MXPA02004428A - Metodo para la prediccion temprana del principio de cancer invasor. - Google Patents

Abstract

Un metodo de pronostico para la prediccion temprana del desarrollo eventual de cancer invasor comprende identificar sitios sospechosos de tejido canceroso y precanceroso aplicando un tinte que mancha selectivamente dichos sitios, seguido por analisis genetico molecular para determinar si el DNA de dichos sitios exhibe perdidas alelicas para mutacion de genes supresores de tumor,.

Description

MÉTODO PARA LA PREDICCIÓN TEMPRANA DEL PRINCIPIO DE CÁNCER INVASOR Esta invención se relaciona con un método de pronóstico para la predicción temprana del desarrollo eventual de cáncer invasor.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Identificación de Tejido Precanceroso mediante Análisis Genético Se cree que todos los neoplasmas se suscitan de células que se han sometido a alteración genética, seguida por expansión clonal. Estas alteraciones genéticas incluyen activación de incogenes proto e inactivación de genes supresores de tumor. La identificación de cambios genéticos específicos con progresión patológica ha permitido la delineación de muchos tumores de modelos de progresión molecular, incluyendo cánceres orales. Estos modelos de progresiones proporcionan marcadores moleculares para ayudar en el diagnóstico y detección de tumores humanos. El análisis molecular ha revolucionado la capacidad de ver cambios genéticos específicos en neoplasmas humanos primarios. Las poderosas técnicas basadas en PCR permiten el uso de muestras de tejido rutinariamente preparadas incrustadas en parafina para extracción de DNA y análisis genético subsecuente. El DNA extraído de estas muestras se puede amplificar para revelar diversas alteraciones genéticas, incluyendo pérdidas alélicas. Estas pérdidas alólicas (omisiones cromosomales) son marcadores para la inactivación de genes supresores de tumor críticos contenidos dentro de la región de pérdida. En tumores adultos, los genes supresores de tumor requieren de un proceso de inactivación de dos pasos, mediante el cual tanto el alelo parental debe ser eliminado para progresión de tumor. Generalmente, la mutación de punta de un alelo es seguida por la omisión del segundo alelo y pérdida completa de función supresora de tumor. Estas omisiones de pérdidas alélicas identificadas mediante análisis de icrosatéli e representan un segundo paso de inactivación común para la inactivación de gen supresor de tumor. En la práctica, la pérdida alélica (u omisiones) se puede determinar utilizando marcadores altamente polimórficos capaces de distinguir los alelos maternales y paternales en DNA normal . Este patrón luego se puede comparar con DNA de tumor en donde la recombinación u omisión se presenta como pérdida del alelo ya sea maternal o paternal (también conocido como pérdida de heterozigosidad de LOH). Recientemente, este proceso de trazo se ha revolucionado con el advenimiento de marcadores de microsatélite (unidades de repetición de DNA pequeñas) que son altamente polimórficos y ocurren a través del genoma humano. Por ejemplo, se pueden probar ubicaciones de gene supresor de tumor crítico en dos brazos cromosomales. Una de las regiones es en el brazo cromosomal 9p y contiene el gen supresor de tumor crítico denominado plß (MTS-1 o CDKN2 ) . Este inhibidor de ciclo de célula crítico se inactiva mediante mutación de punto, omisión y metilación en la mayoría de los cánceres primarios. El segundo análisis se puede hacer en la región cromosomal 3p21, entre las regiones más frecuentemente omitidas en tumores relacionados con el fumar. Aún cuando muchos genes se han aislado de la región 3p, ninguno de los genes candidatos se ha inactivado frecuentemente en tumores primarios o líneas de célula. De manera importante, ambas pérdidas de 9p y 3p son los cambios genéticos más anticipados identificados en progresión de cáncer invasor. Los pacientes con cáncer en cabeza y cuello frecuentemente presentan segundos tumores primarios del tracto aerodigestivo . Los estudios genéticos fundamentales en cáncer de cabeza y cuello muestran que células transformadas sencillas en la cavidad oral se pueden dispersar a través de la mucosa dando lugar a áreas grandes de células relaciones y transformadas clonalmente. Existe evidencia adicional que, cuando dos lesiones se presentan en un paciente, son frecuentemente clónales en origen. Por ejemplo, los pacientes con cáncer en cabeza y cuello frecuentemente tienen parches grandes de células anormales que se pueden probar directamente mediante una sencilla biopsia. Ver, v.gr., Califano y col., Genetic Progression Model for Head and Neck Cáncer. Cáncer Research 56 ( 11 ): 2488-2492 (1996); Sidransky, Nucleic Acid-based Methods for Detection of Cáncer. Science 278 (5340) : 1045-058 (1997); Rosin y col., Use of Allelic Loss to Predict Malignant Risk for Lo -grade Oral Epithelial Dysplasia, Clinical Cáncer Research 6:357362 (2000) . Sabiéndose entonces que una temprana prognosis de que cáncer invasor eventualmente se desarrollará se puede efectuar mediante análisis genético de tejido de sitios de sospecha, sería altamente deseable proporcionar un protocolo clínico sencillo que identificaría las ubicaciones de dichos sitios sospechosos, bastante antes del principio de indicaciones por lo demás visibles.

El Protocolo Mashberg de la Técnica Anterior Se conoce una prueba de tamizado de diagnóstico en vivo que identifica y delinea sitios sospechosos en tejido epitelial. Esta prueba de tamizado, que emplea tinte azul de toluidina O (TBO) para manchar selectivamente tejido canceroso y precanceroso, se describe generalmente en la Patente de Estados Unidos 4,321,251 a Mashberg y en la Patente de Estados Unidos 5,372,801 a Tucci y col. Más recientemente, se han desarrollado juegos que hacen posible para los clínicos administrar rápida y fácilmente la prueba, como parte de otros procedimientos dentales o médicos de rutina, y de esta manera identificar y/o delinear sitios sospechosos en un momento cuando los pacientes no tienen síntomas o mientras que las lesiones displásticas son tan pequeñas que podrían no observarse durante examen visual normal . Una vez que una lesión displástica sospechosa se identifica mediante el protocolo de Mashberg, se tomó una muestra de biopsia regular y se sometió a examen histológico convencional, para determinar si la lesión es maligna o precancerosa . Los juegos para realizar esta prueba, que contienen tinte previamente mezclado y soluciones de enjuague en las cantidades y concentraciones apropiadas, están licenciados por Zila, Inc. y se encuentran comercialmente disponibles en Canadá, Australia y Europa bajo la marca OraTest™.

Posteriormente se determinó que otros tintes catiónicos son similarmente útiles (Ver, v.gr., la Patente de E.U.A. 5,882,672 a Pomerantz) y que la acción marcadora selectiva de dichos tintes se debe a su admisión y retención por la mitocondria de células cancerosas y precancerosas .

EJEMPLO 1 Protocolo de Prueba Clínica Este ejemplo ilustra la práctica convencional del protocolo de Mashberg .

Preparación de Soluciones de Prueba Clínica TBO (v.gr., preparado de conformidad con el Ejemplo 1 de mi Patente de E.U.A. 6,086,852), agente saborizante de frambuesa (IFF Raspberry IC563457), agente de tampón de trihidrato de acetato de sodio y H202 (30% USP) conservador (ver la Patente de E.U.A. 5,372,801), se disuelven en agua purificada (USP), ácido acético glacial y alcohol de etilo SD 18, para producir una solución de prueba de TBO, que tiene la composición indicada en el Cuadro A: CUADRO A Componente % en peso TBO 1 . 00 Sabor 20 Agente Tampón 2 . 45 Conservador 41 Ácido Acético 4 . . 6 1 Alcohol de Etilo 7 . 48 Agua 83 . . 85 100 , . 00 Se preparan soluciones de prueba de enjuague previo y enjuague posterior en 1% en peso de ácido acético en agua purificada, conservador de benzoato de sodio y sabor de frambuesa.

Protocolo Clínico El paciente es cubierto por un babero para proteger la ropa. Se espera la expectoración, de manera que se proporciona al paciente una copa de 295.7 ml (10 onzas), que se puede desechar en un recipiente de desperdicio infeccioso o cuyo contenido se puede verter directamente al centro de un fregadero, para evitar manchar el fregadero. Las superficies ambientales u objetos que se pudieran manchar se cubren o separan del área de prueba . Se conduce un examen visual de cáncer oral, sin utilizar ningunos instrumentos que puedan ocasionar raspaduras o cortes de tejidos suaves. Se hacen anotaciones de la apariencia previa al manchado de los tejidos suaves y dientes. El paciente enjuaga la cavidad oral con aproximadamente 15 ml . de la solución de enjuague previo durante aproximadamente 20 segundos y expectora, para eliminar el exceso de saliva y proporcionar un ambiente oral consistente. Este paso se repite luego con solución de enjuague previo adicional. El paciente luego enjuaga y hace gárgaras con agua durante 20 segundos y luego escupe. El paciente luego enjuaga y hace gárgaras con 30 ml de la solución de prueba de TBO durante un minuto y escupe . El paciente luego se enjuaga con 15 ml de la solución de enjuague posterior durante 20 segundos y escupe. Este paso se repite luego. El paciente luego se enjuaga y hace gárgaras con agua durante 20 segundos y escupe. Este paso se repite luego. Luego se hacen las observaciones de la cavidad oral, utilizando técnicas de examen de tejido suave apropiadas, incluyendo retracción, iluminación bien equilibrada y amplificación, si es necesario. La ubicación, tamaño morfología, color y características superficiales de lesiones sospechosas, que han retenido coloración azul se hacen y registran. A fin de reducir las positivas falsas, el paciente se regresa después de 10-14 días para una repetición del protocolo anterior. Este período permite el tiempo para curar cualquier lesión de ulceración o traumática o etiología de irritación en el momento del primer examen. Una mancha positiva después del segundo examen de una área sospechosa detectada en el primer examen se considera una indicación de tejido canceroso o precanceroso y se hace una biopsia para confirmar esta conclusión . Las lesiones eritroplásticas tempranas manchan en azul, frecuentemente en un patrón punteado o de parches. Sin embargo, es normal que la mancha se retenga por las cavidades papilares irregulares en el corso de la lengua, que no es una indicación positiva. Otras áreas que retienen la mancha azul, pero no se consideran como positivas incluyen la placa dental, márgenes gingivales de cada diente, mancha difusa en el paladar suave debido al tinte transferido de la mancha retenida en el corso de la lengua, y lesiones de ulceración que se distinguen fácilmente. En todos los casos, cuando una lesión es altamente sospechosa, pero no mancha positivamente con esta prueba, es imperativo, sin embargo, que se tome una biopsia .

"Positivos Falsos" Hasta ahora se entendió que el protocolo de Mashberg podía proporcionar indicaciones "positivas falsas", es decir, indicaciones de condiciones cancerosas o precancerosas que posteriormente los exámenes histológicos convencionales no confirmaron, y se ha gastado esfuerzo considerable para reducir la frecuencia de estos positivos falsos, v.gr., mediante los procedimientos repetidos descritos en la patente de Mashberg y medíante formulación especial del tinte como se describe en la patente de Tucci .

Breve Declaración de la Invención Sin embargo, se han determinado ahora cambios genéticos clónales indicativos de desarrollo eventual de cáncer invasor que se pueden identificar en lesiones sospechosas que se manchan con TBO y otros tintes supravitales catiónicos, aún cuando el examen histológico convencional de dichos tejidos manchados no confirme que el tejido es canceroso o precanceroso. De esta manera, las indicaciones que previamente se consideraban "positivos falsos" en el protocolo de Mashberg, en una alta proporción de casos, son las indicaciones más tempranas de alteraciones genéticas que son precursoras al desarrollo de cáncer invasor. De esta manera, los protocolos de mancha de tinte de tipo Mashberg son una forma razonablemente confiable para determinar qué tejidos se deben someter a análisis genético. Consecuentemente, al considerarla en sus aspectos más amplios, proporciona un método de prognóstico para la predicción temprana del desarrollo eventual de cáncer invasor, que combina las enseñanzas de la tecnología de análisis genético del ramo anterior y la tecnología de tinte de manchado selectivo de la técnica anterior, ejemplificada por el protocolo de Mashberg. Mi método comprende aplicar al tejido un tinte de manchado que se retiene selectivamente por la mitocondria de células preneoplásticas , identificando parches clónales examinando visualmente el tejido de sitios de tejido manchados, hacer resección del tejido en la ubicación de los parches clónales y determinar si el DNA extraído del tejido seccionado exhibe pérdidas alólicas o mutación de genes supresores de tumor. Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar a los experimentados en el ramo la práctica de mi invención y las modalidades actualmente preferidas de la misma. Estos ejemplos no se deben entender como limitativos del alcance de la invención, que se define solamente en las reivindicaciones anexas.

EJEMPLO 1 Protocolo Clínico de tipo Mashberg Preparación de Soluciones de Prueba Clínica TBO (v.gr., el producto del Ejemplo 1 de la Patente de E.U.A. 6,086,852), agente saborizante de frambuesa (IFF Raspberry IC563457), agente de tampón de trihidrato de acetato de sodio y H202 (30% USP) conservador (Ver la Patente de E.U.A. 5,372,801), se disuelven en agua purificada (USP), ácido acético glacial y alcohol de etilo SD 18, para producir una solución de prueba de TBO que tiene la composición indicada en el Cuadro A: CUADRO A Componente % en peso Producto TBO 1.00 Sabor .20 Agente Tapón 2.45 Conservador .41 Ácido Acético 4.61 CUADRO A (Continuación) Componente % en peso Alcohol de Etilo 7.48 Agua 83.85 100.00 Las soluciones de prueba de enjuague previo y enjuague posterior de 1% en peso de ácido acético en agua purificada, conservador de benzoato de sodio y sabor de frambuesa se preparan.

Protocolo Clínico El paciente se cubre con un babero para proteger la ropa. Se espera la expectoración, de modo que se proporciona al paciente una copa de 205.7 ml (10 onzas), que se puede desechar en un recipiente de desperdicios infecciosos o el contenido de la cual se puede verter directamente al centro de un fregadero, para evitar el manchado del fregadero. Las superficies ambientales u objetos que pudieran mancharse se cubren o separan del área de prueba . Se conduce un examen de cáncer oral visual, sin utilizar ningunos instrumentos que pudieran ocasionar raspaduras o cortes de tejidos suaves. Se hacen anotaciones de la apariencia previa al manchado de tejidos suaves y dientes. El paciente se enjuaga la cavidad oral con aproximadamente 15 ml . de la solución de enjuague previo durante aproximadamente 20 segundos y escupe, para eliminar el exceso de saliva y proporcionar un ambiente oral consistente. Este paso luego se repite con solución de enjuague previo adicional. El paciente luego se enjuaga y hace gárgaras con agua durante 20 segundos y escupe. El paciente luego se enjuaga y hace gárgaras con 30 ml . de solución de prueba de TB durante un minuto y escupe. El paciente luego se enjuaga con 15 ml . de la solución de enjuague posterior durante 20 segundos y escupe. Este paso luego se repite. El paciente luego se enjuaga y hace gárgaras con agua durante 20 segundos y escupe. Este paso luego se repite. Luego se hacen las observaciones de la cavidad oral, utilizando técnicas apropiadas de examen de tejido suave, incluyendo retracción, alambrado bien equilibrado y amplificación, si es necesaria. La ubicación, tamaño, morfología, color y características superficiales de lesiones sospechosas, que han retenido la coloración azul se hacen y registran.

El paciente regresa después de 10-14 días para una repetición del protocolo anterior. Este período permite tiempo para curar cualquier lesión de ulceración o traumática o etiología de irritación que estuvo presente en el momento del primer examen. Una mancha positiva después del segundo examen de una área sospechosa detectada en el primer examen se considera una indicación de tejido canceroso o precanceroso. Las lesiones eritroplásticas tempranas manchan azul, frecuentemente en un patrón de puntos o parches. Sin embargo, es normal que la mancha se retenga por las cavidades papilares irregulares en el dorso de la lengua, lo que no es una indicación positiva_ Otras áreas que retienen mancha azul, pero no se consideran como positivas incluyen la placa dental, los márgenes gingivales de cada diente la mancha difusa del paladar suave debido al tinte transferido de la mancha retenida en el corso de la lengua, y las lesiones de úlcera que se distinguen fácilmente. En todos los casos, sin embargo, cuando una lesión es altamente sospechosa, pero no retiene mancha positivamente con esta prueba, es sin embargo imperativo que se tome una biopsia y se someta a análisis molecular.

Ejemplo 2 Análisis de Alteración Genética Se obtienen 58 muestras de diversos sitios clínicos. Se determina que el análisis de dos de estas muestras no es posible debido a que hay material inadecuado en los portaobjetos para análisis molecular adicional. En los 56 casos restantes de disectan cuidadosamente células neoplásticas (en casos con cáncer) de tejido normal o epitelio (en todos los otros casos) de tejido normal utilizando un alcance de microdisección de captura láser. Esto permite el aislamiento de las células y extracción de DNA para análisis de microsatólite subsecuente en tres ubicaciones críticas. En 15 casos, se encuentra DNA insuficiente y no es posible el análisis adicional. Dos de las ubicaciones (D9S171 y D9S736) seleccionadas para prueba están en la región cromosomal 9p21 que contiene el gen pl6. Un tercer marcador (D3S1067) se coloca en el cromosoma 3p21. Todos los estudios moleculares en los 41 casos restantes se hacen a ciegas sin conocimiento del diagnóstico patológico . Dentro del estudio, las lesiones que se manchan de azul y las lesiones que se someten a biopsia adyacentes pero no dentro de las áreas de mancha azul se identifican separadamente. De esta manera, en muchos casos se puede probar tanto directamente las áreas manchadas como las áreas no manchadas adyacentes. El análisis de microsatólite de estos marcadores críticos en todos los 41 casos muestra la presencia de LOH (omisiones cromosomales) en virtualmente todos los casos con cáncer y carcinoma in situ, Además, muchas de las lesiones displásticas y las lesiones no displásticas así como aquellas en la categoría desconocida (sin diagnóstico patológico) también marcan cambios genéticos clónales. En 12 de 13 casos de cáncer se identificó un cambio genético clonal como se esperaba. En todos los cuatro casos de carcinoma in situ o displasia severa un cambio clonal también se identifica. En 57% de los casos de displasia (4 de 7) y 85% de casos sin displasia (12 de 14) se encontraron cambios genéticos clónales en uno o más de estos marcadores. En casos con histología desconocida, se identifican cambios genéticos clónales en 25% (1 de 4) de los casos. En total, los cambios clónales se identifican mediante análisis de microsatélite en 80% de las lesiones (33 de 41). Este análisis molecular muestra definitivamente que aproximadamente 80% de las lesiones identificadas por el protocolo de tipo de Mashberg son clónales.

CONCLUSIONES Los estudios previos sugieren que solamente las - lí lesiones con cambios genéticos clónales son probables que progresen a cáncer. Todos estos estudios sugieren que solamente las lesiones con pérdida de 9p y/o 3p proseguirán a cáncer, las lesiones sin estos cambios virtualmente nunca progresaron. El riesgo de progresión en lesiones preneoplásticas claramente se eleva a virtualmente 10% si están presentes otros cambios genéticos más avanzados (v.gr., pérdida de 17 p o mutación de p53) . El riesgo de progresión a cáncer con pérdida de 3p y/o 9p varía de 28-75%. Sin embargo, en el estudio con la frecuencia más baja de progresión (28%), los 116 pacientes probados d? manera prospectiva estaban libres de cáncer antes de entrar al estudio. Los otros dos estudios incluyeron 123 pacientes con un tumor primario previamente resectado y reflejaron un régimen superior o progresión (45-75%). En el estudio más reciente, los autores hicieron una clara recomendación de someter a resección todas las áreas sospechosas con pérdida de dos o más alelos. Este ejemplo establece de esta manera el hecho de que los cambios preneoplásticos identificados por el tinte azul de toluidina en esta población de pacientes son clónales y, por lo tanto, están en la trayectoria de progresión a cáncer. Aún cuando no es seguro que cada una de las lesiones identificadas progresará a un cáncer invasor, es evidente que la expansión clonal inicial ha empezado en estos pacientes. Basados en los estudios arriba mencionados, un cálculo conservativo sugeriría que 50-75% de estas lesiones son probables que progresen a cáncer invasor. Por lo tanto, estos parches clónales colocan a estos pacientes en una categoría de riesgo muy elevado y que la extirpación completa del área afectada está garantizada. Otro punto importante derivado de este Ejemplo se relaciona con la cuestión de manchado y no manchado de áreas. En casi todos los casos tanto las áreas con manchas como las de sin manchas comparten los mismos cambios genéticos clónales. Basados en la elucidación del modelo de progresión clonal de cáncer de cabeza y cuello, es evidente que la mayoría de los pacientes con cáncer de cabeza y cuello que recurren tienen parches grandes de epitelio anormal. No es sorprendente que una biopsia lejos del área de mancha también mostraría los mismos cambios genéticos clónales. De manera importante, hay cuando menos tres caos en donde solamente la biopsia de la región manchada reveló un cambio genético clonal mientras que las áreas no manchadas no mostraron estos cambios. Se debe probablemente a la presencia de parches clónales menores en estos pacientes y además sustenta el uso de manchado con tinte al identificar lesiones anormales . Claramente, el protocolo de tipo de Mashberg identifica pacientes con carcinoma in situ y cáncer confirmado por análisis morfológico convencional. De manera notoria, la vasta mayoría de otras lesiones omitidas aparecen normales o displásticas bajo el microscopio (y de otra manera se habrían clasificado como un "positivo falso" desde el protocolo de Mashberg, pero todavía esas lesiones tienen los cambios genéticos clónales críticos que son necesarios para progresión de cáncer . De esta manera, el protocolo de tipo de Mashberg representa un método poderoso para detectar cánceres así como lesiones que son muy probables que progresen a cáncer. A este respecto, es apropiado someter a biopsia las lesiones identificadas por el manchado, que pueden (A) resultar en una curación debido a que la lesión se puede remover en su totalidad por extracción adicional, o (B) colocar apropiadamente a pacientes en una categoría de alto riesgo documentando la progresión genética clonal. Habiendo descrito mi invención en términos tales como para permitir a aquellos expertos en el ramo entenderla y practicarla y, habiendo identificado las modalidades actualmente preferidas de la misma.

Claims (1)

REIVINDICACIONES

1.- Un método para pronosticar la predicción temprana de desarrollo eventual de cáncer invasor, el método comprendiendo; (a) aplicar a tejido un tinte que mancha que se retiene selectivamente mediante mitocondria de células neoplásticas y preneoplásticas; (b) identificar parches clónales del tejido examinando visualmente el tejido en los sitios de tejido manchado; (c) seccionar tejido en la ubicación de los parches clónales ; (d) determinar si el DNA extraído del tejido seccionado exhibe pérdidas alólicas o mutación de genes supresores de tumor.