TWI280366B - Method for early prediction of the onset of invasive cancer - Google Patents

Description

1280366 五、發明說明（i) 本發明係關 法。 藉由遺傳分析 所有的瘤被 種系擴充的細 瘤基因並使腫 鑑認特定基因 展模型，包括 診斷和偵測人 分子分析法 的能力革新。 製備的組織標 傳學分析。從 基因上的變化 (染色體刪除） 基因失活的標 在成年腫瘤 程，其中兩個 一般而言，一 基因的刪除作 基因喪失的刪 種造成腫瘤 對偶基因的缺

用於早期預測侵入式癌症最終笋 、％展之預斷方 發明背景 法鑑認罹癌前組織 相信是肇始於已進行基因改變，接4、 胞。這些基因學上的改變包括活化5進行純 瘤抑制基因失去活性。利用病理學T始的腫 的改變已容許吾人描繪出許多腫3 的進展 口腔癌。這些進展模式提供分子=i刀子進 體腫瘤。 Λ。己以協助 已使吾人觀察初級人類腫瘤之特 有力之根據PCR的技術容許吾人利^糾因變化 士包埋在石蠟中以供DNA抽取和接仃性 這些樣品中抽出的DNA可經放大以，遺 ，包括對偶基因的缺失。此種對偶路各種 是用於做為包含在缺失區 失 記。 Λ〜里茺膻瘤抑制 ，腫瘤抑制基因需要兩步驟的去活化過 ，、有對偶基因必需均被擊倒以利腫瘤進展。 =對偶基因的單點突變後接著是第二個對偶 ’而使腫瘤抑制功能完全喪失。這些對偶 ，作用係由微小衛星區分析來鑑認，其代表 抑制基因失活的第二去活化步驟。實際上， 失（或刪除）可利用高度多形性標記物來測 1280366 五、發明說明（2) 定，其可分辨正常DNA中的母系和父系姐/ # 尔對偶基因。i言釦彬 式可與腫瘤D NA比較，其中重組或冊彳降 ^ ^ 作用係以喪失母系 或父系對偶基因來表示（亦以喪失L〇h胳A#人 ' “处千結合 近’此種拼圖方法已被微小衛星區標記的到臨（小的dm重 複單位）而有所革新’該標記具有高度多形性並且發生在 所有人類基因組之中。例如’吾人可試驗兩個染色^手臂 上之重要腫瘤抑制基因的位置。一個區位是在染色姊手臂 9P上’並且包含了重要的腫瘤抑制基因，稱為p'i6(^s_i 或CDKN2)。此種重要的細胞循環抑制劑在大多數原發性癌 症中是因單點突變，删除和曱基化作用而失活。第二項分 析可在染色體的3 p 2 1區域完成’此區域處於吸於相關腫瘤 的最經常刪除區域之中。雖然有許多基因已從3p區域被分 離出來，但是未有任何候選基因在原發性腫瘤或細胞株中 被經常去活化。重要的是，9 ρ和3 p二者的缺失是在侵入式 癌症進展中鑑認到的最早期基因變化。 具有頭和頸部腫瘤的病患經常有第二種屬於需氣消化道 之原發性腫瘤。基礎的基因研究對於頭和頸部癌症顯示在 口腔内單一的轉型細胞會散佈到整個黏膜，引起大區域之 與純種系相關且轉型的細胞。尚有證據顯示-當有兩個缺 損發生在一位病患身上，他們原本通常是純種系的。例 如，具有頭和頸部癌症的病患經常有不正常細胞之大片斑 塊’其可直接由簡易切片試驗。 請參考例如，Cal ifano等人，〈頭頸癌症之基因發展模 式>’<< 癌症研究〉〉’第 56 期（11):2488-2492 頁（1996 hi 11 iHB _ ill nr 1 __1 _ ill III· 第5頁 1280366 五、發明說明（4) 第5,8 8 2,6 72號，授予Pomerantz)，並且此種染劑之選擇 性標記作用係由於其經癌症和癌前期細胞之粒線體吸收和 滯留所致。 實施例1 臨床試驗方法 這個實施例係說明傳統Mashberg方法之實行 製備臨床試驗溶液 將ΤΒ0(例如依照本人之美國專利案第6, 0 8 6, 8 52號之實 施例1所製備者），蘼莓加味劑（I F F蘼莓，I C 5 6 3 4 5 7 )，乙 酸鈉之三水合物缓衝劑和H2 02 ( 3 0 %USP)保存劑（請參考美國 專利案第5, 3 72, 8 0 1號），溶於純化的水（USP)，冰醋酸和 SD18乙醇之中，以製成TB0試驗溶液，其具有表A之中指出 的組成：

表A 成份 重量％ TB0 1. 00 加味劑 • 20 緩衝劑 2.45 保存劑 • 41 乙酸 4. 61 乙醇 7. 48 水 83. 85 100.00 製備預先潤洗和之後潤洗試驗溶液，其含有1 %重量百分

1280366 五、發明說明（5) - 比之乙酸在純化的水中，以及苯曱酸納保存劑和薦莓加味 劑。 臨床方法 將病患以圍兜覆蓋以保護衣服。由於預期會有咳出物， 因此提供病患1 0盎司的杯子，其可被棄置於感染廢物筒 中，或其内容物可直接倒入水槽正中央以防將水槽染色。 將可能被染色之環境表面或物體覆蓋或從試驗區移定。 進行目視之口腔癌症檢驗，不使用任何可能造成軟組織 之刻痕或切傷的儀器。以符號標記預先染色之軟組織和牙 齒外觀。 病患用大約1 5毫升預先潤洗溶液潤洗口腔約2 0秒鐘，並 咳出以除去過量唾液並提供一致的口腔環境。然後用其餘 之預先潤洗溶液重覆進行此步驟。 然後病患以水潤洗並嗷喉2 0秒，並且咳出。 然後病患以3 0毫升ΤΒ0試驗溶液潤洗與嗷喉1分鐘，並予 咳出。 然後病患以1 5毫升潤洗後溶液潤洗2 0秒並咳出。然後重 覆此步驟。 然後該病患以水潤洗並嗽喉2 0秒，並予咳出。而後重覆 此步驟。 然後觀察口腔，利用適當的軟組織檢驗技術，若需要尚 包括牽開，良好均衡的照光與放大。該保留藍染色之可疑 損害之位置、大小、形態學、顏色和表面特徵被找出並記 錄下來。

1280366 五、發明說明（6) 為了降低假陽性，在1 0 -1 4日之後將病患帶回以重覆進 行以上方法。這段期間容許任何第一次檢驗時之潰瘍或外 傷損害或干擾之病因疾癒。第二次檢測第一次檢測時債測 之可疑區域獲得之陽性染色結果視為是癌症或癌症前組織 的指示，並對其進行切片以確認此項結論。 早期之紅血球破損染藍經常是呈點狀或斑塊的形式。然 而，舌背不規則之乳頭狀縫隙保持染色是正常的，其並非 陽性的指示。其他區域保持藍染但不被認為是陽性者包括 牙斑、每顆牙齒的牙酿邊緣，由於染劑從舌背上保留之染 色轉移造成的軟顎擴散染色，以及很容易分辨之潰瘍性破 損。在所有情況下，當一個破損被高度懷疑但用此試驗欲 未得到陽性染色結果時，無論如何要緊急進行切片。 π假陽性π 至今吾人瞭解Mashberg方法會提供π假陽性π指示，亦即 指示癌症或癌症前症狀是稍後以傳統組織學檢驗未能確認 者，並且有相當的努力經使用以降低這些假陽性發生的頻 率，例如：藉由M a s h b e r g之專利中說明之重覆方法以及 T u c c i的專利中說明之染劑的特殊調配物。 本發明之簡要申述 然而，現在已測定出指示侵入性癌症最終發展之純種系 基因變化，可在被ΤΒ0或其他陽離子體外活體染劑染色之 可疑損害上被鑑認出來，縱然傳統之組織學檢驗此種染色 組織無法蜂認該組織是惟癌的或癌前期的。因而’在 M a s h b e r g方法中先前被視為π假陽性π之指示，呈高比例的

第9頁 1280366 五、發明說明（7) 體之基因改變的最早 方法是合理之可信任 基因分析。 提供一種用於早期預 其合併了先前技藝之 色用染劑技術，由 包括對於組織施用一 色用染劑，藉由目視 位之純種系斑塊，對 情形出現，乃是侵入性癌症發展前趣 指示。因此，Mash berg型染色之染劍 的方式，用於測定什麼組織應該接受 因此，以最廣泛的方面來考慮，哉 測侵入性癌症可能發展之預示方法， 基因分析技術與先前技藝之選擇性染 Mashberg方法示範的效示。我的方法 種能被贅瘤前期細胞選擇性保留之染 法檢驗該組織的方式鑑認染色組織部

該純種系斑塊的位置部份切除組織敌測定是否從該部份切 除的組織中萃取出的DNA展現腫瘤抑制基因上之對偶基因 缺失或突變。 以下實施例係提供用於對熟 之發明以及其目前較佳之具體 解為對於此發明範圍之限制， 請專利範圍中定義。 習此藝者說明如何實行本人 實例。這些實施例不應被瞭 本發明之範疇僅在附帶之申 實施例1

Mashberg型的臨床方法 息備臨床試驗溶液 將丁B0(例如依照本人之美國專利案第6, 〇 8 6, 8 5 2號之實I瞻 施例1所製備者），蘼莓加味劑（IFF薦莓，IC 5 6 345 7 )，乙 酸鈉之三水合物緩衝劑和H2〇2(30%USP)保存劑（請參考美國 專利案第5，3 7 2，8 0 1號）’溶於純化的水（u s p )，冰錯酸和 · SD18乙醇之中’以製成ΤΒ0試驗溶液，其具有表a之中指出

第10頁 1280366 五、發明說明（8) 的組成：

表A 成份 重量％ ΤΒ0 1. 00 加味劑 • 20 緩衝劑 2. 45 保存劑 .41 乙酸 4.61 乙醇 7.48 水 83.85 100.00 製備預先潤洗和之後潤洗試驗溶液，其含有1 %重量百分 比之乙酸在純化的水中，以及苯曱酸鈉保存劑和薦莓加味 劑。 臨床方法 將病患以圍兜覆蓋以保護衣服。由於預期會有咳出物， 因此提供病患1 0盎司的杯子，其可被棄置於感染廢物筒 中，或其内容物可直接倒入水槽正中央以防將水槽染色。 將可能被染色之環境表面或物體覆蓋或從試驗區移定。 進行目視之口腔癌症檢驗，不使两任何可能造成軟組織 b 之刻痕或切傷的儀器。以符號標記預先染色之軟組織和牙 齒外觀。 病患用大約1 5毫升預先潤洗溶液潤洗口腔約2 0秒鐘，並 · 咳出以除去過量唾液並提供一致的口腔環境。然後用其餘

1280366 五、發明說明（9) - 之預先潤洗溶液重覆進行此步驟。 然後病患以水潤洗並漱喉2 0秒，並且咳出。 然後病患以3 0毫升ΤΒ0試驗溶液潤洗與嗷喉1分鐘，並予 咳出。 然後病患以1 5毫升潤洗後溶液潤洗2 0秒並咳出。然後重 覆此步驟。 然後該病患以水潤洗並嗷喉2 0秒，並予咳出。而後重覆 此步驟。 然後觀察口腔，利用適當的軟組織檢驗技術，若需要尚 包括牽開，良好均衡的照光與放大。該保留藍染色之可疑 損害之位置、大小、形態學、顏色和表面特徵被找出並記 錄下來。 在1 0 -1 4日之後將病患帶回以重覆進行以上方法。這段 期間容許任何第一次檢驗時之潰瘍或外傷損害或干擾之病 因痊癒。第二次檢測第一次檢測時偵測之可疑區域獲得之 性染色結果視為是癌症或癌症如組織的指不。 丨» 早期之紅血球破損染藍經常是呈點狀或斑塊的形式。然 而，舌背不規則之乳頭狀縫隙保持染色是正常的，其並非 陽性的指示。其他區域保持藍染但不被認為是陽性者包括 牙斑、每顆牙齒的牙齦邊緣，由於染劑從舌背上保留之染 色轉移造成的軟顎擴散染色，以及很容易分辨之潰瘍性破 損。在所有情況下，當一個破損被高度懷疑但用此試驗欲 未得到陽性染色結果時，無論如何要緊急進行切片，並進 行分子分析。

第12頁 1280366 五、發明說明（12) 病患群之中以曱苯胺藍染劑鑑認者為純種系的，並且因而 在演進為癌症的途徑上。雖然並未確認每一個鑑認過的損 害會演進成為侵入性的癌症，但清楚的是初始的純種系擴 大已在這些病患身上發生。根據以上提到的研究，一項保 守估計提出：有5 0- 75%此種損害可能會演進成為侵入性癌 症。因此，位在這些純種系斑塊使這些病患位居非常高危 險範疇，並且完全切掉受影響區域是有正當理由的。 另外一項得自本實施例的重點係關於染色和未染色區域 的爭論。在幾乎所有情形之中，染色與未染色區域兩者共 同有一樣的純種系基因變化。根據頭部和頸部癌症之純種 系演進模式的闡明，清楚知道大多數其有再發之頭項癌病 患具有異常上皮之大斑塊。從染色區之切片亦顯示同樣的 純種系基因變化並不令人驚訝。重要的是，至少有三個情 形是只有從染色區得到的切片透露了純種系的基因變化， 而未染色區並顯示這些變化。這可能是由於這些病患身上 有較小的純種系斑塊，並且進而支持了使用染劑染色在鑑 認異常損害上的用途。 清楚地，M a s h b e r g型的方法鑑認出病患之原位腫瘤以及 癌症，這可由標準形態覺分析確認。顯著的是其他刪除的 損害有大部份顯示正常或在顯微鏡下有組織異常（且已另 外分類為得自M a s h b e r g方法之π假陽性π ，但是那些損害仍 然匿藏著重要的對癌症演進必需之純種系基因變化。 因此，M a s h b e r g型式的方法代表一種有用於 <貞測癌症， 以及非常可能進展成癌症之損害的有力方法。在這方面對

第15頁 1280366 五、發明說明（13) - 於染色鑑認之損害進行切片是適當的，其可（A )造成治療 因為該損害可藉進一部切除而完全移除掉，或（B )適當地 將病患列入南危險範鳴中，藉由純種系基因進展的文件證 明。 我以此種說明方式揭示本發明，以使熟習此技藝者得以 瞭解並實行之，並且鑑認其目前最佳之具體實例。

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Claims (1)