGTCAGCAG TATGGTAACT CACGGACGTT CGGCCAAGGG ACCAAGGTGG AAATCAAACG AACTGTGGCT GCACCATCTG TCTTCATCTT CCCGCCATCT GATGAGCAGT TGAAATCTGG AACTGCCTCT GTTGTGTGCC TGCTGAATAA CTTCTATCCC AGAGAGGCCA AAGTACAGTG GAAGGTGGAT AACGCCCTCC AATCGGGTAA CTCCCAGGAG AGTGTCACAG AGCAGGACAG CAAGGACAGC ACCTACAGCC TCAGCAGCAC CCTGACGCTG AGCAAAGCAG ACTACGAAGA AACACAAAGT TCTACGCCTG CGAAAGGTNN AANANNGATC AAGGG-3 ' CDRl de 5 ' -AGGACCAGTC AGAGTATTAC CAACAGCTAC 22 G19B9G7 TTAGCC-3' P05/079-A?C Tabla 3 : Secuencias de Amino Ácidos de las Cadenas Ligeras de los Mabs G14F7E5, G15B4G5 y G19B9G7.

Identidad Secuencia de los Aminoácidos SEQ ID de la NO: Secuencia región GTLSLSPGER ATLSCRASQS VISSYLAWYQ 1 variable QKPGQAPRLL IYGASSRATG IPDRFSGSGS del GTDFTLTISR LEPEDFAVYY CQQYGNSRTF G14F7E5 GQGTKVEIKR TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEE TQSSTPAKVX XQ CDRl de RASQSVISSY LA 2 G14F7E5 CDR2 de GASSRAT 3 G14F7E5 CDR3 de QQYGNSRT 4 G14F7E5 región QSPGTLSLSP GERATLSCRA SQSVSSSYLA 5 variable WYQQKPGQAP RLLIYGASSR ATGIPDRFSG del SGSGTDFTLT ISRLEPEDFA VYYCQQYGSS G15B4G5 RTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSP QQHPDAEAKA DYEETQRFYA CEXSXP CDRl de RASQSVSSSY LA 6 G15B4G5 CDR2 de GASSRAT 7 G15B4G5 P05/079-AEC Los transcriptos del gen de la región variable de la cadena VL de los tres MAbs, utilizan un gen humano VKA27 (DPK22) y un elemento del gen de la cadena ligera J?l humana. Las comparaciones de la secuencia muestran que el G15B4G5 tiene una secuencia A27 de la línea germinal. En contraste, ambos G14F7E5 y G19B9G7 tienen la misma sustitución nucleotídica en la región CDR3 , G a A (posición 257 en la SEQ ID NO: 13 y posición 248 en la SEQ ID NO: 21) . G15B4G5 carece de esta sustitución. Esta sustitución resulta en un cambio de aminoácido de Serina (S) a Asparagina (N) (posición 86 en la SEQ ID NO:l y posición 83 en la SEQ ID NO: 9) . Las comparaciones de la secuencia muestran que G14F7E5 tiene una sola sustitución P05/079-AEC nucleotídica en CDRl de G a T (posición 65 en la SEQ ID NO: 13) . Esta sustitución resulta en un cambio de aminoácido de Serina (S) a Isoleucina (I) (posición 22 en la SEQ ID NO: 1) . G19B9G7 tiene cuatro sustituciones en la CDRl: de G a A en las posiciones 40, 52 y 59 en la SEQ ID NO: 13, y de G a C en la posición 56 en la SEQ ID NO: 13. Estas sustituciones resultan en cambios de aminoácidos como sigue: de Alanina (A) a Treonina (T) en la posición 14 en la SEQ ID NO: 9; de Valina (V) a Isoleucina (I) en la posición 18 en la SEQ ID NO: 9; de Serina (S) a Treonina (T) en la posición 19 en la SEQ ID NO: 9; y de Serina (S) a Asparagina (N) en la posición 20 en la SEQ ID NO: 9. Determinamos que las secuencias del gen VH del ADNc del gen VH amplificado por PCR de los hibridomas que producen los Mabs G14F7E5, G15B4G5 y G19B9G7 como sigue. Generamos un ADN de VH mediante la transcripción inversa del ARN utilizando los cebadores de la región constante de VH. A continuación, amplificamos la región VH del ADNc mediante PCR utilizando una mezcla de cebadores específicos de VH que cubren colectivamente todos los genes VH en los ratones Xenomouse® uti1izados : VH3-07 sentido, 5' -CACCATGGARTTGGGGCTGAGCTGG-3 ' (SEQ ID NO: 29) ; VH3-09 sentido, 5 ' -CACCATGGAGTTKGGACTGAGCTGG-3 ' (SEQ ID NO: 55) ; P05/079-AEC VH3-11 sentido, 5' -CACCATGGAGTTTGGGCTKAGCTGG-3 ' (SEQ ID NO: 56) ; VH3-21 sentido, 5' -CACCATGGAACTGGGGCTCCGCTGG-3 ' (SEQ ID NO: 57) ; VH3-48 sentido, 5 ' -CACCATGGAGTTGGGGCTGTGCTGG-3 ' (SEQ ID NO: 58) ; VH3 -53 sentido, 5 ' -CACCATGGAGTTTTGGCTGAGCTGG-3 ' (SEQ ID NO: 59) ; VH3-64 sentido, 5' -CACCATGACGGAGTTTGGGCTGAGC-3 ' (SEQ ID NO: 60) ; o VH6 sentido, 5 ' -CACCATGTCTGTCTCCTTCCTCATCTT-3 ' (SEQ ID NO: 61) ; y VH3 anti-sentido-IgM ASO, 5'- GTGCTGCTGATGTCAGAGTTG-3' (SEQ ID NO : 30) . Purificamos con gel y clonamos los productos de la PCR del VH en el plásmido pCRIOOO del sistema de clonación TA (Invitrogen™, San Diego, CA) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Aislamos el ADN del plásmido utilizando el protocolo del plásmido Maxi (Qiagen®, Inc., Chatsworth, CA) y lo secuenciamos utilizando el equipo de reacción listo para secuenciar con ciclo terminador Big Dye de ABI-PRISM (Perkin Elmer, Torrance, CA) . Comparamos las secuencias de la región variable con la base de datos de las secuencias de inmunoglobulina humana utilizando DNA PLOT (índice de la P05/079-AEC Base V; Centro MRC para la Concepción Tecnológica de Proteínas, Cambridge, Reino Unido; Mukherjee et al., ". Exp . Med. 177: 1105-16 (1993)), para determinar el uso del gen y para identificar las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3.

Tabla 4 : Secuencias de Ácidos Nucleicos de las Cadenas Pesadas de los Mabs G14F7E5, G15B4G5 y G19B9G7.

Identidad Secuencia de los Ácidos Nucleicos SEQ ID de la NO: Secuencia región 5' -GAAGATCTCA CCATGTCTGT CTCCTTCCTC 31 variable ATCTTCTTGC CCGTACTGGG CCTCCCATGG del GGTGTCCTGT CACAGGTACA GCTGCAGCAG G14F7E5 TCAGGTCCAG GACTGGTGAA GCCCTCGCAG ACCCTCTCAC TCACCTGTGC CATCTCCGGG GACAGTGTCT CTAGCAACAA TGCTGCTTGG AACTGGATCA GGCAGTCCCC ATCGAGAGGC CTTGAGTGGC TGGGAAGGAC ATACTTCAGG TCCAAGTGGT ATAATGATTA TGCAGTATCT GTGAAAAGTC GAATAACCAT CAACCCAGAC ACATCCAAGA ACCAGTTCTC CCTGCAGCTG AACTCTGTGA CTCCCGAGGA CACGGCTGTG TATTACTGTG CTAGAGAGGG TACTATGATT CGGGGAATTA TAAACTGGTT CGACTCCTGG GGCCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCCTCA GGGAGTGCAT CCGCCCCAAC CCTTTTCCCC CTCGT-3' CDRl de 5'-GGGGACAGTG TCTCTAGCAA CAATGCTGCT 32 G14F7E5 TGGAAC-3' CDR2 de 5 ' -AGGACATACT TCAGGTCCAA GTGGTATAAT 33 G14F7E5 GATTATGCAG TATCTGTGAA AAGT-3' P05/079-AEC Identidad Secuencia de los Aminoácidos SEQ ID de la NO: Secuencia CDR3 de 5'-GAGGGTACTA TGATTCGGGG AATTATAAAC 34 G14F7E5 TGGTTCGACT CC-3' región 5' -CTGAGCTGGT TTCCTGTTGC TATTTTTAAA 35 variable GGTGTCCAGT GTGAGGTGCA GCTGGTGGAG del TCTGGGGAAG GCTTGGTCCA GCCTGGGGGG G15B4G5 TCCCTGAGAC TCTCCTGTGC AGCCTCTGGA TTCACCTTCA GTAGCTATGC TATGCACTGG GTCCGCCAGG CTCCAGGGAA GGGACTGGAA TATGTTTCAG CTATTAGTAG TAATGGGGGT AGCACATATT ATGCAGACTC TGTGAAGGGC AGATTCACCA TCTCCAGAGA CAATTCCAAG AACACGCTGT ATCTTCAAAT GGGCAGCCTG AGAGCTGAGG ACATGGCTGT GTATTACTGT GCGAGAGATC ATACGATATT TGGACTGGTT CCTCCGTTGG ACTACTGGGG CCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCCTCAGG GAGTGCATCC GCCCCAACCC TTTTCCCCCT CGTCTCCTGT GAGAATTCCC CGTCGGATAC GAGCAGCGTG GCCGTTGGCT GCCTCGCACA GGACTTCCTT CCCGACTCCA TCACTTTCTC CTGGAAATAC AAGAACAACT CTGAC-3' CDRl de 5'-GGATTCACCT TCAGTAGCTA 36 G15B4G5 TGCTATGCAC-3' CDR2 de 5'-GCTATTAGTA GTAATGGGGG TAGCACATAT 37 G15B4G5 TATGCAGACT CTGTGAAGGG C-3' CDR3 de 5 '-GATCATACGA TATTTGGACT GGTTCCTCCG 38 G15B4G5 TTGGACTAC-3' región 5'-ATGTCTGTCT CCTTCCTCAT CTTCTTGCCC variable GTGCTGGGCC TCCCATGGGG TGTCCTGTCA del CAGGTACAGC TGCAGCAGTC AGGTCCAGGA G19B9G7 CTGGTGAAGC CCTCGCAGAC CCTCTCACTC ACCTGTGCCA TCTCCGGGGA CAGTGTCTCT AGCAACAATG CTGCTTGGAA CTGGATCAGG CAGTCCCCAT CGAGAGGCCT TGAGTGGCTG GGAAGGACAT ACT CAGGTC CTACTGGTAT AATGATTATG CAGTATCTGT GAAAAGTCGA ATAACCATCA ACCCAGACAC ATCCAAGAAC CAGTTCTCCC TGCAGCTGAA CTCTGTGACT P05/079-AEC Tabla 5: Secuencias de Aminoácidos de las Cadenas Pesadas de los Mabs G14F7E5, G15B4G5 y G19B9G7.

Identidad Secuencia de los Aminoácidos SEQ ID de la NO: Secuencia región EDLTMSVSFL IFLPVLGLPW GVLSQVQLQQ 43 variable SGPGLVKPSQ TLSLTCAISG DSVSSNNAAW del NWIRQSPSRG LEWLGRTYFR SKWYNDYAVS G14F7E5 VKSRITINPD TSKNQFSLQL NSVTPEDTAV YYCAREGTMI RGIINWFDSW GQGTLVTVSS GSASAPTLFP L CDRl de GDSVSSNNAA WN 44 G14F7E5 CDR2 de RTYFRSKWYN DYAVSVKS 45 G14F7E5 P05/079-AEC Identidad Secuencia de los Aminoácidos SEQ ID de la NO: Secuencia CDR3 de EGTMIRGIIN WFDS 46 G14F7E5 región LSWFPVAIFK GVQCEVQLVE SGEGLVQPGG 47 variable SLRLSCAASG FTFSSYAMHW VRQAPGKGLE del YVSAISSNGG STYYADSVKG RFTISRDNSK G15B4G5 NTLYLQMGSL RAEDMAVYYC ARDHTIFG V PPLDYWGQGT LVTVSSGSAS APTLFPLVSC ENSPSDTSSV AVGCLAQDFL PDSITFSWKY KNNSD CDRl de GFTFSSYAMH 48 G15B4G5 CDR2 de AISSNGGSTY YADSVKG 49 G15B4G5 CDR3 de DHTIFGLVPP LDY 50 G15B4G5 región MSVSFLIFLP VLGLP GVLS QVQLQQSGPG 51 variable LVKPSQTLSL TCAISGDSVS SNNAAWNWIR del QSPSRGLEWL GRTYYRSYWY NDYAVSVKSR G19B9G7 ITINPDTSKN QFSLQLNSVT PEDTAVYYCA REGTMIRGII NWFDSWGQGT LVTVSSGSAS APT CDRl de GDSVSSNNAA WN 52 G19B9G7 CDR2 de RTYYRSYWYN DYAVSVKS 53 G19B9G7 CDR3 de EGTMIRGIIN WFDS 54 G19B9G7 Las secuencias en negrillas son las secuencias de la señal (líderes) . Los análisis de la secuencia de la cadena pesada revelaron que el G15B4G5 comprende una secuencia de la línea germinal de un gen VH3-64 humano. El dominio variable de G15B4G5 utiliza además un gen D3-9 humano y un P05/079-AEC gen JH4b humano. Una comparación de las secuencias del dominio variable de G15B4G5, que confiere protección contra la infección por C. neoformans y otros GXM anti-C. neoformans humanos que se dice confieren protección, muestra los residuos conservados en la CDR2. Véase la Figura 3.

Ejemplo 5- Experimentos de Protección en Ratones La eficacia protectora de los MAbs se evaluó en experimentos de protección pasiva en ratones. Cada MAb o la IgM del mieloma de control se diluyó en PBS estéril y se administraron intraperitonealmente (IP) dosis de 1000, 100, 50, 5 y 0.5 µg a cada uno de diez ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas de edad (obtenidos de NCI) , una hora antes de la infección IP con 5x106 unidades formadoras de colonia (cfu) de la cepa 24067 de C. neoformans . Las inyecciones fueron de 0.1 ml, diluidas en PBS, y el inoculo micótico se confirmó emplacando en placas de agar de dextrosa saboraud (Fisher) . El número de ratones sobrevivientes se verificó diariamente. Cuando murieron los ratones de control, la supervivencia se evaluó estadísticamente con la prueba de supervivencia del logaritmo del rango de Kaplan-Meier. Una dosis de 100 µg de G15B4G5 fue protectora. Ninguna otra dosis o MAb confirió protección que fuera mayor que aquélla para los controles. G19B9G7 aumento la letalidad (con P05/079-AEC relación al PBS) a todas las concentraciones. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 2. A través de esta especificación y reivindicaciones, la palabra "comprenden" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" se entenderá que implican la inclusión de un entero o grupo de enteros establecidos, pero no la exclusión de algún otro entero o grupos de enteros . Todas las publicaciones y solicitudes de patente citadas en la especificación se incorporan aquí como referencia como si cada publicación o solicitud de patente individual se indicara de manera específica e individual como incorporada como referencia. Aunque la invención anterior se ha descrito con algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad del entendimiento, será fácilmente evidente para aquellos con experiencia ordinaria en la técnica en la técnica, a la luz de las enseñanzas de esta invención, que ciertos cambios y modificaciones pueden hacerse a la misma, sin apartarse del espíritu y alcance de las reivindicaciones anexas.

P05/079-AEC

Claims

REIVINDICACIONES ¡

1. Un anticuerpo monoclonal o una porción que se une al antígeno del mismo, que se une específicamente al glucuronoxilomanano del polisacárido capsular (GXM) de Cryptococcus neoformans, en donde el anticuerpo o porción comprende : (a) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada, que utiliza un gen VH 3-64 humano o un gen VH-6-l humano ; (b) una secuencia de aminoácidos de cadena ligera, que utiliza un gen V? A27 humano; o (c) ambos de (a) y (b) .

2. El anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos CDRl, CDR2 y CDR3 , seleccionadas del grupo que consiste de: (a) las secuencias de aminoácidos CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 43; (b) las secuencias de aminoácidos CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 47; (c) las secuencias de aminoácidos CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO : 51; (d) las secuencias de aminoácidos CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 1 ; (e) las secuencias de aminoácidos CDRl, CDR2 y P05/079-AEC CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 5; (f) las secuencias de aminoácidos CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 9; (g) la secuencia de aminoácidos CDR de cadena pesada de (a) , y la secuencia de aminoácidos de CDR de cadena ligera de (d) ; (h) la secuencia de aminoácidos CDR de cadena pesada de (b) , y la secuencia de aminoácidos de CDR de cadena ligera de (e) ; y (i) la secuencia de aminoácidos CDR de cadena pesada de (c) , y la secuencia de aminoácidos de CDR de cadena ligera de (f) .

3. El anticuerpo monoclonal o una porción que se une al antígeno según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o porción comprende las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos VH encontrada en la SEQ ID NO: 43; (b) la secuencia de aminoácidos VH encontrada en la SEQ ID NO: 47; (c) la secuencia de aminoácidos VH encontrada en la SEQ ID NO: 51; (d) la secuencia de aminoácidos VL encontrada en la SEQ ID NO: 1; (e) la secuencia de aminoácidos VL encontrada en P05/079-A?C la SEQ ID NO: 5; (f) la secuencia de aminoácidos VL encontrada en la SEQ ID NO: 9; (g) la secuencia de aminoácidos VH encontrada en la SEQ ID NO: 43 y la secuencia de aminoácidos VL encontrada en la SEQ ID NO: 1; (h) la secuencia de aminoácidos VH encontrada en la SEQ ID NO: 47 y la secuencia de aminoácidos VL encontrada en la SEQ ID NO: 5; y (i) la secuencia de aminoácidos VH encontrada en la SEQ ID NO: 51 y la secuencia de aminoácidos VL encontrada en la SEQ ID NO : 9.

4. El anticuerpo monoclonal o una porción que se une al antígeno según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o porción comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos de cadena pesada encontrada en la SEQ ID NO: 43 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera encontrada en la SEQ ID NO: 1; (b) la secuencia de aminoácidos de cadena pesada encontrada en la SEQ ID NO: 47 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera encontrada en la SEQ ID NO: 5; y (c) la secuencia de aminoácidos de cadena pesada encontrada en la SEQ ID NO: 51 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera encontrada en la SEQ ID NO: 9. P05/079-AEC

5. Una molécula de ácido nucleico que codifica al anticuerpo o la porción que se une al antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Una línea celular seleccionada del grupo que consiste de G14F7E5 (No. de Acceso ATCC PTA-5170) , G15B4G5 (No. de Acceso ATCC PTA-5171) o G19B9G7 (No. de Acceso ATCC PTA-5172) .

7. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5, unida de manera operable a una secuencia de control de la expresión.

8. Una célula hospedera transformada con una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7.

9. Un método para producir un anticuerpo o un fragmento que se une al antígeno del mismo, que se une específicamente al GXM de C. neoformans, que comprende el paso de cultivar una célula hospedera según la reivindicación 8.

10. Una composición que comprende el anticuerpo o el fragmento que se une al antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, y un portador farmacéuticamente aceptable .

11. La composición según la reivindicación 10, que comprende además un componente seleccionado del grupo que consiste de: P05/079-AEC (a) un agente de diagnóstico; y (b) un agente terapéutico.

12. Un equipo que comprende el anticuerpo o el fragmento que se une al antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

13. Un método para prevenir o reducir la severidad de las condiciones o trastornos causados por la infección con C. neoformans en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende el paso de administrar una cantidad efectiva del anticuerpo o del fragmento que se une al antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11.

14. Un método para incrementar la resistencia de un sujeto en necesidad del mismo para una infección con C. neoformans o para las condiciones o trastornos causados por tal infección, que comprende el paso de administrar un anticuerpo o un fragmento que se une al antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11.

15. El método según la reivindicación 13 ó 14, en donde el sujeto está: (a) inmunocomprometido; (b) infectado con VIH-1; o (c) carece de uno o más genes de la familia VH3 humana . P05/079-AEC

16. El método según cualquiera de las reivindicaciones 13-17, en donde el anticuerpo de GXM de anti-C. neoformans o el fragmento que se une al antígeno del mismo se administra en conjunto con la administración de otro agente terapéutico.

17. Un método para detectar una infección por C. neoformans, que comprende poner en contacto una muestra de un sujeto que se sospecha está infectado con un anticuerpo o un fragmento que se une al antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y detectar la unión del anticuerpo o fragmento al GXM de C. neoformans .

18. El anticuerpo o porción que se une al antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que se deriva de un animal transgénico no humano.

19. El anticuerpo o porción que se une al antígeno según la reivindicación 18, en donde el animal © transgenico no humano es un animal XenoMouse . P05/079-AEC