CN107406504A - Ctla‑4抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

公开了可特异性结合于人CTLA‑4的人抗体，以及相关的基于抗体的组合物和分子。还公开了药物组合物，所述药物组合物包括所述人抗体，以及使用所述人抗体的治疗和诊断方法。

Description

CTLA-4抗体及其用途
背景技术
本文使用的部分标题仅用于组织目的，不应限制所描述的主题。
T细胞活化取决于通过抗原呈递细胞(APC)将肽抗原呈递给抗原受体复合物(TCR)、从而与共受体一起产生额外信号(Bretscher(1970)科学169:1042-1049)(Bretscher(1970)Science 169:1042-1049)。单独的TCR复合物的连接通常不足以诱导T细胞应答，并且在许多情况下导致无反应性或T细胞无效能(Lafferty(1974)自然249:275-276；Jenkins等(1987)J Exp Med 165:302-319(Lafferty(1974)Nature 249:275-276；Jenkins et.al.(1987)J Exp Med 165:302-319))。大多数初始T细胞没有额外的共信号无法应答MHC肽。这突出了具有呈递的配体，如CD80(也称为B7-1)和CD86(也称为B7-2)的抗原呈递细胞(APC)在T细胞活化中的重要性。树突细胞(DCs)、巨噬细胞和B细胞表达基质细胞和上皮细胞上所缺乏的共受体配体。在呈递细胞中，DC表达的CD80/86水平最高。抗原呈递是通路依赖的，不同的配体在外周免疫系统的微环境中表达。
共刺激是T细胞中蛋白质合成、代谢、细胞周期进程、凋亡和分化的有效调节剂。相反，抑制性共刺激可以预防免疫反应的发作或下调免疫反应(Rudd(2003)Nat Rev Immunol3：544-556；Rudd(2008)Nat Rev Immunol 8：153-160)。
所建立的共刺激对中最佳的是CD28及其结合伴侣CD80和CD86。CD28在初始和活化的CD4和CD8阳性T细胞上组成型表达(Lee等(1990)J Immunol 145：344-352；Gross等(1990)J Immunol 144：3201-3210)(Lee et al.(1990)J Immunol 145:344-352；Gross etal.(1990)J Immunol 144:3201-3210)，而CD80和CD86通过活化在DC上进行诱导(Freeman等(1993)J Exp Med 178：2185-2192；Freeman 等(1993)科学262：909-911；Hathcock等(1994)J Exp Med 180：631-640)(Freeman et al.(1993)J Exp Med 178:2185-2192；Freeman et al.(1993)Science 262:909-911；Hathcock et al.(1994)J Exp Med 180:631-640)。CD28在20世纪80年代首次被鉴定为增强TCR诱导性增殖并促进初始CD4+T细胞分化的共受体(Gmunder等(1984)Eur J Biochem 142：153-160；Lesslauer等(1986)Eur JImmunol 16：1289-1296)(Gmunder et al.(1984)Eur J Biochem 142:153-160；Lesslaueret al.(1986)Eur J Immunol 16:1289-1296)。它编码一个44kDa的I型跨膜糖蛋白，其由位于跨膜区域的并列半胱氨酸之间的二硫键形成同源二聚体(Aruffo等(1987)Proc NatlAcad Sci USA 84：8573-8577)(Aruffo et al.(1987)Proc Natl Acad Sci USA 84:8573-8577)。
随着CD28缺陷(即Cd28-/-)小鼠的产生(Shahinian等(1993)科学261：609-612)(Shahinian et al.(1993)Science 261:609-612)，CD28的体内相关性变得明显。这些小鼠免疫受损，显示出T细胞对抗原反应的降低，形成了有缺陷的生发中心和分化T细胞。抗CD3的反应减少了60-70％。CD28还优先促进TH2的分化(Rulifson等(1997)J Immunol 158：658-665)(Rulifson et al.(1997)J Immunol 158:658-665)，为具有形成生发中心和同种型转换能力的B细胞提供帮助(Ferguson等(1996)J Immunol 156：4576-4581)(Fergusonet al.(1996)J Immunol 156:4576-4581)。此外，由于抗凋亡蛋白(如Bcl-2和Bcl-XL)表达的增加，共受体通过调节细胞周期进程并减少细胞死亡或细胞凋亡来预防无反应性(Mueller等(1996)J Immunol 156：1764-1771)(Mueller et al.(1996)J Immunol 156:1764-1771)。由于辅助T细胞受损，CD8T细胞对病毒感染的细胞溶解反应也降低(Kundig等(1996)Immunity 5：41-52)(Kundig et al.(1996)Immunity 5:41-52)。
细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(“CTLA-4”)，其为一种CD28同源物，在活化的CD4+和CD8+ T细胞的表面上表达。如同CD28，CTLA-4也与CD80和CD86结合(Walunas等(1996)J.Exp.Med.183：2541-2550)(Walunas et al.(1996)J.Exp.Med.183:2541-2550)。CTLA-4在T细胞活化后被上调，并作为免疫检查点起作用，下调T细胞的活化和免疫活性。(Grosso等(2013)Cancer Immun.13：1-14)(Grosso et al.(2013)Cancer Immun.13:1-14)。
CTLA4相对较高的结合亲和力使其成为降低免疫活性的激动剂，用于潜在治疗自身免疫疾病。它在对HIV感染的免疫细胞以及PD-1通路和其他通路的初始免疫反应中起作用。已经将CTLA4与IgG分子的Fc区(CTLA4-Ig)的融合蛋白用于类风湿性关节炎的临床试验。CTLA4-Ig融合蛋白为市售的(阿巴西普，abatacept)。基于来自随机III期受益(贝拉西普作为一线免疫抑制评估肾保护和功效)研究的有利结果，美国食品和药物管理局最近也批准了称为贝拉西普的第二代形式的CTLA4-Ig。它在美国被批准用于对EBV敏感或Ebstein Barr病毒患者的肾移植。
相反，阻断CTLA-4(例如，用抗CTLA的抗体，如易普利姆玛)可能是一种抑制肿瘤的免疫系统耐受性的手段，从而为癌症患者提供一种潜在有效的免疫治疗策略(Grosso JF.和Jure-Kunkel MN.(2013)Cancer Immunity 13：5)(Grosso JF.and Jure-Kunkel MN.(2013)Cancer Immunity 13:5)。易普利姆玛目前在美国被用于治疗无法切除或转移性黑素瘤。已经显示，治疗性的人类单克隆抗体与CTLA-4结合并阻断其与B7配体的相互作用，可用于增强T细胞的活化和增殖(Grosso等(2013)Cancer Immu.Rev.13(5)：1-14)(Grosso et al.(2013)Cancer Immu.Rev.13(5):1-14)。
发明概述
本发明公开了涉及以高亲和力特异性结合CTLA-4并调节CTLA-4对某些疾病的作用的抗体。
本文提供了特异性结合人CTLA-4的抗体(例如人抗、鼠抗、嵌合抗体、人源化抗体)。在某些实施方式中，本文所述的抗体可包括重链为例如IgG或IgM的抗体。IgG抗体重链可以选自下组，例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在某些实施方式中，本文提供的抗体可包括选自下组的抗体轻链，例如，κ轻链和λ轻链。在某些实施方式中，本文所述的人IgG重链的可变区可由包含选自下组的核苷酸序列的核酸编码，例如SEQ ID NOs：7、9和11。在某些实施方式中，人κ轻链的可变区可由包含选自下组的核苷酸序列的核酸编码，例如SEQ ID NO：1。在某些实施方式中，人λ轻链的可变区可由包含选自下组的核苷酸序列的核酸编码，例如SEQ ID NOs：3和5。
虽然下文所述的一些实施方式中的抗体是人抗体，但是本文还公开并提供了具有相同CDR和非人框架的抗体、嵌合抗体和人源化抗体。
在一些实施方式中，本文所述的人抗体可包括：由包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的核酸编码的人IgG重链的可变区，以及由包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的核酸编码的人κ轻链的可变区。
在一些实施方式中，所述人抗体可包括：由包含SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的核酸编码的人IgG重链的可变区，以及由包含SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的核酸编码的人λ轻链的可变区。
在一些实施方式中，所述人抗体可包括：由包含SEQ ID NO：11所示核苷酸序列的核酸编码的人IgG重链的可变区，以及由包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的核酸编码的人λ轻链的可变区。
在一些实施方式中，所述人抗体可包括：由包含SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的核酸编码的重链可变区，以及由包含SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的核酸编码的轻链可变区。
在一些实施方式中，所述人抗体可包括：由包含SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的核酸编码的重链可变区，以及由包含SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的核酸编码的轻链可变区。
在一些实施方式中，所述人抗体可包括：由包含SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的核酸编码的重链可变区，以及由包含SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的核酸编码的轻链可变区。
在一些实施方式中，所述人抗体可包括：由包含SEQ ID NO：72所示V基因片段VH3-33序列的核酸编码的人IgG重链可变区，以及由包含SEQ ID NO：13所示V基因片段KV 3-20序列的核酸编码的人κ轻链可变区(图15)。
在一些实施方式中，所述人抗体可包括：由包含SEQ ID NO：14所示V基因片段VH1-46序列的核酸编码的人IgG重链可变区，以及由包含SEQ ID NO：15所示V基因片段LV 2-23序列的核酸编码的人λ轻链可变区(图15)。
在一些实施方式中，所述人抗体可包括：由包含SEQ ID NO：16所示V基因片段VH1-69序列的核酸编码的人IgG重链可变区，以及由包含SEQ ID NO：17所示V基因片段LV 2-14序列的核酸编码的人λ轻链可变区(图15)。
在一些实施方式中，所述抗体可分别包括重链CDR1、CDR2和CDR3序列、SYGMH(SEQID NO：34)、VIWYDGSRQYYADS(SEQ ID NO：35)和GGFWGAFDI(SEQ ID NO：36)，以及轻链CDR1、CDR2和CDR3序列、RASQHVISSYLA(SEQ ID NO：25)、GASSRDT(SEQ ID NO：26)和QQYGTSPWTF(SEQ ID NO：27)。在一些实施方式中，所述抗体是人抗体。在一些实施方式中，所述抗体是鼠抗、嵌合抗体或人源化抗体。
在一些实施方式中，所述抗体可分别包括重链CDR1、CDR2和CDR3序列、NYYMH(SEQID NO：37)、IISPTGGSRTYAQK(SEQ ID NO：38)和EMYNWNGGWDYGMDV(SEQ ID NO：39)，以及轻链CDR1、CDR2和CDR3序列、VGTNSDVEAYDLVS(SEQ ID NO：28)、DNYKRPS(SEQ ID NO：29)和CSYAGFSTWIF(SEQ ID NO：30)。在一些实施方式中，所述抗体是人抗体。在一些实施方式中，所述抗体是鼠抗、嵌合抗体或人源化抗体。
在一些实施方式中，所述抗体可分别包括重链CDR1、CDR2和CDR3序列、SYAIS(SEQID NO：40)、GIIPIFGTANYAQK(SEQ ID NO：41)和DTAMALFYYYGMDV(SEQ ID NO：42)，以及轻链CDR1、CDR2和CDR3序列、TGTSSDVGGYNYVS(SEQ ID NO：31)、EVSNRPS(SEQ ID NO：32)和SSYRSSGTPYVF(SEQ ID NO：33)。在一些实施方式中，所述抗体是人抗体。在一些实施方式中，所述抗体是鼠抗、嵌合抗体或人源化抗体。
在一些实施方式中，所述抗体的scFv可包括重链可变区，其包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗体的scFv可包括重链可变区，其包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗体的scFv可包括重链可变区，其包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
本文还提供了包含人抗体重链转基因和人抗体轻链转基因的细胞系，其中所述细胞系产生可特异性结合于人CTLA-4的人抗体。在一些实施方式中，所述细胞系可以是CHO细胞系。在某些实施方式中，所述细胞系可分泌特异性结合人CTLA-4的人抗体。在一些实施方式中，由细胞系产生的抗体可包括：
分别为重链CDR1、CDR2和CDR3序列SYGMH(SEQ ID NO：34)、VIWYDGSRQYYADS(SEQID NO：35)和GGFWGAFDI(SEQ ID NO：36)，以及轻链CDR1、CDR2和CDR3序列RASQHVISSYLA(SEQ ID NO：25)、GASSRDT(SEQ ID NO：26)和QQYGTSPWTF(SEQ ID NO：27)；或
包含SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的轻链可变区；或
分别为重链CDR1、CDR2和CDR3序列NYYMH(SEQ ID NO：37)、IISPTGGSRTYAQK(SEQID NO：38)和EMYNWNGGWDYGMDV(SEQ ID NO：39)，以及轻链CDR1、CDR2和CDR3序列VGTNSDVEAYDLVS(SEQ ID NO：28)、DNYKRPS(SEQ ID NO：29)和CSYAGFSTWIF(SEQ ID NO：30)；或
包含SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的轻链可变区；或
分别为重链CDR1、CDR2和CDR3序列SYAIS(SEQ ID NO：40)、GIIPIFGTANYAQK(SEQID NO：41)和DTAMALFYYYYGMDV(SEQ ID NO：42)，以及轻链CDR1、CDR2和CDR3序列TGTSSDVGGYNYVS(SEQ ID NO：31)、EVSNRPS(SEQ ID NO：32)和SSYRSSGTPYVF(SEQ ID NO：33)；或
包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方式中，上述的人抗体可由转基因非人动物产生。所述转基因非人动物可以是，例如，小鼠。
根据下述的“抗体”和“抗原结合部分”的定义，上述的人抗体可以是任何全抗体分子或任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或其单链，骆驼抗体包括，例如，纳米抗体，噬菌体展示结合构建体。例如，在一些实施方式中，所述人抗体可以是Fab片段；F(ab)2片段；具有V H和CH 1结构域的Fd片段；具有抗体链的单个氨基酸序列的VL和VH结构域的Fv片段；dAb片段(Ward等，1989Nature 341：544-546)(Ward et al.,1989Nature 341:544-546)，其具有VH结构域；或单独的互补决定区(CDR)或单链Fv(scFv)。在一些实施方式中，所述人抗体可以与另一个原子或分子缀合。如上所述的人抗体可包括包含至少两种人抗体的部分复合物，其各自特异性地结合于人CTLA-4。在一些实施方式中，所述复合物可以是多价的。所述至少两种抗体可以彼此共价或非共价连接。在一些实施方式中，本文所述的人抗体还可以包括部分免疫缀合物或双特异性抗体。
在一些实施方式中，本文所述的人抗体可以阻断或拮抗由人CTLA-4转导的信号。这些抗体中的一些可以结合人CTLA-4上的表位，以便抑制CTLA-4与人B7反受体相互作用。
本发明还提供了包含编码本文所述人抗体氨基酸序列的核苷酸序列的核酸。本文还提供了包含选自SEQ ID NO：7、9和11的核苷酸序列的核酸，其编码抗体重链的氨基酸序列。本文还提供了包含选自SEQ ID NO：1、3和5的轻链核苷酸序列的核酸，其编码抗体轻链的氨基酸序列。
本发明还提供了包含本文所述的人抗体的药物组合物，和药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述药物组合物还可包含一种或多种额外的治疗剂。在一些实施方式中，所述额外的治疗剂或试剂有效诱导针对肿瘤的免疫应答。在一些实施方式中，所述额外的治疗剂或试剂是化学治疗剂。同样在一些实施方式中，所述额外的治疗剂或试剂是作为免疫检查点抑制剂的抗体，包括但并不限于，针对PD-1、PD-1 L1或PD-1 L2的抗体。
本文还提供了一种治疗受试者CTLA-4相关疾病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的药物组合物。在一些实施方式中，所述方法还包括向所述受试者施用一种或多种额外的治疗剂。在一些实施方式中，所述额外的治疗剂或试剂有效诱导针对肿瘤的免疫应答。在一些实施方式中，所述额外的治疗剂或试剂是化学治疗剂。同样在一些实施方式中，所述额外的治疗剂或试剂是作为免疫检查点抑制剂的抗体，包括但并不限于，针对PD-1、PD-1 L1或PD-1 L2的抗体。此外，在一些实施方式中，所述额外的治疗剂是疫苗，包括但并不限于，GM-CSF修饰的肿瘤细胞疫苗或负载了抗原的树突细胞疫苗。在一些实施方式中，所述CTLA-4相关疾病是T细胞介导的自身免疫疾病。在一些实施方式中，所述CTLA-4相关疾病可以是癌症。此外，在一些实施方式中，所述CTLA-4相关疾病可以选自黑素瘤、非小细胞肺癌和前列腺癌。
本发明还提供了一种使用本发明抗体的体外或体内检测样品中是否存在人CTLA-4抗原的方法，用于诊断CTLA-4相关疾病。在一些实施方式中，所述CTLA-4相关疾病是T细胞介导的自身免疫疾病。在一些实施方式中，所述CTLA-4相关疾病可以是癌症。此外，在一些实施方式中，所述CTLA-4相关疾病可以选自黑素瘤、非小细胞肺癌和前列腺癌。
本发明还提供了一种使用抗体抑制(即拮抗)CTLA-4结合配体或活化细胞的能力的方法。在一些实施方式中，所述方法可以抑制CTLA-4向细胞传递信号或模拟(即激动)所述配体作用的能力。在一些实施方式中，所述方法可包括将本文所述的抗体与表达CTLA-4肽的细胞接触。
本发明还提供了一种使用本发明所述抗体来制备用于治疗CTLA-4相关疾病的药物。在一些实施方式中，所述CTLA-4相关疾病是T细胞介导的自身免疫疾病。在一些实施方式中，所述CTLA-4相关疾病可以是癌症。此外，在一些实施方式中，所述CTLA-4相关疾病可以选自黑素瘤、非小细胞肺癌和前列腺癌。
本发明还提供了诱导、增强或延长对患者抗原的免疫应答的方法，包括施用治疗有效量的本文所述的药物组合物，其中所述药物组合物阻断人CTLA-4与人B7配体结合。在一些实施方式中，所述抗原是肿瘤抗原或来自病原体的抗原。在一些实施方式中，所述抗原是乙型肝炎表面抗原。
附图的简要说明
图1显示了scFv噬菌体与重组人CTLA-4(rhCTLA-4)蛋白的结合。
图2A显示了来自克隆C2、C4、C10、C11、C12和C13的重链可变区的核苷酸序列的比对。
图2B显示了来自克隆C2、C4、C10、C11、C12和C13的轻链可变区的核苷酸序列的比对。
图3A显示了来自克隆C6、C7和C15的重链可变区的核苷酸序列的比对。
图3B显示了来自克隆C6、C7和C15的轻链可变区的核苷酸序列的比对。
图4A-4C显示了抗人CTLA-4抗体的重链可变区(VH)的核苷酸序列与其种系序列之间的序列比对。具体地，图4A显示了来源于VH3-33种系序列(SEQ ID NO：72)的抗CTLA-4抗体C2(SEQ ID NO：7)。图4B显示了来源于VH1-46种系序列(SEQ ID NO：14)的抗CTLA-4抗体C5(SEQ ID NO：9)。图4C显示了来源于VH1-69种系序列(SEQ ID NO：16)的抗CTLA-4抗体C15(SEQ ID NO：11)。图4A-4C还指示了带标记的互补决定残基(CDR1、CDR2和CDR3)的位置。虚线表示序列同一性。
图5A-5C显示了抗人CTLA-4抗体的轻链可变区(VL)的核苷酸序列之间的序列比对。具体地，图5A显示了来源于VL3-20种系序列(SEQ ID NO：13)的抗CTLA-4抗体C2(SEQ IDNO：1)。图5B显示了来源于VL2-23种系序列(SEQ ID NO：15)的抗CTLA-4抗体C5(SEQ ID NO：3)。图5C显示了来源于VL2-14种系序列(SEQ ID NO：17)的抗CTLA-4抗体C15(SEQ ID NO：5)。在图5A-5C中标记出CDR1、CDR2和CDR3的位置。虚线表示序列同一性。
图6显示了图6中描述的抗人CTLA-4抗体的重链可变区(VH)的预测氨基酸序列与种系氨基酸序列之间的序列比对。来源于VH3-33种系(SEQ ID NO：18)的抗CTLA-4抗体C2(SEQ ID NO：8)显示在图的顶部。来源于VH1-46种系序列(SEQ ID NO：20)的抗CTLA-4抗体C5(SEQ ID NO：10)显示在图的中间，以及来源于VH1-69种系序列(SEQ ID NO：22)的抗CTLA-4抗体C15(SEQ ID NO：12)显示在图的底部。
图7显示了抗人CTLA-4抗体的轻链可变区(VL)的预测氨基酸序列和种系氨基酸序列之间的序列比对。来源于VL3-20种系序列(SEQ ID NO：19)的抗CTLA-4抗体C2(SEQ IDNO：2)显示在图的顶部。衍生自VL2-23种系序列(SEQ ID NO：21)的抗CTLA-4抗体C5(SEQ IDNO：4)显示在图的中间，以及衍生自VL2-14种系序列(SEQ ID NO：23)的抗CTLA-4抗体C15(SEQ ID NO：6)显示在图的底部。
图8A和8B显示了克隆C2重链和轻链可变区的全长核苷酸序列(分别为SEQ ID NO：60和62)和氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：61和63)。具体地，图8A显示了克隆2重链可变区的全长核苷酸序列(SEQ ID NO：60)和全长氨基酸序列(SEQ ID NO：61)。图8B显示了克隆2轻链可变区的全长核苷酸序列(SEQ ID NO：62)和全长氨基酸序列(SEQ ID NO：63)。下划线是信号肽序列。
图9A和9B显示了克隆C5重链和轻链可变区的全长核苷酸序列(分别为SEQ ID NO：64和66)和氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：65和67)。具体地，图9A显示克隆5重链可变区的全长核苷酸序列(SEQ ID NO：64)和全长氨基酸序列(SEQ ID NO：65)。图9B显示了克隆5轻链可变区的全长核苷酸序列(SEQ ID NO：66)和全长氨基酸序列(SEQ ID NO：67)。下划线是信号肽序列。
图10A和10B显示克隆C15重链和轻链可变区的全长核苷酸序列(分别为SEQ IDNO：68和70)和氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：69和71)。具体地，图10A显示了克隆15重链可变区的全长核苷酸序列(SEQ ID NO：68)和全长氨基酸序列(SEQ ID NO：69)。图10B显示克隆15轻链可变区的全长核苷酸序列(SEQ ID NO：70)和全长氨基酸序列(SEQ ID NO：71)。下划线是信号肽序列。
图11A显示了C2mAb与rhCTLA-4的体外结合。
图11B显示了C5 mAb与rhCTLA-4的体外结合。
图12显示了B7-1和C2 mAb与rhCTLA-4的竞争性结合。
图13A和13B显示通过C2mAb增加PBMC IL-2的产量。特别地，图13A显示当用不同浓度的PHA刺激PBMC时，C2mAb增加了PBMC IL-2的产量。图13B显示当PBMC由1μg/ml PHA刺激时，C2mAb诱导增加了PBMC IL-2的产量。
图14A显示由C2mAb诱导的食蟹猴中，抗HBsAg抗体的血浆效价的提高。
图14B显示了在给药C2mAb的两组四只猴子中，抗HBsAg抗体量的增加。
图15显示了了本发明某些实施方式所述的人种系V基因区段的核苷酸序列。
具体实施方式
本发明提供了基于抗体治疗和诊断疾病的新疗法，所述疾病以人类CTLA-4和/或相关分子的表达(特别是过表达)或活化(特别是过度活化)为特征。本文所述的疗法使用特异性结合于人CTLA-4的人抗体，尤其是人单克隆抗体。在某些实施方式中，本文所述的抗体可衍生自特定的重链和轻链序列，和/或包含特定的结构特征，例如包含特定氨基酸序列的CDR区。本发明还提供分离的抗体、制备此类抗体的方法、检测此类抗体的方法、包含此类抗体的免疫缀合物和双特异性分子，以及包含该抗体的药物组合物。本发明还涉及使用所述抗体抑制(即拮抗)CTLA-4结合配体或活化细胞的能力的方法，例如抑制将信号传递到细胞或刺激(即激活)配体作用的能力。
为了更容易地理解本发明的内容，首先定义某些术语。这些定义应根据本发明的其余部分进行阅读，并且如本领域普通技术人员所理解的。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。在整个详细描述中还阐述了额外的定义。
除非明确指出相反的情况，否则如本文所用，词“一”和“一个”应理解为“至少一个”。
如本文所用，短语“和/或”应当被理解为是指所连接的元素中的“一个或两个”，即在某些情况下结合存在的元素和在其它情况下分离存在的元素。除了明确指出相反的情况，其他元素可任选地存在于除了“和/或”字句特别标识的元素之外，而无论与特定识别的那些元素相关或不相关。因此，作为非限制性的例子，当与例如“包括”的开放式语言结合使用时，在一个实施方式中引用“A和/或B”可指不含B的A(任选地包括除了B以外的元素)；在另一个实施方式中指不含A的B(任选地包括除A以外的元素)；在另一个实施方式中指A和B两者(任选地包括其它元素)。
如本文所用，“或”应被理解为与如上定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为包容性的，即，包括数量或元素列表中的至少一个，但也包括多于一个，以及任选地，额外的未列出的项目。只有明确指出相反的术语下，例如“只有一个”或“的确一个”，或者在权利要求中使用“由...组成”时，将指的是仅列出的一个数字或列表的一个元素。
一般来说，如本文所用，术语“或”仅在作为排他性条款之前被解释为表示排他性的替代品(即“一个或另一个但不是两者”)，例如“任一”，“其中一个”，“只有一个”或“正好是其中之一”。
如本文所用，关于一个或多个元素列表的短语“至少一个”应理解为表示选自元素列表的任何一个或多个元素中的至少一个元素，但不必然包括在元素列表中具体列出的每个元素的至少一个，并且不排除元素列表中元素之间的任何组合。该定义还允许除了在短语“至少一个”所指的元素列表中具体识别的元素之外，可以任选地存在这些元素，无论与特定识别的元素相关或不相关。
因此，作为非限制性的例子，“A和B中的至少一个”(或等同地，“A或B中的至少一个”、或等同地，“A和/或B中的至少一个”)可以在一个实施方式中指至少一个，任选地包括多于一个的没有B存在的A(且任选地包括除B之外的元素)；在另一个实施方式中，可指至少一个，任选地包括多于一个的没有A存在的B(并且任选地包括除A之外的元素)；在另一个实施方式中，可指至少一个，任选地包括多于一个的A和至少一个A，任选地包括多于一个的B(并且任选地包括其它元素)；等等。
如本文所用，所有过渡词语，例如，“包括”、“包含”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”等，应被理解为开放式的，即，意味着包括但不限于。
只有“由……组成”和“基本上由……组成”的过渡性短语分别是专利法领域中使用的封闭或半封闭的过渡性短语。
术语“表位”是指能够特异性结合抗体的蛋白质决定区。表位可以包括分子的化学活性表面组，例如氨基酸或糖侧链，并且可以具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在下，与前者结合力的丧失而不是与后者结合力的丧失。
术语“抗原”是指能够被选择性结合剂(例如抗原结合蛋白(包括，例如，抗体或其免疫功能片段))特异性结合的分子(例如CTLA-4)或分子的一部分，和/或能够用于动物以产生能够结合该分子或其部分的抗体。抗原可以具有能够与不同抗原结合蛋白(例如抗体)相互作用的一个或多个表位。
术语“抗体”包括具有免疫球蛋白样抗原结合功能的任何部分。该术语包括全抗体分子、单链抗体、新型骆驼抗体，包括例如纳米抗体、噬菌体展示结合构建体以及双特异性抗体、抗体缀合物、嵌合抗体等。天然存在的抗体是糖蛋白，其包含通过二硫键相互连接的至少两个重(H)链和两个轻链(L)链。每个重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。所述重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。轻链有两种类型：λ和κ。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区域可以进一步细分为高变区域，称为互补决定区(CDR)，散布在更保守的区域，称为框架区(FR)。如在自然界中发现的，每个VH和VL由以下顺序由氨基末端至羧基末端排列的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。抗体可以是单克隆或多克隆的。在一些实施方式中，所述抗体是人抗体。在一些实施方式中，所述抗体是非人(例如小鼠)、嵌合或人源化的。
在本文中，术语“抗原结合片段”、“抗原结合部分”和“抗原部分”可互换使用，指抗体的一个或多个片段，其具有特异结合抗原(例如，CTLA-4部分)的能力。已经显示，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体分子的片段进行。抗原结合部分的例子包括Fab片段，其是单价片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成；F(ab)2片段，其是二价片段，包括在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段；Fd片段，其具有VH和CH1结构域；Fv片段，其具有抗体链的单个氨基酸序列的VL和VH结构域；dAb片段(Ward等，1989，自然，341：544-546),其具有VH结构域；和分离的互补决定区(CDR)。
抗原结合部分可以是分离的片段，或者可以与一个或多个其它原子或分子缀合，例如化学或生物学部分，或连接到非传统免疫球蛋白衍生的框架或骨架的片段，包括但不限于，例如，锚蛋白、纤连蛋白、结构域抗体、脂质运载蛋白、小模块免疫药物、maxybodies、纳米抗体、蛋白A、affilin、γ-晶状蛋白和泛素，以及本领域技术人员已知的其它预期的骨架。
此外，虽然在天然存在的抗体分子中存在两个具有Fv结构域的链，VL和VH，其由单独的基因编码，但是它们可以通过合成接头使用重组方法连接，使得它们能够被重组表达为单一的蛋白质链，其中VL和VH区域形成一个单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人，1988科学242：423-426；和Huston等，1988Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。这样的单链抗体也包含在术语“抗体”中。这些单链抗体可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且可以以与完整抗体相同的方式进行筛选。
“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，与针对CTLA-4的一组氨基酸决定簇特异性结合的分离的抗体基本不含与CTLA-4以外的抗原大致特异性结合的抗体)。然而，特异性结合CTLA-4蛋白(比如，人CTLA-4)的分离的抗体可能与其他抗原(比如，来自其他物种CTLA-4分子)或与人CTLA-4氨基酸序列具有高同源性的蛋白具有交叉反应性。此外，分离的抗体可基本上不含其它细胞材料和/或化学物质。
术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指所制备的抗体分子，它们都具有单一的分子组成。因此，单克隆抗体组合物显示了对特定表位单一结合的特异性和亲和力。
如本文所用，术语“多克隆抗体”是指具有异种抗体群体的抗体组合物。多克隆抗体通常来源于来自免疫动物或选定人群的混合血清。
如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中至少一个、通常框架区和CDR区都衍生自人源的序列。此外，如果抗体含有恒定区，所述恒定区也衍生自这样的人序列，例如，人种系序列或人种系序列的突变形式。本发明所述的人抗体可包括未被人序列编码的氨基酸残基(例如，突变，比如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的替换)。
术语“人单克隆抗体”是指人抗体，其也是一种“单克隆抗体”。在一些实施方式中，所述人单克隆抗体由杂交瘤细胞产生，其包括获自转基因非人动物(例如，转基因小鼠)的B细胞，其具有一基因组，所述基因组含有通常为人源的重链转基因，以及通常为人源的轻链转基因，所述基因组通常与人源的永生化细胞融合。
如本文所用，术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的人抗体。它包括分离自动物(例如，小鼠)或由其制备的杂交瘤细胞的抗体，所述动物为用于人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体的动物；分离自经转化表达人抗体的宿主细胞的抗体，例如，分离自转染瘤；分离自重组的组合人抗体文库的抗体；以及用其他方法制备、表达、产生或分离的抗体，所述方法涉及将一个或多个的人免疫球蛋白基因序列的全部或一部分剪接到其它的DNA序列中。这种重组的人抗体具有可变区，其中所述框架区和CDR区均衍生自人种系免疫球蛋白序列。然而在某些实施方式中，这种重组的人抗体序列可通过体外诱变发生改变，或当使用人Ig序列转基因动物时，通过体内体细胞诱变，由此使得当重组人抗体的VH和VL区的氨基酸序列是衍生自并且与人种系VH和VL序列相关的序列时，其可能与体内天然存在于人类抗体种系库中的那些不同。
在本文中，术语“识别抗原的抗体”和“特异性识别抗原的抗体”可与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
在一些实施方式中，本文所述的结合人CTLA-4的人抗体可以阻断或拮抗由人CTLA-4转导的信号。这些抗体中的一些可以结合于人CTLA-4上的表位，以便抑制CTLA-4与人B7反受体的相互作用。由于人CTLA-4与人B7的相互作用会传导信号，从而导致携带人CTLA-4受体的T细胞失活，拮抗其相互作用可有效诱导、增强或延长携带人CTLA-4的T细胞的活性，从而延长或增强免疫应答。“阻断抗体”是指这样一种抗体，它可将可溶性人CTLA-4与细胞表达的人B7配体的结合降低至少10％，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或99.9％，或以任何上述百分比开始和结束的任何范围，其中在下述条件下进行：抗体结合位点与人CTLA-4配体结合位点的比例大于1：1，并且抗体浓度大于10nM。
如本文所用，“特异性结合于人CTLA-4”的抗体是指这样一种抗体，它以1×10-7M或其以下(例如1×10-8M或其以下，1×10-9M或其以下)的KD值与人CTLA-4的抗体结合。如本文所用，术语“交叉反应”是指这样一种情况，其中抗体或抗体组不仅可检测地结合于其预期的抗原，而且还可结合于其它抗原上的表位。这可以由抗体的低亲合力或特异性或具有相同或非常相似表位的多种不同抗原引起。如果抗原表位序列在进化中不是高度保守的，当通常希望与相关的抗原组结合时，或者当尝试跨物种标记时，有时交叉反应是需要的。
术语“核酸分子”是指包括例如DNA分子和RNA分子的核苷酸聚合物。这些核苷酸聚合物可以含有天然和/或非天然核苷酸。核酸分子可以是单链或双链的。
核酸可以以细胞裂解物或部分纯化或基本上纯的形式存在于全细胞中。当用标准技术(包括碱/SDS处理、CsCl条带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和其它本领域已知的技术)从其它细胞成分或其它污染物(例如其他细胞核酸或蛋白质)中纯化核酸时，核酸被“分离”或为“基本上纯的”核酸。参见F.Ausubel等人，ed.分子生物学的通用方法，Greene Publishingand Wiley Interscience，纽约(1987)(F.Ausubel,et al.,ed.Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987))。当将本文应用于参考“核酸分子”时，术语“简并”是指编码与参考的核酸分子相同的氨基酸序列，但其与参考的核酸分子具有不同核苷酸序列。例如，在本文中，与SEQ ID NO：1简并的核酸序列编码与SEQ ID NO：1编码的相同的氨基酸序列，但其本身具有与SEQ ID NO：1不同的核酸序列。
在两个核酸或多肽的背景下，当进行最大相符性序列比较和比对时，术语“基本相同”是指两个或多个序列或亚序列，其具有至少约80％，例如至少约85％、约90％、约95％、约98％或约99％的核苷酸或氨基酸残基与特定的参考序列具有同一性，如使用以下序列比较方法和/或通过肉眼检查所测定。例如，本发明提供了具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2基本相同的序列的核酸。“基本同一性”可以存在于长度至少约50个残基的序列区域、至少约100个残基的区域或至少约150个残基的区域上、或在待比较的两个序列的全长上。如下所述，任何两个抗体序列通过使用Kabat中的编号方案只能以一种方式进行比对。来自免疫球蛋白的成熟重链和轻链可变区的氨基酸分别被指定为Hx和Lx，其中x是一个数字，其根据Kabat的方案(免疫目标蛋白序列)标明氨基酸的位置(美国国立卫生研究院(NationalInstitutes of Health)，毕士大(Bethesda)，Md.,1987和1991)。Kabat列出了每个亚组的抗体的许多氨基酸序列，并列出了该亚组中每个残基位置最常发生的氨基酸以产生共有序列。Kabat使用一种方法，用于给所列序列的每个氨基酸分配残基号码，并且这种给残基分配号码的方法已经成为本领域的标准。Kabat的方案可适用于其它抗体，但这些抗体不包括在它的纲要中，参照保守氨基酸将该抗体与Kabat的一种共有序列一起比对。使用Kabat的编码系统很容易识别不同抗体等同位置上的氨基酸。例如，人抗体L50位置上的氨基酸占据与小鼠抗体的氨基酸位置L50的等同位置。当由各个核酸编码的氨基酸序列根据Kabat编号规则进行比对时，编码抗体链的核酸也同样进行比对。
当将一个核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，则该核酸就是“可操作性地连接”。例如，如果启动子或增强子影响了编码序列的转录，它即可操作性地连接于该序列中。关于调控序列的转录，可操作性地连接意味着所连接的DNA序列是连续的，并且在必要时连续的、在阅读框中连接两个蛋白编码区。
如本文所用，术语“载体”是指能够转运与其连接的另一个核酸的核酸分子。一种载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，额外的DNA片段可与之连接。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入了它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点和游离型哺乳动物载体的细菌载体)。其它载体(例如非游离型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作性连接的基因的表达。这样的载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中通用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，其它形式的表达载体也包括在本文中，例如赋予等同功能的噬菌粒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
如本文所用，术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)是指引入了重组表达载体的细胞。这样的术语不仅指特定的受试细胞，而且指这种细胞的后代。由于突变或环境影响，后代可能发生某些修饰，所以这种后代实际上可能不与母细胞相同，但是仍然包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞包括，例如转染瘤，比如CHO细胞、NS/0细胞和淋巴细胞。
术语“免疫细胞应答”是指免疫系统细胞对外部或内部刺激(例如，抗原、细胞因子、趋化因子和其他细胞)的反应，在免疫细胞中产生生化变化，从而导致例如免疫细胞迁移、杀死靶细胞、吞噬、产生抗体、免疫应答的其它可溶性效应物等。
术语“T淋巴细胞反应”和“T淋巴细胞活性”在本文可互换使用，指依赖于T淋巴细胞的免疫应答的组分(例如，T淋巴细胞增殖和/或分化为辅助细胞、细胞毒性杀伤剂或T淋巴细胞抑制剂，由辅助T淋巴细胞向B淋巴细胞提供的信号可引起或预防抗体的产生，用细胞毒性T淋巴细胞杀死特异性靶细胞，以及释放可溶性因子，如调节其他免疫细胞功能的细胞因子)。
术语“免疫应答”是指淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和可溶性大分子(包括例如抗体、细胞因子和补体)的协同作用，其中所述可溶性大分子由上述细胞或组织(例如，肝脏)产生，并导致选择性伤害、破坏或消除侵入了人体的病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞，或在自身免疫或病理炎症的情况下，选择性伤害、破坏或消除对正常人细胞或组织。
可以通过各种方法在体外检测免疫应答的组分。例如，(1)细胞毒性T淋巴细胞可与放射性标记的靶细胞一起孵育，通过放射活性的释放检测这些靶细胞的裂解，(2)辅助T淋巴细胞可与抗原和抗原呈递细胞一起孵育，用标准方法测定细胞因子的合成和分泌(Windhagen A等，1995，Immunity 2(4)：373-80)，(3)抗原呈递细胞可以与全蛋白抗原一起孵育，并通过T淋巴细胞活化测定或生物物理学方法检测该抗原在MHC上的呈递(Harding等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.，86：4230-4)，(4)肥大细胞可以与交联它们的Fc-ε受体的试剂孵育，用酶免疫分析法测定组胺的释放(Siraganian等，1983，TIPS 4：432-437)。
类似地，模型生物(例如小鼠)或人类患者中免疫应答的产物也可以通过本领域普通技术人员熟知的各种方法来检测。例如，(1)可以通过临床实验室通用的标准方法(例如，ELISA)容易地检测响应于疫苗的抗体的产生；(2)可以通过刮擦皮肤表面并放置无菌容器来捕获刮伤部位的迁移细胞的方法，来检测免疫细胞向炎症部位的迁移(Peters等，1988，Blood 72：1310-5)；(3)外周血单核细胞应答有丝分裂原或混合淋巴细胞反应的增殖可用3H-胸苷测定；(4)PBMC中的粒细胞、巨噬细胞和其它吞噬细胞的吞噬能力可以通过将PBMC与标记的颗粒一起放置到孔中来测定(Peters等，1988Blood 72：1310-5))；和(5)可以通过用CD分子的抗体标记PBMC的方法来测定免疫系统细胞的分化，并测定表达这些标记的PBMC的分数。
如本文所用，术语“信号转导途径”或“信号转导事件”是指至少一种生化反应，但更常见的是由细胞与刺激性化合物或药物的相互作用所产生的一系列生物化学反应。因此，刺激性化合物与细胞的相互作用产生了通过信号转导途径传递的“信号”，最终导致细胞应答，例如上述的免疫应答。
如本文所用，术语“细胞表面受体”包括分子和分子复合物，其能够接收信号，并将信号传递给细胞质膜。如本文所用，“细胞表面受体”的例子为CTLA-4的T细胞受体(TCR)或B7配体。
细胞中的信号转导途径可以通过细胞与细胞内部或外部的刺激物的相互作用来引发。如果外部(即，细胞外)刺激物(例如，抗原呈递细胞上的MHC-抗原复合物)与细胞表面受体(例如，T细胞受体)相互作用，则信号转导途径可以跨越细胞的膜、通过细胞的细胞质，在某些情况下进入细胞核来传递信号。如果内部(例如，细胞内)刺激物与细胞内信号转导分子相互作用，信号转导途径可导致信号传递通过细胞的细胞质，并且在某些情况下进入细胞核。
通过下列途径可以发生信号转导，例如分子的磷酸化；非共价变构的相互作用；分子的络合；分子的构象变化；钙释放；磷酸肌醇的生产；蛋白水解切割；环核苷酸的产生和二酰基甘油酯的产生。通常，通过磷酸化信号转导分子发生信号转导。
术语“非特异性T细胞活化”是指独立于其抗原特异性的T细胞的刺激。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指可以安全地用于施用本发明所述抗体的固体或液体填充剂、稀释剂或物质，例如全身或局部施用。可并入本发明组合物中的用于全身给药的药学上可接受的载体包括糖、淀粉、纤维素、植物油、缓冲剂、多元醇和藻酸，以及其它的本领域普通技术人员已知的药学上可接受的载体。代表性的载体包括阿拉伯胶、琼脂、海藻酸盐、羟基烷基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、角叉菜胶、粉末状纤维素、瓜尔豆胶、胆固醇、明胶、琼脂胶、阿拉伯胶、刺梧桐胶、印度胶、刺槐豆胶、辛苯聚醇-9、油醇、果胶、聚丙烯酸及其同系物、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠、聚(环氧乙烷)、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇单硬脂酸酯、丙二醇单硬脂酸酯、黄原胶、黄蓍胶、山梨聚糖酯、硬脂醇、淀粉及其改性剂，以及本领域普通技术人员已知的其它载体。
术语“治疗有效量”或“有效量”是指本文所述的有效“治疗”个体疾病或病症的药物组合物的量。在癌症的情况下，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数量；减少肿瘤大小；抑制(即，在一定程度上减缓或停止)癌细胞浸润到外周器官中；抑制(即一定程度减缓或停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。本领域技术人员将理解，本文所施用的化合物或组合物的有效量可发生变化，并且基于许多因素可以容易地确定，例如，所治疗的疾病或病症、疾病的阶段、待治疗哺乳动物的年龄、健康和身体状况、疾病的严重程度、所施用的具体化合物等。
如本文所用，“治疗”意指降低患者经历的疾病症状的频率(即肿瘤生长和/或转移，或由免疫细胞的数目和/或活性介导的其它作用等)。该术语包括施用本发明的化合物或药物以预防或延迟症状、并发症或疾病生化指标(例如，PSA水平的升高)的出现、缓解症状或阻止或抑制疾病、病症或障碍的进一步发展，治疗可以是预防性的(预防或延迟疾病的发作，或预防其临床或亚临床症状的表现)或治疗性抑制或缓解疾病表现后的症状。
术语“CTLA-4相关疾病”是指以人CTLA-4的表达(特别是过度表达)或活化(特别是过度活化)为特征的疾病。
术语“对象”是指哺乳动物，比如，人和非人灵长类动物，以及实验动物，如兔、大鼠和小鼠，以及其他动物。动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如，羊、狗、牛，鸡、两栖动物和爬行动物。
如本文所用，术语“施用”或“给药”是指以注射或其他物理递送的方式将存在于体外的物质(例如本发明的制剂)递送到患者体内，例如通过口服、粘膜、皮内、静脉内、皮下、肌内递送和/或本文所述或本领域已知的物理递送的任何其它方法。当治疗疾病或其症状时，通常在疾病或其症状出现之后施用该物质。当预防疾病或其症状时，通常在疾病或其症状出现之前施用该物质。
如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”是指涉及免疫系统中的抑制途径的药物，其负责维持自身耐受性并调节免疫系统应答的程度，以使外周组织的损伤最小化。
术语“肿瘤抗原”是指在肿瘤和肿瘤出现的细胞中表达的分化抗原，例如黑素细胞抗原gplOO、MAGE/BAGE/GAGE、Yo、GAD、MART-I/melan-A、Trp-2、热休克蛋白等其他抗原。本文所述的肿瘤抗原可以是宿主中发现的肿瘤特异性T细胞的靶标。肿瘤抗原还可以包括端粒酶，这是合成染色体端粒所必需的，并且在超过85％的人类肿瘤以及仅在有限数量的体细胞组织中表达(Kim等人(1994)Science，266：2011-2013)。
如本文所用，术语“病原体”是指对其宿主致病的生物剂。例如，病原体可以是细菌、病毒、真菌或寄生虫。病原体也可以是HIV。
本发明的各个方面在以下小节中进一步详细描述。
I.针对人CTLA-4的人抗体的制备
可以通过多种技术制备本文所述的人抗体或人单克隆抗体，例如Kohler和Milstein，Nature 256：495(1975)的体细胞杂交技术。也可以使用制备单克隆抗体的其它技术，例如使用人抗体基因文库的B淋巴细胞的病毒或致癌转化或噬菌体展示技术。
也可以使用用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备直接针对CTLA-4的人单克隆抗体。参见例如：Ladner等人的美国专利5,223,409；5,403,484；和5,571,698；Dower等人的美国专利5,427,908和5,580,717；McCafferty等人的美国专利5,969,108和6,172,197；和Griffiths等人的美国专利5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081，在其中描述了这种方法。
使用CTLA-4构建库和淘选
可以通过将本文所述的抗体可变区基因克隆到编码常在噬菌体外表面上表达的噬菌体外壳蛋白的噬菌体展示载体来形成噬菌体展示文库。表达含有抗体可变区和噬菌体衣壳蛋白的融合蛋白，将其输送到噬菌体外表面、并进行组装和展示。最常用于展示库的噬菌体是噬菌体，特别是丝状噬菌体，特别是噬菌体M13，Fd或F1。
然后利用噬菌体展示抗体文库针对固定于固相上的人CTLA-4进行淘选。洗涤表面以除去未结合的噬菌体抗体后，洗脱结合的噬菌体用于感染，制备用于下一轮淘选的新鲜噬菌体抗体。重复几轮淘选，从而富集特异性针对CTLA-4的噬菌体抗体。
抗体的噬菌体展示文库可以单链形式或双链形式制备。单链抗体文库可以包含单独的抗体或其可变区的重链或轻链。然而，单链抗体文库的成员更经常由重链和轻链可变区融合形成，所述重链和轻链的可变区通过单个连续蛋白的肽间隔子分离，其融合为噬菌体衣壳蛋白。
天然来源的抗体可变区的编码序列(例如，免疫或未免疫B细胞的非克隆群体)导致了抗体文库的多样性。或者，通过人工诱变在将编码抗体链的核酸插入展示载体之前或之后可以引入多样性。这种诱变可以在PCR过程中发生，也可以在PCR之前或之后引入。
可以通过几种方式将扩增的VH和VL序列组合在一起来构建抗体片段的文库。
针对CTLA-4的人单克隆抗体的制备
可以使用例如重组DNA技术和基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中制备本文所述的人抗体，参见，例如，Morrison，S。(1985)Science 229：1202。
例如，为了表达抗体，可以通过标准分子生物学技术(例如，PCR扩增，定点诱变)获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且可以插入到表达载体中，使得基因可操作地连接到转录和翻译控制序列。选择与所用的表达宿主细胞相容的表达载体和表达控制序列。抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到单独的载体中，或者在一些实施方式中，将两个基因插入到相同的表达载体中。可以用标准方法将抗体基因插入到表达载体中(例如，在抗体基因片段和载体上连接互补限制性位点，如果不存在限制性位点，则连接平末端)。通过将本文所述的抗体的轻链和重链可变区插入到表达载体中，它可用于产生任何同种型抗体的全长抗体基因，所述表达载体已经编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区，由此使得，VH部分可操作地连接到载体内的CH片段，并且VL片段可操作地连接到载体内的CL片段。此外，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可以克隆到载体中，由此使得信号肽与抗体链基因的氨基末端框内连接。或者，信号肽基因可以可操作地连接到抗体链基因。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除了抗体链基因之外，本文所述的重组表达载体可以携带控制宿主细胞中抗体链基因表达的调控序列。术语“调控序列”包括控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。这些调控序列描述于例如，Goeddel；基因表达技术.酶学方法185，Academic Press，San Diego，Calif。(1990)(Goeddel；GeneExpression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990))中。表达载体的设计，包括调控序列的选择，可能取决于下述因素，诸如待转化宿主细胞的选择，所需蛋白质的表达水平等。哺乳动物宿主细胞表达的典型的调控序列包括病毒元件，其引导哺乳动物细胞中高蛋白质的表达水平，例如源自巨细胞病毒(CMV)的启动子和/或增强子，猿猴病毒40(SV40)，腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒。在一些实施方式中，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。
除了抗体链基因和调控序列之外，本文所述的重组表达载体可携带额外的序列，例如调节载体在宿主细胞中的复制(例如复制起点)和可选择的标记基因的序列。可选择的标记基因有助于选择已经引入载体的宿主细胞(参见，例如全部为Axel等人申请的美国专利号4,399,216，美国专利号4,634,665和美国专利号5,179,017)。例如，选择性标记基因可以对已经引入载体的宿主细胞赋予、抗药性，例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤。典型的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于选择G418)。
为了表达轻链和重链，编码重链和轻链的表达载体可以通过标准技术转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式包括将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的各种常用技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。可以在原核或真核宿主细胞中表达本文所述的抗体。
在一些实施方式中，所述抗体可以在真核细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中表达。用于表达本文所述重组抗体的典型的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)，其包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin，1980 Proc.Natl.Acad.Sci.美国77：4216-4220，其与DH FR可选择标记一起使用，例如在R.J.Kaufman和P.A.Sharp,1982Mol.Biol.159:601-621,NSO骨髓瘤细胞,COS细胞和SP2细胞中有所描述。在一些实施方式中，WO 87/04462，WO 89/01036和EP 338,841中所示的GS基因表达系统可以与NSO骨髓瘤细胞一起使用。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，可以通过培养宿主细胞一段时间制备抗体，这段时间足以使得抗体在宿主细胞中表达或将抗体分泌到培养基中，宿主细胞在其中得以生长。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
在一些实施方式中，克隆的抗体基因可以在其它表达系统中表达，包括原核细胞，例如微生物，例如大肠杆菌(例如，用于制备scFv抗体)，algi以及昆虫细胞。此外，抗体可以在转基因非人动物中产生，例如来自绵羊和兔子的牛奶或来自母鸡的鸡蛋，或转基因植物。参见例如Verma，R.等.(1998)J.Immunol.Meth.216：165-181；Pollock等人(1999)J.Immunol.Meth.231：147-157；和Fischer，R等(1999)Biol.Chem.380：825-839。
为了产生scFv基因，编码DNA片段的VH和VL可以可操作地连接到编码柔性接头的另一个片段，例如氨基酸序列(Gly4-Ser)3，由此使得VH和VL序列可作为连续的单链蛋白被表达，其中VL和VH区通过柔性接头连接(参见例如Bird等人；1988Science 242：423-426；Huston等，1988Proc.Natl.Acad.Sci.美国85：5879-5883；McCafferty等人，1990Nature348：552-554)。
产生本发明的一些实施方式所述的针对CTLA-4的全人单克隆抗体的详细步骤描述在下面的实施例中。例如，可以通过用携带重链和轻链基因的表达载体的电穿孔转染dhfr-CHO细胞，并将其限制稀释至96孔板上。转染的细胞可以在含有甲氨蝶呤的OptiCHO培养基中培养。可以通过形成细胞集落的ELISA筛选孔选择性表达针对CTLA-4的人单克隆抗体的细胞系。
为了纯化抗CTLA-4人单克隆抗体，选择的CHO细胞克隆可以在2升旋转瓶中生长以进行单克隆抗体的纯化。可以进行亲和层析之前用市售蛋白质A-sepharose(例如Pharmacia，Piscataway，N.J。)过滤和浓缩上清液。可以通过凝胶电泳和高效液相色谱检测洗脱的IgG，以确保纯度。缓冲溶液可以换为PBS，浓度可以通过OD280使用1.54消光系数来确定。单克隆抗体可以等分并储存在-80℃。使用常规技术对CTLA-4进行亲和层析进一步纯化抗体。
为了确定所选择的人抗CTLA-4单克隆抗体是否结合到唯一的表位，可用市售可得的试剂(例如，Pierce，Rockford，Ill.)将每种抗体进行生物素化。可以使用如上所述的CTLA-4包被的ELISA平板，使用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体进行竞争性的研究。可以用链霉亲和素-碱性磷酸酶探针检测生物素化的MAb结合。
为了证明单克隆抗体与表达CTLA4的活细胞结合，可以使用流式细胞术。例如，表达CTLA-4(在标准生长条件下生长)的细胞系可以与含有0.1％BSA和10％胎牛血清的PBS中的各种浓度单克隆抗体混合，并在37℃下孵育1小时。洗涤后，在一抗染色的相同条件下，细胞可以与荧光素标记的抗人IgG抗体反应。可以通过FACScan仪器，使用光和侧面散射特性进行样品分析，以对单个细胞进行门控。除了或替代流式细胞术，可以使用荧光显微镜进行替代分析。细胞可以进行如上所述的染色，并用荧光显微镜检测。
可通过Western印迹进一步检测抗CTLA-4人IgG与CTLA-4抗原的反应性。例如，可以制备表达CTLA-4的细胞的细胞提取物，并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用10％胎牛血清封闭，并用待测试的单克隆抗体进行标记。可以使用抗人IgG碱性磷酸酶检测人IgG的结合，并用BCIP/NBT底物片剂(例如Sigma Chem.Co.，St.Louis，Mo.)显影。
在一些实施方式中，本文所述的人抗CTLA-4抗体的某些结构特征可用于产生结构相关的人抗CTLA-4抗体，其保留抗体的至少一种功能性质，例如结合CTLA-4的能力。例如，可以将C2、C5和C15的一个或多个CDR区结合重组于已知的人框架区和CDR，以产生本文包含的额外的重组人抗CTLA-4抗体。
因此，在一些实施方式中，提供了制备抗CTLA-4抗体的方法，所述方法包括：
制备一抗体，其包含(1)人重链框架区和人重链CDR，其中至少一个人重链CDR包含SEQ ID NOs：34、35和36的氨基酸序列；和(2)人轻链框架区和人轻链CDR，其中至少一个人轻链CDR包含选自SEQ ID NOs：25、26和27的氨基酸序列；其中所述抗体特异性结合于CTLA-4。
制备一抗体，其包含(1)人重链框架区和人重链CDR，其中至少一个人重链CDR包含SEQ ID NOs：37、38和39的氨基酸序列；和(2)人轻链框架区和人轻链CDR，其中至少一个人轻链CDR包含选自SEQ ID NOs：28、29和30的氨基酸序列；其中所述抗体特异性结合于CTLA-4。
制备一抗体，其包含(1)人重链框架区和人重链CDR，其中至少一个人重链CDR包含SEQ ID NOs：40、41和42的氨基酸序列；和(2)人轻链框架区和人轻链CDR，其中至少一个人轻链CDR包含选自SEQ ID NOs：31、32和33的氨基酸序列；其中所述抗体特异性结合于CTLA-4。
在一些实施方式中，如上制备的重组抗体可以包含(1)包含三个CDR的人重链可变区：SEQ ID NO：34的VH CDR1，SEQ ID NO：35的VH CDR2和SEQ ID NO：36的VH CDR3；和(2)包含三个CDR的人轻链可变区：SEQ ID NO：25的VL CDR1，SEQ ID NO：26的VL CDR2和SEQ IDNO：27的VL CDR3。
在一些实施方式中，如上制备的重组抗体可以包含(1)包含三个CDR的人重链可变区：SEQ ID NO：37的VH CDR1，SEQ ID NO：38的VH CDR2和SEQ ID NO：39的VH CDR3；和(2)包含3个CDR的人轻链可变区：SEQ ID NO：28的VL CDR1，SEQ ID NO：29的VL CDR2和SEQ ID NO：30的VL CDR3。
在一些实施方式中，如上制备的重组抗体可以包含(1)包含三个CDR的人重链可变区：SEQ ID NO：40的VH CDR1，SEQ ID NO：41的VH CDR2和SEQ ID NO：42的VH CDR3；和(2)包含三个CDR的人轻链可变区：SEQ ID NO：31的VL CDR1，SEQ ID NO：32的VL CDR2和SEQ IDNO：33的VL CDR3。
在一些实施方式中，如上制备的重组抗体可以是单链Fv(scFv)，其包含一重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，和一轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述重组抗体具有非人框架区(例如小鼠)。
在一些实施方式中，如上制备的所述重组抗体可以是scFv，其包含一重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，以及一轻链可变区，其包含SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，如上制备的所述重组抗体可以是scFv，其包含一重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，以及一轻链可变区，其包含如SEQID NO：6所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述scFv可以任选地进一步包含一柔性肽接头，其位于重链可变区和轻链可变区之间。所述肽接头优选由1-15个氨基酸组成，更优选由3-10个氨基酸组成；肽接头的优选序列是GSGGGGS。
下面提供一些实施方式所述的抗体的核苷酸和多肽序列。表A和表B分别提供了亲本抗体或第一筛选抗体的氨基酸和核苷酸序列。
表A
抗CTLA-4的scFv抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列
(下划线和粗体为CDR)
C2 VH,SEQ ID NO:8
C2 VL,SEQ ID NO:2
C5 VH,SEQ ID NO:10
C5 VL,SEQ ID NO:4
C15 VH,SEQ ID NO:12
C15 VL,SEQ ID NO:6
表B
抗CTLA-4的scFv抗体的重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列
C2 VH,SEQ ID NO:7
C2 VL,SEQ ID NO:1
C5 VH,SEQ ID NO:9
C5 VL,SEQ ID NO:3
C15 VH,SEQ ID NO:11
C15 VL,SEQ ID NO:5
表1C2、C5和C15的轻链可变区和重链可变区的CDR氨基酸序列
表1
单克隆抗体C2、C5和C15的轻链和重链CDR序列
II.治疗组合物和方法
还提供了一种药物组合物，包括至少一种本文所述的人单克隆抗体和/或人抗体和/或其抗原结合片段，以药学上可接受的载体。一些组合物包括多种(例如，两种或多种)本文所述分离的人单克隆抗体和/或人抗体。在一些实施方式中，所述组合物的每一种抗体可以是与人CTLA-4不同的预先所选表位相结合的单克隆抗体或人抗体。
本发明的药物组合物具有体外和体内诊断和治疗的实用性。在一些实施方式中，本发明提供了一种使用本文所述的抗体在体外或体内检测样品中是否存在人CTLA-4抗原的方法，例如诊断CTLA-4的相关疾病。在一些方法中，在抗体和人CTLA-4能够形成复合物的条件下，这是通过将待测样品以及对照样品与本发明的抗体接触来实现的。然后在测试样品对形成复合物进行检测(例如，通过ELISA)，测试样品与对照样品之间的任何统计学上显著增加的复合物形成即表明，测试样品中存在人CTLA-4抗原。
本发明还提供了通过将本文所述的抗体与细胞接触，从而抑制CTLA-4激活表达有CTLA-4肽的细胞的能力的方法。在一些实施方式中，提供了治疗一对象的CTLA-4相关疾病的方法，其包括向个体施用治疗有效量的本文所述的药物组合物。同样在一些实施方式中，本发明的抗体可用于制备用于治疗CTLA-4相关疾病的药物。CTLA-4相关疾病可包括癌症、细胞增殖障碍、中枢神经系统疾病、血液系统疾病、炎性疾病、感染性疾病、过敏或T细胞相关疾病。在一些实施方式中，CTLA-4相关疾病是T细胞介导的自身免疫性疾病。在一些实施方式中，CTLA-4相关疾病是癌症。此外，在一些实施方式中，CTLA相关疾病选自黑素瘤、非小细胞肺癌和前列腺癌。
本发明还提供了诱导、增强或延长患者中对抗原的免疫应答的方法，包括施用治疗有效量的本文所述阻断人CTLA-4与人B7配体相结合的药物组合物。本文所述的抗原可以是肿瘤抗原或来自病原体的抗原。肿瘤抗原还可以包括蛋白质端粒酶。肿瘤抗原的另一种形式是从肿瘤组织本身分离的纯化的热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白含有来自肿瘤细胞的蛋白质片段，并且这些HSP高效地递送到抗原呈递细胞以引发肿瘤免疫(Suot,R&Srivastava,P(1995)Science 269：1585-1588；Tamura，Y.等(1997)Science 278：117-120)。在一些实施方式中，所述抗原是乙型肝炎表面抗原。
调整剂量方案以提供最优的预期反应(例如治疗反应)。例如，可以施用单次推注，可以随着时间施用几个分开的剂量，或者如治疗情况的紧急程度所指示的，剂量可按比例减少或增加。本发明的剂量单位形式的说明书取决于或直接取决于(a)抗体的独特特性和要实现的特定治疗效果；(b)本领域固有的用于治疗个体敏感性的限制。
在一个实施方式中，施用方式是静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下，或在靶点附近施用。如果需要，有效的日剂量可以分别分两次、三次、四次、五次、六次或更多次分剂量施用，全天适当间隔，任选地以单位剂型施用。虽然本发明的抗体可以单独施用，但优选将该化合物以本文所述的药物组合物的形式给药。
联合治疗
可以将一种或多种额外的治疗剂加入到本文所述的药物组合物中，施用于个体或共同施用于对象，用于治疗对象中的CTLA-4相关疾病。
阻断CTLA-4可以有效地与化疗方案相结合。在这些情况下，可以减少施用的化学治疗剂的剂量(Mokyr,M.等(1998)Cancer Research 58：5301-5304)。在一些实施方式中，所述额外的治疗剂或试剂是化学治疗剂，包括但不限于，有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢剂、抗生素插入剂、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、生物效应调节物、抗激素剂、血管生成抑制剂和雄激素拮抗剂。
在一些实施方式中，所述额外的治疗剂是作为免疫检查点抑制剂的抗体，包括但不限于，利妥昔单抗、贝伐珠单抗、曲妥珠单抗、抗IGF 1R抗体(例如CP-751,871)、抗CD40抗体(例如，CP-870,8930)、抗PD-1抗体、抗PD-1 L1抗体、抗-PD-1 L2抗体等。在一些实施方式中，所述额外的治疗剂是疫苗，包括但不限于，GM-CSF修饰的肿瘤载体疫苗或负载抗原的树突状细胞疫苗。共同施用包括序贯施用治疗剂，即，其中每个治疗剂在不同时间施用，以及同时施用这些治疗剂或至少两种治疗剂。序贯或同时施用每种治疗剂可受到任何合适的途径的影响，包括但不限于，口服途径、静脉内途径、肌内、皮下途径和通过粘膜组织的直接吸收。所述治疗剂可以通过相同的途径或不同的途径施用。例如，可以口服施用第一治疗剂(例如，化疗剂)，并且可以静脉内施用第二治疗剂(例如抗CTLA4的抗体)。此外，所选择的第一治疗剂的组合可以通过静脉内注射施用，而其它治疗剂的组合可以口服施用。或者，例如，两种治疗剂均可以通过静脉内或皮下注射施用。
实施例
以下讨论的实施例是为了纯粹的示例本发明，并且不应被认为是以任何方式限制本发明。这些实施例并不意味着以下实验是全部或唯一的实验。已经努力确保所用数字(例如数量，温度等)的准确性，但应考虑到一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数为重量份，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，压力为或接近大气压。
实施例1
构建PIII噬菌体展示库
噬菌体展示载体的合成。合成含有编码病毒衣壳蛋白PIII基因的载体(GenScript)。所述PIII基因位于抗体可变区基因(VH和VL基因)插入的多克隆位点的下游。肠激酶切割位点位于PIII基因的上游，以及用于纯化目的的his标签的下游。
cDNA模板的制备。在PAXgeneTM血液RNA管(PAXgene)中收集来自八个供体的人外周血。使用泛影葡胺(Ficoll Hypaque)方法纯化PBMC。使用Midi Kit(凯杰，Qiagen)从PBMC中制备总RNA。通过使用具有寡核苷酸(dT)的II第一链合成试剂盒(Invitrogen)，从总RNA中合成第一链cDNA。
抗体可变区基因的扩增。通过使用cDNA a作为模板，对VH和VL基因库进行PCR扩增。为了从cDNA和质粒模板中扩增VH和VL基因，根据先前公布的那些基因和录入在V-Base序列目录中的最新基因片段设计引物(de Haard(1999)J.Biol.Chem.274:18218–18230；Haidaris(1999)J.Immunol.Methods 257:185–202；Welschof(1995)J.Immunol.Methods179:203–214；Marks(1991)Eur.J.Immunol.21:985–991)。所有的初级PCR反应都使用单独的反向引物和组合的正向引物进行。为了扩增VH基因库，通过使用12种不同的人VH(HVH)反向引物的一种和等摩尔混合的4种人重链J区(HJH)正向引物，从而建立12个单独的PCR反应。对于κ和λVL基因，使用各个HVκ或HVλ反向引物以及HJκ或HJλ正向引物的混合物定义的13个单独反应相同的方法。在含有2ul cDNA反应混合物、2uM引物溶液、200uM dNTPs、5％DMSO和10μl Pfu聚合酶反应缓冲液(Stratagene)的100ul体积中进行PCR反应。在94℃变性5分钟后，加入5单位的Pfu聚合酶，随后在94℃，1分钟、57℃，1分钟和72℃，1分钟下各30个循环，在72℃下的循环末端孵育10分钟。在PCR反应之后，各种反应从8种不同PBL样品的混合物中提供VH、Vκ和Vλ亚体液，其产生三个最终的VH，Vκ和Vλ池，用于纯化和组装。
将VH或VL基因克隆入TA质粒。使用试剂盒(Qiagen)对扩增的VH和VL基因进行凝胶纯化，并分别克隆到TA载体中。在含有2μg T载体和3μg纯化的VH片段的400μl体积(NEB)下进行连接反应，或在含有2.5μg T载体和6ug纯化的VL片段中进行连接反应。将反应物在16℃孵育过夜。使用质粒纯化柱将反应体积浓缩至50μl。将连接的产物转化入XL-1蓝色大肠杆菌感受态细胞(转化效率为8.7×108个细胞/ug)。对每个连接产物进行9次转化，每次转化使用5μl连接产物和40μl感受态细胞。使用Xcell TM(Bio-Rad)，在25μFD，200Ω，2.5kV条件下，对连接产物和感受态细胞的混合物进行电穿孔。当进行每次电穿孔时，在LB培养基中收获细胞并合并。转化细胞的终体积为15ml。为了计算VH或VL的T载体文库的大小，将10ul转化细胞均匀地分布在LB平板上，并在37℃下培养过夜。计数集落，计算T载体文库的大小：VH基因为1.62×107，VL基因为1.86×107。将所有15ml转化细胞接种在10 150-mmLB/琼脂平板上，并在37℃下孵育过夜。使用总共320LB培养基收获来自平板的细胞，并将20ml等分到16个50ml的离心管中并储存在-80℃的冷冻箱中。
构建scFv库。将20毫升VH基因和VL基因的每个T载体文库解冻并旋转以获得细胞。使用HighPure Midi质粒纯化试剂盒(TianGen)纯化含有VH和VL基因的T载体。用针对VH基因的NcoI-HF/XhoI-HF(均来自NEB)或针对VL基因的NheI-HF和NotI-HF(均来自NEB)对纯化的质粒进行如下所示的双重消化：总反应体积750μl中，120μg上述纯化的含有T质粒的VH或VL基因，加入600U NcoI-HF和900U XhoI-HF或600U NhetI-HF和900U NotI-HF。在37℃下反应过夜。消化反应完成后，用酒精沉淀消化的质粒，溶于40μl TE缓冲液中，将VH或VL基因的插入片段进行凝胶纯化。使用相同的方法制备线性化噬菌体载体，其用针对VH基因的NcoI/XhoI或针对VL基因的NheI-HF和NotI-HF进行消化。将VH基因克隆在NcoI/XhoI位点之间，并且在NheI/NotI位点之间克隆Vκ/Vλ基因，由此使得VH和VL基因与噬菌体展示载体中的PIII衣壳蛋白的编码序列一致。VH和VL基因分两个步骤克隆到噬菌体展示载体中。首先将VL基因克隆到载体中。在含有5.5ug线性化载体、3.5μgVL基因插入物和10,000U T4连接酶(NEB)的900μl体积中进行连接反应，16℃下过夜。连接的产物在迷你柱中进行纯化，并在200μlTE缓冲液中洗脱，并电穿孔至E.Coli XL-1蓝色感受态细胞中。对5μl连接产物和40μl感受态细胞各进行电穿孔40次，总共产生多种约5.3×108个独立的转化子。电穿孔后，将细胞置于含有2％葡萄糖、50ug/ml羧苄青霉素和20ug/ml四环素的LB琼脂上，铺在40个培养皿(150mm×10mm；Nunc)中，并在37℃下孵育过夜。将克隆从板上刮下置于1600ml的含有10％甘油和等分试样的超级肉汤培养基(SB)中，并在-70℃下储存。纯化含有噬菌体载体的VL基因，并对用NheI-HF和NotI-HF消化的线性化质粒进行凝胶纯化。以与VL基因连接相同的方式进行VH基因的连接。
实施例2
淘选和获得靶向CTLA-4细胞外Ig-V结构域的scFv序列
抗原。重组人的CTLA-4-Fc融合蛋白购自R&D系统(Systems)(货号为352-CTY/CF)。氨基酸从37至162的CTLA-4序列与免疫球蛋白γI Fc区融合。然后将重组人的CTLA-4-Fc融合蛋白在培养的昆虫细胞中表达，并使用固定的蛋白A柱(Repligen Corporation)进行纯化。
制备PIII噬菌体文库。将来自上述PIII文库甘油储液中的约5×1010个细胞接种到1L的含有2％葡萄糖、50ug/ml羧苄青霉素和20μg/ml四环素的1L SB培养基中，过夜。37℃下振荡培养，直到获得约0.5-0.7的OD600。然后，加入约4×1013个噬菌体形成单位的辅助噬菌体VCSM13和2ml的0.5M异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。在室温下孵育30分钟后，将培养物稀释到5升的含有50μg/ml羧苄青霉素、20ug/ml四环素和0.5mM IPTG的SB培养基中，并在30℃下生长2小时。然后加入卡那霉素至终浓度为70ug/ml，并将培养物在30℃下生长过夜。第二天，将培养物以3000g、15mins、4℃的速度旋转，弃去细菌颗粒。将上清液转移至干净的500ml离心瓶中，并加入PEG8000(4％w/v)和NaCl(3％w/v)以沉淀ScFv噬菌体。将噬菌体沉淀重悬于含有2％脱脂乳或2％BSA的PBS(10mM磷酸盐/150mM NaCl，pH7.4)中。
淘选。将如上所述的获得/制备的1ml的CTLA-4细胞外Ig-V结构域溶解在PBS中，并在室温下用免疫管(Maxisorb，Nunc)孵育过夜。第一轮淘选的蛋白质浓度分别为50ug/ml，第二和第三轮淘选的浓度分别为10ug/ml和5ug/ml。将免疫管用含有4％脱脂乳(Blotto)的PBS在室温下封闭1小时。然后加入约1013cfu的scFv噬菌体。在室温下摇动孵育2小时后，通过10次PBS/0.1％Tween-20洗涤和10次PBS洗涤，洗脱未结合和非特异性结合的scFv噬菌体。室温下，用1ml的洗脱缓冲液(100mM HCl，用固体甘氨酸调节至pH2.2，并含有0.1％BSA)洗脱特异性结合的scFv噬菌体，10分钟。用60μl的2M Tris碱中和洗脱液，并进行ELISA测定。
ELISA检测scFv-噬菌体的结合。将如上所述的获得/制备的CTLA-4细胞外V结构域(10μg/ml的PBS)在室温下，在微量滴定板上包被过夜，然后用Blotto包被。将大约25ul的可溶性scFv噬菌体加入到每个孔中，并在37℃下孵育1小时。洗涤后，加入25μl抗M13 mAb辣根过氧化物酶(HRP)缀合物(Amersham Pharmacia)，其在Blotto中以1:1000稀释，并在37℃下孵育30分钟。然后向每个孔中加入50μl四甲基联苯胺底物(Pierce)，并检测450nm处的吸光度。
scFv噬菌体救援。阳性ScFv噬菌体混合物被用于感染新鲜制备的大肠杆菌XL1-Blue细胞。然后救援、扩增scFv噬菌体，并进行下一轮淘选。为了救援scFv噬菌体，用新鲜的XL1-Blue细胞接种10ml SB(10ug/ml四环素)，并以250rpm，在37℃下振荡，直至OD600＝1。加入1ml的Sc-Fv噬菌体，37℃孵育1小时。将细菌旋转离心，铺在含有50ug/ml羧苄青霉素、20ug/ml四环素和2％葡萄糖的2YT的琼脂上，并在30℃孵育过夜。第二天，将来自板的细菌细胞接种到50ml的含有1％葡萄糖、50ug/ml羧苄青霉素和10ug/ml四环素的SB培养基中(确保OD600～0.1)，并在37℃下，以250rpm摇动直至OD600＝0.7。加入辅助噬菌体VCSM13，IPTG的终浓度为0.25mM。将培养物在室温下孵育30分钟，稀释到100ml的含有50μg/ml羧苄青霉素、10ug/ml四环素和0.5mM IPTG的SB培养基中，并在30℃下生长2小时。加入70ug/ml的卡那霉素，培养物在30℃下生长过夜(约16小时)。第二天，沉淀扩增的噬菌体。
回收阳性scFv序列。一旦在几轮淘选之后确定了最终的阳性噬菌体混合物，则将噬菌体转导回XL1-Blue。将XL1_Blue的SB培养物(10ug/ml的四环素)生长至OD600＝1，然后加入噬菌体。在37℃孵育1小时后，将培养物接种在含有50μg/ml羧苄青霉素、20ug/ml四环素、2％葡萄糖的SB琼脂上，并在30℃孵育过夜。第二天，挑选单个克隆，进行小量制备，并进行测序。
scFvs的纯化和亲和度的测定。将阳性scFv基因亚克隆到表达载体pETFlag(来自pET-15b，Novagen)中，并转化到大肠杆菌B834(Novagen)中。在含有0.5mM异丙基-硫代半乳糖苷的超级肉汤中，在30℃下生长过夜，并诱导scFV的表达。在来自周质提取物和培养基中的抗Flag M2亲和力琼脂糖(Sigma)上纯化Flag标记的scFv。使用PBS缓冲液，用Sephacryl-100色谱法，在FPLC(Amersham Pharmacia)上制备纯化的单体scFv。(Mao(1999)PNAS 96：6953-6958))。根据BIAcore仪器和软件(Amersham Pharmacia)测定的关联(kon)和解离(koff)速率常数计算电离常数(Kd)(Medaglia(2002)蛋白质－蛋白的相互作用.255–272；Roder(1998)Methods Mol.Med.13:531–554)。在BIAcore实验中，将蛋白质抗原固定在CM5芯片上。在scFv结合测量后，用75mM HCl再生芯片(表6)。
实施例3
scFv与CTLA-4结合
与纯化的重组人的CTLA-4结合使用标准方法和步骤，用ELISA显示了从大肠杆菌中表达和纯化的CTLA-4scFv(图3A，3B，4A和4B所示的序列)与重组人的CTLA-4的结合。用各种浓度的scFv孵育经纯化CTLA-4包被的微量滴定板，然后用与碱性磷酸酶缀合的山羊抗人IgG F(ab')2显影。数据显示，所有scFv与CTLA-4剂量依赖性的、特异性的结合(图1)。
实施例4
人全长单克隆抗体的制备
表达载体的构建用重叠PCR将来自信号肽基因、VH或VL基因、以及IgGγ1恒定区或κ或λ恒定区基因的编码抗人的CTLA-4单克隆抗体的全长核苷酸序列进行组装。合成所有信号肽基因、IgGγ1恒定区或κ或λ恒定区基因(GenScript)，并将其克隆到哺乳动物表达载体中。
为了构建IgGγI重链同种型的KD6001-2全长核苷酸序列，用三对引物，其分别为CMV启动子和KDP032，KDP034和KDP035以及KDP020和BGH反向引物(所用的引物序列参见表2)从含有相应序列的质粒中对信号肽基因、VH基因、和IgGγ1恒定区基因进行PCR扩增。针对VH基因的正向引物序列KDP034在信号肽基因的反向引物序列KDP032的5'末端的19nt处互补，针对VH基因的反向引物序列KDP035在5'末端的21nt处与IgGγI恒定区基因的正向引物序列KDP020互补，由此使得构建到VH基因末端的互补性短区促进了各种片段的杂交。将三个扩增的基因在琼脂糖上凝胶纯化。使用外引物(CMV启动子和BGH反向序列)，用梯度PCR连接约20ng的三个基因。在每个10ul体积的含有2uM引物溶液、200uM dNTP和0.1ul Pfx聚合酶反应缓冲液(Invitrogen)的退火温度反应中进行梯度PCR。在94℃下进行5分钟的初始变性步骤，随后在94℃下进行1分钟的30个循环，在45℃至60℃的8种不同温度下进行1分钟的30个循环和在68℃下进行1.5分钟的30个循环，以及在循环末期，在68℃下孵育7分钟。PCR后，在琼脂糖上检测产物，并将正确的DNA片段进行凝胶纯化。用NotI和XbaI消化纯化的DNA片段，琼脂糖凝胶纯化，并连接到已经用相同的限制性酶切割的哺乳动物表达载体中。将连接的产物转化到大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞中，将转化的细胞接种在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB/琼脂平板上。板在37℃下培养过夜。使用CMV启动子和BGH反向序列直接对大肠杆菌菌落进行PCR，以获得阳性克隆。挑取3个阳性菌落，接种到3ml LB中，在37℃下培养过夜。使用Miniprep试剂盒(凯杰，德国)从1.5ml的LB培养物中纯化质粒。通过使用CMV启动子和BGH反向序列对其测序，并确认序列(图8)。
表2用于C2单克隆抗体重链载体构建的引物序列
使用相同的方法构建IgGγI重链的KD6001-5和KD6001-15全长核苷酸序列(图9和10)。对于PCR扩增的VH基因，使用针对KD5001-5 VH基因的引物KDP038和KDP039，使用针对KD5001-15VH基因的引物KDP042和KDP039(参见表3的引物序列)。信号肽基因和IgGγI恒定区基因与构建KD6001-2 IgGγI所用的基因相同。
表3用于C5和C15单克隆抗体重链载体构建的引物序列
为了构建κ轻链同种型的KD6001-2全长核苷酸序列，用三对引物，分别为CMV启动子和KDP032，KDP036和KDP037，以及KDP010和BGH反向引物(所用的引物序列参见表4)，从含有相应序列的质粒中对信号肽基因、VL基因、和κ恒定区基因进行PCR扩增。针对VL基因的正向引物序列KDP036在信号肽基因的反向引物序列KDP032的5'末端的19nt处互补，针对VL基因的反向引物序列KDP037在5'末端的21nt处与κ恒定区基因的正向引物序列KDP010互补，由此使得构建到VL基因末端的互补性短区促进了各种片段的杂交。将三个扩增的基因在琼脂糖上凝胶纯化。使用外引物(CMV启动子和BGH反向序列)，用梯度PCR连接约20ng的三个基因。在每个10ul体积的含有2uM引物溶液、200uM dNTP和0.1ul Pfx聚合酶反应缓冲液(英杰公司)的退火温度反应中进行梯度PCR。在94℃下进行5分钟的初始变性步骤，随后在94℃下进行1分钟的30个循环，在45℃至60℃的8种不同温度下进行1分钟的30个循环和在68℃下进行1分钟的30个循环，以及在循环末期，在68℃下孵育7分钟。PCR后，在琼脂糖上检测产物，并将正确的DNA片段进行凝胶纯化。用NotI和XbaI消化纯化的DNA片段，琼脂糖凝胶纯化，并连接到已经用相同的限制性酶切割的哺乳动物表达载体中。将连接的产物转化到大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞中，将转化的细胞接种在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB/琼脂平板上。板在37℃下培养过夜。使用CMV启动子和BGH反向序列直接对大肠杆菌菌落进行PCR，以获得阳性克隆。挑取3个阳性菌落，接种到3ml LB中，在37℃下培养过夜。使用Miniprep试剂盒(凯杰，德国)从1.5ml的LB培养物中纯化质粒。通过使用CMV启动子和BGH反向序列对其测序，并确认序列。
表4用于C2单克隆抗体轻链载体构建的引物序列
为了构建λ恒定区同种型的KD6001-5和KD6001-15全长核苷酸序列，用引物KDP108和M13F(-21)序列从含有λ恒定区基因的质粒中对λ恒定区基因进行PCR扩增。对于PCR扩增的VL基因，用引物KDP040和KDP106扩增KD5001-5VL基因，用引物KDP043和KDP107扩增KD5001-14VL基因(参见表5的引物序列)。所述信号肽基因与构建KD6001-2IgGγI所用的信号肽基因相同。
表5用于C5和C15单克隆抗体轻链载体构建的引物序列
制备产生mAb的CHO细胞。将母本CHO DG44细胞(dhfr-)培养于含有8mM L-谷氨酰胺和5μg/ml重组人胰岛素(rINS)的CD DG44培养基中。将稳定转染的细胞在含有8mM L-谷氨酰胺，5μg/ml rINS和各种浓度的甲氨蝶呤(MTX)的OptiCHO培养基中培养。
将mAb的重链和轻链表达载体通过电穿孔法共转染到CHO DG44细胞中。在含有20nM MTX的选择培养基中培养稳定转染的克隆混合物。然后进一步选择稳定的混合物，逐渐增加MTX浓度，使之高达10uM，用来扩增表达基因。在此阶段，通过在96孔板中以低密度电镀具有扩增的表达基因的细胞来获得单个克隆。在适当的生长期之后，使用具有抗-Fc抗体的ELISA筛选具有单个克隆的孔，用于mAb生产(Wood等人，1984，Nucleic Acids Research12：3937)。进一步扩大具有高生产mAb水平的克隆。
实施例5
结合CTLA-4的抗CTLA-4的全长单克隆抗体(mAbs)
与纯化的重组人CTLA-4(rhCTLA-4)结合通过ELISA，使用标准方法和步骤显示了CTLA-4 mAbs与纯化的重组人CTLA-4(购自R&D系统，目录号为352-CTY/CF)的结合。用纯化的CTLA-4包被的微量滴定板与各种浓度的C2和C5mAbs一起孵育，然后用与碱性磷酸酶缀合的山羊抗人IgG F(ab')2显影。数据显示，C2(图11A)和C5(图11B)的剂量依赖性结合与4－参数曲线(相关系数为-1.0)非常吻合。25ng/ml的半数最大结合反映了C2与CTLA-4的高结合能力。与C2相比，C5具有较小的结合能力，为66ng/ml的EC50。
与rhCTLA-4结合的动力学分析。用Fortbio仪器和软件(Pall Corp)测定的测量关联(kon)和解离(koff)速率常数来计算C2和C5 mAb的解离常数(Kd)(表6)。将C2和C5 mAb在结合缓冲液中稀释至20ug/ml，将8只传感器在稀释的mAb溶液中浸没5分钟，用于捕获抗体。然后将传感器在封闭溶液中封闭5分钟。将重组人CTLA-4-Fc蛋白在封闭溶液中双倍连续稀释至7种不同浓度，在100nM至1.6nM的范围内变化。通过将抗体捕获传感器置于上述连续稀释的CTLA-4-Fc溶液中来开始进行动力学关联测定。将一个传感器浸入封闭溶液中作为阴性对照。结合5分钟后，将所有传感器移至封闭溶液以开始进行动力学解离测定。7分钟后停止测定。结果如表6所示。
表6结合于rhCTLA-4的C2和C5mAb的动力学分析
克隆 kon(1/Ms) koff(1/s) KD(M)
C2 5.5x 105 4.8x 10-4 8.6x 10-10
C5 2.8x 105 6.1x 10-4 2.2x 10-9
实施例6
C2 mAb阻断B7-1配体与CTLA-4的结合
通过CTLA-4结合共激活剂CD80(B7-1)和CD86(B7-2)，从而抑制T细胞的活化。为了确定所公开的mAb和B7-1或B7-2是否可以抑制彼此与CTLA-4的结合，进行体外测定以测试C2mAb是否能够抑制B7-1与CTLA-4的结合。将易普利姆玛(Ipilimumab)(百时施贵宝，美国-Bristol-Myers Squibb，USA)用作阳性对照。
将含有人重组CTLA-4-Fc(2ug/ml)的50μl、20mM NaHCO3(pH 9.7)包被在96孔板上，并在4℃孵育过夜。除去rhCTLA-4-Fc后，在37℃下，用洗涤/稀释缓冲液(TBS缓冲液，含有0.05％吐温-20，pH7.0)的100μl的3％BSA封闭平板2小时。使用生物素蛋白标记试剂盒(喜润化学-Herochem Inc.，中国)对人重组B7-1-IgG1Fc融合蛋白(R&D Systems Inc.，美国)进行生物素标记。将10ng/ml生物素-B7-1融合蛋白与结合缓冲液(TBST中的1％BSA)中不同浓度的C2mAb或易普利姆玛混合。将混合物(50ul/孔)加入到rhCTLA-4-Fc包被的平板中，并在37℃下孵育2小时。倒出溶液，将板用洗涤缓冲液洗涤3次。将碱性磷酸酶缀合的链霉亲和素(喜润化学,中国)在结合缓冲液中稀释2500倍，并以50ul/孔的比例加入到板中。将板在37℃下孵育2小时后，倒出AP-链霉亲和素溶液，并将板用洗涤缓冲液洗涤6次。以50ul/孔的比例，向板中加入碱性磷酸酶底物pNpp溶液。将板在37℃下孵育20分钟，并使用Bio-Rad酶标仪在405nm处读数。结果如图12所示。在没有C2 mAb或易普利姆玛的情况下，最大信号定义为B7-1的结合。所有样品一式两份进行检测。结果显示，C2 mAb和易普利姆玛均能够与B7-1有效竞争结合CTLA-4。C2 mAb比易普利姆玛能够更有效地抑制B7-1和CTLA-4的结合。并且在C2mAb和B7-1之间以1:1的摩尔比抑制B7-1与CTLA-4的45-50％的结合，这表明C2mAb对CTLA-4具有非常高的结合亲和力。
实施例7
C2 mAb增强PBMC IL-2的制备
T细胞激活后，淋巴细胞分泌细胞因子白介素-2(IL-2)。通过降低细胞因子IL-2的产生，CTLA-4抑制了T细胞的活性。为了测试本文公开的抗体作为T细胞活化的阳性调节剂功能，我们进行了以下实验，用来量化用所公开的抗体对CTLA-4信号阻断对T细胞IL-2产生的增强作用。
使用Accuspin制备新鲜的人外周血单核细胞(PBMC)，并用各种浓度的植物凝集素(PHA)(Sigma)刺激。在96孔板中，在分别含有L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸、25mM Hepes和具有0.1μg/ml、1μg/ml、和10μg/ml PHA以及10％FBS的200ul RPMI 1640培养基中，以1×106个细胞/ml的浓度刺激PBMC。在37℃下培养PBMC2天。洗涤细胞并在培养基中重悬至5×106个细胞/ml。用Raji细胞(ATCC)(NK抗性靶细胞系)测量IL-2的内在NK活性。在37℃，用25μg/ml的丝裂霉素C(Roche)处理Raji细胞1小时。用培养基洗涤Raji细胞4次，并在培养基中稀释至1×106个细胞/ml。用不同浓度的PHA刺激PBMC(5×105个细胞)，并向96孔培养板中加入浓度为25μg/ml的C2 mAb，并在37℃孵育平板48小时至96小时。在48小时、72小时和96小时的孵育时间点，从板上收集培养的上清液。冷冻收获的上清液，随后使用标准的ELISA方法和步骤测定IL2的量。
上述实验结果显示在图13中。用处理72小时的C2 mAb(图A)测定用不同PHA浓度刺激的PBMC所产生的IL-2(图A)。用0.1μg/ml和1μg/ml的PHA刺激，C2 mAb能够增强PBMC所产生IL-2。用10ug/ml PHA刺激的PBMC中未检测到IL-2，可能是由于快速生长的T细胞完全消耗了IL-2。在用C2mAb后处理的48小时、72小时和96小时，测定1μg/ml PHA刺激的PBMC所产生的IL-2(图B)。在C2mAb后处理的72小时和96小时观察到了C2mAb对CTLA-4信号阻断的作用。
实施例8
C2 mAb与rhCTLA-4结合的处理增强了对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抗体反应。
乙型肝炎表面抗原(HBsAg)可以免疫灵长目动物，并在这些灵长类动物中产生抗HBsAg的强中和抗体。CTLA-4是体内免疫应答的负调节因子。因此，在食蟹猴中检测了本文公开的C2mAb对HBsAg疫苗抗体应答的增强能力。在第1天和第29天以10mg/kg的剂量静脉内向两组4只猴子(两只雄性和两只雌性)施用对照人IgG1(抗Her2 mAb)或抗CTLA-4 mAb C2。在PBS中以5mg/ml的浓度制备抗体，并使用0.22um过滤器灭菌。在第2和第30天，用10ug/每个HBsAg(Engerix-B，购自GlaxoSmithKline，中国)肌内免疫所有猴子。使用标准的ELISA方法和步骤，在第1、35和49天测定抗HBsAg的血浆水平。简而言之，用200mM NaHCO3(pH9.6)将HBsAg稀释至2ug/ml，并在4℃下在96孔微孔板上包被过夜。除去HBsAg，用TBST(含有0.05％吐温-20的TBS)洗涤平板三次。在37℃，用含3％BSA的100μl TBST封闭板1小时。使用血浆混合物对抗HBsAg的抗体进行滴度测定。使用来自同一组中每只猴子的5ul血浆制备血浆混合物。将混合物在结合缓冲液(TBST中的1％BSA)中稀释至100、500、2500和12500倍。除去封闭缓冲液后，将混合物加入到96孔板中，并在37℃下孵育2小时。为了比较抗HBsAg抗体的量，将每只猴子的血浆在结合缓冲液中稀释1000倍，并加入到96孔板中，并在37℃下孵育2小时。将C2mAb处理到第49天的猴子血浆混合物作为参考标准，将抗HBsAg抗体的浓度设定为2500单位/ml。孵育2小时后，除去所有血浆，用TBST洗板3次。向板中加入2000倍稀释的山羊抗猴IgG，并在37℃下孵育2小时。洗涤板6次，加入50μl/孔的pNpp底物(南方生物-SouthernBiotech，中国)，并在室温下温育，然后使用酶标仪(Bio-Rad)在405nm读板。所有样品一式两份进行检测。滴定度的测定结果和量的比较结果分别如图14A和14B所示。结果表示同一组中四只猴子的平均值。这些结果证明了，本文公开的C2mAb能够增强针对灵长类动物中的病毒免疫的体内免疫应答。
序列表
<110> 蔡则玲
<120> CTLA-4抗体及其用途
<130> P2015-1260
<160> 72
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 327
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
gatgttgtga tgactcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aggagccaca 60
ctctcctgca gggccagtca acatgttatc agcagctact tagcctggta tcagcaaaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcgtctac ggtgcatcca gtagggacac tggcgtctca 180
gacaggttca ctggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ctgcggtgta tttctgtcag cagtatggta catcaccgtg gacgttcggc 300
caagggacca agctggagat caaacgt 327
<210> 2
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Gly Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln His Val Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Val Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Asp Thr Gly Val Ser Asp Arg Phe Thr
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 3
<211> 333
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
cagtctgccc tgactcagtc tgcctccgtg tctggatttc ctggacagtc gatcaccgtc 60
tcctgcgttg gaaccaacag tgatgttgag gcttatgacc tcgtctcctg gtaccgacaa 120
cacccagaca agtcccccaa cctcctaatt tatgacaact ataagcgacc ctcaggggtt 180
tctgatcgct tctctgcctt caaatctgga aacacggcct ccctgaccat ttctggcctc 240
caggctgaag acgaggctta ttattactgc tgctcttatg caggtttttc cacctggatc 300
ttcggcgcgg ggacccagct caccgtttta ggt 333
<210> 4
<211> 111
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Ser Ala Ser Val Ser Gly Phe Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Val Ser Cys Val Gly Thr Asn Ser Asp Val Glu Ala Tyr
20 25 30
Asp Leu Val Ser Trp Tyr Arg Gln His Pro Asp Lys Ser Pro Asn Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asp Asn Tyr Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Ala Phe Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Tyr Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Phe
85 90 95
Ser Thr Trp Ile Phe Gly Ala Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 5
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gaccaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacag 120
cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgaggtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180
tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata gaagcagcgg cactccttat 300
gtcttcggaa ctgggaccaa gctgaccgtc ctaggt 336
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 6
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Thr Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Arg Ser Ser
85 90 95
Gly Thr Pro Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 7
<211> 354
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 7
caggtccagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtag gcaatattat 180
gctgactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagacg attccaagaa cacgatgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaagac acggctgttt attactgtgc gagaggggga 300
ttttgggggg cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 8
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Arg Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Met Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Phe Trp Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 9
caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggatt cagtttcccc aactactaca tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcagcccta ccggtggtag cagaacgtac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccata accagggaca cgtccacgag cacagtctat 240
atggagttga gcagcctgag atctgaggac acggccgtct attactgtgc gagagaaatg 300
tacaactgga acggaggttg ggactacggt atggacgtct ggggccaagg aaccctggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 10
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Pro Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Ser Pro Thr Gly Gly Ser Arg Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Met Tyr Asn Trp Asn Gly Gly Trp Asp Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 11
caggtgcagc tggtgcagtc cggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatact 300
gctatggcac tattctacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg caccctggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 12
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Thr Ala Met Ala Leu Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 13
<211> 285
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 13
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctca 285
<210> 14
<211> 294
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 14
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaga 294
<210> 15
<211> 291
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 15
cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccaacag tgatgttggg agttataacc ttgtctcctg gtaccaacag 120
cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgagggca gtaagcggcc ctcaggggtt 180
tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgacaat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc tgctcatatg caggtagtag c 291
<210> 16
<211> 294
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 16
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaga 294
<210> 17
<211> 291
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 17
cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacag 120
cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgaggtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180
tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata gaagcagcag c 291
<210> 18
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 19
<211> 95
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 19
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser
85 90 95
<210> 20
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Gly Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 21
<211> 97
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 21
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr
20 25 30
Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser
85 90 95
Ser
<210> 22
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 23
<211> 97
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 23
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
actgtggccg ctccatctgt c 21
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 25
Arg Ala Ser Gln His Val Ile Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 26
Gly Ala Ser Ser Arg Asp Thr
1 5
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 27
Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro Trp Thr Phe
1 5 10
<210> 28
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 28
Val Gly Thr Asn Ser Asp Val Glu Ala Tyr Asp Leu Val Ser
1 5 10
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 29
Asp Asn Tyr Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 30
Cys Ser Tyr Ala Gly Phe Ser Thr Trp Ile Phe
1 5 10
<210> 31
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 31
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 32
Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 33
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 33
Ser Ser Tyr Arg Ser Ser Gly Thr Pro Tyr Val Phe
1 5 10
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 34
Ser Tyr Gly Met His
1 5
<210> 35
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 35
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Arg Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 36
Gly Gly Phe Trp Gly Ala Phe Asp Ile
1 5
<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 37
Asn Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 38
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 38
Ile Ile Ser Pro Thr Gly Gly Ser Arg Thr Tyr Ala Gln Lys
1 5 10
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 39
Glu Met Tyr Asn Trp Asn Gly Gly Trp Asp Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 40
Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 41
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 41
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys
1 5 10
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 42
Asp Thr Ala Met Ala Leu Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
cgcaaatggg cggtaggcgt g 21
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
gccggtggcg gtggccacc 19
<210> 45
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
ggtggccacc gccaccggcc aggtccagct ggtgcagtc 39
<210> 46
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
gctaggcccc tttgttgatg ctgaggagac ggtgaccatt g 41
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
gcatcaacaa aggggcctag c 21
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
aactagaagg cacagtcgag gc 22
<210> 49
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
ggtggccacc gccaccggcc aggtgcagct ggtgcaatc 39
<210> 50
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
gctaggcccc tttgttgatg ctgaggagac ggtgaccagg 40
<210> 51
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
gctaggcccc tttgttgatg ctgaggagac ggtgaccagg 40
<210> 52
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
ggtggccacc gccaccggcg atgttgtgat gactcagtc 39
<210> 53
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
gacagatgga gcggccacag tacgtttgat ctccagcttg g 41
<210> 54
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
ggtggccacc gccaccggcc agtctgccct gactcagtc 39
<210> 55
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
gggttggcct tgggctgacc taaaacggtg agctgg 36
<210> 56
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
ggtggccacc gccaccggcc agtctgccct gactcagc 38
<210> 57
<211> 37
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 57
gggttggcct tgggctgacc taggacggtc agcttgg 37
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 58
ggtcagccca aggccaaccc 20
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 60
<211> 1392
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 60
atgggctggt cctgcatcat cctgttcctg gtggccaccg ccaccggcca ggtccagctg 60
gtgcagtctg ggggaggcgt ggtccagcct gggaggtccc tgagactctc ctgtgcagcg 120
tctggattca ccttcagtag ctatggcatg cactgggtcc gccaggctcc aggcaagggg 180
ctggagtggg tggcagttat atggtatgat ggaagtaggc aatattatgc tgactccgtg 240
aagggccgat tcaccatctc cagagacgat tccaagaaca cgatgtatct gcaaatgaac 300
agcctgagag ccgaagacac ggctgtttat tactgtgcga gagggggatt ttggggggct 360
tttgatatct ggggccaagg gacaatggtc accgtctcct cagcatcaac aaaggggcct 420
agcgtgtttc cactggcccc ctctagtaaa tccacctctg gcggaacagc agccctgggt 480
tgtctggtga aggactactt cccagagccc gtcactgtga gctggaactc cggcgccctg 540
acaagcggag tccatacttt tcctgctgtg ctgcagtcaa gcgggctgta ctccctgtcc 600
tctgtggtca ctgtcccaag ttcaagcctg ggtactcaga cctatatctg caacgtgaat 660
cacaagccaa gcaataccaa agtcgacaag aaagtggagc ccaagtcctg tgataaaaca 720
catacttgcc ccccttgtcc tgcaccagaa ctgctgggag gtccatccgt gttcctgttt 780
ccacccaagc ctaaagacac cctgatgatt tctcggactc cagaggtcac ctgcgtggtc 840
gtggacgtga gccacgagga tcccgaagtc aagttcaact ggtacgtgga tggcgtcgaa 900
gtgcataatg ctaagacaaa accacgggag gaacagtaca actccactta tcgcgtcgtg 960
tctgtcctga ccgtgctgca ccaggattgg ctgaacggca aggagtataa gtgcaaagtg 1020
tccaataagg ctctgcccgc acctatcgag aaaacaattt ctaaggctaa aggacagcct 1080
agagaaccac aggtgtacac tctgcctcca tctcgggagg aaatgaccaa gaaccaggtc 1140
agtctgacat gtctggtgaa aggcttctat cccagcgaca tcgcagtgga gtgggaatcc 1200
aatggacagc ctgagaacaa ttacaagacc acaccccctg tgctggactc tgatggcagt 1260
ttctttctgt atagtaagct gaccgtggat aaatcaaggt ggcagcaggg aaacgtcttt 1320
agttgttcag tgatgcacga agcactgcat aatcactaca cccagaagtc actgtcactg 1380
tccccaggat ga 1392
<210> 61
<211> 463
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 61
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
20 25 30
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
35 40 45
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
50 55 60
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Arg Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
65 70 75 80
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Met Tyr
85 90 95
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Ala Arg Gly Gly Phe Trp Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
130 135 140
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
145 150 155 160
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
165 170 175
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
180 185 190
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
210 215 220
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
225 230 235 240
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
245 250 255
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
260 265 270
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
275 280 285
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
290 295 300
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
305 310 315 320
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
325 330 335
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
340 345 350
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
355 360 365
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
370 375 380
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
385 390 395 400
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
405 410 415
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
420 425 430
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
435 440 445
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450 455 460
<210> 62
<211> 696
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 62
atgggctggt cctgcatcat cctgttcctg gtggccaccg ccaccggcga tgttgtgatg 60
actcagtctc caggcaccct gtctttgtct ccaggggaag gagccacact ctcctgcagg 120
gccagtcaac atgttatcag cagctactta gcctggtatc agcaaaaacc tggccaggct 180
cccaggctcc tcgtctacgg tgcatccagt agggacactg gcgtctcaga caggttcact 240
ggcagtgggt ctgggacaga cttcactctc accatcagca gactggagcc tgaagattct 300
gcggtgtatt tctgtcagca gtatggtaca tcaccgtgga cgttcggcca agggaccaag 360
ctggagatca aacgtactgt ggccgctcca tctgtcttca tttttccacc cagtgacgaa 420
cagctgaagt ccgggacagc tagcgtggtc tgtctgctga acaattttta ccccagggaa 480
gccaaagtgc agtggaaggt cgataacgct ctgcagtctg gaaatagtca ggagtcagtg 540
acagaacagg actccaaaga tagcacttat tctctgtcta gtaccctgac actgagcaag 600
gcagactacg agaagcataa agtgtatgcc tgtgaagtca ctcatcaggg gctgtccagt 660
cccgtcacaa aatcctttaa tcgtggcgaa tgttga 696
<210> 63
<211> 231
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 63
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
20 25 30
Glu Gly Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln His Val Ile Ser Ser
35 40 45
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
50 55 60
Val Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Asp Thr Gly Val Ser Asp Arg Phe Thr
65 70 75 80
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
85 90 95
Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro
100 105 110
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
115 120 125
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
130 135 140
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
145 150 155 160
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
165 170 175
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
180 185 190
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
195 200 205
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
210 215 220
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 64
<211> 1410
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 64
atgggctggt cctgcatcat cctgttcctg gtggccaccg ccaccggcca ggtgcagctg 60
gtgcaatctg gggctgaggt gaagaagcct ggggcctcag tgaaggtttc ctgcaaggca 120
tctggattca gtttccccaa ctactacatg cactgggtgc gacaggcccc tggacaaggg 180
cttgagtgga tgggaataat cagccctacc ggtggtagca gaacgtacgc acagaagttc 240
cagggcagag tcaccataac cagggacacg tccacgagca cagtctatat ggagttgagc 300
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ggaggttggg actacggtat ggacgtctgg ggccaaggaa ccctggtcac cgtctcctca 420
gcatcaacaa aggggccttc cgtgtttcca ctggccccct ctagtaaaag cacctctggc 480
ggaacagcag ccctgggttg tctggtgaag gactacttcc cagagccagt caccgtgtcc 540
tggaacagcg gcgccctgac atccggagtc catacttttc ctgctgtgct gcagtcatcc 600
gggctgtaca gcctgagctc tgtggtcact gtcccaagtt catccctggg tactcagacc 660
tatatctgca acgtgaatca caagccatcc aataccaaag tggacaagaa agtggagccc 720
aagagctgtg ataaaacaca tacttgcccc ccttgtcctg caccagaact gctgggaggt 780
ccatccgtgt tcctgtttcc acccaagcct aaagacaccc tgatgatttc tcgaactcca 840
gaggtcacct gcgtggtcgt ggacgtgtcc cacgaggacc ccgaagtcaa gttcaactgg 900
tacgtggatg gcgtcgaagt gcataatgct aagacaaaac caagagagga acagtacaac 960
agcacttatc gcgtcgtgtc tgtcctgacc gtgctgcacc aggattggct gaacggcaag 1020
gagtataagt gcaaagtgag caataaggct ctgcccgcac ctatcgagaa aacaatttct 1080
aaggctaaag gacagcctag ggaaccacag gtgtacactc tgcctccatc tcgggaggaa 1140
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gcagtggagt gggaaagcaa tggacagcct gagaacaatt acaagaccac accccctgtg 1260
ctggactctg atggcagttt ctttctgtat agtaagctga ccgtggataa atcacggtgg 1320
cagcagggaa atgtctttag ttgttcagtg atgcacgaag cactgcacaa tcactacact 1380
cagaaatcac tgtcactgtc cccagggtaa 1410
<210> 65
<211> 469
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 65
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
20 25 30
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Pro Asn Tyr
35 40 45
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
50 55 60
Gly Ile Ile Ser Pro Thr Gly Gly Ser Arg Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
65 70 75 80
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
85 90 95
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Ala Arg Glu Met Tyr Asn Trp Asn Gly Gly Trp Asp Tyr Gly Met Asp
115 120 125
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly
465
<210> 66
<211> 699
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 66
atgggctggt cctgcatcat cctgttcctg gtggccaccg ccaccggcca gtctgccctg 60
actcagtctg cctccgtgtc tggatttcct ggacagtcga tcaccgtctc ctgcgttgga 120
accaacagtg atgttgaggc ttatgacctc gtctcctggt accgacaaca cccagacaag 180
tcccccaacc tcctaattta tgacaactat aagcgaccct caggggtttc tgatcgcttc 240
tctgccttca aatctggaaa cacggcctcc ctgaccattt ctggcctcca ggctgaagac 300
gaggcttatt attactgctg ctcttatgca ggtttttcca cctggatctt cggcgcgggg 360
acccagctca ccgttttagg tcagcccaag gccaacccca ccgtgaccct gttcccccct 420
tcctccgagg agctgcaggc caacaaggcc accctggtgt gcctgatctc cgacttctac 480
cccggcgctg tgaccgtcgc ttggaaagcc gatggctccc ccgtgaaggc tggagtggag 540
accaccaagc cctccaagca gtccaacaac aagtacgccg ctagctccta cctgagcctg 600
acccccgagc agtggaagtc ccacaggtcc tactcctgcc aggtgaccca cgagggctcc 660
accgtggaga agaccgtggc tcccaccgag tgcagctaa 699
<210> 67
<211> 232
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 67
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Ser Ala Ser Val Ser Gly Phe Pro Gly Gln
20 25 30
Ser Ile Thr Val Ser Cys Val Gly Thr Asn Ser Asp Val Glu Ala Tyr
35 40 45
Asp Leu Val Ser Trp Tyr Arg Gln His Pro Asp Lys Ser Pro Asn Leu
50 55 60
Leu Ile Tyr Asp Asn Tyr Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe
65 70 75 80
Ser Ala Phe Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
85 90 95
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Tyr Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Phe
100 105 110
Ser Thr Trp Ile Phe Gly Ala Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly Gln
115 120 125
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
130 135 140
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
165 170 175
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
180 185 190
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
195 200 205
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
210 215 220
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225 230
<210> 68
<211> 1410
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 68
atgggctggt cctgcatcat cctgttcctg gtggccaccg ccaccggcca ggtgcagctg 60
gtgcagtccg gggctgaggt gaagaagcct gggtcctcgg tgaaggtctc ctgcaaggct 120
tctggaggca ccttcagcag ctatgctatc agctgggtgc gacaggcccc tggacaaggg 180
cttgagtgga tgggagggat catccctatc tttggtacag caaactacgc acagaagttc 240
cagggcagag tcacgattac cgcggacgaa tccacgagca cagcctacat ggagctgagc 300
agcctgagat ctgaggacac ggccgtgtat tactgtgcga gagatactgc tatggcacta 360
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gcatcaacaa aggggcctag cgtgtttcca ctggccccct ctagtaaatc cacctctggc 480
ggaacagcag ccctgggttg tctggtgaag gactacttcc cagagcccgt cactgtgagc 540
tggaactccg gcgccctgac aagcggagtc catacttttc ctgctgtgct gcagtcaagc 600
gggctgtact ccctgtcctc tgtggtcact gtcccaagtt caagcctggg tactcagacc 660
tatatctgca acgtgaatca caagccaagc aataccaaag tcgacaagaa agtggagccc 720
aagtcctgtg ataaaacaca tacttgcccc ccttgtcctg caccagaact gctgggaggt 780
ccatccgtgt tcctgtttcc acccaagcct aaagacaccc tgatgatttc tcggactcca 840
gaggtcacct gcgtggtcgt ggacgtgagc cacgaggatc ccgaagtcaa gttcaactgg 900
tacgtggatg gcgtcgaagt gcataatgct aagacaaaac cacgggagga acagtacaac 960
tccacttatc gcgtcgtgtc tgtcctgacc gtgctgcacc aggattggct gaacggcaag 1020
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aaggctaaag gacagcctag agaaccacag gtgtacactc tgcctccatc tcgggaggaa 1140
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gcagtggagt gggaatccaa tggacagcct gagaacaatt acaagaccac accccctgtg 1260
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cagcagggaa acgtctttag ttgttcagtg atgcacgaag cactgcataa tcactacacc 1380
cagaagtcac tgtcactgtc cccaggatga 1410
<210> 69
<211> 469
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 69
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
20 25 30
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
35 40 45
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
50 55 60
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
65 70 75 80
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
85 90 95
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Ala Arg Asp Thr Ala Met Ala Leu Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
115 120 125
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly
465
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<211> 702
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 70
atgggctggt cctgcatcat cctgttcctg gtggccaccg ccaccggcca gtctgccctg 60
actcagcctg cctccgtgtc tgggtctcct ggacagtcga ccaccatctc ctgcactgga 120
accagcagtg acgttggtgg ttataactat gtctcctggt accaacagca cccaggcaaa 180
gcccccaaac tcatgattta tgaggtcagt aatcggccct caggggtttc taatcgcttc 240
tctggctcca agtctggcaa cacggcctcc ctgaccatct ctgggctcca ggctgaggac 300
gaggctgatt attactgcag ctcatataga agcagcggca ctccttatgt cttcggaact 360
gggaccaagc tgaccgtcct aggtcagccc aaggccaacc ccaccgtgac cctgttcccc 420
ccttcctccg aggagctgca ggccaacaag gccaccctgg tgtgcctgat ctccgacttc 480
taccccggcg ctgtgaccgt cgcttggaaa gccgatggct cccccgtgaa ggctggagtg 540
gagaccacca agccctccaa gcagtccaac aacaagtacg ccgctagctc ctacctgagc 600
ctgacccccg agcagtggaa gtcccacagg tcctactcct gccaggtgac ccacgagggc 660
tccaccgtgg agaagaccgt ggctcccacc gagtgcagct aa 702
<210> 71
<211> 233
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 71
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
20 25 30
Ser Thr Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
35 40 45
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
50 55 60
Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
65 70 75 80
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
85 90 95
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Arg Ser Ser
100 105 110
Gly Thr Pro Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
115 120 125
Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
130 135 140
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val
165 170 175
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
180 185 190
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
195 200 205
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
210 215 220
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225 230
<210> 72
<211> 294
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 72
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaga 294

Claims (51)

1.一种分离的特异性结合于人CTLA-4的人抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述抗体包括：
重链可变区，所述重链可变区包括3个互补决定区(CDR)：SEQ ID NO.:34所示的VHCDR1、SEQ ID NO.:35所示的VH CDR2、以及SEQ ID NO.:36所示的VH CDR3；和
轻链可变区，所述轻链可变区包括3个CDR：SEQ ID NO.:25所示的VLCDR1、SEQ ID NO.:26所示的VL CDR2、以及SEQ ID NO.:27所示的VLCDR3。
2.一种分离的特异性结合于人CTLA-4的人抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述抗体包括：
重链可变区，所述重链可变区包括3个CDR：SEQ ID NO.:37所示的VHCDR1、SEQ ID NO.:38所示的VH CDR2、以及SEQ ID NO.:39所示的VH CDR3；和
轻链可变区，所述轻链可变区包括3个CDR：SEQ ID NO.:28所示的VLCDR1、SEQ ID NO.:29所示的VL CDR2、以及SEQ ID NO.:30所示的VLCDR3。
3.一种分离的特异性结合于人CTLA-4的人抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述抗体包括：
重链可变区，所述重链可变区包括3个CDR：SEQ ID NO.:40所示的VHCDR1、SEQ ID NO.:41所示的VH CDR2、以及SEQ ID NO.:42所示的VH CDR3；和
轻链可变区，所述轻链可变区包括3个CDR：SEQ ID NO.:31所示的VLCDR1、SEQ ID NO.:32所示的VL CDR2、以及SEQ ID NO.:33所示的VLCDR3。
4.如权利要求1、2和3中任一所述的抗体，其特征在于，所述抗体为IgG1抗体。
5.如权利要求4所述的抗体，其特征在于，所述抗体为IgG1、κ或IgG1、λ抗体。
6.如权利要求1、2和3中任一所述的抗体，其特征在于，所述抗体为单链抗体(scFv)。
7.如权利要求6所述的scFv，其特征在于，包括重链可变区以及轻链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO.:8所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列。
8.如权利要求6所述的scFv，其特征在于，包括重链可变区以及轻链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO.:10所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO.:4所示的氨基酸序列。
9.如权利要求6所述的scFv，其特征在于，包括重链可变区以及轻链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO.:12所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO.:6所示的氨基酸序列。
10.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述重链可变区包括：
(i)如SEQ ID NO.:8所示的氨基酸序列，
(ii)由核酸编码的氨基酸序列，所述核酸包括SEQ ID NO.:7所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO.:7简并的核苷酸序列，
(iii)由核酸编码的人IgG重链可变区，所述核酸包括SEQ ID NO.:72所示序列的V基因片段VH3-33，或
(iv)与(i)、(ii)或(iii)具有至少90％同源性，例如至少95％、至少98％、或至少99％同源性的氨基酸序列。
11.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述轻链可变区包括：
(i)如SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列，
(ii)由核酸编码的氨基酸序列，所示核酸包括SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO.:1简并的核苷酸序列，
(iii)由核酸编码的人κ轻链可变区，所示核酸包括SEQ ID NO.:13所示序列的V基因片段KV3-20，或
(iv)与(i)、(ii)或(iii)具有至少90％同源性，例如至少95％、至少98％、或至少99％同源性的氨基酸序列。
12.如权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述重链可变区包括：
(i)SEQ ID NO.:10所示的氨基酸序列，
(ii)由核酸编码的氨基酸序列，所述核酸包括SEQ ID NO.:9所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO.:9简并的核苷酸序列，
(iii)由核酸编码的人IgG重链可变区，所述核酸包括SEQ ID NO.:14所示序列的V基因片段VH 1-46，或
(iv)与(i)、(ii)或(iii)具有至少90％同源性，例如至少95％、至少98％、或至少99％同源性的氨基酸序列。
13.如权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述轻链可变区包括：
(i)SEQ ID NO.:4所示的氨基酸序列，
(ii)由核酸编码的氨基酸序列，所述核酸包括SEQ ID NO.:3所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO.:3简并的核苷酸序列，
(iii)由核酸编码的人IgG重链可变区，所述核酸包括SEQ ID NO.:15所示序列的V基因片段LV 2-23，或
(iv)与(i)、(ii)或(iii)具有至少90％同源性，例如至少95％、至少98％、或至少99％同源性的氨基酸序列。
14.如权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述重链可变区包括：
(i)SEQ ID NO.:12所示的氨基酸序列，
(ii)由核酸编码的氨基酸序列，所述核酸包括SEQ ID NO.:11所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO.:11简并的核苷酸序列，
(iii)由核酸编码的人IgG重链可变区，所述核酸包括SEQ ID NO.:16所示序列的V基因片段VH 1-69，或
(iv)与(i)、(ii)或(iii)具有至少90％同源性，例如至少95％、至少98％、或至少99％同源性的氨基酸序列。
15.如权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述轻链可变区包括：
(i)SEQ ID NO.:6所示的氨基酸序列，
(ii)由核酸编码的氨基酸序列，所述核酸包括SEQ ID NO.:5所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO.:5简并的核苷酸序列，
(iii)由核酸编码的人IgG重链可变区，所述核酸包括SEQ ID NO.:17所示序列的V基因片段LV 2-14，或
(iv)与(i)、(ii)或(iii)具有至少90％同源性，例如至少95％、至少98％、或至少99％同源性的氨基酸序列。
16.一种宿主细胞系，其特征在于，所述宿主细胞系产生权利要求1-12任一所述的抗体。
17.如权利要求13所述的宿主细胞系，其特征在于，所述宿主细胞系为CHO细胞系。
18.一种分离的核苷酸，其特征在于，包括编码权利要求1-12任一所述的抗体的氨基酸序列的核苷酸序列。
19.一种分离的核苷酸，其特征在于，包括：
(i)选自SEQ ID NO.:7、9和11的核苷酸序列，
(ii)与(i)具有至少90％同源性，例如至少95％、至少98％、或至少99％同源性的核苷酸序列，
(iii)编码选自SEQ ID NO.:8、10和12的抗体重链可变区氨基酸序列的核苷酸序列，
(iv)与(i)、(ii)或(iii)简并的核苷酸序列。
20.一种分离的核苷酸，其特征在于，包括：
(i)选自SEQ ID NO.:1、3和5的核苷酸序列，
(ii)与(i)具有至少90％同源性，例如至少95％、至少98％、或至少99％同源性的核苷酸序列，
(iii)编码选自SEQ ID NO.:2、4和6的抗体重链可变区氨基酸序列的核苷酸序列，
(iv)与(i)、(ii)或(iii)简并的核苷酸序列。
21.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1-12任一所述的抗体，和药学上可接受的载体。
22.如权利要求21所述的药物组合物，其特征在于，还包括一种或多种额外的治疗剂。
23.如权利要求22所述的药物组合物，其特征在于，所述额外的治疗剂有效诱导针对肿瘤的免疫应答。
24.如权利要求22所述的药物组合物，其特征在于，所述额外的治疗剂为化学治疗剂。
25.如权利要求22所述的药物组合物，其特征在于，所述额外的治疗剂为作为免疫检查点抑制剂的抗体，包括但并不限于，针对PD-1、PD-L1或PD-L2的抗体。
26.一种治疗一对象中CTLA-4相关疾病的方法，其特征在于，包括向所述对象施用治疗有效量的权利要求21所述的药物组合物。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，还包括向所述个体施用一种或多种额外的治疗剂。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述额外的治疗剂有效诱导针对肿瘤的免疫应答。
29.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述额外的治疗剂为化学治疗剂。
30.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所额外治疗剂为作为免疫检查点抑制剂的抗体，包括但并不限于，针对PD-1、PD-L1或PD-L2的抗体。
31.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述额外治疗剂为疫苗，包括但并不限于，GM-CSF修饰的肿瘤载体疫苗或抗原负载的树突细胞疫苗。
32.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述CTLA-4相关疾病为T细胞介导的自身免疫性疾病。
33.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述CTLA-4相关疾病为癌症。
34.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述CTLA-4相关疾病选自下组：黑素瘤、非小细胞肺癌、或前列腺癌。
35.一种抑制CTLA-4活化表达CTLA-4肽的细胞的能力的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1-12任一所述的抗体与所述细胞接触。
36.一种权利要求1-12任一所述的抗体、或权利要求18所述药物组合物的用途，其特征在于，用于体外或体内检测样品中是否存在人CTLA-4抗原，从而用于诊断CTLA-4相关疾病。
37.如权利要求36所述的用途，其特征在于，所述CTLA-4相关疾病为T细胞介导的自身免疫性疾病。
38.如权利要求36所述的用途，其特征在于，所述CTLA-4相关疾病为癌症。
39.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述CTLA-4相关疾病选自下组：黑素瘤、非小细胞肺癌、或前列腺癌。
40.一种权利要求1-12任一所述的抗体、或权利要求18所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于治疗CTLA-4相关疾病。
41.如权利要求40所述的用途，其特征在于，所述CTLA-4相关疾病为T细胞介导的自身免疫性疾病。
42.如权利要求40所述的用途，其特征在于，所述CTLA-4相关疾病为癌症。
43.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述CTLA-4相关疾病选自下组：黑素瘤、非小细胞肺癌、或前列腺癌。
44.一种权利要求1-12任一所述的抗体的用途，其特征在于，用于制备治疗CTLA-4相关疾病的药物。
45.如权利要求44所述的用途，其特征在于，所述CTLA-4相关疾病为T细胞介导的自身免疫性疾病。
46.如权利要求44所述的用途，其特征在于，所述CTLA-4相关疾病为癌症。
47.如权利要求44所述的用途，其特征在于，所述CTLA-4相关疾病选自下组：黑素瘤、非小细胞肺癌、或前列腺癌。
48.一种权利要求1-12任一所述抗体的用途，其特征在于，用于抑制CTLA-4活化表达CTLA-4肽的细胞的能力。
49.一种诱导、增强或延长患者对抗原的免疫应答的方法，其特征在于，包括施用治疗有效量的权利要求18所述的药物组合物，其中，所述药物组合物阻断人CTLA-4与人B7配体的结合。
50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述抗原为肿瘤抗原或来自病原体的抗原。
51.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述抗原为乙肝表面抗原。
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