MXPA04002658A - Analisis molecular dirigido por luz para pronostico y diagnostico de cancer. - Google Patents

Abstract

La ubicacion en donde las muestras de tejido se obtienen para determinar si las celulas exhiben caracteristicas asociadas con diferenciacion celular o cancer por analisis molecular se determina iluminando un area anatomica macroscopica de tejido con una luz que distingue celectivamente tejido canceroso o pre-canceroso a partir del tejido normal.

Description

ANÁLISIS MOLECULAR DIRIGIDO POR LUZ PARA PRONÓSTICO Y DIAGNÓSTICO DE CÁNCER Esta invención se relaciona a un método combinado para la ubicación y pronóstico tempranos de tej idos que contienen potencialmente células cancerígenas invasivas, antes de la apariencia visual normal del tejido que indica el desarrollo potencial de cáncer invasivo, retrasando un diagnóstico de tal tejido como pre-canceroso o canceroso por ubicación convencional, excisión y procedimientos histológicos . En otro aspecto, la invención se relaciona a un método combinado para la ubicación y detección de tejido que contiene tales células cancerígenas potencialmente invasivas, la apariencia visual normal de la cual es anómala, la cual puede conducir al retraso para obtener un diagnóstico que indique tratamiento.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los pacientes quienes se demoran en obtener una consulta para cáncer por al menos dos meses tienen riesgos significativamente más elevados de muerte que los pacientes con un retraso más corto. (Véase Cáncer, 92 [11] : 2885-2891 , 2001) . De esta manera, si los pacientes se someten más regularmente a una selección de cáncer, acoplado con un procedimiento definitivo para realizar un pronóstico o diagnóstico temprano, los riesgos de proporción de mortalidad de cáncer se reducirían. Por consiguiente, se proporcionan métodos de pronóstico y diagnóstico para predicción temprana de desarrollo eventual de cáncer invasivo o para diagnóstico definitivo, los cuales son gradualmente, rápido, conclusivo, y fácilmente adaptable como un protocolo clínico.

Desarrollo de Tejido Pre-Canceroso y Canceroso: El desarrollo de tumores requiere dos acontecimientos mutacionales separados. Uno de estos acontecimientos puede ocurrir en la línea germinal y puede heredarse. El segundo ocurre entonces somáticamente. Alternativamente, los dos acontecimientos mutacionales pueden ocurrir únicamente en la célula somática de un individuo.

Procedimientos de Selección de Cáncer Selección de Cáncer Visual Convencional Las mutaciones celulares que son normalmente visibles se documentan bien y pueden implicar espesor, decoloración, lunares atípicos, o endurecimiento. Se conocen varios tejidos que caracterizan la diferenciación temprana de melanomas a partir del lunar melanocítico benigno por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo: Característica Lunar Benigno Melanoma Asimetría No Sí Integridad Límite No Sí Color Uniforme, Abigarrado, negro canela/café Diámetro <6 mm Puede ser >6 mm Sin embargo, estas características normalmente visibles y sus características no pueden ser aparentes hasta que el tejido implicado avanza en la trayectoria de progresión normal de cáncer. Consecuentemente, fue necesario un método de selección simple, rápido y relativamente exacto para permitir al médico ubicar tejido sospechoso antes de que aparezcan características normalmente visibles de tejido canceroso o pre-canceroso .

Procedimientos de Selección de Cáncer In vivo para Ubicación Temprana de Tejido Potencialmente Canceroso Se han desarrollado técnicas de selección in vivo para identificar rápida y no invasivamente ubicaciones anatómicas macroscópicas o específicas de un cuerpo del paciente que son probables de contener células con el tumor o fenotipo canceroso en etapas antes de que la observación visual convencional del tejido revelara tal tejido sospechoso. Estas técnicas de selección in vivo para ubicar tales sitios potencialmente cancerosos, particularmente cánceres epiteliales, son rápidas y bastante factibles, aún para el médico clínico general .

Selección Anatómica Macroscópica: Un ejemplo de selección anatómica macroscópica es el análisis de Reacción de Cadena de Polimerasa (PCR) de una simple muestra de saliva. La saliva contiene células exfoliadas que se originan de la región de la cabeza y el cuello — un área de superficie grande -- que es un origen común de células cancerígenas, especialmente en pacientes quienes exponen estas áreas a la nicotina, alcohol y otros carcinógenos conocidos o sospechosos. El análisis de PCR sirve como un procedimiento de selección preeliminar macroscópica, el cual determina si las células exfoliadas encontradas en la saliva del paciente exhiben un fenotipo canceroso, indicando el desarrollo de cáncer dentro de esta área anatómica macroscópica. Por ejemplo, véase Spafford, M.F., et al, "Detection of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Among Exfoliated ucosal Cells by Microsatellite Analysis", Clin, Cáncer Res. 2001, Mar. 7 (3) : 607-612.

Procedimiento de Selección de Cáncer Izi Vivo de Luz Selectiva El tejido que contiene fenotipos de tumor, que pueden indicar el desarrollo eventual de cáncer invasivo, puede identificarse y ubicarse in vivo identificando visualmente las mutaciones o lesiones celulares, utilizando examinaciones de luz in vivo selectivas. Por ejemplo, las Patentes Norteamericanas 5,179,938, y 5,329,938 de Lonky describen utilizan un instrumento endoscópico o espéculo equipado con una fuente de luz quimioluminiscente, para eliminar las desventajas de utilizar fuentes de luz heterocromática concentrada, para examinar y ubicar tejidos sospechosos. La fuente de luz de Lonky irradia en los espectros de luz verde, azul y rojo visibles, con picos espectrales a 450, 550 y 580 nanómetros . Los métodos descritos por Lonky pueden aplicarse a las superficies de las cavidades corporales, tales como tejidos mucosales y así como descargas epiteliales. Las ventajas de utilizar la fuente de luz quimioluminiscente incluye la eliminación de una fuente de luz concentrada que puede provocar al paciente incomodidad, daño celular, reducción de interferencia visual, tal como sombreado, y más importantemente, la coloración selectiva de tejido anormal que lo distingue fácilmente del tejido normal adyacente. Se han descrito soluciones quimioluminiscentes y los procesos para la fabricación de las soluciones y dispositivos por las Patentes Norteamericanas 5,122,306 y 5,194,666.

Pronóstico y Diagnóstico Basados en Análisis Molecular Las mutaciones generalmente resultan de reorganización genética intramolecular, tal como una sustitución, adición o eliminación de un nucleótido, la subunidad de ADN y ARN, respectivamente. Recientemente, sin embargo, la configuración genética ha desarrollado formas para detectar mutaciones de nucleótidos característicos de cáncer y pre-cáncer, tal como los patrones de metilación del ADN y ARN, y actividad enzimática, que es una consecuencia directa de alteraciones de la secuencia de nucleótido o el "código genético" . Se ha determinado también que la actividad cancerosa puede detectarse por cambios en la mitocondria.

I . Mutaciones Genéticas Análisis de ADN El análisis de los polimorfismos de ADN revela una diferencia significativa entre las células normales y las células de tumor; mientras que las células normales son heterozigosas a muchos sitios, los tumores son homozigosos en el mismo sitio (pérdida de heterozigosidad) . Los genes supresores de tumor se asocian con frecuencia con la pérdida de un cromosoma o una parte de un cromosoma, resultando en una reducción a homozigosidad, a través de la eliminación de un alelo de un gen supresor de tumor así como marcadores circundantes. El alelo supresor de tumor restante se inactiva ya sea por una mutación heredada o somática. Algunos ejemplos de genes de supresión de tumor bien documentados incluyen: Poliposis adenomatosos del gen de colon (APC) , genes 1 y 2 de cáncer de ovario/seno familiar (BRCA1 y BRCA2) , gen de Caderina 1 (caderina epitelial o E-caderina) (CDH1) , gen del tipo de neoplasia endocrina múltiple (MEN1) . El gen del tipo 1 de neurofibromatosis (NF1) , gen de subunidad reguladora, alfa, de la proteína cinasa A del tipo 1 (PRKAR1A) , gen de retinoblastoma (RB1) , gen de serina/treonina cinasa 11 (STK11) , y gen del síndrome de von Hipple-Lindau (VHL) . Así, los sitios de cromosoma críticos son predictores del ataque probable de cáncer invasivo . Un ejemplo del análisis de ADN incluye Análisis Microsatélite para determinar mutaciones o la inestabilidad de "brazos cromosomales" o "microsatélites" . Los microsatélites son secuencias repetitivas cortas de ADN que se ha observado que contienen apareamientos erróneos, desalineaciones, o desprendimiento de nucleótido (doblado o acortamiento) . Las mutaciones, tales como estas, se denominan inestabilidad microsatélite y han sido asociadas con un número de cánceres epiteliales . Estudios más recientes han identificados nuevos marcadores microsatélites para detectar pérdida de heterogeneidad, antes de que una célula sufra el cambio morfológico anormal. Véase Guo, Z. , et al, "Allelic Losses in Ora Test-directed Biopsies of Patients wit Prior Upper Aerodigestive Tract Malignancy" , Clinical Canc. Res. Vol. 7, 1963-1968, Julio del 2001. Aquellos expertos en la técnica entienden que estas son diferencias distintas, en el nivel histológico, en el nivel genético y en el nivel anatómico en términos de lado derecho/lado izquierdo, entre tumores con inestabilidad cromosomal e inestabilidad microsatélite . Se sabe también que en leucemias y linfornas, las eliminaciones y traslocaciones intersticiales principales ocurren en el nivel cromosomal macroscópico. En varios tumores epiteliales, tales como los cambios que ocurren de manera diferente, como brazos cromosomales principales se han mostrado para perderse . Los tumores aparentemente progresan bajo una trayectoria o la otra, pero no ambas. (Oncology News International, Vol. 9, No. 8, Suppl, 2, Agu. 2000) análisis MSI requiere generalmente el uso de cinco marcadores MS - dos repeticiones de mononucleotido y tres repeticiones de dinucleótido.

Análisis de ARN Es posible ahora detectar una molécula de ARNm mutante somática en un antecedente de 1000 moléculas de ARNm de tipo silvestre. Esta técnica mide los niveles de expresión genética en muestras que contienen tan pocas como 10-20 células, junto con la capacidad para la detección de mutaciones de punto somático en varios sitios conocidos para alterarse con alta frecuencia. Así, es posible observar microheterogeneidad en los perfiles de expresión genética en pequeños grupos de células en displasia y cáncer. La detección de secuencia se logró en microdisposiciones de oligonucleótido, utilizando una etapa de ligación de ADN de objetivo dirigido acoplada a un sistema de detección unimolecular de Amplificación de Círculo Rodante (RCA) . La etapa de ligación del ADN es adaptable a la detección de los ARNm que contienen mutaciones de punto, Lizardi, P.M., "Messenger RNA Profiling by Single Molecule Counting", Yale University, (2000), http://otir.cancer.gov/tech/imat_awards.html, (Noviembre 28, 2001) .

ADN Telomérico y Proteína Asociativa, Telomerasa Los telómeros son las secuencias de ADN, que son los complejos especializados en las terminaciones de cromosomas. La telomerasa, la ribonucleoproteína que ayuda a mantener los telómeros, es inactiva en muchos tipos de células humanas adultas, pero se activa altamente en la mayoría de los cánceres humanos . Se ha determinado que una interrupción o mutación en cualquiera del ADN telomérico o telomerasa, o el ARN intermediario, puede destapar el telómero, provocando daño adicional al ADN. Así, se sabe que un análisis molecular puede detectar nucleotidos telomericos anormales o actividad enzimática anormal de telomerasa, que se asocian igualmente con la proliferación de células pre-cancerosas . Véase, por ejemplo, Kim, M.M. , et al., "A Low Threshold Level of Expression of Mutant-témplate Telomerasa RNA Inhibits Human Tumor Cell Proliferation" , Proc. Nati. Acad. Sci. USA: Vol . 98, No. 14, 7982-7987, (Julio del 2001).

II. Mutaciones Epigénicas Se descubrió recientemente la metilación promotora aberrante que es una anormalidad molecular fundamental que conduce a la silenciación transcripcional de los genes supresores de tumor, genes que reparan el ADN y genes inhibidores de metástasis, y se enlazan a la predisposición de alteraciones genéticas de otros genes asociados con cáncer. Las alteraciones epigenéticas somáticas en metilación por ADN se enlazan estrechamente al desarrollo, diferenciación celular y transformación neoplástica. Por ejemplo, la hipermetilación de islas CpG en regiones promotoras se ha asociado incrementadamente con la inactivación transcripcional de genes supresores de tumor en carcinogénesis . Aunque las técnicas para medir metilación en segmentos de ADN específicos o en ADN total han estado disponibles, Yamamoto desarrolló un método llamado "Methylation Sensitive-Amplified Fragment Length Polymorphism" (MS-AFLP) para identificar cambios en metilación en el genoma completo. Esta técnica dactiloscópica de ADN imparcial con base en la reacción de cadena de polimerasa (PCR) permite la identificación de los sitios de desdoblamiento que exhiben las alteraciones de metilación de ADN y permiten subsecuentemente el aislamiento de los fragmentos de ADN con estos sitios y sus terminaciones. Las disminuciones o incrementos de intensidad de banda, o diferencias en patrón de banda, se enlazaron específicamente con el fenotipo de tumor. Así, la alteración de metilación proporciona identificación de alteraciones epigenéticas asociadas con la diferenciación celular y cáncer. La mutación de ADN o pérdida de heterogeneidad puede detectarse alternativamente midiendo la metilación de ADN. Véase Yamamoto, F . , Ph.D., "Technology to Detect Genome-wide DNA Methylation Changes" , Burnahm Institute , http : //otir. cáncer .gov/tech/imat_awards .html , (Noviembre 28, 2001) .

III. Mutaciones Mitocondriales Más recientemente, se desarrolló otro método de detección de cáncer, basado en el hallazgo que el ADN mitocondrial (ADNmt) exhibe mutaciones cuando se deriva de células cancerosas humanas .

Existe un estimado de 1000 proteínas diferentes en la mitocondria. Los defectos en tales proteínas pueden caracterizarse como "enfermedades metabólicas" , provocando defectos en los mecanismos de transporte y canales iónicos, más notablemente, defectos en la cadena de transporte de electrones y fosforilación oxidativa. Las mutaciones nucleares pueden afectar la replicación y reparación de ADNmt, transcripción, síntesis de proteína en la matriz, importación de proteína, y otras propiedades de la mitocondria. Véase, por ejemplo, Fliss, et al., "Facile Detection of itochondrial DNA Mutations in Tumors and Bodily Fluids", Science 287, 2017-2019, (2000). En este estudio, se extrajo el ADN a partir de muestras de cerebro derivadas de autopsia de 14 individuos, que varían en edad de 23 a 93 años y se probaron para las tres mutaciones por sujeción de PCR dirigido a PNA. La capacidad para detectar niveles muy bajos de mutaciones de punto en ADNmt por sujeción de PCR dirigida a PNA, permitió el análisis de la presencia o ausencia de por ejemplo A8344G, A3253G y T414G, mutaciones de punto en tejidos a partir de individuos de varias edades. Los casos de cáncer de pulmón correspondieron con las bandas de ADNmt mutantes, que se detectaron utilizando un ensayo de ligación de desigualdad de oligonucleótido sensible y electroforesis en gel . Así, las mutaciones dentro del genoma mitocondrial son aún otro método para detectar actividad cancerosa en células humanas. Véase también Parrella, P., et al., "Detection of Mitochondrial DNA Mutations in Primary Breast Cáncer and Fine-Needle Aspirates", Cáncer Res. 61, 7623-7626, (Octubre del 2001) . Ventajosamente, la expresión cromosomal anormal, asociada con cáncer, puede detectarse con análisis molecular común en etapas muy tempranas de expresión patogénica y con muy pocos números de células afectadas. Sin embargo, dado la extensión del tejido celular del cuerpo humano que podría propagar posiblemente tejido canceroso invasivo, las técnicas de diagnóstico tales como análisis molecular genético, epigenético o mitocondrial no son efectivos en los métodos de detección de cáncer tempranos, debido a que la efectividad de estas técnicas dependen directamente de obtener muestras de tej ido a partir de los sitios de tejido específicos que contienen células que están propagando cáncer. Además, aunque algunos de los métodos de selección de la técnica anterior son capaces de identificar sitios específicos de tejido canceroso o pre-canceroso sospechoso, la ubicación e identificación de tal tejido sospechoso fue, hasta aquí, generalmente seguido por examinación histológica convencional del tejido sospechoso tal como microscopía luminosa. Con frecuencia, tal examinación histológica convencional indica que algunas de las ubicaciones identificadas por técnicas del arte anterior no fueron cancerosas o pre-cancerosas, cuando de hecho, las células de estas ubicaciones exhibieron marcadores para desarrollo eventual de cáncer en esa ubicación, marcadores que podrían haber sido identificados por análisis molecular, es decir, código genético, (ADN o AR ) , patrones epi-genéticos, o ADN mitocondrial (ADNmt) , característica de propagación celular de cáncer. Por ejemplo, la aplicación subsecuente de técnicas de análisis molecular a células derivadas de muestras de tejido sospechoso ubicadas por tinción de tinte mitocondrial - células que se determinaron originalmente por histología convencional para ser "positivos falsos" del protocolo de tinción de tinte Mashberg - revelaron que una proporción elevada de estas células de hecho contenían marcadores que fueron la indicación temprana del desarrollo eventual de cáncer en aquellos sitios sospechosos.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Se ha descubierto ahora un método de pronóstico y diagnóstico mejorado para detectar el crecimiento pre-canceroso y canceroso en tejido humano que combina las ventajas de tecnologías de "selección de ubicación" de luz selectiva de la técnica anterior y/o técnicas de selección anatómica macroscópica, tal como una prueba de saliva, con las tecnologías de pronóstico y diagnóstico precisas de análisis molecular celular. Brevemente, el método comprende varias combinaciones y sub-combinaciones de hasta tres etapas: (1) conducir una prueba de selección que somete saliva a análisis de reacción de cadena de polimerasa (PCR) para determinar si el cáncer de cabeza o cuello en esta región anatómica macroscópica es probable; (2) iluminar una región anatómica macroscópica con luz para visualización selectiva de la ubicación especifica de tejido sospechoso, para permitir la extracción celular o una biopsia de las células en tal ubicación sospechosa específica; y (3) someter a las células obtenidas a partir de la ubicación sospechosa a análisis molecular, para determinar si las células extraídas exhiben características asociadas con la diferenciación celular o cáncer. De acuerdo a una modalidad de la invención, la examinación de luz selectiva in vivo de una región anatómica macroscópica se conduce para identificar la o las ubicaciones de tejido sospechosas específicas, se combina con el análisis molecular de células a partir del tejido sospechoso así ubicado . Aún otra modalidad de la invención incluye conducir una prueba de selección de saliva para determinar si el paciente puede o ha desarrollado cáncer en la cabeza/cuello, seguida por la examinación de luz selectiva in vivo de la región de cuello y cabeza para ubicar específicamente sitios sospechosos, seguida por el análisis molecular de células a partir de sitios sospechosos específicos para confirmar si el tejido sospechoso específicamente identificado contiene células que exhiben características asociadas con cáncer o el desarrollo eventual de cáncer. De acuerdo a aún otra modalidad de la invención la examinación de luz selectiva de una región anatómica macroscópica se sigue por la aplicación tópica de un tinte de tinción selectiva a la ubicación de tejido sospechosa, para confirmar además que se sospecha o que contiene células cancerosas o pre-cancerosas y proporciona tiempo adicional a la vista del tejido sospechoso, antes de realizar una biopsia para obtener células para análisis molecular.

"Análisis Molecular" Como se utiliza en la presente, el término "análisis molecular" significa un procedimiento para identificar anormalidades celulares que indican cáncer o el desarrollo eventual probable de cáncer. Ilustrativamente, estos procedimientos incluyen aquellos que identifican tales anormalidades en el código genético, es decir, ADN o ARN, en patrones epi-genéticos, o en ADN mitocondrial (ADNmt) , de células sospechosas. Así, aunque innumerables nucleótidos dentro y fuera el núcleo de la célula pueden observarse para detectar mutaciones, el término "análisis molecular" se limita a aquellos procedimientos que determinan si un fenotipo de tumor se presenta en las células sospechosas. Por consiguiente, los nucleótidos objetivo o proteínas asociadas y patrones, así como las diversas otras técnicas de detección conocidas por un experto en la técnica, se consideran dentro del alcance del término "análisis molecular" . Aunque la prueba de selección de saliva, Etapa 1, es específica para detectar únicamente cánceres de cuello y cabeza, las Etapas 2-3 pueden aplicarse a cualesquiera células capaces de inspección visual in vivo, incluyendo tejidos tópicos o internos que pueden observarse dentro de una cavidad interna del cuerpo o células individuales distribuidas dentro del fluido de plasma. Tal combinación de etapas proporciona un protocolo clínico simple que puede identificar las ubicaciones de sitios precancerosos, así como sitios sospechosos, bien antes del ataque de indicios de otra manera visibles.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Este método comprende examinar secuencialmente células para ubicar primero e identificar tejido que tiene células sospechosas y luego examinar células a partir de tal tejido sospechoso para detectar la presencia de fenotipo de tumor o canceroso. Los fenotipos de tumor incluyen cualquier mutación, por ejemplo, pérdida alélica, pérdida de heterogeneidad, genes supresores de mutación o de tumor, metilación de ADN anormal, o ADNmt anormal, asociada con cáncer. Se proporciona la siguiente descripción detallada de estas etapas secuenciales para permitir a aquellos expertos en la técnica practicar la invención e indicar las modalidades actualmente preferidas de la misma. Esta descripción no se entenderá como limitante del alcance de la invención, que se limita únicamente por las reivindicaciones anexas .

Etapa 1: Selección de Saliva para Cáncer de Cuello y Cabeza Las muestras de saliva pueden recolectarse en un cierto número de formas. Es más importante que el aparato de recolección cumpla con los requerimientos del análisis de reacción de cadena de polimerasa (PCR) y que la integridad de los ácidos nucleicos no se destruya antes del análisis. El análisis de PCR detecta un incremento o disminución en secuencias repetitivas cortas, llamadas ADN microsatélite . El ADN microsatélite corresponde a un alelo debido a su ubicación en el ADN. Las mutaciones en ADN microsatélite se encuentra que son más comunes en los fenotipos de cáncer epitelial, y así es un análisis particularmente apropiado de células exfoliadas encontradas en la saliva. Se proporciona una descripción completa de este análisis por la Patente Norteamericana Número 6,291,163, de Sidransky, incorporada en la presente para referencia. El análisis de PCR ha llegado a ser algo automatizado, como se describió en la Patente Norteamericana Número 6,326,147, incorporada en la presente para referencia. El PCR se considera un método para amplificación de ácido nucleico que permite la secuenciación de ADN y ARN con una cantidad diminuta de secuencia de ácido nucleico. Dos Patentes Norteamericanas, 5,981,293 y 6,241,689 describen un aparato adecuado para recolectar muestras de saliva. Aún cuando un paciente pueda encontrarse que exhibe positivamente señales de un fenotipo canceroso en la selección de saliva, la ubicación de las células cancerígenas debe entonces identificarse antes de que el pronóstico y tratamiento apropiado puedan efectuarse. Alternativamente, aún cuando la selección de la saliva del paciente resulte en negativo, no significa indicaciones de cáncer, el paciente debe experimentar una examinación visual completa (descrita en la Etapa 2: Ubicación de Tinción Celular) para tipos de cáncer comunes y recurrentes .

Etapa 2 : Ubicación por Examinación de Luz Selectiva La Etapa 2 permite a un médico ubicar y seleccionar precisamente células sospechosas in vivo, por análisis molecular final, proporcionan al médico una visión del sitio sospechoso, permitiendo al médico seleccionar tejidos sospechosos de tejido normal circundante para dirigir el procedimiento de biopsia para obtener células para análisis molecular, Etapa 3. Otra modalidad de la invención emplea el Protocolo Mashberg in vivo o protocolos de ubicación selectiva de tinción de tinte similar como un adjunto adicional a la etapa de ubicación de luz selectiva, inicial. Estos protocolos de tinción de tinte selectivos se emplean ventajosamente para dar al médico una vista más sostenida del tejido circundante y sospechoso, por lo que facilita el procedimiento de biopsi . El protocolo de tinción de tinte Mashberg se describe en detalle en la Patente Norteamericana 6,086,852. El protocolo emplea tinte azul O de toluidina (TBO) para teñir selectivamente tejido canceroso y pre-canceroso. Esta prueba de selección de diagnóstico original se describió en la Patente Norteamericana 4,321,251 a Mashberg y en la Patente Norteamericana 5,372,801 de Tucci et al, incorporadas en la presente para referencia. Otros tintes catiónicos, por ejemplo, Azure B, Azure G y Azul de Cresilo Brillante, se han identificado como útiles marcando selectivamente células cancerosas y pre-cancerosas . Véase, por ejemplo, la Patente Norteamericana 5,882,672, de Pomerantz, incorporada en la presente para referencia. Después de que se realiza la etapa de tinción de tinte, se realiza la biopsia de excisión quirúrgica del tejido sospechoso y un análisis molecular subscuente, en la presente descrito en la "Etapa 3: Diagnóstico-Pronóstico de Análisis Molecular" , sigue para producir un pronóstico/diagnóstico de cáncer o desarrollo eventual de cáncer, si el análisis molecular determina que las células del tejido anormal son malignas o pre-cancerosas.

Etapa 3 : Pronóstico-Diagnóstico de Análisis Molecular Las muestras celulares para análisis molecular se derivan de una variedad de técnicas de biopsia, que en términos generales, implican la remoción de una pequeña pieza de tejido sospechoso para análisis molecular. El método de remoción o extracción de tejido varia con los diversos tipos de biopsias. Por ejemplo, la muestra de biopsia puede comprender porciones o lesiones de piel o células sanguíneas aisladas, por ejemplo, eritrocitos, leucocitos y linfocitos, tejido paratiroide ; tejido de glándula salival; tejido mucosal nasal, tejido orofaringe, tejido de pulmón abierto, tejidos de intestino delgado, etc. El análisis molecular se realiza entonces para confirmar si la muestra de biopsia del tejido sospechoso es cancerosa o pre-cancerosa. El objetivo del análisis celular, es decir, ADN, ARNm, metilación de ADN, actividad de telomerasa, o análisis de ADNmt se selecciona con base en el acceso a la instrumentación, los analistas calificados o la naturaleza de la muestra celular. El análisis molecular de la muestra celular vincula una elección entre varios procedimientos . La electroforesis en gel, la química con base en la reacción de cadena de polimerasa (PCR) -, sistema de detección unimolecular de Amplificación de Círculo Rodante (RCA) , etiquetado fluorescente, tinción inmunohistoquímica, espectroscopia de masa, y colorimetría son ejemplos representativos de procedimientos de análisis molecular efectivos . La naturaleza de la muestra celular, la extracción, y digestión del ácido nucleico influenciará la elección del procedimiento del análisis molecular específico para el análisis óptimo. En la modalidad actualmente preferida de la invención, el procedimiento de análisis molecular empleado es el procedimiento para identificar marcadores microsatélite, es decir, secuencias repetitivas del ADN, a través del análisis de PCR. Se debe entender, sin embargo, que el método de la invención puede incluir cualquier técnica de análisis molecular confiable para determinar si los constituyentes celulares exhiben un fenotipo canceroso o de tipo silvestre. I . Reacción de Cadena de Polimerasa (PCR) , comúnmente la Prueba de Inestabilidad Microsatélite (MSI) MSI se identifica por resolución electroforética de secuencias de ADN raicrosatélite amplificadas. Para realizar la prueba de MSI, los bloques del tejido de tumor quirúrgicamente re-secados ya sea un espécimen recientemente congelado o una formalina fija, se obtiene un espécimen embebido en parafina. El tejido de tumor se micro-disecta para separar el tejido neoplástico a partir del tejido normal, y el ADN se extrae a partir de ambos. Las muestras del ADN genómico a partir de estas muestras se amplifican para un panel de sitio microsatélite mono- y di-nucleótido específico utilizando PCR. Los productos de PCR se analizan entonces por electroforesis . Las bandas adicionales en los productos de PCR del ADN de tumor no se observan en el ADN normal que se clasifica como inestabilidad en ese sitio (o sitio específico) . De acuerdo a los estándares de la industria, los análisis de MSI requieren el uso de cinco marcadores MS, dos repeticiones de mononucleótido y tres repeticiones de di-nucleótido. De acuerdo a la declaración de consenso del Instituto Nacional de Cáncer en la prueba de MSI , cualquier par de muestras que despliega inestabilidad a dos o más de cinco diferentes sitios se clasifica como MSI elevado. Para detalles, véase Guo, Z., yamaguchi, K. , Sánchez-Céspedes, M., Westra, W.H. Koch, .M., Sidransky, D., "Allelic Losses in OraTest-directed Biopsies of Patients with Prior Upper Aerodigestive Tract Malignancy", Clinical Cáncer Res., 7:1963-1968, 2001. Se describe un detalle adicional para permitir a alguien experto en la técnica para realizar el análisis microsatélite en la Patente Norteamericana 6,291,163, de Sidransky, incorporada en la presente para referencia. El análisis de PCR automatizado se describe en la Patente Norteamericana Número 6,326,147, incorporada en la presente para referencia. II . Electroforesis en Gel Las hebras de ácido nucleico se digieren primero selectivamente y luego se someten a electroforesis en donde las moléculas (como proteínas y ácidos nucleicos) migran a través de un gel (por ejemplo, un gel de poliacrilamida) y se separan en bandas de acuerdo a un tamaño. III. RCA La amplificación de círculo rodante (RCA) es una reacción de replicación de ADN anclada a superficie que puede desplegar acontecimientos de reconocimiento molecular únicos . La RCA visualiza exitosamente las secuencias de ADN objetivo tan pequeñas como 50 nts en los linfocitos de sangre periférica o en fibras de ADN estiradas. La amplificación de señal para RCA puede acoplarse a la hibridización del ácido nucleico y la formación de imágenes de fluorescencia multicolor para detectar cambios de nucleótido únicos en ADN dentro de un contexto citológico o en moléculas de ADN únicas, que permiten el haplotipo físico directo y el análisis de mutaciones somáticas en una base de célula por célula. Cada molécula de ADN amplificada generada por RCA puede ubicarse y dibujarse como una señal fluorescente discreta, indicando un acontecimiento de ligación molecular específico. Los perfiles de expresión pueden generarse como histogramas de conteos moleculares únicos, también. Las Patentes Norteamericanas 6,329,150 y 6,210,884 de Lizardi, se incorporan en la presente para referencia para proporcionar detalle amplio para permitir a un experto en la técnica practicar la invención descrita empleando técnicas RCA. IV. Transferencia Southern La transferencia Southern puede identificar diferencias entre alelos normales y mutantes e identifica genes que se relacionan en otros genomas . En una transferencia Southern, el ADN clonado o amplificado se digiere con una enzima de restricción. La gran variedad de fragmentos de ADN se separa de acuerdo con el tamaño por electroforesis y se transfiere en un filtro de nitrocelulos . Los fragmentos se hibridizan entonces con una sonda, pero se detectan únicamente aquellos fragmentos de ADN que contienen homólogos de secuencia, o idénticos en secuencia básica, a la sonda. Las diferencias en base únicas entre individuos se detectan cuando ese cambio de base crea o destruye un sitio para la enzima de restricción utilizada para digerir el ADN. Las eliminaciones o inserciones de ADN que cambian el tamaño del fragmento creado por la o las enzimas de restricción puede también detectarse de esta manera. La Patente Norteamericana Número 5,811,2391, incorporada en la presente para referencia, describe un método para detección de variación de secuencia de ADN de par de bases única por transferencia Southern. V. Etiquetado Fluorescente La secuencia de base exacta de un fragmento de ADN amplificado con PCR o clonado se determina por un método llamado secuenciación de ADN. La secuenciación de ADN se ha automatizado utilizando marcadores fluorescentes diferencialmente coloreados para cada una de las cuatro bases de ADN por lo que la señal fluorescente emitida por cada una de estas "pinturas" de cromosoma pueden leerse por un explorador sensible y se analiza por una computadora. VI . Sondas de ADN Una sonda es un estiramiento de ADN u otro ácido nucleico que se ha atado a un material estable. La sonda se expone entonces a un objetivo de un ácido nucleico libre cuya identidad está siendo detectada (por la sonda) a través de una reacción de hibridización (para terminología, véase Phimster B: Nat Genet 21 [Suppl] :l-60, 1999). La sonda se marca generalmente con un isótopo radioactivo o un químico que puede detectarse después de que la hibridización toma lugar. Por ejemplo, las marcas quimioluminiscentes, por ejemplo, 1, 2-dioxetanos, fosfato alcalino, o biotina, pueden utilizarse como sondas de hibridización para detectar escalas o membranas de secuencia de nucleótido generadas por el protocolo de secuenciación de Church and Gilbert. Véase Church, G.M., Gilbert, W. , Proc. Nati. Acad. Sci., USA 81, 1991-1995, (1984). VII . Microdisposiciones Las microdisposiciones de ADN hechas de materiales robóticos o inertes a alta velocidad, tales como vidrio o nylon, pueden utilizarse para identificar genes y mutaciones genéticas. Las sondas pre-seleccionadas se exponen al ADN "objetivo" y se analizan subsecuentemente por patrones de hibridización utilizando una variedad de programas y estrategias de procesamiento de visualización e información. La identificación de genes o mutaciones genéticas y los niveles de la expresión genética pueden detectarse y analizarse por muchos genes simultáneamente y más rápidamente que por muchas otras técnicas . Varios nombres se han dado a estas microdisposiciones, tales como chip de genoma, biochip, chip de ADN, microdisposición de ADN, disposición genética, y GeneChip®s (marca registrada de "Affymetrix" ) . Habiendo descrito la invención en tales términos como para permitir a aquellos expertos en la técnica entenderla y practicarla, y habiendo identificado las modalidades actualmente preferidas de la misma, se reclama:

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método de pronóstico/diagnóstico para detectar y diagnosticar tejido canceroso y pre-canceroso, el método comprende, en combinación y en secuencia, las etapas de: (a) iluminar un área anatómica macroscópica de tejido con una luz que distingue selectivamente tejido canceroso y pre-canceroso a partir del tejido normal, para ubicar tal tejido sospechoso; (b) separar las células del tejido sospechoso; y (c) someter las células a análisis molecular para determinar si las células exhiben características asociadas con la diferenciación celular o cáncer.
2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa (a) se precede por la selección de cáncer por prueba de saliva para determinar si los tejidos cancerosos o pre-cancerosos existen en los tejidos de la cabeza y el cuello y la etapa (a) se realiza entonces en los tejidos de cabeza y cuello.
3. 3. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa (a) se sigue por aplicación tópica de un tinte de tinción selectiva al tejido sospechoso, para confirmar además que se sospecha de contener células cancerosas o pre-cancerosas y para proporcionar tiempo adicional para ver el tejido sospechoso para ayudar en la biopsia del tejido sospechoso, antes de realizar la etapa (b) .