ÁCIDOS ALFA-IMINO CARBOXÍLICOS N-SUSTITUIDOS CÍCLICOS PARA LA INHIBICIÓN SELECTIVA DE LA COLAGENASA La invención se refiere al uso de ácidos alfa-imino carboxílicos N-sustituidos cíclicos de la fórmula I para la inhibición selectiva de la colagenasa (MMP-13) . Los compuestos de la fórmula I pueden por consiguiente emplearse para el tratamiento de padecimientos degenerativos de las-articulaciones . En padecimientos tales como osteoartritis y reuma existe una destrucción de la articulación causada en particular por la degradación proteolitica de la colágena por colagenasas. Las colagenasas pertenecen a la superfamilia de las metaloproteínasas (MP) o metaloproteinasas de matriz (MMP) . Las MMPs forman un grupo de enzimas dependientes de Zn que participan en la degradación biológica de la matriz extracelular (D. Yip y colaboradores en Investigational New Drugs 17 (1999), 387-399 y Michaelides y colaboradores en Current Pharmaceutical Design 5 (1999) 787-819) . Estas MMPs pueden en particular degradar la colágena fibrilar y no fibrilar, y los proteoglicanos, ambos representando constituyentes importantes de matrix. Las MMPs participan en procesos de curación de heridas, de invasión tumoral, de migración de metástasis y en la angiogénesis , esclerosis múltiple, insuficiencia cardiaca y aterosclerosis (Michaelides página 788; véase arriba). En particular, desempeñan una función importante en la degradación de la matriz de las articulaciones en artrosis y artritis, ya sea osteoartrosis, osteoartritis o artritis reumatoide. Un subgrupo seleccionado dentro de las MMPs es formado, por ejemplo, por colagenasas. Solamente las colagenasas pueden degradar la colágena nativa que, después de todo, desempeña una función de soporte importante en la matriz. Este subgrupo consiste de colagenasa intersticial MMP-1, o bien de neutrofilo colagenasa MMP-8, y de MMP-13 que fue identificado solamente posteriormente. Fue virtualmente imposible detectar MMP-13 en el cuerpo de individuos adultos sanos; es expresada solamente durante el transcurso de enfermedades, por ejemplo, en células cancerosas o ulceras. Se ha detectado también MMP-13 en la matriz de articulaciones de personas y mamíferos artróticos, especialmente en artrosis químicamente avanzada mientras que no ocurre en el tejido de las articulaciones de adultos sanos. La inhibición de MMP-13 por medio de inhibidores apropiados es por consiguiente particularmente adecuada para controlar dichas enfermedades. Se conoce un gran número de inhibidores diferentes de MMPs y de colagenasas (EP 0 606 046; W094/28889; 096/27583) . Se sabe también que ácidos alfa-imino hidroxámicos y carboxílicos N-sustituidos cíclicos y heterocíclicos son inhibidores de metaloproteinasas (EP 0 861 236). Después de estudios clínicos iniciales en seres humanos, se ha determinado ahora que M Ps provocan efectos colaterales. Los efectos colaterales que son mencionados principalmente son dolor músculo-esqueletal o artralgias. Se espera de manera no ambigua de la técnica anterior que inhibidores selectivos podrán reducir estos efectos colaterales (Yip, página 387, véase arriba) . Una desventaja de inhibidores conocidos de MMPs es por consiguiente frecuentemente la falta de especificidad de la inhibición para solamente una clase de MMPs. Asi, la mayoría de los inhibidores de MMP inhiben varias MMPs simultáneamente puesto que las MMPs tienen un dominio catalítico de estructura similar. Por consiguiente, los inhibidores actúan en forma no deseada sobre muchas enzimas, aún las enzimas que tienen una función vital (Massova I y colaboradores, The FASEB Journal (1998) 12, 1075-1095). La Solicitud WO 97/18194 (EP 0 861 236) ya ha descrito ácidos alfa-imino carboxílicos y ácidos alfa-imino hidroxámicos N-sustituidos cíclicos y heterocíclicos que tienen un fuerte efecto de inhibición sobre MMP-3 y MMP-8. Los compuestos divulgados por la descripción en los ejemplos WO 97/18194 muestran también un efecto inhibidor fuerte sobre MMP-13, que se ha encontrado a través de nuestras propias mediciones. En el esfuerzo para encontrar compuestos efectivos para el tratamiento de padecimientos de tejido conectivo, se ha encontrado ahora que los compuestos empleados de conformidad con la invención son inhibidores fuertes de las metaloproteinasa de matriz 13, mientras que los compuestos empleados de conformidad con la invención son esencialmente ineficaces para MMPS3 y 8. Estos compuestos empleados de conformidad con la presente invención son por consiguiente más adecuados en una forma mucho más enfocada para el tratamiento selectivo de dichas enfermedades que los compuestos divulgados y descritos en los ejemplos en WO 97/18194, que inhiben otras MMPs además de MMP-13. Por consiguiente, se espera que estos inhibidores selectivos presenten un rango considerablemente mejorado de efectos colaterales para el tratamiento de tales enfermedades. La invención se refiere por consiguiente al uso de compuestos de la fórmula I
y/o todas las formas estereoisoméricas del compuesto de la fórmula I y/o mezclas de estas formas en cualquier proporción, y/o una sal fisiológicamente tolerada del compuesto de la fórmula I para la producción de un fármaco para la profilaxis y la terapia de padecimientos en los cuales participa una actividad incrementada de la metaloproteinasa de matriz 13, en donde A es un átomo de carbono o un átomo de nitrógeno, en donde A es insustituido o bien está sustituido por -alquilo (C1-C4) , n es los números enteros 1 ó 2, Rl es 1. -alquilo (C1-C10) , en donde alquilo es lineal o ramificado, 2. -alquenilo (C2-C10) en donde alquenilo es lineal o ramificado, 3. -alquinilo (C2-C10) en donde alquinilo es lineal o ramificado, 4. -alquilfenilo (C1-C4) , 5. -alquilo (C1-C ) -cicloalquilo (C3-C7) , 6. -cicloalquilo (C3-C7) o bien 7. -CH2CF3, y R2 es un átomo de hidrógeno o bien -alquilo (C1-C4) . La invención se refiere además al uso de compuestos de la fórmula I, en donde A es un átomo de carbono o un átomo de nitrógeno, en donde A está insustituido o bien está sustituido por metilo, n es los números enteros 1 6 2, Rl es 1. -alquilo (C2-C6) , en donde alquilo es lineal o ramificado 2. -CH;-fenilo, ó 3. -CH:-ciclopropilo, y R2 es un átomo de hidrógeno o metilo. La invención se refiere además al uso de compuestos fórmula II, en donde
Rl es 1. -alquilo (C;-C,), en donde alquilo es lineal o ramificado, 2. -CH^f-fenilo, ó 3. -CH..-cilopropilo, y R2 es un átomo de hidrógeno o metilo. Un aspecto adicional de la invención se refiere al uso de compuestos de la fórmula III, en donde
Rl es 1. -alquilo (C>-CG) , en donde alquilo es lineal o ramificado, 2. -CH?-fenilo, o bien 3. -CHj-ciclopropilo, y R2 es un átomo de hidrógeno o metilo. Un aspecto adicional de la invención se refiere a compuestos novedosos de la fórmula I,
y-/o todas las formas estereoisoméricas del compuesto de la fórmula I y/o mezclas de estas formas en cualquier proporción, y/o una sal fisiológicamente tolerable del compuesto de la fórmula I, en donde A es un átomo de carbono o un átomo de nitrógeno, en donde A está insustituido o sustituido por -alquilo (C;-CÍ) , n es los números enteros 1 ó 2, Rl es 1. -alquilo (Ci-Cio) , en donde alquilo es lineal o ramificado, 2. -alquenilo (C2-Cio) , en donde alquenilo es lineal o ramificado, 3. -alquinilo '(C^-Cio) / en donde alquinilo es lineal o rami icado, 4. -alquilfenilo (C1-C4) , 5. -alquilo (Ci-C4 ) -cicloalquilo (C3-C7) , 6. -cicloalquilo (C3-C7) ó 7. -CH:CF., y R2 es un átomo de hidrógeno o -alquilo (C1-C4) La invención se refiere además a compuestos de la fórmula I, en donde A es átomo de carbono o átomo de nitrógeno, en donde A está insustituido o sustituido por metilo, n es los números enteros 1 ó 2 ?,'. es 1. -alquilo (C2-C5) , en donde alquilo es lineal o ..ramificado, 2. -C-H. -fenilo, o bien 3. -CH2-ciclopropilo, y es un átomo de hidrógeno o metilo. Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a compuestos de la fórmula II en donde
Rl es 1. -alquilo , en donde alquilo es lineal o ramificado, 2. -CH2-fenilo, o bien 3. -CH2-ciclopropilo, y R2 un átomo de hidrógeno o metilo. Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a compuestos de la fórmula III, en donde
Rl es 1. -alquilo (C -Ce) , en donde alquilo es lineal o ramificado, 2. -CHj-fenilo, o bien 3. -CHa-ciclopropilo, y R2 es un átomo de hidrógeno o metilo. El término "alquilo (Ci-Cio)" se refiere a radicales hidrocarburo cuya cadena de carbono es una cadena recta o ramificada y que contiene de 1 a 10 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, tertiaril butilo, pentilo, isopentilo, neopentilo, hexilo, 2 , 3-dimetilbutilo, neohexilo, heptilo, octanilo, nonanilo, decanilo. El término "alquenilo ( C;_ - C ) " se refiere a radicales hidrocarburo cuyas cadenas de carbono es de cadena recta o ramificada y contiene de 1 a 10 átomos de carbono y, según la longitud de la cadena, 1, 2 ó 3 enlaces dobles. Los radicales cicloalquilo (C;--C ) son, por ejemplo, compuestos derivados de monociclos de 3 a 7 miembros, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo o cicloheptilo . La invención se refiere además a un procedimiento para la preparación del compuesto de la fórmula I y/o una forma estereoisomérica del compuesto de la fórmula I y/o una sal fisiológicamente tolerada del compuesto de la fórmula I, que comprende a) la reacción de un compuesto de la fórmula IV
IV en donde A, R2 y n son de conformidad con lo definido en la fórmula I y Re es un átomo de hidrógeno o un grupo protector éster, con un compuesto de la fórmula V,
V en donde Rz es un átomo de cloro, imidazolilo ú OH, en presencia de una base para proporcionar un compuesto de la fórmula VI
en donde A, R2 y n son de conformidad con lo definido en la fórmula I, y Re es de conformidad con lo definido arriba, y reducir un compuesto de la fórmula VI preparado como en a) con hidrógeno y un catalizador de metal en una amina de la fórmula VII v--'.-
y hace reaccionar subsecuentemente el compuesto de la fórmula VII con un compuesto de la fórmula VIII
(VIII) en donde Rl es de conformidad con lo definido en la fórmula I, en presencia de un compuesto básico, por ejemplo, trietilamina, trimetilamina ó piridina para proporcionar un compuesto de la fórmula IX
en donde Rl, R2, A y n son de conformidad con lo definido en la fórmula I, y Re son de conformidad con lo definido arriba, ^fraccionar un^compuesto de la fórmula I que ha sido preparado por el procedimiento a) y que, debido a su estructura química, ocurre en formas enantioméricas en los enantioméros puros por formación de sal con ácidos o bases enantiopuros, cromatografía en fases estacionarias quirales o derivación utilizando compuestos enantiopuros quirales, por ejemplo, aminoácidos, separación de los diastereoméros obtenidos de esta forma, y eliminación de los grupos auxiliares quirales, o o bien el aislamiento en forma libre del compuesto de la fórmula I preparado por los procedimientos b) ó c) , o bien, en el caso en donde grupos ácidos o básicos están presentes, su conversión en sales fisiológicamente tolerables. Es posible emplear como grupo protector para éster Re los grupos como grupos protectores para ásteres en Protective Groups in Organic Synthesis, T.H. Greene, P.G. M. uts, iley-Interscience, 1991. Grupos protectores para ásteres preferidos son, por ejemplo, metilo, etilo, isopropilo, tercbutilo, o benzilo. Los materiales iniciales y reactivos empleados pueden ser preparados ya sea por procedimientos conocidos o bien pueden ser comprados. El sistema de anillo de espinacina puede ser preparado, por ejemplo, de conformidad con lo descrito por S. Klutchko y colaboradores (J. Heterocyclic . CHem. , 28, 97, (1991) ) . Las reacciones se llevan a cabo por ejemplo de conformidad con lo descrito en WO 97/18194. La reacción en el paso de un procedimiento a) se lleva a cabo en presencia de una base, por ejemplo, KOH, NaOH, LiOH, N, O-bis (trimetilsilil ) acetamida (BSA) , N-metilmorfolina ( MM) , N-etilmorfolina (NEM) , trietilamina (TEA) , diisopropiletilamina (DIPEA) , piridina, colidina, imidazol, o carbonato de sodio en solventes, por ejemplo, tetrahidrofurano (THF) , dimetilformamida (DMF) , dimetilacetamida, dioxano, acetonitrilo, tolueno, cloroformo o cloruro de metileno, o bien en presencia de agua. La reacción en el paso de procedimiento b) se efectúa por ejemplo, empleando los catalizadores de metal Pd/C, SnCl2r ó Zn bajo condiciones estándares. En el paso de procedimiento c) , el compuesto de la fórmula I, si ocurre, se encuentra en forma diastereoisomérica o en forma enantiomérica y resulta como mezcla de los mismos en la síntesis seleccionada, separado en los estereoisómeros puros, ya sea por cromatografía o bien en un material de soporte opcionalmente quiral, o bien, si el compuesto racémico de la fórmula I puede formar sales, por cristalización fraccional de las sales diastereoisoméricas formadas con una base ópticamente activa o ácido como auxiliar. Ejemplos de fases estacionarias quirales adecuadas para la separación de enantioméros por cromatografía en capa delgada o en columna son soportes en gel de sílice modificadas (llamados fases Pirkle) y carbohidratos de altos pesos moleculares tales como triacetilcelulosa. Para propósitos analíticos, métodos de cromatografía de gases en fases estacionarias quirales pueden también ser utilizados después de una derivación apropiada conocida por parte de las personas con conocimientos en la materia. Para separar enantioméros de los ácidos carboxílieos racémicos, una base ópticamente activa, habitualmente disponible en el comercio, por ejemplo (-) -nicotina, (+)-y (-) -feniletilamina, bases de quinina, L-lisina ó L- y D-arginina se utilizan para formar sales diastereoméricas que difieren en cuanto a solubilidad, el componente menos soluble es aislado como sólido, el diastereoméro más soluble es depositado a partir del licor madre, y los enantiomeros puros son obtenidos a partir de las sales diastereoméricas obtenidas de esta forma. Es posible de la misma manera convertir en principios los compuestos racémicos de la fórmula I, que contienen un grupo básico, por ejemplo, un grupo amino con ácido ópticamente activo, por ejemplo (+)-campfor-10-ácido sulfónico, ácido D- y L-tartárico, ácido láctico D y L, y ácido mandélico (+ ) y (-) en los enantiomeros puros. Compuestos quirales que contienen funciones alcohol o amina pueden también ser convertidos con aminoácidos enantiopuros apropiadamente activados u opcionalmente N-protegidos en los ésteres o amidas correspondientes, o bien a la inversa, los ácidos carboxílicos quirales pueden ser convertidos con aminoácidos enantiopuro carboxilo-protegidos en las amidas o con los ácidos hidroxi carboxílicos enantiopuros, tales como ácido láctico en los ésteres quirales correspondientes. Es entonces posible utilizar la quiralidad del residuo de aminoácido o alcohol introducido en forma enantiopura para separar los isómeros mediante la realización de una separación de los diastereomeros que están ahora disponibles por cristalización o cromatografía en fases estacionarias adecuadas y después eliminando la porción quiral incluida utilizando métodos adecuados . Productos ácidos o básicos del compuesto de la fórmula I pueden estar en forma de sus sales o bien en forma libre. Se da preferencia a sales farmacológicamente aceptables, por ejemplo, sales de metales alcalinos o sales de metales alcalinos térreos, e hidrocloruros, hidrobromuros, sulfatos, hemisulfatos, todos los fosfatos posibles, y sales de aminoácidos, bases naturales o ácidos carboxilicos . La preparación de sales fisologicamente toleradas a partir de compuestos de la fórmula I que pueden formar sales, incluyendo las formas estereoisoméricas de los mismos, en el paso de procesamiento d) se efectúa de una manera conocida per se. Los compuestos de la fórmula I forman sales estables de metales alcalinos, metales alcalinos térreos u opcionalmente de amonio sustituido con reactivos básicos tales como hidróxidos, carbonatos, bicarbonatos, alcoholatos, y amoniaco o bases orgánicas por ejemplo, trimetilamina o trietilamina, etanolamina ó trietanolamina, o bien aminoácidos básicos, por ejemplo, lisina, ornitina, o arginina. Si los compuestos de la fórmula I tienen grupos básicos, es también posible preparar sales estables de adición de ácido con ácidos fuertes. Para este propósito son adecuados tanto ácidos orgánicos como inorgánicos tales como ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, fosfórico, metansulfónico, benzensulfónico, p-toluensulfónico , 4-bromobenzensulfónico, ciclohexilamidosulfónico, trifluorometilsulfónico, acético, oxálico, tartárico, succ nico o trifluoroacético. La invención se refiere también a agentes farmacéuticos que tienen un contenido efectivo de por lo menos un compuesto de la fórmula I y/o de una sal fisiológicamente tolerada del compuesto de la fórmula I y/o una forma opcionalmente estereioisomérica del compuesto de la fórmula I, junto con un vehículo, aditivo y/u otros ingredientes activos y excipientes farmacéuticamente adecuados y fisiológicamente tolerados . Debido a las propiedades fisiológicas, los compuestos de la invención son adecuados para la profilaxis selectiva y la terapia de todos los padecimientos en cuyo avance participa una actividad incrementada de metaloproteinasa 13. Incluyen padecimientos degenerativos de las articulaciones tales como osteoartrosis, espondilosis, condrolisis, después de trauma de las articulaciones o inmovilización prolongada de las articulaciones después de lesiones patelares o de menisco o bien rupturas de ligamentos. Incluyen también trastornos de tejido conectivo, tales como colagenosis, trastornos periodontales , perturbaciones de la curación de las heridas y trastornos crónicos del sistema locomotor, por ejemplo, artrítides inflamatorios, agudas o crónicas relacionadas con el metabolismo o con el sistema inmunológico, artropatias, mialgias y perturbaciones del metabolismo de los huesos. Los compuestos de la fórmula I son también adecuados para el tratamiento de ulceras, aterosclerosis, y estenosis. Los compuestos de la fórmula I son adecuados además para el tratamiento de inflamaciones, cánceres, metástasis tumoral, caquexia, anorexia y choque séptico. Tales padecimientos pueden ser tratados con los compuestos empleados de conformidad con la presente invención de manera mucho más especifica y con un rango menor de efectos colaterales puesto que esencialmente solamente se inhibe MMP-13. La administración de los fármacos de la invención puede efectuarse por administración oral, por inhalación, por administración rectal o transdérmica o bien por inyección subcutánea, intraarticular, intraperitoneal , o intravenosa. Se prefiere la administración oral. La invención se refiere también a un procedimiento para la producción de un agente farmacéutico, dicho procedimiento comprende la conversión de por lo menos un compuesto de la fórmula I en una forma de dosificación adecuada con un vehículo farmacéuticamente adecuado y fisiológicamente tolerado y, en caso apropiado, con ingredientes activos, aditivos o excipientes adecuados adicionales. Ejemplos de preparaciones sólidas o farmacéuticas adecuadas son gránulos, polvos, tabletas revestidas, tabletas (micro) cápsulas, supositorios, jarabes, soluciones orales, suspensiones, emulsiones, gotas, soluciones inyectables, y productos con liberación prolongada del ingrediente activo, en la producción del cual auxiliares convencionales tales como vehículos, agentes de desintegración, aglomerantes, agentes de revestimiento, agentes de hinchado, agentes de deslizamiento o lubricantes, saborizantes, espesadores y solubilizadores se utilizan. Excipientes frecuentemente utilizados y que pueden ser mencionados son carbonato de magnesio, dióxido de titanio, lactosa, manitol y otros azucares, talco, proteína de leche, gelatina, almidón, celulosa y sus derivados, aceites animales y vegetales tales como aceites de hígado de pescado, aceite de girasol, aceite de cacahuate o aceite de sésamo, polietilenglicol y solventes, por ejemplo, agua estéril y alcoholes monohídricos o polihídricos tales como glicerol. Los productos farmacéuticos son producidos preferentemente y administrados en unidades de dosificación, cada una contiene como ingrediente activo una dosis particular el compuesto de la invención, de la fórmula I. En el caso de unidades de dosificación sólidas, por ejemplo, tabletas, cápsulas, tabletas revestidas o supositorios, esta dosis puede alcanzar hasta 1 000 mg, pero preferentemente es de aproximadamente 50 a 300 mg, y en el caso de soluciones para inyección en forma de ' ampolletas hasta aproximadamente 300 mg, pero preferentemente de aproximadamente 10 a 100 mg. Las dosis diarias indicadas para el tratamiento de un paciente adulto de un peso de aproximadamente 70 kg son de aproximadamente 20 mg a 1 000 mg de ingrediente activo, preferentemente de aproximadamente 100 mg a 500 mg, según la actividad del compuesto de la fórmula I. Sin embargo, en algunas circunstancias, dosis diarias más elevadas o más bajas pueden también ser apropiadas. La dosis diaria puede ser administrada tanto por administración una vez al día en forma de una unidad de dosificación individual o bien como varias unidades de dosificación más pequeñas y mediante la administración de dosis divididas a intervalos definidas más de una vez al día. Los productos finales son habitualmente determinados por métodos espectroscópicos de masa (FAB-, ESI-MS) , con el pico principal indicado en cada caso. Se establecen las temperaturas en grados Celsius, RT significa temperatura ambiente, (de 22° C a 26° C) . Las abreviaturas utilizadas o bien se explican o bien corresponden a convenciones habituales. La invención se explicará con detalles abajo a través de e emplos . Ejemplos de preparación Los compuestos 1, 3, 4 y 5 en la tabla 1 fueron preparados de manera análoga a los procedimientos descritos en el ejemplo 2. Ejemplo 2 Etapa 1: Preparación de ácido 2- (4 ' -nitrobifenil-4-sulfonil ) -1,2,3, 4-tetrahidro-isoquinolin-3- (R) -carboxilico . Se disolvieron 44.2 g (250 mmol) de ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolil-3- (R) -carboxilico en 500 mi de una solución acuosa de hidróxido de sodio 1N, con agitación, se agregaron 150 g (300 mmol) de cloruro de 4,4'-nitrobifenilsulfonilo disuelto en 500 mi de tetrahidrofurano . Durante esto, la temperatura de reacción fue mantenida por debajo de 25° C; y el pH de la solución fue ajustado a pH 10 mediante la adición de NaOH 1N. La mezcla de la reacción fue agitada a temperatura ambiente durante 12 horas (h) . Para el tratamiento, la solución de la reacción fue filtrada a través de una capa aclaradora de Celite® y después el filtrado fue concentrado a la mitad del volumen original en un evaporador rotatorio bajo presión reducida. La solución resultante fue acidificada a pH 2 a 3 mediante la adición de una solución acuosa de ácido cítrico al 20%, por lo que el producto de la reacción se precipito en forma de un sólido incoloro. El sólido resultante fue removido por filtración y secado en un horno de vacío a 40° C. Se obtuvieron 77.9 g (71% del nivel teórico, de un sólido incoloro) . Espectro de masa: ESI: [M + H+] : m/z = 439.4 Etapa 2: Preparación de 2- (4 ' -nitrobefinil-4-sulfonil ) -1,2,3, 4-tetrahidroisoquinolin-3- (R) -carboxilato de metilo Se agregaron 77.5 g (177 mmol) del ácido carboxílico preparado en la etapa 1 en porciones a una solución de 65 mi de cloruro de tionilo (885 mmol) en 800 mi de metanol a una temperatura de -15° C a -10° C. La mezcla fue después agitada a 25° C durante 1 hora y a 50° C durante 1 hora. Para el tratamiento, la solución de la reacción fue concentrada bajo presión reducida y agitada con 300 mi de diclorometano y 300 mi de una solución acuosa saturada de NaHCÜ3. La fase orgánica fue después lavada con agua hasta alcanzar un nivel neutro y secada en a2SÜ , y el solvente fue removido bajo presión reducida. El producto crudo (80 g, aceite de color café) obtenido de esta forma fue purificado por cromatografía en gel de sílice (40µ -63µ) con n-heptano: acetato de etilo = 2:1 como fase móvil. Se obtuvieron 27 g (34% del nivel teórico de un aceite incoloro) . Espectro de masa: ESI: [M + H+] : m/z = 453.4 Etapa 3: Preparación de 2- (4 ' -aminobifenil-4-sulfonil) -1, 2, 3, 4-tetrahidro-isoquinolinil-3- (R) -carboxilato de metilo Se disolvieron 53 g (117 mmol) del compuesto nitro preparado en la etapa 2 en 1.5 1 de una mezcla 1:1 de tetrahidrofurano (THF) y metanol y, después de la adición de 1 g de Pd (10% en carbón activado) , se hidrogeno con ¾ en un aparato de hidrogenación hasta la suspensión de la absorción de H2 (consumo de hidrógeno: 7.2 1). Para el tratamiento, el catalizador, fue filtrado a través de una capa de clarificación de Celite®, y el filtrado fue concentrado en un evaporador rotatorio bajo presión reducida. El residuo aceitoso fue recogido en diclorometano y secado en NaaSO y el solvente fue removido bajo presión reducida. El producto crudo obtenido de esta forma fue recristalizado a partir de éter dietilico. Se obtuvieron 45.7 g (93% del nivel teórico, en forma de un sólido incoloro) . Espectro de masa: ESI: [M + H+] : m/z = 423.4 Etapa 4: Preparación de 2- ( 4 ' -isopropoxicarbonilaminobifenil-4-sulfonil) -1,2,3, -tetrahidroisoquinolin-3- (R) -carboxilato de metilo Se disolvieron 16.9 g (40 mmol) del compuesto de la etapa 3 en 200 mi de diclorometano absoluto y, con agitación a -70° C hasta -60° C, se agregaron sucesivamente 4.9 mi de piridina (60 mmol) y 44 mi (44 mmol) de cloroformato de isopropilo. La mezcla fue después agitada a esta temperatura durante 3 horas. Para el tratamiento, la mezcla de la reacción fue hidrolizada a 0o C mediante adición de 10 mi de agua. Después de la remoción de la fase orgánica, se lavo hasta llegar a un nivel neutro y se seco con Na2S0 , y el solvente fue removido bajo presión reducida en un evaporador rotatorio. El residuo obtenido de esta forma fue cristalizado después de adición de 100 mi de n-pentano en forma de cristales de color salmón. 20.1 g (98%, cristales de color salmón) se obtuvieron. Espectro de masa: ESI: [M + H+] : m/z = 509.5 Etapa 5: Preparación de ácido 2-(4'-isopropoxicarbonilaminobifenil-4-sulfonil ) -1 , 2 , 3, 4-tetrahidroisoquinolin-3- (R) -carboxilico 20 g del éster carboxilico (39.4 mmol) preparada en la etapa 4 fueron disueltos en 200 mi de THF, y, a una temperatura de 25° C, se agregaron 48 mi de una solución acuosa de LiOH 1M. La solución de reacción fue agitada a una temperatura de 25° C durante 3 horas. La mezcla de la reacción fue después concentrada bajo presión reducida, el residuo fue recogido en 750 mi y filtrado a. través de una capa de aclaración de Celite® con adición de carbón activado, y el licor madre fue acidificado con ácido cítrico acuoso. El producto de la reacción precipitado fue filtrado y purificado por cromatografía en gel de sílice (40µ - 63µ) empleando diclorometano :metanol en una proporción 9:1 como fase móvil. Se obtuvieron 41.1 g (72% del nivel teórico de un sólido incoloro) . Espectro de masa: ESI: [M + H+] : m/z = 495.2 Ejemplo 6 Etapa 1: Ácido 5- ( 4 ' -nitrobifenil-4 -sulfonil ) -1-metil-4,5,6, 7-tetrahidro-lH-imidazo [ 4 , 5-c] piridin-6-carboxílico . Se disolvieron 2 g de 1-metilespinacina (9.19 itunol) en 15 mi de agua y, a una temperatura de 0 o C, se agregaron 3 equivalentes de una solución de NaOH 3N (9.19 mi). Después de 10 minutos (min) , se agrego gota a gota lentamente una solución de 4 ' -nitrobifenil-4-sulfonilo (2.74 g, 9.19 mmol) en acetonitrilo y, después de alcanzar la temperatura ambiente, la mezcla es agitada durante 12 horas adicionales. El producto crudo fue purificado por cromatografía. Se obtuvieron 1.9 g (47% del nivel teórico, en forma de un sólido incoloro) . Espectro de masa: ESI : [M + H+] : m/z = 443. Etapa 2: Ácido 5- ( 4 ' -aminobifenil-4 -sulfonil) -1-metil-4,5,6, 7-tetrahidro-lH-imidazo [ 4 , 5-c] piridin-6-carboxílico . Se disolvió 1 g (2.3 mmol) de ácido 5- ( 4 ' -nitrobifenil-4-sulfonil ) -1-metí1-4 ,5,6, 7-tetrahidro-lH-imidazo [4,5-c] piridin-6-carboxílico en 15 mi de dimetilformamida (DMF) y, después de adición de 0.1 g de catalizador de hidrogenación (10% de PD en carbón activado), se hidrogeno cuantitativamente dentro de 2 horas. Después de la remoción del solvente, el producto crudo fue purificado por cromatografía. Se obtuvo 0.74 g (78% del nivel teórico, en forma de un sólido incoloro) . Espectro de masa: ESI: [M + H+] : m/z = 413 Etapa 3: Ácido 5- (4 ' -alcoxicarbonilaminobifenil-4-sulfonil) - l-metil-4, 5, 6, 7-tetrahidro-lH-imidazo [4, 5-c] piridin-6- carboxilico Se disolvieron 500 mg (1.2 mmol) de ácido 5- ( 4 ' -aminobifenil- 4-sulfonil) -l-metil-4, 5, 6, 7-tetrahidro-lH-imidazo [4 , 5- c]piridin-6-carboxilico en 3 mi de DMF y, después de enfriamiento a 0o C, en un baño de hielo, se agrego 2.4 mmol de piridina. Después de agitar a 0o C durante 15 minutos, se agrego 1.8 mmol de cloroformato de isopropilo. La solución de la reacción fue después agitada a temperatura ambiente durante 2 horas. El producto crudo fue purificado por métodos cromatográficos . Se obtuvo 0.38 g (64% del nivel teórico, en forma de un sólido incoloro) . ¦ ·. Espectro de masa: ESI: [M + H+] : m/z = 499. ¦,. Los compuestos 7 a 10 en la tabla 1 fu rprv preparados ^d.e manera análoga a los procedimientos descritos en el ejemplo
Tabla 1 Ejemplo Estructura MS(ESI+) 481
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Ejemplos farmacológicos Preparación y determinación de la actividad enzimática del dominio catalítico de . estromelisina humana (MMP-3) y neutrófilo colagenasa (MMP-8). Las dos enzimas - estromelisina (MMP-3) y neutrófilo colagenasa (MMP-8) - fueron preparadas de conformidad con lo descrito por Ye y colaboradores (Biochemistry; 31 (1992) páginas 11231.--11235 ) . Para medir la actividad enzímica .. .bi en el efecto" inhibidor de la enzima, se incubaron 70 µ? de-'.-.u-n-a solución amortiguadora y 10 µ? de una solución de enzima a pH fisiológico con 10 µ? de una solución acuosa de sulfóxido de dimetilo al 10% (volumen/volumen) que contiene opcionalmente el inhibidor de enzima durante 15 minutos. Después de la adición de 10 µ? de una solución acuosa de sulfóxido de dimetilo al 10% (volumen/volumen) que contiene 1 mmol/1 del sustrato, la reacción enzímica es seguida por espectroscopia de fluorescencia (328 nm(ex)/393 nm(em) ) . La actividad enzímica es representada como un incremento de extinción/minuto. Los valores IC50 listados en la tabla 2 se miden como las concentraciones de inhibidor que provocan en cada caso la inhibición del 50% de la enzima. La solución de amortiguador contiene 0.05% Brij (Sigma, Deisenhofen, Alemania) y 0.1 ml/Tris/HCl, 0.1 mol/1 de NaCl, 0.01 mol/L de CaCl2 y 0.1 mol/1 de piperazin-N, ' -bis [ácido 2-etansulfónico] (pH = 7.5) . La solución de enzima contiene 5 µ?/?a? de uno de los dominios de enzima preparados de conformidad con lo descrito por Ye y colaboradores. La solución de sustrato contiene 1 mmol/1 del sustrato fluorogénico (7-metoxicoumarin-4-il ) acetil-Pro-Leu-Gly-Leu-3- (2 ' , 4 ' -dinitrofenil ) -L-2, 3-diaminopropionil-Ala-Arg-NH2 (Bachem, Heidelberg, Alemania) . Determinación de la actividad enzimática del dominio catalítico de colagenasa humana 3 (MMP-13). Esta proteína se obtiene como proenzima inactiva en INVITEK, Berlín (Número de Catálogo No. 30 100 803) . Activación de la proenzima : Dos partes en volumen de proenzima se incuban con 1 parte en volumen de solución APMA a 37° C durante 1.5 horas. La solución APMA es preparada a partir de una solución de 10 mml/L de acetato de p-aminofenilmercúrico en 0.1 mmol/L de NaOH por dilución con 3 partes en volumen de amortiguador Tris/HCl pH 7.5 (véase abajo). El pH es ajustado entre 7.0 y 7.5 mediante adición de 1 mmol/L de HC1. Después de activación de la enzima, es diluida con amortiguador Tris/HCl a una concentración de 1.67 ug/mL . Para medir la actividad enzimática, se incuben 10 µ? de solución de enzima con 10 µ? de una solución amortiguada al 3% (volumen/volumen) de sulfóxido de dimetilo (reacción 1) durante 15 minutos. Para medir la actividad inhibidora de la enzima, se incuban 10 µ? de la solución enzimática con 10 µ? de una solución amortiguada al 3% (volumen/volumen) de sulfóxido de dimetilo que contiene el inhibidor de enzima (reacción 2 ) . La reacción enzimática tanto en la reacción 1 como en la reacción 2 es seguida, después de adición de 10 µ? de una solución de sulfóxido de dimetilo acuosa al 3% (volumen/volumen) que contiene 0.75 ntmol/L del sustrato, por espectroscopia de fluorescencia (328 nm(extinción) /393 nm(emisión) ) . La actividad enzimica es representada como incremento de extinción/minuto . El efecto inhibidor se calcula como el porcentaje de inhibición a través de la fórmula siguiente: % de inhibición = 100 - [ (incremento de extinción/minuto en reacción 2 )/ (incremento de extinción/minuto en reacción 1) x 100] . La IC5o, es decir, la concentración de inhibidor necesaria para una inhibición del 50% de la actividad enzimica se encuentra graficando los porcentajes de inhibición en varias concentraciones de inhibidor.
La solución de amortiguador contiene 0.05% de Brij (Sigma, Deisenhofen, Alemania) y 0.1 mol/L de Tris/HCl, 0.1 mol/L de NaCl, 0.01 mol/L de CaCl2 (pH = 7.5). La solución de enzima contiene 1.67 µg ml del dominio de enzima . La solución de sustrato contiene 0.75 mmol/L del sustrato flurogénico (7-metoxicoumarin-4-il ) acetil-Pro-Leu-Gly-Leu-3- (2 ' , ' -dinitrofenil ) -L-2, 3-diaminopropionil-Ala-Arg-NH2 (Bachem, Heidelberg, Alemania) . La tabla 2 abajo muestra los resultados. Tabla 2 Ej emplo MMP-3 MMP-8 MMP-13 No . IC50 (nM) IC50 (nM) IC5o (nM 1 3000 2300 40 2 3000 6000 30 3 >10000 2000 70 4 2000 3000 20 5 3000 4000 20 6 10000 4000 80 7 >10000 1000 60 8 >10000 5000 70 9 10000 200 60 10 >10000 700 20 Ejemplos de comparación Los siguientes compuestos especificados en la tabla 3 fueron preparados de conformidad con lo descrito en el documento WO
97/18194. Tabla 3: Ejemplo MMP MMP321 MMP82i No. 131' (nM) (nM) Estructura (nM)
1) La determinación se efectuó de conformidad con 1 descrito arriba. 2) y 3) Los datos fueron tomados de WO 97/18194 La tabla 3 muestra que compuestos estructuralmente similare de la técnica anterior no muestran selectividad en 1 inhibición de MMP-13 solamente.