MXPA02009821A - Inhibicion de la generacion de citocina. - Google Patents

Abstract

Se describen usos de la desloratadina en la preparacion de un medicamento para la inhibicion de la generacion de citocinas proinflamatorias tales como IL-4 e IL-13 en un paciente humano que necesita de dicha inhibicion.

Description

INHIBICIÓN DE LA GENERACIÓN DE CITOCINA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente Invención se refiere a composiciones farmacéuticas y al uso .de desloratadlna en la preparación de un medicamento para la inhibición de la generación de citocinas proinflamatorias, por ejemplo, IL-4 e IL-13. Las células cebadas y los basófilos desempeñan una función en las enfermedades alérgicas e inflamatorias. Estas células producen una amplia variedad de mediadores, tales como prostaglandinas, por ejemplo, prostaglandina D2, leucotrienos, por ejemplo, leucotrieno C4, citocinas e histamlna. Las citocinas son polipéptidos secretados por células que afectan la función de otras células. Las citocinas, incluyendo las interleucinas, difieren ampliamente en los tipos de células afectadas y en las actividades biológicas exhibidas. La desloratadina, una antihistamina no sedante, es descrita por Lippert, U., et al., Experimental Dermatology, 1995, Vol. 4, 272-276 como activa in vitro al inhibir la liberación de las citocinas IL-6 en hasta 40% e IL-8 en hasta 50% de las líneas de células basófilas y cebadas humanas. Las células Fe Rl+ humanas desempeñan una función proinflamatoria considerable a través de la liberación de histamina, triptasa y quimasa. Sin embargo, puesto que las líneas de células basófilas y cebadas humanas muestran una señalización defectuosa a través del receptor de inmunoglobulina-E (IgE) de alta afinidad, Fc» Rl, es difícil predecir qué efecto, si es que existe alguno, tiene la desloratadina sobre la liberación de IL-6 e IL-8 mediada por IgE. S. Molet, et al., Clinical and Experimental Allergy, 1997, Vol. 27, páginas 1167-1174, describen que la desloratadina reduce la liberación de IL-6 e IL-8 inducida por histamina en un estudio in vitro en células endoteliales. Kleine-Tebbe, J., et al., J. Allergy Clin. Immunol. 1994, Vol. 93, No. 2, páginas 494-500, describen que la desloratadlna inhibe la liberación de histamina mediada por IgE y no mediada por IgE en un estudio in vitro en leucocitos basófilos humanos. Los basófilos humanos son una fuente importante de las citocinas IL-4 e IL-13 que se producen in vitro en cultivos de leucocitos mixtos. La producción de IL-4 e IL-13 por los basófilos puede desempeñar una función en la modulación de una variedad de actividades que intervienen en la patogénesis de condiciones inflamatorias alérgicas. Por ejemplo, IL-4 e IL-13 inducen cada uno la secreción de IgE e lgG-4 por células B humanas (véase Schroeder, J. T., "The role of basophil-citokyne networks in asthma", en Asthma and Allergic Diseases: Physiology, Immunopharmacology, and Treatment, editores: G. Marañe, K. F. Austen, ST Holgate, A. B. Kay, L. M. Lichtenstein, Academic Press, San Diego, 75-84, 1998a). Sin embargo, no existe información sobre el efecto de la desloratadina sobre la generación de citocinas tales como IL-4 e IL-13 en basófilos o algún otro tipo de célula. Un estudio realizado por Gibbs, et al. Naunyn Schmiedebegs Arch. Pharmacol, 1998, Vol. 357: 573-578, reporta inhibición moderada (50%) de secreción de IL-4 e IL-13 in vitro en basófilos usando concentraciones relativamente altas de terfenadina, una antihistamina no sedante. Este estudio no probó si las concentraciones de terfenadina usadas eran tóxicas. La FDA ha retirado los dos NDAs de terfenadina debido al hallazgo de que la terfenadina dejó de ser segura por razones cardiacas para su uso en el tratamiento de rinitis alérgica estacional (Federal Register, octubre 5, 1998, Vol. 63, página 53444). Por lo tanto, existe la necesidad de una terapia segura y efectiva para inhibir la secreción de citocinas proinflamatorias tales como IL-4 e IL-13 para tratar estados de enfermedad, por ejemplo, condiciones alérgicas y/o inflamatorias.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un método para inhibir la generación de IL-4 e IL-13 en un paciente humano que necesita de dicha inhibición, el cual comprende administrar a dicho paciente una cantidad efectiva de desloratadina. Típicamente, IL-4 e IL-13 se generan a partir de basófilos humanos, así como también de otras células, por ejemplo, células B humanas. La presente invención provee también un método para inhibir la generación de IL-4 e IL-13 a partir de basófilos humanos en un paciente que exhibe los síntomas de una condición alérgica y/o inflamatoria, el cual comprende administrar a dicho paciente una cantidad de desloratadina efectiva para inhibir la generación de IL-4 e IL-13, y para tratar concurrentemente los síntomas de dichas condiciones alérgicas y/o inflamatorias. La presente invención provee también un método para bloquear la generación de citocinas proinflamatorias en un paciente que necesita de dicho bloqueo, el cual comprende administrar a dicho paciente una cantidad efectiva de desloratadlna. La presente invención provee también un método para inhibir la secreción de citocinas proinflamatorias a partir de basófilos humanos en un paciente que necesita de dicha inhibición, el cual comprende administrar a dicho paciente una cantidad efectiva de desloratadina. Las citocinas proinflamatorias preferidas son IL-4 e IL-13. Los pacientes que necesitan de dicha inhibición, son aquellos que tienen síntomas de condiciones alérgicas/inflamatorias de los conductos de las vías respiratorias, piel, ojos y tracto intestinal. La presente invención provee también un método para tratar a un paciente que exhibe los síntomas de condiciones alérgicas/inflamatorias de la piel, ojos, tracto intestinal y/o conductos de las vías respiratorias superior e inferior, el cual comprende administrar a dicho paciente una cantidad efectiva de desloratadina. Los pacientes que necesitan de dicha inhibición, son aquellos que exhiben síntomas de una condición alérgica y/o inflamatoria de la piel, ojos, tracto intestinal y/o los conductos de las vías respiratorias superior e inferior. La presente invención provee también un método para tratar un estado de enfermedad que tiene un componente alérgico y un componente inflamatorio, el cual comprende administrar a un paciente que necesita de dicho tratamiento, una cantidad de desloratadina efectiva para producir un efecto antiinflamatorio. La presente invención provee también un método para tratar y/o prevenir asma alérgico, e inhibir la secreción de IL-4 e IL-13 en un paciente que necesita de dicho tratamiento, el cual comprende administrar a dicho paciente una cantidad efectiva de desloratadina. La presente invención provee también un método para tratar y/o prevenir rinitis alérgica, e inhibir la secreción de IL-4 e IL-13 en un paciente que necesita de dicho tratamiento, el cual comprende administrar a dicho paciente una cantidad efectiva de desloratadina. La presente invención provee también un método para tratar y/o prevenir dermatitis atópica, e inhibir la secreción de IL-4 e IL-13 en un paciente que necesita de dicho tratamiento, el cual comprende administrar a dicho paciente una cantidad efectiva de desloratadina. La presente invención provee también un método para tratar y/o prevenir urticaria, e inhibir la secreción de IL-4 e IL-13 en un paciente que necesita de dicho tratamiento, el cual comprende administrar a dicho paciente una cantidad efectiva de desloratadina.

La presente invención provee también un método para tratar estados de enfermedad mediados por IL-4 e IL-13 en un paciente que necesita de dicho tratamiento, el cual comprende administrar a dicho paciente una cantidad efectiva de desloratadina para inhibir la generación de IL-4 e IL-13. La cantidad efectiva de desloratadina es una cantidad suficiente para inhibir y de preferencia bloquear la generación de IL-4 e IL-13 de células humanas. La presente invención provee también un método para inhibir la generación de IL-4 e IL-13 de basófilos humanos en un paciente que exhibe los síntomas de una condición alérgica y/o inflamatoria de la piel, ojos, tracto intestinal y/o los conductos de las vías respiratorias superior e inferior, el cual comprende administrar a dicho paciente una cantidad de desloratadina efectiva para inhibir la generación de IL-4 e IL-13, y tratar concurrentemente los síntomas de dicha condición alérgica y/o inflamatoria.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras 1a y 1b ilustran el efecto de la desloratadina sobre la secreción de histamina, leucotrieno C ("LTC ") e IL-4 por basófilos humanos. La figura 2 ilustra gráficamente el efecto de la desloratadina sobre la liberación de histamina y la secreción de IL-4 en respuesta a la activación por ionomicina.

La figura 3 ilustra gráficamente el efecto de la desloratadina sobre la secreción de IL-13 por basófilos humanos activados por anti-lgE e ionomicina. La figura 4 ilustra gráficamente que la desloratadina inhibe la secreción de IL-13 de basófilos activados con IL-3 y PMA. Las figuras 5a, 5b, 5c y 5d ilustran gráficamente ia inhibición de la expresión de ARN mensajero de IL-4 en basófilos pretratados con desloratadina.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De conformidad con los métodos de la presente invención, se demostró la capacidad de la desloratadina para inhibir la generación de IL-4 e IL-13 de basófilos humanos, mientras se comparó concurrentemente su eficacia para prevenir la liberación del mediador de estas células usando varios estímulos. Se encontró que la desloratadina es remarcablemente (casi 6 a 7) veces más potente para reducir la secreción de IL-4 e IL-13 de basófilos humanos inducida por anti-lgE, de lo que fue para inhibir los mediadores, histamina y LTC4, liberados en los mismos sobrenadantes de cultivo. Las citocinas, IL-4 e IL-13, fueron igualmente inhibidas por la desloratadina después de la activación con ionomicina, a pesar de la falta de un efecto sobre la liberación de histamina inducida por ionomicina. La desloratadina mostró un menor efecto para inhibir la IL-13 secretada en respuesta a IL-3 y PMA, sugiriendo que la antihistamina dirige diferencialmente vías individuales de generación de citocina. Por último, no hubo evidencia de que la desloratadina fuera citotóxica, es decir, que mediara sus efectos inhibidores causando menor viabilidad celular. De conformidad con la presente invención, la acumulación de ARN mensajero de IL-4 fue también remarcablemente inhibida, tanto como 80%, después del pretratamiento con desloratadina, sugiriendo que la desloratadina dirige señales que regulan la transcripción del gen de citocina además de los que controlan la liberación del mediador. La frase "una condición alérgica y/o inflamatoria", significa las condiciones alérgicas e inflamatorias y los síntomas presentes sobre la piel, ojos, tracto intestinal y/o en los conductos de las vías respiratorias superior e inferior desde la nariz hasta los pulmones. Las condiciones alérgicas y/o inflamatorias típicas de la piel o los conductos de las vías respiratorias superior e inferior, incluyen rinitis alérgica estacional y perenne, rinitis no alérgica, asma que incluye asma alérgico y no alérgico, sinusitis, resfriados, dermatitis, especialmente dermatitis alérgica y atópica, y urticaria y dermografismo sintomático. Las condiciones alérgicas y/o inflamatorias típicas de los ojos incluyen, pero no están limitadas a, conjuntivitis alérgica. Las condiciones alérgicas y/o inflamatorias típicas del tracto intestinal incluyen, pero no están limitadas a, alergias a alimentos. El término "humano", como se usa en la presente, incluye un sujeto pediátrico masculino o femenino de menos de 12 años de edad hasta menos de 18 años de edad, un sujeto pediátrico masculino o femenino de más de 12 años de edad hasta menos de 18 años, y adultos masculinos y femeninos de 18 y más años de edad. El término "citocinas proinflamatorias", como se usa en la presente, significa las citocinas asociadas con reacciones alérgicas e inflamatorias de la piel, ojos, tracto intestinal y conductos de las vías respiratorias de humanos expuestos a alérgenos. Típicamente, las citocinas proinflamatorias adecuadas incluyen IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9 e IL-13. La cantidad de desloratadina efectiva para tratar o prevenir condiciones alérgicas e inflamatorias de la piel o conductos de las vías respiratorias, variará con la edad, sexo, peso corporal y severidad de la condición alérgica e inflamatoria del paciente. Típicamente, la cantidad de desloratadina efectiva para tratar o prevenir dichas condiciones alérgicas e inflamatorias en un adulto humano de más de 12 años, está en la escala de alrededor de 2.5 mg/día a aproximadamente 45 mg/día, de preferencia de alrededor de 2.5 mg/día a aproximadamente 20 mg/día, o de alrededor de 5.0 mg/día a aproximadamente 15 mg/día, o de alrededor de 5.0 mg/día a aproximadamente 10 mg/día, más preferiblemente de alrededor de 5.0 mg/día a aproximadamente 7.5 mg/día, y muy preferiblemente de alrededor de 5.0 mg/día en dosis individuales o divididas, por ejemplo, 2 x 2.5 mg/día, o en una sola dosis de 5.0 mg/día. La desloratadina es un antagonista de histamina no sedante y de acción duradera con actividad antagonista potente y selectiva del receptor H1 periférico. Se han llevado a cabo estudios de farmacología animal in vitro e in vivo para evaluar varios efectos farmacodinámicos de la desloratadina y la loratadina. En la evaluación de la actividad sobre el sistema nervioso central ("SNC") en ratones, la desloratadina estuvo relativamente libre de producir alteraciones en la función conductual, neurológica o autónoma. Se evaluó el potencial de la desloratadina para ocupar los receptores H1 del cerebro en conejillos de Indias después de la administración IP, y los resultados sugieren poco acceso a los receptores de histamina centrales para la desloratadina. Se han documentado la eficacia y seguridad clínicas de la desloratadina en más de 3,200 pacientes con rinitis alérgica estacional en pruebas clínicas aleatorizadas de cuádruple ciego. Los resultados de estos estudios clínicos demostraron la eficacia de la desloratadina en el tratamiento de pacientes adultos y adolescentes con rinitis estacional. Los puntos finales de eficacia en todos los estudios, fueron puntuación total de síntomas, puntuación total de síntomas nasales, puntuación total de síntomas no nasales y análisis de calidad de vida sana (HQOL) en pruebas de eficacia. La desloratadina (5 mg una vez al día) redujo significativamente la puntuación total de síntomas (la suma de puntuaciones individuales para rinorrea, estornudo, congestión/mala ventilación, comezón nasal, comezón/ardor de ojos, lagrimeo, rojez ocular y comezón de oídos/paladar). La desloratadlna (5 mg) fue significativamente (p<0.01) más efectiva que el placebo para reducir los síntomas nasales. Un punto final de eficacia importante analizado en los estudios de la desloratadina, es la puntuación total de síntomas AM NOW. Este parámetro mide el alivio total de síntomas en el paciente después de 24 horas antes de tomar la siguiente dosis diaria. Se mantuvieron reducciones estadísticamente significativas (p<0.05) para el intervalo de dosificación total de 24 horas sobre la escala de dosificación completa de 5 mg a 20 mg. No hubo diferencia significativa alguna en la eficacia de la desloratadlna (sobre la escala de dosificación completa de 5 mg a 20 mg) a través de subgrupos de pacientes definidos por género, edad o raza. La desloratadina es particularmente útil para el tratamiento y la prevención de los síntomas nasales (mala ventilación/congestión, rinorrea, comezón nasal, estornudo) y no nasales (comezón/ardor de ojos, lagrimeo/ojos llorosos, rojez de los ojos, comezón de los oídos/paladar) de rinitis alérgica estacional, incluyendo congestión nasal, en pacientes que necesitan de dicho tratamiento y/o prevención. La patente de E.U.A. No. 4,659,716, describe métodos para fabricar desloratadina, composiciones farmacéuticas que la contienen, y métodos de uso de la desloratadina y composiciones farmacéuticas que la contienen, para tratar reacciones alérgicas en mamíferos. La patente de E.U.A. No. 5,595,997, describe composiciones farmacéuticas que contienen desioratadina, y métodos de uso de la desloratadina para tratar y prevenir varios estados de enfermedad, por ejemplo, rinitis alérgica. La patente de E.U.A. No. 6,100,274 describe composiciones farmacéuticas estables que contienen desloratadina adecuadas para administración oral, para tratar reacciones alérgicas, por ejemplo, rinitis alérgica. Las composiciones farmacéuticas de desloratadina pueden ser adaptadas para cualquier modo de administración, por ejemplo, para administración oral, parenteral, por ejemplo, subcutánea ("SC"), intramuscular ("IM") e intraperitoneai ("IP), tópica o vaginal, o mediante inhalación (oralmente o intranasalmente). De preferencia, la desloratadina se administra oralmente. Dichas composiciones farmacéuticas se pueden formular combinando desloratadina o una cantidad equivalente de una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, con un vehículo o diluyente adecuado, inerte y farmacéuticamente aceptable que puede ser sólido o líquido. La desloratadina puede ser convertida en las sales acidas de adición farmacéuticamente aceptables, mezclándola con una cantidad equivalente de un ácido farmacéuticamente aceptable. Típicamente, los ácidos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen ios ácidos minerales, por ejemplo, HNO3, H2S?4, H3PO4, HCl, HBr, ácidos orgánicos que incluyen, pero no están limitados a, ácido acético, trifluoroacético, propiónico, láctico, maleico, succínico, tartárico, glucurónico y ácidos cítricos, así como también ácidos alquil o arilsulfónlcos tales como ácido p-toluensulfónico o ácido 2- naftalensulfónico, o ácido metansulfónico. Las sales farmacéuticamente aceptables preferidas son trifluoroacetato, tosilato, mesilato y cloruro. La desloratadina es más estable como la base libre que como una sal acida de adición, y se prefiere más el uso de la base libre de desloratadina en las composiciones farmacéuticas de la presente invención (véase la patente de E.U.A. No. 6,100,274). Las preparaciones en forma sólida incluyen polvos, tabletas, granulos dispersables, cápsulas, cachets y supositorios. Los polvos y tabletas pueden estar formados de alrededor de 2.5 a aproximadamente 95 por ciento de ingrediente activo, de preferencia de alrededor de 2.5 a aproximadamente 20 por ciento, más preferiblemente de alrededor de 2.5 a aproximadamente 10 por ciento, o de alrededor de 2.5 a aproximadamente 5 por ciento, y muy preferiblemente 5 por ciento del ingrediente activo. Se conocen en la técnica vehículos sólidos adecuados, por ejemplo, carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar o lactosa. Se pueden usar tabletas, polvos, cachets y cápsulas como formas de dosificación sólidas adecuadas para administración oral. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables, y métodos de fabricación para varias composiciones, se pueden encontrar en A. Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, décimo octava edición, (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania. Las preparaciones en forma líquida incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones. Como ejemplo se puede mencionar agua o soluciones de agua-propilenglicol para inyección parenteral. Las preparaciones en forma sólida pueden ser convertidas en preparaciones líquidas poco antes de su uso para administración oral. Las formas parenterales para ser inyectadas intravenosamente, intramuscularmente o subcutáneamente, están usualmente en forma de soluciones estériles, y pueden contener agentes de tonicidad (sales o glucosa) y reguladores de pH. Se pueden incluir opacificadores en soluciones orales, suspensiones y emulsiones. Las preparaciones en forma líquida pueden incluir también soluciones para administración intranasal. Las preparaciones en forma líquida pueden comprender las mismas escalas de ingredientes activos que se usan en las preparaciones en forma sólida. Las preparaciones en aerosol adecuadas para inhalación pueden incluir soluciones y sólidos en forma de polvo, las cuales pueden estar en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un gas comprimido inerte, por ejemplo, nitrógeno. Incluidas también son las preparaciones en forma sólida que están destinadas a ser convertidas, poco antes de su uso, en preparaciones en forma líquida para administración oral o parenteral. Dichas formas líquidas incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones. Los compuestos de la invención pueden ser también liberables transdérmicamente. Las composiciones transdérmicas pueden tomar la forma de cremas, lociones, aerosoles y/o emulsiones, y se pueden incluir en un parche transdérmico de la matriz o tipo de depósito como son convencionales en la técnica para este propósito. De preferencia, la preparación farmacéutica está en una forma de dosificación unitaria. En dicha forma, la preparación es subdivida en dosis unitarias adecuadamente dimensionadas que contienen cantidades apropiadas del componente activo, por ejemplo, una cantidad efectiva para lograr el propósito deseado. Además, la desloratadina se puede administrar en asociación con cantidades terapéuticamente efectivas de esteroides, por ejemplo, furoato de mometasona, dipropionato de beclometasona o propionato de fluticasona, inhibidores de leucotrieno, por ejemplo montelukast sódico o zafirlukast, y/o un descongestionante de los conductos de las vías respiratorias superiores que incluye, pero no está limitado a, fenilefedrina, pseudoefedrina y fenilpropanolamina, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, de acuerdo con los niveles de dosificación conocidos por los expertos en la técnica, y como se describe en Physician's Desk Reference. Se prefiere el uso del descongestionante de los conductos de las vías respiratorias superiores, clorhidrato de pseudoefedrina.

EJEMPLOS Materiales v métodos Reactivos especiales Todos estos reactivos fueron adquiridos, a menos que se indique otra cosa: ácido piperazin-N,N'-bis-2-etansulfónico (PIPES), ionomicina, FMLP, PMA y suero de bovino fetal (FBS) de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO); RPMI-1640 y medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) con L- glutamina y conteniendo ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N'-2-etansufónico (HEPES) a 25 mM, gentamicina, aminoácidos no esenciales (100 x) de Life Technologies, Inc., Grand Island, NY; y Percoll de Pharmacia (Piscataway, NJ). La desloratadina usada en estos experimentos fue provista por The Schering-Plough Research Institute. Se obtuvo una solución de abastecimiento a 0.1 M en DMSO, se distribuyó en alícuotas y se congeló a -20°C. Todos los reguladores de pH que contenían PIPES se obtuvieron de material de abastecimiento 10X PIPES (PIPES a 250 mM, NaCI a 1.20 M y KCl a 50 mM, pH 7.3), y se almacenaron a 4°C. Se obtuvo Percoll isotónico (referido como Percoll a 100%) mezclando 9 partes de Percoll con una parte de 10X PIPES. PAG contenía un décimo de 10X PIPES, HAS a 0.003% y D-glucosa a 0.1%. PAG-EDTA contenía adicionalmente EDTA a 4 mM. Todas las soluciones de Percoll usadas para el aislamiento de células, se obtuvieron mezclando las cantidades apropiadas de Percoll a 100% con IX PIPES.

Preparación y cultivo de células Se prepararon suspensiones mixtas de leucocitos conteniendo basófilos usando centrifugación de doble densidad-Percoll, según se describe (Schroeder, et al., J. Immunol.. 1994, Vol. 153: 1808, o mediante una combinación de elutriación de contracorriente y protocolos de centrifugación de densidad Percoll (MacGlashan, et al., J. ImmunoL 1994, Vol. 153: 3006- 3016). Los porcentajes de basófilos obtenidos usando estos protocolos, variaron típicamente entre 5-50% y 10-30%, respectivamente, y se determinaron mediante el conteo de células positivas o negativas teñidas con azul alciano en una cámara de Spiers-Levy (Gilbert y Omstein, 1975). Para algunos experimentos, los basófilos fueron purificados adicionalmente a más de 99.9% usando un protocolo de selección negativa (Miltenyi Corp., Aubum, CA). Para todos los experimentos aparte de donde se evaluaba la expresión de ARN mensajero de IL-4, las células fueron cultivadas en placas de microtítulo de fondo plano de 96 cavidades (por duplicado) usando IMDM complementado con FBS a 5% inactivado con calor (56°C durante 30 minutos), 1 x aminoácidos no esenciales y 5 µg/ml de gentamicina (C-IMDM). Para el análisis de la expresión de ARN mensajero de IL-4, las células en C-IMDM fueron cultivadas en tubos de microcentrífuga de 1.5 ml sometidos a autoclave (libres de ribonucleasa) (véase más adelante), puesto que esto permitió una forma más precisa de aislar cuantitativamente el ARN mensajero sin la necesidad de transferir las células de las cavidades de cultivo antes de la extracción. Para cada condición, las suspensiones de leucocitos que contenían aproximadamente 100,000-500,000 basófilos en 100 µl de C-IMDM, fueron precalentadas a 37°C antes de añadir 100 µl de concentraciones de desloratadina en C-IMDM precalentadas también a 37°C. Después de 15 minutos de preincubación, las células fueron activadas entonces añadiendo 50 µl de 5 x (5 veces la concentración final) de estímulo. Es importante notar aquí que las concentraciones de los estímulos usados fueron óptimas para la generación de IL-4, más que la liberación del mediador. Esto es particularmente aplicable para el anticuerpo anti-lgE, el cual se ha mostrado induce IL-4 a concentraciones 10 veces menores que las que causan liberación óptima de histamina (Schroeder, et al., ibid). Para la cosecha, los cultivos fueron centrifugados y los sobrenadantes libres de células colectados para liberación del mediador y análisis de citocina, según se describe (Schroeder, et al., ibid). Se midieron la histamina, LTC4 e IL-4 en alícuotas de sobrenadante de cultivo tomadas a 4 horas. Para la histamina, esto significa tomar 20-50 µl de sobrenadante, y diluirlos en 1 ml de regulador de pH PAG conteniendo HCIO4 a 1.6%. Después de precipitación a 4°C durante la noche, las muestras fueron puestas a prueba mediante fluorimetría automatizada (Siraganian, R. P., Anal Biochem.. 1974, Vol. 57: 383-394). Se midió LTC4 mediante un RÍA doméstico (MacGlashan, et al., J. Immunol. 1986, Vol. 136:2231-2239). La proteína IL-4 fue medida mediante una ELISA comercial (Biosource International). Los sobrenadantes de cultivo fueron cosechados después de 20 horas de incubación para todos los experimentos en donde se investigaban los efectos de la desloratadina sobre la secreción de IL-13. En algunos casos, se midió también IL-4 en este punto de tiempo, particularmente cuando se usó ionomicina, puesto que la cinética para la secreción de esta citocina se extendió más allá de 4 horas con este estímulo (Schroeder, et al., J. Leuk. Biol.. 1998, Vol. 63:692-698). Se hicieron también mediciones de la proteína IL-13 usando una ELISA comercial (Immunotech).

Aislamiento de ARN v análisis semicuantitativo de la expresión de ARN mensajero de IL-4 Se realizaron cultivos para el análisis de ARN mensajero de IL-4 en tubos de microcentrífuga de polipropileno de 1.5 ml, como se describió anteriormente. Las células fueron pretratadas con desloratadina (10 µM) durante 15 minutos antes de activación con anticuerpo anti-lgE (10-20 ng/ml). Se aisló el ARN total usando el protocolo RNAzoi (Tel-test Inc., Friendswood, TX) después de 2 horas de incubación, que es el tiempo en que la expresión del mensaje de IL-4 alcanza su máximo usando activación dependiente de IgE (Schroeder, et al., J. ImmunoL 1997, Vol. 158:5448-5454). Después de precipitación de isopropanol, el ARN fue lavado con etanol a 70% y secado bajo vacío. Después, el ARN fue resuspendido en 25 µl de agua tratada con pirocarbonato de dietilo (DEPC) y almacenado a -80°C. Se llevaron a cabo transcripción inversa (RT) y reacción en cadena de polimerasa (PCR) con diluciones seriales de ARN como se detalló anteriormente (MacGlashan, et al., J. Immunol. 1994; Vol. 152:3006-3016; Schroeder, et al., J. Immunol.. 1997, Vol. 158:5448-5454) usando el equipo de PCR para ARN GeneAmp (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT). Los productos de PCR fueron visualizados en geles de agarosa a 3% usando tinción con bromuro de etidio. Como se indicó en otra parte, se observaron dos bandas distintas para IL-4. Se observó una banda dominante con un tamaño de aproximadamente 460 pares de bases. La fuente de la banda más pequeña y más débil es incierta, pero se piensa que es una forma alternativamente empalmada de I L-4 (Atamas, et al., ¡ Immunol, 1996, Vol. 156:435-441). Las dos bandas se observan habitualmente usando suspensiones de basófilos puras o enriquecidas. Las figuras 1a y 1b ilustran gráficamente el efecto de la desloratadina sobre la secreción de histamina, LTC4 e IL-4 por basófilos humanos. Para la figura 1a, se prepararon suspensiones mixtas de leucocitos conteniendo basófilos de 3 a 55% de sangre entera usando centrifugación de densidad de Percoll. Las células fueron pretratadas 15 minutos con las concentraciones indicadas de desloratadina antes de activación con anticuerpo anti-lgE (10-20 ng/ml). Los tres productos fueron medidos usando los mismos sobrenadantes de cultivo cosechados después de 4 horas de incubación. Los valores son la media±EEM (n=5). Liberación control para cada producto: hlstamina: 40±6% del total, IL-4: 403±207 pg/106 de basófilos y LTC4: 860±127 pg/106 basófilos. La figura 1b muestra el efecto de la desloratadina sobre la secreción de histamina, LTC4 e IL-4 de basófilos humanos, con 99% de pureza. La liberación control para histamina, LTC4 e IL-4, fueron 60% del total, 903 pg/106 basófilos y 854 pg/106 basófilos, respectivamente. La figura 2 ilustra el efecto de la desloratadina sobre la liberación de histamina (HR) y secreción de IL-4 en respuesta a la ionomicina. Suspensiones de basófilos de 42, 99 y 98% de pureza, fueron pretratadas 15 minutos con desloratadina a 0.1 , 1.0 y 10 µM. Las células fueron activadas entonces con ionomicina (500 ng/ml) durante 4 horas. Los sobrenadantes de cultivo fueron cosechados y puestos a prueba para histamina y proteína I L-4.

Los valores representan la media+EEM, n=3. Los niveles control de IL-4 fueron 3398, 253 y 348 pg/106 basófilos. El por ciento de liberación de histamina en los mismos cultivos, fue de 91 , 25 y 10%, respectivamente. La figura 3 ilustra el efecto de la desloratadina sobre la secreción de IL-13 por basófilos humanos activados por anti-lgE o ionomicina. Suspensiones de basófilos que varían en pureza entre 6-99%, fueron pretratados durante 15 minutos con las concentraciones indicadas de desloratadina. Las células fueron activadas con anti-lgE (10-20 ng/ml) o ionomicina (500 ng/ml). Los sobrenadantes de cultivo fueron cosechados después de 18 horas de incubación, y puestos a prueba para proteína IL-13 mediante ELISA. Los valores con barras de error representan la media+EEM, n=3. La proteína IL-13 en cultivos control promedió 169+35 y 334±144 pg/106 basófilos para antl-lgE e ionomicina, respectivamente. Los valores indicados por los círculos claros son la media para los dos experimentos (los niveles control de IL-13 fueron 260 y 230 pg/106 basófilos). • La figura 4 ilustra gráficamente que la desloratadina inhibe la secreción de 1L-13 de basófilos activados con IL-3 y PMA. Se prepararon basófilos (hasta 94% de pureza) de sangre entera usando centrifugación de doble densidad Percoll, y protocolos de selección negativa. Las células fueron pretratadas con las concentraciones indicadas de desloratadina antes de la adición de IL-3 (100 ng/ml) o PMA (2 ng/ml). Los sobrenadantes de cultivo fueron cosechados después de 18 horas de incubación, y puestos a prueba para proteína IL-13 mediante ELISA. Los valores representan la media±EEM, n=3-4. La cantidad de secreción de IL-13 en ausencia de desloratadina, promedió 570±142 pg/106 basófilos para activación de IL-3, y 216±120 pg/106 basófilos para inducción de PMA. Las figuras 5a-d ¡lustran gráficamente la inhibición de la expresión de ARN mensajero de IL-4 en basófilos pretratados con desloratadina. Las células fueron incubadas durante 15 minutos con desloratadina (10 µM) o DMSO (1 :10,000) antes de recibir anti-lgE (10 ng/ml) o medio solo. El ARN total fue aislado después de 2 horas, y usado para análisis de RT-PCR dilucional para comparar la expresión del mensaje para IL-4 y el gen doméstico, hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT) (panel a). Se muestra el análisis densitométrico para la expresión de ARN no diluido (panel b). La secreción de histamina e I L-4 en los sobrenadantes después de dos horas, se muestra para comparación (paneles c y d, respectivamente). Los valores representan la media±EEM, n=3.

Discusión En la primera serie de experimentos (véase las figuras 1 a y 1 b), se demostró la capacidad de la desloratadina para bloquear la secreción de IL-4 de basófilos, desencadenada por anti-lgE, y se comparó esta Inhibición con la observada para la liberación de histamina y LTC en los mismos sobrenadantes de cultivo de 4 horas. Como se muestra en la figura 1a, las dosis de desloratadina inhibieron dependientemente de la dosis la liberación de histamina y LTC4 a concentraciones entre 1 µM (10"6 M) y 10 µM (10"5 M).

Para comparación, la desloratadina fue remarcablemente más potente contra la secreción de IL-4 que para la liberación del mediador preformado. Las células pretratadas con desloratadina a 1 µM a 10 µM, secretaron 40% a 80% menos IL-4 que las células no expuestas al fármaco. Fue necesaria una concentración casi siete veces mayor de desloratadina para causar una inhibición comparable en la liberación de histamlna y LTC4 por estas células. La inhibición de IL-4, a diferencia de la observada para la histamina, pareció alcanzar una meseta en la escala micromolar de desloratadina, y entonces se alcanzaron valores progresivamente mayores a concentraciones de desloratadina entre 1 µM y 10 µM. Como se muestra en la figura 1b, este efecto fue también evidente usando basófilos purificados a más de 99%, indicando que la desloratadina estuvo afectando directamente a los basófilos para la inhibición de I L-4. La desloratadina inhibió también la histamina de basófilos puros, en gran parte como lo hizo para suspensiones impuras. Se puso a prueba si la desloratadina afectó la liberación de IL-4, histamina y LTC4 de basófilos activados por otros estímulos. La figura 2 muestra que la secreción de histamina inducida por el ionóforo de calcio, ionomicina, no fue afectada por la desloratadina a concentraciones de 0.1, 1.0 y 10 µM. Sin embargo, los altos niveles de IL-4 que fueron secretados en respuesta a la estimulación por ionomicina, fueron remarcablemente inhibidos por las mismas concentraciones de desloratadina (es decir, 0.1, 1.0 y 10 µM). La histamina y LCT4 obtenidas en respuesta a la estimulación por FMLP, tampoco fue inhibida por la desloratadina (datos no mostrados).

Redrup, et al., J. ImmunoL 1998, Vol. 160:1957-1964, reportaron que (1) estímulos múltiples inducen vías farmacológicamente distintas para la generación de IL-13 en basófilos humanos, y que (2) anti-lgE e ionomicina indujeron la secreción de IL-13 que fue sensible al fármaco ¡nmunosupresor, FK-506, sugiriendo que estos estímulos usan una vía dependiente de calcineurina para generar esta citocina. En el estudio de Redrup, et al., la IL-13 obtenida en respuesta a la activación de lL-3 o PMA, no fue afectada por FK-506, y sólo la proteína generada en respuesta al éster de forbol, fue inhibida por inhibidores de PKC. Por lo tanto, se subrayó si la IL-13 inducida por estos estímulos es también afectada diferencialmente con el pretratamiento con desloratadina. La figura 3 muestra que se generó IL-13 en respuesta a anti-lgE o ionomicina. De hecho, hubo una similitud notable en la forma de la curva de respuesta a la concentración de desloratadina para la inhibición de IL-13 inducida por cualquier estímulo. Estas curvas en la figura 3 fueron casi Idénticas a las observadas para la inhibición de IL-4 por desloratadina, como se muestra en las figuras 1 y 2. En particular, se observó una meseta inicial a 1 µM al nivel de inhibición de 50-70%. La inhibición de IL-13 dependiente de la dosis continuó a medida que las concentraciones de desloratadina aumentaron hasta 10 µM. Lo que es interesante observar, la respuesta al pretratamiento con desloratadina fue considerablemente diferente en dos experimentos usando suspensiones impuras (6-11 %) de basófilos. Con estas preparaciones de células, la desloratadina fue considerablemente menos efectiva para prevenir que la IL-13 fuera secretada en respuesta a anti- IgE, requiriendo concentraciones casi 10 veces mayores para producir la misma IC50 observada usando suspensiones más puras de basófilos. La figura 4 muestra que la desloratadina inhibió también la 1L-13 obtenida en respuesta a 1L-3 o PMA, aunque a un menor grado y con curvas de inhibición que parecieron más lineales - logarítmicas. De hecho, el fármaco Inhibió la producción de IL-13 mediada por IL-3 con una IC50 de aproximadamente 2 µM, que fue casi 5 veces la necesaria para Inhibir la IL-13 secretada con la activación de anti-lgE o ¡onomicina. La desloratadina inhibió la IL-13 inducida por PMA en forma similar, con inhibición observada a concentraciones de fármaco entre 1 µM y 10 µM. A diferencia de la histamina y LTC4, las cuales son liberadas de los basófilos dentro de minutos después de la activación, la proteína IL-4 se detecta primero después de 1 a 2 horas, e IL-13 aproximadamente 48 horas después de la activación. Por lo tanto, parecía posible que la cinética de la liberación del mediador contra la producción de citocina, podría explicar las diferencias en su sensibilidad a la desloratadina, particularmente si la lisis celular era un factor. Sin embargo, no hubo evidencia de que la desloratadlna a 10 µM, incluso cuando se combinó con estímulos durante 18 horas, fuera citotóxica, es decir, causara muerte celular evaluada mediante exclusión de azul trípano en cultivos puros de basófilos (datos no mostrados). Las células no se tiñeron con azul trípano cuando se cultivaron con desloratadina sola a 100 µM. Además, se detectó histamina en estos cultivos, indicando que esta concentración de desloratadina causó lisis celular.

Por último, para investigar la posibilidad de que la desloratadina inhibe la secreción de citocina de basófilos afectando la acumulación de ARN mensajero, se examinó el efecto del pretratamiento de desloratadina (10 µm) sobre la expresión del mensaje de IL-4. Para estos experimentos, se usó un protocolo de RT-PCR dilucional para proveer un análisis semicuantitativo. El panel a de la figura 5 muestra claramente que la expresión del ARN mensajero de IL-4 fue inducida en células activadas con anti-lgE (campos 8-10) respecto a células que no reciben estímulo (campos 2-4). El pretratamiento con desloratadlna dio como resultado una disminución sustancial del mensaje de citocina inducido (campos 11-13), mientras que no tuvo efecto alguno sobre la expresión del gen doméstico, HPRT. El panel b de la figura 5 muestra el análisis densitométrico promedio de tres experimentos, indicando que el pretratamiento con desloratadina causó una reducción de aproximadamente 80% en el mensaje de I L-4 acumulado con la activación de antl-IgE. Para comparación, la desloratadina (10 µM) inhibió también la histamina y la proteína IL-4 secretadas en los sobrenadantes de estos cultivos, como se muestra en los paneles c y d, respectivamente, de la figura 5. Los hallazgos de los autores apoyan el concepto de que los mecanismos que sustentan la eficacia de los antagonistas H1 en el tratamiento de rinitis alérgica, se extienden más allá de su capacidad para evitar que la histamina se una a su receptor H1 , mostrando que la desloratadina posee actividad inhibidora contra la generación de IL-4 e IL-13 de basófilos humanos. Otros autores han mostrado que la desloratadina previene la generación de LTC4 y la liberación de histamina mediada por IgE por basófilos humanos, y los resultados de los presentes inventores confirman estos hallazgos (véase Kleine-Tebbe, et al., 1994; y Genovese, et al., Clin. Exp. Allerav. 1996, Vol. 27:559-567). Sin embargo, de conformidad con esta invención, se ha mostrado que la desloratadina es remarcablemente (6 a 7 veces) más efectiva para inhibir la IL-4 e IL-13 inducidas por anti-lgE, de lo que es para bloquear la liberación de histamina y LTC4 en estos cultivos. Lo que es interesante observar, de conformidad con esta invención, la desloratadina inhibió a IL-4 e IL-13 con una curva de respuesta a la dosis que alcanzó una meseta a concentraciones de 1 y 10 µM (véase la figura 1 b). Este efecto no se observó para ia liberación del mediador, y ocurrió sólo para las citocinas (IL-4 e IL-13) producidas en respuesta a anti-lgE o ¡onomicina. Aunque actualmente se desconoce la naturaleza de esta inhibición, se predice que la desloratadina dirige por lo menos dos señales junto con la vía común desencadenada por ambos estímulos. De esta manera, a concentraciones de desloratadina menores de 1 µM, la inhibición puede resultar de la interrupción de una señal que sólo interviene en la generación de citocina, mientras que a concentraciones mayores de 1 µM, una segunda señal puede ser afectada también, causando inhibición de la liberación del mediador preformado para la mayoría de los estímulos. Se encontró que la desloratadina es menos efectiva para prevenir la liberación dei mediador inducida por estímulos independientes de IgE, tales como ionomicina, FMLP y éster de forbol. De hecho, no se encontró evidencia alguna de que la histamina y/o LTC4 liberadas con estos estímulos fueran inhibidas por algunas de las concentraciones de desloratadina puestas a prueba (datos no mostrados). En contraste, la desloratadina fue bastante eficaz para bloquear la producción de IL-4 inducida por ionomicina, y la IL-13 generada en respuesta a ionomicina, PMA o IL-3. Como se indicó anteriormente, la desloratadlna inhibió igualmente la IL-4 e IL-13 inducidas por ionomicina o anti-lgE, con curvas de inhibición que alcanzaron una meseta a concentraciones de fármaco de 1 y 10 µM. Sin embargo, no se observó el mismo patrón y potencia de inhibición para la inhibición de IL-13 inducida por IL-3 o PMA. Con respecto a la producción de citocina, anti-lgE e ionóforo indujeron a IL-4 e IL-13 que son inhibidas por el fármaco inmunosupresor, FK506, sugiriendo que estos estímulos usan una vía de calcineurina dependiente de calcio para la generación de estas citocinas. Sin embargo, la desloratadina no bloquea la IL-13 obtenida en respuesta a IL-3 o PMA, las cuales se piensa activan vías separadas. De esta manera, la desloratadina puede inhibir la liberación del mediador y la secreción de citocina dependiente de IgE, previniendo simplemente cambios en el calcio citosólico. Sin embargo, este efecto no explica totalmente por qué la desloratadina inhibió la citocina inducida por ionomicina, mientras que no tiene efecto alguno sobre la liberación del mediador. Puesto que el entrelazamiento de IgE y los ionóforos de Ca2+ parece activar a la calcineurina en basófilos, es posible que la desloratadina dirija un factor dentro de la vía iniciada por esta fosfatasa.

Mediante el uso de suspensiones puras de basófilos, los autores pudieron concluir por vez primera que la desloratadina media su efecto inhibidor sobre la liberación del mediador de basófilos y producción de citocina directamente. No se pudo obtener evidencia, según se evaluó mediante exclusión de azul trípano, de que las IL-4 e IL-13 disminuidas secretadas estuvieron acompañadas de muerte celular incrementada durante las incubaciones durante 4 a 20 horas. Esto fue aplicable incluso con desloratadina a 10 µM, la cual causó inhibición casi completa (>95%) de la secreción de citocina. Se observó lisis celular a una concentración de 100 µM. De conformidad con los métodos de la presente invención, se demostró que la desloratadina inhibe la acumulación de ARN mensajero de IL-4, apoyando el concepto de que la desloratadina puede regular negativamente factores importantes para la transcripción del gen de citocina. Lo que es interesante observar, el pretratamiento con desloratadina produjo una inhibición de casi 80% del incremento de ARN mensajero de IL-4 mediada por IgE. Sin embargo, la secreción de proteína para esta citocina (IL-4) en los mismos cultivos, estuvo abajo de la detección, y fue de esta forma inhibida en más de 95%. Una vez de nuevo, esto puede implicar que la desloratadina dirige vías múltiples en la generación de citocinas, afectando más que sólo señales importantes para la transcripción de genes. De hecho, continúa siendo posible que la transcripción no sea afectada, pero que el ARN mensajero de lL-4 e IL-13 se vuelve inestable de alguna forma, y que esto explica la acción inhibidora de la desloratadina. Si es así, la inestabilidad debe ser específica para el ARN mensajero de citocina, puesto que los resultados obtenidos demostraron que la expresión del gen doméstico (HPRT) no es afectada por la desloratadina. Se espera que los efectos inhibidores de la desloratadlna sobre la generación de citocina y la liberación del mediador observadas en estos estudios in vitro, se traduzcan en la eficacia clínica de la desloratadina contra condiciones alérgicas e inflamatorias de la piel, por ejemplo, dermatitis atópica y urticaria, y en los ojos, por ejemplo, conjuntivitis alérgica, y en el tracto intestinal, por ejemplo, alergias a alimentos, y en los conductos de las vías respiratorias superior e inferior, por ejemplo, rinitis alérgica, especialmente rinitis alérgica estacional. Dado el hecho de que IL-4 e IL-13 ayudan a regular la síntesis de IgE, activan el endotelio por la transmigración de eosinófilos mediada por VCAM-1 , y que IL-4 promueve el desarrollo del fenotipo 2 de células auxiliares T, se espera que la desloratadina medie la actividad antialérgica, no sólo inhibiendo la liberación del mediador, sino también bloqueando la generación de las cltocinas proinflamatorias IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9 e IL-3.

Estudios clínicos Los siguientes estudios clínicos están diseñados para mostrar que la desloratadina provee efectos inflamatorios antihistamínicos y antialérgicos combinados para controlar síntomas clínicos y reacciones alérgicas de fase temprana y tardía en sujetos humanos expuestos a alérgenos, o que exhiben los signos y síntomas de enfermedades alérgicas y/o inflamatorias de la piel, ojos, tracto Intestinal y conductos de las vías respiratorias.

Estudio No. 1 Objetivo Demostrar que la provocación alérgena nasal de sujetos humanos atópicos, induce efectos sistémicos alérgicos/inmunológicos tales como producción incrementada de citocinas por basófilos y linfocitos, y que esto se manifestará in vitro (liberación incrementada de citocina) e in vivo (incremento en la reacción de fase tardía en la reacción de la piel inducida por alérgenos).

Diseño de estudio Este será un estudio piloto no terapéutico de clasificación abierta, que incluye 6 a 10 sujetos atópicos asintomáticos con historias documentadas de rinitis alérgica estacional (y posiblemente asma alérgico), quienes serán desafiados nasalmente con alérgeno en tres días consecutivos. Se tomarán muestras de sangre tres días antes del inicio de los desafíos nasales, diariamente antes de cada desafío, y una semana después del primer desafío. Se aislarán basófilos y linfocitos usando técnicas estándar de gradiente de Percoll, y sus moléculas de ARN serán extraídas y puestas a prueba usando una prueba de PCR de tiempo real con iniciadores para IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9 IL-13, IL-5 y RANTES. El ARN mensajero para estos productos celulares, será cuantificado mediante comparación con el producto de PCR de un gen de mantenimiento (GAPDH). Se usarán la diferencial de leucocitos y los conteos totales de eosinófilos y basófilos, para evaluar el efecto potencial de cambios en el número de células sobre cambios en el ARN mensajero de citocinas/quimiocinas inducidos por alérgenos. Se harán pruebas de reacción de ronchas de la piel inducida por alérgenos y titulada con dosis al momento de ia extracción inicial anterior de sangre (es decir, 3 días antes del primer desafío con alérgeno nasal), y una semana después del último desafío con alérgeno nasal. Se hará el monitoreo de las puntuaciones de severidad de los síntomas nasales durante cada día de provocación con alérgeno nasal. Se espera que la inducción de la transcripción de citocina se correlacione con el empeoramiento de la sintomatología nasal.

Punto final primario Con base en datos in vitro, el resultado primario esperado debe ser incrementos inducidos por alérgeno en células inflamatorias, y sobrerregulación de la transcripción de IL-4 e IL-13 en el tejido de biopsia de la piel.

Puntos finales secundarios Cambios a partir de la línea basal en leucocitos periféricos, incluyendo eosinófilos, basófilos y linfocitos. Cambios a partir de la línea basal en la producción de citocina por leucocitos. Cambios a partir de la línea basal en el tamaño de la reacción de fase tardía de ronchas de la piel inducidas por alérgeno. Correlación de los cambios anteriores con la sintomatología clínica.

Estudio No. 2 Objetivo Identificación de los efectos bioquímicos y clínicos de las propiedades antialérgicas y antiinflamatorias de la desloratadina. Un estudio de los efectos de la desloratadina sobre la inducción de citocinas de leucocitos de sangre periférica mediante provocación con alérgeno nasal en sujetos humanos atópicos: un estudio clínico preliminar para demostrar que la desloratadina provee efectos antihistamínicos y antialérgicos combinados para controlar la reacción alérgica de fase temprana y tardía y síntomas clínicos en sujetos humanos expuestos a provocación con alérgeno nasal. El número de sujetos para el estudio No. 2 se determinará con base en los hallazgos en el estudio piloto clínico e in vitro.

Hipótesis Existe evidencia de que la provocación de individuos atópicos con alérgeno nasal induce efectos sistémicos, por ejemplo, el conteo de eosinófilos de sangre periférica se incrementa entre 6 a 24 horas siguiendo este procedimiento, y que incrementos consistentes en la respuesta de vías respiratorias inferiores en pacientes con rinitis alérgica y asma, han seguido provocación con alérgeno nasal. Es posible que los efectos sistémicos de la rinitis alérgica sean mediados a través de la proliferación incrementada de leucocitos periféricos y la producción incrementada de cltocinas por estas células. La razón fundamental que sustenta estas hipótesis, es que estos fenómenos dependen del estado de activación en células inmunes, incluyendo basófilos y linfocitos.- Diseño de estudio La eficacia clínica incluirá el mismo diseño de desafío con alérgeno nasal y colectas de muestras de sangre y prueba de ronchas de la piel inducidas por alérgenos como en el estudio No. 1 (véase más adelante). Sin embargo, el estudio No. 2 será un diseño cruzado de doble ciego y controlado por placebo durante el cual la desloratadina (5 mg una vez al día) y el placebo se tomarán diariamente durante 5 a 7 días antes de la primera toma de sangre y a lo largo del resto del período de prueba: la prueba repetida de ronchas de la piel inducidas por alérgeno ocurrirá una semana después del último desafío con alérgeno nasal. El número de sujetos para este estudio se determinará mediante análisis de energía dependiente de los resultados del estudio preliminar. Se intercalará un período de descanso de dos semanas entre los dos períodos de tratamiento.

Diagrama de flujo (días de estudio) -3 (línea basal) 0 1 sangre extraída • desafío desafío con • desafío con • prueba de con alérgeno alérgeno alérgeno ronchas de la nasal** nasal** nasal** piel • prueba de ronchas • sangre • sangre • sangre de la piel extraída* extraída* extraída* •dosificación dosificación •dosificación-» dosificación para diferencial de leucocitos y conteo total de eosinófilos y basófilos • para aislamiento de basófiios y linfocitos y extracción de su ARN para prueba de PCR (I L-4, IL-3, IL-13, IL-5, IL-6 y RANTES) ** síntomas clínicos y puntuación de severidad Puntos finales de eficacia clínica Se harán comparaciones de resultados entre grupos de tratamiento y dentro de los grupos de tratamiento para: Cambios a partir de la línea basal en leucocitos periféricos, incluyendo eosinófilos, basófilos y linfocitos. Cambios a partir de la línea basal en la producción de citocina.

Cambios a partir de la línea basal en el tamaño de la reacción de fase tardía de ronchas de la piel inducidas por alérgeno. Correlación de los cambios anteriores con la sintomatología clínica. Se espera que la desloratadina provea efectos inflamatorios antihistamínicos y antialérgicos en el control de reacciones alérgicas de fase temprana y tardía y síntomas clínicos en humanos.

Claims (9)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de desloratadina en la preparación de un medicamento para la inhibición de la generación de citocinas proinflamatorias en un paciente, el cual comprende una cantidad efectiva de desloratadina.

2.- El uso de desloratadlna en la preparación de un medicamento para la inhibición de la secreción de citocinas proinflamatorias de basófilos humanos, el cual comprende una cantidad efectiva de desloratadina.

3.- El uso de desloratadina en la preparación de un medicamento para la inhibición de la generación de IL-4 e IL-13, el cual comprende una cantidad efectiva de desloratadina.

4.- El uso de desloratadina en la preparación de un medicamento para la inhibición de la generación de IL-4 e IL-13 de basófilos humanos, y para el tratamiento concurrente de los síntomas de una condición alérgica y/o inflamatoria de la piel, ojos, tracto intestinal y/o los conductos de las vías respiratorias superior e inferior, el cual comprende una cantidad de desloratadina efectiva para inhibir la generación de lL-4 e IL-13, y para el tratamiento concurrente de dichos síntomas.

5.- El uso como se reclama en las reivindicaciones 1 a 2 anteriores, en donde las citocinas proinflamatorias son IL-4 e IL-13.

6.- El uso de desloratadina en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un estado de enfermedad asociado con la generación de IL-4 e IL-13 de basófilos humanos que tiene un componente alérgico y un componente inflamatorio, el cual comprende una cantidad de desloratadina efectiva para producir un efecto antiinflamatorio.

7.- El uso como se reclama en la reivindicación 6, en donde el estado de enfermedad es una condición alérgica y/o inflamatoria de la piel, ojos, tracto intestinal y/o los conductos de las vías respiratorias superior e inferior.

8.- El uso como se reclama en la reivindicación 6, en donde el estado de enfermedad es rinitis alérgica estacional o perenne, rinitis no alérgica, asma alérgico y no alérgico, sinusitis, resfriados, dermatitis alérgica o atópica y urticaria, conjuntivitis alérgica, alergias intestinales a alimentos o dermografismo sintomático.

9.- El uso como se reclama en la reivindicación 6, en donde el estado de enfermedad es rinitis alérgica estacional o perenne, asma alérgico, dermatitis atópica, conjuntivitis alérgica, alergias intestinales a alimentos o urticaria.