MXPA04006107A - Camara con volumen ajustable para cultivo celular y ayuda a organos. - Google Patents

Abstract

La invencion presenta camara modulares para cultivar celulas en las cuales el volumen de una camara puede ajustarse sin comprometer el sello o esterilidad de la camara. La invencion se basa en el principio de que el volumen de una camara formada entre dos placas que emparedan una junta de estanqueidad comprimible y un tope substancialmente no comprimible puede ajustarse utilizando una junta de estanqueidad que forma un sello hermetico contra fluidos entre las placas en una pluralidad de niveles de compresion. La invencion permite que el cultivo de celulas entre placas substancialmente paralelas y rigidas en las cuales puede utilizarse un volumen relativamente grande para sembrar las celulas y reducirse el volumen de retencion por perfusion sin abrir o de otra manera desensamblar el sistema para comprometer su esterilidad y hermeticidad contra liquidos. La nueva camara de cultivos celular cerrada, modular y escalable puede filtrarse asi y utilizarse para cultivar celulas (por ejemplo, hepatocitos) con altos niveles de funcion celular en sistemas de ayuda a organicos (por ejemplo, el higado), para la produccion de celulas, para la produccion de productos derivados de celulas, tales como proteinas o virus, o para sistemas a fin de tratar liquidos biologicos para eliminar toxinas, tales como amoniaco, agregar productos sintetizados celulares, o ambos.

Description

CÁMARA CON VOLUMEN AJUSTABLE PARA CULTIVO CELULAR Y AYUDA A ÓRGANOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a sistemas y métodos para cultivar células en cámaras para cultivo celular y diseño de tejidos y para dispositivos de ayuda a órganos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los dispositivos, cámaras, y aparatos para cultivar células son un foco principal en la industria de la biotecnología como sistemas para producir células y compuestos derivados de células así como también para utilizar células en productos de diseño de tejidos como sistemas para tratamiento terapéutico y terapia genética. Aunque en el último siglo se ha concebido, desarrollado y aplicado una amplia variedad de dispositivos para cultivo celular, persiste la necesidad de sistemas novedosos y mejorados, en parte debido a limitaciones no resueltas con los dispositivos existentes y en parte debido a nuevas aplicaciones con requisitos no anticipados por los dispositivos existentes .

J Las limitaciones no resueltas con los t i o celular incluyen: (1) la incapacidad de sembrar y distribuir células en dispositivos en 5 proporciones relativamente altas de volumen de medio a número de células necesarias para soportar la inoculación celular (por ejemplo, adhesión y dispersión para células dependientes de la unión) mientras se reduce el volumen por 10 célula para una función celular ventajosa, crecimiento, y concentración de productos derivados de células, (2) deficiencias inherentes en el ascenso de rendimiento de cultivos celulares con incrementos en el tamaño 15 de los dispositivos, e (3) incapacidades con las escalas económicamente factibles de elaboración que aseguran el acatamiento de las preocupaciones reguladoras. Estos problemas se encuentran compuestos por requisitos para 20 limitaciones disminuidas en transferencia de masa, la necesidad de minimizar el volumen de retención de dispositivos per fusionados para limitar la hemodilución durante el tratamiento in vivo utilizando cultivos celulares, y —25—maximizando l_a __f_un_c_ión de cultivos celulares melindrosos (por ejemplo, células germinales que linajes no deseados ) . La consideración de los dispositivos 5 existentes para cultivo celular y, en particular, para dispositivos adecuados para el cultivo de células mamiferas frágiles dependientes de la adhesión, ilustra las limitaciones y deficiencias que garantizan la 10 localización. Por ejemplo, casi cada dispositivo para cultivo celular anteriormente descrito carece de la capacidad de controlar el volumen contenido en la cámara que aloja las células sin cambiar el componente que comprende 15 las paredes de la cámara misma y/o que comprometa la esterilidad de la cámara y el cultivo celular soportado. Los dos tipos de dispositivos que se han descrito que proporcionan un volumen variable durante el 20 cultivo celular sin comprometer la esterilidad del cultivo, presentan además restricciones significativas que inhiben su aplicación. Se han descrito con anterioridad varias formas de una cámara para el cultivo celular con base en -2-5 — una b_ol_Sc la cual co_nc_epjtua1mente podría permitir volúmenes variables para cultivos, (por ejemplo-, US— -o^ ffift6f^na y US No. 5,714,384 ) , pero las paredes flexibles presentes en estas y otras bolsas no proporcionan un control 5 hermético de los volúmenes, no proporcionan superficies rígidas para el cultivo de células adherentes, ni cámaras presentes con geometrías bien definidas para perfusiones bien definidas (por ejemplo, tensiones por cizallamiento 10 hidrodinámico uniforme requeridas para muchas células adherentes) . La deformabilidad de una pared de una cámara en general (por ejemplo, como se practica por US No. 6 , 152 , 163) , conduce a estas limitaciones inherentes.

Alternativamente, US No. 5,707,868 describe el uso de un diseño basado en pistón como una cámara de volumen variable para el cultivo celular. Este tipo de diseño, similar en concepto a otros diseños basados en pistón para 20 aplicaciones biotecnológicas descritas en US No. 5,143,847, US No. 60007,472, y US No. 6,290,910, son mecánicamente voluminosas y no son adecuadas para cultivos grandes, planos de monocapas adherentes . —25- Una revisión de_ cliseños anteriores de dispositivos para cultivo celular apoya la -^ve^e-s-i-da-d—de n r p a i on de un aparato para el cultivo escalable de células entre placas planas rígidas, substancialmente paralelas, en las 5 cuales puede utilizarse un volumen relativamente grande para sembrar las células y reducirse el volumen de retención en la cámara misma para la perfusión sin abrir o de otra manera desensamblar el sistema para comprometer su 10 esterilidad y hermeticidad contra líquidos. Tal dispositivo tampoco debe requerir un manejo intenso ni desensamblar el dispositivo entre la siembra y la perfusión subsecuente, tal como por la eliminación de una pared de siembra, y debe 15 mejorar el proceso intensivo de labor normalmente de culti vo celular mientras se facilita el procedimie nto aséptico. Un sistema completamente cerrado en el cual las células se bombean directamente a una cámara sin exposición 20 directa a la atmósfe ra exterior, que permita sedimentar y anexar, eliminado el medio de siembra, y la perfu sión de medio o plasma definido establecida con un desensamble o exposición mínimo será compatible estos _25_ requi s i t os . Además , estas características aplicabilidad como terapias para otros pacientes con falla de islote [por ejemplo, en la diabetes) , fallas renales, fallas de los órganos endocrinos (por ejemplo, las glándulas adrenales) , y hematopoyesis deteriorada (por ejemplo, en el cáncer de la médula ósea) . La aplicación de nuevas formas de dispositivos de cultivo celular para el tratamiento de pacientes que padecen una función hepática deteriorada es una necesidad particularmente presente. Más de 43,000 estadounidenses mueren cada año de enfermedad hepática, haciéndola la décima causa de muerte reJ. ac i ojeada_???_ J_a _enfermedad en los EU . Cuando la enfermedad hepática progresa a falla hp áMna, la mortalidad es de 80 % a menos que se encuentre un órgano donador compatible. Como con otros órganos, existe una escasez critica de hígados donadores. Más de 12,000 pacientes se encuentran en lista actualmente como candidatos al transplante, pero menos de la mitad de ese número de hígados vivos se encuentran disponibles cada año. El tratamiento con un dispositivo de ayuda al hígado (LAD) disminuiría la mortalidad asociada con fallas hepáticas al estabilizar pacientes de manera que son candidatos adecuados para un transplante, apoyándolos hasta que haya disponible un hígado de donador adecuado, y/o evitando el deterioro al punto donde se requiera un transplante de hígado. Mejorar la salud pre-operati va de estos pacientes incrementará también el éxito del transplante, disminuyendo así la frecuencia de retransplante y facilitando la demanda de órganos donadores. En casos de fallas súbitas o hepáticas, las cuales ocurren frecuentemente como resultado de una infección viral o toxicidad, el tratamiento con un LAD eliminaría la necesidad de un transplante al apoyar a estos pacientes h^¾i-a gii se regeneren sus JD ropios h i gado s . El transplante de hígado es actualmente el procedimiento más caro de transplantes de órganos. El desarrollo exitoso de un LAD proporcionaría consecuentemente grandes beneficios a los EU como menos muertes y menos costos de cuidado de la salud. Los dispositivos extracorporales para el apoyo temporal de hígado se han investigado desde los 1960s. Se han explorado dos estrategias en el desarrollo de dispositivos de ayuda a hígado: (1) dispositivos no biológicos basados en hemoper fusión en sorbentes, hemodiálisis en membranas permeables selectivamente, e intercambio de plasma ( alchesky , "Non-biological liver support : historie overview", Artif. Organs 18:342-347, 1994) ; y (2) los dispositivos biológicos que incorporan células o componentes celulares (Yarmush et al., "Assessment of artificial liver support technology", Cell Trans . 1: 323-341, 1992 ) . Los dispositivos no biológicos han m st rad_o_ _ so lame nt e una eficacia limitada, confirmando que los materiales sintéticos no -Pte-d-en r m l a7ar el rango y nivel de las funciones metabólicas complejas normalmente ejecutadas por el hígado. Por otra parte, se 5 propuso un LAD biológico en el cual se siembran los hepatocitos en la superficie exterior de fibras huecas y la sangre o plasma circule a través del paso de estas fibras fue propuesto hace casi 25 años por Wolf y colegas (Wolf efc 10 al. "Bilirubin conjugation by an artificial liver composed of cultured cells and synthetic capillaries" , Trans . Amer. Soc. Artif. Int. Organs 21: 16-23, 1975) . Es deseable en tal LAD proporcionar el rango de funciones provistas por 15 los hepatocitos en hígados saludables, incluyendo el despeje de productos catabólicos de proteína (por ejemplo, hemoglobina derivada de la productividad de los glóbulos rojos) , destoxif icación de xenobióticos (compuestos 20 foráneos a un organismo) , gluconeogénesis , homeóstasis para lípidos, minerales, vitaminas, y cofactores, y regulación de composición sanguínea (por ejemplo, por secreción de proteínas portadoras como la albúmina y factores -25— de _coaguladon )_.

Los diseños actuales para un LAD 1-M.ció-g-i-c- —iLt_i..T i zan el inverso de este concepto hoy en día. Los diseños de módem se basan frecuentemente en proporcionar una función hepática critica al soportar suspensiones de hepatocitos de alta densidad en fibras huecas, con circulación de sangre o plasma fuera de las fibras. En este diseño, se va a proporcionar una función hepática extracorporal intermitente hasta que el paciente se recupere mediante la regeneración del hígado o hasta que se encuentre disponible un transplante. Sin embargo, el diseño basado en fibras huecas se encuentra limitado por varios factores, incluyendo: a) transporte inadecuado de masa, b) falta de esca labi 1 idad para la clasificación por tamaños, c) falta de medularidad para la flexibilidad en el diseño y ensamble, d) mal control de la distribución de células, particularmente durante la carga, e) soporte inadecuado de hepatocitos durante la siembra, incluyendo limitaciones en el volumen del medio de soporte, f) incompatibilidad con el procesamiento aséptico, g) restricciones para un volumen nulo en el circuito de j)er f usión _pa_ra _el dispositivo, y h) dinámica en el mezclado entre el contenido del ^ts^-s-ii-i^K)—y—el plasma del paciente debido a restricciones en el diseño de la interfase entre el dispositivo y el paciente. Por ejemplo, es deseable perfusionar ex vivo números relativamente grandes de células, hasta 10% o más de los aproximadamente 2-5*1011 hepatocitos en un adulto saludable, en altas densidades (para minimizar los efectos de dilución en el plasma durante el tratamiento) y con una función diferenciada significativa. Las fibras huecas se han seleccionado para los LADs sobre la base de la disponibilidad al alcance en lugar de la capacidad demostrada de soportar la función de hepatocitos. La perfusión de cultivos de hepatocitos de alta densidad en fibras huecas ha mostrado una falta de beneficios convincentes debido entre otras razones, a limitaciones de transporte que socavan su soporte a cultivos de alta densidad. Tales limitaciones son particularmente agudas para el oxigeno, el cual se requiere tanto para la función metabólica básica asi como también para los pasos iniciales en la destoxif icación . La perfusión de plasma o medio oxigenado mediante o alrededor de una red de fibras huecas tai-la en abordar este pr oblema debido a que estos líquidos acuosos son malos portadores de oxígeno y las distancias asociadas para el transporte son relativamente grandes. Las modificaciones al diseño de núcleo de fibra hueca (por ejemplo, el uso de una red tejida de tres conjuntos independientes de capilares que proporcionan una oxigenación integral como se describe en US No. 5,516,691) complican significativamente la fabricación y abordan incompletamente las limitaciones de transporte fundamentales. Carecen también de la capacidad para orientar los hepatocitos en una configuración laminar más organotí pica . En años recientes se han descrito varios diseños de dispositivos para el cultivo de células de hígado que abordan un subconjunto de ocho factores críticos que limitan el rendimiento de LADs basados en fibra hueca. US No. 5,658,797 describe un dispositivo para tratar hepatocitos cultivados en deslizaderas permeables al gas de tipo placa. Sin embargo, este dispositivo tiene una geometría radial .complicada y requiere el cultivo de estas células dentro de un emparedado complicado y de ??-r-a mane-r-a rpRtr ri-iyo entre los qeles de colágeno. US No. 6,228,607 describe mejoras a los conceptos introducidos en US No. 5,658,797 por el cambio a una geometría Cartesiana para el flujo; sin embargo, las limitaciones en la configuración del cultivo y el requisito de una membrana permeable a líquidos que interviene entre el perfusato y las células complican su aplicación. La Publicación de Solicitud PCT Internacional No. WO 00/78932 aborda las limitaciones anteriores al describir dispositivos modulares en los cuales se cultivan los hepatocitos en películas permeables al gas, impermeables a líquidos, en contacto directo con el perfusato. Sin embargo, en esta última solicitud, no se describe ningún medio para cargar células por perfusión como un sistema cerrado o para cambiar el volumen de la cámara para cultivo celular sin comprometer la esterilidad. Todas las descripciones anteriores no abordan completamente la configuración de sistemas para realizar la interfase de un LAD extracorporal con un paciente con fallas h-epAtica s_ y_ e_n _ne_ce_s idad_de_ tratamiento .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN T.a invención presenta cámaras modulares para cultivar células en las cuales el volumen de la cámara puede ajustarse sin comprometer el sello o esterilidad de la cámara. La invención se basa en el principio de que el volumen de una cámara formada entre dos placas substancialmente rígidas, en las cuales la separación entre placas se ajusta por un tope substancialmente no comprimible, puede ajustarse utilizando una junta de estanqueidad que forma un sello hermético contra fluidos entre las placas en una pluralidad de niveles de compresión. La invención permite el cultivo de células en una cámara con un compartimiento que tiene un volumen relativamente grande para sembrar células pero un volumen de retención relativamente pequeño para la perfusión, de manera tal que esta reducción en el volumen se realiza sin abrirse o de otra manera desensamblando la cámara para comprometer su esterilidad y hermeticidad contra líquidos. La nueva cámara cerrada de cultivo celular, modular, y escalable puede consecuentemente per fusionarse y utilizarse para cultivar células [por ejemplo, hepatocitos) con -a-tfc-o-s—vi-v-el-es—d_e función celular en si stemas de ayuda a órganos (por ejemplo, en hígado) , para la producción de células o productos derivados de las células (por ejemplo, proteínas o virus) o para sistemas a fin de tratar líquidos biológicos para eliminar toxinas (por ejemplo, amoníaco) , agregar productos sintetizados por células, o ambos. Cuando se siembra una o una pluralidad de cámaras con las células apropiadas y se incorporan a un dispositivo, el dispositivo puede utilizarse para tratar un paciente con un órgano (por ejemplo, hígado) en necesidad de asistencia funcional. La invención presenta métodos para cultivar células, donde la cámara se convierte entre dos o más diferentes configuraciones, donde cada configuración se distingue por una distancia única entre las placas superior e inferior correspondientes a un volumen único en el compartimiento formado, sin comprometer el sello hermético y estéril formado por la junta de estanqueidad entre las placas. La invención presenta una cámara con ju_ntas_ de ^sj anque_ida.d_que pueden comprimirse a dos o más niveles diferentes de compresión mi flTit i-as S forma un sello que no permite la canalización a través de la junta de estanqueidad y no falla mecánicamente bajo cargas aplicadas necesarias para el sellado. La junta de estanqueidad se retiene y alinea en una ranura en la pared superior, pared inferior, o ambas paredes del compartimiento. La ranura tiene una profundidad menor al grosor de la junta de estanqueidad y un ancho mayor al grosor de la junta de estanqueidad pero no tan grande como para que la junta de estanqueidad se incline dentro de la ranura. En una modalidad, la junta de estanqueidad se encuentra hecha de esponja de silicona de espuma cerrada. En una modalidad la junta de estanqueidad es un tubo inflable en el cual la presión interna se mantiene pero el volumen de gas al interior varia para cambiar el volumen del compartimiento. En una modalidad la superficie de la junta de estanqueidad es tratada para permitir que la junta de estanqueidad se humedezca o adhiera mejora a una o más de las paredes del compa r t imi e nt o . La invención presenta una cámara con sujetadores para suministrar la carga aplicada a la junta de estanqueidad para el sellado. En una modalidad, estos sujetadores son cautivos de sujetadores de cuarto de vuelta que permiten un apriete y aflojamiento más rápidos que los tornillos de máquina convencionales. El número de sujetadores requeridos se encuentra en función de las propiedades mecánicas de la junta de estanqueidad y las paredes de la cámara. La invención presenta una cámara con volumen ajustable, donde un conjunto de uno o más topes substancialmente no comprimibles ajustan el espaciamiento entre las paredes superior e inferior y, consecuentemente, el volumen del compartimiento para cada configuración . En una modalidad los topes son bandas substancialmente no comprimibles de metal o plástico. Las lengüetas que se extienden fuera de los bordes de las placas superior e inferior pueden incluirse para permitir la eliminación e intercambio de cuñas a fin de convertir entre diferentes configuraciones con diferentes volúmene s . En una mo_dalid_ad los topes son pernos substancialmente no comprimibles. Los pernos pueden ubicarse colinealmente con sujetadores que aseguran conjuntamente las placas superior e inferior . En una modalidad se minimiza la inclinación de las placas superior e inferior al ubicar los topes a lo largo de las mismas lineas centrales que utilizan los sujetadores para suministrar una carga aplicada. En una modalidad se minimiza la inclinación de las placas superior e inferior al utilizar dos o más topes ubicados a bordo y fuera, respectivamente, de la junta de e stanqueidad . En una modalidad se utilizan resortes con sujetadores para mantener una mínima carga aplicada en la junta de estanqueidad durante el uso de la cámara y conversión entre las configuraciones con diferentes volúmenes. En una modalidad la superficie en la cámara para la unión y el cultivo celular es una película permeable al gas, impermeable a líquidos. La película permeable al gas, impermeable a líquidos puede elaborarse a partir dpf pnr ejemplo, poliestireno y también puede tratarse, por ejemplo, por descarga de corona. En una modalidad, la película se trata en la parte para cultivo celular al recubrir con colágeno antes de sembrar células. La concentración de oxígeno suministrado a la cámara puede variarse a fin de controlar la función de las células. La oxigenación puede ser mediante la superficie para cultivo celular, a través del medio, o por ambos métodos . La invención presenta también un método para tensar una película en un respaldo. El respaldo puede ser una placa sólida, porosa o perforada, que sea subs tancialmente rígida. La película tensa en el respaldo puede utilizarse como una superficie para el cultivo celular en la cámara de la invención. En una modalidad se tensa una película en un respaldo, donde la película y el respaldo tienen diferentes coeficientes de expansión térmica, al adherir conjuntamente la película y el respaldo a una temperatura superior a la temperatura a la cual el compuesto de la película y el respaldo se utilizarán para -cul-i-vo ce_l_uJ._a___en la cámara . En una modalidad se tensa una película en un respaldo utilizando un adhesivo que se calienta para permitir que se forme un recubrimiento delgado de adhesivo entre la película y el respaldo. La invención presenta una cámara con volumen ajustable que tiene dos aberturas, donde se utiliza una abertura para introducir un líquido biológico a la cámara y se utiliza otra abertura para ventilar el contenido gaseoso de la cámara durante la introducción del líquido. En una modalidad la cámara tiene dos conjuntos de un par de aberturas, donde se utiliza un conjunto para sembrar la cámara en la configuración de volumen más grande de la cámara, y el otro conjunto se utiliza para perfusionar la cámara en la configuración de volumen más pequeño de la cámara. En una modalidad se distribuyen los puertos para sembrar células en la cámara para distribuir uniformemente células en la superficie para cultivo celular. En una modalidad se distribuye una pluralidad de puertos y se encuentran a manera ris múl t l ps a fin de distribuir uniformemente un liquido biológico para la perfusión a través del compartimiento de la cámara. En una modalidad las hendiduras entre el múltiple para introducir y eliminar un liquido biológicamente distribuyen uniformemente el liquido biológico de perfusión mediante el compartimiento de la cámara. La invención presenta también una cámara con volumen ajustable para el cultivo celular incluyendo un alojamiento con un compartimiento celular que comprende una entrada de líquidos y una salida de líquidos formada por una película permeable al gas, impermeable a líquidos y una membrana permeable a líquidos, y un compartimiento de líquidos que comprende una entrada de líquidos y una salida de líquidos formadas por una pared impermeable y la membrana permeable a líquidos, y donde la entrada de líquidos y la salida de líquidos se encuentran dispuestas de manera tal que el líquido que ingresa por la entrada de líquidos fluye hacia la entrada de líquidos y a través del compartimiento de perfusión de líquidos y sale por el compartimiento de perfusión de líquidos a través—de la salid de líquidos y el alojamiento a través de la salida de líquidos. La cámara puede sembrarse con células, incluyendo células dependientes de la adhesión y células de origen mamífero. Estas células pueden provenir de donadores humanos, porcinos, bovinos, caninos, felinos, equinos, ovinos, conejos, ratas, o murinos o de cepas de células cultivadas o líneas celulares provenientes de uno o más de estos donadores. Adicionalmente , la cámara puede sembrarse con hepatocitos. Las células se siembran en la superficie para la unión y cultivo. La invención presenta también un método para sembrar células en la cámara como un sistema cerrado, donde las células suspendidas en un líquido biológico se perfusionan a través de tubería dentro de la cámara desde un recipiente ventilado, y el contenido gaseoso de la cámara se ventila desde la cámara. Las células pueden cultivarse en la cámara estadísticamente o bajo perfusión con un líquido biológico . En una modalidad el método para sembrar células en la cámara como un sistema cerrado se ara recubrir la superficie para el cultivo celular con colágeno antes de sembrar las células . La invención presenta un método para cultivar células utilizando la cámara con volumen ajustable, donde se siembran las células en la cámara configurada para aceptar un volumen grande de liquido biológico, la cámara de células sembradas se convierte en una configuración con un volumen más pequeño, y se perfusionan las células. En una modalidad se crea el sistema cerrado para sembrar células utilizando un soldador de tubería estéril para realizar las conexiones asépticas. En una modalidad se colecta una pluralidad de cámaras conjuntamente en paralelo, en serie, o una combinación de las mismas para perfusión. Las cámaras individuales pueden estar en configuraciones con volúmenes idénticos o diferentes y pueden tener sea uno o dos compartimientos. Adicionalmente , las cámaras pueden estar dispuestas para permitir el apUamiento de una cámara encima de otra cámara.

En una modalidad se preservan las .Á lulas. La preservación puede ser por ciropreservacion, almacenamiento hipotérmico , o liofilización. En una modalidad, se perfusiona el medio de cultivo con contenido de nutrientes . La invención incluye también un sistema de ayuda al hígado que incluye (1) un dispositivo de flujo que comprende una o más cámaras con volumen ajustable, sembrada cada una de ellas con hepatocitos y a manera de múltiples en sus entradas y salidas a los múltiples comunes de entrada y salida, respectivamente; (2) un primer conducto para conducir plasma sanguíneo desde un paciente hacia el múltiple de entrada; (3) un segundo conducto para conducir plasma tratado desde el dispositivo de flujo hacia el paciente; y (4) una o más bombas para mover el plasma mediante los conductos y el dispositivo de flujo. El sistema puede incluir además un separador de plasma para eliminar las células sanguíneas de la sangre a fin de proporcionar plasma que se pase por el dispositivo de flujo. En una modalidad el sistema de ayuda al hígado de la invención incluye un intercambiador dp— lasma que mezcla e intercambia plasma entre el paciente, el separador de plasma, y el dispositivo de flujo. El intercambiador de plasma puede ser un recipiente con un solo compartimiento o puede tener una pluralidad de compartimientos separados por membranas permeables a líquidos. Las membranas permeables a líquidos tienen poros que inhiben el transporte de las moléculas con pesos moleculares superiores a 50,000 hasta 10,000. En una modalidad para el dispositivo de ayuda al hígado de la invención, el intercambiador de plasma es un dispositivo de inmunoaislamiento . En una modalidad para el dispositivo de ayuda al hígado de la invención, un primer conducto conduce plasma desde el separador de plasma hacia el múltiple de entrada a las cámaras, y un segundo conducto conduce plasma desde el múltiple de salida de las cámaras hacia el paciente . En una modalidad, las membranas permeables a líquidos que separan los compartimientos celular y de líquidos en una cámara de dos compartimientos tienen poros qu -i n h i b a n P) transporte de moléculas con peso moleculares superiores a 50,000 hasta 100,000. La invención incluye también un método para tratar plasma sanguíneo que incluye sembrar un dispositivo de flujo para el cultivo celular de la invención con hepatocitos, introducir plasma sanguíneo por la entrada de líquidos del dispositivo, y permitir que el plasma fluya por el dispositivo y salga por la salida de líquidos . La invención incluye también un método para tratar un paciente en necesidad de ayuda al hígado. El método incluye unir el sistema de ayuda al hígado de la invención al flujo sanguíneo de un paciente y tratar al paciente. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que el comprendido comúnmente por el experto en la materia a la cual pertenece esta invención. Aunque pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente en la práctica o pruebas de la presente invención, a continuación aún suficientes células por eficacia. Además, -j^—ca^^^jjd xL^ie^aj^bÁa^^desde una configu ación para sembrar a una configuración para perfusión sin manejo intensivo o comprometiendo la esterilidad mientras se forman conexiones estériles con un soldador de tubería estéril reduce el tiempo de manejo, reduce la necesidad de equipo caro para procedimientos asépticos (por ejemplo, gabinetes biológicos de seguridad o cubiertas de flujo laminar), y ofrece oportunidades para procedimientos asépticos en sitios clínicos. Los nuevos dispositivos de flujo para cultivo celular permiten también que se cultiven diversas células con niveles deseables de transporte de masa de oxígeno y otros nutrientes, productos residuales, y productos benéficos, mientras se reduce potencialmente la tensión perjudicial por cizallamiento asociada normalmente a niveles superiores de flujo de medio. Como resultado, pueden cultivarse incluso las células relativamente sensibles a cizallamiento tales como hepatocitos durante periodos extendidos de tiempo a tasas de flujo relativamente bajas para el medio con altos niveles de función. Como consecuencia, la y i g a r-.i ?? y la perfusión pueden controlarse independientemente. Además, estos dispositivos permiten el tratamiento directo de superficies para la mejora de unión y función celular asi como también una distribución más uniforme de las células dentro de los dispositivos en forma de cultivos laminares que simulan la arquitectura in vivo del hígado. Estas características permiten que se utilicen nuevos dispositivos de flujo en sistemas de ayuda a órganos (por ejemplo, el hígado) . Otras características y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada, y a partir de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras la y Ib son diagramas esquemáticos de una cámara cerrada con un volumen ajustable para cultivo celular y ayuda a órganos, sellada con una junta de estanqueidad comprimible, convertida de una configuración de volumen relativamente alto (la) a una configuración de volumen relativamente bajo (Ib) por intercambio de una cuña substancialmente no r.Qmprimiblg_. La Figura 2 es una curva de diseño de las propiedades mecánicas deseadas para juntas de estanqueidad para la invención en forma de una gráfica de tensión en función de una de f ormaci ón . Las Figuras 3a y 3b son diagramas esquemáticos de una modalidad de una cámara cerrada de cultivo celular, sellada con una junta de estanqueidad reversiblemente inflable, convertida de una configuración de volumen relativamente alto (3a) a una configuración de volumen relativamente bajo (3b) . Las Figuras 4a y 4b son diagramas esquemáticos de una cámara cerrada de cultivo celular convertida de una configuración de volumen relativamente alto (4a) a una configuración de volumen relativamente bajo (4b) mediante la eliminación de pernos distribuidos substancialmente no comprimibles de un largo fijo mientras se aplica a una tensión mínima al sello que utiliza los resortes. La Figura 5 es un esquemático de un proceso para tensar películas en un respaldo basado en las diferencias en el coeficiente de _la expansión térmica entre la película y el respaldo . Las Figuras 6a y 6b son diagramas esquemáticos de una modalidad de una cámara cerrada de cultivo celular que incluye una membrana permeable a líquidos que separa un compartimiento de perfusión de un compartimiento celular en el cual un compartimiento celular (6a) de volumen relativamente alto se convierte en un compartimiento celular (6b) de volumen relati amente bajo. Las Figuras 7a y 7b son diagramas esquemáticos de dos modalidades del uso de una pluralidad de cámaras cerradas sembradas con células con volumen ajustable como parte de un sistema de ayuda a órganos en el cual un paciente con falla de órganos se trata con las células en la cámara. La Figura 7a es un diagrama esquemático de un sistema en el cual la tasa de flujo mediante las cámaras es independiente de la tasa de flujo de sangre o plasma desde y hacia el paciente. La Figura 7b es un diagrama esquemático de un sistema en el cliarla tasa de flujo mediante la cámara depende de la tasa de flujo de la sangre o plasma desde y ha ía el paciente. La Figura 8 es un diagrama esquemático de un marco con una pluralidad de orificios, al cual se une una película impermeable a líquidos, permeable al gas en la parte que se encuentra orientada al interior de la cámara cerrada de cultivo celular. Las Figuras 9a, 9b, y 9c son diagramas esquemáticos de vistas perspectivas de una cámara cerrada de cultivo celular en la cual se ajusta el volumen por el intercambio de cuñas substancialmente no comprimibles. La Figura 9a es un diagrama esquemático de las partes no ensambladas de la cámara (vistas de arriba hacia abajo) que muestra sus componentes, la Figura 9b es un diagrama esquemático de la cámara ensamblada (vista de arriba hacia abajo), y la Figura 9c es un diagrama esquemático de la cámara ensamblada (vista de arriba hacia abajo) . La Figura 10 es un diagrama esquemático de un sistema cerrado para sembrar una cámara cerrada con células por perfusión a partir de un depósito . La Figura 11 es un diagrama esquemático de una modalidad del sistema extracorporal para rsal i zar interfases una pluralidad de cámaras cerradas sembradas con células con un volumen ajustable con un paciente con fallas de órganos. Las Figuras 12a, 12b, y 12c son diagramas esquemáticos de vistas perspectivas de una cámara cerrada de cultivo celular en la cual se ajusta el volumen por la eliminación de pernos distribuidos y substancialmente no comprimibles de largo fijo mientras se aplica una tensión mínima al sello utilizando resortes. La Figura 12a es un diagrama esquemático de las partes de la cámara no ensamblada que muestra sus componentes, la Figura 12b es un diagrama esquemático de la cámara ensamblada en su configuración con un volumen expandido para sembrar células, y la Figura 12c es un diagrama esquemático de la cámara ensamblada en su configuración con un volumen reducido para perfusión.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La nueva cámara para cultivo celular permite el cultivo de números relativamente grandes y altas densidades de células adherentes (por ejemplo, hepatocitos) en superficies -sjih-SjLan i lmente rígidas en cámaras en las cuales el volumen de la cámara puede ajustarse sin comprometer el sello o esterilidad del aparato y la geometría de la cámara puede controlarse con precisión a fin de ajustar el volumen de la cámara y las tensiones hidrodinámicas por cizallamiento a las cuales se someten las células. Consecuentemente, la invención permite: (1) que la cámara se siembre con células y se cultiven estas células en un volumen relativamente grande de medio, y después ( 2 ) que las células se perfusionen en la misma cámara pero con el volumen de retención de la cámara reducido. La cámara es fácil de manejar y operar, dado que permite cargar las células por perfusión como un sistema cerrado y cambia en volumen por ajustes sencillos de los ajustadores con desatornilladores y el intercambio de topes subs tancialment e no comprimibles. La cámara también es escalable y modular, se proporciona para el cultivo de células en un soporte tenso impermeable a líquidos, permeable al gas, en el cual se reducen las limitantes de transporte al separar el flujo de medio de perfusión (para el suministro de nutrientes y toxinas solubles e/o inductores, y la eliminación de residuos y derivados metabólicos) a partir de la oxigenación, y facilita la incorporación en circuitos de flujo para el tratamiento de pacientes en las fallas hepáticas. Las Figuras la y Ib muestran una modalidad de la nueva cámara 10 que incluye un compartimiento 20 definido por una pared superior 30 y una pared inferior 330 con paredes laterales formadas por una junta de estanqueidad 50 comprimible que crea un sello hermético contra líquidos entre las paredes superior e inferior y aisla el compartimiento del ambiente externo. El sello formado por la junta de estanqueidad se mantiene en su lugar por un conjunto de sujetadores 70 con receptáculos 80 correspondientes, de manera tal que el líquido mantenido al interior del compartimiento es incapaz de filtrarse fuera del compartimiento y los contaminantes (por ejemplo, bacterias y micoplasma) en el ambiente externo son incapaces de penetrar mediante el sello y hacia el compartimiento. El contenido del compartimiento son las células 130, substancialmente cultivadas en la pared inferior y en contacto con un liquido biológico 15, tal como un medio para el cultivo celular, sangre, plasma, o una solución salina balanceada, que rellena completamente el compartimiento y proporciona soporte acuoso para las células . La pared superior 30 se encuentra compuesta típicamente de un material compatible con células, impermeable a los líquidos tal como aluminio anodizado, acero inoxidable, otras aleaciones metálicas, o plástico substancialmente no comprimible (por ejemplo, policarbonato, pol i e s t i reno , y Teflón®) y sus compuestos. Estos materiales pueden utilizarse para otros componentes de dispositivo incluyendo ajustes y múltiples. La pared inferior se encuentra compuesta de un material substancialmente rígido y plano o compuesto con una superficie 320 que se encuentra orientado hacia el interior del compartimiento 20 que mejora, soporta, o de otra manera no interfiere con la unión y cultivo de las células 130. Típicamente es deseable hacer el grosor de las paredes superior e inferior tan pequeño como sea posible sin prohibir de otra manera la fahrirar.ión de estas partes , la rigi de z de la cámara ensamblada, y la operabilidad de la cámara para cultivo celular a fin de reducir el peso general de la cámara y facilitar su manejo. Por estas razones el aluminio anodizado es útil como un material de construcción debido a su peso relativamente ligero por su resistencia, su facilidad de maquinado, y su biocompatibilidad para cultivo celular. En una modalidad la cámara 10 existe en una de dos o - más configuraciones, distinguiéndose cada configuración por un volumen único del compartimiento de la cámara establecido por la altura entre la pared superior 30 y la pared inferior 330. La Figura la representa gráficamente la cámara de un compartimiento en su configuración de volumen relativamente alto, definida en lo sucesivo configuración de "siembra", con un compartimiento relativamente grande para retener las células 20. La Figura Ib representa gráficamente la cámara en su configuración de volumen relativamente bajo, definida en lo sucesivo configuración de "perfusión", con un compartimiento más pequeño para retener células, s_e permi t e n las configuraciones adicionales con diferentes volúmenes. La alineación paralela substancial entre las paredes superior e inferior permanece idéntica entre la configuración de siembra y la configuración de perfusión (asi como también cualesquier configuraciones adicionales) , con la geometría del compartimiento que cambia entre las configuraciones solamente por la distancia entre las paredes superior e inferior. La cámara se convierte entre las configuraciones de volumen diferente al cambiar la carga aplicada y la compresión en la junta 3?G~ estanqueidad 50. La configuración de siembra de volumen más grande de la Figura la requiere que la junta de estanqueidad forme un sello hermético contra líquidos y estéril entre el compartimiento 20 y el ambiente externo en un nivel relativamente bajo de carga y compresión aplicadas; la configuración de perfusión de volumen más bajo de la Figura Ib requiere que la junta de estanqueidad forme también un sello hermético contra líquidos y estéril entre el cp_mp_ar_timiento 20 y el ambiente externo a un mayor nivel de carga aplicada y compresión. La -ca-r-g-a a i i aHa se mide t ipicamente y s e denota como a, tensión, con unidades de fuerza por unidad de área. La compresión se mide típicamente y denota como e, deformación, con unidades sin dimensiones. La junta de estanqueidad 50 se encuentra compuesta de uno o más materiales que tienen compatibilidad mecánica con las cargas aplicadas que deben soportarse y con los volúmenes para cada configuración. Las cargas aplicadas para cada configuración deben ser lo suficientemente grande de manera que se comprima la junta de estanqueidad para formar un sello que resista la presión ejercida por el líquido biológico 15 dentro del compartimiento 20 para esa configuración. Para la configuración estática esta presión se determina por la cabeza de gravedad formada por el líquido biológico dentro del compartimiento. Para las configuraciones perfusionadas o configuraciones que involucran la perfusión, esta presión se determina por una combinación de la cabeza de gravedad y la caída de presión asociada con el __fi ;io_ del líquido biológico. Las cargas - 4 O -aplicadas mínima y máxima corresponden a las cargas aplicadas para las configuraci ones con los volúmenes más grande y más pequeño, respectivamente. Los volúmenes para cada configuración son el producto de las áreas planas expuestas al compartimiento por la pared superior 30 y la pared inferior 330 y la altura del compartimiento en esa configuración respectiva . La Figura 2 representa gráficamente una curva de diseño para las propiedades mecánicas deseadas en una junta de estanqueidad 50 para la nueva cámara 10. Como con cualquier material de formación de sellos, la junta de estanqueidad debe ser comprimible y no contener pasos que permitan la canalización de fluidos de un lado del sello al otro. En particular, el material debe soportar la carga aplicada necesaria para cada nivel de compresión correspondiente a una configuración para la cámara. Este requisito significa que es deseable que la junta de estanqueidad debe ser relati amente dúctil, de manera tal que la tasa de cambio en la carga aplicada necesaria para convertir entre las configuraciones y el cambio en el nivel de compresión entre estas configuraciones es relativamente pequeño. Entre más pequeña sea esta tasa, más ancho será el rango de volúmenes que pueden alojarse en el compartimiento 20 de la cámara. La junta de estanqueidad 50 debe ser también rígida en un rango de cargas aplicadas y compresiones sin "fallas mecánicas". Falla mecánica significa que el material para la junta de estanqueidad se resquebraja o de otra manera pierde su integridad estructural, de manera tal que no puede soportar ya la carga aplicada y ya no puede formar un sello estéril y hermético contra líquidos. La falla mecánica típicamente se encuentra asociada con el incremento relativamente grande e ilimitado en la carga aplicada requerida a medida que se incrementa el nivel de compresión significativamente más allá del alto nivel de compresión mostrado en la Figura 2. La reversibilidad, al ser capaz de alternar repetidamente entre los estados de carga aplicada baja y compresión y los estados de carga aplicada alta y compresión, es deseable para las juntas de estanqueidad pero no se requiere.

Es posible que un material que no sea un compuesto sea adecuado para su us o como la junta de estanqueidad 50 para la nueva cámara 10. Sin embargo, los materiales adecuados para su uso como la junta de estanqueidad 50 para la nueva cámara más típicamente se encuentran compuestos de dos o más materiales en los cuales un componente sea relati amente rígido y el otro componente sea relativamente dúctil. Los materiales específicos que cumplen los requisitos mecánicos para la junta de estanqueidad delineada con anterioridad incluyen esponjas de espuma cerrada, tales como la silicona, neopreno, silicona reforzada, y materiales de caucho de f luorosilicona distribuidos por Greene Rubber Company, Inc. (Woburn, MA) , espumas de poliuretano de poro cerrado, y juntas de estanqueidad "energizadas" reversiblemente . La Figura 3 ilustra una modalidad de una junta de estanqueidad energizada como un tubo cerrado inflable 170. La Figura 3a muestra una cámara en su configuración de siembra en la cual un gas en el tubo 170 de junta de estanqueidad se presuriza para inflar el tubo, de manera tal que el tubo de junta de P R f a n g i i i d a d se llena relat ivamente con ga s , es rígido, y forma un sello hermético contra líquidos y estéril entre la pared superior 30 y la pared inferior 330. El volumen y presuri zación del gas en el tubo se controla con un regulador. Al ajustar este regulador para mantener la presurización del gas dentro del tubo mientras se cambia el volumen de gas dentro del tubo, puede cambiarse la distancia entre las paredes superior e inferior mientras se mantiene el sello. Por ejemplo, al disminuir el volumen de gas dentro del tubo de esta manera, la cámara en configuración de siembra representada gráficamente en la Figura 3a pueden convertirse en la cámara en configuración de perfusión, con el compartimiento 20 con un volumen más pequeño, como se representa gráficamente en la Figura 3b. Es útil proporcionar una ranura para retener la junta de estanqueidad a diferentes niveles de compresión sin comprometer el sello hermético contra líquidos y estéril formado por la junta de estanqueidad entre el compartimiento 20 y el ambiente externo así como también para alinear la junta de estanqueidad para el ensamble y la operación apropiada. La Figura 1 imips ra_¾ue_la junta de estanqueidad 50 y la Figura 3 muestra que la junta de estanqueidad 170 se encuentra asentada en una ranura 310 formada en la pared superior 30. También es posible que se forme una ranura para la junta de estanqueidad en la pared inferior 330 o en ambas paredes superior e inferior. La profundidad de la ranura debe seleccionarse para ser menos profunda que la altura de la junta de estanqueidad en su estado no comprimido y para proporcionar niveles deseados de compresión en cargas aplicadas correspondientes a fin de soportar dos o más niveles de compresión y, consecuentemente, configuraciones de volumen. El ancho de la ranura debe ser mayor que o igual al ancho de la junta de estanqueidad y proporcionar suficiente volumen para la junta de estanqueidad después del nivel más grande de compresión de la junta de estanqueidad, donde la suficiencia para este volumen se encuentra en función de la tasa de Poisson para la junta de estanqueidad. En particular, la ranura no debe ser demasiado ancha para permitir la desalineación de la junta de estanqueidad dentro de la ranura o para permitir que la junta de manera que los niveles de compresión deseados para las diferentes configuraciones de volumen no pueden alcanzarse confiablemente. En otra modalidad se trata la superficie de la junta de estanqueidad, de manera tal que la junta de estanqueidad se humedece mejor o se adhiere a la ranura 310, la pared superior 30, la pared inferior 330, o una combinación de las mismas. Este tratamiento puede ser químico, físico, o una combinación de químico y físico. El tratamiento incrementa la robustez del sello mientras se mejora también la retención y alineación. El volumen del compartimiento 20 no tiene límite superior inherente, al seleccionar diferentes combinaciones de grosor de la pared superior 30 o la pared inferior 330 con grosor y tipo de junta de estanqueidad 50, puede alcanzarse cualquier nivel mínimo de compresión concebible para una mínima carga aplicada deseada. Los diferentes niveles de compresión para las diferentes configuraciones de volumen se determinan por la distancia entre las paredes superior e inferior y se mantiene por un r-An-jimi-o ríe nno o más topes substancialmente no comprimible s . En una modalidad, representada gráficamente en la Figura 1, una o más cuñas 60 y 160 substancialmente no comprimibles actúan como los topes para ajustar el nivel de compresión, carga aplicada, y volumen para cada configuración de volumen diferente. En esta modalidad se eliminan las cuñas de diferente grosor de la periferia de los sujetadores 70, insertados alrededor de la periferia de los sujetadores, o intercambiarse con otras cuñas a fin de convertir de configuraciones de volumen relativamente alto a configuraciones de volumen relativamente bajo y viceversa. El grosor de la cuña determina el nivel de compresión y la altura del compartimiento de la cámara. En particular, la Figura la representa gráficamente la configuración de siembra con una cuña 60 relativamente gruesa, definida como la cuña de siembra exterior, utilizada para ajustar el espaciamiento entre la pared superior 30 y la pared inferior 330 para el compartimiento 20. La Figura Ib representa gráficamente la configuración de perfusión con un cuña 160 perfusión exterior, utilizada para ajustar el espaciamiento entre las paredes superior e inferior para el compartimiento. Preferentemente, se determina el espaciamiento entre la pared superior e inferior para cada configuración, al menos parcialmente, por un conjunto de cuatro o más cuñas, cada una de un grosor idéntico, yaciendo fuera de los sujetadores, de manera tal que la cuñas pueden instalarse y eliminarse o intercambiarse de los costados de las cámaras sin torcerse o de otra manera dañando las cuñas individuales. Además, las cuñas preferentemente tienen dimensiones en el plano de la cámara que se extienden fuera de los bordes de la pared superior 30 y la pared inferior 330, de manera tal que cada cuña tiene una lengüeta que le permite a la cuña asirse o tirarse de la cámara para facilitar la eliminación de la cuña tras la conversión de la configuración. Alternativamente, para una o más configuraciones el espaciamiento entre las paredes superior e inferior se determina por una sola pieza de material substancialmente no comprimible que actúa como una cuña, en la cual esta cuña pretende o (1) instalarse durante el ensamble y no eliminarse durante las operaciones excepto tras la conclusión del uso de la cámara y limpieza o (2) cambiarse irreversiblemente (por ejemplo, cortando o de otra manera dividiéndose en una pluralidad de partes) durante la eliminación o intercambio en el proceso de convertir de una configuración a una segunda configuración con un volumen diferente. En otra modalidad, representada gráficamente en la Figura 4, los pernos 220 substancialmente no comprimibles con largos definidos actúan como los topes para ajusfar el nivel de compresión, carga aplicada, y volumen para una configuración de volumen especifico. En esta modalidad estos pernos se aprietan completamente para ajusfar la altura del compartimiento 20 para la configuración de siembra de la Figura 4a y se aflojan para la configuración de perfusión de la Figura 4b, de manera tal que en esta última configuración estos pernos no tocan la pared inferior 330 y el espaciamiento entre la pared superior 30 y la pared inferior se ajusta por una cuña 180, definida como la "cuña interior", que yace dent o del compartimiento 20 y se encuentra limitada por la junta de estanqueidad 50. La cuña interior se encuentra presente en la configuración de siembra pero no toca ni las paredes superior ni la inferior simultáneamente en puntos en las caras opuestas de la cuña, de manera tal que no ajusta el espaciamiento entre las paredes superior e inferior en la configuración de siembra. También es posible que los pernos substancialmente no comprimibles se extienden a través de la pared inferior y toquen la cara de la pared superior en el compartimiento 20 de siembra, de manera tal que estos pernos sobresalen de la cara externa de la pared inferior después de aflojarse. Las combinaciones de pernos que pasan por la pared superior y los pernos que pasan por la pared inferior también son anticipados . Los materiales específicos adecuados para cuñas exteriores e interiores substancialmente no comprimibles incluyen termoplásticos (por ejemplo, policarbonato) , metales (por ejemplo, aluminio y acero inoxidable), y compuestos de materiales rígidos.

No existe un limite inferior para el grosor las cuñas. aunque en la práctica se dése a grosor mayor a 0.001" (0.025 mi) . De manera similar, los materiales específicos para los pernos 220 substancialmente no comprimibles incluyen termoplásticos , metale.s, y compuestos de materiales rígidos. El largo del perno se determina por su fabricación. En el diseño de la nueva cámara 10 es deseable minimizar la inclinación de la pared superior 30 y la pared inferior 330 tras el apriete de los sujetadores 70. La inclinación puede resultar si se aplica un momento de torsión neto a una o ambas paredes debido a que la junta de estanqueidad 50 actúa como un fulcro para la carga aplicada suministrada por los sujetadores para el sellado. Este momento de torsión crea un momento que incrementa típicamente el volumen del compartimiento 20 debido a que los sujetadores se encuentran ubicados fuera de la junta de estanqueidad. En general, la inclinación es indeseable debido a que es difícil de ajusfar de manera reproducible , da como resultado variaciones en el espaciamiento entre paredes y, consecuentemente, el espaciamiento entre las paredes superior e inferior del compartimiento dentro de una cámara individual, y da como resultado variaciones en el volumen de retención para una determinada configuración entre diferentes cámaras construidas idénticamente. La inclinación puede reducirse al ubicar col inea lmente los sujetadores que suministran la carga aplicada y los topes substancialment e no comprimibles que ajustan el espacio entre las paredes superior e inferior. Por ejemplo, en una modalidad se minimiza la inclinación utilizando cuñas substancialmente no comprimibles con dedos que se entrelazan entre los sujetadores. Estos dedos actúan para balancear el momento de torsión creado por tener los sujetadores fuera de la junta de estanqueidad 50. Alternativamente, como se ilustra en la modalidad representada gráficamente en la Figura 4a, la inclinación puede reducirse al ubicar los topes 220 substancialmente no comprimibles en la misma linea central que los sujetadores 70. Las combinaciones de estas dos modalidades también son posibles .

En la modalidad mostrada en la Figura 4 ae n i- i 1 i 3 n l n s r e s o r t e s 00 a r_a mantener una mínima carga aplicada definida en la junta de estanqueidad 50 durante todas las operaciones, incluyendo la conversión entre diferentes configuraciones de volumen. En esta modalidad los sujetadores 70 se retienen por receptáculos 80, retenido cada resorte por un par de arandelas 190 alrededor de cada sujetador. Las Figuras 4a y 4b muestran los resortes que yacen sobre la pared superior 30; alternativamente, los resortes pueden yacer debajo de la pared inferior 330. Esta modalidad tiene la ventaja que la aplicación continua de una carga aplicada diferente a cero garantiza la preservación del sello hermético contra líquidos y, consecuentemente, la esterilidad para el compartimiento 20. Los resortes 200 tienen propiedades mecánicas de manera tal que, en cada nivel de compresión, los resortes proporcionan una carga aplicada suficiente o mayor a lo suficiente para suministran una carga aplicada relativamente alta, posiblemente mayor a la mínima carga aplicada para esta configuración. Sin embargo, en la configuración de perfusión representada en la Figura 4b, los resortes suministran una carga aplicada relativamente menor que no obstante es igual o mayor que la carga aplicada requerida para esta configuración. Los resortes 200 pueoVen elaborarse a partir de cualquier material que no experimente deformación plástica sobre el rango de cargas aplicadas necesarias para las diferentes configuraciones de volumen y los niveles correspondientes de compresión. Los materiales que son adecuados para el resorte incluyen acero inoxidable y otros materiales. La propiedad más crítica para el resorte es su módulo elástico o constante Hookeana, la cual debe seleccionarse con respecto a las cargas aplicadas y el largo de los sujetadores 70. Para las modalidades que no contienen resortes a fin de suministrar una mínima carga aplicada, cambiar la carga aplicada y el nivel de compresión para convertir entre cOTrfirg«-ac i one-s—s-e—LXeva a calió al aflojar los sujetadores 70 en las Figuras 1 y 3 para reducir del compartimiento de la cámara o apretando estos sujetadores adicionalmente para incrementar el nivel de compresión y disminuir el volumen. Alternativamente, para la modalidad con resortes de la Figura 4, aflojar los pernos 220 de su configuración apretada de la Figura 4a a su configuración menos apretada de la Figura 4b da como resultado la conversión de la cámara 10 de su configuración de siembra de volumen relativamente alto a su configuración de perfusión de volumen relativamente bajo. Para esta última modalidad se utilizan los sujetadores - a fin de ajusfar la compresión inicial en los resortes y no ajustaría subsecuentemente. El número de sujetadores 70 requerido se determina por el ancho y grosor de la junta de estanqueidad 50, las propiedades mecánicas de la pared superior 30 y la pared inferior 330, y las cargas aplicadas requeridas para sellar esta junta de estanqueidad sin inducir la inclinación en las paredes superior e inferior. Para f-a-d-jr dad—d —ma-n-e-©— —o-p^a-cl-ón—ej cleseahl e qn_e estos sujetadores se asienten en los recept^á-ci-l s 8-0 de man ra tal que entre menos vueltas se requieren para apretar y aflojar cada sujetador que con los tornillos de máquina convencionales. La carga aplicada deseada para una configuración de volumen particular determina el grado a cual deben apretarse o aflojarse los sujetadores para cualquier configuración específica. Los sujetadores para la nueva cámara 10 son relativamente no intrusivos, muy fáciles de operar, improbables de fallar, y baratos para obtenerse y operarse. Las modalidades específicas para los sujetadores 70 y los receptáculos 80 para la nueva cámara 10 representada gráficamente en la Figura 1 incluyen sujetadores cautivos y de cuarto de vuelta de Southco® ( Concordville , PA) , Rexnord Specialty Fastener División (Hasbrouck Heights, NJ) , y Dzus Fastener Co. , Inc. (West Islip, NY) y otras formas de seguros que permiten una rápida aplicación y liberación de la compresión entre las partes . El uso de pernos para alineación, compuestos de un material tal como aluminio anodizado o acero i nox i d-a-b^e-, que s-o-a integrales a La p ed superior 30 o pared inferior 330 pueden fácil i- -^E La al inpa i ón rie__asj a_s paredes con sujetadores y receptáculos durante el ensamble de la cámara. Las células 130 en la nueva cámara 10 pueden unirse en cualquier superficie al interior del compartimiento 20, pero se prefiere que la masa celular se cultive substancialmente sobre la superficie 320 de la pared inferior 330 que se encuentra orientada al compartimiento y que esta superficie sirva como un soporte para cultivo celular. Los materiales que tienen las siguientes características proporcionan superficies adecuadas para su uso en la nueva cámara: relati amente no citotóxicas a células en al menos el lado que se encuentra orientado al compartimiento (de manera tal que la unión y función de las células no sea limitado por el material o que el material pueda tratarse en la superficie en este lado de manera tal que a unión y función de las células no sean limitados por este lado del material tratado en superficie) y que sea relativamente no degradante en presencia del líquido biológico 15-¡ L-o-s mat£-rJ_-al s qu e t ienen.. e s t a s características pueden obtenerse fácilmente comorcialmente—o—p-X-ap-a rarsñ n i 1 i 7. ndo técnicas convencionales . Como se describe en La Publicación de Solicitud PCT Internacional No. O 00/78932, cuya descripción se incorpora en la presente para referencia, el tratamiento de superficie para mejorar la adhesión celular y la función celular deseadas pueden ser tratamiento químico, tal como por recubrimiento no específico con colágeno y/u otras moléculas y/o por la unión covalente de moléculas específicas que favorecen el cultivo celular, por tratamiento físico tal como descarga de corona en presencia de un gas que soporte oxigene (por ejemplo, aire) o por cualquier combinación de los mi smo s . Para muchas aplicaciones en cultivo celular, el control de oxigenación de las células y su medio de soporte es benéfico para regular la función celular. En el cultivo de algunos tipos de células, la oxigenación es por el medio para cultivo celular. Sin embargo, otros tipos de células, tales como hepatocitos, tienen demandas de oxígeno que son hepatocitos viables puede depender también de la tensión de o-xd-g-eno presentada a las células.

Por ejemplo, incrementar la concentración de oxigeno desde ambiental (19%) hasta 40% incrementa la ureagénesis en casi 50%. Otra consideración la cual intensifica la necesidad de oxigenación en un cultivo celular o dispositivo de ayuda a órganos es lo necesario para incorporar números relativamente grandes y altas densidades de células en el dispositivo mientras limita el volumen de liquido biológico. En una modalidad las células 130 se cultivan en un soporte 320 plano impermeable a líquidos, permeable al gas mediante el cual las células intercambian gas tal como oxígeno con el ambiente oxigenado {por ejemplo, aire, el cual es oxígeno al 19%) externo a la cámara. Como se describe en la Publicación de Solicitud PCT Internacional No. WO 00/78932, esta modalidad es útil y deseable para muchos tipos de células, incluyendo hepatocitos para su uso en un LAD. Tal soporte de cultivo celular debe ser impermeable contra líquidos bajo presiones encontradas en operación pero permeable al »*± efiQ—e-R—el —e-a-n-g-o—de-S-de—aproximidameiitfi CL^JL. ml/m2/día hasta aproximadamente 1000 l/m2/día. G.?? objeto de mantener la rigidez mecánica necesaria para la pared inferior 330 asi como también para permitir la permeabilidad de gases, permitir la esterilización, debe ser resistente a perforaciones, rasgaduras y arrugas, y ser capaz de manejarse durante la fabricación de la cámara, se prefiere que esta pared inferior sea un compuesto de una película delgada 320 permeable al gas e impermeable contra líquidos soportada sobre un soporte o marco 40 más grueso poroso o rígido perforado. En particular, este marco soporta mecánicamente la película y es suficientemente permeable, poroso, o espacialmente distribuido de manera tal que el marco no presenta limitantes significativas adicionales para transportar gas, particularmente para oxígeno, y tiene también las propiedades mecánicas solicitadas, de manera tal que el marco no impacta de otra manera la permeabilidad efectiva de la película. Por ejemplo, el uso de postes impermeables (no se muestran) relativamente espaciados ampliamente para soportar la película satisface estos r-equi sitos . S±n emba rgo , eJ cont ol eci so de volumen para las diferentes configuraciones de volumen requiere también que la película esté tensa y no relajada bajo presiones encontradas en uso . En una modalidad la pared inferior es un ensamble de marco de película formado al tensar una película permeable al gas, impermeable contra líquidos en un marco metálico perforado. La tensión se logra tomando ventaja de las diferencias en los coeficientes de la expansión térmica entre la película y el marco y por viscosidad disminuida y capacidad incrementada para dispersar el adhesivo utilizado para unir la película y el marco. El coeficiente de expansión térmica es la tasa de cambio en el largo de un material por unidad de largo por grado Celsius. Cuando una película tiene un coeficiente de expansión térmica mayor que el del marco, la película se contrae más que el marco tras la disminución de la temperatura. Consecuentemente, aplicar un adhesivo entre la película y el marco calentados a una temperatura elevada y permitir que el adhesivo se asiente a esta temperatura elevada, la película se contrae más que el marco tras la recuperación a una temperatura menor, dando como resultado que la película se tense. El grado de tensión depende de las diferencias relativas en coeficientes para la expansión térmica entre la película y el marco y la diferencia entre las temperaturas ambiental y elevada. Este método requiere también el uso de un adhesivo que sea compatible tanto con la película como el marco y con las temperaturas elevadas. Es bien sabido que la viscosidad de la mayoría de materiales disminuye a medida que se incrementa la temperatura. La Figura 5 muestra que un adhesivo puede asegurar la película 320 al marco 40 al unir estrechamente la película y el marco, de manera tal que la tensión alcanzada por diferencias en los coeficientes de expansión térmica se mantienen después del enfriamiento. Además, es necesaria una línea o capa delgada, uniforme, de adhesivo para evitar abolladuras en la junta donde el adhesivo une la película y el marco; estas abolladuras pueden comprometer el sello formado entre la junta de estanqueidad 50 y el ensamble 330 marco-película así como también producir irregularidades en el espaciamiento entre la pared superior 30 y el ensamble marco-película. Tales no uniformidades podrían contribuir a un flujo no uniforme en la cámara en configuraciones de perfusión representadas gráficamente en las Figuras Ib, 3b, y 4b. Consecuentemente, el adhesivo se aplica preferentemente por jeringa con una punta inclinada 309, u otro de tales dispositivos que envíen el adhesivo como un recubrimiento delgado que minimice el espaciamiento entre el marco y la película. Además, el adhesivo se aplica a un marco que se ha calentado, de manera tal que el calor disponible en el marco calienta el adhesivo e incrementa la capacidad del adhesivo para dispersar como un recubrimiento delgado. También son posibles métodos alternativos para aplicar el adhesivo, incluyendo (1) rociar el adhesivo sobre la película, marco perforado, o ambos y (2) utilizar una cinta adhesiva aplicada a las partes. La Figura 5 representa gráficamente el proceso para tensar una película 320 a un marco 40 a fin de formar un ensamble 330 marco-película con una película tensa. El primer marco se calienta a una temperatura superior a la temperatura ambiental de típicamente 18-22°C y encima de la temperatura de 37°C a la cual se utilizará la temperatura como un soporte para el cultivo celular en una cámara, se aplica una linea delgada de adhesivo 325 al distribuir desde una jeringa con una punta inclinada 309 sobre la superficie del marco para estar en contacto con la película, yaciendo la película sobre el marco de tal manera que el costado de la película que va a estar orientado lejos de las células 130 en el compartimiento de la cámara se encuentra en contacto con el adhesivo y el marco, y el nuevo ensamble película-marco se transfiere de regreso a un horno o incubadora 290 mantenido a una temperatura superior a la temperatura a utilizarse para el cultivo celular durante un periodo de tiempo suficiente para ajustar el adhesivo. La temperatura elevada para el tratamiento de la película adherida en el marco puede ser el mismo que la temperatura utilizada para calentar el marco antes de la aplicación del adhesivo o, preferentemente, una temperatura superior para mejorar la dispersión del adhesivo, una unión más rápida del adhesivo a la película y el marco, y/o una tensión incrementada de la película debido al coeficiente diferencial de expansión térmica con respecto al marco. Después, tras la eliminación del ensamble marco-película del horno o incubadora, se contrae la película hasta lograr una rigidez . Los materiales para las películas que tienen las características necesarias para este método y consistencia con otras características descritas con anterioridad pueden obtenerse fácilmente de manera comercial o prepararse utilizando técnicas convencionales. En una modalidad la película es poliestireno no poroso, en forma de una lámina de Polyflex®, película de 0.002" (0.05 mi) de grosor de poliestireno fabricada por Plástic Suppliers, Inc. (Columbus, OH) . Para esta modalidad, con un marco 40 compuesto de aluminio anodizado, el adhesivo 325 es preferentemente una resina epóxica, e incluso más preferentemente una resina epóxica de grado médico, tal como la resina epóxica de grado médico EP21LV de Master Bond, Inc. (Hackensack, NJ) , la temperatura para calentar el marco es de 40°C, y la temperatura para tratamiento del ensamble marco-película 330 es de 45°C. En la nueva cámara el líquido biológico en el compartimiento de la cámara suministra a las células de nutrientes básicos para el cultivo celular y se lleva los metabolitos. El liquido biológico suministra también a las células de toxinas, moléculas aminadas, y otros productos residuales biológicos a met abol i za r s e y se lleva los productos de s t ox i f i ca do s , factores segregados, y proteínas. Para el cultivo irj vitro de células este líquido biológico es preferentemente un medio diseñado para el cultivo celular. Para el tratamiento ex vivo por las células este líquido biológico es preferentemente plasma, sangre, o un componente de los mismos . Los líquidos biológicos preferentemente se suministran a y se eliminan del compartimiento en la nueva cámara mediante dos aberturas, una que sirve como entrada para suministrar al compartimiento y otra abertura que sirve como salida para descargar o drenar el compartimiento. Más preferentemente, existen dos tipos de estos pares de aberturas, como se muestra en las Figuras 1, 3, y 4: un primer tipo de abertura 110 y 120 utilizada para sembrar células 130 provenientes de una suspensión en la configuración de siembra de volumen r e 1 a t ivameTTTe—a-i-t-?—£^5j^e_s_ejita_da gráficamente en las Figuras la, 3a, y 4a, y un segundo tipo de abertura 90 y 100 para perfusionar células con 5 líquidos biológicos en la configuración de perfusión de volumen relativamente bajo representada gráficamente en las Figuras Ib, 3b, y 4b. Las aberturas se comunican entre el interior y el exterior del compartimiento por un 10 puerto o múltiple. Los puertos pueden conectarse con cavidades de otras cámaras en paralelo, en serie, o ambas para crear un cJ_ icjuit. o o lazo de flujo para la siembra de células, la perfusión de un líquido bioTogTc^, cr 15 enjuagar o aspirar el contenido del compartimiento. La adición de otros puertos puede servir como ventilaciones para el desplazamiento de aire durante el llenado o como un medio de drenaje para drenar el 20 compartimiento cuando los demás puertos se encuentran unidos a aquellos de otra cámara. Las aberturas para suministro y eliminación de líquidos biológicos se distribuyen preferentemente a fin de suministrar "75""""QWi'í'&r-ffiemea.te--la __ nueva cámara con los líquidos biológicos. Es preferible que las células se en líquidos biológicos de tal manera que las células se distribuyan uniformemente mediante la cámara y se unan como un cultivo uniforme sobre el soporte de cultivo. Para las cámaras relativamente grandes permitidas por esta invención, tal carga uniforme se facilita preferentemente al tener uno o más puertos para introducir la suspensión de células ubicadas hacia un extremo o costado de la cámara y otro conjunto de uno o más puertos para ventilar el aire desplazado del compartimiento tras la ubicadas en el extremo o costado opuesto de la cámara proveniente del primer conjunto de puertos. La ventilación de aire se facilita al inclinar la cámara de manera que los puertos para ventilación se encuentran encima del plano horizontal de los puertos para introducir la suspensión . Las aberturas para suministro y drenaje de líquidos biológicos para perfusión se distribuyen también preferentemente de manera que el ji_luj_o__ de líquido al interior del ompartimiento de la cámara es uniforme. un i f o rmídrarúr £±jn_e____ como la tensxon hidrodinámica por ci zallamiento en cualquier posición horizontal es substa cialmente constante y el flujo no se mueve substancialmente más lento o más rápido en cualquier sección del cuerpo principal del compartimiento. Los estudios con hepatocitos demuestran que la ureagénesis es independiente de las tensiones hidrodinámicas por ci z a 11 ami en to hasta al menos 2 dinas/cm2. Para crear un flujo uniforme de un JJ^qj-U^do biológico de perfusión (también definido pluralidad de aberturas para introducir el liquido biológico a pe r f u s i ona r s e en el compartimiento para la cámara en la configuración de perfusión de la cámara y que se utilice una pluralidad de aberturas para eliminar el perfusato biológico del compartimiento. Más preferentemente, las aberturas para introducir el perfusato al compartimiento se encuentran a manera de múltiple, de manera tal que, a partir de una -s-o-la—en-tra_da común, un múltiple distribuye el perfusato uniformemente a puertos individuales pa a Ta --(^-e^ J aL¿ ___ uniforme en el compartimiento. De manera similar, es preferible que las aberturas para eliminar el 5 perfusato del compartimiento sean múltiples, de manera tal que un múltiple separado (distinto al múltiple de la entrada) recoja el perfusato uniformemente de un segundo conjunto de puertos individuales (distintos a los del primer 10 conjunto de puertos para la entrada) para la eliminación de la cámara mediante una sola salida común. Otro método para alcanzar un flujo uniforme de un perfusato dentro cTsir- 15 compartimiento de la cámara es crear una delgada hendidura entre el múltiple de entrada y el compartimiento y una delgada hendidura similar entre el compartimiento y el múltiple de salida. El largo de la hendidura es preferentemente el 20 largo del compartimiento, y el ancho de la hendidura preferentemente es substancialmente más pequeño que el diámetro del múltiple. La creación de un flujo uniforme de un liquido biológico de perfusión dentro de la "25—c-áffi-a-ta r¿ue_de visualizarse y evaluarse al introducir un tinte de colores o otra manera cTeter arire—— « e-1 ne.llus ato y servando la distribución de tinte dentro del compartimiento. Un método alternativo para evaluar el flujo de perfusato mediante la cámara se basa en medir la caída de presión en la cámara (es decir, la diferencia en presión entre la entrada para perfusión a la cámara y la salida para perfusión a la cámara) . Las caídas de presión medidas pueden compararse con las caídas de presión pronosticadas por modelos de mecánica de fluidos (por ejemplo, como se describe en Denn, Proce s s Fluid Mechanics, Prentice-Hall , Inc. , Englewood Cliffs, NJ, 1980) como un medio para clarificar- 15 si los patrones de flujo son ideales o cuánto difieren estos patrones del ideal. En particular, preferentemente el flujo en los múltiples y compartimientos es laminar, de manera tal que el flujo se encuentra bien 20 caracterizado y tiene un número de Reynolds menor a 2000. Con base en tales observaciones y conceptos básicos derivados de la mecánica de fluidos, pueden formularse instrucciones para -2-5—d-i-r-ig±JL_ e_l__ d_i_s e ño de puertos y múltiples. Para una distribución uniforme de perfusato desde el aberturas de entrada en el compartimiento dentro de la cámara en la configuración de la cámara para perfusión y del compartimiento mediante una pluralidad de aberturas de salida en el múltiple de salida, es preferible que el área transversal de los múltiples respectivos sea mayor que o igual a la suma de las áreas transversales de la pluralidad de aberturas cor espondientes. Consecuentemente, cambiar el número y/o diámetro de las aberturas de entrada y/o salida y/o el di-ám tro _de 1 múltiple correspondiente para seguir esta instrucción facilita el suministro uniforme y drenaje de perfusato desde el compartimiento. Alternativamente, el área transversal eficaz para el múltiple de entrada puede reducirse numéricamente al suministrar el perfusato al múltiple de entrada desde dos o más aberturas de entrada a la cámara. Consecuencias similares resultan de acciones correspondientes en el múltiple de salida. Debido a que algunas células tienen propiedades funcionales o de unión las cuales se por el contacto directo con un líquido biológico y son sensibles al c i z a 1 larnTerTEo~,—er¡—a jgAii ^__^ i_ca_cJ:^ne s puede ser deseable colocar una membrana permeable a líquidos entre el líquido biológico en flujo y 5 las células para limitar las interacciones hidrodinámicas. En esta disposición, un compartimiento adicional, un compartimiento celular, se incorpora a la cámara para interactuar con un compartimiento con un líquido 10 biológico de flujo. La Figura 6 muestra una modalidad de una cámara de dos compartimientos para el eulüjía_celular que tiene una pared superior 30 impermeable, una pared inferior 330 que soport 15 la unión y cultivo de células 130, una junta de estanqueidad 50 comprimible que crea un sello hermético contra líquidos entre las paredes superior e inferior, al menos una membrana 240 permeable a líquidos que separa un 20 compartimiento para las células 130 de un compartimiento para perfusión 260, y paredes laterales 250 para el compartimiento 260. El compartimiento para células se define por la pared inferior, la junta de estanqueidad, y la "25" memb~ra-rra -exuLe a_b 1 e a líquidos. El compartimiento para perfusión se define por 1 me"mrJr"arra perm abie a__^¡JLg^uJ1d^s_, las parede laterales 250, y la pared superior. El volumen del compartimiento para perfusión es el producto 5 matemático del área de la membrana permeable a líquidos en contacto tanto con el compartimiento para células como el compartimiento para perfusión y la altura de las paredes laterales. Para minimizar el volumen del compartimiento 10 para perfusión es preferible que las paredes laterales estén compuestas de una cuña relativamente delgada y substancialmente no comprimible . Aunque la Figura 6 r e p re serfta" 15 gráficamente la cámara de dos compartimientos dividida de manera tal que el compartimiento para perfusión 260 se encuentra encima de una o más membranas permeables a líquidos 240, la cámara puede orientarse en cualquier dirección 20 siempre y cuando el compartimiento para células 20 intervenga entre la membrana permeable a líquidos y la pared inferior 330. La Figura 6 representa gráficamente el uso de sujetadores 70 y receptáculos 80 de acoplamiento a fin de -2-5 a-ee-g-u-xar la__jcá_mara ensamblada y suministrar la carga aplicada en la junta de estanqueidad 50. "¾ rr~eTrrtj nrg-o- —l-e-ß—r-^jQ JLe_s__con__ara n de 1 a s también pueden utilizarse con sujetadores y receptáculos para suministrar una mínima carga aplicada constante, como se describe en una modalidad anterior . En una modalidad la cámara 10 existe en una de dos o más configuraciones, distinguiéndose cada configuración por un volumen único del compar imiento para las células 20 establecidas por la altura entre la membrana 240 permeable a líquidos y la pared inferior 330. La Figura 6a representa gráficamente la cámara de dos compartimientos err su configuración de siembra, con un compartimiento de volumen relativamente alto para las células 20. La Figura 6b representa gráficamente la cámara en su configuración de perfusión, con un compartimiento de volumen relativamente bajo para células. Como con la cámara de un compartimiento descrita en una modalidad anterior, también se permiten las configuraciones adicionales con diferentes volúmenes. Sin embargo, para cada volumen del compartimiento para perfusión 260 preferentemente permanece roTTSircr-rrt-e- —a-ue-que e_s__p_ermi s ibl e también cambiar el volumen de este último compartimiento. La planidad substancial entre la pared substancial, 5 la membrana permeable a líquidos, y la pared inferior permanece idéntica entre la configuración de siembra y la configuración de perfusión (así como también cualesquier configuraciones adicionales) , cambiando la 10 geometría del compartimiento para células entre configuraciones solamente por la distancia entre la membrana permeable a líquidos y las paredes inferiores . La cámara de dos compartimientos se 15 convierte entre las diferentes configuraciones de volumen al cambiar la carga aplicada y la compresión en la junta de estanqueidad 50. La configuración de siembra de volumen más grande de la Figura 6a requiere que la junta de 20 estanqueidad forme un sello hermético contra líquidos y estéril entre el compartimiento para células 20 y el ambiente externo a un nivel relativamente bajo de carga aplicada y compresión; la configuración de perfusión de —25--^_cd_um_e_n_ jmájs Joajj o de la Figura 6b requiere que la junta de estanqueidad forme también un sello j-nnt- ^__li_quidos y estéril entre el compartimiento de volumen reducido para células y el ambiente externo a un nivel relativamente alto de carga aplicada y compresión. Los volúmenes para el compa timiento para células se ajustan por topes substancialmente no comprimibles, los cuales pueden ser cuñas y/o pernos como se describe para las modalidades previas expuestas con a terioridad, como se representa gráficamente en las Figuras 1, 3, y 4. La conversión entre configuraciones es como se describe con anterioridad para otras modalidades, con método de conversión dependiente de si las cuñas o pernos se utilizan como topes y si los resortes se utilizan para suministrar una mínima carga aplicada en la junta de estanqueidad. El compartimiento para perfusión 260 contiene un segundo liquido biológico 132, tal como un medio para cultivo celular, una solución salina balanceada, sangre o plasma. El compartimiento para células 20 contiene tanto células 130 substancialmente cultivadas en la _p_a_r_eji__i n_f_e r i o r 330 así como también un líquido biológico 15 que puede ser el mismo o diferente compartimiento para perfusión. Los líquidos biológicos 15 y 132 se encuentran en contacto líquido mediante la intervención de una o más membranas 240 permeables a líquidos. El líquido biológico 15 suministra a las células de nutrientes básicos para el cultivo celular, toxinas, moléculas aminadas, y otros productos residuales biológicos a me t abol i z a r s e y se lleva los metabolitos, productos de s t ox i f i c ado s , factores segregados, y proteínas. Estas moléculas se transportan en la membrana permeable a líquidos a y desde el líquTdo~ bi ológi co 15. El líquido biológico 15 en el compartimiento para células 20 fluye muy lentamente o es estático. El flujo del primer líquido biológico 15 es substancialmente no afectado por el flujo del segundo líquido biológico 132 en el compartimiento para perfusión 260. El segundo líquido biológico 132 preferentemente se suministra inicialmente al compartimiento para células 20 durante el ttena.do__y se encuentra libre para intercambio con el líquido biológico 15 en la membrana 240 ireTwe-atri-e—a—1 -quó-d-a-3^__JDurante la siembra con una suspensión de células el primer líquido biológico 15 preferentemente se suministra a y se elimina del compartimiento para células mediante dos aberturas, sirviendo una abertura 110 como entrada para suministrar el compartimiento y sirviendo otra abertura 120 como salida para descargar o drenar el compartimiento. El líquido biológico 132 preferentemente se suministra al compartimiento para perfusión mediante un segundo conjunto independiente de dos aberturas, sirviendo una abertura 90 como entrada para suministrar un líquido biológico de perfusión y sirviendo una segunda abertura 100 como salida para el líquido biológico de perfusión. Cada abertura se comunica entre el interior y exterior de su compartimiento correspondiente por un puerto o múltiple. Los puertos pueden conectarse con compartimientos correspondientes de otras cámaras en paralelo, en serie, o ambos para crear circuitos o lazos de flujo separados para la siembra de células provenientes de una -SJj-S-P-ans i ón y para la perfusión del segundo líquido biológico 132 o para enjuagar o aspirar "el—CTDTrt-e-rwrde—d-e ca-da-_c_om a r t imi e n t o . La adición de otros puertos puede servir como ventilaciones para el desplazamiento de aire durante el llenado o como un medio para drenar un compartimiento cuando los demás puertos que se comunican con el compartimiento se unen a aquellos de otra cámara. En la modalidad presentada en la Figura 6, las aberturas para suministro y eliminación de líquidos biológicos 15 y 132 se distribuyen a fin de suministrar uniformemente cada compartimiento de la cámara de dos compartimientos con sus líquidos biológicos correspondientes. Para el compartimiento para células 20, las células 130 preferentemente se siembran a partir de una suspensión de manera tal que las células se distribuyen uniformemente en el compartimiento y se unen como un cultivo uniforme en el soporte 330 de cultivo. Para las cámaras relativamente grandes permitidas por esta invención, tal carga uniforme se facilita preferentemente al tener uno o más puertos 110 para introducir la suspensión de células ub.ic.adas hacia un extremo o costado de la cámara y otro conjunto de uno o más puertos 120 para ~veTr±-ÍT=nr—e-i—a-ijüs dje_aplazado del compartimiento 20 tras la introducción de la suspensión de células ubicadas en el extremo o costado opuesto de la cámara desde los puertos 110. La ventilación de aire se facilita al inclinar la cámara de manera que los puertos para ventilación se encuentran encima del plano horizontal de los puertos para introducir la suspensión. En una modalidad las aberturas para suministro y drenaje del perfusato se distribuyen de manera que el flujo de líquido dentro del compartimiento para perfusión es uniforme. Para una cámara de dos compartimientos las tasas de flujo y las tensiones hidrodinámicas por c i z a 11 ami e n t o permitidas en el compartimiento para perfusión se encuentran limitadas por la adaptabilidad mecánica y resistencia de la membrana permeable a líquidos, con tasas de flujo y tensiones de cizallamiento superiores preferibles para el mezclado. Para crear un flujo uniforme del perfusato se utiliza preferenteme te una pj_ai a.lidad_ de_ aberturas para introducir el liquido biológico a perfusionarse en configuración de perfusión y una pluralidad de aberturas utilizadas para eliminar el perfusato del compartimiento. Más preferentemente, las aberturas para introducir el perfusato al compartimiento para perfusión son múltiples, de manera tal que desde una sola entrada común, un múltiple de entrada distribuye el perfusato uniformemente a puertos individuales para la distribución uniforme en el compartimiento para la perfusión. De manera similar, es preferible que las aberturas para eliminar el perfusato del compartimiento para perfusión sean múltiples, cTe~ manera tal que un múltiple de salida separado y distinto recoge el perfusato uniformemente de puertos individuales para la eliminación de la cámara mediante una sola salida común. Las instrucciones para tamaños de puertos, aberturas, y múltiples para esta modalidad son idénticas a las instrucciones descritas con anterioridad para otras modalidades. La cámara se siembra con células funcionales. Preferentemente, la cámara (o el compiaxt imi_ent_o jpara células para una cámara de dos compartimientos) en su volumen relativamente ~gTam±e7 siembra es sembrado con células provenientes de una suspensión de células, actuando la pared inferior como un soporte para cultivo celular. Además, para su uso como un dispositivo de ayuda a órganos las células sembradas funcionan preferentemente juntas para estimular los tipos y niveles de función posibles para las células en un órgano. Las células pueden desarrollarse en la cámara, permanecen estables en número, o se alternan entre los modos de desarrollo y estabilidad numérica. Las células también pueden mantener su fenotipo anterior o cambiar el fenotipo tras el cultivo en la cámara. La cámara puede utilizarse como un sistema de cultivo in vitro y/o como un dispositivo de asistencia a órganos para tratar un paciente en necesidad de asistencia de órganos. Una fuente de células para la cámara es un órgano de mamífero. Cuando este órgano es el hígado, las células que se cultivan para su uso en un LAD comprenden hepatocitos, las células principales del hígado que son capaces de -s-atisf acer_ JLos requisitos funcionales asociados típicamente con el hígado cuando se colocan en uñ aTntri-eirt-e ^ii^i ^^^_esj ru_ct_ur a 1 apropiados.

Otras células presentes en el hígado pueden incluirse también en la cámara que actúa como un LAD , tal como las células endoteliales, células Ito, células Kupfer (células de tipo macrófagos especializadas) , y fibroblastos. Puede ser deseable un co-cultivo de hepatocitos con uno o más de estos tipos de células en un LAD. Para dispositivos que comprenden una pluralidad de cámaras, cada cámara puede sembrarse con el mismo número de células y/o combinaciones de tipos de células de diferentes números y/o comb inaciones . Dada la disponibilidad relativamente limitada de células humanas, pueden utilizarse fuentes no humanas de células en la invención. Pueden utilizarse células provenientes de otros mamíferos que incluyen, pero que no se limitan a, fuentes porcina, bovina, equina, canina, felina, ovina, y murina. Los donadores para células pueden variar en desarrollo y edad, sexo, especie, peso, y tamaño. Las células pueden derivarse a partir de tejidos donadores de_ .ernt ione s, neonatos, o pacientes más viejos incluyendo adultos. Pueden utilizarse células germinales par enquimales o mesenquimales en la invención e inducirse para diferenciar el 5 desarrollo en el tejido deseado. Además, las mezclas de células derivadas de diferentes cepas celulares, mezclas de células normales y modificadas genéticamente, y/o mezclas de células para dos o más especies o fuentes de 10 tejido. Una fuente alternativa de células es cultivando sea células anteriormente obtenidas de un órgano de mamífero o cultivando células que se han cultivado anteriormente de manera taT~ 15 que existen como una línea celular. Las células para su uso en la invención pueden ser normales o diseñadas genéticamente por transfección espontáneo, química, o viral. Las células recombinantes o diseñadas genéticamente pueden 20 crearse para una función de inmortalidad, alogenicidad reducida, o de hepatocito diferenciado. Los procedimientos para diseñar genéticamente células son conocidos generalmente en la materia; y se describen en Sambrook et -25-— _Jolecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor ?G,—t^^ — Las células se siembran a partir de tejido fresco, procesado, derivado de células cultivadas previamente in vitro, descongeladas de tejido c ioconservado , o alguna combinación de las mismas. Antes de la siembra, las células se suspenden en un medio de siembra y la pared inferior que contiene la superficie para el cultivo celular tratado, si se desea, a fin de mejorar la unión y función de células como se describe con anterioridad. El tratamiento de esta superficie puede realizarse antes del ensamble de la cámara o subsecuentemente para el ensamble de la cámara. Cuando se realiza el tratamiento de la superficie subsecuente al ensamble de la cámara, se aplica el tratamiento, si se encuentra en forma de un fluido, mediante las entradas y salidas para sembrar células. Las células se siembran en la cámara (o el compartimiento para células para la cámara de dos compartimientos con membrana permeable a líquidos) en su configuración de siembra al bombear una suspensión de células directamente —aJ dis ositivo sin la exposición directa al ambiente externo. La tasa de flujo para s uuirTdrs-^e^ l-a sjLi_a.pe_iis_i ón de células es lo suficientemente rápida para evitar la sedimentación y otros deterioros de las células 5 dentro del circuito para el suministro aún lo suficientemente lento para evitar substancial daño mecánico a las células o aglomeraciones debido al ci zallamiento hidrodinámico. Esta tasa de flujo depende del tamaño de la tubería, 10 y en la práctica la propiedad crítica para el suministro es la tensión hidrodinámica por cizallamiento en las paredes de la tubería para suministro. Preferentemente, la tensión por cizallamiento a la cual se encuentran expuestas 15 las paredes del sistema para suministro se encuentra entre 0.1 y 3.0 dinas/cm2. La suspensión de células preferentemente se suministra al compartimiento en la cámara mediante uno o más puertos de manera que tanto 20 el tiempo como la tensión por cizallamiento para el suministro se minimizan mientras se favorece una distribución más uniforme de las células en el compartimiento. Subsecuente al suministro a la cámara, -25—-S..L_deja__s_e d imentar las células y unirse durante un periodo suficiente para establecer un cultivo -&e—c iro-l-a-s-,—^ ^i^ajiL£LLe_no menor a 6 horas y no mayor a 24 horas. En este momento se elimina el liquido biológico utilizado para sembrar las células abriendo un par de puertos y utilizando uno de estos puertos para aspirar el liquido biológico al vacio y el otro puerto para ventilar la cámara a fin de permitir que el aire desplace al liquido biológico. La cámara en configuración de siembra se convierte después en una cámara en configuración de perfusión como se describe con anterioridad, se imprime con un liquido biológico para perfusión, e inicia la perfusión de la cámara. Este conjunto de procedimientos permite la siembra de células en un volumen relativamente grande de liquido biológico típicamente, 5*106 células por mi de medio de cultivo de base, aunque son posibles densidades mayores de células pero menos preferibles y la perfusión subsecuente con una reducción de cuatro veces en el volumen de retención para la cámara y con un mínimo desensamble o exposición al ambiente externo. Son posibles dos modalidades _e_ape_cí_f_ic_as _ para el ambiente en el cual se siembra una cámara con células. -Ttereha 1 i dad—s-e—e_a__e_ri 1 i z a n todas ejemplo, por autoclave de vapor, irradiación gamma, o un tratamiento químico tal como la 5 exposición a peróxido de hidrógeno) antes del ensamble en la cámara y circuitos periféricos dentro de un gabinete biológico de seguridad (BSC) que proporciona un ambiente aséptico (es decir, libre de contaminantes biológicos) . 10 Alternativamente, la cámara puede ensamblarse a partir de partes no estériles y la cámara ensamblada se esteriliza después - por uno de los métodos anteriores - como una unidad. En una modalidad la cámara se procesa 15 completamente dentro de un BSC. En una modalidad alterna se procesa la cámara sin uso adicional de un BSC al utilizar en su lugar una soldador de tubería estéril para realizar conexiones asépticas (por un cuchillo caliente o 20 radiación de microondas o UV) , en un ambiente relativamente sucio, entre segmentos de tubería basada en PVC con extremos bloqueados para evitar la contaminación. Preferentemente, se utiliza un soldador de tubería SCD® IIB, SCD® -_.25___3J.2j__ o TSCD® de Terumo Medical Corporation Somerset, NJ) para crear y romper Í-<-qa.e_nJ- e 1 condiciones estériles. Los experimentos no han demostrado ninguna diferencia en el rendimiento entre las cámaras manejadas únicamente utilizando BSCs y cámaras procesadas utilizando un soldador de tubería SCD® IIB. La capacidad de cambiar una cámara de la configuración de siembra a la configuración de perfusión sin un manejo intensivo o que comprometa la esterilidad mientras se forman conexiones estériles con un soldador de tubería facilita un tiempo de manejo reducido, reduce la necesidad de un equipo caro para procesamiento aséptico (por ejemplo, BSC u otros tipos de 15 cubiertas de flujo laminar) , y ofrece oportunidades para el procesamiento aséptico en sitios clínicos (ampliando en consecuencia las posibilidades para la c r i ocons e rva c ión ) . Debido a la naturaleza unitaria de la 20 nueva cámara para cultivo celular, las cámaras son escalables con la adición de área superficial y volumen a los compartimientos o la adición de una pluralidad de cámaras. En caso de que se incorporen cámaras adicionales, se __2.5.._ _E_r_e_fi_e_re que los compartimientos se comuniquen mediante los puertos a fin de permitir la - -n£iL¾i ón de un liquido biológico entre ellos.

Para esta comunicación la entrada 90 para el liquido biológico se conecta a un múltiple de entrada externa que distribuye el flujo del liquido biológico uniformemente a cada una de las pluralidades de compartimientos para exponer las células (o compartimientos para la perfusión para cámaras de dos compartimientos) al liquido biológico. Después del paso por los múltiples compartimientos en paralelo, el liquido biológico se recoge en un múltiple común de salida externa . Los múltiples para esta cámara oTe~ compartimiento múltiple para cultivo celular se conectan preferentemente a sus compartimientos asociados por conectores desmontables. Estos conectores permiten una fácil instalación y el posible reemplazo de conexiones individuales. Alternativamente, los múltiples externos de entrada y salida, si se desea, pueden conectarse a cada compartimiento asociado. Para un dispositivo que consiste en una pluralidad de cámaras individuales, cada miembro _ puede sembrarse con células separadamente como cámaras individuales no aglomeradas externos de entrada y salida y después subsecuentemente en múltiples conjuntamente en un sistema completo. El momento en el cual se ensamblan conjuntamente las cámaras sembradas en esta última modalidad puede ser después de sembrar o después de permitir el establecimiento adicional de cultivos . Las células sembradas en la cámara pueden conservarse. La conservación puede ser por cr i oconse r vación , almacenamiento hipotérmico, o 1 i o f i 1 i z a c i ón . Cuando las células sembradas s~orT hepatocitos y/u otras células provenientes de un hígado, pueden utilizarse las nuevas cámaras en configuración de perfusión como un LAD para tratar un paciente en necesidad de asistencia al hígado. En general, el LAD consiste en una o más de las cámaras, un medio para obtener sangre del paciente para tratamiento, y un medio para intercambiar la sangre con el contenido de las cámaras a fin de permitir que las células traten la sangre o los componentes de la misma. El LAD puede utilizarse para tratar a un humano o a otro animal con fallas hepáticas. n gpnpral , s on__p o_s_ib_l e s al menos dos tipos de modalidades para configurar el conjunto de una o más cámaras, el paciente, el medio para obtener sangre del paciente, y el medio para intercambiar la sangre del paciente con las cámaras: un circuito en el cual la tasa de flujo por las cámaras es independiente de la tasa de flujo de sangre o plasma separado del paciente, y un circuito en el cual la tasa de flujo por las cámaras se acopla a la tasa de flujo de sangre o plasma separado del paciente. La primera configuración se define en lo sucesivo como un LAD con reciclaje completo, y la segunda configuración se define en lo sucesivo como un LAD con paso sencillo. La Figura 7a muestra un diagrama esquemático de una modalidad para una sistema de soporte al hígado extracorporal en el cual las nuevas cámaras 10 para cultivo celular se utilizan como parte de un LAD con reciclaje completo. El sistema incluye una incubadora 290 con cámaras múltiples en configuración de perfusión (tal como las cámaras representadas _g_r_á_fjÍc amenté en las Figuras Ib, 3b, 4b, y 6b) .

Alojado al interior de incubadora -exc-LLe_nJira un múltiple 611 entrada ext para distribuir liquido biológico a las entradas para perfusión 90 para cada cámara y un múltiple 612 de salida externo para recoger liquido biológico de la salida para perfusión 100 para cada cámara. El liquido biológico se suministra al múltiple de entrada externo desde un intercambiador 300 de plasma por una bomba 276 y se regresa desde el múltiple de salida externo al intercambiador de plasma. La sangre del paciente 900 se suministra por una bomba 272 en una unidad 280 de pl a sma f é r es i s , en la cual se separa el plasma de la sangre concentrada en componentes celulares. El plasma separado fluye después al inter cambiador de plasma, donde se mezcla con el liquido biológico tratado por las células cultivadas en las cámaras. La sangre concentrada se regresa directamente al paciente. Una parte del contenido del intercambiador de plasma se regresa también al paciente por una tercera bomba 274 a fin de transportar el plasma tratado al paciente. En el flujo del liquido biológico y el plasma se encuentran también monitores de pH, temperatura, y sensores de flujo (no se muestran) . F, 1 si stema 600 de soporte de hígado extracorporal representado gráficamente en la Figura 7a se define como LAD con un reciclaje completo debido a que el contenido de las cámaras 10 no se le regresa directamente al paciente 900 después de cada paso por las cámaras sino que se recicla y mezcla con plasma del paciente en el inter cambiador 300 de plasma. Las cámaras preferentemente son múltiples en paralelo, aunque es posible colocar a manera de múltiples una o más de las cámaras en serie. El numero de cámaras puede variar hasta 100 o más, y las cámaras pueden cargarse con células idénticas o diferentes así como también con números idénticos o diferentes de células.

Además, las cámaras pueden ser idénticas en el número de compartimientos, o algunas de las cámaras pueden tener solamente un solo compartimiento y algunas de las cámaras dos compartimientos con una o más membranas de intervención permeables a líquidos. El i nte re ambiador 300 de plasma en el LAD con reciclaje completo 600 funciona como un mezclador para el plasma generado del paciente por la unidad 280 de pl a sma fé r e s i s y el líquido ^^ ÁjA^ ^ f at-aHn por las células en las cámaras 10. El intercambiador de plasma puede existir en una de dos modalidades. En una modalidad el intercambiador de plasma es un simple recipiente que permite el libre mezclado del plasma proveniente de la unidad de pl a sma f é r e s i s y el líquido biológico de las cámaras con otras limitantes de mezclado. La composición del líquido en el intercambiador de plasma en esta modalidad se determina simplemente por reglas de mezclado de dos líquidos completamente miscibles con base en el volumen del intercambiador de plasma y las tasas de flujo de plasma generada por la unidad de plasmaf éresis , de líquido biológico tratado generado por las cámaras de múltiples, y de líquido proveniente del intercambiador de plasma bombeado a las cámaras y al paciente. En esta modalidad no existe inmunoaislamiento entre las células en las cámaras y el paciente, a menos que cada una de las cámaras tenga dos compartimientos con una membrana permeable a líquidos que funcione también como una membrana i nmuno a i s 1 an t e . El intercambiador 300 de plasma puede tampoco ser un recipiente sencillo que permita ¦e-1—l-i-hj-„p mezclado de plasma proveniente de la unidad de plasmaf éresis y liquido biológico proveniente de las cámaras sino en su lugar un dispositivo de inmunoaislamiento en el cual el mezclado de plasma fresco proveniente del paciente y liquido tratado derivado de las cámaras 10 se controla por el paso por las membranas diseñadas para evitar el paso de moléculas i nmunor ea ct i va s . En el dispositivo de inmunoaislamiento el depósito de plasma generado proveniente de y regresado al paciente se separan del depósito de liquido biológico tratado por las cámaras y se suministran a las cámaras. Con un dispositivo de inmunoaislamiento el mezclado entre el plasma del paciente y el liquido biológico tratado por las células en las cámaras se reduce con relación al libre mezclado permitido en el mezclador sencillo de la modalidad anterior. Sin embargo, la selección de cortes para los tamaños de poro de la membrana para el dispositivo de inmunoaislamiento transmite los beneficios para el inmunoaislamiento no posible con el mezclador sencillo de la primera Estas membranas permeables inhiben el transporte de moléculas con pesos moleculares mayores a 50,000 a 100,000. La Figura 7b muestra un diagrama esquemático de una modalidad para un sistema de soporte al hígado extracorporal en el cual las nuevas cámaras para el cultivo celular se utilizan como parte de un LAD con un solo paso. El sistema incluye una incubadora 209 con cámaras 10 múltiples en configuración de perfusión (tal como las cámaras representadas gráficamente en las Figuras Ib, 3b, 4b, y 6b) .

Alojado al interior de la incubadora se 15 encuentra un múltiple 611 de entrada externo para distribuir plasma directamente a las entradas la para perfusión 90 para cada cámara y un múltiple 612 de salida externo para recoger el plasma tratado proveniente de la salida para 20 perfusión 100 para cada cámara. La sangre del paciente se suministra por una bomba 272 en una unidad 280 de plasmaf éresis . El plasma separado se suministra después al múltiple de entrada externo proveniente de una unidad 280 de -25__ril_aj5m_ajére s i s por una bomba 278 y regresa como asma tratado proveniente del múltipl ¾4i4a externo, directamente al paciente 900 sangre concentrada nuevamente se regresa directamente al paciente. El sistema 605 de soporte al hígado extracorporal representado gráficamente en la Figura 7b se define como un LAD con un solo paso debido a que el contenido de las cámaras 10 se regresan directamente al paciente 900 después de solamente un paso por las cámaras en lugar de reciclarse y mezclarse con plasma proveniente del paciente en un intercambiador de plasma. Las cámaras pueden ser múltiples en paralelo o en serie, con la selección de configuración dependiente de las características de mezclado deseadas y de la cinética de las células para procesar toxinas. El número de cámaras puede variar hasta 100 o más, y las cámaras pueden cargarse con células idénticas o diferentes así como también con números de células idénticos o diferentes. Además, las cámaras pueden ser idénticas en el número de compartimientos, o algunas de las cámaras pueden tener solamente un solo compartimiento y algunas de las cámaras dos _compar timientos con una o más membranas permeables a líquidos de intervención. Debido a f?? pl t, ? G) con un solo paso 605 no presenta un intercambiador de plasma para mezclar el plasma generado del paciente con líquido biológico tratado por las cámaras, el LAD con un solo paso no puede proporcionar inmunoai slamiento entre el paciente y las células a menos que cada cámara tenga también dos compartimientos con al menos una membrana permeable a líquidos que funciona como una membrana de inmunoaislamiento .

E j empl os La invención se describe además en los siguientes ejemplos, los cuales no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones. El Ejemplo 1 describe el procedimiento para tensar una delgada película polimérica sobre un respaldo metálico perforado basado en la expansión térmica diferencial. Los Ejemplos 2, 3, y 4 describen el ensamble, la siembra con células, y la perfusión de una cámara cerrada de cultivo celular con volumen ajustable en la cual el volumen se ajusta por el intercambio de cuñas plásticas substancialmente no comprimibles. El Ejemplo 5 describe una modalidad del sistema en el cual una pluralidad -d-e—elma-r -_^£?t a_da_s_ sembradas con células con volumen ajustable se utiliza para tratar un paciente con fallas de órganos. El Ejemplo 6 describe las pruebas utilizadas para medir la función de hepatocitos y evaluar el rendimiento de cámaras cerradas de cultivo celular con volumen ajustable. Los Ejemplos 7 y 8 describen el rendimiento de cámaras cerradas de cultivo celular con volumen ajustable. El Ejemplo 9 describe el ensamble, siembra con células, y la perfusión de una cámara cerrada de cultivo celular con volumen ajustable en el cual se mantiene una mínima carga en el sello para la cámara utilizando resortes.

Ejemplo 1: Tensar una Película de Poliestireno sobre un Respaldo Metálico Perforado La capacidad de unir y tensar una delgada película polimérica sobre un marco metálico perforado basado en diferencias en coeficientes de expansión térmica entre la película y el marco se demostró utilizando una película de 0.002" (0.05 mm) de grosor de _oJLiestireno (Polyflex®, Plastics Suppliers, Columbus, OH) y un marco 40 de aluminio ¡entado gráficamente en la Figura 8) .

Esta película, tratada con corona en un costado, proporciona una superficie permeable a gas e impermeable a líquidos en la cual pueden sembrarse, unirse, y cultivarse hepatocitos, como se describe anteriormente en la Publicación de Solicitud PCT Internacional No. WO 00/78932. El marco se preparó al maquinar un primer conjunto de 2240 orificios pasantes 350 de 0.252" de diámetro (6.4 mm) , espaciados 0.272" (6.9 mm) de diámetro a diámetro en un patrón de tipo panal centrado en las superficies de 12" * 19" (30.5 cm * 48.2 cm) de una placa de aluminio de H" (6.35 mm) de grosor (McHaster-Carr , Bridgeport, NJ) , y un segundo conjunto de 52 orificios pasantes 340 de 0.252" (6.4 mm ) d e diámetro en las mismas superficies a lo largo de su perímetro. Subsecuentemente, el marco se trató con una anodización sulfúrica de 0.0005-0.0008" (0.0127-0.0203 mm) de grosor, Tipo II, claro por Mi 1 -A- 8625C , a fin de proteger contra el ataque por solventes. Este primer conjunto de orificios 350 proporcionó perforaciones para el libre intercambio de gas en la película a aplicarse; el segundo conjunto de orificios 340 e rm i t j_ó_ ensamblar el marco con la película unida con una placa opuesta en una cámara para cultivo celular. El segundo conjunto consistió de 2 grupos de 21 orificios pasantes dispuestos a lo largo del eje largo del marco, 0.825" (20.9 mm) del borde adyacente del marco a lo largo del eje corto del marco y espaciado uniformemente con centros espaciados de 0.916" (23.2 mm ) , y dos grupos de cinco orificios pasantes dispuestos a lo largo del eje corto del marco, 0.340" (8.6 mm) del borde adyacente del marco a lo largo del eje largo del marco y espaciado uniformemente con centros espaciados 1.725 (4.38 cm) . Para formar un ensamble marco-película el marco perforado 40 se calentó primeramente a 40°C en una incubadora y después se eliminó brevemente para aplicar una delgada línea de aproximadamente 0.003" (0.076 mm) de grosor de resina epóxica de grado médico (EP21LV, Master Bond, Inc., Hackensack, NJ) , mezclada en una proporción de 1:1 en peso de las partes A y B, en una de las caras del marco que contiene los orificios pasantes. Esta línea de resina epóxica se aplicó al distribuir desde una nga de 10 mi de volumen con punta inclinada de 0.027"-ID (0.68 cm) (Small Parts Inc., Miami Lakes, FL) y se coloca entre los conjuntos interior y exterior de orificios pasantes, 350 y 340, respectivamente. Una película de 10" * 18" (25.4 * de 45.7 cm) Polyflex, lado de corona en la cara de la película no opuesta al marco, se colocó después sobre el costado con resina epóxica del marco y el ensamble se incubó durante toda la noche a 45°C. El ensamble se eliminó de la incubadora y se dejó enfriar a temperatura ambiente, se extirparon cortes de la película exterior a la línea de resina epóxica y hacia el borde del marco extirpado utilizando un cortador de caja, y el ensamble se esterilizó por irradiación gamma. Este procedimiento dio como resultado una película permeable al gas, impermeable a líquidos, adecuada como una superficie para la unión y el cultivo de células adherentes, fijas a un respaldo metálico perforado que fue substancialmente plano y que substancialmente no se pandeó cuando se ensambla en una cámara perfusionada para cultivo celular.

Ejemplo 2: Cámara Cerrada con Volumen Ajustable La capacidad de cámaras cerradas con volumen ajustable, en la cual se ajustan los volúmenes mediante el uso de cuñas substancialmente no comprimibles, a sembrarse con células se evaluó al construir una cámara. La cámara 10, como se representa gráficamente en las Figuras 9a, 9b, y 9c, comprendieron un ensamble de placa superior 30, ensamble 330 de marco-película, junta de estanqueidad 50 comprimible, cuña interior 180 substancialmente no comprimible, conjuntos de cuñas exteriores substancialmente no comprimibles para siembra 6? y para perfusión, ajustes asociados 410, 440, 450, y 460, y componentes asociados 70, 80, 420, 430, y 470 para ajusfar el ensamble marco- película a la placa superior. La placa superior 30 fue una pieza de placa de aluminio 12" * 19" (30.5 cm * 48.3 cm) * 3/8" de grosor (9.5 mm) (McMaster-Carr ) maquinada con un conjunto de 6 tipos de características y terminada con una anodización sulfúrica de 0.0005-0.0008" (0.0127-0.0203 mm) de grosor, Tipo II, claro por MÍ1-A-8625C. Un primer conjunto de 32 orificios pasantes 360 de O.J2JT7^_ (6.5 mm) de diáme^ro^ 0.375" (9.5 mm) de profundidad acopló el conjunto de 32 orificios pasantes 340 en el marco 40 del ensamble 330 marco-pelicula y permitió el paso de sujetadores 70. Estos conjuntos de acoplamiento de orificios pasantes se espaciaron para distribuir substancialmente las fuerzas de carga derivadas de los sujetadores para un sellado uniforme con la junta de estanqueidad. En una cara de 12" * 19" (30.5 cm * 48.3 cm) de la placa superior dos orificios pasantes 400 de 0.112" (2.8 mm) de diámetro, roscado interiormente para tornillos 470 de acero inoxidable de cabeza redonda #6-32, se maquinaron opuestos a un subconjunto de los orificios 360. En la cara opuesta de la placa superior una ranura 310 de 0.078" (1.9 mm) de profundidad, 0.375" (9.5 mm) de ancho, 17.914" * 9.916" (45.5 cm * 25.1 cm), centrada en la cara, proporcionó un espacio para un asentamiento de junta de estanqueidad de caucho de esponja de silicona de grado medio de W (6.3 cm) de grosor (Greene Rubber, oburn, MA) . Cuatro orificios pasantes 111 adicionales de 3/8" (9.5 mm ) de profundidad (numerados en el sentido de las manecillas del reloj desde la cara de la placa superior sin la ranura) , roscado interiormente para los ajustes 460 roscados a seguro Luer macho #1/4-28, se maquinaron en la placa superior adyacente a las esquinas de la ranura. Estos orificios fueron escariados de 0.346" (8.8 mm) de diámetro en la cara opuesta a la ranura a fin de permitir el uso de juntas tipo 0 420 de tamaño 009 para sellar entre los ajustes 460 y la placa superior. La combinación de los ajustes y los orificios crearon un puerto 110 de siembra, un puerto 116 de s i emb ra / a s p i r ac i ón , un puerto 120 de ventilación, y un puerto extra 121. Estos orificios se utilizaron para introducción y eliminación de líquidos en la configuración de siembra de volumen relativamente alto. La introducción a y eliminación de líquidos de la configuración de perfusión de volumen relativamente bajo se implemento por un múltiple de entrada de diámetro relativamente grande y tuberías de salida y un conjunto de orificios transve sales de diámetro más pequeño.

Dos orificios pasantes 370 y 380 de 19" de largo (48.3 cm) por 0.155" (3.9 mm) , a 1.843" (4.7 cm) de los costados adyacentes y centrados en la cada de 3/8" (9.5 mm) de grosor, se maquinaron a lo largo del eje largo de la placa superior. Cada extremo de estos orificios fueron escariados de 0.290" (7.4 mm) de diámetro * 0.050" (1.3 mm) de profundidad y roscados interiormente de 0.200" (5.1 mm) de profundidad para aceptar los ajustes 440 de #10-32 de acero inoxidable con juntas tipo 0 430 -006 asociadas para sellar el ajuste a la placa superior. Finalmente, se perforaron 30 orificios transversales 390 de 0.110" (2.8 mm) de profundidad, de 0.025" (0.64 cm) de diámetro, en la cara de la placa superior con la ranura a fin de conectar un paso para los fluidos desde los orificios 370 y 380 de 19" de largo (48.3 cm) a la parte superior, con 15 orificios 390 por orificios de 19" (48.3 cm) . Estos orificios 390 se espaciaron uniformemente a 1.129" (2.9 cm) . La cámara 10 se ensambló parcialmente al sujetar primeramente un conjunto de 28 receptáculos 80 de acero inoxidable de Southco® (D.B. Roberts, Boston, MA) sobre la cara de la placa superior 30 que se opone a la ranura 310 utilizando los orificios 400 roscados interiormente y dos tornillos 470 de acero inoxidable de cabeza redonda #6-32. Estos receptáculos no estaban destinados para eliminarse rutinariamente de la placa superior durante el desensamble y limpieza de la cámara después del cultivo celular. Después, los cuatro ajustes 460 de seguro Luer con juntas tipo O 430 se roscaron aflo j adámente en los orificios 111 roscados interiormente correspondientes y los tapones 450 de plástico correspondientes de seguro Luer hembra se apretaron en cada uno de estos ajustes de seguro Luer. La placa superior se volteó después para exponer la cara con la ranura 310, la junta de estanqueidad 50 se alineó en la ranura, y una cuña interior 180 de policarbonato de 0.005" (0.12 mm) de grosor, de 0.25" (6.4 mm) , de 17.14" * 9.14" (45.5 cm * 23.2 cm) colocada en la placa superior y limitada por la junta de estanqueidad. Este ensamble superior parcial se esterilizó por autoclave de vapor antes del ensamble ulterior. Los pares de tornillos 410 de acero inoxidable de cabeza plana de #10-32 y los ajustes 440 de seguro Luer roscados a macho #10-32, se esterilizaron por vapor (todas las juntas tipo O 430 , de tamaño -006) . Todos los pasos subsecuentes en el ensamble se llevaron a cabo en un gabinete biológico de seguridad (BSC) y partes esterilizadas implicadas excepto como se observó anteriormente. El procedimiento aséptico se aseguró manejando materiales sea con pinzas estériles o guantes estériles al interior del BSC. Primeramente, el ensamble 330 marco-película y el ensamble superior parcial se desenrollaron de sus bolsas de autoclave y se apretaron los ajustes 460 flojos. Después, los ensambles de marco-película y superior se alinearon acoplando los conjuntos de orificios pasantes 360 y 340, de manera tal que el costado de soporte de película del ensamble de marco-película y el costado del ensamble superior con junta de estanqueidad sobresaliente estuvieron opuestos. Después se insertaron los tornillos 70 de acero inoxidable roscados de colocación rápida de Southco0 desde la cara expuesta del ensamble de marco-película por los orificios 360 y 340 y se capturaron en los receptáculos 80. Se colocó un conjunto de cuatro cuñas exteriores 60 de policarbonato de 0.0625" (1.6 mm) de grosor entre los tornillos a fin de ajustar el volumen de la cámara 10 a 165 mi para sembrar las células en la configuración de siembra. Estas cuñas exteriores para siembra tuvieron dimensiones planas que les permitieron extenderse fuera del perímetro formado por los bordes de la placa superior 30 y el ensamble de marco-película, como se representa gráficamente en las Figuras 9b y 9c. La cámara 10 se selló después al apretar los tornillos 70 de Southco®, desde el interior de las esquinas para comprimir uniformemente la junta de estanqueidad 50 sin inducir la inclinación substancial de la cámara, con un desatornillador de potencia (Black & Decker, Hampstead, MD) con un mínimo momento de torsión. Los tornillos 70 de Southco0 se apretaron subsecuentemente de manera adicional al repetir el procedimiento anterior con un ajuste de 3 ½ en el ajuste de momento de torsión del desatornillador. El paso final en el ensamble de la cámara cerrada en la configuración de siembra fue la instalación y apriete de los ajustes 440 y 410 sobre los extremos del par de orificios 370 y 380 de 19" (48.3 cm) de largo, de manera tal que cada parte de 1 a cámara contuviese solamente un tipo de estos dos ajustes. La cámara se mantuvo bajo condiciones asépticas y no abrió hasta su uso. Este procedimiento dio como resultado la creación de una cámara cerrada, estéril, en la configuración de siembra en la cual pueden sembrarse las células en un área de 17.164" * 9.166" (43.6 cm * 23.3 cm) de película permeable al gas, impermeable a líquidos, en un compartimiento sellado de 165 mi de volumen. Los estudios de la cámara cerrada 10 como dispositivo de cultivo celular se llevaron a cabo utilizando hepatocitos primarios en medio de cultivo de base (Medio Williams E complementado con 4.5 g/1 de glucosa, 0.5 de U/ml de insulina bovina, 7 ng/ml de glucínea, 7.5 ug/ml de hidrocortisona , 10 mM de HE PE S , 20 ng/ml de EGF, 20 mM de glutamina, 10 IU de penicilina, y 10 µ? de estreptomicina) con suero de caballo (HS) al 1%, obtenido de hígados de cerdos cruzados de Yorkshire/Hampshire (EM Parsons, Hadley, MA y ABI, Baltimore, MD) pesando ±8.3 kg . Se administró heparina ( El kin s - S inn , Cherry Hill, NJ) intravenosamente a 0.5 mg/kg y se aneste siaron los donadores con una mezcla de Telazol (7-10 mg/kg, Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, LA) y Rompun (5 mg/kg, Miles, Inc., Shawnee, Mission, KS) . El plano de anestesia se mantuvo con gas isoflurano. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las instrucciones de IACUC. Las células se aislaron utilizando una modificación del método de Seglen (Selgen, "Preparation of isolated rate liver cells", en Methods in Cell Biology, Prescott et al., eds. Vol . 13, Academic Press, Nueva York, NY, 1976 ) . En resumen, el hígado expuesto se canuló y perfusionó in situ con Enjuagadores Lactados fríos (Baxter, Deerfield, IL) a 20 ml/min antes de la escisión. El hígado se calentó rápidamente y se perfusionó con EDTA al 0.2% a 37% seguido de la perfusión de 1 mg/ml de colagenasa (Life Technologies, Grand Island, NY) a 37°C hasta que la digestión pareció ser completa (típicamente después de 18-26 minutos) . Además, la digestión se detuvo con la adición de solución salina compensada de Hank ( Bi oWh i 11 a ke r , Walkerville, MD) complementada con HS al 10%. Se extirparon el tejido no digerido y la vesícula biliar y el resto del tejido pasó secuencialmente por un cedazo de acero inoxidable (Fisher Scientific, Pittsburg, PA) con poros de 200 µp? de diámetro. La suspensión de células se enjuagó después dos veces y se volvió a suspender en un medio de cultivo de base. Después las células se sembraron en la cámara 10 utilizando el aparato 480 representado gráficamente en la Figura 10. Todos los pasos se realizaron asépticamente con componentes estériles dentro de un BSC a menos que se establezca de otra manera a fin de asegurar la esterilidad, aunque conceptúa lmente no se requiere un BSC si se utiliza un soldador de tubería para realizar conexiones asépticas. Sin embargo, por simplicidad no se utilizó un soldador de tubería en estos estudios. En algunos estudios la película permeable al gas, impermeable a líquidos, se pre-cubrió con una solución de 160 mi de volumen de 44 / ral de colágeno de Tipo I en agua destilada, desionizada, durante 30-60 minutos. Utilizando un BSC esta solución se introdujo a la cámara 10 eliminando los tapones hembras de seguro Luer de un par de puertos de seguro Luer en la cara exterior de la parte superior de la cámara, distribuyendo la solución en un puerto ahora abierto con una pipeta de 50 mi de volumen mientras se ventila el contenido gaseoso del compartimiento en el BSC mediante el otro puerto ahora abierto, y reinstalando los tapones de seguro Luer en sus respectivos ajustes. Subsecuentemente, la solución de colágeno no absorbida se eliminó al eliminar nuevamente el par anteriormente mencionado de tapones de seguro Luer, aspirando el compartimiento con una pipeta de Pasteur de volumen de 2 mi colocada en un ajuste abierto recién vaciado por un tapón de seguro Luer, enjuagando el compartimiento con 50 mi de medio de cultivo de base por pipeta, y aspirando este enjuague como se describe para la solución de colágeno. El resultado es un recubrimiento de grosor molecular de colágeno en la película. Las células se sembraron en una cámara individual 10 a partir de una suspensión de células 131 preparada con una concentración de 5*105 células/ml en una botella aspiradora Pyrex® 510 de 11 de volumen con entubación 520 (Fisher Scientific) con tapón 500, filtro 490, las partes asociada s 440, 450, 550, y 570 pa ventilación durante la siembra. El frasco se colocó en un agitador 540 para mantener la suspensión bien mezclada y minimizar la sedimentación de las células durante la siembra. La cámara se preparó para siembra eliminando tres tapones de seguro Luer de los ajustes de seguro Luer en la cara exterior de la parte superior de la cámara. El aparato 480 para distribuir las células 130 en la cámara 10 se ensambló después al conectar la entubación 520 a un segmento de tubería 570 de 0.25" (6.4 mm) de ID de Tygon© LFL US® 17 Masterflex® (Colé Parmer Instrument Company, Vernon Hills, IL) a un ajuste 550 de seguro Luer con lengüetas a macho a un grifo 560 de cuatro vías a un ajuste 550 de seguro Luer macho a lengüetas y un ajuste 551 de seguro Luer hembra a hembra a dos segmentos paralelos de tubería 580 de ID de 0.19" (4.8 cm) de Tygon® LFL US® 25 Masterflex® (Colé Parmer Instrument Company) a la cámara 10 y desde la cámara 10 a un ajuste 550 de seguro Luer macho a lengüetas a un segmento de tubería 570 de Tygon® LFL US® 17 Masterflex® (Colé Parmer Instrument Company) a nn jnsh R 4 ? de seguro Luer con lengüetas a macho a un receptor 530 de residuos formado por un ensamble de las partes 440, 590 , 570, y 490. Este receptor 530 permitió la ventilación aséptica del aparato 480 a fin de alojar el contenido gaseoso desplazado de la cámara y la tubería durante la siembra de las células. El flujo en el aparato 480 se controló cargando los segmentos de tubería 580 individualmente en cabezas de bomba Easy-Load® con alojamiento de PSF 271 (Colé Parmer Instrument Company) instaladas en un accionador peristáltico digital de velocidad variable L/S® con rotor 270 de acero inoxidable (Colé Parmer Instrument Company) . El uso de puertos duales para introducir la suspensión de células 131 facilitó la siembra uniforme de células en la cámara 10. Los segmentos de tubería 570 y 580 se seleccionaron para acoplar el área transversal para el flujo en el segmento 570 con la suma de las áreas transversales para flujo dentro de los segmentos 580. Estos tres segmentos de tubería se imprimaron con la suspensión de células 131 antes de la introducción de las células a la cámara. Para sembrar actualmente la suspensión de las células 131 en la cámara 10, se inclinó la cámara a aproximadamente 45° de la horizontal en su eje corto y se llenó al bombear 165 mi de la suspensión de células 131 a 80.45 km/min (50 mi/min) a través de segmentos duales de la tubería 580. Esta tasa de flujo se seleccionó para minimizar el tiempo requerido para sembrar células sin inducir al c i z a 11 ami en t o excesivo de la suspensión. Subsecuentemente, la cámara se inclinó hacia atrás a la horizontal, se desconectó la tubería de la cámara, y se taparon todos los puertos abiertos en la cámara. La cámara se transfirió después a una incubadora operada a 37°C, C02 al 10%, y humedad relativa al 85%. Este procedimiento puede repetirse para sembrar una pluralidad de cámaras.

Ejemplo 3: Cámara Cerrada con Volumen Ajustable - Reducción en Volumen La capacidad de una cámara sembrada con células para convertirse desde una configuración de siembra con contenido de 165 mi de medio a una configuración de perfusión con contenido de 35 mi de medio se demostró con la cámara 10 del -E-j-amril_Q_2 represervtada_ gráficamente en la Figura 9. La cámara se reconfiguró después de aproximadamente 18-24 horas de cultivo estático al eliminar primeramente la cámara desde la incubadora y colocarla en un BSC. Después, se eliminaron los tapones 450 para los puertos 116 y 120, se aspiró el medio en la cámara mediante el puerto 116 ahora abierta, se enjuagó el compartimiento para eliminar residuos no adherentes al distribuir y aspirar 50 mi de medio de cultivo de base mediante el puerto 116, y se reemplazaron los tapones 450. El volumen del compartimiento se redujo después al eliminar los tapones para los ajustes 440 de perfusión, aflojar los sujetadores 70, eliminar y reemplazar las cuatro cuñas exteriores 60 de 0.0625" (1.6 mm) de grosor con un conjunto de cuatro cuñas de policarbonato de 0.005" (0.13 mm) de grosor, y reapretar los sujetadores 70 como se describe en el Ejemplo 2. Se eliminaron las cuñas al retirar las lengüetas. Este procedimiento no comprometió la esterilidad de la cámara disminuyó aún el volumen del compartimiento y pasos de flujo asociados cuatro veces a 35 mi, proporcionando aproximadamente 1 mi par rqfja 2 * 10 c_élu 1 a s sembradas. El perfusato se distribuyó mediante el interior de la cámara utilizando múltiples de entrada y salida internos maquinados en la placa superior 30. El perfusato ingresó por uno de los puertos de perfusión de entrada, fluyó por el orificio asociado de 19" (48 .3 cm) , desde el cual se distribuyó por los 15 orificios transversales asociados 390 en el compartimiento de la cámara. El perfusato fluyó después por el compartimiento de la cámara, salió por el conjunto de 15 orificios tr ns ersales 390 a su orificio asociado de 19" (48.3 cm) de largo^ y~ salió de la cámara 10 por el puerto 100 de salida de perfusión. Las tasas de flujo para perfusión se seleccionaron de manera tal que los flujos por las características en la placa superior 30 y el compartimiento de la cámara fuesen laminares (es decir, números de Reynolds asociados menores a 2000) . El diámetro más pequeño de los orificios transversales 390 relativos al diámetro de los orificios 370 y 380 de 19" (48 .3 cm) de largo se seleccionó para distribuir uniformemente el flujo de perfusato por los orificios pasantes 390 con un mínimo pnt- pnami pnt-o preferencial jde perfusato mediante un subconjunto de orificios pasantes, lo cual daría como resultado un entrenamiento preferencial de perfusato mediante el compartimiento de la cámara.

Ejemplo 4: Cámara Cerrada con Volumen Ajustable - Perfusión como un Solo Cartucho La capacidad de una cámara 10 sembrada con células en configuración de perfusión a perf usionar se se evaluó con la cámara del Ejemplo 3 y un circuito de lazo cerrado. Estas pruebas permitieron también el estudio de la función de hepatocitos ín vitro bajo la perfusión de medio o plasma, el uso de múltiple de estas cámara dispuestas conjuntamente en múltiple para tratar un animal con fallas hepáticas, y la confirmación de ascenso de la función por célula de estas nuevas cámaras a cámaras anteriormente descritas en la Publicación de Solicitud PCT Internacional No. WO 00/78932. Se ensambló un circuito de lazo cerrado para perfusión (es decir, un circuito para perfusión con reciclaje completo) con una cámara 10 .sembrada con células en su configuración de perfusión, un receptor de volumen de 500 mi estéril con tapa y ajustes asociados, y dos segmentos de tubería de 2' (61 cm) de largo L/S® Masterflex® de ID de 0.06" (5.1 cm) (Colé Parmer Instrument Company) con ajustes asociados de seguro Luer de lengüetas a macho que conectan la cámara y el receptor. El receptor se cargó con un volumen definido de perfusato antes de la conexión. La tubería fue Tygori LFL para estudios con medio o plasma sin contenido de diazepam; se utilizó tubería de Vitori para estudios con un medio estimulado con diazepam. Los dos segmentos de tubería conectaron los puertos de entrada y salida de la cámara al receptor, respectivamente. Las partes se esterilizaron por autoclave de vapor o se recibieron estériles antes de ensamblarse. El circuito ensamblado para perfusión se transfirió desde el BSC a una incubadora operada a 37°C y el C02 al 10%. La tubería que conecta el receptor y el puerto de entrada a la cámara se cargó en una cabeza de bomba Easy- Load® (Colé Partner Instrument Company) instalada en un accionador peristáltico digital inoxidable (Colé Partner Instrument Company) . Después, el medio en el receptor se recirculó por el circuito (es decir, desde el receptor por la tubería hasta la cámara por un segundo conjunto de tubería de regreso al receptor) a una tasa de flujo típicamente de lOmUmin. Al inicio, la cámara 10 se inclinó típicamente desde la horizontal en su eje corto a fin de facilitar la eliminación de burbujas de aire provenientes del compartimiento de la cámara. El receptor en este circuito funcionó también como una trampa de burbujas. Después de una perfusión durante 6, 18, o 24 horas, se muestreó el perfusato recirculante y se probaron sus propiedades bioquímicas reflectivas de función de hepatocitos, como se describe en el Ejemplo 4. Fueron posibles múltiples periodos secuenciales de perfusión al intercambiar el receptor para un nuevo receptor con perfusato fresco. Después de completar el estudio se eliminó una cámara 10 de la incubadora, se de_s£rLS. mbLó_,_ _y__ se_ _lim ió . Se desconectaron toda la tubería y ajustes de plástico y se desecharon d-e-s-p-a-é-s de -mnsd i mi en tos apropiados p ara materiales bi ope 1 i g ros o s . Después, los sujetadores 70 y los ajustes de seguro Luer hembra de acero inoxidable para perfusión 440 fueron eliminados y limpiados por sonificación durante 30 minutos. La película permeable al gas, impermeable a líquidos fue despojada del ensamble marco-película 330, se remojó el marco 40 en etanol al 70% en agua durante 24 horas para aflojar la resina epóxica residual, y se desecharon esta resina epóxica y residuos de película asociada utilizando una navaja de afeitar o escalpelo. Después de eliminar tanto la junta de estanqueidad 50 como la cuña interior 180, se limpió la placa superior 30 depurando con el detergente Bacdown (Decon Labs, Bryn Mawr, PA) . Los orificios pasantes 370 y 380 de 19" (48.3 cm) se limpiaron individualmente utilizando segmentos de limpiador de tubería y limpia con chorro de agua con H202 al 1%. Todas las partes se enjuagaron con agua y se secaron para su uso futuro. Aunque el circuito descrito para pexxju_s.i_ón ¿uvq una configuración de lazo cerrado, anticipamos formas de la modalidad "descx üra en este J^j-e-mp-l-O gn tienen una configuración de lazo abierto en la cual la trayectoria de flujo es desde un depósito de suministro, mediante una bomba, por la cámara, y hacia un deposito de concentración. El ensamble y la operación de este circuito abierto sigue los procedimientos generales descritos con anterioridad para un circuito de lazo cerrado.

Ejemplo 5: Sistema para Tratamiento de un Animal con Fallas Hepáticas con un Sistema que Incluye una Pluralidad de Cámaras Cerradas de Cultivo Celular con Volumen Ajustable Se utilizaron cámaras 10 sembradas con células en su configuración de perfusión como parte de un circuito 600 de LAD ex t r a co r por a 1 para tratar cerdos de 30-50 Ib (13.6 - 22.7 kg . ) con fallas hepáticas. Este sistema, como se representa gráficamente en la Figura 11, consistió de una máquina 280 MC 9000+ (Haemonetics , Inc., Braintree, MA) para aféresis, un conjunto de 10 cámaras 10 en múltiple en paralelo, una incubadora 290 de eá-mar-a rencilla Mod_e__lo_ _J3JL10_ ( The rmoForma , Marietta , OH) para proporcionar soporte cámaras. un baño 730 de agua, y bombas asociadas, tubería, y otros accesorios de manejo de fluidos. La Figura 11 5 muestra solamente tres cámaras por simplicidad. La MCS 9000+ es un dispositivo basado en la centrifugación aprobado por la FDA para separar plasma de otros componentes sanguíneos. La operación del MCS se controla por una pantalla 10 electrónica amigable al usuario que requiere una mínima intervención del operador garantizando la seguridad del paciente. Por ejemplo, el MCS controla automáticamente los ciclos alternos "Extraer" y "Regresar" para el flujo sanguíneo y 15 responde si se alcanzan los límites en el volumen de sangre extracorporal . El tratamiento de un paciente con un LAD 600 requirió múltiples fases: una primera fase en la cual se sembraron hepatocitos en una 20 pluralidad de cámaras 10 en su configuración de siembra (como se describe en el Ejemplo 2) , una segunda fase en la cual las cámaras en su configuración de siembra se convirtieron a su configuración de perfusión (como se describe en -2§ el E_ ampj. o_ 3_i , una_ tercera_ fase en la cual las cámaras en su configuración de perfusión se pe r fus i on a ron con un medio de cultivo de base ( "pre-perf usión" ) , una cuarta fase en la cual se trató el plasma de un cerdo con fallas hepáticas con el LAD extracorporal, y una quinta fase en la Cual las cámaras en su configuración de perfusión se re-perfusionaron con medio de cultivo de base ("post-perfusión") . La preperfusión proporcionó una linea de base para el rendimiento in vítro del LAD antes de la exposición a plasma proveniente de un paciente con función hepática comprometida; las proporciones de diferentes funciones de hepatocito in vitro en pos t -pe r f u s i ón a preperfusión proporcionaron la métrica para evaluar cuán bien sobrevivieron las células en el LAD expuesto a plasma enfermo. El LAD 600 extracorporal con una pluralidad de cámaras 10 consistió de dos circuitos, el "Circuito de Dispositivo" 610 y el "Circuito de Retorno de Plasma" 620, realiza la inferíase mediante una unidad denotada como el "Depósito de Plasma" 300. El Depósito de Plasma _f_u_e_ un __en_samble_ _d_e jolicarbonato, con base en los ensambles descritos en la Publicación de Solicitud --P-C-T- —T-afp.rnar.i ona 1 No. WO 00/78932 como depósitos, con ajustes asociados para la recepción de plasma del paciente, flujo de 5 paciente a y desde el Circuito de Dispositivo mediante múltiples para la perfusión 613 y 614 de medios, para el retorno de plasma al paciente, y ventilar el depósito de plasma a fin de evitar la formación de presión. Todas las 10 partes anteriormente no descritas en los Ejemplos 1, 2, 3, o 4 se esterilizaron sea por irradiación gamma o por autoclave de vapor. Cada segmento de tubería descrita a continuación tuvo ajustes 550 de seguro Luer lengüeta a macho 15 a cada extremo a menos que se indique de otra mane ra . El Dispositivo de Circuito 510 comprendió dos conjuntos de múltiples 611 y 612 de entrada y salida de dispositivo, cámaras 10 20 en múltiple con tubería y ajustes asociados que llevan y salen de las cámaras, múltiples para la perfusión 613 y 614 de medio con tubería y ajustes asociados, un depósito para el medio para pre- y post-perf usión 800, un depósito 810 -_2-5 p_ax_a_ e _ua_g_a_jr_ ^célula s de_s pué_s_ _de 1_ tratamiento de plasma enfermo, y un depósito 820 de residuos. -ELCLS can juntos. de ni nnn cámaras sembradas c on células en su configuración de perfusión, en múltiple conjuntamente en paralelo, se ensamblaron como se explica a continuación. La entrada 90 de cada cámara se conectó a un múltiple 611 de entrada para las cámaras (formadas a partir de un conjunto de grifos 560 de cuatro vías conectado en serie) por segmentos secuenciales de Tubería 650 de Watson-Mar low ( Watson-Marlow , Inc, ilmíngton, DE (con ajustes asociados 550 y 840 en cada extremo) y de tubería 630 Tygon® LFL US® 14 Masterflex®. El puerto 100 de salida de cada cámara se conectó a un múltiple 612 de salida para las cámaras (formadas a partir de un segundo conjunto de grifos 560 de cuatro vías conectados en serie) por un segundo conjunto de segmentos de tubería 630 de Tygon® LFL US ® 14 Masterflex®. El resto del Circuito 610 de Dispositivo se formó como se explica a continuación. Los múltiples 611 y 612 de entrada y salida para los dos conjuntos de cámaras se conectaron por segmentos de tubería 58JL Tygon® L/S® 25 _Ma_s ter f lex a múltiples de entrada y salida para la perfusión 613 y 614 de medio , fea^ee vamente- Cada uno de estos últimos múltiples comprendió 3 grifos 560 de cuatro vías. Un grifo 560 en el múltiple de entrada para la perfusión 613 de medio se conectó por un segmento de tubería 580 de Tygon® LFL L/S® 25 Masterf lex® al ajuste 301 en el Depósito 300 de Plasma, se conectó un segundo grifo 560 en el múltiple de entrada para la perfusión de medio por un segmento de tubería 580 de Tygon® LFL L/S® 25 Masterflex® a la entrada de depósito para una perfusión 810 de medio, y el tercer grifo 560 en el múltiple de entrada para la perfusión de medio se conectó a la entrada del depósito 810 de enjuague y la entrada del depósito 830 de imprimación (una botella desechable de Nalgene de 125 mi de volumen con filtro 490 de aire asociado) . Un grifo 560 en el múltiple de salida para la perfusión 613 de medio se conectó por un segmento de tubería 580 de Tygon® LFL US® 25 Masterflex® al ajuste 302 en el Depósito 300 de Plasma, un segundo grifo 560 en el múltiple de salida para la perfusión de medio se conectó por xxxi a_ _5_80 de_Tygon®_ LFL US® 25 Masterflex® a la salida del depósito para -pe-r£¾-s-3r-éí¾—8^0—de mecLLo-, ¾? el tere er grifo 560 e_n el múltiple de salida para la perfusión de medio se conectó a la salida del depósito 810 de 5 residuos. El Circuito 610 de Depósito se pre- perfusionó durante 18 horas como se describe en el Ejemplo 4. Después, el Circuito de Dispositivo se enjuagó con 1 1 de medio de cultivo de base, durante lo cual se enjuagó a 10 presión el contenido de las cámaras hacia del depósito 820 de residuos. El ensamble se transfirió después a la sala de operaciones para el tratamiento del cerdo con fallas hepáticas. El circuito 600 de perfusión 15 extracorporal conectó los dispositivos en la configuración de tratamiento de paciente a la unidad 280 de aféresis. La salida de la unidad de aféresis se conectó al Depósito 300 de Plasma asépticamente antes de conectar al paciente. El 20 sistema implementado se basó en el uso de un tazón centrifugo de 125 mi de volumen. La aféresis se inició inmediatamente después de la estabilización de la presión sanguínea después de la cirugía. Para minimizar -2§- -la hamo di lución_ _ _COJ plasma saludable, el Depósito 300 de Plasma fue imprimado con medio, rcm—-r-?-?—mi—<d-e—e-s-t-e ?&ß ??? regresó al paciente antes del inicio de la aféresis. Se extrajo toda la sangre por la unidad 280 de aféresis 5 mediante la linea "Extraer/Regresar" desde una cánula implantada en la arteria femoral izquierda del paciente y se separó el plasma en plasma y sangre concentrada (una mezcla de glóbulos con una cantidad residual de plasma) . 10 La tasa de extracción fue ajustable desde 20-80 mlmin. Fue deseable maximizar esta tasa, la cual se limitó por el estado fisiológico del paciente, a fin de optimizar la eficacia terapéutica. La sangre concentrada se regresó 15 al paciente por la linea de Extracción/Regreso a 20-60 ml/min. Esta tasa se limitó por el diámetro de la cánula implantada. Una solución de 40 U/ml de heparina en salmuera se administró por la unidad de aféresis como anticoagulante a 20 una tasa de 1 mi a 15 mi de sangre extraída. El plasma se bombeó por la unidad de aféresis al Depósito de Plasma y se muestreó desde un grifo en la línea de la unidad de aféresis al Depósito de Plasma . -2§ DeJL _De_pó s i t_o de Plasma, se direccionó el plasma por los dispositivos y se regresó al parei- frtre-. &4 p-l-a-sma se regresó al pacient e mediante el Circuito 620 de Retorno de Plasma. Este circuito consistió de una bomba 274, segmentos de tubería conectados a una trampa 670 de burbujas encamisadas de agua de Radnoti, y una cánula implantada a la vena femoral izquierda del paciente. Este plasma se complementó con salmuera 790 y una solución de dextrosa al 5% en salmuera 780, suministrado por bombas digitales 285 y 286 de canal sencillo, respectivamente. El uso de estas bombas ofreció un mayor control y con f i ab i 1 i da d que la infusión de salmuera y dextrosa por goteo de IV mientras se toma ventaja del acceso vascular necesario para el tratamiento extracorporal. Se tomó como infusión salmuera a una tasa de 2 ml/min y dextrosa a una tasa de 0.30 ml/min-kg de peso corporal (previo a la falla hepática) y 0.1 ml/min-kg de peso corporal (tras la falla hepática ) . Se trató plasma por perfusión mediante las cámaras 10 en el Circuito 610 de Dispositivo en un lazo de reciclaje en el cual el plasma tosteni-erLíLe _de. _l.a_ jjnidad _2_8_0_de aféresis ingresó al Depósito 300 de Plasma y se circuló por los múltipl-ens &11 - £12____de__._disp ositivo_ independientemente del regreso al paciente. El Circuito de Dispositivo hizo la interfase con el Circuito 620 de Retorno de Plasma mediante el Depósito de Plasma. El plasma en este depósito se hizo reciclar continuamente por un conjunto de una o más cámaras alojadas en una incubadora 290 suministró una mezcla de C02 al 10% en aire. La tasa de flujo volumétrica para la perfusión mediante cada cámara individual fue de 10 ml/min, con base en tasas de flujo utilizadas para optimizar el ascenso de función in vitro como se describe en el Ejemplo 7 a continuación mostrado. El plasma se hizo recircular continuamente desde el Depósito de Plasma por el Circuito de Dispositivo al bombear las tuberías individuales a cada cámara a 10 ml/min utilizando una bomba de 16 canales Watson-Marlow. El plasma se bombeó a una tasa variable desde el Depósito de Plasma utilizando una bomba digital de un solo canal y regresó al paciente. La tasa variable se determinó con base en el plasma producido por ciclo y el tiempo de ciclo t-o.t-a.JLi Este, jaé todo de tratamiento permitió que el plasma proveniente de cada ciclo de CTtrac ci fl—^&a.l-i-z^£ múltiples pasos por el Circuito de Dispositivo antes de regresarse al paciente . Este LAD 600 se ejecutó continuamente con muestras de plasma tomadas cada media hora con jeringas ubicadas antes y después del Depósito 300 de Plasma. Después de un periodo de tratamiento de seis horas desde el inicio de la aféresis, el Dispositivo 610 de Circuito se desconectó del Circuito 620 de Retorno de Plasma al hacer girar los grifos 560 de cuatro vías en los múltiples de entrada y salida para la perfusión media 613 y 614 a su posición "f". La aféresis continuó durante un periodo adicional de dos horas y el muestreo continuó evaluando el efecto del tratamiento con cartuchos de dispositivo sembrado de hepatocitos . Se le dio muerte al paciente y se le dejó desangrar. El Circuito de Dispositivo se enjuagó con agua a chorro cambiando la posición de los grifos 560 en los múltiples de entrada y salida para la perfusión media 613 y 614 a fin de permitir 11 de medio de enjuague para perfusionar desde el depó-s tLO _8i0_ de_e_n _u^g_ue_ media n te el circuito de dispositivo y hacia el depósito 820 de residuos. -&e-s-p¾ré-s-—á-e—q-u-ß—s-e 1 i m i ó C_QII_ agua el plasma de las cámaras 10, el Circuito de Dispositivo se perfusionó con el medio de post-per fusión 5 durante un periodo de 18 horas. Se tomó una muestra de medio de 18 horas, y los dispositivos se desensamblaron y limpiaron como se detalla en el E j emplo 4. 10 Ejemplo 6: Pruebas para Evaluación de la Función de Hepatocitos Los hepatocitos tienen una amplia variedad de funciones metabólicas, incluyendo anabolismo (por ej emplo , síntesis y secreción de 15 glucosa y albúmina) y catabolismo (por ej emplo , metabolismo de amoníaco y productos catabclicos de proteína a urea y de s t oxi f i ca c i ón de xenobióticos por conversión de compuestos relativamente apolares a relativamente más 20 polares, compuestos conjugados) . El catabolismo en particular produce compuestos que son menos tóxicos y son limpiados más fácilmente del cuerpo por el sistema renal (es decir, los ríñones y la orina) . Evaluamos el rendimiento -¾> met_aJcLQlJLccL _como_la Jta_sa_d_e ureagénesis (síntesis y secreción de urea) , tasa de limpieza de amormfW fe-a-s-a de metabolismo del diaze p am xenobiótico modelo, grado de conjugación de diazepam, y tasa de secreción de glucosa en el medio de cultivo. Los incrementos en estas propiedades reflejan la función incrementada de las células. El estado de cultivo se determinó por la tasa de lactogénesis (síntesis y secreción de lactato) y tasas de acumulación de la deshidrogenasa de lactato de enzima citosólica (LDH) , catalizando la conversión de piruvato a lactato, y la aminotrans f erasa de aspartato de enzima mitocondrial (AST) , catalizando la conversión del grupo amino de ácido aspártico a un grupo queto de ácido quetoglutár ico , en el medio de cultivo. La comparación de estas tasas entre diferentes tipos de dispositivos permite la comparación entre el estado de las células cultivadas en estos dispositivos. La ureagénesis se midió para cultivos de hepatocitos en dispositivos sea perfusionados durante 18 horas con medio de cultivo de base o perfusionados durante 24 horas con medio de G-ul-ti. _o_ cle__ ¿ase^complementado con 10 mM de NH4C1 exógeno. Las muestras de 20 µ? de volumen de medio tia-t^u±o rnn hepatocitos derivadas de dispositivos individuales se mezclaron con 0.5 mi, de 111 g/1 de H3P04, 3.33 NH2S04, 66.7 mg/1 de FeCl3, 1.67 g/1 de diacetilmonoxima, y 13.3 mg/1 de tiosemicarbazona en agua destilada desionizada en microtuberí as individuales de una placa de racimos de 96 microtubos (Sigma #07-200-319) antes de la incubación a 100°C durante cinco minutos. Los triplicados de absorbencia óptica de 200 µ? de volumen derivados de cada microtuberia fueron medidos en cavidades individuales de una placa de 96 cavidades con un lector de microplacas SPECTRAmax® 250 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . Después se determinaron las concentraciones con base en las diferencias en absorbencia óptica a 540 nm y 690 nm y una curva convencional para 1-100 pg/ml. Las tasas de ureagénesis se expresaron como una cantidad de urea producida por célula perfusionada por célula sembrada por día al multiplicar las concentraciones por volumen de perfusato y al dividir por el número de células sembradas. En esta prueba las altas tasas de f x_ma_c_i_óiL de urea corresponden a los altos niveles esperados de desaminación y despeje de -amon 1 aee-, f-ua-cixxfue-S ob j etivo clínicamente deseadas. Entre más alta sea la tasa de ureagénesis, mayor será el nivel deseado de desaminación. Se midió el metabolismo de diazepam para cultivos de hepatocitos en dispositivos perf usionados durante 24 horas con medio de cultivo de base complementado con 25 µ?/p?? de esta droga (D-889; Sigma Chemical, St. Louis, MO) , solubilizado en DMSO a 10 mg/ml, y albúmina de suero bovino al 1% (BSA) . El diazepam es el nombre genérico para el Valium de be n z odi a z epi na . Como una molécula relativamente apolar, el diazepam se despeja más eficazmente por el sistema renal después de dos fases de transformación a moléculas más polares. La desalquilación e hidroxilación son procesos de Fase I catalizados por isozimas de la familia de monooxigenasas de función mixta de citocromas P450; por ejemplo, la isozima 2C19 desalquila el diazepam a nordiazepam o temazepam a oxazepam, y la isozima 3A4 hidroxila el diazepam a temazepam o nordiazepam a oxazepam. La conjugación es un pxü££fl.Q d_e_ Ja_se_ ? medí ado por un conjunto separado de enzimas que dan como resultado una unión—eovalcnta— e narhnhidratos o sulfatos a lipofilos . El diazepam y sus metabolitos conjugados y no conjugados fueron detectados y las concentraciones fueron medidas utilizando HPLC de fase inversa. Estas mediciones requirieron el uso de tubería en el circuito de perfusión hecho por Viton® el cual, junto con la BSA, minimizaron la absorción no específica de diazepam y los metabolitos a fin de permitir una recuperación substancialmente al 100%. Las muestras de medio tratado con hepatocitos fueron tratadas primeramente con 100 µg de lucuronidasa/sulfatasa (S-9751, Sigma) durante 3 horas a 37°C. Este tratamiento permitió la detección de metabolitos glucorinidados o sulfatados durante la destoxif icación de Fase II. Después, se agregaron 400 µ? de medio tratado con hepatocitos y de medio tratado con glucuronidasa , tratado con hepatocitos, a 600 µ? de metanol en tubos centrífugos de 1.5 mi, mezclados, y girados a 7200 * g durante 30 minutos a 4°C. Las muestras centrifugadas se c-aLocajioja _d_ej3pjjés_ en frascos de un automuestreador para cargar muestras -jrfÍ-á -vi du a 1 e s —&a —un_a col nmna C18 (uBondapak, 3.9* 300 mra; Waters Corp., Milford, MA ) . La HPLC de fase inversa se llevó a cabo eludiendo diazepam y sus metabolitos en una fase móvil de metanol al 60% y 0.03 M de fosfato de potasio (pH de 4.5) al 40% a una tasa de flujo de 1.5 ml/minuto. La elución se midió por absorbencia óptica a 240 nm con un sistema de HPLC Coulter Beckman (automuestreador System Gold® modelo 508, detector de modelo 168, módulo de solventes modelo 126) . Las muestras fueron analizadas con el software System Gold® 32 KaratTM. Se construyeron las curvas convencionales para el diazepam y cada metabolito utilizando las normas de referencia (Sigma) preparadas en medio al 40% y metanol al 50% y se manejaron de manera similar a las muestras de medio tratado con células. Las curvas convencionales oscilaron de 2 a 74 µg/ml con limites inferiores de cuanti f icación de 4 pg/ml. Las recuperaciones con extracción utilizando metanol promediaron 82% con coeficientes de variaciones menores al 20%. En general, este método proporcionó una __te_c_ujoexa ciqjn superior en comparación a los métodos existentes. expresaron como una cantidad total de metabolitos producidos por células pe r f u s i onada s sembradas por día al multiplicar las concentraciones por volumen de perfusato y dividir por el número de células sembradas. Los grados de conjugación se expresaron como la proporción de la concentración total de metabolitos conjugados a la concentración total de metabolitos. En esta prueba las proporciones altas de formación de metabolitos reflejan altas actividades para isozimas de Fase I, y grados altos de conjugación reflejan altas actividades para las enzimas de Fase II. Se midió la lactogénesis utilizando el juego#73510 de Sigma (St. Louis, MO) para cultivos de hepatocitos en dispositivos per fusionados sea durante 18 o 24 horas con medio de cultivo de base. Este juego contiene un agente reactivo tanto con una oxidasa que convierte lactato en piruvato y H2C>2 como una peroxidasa que cataliza la producción de un producto colorimétr ico en presencia de peróxido. Los_ tr i _l^i c_a_do_s_ para_muestra s de 10 µ? derivados de cada dispositivo se incubaron con 100 µ? de agente reac tivo de juego en cavidades individuales de una microplaca de 96 cavidades durante 10 minutos. La absorbencia óptica a 540 nm se midió después con un lector de microplacas SPECTRAmax® 250. Las concentraciones se determinaron con base en una curva convencional para 0.05-5 mM . Las tasas de lactogénesis se expresaron como una cantidad de lactato producido por célula perfusionada sembrada por dia al multiplicar las concentraciones por volumen de perfusato y al dividir por el número de células sembradas. En esta prueba, tasas similares de formación de lactato corresponden a cultivos con estados fisiológicos similares. Se midieron las concentraciones de LDH y AST en medio proveniente de cultivos de hepatocitos en dispositivos pe r f u s i onado s con medio de cultivo de base y de amoniaco y glucosa provenientes de cultivos pe r f u s ionados con plasma porcino a partir de muestras de 10 µ? utilizando un Sistema de Química DT60 II Vitroso (Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, NJ) . Las tasas de acumulación de LDH y AST se expresaron como cantidades de LDH y AST liberadas por célula perfusionada sembrada por día al perfusato y dividendo por el número de células sembradas. Tasas similares de acumulación de LDH o AST en el medio corresponden a cultivos con grados similares de muerte celular. Las tasas de secreción de glucosa se expresaron como la cantidad de glucosa segregada por célula perfusionada sembrada por día multiplicando concentraciones por volumen de perfusato y dividiendo por el número de células sembradas. Las concentraciones decrecientes de amoníaco en el plasma y las concentraciones crecientes de glucosa en el medio y el plasma (definidas "gluconeogénesis") después del tratamiento por hepatocitos reflejan la funcionalidad creciente clínicamente relevante de estas células.

Ejemplo 7: Comparación de Rendimiento entre Cámara s de Cultivo Celular Anteriormente Descritas y la Nueva Cámara Cerrada de Cultivo Celular con Volumen Ajustable El rendimiento de hepatocitos perf usionados en el aparato del Ejemplo 3 se — -cjamp ri-. _ ?? el rendimiento de lo_s_ hepatocitos cultivados en dos sistemas más pequeños -d^s- iHr--e-s—e-«—J-a—B-u_hJJ-cac i ón de Solicit u d de PCT Internacional No. WO 00/78932. En cada uno de estos sistemas, definidos en lo sucesivo dispositivos "pequeño", "mediano", y "grande", se cargaron los hepatocitos a densidades similares en películas de poliestireno permeables al gas, impermeables a líquidos, (Polyflex) , cultivadas estadísticamente durante un día con volúmenes equivalentes de medio por célula cargada, y pe r f u s i onada s en reciclaje completo durante un día con volúmenes equivalentes de medio por célula cargada y a tensiones por cizallamiento equivalentes (calculadas con base en la altura y ancho de la cámara y la tasa de flujo de perfusato) . Los dispositivos pequeño y mediano fueron cámaras de cultivo celular en las cuales las células fueron sembradas al gotear ve ticalmente las suspensiones desde una punta de pipeta sobre la superficie de cultivo, cultivadas estadísticamente con una cubierta floja y eliminable, el medio para sembrar células se eliminó por la aspiración después de _ a eJLimijnaci QÜ completa de la cubierta, y una tapa y tubería instaladas subsecuentemente para ¦c-rea-r—«na—cámar —c-e-r-r-a-d-a—ar perfusión . Estas operaciones, con excepción del cultivo estático, se realizaron con un BSC para proporcionar un ambiente estéril para el procedimiento aséptico. En comparación, el dispositivo grande presentó las propiedades de la invención de la cámara cerrada con volumen ajustable, en particular sembrando por perfusión en una cámara cerrada, la aspiración del medio para sembrar células sin comprometer las paredes de la cámara, y una cámara cerrada para perfusión creada al reducir el volumen de la cámara sin comprometer la esterilidad. Aunque no se utilizó un soldador 15 de tubería para realizar conexiones asépticas para estos estudios, solamente las operaciones de aspiración y conexión de tubería a la cámara cerrada requirieron el uso de un BSC. El tamaño y las propiedades operativas 20 para los dispositivos pequeño, mediano, y grande consistentes de cámaras de cultivo individuales se describen en la Tabla 1. Los sistemas para los dispositivos pequeño y mediano son de aproximadamente l/40avo y l/8vo, -45- --r-aspejc£±v_a.m.eniej del tamaño del aparato del Ejemplo 3, aunque los volúmenes de las cámaras -p&r s-e durante La perfusión para los dispositivos pequeño y mediano son de aproximadamente l/16avo y l/12avo los volúmenes del aparato del Ejemplo 2 y la tasa de flujo volumétrico para perfusión difiere entre los diferentes tamaños. Sin embargo, el ascenso de rendimiento de cultivos celulares con base en principios para diseño de reactores requiere acoplar la densidad de células cultivadas, el volumen del medio perfusionado por célula, y las fuerzas mecánicas experimentadas (es decir, tensiones por ci zallamiento hidrodinámicas) entre sistemas de diferentes tamaños y no volumen de la cámara de tasa de flujo per se. La función y estado de un cultivo depende de la densidad de células en el cultivo, y el agotamiento y acumulación de compuestos en un cultivo, lo cual a su vez afecta la función y estado del cultivo, depende del volumen de medio disponible por célula. En último lugar, la función y estado de un cultivo pueden verse afectados por tensión por ci zallamiento . Consecuentemente, las tasas por célula de ureaqénesis , metabolismo de diazepam, gluconeogéne s i s , 1 actogéne s i s , y liberación de JíA iax para los di s posjJ:_iy_os de tamaños diferentes sembrados en densidades equivalentes y suministraron volúmenes equivalentes de medio por célula. La Tabla 2 muestra que tal acoplamiento se alcanzó entre nuestros sistemas. Tabla 1 Clasificación por Tamaños y Propiedades Operativas para Cultivo Prefundido de Hepatocitos Propiedad Tipo de Dispositivo* Reí. de Propiedad Pequeño Mediano Grande { Grande } { Grande ; { Medi . } { Peq . } Area ( cm ) 23 104 928 .9 40.4 Número de células 2.0*107 1.0*108 8.2*10* 8.2 41.1 cultivadas Volumen de 2.8 2.2 35 15.9 12.5 cámara (mi) Volumen de perfusato para 15 75 600 .0 40.0 estudios 24hr (mi) Volumen de perfusato para 10 50 380 7.6 38.0 estudios 18hr (mi) Tasa de flujo de 1.5 0.7 10 14.3 6.7 perfusato (ml/min) *Tamaños basados en una sola cámara por dispositivo Tabla 2 Propiedades Escaladas de Dispositivos para Cultivo Perfusionado de Hepatocitos Propiedad Tipo de Dispositivo* Tasa de Propiedad Pequeño Mediano Grande {Grande} {Grande} {Medí . } { Pe . } Dens idad celular 8.7*105 9.6*105 8.1*105 0.84 0.93 ( cé lulas /cm2 ) Volumen de perfusionado por célula 0.67 0.67 0.67 1.00 1.00 para estudios de 24 hr (nl/célula) perfusionado para estudios 0.50 0.50 0.50 1.00 1.00 de 18hr (ml/célula) Tensión por ci za 11 arai ent o nominal en 1.29 1.33 1.60 1.20 1.24 cámara (dinas/cm2) Habiéndose establecido condiciones operativas favorables para el ascenso entre los tres dispositivos diferentemente dimens ionados , evaluamos el rendimiento metabólico y el estado -d& en 1 t i vo de _los he _aj: ci tos cultivados en estos dispositivos y funciones y propiedades coroporT-a-d-a-s s-ote÷e ma base por célula. La ureagénesis, metabolismo de diazepam, gluconeogéne s i s , lactogéne s i s , y liberación de LDH y AST fueron determinadas como se describe en el Ejemplo 6. Para los estudios en los cuales se perfusionaron los cultivos durante 24 horas, se utilizaron grandes dispositivos que consisten en cámaras individuales 10, como se describe en el Ejemplo 4; para estudios en los cuales se perfusionaron cultivos durante 18 horas, se utilizaron dispositivos grandes, que consisten en 10 cámaras individuales 10 en múltiple en paralela, como se describe en el E j emp lo 5. La Tabla 3 muestra que las operaciones especificas de hepatocitos de ureagénesis y metabolismo de diazepam fueron similares sobre una base por célula entre los tres diferentes tamaños para dispositivos perf usionados con un medio de cultivo de base estimulado con amoniaco y diazepam durante 24 horas. Además, la acumulación de lactato y LDH en el medio fue menor, sobre una bases por célula, en la cámara ¦ ceitada. CQJOL _un volumen a ustable 10 que en dispositivos más pequeños. Se espera ureagénesis y desaminación in vivo, y una liberación decreciente de LDH refleja hepatocitos más saludables. La lactogénesis decreciente in vitro debe correlacionarse con acidosis decreciente bajo fallas hepáticas. Estos resultados soportan el ascenso de función in vitro en la nueva invención, con una mejora en soporte de algunas funciones de hepatocitos en comparación con células cultivadas en aparatos que requieren un manejo adicional para la conversión de la configuración de siembra a configuración de perfusión Escalamiento de la Función de Hepatocitos In Vitro con Tamaño de Dispositivo: Cultivos Perfundidos durante 24 Horas Propiedad Tipo de Dispositivo Tasa de Propiedad Pequeño Mediano Grande {Grande} {Grande} { edí . } { Peq . } üreagénesis ( 65.3+ 77.8± 1.19+ 1.53 + pg/célula- 50.9±3.7 15.4 9.5 0.32 0.22 día) Tasa de me t abo 1 i smo 48 + 23± 5.11± 1.21± 79± de diazepam .21 .66 0.18 0.19 .04 (pg/célula- día) Grado de conjugación 74.4 + 70.3± 79.9± 1.14± 1.07 + de diazepam 8.2 37.9 8.6 0.62 0.17 (%) Lactogénesis 0.52 + 0.561 0.23 + 0.41 + 0. 4 + (pinoles /célu 0.04 0.06 0.11 0.20 0.21 la-dia ) LDH liberada 0.15± 0.16 + 0.06 + 0.36± 0.42 + (pU/célula- 0.01 0.01 0.03 0.20 0.23 dia) *Los datos para üreagénesis, lactogénesis, consumo de glucosa, y LDH liberada son promedios de tres aislamientos (1137L, 1138L, y 1141L) ; datos para metabolismo de diazepam provenientes de un solo aislamiento (1141L) .

Tabla 4 muestra que la üreagénesis >r_e una base_ por células entre los dispositivos individuales a pequeña escala Tc"e~f~eTre-rrci¦attcs-—&f¾-fe-e÷ ^ aej t-e y. medio de cultivo de base no estimulado durante 18 horas y conjuntos de 10 cámaras cerradas 10 en configuración de perfusión en múltiple conjuntamente en paralelo y per fusionados como se describe en el Ejemplo 5. Además, las tasas por células de lactogénesis y liberación de las enzimas LDH y AST en el perfusato fueron similares entre las dos escalas de sistemas. Para estos estudios se examinaron también el impacto de utilizar un recubrimiento de colágeno, como se describe en el Ejemplo 2, en el rendimiento resultante de los sistemas. No se observó ninguna diferencia grande entre las cámaras recubiertas o no recubiertas con colágeno. Estos resultados soportan además el ascenso de función in vitro en la nueva invención asi como también el ascenso con el número de cámaras en el sistema, que soporta el concepto de modularidad, y la independencia de función celular al pre-recubrir la película 320 con colágeno. datos para superficies de cultivo celular recubiertas con colágeno derivadas de un solo aislamiento (1151L) .

Ejemplo 8: Tratamiento de Plasma con Cámara Cerrada de Cultivo Celular con Volumen Ajustable EJ. apa_rat_o _d_ej^ EJl emplo 4 se perfusionó con HS al 100% durante tres horas y el despeje áre—amo n í a c —y—e^L u-e 4ve-o-g-é^i-e-s_L= s_e examinó como se describe en el Ejemplo 6. La concentración de amoníaco descendió desde una concentración 5 inicial de 564 µ? hasta 468±28 µ? durante el periodo de seis horas, mientras que la concentración de glucosa se incrementó de 53 mg/dl a 56±0 mg/dl. Estos resultados demuestran la capacidad de hepatocitos 130 cultivados en 10 cámaras cerradas con volumen ajustable para tratar el plasma de animales.

Ejemplo 9: Cámara Cerrada con Volumen Ajustable y Mantenimiento de Carga Mínima Definida en 15 Junta de Estanqueidad - Ensamble, Siembra con Células, Reducción en Volumen, y Perfusión Una modificación del aparato descrito en los Ejemplos 2 y 3 se desarrolló para disminuir el tiempo de manejo durante el proceso 20 para reducir el volumen y mejorar el diseño de la cámara utilizando pernos activados por resorte a fin de proporcionar continuamente una fuerza adecuada para la compresión de la junta de estanqueidad mediante la reducción en el — 2-5 p^ec so de voJL ume n_. Para a j_u s tar e 1 olumen para la configuración de siembra, 20 tornillos -2-2-Q—d-e—c- fe-e-z-a-^e^a onal de _a ero inoxidable 18-8 5/16"-18 V de largo, denotados en lo sucesivo como "pernos de montaje vertical" y maquinados a un largo definido fueron sujetados en la placa superior 30 a fin de crear un compar imiento 20 de 0.060" profundidad (1.52 mm) cuando se apoyaron fuera del ensamble marco-película 330 preparado de acuerdo con el Ejemplo 1. Dos conjuntos de orificios 221 de 6 " (15.9 cm) de diámetro, 0.825" (2.1 cm) dentro desde cada extremo a lo largo del eje largo de la placa, y dos conjuntos de orificios 221 de 4 W (10.8 cm) de diámetro, 0.34" (8.6 mm) dentro desde el extremo a lo largo del eje corto de la placa, se roscaron con 5/16" (0.79 cm) - 18 vueltas a fin de habilitar la sujeción de los pernos 220 de montaje vertical. La placa superior 30 y el ensamble marco-película 330 se ensamblaron utilizando tornillos 230 de cabeza hexagonal 321/4"- 28 1 ¾"de largo 18-8 de acero inoxidable, cuando se pasaron por las placas, se activaron cada uno de ellos con un resorte 200 (con una constante de r-es*tte de 119- 7 1b¿/ i n ) intere ala do ent re dos arandelas 190 de acero inoxidable 18-8 de V de - íame Li u—(-6÷ —mm-)—y—S-T—a-s-e-g-u r a r op con una tuerca 210. Se suministró la cantidad de fuerza necesaria para comprimir uniformemente la junta de estanqueidad 50 a fin de asegurar un sello hermético contra líquidos apretando la tuerca de manera tal que la altura del resorte cambió de una altura libre de 0.75" (19 mm) a una altura comprimida de 0.545" (13.8 mm) . De otra manera, la cámara 10 se ensambló y sembró como se describe en el Ejemplo 3, con la sustitución de los pernos 220 de montaje vertical para las cuñas exteriores 60 y los tornillos 230 activados por resorte para los sujetadores Southco®. Los pernos de montaje vertical y los torillos activados por resorte alternados en un patrón que proporcionó la cantidad de fuerza necesaria para comprimir uniformemente la junta de estanqueidad así como también el número de pernos de montaje vertical necesarios para crear un volumen uniforme para el compartimiento 20 con la mínima inclinación de placa. Para reconfigurar la cámara 10 en su configuración de perfusión, la cámara sembrada -&?? célillas con pernos, activados por resorte en configuración de siembra se conectó con el circuito La per u ión descrita en el Ejemplo 4. Los pernos 220 de montaje vertical se aflojaron H vuelta utilizando una llave de cabeza hexagonal, eliminando su característica de "montaje vertical" del ensamble. A medida que los resortes 200 continuaron comprimiendo la junta de estanqueidad 50, la placa superior 30 y el ensamble marco-película 330 se apoyaron lentamente fuera de la cuña interior 180 substancialmente incompr imibl e 0.005" (0.13 mm) anteriormente descrita en el Ejemplo 2, reduciendo el volumen del compartimiento y ocasionando que el fluido al interior de la cámara salga de los múltiples de entrada y salida de perfusión. La cámara se perfusionó después como se describe en el Ejemplo 4.

Otras modalidades Debe comprenderse que aunque la invención se ha descrito en conjunto con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invención, la cual se deJLLo_e__p_or_ el alcance de las reivindicaciones anexas. Otros aspectos, ventajas, y mnrti f i P. a r. i ones se encuentran de ntro del al canee de las siguientes reivindicaciones.

Claims (1)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la invención como antecedente , se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : RE IVIND ICACIONES 1. Un aparato con una cámara cerrada con volumen ajustable para cultivar células, caracterizado el aparato porque comprende: un compartimiento formado entre las placas superior e inferior separadas por una junta de estanqueidad; una superficie interior en la placa inferior para cultivar células ; un medio para cambiar el volumen del compartimiento al cambiar la distancia entre las placas superior e inferior aunque la junta de estanqueidad mantiene un sello estéril y hermético contra líquidos. 2. El aparato según la reivindicación 1, caracterizado porque el medio para cambiar el volumen del compa timiento al cambiar la distancia entre las placas superior e inferior se selecciona a partir del grupo que consiste en: un espaciador incompr imible , un perno activado por resorte, un sujetador cautivo, un sujetador de cuarto de vuelta, y un pe rn o ros cado . 3. El aparato según la reivindicación 1, caracterizado porque las placas son planas y rígidas . 4. El aparato según la reivindicación 1, caracterizado porque el aparato es un dispositivo de ayuda al hígado. 5. El aparato según la reivindicación 1, caracterizado porque el aparato se encuentra incorporado a un dispositivo de ayuda al hígado. 6. Un método para cultivar células en una cámara cerrada con volumen ajustable, caracterizado el método porque comprende: proporcionar un compartimiento formado entre las placas superior e inferior separadas por una junta de están queidad; cultivar las células sobre la superficie interior de la placa inferior; contactar las células con un líquido biológico; y cambiar el volumen del compartimiento al cambiar el hueco entre las placas superior e inferior mientras la junta de estanqueidad mantiene un sello estéril y hermético contra líquidos. 7. El método según la rei indicación 6, caracterizado porque el volumen del compartimiento se cambia al cambiar la distancia entre las placas superior e inferior ajustada por un espaciador incompr imible . 8. El método según la reivindicación 6, caracterizado porque las placas son planas y rígidas . 9. El método según la reivindicación 6, caracterizado porque las células se introducen en el compartimiento por perfusión al compartimiento . 10. Un método para cultivar células utilizando el aparato según la reivindicación 1. 11. Un método para tratar un paciente utilizando el aparato según la reivindicación

1. RESUMEN La invención presenta cámaras modulares para cultivar células en las cuales el volumen de una cámara puede ajustarse sin comprometer el sello o esterilidad de la cámara. La invención se basa en el principio de que el volumen de una cámara formada entre dos placas que emparedan una junta de estanqueidad comprimible y un tope substancialmente no comprimible pueden ajustarse utilizando una junta de estanqueidad que forma un sello hermético contra fluidos entre las placas en una pluralidad de niveles de compresión. La invención permite que el cultivo de células entre placas substancialmente paralelas y rígidas en el cual pueda utilizarse un volumen relativamente grande para sembrar las células y reducirse el volumen de retención por perfusión sin abrir o de otra manera desensamblar el sistema para comprometer su esterilidad y hermeticidad contra líquidos. La nueva cámara cerrada de cultivo celular, modular y escalable puede per fus ionarse así y utilizarse para cultivar células (por ejemplo, hepatocitos) con altos niveles de función celular en sistemas de ayuda a órganos (por ejemplo, el hígado) , para la producc ión de cél ulas, para la producción de productos derivados de células, tales como proteínas o virus, o para sistemas a fin de tratar líquidos biológicos para eliminar toxinas, tales como amoníaco, agregar productos sintetizados celulares, o ambos.