JP2004509637A - 浸潤癌の発生の早期予測のための方法 - Google Patents
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Abstract
浸潤癌の起こり得る発生の早期予測のための予後推定方法であって、そのような部位を選択的に染色する色素を適用すること、引き続きそのような部位のＤＮＡが腫瘍抑制遺伝子の変異に対して対立遺伝子欠損を呈するかどうかを決定する分子遺伝学的分析によって疑わしい癌性および前癌性組織部位を同定することを含む方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、浸潤癌（ｉｎｖａｓｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ）の起こり得る発生の早期予測のための予後推定方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
［遺伝的分析による前癌組織の同定］
全ての新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍｓ）は遺伝子変異（ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ）を受けた細胞から生じ、引き続きクローン的な増大を生じると信じられている。これらの遺伝子変異には、プロトオンコジーンの活性化および腫瘍抑制遺伝子の不活性化が含まれる。病理学的な進展を伴う特定の遺伝的変化（ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｈａｎｇｅｓ）の同定は、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒｓ）を含む多くの癌の分子進展モデルを説明し得るものである。これらの進展モデルは、ヒト腫瘍の診断および検出を援助する分子マーカーを提供する。
【０００３】
分子レベルの分析は、ヒト原発新生物の特定の遺伝的変化を調べる能力に変革をもたらした。ＰＣＲに準拠した強力な技術は、ＤＮＡ抽出および引き続く遺伝的分析のために、ルーチンに作製されたパラフィン包埋標本を使用することを可能にする。これらのサンプルから抽出されたＤＮＡを増幅して、対立遺伝子欠損（ａｌｌｅｌｉｃ ｌｏｓｓｅｓ）を含む様々な遺伝子変異を明らかにすることができる。そのような対立遺伝子欠損（染色体欠失）は、欠損部位に保持される重要な腫瘍抑制遺伝子の不活性化に関するマーカーである。
【０００４】
成人の腫瘍において、腫瘍抑制遺伝子は２段階の不活性化プロセスを必要とし、それによって腫瘍の進展に関する両親の対立遺伝子の双方がノックアウトされなければならない。一般的に、一方の対立遺伝子のポイントミューテーションには、二番目の対立遺伝子の欠失、および腫瘍抑制機能の完全な欠損が伴う。マイクロサテライト分析により同定されたこれら対立遺伝子的な欠損（ｌｏｓｓｅｓ）、欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）は、腫瘍抑制遺伝子不活性化に関する共通の第二の不活性化ステップを表すものである。実際には、対立遺伝子欠損（または欠失）は、正常ＤＮＡにおける母性（ｍａｔｅｒｎａｌ）および父性（ｐａｔｅｒｎａｌ）の対立遺伝子を区別し得る高度の多型マーカーを使用することによって決定し得る。そして、このパターンは、組換えまたは欠失が母性または父性（ＬＯＨのヘテロ接合の欠損としても知られる）のどちらかの欠損として表される腫瘍ＤＮＡと比較される。最近、このマッピングプロセスは、高度に多型でかつヒトゲノム全体に生じるマイクロサテライトマーカー（小規模なＤＮＡ反復単位）の登場によって変革された。例えば、２つの染色体腕上に座位する重要な腫瘍抑制遺伝子座をテストすることができる。領域の１つは染色体腕９ｐ上に座位し、そしてｐ１６（ＭＴＳ−１またはＣＤＫＮ２）と呼ばれる重要な腫瘍抑制遺伝子を保持している。この重要な細胞周期インヒビターは、大抵の原発癌において、ポイントミューテーション、欠失およびメチレーションによって不活性化されている。第二の分析は、染色体領域３ｐ２１、即ち、喫煙に関連する腫瘍において最も頻繁に欠失する領域中において実施することができる。多くの遺伝子が３ｐ領域から単離されたが、これら候補遺伝子の何れも、原発癌または細胞株において頻繁には不活性化されていない。重要なことに、９ｐおよび３ｐ双方の欠損は、浸潤癌進展において同定される早期の遺伝的変化である。
【０００５】
頭頸部癌（ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ）の患者は、しばしばエアロダイジェスティブトラクト（ａｅｒｏｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｔｒａｃｔ）の２次原発腫瘍（ｓｅｃｏｎｄ ｐｒｉｍａｒｙ ｔｕｍｏｒｓ）を伴っている。頭頸部癌の基礎遺伝的な研究は、口腔の単一の形質転換細胞が粘膜全体に広がって、クローン的に関連する形質転換細胞の広区域を形成し得ることを示している。一人の患者に二つの病巣が生じた際には、それらは由来としては大抵クローン的なものであるとの更なる証拠がある。例えば、頭頸部癌の患者は、しばしば異常細胞の大きな斑（ｐａｔｃｈ）を有し、それは単純なバイオプシーによって直接検査できる。
【０００６】
例えば、Ｃａｌｉｆａｎｏ等、 Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｈｅａｄ ａｎｄ Ｎｅｃｋ Ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５６（１１）：２４８８−２４９２（１９９６）； Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ―ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８（５３４０）：１０４５−０５８（１９９７）； Ｒｏｓｉｎ等、 Ｕｓｅ ｏｆ Ａｌｌｅｌｉｃ Ｌｏｓｓ ｔｏ Ｐｒｅｄｉｃｔ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｒｉｓｋ ｆｏｒ Ｌｏｗ―ｇｒａｄｅ Ｏｒａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｄｙｓｐｌａｓｉａ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３５７３６２（２０００）を参照されたい。
【０００７】
そして、浸潤癌が将来において生じるとの早期の予後推定が、疑わしい部位の組織の遺伝的分析によって達成できることが知られている。従って、視認しえる徴候が生じるよりかなり前に、そのような疑わしい部位の局在部を同定する単純な臨床プロトコールの提供が非常に望まれている。
【０００８】
［従来技術のＭａｓｈｂｅｒｇプロトコール］
上皮組織上の疑わしい部位を同定および描写するための、イン ビボの診断スクリーニング検査が知られている。このスクリーニング検査は、癌性および前癌性の組織を選択的に染色するトルイジンブルー Ｏ（ＴＢＯ）色素を用いるものであり、Ｍａｓｈｂｅｒｇの米国特許４，３２１，２５１およびＴｕｃｃｉ等の米国特許５，３７２，８０１に一般的に開示されている。さらに最近ではキットが開発されており、それは他のルーチンの歯学的または医学的な処置の一部として、医者が迅速かつ容易に検査を施することを可能にし、患者が無症状である時、または異形成病巣が通常の視覚的検診では見逃される可能性がある大変小さなものである間に、疑わしい部位をこのように同定および／または描写することを可能にするものである。疑わしい異形性病巣がＭａｓｈｂｅｒｇプロトコールで同定されたときには、通常のバイオプシーサンプルが採取され、そして病巣が悪性か前癌性かを決定するために通常の組織学的検査に供試された。この検査を実施するキットは、適切な量および濃度のプレミックス色素および洗浄溶液を含むもので、Ｚｉｌａ社によりライセンスされており、カナダ、オーストラリアおよびヨーロッパにおいてＯｒａＴｅｓｔＴＭの商標で商業的に入手可能である。後に、他の陽イオン性色素が同様に有用であり（例えば、Ｐｏｍｅｒａｎｔｚの米国特許５，８８２，６７２を参照）、そのような色素の選択的マーキング作用は、癌性および前癌性細胞のミトコンドリアによるそれらの摂取および保持によるものであることが決定された。
【０００９】
［例１］
＜臨床検査プロトコール＞
この例はＭａｓｈｂｅｒｇプロトコールの従来のプラクティスを例証するものである。
臨床検査溶液の調製
ＴＢＯ（例えば、私の米国特許６，０８６，８５２の実施例１に従って調製されたもの）、キイチゴフレーバー剤（ＩＦＦ Ｒａｓｐｂｅｒｒｙ ＩＣ５６３４５７）、酢酸ナトリウム三水和物緩衝剤およびＨ２Ｏ２（３０％ ＵＳＰ）防腐剤（米国特許５，３７２，８０１を参照）が、表Ａに示される組成を有するＴＢＯ検査溶液を作成するために、純水（ＵＳＰ）、氷酢酸およびＳＤ １８ エチルアルコール中に溶解される。
【００１０】
【表Ａ−１】
純水中の１重量％酢酸、安息香酸ナトリウム防腐剤およびキイチゴフレーバーの前洗浄および後洗浄検査溶液が調製される。
【００１１】
臨床プロトコール
患者は衣服を保護するために胸当てを着用させられる。喀出（ｅｘｐｅｃｔｏｒａｔｉｏｎ）が予想されるため患者は１０オンスのカップを与えられるが、このカップは感染性廃棄物コンテナー中に入れて廃棄でき、またはその内容物は流しが染色されるのを防ぐために流しの排水溝の中心部に直接流すことができる。周囲との接触面または染色され得る対象は、覆われるかまたは検査領域から取り除かれる。
【００１２】
視覚的な口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）検査が、軟組織（ｓｏｆｔ ｔｉｓｓｕｅｓ）に刻み目または切り傷を生じ得るどのような道具も使用することなく行われる。軟組織または歯の前染色の出現が記録される。
【００１３】
患者は、余分の唾液を除去して一貫性のある口腔環境を提供するために、約２０秒間にわたり約１５ｍｌの前洗浄溶液で口腔を洗浄し、喀出する。次いで、追加の前洗浄溶液を用いてこのステップが繰り返される。
【００１４】
次に、患者は２０秒間水で洗浄およびうがいを行い、喀出する。
【００１５】
次に、患者は１分間ＴＢＯ検査溶液３０ｍｌで洗浄およびうがいを行い、喀出する。
【００１６】
次に、患者は２０秒間、後洗浄液１５ｍｌで洗浄を行い、喀出する。次いでこのステップが反復される。
【００１７】
次に、患者は２０秒間水で洗浄およびうがいを行い、喀出する。次いでこのステップが反復される。
【００１８】
次に、必要であれば退縮（ｒｅｔｒａｃｔｉｏｎ）、バランスのよい照明、および拡大視野を含む適切な軟組織の検診技術を使用して、口腔の観察が行われる。青色をもった疑わしい病巣の局在、サイズ、形態、色彩および表面の特徴が検査され、記録される。
【００１９】
偽陽性を減らすために、患者は１０−１４日後に上記プロトコールの反復に戻される。この期間は、第一検診期間での何等かの潰瘍性（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ）または外傷性（ｔｒａｕｍａｔｉｃ）病巣または刺激性病因（ｉｒｒｉｔａｔｉｎｇ ｅｔｉｏｌｏｇｙ）が治癒するのための期間を与えるものである。第一検診で検出された疑わしい領域の第二検診後の陽性染色は、癌性または前癌性組織の徴候と考えられ、バイオプシーはこの結果を立証するためになされる。
【００２０】
初期のエリスロプラスティック（ｅｒｙｔｈｒｏｐｌａｓｔｉｃ）な病巣は、しばしば点状または斑状のパターンで青色に染色される。しかしながら、舌背（ｄｏｒｓｕｍ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｎｇｕｅ）上の不規則な乳頭状間隙（ｐａｐｉｌｉａｒ ｃｒｅｖｉｃｅｓ）により保持される染色については正常であり、それは陽性の徴候ではない。陽性とは認められないが青色染色性を保持する他の領域には、歯のプラーク、各歯の歯肉境界、軟口蓋（ｓｏｆｔ ｐａｌａｔｅ）の拡散性の染色が含まれる。なぜなら、舌背および潰瘍性の病巣上に保持された染色から移行した色素は容易に区別可能だからである。この検査では陽性に染色されないが、病巣の存在が非常に疑われる全ての例においては、バイオプシーが取られることがやはり不可避である。
【００２１】
偽陽性
現在までに、Ｍａｓｈｂｅｒｇプロトコールは「偽陽性」の徴候、即ち、後の通常の組織学的検診で確認できない癌性または前癌性の状態の徴候を示し得ることが理解されていた。それら偽陽性の頻度を、例えば、Ｍａｓｈｂｅｒｇ特許に記載の手順の反復によって、およびＴｕｃｃｉ特許に記載されている色素の特別な処方によって低減するために、少なからぬ努力が費やされた。
【００２２】
【発明の概要】
しかしながら、浸潤癌の起こり得る発生を暗示するクローン的な遺伝的変化が、先に述べた染色された組織の通常の組織学的検診により該組織が癌性または前癌性であることが立証されなくとも、ＴＢＯおよび他の陽イオン性の超生体染色色素（ｓｕｐｒａｖｉｔａｌ ｄｙｅｓ）によって染色される疑わしい病巣において同定されることが決定された。従って、Ｍａｓｈｂｅｒｇプロトコールにおいて例中の高い比率で「偽陽性」と以前に考えられた徴候は、浸潤癌の発生の前兆である遺伝子変異の最も初期の徴候である。従って、Ｍａｓｈｂｅｒｇタイプの染色色素プロトコールは、どの組織を遺伝的分析に供試すべきかを決定するための、合理的で信頼できる手段である。
【００２３】
従って、その最も広い側面で考慮すれば、私は、最終的な浸潤癌の発生を早期に予測するための予後推定方法を提供する。この方法は、従来技術である遺伝子分析技術と、Ｍａｓｈｂｅｒｇプロトコールで例示される従来技術の選択的染色色素技術の教示とを組合わせたものである。私の方法は、組織に対して、新生物発生前（ｐｒｅｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）細胞のミトコンドリアにより選択的に保持される染色色素を適用することと、染色された組織部位について前記組織を視覚的に検診することによりクローン班（ｃｌｏｎａｌ ｐａｔｃｈｅｓ）を同定することと、前記クローン班の座位において組織を切除することと、および前記切除組織から抽出したＤＮＡが腫瘍抑制遺伝子の対立遺伝子的な欠損または変異を呈するかどうかを決定することとを含むものである。
【００２４】
以下に示す実施例は当業者に対して、私の発明の実施およびその現在の好適な態様を明らかにするために提供される。これらの実施例は本発明の範囲を限定するものと理解されるべきではなく、本発明は特許請求の範囲に記載した範囲においてのみ限定されるものである。
【００２５】
【実施例】
［実施例１］
＜Ｍａｓｈｂｅｒｇタイプ臨床プロトコール＞
臨床検査溶液の調製
ＴＢＯ（例えば、米国特許６，０８６，８５２の実施例１の産物）、キイチゴフレーバー剤（ＩＦＦ キイチゴ ＩＣ５６３４５７）、酢酸ナトリウム三水和物緩衝剤およびＨ２Ｏ２（３０％ ＵＳＰ）防腐剤（米国特許５，３７２，８０１を参照）が、表Ａに示される組成を有するＴＢＯ検査溶液を作成するために、純水（ＵＳＰ）、氷酢酸およびＳＤ １８ エチルアルコールに溶解される。
【００２６】
【表Ａ−２】
純水中の１重量％酢酸、安息香酸ナトリウム防腐剤およびキイチゴフレーバーの前洗浄および後洗浄検査溶液が調製される。
【００２７】
臨床プロトコール
患者は衣服を保護するために胸当てを着用させられる。喀出（ｅｘｐｅｃｔｏｒａｔｉｏｎ）が予想されるため患者は１０オンスのカップを与えられ、カップは感染性廃棄物コンテナー中に入れて廃棄でき、または、その内容物は流しが染色されるのを防ぐために流しの排水溝の中心部に直接流し得る。周囲との接触面または染色され得る対象は、覆われるかまたは検査領域から取り除かれる。
【００２８】
視覚的な口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）検査が、軟組織（ｓｏｆｔ ｔｉｓｓｕｅｓ）に刻み目または切り傷を生じ得るどのような道具も使用することなしに行われる。軟組織または歯の前染色の出現が記録される。
【００２９】
患者は、余分の唾液を除去して一貫性のある口腔環境を提供するために、約２０秒間にわたり約１５ｍｌの前洗浄溶液で口腔を洗浄し、喀出する。次いで、追加の前洗浄溶液を用いてこのステップが繰り返される。
【００３０】
次に、患者は２０秒間水で洗浄およびうがいを行い、喀出する。
【００３１】
次に、患者は１分間ＴＢＯ検査溶液３０ｍｌで洗浄およびうがいを行い、喀出する。
【００３２】
次に、患者は２０秒間、後洗浄液１５ｍｌで洗浄を行い、喀出する。次いでこのステップが反復される。
【００３３】
次に、患者は２０秒間水で洗浄およびうがいを行い、喀出する。次いでこのステップが反復される。
【００３４】
次に、必要であれば退縮（ｒｅｔｒａｃｔｉｏｎ）、バランスのよい照明、および拡大視野を含む適切な軟組織の検診技術を使用して、口腔の観察が行われる。青色をもった疑わしい病巣の局在、サイズ、形態、色彩および表面の特徴が検査され、記録される。
【００３５】
患者は１０−１４日後に上記プロトコールの反復に戻された。この期間は、第一検診期間に存在した何等かの潰瘍性（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ）または外傷性（ｔｒａｕｍａｔｉｃ）病巣または刺激性病因（ｉｒｒｉｔａｔｉｎｇ ｅｔｉｏｌｏｇｙ）が治癒するための期間を与えるものである。第一検診で検出された疑わしい領域の第二検診後の陽性染色は、癌性または前癌性組織の徴候と考えられる。
【００３６】
初期のエリスロプラスティック（ｅｒｙｔｈｒｏｐｌａｓｔｉｃ）な病巣は、しばしば点状または斑状のパターンで青色に染色される。しかしながら、舌背（ｄｏｒｓｕｍ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｎｇｕｅ）上の不規則な乳頭状間隙（ｐａｐｉｌｉａｒ ｃｒｅｖｉｃｅｓ）により保持される染色については正常であり、それは陽性の徴候ではない。陽性とは認められないが青色染色性を保持する他の領域には、歯のプラーク、各歯の歯肉の境界、軟口蓋（ｓｏｆｔ ｐａｌａｔｅ）の拡散性の染色が含まれる。なぜなら、舌背および潰瘍性の病巣上に保持された染色から移行した色素は容易に区別可能だからである。しかしながら、この検査において陽性に染色されないものの、病巣の存在が非常に疑われる全ての例においては、バイオプシーが取られ、そして分子レベルの分析に供試されることが不可避なことである。
【００３７】
［実施例２］
＜遺伝子変異の分析＞
様々な臨床上の部位から５８サンプルが得られた。これらサンプル中の２サンプルについては、更なる分子レベルの分析には不十分な試料しかスライド上に存在しないので、分析は不可能であることが決定された。残りの５６例において、新生物性細胞（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）が、レーザー捕捉顕微解剖鏡（ｌａｓｅｒ ｃａｐｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｓｃｏｐｅ）を使用して、（癌の事例）正常組織または上皮から、（他の全ての事例）正常組織から慎重に摘出された。これは３つのクリティカルな座位での引き続くマイクロサテライト分析のために、細胞分離およびＤＮＡ抽出を可能にする。１５例においては、ＤＮＡが不十分で更なる分析は不可能である。検査のために選択された２つの座位（Ｄ９Ｓ１７１およびＤ９Ｓ７３６）は、ｐ１６遺伝子を保持する染色体領域９ｐ２１上にある。第三のマーカー（Ｄ３Ｓ１０６７）は、染色体３ｐ２１上に位置する。残りの４１例において、全ての分子レベルの研究は、病理学的診断の知見を考慮しない盲検で行なわれた。
【００３８】
本研究においては、青色染色された病巣と、青色染色領域内ではないがそれに近接するバイオプシーを行った病巣とが別々に同定される。従って、多くの事例において、染色領域ならびに近接する非染色領域の双方を直接検査することができる。これら４１例の全てにおいて、これらのクリティカルなマーカーのマイクロサテライト分析は、イン サイチュー（ｉｎ ｓｉｔｕ）で、癌および癌種（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を有する実際上全ての事例においてＬＯＨ（染色体欠失）の存在を示す。加えて、異形成および非異形成病巣の多く、ならびに未知（病理学的診断なし）のカテゴリーにおける病巣もまた、クローン的な遺伝的変化を保持する。
【００３９】
１２例の癌の症例中の１２例において、予測されたようにクローン的な遺伝的変化が同定された。イン サイチューでの癌種または重篤な異形成の４つ全ての事例においても、クローン的な変化が同定された。異形成の事例中の５７％（７例中の４例）および異形成を呈さない事例中の８５％（１４例中の１２例）において、クローン的な遺伝的変化がそれらのマーカー中の１以上に認められた。未知の組織学的特徴を有する事例において、クローン的な遺伝的変化が、前記事例中の２５％（４例中の１例）において同定された。全体的には、クローン的な変化は、マイクロサテライト分析により病巣の８０％（４１例中の３３例）において同定された。この分子レベルの分析は、Ｍａｓｈｂｅｒｇタイプのプロトコールにより同定された病巣の約８０％がクローン的であることを示すものである。
【００４０】
［結論］
以前の研究は、クローン的な遺伝的変化を有する病巣のみが、癌に進行するらしいと示唆している。これらの研究の全てが、９ｐおよび／または３ｐ欠損を有する病巣のみが癌に進行し、これらの変化を有さない病巣は決して進行しないことを示唆している。もし他のより進展的な遺伝的変化（例えば、１７ｐ欠損またはｐ５３の変異）が存在するならば、新生物発生前の病巣における進行のリスクは明らかに実際上１００％に上昇する。
【００４１】
３ｐおよび／または９ｐ欠損の場合の癌に進行するリスクは、２８−７５％にわたっている。しかしながら、進行の最低の頻度（２８％）の事例での研究において、予見的に検査された１１６例の患者は研究の開始の前に癌はなかった。他の２つの研究は、以前切除した原発腫瘍などを有する１２３患者を含むものであり、高率または進行（４５−７８％）を反映するものであった。もっとも最近の研究において、その著者は、２以上の対立遺伝子欠損をもった全ての疑わしい領域の切除を明確に推奨していた。
【００４２】
従って、この実施例は、この患者集団中のトルイジンブルー色素により同定された新生物発生前の変化はクローン的なものであり、それゆえに癌への進行途上のものであるとの事実を確立するものである。同定された病巣の全てが浸潤癌に進行するかは確かではないが、初期のクローン的な増幅がこれらの患者で開始していることは明らかである。上記の研究に基づいて、保護評価（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｅｓｔｉｍａｔｅ）は、これらの病巣の５０−７５％が浸潤癌に進行するらしいことを示唆する。それゆえ、これらのクローン班の存在により、これらの患者は非常に高リスクなカテゴリーに分類され、したがって疾患領域の完全な摘出が許可される。
【００４３】
この実施例から導かれるもう１つの重要なポイントは、染色領域および非染色領域の議論に関連するものである。ほとんど全ての事例において、染色領域および非染色領域の双方が同一のクローン的な遺伝的変化を共有している。頭頸部癌のクローン的な進行モデルの説明に基づけば、再発（ｒｅｃｕｒ）する頭頸部癌を有する大抵の患者が、異常上皮の大班を有することは明らかである。染色領域から離れた部位のバイオプシーもまた、同一のクローン的な遺伝的変化を示すであろうことは驚くべきことではない。重要なことは、染色領域のバイオプシーのみがクローン的な遺伝的変化を示す一方、非染色領域はこれらの変化を示さない事例が少なくとも３例存在することである。これはおそらく、これらの患者にはより小さいクローン班が存在することによるものであり、異常病巣の同定における色素染色の使用を更に支持するものである。
【００４４】
明らかに、Ｍａｓｈｂｅｒｇタイプのプロトコールは、イン サイチューにおいて、癌種および通常の形態学的分析によって確証された癌を有する患者を同定した。注目すべきことに、他の除去された病巣の大多数は、顕微鏡観察下で正常もしくは異形成であると思われたが（さもなければそれらはＭａｓｈｂｅｒｇプロトコールより「偽陽性」として分類されたであろう）、それでも、これらの病巣は癌への進行に必然的で重要なクローン的な遺伝的変化を保持している。
【００４５】
従って、Ｍａｓｈｂｅｒｇタイププロトコールは、癌に加えて、癌に進行するであろう病巣を検出するための強力な方法を提示するものである。この点において、染色によって同定される病巣をバイオプシーすることは適切であり、それは（Ａ）前記病巣が更なる切除によりその全体を除去できるので治癒に至り、または（Ｂ）クローン的な遺伝的進行の証拠立てによって適切に患者を高リスクカテゴリーに分類する。
【００４６】
当業者が本発明を理解および実施するための事項に関する本発明の内容を開示し、また本発明の現在の好適な態様を特定したので、特許請求の範囲に記載のとおり、本発明についての権利を請求する。
【発明の属する技術分野】
本発明は、浸潤癌（ｉｎｖａｓｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ）の起こり得る発生の早期予測のための予後推定方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
［遺伝的分析による前癌組織の同定］
全ての新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍｓ）は遺伝子変異（ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ）を受けた細胞から生じ、引き続きクローン的な増大を生じると信じられている。これらの遺伝子変異には、プロトオンコジーンの活性化および腫瘍抑制遺伝子の不活性化が含まれる。病理学的な進展を伴う特定の遺伝的変化（ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｈａｎｇｅｓ）の同定は、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒｓ）を含む多くの癌の分子進展モデルを説明し得るものである。これらの進展モデルは、ヒト腫瘍の診断および検出を援助する分子マーカーを提供する。
【０００３】
分子レベルの分析は、ヒト原発新生物の特定の遺伝的変化を調べる能力に変革をもたらした。ＰＣＲに準拠した強力な技術は、ＤＮＡ抽出および引き続く遺伝的分析のために、ルーチンに作製されたパラフィン包埋標本を使用することを可能にする。これらのサンプルから抽出されたＤＮＡを増幅して、対立遺伝子欠損（ａｌｌｅｌｉｃ ｌｏｓｓｅｓ）を含む様々な遺伝子変異を明らかにすることができる。そのような対立遺伝子欠損（染色体欠失）は、欠損部位に保持される重要な腫瘍抑制遺伝子の不活性化に関するマーカーである。
【０００４】
成人の腫瘍において、腫瘍抑制遺伝子は２段階の不活性化プロセスを必要とし、それによって腫瘍の進展に関する両親の対立遺伝子の双方がノックアウトされなければならない。一般的に、一方の対立遺伝子のポイントミューテーションには、二番目の対立遺伝子の欠失、および腫瘍抑制機能の完全な欠損が伴う。マイクロサテライト分析により同定されたこれら対立遺伝子的な欠損（ｌｏｓｓｅｓ）、欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）は、腫瘍抑制遺伝子不活性化に関する共通の第二の不活性化ステップを表すものである。実際には、対立遺伝子欠損（または欠失）は、正常ＤＮＡにおける母性（ｍａｔｅｒｎａｌ）および父性（ｐａｔｅｒｎａｌ）の対立遺伝子を区別し得る高度の多型マーカーを使用することによって決定し得る。そして、このパターンは、組換えまたは欠失が母性または父性（ＬＯＨのヘテロ接合の欠損としても知られる）のどちらかの欠損として表される腫瘍ＤＮＡと比較される。最近、このマッピングプロセスは、高度に多型でかつヒトゲノム全体に生じるマイクロサテライトマーカー（小規模なＤＮＡ反復単位）の登場によって変革された。例えば、２つの染色体腕上に座位する重要な腫瘍抑制遺伝子座をテストすることができる。領域の１つは染色体腕９ｐ上に座位し、そしてｐ１６（ＭＴＳ−１またはＣＤＫＮ２）と呼ばれる重要な腫瘍抑制遺伝子を保持している。この重要な細胞周期インヒビターは、大抵の原発癌において、ポイントミューテーション、欠失およびメチレーションによって不活性化されている。第二の分析は、染色体領域３ｐ２１、即ち、喫煙に関連する腫瘍において最も頻繁に欠失する領域中において実施することができる。多くの遺伝子が３ｐ領域から単離されたが、これら候補遺伝子の何れも、原発癌または細胞株において頻繁には不活性化されていない。重要なことに、９ｐおよび３ｐ双方の欠損は、浸潤癌進展において同定される早期の遺伝的変化である。
【０００５】
頭頸部癌（ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ）の患者は、しばしばエアロダイジェスティブトラクト（ａｅｒｏｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｔｒａｃｔ）の２次原発腫瘍（ｓｅｃｏｎｄ ｐｒｉｍａｒｙ ｔｕｍｏｒｓ）を伴っている。頭頸部癌の基礎遺伝的な研究は、口腔の単一の形質転換細胞が粘膜全体に広がって、クローン的に関連する形質転換細胞の広区域を形成し得ることを示している。一人の患者に二つの病巣が生じた際には、それらは由来としては大抵クローン的なものであるとの更なる証拠がある。例えば、頭頸部癌の患者は、しばしば異常細胞の大きな斑（ｐａｔｃｈ）を有し、それは単純なバイオプシーによって直接検査できる。
【０００６】
例えば、Ｃａｌｉｆａｎｏ等、 Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｈｅａｄ ａｎｄ Ｎｅｃｋ Ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５６（１１）：２４８８−２４９２（１９９６）； Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ―ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８（５３４０）：１０４５−０５８（１９９７）； Ｒｏｓｉｎ等、 Ｕｓｅ ｏｆ Ａｌｌｅｌｉｃ Ｌｏｓｓ ｔｏ Ｐｒｅｄｉｃｔ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｒｉｓｋ ｆｏｒ Ｌｏｗ―ｇｒａｄｅ Ｏｒａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｄｙｓｐｌａｓｉａ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３５７３６２（２０００）を参照されたい。
【０００７】
そして、浸潤癌が将来において生じるとの早期の予後推定が、疑わしい部位の組織の遺伝的分析によって達成できることが知られている。従って、視認しえる徴候が生じるよりかなり前に、そのような疑わしい部位の局在部を同定する単純な臨床プロトコールの提供が非常に望まれている。
【０００８】
［従来技術のＭａｓｈｂｅｒｇプロトコール］
上皮組織上の疑わしい部位を同定および描写するための、イン ビボの診断スクリーニング検査が知られている。このスクリーニング検査は、癌性および前癌性の組織を選択的に染色するトルイジンブルー Ｏ（ＴＢＯ）色素を用いるものであり、Ｍａｓｈｂｅｒｇの米国特許４，３２１，２５１およびＴｕｃｃｉ等の米国特許５，３７２，８０１に一般的に開示されている。さらに最近ではキットが開発されており、それは他のルーチンの歯学的または医学的な処置の一部として、医者が迅速かつ容易に検査を施することを可能にし、患者が無症状である時、または異形成病巣が通常の視覚的検診では見逃される可能性がある大変小さなものである間に、疑わしい部位をこのように同定および／または描写することを可能にするものである。疑わしい異形性病巣がＭａｓｈｂｅｒｇプロトコールで同定されたときには、通常のバイオプシーサンプルが採取され、そして病巣が悪性か前癌性かを決定するために通常の組織学的検査に供試された。この検査を実施するキットは、適切な量および濃度のプレミックス色素および洗浄溶液を含むもので、Ｚｉｌａ社によりライセンスされており、カナダ、オーストラリアおよびヨーロッパにおいてＯｒａＴｅｓｔＴＭの商標で商業的に入手可能である。後に、他の陽イオン性色素が同様に有用であり（例えば、Ｐｏｍｅｒａｎｔｚの米国特許５，８８２，６７２を参照）、そのような色素の選択的マーキング作用は、癌性および前癌性細胞のミトコンドリアによるそれらの摂取および保持によるものであることが決定された。
【０００９】
［例１］
＜臨床検査プロトコール＞
この例はＭａｓｈｂｅｒｇプロトコールの従来のプラクティスを例証するものである。
臨床検査溶液の調製
ＴＢＯ（例えば、私の米国特許６，０８６，８５２の実施例１に従って調製されたもの）、キイチゴフレーバー剤（ＩＦＦ Ｒａｓｐｂｅｒｒｙ ＩＣ５６３４５７）、酢酸ナトリウム三水和物緩衝剤およびＨ２Ｏ２（３０％ ＵＳＰ）防腐剤（米国特許５，３７２，８０１を参照）が、表Ａに示される組成を有するＴＢＯ検査溶液を作成するために、純水（ＵＳＰ）、氷酢酸およびＳＤ １８ エチルアルコール中に溶解される。
【００１０】
【表Ａ−１】
【００１１】
臨床プロトコール
患者は衣服を保護するために胸当てを着用させられる。喀出（ｅｘｐｅｃｔｏｒａｔｉｏｎ）が予想されるため患者は１０オンスのカップを与えられるが、このカップは感染性廃棄物コンテナー中に入れて廃棄でき、またはその内容物は流しが染色されるのを防ぐために流しの排水溝の中心部に直接流すことができる。周囲との接触面または染色され得る対象は、覆われるかまたは検査領域から取り除かれる。
【００１２】
視覚的な口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）検査が、軟組織（ｓｏｆｔ ｔｉｓｓｕｅｓ）に刻み目または切り傷を生じ得るどのような道具も使用することなく行われる。軟組織または歯の前染色の出現が記録される。
【００１３】
患者は、余分の唾液を除去して一貫性のある口腔環境を提供するために、約２０秒間にわたり約１５ｍｌの前洗浄溶液で口腔を洗浄し、喀出する。次いで、追加の前洗浄溶液を用いてこのステップが繰り返される。
【００１４】
次に、患者は２０秒間水で洗浄およびうがいを行い、喀出する。
【００１５】
次に、患者は１分間ＴＢＯ検査溶液３０ｍｌで洗浄およびうがいを行い、喀出する。
【００１６】
次に、患者は２０秒間、後洗浄液１５ｍｌで洗浄を行い、喀出する。次いでこのステップが反復される。
【００１７】
次に、患者は２０秒間水で洗浄およびうがいを行い、喀出する。次いでこのステップが反復される。
【００１８】
次に、必要であれば退縮（ｒｅｔｒａｃｔｉｏｎ）、バランスのよい照明、および拡大視野を含む適切な軟組織の検診技術を使用して、口腔の観察が行われる。青色をもった疑わしい病巣の局在、サイズ、形態、色彩および表面の特徴が検査され、記録される。
【００１９】
偽陽性を減らすために、患者は１０−１４日後に上記プロトコールの反復に戻される。この期間は、第一検診期間での何等かの潰瘍性（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ）または外傷性（ｔｒａｕｍａｔｉｃ）病巣または刺激性病因（ｉｒｒｉｔａｔｉｎｇ ｅｔｉｏｌｏｇｙ）が治癒するのための期間を与えるものである。第一検診で検出された疑わしい領域の第二検診後の陽性染色は、癌性または前癌性組織の徴候と考えられ、バイオプシーはこの結果を立証するためになされる。
【００２０】
初期のエリスロプラスティック（ｅｒｙｔｈｒｏｐｌａｓｔｉｃ）な病巣は、しばしば点状または斑状のパターンで青色に染色される。しかしながら、舌背（ｄｏｒｓｕｍ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｎｇｕｅ）上の不規則な乳頭状間隙（ｐａｐｉｌｉａｒ ｃｒｅｖｉｃｅｓ）により保持される染色については正常であり、それは陽性の徴候ではない。陽性とは認められないが青色染色性を保持する他の領域には、歯のプラーク、各歯の歯肉境界、軟口蓋（ｓｏｆｔ ｐａｌａｔｅ）の拡散性の染色が含まれる。なぜなら、舌背および潰瘍性の病巣上に保持された染色から移行した色素は容易に区別可能だからである。この検査では陽性に染色されないが、病巣の存在が非常に疑われる全ての例においては、バイオプシーが取られることがやはり不可避である。
【００２１】
偽陽性
現在までに、Ｍａｓｈｂｅｒｇプロトコールは「偽陽性」の徴候、即ち、後の通常の組織学的検診で確認できない癌性または前癌性の状態の徴候を示し得ることが理解されていた。それら偽陽性の頻度を、例えば、Ｍａｓｈｂｅｒｇ特許に記載の手順の反復によって、およびＴｕｃｃｉ特許に記載されている色素の特別な処方によって低減するために、少なからぬ努力が費やされた。
【００２２】
【発明の概要】
しかしながら、浸潤癌の起こり得る発生を暗示するクローン的な遺伝的変化が、先に述べた染色された組織の通常の組織学的検診により該組織が癌性または前癌性であることが立証されなくとも、ＴＢＯおよび他の陽イオン性の超生体染色色素（ｓｕｐｒａｖｉｔａｌ ｄｙｅｓ）によって染色される疑わしい病巣において同定されることが決定された。従って、Ｍａｓｈｂｅｒｇプロトコールにおいて例中の高い比率で「偽陽性」と以前に考えられた徴候は、浸潤癌の発生の前兆である遺伝子変異の最も初期の徴候である。従って、Ｍａｓｈｂｅｒｇタイプの染色色素プロトコールは、どの組織を遺伝的分析に供試すべきかを決定するための、合理的で信頼できる手段である。
【００２３】
従って、その最も広い側面で考慮すれば、私は、最終的な浸潤癌の発生を早期に予測するための予後推定方法を提供する。この方法は、従来技術である遺伝子分析技術と、Ｍａｓｈｂｅｒｇプロトコールで例示される従来技術の選択的染色色素技術の教示とを組合わせたものである。私の方法は、組織に対して、新生物発生前（ｐｒｅｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）細胞のミトコンドリアにより選択的に保持される染色色素を適用することと、染色された組織部位について前記組織を視覚的に検診することによりクローン班（ｃｌｏｎａｌ ｐａｔｃｈｅｓ）を同定することと、前記クローン班の座位において組織を切除することと、および前記切除組織から抽出したＤＮＡが腫瘍抑制遺伝子の対立遺伝子的な欠損または変異を呈するかどうかを決定することとを含むものである。
【００２４】
以下に示す実施例は当業者に対して、私の発明の実施およびその現在の好適な態様を明らかにするために提供される。これらの実施例は本発明の範囲を限定するものと理解されるべきではなく、本発明は特許請求の範囲に記載した範囲においてのみ限定されるものである。
【００２５】
【実施例】
［実施例１］
＜Ｍａｓｈｂｅｒｇタイプ臨床プロトコール＞
臨床検査溶液の調製
ＴＢＯ（例えば、米国特許６，０８６，８５２の実施例１の産物）、キイチゴフレーバー剤（ＩＦＦ キイチゴ ＩＣ５６３４５７）、酢酸ナトリウム三水和物緩衝剤およびＨ２Ｏ２（３０％ ＵＳＰ）防腐剤（米国特許５，３７２，８０１を参照）が、表Ａに示される組成を有するＴＢＯ検査溶液を作成するために、純水（ＵＳＰ）、氷酢酸およびＳＤ １８ エチルアルコールに溶解される。
【００２６】
【表Ａ−２】
【００２７】
臨床プロトコール
患者は衣服を保護するために胸当てを着用させられる。喀出（ｅｘｐｅｃｔｏｒａｔｉｏｎ）が予想されるため患者は１０オンスのカップを与えられ、カップは感染性廃棄物コンテナー中に入れて廃棄でき、または、その内容物は流しが染色されるのを防ぐために流しの排水溝の中心部に直接流し得る。周囲との接触面または染色され得る対象は、覆われるかまたは検査領域から取り除かれる。
【００２８】
視覚的な口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）検査が、軟組織（ｓｏｆｔ ｔｉｓｓｕｅｓ）に刻み目または切り傷を生じ得るどのような道具も使用することなしに行われる。軟組織または歯の前染色の出現が記録される。
【００２９】
患者は、余分の唾液を除去して一貫性のある口腔環境を提供するために、約２０秒間にわたり約１５ｍｌの前洗浄溶液で口腔を洗浄し、喀出する。次いで、追加の前洗浄溶液を用いてこのステップが繰り返される。
【００３０】
次に、患者は２０秒間水で洗浄およびうがいを行い、喀出する。
【００３１】
次に、患者は１分間ＴＢＯ検査溶液３０ｍｌで洗浄およびうがいを行い、喀出する。
【００３２】
次に、患者は２０秒間、後洗浄液１５ｍｌで洗浄を行い、喀出する。次いでこのステップが反復される。
【００３３】
次に、患者は２０秒間水で洗浄およびうがいを行い、喀出する。次いでこのステップが反復される。
【００３４】
次に、必要であれば退縮（ｒｅｔｒａｃｔｉｏｎ）、バランスのよい照明、および拡大視野を含む適切な軟組織の検診技術を使用して、口腔の観察が行われる。青色をもった疑わしい病巣の局在、サイズ、形態、色彩および表面の特徴が検査され、記録される。
【００３５】
患者は１０−１４日後に上記プロトコールの反復に戻された。この期間は、第一検診期間に存在した何等かの潰瘍性（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ）または外傷性（ｔｒａｕｍａｔｉｃ）病巣または刺激性病因（ｉｒｒｉｔａｔｉｎｇ ｅｔｉｏｌｏｇｙ）が治癒するための期間を与えるものである。第一検診で検出された疑わしい領域の第二検診後の陽性染色は、癌性または前癌性組織の徴候と考えられる。
【００３６】
初期のエリスロプラスティック（ｅｒｙｔｈｒｏｐｌａｓｔｉｃ）な病巣は、しばしば点状または斑状のパターンで青色に染色される。しかしながら、舌背（ｄｏｒｓｕｍ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｎｇｕｅ）上の不規則な乳頭状間隙（ｐａｐｉｌｉａｒ ｃｒｅｖｉｃｅｓ）により保持される染色については正常であり、それは陽性の徴候ではない。陽性とは認められないが青色染色性を保持する他の領域には、歯のプラーク、各歯の歯肉の境界、軟口蓋（ｓｏｆｔ ｐａｌａｔｅ）の拡散性の染色が含まれる。なぜなら、舌背および潰瘍性の病巣上に保持された染色から移行した色素は容易に区別可能だからである。しかしながら、この検査において陽性に染色されないものの、病巣の存在が非常に疑われる全ての例においては、バイオプシーが取られ、そして分子レベルの分析に供試されることが不可避なことである。
【００３７】
［実施例２］
＜遺伝子変異の分析＞
様々な臨床上の部位から５８サンプルが得られた。これらサンプル中の２サンプルについては、更なる分子レベルの分析には不十分な試料しかスライド上に存在しないので、分析は不可能であることが決定された。残りの５６例において、新生物性細胞（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）が、レーザー捕捉顕微解剖鏡（ｌａｓｅｒ ｃａｐｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｓｃｏｐｅ）を使用して、（癌の事例）正常組織または上皮から、（他の全ての事例）正常組織から慎重に摘出された。これは３つのクリティカルな座位での引き続くマイクロサテライト分析のために、細胞分離およびＤＮＡ抽出を可能にする。１５例においては、ＤＮＡが不十分で更なる分析は不可能である。検査のために選択された２つの座位（Ｄ９Ｓ１７１およびＤ９Ｓ７３６）は、ｐ１６遺伝子を保持する染色体領域９ｐ２１上にある。第三のマーカー（Ｄ３Ｓ１０６７）は、染色体３ｐ２１上に位置する。残りの４１例において、全ての分子レベルの研究は、病理学的診断の知見を考慮しない盲検で行なわれた。
【００３８】
本研究においては、青色染色された病巣と、青色染色領域内ではないがそれに近接するバイオプシーを行った病巣とが別々に同定される。従って、多くの事例において、染色領域ならびに近接する非染色領域の双方を直接検査することができる。これら４１例の全てにおいて、これらのクリティカルなマーカーのマイクロサテライト分析は、イン サイチュー（ｉｎ ｓｉｔｕ）で、癌および癌種（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を有する実際上全ての事例においてＬＯＨ（染色体欠失）の存在を示す。加えて、異形成および非異形成病巣の多く、ならびに未知（病理学的診断なし）のカテゴリーにおける病巣もまた、クローン的な遺伝的変化を保持する。
【００３９】
１２例の癌の症例中の１２例において、予測されたようにクローン的な遺伝的変化が同定された。イン サイチューでの癌種または重篤な異形成の４つ全ての事例においても、クローン的な変化が同定された。異形成の事例中の５７％（７例中の４例）および異形成を呈さない事例中の８５％（１４例中の１２例）において、クローン的な遺伝的変化がそれらのマーカー中の１以上に認められた。未知の組織学的特徴を有する事例において、クローン的な遺伝的変化が、前記事例中の２５％（４例中の１例）において同定された。全体的には、クローン的な変化は、マイクロサテライト分析により病巣の８０％（４１例中の３３例）において同定された。この分子レベルの分析は、Ｍａｓｈｂｅｒｇタイプのプロトコールにより同定された病巣の約８０％がクローン的であることを示すものである。
【００４０】
［結論］
以前の研究は、クローン的な遺伝的変化を有する病巣のみが、癌に進行するらしいと示唆している。これらの研究の全てが、９ｐおよび／または３ｐ欠損を有する病巣のみが癌に進行し、これらの変化を有さない病巣は決して進行しないことを示唆している。もし他のより進展的な遺伝的変化（例えば、１７ｐ欠損またはｐ５３の変異）が存在するならば、新生物発生前の病巣における進行のリスクは明らかに実際上１００％に上昇する。
【００４１】
３ｐおよび／または９ｐ欠損の場合の癌に進行するリスクは、２８−７５％にわたっている。しかしながら、進行の最低の頻度（２８％）の事例での研究において、予見的に検査された１１６例の患者は研究の開始の前に癌はなかった。他の２つの研究は、以前切除した原発腫瘍などを有する１２３患者を含むものであり、高率または進行（４５−７８％）を反映するものであった。もっとも最近の研究において、その著者は、２以上の対立遺伝子欠損をもった全ての疑わしい領域の切除を明確に推奨していた。
【００４２】
従って、この実施例は、この患者集団中のトルイジンブルー色素により同定された新生物発生前の変化はクローン的なものであり、それゆえに癌への進行途上のものであるとの事実を確立するものである。同定された病巣の全てが浸潤癌に進行するかは確かではないが、初期のクローン的な増幅がこれらの患者で開始していることは明らかである。上記の研究に基づいて、保護評価（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｅｓｔｉｍａｔｅ）は、これらの病巣の５０−７５％が浸潤癌に進行するらしいことを示唆する。それゆえ、これらのクローン班の存在により、これらの患者は非常に高リスクなカテゴリーに分類され、したがって疾患領域の完全な摘出が許可される。
【００４３】
この実施例から導かれるもう１つの重要なポイントは、染色領域および非染色領域の議論に関連するものである。ほとんど全ての事例において、染色領域および非染色領域の双方が同一のクローン的な遺伝的変化を共有している。頭頸部癌のクローン的な進行モデルの説明に基づけば、再発（ｒｅｃｕｒ）する頭頸部癌を有する大抵の患者が、異常上皮の大班を有することは明らかである。染色領域から離れた部位のバイオプシーもまた、同一のクローン的な遺伝的変化を示すであろうことは驚くべきことではない。重要なことは、染色領域のバイオプシーのみがクローン的な遺伝的変化を示す一方、非染色領域はこれらの変化を示さない事例が少なくとも３例存在することである。これはおそらく、これらの患者にはより小さいクローン班が存在することによるものであり、異常病巣の同定における色素染色の使用を更に支持するものである。
【００４４】
明らかに、Ｍａｓｈｂｅｒｇタイプのプロトコールは、イン サイチューにおいて、癌種および通常の形態学的分析によって確証された癌を有する患者を同定した。注目すべきことに、他の除去された病巣の大多数は、顕微鏡観察下で正常もしくは異形成であると思われたが（さもなければそれらはＭａｓｈｂｅｒｇプロトコールより「偽陽性」として分類されたであろう）、それでも、これらの病巣は癌への進行に必然的で重要なクローン的な遺伝的変化を保持している。
【００４５】
従って、Ｍａｓｈｂｅｒｇタイププロトコールは、癌に加えて、癌に進行するであろう病巣を検出するための強力な方法を提示するものである。この点において、染色によって同定される病巣をバイオプシーすることは適切であり、それは（Ａ）前記病巣が更なる切除によりその全体を除去できるので治癒に至り、または（Ｂ）クローン的な遺伝的進行の証拠立てによって適切に患者を高リスクカテゴリーに分類する。
【００４６】
当業者が本発明を理解および実施するための事項に関する本発明の内容を開示し、また本発明の現在の好適な態様を特定したので、特許請求の範囲に記載のとおり、本発明についての権利を請求する。
Claims (1)
- 浸潤癌の起こり得る発生の早期予測のための予後推定方法であって、前記方法が、
（ａ）組織に対して、新生物的および前新生物的な細胞のミトコンドリアにより選択的に保持される染色色素を適用することと、
（ｂ）染色された組織部位について、前記組織を視覚的に検診することにより前記組織のクローン班を同定することと、
（ｃ）前記クローン班の座位において組織を切除することと、
（ｄ）前記切除組織から抽出されたＤＮＡが対立遺伝子欠損または腫瘍抑制遺伝子の変異を呈するかどうかを決定することと、
を含む方法。
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