AGENTE TERAPEUTICO Y PROFILACTICO PARA COMPLICACIONES DIABETICAS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención concierne al agente profiláctico y terapéutico con compuestos que tienen efecto inhibidor sobre la actividad reductasa de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG CoA) como el ingrediente activo, para complicaciones diabéticas. La invención concierne especialmente al producto farmacéutico para prevenir y/o tratar el principio y el progreso de nefropatxa diabética, neuropatía diabética, retinopatía diabética y angiopatía diabética .
ANTECEDENTES DE LA INVENCION La diabetes mellitus es conocida por conducir a complicaciones diabéticas tales como nefropatía diabética, neuropatía diabética, retinopatía diabética o angiopatía diabética, y puede requerirse el control estricto de la glucosa sanguínea para la prevención y el tratamiento de las mismas. En estas complicaciones se observan a menudo la fibrosis y la calcificación de los tejidos. Bajo la condición de glucosa sanguínea elevada, se producen las proteínas glicosiladas que son las moduladoras para la función celular, y se observa la acumulación de sorbitol debido a la activación de la ruta de poliol intracelula , que conduce a la activación de la proteina quinasa C intracelular (PKC) , la cual da como resultado la anormalidad de las células glomerulares en el riñon, células nerviosas o células endoteliales arteriales, e induce a la acumulación de matrices extracelulares y a la calcificación . La expresión acelerada de matrices extracelulares tales como colágeno tipo IV o fibronectina está bien documentada (Cagliero E. y colaboradores: J. Clin. Invest., 82, 735-738 (1988), Haneda M. y colaboradores: Diabetologia, 34, 19.8-200 (1991), Doi T. y colaboradores: Eroc. Nati. Acad. Sci. USA, 89, .2873-2877 (1992)), pero recientemente hay varios documentos que reportan que la expresión de osteopontina en el riñon y los vasos sanguíneos aumenta marcadamente bajo condiciones diabéticas y la expresión de .la osteopontina acelerada de ese modo puede estar de alguna manera relacionada con la nefropatla diabética o la angiopatía diabética (Takemoto M. y colaboradores: Arterioscle . Thromb. Vasc. Biol., 20, 624-628 (2000), Takemoto M. y colaboradores: nn. NY Acad. Sci., 902, 357- 360 (2000)). Desde estos descubrimientos, se esperó que la supresión de la expresión de la osteopontina como unas matrices celulares cuya expresión es acelerada en el riñon y la pared arterial bajo la condición diabética, puede ser efectiva profilácticamente en el principio o la gravedad de la nefropatia diabética o la angiopatia diabética. Actualmente, no hay productos farmacéuticos descubiertos para el control de la calidad esencial de lesiones de tejido tales como la expresión y la producción de matrices extracelulares como la osteopontina a fin de prevenir y/o de tratar complicaciones diabéticas tales como nefropatia diabética, neuropatía diabética, retinopatía diabética y angiopatia diabética entre otras, y es la mejor expectativa para el hallazgo de productos farmacéuticos que tengan el excelente efecto terapéutico para complicaciones diabéticas . Sobre esto, los compuestos que tienen efecto inhibidor sobre la actividad reductasa de HMG-CoA fueron conocidos por tener los efectos sobre la supresión de la proliferación celular, de la supresión de la adhesión celular, la supresión del espesamiento íntimo y la prevención así como también el tratamiento de la osteoporosis entre otros además del efecto principal de inhibir la biosíntesis del colesterol. Además, se ha reportado la supresión de la acumulación de fibronectina en la lesión íntima de la neointima inducida por daño endotelial en la arteria carótida ( itahara M. y colaboradores: Jpn. J. Pharmacol. , 77, 117-128 (1998). No obstante, no se ha reportado sobre el efecto de la expresión de la osteopontina. El objeto de la presente invención es proporcionar los productos farmacéuticos que puedan prevenir y/o tratar las complicaciones diabéticas tales como nefropatia diabética, neuropatía diabética, retinopatía diabética y angiopatía diabética entre otras al suprimir la expresión de osteopontina en el riñon y en los vasos sanguíneos bajo la condición diabética.
DESCRIPCION DE LA INVENCION Conociendo la presente situación como se describió anteriormente, los inventores de la presente invención administraron inhibidores de la HMG-CoA reductasa tal como el compuesto mostrado en la fórmula (I), es decir (+) -bis {ácido (3R, 5S, 6E) - 7- [2- ciclopropil- 4- (4-fluorofenil) - 3- quinolil]- 3, 5- dihidroxi- 6-heptenoico}- cálcico (en lo sucesivo mencionado como pitavastatina cálcica) en ratas diabéticas inducidas con estreptozotocina (STZ) e investigaron el efecto en detalle sobre la expresión del mRNA de la osteopontina en el riñon y en los vasos sanguíneos. Como un resultado, el compuesto mostrado en la fórmula (1) o la forma lactonizada del mismo ha mostrado el efecto notable sobre la supresión de la expresión del mRNA de la osteopontina, así se descubrió la efectividad de estos compuestos sobre la prevención y/o el tratamiento de complicaciones diabéticas y se completó la presente invención. Esto quiere decir que la presente invención es para proporcionar el agente profiláctico y/ o terapéutico para complicaciones diabéticas que tengan el compuesto mostrado en la fórmula (1) :
(en donde R es grupo orgánico, X es -CH2CH2- o -CH=CH- , y M es átomo de hidrógeno, grupo Ci_i0 alquilo o grupo catiónico aceptable fisiológicamente) o la forma lactonizada de éstos, como el ingrediente activo. BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1(a) muestra el efecto de la pitavastatina calcica sobre la secreción de la proteina de la osteopontina en el medio de cultivo acondicionado desde células del músculo liso aórtico de ratas, cultivadas bajo la concentración normal de glucosa, mientras que la Figura 1(b) muestra el efecto de la Atorvastatina sobre la secreción de la proteina de la osteopontina en el medio de cultivo acondicionado desde células del músculo liso aórtico de ratas, cultivadas bajo la concentración normal de glucosa. La figura 2 (a) muestra la influencia de la adición de ácido mevalónico sobre el efecto supresivo de la pitavastatina cálcica sobre la expresión del mRNA de la osteopontina intracelular en células del músculo liso aórtico de ratas cultivadas bajo la concentración normal de glucosa, mientras que la figura 2 (b) muestra la influencia de la adición de ácido mevalónico sobre el efecto supresivo de pitavastatina cálcica sobre la secreción de la proteina de la osteopontina en el medio de cultivo acondicionado desde células de músculo liso aórtico de ratas cultivadas bajo la concentración normal de glucosa.
MEJOR MODO DE LLEVAR A CABO LA INVENCION A continuación, la descripción detallada de la invención. Los compuestos mostrados en la fórmula (1) o la forma lactonizada de los mismos, se han conocido como los compuestos que tienen el efecto inhibidor sobre la actividad reductasa de HMG-CoA, pero si estos compuestos tienen algún efecto sobre la supresión de la expresión de osteopontina, por lo tanto son útiles como los productos farmacéuticos en el tratamiento de complicaciones diabéticas o no han sido elucidados hasta ahora. El compuesto mostrado en la fórmula (1) o la forma lactonizada de éstos se describe por medio de los ejemplos en la Patente EüA No. 4,739,073 y la Patente Europea No.
114,027; Solicitud de Patente Europea Revelada No. 367,895; Patentes EÜA Nos. 5,001,255, No. 4,613,610, No. 4,851,427, No. 4,755,606 y No. 4,808,607, No. 4,751,235, No. 4,939,159, No. 4,822,799, No. 4,804,679, No. 4,876, 280, No. 4, 829, 081, No. 4,927,851 y No. 4,588,715; y F. G. at awala, Medical Research Reviews, 11, 121-146 (1991), y también la Solicitud de Patente Europea Revelada No. 304,063 y No. 330,057 y las Patentes EUA No. 5,026,708 y No. 4,868,185; Solicitud de Patente Europea Revelada No. 324,347; Solicitud de Patente Europea Revelada No. 300,278; Patentes EÜA No. 5,013,749, No. 5,872,130 y No. 5,856,336, Patentes EÜA No. 4,231,938, Patente EÜA No. 4,444,784, Patente EÜA No. 4,346,227, Patente EÜA No. 5,354,772, Patente EÜA No. 5,273,995, Patente EUA No. 5,177,080, Patente EUA No. 3,983,140, Patente Japonesa No. 2,648,897, Patente EUA No. 5,260,440 o Bioorganic & Medicinal
Chemistry, 5, pp 437 , (1977) y Patente Japonesa No.
2,569,746, Patente Europea No. 304, l D63 o Patente EUA No.
5, 856, 336. En particular, se describen respectivamente , la lovastatina en la Patente EUA No. 4,231, 938, la simvastatina en la Patente EÜA No. 4,444,784, la pravastatina en la Patente EUA No. 4,346,227, la fluvastatina en la Patente EÜA No. 5,354,772, la atorva-statina en la Patente EÜA No. 5,273, 995, la cerivastatina en la Patente EUA No. 5,177,080, la mevastatina en la Patente EUA No. 3,983,140, y la rosuvastatina, que es bis (+) -7-[4- (4-fluorofenil) -6-isopropil-2- (N-metil-N-metansulfonilaminopirimidina) -5-il]- (3R, 5S)- dihidroxi- (E) -6- (heptanoato monocálcico en la Patente Japonesa No. 2,648,897, la Patente EUA No. 5,260,440 o Bioorganic & Medicinal Chemistry, 5, pp 437, (1977) . Además, la pitavastatina calcica se describe en la Patente japonesa No. 2,569,746, la Patente Europea No. 304,063 o la Patente EUA No. 5,856,336. El grupo orgánico preferido, mostrado como R en la fórmula anterior es el grupo con la estructura anular seleccionada de los grupos indolilo, indenilo, piridilo, pirrolopiridilo, pirazolpiridilo, tienopiridilo, pirimidinilo, pirazolilo, pirrolilo, imidazolilo, indolizinilo, quinolilo, naftilo, hexahidronaftilo, ciclohexilo, fenilsililfenilo, feniltienilo y fenilfurilo. El grupo especialmente preferido entre éstos grupos orgánicos cíclicos son hexahidronaftilo, indolilo, piridilo, pirimidinilo, pirrolilo y quinolilo. Estas estructuras anulares pueden tener substituyentes tales como el grupo hidroxilo, el grupo Ci-io alquilo (incluyendo el grupo cíclico de cadena ramificada, cadena recta) el grupo alquiloxialquilo, el grupo alquilcarboniloxi, el grupo amino substituido, el grupo sulfamoilo substituido, el grupo halofenilo, y el grupo fenilo entre otros, especialmente más preferidos son aquellos con el grupo isopropilo, el grupo ciclopropilo y el grupo p-fluorofenilo . Como las sales aceptables fisiológicamente del compuesto mostrado en la fórmula (1) , son seleccionadas las sales de metales alcalinos, tales como la sal sódica, la sal de potasio y las similares, sales de metales alcalino-térreos, tales como la sal de calcio, la sal de magnesio y las similares, sales aminadas orgánicas tales como la sal fenetilaminada y las similares, y la sal de amonio, pero las sales de sodio y de calcio son más preferidas . Además, son seleccionados los compuestos que exhiben el efecto inhibidor sobre la actividad reductasa de HMG-CoA, tales como lovastatina, pravastatina, simvastatina, fluvastatina, serivastatina, atorvastatina, rosuvastatina y pivastatina cálcica, entre los compuestos enlistados anteriormente. Entre ellos es particularmente preferida la pivastatina cálcica. El compuesto mostrado en la fórmula (1) anterior, suprime hasta un nivel estadísticamente significativo la expresión del gen de la osteopontina en el riñon y en los vasos sanguíneos de ratas diabéticas inducidas con STZ así como también la expresión del gen de la osteopontina en células cultivadas del músculo liso vascular de ratas como se muestra en los ejemplos siguientes. Por consiguiente, los compuestos mostrados en la fórmula (1) anterior y la forma lactonizada de la misma, son útiles para la prevención y/o el tratamiento de complicaciones diabéticas tales como nefropatia diabética, neuropatía diabética, retinopatía diabética, y angiopatía diabética entre otras a través de la supresión de la expresión de la osteopontina. El uso de los compuestos de la presente invención hace posible no solamente prevenir y tratar las complicaciones diabéticas que tienen lugar con la expresión acelerada de osteopontina en pacientes diabéticos, sino también explotar las posibilidades de los nuevos sistemas experimentales así como también de los nuevos clasificadores de productos farmacéuticos entre otras ventajas. Las formas de administración al usar los compuestos de la presente invención cuando los productos farmacéuticos son, por ejemplos, formas de administración oral tales como tabletas, cápsulas, gránulos, polvos o jarabes entre otras, así como también formas de administración parenteral tales como inyección intravenosa, inyección intramuscular, absorción transdérmica, supositorio, inhalación, soluciones oftálmicas, o colunarias entre otras. Además, el ingrediente activo por .si mismo puede ser usado a fin de producir las preparaciones farmacéuticas en estas formas variadas, o algunos excipientes, aglutinantes, rellenos, desintegradores, surfactantes, lustradores, agentes de dispersión, reguladores, conservadores, saborizantes, perfumes, agentes recubridores, portadores, y diluyentes entre otros pueden ser apropiadamente compuestos en ellos. La forma preferida es la forma de administración oral entre ellas, y el pH de la preparación es ajustada preferiblemente en consideración a la estabilidad del ingrediente activo, de conformidad con los métodos descritos en la Solicitud de Patente Japonesa Revelada No. Hei 2-6406, Patente Japonesa No. 2,774,037, y WO97/23200. La dosis para el uso médico de la presente invención puede ser variada, dependiendo del peso, edad, sexo, asi como también de los síntomas de los pacientes, pero 0.01 a 100 mg por día, y especialmente 0.1 a 10 mg por día del compuesto mostrado en la fórmula (1) anterior es administradas preferiblemente en la forma de una vez al día o dos veces al día por adulto en general. Ejemplos La utilidad de la presente invención se describe con referencia a ios siguientes e emplos, pero la invención no se limita a los ejemplos descritos en la presente. Ejemplo 1. La supresión de la expresión del mRNA de osteopontina en el riñon y vasos sanguíneos de .ratas diabéticas inducidas con estreptozotocina . Los efectos de la pitavastatina calcica sobre la expresión del mRNA de osteopontina en el riñon y en los vasos sanguíneos de ratas diabéticas inducidas con STZ, se investigaron de conformidad con el método descrito posteriormente . Es decir, 35 mg por kg de peso corporal de STZ disueltos en la concentración de 50 mg/ml de solución salina fisiológica fueron inyectados en la vena de la cola de ratas Winstar machos (peso- corporal: aproximadamente 300 g) , y a los animales se les administró oralmente 1 ml/kg de peso corporal de solución de carboximetilcelulosa al 0.5 % que contenía el fármaco de prueba (pitavastatina célcica) en la concentración de 3 mg/ mi con una sonda gástrica. Después, la administración oral se efectuó una vez al día en el mismo volumen y a tiempo fijo durante el experimento. El mismo volumen de solamente carboximetilcelulosa al 0.5 % se administró por medio de administración oral forzada para el grupo control. La sangre venosa fue sacada de la vena de la cola en el segundo día del experimento y se confirmó la presencia de 200 mg/dl o superior de los niveles de azúcar en la sangre. 24 horas después de 7 días de administración, la sangre fue sacada bajo la anestesia con éter, y se aislaron los ríñones y la aorta torácica. La cantidad predeterminada de la pieza de tejido en ISOGEN (Wako Puré Chemicals .K.) se homogeneizó en un homogeneizador politron y se extrajo el RNA total. El RNA total asi obtenido se precipitó usando isopropanol. El precipitado se lavó con etanol frió de congelación al 70 % y se almacenó a - 80 °C en etanol al 70 g. " > Se detectó el mRNA de la osteopontina en el RNA total obtenido por medio del método de manchado Northern convencional. Esto quiere decir que el RNA total precipitado con etanol al 70 % se sometió a centrifugación a 15,000 rpm, el precipitado se secó a temperatura ambiente después de decantar el sobrenadante y se disolvió en una pequeña cantidad de regulador TE (10 mM de regulador de Tris-HCl-1 mM de solución de EDTA) . 10 µ? de la solución asi obtenida se diluyó con 990 µ? de solución reguladora de TE, y la cantidad de RNA se calculó por medio de la medición de la absorbancia de la solución a 260 nm de rayos ultravioleta. Se añadió solución de glioxal desionizada al 40 % (3.5 µ?) , solución reguladora de NaHP04 0.1 M (2.4 µ?) y dimetilsulfoxida (11.8 µ?) a la cantidad predeterminada (10 o 20 µg) del RNA total (volumen final: 6 µ?) , se calentó a 50 °C por 1 h y el RNA total se desnaturalizó. Se añadieron 6.3 µ? de solución reguladora de 10 mM de fosfato de sodio (pH: 6.8) que contenia 50 % de glicerol y 0.4 % de azul de bromofenol a la solución, después la solución se enfrió a la temperatura ambiente, y luego el RNA se sometió a electroforesis usando gel de agarosa al 1.5 %. El RNA se manchó desde agarosa en membrana de nylon de una manera convencional usando 20X de solución salina-citrato de sodio (SS'C) . La membrana de nylon manchada se lavó con 2X de SSC, y el RNA se fijó sobre la membrana de nylon calentándola a 80 °C al vacio. El fragmento de DNA que codificó a la osteopontina se digirió desde el vector pCRIIrOP con Eco Rl endonucleasa y se purificó con Probé Quant™G-50 Micro Columns (Amersham Pharmacia Biotech Co. Ltd.). El fragmento de DNA que codificó a la osteopontina asi obtenido se hibridizó durante toda la noche junto con la membrana de nylon a 65 °C con la sonda radioactiva de Rediprime™ II (Amersham Pharmacia Biotech Co. Ltd.) marcada con radioisótopo 32P. El nivel de radioisótopo de la sonda enlazado a la membrana de nylon se detectó sobre película de rayos-X y se analizó la densidad de la banda de conformidad con la imagen de NIH. Se usó 18S tRNA como el estándar interno de RNA y la cantidad de la expresión se representó con las intensidades comparativas de la densidad de las bandas. El mRNA de la osteopontina se midió similármente en el experimento de ratas normales . Los resultados del Ejemplo 1 se muestran en la Tabla
1. En la Tabla 1, OPN mRNA/18S representa la proporción de la densidad de mRNA de osteopontina a la densidad de 18S tRNA basada en el Análisis de Imagen de NIH y el % de inhibición representa la de los grupos control respectivos. Los valores de 0PNmRNA/18S son la media + desviación estánda . Tabla 1 Riñon Aorta 0PNmRNA/18S % de 0PNmRNA/18S % de Inhibición Inhibición
Control saludable 1.343±0.462 2.400±1.345 Saludables con administración de fármaco 1.667+0.321 -24.1 2.433+0.929 -1.4
Control de diabéticos 3.233+0.115 3.20010.361 Diabéticos con administración de fármacos 1.933+0.874* 40.2 1.30010.781*
*: diferente significativamente del control; p = 0.016 **: diferente significativamente del control; p = 0.036 OPN: osteopontina La proporción de mRNA de osteopontina en el riñon y la aorta a 18S tRNA aumentó desde 1.343 a 3.233 y 2.400 a 3.200 respectivamente en ratas diabéticas inducidas con estreptozotocina. La pitavastatina cálcica no influyó la expresión de osteopontina en el riñon y la aorta de ratas saludables (1.667 y 2.433 respectivamente), pero disminuyó con el significado estadístico la cantidad de la expresión de mRNA de osteopontina en el riñon y la aorta de ratas diabéticas inducidas con STZ a 1.933 (proporción de inhibición: 40.2 %) a 1.300 (proporción de inhibición: 59.4 %) , respectivamente. Ejemplo 2. La supresión de la secreción de la proteína de osteopontina en células de músculo liso aórtico de ratas. Se midió el efecto de la pitavastatina cálcica y la atorvastatina sobre la secreción de la proteína de osteopontina en medio de cultivo acondicionado desde células de músculo liso aórtico de ratas cultivadas bajo la concentración de glucosa normal, de conformidad con el método descrito posteriormente. Primeramente, las células de músculo liso aórtico de ratas (5 a 10 pasos de cultivo) , fueron sembradas en placas de cultivo de 6 pocilios y los cultivos confluentes fueron logrados por cultivo en medio de Eagle modificado de Dulbecco's bajo en glucosa (1000 mg/1) (D EM) con suero bovino fetal al 10 % (FBS: BioWhittaker Co. Ltd) bajo atmósfera de CC½ al 5 % a 37 °C. Después, el medio se reemplazó con el medio con fármacos de prueba (pitavastatina cálcica y atorvastatina) y las células se
\L cultivaron por 48 horas. Después de que el medio fue reemplazado otra vez con 1.5 mi de medio libre de FBS por pocilio, las células se cultivaron por 48 horas adicionales y el medio acondicionado se colectó. La cantidad igual de NaCl 0.14 M en 50 mM de solución reguladora de clorhidrato de Tris (pH 7.4") se añadió ai volumen predeterminado (0.5-1 mi) del medio acondicionado, y luego se añadieron 50 µ? de celulosa DEAE de intercambio aniónico; DE52 (Whatraan Co. Ltd. ) se suspendió en concentración de 50 % después de aumento de volumen y se equilibró con el mismo regulador descrito anteriormente, se agitó suavemente por 1 hora a 4 °C, y la proteina de osteopontina fue absorbida sobre DE52.
Después de centrifugación, se sedimentó, los geles de DE52 sedimentados, se lavaron varias veces con el mismo regulador, y se añadieron 60 µ? de solución reguladora de clorhidrato de Tris 0.2 M (pH 6.8) que contenia 5 % de 2-mercaptoetanol, 4 % de SDS, 5 mi de EDTA, 20 % de glicerol y 0.01 % de azul de bromofenol, y se trataron térmicamente por 5 minutos a 95 °C. Después de enfriamiento a la temperatura ambiente, la suspensión se centrifugó y la cantidad predeterminada (30 µ?) del sobrenadante se sometió a electroforesis sobre gel de poliacrilamxda con SDS al 10 %. Después de electroforesis, las proteínas se transfirieron sobre membrana de nitrocelulosa de conformidad con la técnica convencional y se condujo el manchado Western de conformidad con el método convencional. Es decir, la membrana de nitrocelulosa se agitó en TBS-T (regulador de Tris-solución salina fisiológica que contenia 0.2 % de Tween-20) con 3 % de albúmina de suero bovino durante 1 hora y la membrana subsecuentemente fue expuesta con el mismo regulador descrito anteriormente que contenia anticuerpo anti-osteopontina (MP IIIBlOi; American Research Products Co. Ltd.) en dilución de 1/1000 por 1 hora con agitación. Después de eso, la membrana se agitó por 1 hora en solución de anticuerpo IgG anti-ratón enlazado a peroxidasa de rábano diluida a 1/5000 con TBS-T que contenia 3 % de albúmina de suero bovino y luego se lavó con TBS-T por varias veces. Las quimioluminicencias fueron detectadas sobre película de rayos X usando ECLm (Amersham Pharmacia Biotech Co. Ltd.). La densidad de las bandas se analizaron de conformidad con la Imagen de NIH. Las mediciones anteriores se llevaron a cabo con la concentración de 0 µ (control), 0.03 µ? y 0.3 µ? para la pitavastatina cálcica, y con las concentraciones de 0 µ? (control), 0.3 µ? y 3 µ? para atorvastatina, respectivamente . Los resultados del Ejemplo 2 se muestran en la figura
1. La densidad de la proteína de osteopontina medida con el Análisis de Imagen de NIH para varias concentraciones de pitavastatina cálcica se muestran en la figura 1(a), y la densidad de la proteína de osteopontina medida con el Análisis de Imagen de NIH para varias concentraciones de atorvastatina se muestran en la figura 1(b). Es claro de la figura 1 que ambas, la pitavastatina cálcica y la atorvastatina inhibieron con el significado estadístico la cantidad de la secreción de proteína osteopontina en el medio acondicionado de células cultivadas de músculo liso aórtico de ratas. Ejemplo 3. El efecto de ácido mevalónico sobre la expresión de mRNA de osteopontina y la supresión de la secreción de la proteína de osteopontina en células de músculo liso aórtico de .ratas. Se midió, el efecto del ácido mevalónico sobre la supresión con pivastatina cálcica por medio de la expresión de mRNA de osteopontina y la secreción de proteína de osteopontina en células de músculo liso aórtico de ratas, de conformidad con el método descrito posteriormente. Se sembraron células de músculo liso aórtico de ratas (5 a 10 pasos de cultivo) en una placa de cultivo de seis pocilios y los cultivos confluentes se lograron por cultivo en DMEM de baja glucosa (1000 mg/ml) con FBS al 10 % bajo atmósfera de C02 al 5 % a 37 °C. Después, el medio se reemplazó con el medio con pitavastatina cálcica (8 µ?) y/o ácido mevalónico (100 µ?) , y las células se cultivaron por otras 48 horas. El medio fue reemplazado otra vez con 1.5 mi de medio libre de FBS por pocilio, y las células se cultivaron por 48 horas adicionales. Después del cultivo, las células adheridas a la placa de cultivo se homogeneizaron junto con ISOGEN, se extrajo el ??? exactamente como en el Ejemplo 1, y se analizó la cantidad de mRNA de osteopontina por medio del método de manchado northern. Al mismo tiempo, se colectó el medio acondicionado, se absorbió la proteina de osteopontina sobre DE52, se sometió a electroforesis exactamente como en el ejemplo 2, y se analizó la cantidad de proteina de osteopontina secretada por medio del método de manchado western. Las mediciones anteriores se llevaron a cabo en los tres casos cuando no se añadieron la pitavastatina cálcica y el ácido mevalónico, cuando solamente se añadió la pitavastatina, y cuando se añadieron ambos, la pitavastatina cálcica y el ácido mevalónico. Los resultados del Ejemplo 3 se muestran en la Figura 2. La figura 2(a) muestra la proporción de la densidad de la banda de mRNA de osteopontina a la densidad de la banda de 18S tRNA de conformidad con el Análisis de Imagen de NIH, y la Figura 2 (b) muestra la densidad de la proteina de osteopontina de conformidad con el Análisis de Imagen de IH para las tres condiciones descritas anteriormente. Aunque la pitavastatina cálcica suprime ambos, la expresión del mRNA de osteopontina y la secreción de proteina de osteopontina desde células de músculo liso de ratas, cultivadas, es claro desde la Figura 2 que este efecto supresivo con la pitavastatina cálcica desaparece con la adición de ácido mevalónico. De este hecho, se encontró que la adición de pitavastatina cálcica suprime la producción de ácido mevalónico suprimiendo asi la expresión de mRNA de osteopontina así como también la secreción de la proteína de la misma en células de músculo liso aórtico. Aplicación Industrial El compuesto de la presente invención mostrado en la fórmula (1) muestra la acción inhibidora efectiva y específica contra la expresión acelerada de osteopontina en el riñon y la aorta aquejados con la condición diabética sin afectar la expresión de osteopontina bajo condiciones saludables, y suprime marcadamente la biosíntesis de osteopontina en estos órganos en diabetes . Por consiguiente, el compuesto mostrado en la fórmula
(1) es especialmente útil como fármaco para el tratamiento y/o profilaxis para complicaciones diabéticas que tienen lugar posiblemente por la expresión acelerada del gen de osteopontina tales como en nefropatía diabética, neuropatía diabética, retinopatía diabética y angiopatía diabética entre otras.