MXPA04007588A

MXPA04007588A - Genes de desaturasa, enzimas codificadas por los mismos, y sus usos.

Info

Publication number: MXPA04007588A
Application number: MXPA04007588A
Authority: MX
Inventors: L Pereira Suzette
Original assignee: Abbott Lab
Priority date: 2002-01-30
Filing date: 2003-01-21
Publication date: 2004-12-06
Also published as: ES2310652T3; WO2003064596A8; US20090226987A1; US8067674B2; US7723503B2; CA2474894C; DK1480993T3; ATE402944T1; EP1480993A2; CA2474894A1; JP2005515776A; EP1480993B2; WO2003064596A3; CA2714295A1; EP1480993A4; US20030196217A1; DE60322515D1; JP4780916B2; WO2003064596A2; CA2714295C

Abstract

Se describen polinucleotidos aislados que codifican una omega-3-desaturasa y una delta-12-desaturasa, las enzimas codificadas por los polinucleotidos aislados, vectores que contienen los polinucleotidos aislados, huespedes transgenicos que contienen los polinucleotidos aislados que expresan las enzimas codificadas por los mismos, metodos para producir las enzimas de desaturasa, y un metodo para utilizar las enzimas para hacer acidos grasos poliinsaturados. Los polinucleotidos aislados se derivan de un hongo, Saprolegnia diclina (ATCC 56851). En particular, se puede utilizar omega-3-desaturasa, por ejemplo, en la conversion de acido araquidonico (AA) a acido eicosapentanoico (EPA). Se puede utilizar delta-12-desaturasa, por ejemplo, en la conversion de acido oleico (OA) a acido linoleico (LA). El EPA o los acidos grasos poliinsaturados producidos del mismo se pueden agregar a composiciones farmaceuticas, composiciones nutricionales, alimentos para animales, asi como a otros productos, tales como cosmeticos.

Description

GENES DE DESATURASA, ENZIMAS CODIFICADAS POR LOS MISMOS Y SUS USOS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención está dirigida a la identificación y aislamiento de genes novedosos que codifican enzimas involucradas en la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs). La invención también está dirigida a enzimas de desaturasa novedosas codificadas por estos genes y los métodos para utilizar los genes y/o las enzimas codificadas por los genes. En particular, la invención está dirigida a genes derivados de los hongos Saprolegnia diclina (ATCC 56851) que codifican una co3-desaturasa novedosa (también referida en la presente como desaturasa ?17) y una desaturasa ?12 novedosa. Estas enzimas catalizan la introducción de un enlace doble de carbono-carbono entre una posición particular dentro de un substrato de ácido graso. Por ejemplo, la desaturasa ?3 novedosa descrita en la presente cataliza la conversión del ácido araquidónico (20:4n-6) a ácido eicosapentaenoico (20:5n-3) (así como otros reacciones de desaturación involucrando otros substratos). De la misma forma, la desaturasa ?12 novedosa descrita en la presente cataliza la conversión de ácido oleico (18:1n-9) en ácido linoleico (18:2n-6). Los PUFAs así formados pueden ser agregados a composiciones farmacéuticas, composiciones n utricionales, alimentos para animales, u otros productos.

ANTECEDENTES Las desaturasas son una clase de enzimas críticas en la producción de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga. Los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) juegan muchos papeles en el funcionamiento apropiado de todas las formas de vida. Por ejemplo, los PUFAs son componentes importantes de la membrana de plasma de una célula, en donde se encuentran en la forma de fosfolípidos. Los PUFAs también son precursores de porsaciclinas, eicosanoides, leucotrienos y prostaglandinas de mamíferos. Adicionalmente, los PUFAs son necesarios para el desarrollo apropiado del cerebro de infantes, así como para la formación y reparación de tejido en mamíferos maduros. En vista de la importancia biológica de los PUFAs, se han estado haciendo intentos para producirlos en una forma eficiente. Un número de enzimas, más notablemente desaturadas y elongasas está involucrado en la biosíntesis de PUFAs (ver Figura 1). Las elongasas catalizan la adición de una unidad de 2 carbonos a un substrato de ácido graso. De esta forma, por ejemplo, una elongasa (genéricamente designada "elo" en la Figura 1) cataliza la conversión de ácido ?-linoleico (18:3n-6) a ácido dihomo-y-linoleico (20:3n-6), así como la conversión de ácido estearidón ico (18:4n-3) a ácido eicosatetranoico (20:4n-3), etc. Las desaturasas catalizan la introducción de instauraciones (es decir, enlaces dobles) entre átomos de carbono dentro del la cadena alquilo del ácido graso del substrato. De esta manera, por ejemplo, el ácido Iinoleico (18:2n-6) es producido a partir de ácido oleico (18:1n-9) a través de la acción de una desaturasa ?12. Similarmente, el ácido ?-linoleico (18:3n-6) es producido a partir de ácido Iinoleico a través de la acción de una desaturasa ?6. A lo largo de la presente solicitud, los PUFAs serán identificados -de manera no ambigua utilizando el sistema "omega" de nomenclatura propiciada por fisiólogos y bioquímicos, según opuesto al sistema "delta" o sistema I.U.P.A.C. normalmente propiciado por químicos. En el sistema "omega", un PUFA es identjfjcado a__tr_a_vés-"dé uña designación numérica del número de carbonos en la cadena.

Esto seguido por dos puntos (:) y la otra designación numérica del número de instauraciones en la molécula. Esto es seguido entonces por la designación "n-x", en donde x es el número de carbonos a partir del extremo metilo de la molécula en donde está localizada la primera instauración. Cada instauración subsiguiente (en donde hay más de un enlace doble) está localizado 3 átomos de carbono adicionales hacia el extremo carboxilo de la molécula. De esta forma, los PUFAs descritos en la presente pueden ser descritos como siendo PUFAs "interrumpidos por metileno". En donde se requiere de alguna otra designación, las desviaciones del sistema "omega" serán observadas. Cuando sea apropiado, en la presente también serán identificadas utilizando el sistema "omega". De esta forma, una desaturasa "omega-3" cataliza la introducción de un enlace doble entre los dos carbonos en las posición es 3 y 4 a partir del extremo metilo del substrato. Sin embargo, en muchos casos, es más conveniente indicar la actividad de una desaturasa contando a partir del extremo carboxi del substrato. De esta manera, como se muestra en la Figura 1, una desaturasa ?9 cataliza la introducción de un enlace doble entre los dos carbonos en las posiciones 9 y 10 a partir del extremo carboxilo del substrato. En resumen, en donde se utiliza el término "omega", la posición en el substrato se está designando con relación al término metilo; en donde se utiliza el término "delta", la posición en el substrato está siendo designada con relación al término-carbOxiro Se debe observar que los mamíferos no pueden desaturar substratos de ácidos grasos más allá de la posición ?9, (es decir, más allá de 9 átomos de carbono distantes del término carboxilo). De esta manera, por ejemplo, los mamíferos no pueden convertir ácido oleico (18:1n-9) en ácido linoleico (18:2n-6); el ácido linoleico contiene una instauración en la posición ?12. De la misma forma, el ácido a-linoleico (18:3n-3) (que tiene instauraciones en ?12 y ?15) no puede ser sintetizados por mamíferos. Sin embargo, por ejemplo, los mamíferos no pueden convertir ácido a-linoleico en ácido estearidónico (18:4n-3) a través de la acción de una desaturasa ?6. (Ver Figura 1. Ver también la publicación PCT WO 96/13591; The FASEB Journal, Abstracts, Parte I, Abstract 3093; página A532 (Experimental Biology 98, San Francisco, CA, 18-22 de abril de 1998); y la Patente de E.U.A. No. 5,552,306).

Aun refiriéndose a la Figura 1, en mamíferos, el hongo y las algas, el ácido estearidónico así formado es convertido en ácido eicosatetraenoíco (20:4n-3) a través de la acción de una elongasa. Este PUFA puede entonces ser convertido a ácido eicopentaenoico (20:5n-3) a través de una desaturasa ?5. El ácido eicopentaenoico puede entonces, a su vez, ser convertido a ácido ?3- docosapentaenoico (22:5n-3) a través de una elongasa. Otros eucariotes, incluyendo hongo y plantas, tienen enzimas que desaturan substratos de ácido graso en el carbono ?12 (ver la ácidos grasos poliinsaturados principales de anímales de los mismos son ya sea derivados de dieta y/o de desaturación y elongación de ácido linoleico o ácido a-linoleico. En vista de estas dificultades, aún queda una necesidad importante de aislar genes involucrados en síntesis de PUFA. Idealmente, estos genes podrían originarse de especies que naturalmente producen ácidos grasos que no son producidos naturalmente en mamíferos. Estos genes podrían entonces ser expresados en un sistema microbiano, de planta o animal, el cual podría por lo tanto ser alterado para producir cantidades comerciales de uno o más PUFAs. De esta forma, existe una necesidad definitiva de enzimas de desaturasa ?12 y ?17, los genes respectivos que codifiquen estas enzimas, así como métodos recombinantes para la producción de estas enzimas. Adicionalmente, existe una necesidad de aceites conteniendo niveles de PUFAs más allá de aquellos naturalmente presentes. El acceso a dichas enzimas de desaturasa ?12 y ?17 permite la producción de grandes cantidades de PUFAs que no pueden ser sintetizadas de novo en mamíferos. Estos PUFAs pueden ser utilizados como agentes farmacéuticos y/o suplementos nutricionales. Todas las patentes, publicaciones de patente y documentos prioritarios citados en la presente se incorporan por referencia en su totalidad .

COMPENDIO DE LA INVENCION Una modalidad de la presente invención abarca una secuencia de ácido de nucleótido aislado o fragmento de la misma que comprende o complementa una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de desaturasa, en donde la secuencia de aminoácido del polipéptido tiene por lo menos 50% de identidad de secuencia a una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 26 y SEC ID NO: 42. La presente invención también incluye una secuencia de nucleótido aislado (o fragmento de la misma) que comprende o complementa a por lo menos 50% de la secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 25 y SEC ID NO: 41. En particular, la secuencia puede ser seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 25 y SEC ID NO: 41. Las secuencias pueden codificar una desaturasa funcionalmente activa que utiliza un ácido graso pool insaturado como un substrato. Además, la secuencia de nucleotido puede ser aislada de un hongo, tal como Saprolegnia diclina. Una modalidad adicional de la presente invención incluye un polipéptido purificado codificado por las secuencias de nucleotido anteriormente descritas. La presente invención también incluye un polipéptido purificado que un substrato de ácido graso poliinsaturado en un carbono omega-3 del substrato y tiene por lo menos 50% de identidad de aminoácido a una secuencia de aminoácido que comprende SEC ID NO_:__26.— E-l - ol-i- tidO puede" dé saturar un substrato de ácido graso que tiene 20 átomos de carbono. Adicionalmente, la presente invención abarca un polipéptido purificado que desatura un substrato de ácido graso poliinsaturado en un carbono delta-12 del substrato y tiene por lo menos 50% de identidad de aminoácido a la SEC ID NO: 42. El polipéptido puede desaturar un substrato de ácido graso que tiene 18 átomos de carbono. Otra modalidad de la presente invención incluye un método para producir una desaturasa que comprende los pasos de: aislar una secuencia de nucleotido que comprende o complementa por lo menos 50% de una secuencia de nucleotido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 25 y SEC ID NO: 41; la construcción de un vector que comprende la secuencia de nucleotido aislada; y la introducción del vector en la célula huésped durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la expresión de una desaturasa codificada por la secuencia de nucleotido aislada. Una modalidad adicional de la presente invención incluye un vector que comprende: 1) una secuencia de nucleotido aislada correspondiente a o complementaria a por lo menos 50% de la secuencia de nucleotido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 25 y SEC ID NO: 41; operablemente enlazada a b) una secuencia reguladora. Adicionalmente, otra modalidad de la presente invención incluye una célula huésped que comprended el vector anterior. La seleccionada del grupo que consiste de una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula de planta y una célula de hongo. Con respecto a la célula huésped, la expresión de la secuencia de nucleotido aislada del vector puede dar como resultar en que la célula huésped produzca un ácido graso poiiinsaturado que no es producido en un tipo silvestre de la célula huésped. También, la presente invención abarca una célula de planta, planta o tejido de planta que comprende el vector anteriormente descrito, en donde, la expresión de la secuencia de nucleotido del vector resulta en la producción de un ácido graso poiiinsaturado a traes de la célula de planta, planta o tejido de planta. El vector en la célula de planta, planta o tejido de planta puede inducir la producción de un ácido graso poiiinsaturado seleccionado del grupo que consiste de, por ejemplo, ácido linoleico, ácido eicosatetraenoico y ácido eicosapentaenoico. También, la invención incluye uno o más aceites de plantas o ácidos expresados por la célula de planta, planta o tejido de planta. La invención también incluye una planta transgénica que comprende el vector anteriormente mencionado, en donde la expresión de la secuencia de nucleotido del vector resulta en la producción de un ácido graso poliinsaturado en semillas de la planta transgénica. Otra modalidad de la presente invención abarca un método para la producción de un ácido graso poliinsaturado que comprende complementa a por lo menos el 50% de la secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 25 y SEC ID NO: 41; la construcción de un vector que comprende la secuencia de nucleótido aislado; transformar el vector en una célula huésped durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la expresión de una desaturasa codificada por la secuencia de nucleótido aislada; y exponer la desaturasa expresada seleccionada del grupo que consiste de una omega-3-desaturasa y una delta 12-desaturasa , a un substrato de ácido graso, mediante el cual el substrato es catalíticamente convertido mediante dicha desaturasa en un producto de ácido graso poliinsaturado deseado. El substrato es ácido dihomo-gama-linoleico o ácido araquidónico y el producto de ácido graso poliinsaturado es ácido eicosatetraenoico o ácido eicosapentaenoico, respectivamente, cuando la desaturasa expresada es una omega-3-desaturasa. El ácido graso poiiinsaturado del substrato es ácido oleico y el ácido graso poiiinsaturado del producto es ácido linoleico, cuando la desaturasa expresada es una delta 12-desaturasa. El método además comprende el paso de exponer el producto del ácido graso poiiinsaturado a una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una desaturasa y una elongasa, mediante las cuales el producto del ácido graso poiiinsaturado es catalíticamente convertido en otro producto de ácido graso poiiinsaturado. El ácido graso poiiinsaturado del producto es ácido poiiinsaturado es ácido eicosapentaenoico o ácido omega-3- docosapentaenoico, respectivamente, cuando la desaturasa expresada es una omega-3-desaturasa. El ácido graso poiiinsaturado del producto es ácido linoleico y el otro ácido graso poiiinsaturado es ácido gama-linoleico, cuando la desaturasa expresada es una delta 12-desaturasa. Adicionalmente, el método descrito directamente anteriormente puede además comprender el paso de exponer el otro ácido graso poiiinsaturado a una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una desaturasa y una elongasa a una ácido graso poiiinsaturado final. El ácido graso poiiinsaturado final se selecciona del grupo que consiste de ácido omega 3-docosapentaenoico y ácido docosahexaenoico, cuando la desaturasa expresada del paso (d) es una omega 3-desaturasa. En contraste, el ácido graso poiiinsaturado final se selecciona del grupo que consiste de ácido dihomo-gama- linoleico, ácido araquidónico, ácido adrénico, ácido omega 6- docosapentaenoico, ácido eicosatetraenoico, ácido estearidónico, ácido eicosapentaenoico, ácido omega 3-docosapentaeno¡co, y ácido docosahexaenoico, cuando la desaturasa expresada es una delta 12- desaturasa. Una modalidad adicional de la presente invención incluye un método para producir un ácido graso poliinsaturado que comprende la exposición de un substrato de ácido graso a un polipéptido que tiene por lo menos 50% de identidad de aminoácido a una secuencia jJe_arrün > c¡do--se^ que consiste de SEC ID NO: 26 y SEC ID NO: 42; mediante las cuales el substrato de ácido graso es catalíticamente convertido en un producto de ácido graso poliinsaturado. El substrato de ácido graso es ácido dihomo-gama- linoleico o ácido araquidónico y el ácido graso poliinsaturado del producto es ácido eicosatetraenoico o ácido eicosapentaenoico, respectivamente, cuando el polipéptido es una omega 3-desaturasa. En contraste, el substrato del ácido graso es ácido oleico y el producto del ácido graso poliinsaturado es ácido linoleico, cuando el polipéptido es una delta 12-desaturasa. Una modalidad adicional de la presente invención incluye una composición que comprende por lo menos un ácido graso poliinsaturado seleccionado del grupo que consiste de ácido graso poliinsaturado del "producto" producido de acuerdo con el método descrito anteriormente, el "otro" ácido graso poliinsaturado producido de acuerdo con al método descrito anteriormente, y el ácido graso poliinsaturado "final" producido de acuerdo con el método descrito anteriormente. El ácido graso poliinsaturado del producto es ácido eicosatetraenoico o ácido eicosapentaenoico, cuando la desaturasa expresada es una omega 3-desaturasa. En contraste, el ácido graso poliinsaturado del producto es ácido linoleico, cuando la desaturasa expresada es una delta 12-desaturasa. El otro ácido graso poliinsaturado es ácido eicosapentaenoico o ácido omega 3- docosapentaenoico, respectivamente, cuando la desaturasa expresada es una omega 3-desaturasa. Sin embargo, el otro ácido expresada es una delta 12-desaturasa. El ácido graso poliinsaturado final se selecciona del grupo que consiste de ácido omega 3- docosapentaenoico y ácido docosahexaenoico, cuando la desaturasa expresada es una omega 3-desaturasa. En contraste, el ácido graso poliinsaturado final se selecciona del grupo que consiste de ácido dihomo-gama-linoleico, ácido araquidónico, ácido adrénico, ácido omega 6-docosapentaenoico, ácido eicosatetraenoico, ácido estearidónico, ácido eicosapentaenoico, ácido omega 3- docosapentaenoico, y ácido docosahexaenoico, cuando la desaturasa expresada es una delta 12-desaturasa. Una modalidad adicional de la presente invención incluye un método para la prevención o tratamiento de una condición causada por el insumo insuficiente de por lo menos un ácido graso poliinsaturado que comprende la administración al paciente de la composición anteriormente mencionada en una cantidad suficiente para efectuar la prevención o tratamiento.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es un esquema que muestra la trayectoria biosintética que conduce a la producción de varios PUFAs. La Figura 2 es la secuencia de nucleótido de sdd17 (SEC ID NO: 25), un gen derivado de S. diclina (ATCC 56851 ) que codifica una desaturasa de ácido graso co3 novedosa. L _a._ _i g u ra -3-e s la_s "e-cü~e ñc ia de aminoácido de la desaturasa co3 (SDD17) (SEC ID NO: 26) codificada por la secuencia de nucleótido descrita en la Figura 2. La Figura 4 es una comparación de la secuencia de aminoácido entre la desaturasa SDD17 descrita en la Figura 3 y una desaturasa ?15 conocida de Synechocystis sp. (SYCDESB). La Figura 5 es una comparación de la secuencia de aminoácido entre la desaturasa SDD17 descrita en la Figura 3 y una desaturasa ?17 conocida de C. elegans (CELEFAT). La Figura 6 es la secuencia de nucleótido de sdd12 (SEC ID NO: 41), un gen derivado de S. diclina (ATCC 56851) que codifica una desaturasa de ácido graso ?12 novedosa. La Figura 7 es la secuencia de aminoácido de la desaturasa ?12 (SDD12) (SEC ID NO: 42) codificada por la secuencia de nucleótido descrita en la Figura 6.

La Figura 8 es una comparación de una secuencia de aminoácido entre la desaturasa SDD12 descrita en la Figura 7 y una desaturasa ?12 conocida de G. hirsutum (GH06DES). La Figura 9 lista los identificadores de secuencia utilizados a lo largo de la solicitud así como la secuencia de aminoácido o nucleótido correspondiente.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Abreviaciones utilizadas en la presente _18J :J.n: =5L ácido oleteo = O A 18: 2n- -6 = ácido linoleico = LA 18: 3n- -6 = ácido gama-linoleico = GLA 18: 3n -3 - ácido alfa-linoleico = ALA 18: 4n- -3 = ácido estearidónico = STA 20: :3n- -6 = ácido dihomo-gama-linoleico = DGLA 20: :4n -6 = ácido araquidónico = AA 20: :4?· -3 = ácido eicosatetraenoico = ETA 20: :5n -3 = ácido eicosapentaenoico = EPA 20: :4n -6 = ácido adrénico 22 :5n -3 = ácido omega-3-docosapentaenoico = DPA 22 :6n -3 = ácido docosahexaenoico = DHA PUFA = ácido graso poliinsaturado El tema objeto de la invención se refiere a las secuencias de nucleótido y aminoácidos traducidas de o3-desaturasa y los genes de desaturasa ?12 aislados de hongos Saprolegnia diclina o S. diclina (ATCC 56851). Además, el tema de la invención también incluye los usos de estos genes y de las enzimas codificadas por estos genes. Por ejemplo, los genes y sus enzimas correspondientes pueden ser utilizados en la producción de ácidos grasos poliinsaturados tales como ácido linoleico, ácido eicosapentaenoico, y similares. Estos ácidos grasos pueden ser agregados a composiciones farmacéuticas, composiciones nutriciona les y otros productos valuables. El_h jigx> S-.-— di el i na — (ATCC 56851), a partir del cual los polinucleótidos descritos aquí fueron aislados, está comercialmente disponible en la Colección de Cultivos de Tipo Americano, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110. El hongo es suministrado congelado y puede ser propagado en agar de harina de maíz de medio 307 ATCC (Difco # 0386) a 24°C. Para información adicional de este hongo, ver Beakes G. (1983) "A comparative account of cyst coat ontogeny in saprophytic and fish-lesion (pathogenic) isolates of the Saprolegnia o7c//'na-parasit¡ca complex." Can. J. Bot. 61 , 603-625; y Willoughby L.G. y otros, (1983) "Zoospore germination of Saprolegnia pathogenic to fish." Trans. Br. Mycol. Soc. 80, 421-435.

El Gen co3-Desaturasa, el Gen ?12-Desaturasa , y las Enzimas Codificadas por los mismos Las enzimas codificadas por los genes de desaturasa 3-omega y delta-12-desaturasa de la presente invención son esenciales en la producción de PUFAs que tienen por lo menos dos instauraciones y una longitud global de 18 carbonos o más. La secuencia de nucleótido del gen de desaturasa omega-3 de Saprolegnia diclina aislado se muestra en la SEC ID NO: 25 y en la Figura 2. Este gen difiere significativamente en secuencia de todos los genes de desaturasa conocidos, de cualquier fuente. La enzima de desaturasa^ La secuencia de nucleótido del gen de desaturasa delta-12 de Saprolegnia diclina aislado se muestra en SEC ID NO: 41 y en la Figura 6. Este gen también difiere significativamente en secuencia de todos los genes de desaturasa conocidos, de cualquier fuente. La enzima de desaturasa delta-12 codificada se muestra en SEC ID NO: 42 y en la Figura 7. El gen de desaturasa omega-3 aislado de la presente invención, cuando se transforma en una huésped de hongo, produce una enzima de desaturasa omega-3 que fácilmente cataliza la conversión de DGLA en ETA, AA en EPA, y ácido adrénico en DPA (ver Ejemplo 5). En igual forma, el gen de desaturasa delta-12 aislado de la presente invención, cuando se transforma en un huésped hongo, produce una enzima de desaturasa delta-12 que fácilmente cataliza la conversión de OA en LA (ver Ejemplo 9).

Se debe observar que la presente invención también abarca secuencias de nucleótido (y las proteínas codificadas correspondientes) que tienen secuencias que comprende, idénticas a, o complementarias a por lo menos alrededor del 50%, preferiblemente por lo menos aproximadamente 60% y más preferiblemente por lo menos alrededor de 70%, aún más preferiblemente por lo menos alrededor de 80% y de preferencia por lo menos 90% de los nucleótidos (es decir, que tiene identidad de secuencia a la secuencia) mostrados en SEC ID NO: 25 y SEC ID diclina, respectivamente) descrito en la presente. (Todos los enteros entre 50% y 100% también se consideran como estando dentro del alcance de la presente invención con respecto al porcentaje de identidad). Dichas secuencias pueden ser derivadas de cualquier fuente, ya sea aisladas de una fuente natural, o producidas a través de una ruta semi-sintética, o sintetizadas de novo. Dichas secuencias pueden ser aisladas de o derivadas de fuentes de hongo, así como de otras fuentes no de hongo, tales como bacterial, de algas, C. elepans, de ratón o ser humano. La presente invención también abarca fragmentos y derivados de las secuencias de nucleótido mostradas en SEC ID NO: 25 y SEC ID NO: 41, así como fragmentos y derivados de las secuencias derivadas de otras fuentes, y que tienen la complementariedad anteriormente descrita, identidad o correspondencia. Los equivalentes funcionales de las secuencias anteriores (es decir, se secuencias que tienen actividad de desaturasa omega-3 o actividad de desaturasa delta-12, según sea apropiado) también se abarcan a través de la presente invención. Para propósitos de la presente invención, un "fragmento" de una secuencia de nucleótido se define como una secuencia contigua de aproximadamente por lo menos 6, preferiblemente por lo menos aproximadamente 8, más preferiblemente de alrededor de 10 nucleótido, y aún más preferiblemente de alrededor de 15 nucleótidos a una región de la secuencia de nucleótido especificada.

La i d e n t i d a d__de____d.e_ce-n c i a — o — o rcénl"aj e de identidad es el número de coincidencias exactas entre de secuencia alineadas divididas entre la longitud de la secuencia más corta y multiplicado por 100. Una alineación aproximada para las secuencias de ácido nucleico se proporciona a través del algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics, s.482-489 (1981). Este algoritmo puede ser extendido al uso con secuencias de péptido o proteína utilizando la matriz de puntuación creada por Dayhoff, Atlas of Proteins Sequences and Structure, M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. EUA, y normalizadas por Gribskov, Nucí. Acids Res. (14(6),: 6745-66763 (1986). El Grupo de Computadora de Genética (GCG) (Madison, Wisconsin) proporciona un programa de computadora que automatiza este algoritmo para ambas secuencias de ácido nucleico y péptido en la aplicación de la utilidad "MejorAjuste". Los parámetros por omisión para este método se describen en el Manual del Programa de Paquete de Análisis de Secuencia de Wisconsin, Versión 8 (1995) (disponible de GCG). Otros programas igualmente adecuados para calcular el porcentaje de identidad o similitud entre secuencias son generalmente conocidos en la técnica. La invención también incluye un polipéptido purificado el cual desatura PUFAs en la posición omega-3 y tiene por lo menos aproximadamente 50% de similitud de aminoácido o identidad, preferiblemente por lo menos alrededor de 60% de similitud o aproximadamente 80% de similitud o identidad, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 90% de similitud o identidad a la secuencia de aminoácido mostrada en SEC ID NO: 26 (Figura 3) y codificada por la secuencia(s) de nucleótido anteriormente observada. (Todos los enteros entre 50% y 100% de similitud o identidad también se incluyen dentro del alcance de la presente invención). La invención además incluye un polipéptido purificado el cual desatura PUFAs en la posición delta-12 y tiene por lo menos aproximadamente 50% de similitud o identidad de aminoácido, preferiblemente por lo menos aproximadamente 60% de similitud o identidad, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 70% de similitud o identidad, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 80% de similitud o identidad, y de preferencia por lo menos aproximadamente 90% de similitud o identidad, a la secuencia de aminoácido mostrada en SEC ID NO: 42 (Figura 7), el cual, a su vez, está codificado por la secuencia(s) de nucleótido anteriormente descrita. (Todos los enteros entre 50% y 100% de similitud o identidad también se incluyen dentro del alcance de la presente invención). El término "identidad" se refiere a la relación de dos secuencias sobre bases de nucleótido-por-nucleótido sobre una ventana o segmento de comparación particular. De esta manera, ¡dentidad""se_"¾éfiñ"é^como el grado de igualdad, correspondencia o equivalencia entre las mismas estructuras de cadena (ya sea sentido o antisentido) de dos segmentos de ADN. El "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre una región particular, determinando el número de posiciones en las cuales la base idéntica ocurre en ambas secuencias con el fin de producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de dichas posiciones por el número total de posiciones en el segmento que se está comparando y multiplicando el resultado por 100. La alineación óptima de secuencias puede ser conducida a través del algoritmo de Smith & Waterman, Appl. Math. 2:482 (1981 ), por el algoritmo de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1979), por el método de Pearson & Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. (EU A) 85:2444 (1988) y por los programas de computadora que implementan los algoritmos relevantes (por ejemplo, Clustal Macaw Pileup (http://cmqm.stanford.edu/biochem218/11Multiple.pdf; Higgins & otros, CABIOS. 5L151-153 (1989), FASTDB (Intelligenetics), BLAST (National. Center for Biomedical Information; AltschuI y otros, Nucleic Acids Research 25:3389-3402 (1997)), PILEUP (Genetics Computer Group, Madison, Wl), o GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA (Wisconsin Genetics Software Package Reléase 7.0, Genetics Computer Group, Madison, Wl). (Ver Patente de E.U.A. No. 5,912,120.). Para propósitos de la presente invención, "complementariedad" se define como el grado de relevancia entre dos segmentos de ADN. S-e- determina midien do la habilidad de la estructura d-e_e_a_d_e_n_a d_e sentido de un segmento de ADN para hibridizar con la estructura de cadena antisentido del otró segmento de ADN, bajo condiciones apropiadas, para formar una hélice doble. Un "complemento" se define como una secuencia la cual hace pareja a una secuencia dada en base a las reglas de aparejamiento de base canónica. Por ejemplo, una secuencia A-G-T en una estructura de cadena de nucleótido es "complementaria" a T-C-A en la otra estructura de cadena. En la hélice doble, la adenina aparece en una estructura de cadena, la tiamina aparece en la otra estructura de cadena. Similarmente, siempre que se encuentre guanina en una estructura de cadena, la citosina se encuentra en la otra. Entre mayor la relación entre las secuencias de nucleótido o dos segmentos de ADN, mayor es la habilidad para formar dobletes híbridos entre las estructuras de cadena de los dos segmentos de ADN. La "similitud" entre dos secuencias de aminoácido se define como la presencia de una serie de residuos de aminoácido idénticos, así como conservados en ambas secuencias. Entre más alto el grado de similitud entre dos secuencias de aminoácido, más alta es la correspondencia, igualdad o equivalencia de dos secuencias. (La "identidad" entre dos secuencias de aminoácido se define como la presencia de unas series de residuos de aminoácido exactamente parecidas o invariantes en ambas secuencias). Las definiciones de "complementariedad", "identidad" y "similitud" son bien conocidas por _a-q.u. e l los c o n_e x p_e.r i e n.cJ a e n I a técnica "Codificado por" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de polipéptido, en donde la secuencia de polipéptido o una porción de la misma contiene una secuencia de aminoácido de por lo menos 3 aminoácidos, más preferiblemente por lo menos 8 aminoácidos, y aún más preferiblemente por lo menos 15 aminoácidos de un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico. La presente invención también abarca una secuencia de nucleótido aislado el cual codifica actividad de desaturasa PUFA y que es hibridizable, bajo condiciones moderadamente estrictas, a un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido que comprende o complementa la secuencia de nucleótido que comprendida en SEC ID NO: 25 o SEC ID NO: 41. Una molécula de ácido nucleico es "hibridizable" a otra molécula de ácido nucleico cuando una forma de estructura de cadena individual de la molécula de ácido nucleico puede endurecer a la otra molécula de ácido nucleico bajo las condiciones apropiadas de temperatura y resistencia iónica (ver Sambrook y otros, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York)). Las condiciones de temperatura y resistencia iónica determinan la "severidad" de la hibridación. La "hibridación" requiere que dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias. Sin embargo, dependiendo de la severidad de la hibridación, pueden ocurrir desajustes entre bases. La severidad _a.p_ o_p_i.a_d a__p_a _a_h_i b r_i_d_i.z a.r___ c ixl_o_s_ n_u_cl e 1C_Q_S depende de la longitud . d_e_ los ácidos nucleicos y del grado de complementación. Dichas variables son bien conocidas en la técnica. Más específicamente, entre mayor es el grado de similitud o homología entre dos secuencias de nucleótido, mayor es el valor de Tm para los híbridos de los ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. Para híbridos mayores de 100 nucleótidos de longitud, las ecuaciones para calcular Tm han sido derivadas (ver Sambrook y otros, supra). Para la hibridación con ácidos nucleicos más cortos, la posición de los desajustes se convierten en más importantes, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (ver Sambrook, y otros, supra). Como se utiliza aquí, un "fragmento o secuencia de ácido nucleico aislado" es un polímero de ARN o de ADN que es de estructurad de cadena individual o doble, opcionalmente conteniendo bases de nucleótido sintéticas, no naturales o alteradas. Un fragmento de ácido nucleico aislado en la forma de un polímero de ADN puede estar comprendido de uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico, o ADN sintético. (Un "fragmento" de un polinucleótido especificado se refiere a una secuencia de polinucleótido que comprende una secuencia contigua de aproximadamente por lo menos alrededor de 6 nucleótidos, preferiblemente de por lo menos aproximadamente 8 nucleótidos, más preferiblemente de por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos, y aún más preferiblemente de por lo menos aproximadamente 15 nucleótidos, y de preferencia de or lo me nos aproximadamen t e 2_5 ? u„c±e_ó_tidx> s _Ld_é_nli c os o_ complementarios a una región de la secuencia de nucleótido especificada). Los nucleótidos (usualmente encontrados en su forma 5'-monofosfato) son referidos a, a través de su designación de letra individual como sigue: "A" para adenilato o desoxiadeni lato (para ARN o ADN, respectivamente), "C" para citidilato o desoxicitidilato, "G" para guanilato o desoxiguanilato, "U" para uridilato, "T" para desoxitimidilato, "R" para purinas (A o G), "Y" para pirimidinas (C o T), "K" para G o T, "H" para A o C o T, "I" para inopina, y "N" para cualq uier nucleótido. Los términos "fragmento o sub-fragmento que es funcionalmente equivalente" y "fragmento o sub-fragmento funcionalmente equivalente", se utilizan intercambiablemente en la presente. Estos términos se refieren a una porción o sub-secuencia de un fragmento de ácido nucleico aislado en el cual la habilidad para alterar la expresión del gen o producir un cierto fenotipo se conserva si o no el fragmento o sub-frag mentó codifica una enzima activa. Por ejemplo, el fragmento o sub-fragmento puede ser utilizado en el diseño. de construcciones quiméricas para producir el fenotipo deseado en una planta transformada. Las construcciones quiméricas pueden ser diseñadas para uso en co-supresión o antisentido enlazando un fragmento o sub-fragmento de ácido nucleico del mismo, si o no codifica una enzima activa, en la orientación apropiada con relación a una secuencia promotora de planta. Los té r min_o s "Immjo Logia "_, " m ó I oyó", " s_u.b_s t aixcj a Inxen le similar" y "substancialmente correspondiente", se utilizan de manera intercambiable en la presente. Estas se refieren a fragmentos de ácido nucleico en donde los cambios en una o más bases de nucleótido no afectan la habilidad del fragmento del ácido nucleico para mediar la expresión de gen o producir un cierto fenotipo. Estos términos también se refieren a modificaciones de los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención tales como eliminación o inserción de uno o más nucleótidos que no alteran substancialmente las propiedades funcionales del fragmento de ácido nucleico resultante con relación al fragmento inicial, no modificado. En consecuencia se entiende, como se apreciará por aquellos con experiencia en la técnica, que la invención abarca más que secuencias ilustrativas específicas. "Gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína especifica, incluyendo secuencias reguladoras precedentes (secuencias no de codificación 5') y siguientes (secuencias de no codificación 3') a la secuencia que codifica. "Gen nativo" se refiere a un gen como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. En contraste, "construcción quimérica" se refiere a una combinación de fragmentos de ácido nucleico que no se encuentran normalmente en la naturaleza. Por consiguiente, una construcción quimérica puede comprender secuencias reguladoras y secuencias de codificación que se derivan de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y se-C-iie n_cia s d_e c_Q.dltLc.axjj3.rj d eriv adas de la misma fuente , pero configuradas en una forma diferente que aquellas normalmente encontradas en la naturaleza. (El término "aislado" significa que la secuencia es removida de su ambiente natural.) Un gen "foráneo" se refiere a un gen que no se encuentra normalmente en el organismo huésped, pero que es introducido dentro del organismo huésped a través de transferencia de gen. Los genes foráneos pueden comprender genes nativos insertados dentro del organismo no nativo, o construcción quimérica. Un "transgen" es un gen que ha sido introducido dentro del genoma a través del procedimiento de transformación. "Secuencia de codificación" se refiere a una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácido específica. "Secuencias reguladoras" se refieren a secuencias de nucíeótido localizadas en la corriente ascendente (secuencias no de codificación 5'), dentro, o corriente descendente (secuencias no de codificación 3') de una secuencia de codificación, y la cual influencia la transcripción, el procesamiento o estabilidad del ARN, o la traducción de la secuencia de codificación asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir, pero no se limitan a, promotores, secuencias líderes de traducción, intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación. "Promotor" se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia de codificación o ARN funcional. La secuencia promotor consiste de elementos próximos o más distantes de corriente ascendente, los elementos anteriores por I o g e-n_e.r_aJ referidos como mejoradores. Por cons i g _u_¡ e nte, un. "mejorador" es una secuencia de ADN que puede estimular la actividad del promotor y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para mejorar el nivel o especificidad del tejido de un promotor. Las secuencias promotor también pueden ser localizadas dentro de las porciones transcritas de los genes, y/o corriente descendente de las secuencias transcritas. Los promotores pueden ser derivados en su totalidad de un gen nativo, o pueden estar compuestas de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o aún comprenden segmentos de ADN sintéticos. Se entiende por aquellos con experiencia en la técnica que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de célula, o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Los promotores que causan que un gen sea expresado en la mayoría de los tipos de célula en la mayoría de las veces son comúnmente referidos como "promotores constitutivos". Los nuevos promotores de varios tipos útiles en células de planta están siendo constantemente descubiertos; numerosos ejemplos pueden ser encontrados en el compilación de Okamuro y Goldberg, (1989) Biochemistry of Plants 75:1-82. Además se reconoce que ya que en la mayoría de los casos los límites exactos de secuencias reguladoras no han sido completamente definidos, los fragmentos de ADN de alguna variación pueden tener idéntica actividad promotora. U-n_^_¡.n-tr-ó n— e s u na- s-e-c-u-e.ac.i-a q u e i n-t.e_r_v_i_e_n_e_e n u„n_g_e_n_q_uje„n_o codifica una porción de la secuencia de proteína. De esta manera, dichas secuencias son transcritas dentro del ARN pero entonces son eliminadas y no traducidas. El término también se utiliza para las secuencias de ARN eliminadas. Un "exón" es una porción de la secuencia de un gen que es transcrito y se encuentra en el mensajero maduro de ARN derivado del gen, pero no es necesariamente una parte de la secuencia derivada que codifica el producto de gen final. La "secuencia líder de traducción" se refiere a una secuencia de ADN localizada entre la secuencia promotor de un gen y la secuencia de codificación. La secuencia líder de traducción está presente en la corriente ascendente de ARNm completamente procesada de la secuencia de inicio de traducción. La secuencia líder de traducción puede afectar el procesamiento de la transcripción primaria de ARNm, la estabilidad del ARNm, o eficiencia de la traducción. Ejemplos de secuencias líderes de traducción ha sido descritas (Turnes, R. y Foster, G.D. (1995) Molecular Biotechnology 3:225). "Secuencias no de codificación 3"' se refiere a secuencias de ADN localizadas en la corriente descendente de una secuencia de codificación e incluye secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar el procesamiento de ARNm o la expresión del gen. La señal de poliadenilación está usualmente caracterizada por l a-af e cc i ó n-d-e-l a— a d i &i ó -n-d-e— tractos de- cid_o_ p-lia.de nlLLco aJ extremo 3' del precursor de ADNm. El uso de diferentes secuencias no de codificación 3' se ejemplifica a través de Ingelbrecht y otros, (1989) Plant Cell 7:671-680. "Transcripción de ARN" se refiere al producto resultante de trascripción catalizada de polimerasa de ARN de una secuencia de ADN. Cuando la transcripción de ARN es una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN, es referida como la transcripción primaria o puede ser una secuencia de ARN derivada del procesamiento post-transcripcional de la transcripción primaria y es referida como el ARN maduro. "ARN Mensajero (ARNm)" se refiere al ARN que está sin intrones y que puede ser traducida a la proteína a través de la célula. "ADNc" se refiere a un ADN que es complementario a y sintetizado por una plantilla de ARNm utilizando transcriptasa inversa de enzima. El ADNc puede ser una forma de estructura de cadena individual o convertida a una estructura de cadena doble utilizando el fragmento Klenow de polimerasa de ADN I. ARN "Sentido" se refiere a una transcripción de ARN que incluye el ARNm y puede ser traducida a proteína dentro de una célula o in vitro. "ARN Antisentido" se refiere a una transcripción de ARN que es complementara a todas o parte de las transcripciones primarias objetivo o ARNm y que bloquea la expresión del gen objetivo (Patente de E.U.A. No. 5,107,065). La complementariedad de un ARN antisentido puede ser con cualquier parte de la transcripción de gen específico, es decir, en la secuencia no de codificación 5', la secuencTa- n~o — d e — c o d if i e a e i ó -n- -3^, — i n-t-r-o n e s — o — La — S-e u-e^acia d^ codificación. "ARN funcional" se refiere a ARN antisentido, ARN de ribozima, u otro ARN que puede no ser traducido pero aún tiene efecto sobre los procesos celulares. Los términos "complemento", y "complemento inverso" se utilizan de manera intercambiable en la presente con respecto a transcripciones de ARNm, y se pretende que definan el ARN antisentido del mensaje. El término "ARN endógeno" se refiere a cualquier ARN que es codificado a través de cualquier secuencia de ácido nucleico presente en el genoma del huésped antes de la transformación con la construcción recombinante de la presente invención, si es de existencia natural o no se existencia natural, es decir, introducida a través de medios recombinantes, mutagénesis, etc. El término "de existencia no natural" significa artificial, no consistente con lo que normalmente se encuentra en la naturaleza.

El término "operablemente enlazada" se refiere a la asociación de las secuencias de ácido nucleico en un fragmento de ácido nucleico individual por lo que la función de uno está regulada por el otro. Por ejemplo, un promotor está operablemente enlazado con una secuencia de codificación cuando es capaz de regular la expresión de la secuencia de codificación (es decir, que la secuencia de codificación está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias de codificación pueden estar operablemente enlazadas a secuencias reguladoras en una orientación sentido o antisentido. En otro ejemplo, las regiones de ARN complementarias de la invención pueden estar operablemente enlazadas, ya sea directamente o 3' al ARNm objetivo, o dentro del ARNm objetivo, o una primera región complementaria es 5' y su complemento es 3' al ARNm objetivo. El término "expresión", como se utiliza aquí, se refiere a la producción de un producto final funcional. La expresión de un gen involucra la transcripción del gen y la traducción del ARNm en un precursor o proteína madura. "Inhibición antisentido" se refiere a la producción de transcripciones de ARN antisentido capaces de suprimir la expresión de la proteína objetivo. "Co-supresión" se refiere a la producción de transcripciones de ARN sentido capaces de suprimir la expresión de genes foráneos o endógenos idénticos o substancialmente similares (Patente de E.U.A. No. 5.231.020). Proteína "madura" se refiere a un polipéptido procesado después de la traducción; es decir, uno a partir del cual cualquier pre- o propéptido presente en el producto de traducción primaria ha sido removido. Proteína "precursora" se refiere al producto primario de la traducción de ARNm; es decir, con pre- y propéptidos aún presentes. Los pre- y propéptidos pueden ser pero no se limitan a señales de localización intracelulares. "Transformación estable" se refiera a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en un genoma de un organismo huésped, incluyendo ambos genomas, nuclear y organelar, dando como resultado una herencia genéticamente estable. En contraste, "transformación transitoria" se refiere a la transferencia de un fra gTffeTTtó <3?~ acficlo nucleico dentro del núcleo, o organelo que contiene ADN, de un organismo huésped dando como resultado la expresión del gen sin la integración o herencia estable. Los organismo huésped que contienen fragmentos de ácido nucleico transformados son referidos como organismos "transgénicos". El método preferido de transformación de célula de arroz, maíz, u otras monocotiledóneas es el uso de tecnología de transformación de partículas aceleradas o "pistola de gen" (Klein y otros, (1987) Nature (Londres) 327:70-73; Patente de E.U.A. No. 4,945,050). O un método mediado por Agrobacteria utilizando un plásmido Ti apropiado que contiene el transgen (Ishida y otros, 1996, Nature Biotech, 14:745-750). El término "transformación" como se utiliza aquí, se refiere a ambas transformaciones, la estable y la transitoria. Las técnicas de ADN recombinante estándares y clonación molecular utilizadas en la presente son bien conocidas en la técnica y se describen más completamente en Sambrook, J. Fritsch, E.F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (de aquí en adelante "Sambrook"). El término "recombinante" se refiere a una combinación artificial de dos segmentos separados de algún modo de secuencia, por ejemplo, a través de síntesis química o a través de la manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos a través de técnicas de ingeniería genética. "PCR" o "Reacción de Cadena de Polimerasa" es una técnica para — la s ntesis dé~ ¾ra7¡des cantidades de segmentos de ADN específicos, que consiste de series de ciclos repetitivos (Perkin Elmer Cetus Instruments, Norwalk, CT). Típicamente, el ADN de estructura de cadena doble se calienta desnaturalizados, los dos iniciadores complementarios a los límites 3' del segmento objetivo son endurecidos a baja temperatura y después extendidos a una temperatura intermedia. Un grupo de estos tres pasos consecutivos es referido como un ciclo. Reacción de cadena de polimerasa ("PCR") es una técnica poderosa utilizada para amplificar ADN millones de veces, a través de la replicación repetida de una plantilla, en un corto período de tiempo. (Mullís y otros, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 (1986); Erlich y otros, Solicitud de Patente Europea 50,424; Solicitud de Patente Europea 84,796; Solicitud de Patente Europea 50,424; Solicitud de Patente Europea258,017; Solicitud de Patente Europea 50,424; Solicitud de Patente Europea 237,362; Mullís, Solicitud de Patente Europea 50,424; Solicitud de Patente Europea 201,184, Mullís y otros, Patente de E.U.A. No. 4,683,202; Erlich, Patente de E.U.A. No. 4,582,788; y Saiki y otros, Patente de E.U.A. No. 4,683,194). El proceso utiliza grupos de oligonucleótidos sintetizados in vitro específicos a síntesis de ADN prima. El diseño de los iniciadores es dependiente de las secuencias de ADN que se desea analizar. La técnica se lleva a cabo a través de muchos ciclos (usualmente 20-50) de fusión de la plantilla a alta temperatura, permitiendo que los iniciadores endurezcan las secuencias complementarias — dentro — de la" pía ñt ¡TI a y~ después replicando la plantilla con polimerasa de ADN. Los productos de las reacciones PCR son analizados a través de separación en geles de agarosa seguido por tinción con bromuro de etidio y visualización con transluminación UV. Alternativamente, los dNTPs radioactivos pueden ser agregados a PCR con el fin de incorporar una etiqueta en los productos. En este caso los productos de PCR son visualizados a través de la exposición del gel a película de rayos x. La ventaja agregada de radiomarcar productos PCR es que los niveles de productos de amplificación individuales pueden ser cuantificados. Los términos "construcción recombinante", "construcción de expresión", y "construcción de expresión recombinante", se utilizan de manera intercambiable aquí. Estos términos se refieren a una unidad funcional de material genético que puede ser insertado dentro del genoma de una célula utilizando metodología estándar bien conocida por alguien con experiencia en la técnica. Dicha construcción puede ser ella misma o puede ser utilizada en conjunción con un vector. Si se utiliza un vector, entonces la selección del vector depende del método que será utilizado para la transformación de plantas huésped, así como es bien conocido por aquellos con experiencia en la técnica. Por ejemplo, un vector de plásmido puede ser utilizado. Un artesano experto está bien advertido de que los elementos genéticos deben estar presentes en el vector con el fin de exitosamente transformar, seleccionar y —pjio-p-ag-a-r — e-é lulas — huésped qué c rTp Feñ d e n cualquiera de los fragmentos de ácido nucleico aislados de la invención. El artesano experto también reconocerá que resultarán diferentes eventos de transformación diferentes en diferentes niveles y patrones de expresión (Jones y otros, (1985), EMBO J. 4:2411-2418; De Almeida y otros, (1989) Mol. Gen. Genetics 218:78-86), y de esta forma los múltiples eventos puede ser clasificados con el fin de obtener líneas que despliegan el nivel y patrón de expresión deseado. Dicha clasificación puede ser lograda a través del análisis Southern de ADN, análisis Northern de expresión de ARNm, análisis Western de expresión de proteína, o análisis fenotípico.

Expresión de Genes de Desaturasa Omeqa-3 y de Desaturasa Delta 12 Una vez que los genes que codifican las enzimas de desaturasa omega-3 y de delta-12 han sido aislados, pueden entonces ser introducidos dentro de una célula huésped ya sea procariótica o eucariótica (individualmente o en combinación) a través del uso de un vector o construcción. El vector, por ejemplo, un bacteriófago, cósmido o plásmido, puede comprender la secuencia de nucleótido que codifica cualquiera o ambas de las enzimas de desaturasa, así como cualquier promotor que es funcional en la célula huésped y es capaz de dividir la expresión de la desaturasa(s) codificadas mediante — la — seeue-neiafs-) — de nucí eofi cfo~ ÉT promotor esté en asociación operable con, u operablemente enlazado, a la secuencia de nucleótido. (Como se observó anteriormente, una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor) se dice que está "operablemente enlazada" con una secuencia de codificación si la secuencia reguladora afecta la transcripción o expresión de la secuencia de codificación. El promotor (u otro tipo de secuencia reguladora) no necesita estar directamente enlazada a la secuencia de codificación. Los promotores adecuados incluyen, por ejemplo, aquellos de genes que codifican deshidrogenasa de alcohol, deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato, fosfoglucoisomerasa, cinasa de fosfoglicerato, fosfatasa ácida, T7, TPI, lactasa, metalotioneina, intermediario anterior de citomegalovirus, suero de proteína ácida, glucoamilasa, y promotores activados en presencia de galactosa, por ejemplo, GAL1 y GA O. Adicionalmente, las secuencias de nucleótido que codifican otras proteínas, oligosacáridos, lípidos, etc., también pueden ser incluidas dentro del vector, así como otras secuencias reguladoras tales como una señal de poliadenilación (por ejemplo, la señal poli-A del antigen SV-40T, iovalalbumina o hormona del crecimiento de bovino), marcadores de resistencia antibiótica, marcadores autotróficos, y similares. La elección de las secuencias presentes en la construcción depende de los productos de expresión deseados, la naturaleza de la célula huésped, y los medios propuestos para separar las células transformadas de las células no transformadas. — Gomo— se m ene i nO"~anteTi"orrñ eTTte", LTñá~~vez que el vector ha sido construido, puede entonces ser introducido dentro de la célula huésped de elección a través de métodos conocidos por aquellos con experiencia en la técnica incluyendo, por ejemplo, transfección , transformación, y electroporación (ver Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 2a. edición, Vol. 1-3, ed. Sambrook y otros, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). La célula huésped entonces es cultivada bajo condiciones adecuadas permitiendo la expresión de los genes que conducen a la producción del PUFA deseado, el cual entonces es recuperado y purificado. (El substrato el cual puede ser producido a través de la célula huésped ya sea naturalmente o transgénicamente, así como las enzimas las cuales pueden ser codificadas a través de secuencias de ADN presentes en el vector, la cual es subsecuentemente introducida dentro de la célula huésped, se muestran en la Figura 1.). Ejemplos de células huésped procarióticas adecuadas incluyen, por ejemplo, bacteria tal como Escherichia coli y Bacilus subtilis, así como cianobacteria tal como Spirulina spp. (es decir, alga azul-verde). Ejemplos de células huésped eucarióticas incluyen, por ejemplo, células de mamífero, células de planta, células de levadura tales como Saccharomyces cerevisiae, Saccharaomyces carlsbergensis, Lipomyces starkey, Candida spp. tal como Yarrowia (Candida) lipolytica, Kluyveromyces spp., Pichia spp., Trichoderma spp., o Hansenula spp., o células de hongo tales como células de hongo filamentosas, por ejemplo, Aspergillus, Neurospora, y P-enieill-i-um. — P e fe r i bte ent e~ se uTNTzañ ceT ülas Saccharomyces cervisiae (levadura de panadero). La expresión en una célula huésped puede ser lograda en una forma transitoria o estable. La expresión transitoria puede ocurrir a partir de construcciones introducidas que contienen señales de expresión funcionales en la célula huésped, que cuyas construcciones no replican y raramente se integran dentro de la célula huésped, o en donde la célula huésped no se está proliferando. La expresión transitoria también puede ser lograda induciendo la actividad de un promotor regulable operablemente enlazado al gen de interés, aunque dichos sistemas frecuentemente exhiben un nivel basal bajo de expresión. La expresión estable puede ser lograda introduciendo una construcción que se pueden integrar dentro del genoma huésped o que autónomamente replica en la célula huésped. La expresión estable del gen de interés pueden ser seleccionada a través del uso de un marcador seleccionable localizado en o co-transfectado con la construcción de expresión, seguido por la selección de las células que expresan el marcador. Cuando la expresión estable resulta de la integración, el sitio de la integración de la construcción puede ocurrir de manera aleatoria dentro del genoma huésped o pueden ser activada a través del uso de construcciones que contienen regiones de homología con el genoma huésped suficiente para activar la recombinación con el lugar huésped. En donde las construcciones son activadas a un lugar endógeno, todas o algunas de las regiones reguladoras t_r_ a_n s_cr Lp-cio n a I e s- -o -d -e— t-r a du c c i ó tt p a~e~d "en - seT^pT D vTsTa s a través del lugar endógeno. Un mamífero transgénico también puede ser utilizado con el fin de expresar las enzimas de la presente invención, y de esta forma finalmente produce el PUFA(s) de interés. Más específicamente, una vez que las construcciones anteriormente mencionadas son creadas, pueden ser insertadas dentro del pronúcleo de un embrión. El embrión puede entonces ser implantado dentro de un recipiente hembra. Alternativamente, un método de transferencia nuclear también puede ser utilizado (Schnieke y otros, Science 278:2130-2133 (199)). La gestación y nacimiento entonces son permitidas para ocurrir (ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,750,176 y Patente de E.U.A. No. 5.700.671). Leche, tejido, u otras muestras de fluido del vástago entonces deberán contener niveles alterados de PUFAs, según comparado con los niveles normalmente encontrados en el animal no transgénico. Las generaciones subsiguientes pueden ser monitoreadas para la producción de niveles alterados o mejorados de PUFAs y de esta forma la incorporación del gen(es) que codifican la enzima(s) de desaturasa deseada dentro de sus genomas. El mamífero utilizado como el huésped puede ser seleccionado del grupo que consiste de, por ejemplo, ratones, ratas, conejos, cerdos (porcinos), cabras y ovejas (ovinos), caballos y bovinos. Sin embargo, cualquier mamífero puede ser utilizado siempre que tenga la habilidad de incorporar ADN que codifican enzimas de interés dentro de sus genomas. Pata Ja-e xp re s i ó n de- -un- p o Hp é p tido d~é~ d e~s álTíra s a7 las regiones de iniciación y terminación transcripcionales y de traducción están operablemente enlazadas al ADN que codifica el polipéptido de desaturasa de interés. Las regiones de iniciación y terminación transcripcionales y de traducción se derivan de una variedad de fuentes no exclusivas, incluyendo el ADN que va a ser expresado, genes conocidos o que se sospecha que son capaces de expresión en el sistema deseado, vectores de expresión, síntesis química, o de un lugar endógeno en una célula huésped. La expresión en un tejido de planta y/o parte de la planta presenta ciertas eficiencias, particularmente en donde los tejidos o una parte es una que es cosechada anteriormente, tal como una senilla, hojas, frutas, flores, raíces, etc. La expresión puede ser activada a esa ubicación con la planta a través del uso de la secuencia reguladora específica tal como aquellas de las patentes de E.U.A. Nos. 5,463,174; 4,943,674; 5,106,739; 5,175,095; 5,420,034; 5,188,958; y 5,589,379. Alternativamente, la proteína expresada puede ser una enzima que produce un producto, y ese producto puede ser incorporado, ya sea directamente o sobre modificaciones adicionales, dentro de una fracción de fluido de la planta huésped. La expresión de un gen de desaturasa, o transcripciones de desaturasa antisentido, pueden alterar los niveles de PUFAs específicos, o derivados de los mismos, encontrados en partes de plantas y/o tejidos de planta. El polipéptido de desaturasa que codifica la región puede ser expresado ya sea por sí mimoso o con otros genes, con el fin de producir tejidos y/o partes d_e_pJan-ta que — contienen— prop rcione^ mas a tas~~de Tos PUFAs deseados, o en los cuales la composición de PUFA más cercanamente reensambla aquella de la leche materna de ser humano (Prieto y otros, publicación PCT WO 95/24494). La región de terminación se puede derivar de la región 3' del gen a partir del cual la región de iniciación fue obtenida o fe un gen diferente. Un número mayor de regiones de terminación son es conocido como siendo satisfactorio en una variedad de huéspedes de el mismo y diferente género y especie. La región de terminación usualmente se selecciona como un aspecto de conveniencia en lugar de debido a una propiedad particular. Como se observó anteriormente, una planta (por ejemplo, Glycina max (fríjol de soya) Brassica napus (cañóla) o tejido de planta también puede ser utilizada como un huésped o una célula huésped, la cual puede, a su vez, ser utilizada en la producción de PUFAs. Más específicamente, los PUFAs deseados pueden ser expresados en semillas. Los métodos de aislamiento de aceites de semilla son conocidos en la técnica. De esta manera, además de proporcionar una fuente para los PUFAs, los componentes de los aceites dé semillas pueden ser manipulados a través de la expresión de los genes de desaturasa, así como quizás otros genes de desaturasa y genes de elongasa, para proveer aceites de semillas que pueden ser adicionados a composiciones nutricionales, composiciones farmacéuticas, alimentos para animales, y cosméticos. Una vez más, un vector que comprende una secuencia de -A-D N-q u e- e o d i f \ c a~e ~ g e n~d e^des aTCTr ~as~á~d e ñ teres , operablemente enlazado a un promotor, es introducido dentro del tejido de planta o planta durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la expresión del gen de desaturasa. El vector también puede comprender uno o más genes que codifican otras enzimas, por ejemplo, las enzimas delta-5-desaturasa, elongasa, delta-12-desaturasa, delta-15 desaturasa, delta-17-desaturasa y/o delta-19-desaturasa. El tejido de planta o planta puede producir el substrato relevante (por ejemplo, ácido adrénico o DPA) sobre el cual actúa la enzima o un vector que codifica enzimas que producen dichos substratos pueden ser introducidos dentro del tejido de planta, célula de planta o planta. Además, los substratos adecuados pueden ser rociados sobre los tejidos de planta expresando las enzimas apropiadas. Al utilizar estas varias técnicas, se pueden producir PUFAs a través del uso de una célula de planta, tejido de planta o planta. También se debe observar que la invención también abarca una planta transgénica que comprende el vector anteriormente mencionado, en donde la expresión de la secuencia(s) de nucleótido del vector da como resultado la producción de la PUFA deseada, por ejemplo, las semillas de la planta transgénica. La regeneración, desarrollo y cultivación de plantas de transformantes de protoplasto de planta individual o de varios explantes transformados es bien conocida en la técnica (Weissback y Wiessback, En: Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.), Academic Press, Inc. San Diego, CA, (1988)). Este proceso de re g _e_n_exa c ió — y — c-r-e-e imiento tipie anreTrt ¾ i TTc I Ty los pasos de selección de las células transformadas, cultivando aquellas células individualizadas a través de etapas usuales de desarrollo embriónico a través de la etapa de planta joven enraizada. Los embriones transgénícos y semillas son similarmente regenerados. Los retoños enraizados transgénícos resultantes son después plantados en un medio de crecimiento de planta apropiado tal como tierra. El desarrollo o regeneración de plantas que contienen el gen foráneo, exógeno que codifica una proteína de interés es bien conocido en la técnica. Preferiblemente, las plantas regeneradas son auto-polinizadas para proveer plantas transgénicas homocigosas. Por el contrario, el polen obtenido de plantas regeneradas está entrelazado a plantas de crecimiento por semilla de líneas agronómicamente importantes. Inversamente, el polen de plantas de estas lineas importantes se utiliza para polinizar plantas regeneradas. Una planta transgénica de la presente invención que contiene un polipéptido deseado se cultiva utilizando métodos bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Existe una variedad de métodos para la regeneración de plantas a partir de tejidos de planta. El método particular de regeneración dependerá del tejido de planta de partida y la especie de la planta particular que va a ser regenerada. Los métodos para transformar dicotiledóneas, principalmente a través del uso de Agrobacterium tumefaciens, y obteniendo plantas transgénicas que han sido publicadas para algodón (Patente de E .U_ ^_No_.__5-,-0-04^86-2— Patente nde'E'ü A ^ No ~~~5~T59 ,135, Patente de E.U.A. No. 5,518,908), frijol de soya (Patente de E.U.A. No. 5,569,834, Patente de E.U.A. No. 5,416,011 , MaCabe y otros, BiolTechnology 6:923 (1988), Christou y otros, Plant Physiol. 87:671-674 (1988); Brassica (Patente de E.U.A. No. 5,463,174); cacahuate (Cheng y otros, Plant Cell Rep. 15:653-657 (1996), McKently y otros Plant Cell Rep. 14:699-703 (1995)); papaya; y chícharo (Grant y oros, Plant Cell Rep. 15:254-258, (1995)). La transformación de monocotiledóneas utilizando electroporación, bombardeo de partículas, y Agrobacterium ha sido lograda en espárragos (Bytebier y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. (EUA) 84:5354, (1987)); cebada (Wan y Lemaux, Plant Physiol 104:37 (1994)); Zea mays (Rhodes y otros, Science 240:204 (1988); Gordon-Kamn y otros, Plant Cell 2:603-618 (1990), Fromm y otros, BioTechnology 8:833 (1990), Koziel y otros, BioTechnology, 11: 194 (1993), Armstrong y otros, Crop Sciences 35:550-557 (1992); avena (Somers y otros, BioTechnology, 10: 15 89 (1992), pasto de huerta (Horn y otros, Plant Cell Rep. 7:469 (1988)); arroz (Toriyama y otros, TheroAppl. Genet. 205:34 (1986); Part y otros, Plant Mol. Biol. 32:1135-1148, (1996); Abedinia y otros, Aust. J. Plant Physiol. 24:133-141 (1997); Zhang y Wu, Thero. Appl. Genet. 76:835 (1988); Zhang y otros Plant Cell Rep. 7:739 (1988); Battraw y Hall. Plant Sci. 86:191-202 (1991)), centeno (De la Peña y otros, Nature 325:274 (1987)); caña de azúcar (Bower y Birch, Plant J. 2:409 (1992)); pasto alto (Vasil y otros, Bio/Technology 10:667 (1992); Patente de E.U.A. _N o^_5, 63UL5 " Se han desarrollado ensayos para la expresión de gen en base a la expresión transitoria de construcciones de ácido nucleico clonadas a través de la introducción de moléculas de ácido nucleico en células de planta mediante el tratamiento de glicol polietiiénico, electroporación, o bombardeo de partícula (Marcotte y otros, Nature 335: 454-457 (1988); Marcotte y otros, Plant Cell 1:523-532 (1989); MacCarty y otros, Cell 66:895-905 (1991); Hattori y otros, Genes Div. 6:609-618 (1992); Goff y otros, EMBO J. 9:2517-2522 (1990). Los sistemas de expresión transitorios pueden ser utilizados para f uncionalmente diseccionar construcciones de gen (ver generalmente Maliga y otros, Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995)). Se entiende que cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención puede ser introducida en una célula de planta en una forma permanente o transitoria en combinación con otros elementos genéticos tales como vectores, promotores, mejoradores, etc. Además de los procedimientos anteriormente discutidos, los practicantes están familiarizados con los materiales de fuente estándar que describen condiciones específicas y procedimientos para la construcción, manipulación y aislamiento de macromoléculas (por ejemplo, moléculas de ADN, plásmidos, etc.), la generación de organismos recombinantes y la clasificación y aislamiento de clones (ver por ejemplo, Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989); Maliga y otros, Methods in Birren y otros, Genome Analysis: Detecting Genes, 1, Cold Spring Harbor Nueva York (1998); Birren y otros, Genome Analysis: Analyzing ADN, 2, Cold Spring Harbor Nueva York (1998).; Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, eds. Clark, Springer, Nueva York (1997)). En vista de lo anterior, la presente invención abarca un método para producir una enzima de desaturasa omega-3 y/o de desaturasa delta-12, el método comprende los pasos de: 1) aislar la secuencia de nucleótido del gen que codifica la enzima(s) de desaturasa deseada; 2) construir un vector que comprende la secuencia(s) de nucleótido; y 3) introducir el vector dentro de una célula huésped durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la producción de la enzima(s) de desaturasa. La presente invención también abarca un método para la producción de PUFAs, el método comprende exponer un substrato de ácido graso adecuado a la enzima de tal manera que la desaturasa convierte el substrato de ácido graso en un producto PUFA deseado. Por ejemplo, cuando AA (20:4n-6) es expuesto a la enzima de desaturasa omega-3 de la presente invención, se convierte en EPA (20:5n-3). La EPA así formada puede ser convertida en DPA (22:5n- 3) a través de la acción de una elongasa, y el DPA subsecuentemente convertido en DHA (22:6n-3) a través de una desaturasa delta-4. De la misma forma, cuando OA (18:1n-9) es expuesto a la enzima de desaturasa delta-12 de la presente invención, es en virtualmente todos los PUFAs mostrados en la Figura 1 a través de las acciones subsiguientes de desaturasas y/o elongasas adecuadas.

Usos de los Genes de Desaturasa en Cuestión y Enzimas Codificadas por los mismos; Como se observó anteriormente, los genes de desaturasa aislados y las enzimas de desaturasa codificadas por los mismos pueden tener varios usos. Por ejemplo, los genes y las enzimas correspondientes pueden ser utilizados indirectamente o directamente, individualmente o en combinación, en la producción de PUFAs. Por ejemplo, la desaturasa omega-3 puede ser utilizada en la producción de ETA, EPA, DPA, DHA y similares. Como se utiliza en este contexto, la palabra "indirectamente" abarca la situación en donde la enzima se utiliza para catalizar la conversión de un substrato de ácido graso directamente dentro del producto de ácido graso deseado, sin ningún paso intermedio o intermediarios de trayectoria (por ejemplo, la conversión de AA a EPA). El producto asi obtenido entonces es utilizado en una composición. "Indirectamente" abarca la situación en donde una desaturasa de acuerdo con la presente invención se utiliza para catalizar la conversión de un substrato de ácido graso en otro ácido graso (es decir, una trayectoria intermedia) a través de la desaturasa (por ejemplo, la conversión de AA a EPA) y después el último ácido graso (el EPA) es cojiy_e tid-0-_aL-p r-o d u eto— de— ácido~g á c^e¾eTdo a través del uso de otra desaturasa o enzima no de desaturasa (por ejemplo, la conversión de EPA a DPA a través de elongasa). Estos PUFAs (es decir, aquellos producidos ya sea directamente o indirectamente a través de la actividad de las desaturasas en cuestión) pueden ser agregadas a, por ejemplo, composiciones nutricionales, composiciones farmacéuticas, cosméticos y alimento para animales, todos los cuales están abarcados por la presente invención. Dichos usos se describen en detalle más adelante.

Composiciones Nutricionales La presente invención incluye composiciones nutricionales. Para propósitos de la presente invención, dichas composiciones incluyen cualquier alimento o preparación para consumo humano (incluyendo para consumo enteral y/o parenteral) el cual cuados se absorbe en el cuerpo (a) sirve para nutrir o construir tejidos o suministrar energía; y/o (b) mantener, restaurar o soportar el estado nutricional adecuado o función metabólica. La composición nutricional de la presente invención comprende un aceite, éster de ácido graso, o ácido graso producido directamente o indirectamente a través del uso de genes de desaturasa descritos en la presente. La composición puede ya sea estar en una forma sólida o líquida. Adicionalmente, la composición puede incluir macronutrientes comestibles, vitaminas y/o minerales en cantidades deseadas para un uso particular. Las cantidades de es!qs_j_n j.r_e-d Je -tes — ariarán- dep^encii elido de si la composición pretende usarse con infantes, niños o adultos, normales, saludables, o para el uso con individuos que tienen necesidades especializadas, tales como individuos que sufren de trastornos metabólicos y similares. Ejemplos de macronutrientes que pueden ser adicionados a la composición incluyen (pero no se limitan a): grasas comestibles, carbohidratos y proteínas. Ejemplos de dichas grasas comestibles incluyen (pero no se limitan a): aceite de coco, aceite de borraja, aceite de hongo, aceite de corriente negra, aceite de soya, y mono- y diglicéridos. Ejemplos de dichos carbohidratos incluyen (pero no se limitan a): glucosa, lactosa comestible, y búsqueda hidrolizada. Adicionalmente, ejemplos de proteínas que pueden ser utilizadas en la composición nutricional de la invención incluyen (pero no se limitan a) proteínas de soya, suero electrodializado, leche desnatada electrodializada, suero de leche, o los hidrolisatos de estas proteínas. Con respecto a las proteínas y minerales, lo siguiente debe ser agregado a las composiciones nutricionales de la presente invención: calcio, fósforo, potasio, sodio, cloruro, magnesio, manganeso, hiero, cobre, zinc, selenio, yodo, y Vitaminas A, E, D, C, y el complejo B. Otras vitaminas y minerales también pueden ser agregados. Los componentes utilizados en las composiciones nutricionales de la presente invención serán de origen semi-purificado o purificado. Por semi-purificado o purificado se da a entender un m a t e ña\__ e_L_c_u_a L_h.a— si d -o— re p a raü'0~~8T~ ráVés~ó e purificación de una material natural o a través de síntesis de novo. Ejemplos de composiciones nutricionales de la presente invención incluyen (pero no se limitan a): fórmulas de infantes, suplementos dietéticos, su bstituyentes dietéticos, y composiciones de rehidratación. Las composiciones nutricionales de interés particular incluyen (pero no se limitan a) composiciones para suplemento enteral o parenteral para infantes, fórmulas de infantes especializadas, suplementos para personas de edades mayores, y suplementos para aquellos con dificultades gastrointestinales y/o mala absorción. Las composiciones nutricionales de la presente invención pueden también ser adicionadas al alimento aún cuando la adición de la dieta no es requerida. Por ejemplo la composición puede ser adicionada a alimento de cualquier tipo, incluyendo (pero no limitándose a): margarina, mantequilla modificada, quesos, leche, yogurt, chocolate, dulces, botanas, aceites de ensalada, aceites para cocinar, grasas para cocinar, carnes, pescados y bebidas. En una modalidad preferida de la presente invención, la composición nutricional es un producto nutricional enteral, más preferiblemente, un producto nutricional enteral de adulto o pediátrico. Esta composición puede ser administrada a adultos o niños que experimentan tensión o que tienen necesidades especializadas debido a estados de enfermedad crónicos o agudos. La composición puede comprender, además de PUFAs producidos de ac u_exd-0— c o n— I-a— p re sen t e ~m~v~e7Tc ¡ orT,— rña c ronutrientes, vitaminas y/o minerales, como se describe previamente. Los macronutrientes pueden estar presentes en cantidades equivalentes a aquellas presentes en la leche humana o en sobre bases de energía, es decir, sobre bases por caloría. La fórmula enteral, por ejemplo, puede ser esterilizada y subsecuentemente utilizada sobre bases de lista-para-utilizarse (RTF) o almacenarse en un líquido o polvo concentrado. El polvo puede ser preparado rociando en seco la fórmula preparada como se indica anteriormente, y reconstituyéndola a través de rehidratación del concentrado. Las fórmulas para adultos y pediátricas son conocidas en la técnica y están comercialmente disponibles (por ejemplo, Similar®, Ensure®, Jevity® y Alimentum® de Ross Products División, Abbott Laboratories, Columbus, Ohio). Un aceite o ácido graso producido de acuerdo con la presente invención pueden ser adicionado a cualquiera de estas fórmulas. La densidad de energía de las composiciones nutricionales de la presente invención, cuando está en forma líquida, pueden estar e la escala de aproximadamente 0.6 kilocaloría a aproximadamente 3 kilocaloría por mi. Cuando está en forma sólida o en polvo, los suplementos nutricionales pueden contener de aproximadamente 1.2 a más de 9 kilocalorías por gramo, preferiblemente de aproximadamente 3 a 7 kilocalorías por gramo. En general, preferiblemente de aproximadamente 3 a 7 kilocalorías por gramo. En general, calidad de osmótico de un producto líquido deberá ser -menor— de- 7-0 ?-?tT s nrry ma's^pfé éTTbTemente , menor de 660 mOsm. La fórmula nutricional puede incluir macronutrientes, vitaminas y minerales, como se observó anteriormente, además de los PUFAs producidos de acuerdo con la presente invención. La presencia de estos componentes adicionales ayuda a la ingestión individual de los requerimientos diarios mínimos de estos elementos. Además de la provisión de PUFAs, también puede ser deseable agregar zinc, cobre, ácido fólico y antioxidantes a la composición. Se cree que estas substancias estimulan un sistema inmune estresado y por lo tanto proveerán beneficios adicionales al individuo que recibe la composición. Una composición farmacéutica también puede ser suplementada con estos elementos. En una modalidad más preferida, la composición nutricional comprende, además de antioxidantes y por lo menos un PUFA, una fuente de carbohidratos, en donde por lo menos 5 por ciento en peso del carbohidrato es un oligosacárido indigestible. En una modalidad más preferida, la composición nutricional adicionalmente comprende proteína, taurina y carnitina. Como se observó anteriormente, los PUFAs producidos de acuerdo con la presente invención o derivados de los mismos, pueden ser adicionados a un substituto o suplemento dietético, particularmente una fórmula de infante, para pacientes que experimentan alimentación intravenosa o para la prevención o tratamiento de mala nutrición u otras condiciones o estados de enfermedad. Como antecedente, se deberá observar que la leche maienia_h-uma-n-a--UeAe--w que comprende de aproximadamente 0.15% a aproximadamente 0.36% de DHA, de aproximadamente 0.3% a aproximadamente 0.13% de EPA, de aproximadamente 0.30% a aproximadamente 0.88% de AA, de aproximadamente 0.22% a aproximadamente 0.67% de DGLA, y de aproximadamente 0.27% a aproximadamente 1.04% de GLA. De esta manera, dichos ácidos grasos tales como AA, EPA y/o DHA producidos de acuerdo con la presente invención pueden ser utilizados para alterar, por ejemplo, la composición de fórmulas de infante, con el fin de replicar más fielmente el contenido de PUFA de la leche materna humana o para alterar la presencia de PUFAs normalmente encontrados en una leche de mamífero no humana. En particular, una composición para utilizar un agente medicinal o suplemento alimenticio, particularmente substituto o suplemento de leche materna, preferiblemente comprenderá uno o más de AA, DGLA y GLA. Más preferiblemente, la composición comprenderá de aproximadamente 0.3 a 30% de AA, de aproximadamente 0.2 a 30% de DGLA, y/o de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 30% de GLA. Las composiciones nutricionales parenterales comprenden de aproximadamente 2 a aproximadamente 30% en peso de ácidos grasos calculados como triglicéridos que están abarcados por la presente invención. La composición preferida tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 25% en peso de la composición de PUFA total como GLA. Otras vitaminas, p.a r-Uc-u lar-me te— vita mtn a's^sT) r¡Tb~l~es ~é n grasa tales como la vitamina A, D, E y L-carnitina, pueden opcionalmente ser incluidas. Cuando se desea, un conservador tal como alfa-tocoferol puede ser adicionado en una cantidad de aproximadamente 0.1% en peso. Además, las relaciones de AA, DGLA y GLA pueden ser adaptadas para un uso final dado particular. Cuando se formulan como un suplemento o substituto de leche materna, una composición que comprende uno o más de AA, DGLA, y GLA será provista en una relación de aproximadamente 1:19:30 a aproximadamente 6:1:0.2, respectivamente. Por ejemplo, la leche materna de animales puede variar en relaciones de AA:DGLA:GLA en la escala de 1:19:30 a 6:1:0.2, las cuales incluyen radios intermedios que son preferiblemente de aproximadamente 1:1:1, 1:2:1, 1:1:4. Cuando se producen juntas en una célula huésped, ajusfando la velocidad y porcentaje de conversión de un substrato precursor tal como GLA y DGLA a AA pueden ser utilizados para controlar las relaciones de PUFA precisamente. Por ejemplo, una velocidad de conversión de 5% a 10% de DGLA a AA puede ser utilizada para producir una relación de AA a DGLA de aproximadamente 1:19, siempre que una velocidad de conversión de aproximadamente 75% a 80% pueda ser utilizada para producir una relación de AA a DGLA de aproximadamente 6:1. Por consiguiente, si en un sistema de cultivo de célula o en un animal huésped, que regula el cronometraje, la extensión y especificidad de la expresión de desaturasa, así como la expresión de otras desaturasas y elongasas, pueden ser utilizadas para acuerdo con la presente invención (por ejemplo, AA, EPA, etc.) pueden entonces ser combinadas con otras PUFAs u otros tipos de ácidos grasos en las concentraciones y relaciones deseadas. Adicionalmente, las PUFAs producidas de acuerdo con la presente invención o células huésped transformadas para contener y expresar los genes de desaturasa en cuestión también pueden ser utilizados como suplementos de alimento animal para alterar un tejido de animal o composición de ácido graso de leche a una más deseable para consumo humano o animal.

Composiciones Farmacéuticas La presente invención también abarca una composición farmacéutica que comprende uno o más de los ácidos y/o aceites resultantes producidos utilizando los genes de desaturasa, de acuerdo con los métodos descritos aquí. Específicamente, dicha composición farmacéutica puede comprender uno o más de los PUFAs y/o aceites, en combinación con un portador, auxiliar o vehículo farmacéuticamente aceptable, no tóxico, bien conocido, tal como salina regulada en su pH de fosfato, agua, etanol, polioles, aceites vegetales, un agente de humectación, o una emulsión tal como emulsión de agua/aceite. La composición puede estar ya sea en una forma líquida o sólida. Por ejemplo, la. composición puede estar en la forma de una tableta, cápsula, líquido o polvo que se puede ingerir, ungüento o crema inyectable o tópica. La fluidez ^a.p_r_op la-d a — ue¾le — ser — m~a~nt¾T¡Tdá~ póT ejemplo, a través de la manutención del tamaño de partícula deseado en el caso de dispersiones y a través del uso de agentes tensioactivos. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro de sodio, y similares. Aparte de dichos diiuyentes inertes, la composición también puede incluir auxiliares, tales como agentes de humectación, agentes de emulsificación y suspensión, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, y agentes de perfume. Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden comprender agentes de suspensión tales como alcoholes isostearílicos etoxilados, sorbitol polietilénico y ésteres de sorbitan, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar, y tragacanto o mezclas de esas sustancias. Las formas de dosificación sólidas tales como tabletas y cápsulas pueden ser preparadas utilizando técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, PUFAs producidos de acuerdo con la presente invención pueden ser tableteados con bases de tabletas convencionales tales como lactosa, sacarosa, y almidón de maíz en combinación con aglutinantes tales como acacia, almidón de maíz, o gelatina, agentes de desintegración tales como almidón de papa o ácido algínico, y un lubricante tal como ácido esteárico o estearato de magnesio. Las cápsulas pueden ser preparadas a través de la incorporación de estos excipientes en una cápsula de gelatina junto presentada anteriormente. Para administración intravenosa, los PUFAs producidos de acuerdo con la presente invención o derivados de los mismos pueden ser incorporados en formulaciones comerciales tales como Intralipids™ . El perfil de ácido graso de plasma adulto normal típico comprende 6.64 a 9.46% de AA, 1.45 a 3.11% de DGLA, y 0.02 a 0.08% de GLA. Estos PUFAs o sus precursores metabólicos pueden ser administrados solos o en combinación con otros PUFAs para lograr un perfil de ácido graso normal en un paciente. Cuando se desea, los componentes individuales de las formulaciones pueden ser provistos individualmente, o en forma de equipos, para uso individual o múltiple. Una dosificación típica de un ácido graso particular es de 0.1 mg a 20 g, tomado de una a cinco veces por día (hasta 100 g diariamente) y está preferiblemente en la escala de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 1, 2, 5 o 10 g diariamente (tomado en una o múltiples dosis). Las rutas de administración posibles de las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, por ejemplo, enteral (por ejemplo, oral o rectal), y parenteral. Por ejemplo, una preparación líquida puede ser administrada oralmente o rectalmente. Adicionalmente, una mezcla homogénea puede ser completamente dispersada en agua, mezclada bajo condiciones estériles con diluyentes, conservadores, reguladores de pH o propulsores deseado. Por ejemplo, si la composición está siendo utilizada para tratar piel áspera, seca o envejecida, para tratar piel dañada o quemada, o para tratar piel o cabello afectado por una enfermedad o condición, puede ser aplicada tópicamente. La dosificación de la composición que va a ser administrada al paciente puede ser determinada por uno con experiencia en la técnica y depende de varios factores tale como el peso del paciente, la edad del paciente, la salud global del paciente, el historial del paciente, el estado inmune del paciente, etc. Con respecto a la forma, la composición puede ser, por ejemplo, una solución, una dispersión, una suspensión, una emulsión o un polvo estéril que entonces es reconstituido. La presente invención también incluye el tratamiento de varios trastornos a través del uso de las composiciones farmacéuticas y/o nutricionales descritas aquí. En particular, las composiciones de la presente invención pueden ser utilizadas para tratar restenosis después de angioplastía. Además, los síntomas de inflamación, artritis reumatoide, asma y psoariasis también pueden ser tratadas con las composiciones de la invención. La evidencia también indica que los PUFAs pueden estar involucrados en metabolismo de calcio; de esta manera, las composiciones de la presente invención pueden ser utilizadas en el tratamiento o prevención de osteoporosis y de piedras en el riñon o tracto urinario. Adicionalmente, las composiciones de I a pre se nle_Ln_v_e-n-ció-n-pueden ser también utilizadas en el tratamiento de cáncer. Se ha mostrado que las células malignas tienen composiciones de ácidos grasos alteradas. Además los ácidos grasos han mostrado que desaceleran su crecimiento, causan la muerte de la célula e incrementan su susceptibilidad a agentes quimioterapéuticos. Además, las composiciones de la presente invención también pueden ser útiles para tratar caquexia asociada con cáncer. Las composiciones de la presente invención también pueden ser usadas para tratar diabetes (ver Patente de E.U.A. No. 4,826,877 y Horrobin y otros, Am. J. Clin. Nutr. Vol. 57 (Suppl.) 732S-737S). El metabolismo y composición de los ácidos grasos alterados ha sido demostrados en animales diabéticos. Además, las composiciones de la presente invención, que comprenden PUFAs producidas ya sea directamente o indirectamente a través del uso de enzimas de desaturasa, también pueden ser utilizadas en el tratamiento de eczema y en la reducción de la presión sanguínea. Adicionalmente, las composiciones de la presente invención pueden ser utilizadas para inhibir agregación de plaquetas, para inducir vasodilatación, para reducir los niveles de colesterol, para inhibir la proliferación del músculo liso de la pared de las venas y tejido fibroso (Brenner y otros, Adv. Exp. Med . B i o I . Vol. 83, p.85-101, 1976), para reducir o prevenir sangrado gastrointestinal y otros efectos laterales de fármacos antiinflamatorios no esferoidales (ver Patente de E.U.A. No. 4,666,701), para prevenir o tratar endometriosis y s í n d ronn e_j?xem e LD_s_t.Lu.aJ— {-v-e-r-Patente de E.U.A. No. 4,758,592), y para tratar encefalomielitis miálgica y fatiga crónica después de infecciones virales (ver Patente de E.U.A. No. 5,116,871). Los usos adicionales de las composiciones de la presente invención incluyen el uso en el tratamiento de SIDA, esclerosis múltiple, y trastornos de piel inflamatorios, así como para el mantenimiento de la salud general. Adicionalmente, las composiciones de la presente invención pueden ser utilizadas para propósitos cosméticos. Se pueden adicionar a composiciones cosméticas pre-existentes tal como una mezcla es formada o una PUFA es producida de acuerdo con el tema de la invención puede ser utilizada como el ingrediente "activo" solo en una composición cosmética.

Aplicaciones Veterinarias: Se deberá observar que las composiciones farmacéuticas y nutricionales anteriormente descritas pueden ser utilizadas en conexión con animales (es decir, domésticos o no domésticos, incluyendo mamíferos, pájaros, reptiles, lagartos, etc.) así como seres humanos, como animales que experimentan muchas de las mismas necesidades y condiciones que los seres humanos. Por ejemplo, el aceite o ácidos grasos de la presente invención pueden ser utilizados en suplementos de alimentos para animales, substitutos de alimentos para animajes^ yj^am nas_rj_aj"a_anj_maLe-S^o-en-ungüentos tópicos para animales. La presente invención además puede ser ilustrada a través de ejemplos no limitantes presentados a continuación: EJEMPLO 1 Construcción de la Colección de ADN de Saprolegnia diclina (ATCC 56851) Para aislar genes que codifican enzimas de desaturasa funcional, se construyó una colección de ADNc. Los cultivos de Saprolegnia diclina se hicieron crecer en medios de dextrosa de papa (Difco ? 366, BD Diagnostic Systems, Sparks, Maryland) a temperatura ambiente durante cuatro días con agitación constantes. El micelio se cosechó mediante filtración a través de varias capas de estopilla y los cultivos se trituraron en nitrógeno líquido utilizando un mortero y una mano de mortero. Los lisatos de célula se volvieron a suspender en regulador de pH a temperatura ambiente (Qiagen, Valencia, California) conteniendo ß-mercaptoetanol y se incubaron a 55°C durante tres minutos. Estos lisatos se homogenizaron ya sea a través de aspiraciones repetidas a través de una jeringa o sobre una columna de marca "Qiashredder" (Qiagen). El ARN total fue finalmente purificado utilizando el equipo de marca "RNeasy Maxi" (Qiagen), de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARNm se aisló del ARN total de cada organismo utilizando una resina de celulosa oligo dJT_E j_eqj¿lpj^de^o_n_^ "pBluescript II XR" (Stratagene, La Jolla, California) se utilizó para sintetizar el ADNc de estructura de cadena doble. El ADNc de estructura de cadena doble entonces se clonó direccionalmente (5' EcoRI/ 3'- Xhol) en el vector pBluescript II SK( + ) (Strategene). La colección de S. diclina contuvo aproximadamente 2.5 x 106 clones, cada uno con un tamaño de inserto promedio de aproximadamente 700 bp. El ADN genómico de S. diclina se aisló triturando el cultivo en nitrógeno líquido seguido por purificación utilizando el equipo de marca "Genomic DNA Extraction" (Qiagen), de acuerdo con el protocolo del fabricante.

EJEMPLO 2 Determinación del Uso del Codón en Saproleqnia diclina Los extremos 5' de 350 clones de ADNc aleatorios se secuenciarion de la colección de ADNc de Saprolegnia diclina descrita en el Ejemplo 1. Las secuencias se tradujeron en seis marcos de lectura utilizando el programa GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wiscosin) con el algoritmo de marca "FastA" para buscar la similitud entre una secuencia de investigación y un grupo de secuencias del mismo tipo, específicamente dentro de la base de datos GenBank. Muchos de los clones fueron identificados como genes de verificación putativa en base a la homología de la proteína a genes conocidos. Ocho secuencias de ADNc de S. diclina de esta forma se seleccionaron. Adicionalmente, las secuencias d_e desaturasa delta-5 y delta-6 de S. diclina de longitud completa también se utilizaron (ver Cuadro 1 a continuación). Estas secuencias entonces se utilizaron para generar la desviación del codón de S. diclina mostrada en el Cuadro 2 a continuación empleando el programa "CodonFrequency" de GCG.

CUADRO 1 Genes de Saprolegnia diclina utilizados para la generación del Cuadro de la desviación del codón CUADRO 2 EJEMPLO 3 Diseño de Oliqonucleótidos Degenerados p'ara el Aislamiento de una Desaturasa Omeqa-3 de Saprolegnia diclina (ATCC 56851 El hongo similar a Saprolegnia diclina produjo un amplio rango de- PUFAs, incluyendo ácido araquidónico (AA) y ácido eicosapentanoico (EPA) a través de la trayectoria biosintética de PUFA descrita en la Figura 1. El análisis de la composición de ácidos grasos de Saprolegnia diclina (ATCC 56851) mostró 15.42% del total de lipidos que van a ser AA y 12.2% del total de lípidos que van a ser EPA (Ver Cuadro 5). El ácido linoleico (LA) fue el único otro intermediario presenté en altas cantidades. Esto indica que S. diclina tiene desaturasas delta-6 y delta-5 muy activas, así como las elongasas que desvían intermediarios a través de la trayectoria descrita en la Figura 1. Debido al alto porcentaje de EPA en esje_ organismo, una desaturasa omega-3 activa (sinónimo con una desaturasa "delta-15" cuando el substrato es un ácido graso de 19 átomos de carbono, una desaturasa "delta-17" cuando el substrato es un ácido graso con 20 átomos de carbono, y una desaturasa "delta-19" cuando el substrato es un ácido graso de 22 átomos de carbono), se predice que existe, la cual es capaz de convertir AA (20:2n-6) en EPA (20:5n-3). Como justamente se observó, las desaturasas omega3 son enzimas que catalizan la introducción de un enlace doble en la posición delta-15 para las cadenas de acilo de 18 átomos de carbono, la posición delta-17 para las cadenas de acilo de 20 átomos de carbono, y la posición delta-19 para las cadenas de acilo de 22 átomos de carbono. Hay varias desaturasas omega-3 conocidas de plantas, pero estas actúan exclusivamente sobre substratos de ácido graso de 18 átomos de carbono como LA (18:2n-6) y GLA (18:3n-6).

Estos tipos de desaturasas son colectivamente referidas como delta-15-desaturasas. En este punto en el tiempo, solamente un gen de desaturasa omega-3 ha sido aislado cuya enzima codificada cataliza la desaturación de substratos de ácido graso de 18 átomos de carbono, de 20 átomos de carbono, y de 22 átomos de carbono. Esto es fat-1 de C. elegans. Ver Patente de E.U.A. No. 6,194,167, presentada el 27 de febrero del 2001. El método utilizado en este Ejemplos para identificar la desaturasa omega-3 de S. diclina involucró amplificación PCR de una región del gen de desaturasa utilizando o I i g ojiu_cJe_ótido_s_ degenerados (iniciadores) que contuvieron motivos conservados presentes en otras desaturasas omega-3 conocidas. Las desaturasas omega-3 de los siguientes organismos fueron utilizadas para diseñar estos iniciadores degenerados: Arabidopsis thaliana (Swissprot # P46310), Ricunus communis (Swissprot # P48619), (Swissprot # P48619), Glycine max (Swissprot # P48621), Sesamum indicum (Swissprot # P48620), Nicotiana tabacum (GenBank # D79979), Perilla frutescens (GenBank # U59477), Capsicum annum (GenBank # AF222989), Limnathes douglassi (GenBank # U17063), y Caenorhabditis elegans (GenBank '# L41807). Algunos iniciadores fueron designados para contener los motivos de caja de histidina conservados que fueron componentes importantes del sitio activo de las enzimas. Ver Shanklin, J.E., McDonough , V.M. y Martin, CE. (1994) Biochemstry 33, 12787-12794. La alineación de las secuencias fue llevada a cabo utilizando el programa Múltiple Sequence Alignement CLUSTALW (http://workbench.sdsc.edu). Los siguientes iniciadores degenerados fueron diseñados y utilizados en varias combinaciones: Motivo 1 de proteína: NH3- TRAAI PKHCWVK -COOH Iniciador RO 1144 (hacia adelante): 5'-ATC CGC GCC GCC ATC CCC AAG CAC TGC TGG GTC AAG-3' (SEC ID NO: 1). Motivo 2 de proteína: NH3 - ALFVLGHDCGHGSFS -COOH Este iniciador contiene la caja 1 de histidina (subrayada). Iniciador GGC CAY GGC TCG TTC TCG-3' (SEC ID NO: 2). Iniciador RO 1118 (reversa): 5'- GAG RTG GTA RTG GGG GAT CTG GGG GAA GAR RTG RTG GRY GAC RTG-3' (SEC ID NO: 3). Motivo 3 de proteína: NH3 - PYHGRWISRHTHHQN -COOH. Este iniciador contiene la caja 2 de histidina (subrayada). Iniciador RO 1121 (hacia delante): 5'-CCC TAC CAY GGC TGG CGC ATC TCG CAY CGC ACC CY CAY CAG AAC-3' (SEC ID NO: 4).

Iniciador RO 1122 (reversa): 5'- GTT CTG RTG RTG GGT CCG RTG CGA GAT GCG CCA GCC RTG GTA GGG-3 ' (SEC ID NO: 5). Motivo 4 de proteína: NH3 - GSHF D/H P D/Y SDLF -COOH Iniciador RO 1146 (hacia delante): 5'- GGC TCG CAC TTC SAC CCC KAC TCG GAC CTC TTC GTC-3' (SEC ID NO: 6). Iniciador RO 1147 (reversa): 5'- GAC GAA GAG GTC CGA GTM GGG GTW GAA GTG CGA GCC-3' (SEC ID NO: 7). Motivo 5 de proteína: NH3 - WS Y/F L/V RGGLTT L/l DR - COOH Iniciador RO 1149 (reversa): 5'- GCG CTG SAK GGT GGT GAG GCC GCC GCG GAW GSA CGA CCA-3' (SEC ID NO: 8). Motivo 6 de proteína: NH3 - HHDIGTHVIHHLFPQ -COOH Esta secuencia contiene la tercera caja de histidina (subrayada). Iniciador RO 1114 (reversa): 5'- CTG GGG GAA GAG RTG RTG GAT GAC RTG GGT GAT GTC RTG RTG-3' (SEC ID NO: 9). Motivo 7 de proteína: NH3 - H L/F FP Q/K IPHYHL V/l EAT - Iniciador RO 1116 (reversa): 5'- GGT GGC CTC GAY GAG RTG GTA RTG GGG GAT CTK GGG GAA GAR RTG-3' (SEC ID NO: 10). Motivo 8 de proteína: NH3 - HV A/1 HH L/F FPQIPHYHL -COOH Este iniciador contiene la tercera caja de histidina (subrayada) y cuenta para las diferencias entre la desaturasa omega-3 de planta y la desaturasa omega-3 de C. elegans. Iniciador RO 1118 (Reversa): 5'- GAG RTG GTA RTG GGG GAT CTG GGG GAA GAR RTG RTG GRY GAC RTG-3' (SEC ID NO: 11). El código de degeneración utilizado para las SEC. ID. NOS: 1 a 11 fue como sigue: R= A/G; Y = C/T; M = A/C; K=G/T; W=A/T; S = C/G; B = C/T; D = A/G/T; H = A/C/T; V = A/C/G; y N = A/C/G/T.

EJEMPLO 4 Identificación y Aislamiento de un Gen de Desaturasa Omega-3 de Saproleqnia diclina (ATCC 56851) Varios grupos de iniciadores degenerados descritos en el Ejemplo 3 se utilizaron en reacciones de amplificación PCR, utilizando como una plantilla ya sea el ADN de plásmido de la colección de ADNc de S. diclina (del Ejemplo 1), o ADN genómico de S. diclina. También varias diferentes polimerasas de ADN y condición es de reacción fueron ut ijjza d_as_p a a_ Ja_s_am pJ cacJ o_n_e^s_ PCR. Estas reacciones diversamente involucradas utilizando polimerasa de ADN de marca "Platinum Taq" (Life Technologies Inc., Rockville, Maryland ), o polimerasa de ADNc (Clonetech, Palo Alto, California), o Taq PCR-mix (Qiagen), a diferentes temperaturas de endurecimiento. La amplificación de PCR utilizando los iniciadores RO 1121 (hacia delante) (SEC ID NO: 4) y RO 1116 (reversa) (SEC ID NO: 10) dieron como resultado la amplificación exitosa de un fragmento homólogo a una desaturasa omega-3 conocida. El iniciador RO 1121 (hacia delante) corresponde al motivo 3 de proteína; el iniciador RO 1116 (reversa) corresponde al motivo 7 de proteína. La amplificación PCR fue llevada a cabo en un volumen total de 50 µ\ conteniendo: 3 µ\ de plantilla de la colección de ADNc, regulador de pH de PCR conteniendo 40 mM de Tricita-KOH (pH 9.2), 15 mM de HOAC, 3.5 mM de Mg(OAc)2, 3.75 yg/ml de BSA (concentración final), 200 µ? de cada trifosfato de desoxiribonucleótido, 10 pmoles de cada iniciador y 0.5 µ\ de polimerasa de ADNc de marca "Advantage" (Clonetech). La amplificación se Nevó a cabo como sigue: la desnaturalización inicial a 94°C durante 3 minutos, seguido por 35 ciclos de lo siguientes: 94°C durante 1 minuto, 60°C durante 30 segundos, 72°C durante 1 minutos. Un ciclo de extensión final de 72°C durante 7 minutos se llevó a cabo, seguido por la terminación de la reacción a 4°C. Una banda de PCR de aproximadamente 48 bp individual fue generada, la cual fue resuelta en u_n gel de agarosa d_e m_a.r_ca "SeaKem Gold" al 1% (F C BioProducts, Rockland, Maine), y gel purificado utilizando el Equipo de Extracción de Gel Qiagen. Los extremos escalonados en el fragmento fueron "llenados" utilizando polimerasa de ADN T4 (Life Technologies, Rockville, Maryland) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y los fragmentos de ADN fueron clonados dentro del vector PCR-Blunt (Invitrogen, Carlsbad, California). Los plásmidos recombinantes fueron transformados en células super competentes TOP10 (Invitrogen), y ocho clones fueron secuenciados y se llevó a cabo una búsqueda en la base de datos (Gen-EMBL). Los clones "sdd17-7-1" a "sdd17-7-8" todos fueron encontrados que contienen y un inserto de aproximadamente 483 bp. La secuencia de aminoácido deducida de este fragmento mostró una identidad más alta a las siguientes proteínas (en base a una búsqueda "tFastA"): 1. 37.9% de identidad en 161 aminoácidos traslapados con desaturasa omega-3 (delta-15) de Synechocystis sp. (Acceso # D13780). 2. 40% de identidad en 113 aminoácido de traslapados con desaturasa omega-3 plastidial de Picea abies (Acceso # AJ302017). 3. 35.9% de identidad en 128 aminoácidos traslapados con desaturasa de ácido graso FAD8 de Zea mays (Acceso # D63953). En base a esta homología de secuencia para conocer las desaturasas de ácido graso omega-3, parece que probablemente este f r_a.g_m_e_nt_o d_e A_D_ f_ue p_a_r_te _d_e u g_e_n de d_e_s_a t.u_r_a_s_a_ o_m_e_g_a_-3_ presente en S. diclina. La secuencia de ADN identificada anteriormente fue utilizada en el diseño de oligonucleótidos para aislar el extremo 3' y 5' de este gen a partir de la colección de ADNc descrita en el Ejemplo 1. Para aislar el extremo 3' del gen, se diseñaron los siguientes oligonucleótidos: RO 1188 (hacia delante): 5'- TAC GCG TAC CTC ACG TAC TCG CTC G-3' (SEC ID NO: 12). RO 1189 (hacia delante): 5'- TTC TTG CAC CAC AAC GAC GAA GCG ACG-3' (SEC ID NO: 13). RO 1190 (hacia delante): 5'- GGA GTG GAC GTA CGT CAA GGG CAA C-3' (SEC ID NO: 14). RO 1191 (hacia delante): 5'- TCA AGG GCA ACC TCT CGA GCG TCG AC-3' (SEC ID NO: 15). Estos iniciadores (SEC ID NOS: 12-15) fueron utilizados en las combinaciones con el oligonucleótido del vector SK( + ) pBluescript: RO 898: 5'- CCC AGT CAC GAC GTT GTA AAA CGA CGG CCA G-3' (SEC ID NO: 16). Las amplificaciones de PCR fueron llevadas a cabo utilizando ya sea polimerasa de marca "Taq PCR Master Mix" (Qiagen) o polimerasa de ADNc de marca "Advantage" (Clonetech) o polimerasa de ADN Taq de marca "Platinum" (Life Technologies), como sigue: Para la polimerasa "Taq PCR Master Mix", 10 pmoles de cada iniciador se utilizaron junto con 1 µ\ de ADN de la colección de ADNc d_e_l E_j_e m pío 1_. La amplificación se 11 evó a ca bo como sigue: desnaturalización inicial a 94°C durante 3 minutos, seguida por 35 ciclos de lo siguiente: 94°C durante 1 minuto, 60°C durante 30 segundos, 72°C durante 1 minutos. Un ciclo de extensión final de 72°C durante 7 minutos se llevó a cabo, seguido por la terminación de la reacción a 4°C. Esta amplificación dio como resultado las bandas más distintas según comparadas con las otras dos condiciones probadas. Para la reacción de polimerasa de ADNc de marca "Advantage", la amplificación PCR se llevó a cabo en un volumen total' de 50 µ\ conteniendo: 1 µ\ de la plantilla de la colección de ADNc del Ejemplo 1 , regulador de pH de PCR conteniendo 40 mM de Tricita-KOH (pH 9.2), 15 mM de HOAC, 3.5 mM de Mg(OAc)2, 3.75 /vg/ml de BSA (concentración final), 200 µ? cada trifosfato de desoxiribonucleótido, 10 pmoles de cada iniciador y 0.5 µ\ de polimerasa de ADNc (Clonetech). La amplificación se llevó cabo como se describe para el Taq PCR Master ix. Para la reacción de polimerasa de ADN Taq de marca "Platinum", la amplificación PCR se llevó a cabo en un volumen total de 50 µ? conteniendo: 1 µ\ de la plantilla de la colección de ADNc del Ejemplo 1, regulador de pH de PCR conteniendo 20 mM de Tris-HCI, pH 8.4, 50 mM de KCI (concentración final), 200 µ? cada trifosfato de desoxiribonucleótido, 10 pmoles de cada iniciador, 1.5 mM de MgS04, y 0.5 µ\ de polimerasa de ADN Taq Platinum. La amplificación se llevó cabo como sigue: desnaturalización inicial a 9-4-° C— d-ar_a-nie_3_jiijji.u_tos.,_sg_g.u¡do por 30 ci dos de lo siguiente: 94 °C_ durante 45 segundos, 55°C durante 30 segundos, 68°C durante 2 minutos. La reacción se terminó a 4°C. Todos los cuatro grupos de iniciadores en combinación con el iniciador del vector generaron distintas bandas. Las bandas PCR de la combinación (RO 1188 + RO 898) fueron >500 bp y esto se purificó con gel y se clonó separadamente. Las bandas PCR generadas de otras combinaciones de iniciadores fueron <500 bp. Las bandas se purificaron con gel, se sondearon juntas, y se clonaron dentro del vector PCR-Blunt (Invitrogen) como se describió anteriormente. Los plásmidos recombinantes fueron transformados en células super competentes TOP10 (Invitrogen) y los clones se secuenciarion y analizaron. El clon "sdd17-16-4 y "sdd16-6" conteniendo el inserto de aproximadamente 500 bp y los clones "sdd 17- 17-6", "sdd 17- 17- 10" y "sdd17-20-3" conteniendo los insertos de aproximadamente 400 bp, todos fueron encontrados que contienen el extremo 3' de la desaturasa omega-3 putativa. Estas secuencias se traslaparon una con la otra, así como con el fragmento originalmente identificado de este gen de desaturasa omega-3 putativo. Todas las secuencias contuvieron el codón de detención 'TAA' y una cola poli-A típica de los extremos 3' de genes eucarióticos. Esta secuencia del extremo 3' fue homologa a otras desaturasa omega-3 conocidas, compartiendo la identidad más alta (41.5% en 130 traslapes de aminoácidos) con la desaturasa delta-15 de Synechocystis (Acceso # D13780). P a r-a -e l— a-i-s l a m-i e-n-t-o-d-e-l-e-x t^ oligonucleótidos fueron diseñados y utilizados en combinaciones con el oligonucleótido del vector SK( + ) pBluescript: RO 899: 5'- AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA AC AGC-3' (SEC ID NO: 17). RO 1185 (reversa): 5'-GGT AAA AGA TCT CGT CCT TGT CGA TGT TGC-3' (SEC ID NO: 18). RO 1186 (reversa): 5'- GTC AAA GTG GCT CAT CGT GC-3' (SEC ID NO: 19). RO 1187 (reversa): 5'- CGA GCG AGT ACG TGA GGT ACG CGT AC-3' (SEC ID NO: 20). Las amplificaciones se llevaron a cabo utilizando ya sea la polimerasa de marca "Taq PCR Master Mix" (Qiagen) o polimerasa de ADNc de marca "Advantage" (Clonetech) o polimerasa de ADN Taq de marca "Platinum" (Life Technologies), como se describe aquí anteriormente para el aislamiento del extremo 3'.

Las bandas PCR generadas de las combinaciones del iniciador (RO 1185 o RO 1186 + RO 899) estuvieron entre aproximadamente 580 a aproximadamente 440 bp y estas se sondearon y clonaron dentro del vector PCR-Blunt como se describió anteriormente. Los clones así generados incluyeron "sdd 17- 14- 1 ", "sdd 17- 14- 10", "sdd 17-18-2", "sddl 7-18-8", todos los cuales mostraron homología con las desaturasas omega-3 conocidas. Adicionalmente. Las bandas generadas a partir de (RO 1187 + RO 899) fueron de aproximadamente 680 bp y estas se clonaron separadamente para generar clones "sdd17-22-2", y "sd d17-22-5", los cuales también mostraron homología con las desaturasas omega-3 conocidas. Todos estos clones se traslaparon uno con el otro, así como con el fragmento original de la desaturasa omega-3 putativa. Estas secuencias contuvieron un sitio ATG' seguido por un marco de lectura abierto, indicando que es el sitio de inicio de este gen. Estos fragmentos mostraron una identidad más alta (39.5% en 146 aminoácidos traslapados) con la desaturasa delta-15 de Caléndula officinalsi (Acceso # AJ245938). La longitud completa de esta desaturasa omega-3 se obtuvo a través de amplificación PCR de la colección de ADNc de S. diclina utilizando los siguientes oligonucleótidos: RO 1212 (hacia delante): 5'- TCA ACA GAA TTC ATG ACC GAG GT AAG ACG AAG GTC GAG TTC CCG-3' (SEC ID NO: 21). Este iniciador contiene el sitio de inicio 'ATG' (subrayado individual) seguido por la secuencia 5' de la desaturasa omega-3. Además, un sitio EcoRI (subrayado doble) fue introducido corriente ascendente del sitio de inicio para facilitar la clonación en el vector de expresión de levadura pYX242. RO 1214 (reversa): 5'- AAA AGA AAG CTT CGC TTC CTA GTC 5 TTA GTC CGA GGC CTT GGC-3' (SEC ID NO: 22). Este iniciador contiene el codón de detención 'TAA' (subrayado individual) del gen así como la secuencia en corriente descendente del codón de detención. Esta secuencia fue incluida debido a que las regiones dentro del gen fueron muy ricas en G-C, y de esta forma no pudieron -1-0 s-e-r — incluidas — en — el — diseño — de — Los — oJ-i-g-O-n- c-l-e-O-tixLo-s paxa La- amplificación PCR. Además, un sitio Hindi (doble subrayado) fue incluido para la clonación conveniente dentro de un vector de expresión de levadura pYX242. La amplificación PCR se llevó a cabo utilizando la polimerasa 15 de marca "Taq PCR Master Mix" (Qiagen), 10 pmoles de cada iniciador, y 1 µ\ del ADN de la colección de ADNc del Ejemplo 1. La amplificación fue llevada a cabo como sigue: desnaturalización inicial a 94°C durante 3 minutos, seguido por 35 ciclos de lo siguiente: 94°C durante 1 minuto, 60°C durante 30 segundos, 72°C 20 durante 1 minuto. Un ciclo de extensión final de 72°C durante 7 minutos fue llevado a cabo, seguido por la terminación de la reacción a 4°C. Una banda PCR de aproximadamente 1 kb fue de esta forma obtenida y esta banda fue aislada, purificada, clonada en el vector 25 PCR-Blunt (Invitrogen), y transformada en células TOP10. Los " 11 78 insertos se secuenciaron con EcoRI / HindIII para liberar el inserto de longitud completa, y este inserto se clonó dentro del vector de expresión de levadura pYX242, previamente digerido con EcoRI / Hindi. Esta construcción contuvo 1077 bp de sdd17 clonado en pYX242. Esta construcción fue marcada pRSP19, la cual fue transformada en levadura SC334 para los estudios de expresión. Además, el gen omega-3 de S. diclina fue clonado en otro vector de expresión de levadura, pYES 2 (Invitrogen). Para esto, el gen de desaturasa omega-3 fue aislado de la colección de ADNc g e n e r a d a— e n— e -I— Ej e m p-l o— 1— a- t r a-v é s— d e am p-l-i-f-i c a c i ón— P-C-R_(-C o mo_s_e_ describió anteriormente) utilizando los siguientes oligonucleótidos: R01221 (hacia delante) (SEC ID NO: 23) 5'- TCA ACA AGA CTT ATG ACC GAG GAT AAG ACG AAG GTC GAG TTC CCG-3'. Este iniciador contiene el sitio de inicio 'ATG' (subrayado) seguido por la secuencia 5' de la desaturasa omega-3. Además, un ° sitio HindIII (negritas) fue introducido corriente arriba del sitio de inicio para facilitar la clonación en el vector de expresión de levadura pYES2. R01222 (reversa) (SEC ID NO: 24) 5'- AAA AGA GAA TTC CGC TTC CTA GTC TTA GTC CGA CTT GGC CTT GGC-3' Este iniciador contiene el codón de detención 'TAA' (subrayado) del gen así como secuencias en corriente descendente a partir del codón de detención. Esta secuencia fue incluida ya que las regiones dentro del gen fueron muy ricas en G + C y de esta manera no pueden ser incluidas en el diseño de los oligonucleótidos para la amplificación de PCR. Además, un sitio EcoRI (negritas) fue incluido para la clonación conveniente en el vector de expresión de levadura 5 pYES2. La banda PCR de aproximadamente 1 kb de esta manera generada fue digerida con Hindlll / EcoRI y clonada en pYES2 digerido con las mismas enzimas de restricción. La construcción resultante (sdd17 + pYES2) se etiquetó pRSP20, y fue utilizada en -1-0 —os-es-tud-ios-d -co-exp^esmn También se hicieron intentos para aislar el gen sdd17 de longitud completa a partir de ADN genómico mediante amplificación PCR. Sin embargo, el producto PCR obtenido fue más grande que 1077 bp (aproximadamente 1.15 kb), y la secuenciación de este 15 producto reveló la presencia de pequeños intrones en la secuencia genómica. El gen de longitud completa de esta desaturasa omega-3 putativa (marcado sdd17) fue de 1077 bp de longitud y se muestra en la Figura 2 (SEC ID NO: 25). 20 El gen de la SEC ID NO: 25 codifica una proteína de 358 residuos de aminoácido (SEC ID NO: 26) (Figura 3). Una búsqueda de la secuencia de proteína deducida de sdd17 (utilizando el programa "tFastA") mostró que la proteína tiene una identidad más alta (41% en 269 aminoácidos traslapados) con la desaturasa delta- 25 15 de Synechocystis sp. (ATCC número de acceso 13780) (Figura 4).

Esta proteína comparte similitudes de secuencia con varias otras desaturasas omega-3. La comparación de esta secuencia de proteína predicha con la enzima FAT1 de C. elegans (ATCC No. de acceso L41807) reveló solamente un 31.6% de identidad en 310 aminoácidos traslapados (Figura 5). Como todas las desaturasas omega-3, esta enzima no contiene un dominio b5 de citocromo dentro del extremo 5' de su secuencia. El dominio b5 de citocromo está presente en la mayoría de las enzimas de desaturación de "extremos frontales" similares a las a^satTTr^sas-^ delta— 5~ y delta-6— La— de-sa-t-ur-asa— omega^3— d-e-S.c.r_i_ta_e_o_ este ejemplo incluye las tres secuencias ricas en histidina que están presentes en todas las desaturasas de enlace de membrana. Estos tres dominios están presentes en la posición 89 a 93 (HDCGH), 125 a 129 (HQVHH) de SEC ID NO: 26. Estas cajas ricas en histidina se cree que coordinan la estructura diiron-oxo en el sitio activo de la enzima, y son necesarias para que la actividad de la enzima; ver Stukey, J.E., McDonough, V.M. & Martn, CE. (1990) J. Biol. Chem. 265, 20144-20149. Estas características son consistentes con la proteína "SDD17" siendo un miembro de la familia de desaturasa /hidroxilasa enlazada a membrana de las proteínas diiron-oxo. El contenido G + C de este gen es de 61.8%.

EJEMPLO 5 Expresión del Gen de Desaturasa Omega-3 (" sddl 7") de Saprolegnia diclina en Levadura de Panadero 5 Para determinar la especificidad del substrato y la clase de reacción catalizada por la proteína SDD17, sdd17 fue heterólogamente expresada en una Saccharomyces cervisiae (SC334). Debido a que S. cervisiae sintetiza ácidos grasos más allá de OA (18:1n-9), es un sistema ideal a usar para determinar la -1-T — ae+i -idad — de — en-z-ima — e — s u-bst r_a±o s du_r_a_oie más tiempo que OA debido a que no se detectarán antecedentes de actividad de enzima. Los substratos de ácidos grasos adecuados pueden ser exógenamente suministrados al huésped los cuales son absorbidos por la célula y actúan a través de la proteína expresada del gen 15 sddl 7 transformado. El clon pRSP19, el cual contuvo la desaturasa omega-3 de longitud completa (sdd17) de S. diclina clonado en pYX242, fue transformado e Saccharomyces cervisiae (SC334) utilizando el equipo de marca "Alkali-Cation Yeast Transformation" (BIO 101, 20 Vista, California). Los transformantes fueron seleccionados de auxotrofia de leucina con leucina carente de medios (DOB [-Leu]). Para detectar la actividad de desaturasa específica de estos clones, los transformantes se hicieron crecer en la presencia de 50 µ? de LA (18:2n-6), GLA (18:3n-6), DGLA (20:3n-6), AA (20:4n-6), y ácido 25 adrénico (22.4n-6). La conversión de estos substratos de ácido graso exógenamente suministrados en un producto que tiene una instauración adicional indica la presencia de una actividad de desaturasa específica que no se encuentra en S. cervisiae de tipo salvaje: La conversión de LA (18:2n-6) a ALA (18:3n-3) indica actividad de desaturasa delta-15. La conversión de GLA (18:3n-6) a STA (18:4n-3) indica la actividad de desaturasa delta-15. La conversión de DGLA (20:3n-6) a ETA (20:4n-3) indica la á^fi i¾^^"e~cle"s"a"tuTas"a^d-el-t-aH-7^ La conversión de ácido adrénico (22:4n-6) a DPA (22:5n-6) indica la actividad de desaturasa delta-19. La cepa de control negativo fue S. cerevisiae transformada con el vector pYX242. Los cultivos experimentales y los cultivos de control se hicieron crecer simultáneamente y se analizaron. Los cultivos fueron vigorosamente agitados (250 rpm) y se hicieron crecer durante 48 horas a 24°C en presencia de 50 vM (concentración final) de varios substratos (ver Cuadro 3). Las células se hicieron girar, se lavaron una vez en agua destilada, y las pellas se volvieron a suspender en metanol; se agregó cloroformo junto con tritiridecanoina (como un estándar interno). Estas mezclas se incubaron durante por lo menos una hora a temperatura ambiente, o a 4°C durante la noche. La capa de cloroformo se extrajo y se filtró a través de un filtro Whatman con 1 gm de sulfato de sodio anhidro para remover la partícula en cuestión y el agua residual. Los solventes orgánicos se evaporaron a 40°C bajo una corriente de nitrógeno. Los lípidos extraídos entonces se convirtieron a ésteres metílicos de ácido graso (FAME) para análisis de cromatografía de gas (GC) a través de la adición de 2 mi de 0.5N de hidróxido de potasio en metanol a un tubo cerrado. Las muestras se calentaron a 95°C-100°C durante 30 minutos y se enfriaron a temperatura ambiente. Aproximadamente 2 mi de borotrif luoruro al 14% en metanol se agregaron y se repitió el calentamiento. Después de que la mezcla de lípidos extraídos se enfrió, se agregaron 2 mi de agua y 1- min_l ~h~é~x"aTro— para- extraer— FAME— para— el— análisis^ a— tr-a^-és_d_e_GC_ El porcentaje de conversión se calculó utilizando la fórmula: % Conversión = \% Producto] x 100 [% Producto + % Substrato] CUADRO 3 Expresión de Levadura de Desaturasa Omeqa-3 (SDD17) de * 50 µ? de substrato utilizado. Los números en paréntesis representan el ácido graso como un porcentaje de los lípidos totales de la levadura. 18:2n-6 = Acido linoleico 20:3n-6 Acido dihomo-gama- linoleico 18:3n-6 = ácido gama-linoleico 20:4n-6 = ácido araquidónico 18:3n-3 = ácido alfa-linoleicc 22:4n-6 = ácido adrénico 18:4n-3 = ácido estearidónico 20:4n-3 = ácido eicosatetranoico 20:5n-3 = ácido eicosapentanoico 22:5n-3= ácido omega-3- docosapentanoico El Cuadro 3 despliega la actividad de enzima del producto de proteína codificado por sdd17 de Saproiegnia diclina ( ATCTC 5 &85 ~)~ Esta enzima es una desaturasa omega-3 activa capaz de desaturar ambos substratos de ácido graso omega-6 de 20 átomos de carbono y de 22 átomos de carbono para producir los productos de ácido graso omega-3 correspondientes. Esta enzima convierte 13.8% del substrato AA agregado al producto EPA correspondiente, de esta forma indicando a actividad de desaturasa delta-17. Además, esta enzima también actúa sobre DGLA, convirtiéndolo en ETA, como sería esperado para una desaturasa delta-17. En este Ejemplo, sin embargo, solamente 5% de DGLA agregado fue convertido a ETA, indicando que bajo las condiciones utilizadas aquí, la enzima tiene una preferencia de substrato para AA según comparado con DGLA. La actividad de esta enzima hacia substratos de ácido graso de 22 átomos de carbono también fue investigada debido a que los ácidos grasos omega-3 de 22 átomos de carbono como DPA y DHA tienen implicaciones dietéticas y farmacéuticas importantes. A partir del Cuadro 3, se puede ver que esta enzima fue activa sobre substratos de 22 átomos de carbono tales como ácido adrénico, convirtiendo 4$ de éste a DPA. Como se puede ver a partir de los cultivos de control, no hubo una conversión específica de substrato exógenamente adicionado a producto en S. cerevisiae no transformado. El Cuadro 4 demuestra que esta desaturasa omega-3 (SDD17) también pueden funcionar a una temperatura más baja (es decir, 15°C). Aquí, 50 µ? del substrato exógeno fue adicionado a los transformantes y los cultivos se h i"c ¡"eron^c r ec e r— du r-a n-t e— 48--h or as-a 15°C. El análisis de ácidos grasos fue llevado a cabo como se describió anteriormente. La absorción global del substrato a través de S. cerevisiae a 15°C menos menor que aquella vista a 24°C (comparar Cuadro 3 & y Cuadro 4). Sin embargo la conversión porcentaje del substrato a producto a través de la enzima se incrementó a 15°C. Ya que la presencia de una concentración más baja del substrato de ácido graso parece que mejora la actividad de la enzima, es posible que los substratos de ácido graso a concentraciones altas puedan ejercer una Inhibición de retroalimentación en esta enzima. Se pueden realizar estudios adicionales para determinar el efecto de diferentes concentraciones de substrato y diferentes temperaturas en la expresión de esta desaturasa omega-3 en S. cerevisiae.

CUADRO 4 Expresión de Levadura de la Desaturasa Omeqa-3 (SDD17) de Saproleqnia diclina a 15°C * 50 µ?t? de substrato utilizado Los números en paréntesis representan ácido graso como un porcentaje de los lípidos totales de levadura. 18:2n-6 = Acido linoleico 20:3n-6 Acido dihomo-gama- linoleico 18:3n-6 = ácido gama-linoleico 20:4n-6 = ácido araquidónico 18:3n-3 = ácido alfa-linoleico 22:4n-6 = ácido adrénico 18:4n-3 = ácido estearidónico 20:4n-3 = ácido eicosatetranoico 20:5n-3 = ácido eicosapentanoico 22:5n-3 = ácido omega-3- docosapentanoico A— d ife-r-ejxc J a de todas las saturasas omega-3 conocidas, la enzima que codifica sdd17 no desatura ningún substrato de acilo graso omega-6 de 19 átomos de carbono a sus ácidos grasos omega-3 correspondientes (bajo las condiciones probadas). Es posible que in vivo, - esta enzima funcione exclusivamente sobre AA, convirtiéndola en EPA. Esto podría ser consistente con el perfil del ácido graso de S. diclina desplegando altas cantidades de AA y EPA, pero pequeñas o nada de los otros intermediarios omega-3 (Cuadro 5).

CUADRO 5 Perfil del ácido graso de Saproleqnia diclina ATCC 56851 De esta forma, sdd17 codifica una desaturasa omega-3 novedosa, capaz de desaturar substratos de ácido graso de 20 átomos de carbono y de 22 átomos de carbono. La proteína SDD17 puede fácilmente ser expresada en un sistema heterologo y de esta manera tiene potencial para el uso en otros sistemas heterólogos como plantas. Esta enzima es muy diferente de otras desaturasas omega-3 conocidas, mostrando una actividad en ambos substratos de ácido graso de 20 átomos de carbono y de 22 átomos de carbono, pero no es substratos de 18 átomos de carbono. Solamente comparte 31.6% de identidad con FAT-1, la única otra desaturasa conocida capaz de actuar sobre substratos de ácido graso omega-6 de 20 EJEMPLO 6 Co-Expresión de Desaturasa Omeqa-3 de S. diclina con Otras Enzimas La construcción pRSP20 que consiste de sdd17 clonado dentro del vector de expresión de levadura pYES2, como se describe en el Ejemplo 3, fue utilizado en los estudios de co-expresión con otras desaturasas y elongasas. pRSP3, una construcción que contiene el gen delta 5-desaturasa (SEC ID NO: 27) de S. diclina clonado dentro del vector de expresión de levadura pYX242, fue co-transformado con pRSP20 en levadura. El protocolo de transformación fue como se describió en el Ejemplo 4. Esta delta 5-desaturasa cataliza la conversión de DGLA a AA y ETA a EPA. Los co-transformante fueron seleccionados en medio mínimo careciendo de leucina y Uracil (DOB [-Leu-Ura]). El Cuadro 6 muestra que cuando 50 µ? del substrato DGLA (20:3 n-6) fue agregado, la delta 5-desaturasa convertida en AA (20:4, n-6) y la desaturasa omega-3 fue capaz de además de desaturar AA en EPA (24:5, n-3). El porcentaje de conversión del substrato al producto final fue de 5%, sin ningún antecedente observado en el control negativo.

CUADRO 6 Estudios de Co-expresión con la Desaturasa O m e g a^3~( -S D -D-t-7 )~d e S. diclina * 50 µ? del substrato utilizado Los números en paréntesis representan ácido graso como un porcentaje total de lípidos de levadura. 18:3n-6 = ácido gama-linoleico 20:3n-6 = ácido dihomo-gama-linoleico 20:4n-6 = ácido araquidónico 20:4n-3 = ácido eicosatetraenoico 20:5n-3 = ácido icosapentaenoico % de conversión = [% Producto 1 + % Producto 21 [% Substrato + % Producto 1 + % Producto 2] El Cuadro 6 también muestra los resultados de un experimento de co-transformación que involucran pRSP20 y pRAT-4-A7, una elongasa obtenida de Thraustochytrid sp. 7901 (SEC ID NO: 28) clonada en pYX242. Este gen de enlogasa cataliza la adición de dos carbonos más a la PUFA pre-existente. Cuando se agregan 50 µ? del substrato GLA a DGLA, y el DGLA además fue desaturado por la desaturasa omega-3 a ETA (20:4 n-3). El porcentaje de conversión del substrato al producto final fue de 1.4% sin antecedentes observados en el control negativo. De esta manera la desaturasa omega-3 de S. diclina fue capaz de utilizar un producto producido, en un sistema de expresión heterólogo, por otra enzima heterologa de la trayectoria biosintética de PUFA, y convertir ese producto en el PUFA esperado. Se deberá observar que la expresión (y por lo tanto la actividad) de sdd17 cuando se clona en el vector pYES2 (pRSP20) fue mucho menor que cuando se clonó dentro del vector pYX242 (pRSP19). Esto puede ser explicado a través de la diferencia en los promotores de expresión presentes en cada vector. El promotor pYX232 es un promotor constitutivo y es mucho más fuerte que el promotor inducible por galactosa en pYES2. Se han hecho similares 5 observaciones durante los estudios de expresión con otras desaturasas cuando se clonan dentro de estos dos vectores de expresión. Se pueden llevar a cabo estudios adicionales de co-expresión utilizando pRSP19 en lugar de pRSP20 junto otras desaturasas y -1-T — elonga¾as- — "Pam ién—la^desaturasa ome~ga~3— ele S Üic iTFa tamBTeñ" puede ser co-expresada con otras enzimas como la delta 4- desaturasa pRTA7 (SEC ID NO: 29), en donde el ácido adrénico (22:4 n-6) puede ser adicionado como un substrato y el producto final DHA (22:6 n-3) puede ser producido debido a la acción 15 concertada de la desaturasa omega-4 y la delta 4-desaturasa.

EJEMPLO 7 Diseño de Iniciadores Degenerados para el Aislamiento del Gen de Delta 12-Desaturasa de Saorolegnia dictina ATCC 56851 20 El análisis de la composición de ácidos grasos de Saprolegnia diclina (ATCC 56851) reveló la presencia de una cantidad considerable de LA, la cual sugiere la presencia de una delta 12- desaturasa muy activa (Cuadro 5). La delta 12-desaturasa utiliza OA 25 como un substrato, de esta manera cataliza la conversión de OA a LA (ver Figura 1). La Delta 12-desaturasa está presente solamente en plantas, hongos, e insectos, pero no en mamífero, incluyendo seres humanos. De esta manera LA es un ácido graso "esencial" en seres humanos debido a que no puede sintetizarse in vivo. LA es además 5 desaturado y alongado para producir compuestos intracelulares importantes como GLA, AA y EPA. El objetivo de este experimento fue aislar el gen de delta 12- desaturasa de S. diclina y verificar su funcionalidad a través de la expresión de la enzima en un sistema huésped heterologo tal como -1-? — I e v a d u r a— E l-m é -t o do^to m a do^f u e-el_d i s eñ c &e~i n cracioTes^cl e g e n e ráelas (oligonucleótidos) que representan motivos de aminoácido conservados de delta 12-desaturasas conocidas. En el diseño de estos iniciadores, la información de la secuencia de la desaturasa delta-12 de ambas fuentes, de hongo y de planta, incluyendo la 15 información de la secuencia de: Mortierella alpina (Acceso # AF110509), Mucor rouxii (Acceso No. AF161219), Brassica júncea (Acceso # X91139), Arabidopsis thaliana (Acceso # L26296), y Borago officinalis (Acceso # AF0744324). La información de secuencia fue analizada utilizando el programa Blockmaker 20 CODEHOP (http://blocks.fhcrc.org/codehop.html). Los iniciadores degenerados utilizados en este Ejemplo fueron como sigue: Motivo 1 de proteína: NH3 - P N/E ETIKERI D/E A/C IPAHCG - COOH 25 Iniciador RO 967 (hacia delante): 5'- CCG SAG TTC ACS ATC AAG GAG ATC CGC GAS KSC ATC CCG GCC CAC TGT TTC -3' (SEC ID NO: 30). Motivo 2 de proteína: NH3 - P H/F YHAEEAT V/Y H l/L KK A/L -COOH Iniciador RO 968 (reversa): 5'- GRS CTT CTT GAK GTG GWM SGT GGC CTC CTC GGC GTG GTA GWR CGG CAT -3' (SEC ID NO: 31). Motivo 3 de proteína: NH3 - P L/V YW A/l C/M/A QG V/l V L/G/C TGVW -COOH lntciadar-RO^64~(ha^ TGC CAG GGT RTG GTC CTC ACS GGT GTC TGG-3' (SEC ID NO: 32) Esta secuencia es más similar a la Delta 12-desaturasa de planta conocida. Iniciador RO 965 (hacia delante): 5'- CCS STC TAC TGG ATC RYS CAG GGT RTC GTC KGY ACS GGT GTC TGG-3 (SEC ID NO: 33). Esta secuencia es más similar a la Delta 12-desaturasa conocida. Motivo 4 de proteína: NH3 - HVAHH L/F FS T/Q MPHYHA - COOH Iniciador RO 966 (reversa): 5'- GGC GTG GTA GTG CGG CAT SMM CGA GAA GAR GTG GTG GGC GAC GTG-3' (SEC ID NO: 34). El código de degeneración utilizado para los oligonucleotidos fue como sigue: R= A/G; Y= C/T; M = A/C; K = G/T; W = A/T; S = C/G; B = C/G/T; D = A/G/T; H = A/C/T; V = A/C/G; N = A/C/G/T.

EJEMPLO 8 Identificación y Aislamiento del Gen de Delta 12-desaturasa de Saprolepnia diclina (ATCC 56851) Para aislar un fragmento del gen de delta 12-desaturasa de S. diclina, se llevó a cabo PCR utilizando la colección de ADNc de S. diclina del Ejemplo 1 como una plantilla. Los iniciadores se u†i†iza n— en_l~as~ s gu ^ 965 + RO 966), y (RO 967 + RO 968). La PCR se llevó a cabo en 100 µ? volúmenes utilizando la polimerasa de marca "Taq PCR Master Mix" (Qiagen). Se utilizaron 10 pmoles de cada iniciador junto con 1 µ? de ADN de la colección de ADNc. La amplificación se llevó a cabo como sigue: desnaturalización inicial a 94°C durante 4 minutos, seguido por 25 ciclos de lo siguiente: 94°C durante 1 minuto, 47°C durante 1 minuto, 72°C durante 2 minutos. Un ciclo de extensión final de 72°C durante 5 minutos fue realizado, seguido por la terminación de reacción a 4°C. La amplificación con (RO 964 + RO 966) o (RO 965 + RO 966) dio como resultado bandas distintas de aproximadamente 688 bp en longitud. La amplificación con (RO 967 + RO 968) dio como resultado una banda distinta de aproximadamente 660 bp. Estas bandas fueron resueltas en un gel de agarosa de marca "SeaKem Gold" al 1% (F C BioProd ucts), y purificadas con gel utilizando el Equipo de Extracción de Gel Qiagen. Los extremos escalonados en el fragmento fueron "llenados" utilizando polimerasa de ADN T4 (Life Technologies), siguiendo las especificaciones del fabricante. Los fragmentos de ADN entonces fueron clonados dentro del vector PCR-Blunt (Invitrogen). Los plásmidos recombinantes fueron transformados en células super competentes TOP10 (Invitrogen), los clones se secuenciaron, y una búsqueda en la base de datos (Gen-EMBL) fue realizada. Los clones "sdd12-1-8", "sdd12-2-8", y "sdd 12-5-1 " todos fueron errcoTTt a~dcrs que s~e tra~s a~p~an uno c n el otro" y es~t~o~s~ fragmentos traslapados fueron alineados utilizando el programa de marca "ASSEMBLE" (GCG) para crear un fragmento de fusión individual de aproximadamente 900 bp. Una búsqueda "tFastA"con el aminoácido deducido de esta secuencia de fusión mostró la identidad más alta a las siguientes proteínas: 49% de identidad en 298 aminoácidos traslapados con Delta 12-desaturasa de Borago officinalis (Acceso # AF074324) y 46.7% de identidad en 322 aminoácidos traslapados con Delta 12-desaturasa de Sesamum indicum (Acceso # AF192486). Con base en la alta identidad a la delta 12-desaturasa conocida, el fragmento fue considerado como siendo una región del gen de delta 12-desaturasa de S. diclina. Este fragmento fue utilizado para diseñar que los iniciadores empujen los extremos 5' y 3' del gen. Para aislar el extremo 3' del gen, se diseñaron los siguientes oligonucleótidos: RO 975 (hacia adelante): 5'- CAC GTA CCT CCA GCA CAC GGA CAC CTA CG-3" (SEC ID NO: 35). RO 976 (hacia delante): 5'- GAT CGA CAG CGC GAG CCA CCA 5 CAT TGC-3' (SEC ID NO: 36). Estos se utilizaron en combinaciones con el vector de oligonucleótido SK( + ) de pBluescript: 5'- AGT CAC GAC GTT GTA AAA CGA CGG CCA G-3' (SEC ID NO: 16). Las amplificaciones PCR se llevaron a cabo utilizando -\Q — p o l i m e r a s a- d e—m a r c a- " a q— PCrR— IVrater M i x "- Q i a g^e n ) c o m o"s i g ? e_:"S e utilizaron 10 pmoles de cada iniciador junto con 1 µ\ de ADN de la colección de ADNc del Ejemplo 1 como plantilla. Las condiciones de amplificación fueron como sigue: desnaturalización inicial a 94°C durante 3 minutos, seguido por 35 ciclos de lo siguiente: 94°C 15 durante 1 minuto, 60°C durante 30 segundos, 72°C durante 1 minuto. Un ciclo de extensión final de 72°C durante 7 minutos fue realizado, a través de la terminación de reacción a 4°C. La primera combinación (RO 898 + RO 975) generó una banda PCR de aproximadamente 390 bp y la primera combinación (RO 898 + 20 RO 976) generó una banda de aproximadamente 300 bp de longitud. Estas bandas se purificaron y se clonaron, incluyendo los clones "sdd12-8-12" y "sdd12-9-4-" que se encontró que contienen el extremo 3' del gen de delta 12-desaturasa. Estas secuencias traslaparon el fragmento de delta 12-desaturasa inicial e incluyendo 25 un codón de detención TAA y una cola poli-A. El análisis de secuencia con el programa "tFastA" reveló que el clon "sdd 12-9-4" compartió 54.5% de identidad en un traslape de aminoácido 73 con la delta 12-desaturasa de Mortierella alpina (Acceso # AB020033), y 56.9% de identidad con un traslape de aminoácido 72 con la delta 12-desaturasa de Muero rouxii (Acceso # AF161219). Para aislar el extremo 5' de este gen, se diseñaron los siguientes oligonucleótidos y se utilizaron en combinación con el oligonucleótido de vector SK( + ) pBluescript RO 899 (SEC ID NO: 17).

RO 977 (reversa): 5'- CAA ATG GTA AAA GCT AGT GGV AGC G.C_T_G-C^3 -SE-C-ID-N 0^3-7), — RO 978 (reversa): 5'- AGT ACG TFC CCT GGA CGA ACC AGT AGA TG-3' (SEC ID NO: 38). Las amplificaciones PCR se llevaron a cabo utilizando polimerasa de marca "Taq PCR Master ix" (Qiagen) o el equipo de PCR de ADNc de marca "Advantage-GC" (Clonetech). El producto Clonetech fue utilizado para franquear problemas de amplificación de PCR potenciales que pueden ocurrir con regiones ricas en GC generalmente presentes en el extremo 5' de las desaturasas de este organismo. Las amplificaciones PCR utilizando la polimerasa de marca "Taq PCR Master Mix" se llevaron a cabo como se describe para el aislamiento del extremo 3' de este gen. Cuando se utiliza el equipo "PCR de ADNc Ad antage-GC", las condiciones del termociclo fueron como sigue: la plantilla fue inicialmente desnaturalizada a 94°C durante 1 minuto, seguido por 30 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 68°C durante 3 minutos, y finalmente un ciclo de terminación a 68°C durante 5 minutos. Cada reacción incluyó 1 µ\ de la plantilla de la colección de ADNc (del Ejemplo 1), 10 pmoles de cada iniciador, 0.2 mM cada dNTP, 1 M GC fundido, y 375 //g/ml de BSA en un volumen total de 50 µ\. Un producto PCR de aproximadamente 371 bp fue obtenido utilizando la combinación de iniciadores (RO 899 + RO 978). Esta banda se clonó dentro del vector PCR-Blunt (Invitrogen) como se describió anteriormente. Solamente un clon, "sdd12-10-8" de esta forma obtenido contuvo el sitio de inicio ATG putativo del gen. Otros clones— tu- ier-on— el— AT-G— reemplazada— por— otros— eod on es~r— El— aná rsis" "tFastA" de la secuencia de aminoácido deducido de "sdd12-10-8" mostró 47.2% de identidad en un traslape de aminoácido 72 de la desaturasa delta-12 de Impatiens balsamina (Acceso # AF182520) t 42.7% de identidad en un traslape de aminoácido 75 con la desaturasa delta-12 de Caléndula officinalis (Acceso # AJ245938). La longitud completa de esta delta 12-desaturasa fue obtenida a través de amplificación PCR de la colección de ADNc de S. diclina del Ejemplo 1 utilizando los^siguientes oligonucleótidos: RO1051 (hacia delante): 5' TCA ACA GAA TCC ATG TGC AAA GGT CAA GCT CCT TCC AAG GCC GAC GTG-3' (SEC ID NO: 39). Este iniciador contiene el sitio de inicio 'ATG' (subrayado) seguido por la secuencia 5' de la Delta 12-desaturasa . Además, un sitio EcoRI (doble subrayado) fue introducido en la corriente ascendente del sitio de inicio para facilitar la clonación dentro del vector de expresión de levadura pYX242.

RP1057 (reversa): 5'- AAA AGA AAG CTT TTA CTT TTCCTC GAG CTT GCG CTT GTA AAA CAA AAC-3' (SEC ID NO: 40). Este iniciador contiene el codón de detención (subrayado) del gen así como el sitio HindIII (subrayado doble), el cual fue incluido para la conveniente clonación en el vector de expresión de levadura pYX242.

Las amplificaciones PCR fueron llevadas a cabo utilizando ambas, polimerasa de marca "Taq PCR Master Mix" (Qiagen) y el equipo de marca "Advantage-GC ADNc PCR" (Clonetech), como se describió anteriormente. En este caso, sin embargo, el ADN geno mico — de — S — di dina — ue — uthrzado — como — ra — plantilla — para — la amplificación. Una banda PCR de aproximadamente 1.1 kb fue de esta forma obtenida y esta banda se aisló, se purificó, se clonó dentro del vector PCR-Blunt (Invitrogen), y se transformó en células TOP10. Los insertos fueron secuenciados para verificar la secuencia del gen. El clon "sddl 2-gg-b1 " fue digerido con EcoRI / HindIII para liberar el inserto de longitud completa, y este inserto fue clonado dentro del vector de expresión de levadura pYX242, previamente digerido con EcoRI / HindIII. Esta construcción incluyó 1182 bp del gen de desaturasa delta-12 y pYX242. La construcción se etiquetó pRSP11. La construcción pRSP11 entonces fue transformada en S. cerevisiae (SC334) para los estudios de expresión. El gen de longitud completa de esta desaturasa delta-12 putativa (etiquetada sdd12) fue de 1182 bp de longitud (SEC ID NO: 41). (Figura 6). El gen codifica una proteína de 393 residuos de aminoácido (SEC ID NO: 42) (Figura 7). Una búsqueda "tFastA" de la secuencia de proteína deducida de sdd12 mostró que la proteína tiene una identidad más alta (45.6% en el traslape de aminoácido 379 con la desaturasa delta-12 de gossypium hidsutum (Acceso # X97016) (Figura 8) y 49.6% de identidad en el traslape de aminoácido 353 con la desaturasa delta-12 de Sesamum indicum (FAD2) (Acceso # AF192486). Como otras desaturasas delta-12, esta enzima tampoco contiene un dominio b5 de citocromo dentro del extremo 5' de su secuencia. Esta enzima no contiene las tres secuencias ricas en — fHS-Hd+n-a— q-u-e— e s t á -n— r-es re n t e s— e-n— t ^o d a s— l a s— d e s a t u r a s a s e n ha z a cha s— a membrana. La posición y longitud de estas cajas de histidina son similares a aquellas vistas en otras desaturasas. Estas están presentes en las posiciones de aminoácido 108 a 112 (HECGH), 144 1 148 (HRRHH), y 326 a 330 (HVTHH) de SEC ID NO: 42. Como se observó anteriormente, estas cajas ricas en histidina se cree que coordinan la estructura de diiron-oxo en el sitio activo de la enzima y son necesarias para la actividad de la enzima.

EJEMPLO 9 Expresión del Gen de Delta 12-desaturasa (sdd12) en Levadura de panadero Para determinar la especificidad del substrato y la clase de reacción catalizada por esta delta 12-desaturasa (SDD12), sdd12 fue heterológicamente expresada en una Saccharomyces cerevisiae (SC 344). Como se observó anteriormente, debido a que S. cerevisiae no puede sintetizar ácidos grasos más allá de OA, es un sistema ideal para determinar la actividad de la enzima en substratos más grandes que OA debido a que no se detectará ningún antecedente de actividad de enzima. Los substratos de ácido graso adecuados son exógenamente suministrados al huésped; estos substratos se absorben a través de la célula y actúan mediante la desaturasa delta-12 expresada del gen sdd12 transformado. El clon pRSP11, el cual contuvo la desaturasa delta-12 de I o n g i tud completa (sdd12) de S. d ¡clin a _._C-Lo-n-a-d-Q-d-e-n-t-r-Q-d-e-p— e-lona d ø-dentro de p242, fue transformado en Saccharomyces cerevisiae (SC334) utilizando el equipo de marca "Alkali-Cation Yeast Transformation" (BIO 101), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los transformantes fueron seleccionados para auxotrofía de leucina en medio carente de leucina (DOB-Leu). Para detectar la actividad de desaturasa específica de estos clones, los transformantes se hicieron crecer en presencia de 50 µ? de cada uno de OA, LA, GLA, y DGLA. La conversión de OA a LA (18:2n-6) indica la actividad de desaturasa delta-12. La conversión de LA a ALA (18:3n-3) indica la actividad de desaturasa delta-15. La conversión de LA a GLA (18:3n-6) indica la actividad de desaturasa delta-6. La conversión de GLA a ácido estearidónico (18:4n-3) indica la actividad de desaturasa delta-15. La conversión de DGLA a ETA (20:4n-3) indica la actividad de desaturasa delta-17. La conversión de DGLA a AA (20:4n-6) indica la actividad de desaturasa delta-5. La cepa de control negativo fue S. cerevisiae transformada con el vector pYX242. Los cultivos de control y experimentales se hicieron crecer simultáneamente y se analizaron. Los cultivos fueron vigorosamente agitados (250 rmp) y se hicie ron crecer durante 48 hora_s_^a_ 2 A_C_-e n^p r_e s e e i a— de— 50—µ? (concentración final) de varios substratos (ver Cuadro7). Las células se hicieron girar, se lavaron una vez en agua destilada, y las pellas se volvieron a suspender en metanol; se agregó cloroformo junto con tritiridecanoina (como un estándar interno). Estas mezclas se incubaron durante por lo menos una hora a temperatura ambiente, o a 4°C durante la noche. La capa de cloroformo se extrajo y se filtró a través de un filtro Whatman con 1 gm de sulfato de sodio anhidro para remover la partícula en cuestión y el agua residual. Los solventes orgánicos se evaporaron a 40°C bajo una corriente de nitrógeno. Los lípidos extraídos entonces se convirtieron a ésteres metílicos de ácido graso (FAME) para análisis de cromatografía de gas (GC) a través de la adición de 2 mi de 0.5N de hidróxido de potasio en metanol a un tubo cerrado. Las muestras se calentaron a 95°C-100°C durante 30 minutos y se enfriaron a temperatura ambiente. Aproximadamente 2 mi de borotrif luoruro al 14% en metanol se agregaron y se repitió el calentamiento. Después de que la mezcla de lípidos extraídos se enfrió, se agregaron 2 mi de agua y 1 mi de hexano para extraer FAME para el análisis a través de GC. El conversión porcentaje se calculó utilizando la fórmula: % Conversión = G% Producto] x 100 [% Producto + % Substrato] El Cuadro 7 muestra la actividad de enzima de la desaturasa delta-12 cuando se expresa en levadura. Aquí, el clon pRSP11 LA, indicando la actividad de la desaturasa delta-12. En el Cuadro 7, los ácidos grasos de interés están representados como un porcentaje del total de lípidos extraídos de levadura. GC/MS fue empleado para identificar los productos. Bajo estas condiciones, los clones no exhibieron otras actividades de desaturasa. Esto confirma que el gen aislado es un gen de desaturasa delta-12. No se detecto ninguna conversión del substrato de antecedente utilizando huéspedes transformados con el vector solo. Estos datos indican que esta desaturasa delta-12 puede ser expresada en un sistema heterólogo y es de esta manera útil en la producción de ácidos grasos poliinsaturados transgénicos como GLA, AA, EPA y DHA.

CUADRO 7 Expresión de Delta 12-desaturasa de Saprolegnia diclina en Levadura de panadero a 24°C Clon Actividad de Substrato* Producto % de desaturación incorporado Producido conversión del substrato Prspl 1 Delta 12 OA (17.09%) LA (9.59%) 35.8% (pYX242 + Delta 15 LA (18.14%) ALA (0.06%) 0 Delta 12- Delta 6 LA (18.14%) GLA (0%) 0 Desaturasa Delta 5 _DGL A_( 25_. J38 % ) _AA_(i)_.1-7%.)- 0 (S. diclina)) Delta 17 DGLA (25.38%) ETA (0.07%) 0 Control Delta 12 OA (18.99%) LA (0.09%) 0 (pYX242) Delta 15 LA (8.63%) ALA (0. %) 0 Delta 6 LA (8.63%) GLA (0%) 0 Delta 5 DGLA (13.74%) A A (0%) 0 Delta 17 DGLA (13.74%) ETA (0%) 0 * 50 µ?? del substrato utilizado Los números en paréntesis representan ácido graso como porcentaje del total de lípidos de levadura.

Composiciones Nutricionales Las PUFAs descritas en la Descripción Detallada puede ser utilizadas en varios suplementos nutricionales, formulaciones de infantes, substitutos nutricionales y otras soluciones nutricionales.

I. FORMULACIONES PARA INFANTES A. Isomil® Fórmula de soya con Hierro: Uso: Como una bebida para infantes, niños y adultos con una alergia o sensibilidad a leche de vaca. Un alimento para pacientes con trastornos para los cuales la lactosa debe ser evitada: deficiencia de lactasa, intolerancia a la lactosa y galactosemia. Características: -Aislado de proteína de soya para evitar los síntomas de alergia o sensibilidad a la proteína de la leche de vaca. das— co-n- lactosa. -Baja acción osmótica (240 mOs/kg agua) para reducir el riesgo de diarrea osmótica. -Carbohidratos dobles (jarabe de maíz y sacarosa) diseñados para mejorar la absorción de carbohidratos y reducir el riesgo de exceder la capacidad de absorción de intestino dañado. -1.8 g de Hierro (como sulfato ferroso) por 100 Calorías para ayudar a prevenir la deficiencia de hierro. -Niveles recomendados de vitaminas y minerales. -Aceites vegetales para proporcionar los niveles recomendados de ácidos grasos esenciales. -Color, blanco leche, consistencia similar a la lecha, y aroma agradable. Ingredientes: (Pareve) 85% de agua, 4.9% de jarabe de maíz, 2.6% de azúcar (sacarosa), 2.1% de aceite de soya, 1.9% de aislado de proteína de soya, 1.4% de aceite de coco, 0.15% de citrato de calcio, 0.11% de fosfato de calcio tribásico, citrato de potasio, fosfato de potasio monobásico, cloruro de potasio, mono- y diglicéridos, lecitina de soya, carragenano, ácido ascórbico, L-metionina; cloruro de magnesio, fosfato de potasio dibásico, cloruro de sodio, cloruro de colina, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, riboflavina, clorhidrato de p±rJ_d_axLn , ácicLo fólLca, sulfato d_e ma gne^i-o , — od-uto — de potasio, filoquinona, biotina, selenita de sodio, vitamina D3 y cianocobalamina.

B. Fórmula de Soya Isomil® DF para Diarrea: Uso: Como un alimento para un corto período de tiempo para la administración dietética de diarrea en infantes y bebés. Características: -Aislado de proteína de soya para evitar síntomas de alergia o sensibilidad a la proteína de leche de vaca. -Clínicamente muestran que reducen la duración, de heces fecales sueltas, acuosas durante diarrea ligera a severa en infantes.

-Nutricionalmente completa para cumplir con las necesidades nutricionales del infante. -Proteína de soya aislada con L-metionína agregada para alcanzar o exceder un requerimiento del infante para todos los aminoácidos esenciales. -Formulación libre de lactosa para evitar diarrea asociada con lactosa. -Baja acción osmótica (240 mOsm/kg agua) para reducir el 5 riesgo de diarrea osmótica. -Carbohidratos dobles (jarabe de maíz y sacarosa) diseñados para mejorar la absorción de carbohidratos y reducir el riesgo de exceder la capacidad de absorción de intestino dañado. -Alcanza o exceder los niveles de vitaminas y minerales KL_r_ecLo_ men_d a_d_o LS_D_O Lr_eJ^C_omiXé_d_e_N_uirLción_de^^ de Pediátricos y requeridos por el Acta de Fórmula de Infantes. -1.8 g de Hierro (como sulfato ferroso) por 100 Calorías para ayudar a prevenir la deficiencia de hierro. -Aceites vegetales para proporcionar los niveles recomendados 15 de ácidos grasos esenciales. Ingredientes: (Pareve) 86% de agua, 4.8% de jarabe de maíz, 2.5% de azúcar (sacarosa), 2.1% de aceite de soya, 2.0% de aislado de proteína de soya, 1.4% de aceite de coco, 0.7% de fibra de soya, 0.12% de citrato de calcio, 0.11% de fosfato de calcio tribásico, 20 0.10% de citrato de potasio, cloruro de potasio, fosfato de potasio monobásico, mono- y diglicéridos, lecitina de soya, carragenano, ácido ascórbico, L-metionina; fosfato de potasio dibásico, cloruro de sodio, cloruro de colina, taurina, sulfato ferroso, m-ínositol, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinc, L-carnitina, niacinamida, 25 pantotenato de calcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, riboflavina, clorhidrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, yoduro de potasio, filoquinona, biotina, selenita de sodio, vitamina D3 y cianocobalamina.

C. Fórmula de Soya Libre de Sacarosa Isomil® SF con Hierro: Uso. Como un bebida para infantes, niños y adultos con una alergia o sensibilidad a proteína de leche de vaca o un intolerancia a la sacarosa. Características: _ -Aislado de proteína de soya para evitar los síntomas de alergia o sensibilidad a la proteína de la leche de vaca. -Formulación libre de lactosa para evitar diarrea asociadas con lactosa (la fuente de carbohidratos son los Polímeros de Glucosa Polycose®) -Libre de sacarosa para pacientes que no toleran la sacarosa. -Baja acción osmótica (180 mOsm/kg agua) para reducir el riesgo de diarrea osmótica. -1.8 g de Hierro (como sulfato ferroso) por 100 Calorías para ayudar a prevenir la deficiencia de hierro. -Niveles de vitaminas y minerales recomendados. -Aceites vegetales para proporcionar los niveles recomendados de ácidos grasos esenciales. -Color blanco leche, consistencia similar a la leche, y aroma agradable.

Ingredientes: (Pareve) 75% de agua, 11.8% de almidón de maíz hidrolizado, 4.1% de aceite de soya, 2.8% de aceite de coco, 0.1% de almidón de maíz modificado, 0.38% de fosfato de calcio tribásico, 0.17% de citrato de potasio, 0.13% de cloruro de potasio, mono- y diglicéridos, lecitina de soya, cloruro de magnesio, ácido ascórbico, L-metionina, carbonato de calcio, cloruro de sodio, cloruro de colina, carragenano, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro sulfato de manganeso, yoduro de potasio, filoquinona, biotina, selenita de sodio, vitamina D3 y cianocobalamina.

D. Fórmula con Soya Isomil® 20 con Hierro Lista para Alimentar, 20 Cal/fl oz.: Uso: Cuando se desea una alimentación con soya. Ingredientes: (Pareve) 85% de agua, 4.9% de jarabe de maíz, 2.6% de azúcar (sacarosa), 2.1% de aceite de soya, 1-9% de aislado de proteína de soya, 1.4% de aceite de coco, 0.5% de citrato de calcio, 0.11% de fosfato de calcio tribásico, citrato de potasio, fosfato de potasio monobásico, cloruro de potasio, mono- y diglicéridos, lecitina de soya, carragenano, ácido ascórbico, L-metionina, cloruro de magnesio, fosfato dé potasio dibásico, cloruro de sodio, cloruro de colina, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, riboflavina, clorhidrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, yoduro de potasio, filoquinona, biotina, selenita de sodio, vitamina D3 y cianocobalamina.

E. Fórmula para Infantes Similar®: Uso: Cuando una fórmula de infante es necesaria: s la decisión es hecha para descontinuar la alimentación con amamantamiento es necesario o como una rutina de alimentación si el amamantamiento no es adoptado.

Características: -Proteína de calidad y cantidad apropiada para el buen crecimiento; desnaturalizada por calor, lo cual reduce el riesgo de pérdida de sangre entérica asociada con la leche. -Grasa de una mezcla de aceites vegetales (doblemente homogeneizada) proporcionando un ácido linoleico esencial que es rápidamente absorbido. -Carbohidrato como lactosa en proporción similar a aquella de la leche humana. -Baja carga de soluto renal para minimizar el estrés en órganos en desarrollo. -Formas en polvo, Líquido concentrado y Listas para alimentar.

Ingredientes: (-D) Agua, leche desgrasada, lactosa, aceite de soya, aceite de coco, mono- y diglicéridos, lecitina de soya, carragenano, ácido ascórbico, cloruro de colina, taurina, m-inositol, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinc, niacinamida, sulfato ferroso, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, riboflavina, clorhidrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, filoquinona, biotina, selenita de sodio, vitamina D3 y cianocobalamina.

F. Fórmula para Infantes Prematuros Similac® NeoCaré_co_ H ierro: Uso: Para las necesidades especiales nutricionales de infantes prematuros después del alta médica del hospital. Similac NeoCare es una fórmula completamente nutricional desarrollada para proporcionar a los infantes prematuros extra calorías, proteínas, vitaminas y minerales necesarios para ponerse al día en cuanto a crecimiento y desarrollo de soporte.

Características: -Reduce la necesidad de suplementos calóricos y de vitaminas.

Más calorías (22 cal/fl oz) que las fórmulas de términos estándares (20 cal/fl oz). -Mezcla de grasa altamente absorbida, con triglicéridos de cadena media (MCToil) para ayudar a lograr las necesidades digestivas especiales de infantes prematuros.

-Niveles más altos de proteínas, vitaminas y minerales por 100 calorías para extender el soporte nutricional iniciado dentro del hospital. -Más calcio y fósforo para mejorar la mineralización de huesos.

Ingredientes: (-D) Sólidos de jarabe de maíz, leche desgrasada, suero concentrado de proteína, aceite de cártamo altamente oleico, aceite de coco fraccionado (triglicéridos de cadena media), aceite de coco, citrato de potasio, fosfato de calcio monobásico, carbonato de calcio, ácido ascórbico, c I OLULO__Í d_e magnesio, cloruro de potasio, cloruro de sodio, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, cloruro de colina, palmitato de ascorbilo, L-carnitina, acetato de alfa-tocoferilo, sulfato de zinc, niacinamida, tocoferoles mezclados, citrato de sodio, pantotenato de calcio, sulfato cúprico, clorhidrato de cloruro de tiamina, clorhidrato de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, filoquinona, biotina, selenita de sodio, vitamina D3 y cianocobalamina.

G. Fortificante de Leche Humana Baja en Hierro Similar Natural Care Lista para Usarse, 24 cal/fl oz.. Uso: Diseñada para ser mezclada con leche humana o para ser alimentada alternativamente con leche humana a infantes de bajo peso al nacer. Ingredientes: Agua -D, leche descremada, almidón de maíz hidrolizado, lactosa, aceite de coco fraccionado (triglicéridos de • cadena media), suero de concentrado de proteína, aceite de soya, aceite de coco, fosfato de calcio tribásico, citrato de potasio, cloruro de magnesio, citrato de sodio, ácido ascórbico, carbonato de calcio, mono- y diglicéridos, lecitina de soya, carragenano, cloruro de colina, m-inositol, taurina, niacinamida, L-carnitina, acetato de alfa- tocoferilo, sulfato de zinc, cloruro de potasio, pantotenato de calcio, palmitato de Vitamina A, sulfato ferroso, clorhidrato de cloruro de tiamina, clorhidrato de piridoxina, biotina, ácido fólico, sulfato de manganeso, filoquinona, vitamina D3, selenita de sodio y cianocobalamina.

II. FORMULACIONES NUTRICIONALES A. ENSURE® Uso: ENSURE es un alimento líquido bajo en residuos diseñado principalmente como un suplemento nutricional oral que va a ser utilizado con o entre alimentos, o, en cantidades apropiadas, como un reemplazo de alimento. ENSURE es lactosa y libre de gluten, y es adecuada para el uso en dietas modificadas, incluyendo dietas bajas en colesterol. Aunque es principalmente un suplemento oral, puede ser alimentado a través de un tubo. Condiciones del Paciente: -Para pacientes en dietas modificadas -Para pacientes mayores con riesgo de nutrición -Para pacientes con pérdida de peso involuntaria.

-Para pacientes recuperándose de una enfermedad o cirugía. -Para pacientes que necesitan una dieta baja en residuos. Ingredientes: Agua D, Azúcar (sacarosa) maltodextrina (Maíz(, Caseinatos de sodio y de calcio, Aceite de cártamo altamente oleico, Aislado de proteína de soya, Aceite de soya, Aceite de cañóla, Citrato de potasio, Fosfato de calcio tribásico, Citrato de sodio, Cloruro de magnesio, Fosfatóte Magnesio dibásico, Sabor artificial, Cloruro de sodio, Lecitina de soya, Cloruro de colina, Acido ascórbico, Carragenano, Sulfato de zinc, Sulfato ferroso, Acetato de alfa-tocoferilo^ Gorna_aj^ Pantotenato de Calcio...

Clorhidrato de cloruro de tiamina, Clorhidrato de piridoxina, Riboflavina, Acido fólico, Yoduro de potasio, Selenato de sodio.

B. BARRAS DE ENSU RE®: Uso: Las barras ENSURE son de nutrición completa, balanceada para uso suplemental entre o con las comidas. Proveen una alternativa rica en nutrientes, deliciosa a otros bocadillos. Las barras de ENSURE contienen <1 g de lactosa/barra, y el sabor de Biscocho de chocolate está libre de gluten. (El sabor de Galletas de Miel Graham contienen gluten). Condiciones del paciente: -Para pacientes que necesitan calorías, proteínas, vitaminas y minerales extras. -Especialmente útiles para personas que no toman suficientes calorías y nutrientes.

-Para personas que tienen la habilidad de masticar y tragar. -No se deben utilizar por cualquiera con una alergia a los cacahuates o cualquier tipo de nueces. Ingredientes: Galletas de Miel Graham — Jarabe de maíz de alta fructuosa, Aislado de proteína de soya, Azúcar morena, maltodextrina (Maíz), (Arroz crujiente, Arroz molido, Azúcar [Sacarosa], sal [Cloruro de sodio], y Malta), cascara de avena, Aceites de semilla de algodón y soya parcialmente hidrogenados, Polisacárido de soya, glicerina, Concentrado de Proteína de suero, Polidextrosa, Fructosa, Caseinato de sodio, Polvo de coj^ojL,_SiLbQ e_s_ artificiales, Aceite de cañóla, Aceite de cártamo altamente oleico, Leche seca desgrasada, Polvo de suero, Lecitina de soya y Aceite de maíz. Fabricado en una instalación que procesa nueces. Vitaminas y Minerales: Fosfatóte Calcio Tribásico, Fosfato de Potasio Dibáslco, Oxido de Magnesio, Sal (Cloruro de Sodio), Cloruro de Potasio, Acido Ascórbico, Ortofosfato Férrico, Acetato de Alfa-Tocoferilo, Niacinamida, Oxido de Zinc, Pantotenato de Calcio, Gluconato de Cobre, Sulfato de Manganeso, Riboflavina, Beta Caroteno, Clorhidrato de Piridoxina, Monoitrato de Tiamina, Acido Fólico, Biotina, Cloruro de Cromo, Yoduro de Potasio, Selenato de Sodio, Molibdato de Sodio, Filoquinona, Vitamina D3 y Cianocobalamina. Proteína: Galletas Graham de Miel. La fuente de proteínas es una mezcla de aislado de proteína de soya y proteínas de leche.

Asilado de proteína de soya 74% Proteínas de leche 26% Grasa: Galletas Graham de Miel. La fuente de grasa es una mezcla de semilla de algodón y fríjol de soya parcialmente hidrogenados, cañóla, cártamo altamente oleico, y lecitina de soya. Aceite de semilla de algodón y de fríjol de soya parcialmente hidrogenado Aceite de cañóla Aceite de cártamo altamente oleico Aceite de maíz Lecitina de soya Carbohidratos: Galleta Graham de Miel. La fuente de carbohidratos es una combinación de jarabe de maíz alto en fructosa, azúcar morena, maltodextrina, miel, arroz . crujiente, glicerina, polisacárido de soya, y cascara de avena. Jarabe de maíz alto en fructosa Azúcar morena Maltodextrina Miel Arroz crujiente Glicerina Polisacárido de soya Cáscara de avena C. ENSURE® ALTO EN PROTEINA: Uso: El ENSURE ALTO EN PROTEINA es un concentrado, de alimento líquido alto en proteína para personas que requieren de calorías, proteínas, vitaminas y minerales adicionales en sus dietas. Puede ser utilizado como un suplemento nutricional oral o entre los alimentos, o en cantidades apropiadas, como un reemplazo de alimento. ENSURE ALTO EN PROTEINA está libre de lactosa, y gluten, y es adecuado para uso mediante personas que se recuperan de cirugía general o fracturas de cadera y por pacientes en riesgo por úlceras de presión. Condiciones del paciente: -Para pacientes que requieren de calorías, proteínas, vitaminas y minerales adicionales, tales como pacientes que se recuperan de cirugía general o fracturas de cadera, pacientes en resigo por úlceras de presión, y pacientes con dietas bajas en colesterol. Características: -Bajo en grasas saturadas. -Contiene 6 g de grasa total y < 5 mg de colesterol por porción. -Sabor cremoso, rico -Excelente fuente de proteínas, calcio y otras vitaminas y minerales esenciales. -Para dietas bajas en colesterol -Libre de lactosa, fácilmente digerible. Ingredientes: Vainilla Suprema: -Agua D, Azúcar (Sacarosa), Maltodextrina (Maíz), Caseinatos de Calcio y Sodio, Aceite de Cártamo altamente oleico, Aislado de Proteína de soya, Aceite de soya, Aceite de cañóla, Citrato de Potasio tribásico, Citrato de Sodio, Cloruro de Magnesio, Fosfato de Magnesio Dibásico, Sabor artificial, Cloruro de Sodio, Lecitina de Soya, Cloruro de Colina, Acido Ascórbico, Carragenano, Sulfato de Zinc, Sulfato Ferroso, Acetato de Alfa-Tocoferilo, Goma Galano, Niacinamida, Pantotenato de Calcio, Sulfato de Manganeso, Sulfato de Cobre, Palmitato de Vitamina A, Riboflavina, Acido Fólico, Molibdato de Sodio, Cloruro de Cromo, Biotina, Yoduro de Potasio, Selenato de S D3 y Cianocabalamina. Proteína: La fuente de proteína es una mezcla de dos proteínas de alto valor biológico: caseína y soya. Caseinatos de sodio y de calcio 85% Aislado de proteína de soya 15% Grasa: La fuente de grasa es una mezcla de tres aceites: cártamo altamente oleico, cañóla y soya.

Aceite de cártamo altamente oleico 40% Aceite de cañóla 30% Aceite de soya 30% nivel de grasa en ENSURE ALTA EN PROTEINA reúne guía de la Asociación de Corazón Americana (AHA). Los 6 gramos de grasa en ENSURE ALTA EN PROTEINA representa 24% del total de calorías, con 2.6% de grasa siendo de ácidos grasos saturados y 7.9% de ácidos grasos poliinsaturados. Estos valores están dentro de la guía AHA de <30% del total de calorías de grasa, < 110 % de las calorías de ácidos grasos saturados, y <10% del total de calorías de ácidos grasos poliinsaturados. Carbohidratos: ENSURE ALTA EN PROTEINA contiene una combinación de maltodextrina y sacarosa. La dulzura ligera y variedad de sabores^ (vainilla suprema, chocolate royal, mora salvaje, y plátano), más Paquetes de Sabor VARI-FLAVORS® en nuez, cereza, fresa, limón, y naranja ayudan a prevenir cansarse de los sabores y ayuda al cumplimiento del paciente. Vainilla y otos sabores de no chocolate: Sacarosa 60% Maltodextrina 40% Chocolate: Sacarosa 70% Maltodextrina 30% D. ENSURE® LIGHT Uso: ENSURE LIGHT es un alimento líquido bajo en grasas diseñado para uso como un suplemento nutricional oral con o sin alimentos. ENSURE LIGHT es libre de lactosa y gluten, y es adecuado para uso en dietas modificadas, incluyendo dietas en bajo colesterol. Condiciones del paciente: -Para pacientes con peso normal o con sobrepeso que necesitan una nutrición extra en un suplemento que contiene 50% menos de grasa y 20% menos calorías que ENSURE. -Para adultos sanos que no comen bien y necesitan nutrición extra. Características: -Bajo en grasa y grasa saturada -Contiene 3 g de grasa total por porción y < 5 mg de colesterol. -Sabor rico y cremoso -Excelente fuente de calcio y otras vitaminas y minerales esenciales. -Para dietas bajas en colesterol. -Libre de lactosa, rápidamente digerible. Ingredientes: Vainilla francesa: Agua -D, Maltodextrina (Maíz), Azúcar (Sacarosa), Caseinato de Calcio, Aceite de cártamo altamente oleico, Aceite de cañóla, Cloruro de Magnesio, Citrato de sodio, Citrato de Potasio, Fosfato de Potasio Dibásico, Fosfato de Magnesio Dibásico, Sabor Natural y Artificial, Fosfato de Calcio Tribásico, Gel de Celulosa, Cloruro de Colina, Lecitina de Soya, Carragenano, Goma de Celulosa, Sulfato Ferroso, Acetato de Alfa-Tocoferilo, Sulfato de Zinc, Niacinamida, Sulfato de Manganeso, Pantotenato de Calcio, Palmitato de Vitamina A, Clorhidrato de Piridoxina, Riboflavina, Cloruro de Cromo, Acido Fólico, Molibdato de Sodio, Yoduro de Potasio, Selenato de Sodio, Filoquinona, Vitamina D3 y Cianocobalamina. Proteína: La fuente de proteína es caseinato de calcio.

Caseinato de calcio 100% Grasa: La fuente de grasa es una mezcla de dos aceites: cártamo altamente oleico y cañóla.

Aceite de cártamo altamente oleico 70% Aceite de cañóla 30% El nivel de gras en ENSURE LIGHT va de acuerdo con la guía de la Asociación de Corazón Americana (AHA). Los tres gramos de grasa en ENSURE LIGHT representan 13.5% del total de calorías, con 1.4$ de grasa siendo de ácidos grasos saturados y 2.6%$ de ácidos grasos poliinsaturados. Estos valores están dentro del a guía AHA de <30% del total de calorías de grasa y <10% del total de calorías de ácidos grasos poliinsaturados. Carbohidrato: ENSURE LIGHT contiene una combinación de maltodextrina y sacarosa. El sabor a chocolate contiene jarabe de maíz también. La dulzura ligera y la variedad de sabores (Vainilla francesa, chocolate supremo, remolinos de fresa, más paquetes de sabores VARI-FLAVORS® en nuez, fresa, limón y naranja, ayudan a prevenir la fatiga al sabor ayuda en la aceptación del paciente. Vainilla y otros sabores no de chocolate: Sacarosa Maltodextrina Chocolate: Sacarosa Jarabe de maíz Maltodextrina Vitaminas y Minerales: Una porción de 236.508 mi de ENSURE LIGHT proporciona por lo menos 25% de los RDIs para 24 vitaminas y minerales clave. Cafeína: El sabor a chocolate contiene 2.1 mg de cafeína/236.508 mi E. ENSURE PLUS®: Uso: ENSURE PLUS es un alimento líquido, bajo en residuos, alto en calorías para uso cuando se necesitan calorías y nutrientes extra, pero una concentración normal de proteínas. Se diseñó principalmente como un suplemento oral nutricional que será utilizado con o entre comidas, en cantidades apropiadas, como un substituto de alimento. ENSURE PLUS está libre de lactosa y gluten.

Aunque es principalmente un suplemento nutricional, puede ser alimentado a través de un tubo. Condiciones del paciente: -Para pacientes que requieren calorías y nutrientes extra, pero una concentración normal de proteínas, en un volumen limitado. -Para pacientes que necesitan ganar o mantener un peso saludable. Características: -Sabor cremoso, rico. -Buena fuente de vitaminas y minerales esenciales. Ingredientes: Vainilla: Agua -D, Jarabe de Maíz, Maltodextrina (Maíz), Aceite de Maíz, Caseinatos de Sodio y Calcio, Azúcar (Sacarosa), Aislado de Proteína de Soya, Cloruro de Magnesio, Citrato de Potasio, Fosfato de Calcio Tribásico, Lecitina de Soya, Sabor Natural y Artificial, Citrato de Sodio, Cloruro de Potasio, Cloruro de Colina, Acido Ascórbico, Carragenano, Sulfato de Zinc, Sulfato Ferroso, Acetato de Alfa-Tocoferilo, Niacinamida, Sulfato Ferroso, Clorhidrato de Cloruro de Tiamina, Sulfato Cúprico, Clorhidrato de Piridoxina, Riboflavina, Palmitato de Vitamina A, Acido Fólico, Biotina, Cloruro de Cromo, Molibdato de Sodio, Yoduro de Potasio, Selenita de Sodio, Filoquinona, Cianocobalamina y Vitamina D3. Proteína: La fuente de proteína es una mezcla de dos proteínas de valores biológicos altos: caseína y soya Caseinato de sodio y Calcio 84% Aislado de proteína de soya 16% Grasa: La fuente de grasas es aceite de maíz Aceite de maíz 100% Carbohidrato: ENSURE PLUS contiene una combinación de maltodextrina y sacarosa. La dulzura ligera y la variedad de sabores (vainilla, chocolate, fresa, café, nuez, y rompope), mas Paquetes de sabores VARI-FLAVORS® en nuez, cereza, fresa, limón y naranja, ayudan a prevenir fatiga por sabor y ayuda al cumplimiento por parte del paciente. Sabores vainilla, fresa, nuez y café: Jarabe de maíz 39% Maltodextrina 38% Sacarosa 23% Sabores de chocolate y rompope: Jarabe de maíz 36% Maltodextrina 34% Sacarosa 30% Vitaminas y Minerales: Una porción de 236.508 mi de ENSURE PLUS proporciona lo menos 15% de los RDIs para 25 vitaminas y minerales clave. Cafeína: El sabor chocolate contiene 3.1 mg de cafeína/236.508 mi. sabor a café contiene un rastro de cantidad de cafeína.

F. ENSURE PLUS® HN Uso: ENSURE PLUS HN es un alimento líquido alto en nitrógeno, alto en calorías completo diseñado para personas con necesidades de calorías y proteínas más altas o tolerancia de volumen limitado. Puede ser utilizado para suministro oral o para soporte nutricional oral a través de tubo. ENSURE PLUS HN está libre de lactosa y gluten. Condiciones del paciente: -Para paciente con necesidad de calorías y proteínas incrementadas, tales como después de cirugía o daño. -Para pacientes con tolerancia al volumen limitada y saciedad temprana. Características: -Para nutrición suplementaria o total -Para alimentación oral o por tubo -1.5 CaVml -Alto nitrógeno -Calóricamente denso. Ingredientes: Vainilla: Agua -D, Maltodextrina (Maíz), Caseinatos de Sodio y Calcio, Aceite de Maíz, Azúcar (Sacarosa), Aislado de Proteína de Soya, Cloruro de Magnesio, Citrato de Potasio, Fosfato de Calcio Tribásico, Lecitina de Soya, Sabor Natural y Artificial, Citrato de Sodio, Cloruro de Colina, Acido Ascórbico, Taurina, L-carnitina, Sulfato de Zinc, Sulfato Ferroso, Acetato de Alfa-Tocoferilo, Niacinamda, Carragenano, Pantotenato de Calcio, Sulfato de manganeso, Sulfato Cúprico, Clorhidrato de Cloruro de Tiamina, Clorhidrato de Piridoxina, Riboflavina, Palmitato de Vitamina A, Acido Fólico, Biotina, Cloruro de Cromo, Molibdato de Sodio, Yoduro de Potasio, Selenita de Sodio, Filoquinona, Cianocobalamina y Vitamina D3.

G. POLVO ENSURE®: Uso: El POLVO DE ENSURE (reconstituido con agua) es un alimento líquido bajo en residuos diseñado principalmente como un suplemento oral nutricional que será utilizado con o entre alimentos. El POLVO ENSURE está libre de lactosa y gluten, y es adecuado para uso en dietas modificadas, incluyendo dietas en bajo colesterol. Condiciones del paciente: -Para pacientes con dietas modificadas -Para pacientes de edad mayor en riesgos de nutrición -Para pacientes que se recuperan de enfermedad/cirugía -Para pacientes que necesitan una dieta baja en residuos. Características: -Conveniente, fácil de mezclar -Bajo en grasa saturada -Contiene 9 g del total de grasa y < 5 mg de colesterol por porción -Alto en vitaminas y minerales. -Para dietas bajas en colesterol -Libre de lactosa, fácilmente digerible. Ingredientes: Jarabe de maíz -D, Maltodextrina (Maíz), Azúcar (Sacarosa), Aceite de maíz, Caseinatos de Sodio y Calcio, Aislado de Proteína de Soya, Sabor natural y artificial, Citrato de Potasio, Cloruro de Magnesio, Fosfato de Calcio Tribásico, Cloruro de Potasio, Lecitina de Soya, Cloruro de Colina, Acido Ascórbico, Sulfato de Zinc, Sulfato Ferroso, Acetato de Alfa-Tocoferilo, Niacinamda. Carragenano, Pantotenato de Calcio, Sulfa.to de manganeso, Sulfato Cúprico, Clorhidrato de Cloruro de Tiamina, Clorhidrato de Piridoxina, Riboflavina, Palmitato de Vitamina A, Acido Fólico, Biotina, Cloruro de Cromo, Molibdato de Sodio, Yoduro de Potasio, Selenita de Sodio, Filoquinona, Vitamina D3 y Cianocobalamina. Proteína: La fuente de proteína es una mezcla de dos proteínas de alto valor biológico: caseína y soya Caseinatos de sodio y calcio 84% Aislado de proteína de soya 16% Grasa: La fuente de grasa es aceite de maíz. Aceite de maíz 100% Carbohidrato: ENSURE EN POLVO contiene una combinación de jarabe de maíz, maltodextrina y sacarosa. La dulzura ligera de ENSURE EN POLVO, más los Paquetes de Sabor VARI-FLAVORS® en nuez, cereza, fresa, limón y naranja ayuda a prevenir la fatiga al sabor y cumplimiento del paciente. Vainilla: Jarabe de maíz 35% Maltodextrina 35% Sacarosa 30% k-P-U-D-l-N-EJSlSU-R^® Uso: El PUDIN ENSURE es un suplemento nutriente denso que proporciona una nutrición balanceada en una forma no liquida que se va a utilizar con o entre los alimentos. Es apropiado para dietas consistentes modificadas (por ejemplo, suave, en puré o completamente líquido) o para personas con problemas para deglutir. El PUDIN ENSURE es libre de gluten. Condiciones del paciente: -Para pacientes en dietas consistentes-modificadas (por ejemplo, (suave, en puré o completamente líquido) -Para pacientes con problemas para deglutir. Características: -Rico y cremoso, buen sabor. -Buena fuente de vitaminas y minerales esenciales. -Conveniente, no necesita refrigeración -Libre de gluten Perfil de Nutrientes para 147.868 mi: 250- calorías, 10.9% de proteínas, 34.9% grasa, 54.2% Carbohidratos. Ingredientes: Leche desgrasada -D, Agua, Azúcar (Sacarosa), Aceite de Soya parcialmente hidrogenado, Almidón de Alimento Modificado, Sulfato de Magnesio, Lactilato de Estearoilo de Sodio, Fosfato de Sodio Dibásico, Sabor artificial, Acido Ascórbico, Sulfato de Zinc, Sulfato Ferroso, Acetato de Alfa-Tocoferilo, Cloruro de Colina, Niacinamda, Sulfato de Manganeso, Pantotenato de Calcio, Amarillo #5 FD&C, Citrato de Potasio, Sulfato Cúprico, Clorhidjrato de Cloruro de Tiamina, Clorhidrato de Piridoxina, Riboflavina, Palmitato de Vitamina A, Riboflavina, Amarillo #6 FD&C, Acido Fólico, Biotina, Filoquinona, Vitamina D3 y Cianocobalamina. Proteína: La fuente de proteína es leche desgrasada. Leche desgrasada 100% Grasa: La fuente de grasa es aceite de fríjol de soya hidrogenado. Aceite de fríjol de soya hidrogenado 100% Carbohidrato: El PUDIN ENSURE contiene una combinación de sacarosa y almidón de alimento modificado. La dulzura ligera y la variedad de sabores (vainilla, chocolate, sirope de caramelo, y tapioca) ayudan a prevenir fatiga al sabor. El producto contiene 9.2 gramos de lactosa por porción. Vainilla y otros sabores no de chocolate: Sacarosa 56% Lactosa 27% Almidón de alimento modificado 17% Chocolate: Sacarosa 58% Lactosa 26% Almidón de alimento modificado 16% I. ENSURE® CON FIBRA: Uso: E.MSU.RE CON FIBRA es un alimento líquido nutricionalmente completo, que contiene fibra, para personas que se pueden beneficiar de fibra y nutrientes dietéticos incrementados. ENSURE CON FIBRA es adecuado para personas que no requieren una dieta baja en residuos. Puede ser alimentado oralmente o a través de un tubo, y puede ser utilizado como un suplemento nutricional para una dieta regular, o en cantidades apropiadas, como un substituto de alimento. ENSURE CON FIBRA está libre de lactosa y gluten, y es adecuado para uso en dietas modificadas, incluyendo dietas bajas en colesterol. Condiciones del Paciente: -Para pacientes que se benefician de la fibra dietética incrementada y nutrientes.

Características: -Nueva fórmula avanzada baja en grasa saturada, alta en vitaminas y minerales. -Contiene 6 d del total de grasa y < 5 mg de colesterol por porción . -Rico, sabor cremoso -Buena fuente de fibra. -Excelente fuente de vitaminas y minerales esenciales. -Para dietas en colesterol bajo presión reducida -Libre de lactosa y gluten. Ingredientes: Agua -D; Maltodextrina (Maíz), Azúcar (S-arc a -r-o-sa)— G¾ -s e i r+a-t-o s-d e-So dio— y— C-alcio Eib_r_a d_e_ A^_e_na^ A c e i t e de Cártamo altamente oleico, Aceite de Cañóla, Aislado de Proteina de Soya, Aceite de Maíz, Fibra de Soya, Fosfato de Calcio Tribásico, Cloruro de Magnesio, Citrato de Potasio, Gel de Celulosa, Lecitina de Soya, Fosfato de Potasio Dibásico, Citrato de Sodio, Sabores naturales y artificiales, Cloruro de Colina, Fosfato de Magnesio, Acido Ascórbico, Goma de Celulosa, Cloruro de Potasio, Carragenano, Sulfato Ferroso, Acetato de Alfa-Tocoferilo, Sulfato de Zinc, Niacinamda, Sulfato de manganeso, Sulfato Cúprico, Palmitato de Vitamina A, Pantotenato de Calcio, Cloruro de Tiamina, Clorhidrato de Clorhidrato de Piridoxina, Riboflavina, Acido Fólico, Cloruro de Cromo, Biotina, Molibdato de Sodio, Yoduro de Potasio, Selenato de Sodio, Filoquinona, Vitamina D3 y Cianocobalamina. Prote ína: La fuente de proteína es una mezcla de dos proteínas de valores biológicos altos, caseína y soya.

Caseinatos de sodio y calcio 80% Aislado de proteína de soya 20% Grasa: La fuente de grasa es una mezcla de tres aceites: cártamo altamente oleico, cañóla y maíz. Aceite de cártamo altamente oleico 40% Aceite de cañóla 40% Aceite de maíz 20% El nivel de grasa en ENSURE CON FIBRA se apega a la guía de la Asociac grasa en ENSURE CON FIBRA representan 22% del total de calorías, con 2.01% de la grasa siendo de ácido grasos saturados y 6.7% de ácidos grasos poliinsaturados. Estos valores están dentro del la guía AHA de < 30% de calorías totales de grasa, < 10% de las calorías de ácidos grasos saturados y < 10% del total de calorías de ácidos grasos poliinsaturados. Carbohidrato: ENSURE CON FIBRA contiene una combinación de maltodextrina y sacarosa. La dulzura ligera y la variedad de sabores (vainilla, chocolate, y mantequilla de nuez), más los Paquetes de sabores VARI-FLAVORS® en nuez, cereza, fresa, limón y naranja, ayudan a prevenir la fatiga al sabor y ayudar al paciente a cumplir. Vainilla y otros sabores no de chocolate: Maltodextrina 66% Sacarosa 25% Fibra de avena 7% Fibra de soya 2% Chocolate: Maltodextrina 55% Sacarosa 36% Fibra de avena 7% Fibra de soya 2% Fibra: La mezcla de fibra utilizada en ENSURE CON FIBRA consiste aproximadamente 4 gramos del total de fibra dietético por lata de 236.508 mi. La relación de fibra insoluble a soluble es de 95:5. Los varios suplementos nutricionales descritos anteriormente y conocidos por aquellos con experiencia en la técnica pueden ser substituidos y/o suplementados con PUFAs producidos de acuerdo con la presente invención.

Producto Nutricional J.Oxepa™ Oxepa es un producto nutricional, bajo en carbohidratos, calóricamente denso, enteral para el manejo de dietas de pacientes con o en riesgo de ARDS. Tiene una combinación única de ingredientes, incluyendo una mezcla de aceite patentada que contiene ácido eicosapentanoico (EPA de aceite de pescado), ácido ?-linoleico (GLA de aceite de borraja), y niveles antioxidantes elevados.

Distribución calórica: La densidad calórica es alta a 1.5 Cal/ml (355 cal/235.508 mi), para minimizar el volumen requerido para reunir las necesidades de energía. La distribución de la Calorías en Oxepa se muestra en el Cuadro A.

CUADRO A Distribución Calórica de Oxepa Grasa: -Oxepa contiene 22.2 g de grasa por porción de 235.508 mi (93.7 g/l). -La fuente de grasa es una mezcla de aceite de 31.8% de aceite de cañóla, 25% de triglicéridos de cadena media (MCTs), 20% de aceite de borraja, 20% de aceite de pescado, y 3.2% de lecitina de soya. El perfil de ácido graso típico de Oxepa se muestra en el Cuadro 8. -Oxepa proporciona una cantidad balanceada de ácidos grasos polünsaturados, monosaturados, y saturados, como se muestra en el Cuadro VI. -Los triglicéridos de cadena media ( CTs) - 25% de la mezcla de grasa - ayuda de vaciado gástrico debido a son absorbidos a través del tracto intestinal sin emulsificación a través de ácidos de bilis. Los varios componentes del ácido graso del producto nutricional Oxepa™ pueden ser substituidos y/o suplementados con las PUFAs producidas de acuerdo con esta invención.

CUADRO B Perfil del Acido Graso Típico Acidos grasos % Total g/235.508 mi 9/L* Caproico (6:0) 0.2 0 04 0.18 Caprílico (8:0) 14.69 3 .1 13.07 Cáprico (10:0) 11.06 2 33 9.87 Palmítico (16:0) 5.59 1 18 4.98 Palmitoleico 1.82 0 38 1.62 Esteárico 1.94 0. 39 1.64 Oleico 24.44 5. 16 21.75 Linoleico 16.28 3. 44 14.49 a-Linoleico 3.47 0. 73 3.09 ?-Linoleico 4.82 1. 02 4.29 Eicosapentaenoico 5.11 1. 08 4.55 n-3- 0.55 0. 12 0.49 Docosapentaenoico Docosahe aenoico 2.27 0. 48 2.02 Otros 7.55 1. 52 6.72 Los ácidos grasos igual aproximadamente a 95% de la grasa total.

CUADRO C Perfil de Grasa de Oxepa Carbohidrato: -El contenido de carbohidrato es de 25.0 por porción de 235.508 mi (105.5 g/l). -Las fuentes de carbohidrato son 45% de maltodextrina, (un complejo de carbohidrato) y 55% de sacarosa (una azúcar simple), ambas son fácilmente digeridas y absorbidas. -El contenido alto en grasa y bajo en carbohidrato de Oxepa está diseñado para minimizar la producción de dióxido de carbono (C02). Los altos niveles de C02 pueden complicar es destete en pacientes dependientes de ventilado. El bajo nivel de carbohidrato también puede ser útil para aquellos pacientes que han desarrollado hiperglicemia inducida por tensión.

-Oxepa está libre de lactosa. El régimen alimenticio de carbohidrato, el aminoácidos de proteína, y porción de glicerol de grasas pueden ser convertidos a glucosa dentro del cuerpo. A lo largo de este proceso, los requerimientos de carbohidrato de tejidos dependientes de glucosa (tal como el sistema nervioso central y células de la sangre) se cumplen. Sin embargo, una dieta libre de carbohidratos puede conducir a quetosis, catabolismo excesivo de proteína de tejido, y pérdida de fluido y electrolitos. Estos efectos pueden ser prevenidos a través de la ingestión diaria de 50 ja__J_fX0 — g — e^e — car orTTdTa os dl ^r+b res7~~~líi Ti h gestión calórica es adecuada. El nivel de carbohidratos en Oxepa también es suficiente para minimizar glucoeogenésis, si la energía necesita ser lograda. Proteína: -Oxepa contiene 14.8 g de proteína por porción de 235.508 mi (62.5 g/l). -El total de calorías/relación de nitrógeno (150:1) alcanza la necesidad de los pacientes estresados. -Oxepa proporciona proteínas suficientes para promover el anabolismo y el mantenimiento de la masa del cuerpo sin grasa sin precipitar problemas respiratorios. Las ingestiones de alta proteína son una preocupación en pacientes con insuficiencia respiratoria. Aunque la proteína tiene un pequeño efecto sobre la producción de C02, una dieta alta en proteína incrementará la unidad ventiladora. -Las fuentes de proteína de Oxepa son de 86.6% de caseinato de sodio y 13.2% de caseinato de calcio. -El perfil de aminoácido del sistema de proteína en Oxepa logra o sobrepasa el estándar del grupo de proteínas de alta calidad de la Academia Nacional de las Ciencias. *Oxepa está libre de gluten.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una secuencia de ácido nucleico aislado o fragmento de la misma que comprende o complementa a una secuencia de nucleotido que codifica un polipéptido que tiene, actividad de desaturasa, en donde la secuencia de aminoácido de dicho polipéptido tiene por lo menos 50% de identidad de secuencia a una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste SEC ID NO: 26 y SEC ID NO: 42. secuencia de nucleotido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 25 o SEC ID. NO: 41. 3. La secuencia de nucleotido aislada de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicha secuencia se selecciona del grupo que consiste de SEC ID NO: 25 y SEC ID NO: 41. 4. La secuencia de nucleotido aislada de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en donde dicha secuencia codifica una desaturasa funcionalmente activa que utiliza un ácido graso poliinsaturado como un substrato. 5. La secuencia de nucleotido aislada de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicha secuencia se deriva de Saprolegnia diclina. 6. Un polipéptido purificado derivado a través de dicha secuencia de nucleotido aislada de acuerdo con la reivindicación 1 o 2. 7. Un polipéptido purificado que desatura un substrato de ácido graso poliinsaturado en un carbono omega-3 de dicho substrato y tiene por lo menos 50% de identidad de aminoácido a una secuencia de aminoácido que comprende SEC ID NO: 26. 8. El polipéptido purificado de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho polipéptido desatura un substrato de ácido graso que tiene 20 átomos de carbono. 9. Un polipéptido purificado que desatura un substrato de ácido 42. 10. El polipéptido purificado de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicho polipéptido desatura un substrato de ácido graso que tiene 18 átomos de carbono. 11. Un método para producir una desaturasa que comprende los pasos de: (a) aislar una secuencia de nucleótido que comprende o complementa a por lo menos 50% de la secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 25 y SEC ID NO: 41; (b) construir un vector que comprende dicha secuencia de nucleótido aislado del paso (a); y (c) introducir dicho vector del paso (b) dentro de una célula huésped durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la expresión de una desaturasa codificada a través de dicha secuencia de nucleótido aislada del paso (a). 12. Un vector que comprende: 1) una secuencia de nucleótido aislada que corresponde a o complementa a por lo menos el 50% de 5 la secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste SEC ID NO: 25 y SEC ID NO: 41, operablemente enlazada a b) una secuencia reguladora. 13. Una célula huésped que comprende dicho vector de la reivindicación 12. — — ^doirae^^icl a^é LiTa^ huésped es una célula eucariótica seleccionada del grupo que consiste de una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula de planta y una célula de hongo. 15. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 14, en 15 donde la expresión de dicha secuencia de nucleótido aislada de dicho vector da como resultado que dicho huésped produzca un ácido graso poliinsaturado que no se produce en un tipo silvestre de dicha célula huésped. 16. Una célula de planta, planta o tejido de planta que 20 comprende dicho vector de la reivindicación 2, en donde la expresión de dicha secuencia de nucleótido de dicho vector da como resultado la producción de un ácido graso poliinsaturado a través de dicha célula de planta, planta o tejido de planta. 17. La célula de planta, planta o tejido de planta de acuerdo 25 con la reivindicación 16, en donde dicho vector induce la producción de un ácido graso poliinsaturado seleccionado del grupo que consiste de ácido linoleico, ácido eicosatetraenoico, y ácido eicopentaenoico. 18. Una planta transgénica que comprende dicho vector de la 5 reivindicación 12, en donde la expresión de dicha secuencia de nucleótido de dicho vector da como resultado la producción de un ácido graso poliinsaturado en semillas de dicha planta transgénica. 19. Uno o más aceites o ácidos de planta expresados a través de dicha célula de planta, planta o tejido de planta de acuerdo con la ±0 r e i v rn dtc a-c i ó n T6r. 20. Un método para la producción de un ácido graso poliinsaturado que comprende los pasos de: (a) aislar una secuencia de nucleótido que comprende o complementa a por lo menos 50% de la secuencia de nucleótido 15 seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 25 y SEC ID NO: 41; (b) construir un vector que comprende dicha secuencia de nucleótido aislado del paso (a); (c) transformar el vector del paso (b) dentro de una célula 20 huésped durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la expresión de una desaturasa codificada a través de dicha secuencia de nucleótido aislada del paso (a); y (d) exponer dicha desaturasa expresada seleccionada del grupo que consiste una omega-3-desaturasa y una delta 12-desaturasa, a 25 un substrato de ácido graso, a través de las cuales dicho substrato es catalíticamente convertido por dicha desaturasa en un producto de ácido graso poliinsaturado. 21. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde dicho^substrato es ácido dihomo-gama-linoleico o ácido araquidónico 5 y dicho ácido graso poliinsaturado del producto es ácido eicosatetraenoico o ácido eicopentaenoico, respectivamente, cuando dicha desaturasa expresada es una omega-3-desaturasa. 22. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde dicho ácido graso poliinsaturado del substrato es ácido oleico y J __dJ_cJic_ácido_g na s o p-O-LUn atura d^s>— e^el — producto — es ácrdo riTToleTicoV cuando dicha desaturasa expresada es delta 12-desaturasa. 23. El método de acuerdo con la rei indicación 20, que comprende además, después del paso (d), el paso de: (e) exponer dicho producto de ácido graso poliinsaturado del 15 paso (d) a una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una desaturasa o una elongasa, a través de la cual el producto del ácido graso poliinsaturado del paso (d) es catalíticamente convertido en otro producto de ácido graso poliinsaturado. 24. El método de acuerdo con la reivindicación 23, en donde 20 dicho ácido graso poliinsaturado del producto es ácido eicosatetraenoico o ácido eicosapentaenoico y dicho otro ácido graso poliinsaturado es ácido eicosapentaenoico o ácido omega 3- docosapentaenoico, respecti amente, en donde dicha desaturasa expresada del paso (d) es una omega 3-desaturasa. 25 25. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicho ácido graso poliinsaturado del producto es ácido linoleico y dicho otro ácido graso poliinsaturado es ácido gama-linoleico, cuando dicha desaturasa expresada del paso (d) es una delta 12-desaturasa. 26. El método de acuerdo con la reivindicación 23, que comprende además el paso de exponer dicho otro ácido graso poliinsaturado a una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste de una desaturasa o una elongasa con el fin de convertir dicho otro ácido graso poliinsaturado a un ácido graso poliinsaturado 27. El método de acuerdo con la reivindicación 26, en donde dicho ácido graso poliinsaturado final se selecciona del grupo que consiste de ácido omega 3-docosapentaenoico y ácido docosahexaenoico, cuando dicha desaturasa expresada del paso (d) es omega 3-desaturasa. 28. El método de acuerdo con la reivindicación 26, en donde dicho ácido graso poliinsaturado final se selecciona del grupo que consiste de ácido dihomo-gama-linoleico, ácido araquidónico, ácido adrénico, ácido omega 6-docosopentaenoico, ácido eicosatetraenoico, ácido estearidónico, ácido eicosapentaenoico, ácido omega 3-docosapentaenoico, y ácido docosahexaenoico, cuando dicha desaturasa expresada del paso (d) es una delta 12-desaturasa . 29. Un método para la producción de un ácido graso poliinsaturado que comprende exponer un substrato de ácido graso a un polipéptido que tiene por lo menos 50% de identidad de aminoácido a una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste SEC ID NO: 26 y SEC ID NO: 42, a través de la cual dicho substrato de ácido graso es catalíticamente convertido en dicho ácido graso poliinsaturado. 30. El método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde el substrato de ácido graso es ácido dihomo-gama-linoleico o ácido araquidónico y dicho ácido graso poliinsaturado del producto es ácido eicosatetraenoico, o ácido eicosapentaenoico, respectivamente, — e-u^vdo — dicho — po+rpéptido — es un^a ofñeqaT- ^ desaturasa. 31. El método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde dicho substrato de ácido graso es ácido oleico y dicho ácido graso poliinsaturado es ácido linoleico, cuando dicho polipéptido es una delta 12-desaturasa. 32. Una composición que comprende por lo menos un ácido graso poliinsaturado seleccionado del grupo que consiste dicho ácido graso poliinsaturado del producto producido de acuerdo con el método de la reivindicación 20, dicho otro ácido graso poliinsaturado producido de acuerdo con el método de la reivindicación 23, y dicho ácido graso poliinsaturado final producido de acuerdo con el método de la reivindicación 26. 33. La composición de acuerdo con la reivindicación 32, en donde dicho ácido graso poliinsaturado del producto es ácido eicosatetraenoico o ácido eicosapentaenoico, cuando dicha desaturasa expresada del paso (d) es una omega 3-desaturasa. 34. La composición de acuerdo con la reivindicación 32, en donde dicho ácido graso poliinsaturado del producto es ácido linoleico cuando dicha desaturasa expresada del paso (d) es una delta 12-desaturasa. 35. La composición de acuerdo con la reivindicación 32, en donde dicho otro ácido graso poliinsaturado es ácido eicosapentaenoico o ácido omega 3-docosapentaenoico, respectivamente, cuando dicha desaturasa expresada del paso (d) es __ujLa_o_m-e_g.a_3-^d-e- a-t-u-r-a-s-a-; 36. La composición de acuerdo con la reivindicación 32, en donde dicho otro ácido graso poliinsaturado del producto es ácido gama-li noleico, cuando dicha desaturasa expresada del paso (d) es una delta 12-desaturasa. 37. La composición de acuerdo con la reivindicación 32, en donde dicho ácido graso poliinsaturado final se selecciona del grupo que consiste de ácido 3-docosapentaenoico y ácido docohexaenoico, cuando dicha desaturasa expresada del paso (d) es una omega 3- desaturasa. 38. La composición de acuerdo con la reivindicación 32, en donde dicho ácido graso poliinsaturado final se selecciona del grupo que consiste de ácido dihomo-gama-linoleico, ácido araquidónico, ácido adrénico, ácido omega 6-docosapentaenoico, ácido icosatetraenoico, ácido estearidónico, ácido eicosapentaenoico, ácido omega 3-docosapentaenoico y ácido docohexaenoico, cuando dicha desaturasa expresada del paso (d) es una delta 12-desaturasa. 39. Un método para prevenir o tratar una condición causada por la ingestión insuficiente de por lo menos un ácido graso poliinsaturado que comprende la administración a dicho paciente de dicha composición de la reivindicación 32 en una cantidad suficiente para efectuar dicha prevención o tratamiento.