MXPA03012030A - Anticuerpos humanizados derivados de dd-3b6/22, especificos para el fragmento de dimero d de fibrina. - Google Patents

Abstract

La presente invencion es dirigida a formas humanizadas del anticuerpo monoclonal de raton DD-3B6/22. Este anticuerpo es especifico para dimero D, un fragmento de degradacion de polimeros de fibrina reticulados. La invencion tambien incluye el uso de estos anticuerpos para detectar coagulos sanguineos in vivo.

Description

ANTI CU ERPOS H U MAN IZADOS DERIVADOS DE DD-3B6/22, ESPECIFICOS PARA EL FRAGMENTO DE DIW1ERO D DE FI BRINA CAMPO D E LA I NVENCIO N La presente invención se refiere de manera general a moléculas portadoras derivadas de una especie o raza de animal o de ave y las cuales son substancialmente no inmunogénicas cuando se exponen a un sistema inmune de una especie o raza de otra criatura animal o ave. De manera más particular, la presente invención proporciona moléculas inmunointeractivas desinmunizadas y aún más particularmente anticuerpos desinmunizados para uso en aplicaciones diagnósticas y terapéuticas.

ANTECEDENTES D E LA INVENCIO N Los detalles bibliográficos de las publicaciones referidas en esta especificación son recolectados al final de la descripción. La referencia a cualquier técnica anterior en esta especificación no es, y no debería ser tomada como, un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia de que esta técnica anterior forma parte del conocimiento general común en cualquier país. El fibrinógeno es una molécula de proteína grande, el cual normalmente circula en plasma sanguíneo en un estado disuelto. En la presencia de trombina, las moléculas de fibrinógeno forman polímeros similares a hilos largos o redes llamadas fibrina, la cual es el ingrediente principal de los coágulos sanguíneos. Sobre la digestión con plasmina, el fibrinógeno forma fragmentos designados A-E-. Los fragmentos D y E son los fragmentos predominantes y existe aproximadamente dos veces tanto de D como existe de E. El fibrinógeno tiene una forma trinodular donde el fragmento E es un componente central y el fragmento D es un componente terminal. Las digestiones de plasmina de fibrina y fibrinógeno pueden ser diferenciadas unas de otras usando electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). La reticulación de fibrina con Factor XI 11 a forma dímeros de fragmento D llamado dímero D. El Factor XI M a es una enzima que introduce enlaces covalentes entre monómeros adyacentes en la fibrina (Budzynski et al., Blood 54(4): 794-804, 1979). El Factor Xllla es activado por la remoción catalizada por trombina de un péptido de un precursor en plasma y en plaquetas snaguíneas. El dímero D es una molécula de aproximadamente 189,000 daltones, la cual consiste esencialmente de dos porciones de fragmento D derivadas de diferentes moléculas de fibrina unidades covalentemente por enlaces de reticulación entre los remanentes de cadena ? de fibrinógeno. El fibrinógeno comprende por sí mismo seis cadenas con dos copias de una cadena a, ß y ?. Otro complejo (DD)E es formado mediante degradación de plasmina de fibrina humana reticulada y comprende una combinación de dos fragmentos D y fragmento E. Otros derivados reticulados son descritos por Graeff y Halfer (Graeff y Halfer, "Detection and Relevance of Cross-linked Fibrin Derivatives in Blood" (Detección e importancia de derivados de fibrina reticulados en la sangre), Seminars in Thrombosis and Hemostatis 8(1), 1982) e incluyen derivados reticulados de alto peso molecular, tales como DY, YY, XD, XY, DXD y YXD. La hemostasis normal o coagulación de sangre involucra mantener constituyentes intravasculares en una fase líquida o suspensión mientras que se permite de manera concomitante la deposición local de componentes de sangre de fase sólida en áreas de daño de vasos. En la salud, se ha asumido, pero nuncia se ha demostrado experimentalmente, que existe un balance entre una deposición intravascular de bajo grado de fibrina y su remoción mediante fibrinólisis o fagocitosis celular. Las observaciones clínicas tempranas revelaron que algunos pacientes severamente enfermos desarrollaron signos de hemorragia y amoratado masivo y tuvieron tiempos de coagulación prolongados y trombocitopenia. En postmorten, en algunos casos, los trombos de fibrina fueron demostrados en la microvasculatura. La naturaleza difusa de estos trombos dieron origen a coagulación intravascular diseminada (DIC) también conocida como coagulopatía consutiva. Subsecuentemente, los trombos fueron asociados con condiciones tales como trombosis de vena profunda (DVT) y embolismo pulmonar (PE). Las condiciones tales como DIC, DVT y PE involucran la activación del sistema de coagulación que resulta en consumo de plaquetas, generación de trombina, deposición de fibrina y fibrinólisis secundaria. El efecto biológico neto de este proceso refleja un balance entre la deposición de fibrina y evacuación de fibrina. Las manifestaciones clínicas resultantes pueden ser hemorragia, cuando predomina la supresión de factores de coagulación, o daño de tejido isquémico, debido a los efectos de la oclusión vascular entre otras condiciones.

DIC, DVT y PE han sido reportados como un fenómeno secundario en una amplia variedad de desórdenes, en particular aquéllos acompañados por una combinación de choque, acidosis e hipoxemia. Las asociaciones clínicas bien reconocidas son sepsis, trauma mayor, malignidad y desórdenes obstétricos. Recientemente, DVT ha sido reconocida como un problema particular durante el viaje en aire prolongado u otra inmovilidad prolongada. En cualquier caso, la activación de la secuencia de coagulación resulta en el consumo de proteína de coagulación y plaquetas, conduciendo a la deposición de fibrina en la micro-circulación. De manera ideal, un diagnóstico definitivo de condiciones, tales como DIC, DVT y PE requiere la demostración directa de deposición de fibrina difusa. La dificultad práctica para obtener evidencia de biopsia directa múltiple para diferenciar entre formación de fibrina localizada y generalizada ha conducido al desarrollo de pruebas indirectas que son substituidas como puntos finales diagnósticos. Sin embargo, estas pruebas no son específicas para el síndrome de deposición de fibrina intravascular. Su especificidad es reducida adicionalmente por la acción de otras enzimas que aunque no son capaces de convertir el fibrinógeno a fibrina, pueden provocar alteraciones simlares a trombina en lo demás factores de coagulación involucrados en la trombosis. Todas las pruebas indirectas se basan en el principio de que la trombina es la única enzima (excluidos los venenos de víboras) capaz de convertir el fibrinógeno a fibrina en mamíferos. Además, aparte de las pruebas de paracoagulación que detectan la presencia de complejos de monómeros de fibrina solubles, en circulación, ninguna de las pruebas específicas de trombina más específicas están fácilmente disponibles útiles para aplicación clínica inmediata en el diagnóstico de estas condiciones asociadas con fibrina. Estas pruebas incluyen ia prueba de FPA (fibrinopéptido A), donde FPA es medido mediante un procedimiento de RIA específico, ensayos de monómeros de fibrina, cromatografía de exclusión de gel de fibrinógeno y pruebas para FPB (fibrinopéptido B) o FBP incrementable por trombina. Las pruebas con no especificidad bioquímica para acción de trombina incluyen las pruebas de tiempo de protrombina (PT), tiempo de tromboplastina (A PTT) y tiempo de coagulación de trombina (TCT). Aunque frecuentemente útiles en la práctica, debe reconocerse que la información obtenida de estas pruebas es de naturaleza no específica, actuando como una medida de supresión de factor de coagulación sin importar la etiología. Los ensayos de factor de coagulación también han sido encontrados por ser relativamente no específicos y estos incluyen ensayos de cofactores V y VIII, así como pruebas para niveles de fibrinógeno. Las pruebas de productos de degradación de fibrina-fibrinógeno hasta ahora no han probado ser específicas para la acción de plasmina en fibrina y pueden producir resultados positivos donde ha habido fibrinogenólisis sin acción de trombina previa sobre la molécula de fibrinógeno. Estas pruebas incluyen pruebas para fragmentos D y E. Las pruebas para interacción o liberación de plaquetas mediada por trombina han sido encontradas de naturaleza no específica. Estas incluyen cuenta de plaquetas, supervivencia de plaquetas y pruebas de liberación de plaquetas. También se ha intentado el uso de fibrinógeno radio marcado en relación con identificar los factores de coagulación, pero se ha encontrado que el lento y difícil de realizar. De esta manera, la eficacia de una prueba diagnóstica se basa en su capacidad para indicar la presencia o ausencia de enfermedad. Existen principios de diseño esenciales bien reconocidos para estudios que determinan la eficacia de una prueba diagnóstica, la cual permita que se determinen los cuatro índices de sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo. El primer requerimiento es la adopción de un estándar adecuado para diagnóstico. De manera ideal, este estándar debería ser ligeramente más de una definición clínica y debería ser tan específico como sea posible para la entidad de enfermedad. Una dificultad inherente en relación a DVT y PE en particular, es que muchas de las pruebas de laboratorio rutinariamente disponibles también carecen de especificidad diagnóstica. Una cuenta de plaquetas baja soporta la posibilidad de estas condiciones, pero puede ocurrir como un hallazgo aislado secundario a una infección. Limitaciones similares aplican a muchos de los ensayos de coagulación. La hipofribrinogenemia no distingue entre fibrinólisis primaria, debido ya sea la acción de plasmina o elastasas y la fibrinólisis secundaria siguiendo la conversión mediada por trombina de fibrinógeno a fibrina. De manera alternativa, las pruebas sensibles de acción de trombina están disponibles, pero existen desventajas obvias con su uso clínico. Un ejemplo es el ensayo de FPA el cual, aunque específico para la acción de trombina, es exquisitamente sensible y puede detectar coagulación intravascular localizada, produciendo un resultado positivo en trombosis venosa sin complicar. La importancia clínica de un nivel de FPA elevado, aún con una prueba de paracoagulación positiva, está entonces en cuestión, en particular si la cuenta de plaquetas, pruebas de coagulación globales y nivel de fibrinógeno son normales. Por estas razones, sensibilidad, especificidad y valores predictivos no pueden ser determinados en una manera estándar. La presentación clínica de estos desórdenes es compleja e impredecible. La aplicación de las pruebas disponibles para diagnóstico son, por lo tanto, mejor consideradas en relación a los diferentes síndromes clínicos de coagulación intravascular. El anticuerpo monoclonal de murlno 3B6 fue descrito (patente estadounidense no.4,758,524). Este anticuerpo es específico para dímero D y representa el primer anticuerpo específico de coágulo. Sin embargo, la capacidad para usar este anticuerpo, en humanos como un agente diagnóstico sistémico es limitada debido a la inmunogenicidad de la molécula. Por lo tanto, existe una necesidad, para modificar el anticuerpo 3B6 para reducir su inmunogenicidad en animales que no sean murinos y humanos.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION A lo largo de esta especificación, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, la palabra "comprender", o variaciones tales como "comprende" o "comprendiendo", serán entendidas para implicar la inclusión de un elemento, entero o grupo de elementos o enteros declarados, pero no la exclusión de cualquier otro elemento o entero o grupo de elementos o enteros. Los artículos "un" y "una" se usan en la presente para referirse a uno o más de uno (es decir al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A manera de ejemplo, "un elemento" significa uno elemento o más de un elemento. En el trabajo que conduce a la presente invención, la tecnología de desinmunización se usó para reducir la inmunogenicidad del anticuerpo 3B6. Esto ha permitido el desarrollo de un procedimiento diagnóstico de formación de imágenes de trombosis para uso en humanos. Adicionalmente, la forma desinmunizada del anticuerpo 3B6 permite su uso como un agente enfocador de coágulo para entregar agentes de disolución de coágulo o prevención de crecimiento de coágulos, tales como anticoagulantes al sitio de un coágulo. Las moléculas desinmunizadas de la presente invención actúan por lo tanto, como portadores de agentes diagnósticos y terapéuticos a un sitio objetivo, tal como un coágulo. Las moléculas también pueden tener sus propias propiedades diagnósticas o terapéuticas. El desarrollo de una forma desinmunizada del anticuerpo 3B6 tiene aplicación para un rango de condiciones, tales como DVT y PE. Adicionalmente, los anticuerpos 3B6 desinmunizados pueden ser usados en combinación con medicina nuclear tomográfica asistida por computadora o técnicas de formación de imágenes planas, tales como CT, MRI o ultrasonido.

La presente invención proporciona, en consecuencia, una molécula portadora generalmente en la forma de una molécula inmunointeractiva y en particular un anticuerpo monoclonal hecho quimérico y/o mutado en relación a una molécula madre, de manera que exhibe capacidad reducida para la inmunogenicidad en un huésped objetivo, tal como un humano. El proceso de quimerismo o mutación es referido en la presente como desinmunización. En una modalidad particularmente preferida, la molécula inmunointeractiva, tal como el anticuerpo monoclonal, es humanizada para reducir su inmunogenicidad en humanos. La desinmunización puede ser conducida en diferentes maneras, pero en una modalidad preferida, uno o más aminoácidos en la región variable (v) de un anticuerpo monoclonal son mutados (por ejemplo, substituidos) para reducir el reconocimiento MHC II de péptidos derivados de esta región. En otras palabras, el proceso de desinmunización es dirigido a reducir una respuesta inmune mediada por epitope de células T al anticuerpo. El anticuerpo más preferido de la presente invención es una forma desinmunizada de anticuerpo monoclonal de murino 3B6, el cual exhibe la especificidad para el dímero D. La generación de una forma desinmunizada de 3B6 permite el desarrollo Ínter alia de un agente enfocador de coágulo sistémico para coágulos sanguíneos en humanos esto permite su uso como un agente formador de imágenes y como un vehículo para entregar agentes de disolución de coágulo o de prevención de crecimiento de coágulo, tal como al sitio de un coágulo. Por lo tanto, el anticuerpo desinmunizado actúa solo o como un portador para un rango de agentes diagnósticos y/o terapéuticos.

De acuerdo con esto, un aspecto de la presente invención proporciona una variante de una molécula inmunointeractiva que comprende una porción que tiene especificidad para derivados de fibrina reticulados y dicha porción es derivada de una molécula inmunointeractiva obtenible de una criatura animal o ave, en donde la variante exhibe inmunogenicidad reducida en otra criatura animal o ave de la misma o diferente especie. De preferencia, la molécula inmunointeractiva es un anticuerpo monoclonal variante que comprende una porción que tiene especificidad para derivados de fibrina reticulados. Más preferiblemente, el anticuerpo monoclonal es una variante de un anticuerpo monoclonal derivado de murino que tiene especificidad para dimero D derivado de humano y otros derivados de fibrina reticulados y no reactividad con fibrinógeno o productos de degradación de fibrinógeno incluso de fragmentos D y E, en donde el anticuerpo monoclonal derivado de murino variante es substancialmente no inmunogénico en un humano. De preferencia, el anticuerpo es una molécula de anticuerpo desinmunizado que tiene especificidad por un epitope reconocido por el anticuerpo monoclonal 3B6 y comprende al menos una de las regiones determinantes complementarias (CDRs) del dominio variable derivado del anticuerpo monoclonal 3B6 y las partes derivadas de inmunoglobulina restantes de la molécula de anticuerpo desinmunizada son derivadas de una inmunoglobulina o un análogo de la misma del huésped para el cual se va a desinmunizar el anticuerpo. La presente invención proporciona, por lo tanto, una molécula de anticuerpo desinmunizada que tiene especificidad para un epitope reconocido por el anticuerpo monoclonal 3B6, en donde al menos una de las regiones determinantes com plementarias (CDRs) del dom inio variable de dicho anticuerpo desinmunizado es derivado de anticuerpo m onoclonal 3B6, en donde uno o más aminoácidos en una región variable de dicho anticuerpo 3B6 es m utado para red ucir el reconocimiento de MHC clase I I de péptidos derivados de esta región . La presente i nvención proporciona además una variante de anticuerpo monoclonal de m urino 3B6 desin m unizado para uso en humanos comprendiendo una o más mutaciones de aminoácidos en la región v del anticuerpo 3 B6 desig nada para elim inar o reducir los fragmentos de péptidos de la región v que se asocia con la molécula de MH C clase I I . Las molécu las in munointeractivas desinmun izadas son útiles solas o como portadores de agentes diagnósticos y/o terapéuticos a un sitio objetivo, tal como un coágu lo de sangre. De acuerdo con esto, la presente invención contempla un método para detectar un coágulo sangu íneo en un paciente h u mano al introducir en el paciente una forma desinmunizada de anticuerpo monoclonal de m urino 3B6 o u n fragmento de unión de antígen del mismo, marcado con una molécula reportadora q ue perm ite la disem inación del anticuerpo marcado a través del sistema circulatorio y entonces someter al paciente a un medio de detección de molécula reportadora para identificar la ubicación del anticuerpo en un coágulo. En una modalidad alternativa, la forma desinmunizada de 3B6 no está marcada, pero un segundo anticuerpo que tiene especificidad anti- inmunoglobulina es marcado. Este anticuerpo forma un complejo marcado con el primer anticuerpo mencionado. Como un portador, el portador desinmunizado puede entregar cualquier molécula de unión de coágulo al sitio de un coágulo así como otros agentes diagnósticos o terapéuticos. Por lo tanto, la presente invención contempla el uso de un anticuerpo monoclonal de murino desinmunizado específico para el dímero D u otros derivados de fibrina reticuiados en la fabricación de agente de formación de imágenes de coágulo. Todavía otro aspecto de la presente invención contempla un método para facilitar la disolución o remoción de un coágulo sanguíneo en un humano, comprendiendo dicho método administrar a dicho humano una cantidad efectiva de disolución de coágulo o prevención de crecimiento de coág ulo de un anticuerpo monoclonal derivado de murino variante, que tiene especificidad para dímero D derivado de humano y otros derivados de fibrina reticuiados y no reactividad con fibrinógeno o productos de degradación de fibrinógeno, incus de fragmentos D y E, en donde dicho anticuerpo monoclonal derivado de murino variante es substancialmente no inmunogénico en un humano, en donde dicho anticuerpo monoclonal comprende además un agente de disolución de coágulo o prevención de crecimiento de coágulo fusionado, unido o asociado de otra manera al mismo. Todavía otro aspecto de la presente invención es dirigido al uso de un anticuerpo monoclonal derivado de murino variante que tiene especificidad para dímero D derivado de humano y otros derivados de fibrina reticulados y no reactividad con fibrinógeno o productos de degradación de fibrinógeno, incluso de fragmentos D y E, en donde dicho anticuerpo monoclonal derivado de murino variante es substancialmente no inmunogénico en un humano y dicho anticuerpo comprende además un agente de disolución de coágulo o prevención de crecimiento de coágulo fusionado, unido o atado de otra manera al mismo en la fabricación de un medicamento para la disolución de un coágulo sanguíneo en un humano. Una molécula preferida es un anticuerpo monoclonal de murino variante 3B6 desinmunizado para uso en humanos y que com prende una combinación de regiones v de cadena pesada y ligera, que comprende las secuencias de aminoácidos codificadas por secuencias de nucleótidos seleccionadas de SEQ ID NO:7/SEQ I D NO: 10, SE IDNO:8/SEQ ID NO: 10, SEQ I D NO:9/SEQ I D NO: 1 0, SEQ ID NO:7/SEQ I D NO: 12, SEQ ID NO:8/SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:8/SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO:9/SEQ I D NO: 1 1 , SEQ ID NO:9/SEQ ID NO: 1 2 y SEQ I D NO:7/SEQ I D NO: 1 1 , o combinaciones de aminoácidos codificados por secuencias de nucleótidos teniendo al menos 70% de similitud a una o ambas secuencias de aminoácidos en cada uno de los pares listados antes o secuencias de nucleótidos capaces de hibridar a condiciones de baja severidad a una o ambas secuencias de nucleótidos o sus formas complementarlas en cada uno de los pares listados antes. El anticuerpo 3B6 variante desinmunizado para uso de preferencia comprende una combinación de regiones v de cadena pesada y ligera, comprendiendo las secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NO: 1 /SEQ ID NO:4, SEQ I D NO:2/SEQ I D NO:4, SEQ I D NO:3/SEQ I D N0:4, SEQ I D N0: 1/SEQ I D N0:6, SEQ I D N0:2/S EQ I D N0:6, SEQ ID N0:2/SEQ I D N0:5, SEQ I D NO:3/SEQ I D N0:5, SEQ ID NO:3/SEQ ID N0:6 y SEQ ID N0. 1 /SEQ I D N0:5 o combinaciones de secuencias de aminoácidos teniendo al menos 70% de similitud a una o ambas secuencias de aminoácidos en cada uno de los pares listados antes. Otra variante preferida de 3B6 comprende una combinación de regiones v de cadena pesada y ligera seleccionadas de VHv5/VKv1 , VHv6/VKv1 , VHv7/VKv1 , VHv5/V v7, VHv6/VKv7, VHv6/VKv4, VHv7/VKv4, VHv7/Vku7 y VHv5/VKv4. Otro aspecto de la prsente invención contempla un método para detectar un coágulo sanguíneo en un paciente humano al introducir en el paciente una forma desinmunizada de anticuerpo monoclonal de murino 3B6 o un fragmento de unión de antígeno del mismo, marcado con una molécula reportadora, que permite la diseminación del anticuerpo marcado a través del sistema circulatorio y entonces se somete al paciente a una exploración de medicina nuclear tomográfica asistida por computadora para visualizar el coágulo. Todavía otro aspecto de la presente invención contempla un método para detectar un coágulo sanguíneo en un paciente humano al introducir en el paciente una forma desinmunizada de anticuerpo monoclonal de murino 3B6 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, marcado con una molécula reportadora que permite la diseminación del anticuerpo marcado a través del sistema circulatorio y entonces se somete dicho paciente a formación de imágenes de coágulo planas para visualizar el coágulo.

La molécula inmunointeractiva desinmunizada de la presente invención también es útil para anclar un anti-coagulante en un sitio particular. Este aspecto proporciona, por lo tanto, un anclaje específico de tejido de un agente diagnóstico o terapéutico a, por ejemplo, un coágulo. Adicionalmente, la molécula inmunointeractiva puede ser diseñada para tener especificidades múltiples. Por ejemplo, un anticuerpo desinmunizado bi-específico es contemplado, el cual comprende una especificidad para un coágulo y otra especificidad para un sitio de un coágulo (por ejemplo, a una receptor celular). Esto permite que el anticuerpo permanezca en el sitio del coágulo. En una alternativa, un tratamiento de múltiples pasos es contemplado donde, por ejemplo, 3B6 desinmunizado u otra molécula interactiva conjugada a un anti-coagulante es administrada para enfocar el coágulo y forma un complejo y entonces un segundo anticuerpo es dirigido al primer anticuerpoy/o el anti-coagulante es administrado para intensificar o monitorear el primer complejo. La molécula inmunointeractiva desinmunizada también puede ser usada para determinar la cinética de la disipación de coágulo o desaparición de coágulo. Esto es útil para predecir incluso antes la aparición o desaparición de coágulos y, de ahí, ayuda a determinar la cinética de cuando iniciar segundos tratamientos, tales como tratamientos anti-coagulantes. La presente invención proporciona además conjugados que comprenden las moléculas inmunointeractivas desinmunizadas y etiquetas de formación de imágenes y/o teraéuticas. Ejemplos de etiquetas de formación de imágenes incluyen etiquetas de MRI, ultrasonido y CT. Ejemplos de etiquetas terapéuticas incluyen isótopos radioactivos, agentes anti-coagulantes y citocinas. Un resumen de identificadores de secuencias usados a lo largo de la presente especificación es provisto en la Tabla 1.

TABLA 1 Resumen de identificadores de secuencias BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una representación que muestra (A) un esquema del anticuerpo monoclonal 3B6; (B) una fotografía de 3B6 que une a coágulos sanguíneos (aumentox4,2000).

La Figura 2 es una representación esquemática de un anticuerpo 3B6 marcado con una etiqueta nuclear (99mTc)~ La Figura 3A es una representación diagramática que muestra la administración de 3B6 9SmTc al sistema circulatorio de un humano. La Figura 3B es una representación fotográfica que muestre la visualización de coágulos de sangre en los muslos anteriores como radiación de concentrados de 99mTc en el sitio de coágulo. Las Figuras 4A, 4B y 4C son representaciones gráficas que muestran el ensayo de captura de dimero D que usa anticuerpos monocíonales 3B6 desinmunizados.

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La presente invención es denotada en parte en la aplicación de técnicas bioquímicas para hacer una molécula inmunointeractiva derivada de una criatura animal o ave substancialmente no inmunogénica en otra criatura animal o ave de la misma o diferente especie. El proceso bioquímico es referido en la presente como "desinmunización". La referencia en la presente a "desinmunización" incluye procesos, tales como injerto de región determinante complementaria (CDR), "redimensionado" con respecto a una región de marco de trabajo de una molécula inmunointeractiva y mutación de región variable (v), todos dirigidos a reducir la inmunogenicidad de una molécula inmunointeractiva en un huésped particular. En el presente caso, la molécula inmunointeractiva preferida es un anticuerpo, tal como un anticuerpo policlonal o monoclonal. En una modalidad muy preferida, la molécula inmunointeractiva es un anticuerpo monoclonal , derivado de una criatura an im al o ave y la cual exhibe inmu nogenicidad reducida en otra criatura anim al o ave de la misma o diferente especie. La presente invención se refiere de manera general a moléculas portadoras de una especie o raza ani mal o de ave y las cuales son substancialmente no inmunogénicas cuando se exponen a un sistema inmune de una especie o raza de otra criatura an imal o ave. Las moléculas portadoras pueden exhibir propiedades d iag nósticas o terapéuticas útiles per se o pueden ser usadas para entreg ar compuestos activos (por ejem plo, agentes anti-coag ulado , isótopos radioactivos) a un sitio objetivo. De manera general, las moléculas portadoras son m oléculas ¡n mun ointeractivas. De manera más particular, la presente invención es dirigida a u n anticuerpo monoclonal derivado de m urino desinmunizada incluyendo una forma mamiferalizada no de murino substancialmente incapaz de inducir una respuesta inmune contra sí mismo en un animal no de m urino y en particular un humano. Aún más particularmente, la presente invención proporciona una forma desinm unizada de anticuerpo monoclonal de mu rino 3B6, de manera que que es incapaz de, o exhibe capacidad reducida para, inducir una respuesta inm une substancial contra sí m ismo o sus derivados cuando se administra a un humano. Las moléculas ¡nm unointeractivas desinm unizadas y en particular anticuerpos de la presente invención, tienen un rango de aplicaciones diagnósticas y terapéuticas útiles, tal como en la detección de coágulos s angu íneos en el sistem a circu latorio de un h umano y com o un agente enfocador de coág ulos para entregar un agente de disolución de coág ulo o prevención de creci miento de coág u lo, tal com o u n anticoagulante. Las formas desinmunizadas incluyendo humanizadas del presente anticuerpo monoclonal son particularmente útiles en el diagnóstico y tratamiento de condiciones , tales como trom bosis de ven a profunda y embolismo pulm onar. Las moléculas de la presente i nvención son particu larmente úti les como agentes para entregar compuestos activos a un sitio objetivo. Tales compuestos activos incluyen moléculas de unión de coágulos. De acuerdo con esto, un aspecto de la presente invención proporciona una variante de una molécula inm u no interactiva, dicha variante comprende u na porción que tiene especificidad por derivados de fibrina reticulados y dicha porción es derivada de una molécula inmunointeractiva obtenible de una criatura animal o ave, en donde dicha variante exh ibe inmunogenicidad reducida en otra criatura animal o ave de la m isma o diferente especie. Como se declara antes, la forma preferida de molécula inmunointeractiva es un anticuerpo y en particular un anticuerpo monoclonal . De acuerdo con esto, otro aspecto de la presente invención proporciona un anticuerpo monoclona l variante que comprende una porción que tiene especificidad por derivados de fibrina reticu lados y dicha porción es derivada de u n anticuerpo monoclonal obteni ble de u na primera criatura animal o ave, en donde d icha variante exhibe inm unogenicidad reducida en una seg unda criatura animal o ave de la mism a o diferente especie. En una modalidad particul armente preferida, un a nticuerpo monoclonal es obtenido de un animal de murino y es desinmunizado con respecto a otro animal de murino o una especie diferente de animal, tal como un humano. El anticuerpo monoclonal de murino es cultivado en el animal de murino a un dímero D no desnaturalizado, el cual es derivado de fibrinógeno. La última molécula es digerida por plasmina y genera un rango de fragmentos designados fragmentos A a E. La reticulación de fibrina con Factor Xllla forma dímeros de fragmento D referidos como "dímero D". El dímero D es una molécula de aproximadamente 189,000 daltones y comprende dos porciones de fragmento D unidas por enlaces reticulados entre los remanentes de cadena ? de fibrinógeno. De acuerdo con esto, otro aspecto de la presente invención es dirigido a un anticuerpo monoclonal derivado de murino variante que tiene especificidad por dímero D derivado de humano y otros derivados de fibrina reticulados y no reactividad con fibrinógeno o productos de degradación de fibrinógeno, incluso de fragmentos D y E, en donde dicho anticuerpo monoclonal derivado de murino variante es substancialmente no inmunogénico en un humano. La referencia a "substancialmente no inmunogénico" incluye inmunogenicidad reducida comparada con un anticuerpo padre, es decir, un anticuerpo antes de la exposición a procesos de desinmunización. El término "inmunogenicidad" incluye una capacidad para provocar, inducir o facilitar de otra manera una respuesta humoral y/o mediada por células T en un animal huésped. Los criterios inmunogénicos particularmente convenientes incluyen la capacidad de secuencias de aminoácidos derivados de una región variable (v) de un anticuerpo para interactuar con moléculas MHC clase I I , estimulando o facilitando con ello una respuesta mediada por células T que incluye una respuesta humoral asistida por células T. La molécula inmunointeractiva y en particular, un anticuerpo monoclonal contemplado por la presente invención , incluye referencia a un agente enfocador de coágulos. El anticuerpo monoclonal derivado de murino preferido es referido en la presente como anticuerpo monoclonal 3B6, el cual es descrito en la patente estadounidense no. 4, 758,524. De acuerdo con esto, en una modalidad particularmente preferida, la presente invención proporciona una forma desinmunizada de anticuerpo monoclonal 3B6, en donde dicho 3B6 desinmunizado es substancialmente no inmunogénico en humanos. Nuevamente, "substanciamente no inmunogénico" en este contexto significa una capacidad reducida del anticuerpo monoclonal 3B6 desinmunizado para inducir o facilitar una respuesta inmune contra sí mismo (siguiendo la administración inicial o subsecuente) en un humano comparado con un anticuerpo monoclonal de murino 3B6, antes de la desinmunización. Aunque la invención preferida es dirigida en particular a una forma desinmunizada de 3B6 con respecto a humanos, la presente invención se extiende a este anticuerpo u otro anticuerpo con una especificidad similar para dímero D y/u otros derivados de fibrina reticulados desinmunizados para cualquier otra especie animal o ave. Referencia en la presente a otros derivados de fibrina reticulados incluye, por ejemplo, además del dímero D, derivados de dímero D y un complejo comprendiendo fragmentos D y E. El último incluye (DD)E y se forma mediante degradación de plasmina de fibrina humana reticulada y comprende una combinación de dos fragmentos D y fragmento E. Otros derivados reticulados incluyen DY, YY, XD, XY, DXD y YXD, donde las letras representan fragmentos de fibrinógeno formados siguiendo la degradación por plasmina, en donde X y Y son diferentes y son seleccionados de fragmentos A a C y E. De preferencia, el anticuerpo desinmunizado de la presente invención es derivado de un anticuerpo específico para dímero D y otros derivados de fibrina reticulados, pero el cual no reacciona cruzado con fibrinógeno , productos de degradación de fibrinógeno incluso de fragmento D y fragmento E. De preferencia, los clones productores de anticuerpos son seleccionados usando moléculas de dímero D de fase de solución en lugar de dímero D inmovilizado, aunque los clones seleccionados por cualquier forma de dímero D son contemplados por la presente invención. De preferencia, el anticuerpo desinmunizado exhibe una afinidad por su antígeno objetivo, el cual es similar a la afinidad exhibida por anticuerpo monoclonal de murino 3B6. Por "afinidad", en relación a la interacción entre un sitio de unión de antigeno individual en una molécula de unión de antígeno y su sitio correspondiente en el antígeno incluye la fuerza de esta interacción. Por "anticuerpo" se quiere decir una proteína de la familia de inmunoglobulina que es capaz de combinar, interactuar o asociarse de otra manera con un antígeno. Por (o tanto, un anticuerpo es, una molécula de unión de antígeno. Un "anticuerpo" es un ejemplo de una molécula inmunointeractiva e incluye un anticuerpo policlonal o monoclonal. Las moléculas inmunointeractivas preferidas de la presente invención son anticuerpos monoclonales. Un anticuerpo incluye partes del mismo, incluyendo porciones Fab y determinantes de unión de antígeno. El término "antígeno" es usado en la presente en su sentido más amplio para referirse a una substancia que es capaz de reaccionar en y/o inducir una respuesta inmune. La referencia a un "antígeno" incluye un determinante antigénico o epitope. El antígeno en el presente contexto es considerado como la molécula inmunointeractiva y, de manera más particular, un anticuerpo monoclonal. Cualquier molécula que tiene afinidad de unión por un antígeno objetivo es referida como una "molécula de unión de antígeno". Se entenderá que este término se extiende a inmunoglobulinas (por ejemplo, anticuerpos policlonales o monclonales), fragmentos de inmunoglobulina y marcos de trabajo de proteína derivados no derivados de inmunoglobulina que exhiben actividad de unión de antígeno. Los términos "anticuerpo" y "moléculas de unión de antígeno" incluyen formas desinmunizadas de estas moléculas. Esa parte de una molécula antigénica contra la cual una respuesta inmune particular es dirigida es referida como un "determinante antigénico" o "epitope" e incluye un hapteno. Normalmente, en un animal, los antígenos presentan varios o incluso m uchos determinantes antigénicos simultáneamente. Un "hapteno" es una substancia que puede combinar la especificidad con un anticuerpo pero no puede o solamente induce pobremente una respuesta inmune a menos que se una a un portador. Un hapteno normalmente comprende un solo determinante antigénico o epitope. Como se declara antes, aunque los anticuerpos preferidos de la presente invención son formas desinmunizadas de anticuerpos monoclonales de murino para uso en humanos, la presente invención se extiende a anticuerpos a partir de cualquier fuente y desinmunizados para uso en cualquier huésped. Ejemplos de fuentes y huéspedes animales y de aves incluyen humanos, primates, animales de ganado (por ejemplo, borregos, vacas, caballos, cerdos, burros), animales de pruebas de laboratorio (por ejemplo, ratones, conejos, conejillos de Indias, hámsters), animales de compañía (por ejemplo, perros, gatos), aves de corral (por ejemplo, pollos, patos, gansos, pavos) y aves de caza (por ejemplo, faisanes). Los anticuerpos desinmunizados o parte de los mismos también pueden ser generados en tejidos no animales, tales como plantas. Las plantas son particularmente útiles como una fuente de anticuerpos de cadena simple. Otro aspecto de la presente invención contempla un método para generar un anticuerpo monoclonal desinmunizado teniendo especificidad por determinantes antigénicos en dímero D humano u otros derivados de fibrina reticulados, comprendiendo dicho método: (i) obtener un derivado de fibrina reticulado o extracto conteniendo el mismo a partir de un humano; (ii) generar un anticuerpo en un animal no humano específico a dicho derivado de fibrina reticulado, pero el cual no reacciona cruzado con el fragmento D; y (üi) someter dicho anticuerpo derivado no de humano a medios de desinmunización. El derivado de fibrina reticulado puede ser derivado de cualquier extracto antigénico adecuado incluyendo degradación mediada por plasmina de coágulos de fibrina o mediante acción simultánea de trombina, Factor Xllla y plasmina sobre fibrinógeno con formación de coágulo transiente y lisis de coágulo subsecuente. En el último método, el fibrinógeno es convertido a fibrina por la acción de trombina y Factor Xllla y subsecuentemente es digerido con plasmina. Por supuesto, se apreciará que el derivado de fibrina o extracto conteniendo el mismo puede ser obtenido de una fuente animal diferente al humano. La fuente antigénica es convenientemente de una muestra biológica. Una muestra que puede ser extraída, sin tratar, tratada, diluida o concentrada de un animal es incluida en el término "muestra biológica". El método anterior para obtener la fracción antigénica cruda representa un método in vitro. Un método in vivo adecuado incluye obtener sueros u otro fluido corporal conteniendo el derivado de fibrina reticulado de un animal incluyendo humano y someter el fluido corporal a un proceso de PAGE, en donde el derivado de fibrina reticulado substancialmente puro es aislado. De manera alternativa, los derivados de fibrina reticulados pueden ser purificados a partir de suero obtenido de pacientes que sufren varios desórdenes trombóticos basados en una técnica que usa filtración en gel en combinación con cromatografía de intercambio de iones como se describe por Willner et al., Bioc emistry 21: 2687-2692, 1982.

El antígeno (es decir, dímero D u otro derivado de fibrina reticulado) puede separarse de la muestra biológica mediante cualquier medio adecuado. Por ejemplo, la separación puede tomar ventaja de cualquiera de una o más de las propiedades de carga de superficie, tamaño densidad, actividad biológica y del antígeno y su afinidad por otra entidad (por ejemplo, otra proteína o compuesto químico al cual se une o se asocia de otra manera) . Así, por ejemplo, la separación del antígeno del fluido biológico puede lograrse mediante cualquier de una o más de ultra-centrifugación, cromatografía de intercambio de iones (por ejemplo, cromatografía de intercambio de aniones, cromatografía de intercambio de cationes), electroforesis (por ejemplo, electroforesis de gel de poliacrilamida, enfoque isoeléctrico), separación por tamaño (por ejemplo, filtración en gel, ultra-filtración) y separación mediada por afinidad (por ejemplo, separación de inmunoafinidad incluyendo, pero no limitada a, separación de perlas magnéticas, tales como separación de DynabeadM , inmunocromatografía, inmunoprecipitación). La elección de la o las técnicas de separación empleadas puede depender de la actividad biológica o propiedades físicas del antígeno particular. De preferencia, la separación del antígeno del fluido biológico conserva epitopes conformacionales presentes en la superficie del antígeno y, así, evita convenientemente técnicas que provoquen la desnaturalización del antígeno. Personas de habilidad en la técnica reconocerán la importancia de mantener o imitar tan cerca como sea posible, condiciones fisiológicas peculiares para el antígeno (por ejemplo, el fluido biológico a partir del cual son obtenidos) para asegurar que los determinantes antigénicos o sitio(s) activo(s) en el antígeno, cuando se exponen al animal, sean estructuralmente idénticos a aquél del antígeno natural. Esto asegura el surgimiento de anticuerpos apropiados en en animal inmunizado que reconocerían el antígeno natural. En una modalidad preferida de este tipo, el antígeno es separado del fluido biológico que usa cualquiera o más de separación por afinidad, filtración en gel y ultra-filtración. La inmunización y producción subsecuente de anticuerpos monoclonales puede ser realizada usando protocolos estándares, como por ejemplo, los descritos por Kóhler y Milstein (Nature 256:495-499, 1975; óhler y Milstein, Eur. J. Immunoí. 6(7): 511-519, 1976), Coligan et al (Current Protocols ¡n Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 1991-1997) o Toyama et al. ("Monoclonal Antibody, Experiment Manual", publicado por Kodansha Scientific, 1987). De manera esencial, un anima! es inmunizado con un fluido biológico conteniendo antígeno o fracción del mismo mediante métodos estándares para producir células productoras de anticuerpos, en particular células somáticas productoras de anticuerpos (por ejemplo, linfocitos B). Estas células pueden ser removidas entonces a partir del animal inmunizado para inmortalización. El antígeno puede necesitar asociarse primero con una molécula más grande. El último es cualquier substancia de peso moleuclar normalmente alto a la cual una substancia no o pobremente inmunogénica (por ejemplo, un hapteno) está enlazado de manera natural o artificial para intensificar su inmunogenicidad. La inmortalización de las células productoras de anticuerpo puede realizarse usando métodos, los cuales son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la inmortalización puede lograrse mediante el método de transformación usando virus Epstein-Barr (EBV) (Kozbor et al., Methods in Enzymology 121: 140, 1986). En una modalidad preferida, las células productoras de anticuerpos son inmortalizadas usando el método de fusión celular (descrito en Coligan et al., 1991-1997, supra), el cual es empleado ampliamente para la producción de anticuerpos monoclonales. En este método, las células productoras de anticuerpos somáticas con el potencial de producir anticuerpos, en particular células B, son fusionadas con una línea de células de mieloma. Estas células somáticas pueden ser derivadas de los nodulos linfáticos, bazos y sangre periférica de animales iniciados, de preferencia animales roedores, tales como ratones y ratas. En la modalidad ejemplar de esta invención, células de bazo de ratón son usadas. Sin embargo, sería posible usar células de rata, conejo, borrego o cabra o células de otra especie animal en su lugar. Las líneas de células de mieloma especializadas han sido desarrolladas a partir de tumores linfocíticos para usarse en procedimientos de fusión productores de hibridoma ( ohler y Milstein, 1976, supra; Shulman et al., Nature 276: 269-270, 1978; Volk et al. J. Virol.4(1): 220-227, 1982). Estas líneas de células han sido desarrolladas por al menos tres razones. La primera es facilitar la selección de hibridomas fusionados de células de mieloma no fusionadas y de auto-propagación indefinida de manera similar. Usualmente, esto se logra al usar mielomas con deficiencias de enzimas que los hacen incapaces de crecer en ciertos medios selectivos que soportan el crecimiento de hibridomas. La segunda razón surge de la capacidad inherente de células linfocíticas de tumor para producir sus propios anticuerpos. Para eliminar la producción de anticuerpos de células de tumor por los hibridomas, las líneas de células de mieloma incapaces de producir luz endógena o cadenas de inmunoglobulina pesadas son usadas. Una tercera razón para la selección de estas líneas celulares es por su conveniencia y eficiencia para fusión. Muchas líneas de células de mieloma pueden ser usadas para la producción de híbridos de células fusionadas, incluyendo, por ejemplo, P3X63-Ag8, P3X63-AG8.653, P3/NS1-Ag4-1 (NS-1), Sp2/0-Ag14 y S194/5.XXO.BU.1. Las líneas de células P3X63-Ag8 y NS-1 han sido descritas por Kohler y Milstein (1976, supra), Shulman et al. (1978, supra) desarrollaron la línea de mieloma Sp2/0-Ag14. La línea S194/5.XXO-Bu.1 fue reportada por Trowbridge (J. Exp. Med. 148(1): 313-323, 1978). Los métodos para generar híbridos de células de nodulo linfático o bazo productoras de anticuerpos y células de mieloma usualmente involucran mezclar células somáticas con células de mieloma en una proporción 10:1 (aunque la proporción puede variar desde aproximadamente 20:1 hasta aproximadamente 1:1), respectivamente, en la presencia de un agente o agentes (químicos, vírales o eléctricos) que promueve la fusión de membranas celulares. Los métodos de fusión han sido descritos (Kohler y Milstein, 1975, supra; Kohler y Milstein, 1976, supra; Gefter et al., Somatic Celi Genet. 3: 231-236, 1977; Volk et al., 1982, supra). Los agentes promotores de fusión usados por aquellos investigadores fueron virus Sendai y polietilenglicol (PEG).

Debido a que los procedimientos de fusión producen híbridos viables a frecuencia muy baja (por ejemplo, cuando los bazos son usados como una fuente de células somáticas, solo un híbrido es obtenido por aproximadamente cada 1 x1 05 céluls de bazo), es preferible tener un medio para seleccionar los híbridos de células fusionadas de las células sin fusionar restantes, en particular, las células de mieloma sin fusionar. Un metido para detectar los hibridomas productores de anticuerpos deseados entre otros híbridos de células fusionadas -resultantes también es necesario. En general, la selección de híbridos de células fusionadas se logra al cultivar las células en medios que soportan el crecimiento de hibridomas, pero previenen el crecimiento de las células de mieloma sin fusionar, las cuales normalmente continuarían dividiéndose indefinidamente. Las células somáticas usadas en la fusión no mantiene viabilidad a largo plazo en cultivo in vitro y de ahí no plantean un problema. En el ejemplo de la presente invención, las células de mieloma que carecen de hipoxantina fosforibosil transferasa (HPRT-negativa) fueron usadas. La selección contra estas células se hace en medio de hipoxantina/aminopterina/timidina (HAT), un medio en el cual los híbridos de células fusionadas sobreviven debido al genotipo HPRT-positivo de las células de bazo. El uso de células de mieloma con diferentes deficiencias genéticas (sensibilidades a medicamento, etc.) que pueden ser seleccionadas contra en medios que soportan el crecimiento de híbridos genotípicamente competentes también es posible. Varias semanas son requeridas para cultivar selectivamente los híbridos de células fusionadas . Temprano en este periodo, es necesario identificar aquellos híbridos que producen el anticuerpo deseado, de manera que puedan ser clonados y propagados subsecuentemente. En general , alrededor de 1 0% de los híbridos obtenidos producen en alticuerpo deseado, a unque un rango desde aproximadamente 1 hasta aproxim adamente 30% no es extraño. La detección de híbridos productores de anticuerpos puede lograrse mediante cualquiera de varios métodos de ensayo estándares, incluyendo técn icas de inm unoensayo enlazado a enzima y radioinmunoensayo com o , por ejem plo, se describe en Kennet et al . ((eds) Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimensión in Biológica! Analyses (Anticuerpos monoclonales e hibridomas: una nueva dimensión en los a nálisis biológicos) , pp. 376-384, Plen um Press, Nueva York, 1 980). En una m odalidad particularmente preferida, un ensayo inmunoabsorbente en l azado a enzim a (ELISA) es rea lizado para clones productores de anticuerpos seleccionados usando el dímero D de fase de solución. Una vez que los h íbridos de células fusionadas deseadas han sido seleccionados y clonados en líneas de células productoras de anticuerpos individ uales , cada l ínea celular puede ser propagada en cua lquiera de dos maneras está ndares. Una suspensión de las células de hibridoma puede ser inyectada en un animal h istocom patible. El animal inyectado desarrollará entonces tumores q ue secretan el anticuerpo monoclonal específico producido por el h íbrido de cél ulas fusionadas. Los fluidos corporales del animal, tales como suero o fluido de ascitis, pueden ser designados para proporcionar anticuerpos monclonales en alta concentración. De manera alternativa, las líneas de células individuales pueden ser propagadas in vitro en vasos de cultivo de laboratorio. El medio de cultivo conteniendo altas concentraciones de un solo anticuerpo monoclonal específico puede ser recolectado por decantación, filtración o centrifugación y purificado subsecuentemente. Las líneas de células son probadas por su especificidad para detectar el antígeno de interés por cualquier medio de inmunodetección adecuado. Por ejemplo, líneas de células pueden dividirse en alícuotas en una variedad de cavidades y pueden ser incubadas y el sobrenadante de cada cavidad es analizado mediante ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA), técnica de anticuerpo fluorescente indirecta o similares. La o las líneas celulares que producen un anticuerpo monoclonal capaz de reconocer el antígeno objetivo, pero que no reconoce epitopes no enfocados son identificadas y entonces son cultivadas directamente in vitro o son inyectadas a un animal histocompatible para formar tumores y para producir, recolectar y purificar los anticuerpos requeridos. De esta manera, la presente invención proporciona en un primer paso, anticuerpos monoclonales los cuales interactúan con dímero D u otro derivado de fibrina reticulado. Como se indica antes, las células no animales, tales como células de planta, levadura y/o microbio, pueden ser usadas para generar anticuerpos normalmente de cadena simple. En esta modalidad, tales células son diseñadas para expresar moléculas de ácido nucleico, las cuales codifican una cadena de un anticuerpo. El anticuerpo monoclonal es sometido entonces a medios de desinmunización. Tal proceso puede tomar cualquiera de una variedad de formas incluyendo la preparación de anticuerpos quiméricos, los cuales tienen la misma especificidad o similar que los anticuerpos monoclonales preparados de acuerdo con la presente invención. Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos cuyos genes de cadena ligera y pesada han sido construidos, normalmente mediante ingeniería genética, a partir de genes de región variable y constante de inmunoglobulina pertenecientes a diferentes especies. De esta manera, de acuerdo con la presente invención, una vez que se obtiene un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal deseado, se usan técnicas para producir anticuerpos monoclonales interespecíficos, en donde la región de unión de una especie se combina con una región no de unión del anticuerpo de otra especie (Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443, 1987). Por ejemplo, las CDRs de un anticuerpo monoclonal no humano (por ejemplo, de murino) puede ser injertado sobre un anticuerpo humano, "humanizando" por ello el anticuerpo de murino (publicación de patente europea no. 0 239 400; Jones et ai., Nature 321: 522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature 332: 323-327, 1988). En este caso, el proceso desinmunizante es específico para humanos. De manera más particular, las CDRs pueden ser injertadas sobre una región variable de anticuerpo humano con o sin regiones constantes humanas. El anticuerpo no humano que proporciona las CDRs es referido normalmente como el "donador" y el anticuerpo humano que proporciona el marco de trabajo es referido normalmente como el "receptor". Las regiones constantes no necesitan estar presentes, pero si están, deben ser substancialmente idénticas a regiones constantes de inmunoglobuiina humana, es decir, al menos aproximadamente 85-90%, de preferencia aproximadamente 95% o más idéntica. De ahí, todas las partes de un anticuerpo humanizado, excepto posiblemente las CDRs, son substancialmente idénticas a partes correspondientes de secuencias de inmunoglobuiina humana natural. De esta manera, un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo que comprende una inmunoglobuiina de cadena ligera humanizada y una cadena pesada humanizada. Se dice que un anticuerpo donador es "humanizado", mediante el proceso de "humanización", debido a que se espera que el anticuerpo humanizado resultante se una al mismo antígeno que el anticuerpo donador que proporciona las CDRs. Referencia en la presente a "humanizado" incluye referencia a un anticuerpo desinmunizado para un huésped particular, en este caso, un huésped humano. Se entenderá que los anticuerpos desinmunizados pueden tener substituciones de aminoácidos conservadoras adicionales, las cuales no tienen substancialmente efecto sobre la unión de antígeno u otras funciones de inmunoglobuiina. Substituciones conservadoras ejemplares pueden hacerse de acuerdo con la Tabla 2.

TABLA 2 Métodos ejemplares que pueden emplearse para producir anticuerpos desinmunizados de acuerdo con la presente invención son descritos, por ejemplo, en Richmann et al. , 1 988, supra; patentes estadounidenses nos. 6,056,957, 6,180,370 y 6,180,377 y Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901, 1987. De esta manera, en una modalidad, la presente invención contempla una molécula de anticuerpo desinmunizada teniendo especificidad para un epitope reconocido por anticuerpo monoclonal 3B6, en donde al menos uno, o al menos dos, o al menos tres, o al menos cuatro, o al menos cinco de las regiones determinantes complementarias (CDRs) del dominio variable de dicho anticuerpo desinmunizado es derivado de dicho anticuerpo monoclonal 3B6 y las partes derivadas de inmunoglobulina restantes de la molécula de anticuerpo desinmunizado son derivadas de una inmunoglobulina o un análogo de la misma del huésped para el cual el anticuerpo va a ser desinmunizado. Este aspecto de la presente invención involucra la manipulación de la región de marco de trabajo de un anticuerpo no humano. De preferencia, el anticuerpo desinmunizado es una forma humanizada de murino 3B6. Un proceso de desinmunización preferido es referido en la presente a un injerto de región variable(v) y resulta en un anticuerpo quimérico. El anticuerpo resultante comprende una o más substituciones de aminoácidos dentro de la región v cuando se compara con el presente anticuerpo (por ejemplo, murino). La razón para hacer cambios de región v es para promover el potencial para una respuesta inmune inducida en el huésped pretendido (por ejemplo, un humano). La base de desinmunización es proclamada en parte en la suposición de que una respuesta inmune substantiva a un anticuerpo introducido requiere una respuesta mediada por células T. El disparador para la respuesta de células T es la presentación de péptidos procesados que emanan del anticuerpo introducido en la superficie de células que presentan antígeno (APCs). Las APCs presentan tales péptidos en asociación con moléculas de MHC clase II de superficie. Por lo tanto, la aproximación desinmunizada se basa en: (i) predecir secuencias de péptidos capaces de asociarse con moléculas de MHC clase I I; y (ii) cambiar residuos estratégicos para eliminar la capacidad del péptido para asociarse con la molécula de MHC clase II . De acuerdo con esto, otro aspecto de la presente invención proporciona una variante de anticuerpo monoclonal de murino 3B6 desinmunizado para uso en humanos, comprendiendo dicha variante una o más mutaciones de aminoácidos en la región v de dicho anticuerpo 3B6 para eliminar o reducir los fragmentos de péptidos de dicha región v que se asocia con moléculas de MHC clase II. Una o más substituciones, adiciones y/o supresiones de aminoácidos o una o más substituciones, adiciones y/o supresiones de nucleótidos es abarcada por el término "mutación" o "mutaciones". En una modalidad particularmente preferida, los anticuerpos desinmunizados son generados por co-transfección de diferentes combinaciones de tres genes de cadena H desinmunizados y tres genes de cadena L desinmunizados. Las variantes resultantes son derivadas de diferentes combinaciones codificadas por genes de cadena H y cadena L. Las cadenas H preferidas son Hv5, Hv6 y Hv7. Estas son referidas en la presente como 3B6DIVHv5 (SEQ ID NO:1), 3B6DIVHv6 (SEQ ID NO:2) y 3B6DIVHv7 (SEQ ID NO:3). Las cadenas L preferidas son Kv1, Kv4 y Kv7. Estas son referidas en la presente como 3B6DIVKv1 (SEQ ID NO:4), 3B6DIVKV4 (SEQ ID NO:5) y 3B6DIVKv7 (SEQ ID NO:6). Las combinaciones particularmente útiles incluyen VHv5/VKv1, VHv6/VKv1, VHv7/VKv1, VHv5/VKv7, VHv6/VKv7, VHv6/VKv4, VHv7/VKv4, VHv7/VKv7 y VHv5(VKv4. Los números de identificación de secuencia (SEQ ID NOS) en paréntesis representan las secuencias de aminoácidos de las cadenas particulares. Las secuencias de nucleótidos correspondientes que codifican cada una de SEQ ID NOS:1-6 son representadas por SEQ ID NOS:7-12. Todas estas combinaciones de cadenas H y L también son abarcadas por la presente invención. De acuerdo con esto, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal de murino variante 3B6 desinmunizado para uso en humanos,' comprendiendo dicha variante una combinación de regiones v de cadena pesada y ligera comprendiendo las secuencias de aminoácidos codificadas por secuencias de nucleótidos seleccionadas de SEQ ID NO-.7/SEQ ID 0:10, SEQ ID NO:8/SEQ ID NO.10, SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:11 o combinaciones de secuencias de aminoácidos codificadas por secuencias de nucleótidos que tienen al menos 70% de similitud a una o ambas secuencias de aminoácidos en cada uno de los pares o secuencias de nucleótidos listadas antes capaces de hibridar a condiciones de baja severidad a una o ambas secuencias de nucleótidos o sus formas complementarias en cada uno de los pares listados antes. Todas esas combinaciones de cadenas H y L también son abarcadas por la presente invención. De acuerdo con esto, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal de murino variante 3B6 desinmunizado para uso en humanos, dicha variante comprende una combinación de regiones v de cadena pesada y ligera comprendiendo las secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2/SEQ ID NO:4, SEQ ID NO;3/SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:1/SEQ ID IMO:6, SEQ ID NO:2/SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:2/SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:5 o combinaciones de secuencias de aminoácidos codificadas por secuencias de nucleótidos teniendo al menos 70% de similitud a una o ambas secuencias de aminoácidos en cada uno de los pares listados antes. De manera más particular, la presente invención proporciona una variante de un. anticuerpo monoclonal de murino 3B6 desinmunizado para uso en humanos, comprendiendo dicha variante una combinación de regiones v de cadena pesada y ligera seleccionadas de VHv5/VKv1, VHv6/VKv1, VHv7/VKv1, VHv5/VKv7, VHv6/VKv7, VHv6/VKv4, VHv7/VKv4, VHv7/VKv7 y VHv5/VKv4. El término "similitud" como se usa en la presente, incluye identidad exacta entre secuencias comparadas en el nivel de nucleótidos o aminoácidos. Donde existe no identidad en el nivel de nucleótidos, "similitud" incluye diferencias entre secuencias, las cuales resultan en diferentes aminoácidos que no obstante están relacionados unos con otros en los niveles estructural , funcional, bioquímico y/o conformacional. Donde existe no identidad en el nivel de aminoácidos, "similitud" incluye aminoácidos que no obstante están relacionados unos con otros en los niveles estructural, funcional, bioqu ímico y/o conformacional. En una modalidad particularmente preferida, las comparaciones de nucieótidos y secuencias están hechas en el nivel de identidad en lugar de similitud. Los términos usados para describir relaciones de secuencias entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos incluyen "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "similitud de secuencia", "identidad de secuencia", "porcentaje de similitud de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia", "substancialmente similar" e "identidad substancial". Una "secuencia de referencia" es al menos 12, pero frecuentemente 15 a 1 8 y frecuentemente al menos 25 o por arriba, tal como 30 unidades de monómero, incluso de residuos de nucieótidos y aminoácidos, de longitud. Debido a que dos polinucleótidos pueden comprender cada uno (1 ) una secuencia (es decir, solo una porción de la secuencia de polinucleótidos completa) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencia entre dos (o más) polinucleótidos son realizadas normalmente al comparar secuencias de los dos polinucleótidos sobre una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación" se refiere a un segmento conceptual de normalmente 12 residuos contiguos que se compara con una secuencia de referencia. La ventan a de comparación puede comprender ad iciones o su presiones (es decir, aberturas) de aproximad amente 20% o menos, como se com para con la secuencia de referencia (la cual no comprime adiciones o supresiones) para alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para alinear un a ventana de comparación puede ser conducida por implementaciones computarizadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en Wisconsin Genetícs Software Package Reléase 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison , WI , USA) o por inspección y la mejor alineación (es decir res ultante en el más alto porcentaje de homolog ía sobre la ventana de comparación) generada por cualquiera de los diversos métodos seleccionados . También puede hacerse referencia a la famil ia BLASTA de programas como, por ejemplo, se describe por Altsch ul et al. (Nucí. Acids. Res. 25: 3389-3402, 1 997). Una discusión detallada de análisis de secuencia puede ser encontrada en U nit 1 9.3 de Ausubel et al. ("Current Protocols in Molecular Biology" (Protocolos actuales en biolog ía molecular), John Wiley & S ons Inc. , 1 994-1 998, capítulo 15). Los térm inos "sim ilitud de secuencia" e "identidad de secuencia" como se usan en la presente, se refieren al grado en que las secuencias son idénticas o funcional o estructuralmente similares en u na base de nucleótido-por-nucleótido o una base de am inoácido-por-am inoácido sobre una ventan a de comparación. As í, un " porcentaje de identidad de secuencia" , por ejemplo, es calculado al comparar dos secuencias alineadas de manera óptima sobre la ventana de comparación, determin ando el n úmero de posiciones en los cuales la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G , I) o el residuo de aminoácidos idéntico (por ejemplo, Ala, Pro , Ser, T r, Gly, Val , Leu, l ie, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg , H is, As p, Glu, Asn, G ln , Cys y Met) ocurre en ambas secuencias, para prod ucir el n úmero de posiciones ig ualadas, dividiendo el n úmero de posiciones igualadas or el número total de posiciones en la ventana de com paración (es decir, el tamaño de ventana) y multiplicar el resultado por 1 00 para prod ucir el porcentaje de identidad de secuencia. Para los fines de la presente invención , "identidad de secuencia" pretenderá significar el "porcentaje de igualación" calculado por el promgram a de computadora DNAS I S (versión 2.5 por ventanas, d isponible de Hitache software Engineering Co. , Ltd. , South San Francisco, California, USA) usando omis iones estándares com o se usa en el manual de referencia que acompaña el programa de computadora. Comentarios similares aplican en relación a similitud de secuencia. Las mutaciones y derivados contemplados por la presente invención incluyen mutaciones redundantes en secuencias de nucleótidos, las cuales no resultan en un cambio en l a secuencia de aminoácidos. La referencia en la presente a un a baja severidad incluye y abarca desde al menos aproximadamente 0 hasta al menos aproximadamente 15% v/v de formamida y desde al menos aproximadamente sal 1 M hasta al menos aproxim adamente 2 M para h ibridación , y al menos aproximadamente sal 1 M hasta al menos aproximadamente 2 M para condiciones de lavado. De manera general, una baja severidad está a desde aproximadamente 25-30°C hasta aproximadamente 42°C . La temperatura puede ser alterada y mayores temperaturas pueden ser usadas para reemplazar formamida y/o para dar condiciones de severidad alternativa. Las condiciones de severidad alternativas pueden ser aplicadas donde sea necesario, tales como severidad de medio, la cual incluye y abarca desde al menos aproximadamente 16% v/v hasta al menos aproximadamente 30% v/v formamida y desde al menos aproximadamente sal 0.5 M hasta al menos aproximadamente 0.9 M para hibridación, y al menos aproximadamente sal 0.5 M hasta al menos aproximadamente 0.9 M para condiciones de lavado, o alta severidad, la cual incluye y abarca desde al menos aproximadamente 31% v/v hasta al menos aproximadamente 50% v/v formamida y desde al menos aproximadamente 0.01 M hasta al menos aproximadamente sal 0.15 M para hibridación, al menos aproximadamente sal 0.01 hasta al menos aproximadamente 0.15 M para condiciones de lavado. En general, el lavado es realizado Tm = 69.3 + 0.41 (G+C)% (Marmur y Doty, J. Mol. Biol. 5: 109, 1962). Sin embargo, la Tm de un DNA doble disminuye por 1°C con cada aumento de 1% en el número de pares de base no igualados (Bonner y Laskey, J. Mol. Biol. 5: 109, 1962). La formamida es opcional en estas condiciones de hibridación. De acuerdo con esto, niveles particularmente preferidos de severidad son definidos como sigue: baja severidad es 6 x amortiguador SSC, 0.1% p/v SDS a 25-42°C; una severidad moderada es 2 x amortiguador SSC, 0.1% p/v SDS a una temperatura en el rango de 20°C a 65°C; alta severidad es 0.1 x amortiguador SSC, 0.1% p/v SDS a una temperatura de al menos 65°C. Como se usa en la presente, el término "CDR" incluye lazos estructurales de CDR, los cuales cubren a las tres regiones de cadena ligera y las tres de cadena pesada en la porción variable de una región de marco de trabajo de anticuerpo, las cuales puentean filamentos ß en la porción de unión de la molécula. Estos lazos tienen estructuras canónicas características (Chothia et al., J. Mol. Biol. 227: 799, 1992; Kabat et al. "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Department of Health and Human Services, 1983). Una región variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina, la cual es interrumpida por tres regiones hipervariables, también llamadas CDRs, es referida en la presente como una "región de marco de trabajo". El grado de la región de marco de trabajo y CDRs han sido definidas de manera precisa (ver, por ejemplo, Krebber et al., J. Immunol. Methods 201(1): 35-55, 19). Las secuencias de las regiones de marco de trabajo de diferentes cadenas ligeras o pesadas son conservadas relativamente dentro de una especie. Como se usa en la presente, una "región de marco de trabajo humana" es una región de marco de trabajo que es substancialmente idéntica (aproximadamente 85% o más, usualmente 90-95% o más) a la región de marco de trabajo de una inmunoglobulina humana que ocurre de manera natural. La región de marco de trabajo de un anticuerpo, que es las regiones de marco de trabajo combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para posicionar y alinear las CDRs. Las CDRs son principalmente responsables de la unión a un epitope de un antígeno. Como se usa en la presente, el término "región variable de cadena pesada" significa un polipéptido, el cual es de aproximadamente 110 a 125 residuos de aminoácidos de longitud, la secuencia de aminoácidos del cual corresponde a aquélla de una cadena pesada de un anticuerpo monoclonal de la invención, iniciando desde el residuo de aminoácidos amino-terminal (N-terminal) de la cadena pesada. De igual manera, el término "región variable de cadena ligera" significa un polipéptido el cual es desde aproximadamente 95 hasta 130 residuos de aminoácidos de longitud, la secuencia de aminoácidos de la cual corresponde a aquélla de una cadena ligera de un anticuerpo monoclonal de la invención, iniciando a partir del residuo de aminoácido N-terminal de ia cadena ligera. Las "cadenas ligeras" de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 25 Kd o 214 aminoácidos) son codificadas por un gene de región variable en el extremo NH2 (aproximadamente 1 10 aminoácidos) y un gene de región constante ? o ? en el extremo COOH. Las "cadenas pesadas" de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 50 Kd o 446 aminoácidos), son codificadas de manera similar por un gene de región variable (aproximadamente 1 16 aminoácidos) y uno de los otros genes de región constante antes mencionados, por ejemplo, ? (que codifican aproximadamente 330 aminoácidos). El término "inmunogenicidad" es usado en la presente en su sentido más amplio para incluir la propiedad de evocar una respuesta inmune dentro de un organismo. La inmunogenicidad normalmente depende en parte del tamaño de la substancia en cuestión , y en parte sobre qué tan diferentes son las moléculas del huésped. Generalmente se considera que las proteínas altamente conservadas tienden a tener inmunogenicidad bastante baja.

El término "inmunoglobulina" se usa en la presente para referirse a una proteína que consiste de uno o más polipéptidos codificados substancialmente por genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante ?, ?, a, ? (lgG lgG2, lgG3, lgG4), d, e y µ, así como la miríada de genes de región variable de inmunoglobulina. Una forma de inmunoglobulina constituye la unidad estructural básica de un anticuerpo. Esta forma es un tetrámero y consiste de dos pares idénticos de cadenas de inmunoglobulina, teniendo cada par una cadena ligera y una pesada. En cada par, Is regiones varialbes de cadena ligera y pesada son responsables juntas de la unión a un antígeno, y las regiones constantes son responsables de las funciones efectoras del anticuerpo. Además de los anticuerpos, las inmunoglobulinas pueden existir en una variedad de otras formas incluyendo, pro ejemplo, Fv, Fab, Fab' y (Fab')2. La referencia en la presente a "inmuno-interactiva" incluye la referencia a cualquier interacción, reacción u otra forma de asociación entre moléculas y en particular donde una de las moléculas es, o imita, un componente del sistema inmune. Una "molécula inmunointeractiva" incluye un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, anticuerpo sintético o una molécula de unión asociada a células T (TABM). Por "aislado" se quiere decir material que está substancial o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan en su estado natural. Una muestra de fluido biológico que es aislada de, o derivada de, una fuente particular del huésped es descrita por ser "obtenida de".

La invención también contempla el uso y generación de fragmentos de anticuerpos mon oclonales producidos mediante el método de la presente invención que incluye, por ejemplo, fragmentos Fv, Fab, Fab' y F (ab')2. Tales fragmentos pueden ser preparados mediante métodos estándares como por . ejemplo, se describe por Coligan et al. ( 1 991 -1 997 , su pra) . La presente invención también contempla moléculas de unión de antígeno sintéticas o recombinantes con la misma especificidad o simil ar que los anticuerpos monoclonales de la invención. Las moléculas de unión de antígeno de este tipo pueden comprender un fragmento Fv estabilizado sintético. Fragmentos ejemplares de este tipo incluyen fragmentos Fv de cadena simple (sFv, llamados frecuentemente scFv) , en los cuales un enlazador de péptido es usado para puentear el extremo N o extremo C de un dominio VH con el extremo C o extremo N, respectivamente, de un dom in io VL. ScFv carecen de todas las partes constantes de anticuerpos com pletos y no son capaces de activar el complemento. Los enlazadores de péptidos adecuados para unirse a los domin ios VH y VL son aquéllos que permiten q ue los dom inios VH y VL se doblen en una sola cadena de pol ipéptido ten iendo un sitio de unión de antígeno con una estructura tridimensional similar a aquélla del sitio de unión de antígeno de un anticuerpo completo a partir del cual se deriva el fragmento Fv. Los enl azadores q ue tienen las propiedades deseadas pueden ser obtenidos por el método descrito en la patente estadoun idense no 4, 946,778. Sin embargo, en algunos casos, un en lazador está ausente. Los ScFvs pueden ser preparados, por ejemplo , de acuerdo con métodos señalados en rebber et al. (1997, supra). De manera alternativa, pueden ser preparados mediante métodos descritos en la patente estadounidense no 5,091,513, patente europea no 239,400 o los artículos por Winter y Milstein (Nature 349: 293, 191) y Plückthun et al. (en Antibody engineering: A practica! approach (Ingeniería de anticuerpos: una aproximación práctica), 203-252, 1996). De manera alternativa, el fragmento Fv estabilizado sintético comprende un Fv estabilizado con disulfuro (dsFv), en el cual los residuos de cisteína son introducidos en los dominios VH y VL, de manera que en la molécula Fv completamente doblada los dos residuos formarán un enlace dísulfuro entre ellos. Los métodos adecuados para producir dsFv son descritos, por ejemplo, en (Glockshuber et al., Biochem. 29: 1363-1367, 1990; Reiter et al., J. Biol. Chem. 269: 18327-18331, 1994; Reiter et al., Biochem. 33: 5451-5459, 1994; Reiter et al., Cáncer Res. 54: 2714-2718, 1994; Webber et al., Mol. Immunol. 32:249-258, 1995). También contempladas como moléculas de unión de antígeno sintéticas o recombinantes son los dominios de región variable simple (llamados dAbs) como se describe, por ejemplo, en (Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989; Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-448, 1993; Davies & Riechmann, FEBS Lett. 339: 285-290, 1994). De manera alternativa, la molécula de unión de antígeno sintética o recombínante puede comprender un "minicuerpo". A este respecto, los minocuerpos son pequeñas versiones de anticuerpos completos, los cuales codifican en una cadena simple los elementos esenciales de un anticuerpo completo. Convenientemente, el minicuerpo está comprendido por los dominios de VH y VL de un anticuerpo natural fusionado a la región de gozne y dominio CH3 de la molécula de inmunoglobulina como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense no 5,837,821. En una modalidad alterna, la molécula de unión de antígeno sintética o recombinante puede comprender marcos de trabajo de proteína, derivados no de inmunoglobulina. Por ejemplo, puede hacerse referencia a Ku & Schutz {Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92: 6552-6556, 1995), la cual describe un citocromo de proteína de haz de cuatro hélices b562 teniendo dos lazos aleatorios para crear regiones determinantes complementarias (CDRs), las cuales han sido seleccionadas para unión de antígeno. La molécula de unión de antígeno sintética o recombinante puede ser multivalente (es decir, teniendo más de un sitio de unión de antígeno). Tales moléculas multivalentes pueden ser específicas para uno o más antígenos. Las moléculas multivalentes de este tipo pueden ser preparadas mediante dimerización de dos fragmentos de anticuerpos a través de un péptido conteniendo cisteinilo como se describe, por ejemplo, por (Adams et al., Cáncer Res. 53: 4026-4034, 1993; Cumber et al., J. Immunol. 149: 120-126, 1992). De manera alternativa, la dimerización puede ser facilitada por fusión de los fragmentos de anticuerpos a hélices anfifílicas que se dimerizan de manera natural {Plünckthun, Biochem. 31: 1579-1584, 1992) o mediante el uso de dominios (tales como cierres de leucina jun y fos) que heterodimerizan preferencialmente (Kostelny et a!., J. immunol. 148: 1547-1553, 1992). En una modalidad adicional, un proceso de múltiples pasos es empleado, tal como se administra primero un anticuerpo desinmunizado y entonces un anti-anticuerpo con, por ejemplo, una molécula reportadora. La presente invención abarca adicionalmente análogos químicos de aminoácidos en ios anticuerpos variantes. El uso de análogos químicos de aminoácidos es útil inter alia para estabilizar las moléculas cuando se administran a un sujeto. Los análogos de los aminoácidos contemplados en la presente incluyen, pero no están limitados a, modificaciones de cadenas laterales, incorporación de aminoácidos no naturales y/o sus derivados durante síntesis de péptido, polipéptido o proteína y el uso de reticuladores y otros métodos, los cuales imponen restricciones conformacionales en la molécula proteinácea o sus análogos. Ejemplos de modificaciones de cadenas laterales contempladas por la presente invención incluyen modificaciones de grupos amino, tales como alquilación reductora mediante reacción con un aldehido, seguida por reducción con NaBH4; am idinación con metilacetimidato; acilación con anhídrido acético; carbamoilación de grupos amino con cianato; trinitrobencilación de grupos amino con ácido 2,4,6-trinitrobencen sulfónico (TNBS); acilación de grupos amino con anhídrido succínico y anhídrido tetrahidroftálico; y piridoxilación de Usina con piridoxal-5-fosfato, seguido por reducción con NaBH4. El grupo guanidina de residuos de arginina puede ser modificado por la formación de productos de condensación heterocíclicos con reactivos tales como 2,3-butanodiona, fenilglioxal y gíioxal. El grupo carboxilo puede ser modificado por activación de carbodiimida vía formación de O-acilisourea seguida por derivación subsecuente, por ejemplo, a una amida correspondiente.

Grupos sulfidrilo pueden ser modificados por métodos, tales como carboximetilación con ácido yodoacético o yodoacetamida; oxidación de ácido perfórmico a ácido cisteico; formación de un disulfuro mezclado con otros compuestos de tiol; reacción con maleimida, anhídrido maleico u otra maleimida substituida; formación de derivados mercuriales usando 4-cloromercuribenzoato, ácido 4-cloromercurifenilsulfónico, cloruro de fenilmercurio, 2-cloromercuri-4-nitrofenol y otros mercuriales; carbamoilación con cianato a pH alcalino. Los residuos de triptófano pueden ser modificados mediante, por ejemplo, oxidación con N-bromosuccinimida o alquilación del anillo de indo] con bromuro de 2-hidroxi-5-nitrobencilo o haluros de sulfenilo. Los residuos de tirosina, por otra parte, pueden ser alterados mediante nitración con tetranitrometano para formar un derivado de 3-nitrotirosina. La modificación del anillo de imidazol de un residuo de histidina puede lograrse mediante alquilación con derivados de ácido yodoacético o N-carbetoxilación con dietilpirocarbonato. Ejemplos de incorporar aminoácidos no naturales y derivados durante la síntesis de péptidos incluyen, pero no están limitados a, uso de norleucina, ácido 4-amino butírico, ácido 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanoico, ácido 6-aminohexanoico, t-butilglicina, norvalina, fenilglicina, ornitina, sarcosina, ácido 4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico, 2-tienil alanina y/o isómeros D de aminoácidos. Una lista de aminoácidos no naturales, contemplada en la presente es mostrada en la Tabla 3.

TABLA 3 Aminoácido no convencional Código Aminoácido no convencional Código Acido a-aminobutírico Abu L-N-metilalanina Nmala a-amino-oc-metlbutirato gabu L-N-metilarginina Nmarg Aminociclopropano- Cpro L-N-metilasparagina Nmasn carboxilato L-N-ácido metilaspártico Nmasp Acido aminoisobutírico Aib L-N-metilcisteína Nmcys Aminonorbornilo- Norb L-N-metilglutamina Nmgln carboxiiato Ácido L-N-glutámico Nmglu Ciclohexilalanína Chexa L-Nmetiihístidina Mnhis Ciclopentilalanina Cpen L-N-metilisoleucina Nmile D-alanina Dal L-N-metilleucina Nmleu D-arginina Darg L-N-metillisina Nmlys Acido D-aspártico Dasp L-N-metilmetionina Nmmet D-cisteína Dcys L-N-metilnorleucina Nmnle D-glutamina Dgln L-N-metilnorvalina Nmnva Acido D-glutámico Dglu L-N-metilornitina Nmorn D-histidina Dhis L-N-metilfenilalanina Nmphe D-isoIeucina Diie L-N-metilprolina Nmpro D-leucina Dleu L-N-metilserina Nmser D-lisina Dlys L-N-metiltreonina Nmthr D-metionina Dmet L-N-metiltriptófano Nmtrp D-ornitina Dorn L-N-metiltirosina Nnmtyr D-fenilalanina Dphe L-N-metilvalina Nmval D-prolina Dpro L-N-metiletilglicina Nmetg D-serina Dser L-N-metil-t-butilglicina Nmtbug D-treonina Dthr L-norleucina Nle D-triptófano Dtrp L-norvalina Nva D-tirosina Dtyr a-metil-aminoisobutirato Maib D-valina Dval a-metil-Ya,ompbitoratp gabu D- -metilalanina Dmala a-metilciclohexilalanina Mchexa D-a-metilarginina Dmarg a-metilciclopentilalanina cpen D-a-metilasparagina Dmasn a-metil-a-naftilalanina Manap D-a-metilaspartato Dmasp a-metiipenicilamina Mpen D- -met¡lc¡steína Dmcys N-(4-aminobutiI)glicina Nglu D-a-metilglutamina Dmgln N-(2-aminoetil)gIicina Naeg D-a-metilhistidina Dmhis N-(3-aminopropil)glicina Norn D-a-metilisoleucina Dmile N-amino-a-metilbutirato Nmaabu D-a-metilleucina Dmleu a-naftiialanina Anap D-a-metiilisina Dmlys N-bencilg!icina Nphe D- -metilmetionina Dmmet N-(2-carbamiletil)glicina Ngln D-a-metilornitina Dmorn N-(carbamil-metil)glicina Nasn D-a-metilfenilalanina Dmphe N-(2-carboxietil)glicina Nglu D-a-metilprolina Dmpro N-(carboximetil)glicina Nasp D-a-metilserina Dmser N-ciclobutilglicina Ncbut D-a-metiltreonina Dmthr N-cicloheptilglicina Nchep D-a-triptófano Dmtrp N-cicIohexilglicina Nchex D-a-met¡ltirosina Dmty N-ciclodecilglicina Ncdec D-a-metilvalina Dmval N-cicíododecilglicina Ncdod D-N-metilalanina Dnmala N-ciclooctilglicina Ncoct D-N-metilarginina Dnmarg N-c¡clopropilglicina Ncpro D-N-metilasparagina Dnmasn N-cicloundecilglicina Ncund D-N-meti!aspartato Dnmasp N-(2,2-d¡feniletil)glicina Nbhm D-N-metilcisteína Dnmcys N-(3,3-difen¡lproil)glicina Nbhe D-N-metilglutamina Dnmgln N-(3-guan¡d¡nopropil)glicina Narg D-N-metilglutamato Dnmglu N-(1-hidroxietil)glicina Nthr D-N-metil istid¡na Dnmhis N-(hidroxietil)gl¡c¡na Nser D-N-metilisoIeucina Dnmile N-(imidazoliletil)glicina Nhis D-N-met¡lleucina Dnmleu N-(3-indoliletil)glicina Nhtrp D-N-metillisina Dnmlys N-metil-y-aminobutirato Nmgabu N-metilc¡clohexilalanina Nmchexa D-N-metilmetionina Dnmmet D-N-metilornitina Dnmorn N-metilciclopentilalanina Nmcpen N-met¡lglic¡na Nala D-N-metilfenilalanina Dnmphe N-met¡lam¡noisobutirato Nmaib D-N-metilprolina Dnmpro N-(1-metilproil)glicina Nile D-N-met¡lserina Dnmser N-(2-metilpropiI)glicina Nleu D-N-metiltreonina Dnmthr D-N-metiltriptófano Dnmírp N-(1-metiletil)glicina Nval D-N-metiltirosina Dnmtyr N-metila-naftilalanina Nmanap D-N-metilvalina Dnmval N-metilpenicilamina Nmpen Acido y-aminobutír¡co Gabu N-(p-hidroxifenil)glicina Nhtyr L-t-butilglicina Tbug N-(tiometil)glicina Ncys L-etilglicina Etg Penicilamina Pen L-homofenilalanina Hphe L-a-metilalanina Mala L- -metilarginina Marg L-a-metilasparagina Masn L-a-metilaspartato Masp L- -metil-t-butilglicina Mtbug L- -metilcisteina Mcys L-metiletilglicina Metg L-a-metilglutamina Mgln L-a-metilglutamato Mglu L-a-metilhistidina Mhis L-a-metilhomofenilalanina Mhphe L-a-metilisoleucina Mile N-(2-metiItioetil)glicina Nmet L-a-metilleucina Mleu L- -metillisina Mlys L-a-metilmetionina Mmet L-a-metilnorleucina Mnle L-a-metilnorvalina Mnva L- -metilornitina Morn L-a-metilfenilalanina Mphe L-a-metilprolina Mpro L- -metilserina Mser L-a-metiltreonina Mthr L-a-metiltriptófano trp L-a-metiltirosina tyr L-a-metilvalina Mval L-N-metilhomofenilalanina Nmhphe N-(N-(2,2-difeniIetil) Nbhm N-(N-(3,3-difenilpropil) Nnbhe carbamilmetil)glicina carbamilmetil)glicina 1-carboxi-1-(2,2-difenil- Nmbc etilamino)ciclopropano Pueden usa rse reticuladores , por ejemplo , para estabil izar conformaciones trid imensionales , usando reticuladores homo-bifun cionales, ta les como los im ido ásteres bifuncionaíes teniendo g rupos separadores (CH2)n con n=1 a n=6, gl utaraldeh ído, N-h idroxisuccin im ida ésteres y reactivos hetero-bifuncionales, los cuales usualmente contienen una porción amino-reactiva, tal como N-hidroxisuccinimida y otra porción reactiva específica de grupo, tal como una porción maleimido o ditio (SH) o carbodiimida (COOH). Además, los péptidos pueden ser restringidos conformacionalmente mediante, por ejemplo, la incorporación de Ca y Na-metilamino ácidos, introducción de dobles enlaces entre los átomos Ca y Cp de aminoácidos y la formación de péptidos cíclicos o análogos al introducir enlaces covalentes, tales como formando un enlace de amida entre los extremos N y C, entre las dos cadenas laterales o entre una cadena lateral y el extremo N o C. Un anticuerpo monoclonal obtenido antes de la desinmunización puede ser identificado por cualquier número de medios incluyendo los pasos de: (a) recubrir una superficie con antígeno seleccionado de derivado de fibrina reticulado o extracto conteniendo el mismo o producto de degradación de fibrinógeno; (b) contactar el antígeno en el paso (a) con anticuerpo monoclonal derivado de derivado de fibrina reticulado preparado como se describe antes; y (c) someter el complejo formado en el paso (b) a un paso de amplificación de señal. Convenientemente, en el paso (a), una placa de cavidades puede ser utilizada, en la cual los derivados de fibrina reticulados tales como dímero D y/o producto de degradación de fibrinógeno (de preferencia obtenido a partir de un procedimiento en donde el fibrinógeno fue digerido convenientemente con trombina para obtener un fragmento D, fragmento E y opcionalmente fragmentos X y Y) fue aplicado a las cavidades individuales. Subsecuentemente, el anticuerpo monoclonal derivado de un derivado de fibrina reticulado fue adicionado entonces a cada cavidad. Un paso de amplificación de señal apropiado, el cual puede ser aplicado es un paso de EIA, en donde un conjugado de enzima apropiado puede ser acoplado al complejo y substrato adicionado subsecuentemente. De manera alternativa, pueden usarse RIA, FIA, aglutinación, adherencia o quimioluminiscencia como pasos de amplificación de señal apropiados. El propósito del procedimiento de ensayo de clsificación referido antes es para asegurar que las células siendo probadas están produciendo anticuerpo específico para el derivado de fibrina reticulado relevante, pero o fragmento D. Debería haber una reacción mínima con fibrinógeno o productos de degradación de fibrinógeno y una reacción positiva con el derivado. El término "mínima" incluye sin reactividad, pero se extiende a niveles básales tales como se compara con un anticuerpo dirigido a fibrinógeno per se. Consecuentemente, una reacción mínima incluye la reactividad sub-óptima comparada con un anticuerpo específico de fibrinógeno. La presente invención también incluye dentro de su alcance un ensayo para detectar derivados de fibrina enlazados incluyendo los pasos de: (1) contactar un anticuerpo monoclonal específico para derivados de fibrina reticulados pero no fragmento O con una muestra biológica que se sospecha que contiene un antígeno derivado de un derivado de fibrina reticulado o que comprende un derivado de fibrina reticulado per se; y (2) someter el complejo formado en el paso (1) a un paso de amplificación de señal. En el ensayo antes mencionado, el derivado de fibrina reticulado es convenientemente dímero D, D2E o cualquier otro derivado de una naturaleza de alto peso molecular como se describe antes. El anticuerpo monoclonal es preparado como se describe previamente, el cual es relevante para el derivado de fibrina reticulado particular siendo ensayado. La presencia del derivado de fibrina reticulado puede ser usada como un auxiliar diagnóstico adecuado para condiciones pretrombóticas, trombóticas u otras que involucran la formación y lisis de fibrina. El anticuerpo monoclonal desinmunizado de la presente invención es particularmente útil para formar imágenes de coágulos sanguíneos así como para enfocar coágulos sanguíneos con el fin de llevar el coágulo a contacto con enzimas u otros agentes químicos capaces de disolver, completa o parcialmente, el coágulo. Con respecto a la formación de imágenes de coágulo, una molécula reportadora es unida al anticuerpo monolconal desinmunizado o a un anticuerpo que tiene especificidad para el anticuerpo desinmunizado o una porción o conjugado en el mismo y este es introducido entonces a un huésped, tal como un humano. Al detectar la molécula reportadora, los coágulos sanguíneos pueden ser visualizados. Una forma particularmente útil de molécula reportadora es una etiqueta nuclear. Las etiquetas nucleares contempladas para uso en la presente invención incluyen, pero no están limitadas a un quelato de ión metálico bifuncional. El quelato puede estar unido al anticuerpo por sí mismo o quelatos múltiples pueden estar unidos a la proteína vía dendrímeros. Las etiquetas nucleares particularmente preferidas son 99mTc, 18F, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 77Br, 97Ru, 11ln, 123l, 124l, 31l y 188Re. La etiqueta nuclear más preferida es 99mTc. De preferencia, el huésped es un humano y, de ahí, es necesario para el anticuerpo monoclonal de murino 3B6 ser desinmunizado. Las formas alternativas de inmunocentellografía pueden ser obtenidas usando isótopos, tales como 68Ga o 124l u otros isótopos de PET. Tal tecnología puede ser descrita como "inmuno-PET". La tecnología tiene ventajas sobre centellografía de cámara ? y puede proporcionar imágenes de alta resolución de coágulos sanguíneos, especialmente en áreas del cuerpo menos tratables para medios diagnósticos convencionales, tais como pulmones o pequeños coágulos en el peroné o pelvis. De acuerdo con esto, la presente invención proporciona una molécula conjugada que comprende una molécula inmunointeractiva desinmunizada, tal como un anticuerpo desinmunizado y una o ambas de una etiqueta de formación de imágenes o un agente terapéutico. Las etiquetas de formación de imágenes preferidas son etiquetas tipos MRI, ultrasonido y/o CT, tales como pero no limitadas a, 99mTc, 8F, 64Cu, 67Ga, B8Ga, 77Br, 97Ru, 111ln, 123l, 124l, 131l y 188Re. Las etiquetas terapéuticas preferidas incluyen citocinas, agentes anti-coagulantes, agentes reparadores de heridas y agentes anti-infección. Otro aspecto de la presene invención contempla un método para detectar un coágulo sanguíneo en un paciente ¡humano, comprendiendo dicho método introducir en dicho paciente una forma desinmunizada de anticuerpo monclonal de murino 3B6 o un fragmento de unión de antígeno del mismo etiquetado con una molécula reportadora que permite la diseminación del anticuerpo etiquetado a través del sistema circulatorio y entonces someter dicho paciene a medios de detección de molécula reportadora para identificar la ubicación del anticuerpo en un coágulo. De preferencia, la molécula reportadora es una etiqueta nuclear. De preferencia la etiqueta nuclear es 99mTc, 18F, 64Cu, 67Ga, S3Ga, 77Br, 97Ru, 111ln, 123l, 124l, 131l y 188Re. De preferencia, la etiqueta nuclear es 9SmTc. La presente invención contempla además el uso de un anticuerpo monoclonal de murino desinmunizado específico para dimero D u otros derivados de fibrina reticulados en la fabricación de agente de formación de imágenes de coágulo. De preferencia, el anticuerpo monoclonal de murino es 3B6 o un homólogo del mismo. De preferencia, la etiqueta de formación de imágenes de coágulo es para uso en humanos. El mismo anticuerpo también puede llevar etiquetas múltiples, tales como reactivos anti-coagulantes múltiples y/o moléculas reportadoras. De manera alternativa, o adicional, pueden administrarse anti-anticuerpos múltiples portando cada uno una etiqueta diferente. El presente anticuerpo enfocador de coágulo puede ser usado solo o en combinación con otros protocolos de formación de imágenes. Uno de tales protocolos es la formación de imágenes planas, tal como pero no limitada a CT, MRI o ultasonido. De acuerdo con esto, otro aspecto de la presente invención contempla un método para detectar un coágulo sanguíneo en un paciente humano, comprendiendo dicho método introducir en dicho paciente una forma desinmunizada de anticuerpo monoclonal de murino 3B6 o un fragmento de unión de antígeno del mismo marcado con una molécula reportadora que permite la diseminación del anticuerpo marcado a lo largo del sistema circulatorio y entonces someter dicho paciente a la formación de imagen de coágulo plana. De preferencia, la formación de imagen plana es exploración de CT o MRI. El ultrasonido también puede ser usado en el proceso de formación de imágenes. De acuerdo con esto, otro aspecto de la presente invención contempla un método para detectar un coágulo sanguíneo en un paciente humano, comprendiendo dicho método introducir en dicho paciente una forma desinmunizada de anticuerpo monoclonal de murino 3B6 o un fragmento de unión de antigeno del mismo marcado con una molécula reportadora que permite la diseminación del anticuerpo marcado a lo largo del sistema circulatorio y entonces someter dicho paciente a una exploración de medicina nuclear tomográfica asistida por computadora para visualizar el coágulo. De preferencia, la molécula reportadora es una etiqueta nuclear. De preferencia, la etiqueta nuclear es 99mTc, 18F, 6 Cu, 67Ga, s8Ga, 77Br, 97Ru, ,1In, 123l, 124I, 131l y 88Re. De preferencia, la etiqueta nuclear es "mTc.

Los agentes de formación de imágenes de coágulo de la presente invención también son útiles como agentes terapéuticos. En particular, los agentes enfocadores de coágulo son fusiondos, unidos o asociados de otra manera con un agente de disolución de coágulo o prevención de crecimiento de coágulo, tal como una molécula anticoagulante. De acuerdo con esto, otro aspecto de la presente invención contempla un método para facilitar la disolución o remoción de un coágulo sanguíneo en unhumano, comprendiendo dicho método administrar a dicho humano una cantidad efectiva de disolución de coágulo o prevención de crecimiento de coágulo de unanticuerpo monoclonal derivado de murino variante, que tiene especificidad para dímero D derivado de humano y otros derivados de fibrina reticulados y ninguna reactividad con fibrinógeno o productos de degradación de fibrinógeno incluso de fragmentos D y E, en donde dicho anticuerpo monoclonal derivado de murino variante es substancialmente no inmunogénico en un humano, en donde dicho anticuerpo monoclonal comprende además un agente de disolución de coágulo o prevención de crecimiento de coáuglo fusionado, unido o asociado de otra manera al mismo. Todavía otro aspecto de la presente invención se dirige al uso de un anticuerpo monoclonal derivado de murino variante que tiene especificidad para dímero D derivado de humano y oros derivados de fibrina reticulados y ninguna reactividad con fibrinógeno o productos de degradación de fibrinógeno, incluso de fragmentos D y E, en donde dicho anticuerpo monoclonal derivado de murino variante es substancialmente no inmunogénico en un humano y dicho anticuerpo comprende además un agente de disolución de coágulo o prevención de crecimiento de coágulo fusionado, unido o asociado de otra manera al mismo en la fabricación de un medicamento para la disolución de un coágulo sanguíneo en un humano. En una modalidad alternativa, pueden usarse anticuerpos desinmunizados múltiples. En un ejemplo, un anticuerpo 3B6 desinmunizado es administrado solo y entonces anticuerpos anti-inmunoglobulina desinmunizados cada uno portando un agente, tal como un agente diagnóstico o terapéutico, los cuales enfocarán un complejo de coágulo-3B6. Todavía otra alternativa es diseñar anticuerpos con múltiples (por ejemplo, bi-) especificidades. En este caso, una especificidad puede ser para el coágulo y otra para el sitio del coágulo (por ejemplo, para un receptor de célula). Esto también puede lograrse usando anticuerpos múltiples. La presente invención contempla además composiciones que comprenden los agentes enfocadores de coágulo de la presente invención y uno o más portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles, así como formas liofilizadas de preparaciones de anticuerpos junto con agentes estabilizantes, tais como azúcar, proteínas u otros compuestos o moléculas que facilitan el proceso de radiomarcado. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y bongos. El portador puede ser un solvente o medio de dilución comprendiendo, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo, mediante el uso de surfactantes. Las prevenciones de la acción de microorganismos pueden ser ocasionadas por varios agentes anti-bacterianos y anti-fungales, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isoténicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables pueden ser ocasionadas por el uso en las composiciones de agentes retardantes de absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las soluciones inyectables estériles son preparadas al incorporar los compuestos activos en la cantidad requerida en el solvente apropiado con el ingrediente activo y opcionaimente otros ingredientes activos según se requiera, seguido por esterilización por filtración u otros medios apropiados de esterilización. Los partadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes anti-bacterianos y anti-fungales, agentes retardantes de absorción e isotónicos y similares. El uso de tales medios y agentes para substancias activas farmacéuticas es bien conocido en la técnica y excepto en cuanto a que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el inrediente activo, su uso en las composiciones terapéuticas es contemplado. Ingredientes activos complementarios también pueden ser incorporados en las composiciones.

Los agentes enfocadores de coágulo de la presente invención son útiles para el diagnóstico y/o tratamiento de condiciones asociadas con trombina, tales como DVT, PE y DIC. Todavía otro aspecto de la presente invención contempla un método para tratar un sujeto con cáncer asociado con fibrina. En esta modalidad, los anticuerpos para el epitope de dimero D pueden usarse para entregar agentes citotóxicos, tales como un isótopo que emite emisión ß o ? o combinaciones de las mismas. Tales isótopos incluyen pero no están limitadas a 131l, itrio-90, renio-186, renío-188, lutecio-117 y cobre-67. La fibrina asociada con un cáncer incluye un tumor encapsulado con fibrina. Las moléculas inmunointeractivas desinmunizadas de la presente invención son, por lo tanto, portadores para cualquier agente de unión de coágulo o agentes de disolución de coágulos o para cualquier gente que tenga propiedades diagnósticas o terapéuticas útiles. Las moléculas inmunointeractivas desinmunizadas de la presente invención también son útiles para determinar la cinética de disolución, disipación y/o desaparición de coágulo. Una vez que esta información está disponible, los agentes de disolución de coágulo o de formación de imágenes pueden ser administrados muy rápidamente. La presente invención se describe adicionalmente mediante los siguientes Ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1 Fusión celular y selección de híbridos Los bazos fueron removidos asépticamente de 2 ratones inmunizados muertos mediante dislocación cervical tres días después de una inyección de dimero D. Previamente, los ratones habían sido inmunizados con tres inyecciones de lisado de fibrina con enzimas proteo.líticas trombina y plasmina como se reporta en la referencia de Graeff y Hafter mencionada antes. Dos bazos fueron colocados en una caja de Petri de 60 mm (Falcon, 3001, Oxnard, Calif.) conteniendo 5 mi de medio completo (85% RPMI 1640, 15% p/v suero de ternera fetal, 100 I.U./ml penicilina, 100 µ9/?t?? de estreptomicina y 2 X 10"3 M glutamina; Gibco, Grand Island, N.Y.). Se preparó una suspensión celular al descapsular el bazo con agujas 2 x 18 de calibre unidas a jeringas desechables de 3 mi con el último centímero de la punta doblado a través de un ángulo de 60°. La suspensión celular se aspiró entonces en una jeringa de 10 mi equipada con una aguja de calibre 22 y se expulsó con presión moderada. Esta operación se realizó dos veces antes de filtrar las células en un tubo Falcon 2001 a través de una pantalla de acero inoxidable de malla fina para remover los desechos y grumos celulares más grandes. Se permitió que la suspensión celular permaneciera durante 5 minutos a temperatura ambiente para permitir que los grumos y fragmentos de membrana más pequeños se asentaran antes de transferir la suspensión celular a un tubo Falcon 2001 fresco. Las células fueron centrifugadas a 350G durante 5 minutos a temperatura ambiente y el sobrenadante fue decantado de la primera pella celular a un tubo fresco y se centrifugó a 700G durante cinco minutos para dar una segunda pella celular y las dos pellas fueron depositadas y resuspendidas en 5 mi de medio completo. Los glóbulos blancos de bazo (SWBC) fueron contados entonces y su viabilidad se estimó mediante manchas azules de Trypan y Turks, respectivamentey 100 x 10s SWBC viables fueron colocadas en tubos Falcon 2001 separados en un volumen total de 5 mi de medio completo. Las células de mieloma NS-1 a ser fusadas para fusión, se lavaron una vez mediante centrifugación a 380G durante 15 minutos a temperatura ambiente y se ajustaron a 5 x 106 células viables/ml en medio completo. Veinticinco x 106 NS-1 y 100 x 105 SWBC inmunes se mezclaron y centrifugaron a 350G durante 5 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se decantó, el medio restante fue removido cuidadosamente con una pipeta de Pasteur y 2 mi de una solución al 42% p/v de polietilenglicol (PEG, MW1540) (Baker Chemical Co., New Jersey). En RPMI 1640 conteniendo 15% v/v sulfóxido de dimetilo (DMSO) a 37°C se adicionó con una pipeta desechable de vidrio de 5 mi (Corning Glass, Corning, NY) y las células fueron resuspendidas con la misma pipeta de 5 mi durante 30 segundos con la ayuda de un pipeteador eléctrico (Pipet-aid Drummond Scientific Co., Broomall, PA). Se permitió que la suspensión de PEG-células permaneciera durante unos 30 segundos adicionales a temperatura ambiente antes de adicionar 5 mi de medio completo, en forma de gotas, con una pipeta de Pasteur, sobre un periodo de 90 segundos con golpecitos constantes del tubo, suficientes para asegurar un mezclado completo con la solución de PEG viscosa. Unos 5 mi adicionales de medio completo se adicionaron inmediatamente y se mezclaron mediante inversión y se permitió que la suspensión celular permaneciera durante unos 150 segundos adicionales a temperatura ambiente antes de la centrifugación a 350G durante 5 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se decantó y la pella celular se resuspendió suavemente en 5 mi de medio completo usando una pipeta de 5 mi con el pipeteador eléctrico; se tuvo extremo cuidado de no romper todos los grumos celulares. Usando una escaladora Tridak (Bélico Glass Inc., Vineland, NJ), se adicionó 0.05 mi de la suspensión celular a cada cavidad de 4 placas de 24 cavidades Costar (Costar 3524, Cambridge, Mass.) conteniendo 1 x 106 SWBC de ratón BALB/c normales como células alimentadoras en 1 mi de medio completo conteniendo 10"4 M Hypoxanthine (Sigma), 4 x 10"7 Aminopterin (Sigma), 1.6 x 10"5 M Thymidine (Sigma) y 4 x 10"5 M 2-Mercaptoethanol (medio HAT), de aquí en adelante referido como placas de 10 fusión. Las placas de 1o fusión fueron colocadas entonces en una atmósfera de 5% C02 95% aire humidifcada a 37°C. Las células fueron alimentadas primero ya sea en los días 5 o 7 y posteriormente cuando fuera necesario, con 0.5 mi de medio HAT fresco. En general, en el día 10, 0.5 mi del medio se removió del ensayo de clasificación de cada cavidad mostrando crecimiento de hibridoma y 0.5 mi de medio HAT fresco fue reemplazado. Un número de las cavidades de crecimiento más fuerte fueron elegidas para mantenimiento en la base del ensayo de clasificación. Se permitió que las cavidades elegidas crecieran a confluencia en la cavidad origina (1o cavidad), entonces cada una fue dividida en dos y transferida a una cavidad fresca (2o cavidad) de un placa Costar de 24 cavidades (2o placa). Las cavidades se checaron diariamente y se expandieron a una segunda, tercera o cuarta cavidad de la 2o placa Costar cuando fue necesario. De los días 14-28, las células fueron alimentadas con medio HT. Cuando hubo un crecimiento más fuerte en al menos dos cavidades de la 2° placa, el sobrenadante de una cavidad de cada clonotipo fue elegido para reclasificación y un número de clonotipos productores de anticuerpo específico fueron elegidos a partir de los resultados del segundo ensayo de clasificación para producir líneas de células secretadoras de anticuerpo monoclonal mediante dilución limitante.

EJEMPLO 2 Clonación de hibridomas Una 2° cavidad de cada clonotipo elegido fue resuspendida y el número de células viables por cavidad fue estimado por exclusión de azul Trypan. Justo antes de platinar cada clonotipo, se hicieron las series de diluciones relevantes en medio HT o medio completo (si las células eran más viejas de 28 días post fusión) para dar una frecuencia de 0.5 células/0.05 mi. Este volumen fue adicionado entonces con una escaladora Tridak a cada cavidad de una placa de cultivo de tejido con fondo plano de 96 cavidades (Flow Laboratories, Mississauga, Ontario, Canadá) (placa LD) conteniendo 1 x 105 células alimentadoras de bazo de ratón normales en 0.1 mi HT o medio completo. Las placas LD fueron colocadas entonces en una atmósfera de 5% C02, 95% aire, humidificada a 37°C y se clasificaron por crecimiento clonal 7-10 días después. De cada cavidad de crecimiento positivo, se removió 0.1 mi de sobrenadante para clasificar y estas cavdiades fueron alimentadas por primera vez con 0.1- 0.15 mi HT o medio completo. En la base del ensayo de clasificación de LD, se seleccionaron finalmente un mínimo de dos de los "mejores" clones productores de anticuerpo específico para expansión a cultivo de masa. De manera alternativa, si se deseaba obtener una gran cantidad de Mab, ratones BALB/c hembras fueron administrados con una inyección intraperitoneal de 0, 5 mi 2, 5, 10, 14, tetrametilpentadecano (Pristane, Aldrich Chemical Corpo., Milwaukee, Wísconsin) 14 días antes de la inyección de 2 x 106 células de hibridoma viables y los fluidos de ascitis fueron recolectados de los ratones 12-14 días después de la inyección de las células. El fluido ascítico fue clarificado mediante centrifugación y MAb fue recuperado mediante precipitación con 45% de sulfato de amonio y se almacenaron a ya sea 4°C o -70°C en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) conteniendo 0.01% azida de sodio.

EJEMPLO 3 Ensayo de clasificación de anticuerpo monoclonal Las cavidades de una placa de microprueba de fondo U de 96 cavidades (Disposable Products Pty, Ltd., Adelaide, South Australia) se recubrieron al adicionar 50 µ? de ya sea dímero D (5 µg/m\) o productos de degradación de fibrinogeno (5 g/ml en PBS durante una hora a temperatura ambiente 25°C). El antígeno en exceso fue removido al invertir y golpear la placa y la placa se lavó tres veces con PBS conteniendo 0.05% p/v Tween 20 (Sigma Chemical Corp., St Louis, Missouri). Los clones que secretan Mab para dímero D o productos de degradación de fibrinogeno fueron detectados entonces al adicionar 50 µ? de sobrenadante de cultivo de tejido a cada cavidad e incubar durante una hora a temperatura ambiente. MAb sin unir fue removido mediante inversión y golpeado y la placa se lavó tres veces con PBS/Tween. Cien µ? de una dilución 1/1000 de inmunoglobulina anti-ratón de conejo conjugada con peroxidasa (Dakopatts, Copenhagen, Dinamarca) en PBS/Tween se adicionaron y se permitió que se incubaran una hora adicional a temperatura ambiente. La placa fue invertida nuevamente y se lavó tres veces con PBS/Tween y 100 µ| de substrato activado (justo antes de usarse, 10 µ? de solución al 3% de peróxido de hidrógeno se adicionaron a 10 mi de una solución de substrato conteniendo 50 mM citrato, 2.5 mM de dihidrocloruro de 0-tolidina (0-tolidina, Sigma Chemical Co., recristalizada a partir de HCI diluido) 0.025 mM EDTA pH 4.5) se adicionaron a cada cavidad. La reacción de color se detuvo después de 10 minutos mediante la adición de 50 µ? de HCI 3M, la cual provocó un cambio de color de azul a amarillo y la absorbancia se registró a 450 nm en un Titertek Multiskan.

EJEMPLO 4 Identificación de secuencias de región variable de 3B6 El hibridoma de murino 3B6 fue propagado en medio RPMI 1640 complementado con 15% p/v de suero de ternera fetal. El RNA total fue preparado a partir de 107 células de hibridoma. El cDNA de VH y V fue preparado usando transcriptasa inversa y región constante ? de ratón e iniciadores de región constante de IgG de ratón. Los cDNAs de primer filamento fueron amplificados mediante PCR usando una variedad de iniciadores de secuencia de señal de ratón (6 conjuntos para VH y 7 conjuntos para VK). Los DNAs amplificados fueron purificados con gel y clonados en el vector pGem® T Easy (Promega). Los clones VH y VK obtenidos fueron clasificados para inserciones del tamaño esperado mediante PCR y la secuencia de DNA de clones seleccionados se determinó mediante el método de terminación de cadena dideoxi. Genes VH y V productivo fueron identificados mediante análisis de secuencia. La ubicación de las regiones determinantes complentarias (CDRs).fue determinada con referencia a otras secuencias de anticuerpos (43). El VH de 3B6 puede ser asignado a sub-grupo IA de cadenas pesadas de ratón. El V de 3B6 puede ser asignado a sub-grupo I de cadenas de ratón.

EJEMPLO 5 Análisis de secuencias de región variable (v) de 3B6 con epitopes de células T potenciales Se analizaron secuencias de VH y VK de 3B6 por la presencia de epitopes de células T potenciales usando procedimientos descritos previamente (Carr et al., publicación de patente internacional no. WO 98/52976). Los péptidos identificados como epitopes de células T potenciales (péptidos de unión de MHC clase II) fueron modificados in silico y la secuencia modificada fue re-analizada para asegurar la pérdida de unión de MHC clase II potencial y verificar que motivos de unión de MHC clase II adicionales no hubieran sido generados en la secuencia circundante. De manera alternativa, la secuencia fue modificada para convertir el motivo de unión de MHC clase II a uno encontrado en la línea de germen humano. Substituciones de aminoácidos simples, generalmente conservadoras, fueron probadas y substituciones hechas con respecto a la estructura de anticuerpo globla. Una variedad de secuencias variantes son compiladas para VH y VK, conteniendo cada una diferentes números de substituciones.

EJEMPLO 6 Secuencias de regiones variables (v) de 3B6 variantes de diseñador con números reducidos de epitopes de células T potenciales Las regiones pesadas y ligeras (v) diseñadas de acuerdo con el esquema del Ejemplo 5 fueron construidas in vitro mediante el método de recombinación de PCR de traslape descrito (Daugherty et al., Nucleic Acids Research 19: 2471-2476, 1991). Los genes VH y V de murino clonados fueron usados como plantillas para mutagénesis de las regiones de marco de trabajo a las secuencias humanizadas requeridas. Los conjuntos de pares de iniciadores mutagénicos fueron sintetizados abarcando las regiones a ser alteradas. Los iniciadores adyacentes incluyeron 15 bp de secuencia homologa. Una primera vuelta de PCR usando estos iniciadores produjo 5 a 8 fragmentos de DNA de traslape abarcando el gene de región (v) diseñado. Los vectores VH-PCR1 y VK-PCR1 (Orlandi et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837, 1989) se usaron como plantillas para introducir la secuencia flanqueadora 50 incluyendo el péptido de señal líder, intrón líder y el promotor de inmunoglobulina de murino, y la secuencia flanqueadora 3' incluyendo el sitio de empalme y secuencias de intrón, en unos dos fragmentos de traslape. Los fragmentos de DNA producidos fueron combinados en una segunda vuelta de PCR usando iniciadores flanqueadores exteriores para obtener productos de PCR de la longitud completa requerida. Estos productos de PCR fueron clonados en el vector pUC19 para determinación de secuencia de DNA. Los clones fueron seleccionados de manera que contenían las alteraciones de secuencia esperadas y la secuencia de DNA completa fue confirmada por ser correcta para cada VH y VK deseado. Los genes de cadena pesada y ligera fueron transferidos a los vectores de expresión pSVgpí y pSVhyg con regiones constantes ? o lgG1 humana como se describe (Tempest et al., Biotechnology 9: 266-271, 1991). Los vectores HH-PCR1 y V«-PCR1 (Orlandi et al., 1989, supra) se usaron cmo plantillas para introducir la secuencia flanqueadora 5' incluyendo el péptido de señal líder, intrón líder y el promotor de inmunoglobulina de murino y la secuencia flanqueadora 3' incluyendo el sitio de empalme y secuencias de intrones.

EJEMPLO 7 Expresión y purificación de anticuerpos de 3B6 variantes Los vectores de expresión de cadena pesada y ligera de 3B6 variantes fueron co-transfectados en diferentes combinaciones mediante electroporación en NSO, un mieloma de ratón no productor de Inmunoglobulina, obtenido de European Collection of Animal Cell Cultures, Portón, U.K. (ECACC No 85110505). Las colonias que expresan el gene gpt fueron seleccionadas en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 0.8 jig/ml de ácido micofenólico y 2.50 µg/m\ de xantina. La producción de anticuerpo humano mediante clones de células transfectadas fue medida mediante ELISA para IgG humana (48). Las líneas celulares que secretan anticuerpo fueron seleccionadas y expandidas. Los anticuerpos de 3B6 variantes fueron purificados usando Prosep®-A (Bioprocessing Ltd, Conset, U.K.).

EJEMPLO 8 Prueba funcional de anticuerpos de 3B6 variantes Los anticuerpos variantes fueron probados para unión de dimero D usando ensayos basados en ELISA ampliamente como se describe en el Ejemplo 3. La especificidad de unión se confirmó usando el ensayo de unión de fibrinógeno humano. Sin embargo, en una modalidad preferida, el dimero D fue usado en fase de solución. En este ensayo, los anticuerpos de 3B6 fueron recubiertos en la placa de ELISA a 0.5 µg/ca idad, para capturar el dimero D en solución. El dimero D fue aplicado a 10 µg/ml (500 ng/cavidad) y diluciones dobladas. El anticuerpo revelador fue anti-D monoclonal de ratón conjugado con HRPO (Dimertest EIA Tag; Agen) y los resultados fueron desarrolados mediante substrato OPD y se leyeron a 492 nm. Los anticuerpos de 3B6 desinmunizados son comparados con los anticuerpos de 3B6 de murino y quiméricos y el anticuerpo desinmunizado de iniciativa previo 3B6 D1VH1/DIVK1. Los resultados son mostrados en las Figuras 4A, 4B y 4C. El uso de dimero D de fase de solución probó ser mejor que el dimero D de fase sólida en la selección de clones y es un aspecto preferido de la presente invención.

EJEMPLO 9 Visión de trombos usando 3B6-99mTc El anticuerpo monoclonal de 3B6 de ratones y forma desinmunizada para humanos es representado en la Figura 1A y exhibe especificidad para fibrina, la cual es una parte mayor de los coágulos de sangre (Figura 1B). Un concepto de formación de imágenes de coágulo es desarrollado al marcar el anticuerpo monoclonal de 3B6 con una etiqueata nuclear, en este caso, 99mTc (Figura 2). La administración del anticuerpo monoclonal desinmunizado de 3B6 marcado en humanos (Figura 3A). La visualización de coágulos en el sistema circulatorio, tal como coágulos sanguíneos en los muslos anteriores (Figura 3B) ocurre mediante unión del anticuerpo monoclonal a fibrina, resultando en la concentración de radiación en el sitio de coágulo.

EJEMPLO 10 Visión de trombos usando 3B6-99mTc Los émbolos pulmonares (0.1-0.5 g) fueron creados en perros anestesiados mediante embolización de trombos pre-formados hechos mediante infusión de trombina y fibrinógeno humano a través de catéteres de globo colocados en las venas femorales. Los fragmentos Fab' purificados (0.35 mg) de un derivado quimérico (humano/murino) de un anticuerpo monoclonal específico de fibrina fueron marcados con un 15 mCi de 99mTc. Una hora después de embolización, la preparación de anticuerpos radiomarcados fue inyectada a través de un catéter intravenoso ¡periférico. Ocho horas después de la inyección de anticuerpos, se realizaron exploraciones de formación de imágenes para visualizar los émbolos. Los fragmentos de anticuerpos marcados con 99mTc clarificados de la circulación con un t1 2 de una hora para ambos sujetos. En el sujeto 1, dos émbolos pequeños en el lóbulo inferior derecho (masa combinada, 0.187 g) fueron visibles. La proporción de radioactividad de coágulo/sangre fue 38:1. En el sujeto 2, un émbolo en el lóbulo inferior derecho (masa, 0.449 g) fue visible. La proporción de radioactividad de coágulo/sangre fue 27:2. Un émbolo pequeño (0.091 g) fue descubierto en el ventrículo derecho del sujeto 1. La proporción de radioactividad de coágulo/sangre fue 45:1. Ningún efecto adverso fue notado de ya sea administración de anticuerpos o metodología de exploración. La infusión de fragmentos de anticuerpo antí-fibrina radiomarcados seguido por formación de imágenes, produce imágenes de émbolos, incluso émbolos relativamente pequeños en ia periferia del pulmón. Las imágenes fueron confiables y requieren entrenamiento mínimo para interpretar. La técnica puede ser usada para formar imágenes de trombos de venas profundas en el mismo ajuste. Este agente es bien tolerado por los sujetos. No existe necesidad de sostenimiento del aliento o compuertas cardíacas. Usa tinte de contraste intravenoso no nefrotóxico. La dosis de radiación es simlar a la dosis usada para exploraciones de ventilación/perfusión. Esta tecnología puede simplificar y aclarar el diagnóstico de PE y DVT, usando tecnología disponible en la mayoría de los centros médicos. Aquéllos expertos en la técnica apreciarán que la invención descrita en la presente es susceptible a variaciones y modificaciones diferentes a aquéllas descritas de manera específica. Se entenderá que la invención incluye tales variaciones y modificaciones. La invención también incluye todos los pasos, características, composiciones y compuestos referidos a o indicados en esta especificación, de manera individual o colectiva, y cualquiera y todas las combinaciones de cualquiera de dos o más de dichos pasos o características.

BIBLIOGRAFIA Adams et al., Cáncer Res. 53: 4026-4034, 1993. Altschul et al., Nucí. Acids Res. 24:3389-3402. 1997. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology" (Protocolos actuales en biología molecular), John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, capítulo 15. Budzynski et al., Blood 54(4), 1979. Carr et al. (publicación de patente internacional no. WO 98/52976). Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901, 1987. Chothia et al., J. Mol. Biol. 27: 799, 1992. Chou et al (patente estadounidense no.6,056,957). Coligan et al., Current Protocols in Immunology (Protocolos actuales en inmunología), John Wiley & Sons, Inc., 1991-1997. Cumber et al., J. Immunol. 149: 120-126, 1992. Daugherty et al., Nucleic Acids Research 19: 2471-2476, 1991. Davies & Riechmann, FEBS Lett. 339: 285-290, 1994. Publicación de patente europea no. 0239400. Gefter et al., Somatic Cell Genet. 3: 231-236, 1977. Glockshuber et al., Biochem. 29: 1363-1367, 1990. Graeff y Halfer, "Detection and Relevance of Cross-linked Fibrin Derivatives in Blood" (Detección e importancia de derivados de fibrina reticulados en la sangre), Seminars in Thrombosis and Hemostatis 8(1), 1982. Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-448, 1993.

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Claims (47)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado específico para un epitope en dímero D humano, el cual reconoce fibrina reticulada pero no fibrinógeno, en donde dicho anticuerpo es seleccionado de: (i) un anticuerpo desinmunizado, en donde uno o más residuos de aminoácidos en el dominio variable (v) de dicho anticuerpo son mutados para eliminar o reducir los fragmentos de péptidos de dicho dominio v que se asocian con moléculas de MHC clase II; (ii) un anticuerpo humanizado, en donde al menos una región determinante complementaria (CDR) de un dominio v de dicho anticuerpo humanizado es derivdo de dicho anticuerpo monoclonai específico de dímero D y las partes derivadas de ¡nmunoglobulina restantes de dicha molécula de anticuerpo humanizado son derivadas de una ¡nmunoglobulina humana y en donde dicho anticuerpo humanizado es seleccionado usando dímero D soluble; y (¡ii) un fragmento de dicho anticuerpo de (i) o (ii), el cual reconoce fibrina reticulada pero no fibrinógeno.

2. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en donde dicho epitope específico de dímero D es definido por la unión de anticuerpo monoclonai de murino 3B6, o un anticuerpo, el cual inhibe competitivamente 3B6.

3. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1 o 2, en donde dicho anticuerpo es derivado de diferentes combinaciones de genes de cadena pesada (H) y cadena ligera (L).

4. El anticuerpo aislado de la reivindicación 3, en donde dichas cadenas H son seleccionadas de Hv5 (3B6DIVHv5; SEQ ID ??. ), Hv6 (3B6DIVHv6; SEQ ID NO:2) y Hv7 (3B6DIVHv7; SEQ ID NO:3).

5. El anticuerpo aislado de la reivindicación 3, en donde dichas cadenas L son seleccionadas de Kv1 (3B6DIVKv1; SEQ ID NO:4), Kv4 (3B6DIVKv; SEQ ID NO:5) y Kv7 (3B6DIVKv7; SEQ ID NO:6).

6. El anticuerpo aislado de la reivindicación 4 o 5, en donde dicho anticuerpo comprende una combinación de cadenas H y cadenas L seleccionadas de VHv5/VKv1, VHv6/VKv1, VHv7/VKv1, VHv5/VKv7, VHv6/VKv7, VHv6A Kv4, VHv7/V v4, VHv7/VKv7 y VHv5/VKv4.

7. El anticuerpo aislado de la reivindicación 2, en donde dicho anticuerpo comprende una combinación de dominios v de cadena H y L comprendiendo secuencia de aminoácidos codificada por secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:11 o combinaciones de secuencias de aminoácidos codificadas por secuencias de nucleótidos teniendo al menos 70% de similitud a una o ambas secuencias de aminoácidos en cada uno de los pares listados antes o secuencias de nucleótidos capaces de hibridar a condiciones de baja severidad a una o ambas secuencias de nucleótidos o sus formas complementarias en cada uno de los pares listados antes.

8. El anticuerpo aislado de la reivindicación 2, en donde dicho anticuerpo comprende una combinación de dominios v de cadena H y L comprendiendo secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID N0:1/SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:2/SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:3/SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:1/SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:2/SEQ ID N0:6, SEQ ID NO:2/SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:3/SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:3/SEQ ID NO:6 y SEQ ID N0:1/SEQ ID N0:5 o combinaiones de secuencias de aminoácidos teniendo al menos 70% de similitud a una o ambas secuencias de aminoácidos en cada uno de los pares listados antes.

9. Un método para detectar un coágulo sanguíneo en un paciente humano, comprendiendo dicho método introducir en dicho paciente un anticuerpo específico para un epitope en dimero D humano, el cual reconoce fibrina reticulada pero no fibrinógeno, en donde dicho anticuerpo es seleccionado de: (i) un anticuerpo desinmunizado, en donde uno o más residuos de aminoácidos en el dominio v de dicho anticuerpo son mutados para eliminar o reducir fragmentos de péptidos de dicho dominio v que se asocia con moléculas de MHC clase II; (ii) un anticuerpo humanizado, en donde al menos una CDR de un dominio v de dicho anticuerpo humanizado es derivado de dicho anticuerpo monoclonal específico de dimero D y las partes derivadas de ¡nmunogfobulina restantes de dicha molécula de anticuerpo humanizado son derivadas de una inmunoglobulina humana y en donde dicho anticuerpo humanizado es seleccionado usando dimero D soluble; y (iii) un fragmento de dicho anticuerpo de (i) o (ii), el cual reconoce fibrina reticulada pero no fibrinógeno; y en donde dicho anticuerpo es marcado con una molécula reportadora y en donde se permite que dicho anticuerpo marcado se disemine a lo largo del sistema circulatorio, y en donde el paciente es sometido a una exploración de medicina nuclear tomográfica asistida por computadora para visualizar el coágulo.

10. El método de la reivindicación 9, en donde dicho epitope específico de dímero D es definido por la unión de anticuerpo monoclonal de murino 3B6 o un anticuerpo el cual inhibe competitivamente 3B6.

11. El método de la reivndicación 9 o 10, en donde dicho anticuerpo es derivado de diferentes combinaciones de genes de cadena H y cadena L.

12. El método de la reivindicación 11, en donde dichas cadenas H son seleccionadas de Hv5 (3B6DIVHv5; SEQ ID NO:1), Hv6 (3B6DIVHv6; SEQ

ID NO:2) y Hv7 (3B6DIVHv7; SEQ ID NO:3). 13. El método de la reivindicación 11, en donde dichas cadenas L son seleccionadas de Kv1 (3B6DIVKv1; SEQ ID NO:4), Kv4 (3B6DIVKv; SEQ ID NO:5) y Kv7 (3B6DIVKv7; SEQ ID NO:6).

14. El método de la reivindicación 12 o 14, en donde dicho anticuerpo comprende una combinación de cadenas H y cadenas L seleccionadas de VHv5/VKv1, VHv6/VKv1, VHv7/VKv1, VHv5/VKv7, VHv6/V v7, VHv6/VKv4, VHv7/VKv4, VHv7/VKv7 y VHv5/VKv4.

15. El método de la reivindicación 10, en donde dicho anticuerpo comprende una combinación de dominios v de cadena H y L comprendiendo secuencia de aminoácidos codificada por secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:9/SEQ D O:12 y SEQ ID NO:7/SEQ ID N0:11 o combinaciones de secuencias de aminoácidos codificadas por secuencias de nucleotidos teniendo al menos 70% de similitud a una o ambas secuencias de aminoácidos en cada uno de los pares listados antes o secuencias de nucleotidos capaces de hibridar a condiciones de baja severidad a una o ambas secuencias de nucleotidos o sus formas complementarias en cada uno de los pares listados antes.

16. El método de la reivindicación 10, en donde dicho anticuerpo comprende una combinación de dominios v de cadena H y L comprendiendo secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2/SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:2/SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:2/SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:5 o combinaciones de secuencias de aminoácidos teniendo al menos 70% de similitud a una o ambas secuencias de aminoácidos en cada uno de los pares listados antes.

17. El método de la reivindicación 9, en donde dicha formación de imágenes de coágulo plana es MRI, rayos X, exploración CT, ultrasonido o exploración de medicina nuclear incluyendo centellografía gamma o PET.

18. El método de la reivindicación 9, en donde dicha molécula reportadora es una etiqueta nuclear.

19. El método de la reivindicación 18, en donde dicha etiqueta nuclear es 99mTc, 8F, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 77Br, 97Ru, 1 1ln, 123l, 131l y 88Re.

20. El método de la reivindicación 19, en donde dicha etiqueta nuclear es 99mTc.

21. Un método para facilitar la disolución o remoción de un coágulo sanguíneo en un humano, comprendiendo dicho método administrar a dicho humano una cantidad efectiva de disolución de coágulo o prevención de crecimiento de coágulo de un anticuerpo específico para un epitope en dímero D humano, el cual reconoce fibrina reticulada pero no fibrinógeno, en donde dicho anticuerpo es seleccionado de: (i) un anticuerpo desinmunizado, en donde uno o más residuos de aminoácidos en el dominio v de dicho anticuerpo son mutados para eliminar o reducir fragmentos de péptidos de dicho dominio v que se asocia con moléculas de HC clase II; (ii) un anticuerpo humanizado, en donde al menos una CDR de un dominio v de dicho anticuerpo humanizado es derivado de dicho anticuerpo monoclonal específico de dímero D y las partes derivadas de inmunoglobulina restantes de dicha molécula de anticuerpo humanizado son derivadas de una inmunoglobulina humana y en donde dicho anticuerpo humanizado es seleccionado usando dímero D soluble; y (Mi) un fragmento de dicho anticuerpo de (i) o (ii), el cual reconoce fibrina reticulada pero no fibrinógeno; en donde dicho anticuerpo comprende además un agente de disolución de coágulo o prevención de crecimiento de coágulo fusionado, unido o asociado de otra manera al mismo.

22. El método de la reivindicación 21, en donde dicho epitope específico de dímero D es definido por el anticuerpo monoclonal de murino 3B6, o un anticuerpo el cual inhibe competitivamente 3B6.

23. El método de la reivindicación 21 o 22, en donde dicho anticuerpo es derivado de diferentes combinaciones de genes de cadena H y cadena L.

24. El método de la reivindicación 23, en donde dichas cadenas H son seleccionadas de Hv5 (3B6DIVHv5; SEQ ID NO:1), Hv6 (3B6DIVHv6; SEQ ID NO:2) y Hv7 (3B6DIVHv7; SEQ ID NO:3).

25. El método de la reivindicación 23, en donde dichas cadenas L son seleccionadas de Kv1 (3B6DIVKv1; SEQ ID NO:4), Kv4 (3B6DIVKv; SEQ ID NO:5) y Kv7 (3B6DIVKv7; SEQ ID NO:6).

26. El método de la reivindicación 24 o 25, en donde dicho anticuerpo comprende una combinación de cadenas H y cadenas L seleccionadas de VHv5/VKv1, VHv6/VKv1, VHv7/VKv1, VHv5/VKv7, VHv6/V v7, VHv6/VKv4, VHv7/VKv4, VHv7/VKv7 y VHv5/VKv4.

27. El método de la reivindicación 22, en donde dicho anticuerpo comprende una combinación de dominios v de cadena pesada y ligera comprendiendo secuencia de aminoácidos codificada por secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:8/SEQ ID !MO:12, SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:11 o combinaciones de secuencias de aminoácidos codificadas por secuencias de nucléotidos teniendo al menos 70% de similitud a una o ambas secuencias de aminoácidos en cada uno de los pares listados antes o secuencias de nucleótidos capaces de hibridar a condiciones de baja severidad a una o ambas secuencias de nucleótidos o sus formas complemtarias en cada uno de los pares listados antes.

28. El método de la reivindicación 22, en donde dicho anticuerpo comprende una combinación de dominios v de cadena H y L comprendiendo secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2/SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:2/SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:2/SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:5 o combinaciones de secuencias de aminoácidos teniendo al menos 70% de similitud a una o ambas secuencias de aminoácidos en cada uno de los pares listados antes.

29. El uso de un anticuerpo específico para un epitope en dímero D humano, el cual reconoce fibrina reticulada, pero no fibrinógeno, en donde dicho anticuerpo es seleccionado de: (i) un anticuerpo desinmunizado, en donde uno o más residuos de aminoácidos en el dominio v de dicho anticuerpo son mutados para eliminar o reducir fragmentos de péptidos de dicho dominio v que se asocia con moléculas de MHC clase II; (ii) un anticuerpo humanizado, en donde al menos una CDR de un dominio v de dicho anticuerpo humanizado es derivado de dicho anticuerpo monoclonal específico de dímero D y las partes derivadas de inmunoglobulina restantes de dicha molécula de anticuerpo humanizado son derivadas de una inmunoglobulina humana y en donde dicho anticuerpo humanizado es seleccionado usando dímero D soluble; y (iii) un fragmento de dicho anticuerpo de (i) o (¡i), el cual reconoce fibrina reticulada pero no fibrinógeno; en la fabricación de un medicamento para la disolución de un coágulo sanguíneo en un humano.

30. El uso del anticuerpo aislado de la reivindicación 29, en donde dicho epitope específico de dímero D es definido por la unión de anticuerpo monocional de murino 3B6, o un anticuerpo, el cual inhibe competitivamente 3B6.

31. El uso del anticuerpo aislado de la reivindicación 29 o 30, en donde dicho anticuerpo es derivado de diferentes combinaciones de genes de cadena H y cadena L.

32. El uso del anticuerpo aislado de la reivindicación 31, en donde dichas cadenas H son seleccionadas de Hv5 (3B6DlVHv5; SEQ ID NO:1), Hv6 (3B6DIVHv6; SEQ ID NO:2) y Hv7 (3B6DIVHv7; SEQ ID NO:3).

33. El uso del anticuerpo aislado de la reivindicación 31, en donde dichas cadenas L son seleccionadas de Kv1 (3B6DIVKv1; SEQ ID NO:4), v4 (3B6DIVKv; SEQ ID NO:5) y Kv7 (3B6DlVKv7; SEQ ID NO:6).

34. El uso del anticuerpo aislado de la reivindicación 32 o 33, en donde dicho anticuerpo comprende una combinación de cadenas H y cadenas L seleccionadas de VHv5/VKv1, VHv6/VKv1, VHv7/VKv1, VHv5/VKv7, VHv6/VKv7, VHv6/VKv4, VHv7/VKv4, VHv7/VKv7 y VHv5/VKv4.

35. El uso del anticuerpo aislado de la reivindicación 30, en donde dicho anticuerpo comprende una combinación de dominios v de cadena H y L comprendiendo secuencia de aminoácidos codificada por secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:7/SEQ ID ??. 2, SEQ ID NO:8/SEQ ID ??. 2, SEQ ID NO:8/SEQ ID NO:11, SEQ ID NO.-9/SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:11 o combinaciones de secuencias de aminoácidos codificadas por secuencias de nucléotidos teniendo al menos 70% de similitud a una o ambas secuencias de aminoácidos en cada uno de los pares listados antes o secuencias de nucleótidos capaces de hibridar a condiciones de baja severidad a una o ambas secuencias de nucleótidos o sus formas complementarias en cada uno de los pares listados antes.

36. El uso del anticuerpo aislado de la reivindicación 30, en donde dicho anticuerpo comprende una combinación de dominios v de cadena H y L comprendiendo secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2/SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:4, SEQ ID N0.1/SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:2/SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:2/SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:5 o combinaciones de secuencias de aminoácidos teniendo al menos 70% de similitud a una o ambas secuencias de aminoácidos en cada uno de los pares listados antes.

37. Un conjugado que comprende un anticuerpo específico para un epitope en dímero D humano, el cual reconoce fibrina reticulada, pero no fibrinógeno, en donde dicho anticuerpo es seleccionado de: (i) un anticuerpo desinmunizado, en donde uno o más residuos de aminoácidos en el dominio v de dicho anticuerpo son mutados para eliminar o reducir fragmentos de péptidos de dicho dominio v que se asocia con moléculas de MHC clase II; (ii) un anticuerpo humanizado, en donde al menos una CDR de un dominio v de dicho anticuerpo humanizado es derivado de dicho anticuerpo monoclonal específico de dímero D y las partes derivadas de inmunoglobulina restantes de dicha molécula de anticuerpo humanizado son derivadas de una inmunoglobulina humana y en donde dicho anticuerpo humanizado es seleccionado usando dímero D soluble; y (iii) un fragmento de dicho anticuerpo de (i) o (ii), el cual reconoce fibrina reticulada pero no fibrinógeno; y uno o ambos de una etiqueta de formación de imágenes y/o un agente terapéutico.

38. El conjugado de la reivindicación 37, en donde dicho epitope específico de dímero D es definido por la unión de anticuerpo monoclonal de murino 3B6, o un anticuerpo el cual inhibe competitivamente 3B6.

39. El conjugado de la reivindicación 37 o 38, en donde dicho anticuerpo es derivado de diferentes combinaciones de genes de cadena H y cadena L.

40. El conjugado de la reivindicación 39, en donde dichas cadenas H son seleccionadas de Hv5 (3B6DIVHv5; SEQ ID NO:1), Hv6 (3B6DIVHv6; SEQ ID NO:2) y Hv7 (3B6DIVHv7; SEQ ID NO:3).

41. El conjugado de la reivindicación 39, en donde dichas cadenas L son seleccionadas de Kv1 (3B6DIVKv1; SEQ ID NO:4), Kv4 (3B6DlVKv; SEQ ID NO:5) y Kv7 (3B6DIVKv7; SEQ ID NO:6).

42. El conjugado de la reivindicación 40 o 41, en donde dicho anticuerpo comprende una combinación de cadenas H y cadenas L seleccionadas de VHv5/VKv1, VHv6/VKv1, VHv7/VKv1, VHv5/VKv7, VHv6/VKv7, VHv6/VKv4, VHv7/VKv4, VHv7/VKv7 y VHv5/VKv4.

43. El conjugado de la reivindicación 38, en donde dicho anticuerpo comprende una combinación de dominios v de cadena H y L comprendiendo secuencia de aminoácidos codificada por secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:10, SEQ ID N0:8/SEQ ID NO.-10, SEQ ID N0:9/SEQ ID NO:10, SEQ ID N0:7/SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:8/SEQ ID NO:12, SEQ ID N0:8/SEQ ID ?0.?1, SEQ ID N0:9/SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:9/SEQ ID N0:12 y SEQ ID NO:7/SEQ ID N0:11 o combinaciones de secuencias de aminoácidos codificadas por secuencias de nucléotidos teniendo al menos 70% de similitud a una o ambas secuencias de aminoácidos en cada uno de los pares listados antes o secuencias de nucleótidos capaces de hibridar a condiciones de baja severidad a una o ambas secuencias de nucleótidos o sus formas complementarias en cada uno de los pares listados antes.

44. El conjugado de la reivindicación 38, en donde dicho anticuerpo comprende una combinación de dominios v de cadena H y L comprendiendo secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2/SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:2/SEQ ID NO:6, SEQ ID N0.2/SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:6 y SEQ ID ??. /SEQ ID NO:5 o combinaciones de secuencias de aminoácidos teniendo al menos 70% de similitud a una o ambas secuencias de aminoácidos en cada uno de los pares listados antes.

45. El conjugado de la reivindicación 37, en donde dicha etiqueta de formación de imágenes es una etiqueta tipo rayos x, Rl, ultrasonido, CT o medicina nuclear (incluyendo centellografía gamma y PET).

46. El conjugado de la reivindicación 45, en donde dicha etiqueta de formación de imágenes es seleccionada de 99mTc, 18F, 6 Cu, 67Ga, 68Ga, 77Br, 97Ru, 111ln, 123l, 131l y 188Re.

47. El conjugado de la reivindicación 46, en donde dicha etiqueta de (54) Título: ANTICUERPOS HUMANIZADOS DERIVADOS DE DD-3B6/22, ESPECIFICOS PARA EL FRAGMENTO DE DIMERO D DE FIBRINA (57) Resumen: La presente invención es dirigida a formas humanizadas del anticuerpo monoclonal de ratón DD-3B6/22. Este anticuerpo es específico para dímero D, un fragmento de degradación de pol ímeros de fibrina reticul ados. La invención también incl uye el uso de estos anticuerpos para detectar coág ulos sang u íneos in vivo .