MXPA02008874A - Microcapsulas que comprenden cianoacrilatos de polialquilo funcionalizados. - Google Patents
Microcapsulas que comprenden cianoacrilatos de polialquilo funcionalizados.Info
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Abstract
La invencion se relaciona con microcapsulas rellenadas con gas que consisten de cianoacrilatos de polialquilo funcionalizados que se producen por copolimerizacion de uno o mas cianoacrilatos de alquilo con un monomero funcional o hidrolisis parcial de la cadena lateral de un cianoacrilato de polialquilo, asi como con un procedimiento para la elaboracion de microcapsulas rellenadas con gas y su uso para diagnostico en ultrasonido.
Description
MICROCAPSULAS QUE COMPRENDEN CIANOACRILATOS DE PO IALQÜ LO FUNCIONALIZADOS
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los objetivos de la invención son microcápsulas rellenadas con gas que contienen cianoacrilato de polialquilo funcionalizado, especialmente para uso en diagnóstico de ultrasonido, así como con procesos para su producción. La solicitud se basa en las siguientes definiciones: Micropartículas : Término genérico para cualquier partícula que mide entre 500 nm y 500 µm, sin importar su diseño estructural . Microcápsulas: Todas las partículas que miden entre 500 nm y 500 µm con una estructura de núcleo-cubierta. Material de pared = material de cubierta: Material de la cubierta de microcápsula. Nanopartículas: Término genérico para todas las partículas que miden menos de 500 nm, sin importar su diseño estructural. Partículas: Término genérico para nonapartículas y micropartículas . Microcápsulas rellenadas con gas: Microcápsulas con un núcleo gaseoso. Homopolímeros: Polímeros elaborados de un monómero.
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Copolímero: Polímero elaborado de diversos monómeros. Cianoacrilato de alquilo: Éster alquílico de ácido cianoacrílico. Cianoacrilato de polialquilo: Polímero elaborado de uno o . as cianoacrilatos de alquilo esencialmente sin grupos de ácido libre y alcohol. Grupo funcional: Grupo de moléculas que contienen por lo menos un compuesto atómico reactivo polar con un grupo X-H de átomos, con X = O, S y N. Grupo funcional latente: Un grupo funcional que se proporciona con un grupo protector, por lo que el grupo protector también puede proteger a varios grupos funcionales . Monomero funcional: Comonómero para cianoacrilatos de alquilo, el cual, además del grupo de la molécula polimerizante contiene por lo menos un grupo funcional libre o latente y con el cual se puede producir un copolímero con grupos funcionales libres directamente o después de separación del grupo protector. Cianoacrilato de polialquilo funcionalizado: Cianoacrilato de polialquilo con grupos funcionales libres que se pueden producir por copolimerización de por lo menos un cianoacrilato de alquilo y por lo menos un monómero funcional o por hidrólisis parcial de cadena lateral de la función de ácido esterificada de los cianoacrilatos de polialquilo. Funcionalización: Producción de cianoacrilatos de
polialquilo funcionalizados por copolimerización de por lr menos un cianoacrilato de alquilo y por lo menos un monómero funcional o por hidrólisis parcial de cadena lateral de la función de ácido esterificado de los cianoacrilatos de polialquilo. Cianoacrilato de polialquilo no funcionalizado: Cianoacrilato de polialquilo. Proporción de fase gaseosa fG: Relación del volumen de gas respecto al volumen total del lote de reacción = proporción del volumen de la fase del gas en la mezcla de reacción. Agitación es la mezcla de un líquido con una sustancia líquida, sólida o gaseosa de manera tal que la proporción de fase gaseosa fG es <1%. Dispersión es la mezcla de un líquido con una sustancia líquida, sólida o gaseosa de manera tal que la proporción de fase gaseosa fG es > 1%. Dispersión es un sistema de fases múltiples coloidal (tamaño de partícula < 500 nm) o disperso de manera gruesa (tamaño de partícula > 500 nm) . Dispersión primaria es una dispersión coloidal que consiste de partículas de polímero, producidas por polimerización de uno o más monómeros. Autogasificación es la introducción de gas en un líquido por el movimiento del gas o por la producción de un
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flujo dinámico bajo presión. Flotación es el movimiento de las microcápsulas rellenadas con gas dirigido contra la fuerza de aceleración
(aceleración debido a gravedad versus aceleración radial a) en base en una diferencia en la densidad entre las microcápsulas y los agentes dispersantes. Material que flota es la capa acremada de microcápsulas rellenadas con gas después de flotación. Como se define por la patente, el término polímero comprende homopolímeros y también copolímeros, y el término polimerización comprende homopolimerización y copolimerización. Cianoacrilatos de alquilo o cianoacrilatos de polialquilo se utilizan de diversas maneras en medicina y en farmacia. El agente farmacéutico HistoacrylMR consiste, por ejemplo, de cianoacrilato de butilo y se utiliza como adhesivo de tejido o adhesivo vascular en cirugía. Después de su aplicación, el monómero se polimeriza y es capaz de sellar tej ido o vasos muy rápidamente . Además, también se han propuesto cianoacrilatos de alquilo para formulaciones de deposición de ingredientes activos (Couvreur, P. et al. J. Pharm. Pharmacol. 31, 331-332 1979) . En este caso, el ingrediente activo o los ingredientes activos se incrustan en una matriz que consiste del polímero correspondiente. Como resultado, se puede modificar y controlar
la velocidad y el sitio de liberación del ingrediente activo. En este caso, los cianoacrilatos de alquilo o los cianoacrilatos de polialquilo son adecuados tanto para la producción de la medición de los implantes que contienen ingrediente activo de hasta varios centímetros y para la producción de micropartículas y nanopartículas que miden algunos micrómetros o nanómetros. Los cianoacrilatos de alquilo o cianoacrilatos de polialquilo han encontrado aplicación especial en la formulación de medio de contraste de ultrasonido. Como medio de contraste las sustancias que contienen o que liberan gases se utilizan generalmente en diagnóstico de ultrasonido médico, dado que, junto con estas sustancias, se puede producir una diferencia de densidad más eficiente y por lo tanto una diferencia de impedancia que entra en líquidos o sólidos y sangre. El uso de los términos "micropartículas" y
"microcápsulas" no es uniforme en la técnica anterior. En la descripción que sigue de la técnica anterior, las definiciones en las cuales se basa esta aplicación se utilizan incluso si la terminología de los documentos se desvía de la misma. En las patentes europeas EP 0 398 935 y EP 0 458 745, se describen microcápsulas que contienen gas como medio de contraste de ultrasonido que consisten de materiales poliméricos biodegradables sintéticos. Los cianoacrilatos de
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polialquilo y polilactidas, i. a., se describen como materiales de pared. Mediante optimización de proceso, el cual se describe en la patente europea EP 0 644 777, se puede mejorar de manera significativa la actividad de ultrasonido de las microcápsulas rellenadas con gas que se describen en EP 0 398 935. Se obtiene un aumento en la actividad de ultrasonido por el diámetro de núcleo de aire el cual se ha agrandado en el caso de un diámetro de partícula constante. Pese a los espesores de pared más pequeños que resultan de esto, las partículas no obstante sobreviven al paso a través del sistema cardiopulmonar. La cubierta de las microcápsulas rellenadas con gas que se describen se acumulan a partir de cianoacrilatos de polialquilo o poliésteres de ácidos a-, ß- o ?-hidroxicarboxílicos . El proceso de producción optimizado para microcápsulas rellenadas con gas que consisten de cianoacrilatos de polialquilo se caracteriza porque el monómero se dispersa y polimeriza en una solución acuosa saturada con gas, acida y en este caso la acumulación de microcápsulas se lleva a cabo directamente. De esta manera, las microcápsulas rellenadas con gas se pueden producir sin solventes orgánicos. Las microcápsulas rellenadas con gas de la técnica anterior, cuyo material de cubierta consiste de cianoacrilatos de polialquilo, tienen, sin embargo, muchos inconvenientes: 1. Los polímeros de cianoacrilatos de alquilo no tienen grupos funcionales hasta el grupo alcohol terminal, los
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cuales son necesarios para un acoplamiento covalente directo de moléculas que se unen específicamente o de sustancias que alteren la cinética. 2. Debido a la ausencia de grupos funcionales y en comparación con polímeros funcionalizados, los polímeros de cianoacrilatos de alquilo son similares en cuanto a peso molecular y los cianoacrilatos de alquilo son menos hidrosolubles y menos susceptibles de expandirse. En el caso de una administración intravenosa, la eliminación de las microcápsulas de la circulación sanguínea por el sistema retículo endotelial del hígado depende fuertemente de la hidrofilicidad de la superficie de partícula, por lo que las superficies hidrofóbicas aceleran la eliminación. Como un resultado, se limita el intervalo de tiempo para diagnóstico. 3. La degradación in vivo se lleva a cabo por hidrólisis de cadena lateral y despolimerización. Además del pH del medio y el peso molecular del polímero, la presencia de grupos funcionales es un parámetro más importante para la degradación en la sangre y en el hígado, por lo que la degradación y metabolización generalmente se lleva a cabo más rápidamente cuanto mayor sea el grado de funcionalización. 4. Las microcápsulas rellenadas con gas que consisten de cianoacrilato de polialquilo tienen una estabilidad limitada contra la dilución, de manera que la dosis de medio de contraste para ultrasonido debe variar de manera
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significativa cuando se realiza una variación vía el volumen de administración, pero necesita variar menos cuando la variación se realiza por medio de concentración de medio de contraste para ultrasonido. Especialmente cuando se realiza durante una infusión, la opción de diluir el medio de contraste reduce el costo de administración. El objetivo de esta invención es proporcionar microcápsulas rellenadas con gas para uso en el diagnóstico por ultrasonido, que no tenga los inconvenientes de la técnica anterior. La funcionalización puede ampliar la posibilidad de unión específica de moléculas de unión o de sustancias que alteren la cinética, al polímero. Además, se puede obtener hidrofilización para disminuir la velocidad de eliminación de microcápsulas de la circulación sanguínea por el sistema retículo endotelial en el hígado y por lo tanto prolongar el intervalo de tiempo de diagnóstico. Además, se debe acelerar la degradación y metabolización de las microcápsulas rellenadas con gas en el hígado. Adicionalmente, los medios de contraste para ultrasonido de acuerdo con la invención deben mostrar mayor estabilidad contra dilución en comparación con los medios de contraste para ultrasonido de la técnica anterior, de manera que se produzcan grados adicionales de libertad en la variación de la dosis que se administre así como del tipo de administración. El objetivo de esta invención se obtiene por
microcápsulas rellenadas con gas para uso en diagnóstico de ultrasonido que contiene cianoacrilato de polialquilo funcionalizado. El cianoacrilato de polialquilo funcionalizado se puede generar por copolimerización de uno o más cianoacrilatos de alquilo, preferiblemente cianoacrilato de butilo, de etilo o de isopropilo, con un monómero funcional, preferiblemente ácido cianoacrílico, o bien por hidrólisis parcial de cadena lateral de un cianoacrilato de polialquilo, preferiblemente cianoacrilato de polibutilo, polietilo o poliisopropilo. La producción de las microcápsulas rellenadas con gas, las cuales contienen cianoacrilato de polialquilo funcionalizado, se puede llevar a cabo de diversas maneras: Variante de proceso I : La primera variante de proceso se caracteriza por las siguientes etapas de proceso: (a) Mezclado del monómero funcional con uno o más cianoacrilatos de alquilo, (b) Copolimerización in si tu y acumulación de microcápsulas en solución acuosa acida, bajo condiciones de dispersión en una etapa de proceso.
Variante de proceso II: La segunda variante de proceso se caracteriza por las siguientes etapas de proceso:
(a) Mezclado del monómero funcional con uno o más cianoacrilatos de alquilo, (b) Copolimerización in si tu, en solución acuosa acida, bajo condiciones de agitación, y (c) Acumulación de microcápsulas bajo condiciones de dispersión, de manera separada de la copolimerización.
Variante de proceso III La tercera variante de proceso se caracteriza por las siguientes etapas de proceso:
(a) Polimerización in si tu de uno o más cianoacrilatos de alquilo y acumulación de microcápsulas en solución acuosa acida bajo condiciones de dispersión en una etapa de proceso, (b) Implementación de hidrólisis parcial de cadena lateral por adición de lye, (c) Detección de la reacción por la adición de ácido.
Variante de proceso IV: La cuarta variante de proceso se caracteriza por las siguientes etapas de proceso:
(a) Polimerización in si tu de uno o más cianoacrilatos de alquilo en solución acuosa acida, bajo condiciones de agitación, (b) Acumulación de microcápsulas bajo condiciones de dispersión, de manera separada de la copolimerización, (c) Implementación de hidrólisis parcial de cadena lateral por adición de lye, (d) Detención de la reacción por adición de ácido.
Variante del proceso V: La quinta variante se caracteriza por las siguientes etapas de proceso. (a) Polimerización in situ de uno o más cianoacrilatos de alquilo en solución acuosa acida, bajo condiciones de agitación, (b) Implementación de hidrólisis parcial de cadena lateral por adición de lye en dispersión primaria, (c) Detección de la reacción por adición de ácido, (d) Acumulación de microcápsulas bajo condiciones de dispersión opcionalmente con adición renovada de uno o más cianoacrilatos de alquilo. Sin importar la variante de proceso, una o más flotaciones con captación subsecuente del material que flota en un medio fisiológicamente compatible, opcionalmente se puede llevar a cabo después de que se ha realizado la acumulación de
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microcápsulas . Además, incluso en el caso de funcionalización por copolimerización con un monómero funcional que ya ha sido realizada, se puede llevar a cabo una funcionalización adicional opcionalmente por hidrólisis parcial de cadena lateral al agregar lye y detener la reacción por la adición de ácido. Además, se pueden implementar etapas de proceso tales como filtración, ultrafiltración o centrifugado para purificación, opcionalmente. Sin importar la variante de proceso, los esteres de alquilo de ácido cianoacrílico se utilizan preferiblemente como monómeros. Se prefieren especialmente el ácido cianoacrílico de butilo, de etilo y de isopropilo. Como monómeros funcionales, se pueden utilizar los siguientes: Ácido cianoacrílico (H2C=C (CN) -CO-OH) , ácido metacrílico (H2C=C (CH3) -CO-OH) , ácido metilenmalónico (H2C=C (CO-OH) 2) y ácido a-cianosórbico (H3C-CH=CH-CH=C (CN) -COOH) y sus derivados, con las fórmulas generales: H2C=C(CN) -CO-X-Z (derivados de ácido cianoacrílico), H2C=C (CH3) -X-Z (derivados de ácido metacrílico), H2C=C (CO-X1 -Z ' ) 2 (derivados de ácido metilenmalónico) y H3C-CH=CH-CH=C(CN) -CO-X-Z (derivados de ácido a-cianosórbico) con X = -O-, -NH- o -NR1- y
tAttíM_____i________^______i__É__.
Z = -H, -R2-NH2, -R2 -NH-R1, -R2-SH, R2-OH, R2-HC (NH2) -R1
-CH2- ?CH-CH2, -CH2-C ?H-CHR1, -CR2H2-C AH-CH2, -CI^H-C AH-CR1!-,
en donde R1 = radical alquilo lineal o ramificado y R2 = radical alquileno lineal o ramificado respectivamente con 1 hasta 20 átomos de carbono y en donde tanto X1 como Z', en cada caso, independientemente uno de otro, tienen el significado que se indica para X y Z. Estírenos sustituidos (Y-C6H4-CH=CH2) o metilestirenos
(Y-C6H4-C(CH3)=CH2) con Y=-NH2, -NRXH, -OH, -SH, -R2-NH2/ -R2-NH-R1, -R2-SH, R2-OH,
-R2-HC(NH2) -R1
en donde R1 = radical alquilo lineal o ramificado y
R2 = radical alquileno lineal o ramificado, respectivamente con
1 hasta 20 átomos de carbono. Emulsificantes polimerizables (Surfmer) , iniciadores con funcionalidad (Inisurf) y agentes de transferencia de cadena con funcionalidad (Transsurf)
Los que se utilizan preferiblemente son: Ácido cianoacrílico (H2C=C(CN) -CO-OH) y
Metacrilato de glicidilo (H2C=C (CH3) -CO-0-C AH2-CH-CH2=2 , 3-epoxipropilmetacrilato En este caso, el monómero funcional de ácido cianoacrílico genera grupos carboxilo libres como grupos funcionales con un grupo atómico 0-H reactivo polar. El monómero funcional de metacrilato de glicidilo genera dos grupos alcohol vecinales libres (diol) con dos grupos atómicos 0-H reactivos polares. Los grupos alcohol se protegen en metacrilatos de glicidilo en un grupo epóxido
(grupos funcionales latentes) y se libera por hidrólisis. En las variantes de proceso I y II, la funcionalización se obtiene por una copolimerización del cianoacrilato de alquilo con un monómero funcional. En las variantes de proceso III a V, la funcionalización se obtiene por un tratamiento subsecuente del cianoacrilato de polialquilo ya sea en la dispersión primaria o en la suspensión de microcápsulas con lyes. En medio alcalino, esto lleva a la hidrólisis de éster de la función acida esterificada en la cadena lateral. En base en la fuerza deseada de la funcionalización, tal reacción se lleva a cabo a un pH de 9-14 durante aproximadamente 15 minutos hasta 5 horas, a temperatura ambiente . La reacción se puede detener, por ejemplo, con ácido
clorhídrico, al ajustar a un pH por debajo de 7. Al variar el pH y el tiempo de reacción de la hidrólisis del éster, es posible un control del grado de funcionalización. Se obtiene una funcionalización de superficie pura si la reacción se lleva a cabo con precaución. La etapa de proceso en las variantes de proceso I y III, en las cuales la polimerización y la acumulación de microcápsulas se lleva a cabo en una etapa, se describen básicamente en las patentes europeas EP 0398935 y 0644777. La polimerización y acumulación de microcápsulas se lleva a cabo aquí en una etapa del proceso bajo condiciones de dispersión. Como herramienta de dispersión, son adecuadas principalmente los mezcladores de rotor-estator, dado que estos últimos producen un gradiente de cizallamiento significativo y aseguran una introducción alta de gas por autogasificación. La etapa de proceso en las variantes de proceso II, IV y V, en las cuales se llevan a cabo la polimerización y la acumulación de microcápsulas en dos etapas, es el objetivo de la solicitud de patente alemana (número de solicitud: 19925311.0) . La invención que se describe aquí se relaciona con un proceso de etapas múltiples para la producción de microcápsulas rellenadas con gas, en el cual la etapa de proceso de polimerización de las sustancias de conformación de cubierta y la etapa de acumulación de microcápsulas se lleva a cabo por
separado. Las microcápsulas que se producen con el proceso de acuerdo con la invención tienen una estructura de núcleo-cubierta se diferencia por una distribución de tamaño definida. La polimerización del monómero se lleva a cabo, en este caso, en solución acuosa acida, bajo condiciones de agitación de manera tal que la proporción de fase gaseosa fG es < 1%. Como un producto intermediario de estas variantes de proceso, se obtiene una dispersión primaria que consiste de partículas de polímero coloidales. El diámetro de las partículas de _.átex poliméricas que se producen para la encapsulación de gas se encuentran en un intervalo de 10 nm a 500 nm, preferiblemente en un intervalo de 30 nm a 150 nm, de manera especialmente ventajosa en un intervalo de 60 nm a 120 nm. El tamaño de partícula de las partículas de polímero coloidales (caracterizadas, por ejemplo, por el diámetro promedio y la polidispersibidad) y el peso molecular del polímero (caracterizable, por ejemplo, por el valor máximo de la distribución de masa molar y la distribución de masa molar) puede ser alterado, por ejemplo el pH del medio de agitación, la concentración de tensioactivo y el tipo de tensioactivo. En particular, la relación del baño de licor (cociente de la masa del tensioactivo entre la masa de monómeros) es un parámetro importante, mediante el cual se pueden controlar las propiedades de la partícula polimérica coloidal. En este caso,
el peso molecular del polímero altera la temperatura de transición vitrea del polímero y por lo tanto su elasticidad, un parámetro más importante que los producidos a partir de partículas poliméricas coloidales. Como elementos de agitación para la polimerización, se consideran básicamente todos los agitadores utilizados comúnmente, pero en especial aquéllos que se utilizan para el mezclado profundo de medios poco vistosos como agua (< 10 mPas) . Estos incluyen, por ejemplo, agitadores propelentes, agitadores de paleta, agitadores con alabe doblado, agitadores MIGMR y agitadores de disco, etc. En relación con la polimerización, una gran proporción que se produce de manera opcional durante la polimerización se puede separar (por ejemplo por filtración) , de manera que esta última ya no tenga un efecto disruptivo en el proceso de formación de las microcápsulas. La formación de las microcápsulas rellenadas con gas se lleva a cabo en otra etapa por agregación de acumulación de estructura de las partículas de polímero coloidales. La acumulación de microcápsulas de la dispersión primaria del polímero se lleva a cabo bajo condiciones de dispersión de manera que la proporción de fase gaseosa fG es < 1%, preferiblemente mayor de 10%. Se puede ver claramente la formación de trombos. Para este fin, la dispersión primaria debe agitarse con una herramienta de dispersión, de manera que
la proporción de fase de gas fG en la mezcla de reacción esté claramente por encima de un valor 1% y generalmente aumenta a más de 10%. Como herramientas de dispersión en la producción de microcápsulas rellenadas con gas en procesos de etapa múltiple, también son adecuados rotores con estatores -mezcladores que puedan producir un gradiente de cizallamiento alto. Además, aseguran una introducción alta de gas. Las dimensiones y los tamaños de operación de la o las herramientas de dispersión determinan esencialmente las distribuciones de tamaño de partícula de las microcápsulas; la determinación de su tamaño también depende del tamaño y capacidad de enfriamiento de la unidad. Una variante de proceso concreta consiste en realizar la producción de la dispersión primaria en un reactor continuo, por lo que para este fin los reactores de tubo con su comportamiento de tiempo libre definido estrechamente son los más adecuados en comparación con los reactores de recipiente de agitación. Mediante una selección adecuada de parámetros de polimerización, se pueden asegurar la geometría del reactor así como el tiempo libre medio de una manera sencilla en un reactor de tubo, de manera que se complete totalmente la polimerización al final del reactor del tubo. En el extremo del reactor de tubo, se puede utilizar
un sistema de rotor-eástator de etapas múltiples para la reacción de acumulación de microcápsulas, de manera que la totalidad del proceso se realiza en un solo aparato, y las dos etapas de proceso, la producción de una dispersión de polímero y la reacción de acumulación de microcápsulas no obstante se separan entre sí . Otras variantes de proceso requieren el uso de un reactor de circuito, que consiste de un recipiente de agitación continuo u opcionalmente un recipiente de agitación intermitente con un circuito exterior, el cual contiene una unidad de dispersión en línea de una sola etapa o etapas múltiples o bien un sistema de rotor-estator de una sola etapa o de etapas múltiples, el cual, además, puede producir la salida para el circuito exterior. En este caso, la producción de la dispersión primaria se lleva a cabo en el área del recipiente de agitación bajo las condiciones de agitación moderadas así como en el circuito cerrado o en el reactor de circuito completo cuando el circuito está abierto. Específicamente, bajo condiciones de circulación, las cuales no permiten ninguna autogasificación por los intervalos de velocidad ajustados correspondientemente. Al final de la reacción, se abre el circuito para permitir entonces la reacción de acumulación de las microcápsulas por la unidad de rotor-estator que se integra en el circuito. Cuando el circuito se abre desde la salida, el intervalo de velocidad
"dé la unidad de rotor-estator aumenta en consecuencia. Los ejemplos 1 y 2 proporcionan ejemplos de proceso para la acumulación de etapa múltiple de microcápsulas, de acuerdo con la solicitud de patente alemana mencionada antes. Sin importar la variante de proceso, el medio de agitación o de dispersión puede contener uno o más de los siguientes tensioactivos: Sales a. calinas de alquilarilpoli (oxietilen) sulfato, dextranos, poli (oxietilenos) , polímeros de bloque de poli (oxipropileno) -poli (oxietileno) , alcoholes grasos etoxilados (cetomacrogoles) , ácidos grasos etoxilados, alquilfenolpoli (oxietilenos) , copolímeros de alquilfenolpoli (oxietileno) (s) y aldehidos, esteres de ácido graso parcial de sorbitano, esteres de ácido graso parcial de poli (oxietilen) sorbitano, esteres de ácido graso de poli (oxietileno) , éteres de alcohol graso de poli (oxietileno) , esteres de ácido graso de sacarosa o éster de macrogolglicerol, alcoholes polivinílicos, esteres de ácido graso de poli (oxietilen) hidroxi, macrogoles de alcoholes multivalentes, y esteres de ácidos grasos parciales. Se utiliza de manera preferible uno o más de los siguientes tensioactivos: nonilfenoles etoxilados, octilfenoles etoxilados, copolímeros de aldehidos y octilfenolpoli (oxietileno) , esteres de ácido graso parcial de glicerol etoxilado, aceite de ricino hidrogenado etoxilado,
poli (oxietilen) -hidroxiestearato, polímeros de bloque de poli (oxipropilen) -poli (oxietileno) con una masa molar <20,000. Los tensioactivos especialmente preferidos son: Para-octilfenol-poli- (oxietileno) con 9-10 grupos etoxi en promedio (=octoxinol 9,10), para-nonilfenol- poli (oxietileno) con 30/40 grupos etoxi en promedio (= por ejemplo EmulanMR30, EmulanMR40) , sal de sulfato de Na de para- nonilfenol-poli (oxietileno) con 28 grupos etoxi en promedio (= por ejemplo, DisponilMR AES) , monoestearato de poli (oxietilen) glicerol (por ejemplo Tagat"11 S) , alcohol polivinílico con un grado de polimerización de 600-700 y un grado de hidrólisis de 85%-90% (= por ejemplo MowiolMR 4-88) , éster de ácido poli (oxietileno) -660-hixoesteárico (= por ejemplo, SolutolMR HS 15) , copolímero de formaldehído y para- octilfenolpoli (oxietileno) (= por ejemplo TritonMR WR 1339), polímeros de bloque de polioxipropileno-polioxietileno con una masa molar de aproximadamente 12,000 y una proporción de polioxietileno de aproximadamente 70% (= por ejemplo LutolMR F127) , alcohol cetilestearílico etoxilado (= por ejemplo, CremophorMR A25) , aceite de ricino etoxilado (= por ejemplo CremophorMR EL) . Los ajustes de la velocidad de reacción de polimerización y los tamaños de partícula medios que resulten de lo mismo se llevan a cabo, i. a., además de la temperatura por el pH, el cual se puede ajustar como una función de ácido y
la concentración en un intervalo de 1.0 a 4.5, por ejemplo por ácidos, tales como ácido clorhídrico, ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Otros valores que alteran la velocidad de reacción son el tipo y concentración del tensioactivo así como el tipo y concentración de aditivos. El monómero se agrega a una concentración de 0.1 a 60%, preferiblemente de 0.1 a 10%, a una solución acuosa acida. La polimerización y la acumulación de microcápsulas se realizan a temperaturas de -10°C a 60°C, preferiblemente en un intervalo de 0°C a 50°C, y de manera especialmente preferible entre 5°C y 35°C. El período de polimerización y la acumulación de microcápsulas se encuentra entre 2 minutos y 2 horas . Con los procesos mencionados antes, en principio todos los gases en las microcápsulas se pueden incluir si la reacción se lleva a cabo correctamente. A modo de ejemplo, se pueden mencionar: aire, nitrógeno, oxígeno, dióxido de carbono, gases nobles, óxidos de nitrógeno, alcanos, alquenos, alquinos, óxido nitroso y perfluorohidrocarburos . El lote de reacción se puede trabajar adicionalmente. Es aconsejable la separación de microcápsulas rellenadas con gas del medio de reacción. Esto se puede realizar de una manera sencilla mediante el uso de la diferencia de densidad por flotación. Las
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microcápsulas rellenas con gas forman un material que flota, el cual se puede separar fácilmente del medio de reacción. El material que flota que se obtiene después se puede captar con un vehículo fisiológicamente compatible, en el caso más sencillo agua o solución salina común fisiológica. La suspensión se puede administrar directamente. Es aconsejable opcionalmente la dilución. El proceso de separación también se puede repetir una o más veces. Mediante el ajuste específico de las condiciones de flotación, se pueden obtener fracciones con propiedades definidas . El tamaño y la distribución de tamaño de las microcápsulas se determinan por diversos parámetros de proceso, por ejemplo el gradiente de cizallamiento o el período de agitación. El diámetro de las microcápsulas rellenadas con gas se encuentra en un intervalo de 0.2-50 µm, en el caso de agentes parenterales, preferiblemente entre 0.5 y 1 µm y de manera especialmente preferible entre 0.5 y 5 µm. Las suspensiones son estables durante un período prolongado y las microcápsulas no se agregan. No obstante, se puede mejorar la durabilidad mediante liofilización subsecuente, opcionalmente después de la adición de polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico, gelatina, albúmina sérica humana u otro crío protector que sea conocido para los expertos en la técnica.
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.as microcápsulas rellenadas con gas de acuerdo con la invención se pueden utilizar directamente u opcionalmente después de activación para acoplamiento específicamente de moléculas de unión o las sustancias que alteren la cinética. 5 Una activación del cianoacrilato de polialquilo funcionalizado puede facilitar opcionalmente el acoplamiento de moléculas de unión específicamente o de sustancias que alteren la cinética. Por ejemplo, la activación- con EDC clorhidrato de (1- 10 etil-3- (3 -dimetilaminopropil) -carbodiimida) se puede llevar a cabo, mediante el cual se introduce un grupo o-acilurea en la posición de polímero como un grupo que se puede acoplar. En este caso, la unión de la molécula que se va a unir preferiblemente se lleva a cabo por grupos amina. Para
15 este fin, la molécula que se va a unir opcionalmente puede estar aminada (por ejemplo: polietilenglicol terminado en amina) . Como moléculas que se unen específicamente, anticuerpos, preferiblemente anticuerpos contra EDB-FN,
20 anticuerpos contra endostatina, anticuerpos contra CollXVIII, anticuerpos contra CM201, anticuerpos contra ligando de L- selectina tales como anticuerpos contra PNAd (anticuerpos MECA79) , anticuerpos CD105, anticuerpos contra ICAM1 o ligandos endogénicos, preferiblemente L-selectina y de manera preferida
25 especialmente L-selectina quimera son los que se pueden
utilizar. Como sustancias que alteran la cinética, se pueden utilizar polímeros sintéticos, preferiblemente polietilenglicol (PEG) , proteínas, preferiblemente albúmina sérica humana o sacáridos, preferiblemente dextrano. Las moléculas que se unen específicamente o las sustancias que influyen en la cinética se pueden acoplar directamente a los grupos funcionales del cianocrilato de polialquilo funcionalizado vía un separador, por ejemplo proteína G, o se pueden biotinar vía acoplamiento de estreptavidina-biotina a las microcápsulas rellenadas con gas. Los grupos funcionales de los cianoacrilatos de polialquilo funcionalizados opcionalmente se pueden activar antes de la reacción de acoplamiento. Si no se lleva a cabo acoplamiento directo, los separadores o la estreptavidina se unen en una primera etapa de proceso vía grupos funcionales del cianoacrilato de polialquilo funcionalizado a las microcápsulas rellenadas con gas. Las moléculas de unión específicamente o las sustancias que alteran la cinética después se acoplan al separador en la segunda etapa de proceso o se acoplan a estreptavidina en forma biotinada. Además en este caso, los grupos funcionales del cianoacrilato de polialquilo funcionalizado opcionalmente se pueden activar antes de la reacción de acoplamiento.
Ejemplo 1: microcápsulas rellenadas con gas, no funcionalizadas
Procedimiento de tapa múltiple de acuerdo con la Solicitud de Patente Alemana No. 19925311.0 (a) Producción de la dispersión primaria Para propósitos de inyección, se cargan 500 ml de agua en un reactor de vidrio de 1 1 con una relación de diámetro respecto altura de 0.5, y un pH de 1.5 se ajusta al agregar ácido clorhídrico ÍN y se ajusta la temperatura del reactor a 290.5°K. Mientras se agita con un agitador propulsor, se agregan 5.0 g de octoxinol y se agita hasta que se disuelve completamente el octoxinol. Después, se agregan en gotas 7 g de éster butílico del ácido cianoacrílico, bajo las mismas condiciones de agitación durante un período de 15 minutos, y se agita durante otras 2 horas.
(b) Producción de la suspensión de microcápsula
La dispersión primaria se dispersa durante 2 horas con un equipo Ultraturrax (por ejemplo IKA, tipo T25) con gradientes de alto cizallamiento (velocidad libre del equipo Ultraturrax de aproximadamente 20,500 min"1). Por la dispersión, se lleva a cabo la autogasificación del medio de proceso con el resultado de una formación fuerte de espuma.
Después de finalizar la reacción, se forma una capa cremosa de microcápsulas rellenadas con gas. Para propósitos de inyección, el material que flota se separa del medio de reacción y se capta con 375 ml de agua. La suspensión que se obtiene de esta manera contiene microcápsulas en un intervalo de 0.5-10 µm (difractómetro láser del tipo de Malvern Instruments Company, MastersizerS) .
(c) Liofilización
Después se disuelven en el lote 40 g de polivinilpirrolidona, la suspensión se formula a 5 g y se liofiliza.
(d) Tamaño de partícula de las nanopartículas en la dispersión primaria
La dispersión primaria que se obtiene de acuerdo con el inciso (a) se mide por medio de dispersión dinámica de luz (dispositivo: Nícomp Submicron Particle Sizer) . La figura 1 muestra la distribución del tamaño medido de las nanopartículas. El diámetro medio de la distribución de tamaño es de 83 nm y está ponderado en cuanto a intensidad con un índice de polidispersividad de aproximadamente 25%.
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Ejemplo 2: Microcápsulas rellenadas con gas no funcionalizadas
Procedimiento de etapas múltiples, de acuerdo con la Solicitud de Patente Alemana No. 19925311.0
(a) Producción de la dispersión primaria:
Se introduce 1 1 de una solución acuosa de octoxinol 1% a un pH de 2.5 en un reactor de vidrio de 2 1 con una relación de diámetro respecto a altura de aproximadamente 0.5 y un circuito exterior con una unidad de rotor-estator-mezclador de una etapa. Se agregan 14 g de éster butílico de ácido cianoacrílico en gotas durante 5 minutos y se agita durante 30 minutos para introducirse sin aire dentro de la mezcla de reacción.
(b) Producción de la suspensión de microcápsulas
Para la producción de la suspensión de microcápsulas, el circuito exterior se une al circuito durante 60 minutos y se dispersa la dispersión primaria. El agitador en el reactor de vidrio se ajusta de manera que se lleva a cabo la autogasificación de la mezcla de reacción. Después del final de la prueba, se forma una capa acremada. Para propósitos de inyección, el material que flota se separa del medio de
reacción y se capta con 1.5 1 de agua.
Ejemplo 3: Influencia de la concentración del tensioactivo en las propiedades de partícula
(a) Producción de la dispersión primaria
Las dispersiones primaras se producen de manera análoga al ejemplo 1 (a) con concentraciones de Tritón respectivamente de 0.1% (0.5 g), 0.5% (2.5 g), 1% (5 g) , 2% (10 g) y 10% (50 g) .
(b) Producción de la suspensión de microcápsulas
Se construyen microcápsulas rellenadas con gas a partir de las dispersiones primarias que se obtienen, de acuerdo con el inciso (a) . Las dispersiones primarias se utilizan con diferentes distribuciones de tamaño con un diámetro medio de 50 nm, 100 nm y 250 nm (dispersión dinámica de luz) . El proceso se realiza como se describe bajo el ejemplo Kb) .
(c) Tamaño de partícula de las nanopartículas en la dispersión primaria
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Las
primarias se caracterizan por medio de dispersión dinámica $ luz con respecto al tamaño de partícula. La figura 2 muestra el diámetro medido del medio de partícula (ponderado en cuanto a intensidad) . El tamaño de la nanopartícula polimerizada desciende sistemáticamente al aumentar la concentración de tensioactivo.
(d) Tamaño de partícula de las microcápsulas rellenadas con gas
La figura 3 muestra la distribución de tamaño ponderada en cuanto a volumen (contador de partículas de Particle Sizing Systems Company, tipo AccuSizer 770) de las microcápsulas rellenadas con gas, producidas de acuerdo con el ejemplo 3 (b) en el intervalo de medición de 0.8-10 µm. La distribución de tamaño de partícula de la dispersión primaria no tiene influencia significativa en la distribución de tamaño de las microcápsulas rellenadas con gas.
(e) Amortiguamiento por ultrasonido de las microcápsulas rellenadas con gas
Para caracterizar las propiedades en el campo de ultrasonido, se determinó la absorción dependiente de frecuencia (amortiguamiento de ultrasonido) de las microcápsulas producidas de acuerdo con el ejemplo 3. La figura
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4 muestra el espectro de absorción de las microcápsulas rellenadas con gas en el intervalo de frecuencia de ultrasonido de 1 a 25 MHz. Se estandariza a amortiguamiento máximo. El intervalo de absorción máxima se desplaza a frecuencias de ultrasonido más altas con un tamaño cada vez mayor de las partículas primarias utilizadas para la producción de microcápsulas .
(f) Espesor de pared de microcápsula
Con condiciones de dispersión idénticas, se obtienen microcápsulas del mismo tamaño de partícula (ejemplo 3 (d) ) pero con propiedades muy diferentes en el campo de ultrasonido
(ejemplo 3 (e) ) . Si la frecuencia de ultrasonido de absorción máxima (ejemplo 3 (e) ) se considera como una frecuencia de resonancia de la población de microcápsula, este procedimiento se puede describir con teorías convencionales respecto a la interacción del ultrasonido con burbujas de gas (N. de Jong Acoustic Properties of Ultrasound Contrast Agents, Rotterdam, Diss. 1993) y se puede atribuir a espesores diferentes de la pared de microcápsula. La frecuencia de resonancia de burbujas de gas (sin una cubierta) en un líquido es inversamente proporcional al diámetro de las burbujas de gas.
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en donde : fo = frecuencia de resonancia [s"1] ; r = radio de la burbuja [m] ¡ Y = exponente adiabático del gas (Cp/Cv; aquí 1.4); P = presión que prevalece (aquí, 1 x 105 N/m2) ; p = densidad del líquido (aquí, 1 x 103 kg/m3 De acuerdo con la teoría mencionada antes, esta dependencia por microcápsulas debe ser expandida por un término adicional que contenga un parámetro de cubierta:
fo'mxcrocápsula _
o _ rp "Parámetro de cubierta" = S * .(r - r,) (l-v) E es el módulo de elasticidad [N/m2] del material de cubierta -del polímero; v es la relación de Poisson (que adquiere valores de 0 a 0.5), el cual describe la relación de cambio de volumen de un elemento respecto a la expansión y (r- r_) es la diferencia entre el radio exterior e interior de las microcápsulas- y por lo tanto el espesor de pared [m] . La figura 3 (ejemplo 3 (d) ) muestra que la distribución de tamaño de las microcápsulas no difiere cuando
se1 utilizan dispersiones primarias de distribución de tamaño diferentes. La figura 4 (ejemplo 3 (e) ) demuestra que la frecuencia de resonancia de las microcápsulas con tamaño cada vez mayor de las partículas primarias utilizadas para acumular las microcápsulas se desplaza a frecuencias de ultrasonido superiores. Con el tamaño medio de microcápsulas conocido a partir de la figura 3 (diámetro de aproximadamente 2.5 µm) y la frecuencia de resonancia medida de la figura 4, se puede calcular el parámetro de cubierta con la ecuación (2) anterior.
Tabla 1: Comparación de las variables de medición para calcular los parámetros de cubierta, de acuerdo con la ecuación (2)
Í - El graficado del parámetro de cubierta Se versus el diámetro medio de las nanopartículas en la dispersión primaria proporciona una dependencia lineal (figura 5) . Evidentemente, el tamaño de la partícula primaria determina directamente el espesor de pared de las microcápsulas producidas a partir del mismo . La pendiente contiene tanto el módulo de elasticidad E y v (véase antes: definición de la ecuación de parámetro de cubierta (3) ) . Dado que v puede asumir solo valores entre 0 y 0.5, se puede determinar fácilmente un módulo de elasticidad de 1-2 x 106 N/m2 a partir de la pendiente (5 x 107 N/m2) , el cual se encuentra entre los esteres de ácido poliacrílico de alto peso molecular (3 x 109 N/m2) y caucho vulcanizado (3-8 x 105 N/m2) .
Ejemplo 4: Microcápsulas rellenadas con gas funcionalizadas
Variante del proceso IV (a) Producción de la dispersión primaria
Para propósitos de inyección, se cargan 500 ml de agua en un reactor de vidrio de 1 1 con una relación de diámetro respecto a altura de 0.5, y se establece un pH de 2.5 al agregar ácido clorhídrico ÍN y se ajusta la temperatura del reactor a 290.5°K. Mientras se agita con un agitador
propelente, se agregan 5.0 g de , f oxinol y se agita hasta que se disuelve por completo el ocjtoxinol . Después, bajo las mismas condiciones de agitación, se agregan en gotas 7 g de éster butílico de ácido cianoacrílico, durante un período de 15 minutos y se agita durante otras 2 horas.
(b) Producción de la suspensión de microcápsula
La dispersión primaria se dispersa durante 2 horas con un equipo Ultraturrax (por ejemplo, IKA, tipo T25) con gradientes de cizallamiento alto (velocidad libre del equipo
Ultraturrax de aproximadamente 20,500 min"1). Mediante la dispersión, se lleva a cabo la autogasificación del medio de proceso con el resultado de una fuerte formación de espuma. Después de finalizar la reacción, se forma una capa acremada de microcápsulas rellenadas con gas. Para propósitos de inyección, el material que flota se separa del medio de reacción y se capta con 375 ml de agua. La suspensión de microcápsulas que se produce de esta manera tiene un contenido de polímero de 8.45 mg/ml con un pH de 3.8 (24.1°C) .
(c) Funcionalización de microcápsulas rellenadas con gas mediante hidrólisis parcial de cadena lateral
Mientras se agita, se mezclan 50 ml de la suspensión
de microcápsulas de acuerdo con el ejemplo 4 (b) con 100 ml d>° una solución de hidróxido de sodio de concentraciones 6.0 x 10" 5 mol/1 (cl) , 6.6 x 10"4 mol/1 (c2) y 7.2 x 10"3 mol/1 (c3). En el lote de reacción, resultan valores de pH de 7.7 (cl) , 10.6 (c2) y 11.7 (c3) . Después de aproximadamente 2 horas de tiempo de reacción, se establece un pH de 3 con ácido clorhídrico.
(d) Tamaño de partícula de las microcápsulas rellenadas con gas
La figura 6 muestra la distribución de tamaño ponderado en volumen (contador de partículas de Particle Sizing Systems Company, tipo AccuSizer770) de las microcápsulas rellenadas con gas en el intervalo de medición de 0.8 a 10 µm. Únicamente a la concentración de solución máxima de hidróxido de sodio (c3) se puede observar un ligero cambio en la distribución de tamaño. Esto se puede atribuir a una reducción del espesor de pared. Bajo las condiciones que se describen aquí , no se observa agregación y tampoco cambio en la concentración de partículas.
(e) Eficacia de ultrasonido in vitro de las microcápsulas, de acuerdo con el ejemplo 4
Para caracterizar las propiedades de las microcápsulas en el campo de ultrasonido, se determina la
--tafc> .
absorción de ultrasonido dependiente de frecuencia (amortiguamiento de ultrasonido) de las microcápsulas. La figura 7 muestra el espectro de absorción de las microcápsulas rellenadas con gas en el intervalo de frecuencia de ultrasonido de 1 a 20 MHz. Se estandariza al máximo de amortiguamiento. El espectro de absorción para las microcápsulas de acuerdo con el ejemplo 4 (cl) y 4 (c2) se desplaza fácilmente para disminuir las frecuencias de ultrasonido en comparación con las microcápsulas no tratadas, de acuerdo con el ejemplo 4 (b) . Para las microcápsulas de acuerdo con el ejemplo 4 (c3) (el tratamiento superficial más vigoroso con una solución de hidróxido de sodio) , el intervalo de absorción máximo se desplaza claramente a las frecuencias menores de ultrasonido. Este desplazamiento se puede atribuir a una reducción en el espesor de pared y corresponde a los resultados para la distribución de tamaño de partícula. Además de los espectros de absorción relativos que se muestran en la figura 7, también se muestran en la figura 8 los valores absolutos del amortiguamiento de ultrasonido para una frecuencia de medición diagnósticamente relevante de 5 MHz. Esta comparación muestra que el parámetro de eficacia de ultrasonido crece significativamente con un grado cada vez mayor de funcionalización (concentración de la solución de hidróxido de sodio) . Todas las mediciones se realizaron a una
concentración constante de microcápsulas de 2.5 x 106 partículas/ml en TritonXlOO^O .01% . Ejemplo 6: Microcápsulas rellenadas con gas funcionalizadas
Variantes del proceso III (a) Producción de la suspensión de microcápsula
Se introducen 7 1 de una solución acuosa de octoxinol 1% a un pH de 2.5 en un reactor de 20 1 y se mezcla con un mezclador de rotor-estator con un gradiente de cizallamiento alto de manera que se lleva a cabo la autogasificación con formación fuerte de espuma. Se agrega rápidamente (< 1 minuto) y se dispersan 100 g de éster butílico de ácido cianoacrílico. Se polimeriza durante 60 minutos con autogasificación, por lo que se forman microcápsulas rellenadas con gas. En un embudo de separación, se separa el material de la capa superior y el de la capa inferior se elimina por drenado, y el material que flota se resuspende con 3 1 de una solución acuosa de octoxinol 0.02%. La suspensión de microcápsulas que se obtiene de esta manera tiene un contenido de polímero de 9.46 mg/ml, una densidad de 0.943 g/ml y un pH de 3.5.
(b) Funcionalización de microcápsulas rellenadas con gas por hidrólisis parcial de cadena lateral
Se mezclan 2418 g (bl) o 2500 g (b2) de una suspensión de microcápsulas de acuerdo con el inciso (a) , con 239 g (bl) o 501 g (b2) de una solución de hidróxido de sodio a una concentración de 8 x 10"2 mol/1 mientras se agita. Los valores de pH de 11.8 (bl) o de 12.1 (b2) resultan en el lote de reacción. Se agita durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después se ajusta el pH a 3.5 con ácido clorhídrico ÍN.
(c) Tamaño de partícula de las microcápsulas rellenadas con gas
La figura 9 muestra la distribución de tamaño ponderado en volumen (contador de partículas de Particle Sizing
Systems Company, tipo AccuSizer 770) de las microcápsulas rellenadas con gas, que se producen en el intervalo de medición de 0.8 a 10 µm.
(d) Liofilización y determinación del contenido de butanol
Prueba de funcionalización Para propósitos de inyección, las suspensiones de acuerdo con los ejemplos 6 (a) y (b) se diluyen con agua hasta un contenido de polímero de aproximadamente 4 mg/ml. Después, en cada lote, se establece una concentración de polivinilpirrolidona de 10%, las suspensiones se formulan hasta
l|ͧé«y se liofilizan. Por medio de crorflfeografía de gas (método de espacio vacío: gas portador: helio; fase estacionaria: DB624; dispositivo: Perkin-Elmer HS40) , se determina el contenido de 1-butanol. En comparación con microcápsulas no funcionalizadas de acuerdo con el ejemplo 6 (a) , se encuentra un valor superior 5x para las microcápsulas funcionalizadas, de acuerdo con el ejemplo 6(bl) y se encuentra 20 veces tanto 1-butanol, de acuerdo con el ejemplo 6 (b2) .
Tabla 2 : Determinaciones de contenido de butanol
(e) Titulación antagonista para determinación de carga de superficie
Prueba de funcionalización
b___W?_____tfi__?________i
Las determinaciones de carga se realizan con un titulador Mütek PCD 02. Las muestras se titulan en 4 diluciones (0.3% < contenido de polímero < 1.2%) hasta neutralidad de carga con una solución P-DADMAC de la concentración de 0.1 mmoles. Se calcula la densidad de carga a partir de las líneas de compensación de mediciones individuales (consumo de solución de P-DADMAC a un contenido dado de polímero) , y el radio de partícula promedio de las microcápsulas. En la figura 10 se muestran los resultados de medición. Para suspensiones de microcápsulas no funcionalizadas de acuerdo con el ejemplo 6 (a), r.o se puede determinar densidad de carga significativa con este método. Para microcápsulas funcionalizadas de acuerdo con el ejemplo 6 (b) , una densidad de carga de superficie de 4.2 µC/cm2 (bl) o de 5.1 µC/cm2 (b2) se sigue a partir de la pendiente de las líneas de compensación. La densidad de carga aumenta al aumentar la concentración de solución de hidróxido de sodio en la reacción. Para microcápsulas no funcionalizadas de acuerdo con el ejemplo 6 (a) , se produce una línea de compensación sin una pendiente significativa.
(f) Estabilidad de dilución
Para propósitos de inyección, la concentración de microcápsulas de las suspensiones de acuerdo con los ejemplos 6 (a) y (b) se establece con agua a 5 x 109 partículas (> 1 µm)
Sizing Systems
estabilidad de dilución, en cada caso se diluye 1 ml de las suspensiones con solución salina común isotónica de volúmenes cada vez mayores y se estudian visualmente para determinar los agregados de microcápsulas después de 30 minutos de duración de servicio (mientras se agitan ligeramente) . Aunque las microcápsulas no funcionalizadas de antemano tienden de manera visible a la agregación después de que se incrementa el volumen en 500% (1 ml de suspensión de microcápsula + 5 ml de solución salina común isotónica) , las microcápsulas funcionalizadas aún están libres de agregados después de un incremento de volumen de 2000% (1 ml de suspensión de microcápsula + 20 ml de solución salina común isotónica) .
(g) Degradación in vitro
Para propósitos de inyección, la concentración de microcápsula de las suspensiones se ajusta con agua a 5 x 109 partículas ( > 1 µm) por ml (contador de partículas de Particle Sizing Systems Company, tipo AccuSizer 770) . Para estudiar la cinética de degradación, se realizan mediciones dependientes del tiempo de la turbidez a una longitud de onda de 790 nm (espectrómetro de Shimadzu Company UV-2401PCT) y 25°C. Para
este fin, se diluyen 0.5 ml de la formulación tespectiva directamente en la celda de medición con 2.0 ml de una solución de hidróxido de sodio (concentración: 1.25 x 10"3 mol/1), de manera que se ajusta el pH a 11. Después de 60 segundos, se inicia la medición. A modo de ejemplo, la figura 11 muestra los resultados para microcápsulas rellenadas con gas que se producen de acuerdo con el ejemplo 6 (a) (no funcionalizadas) y del ejemplo 6(b2) (funcionalizadas). En comparación con la muestra no tratada, el tiempo libre de la microcápsula funcionalizada se reduce en aproximadamente 75% y la velocidad máxima de disolución
(aumento en el punto de inflexión) aumenta en 0.37% trans. /s
(no funcionalizado) a 0.86% trans. /s (funcionalizado).
(h) Eficacia de ultrasonido in vivo
Se anestesia a un perro mestizo (de aproximadamente 12 kg de peso corporal) (anestesia por inhalación, aire + 2-3% de enflurano; respiración espontánea) y se prepara para un estudio sonográfico del corazón. El estudio se realiza con dispositivo de ultrasonido de la compañía ATL (tipo UM9, transductor L10/5) en el modo espectral Doppler para amplitudes de transmisión bajo, media y alta. En cada caso, el animal de prueba recibe una administración intravenosa de la sustancia de prueba que se
produce de acuerdo con el fajemplo 6 (a) (no funcionalizada) y el ejemplo 6(b2) (funcionalizada). Como una sustancia de referencia, se utiliza un medio de contraste que se produce de manera análoga al ejemplo 23 de WO 93/25242 con polivinilpirrolidona como un crioprotector. La dosis que se utiliza es de 3 x 107 partículas por kg de peso corporal para todas las sustancias de prueba. La figura 12 muestra la intensidad integral Doppler (superficie debajo de la curva de intensidad-tiempo) , y la figura 13 muestra el período de contraste de ultrasonido de la sustancia de referencia y de las sustancias de prueba. Se puede discernir que las microcápsulas rellenadas con gas funcionalizadas de acuerdo con el ejemplo 6(b2) tienen claramente mejores propiedades contrastantes en comparación con las microcápsulas rellenadas con gas no funcionalizadas de la técnica anterior. Esto se puede discernir en una intensidad integral más alta y una extensión del intervalo del tiempo de diagnóstico. Los valores de eficacia de las microcápsulas rellenadas con gas y funcionalizadas, de acuerdo con el ejemplo 6(b2) aumenta en 50%, y los tiempos de contraste se prolongan en aproximadamente un factor de 2.
Ejemplo 7: Microcápsulas rellenadas con gas y funcionalizadas Variante de proceso I
Se cargan 7 1 de una solución acuosa de octoxinol 1% con un pH de 2.5 en un reactor de 20 1 y se dispersan con un mezclador de rotor-estator a un gradiente de cizallamiento alto de manera que se lleva a cabo la autogasificación con una formación fuerte de espuma. Una mezcla de 75 g de éster butílico de ácido cianoacrílico y 15 g de ácido cianoacrílico se agregan rápidamente (< 1 limito) y se dispersa. Se polimeriza durante 60 minutos bajo autogasificación, por lo que se forman microcápsulas rellenadas con gas. En un embudo de separación, se separa el material que flota, el material de la parte inferior se elimina por drenado y el material que flota se resuspende con 3 1 de una solución acuosa de octoxinol 0.02%. La suspensión que se obtiene de esta manera contiene microcápsulas rellenadas con gas que miden 0.5 a 10 µm (difractómetro láser de Malvern Instruments Company, tipo MastersizerS) .
Ejemplo 8: Microcápsulas rellenadas con gas funcionalizadas Variante de proceso II
(a) producción de la dispersión primaria
Para propósitos de inyección, se cargan 500 ml de agua en un reactor de vidrio de 1 1 con una relación de
dififi iro respecto a altu?-de 0.5, y se establece un pH de 1.5 al agregar ácido clorhídrico ÍN y se establece una temperatura de re tor de 290.5°K. Mientras se agita con un agitador propelente, se agregan 5.0 g de octoxinol y se agita hasta que se disuelve por completo el octoxinol. Después, bajo las mismas condiciones de agitación diarante un período de 15 minutos, se agregan en gotas 6.0 g de éster butílico del ácido cianoacrílico junto con 1.0 g de ácido cianoacrílico y se agita durante otras 2 horas. La dispersión primaria que se obtiene se mide por medio de dispersión dinámica de luz (dispositivo: Nicomp Submicron Particle Sizer) y muestra nanopartículas en un intervalo de 50 a 120 nm.
(b) Producción de la suspensión de microcápsula
La dispersión primaria se dispersa durante 2 horas con un equipo Ultraturrax (por ejemplo IKA, tipo T25) con gradientes de cizallamiento altos (velocidad libre del equipo Ultraturrax de aproximadamente 20,500 min"1). Por la dispersión, se lleva a cabo la autogasificación del medio de proceso con el resultado de una fuerte formación de espuma. Después de finalizar la reacción se forma una capa acremada de microcápsulas rellenadas con gas. Para propósitos de inyección, el material que flota se separa del medio de reacción y se capta con 375 ml de agua. La suspensión de microcápsulas que se
obtiene de esta manera contiene microcápsulas en un intervalo de 0.5-10 µm (dif actómetro láser de Malvern Instruments Company, tipo MastersizerS) .
(c) Liofilización
Se disuelven 40 g de polivinilpirrolidona en el lote, y la suspensión se formula a 5 g y se liofiliza.
Ejemplo 9: Microcápsulas rellenadas con gas funcionalizadas Variantes de proceso V
(a) Producción de la dispersión primaria:
Para propósitos de inyección, se cargan 500 ml de agua en un reactor de vidrio de 1 1 con una relación de diámetro respecto altura de 0.5 y se establece un pH de 1.5 al agregar ácido clorhídrico ÍN y se establece una temperatura de reactor de 290.5°K. Mientras se agita con un agitador y propelente, se agregan 5.0 g de octoxinol y se agita hasta que el octoxinol se disuelve por completo. Después, bajo las mismas condiciones de agitación durante un período de 15 minutos, se agregan a gotas 7 g de éster butílico de ácido cianoacrílico, y se agita durante otras 2 horas.
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(b* ! Funcionalización de la dispersión primaria
En la dispersión primaria, se establece un pH de 11 con 165 ml de una solución de hidróxido de sodio 0. ÍN mientras se agita, y se agita durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Después se establece un pH de 3 con 13 ml de ácido clorhídrico
0.1N.
(c) Producción de la suspensión de microcápsula
La dispersión primaria funcionalizada se dispersa durante 2 horas con un equipo Ultraturrax (por ejemplo, IKA, tipo T25) con gradientes de alto cizallamiento (velocidad libre de Ultraturrax de aproximadamente 20,500 min"1). Mediante la dispersión, se lleva a cabo una autogasificación del medio de proceso con el resultado de una formación fuerte de espuma. Después de finalizar la reacción, se forma una capa acremada de microcápsulas rellenadas con gas. Para propósitos de inyección, el material que flota se separa del medio de reacción y se capta con 375 ml de agua. La suspensión que se obtiene de esta manera contiene microcápsulas en un intervalo de 0.5-10 µm (difractómetro láser de Malvern Instruments Company, tipo MastersizerS) .
Ejemplo 10: Unión de HSA a microcápsulas rellenadas con gas funcionalizadas .
La suspensión de microcápsula de acuerdo con el ejemplo 6(b2) se purifica por flotación al menos 5x de solución Triton-XlOO 0.02%. Se mezcla 1 ml de la suspensión de microcápsula purificada con una concentración de 5 x 109 partículas por ml, con 10 µl de una solución HSA 10% y se agita durante 60 minutos a 4°C. Después se agregan 10 mg de clorhidrato de (l-etil-3- (3- (dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y se ajusta el pH a 6.5 con ácido clorhídrico 0.1N. Se vigila la incubación durante aproximadamente 16 horas a 4°C mientras se agita. Las microcápsulas rellenadas con gas, a las cuales se une HSA, se separan por flotación repetida de HSA no unido y los subproductos. Se une 57% de la cantidad de proteína a las microcápsulas (espectroscopia UV) .
Ejemplo 11: Unión de polietilenglicol a microcápsulas rellenadas con gas funcionalizadas
La suspensión de microcápsula de acuerdo con el ejemplo 6(b2) se purifica por flotación en por lo menos 5x de solución Triton-XlOO 0.02%. Se mezcla 1 ml de suspensión de microcápsula purificada con una concentración de 5 x 109
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partículas por ml, con 10 µl de una solución 10% de polietilenglicol terminado en amina (HO-POE-NH2/3000 Dalton) y se agita durante 60 minutos a 4°C. Después se agregan 10 mg de EDC, y se ajusta el pH a 6.5 con ácido clorhídrico 0.1N. Se continúa la incubación durante aproximadamente 16 horas a 4°C mientras se agita. Las microcápsulas rellenadas con gas, a las cuales se ha unido HO-POE-NH2, se separan por flotación repetida de HO-POE-NH2 no unido y los subproductos. Se une 70% de HO-POE-NH2 utilizado, a las microcápsulas (Colorimetrische Methode mittels Iod-PEG Komplex [Colorimetric Method Using Iodine-PEG Complex] , de acuerdo con G. E. C. Sims, T. J. A. Snope, Ann. Biochem., 107, 60-63 (1980)).
Ejemplo 12: Unión de L-selectina a microcápsulas rellenadas con gas funcionalizadas
La suspensión de microcápsulas de acuerdo con el ejemplo 6(b2) se purifica por flotación con por lo menos 5x a partir de una solución Triton-XlOO 0.02%. Se vuelve a amortiguar 1 ml de suspensión de microcápsula purificada con una concentración de 5 x 109 partículas por ml, en 10 mmoles de acetato, pH 4.0 y se activa con EDC/NHS 0.1M. Posteriormente, se incuba con 0.25 mg de proteína G (exceso 5X) durante una hora a temperatura ambiente. La reacción finaliza durante una incubación de 15 minutos con etanolamina 1 M.
Las microcáps as rellenadas con gas, a las cuales se une la proteína G, se purifican por lavado repetido por medio de centrifugado a un máximo de 500 g. Las microcápsulas unidas a proteína G rellenadas con gas y purificadas se incuban durante la noche con 100 µg de 1 g de L-selectina quimera. Se une 50% de la cantidad de L-selectina a las microcápsulas (medición FACS: serie de saturación con anticuerpos contra selectina) .
Ejemplo 13 Unión de estreptavidina a microcápsulas rellenadas con gas y funcionalizadas, con acoplamiento subsecuente a partículas de biotina-oro.
La suspensión de microcápsulas de acuerdo con el ejemplo 6(b2) se purifica por flotación con por lo menos 5x a partir de una solución Triton-XlOO 0.02%. Se mezcla 1 ml de suspensión de microcápsulas purificadas con una concentración de 5x 109 partículas por ml, con 1 ml de una solución de estreptavidina 2%, y se agita durante 60 minutos a 4°C. Después se agregan 10 mg de EDC, y se ajusta el pH a 6.5 con ácido clorhídrico 0.1N. La incubación continúa durante aproximadamente 16 horas a 4°C mientras se agita. Las microcápsulas rellenadas con gas, a las cuales se une estreptavidina, se separan por flotación repetida a partir de proteína no unida y de subproductos.
Se mezclan 500 µl de microcápsula-estr fc&vidina-construcciones purificadas de esta manera, a temperatura ambiente, con 500 µl de una dispersión de partículas de biotina-albúmina-oro (Sigma Biochemicals) con un diámetro promedio de 17-23 nm. Se verifica un acoplamiento exitoso por medio de microscopía electrónica* (de transmisión) (figura 14) .
Ejemplo 14: Microcápsulas rellenadas con nitrógeno
(a) Producción de la dispersión primaria
Para propósitos de inyección, se cargan 500 ml de agua a contracorriente con nitrógeno, en un reactor de vidrio purgado con 1 1 de nitrógeno, con una relación de diámetro respecto a altura de 0.5 y se ajusta el pH a 1.5 al agregar ácido clorhídrico ÍN y se ajusta la temperatura del reactor a 290.5°K. Mientras se agita con un agitador propelente, se agregan 5.0 g de octoxinol y se agita hasta que se disuelve por completo el octoxinol . Por medio de un tubo de vidrio se dirige nitrógeno al interior de la solución, durante 24 horas. Después se agregan 7 g de éster butílico de ácido cianoacrílico, en gotas, a contracorriente en nitrógeno bajo las mismas condiciones de agitación, durante un período de 15 minutos, y se agita durante otras 2 horas.
b) Producción de la suspensión de microcápsula
La dispersión primaria se dispersa en una contracorriente de nitrógeno durante 2 horas con un equipo Ultraturrax (por ejemplo IKA, tipo T25) con gradientes de alto cizallamiento (velocidad libre del equipo Ultraturrax de aproximadamente 20,500 min"1). Por dispersión, se lleva a cabo una autogasificación del medio de proceso con el resultado de una fuerte formación de espuma. Después de finalizar la reacción, se forma una capa acremada de microcápsulas rellenadas con gas. El material que flota se separa del medio de reacción y se capta con 375 ml de agua, el cual se ha saturado previamente con argón. Posteriormente en una contracorriente con argón, se decantan hasta 10 g de cada uno, y se sellan hermético a gases. La suspensión que se obtiene de esta manera contiene microcápsulas en un intervalo de 0.5-10 µm (difractómetro láser de Malvern Instruments Company, tipo MastersizerS) .
c) Detección de rellenado con nitrógeno
La detección de nitrógeno se realiza con la ayuda de espectroscopia Raman (dispositivo: Dilor Labram) en la cámara de gas por encima de la suspensión de microcápsula directamente
en el recipiente de vi4rio. Para este fin, se realiza una primera medición en el in?a(^ralo de 2200 a 2400 cm"1 y 50 a 150 cm"1 (valor nulo) . Después se destruyen las microcápsulas con ayuda de ultrasonido (baño de ultrasonido durante 30 minutos, dispositivo: Bandelin Sonorex), y se mide nuevamente. Después de que se han destruido las microcápsulas, la banda de vibración de N2 a 2300 cm"1 y las bandas de rotación específicas para N2 de 50 a 150 cm"1 se pueden ver con claridad.
Ejemplo 15 Microcápsulas rellenadas con gas funcionalizadas Monómero funcional de metacrilato de glicidilo
(a) Producción de la dispersión primaria
Para propósitos de inyección, se cargan 500 ml de agua en un reactor de vidrio de 1 1 con una relación de diámetro respecto a altura de 0.5, y se establece un pH de 1.5 al agregar ácido clorhídrico ÍN, y se establece una temperatura de reactor de 290°K. Mientras se agita con un agitador propelente, se agregan 5.0 g de octoxinol y se agita hasta que se disuelve por completo el octoxinol. Se mezclan 6.0 g de éster butílico del ácido cianoacrílico con 1.0 g de metacrilato de glicidilo (2, 3-epoxipropilmetacrilato) y además de 100 mg de AlBN (azo-bis-isobutironitrilo) se disuelve en la mezcla bajo una atmósfera de nitrógeno seco.
Posteriormente la mezfgi© se agrega en gotas a una solución acida de octoxinol, durante un período de 15 minutos mientras se agita con un agitador propelente - sin autogasificación, y se agita durante otras 24 horas a 318°K. La dispersión primaria que se obtiene se mide por medio de dispersión dinámica de luz (dispositivo: Nico p Submicron Particle Sizer) y muestra nanopartículas en un intervalo de 30 a 200 nm.
(b) Producción de la suspensión de microcápsula
La dispersión primaria se dispersa durante 2 horas con un equipo Ultraturrax (por ejemplo IKA, tipo T25) con gradientes de alto cizallamiento (velocidad libre del equipo Ultraturrax de aproximadamente 20,500 min"1). Mediante la dispersión, la autogasificación del medio de proceso se lleva a cabo con el resultado de una fuerte formación de espuma. Después de finalización de la reacción, se forma una capa acremada de microcápsulas rellenadas con gas. Para propósitos de inyección, el material que flota se separa del medio de reacción y se capta con 375 ml de agua. La suspensión de microcápsulas que se obtiene de esta manera contiene microcápsulas en un intervalo de 0.5-10 µm (difractómetro láser de Malvern Instruments Company, tipo MastersizerS) .
Ejemplo 16: MicrocápsT^éto-S rellenadas con gas funcionalizadas
(a) Producción de la dispersión primaria
Para propósitos de inyección, se cargan 500 ml de agua en un reactor de 1 1 con una relación de diámetro respecto a altura de 0.5, y se establece un pH de 1.5 al agregar ácido clorhídrico ÍN, y se establece una temperatura de reactor de 283°K. Mientras se agita con un agitador propelente, se agrega 5.0 g de octoxinol hasta que el octoxinol se disuelve por completo. Se mezclan 6.0 g de éster butílico de ácido cianoacrílico con 1.0 g de 4-aminoestireno y se agrega en gotas a la solución acida de octoxinol durante un período de 15 minutos mientras se agita con un agitador propelente - sin autogasificación. La mezcla de reacción se irradia con una lámpara UV de laboratorio y se agita durante otras 24 horas a 283 °K. La dispersión primaria que se obtiene se mide por medio de dispersión dinámica de luz (dispositivo: : Nicomp Submicron Particle Sizer) y muestra nanopartículas en un intervalo de 50 a 200 nm.
(b) Producción de la suspensión de microcápsula
La dispersión primaria se dispersa durante 2 horas
con un equipo Ultraturrax (por ejemplo IKA, tipo T25) con gradientes de alto cizallamiento (velocidad libre del equipo Ultraturrax de aproximadamente 20,500 min"1). Mediante la dispersión, la autogasificación del medio de proceso se lleva a cabo con el resultado de una fuerte formación de espuma. Después de finalización de la reacción, se forma una capa acremada de microcápsulas rellenadas con gas. Para propósitos de inyección, el material que flota se separa del medio de reacción y se capta con 375 ml de agua. La suspensión de microcápsulas que se obtiene de esta manera contiene microcápsulas en un intervalo de 0.5-10 µm (difractómetro láser de Malvern Instruments Company, tipo MastersizerS) .
Ejemplo 17: Microcápsulas rellenadas con gas funcionalizadas Monómero funcional de iniciador azo de polietilenglicol Inisurf (PEGA200)
(a) Producción de la dispersión primaria
Para propósitos de inyección, se cargan 500 ml de agua en un reactor de 1 1 con una relación de diámetro respecto a altura de 0.5, y se ajusta el pH de 1.5 al agregar ácido clorhídrico IN, y se ajusta la temperatura de reactor de 290°K. Mientras se agita con un agitador propelente, se agrega 5.0 g de octoxinol hasta que el octoxinol se disuelve por completo.
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Sé df.-|Sµelve 1.0 g de iß piador azo de polietietilenglicol ( [NC(CH3)2COO(CH2CH2?)5H]2) (Taiier, K. ; Polym. Adv. Techn. 6, 435 (1995)) en 6.0 g de éster butílico de ácido cianoacrílico a temperatura ambiente. Después la mezcla se agrega en gotas a una solución acida de octoxinol, durante un período de 15 minutos mientras se agita con un agitador propelente - sin autogasificación, y se agita durante otras 24 horas a 318°K. La dispersión primaria que se obtiene se mide por medio de dispersión dinámica de luz (dispositivo: : Nicomp Submicron Particle Sizer) y muestra nanopartículas en un intervalo de 30 a 200 nm.
(b) Producción de la suspensión de microcápsula
La dispersión primaria se dispersa durante 2 horas con un equipo Ultraturrax (por ejemplo IKA, tipo T25) con gradientes de alto cizallamiento (velocidad libre del equipo Ultraturrax de aproximadamente 20,500 min"1). Mediante la dispersión, la autogasificación del medio de proceso se lleva a cabo con el resultado de una fuerte formación de espuma. Después de finalización de la reacción, se forma una capa acremada de microcápsulas rellenadas con gas. Para propósitos de inyección, el material que flota se separa del medio de reacción y se capta con 375 ml de agua. La suspensión de microcápsulas que se obtiene de esta manera contiene
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microcápsulas en un intervalo de 0.5-10 µm (difractórttifcro láser de Malvern Instruments Company, tipo MastersizerS) .
Ejemplo 18: Unión del anticuerpo MECA79 a microcápsulas rellenadas con gas y funcionalizadas.
La suspensión de microcápsulas de acuerdo con el ejemplo 6(b2) se purifica por flotación con por lo menos 5x de solución Triton-XlOO 0.02%. Se vuelve a amortiguar 1 ml de suspensión de microcápsulas purificadas con una concentración de 5 x 109 partículas por ml, en 10 mmoles de acetato, pH 4.5, y se activa con EDC/NHS 0.1 M. Después se incuba con 0.25 mg de estreptavidina (exceso 5x) durante una hora a temperatura ambiente. La reacción finaliza durante incubación por 15 minutos con etanolamina 1 M. Las microcápsulas rellenadas con gas, a las cuales se ha unido estreptavidina, se purifican por lavado repetido por medio de centrifugado a un máximo de 500 g. Las microcápsulas rellenadas con gas y purificadas ahora unidas a biotina se incuban durante 1 hora con 1 mg del anticuerpo MECA79 biotinados y después se lavan. Las microcápsulas control se producen de manera análoga con el uso de anticuerpos de isotipo IgM biotinados (clon R4-22) . Se unen 50% de las cantidades de anticuerpos utilizados a las microcápsulas (medición FACS: serie de saturación con anticuerpos contra IgM-FITC) .
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. El anticuerpo MECA79 detecta el "nodulo periférico de adresina", un grupo de ligaqo que se presenta de manera constitutiva solo en las vénulas altamente endoteliales de los nodulos linfáticos periféricos y mesentéricos.
Ejemplo 19: Detección in vivo y detección sonográfica de la concentración específica de las microcápsulas de MECA79-anticuerpo-polímero en nodulos linfáticos periféricos y mesentéricos . Se inyecta intravenosamente a ratones NMRI con dispersión acuosa isotónica y 100 µl de una suspensión de microcápsulas de MECA79-anticuerpo-polímero del ejemplo 18 (107 partículas por kg de peso de ratón) . Los ratones control recibieron cantidades comparables de una suspensión de microcápsulas de isotipo-IgM-anticuerpo-polímero. Después de 30 minutos, se sacrifica a los animales. Se extirpan los nodulos linfáticos periféricos y mesentéricos, el bazo y los riñones, y se embeben en un lecho de gel como una formación de imagen fantasma. La detección de las microcápsulas se lleva a cabo por exploración de la figura fantasma en el modo Doppler de armónicas de color. En el bazo de ambos grupos de animales (los tratados con MECA79 y el control de isotipo) se encuentran señales de microcápsulas comparables cuantitativamente que muestran que los macrófagos del bazo captan el medio de contraste de una manera no específica. En el riñon, no se
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encuentran señales de microcápsulas. En los nodulos linfáticos periféricos y mesentéricos, sin embargo, las señales de las microcápsulas se encuentran únicamente en el grupo de animales tratado con anticuerpo MECA79 (figura 15A) , pero no en el grupo de animales control de isotipo (figura 15B) -- una detección para la concentración específica de las construcciones de MECA79-anticuerpo-microcápsula.
Ejemplo 20: Unión de anticuerpos contra CD105 de ratón a microcápsulas rellenadas con gas funcionalizadas
Los anticuerpos contra CDl05 de ratón se unen de manera análoga al ejemplo 18 a microcápsulas rellenadas con gas funcionalizadas .
Ejemplo 21: Detección in vivo y detección sonográfica de la concentración específica de microcápsulas con polímeros de anticuerpo contra CDl05 de ratón en tumores
Las suspensiones de microcápsulas con polímero de anticuerpo contra CD105 de ratón, de acuerdo con el ejemplo 20, se estudian en el modelo de tumor F9 en ratones atímicos. La sustancia de prueba en estado no anestesiado se administra por vía intravenosa en una sola inyección a una dosis de 2.1 x 107 partículas por kg de peso corporal a dos ratones atímicos que
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presentan tumor. Dos ratones control recibieron mierocápsulas-estreptavidina-construcción, de acuerdo con el ejemplo 13 a la misma dosificación. Después de 30 minutos, se sacrifican los animales. Se extirpan los tumores y se estudian sonográficamente ex vivo en un tanque acuoso con un dispositivo de ultrasonido de la compañía ATL (tipo UM9, transductor L10-5) en una armónica de color Doppler con el uso de una amplitud sónica elevada. La figura 16B muestra una codificación de color en el tumor de un ratón que se inicia desde las microcápsulas rellenadas con gas irradiadas, de acuerdo con el ejemplo 20. La figura 16A está libre de señales de color que se inducen por microcápsulas que muestran la sustancia de control . Esta es una detección de una concentración específica de construcción de microcápsula de polímero de anticuerpo contra CD105 en el tumor .
Ejemplo 22: Unión de anticuerpos contra ICAM-1 de ratón a microcápsulas rellenadas con gas y funcionalizadas
Se unen anticuerpos contra ICAM-1 de ratón a microcápsulas rellenadas con gas funcionalizadas, de manera análoga al ejemplo 18. Se producen de manera análoga microcápsulas control, con el uso del anticuerpo para el isotipo IgG biotinado.
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Ejemplo 23: Detección in vivo y detección sonográfica de la concentración específica de microcápsulas de polímero con anticuerpo contra ICAM-1 de ratón en el cerebro y en la médula espinal
Las suspensiones de microcápsulas de polímero de anticuerpo contra ICAM-1 de ratón, de acuerdo con el ejemplo 22, se estudian en el modelo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) del ratón. La sustancia de prueba en el estado no anestesiado se administra por vía intravenosa en una sola inyección a una dosis de 1 x 109 partículas por kg de peso corporal , a dos ratones . Los dos ratones control recibieron cantidades comparables de una suspensión de microcápsula de polímero de anticuerpo contra isotipo IgG. Después de 4 horas, los animales se sacrifican. Se extirpan el cerebro y la médula espinal y se estudian sonográficamente ex vivo en un tanque de agua con un dispositivo de ultrasonido de la compañía ATL (tipo UM9, transductor L10-5) en la armónica de color Doppler con el uso de una amplitud sónica elevada. La figura 17B y la figura 18, 2B, muestran una codificación de color en el cerebro y médula espinal/cerebelo de un ratón EAE que inicia a partir de microcápsulas rellenadas con gas e irradiadas de acuerdo con el ejemplo 22. La figura 17A y la figura 18, 2A están libres de
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señales de color que se induzcan por micropartículas y muestran la sustancia control. (Figura 18, 2: imagen sintetizada de imágenes en sección transversal de la médula espinal/cerebelo explorados; figura 18, 1: imagen anatómica macroscópica de la médula espinal/cerebelo) . Esta es una detección de la concentración específica de las construcciones de microcápsula con polímero y anticuerpo contra ICAM-1 de ratón en el cerebro y médula espinal.
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Claims (37)
1. Microcápsulas rellenadas con gas, caracterizadas porque estás últimas contienen cianoacrilato de polialquilo funcionalizado.
2. Las microcápsulas rellenadas con gas, como se describen en la reivindicación 1, en donde el cíanoacrilato de polialquilo funcionalizado se produce por copolimerización de uno o más cianoacrilatos de alquilo con un monómero funcional.
3. Las microcápsulas rellenadas con gas, como se describen en la reivindicación 2, en donde se utiliza como un monómero funcional: ácido cianoacrílico (H2OC (CN) -CO-OH) , ácido metacrílico (H2C=C (CH3) -CO-OH) , ácido metilenmalóníco (H2C=C (CO-OH) 2) y ácido a-cianosórbico (H3C-CH=CH-CH=C (CN) -COOH) o sus derivados, con las fórmulas generales: H2C=C (CN) -CO-X-Z (derivados de ácido cianoacrílico), H2C=C (CH3) -CO-X-Z (derivados de ácido metacrílico), H2C=C (CO-X ' -Z ' ) 2 (derivados de ácido metilenmalónico) y H3C-CH=CH-CH=C(CN) -CO-X-Z (derivados de ácido a-cianosórbico) con X = -O-, -NH- o -NR1- y Z = -H, -R2-NH2, -R2 -NH-R1, -R2-SH, R2-OH, R2-HC (NH2) -R1 • »??a ?, ,t^A? ?m umm tÉmiÉ? ^/^m -?áú liii •CH2- ACH-CH2, -CH2-C AH-CHR1, en donde R1 = radical alquilo lineal o ramificado y R2 = radical alquileno lineal o ramificado respectivamente con 1 hasta 20 átomos de carbono y en donde tanto X' como Z1, en cada caso, independientemente uno de otro, tienen el significado que se indica para X y Z. estírenos sustituidos (Y-C6H4-CH=CH2) o metilestirenos (Y-C6H4-C(CH3)=CH2) con Y=-NH2, -NRXH, -OH, -SH, -R2-NH2, -R2-NH-R1, -R2-SH, R2-0H, -R2-HC(NH2) -R1 en donde R1 = radical alquilo lineal o ramificado y R2 = radical alquileno lineal o ramificado, respectivamente con 1 hasta 20 átomos de carbono o emulsificantes polimerizables (Surfmer) , iniciadores con funcionalidad (Inisurf) y agentes de transferencia de cadena con funcionalidad (Transsurf) .
4. Las microcápsulas rellenadas con gas, como se describen en la reivindicación 3, en donde, como un monómero funcional, se utiliza ácido cianoacrílico (HC=C(CN) -CO-OH) ^*É_^..^ JBiilMte.^, , .,-...-¿. ^.^..^^..-i.^^-^*^^ o metacrilato de glicidilo (H2C=C (CH3) -CO-0-C AH2-CH-CH2=2 , 3-epoxipropilmetacrilato .
5. Las microcápsulas rellenadas con gas, como se describen en la reivindicación 2, en donde se utiliza cianoacrilato de butilo, de etilo o de isopropilo, como un cianoacrilato de alquilo.
6. Las microcápsulas rellenadas con gas, como se describen en la reivindicación 1, en donde el cianoacrilato de polialquilo funcionalizado se produce por hidrólisis parcial de cadena lateral de un cianoacrilato de polialquilo.
7. Las microcápsulas rellenadas con gas, como se describen en la reivindicación 6, en donde el cianoacrilato de butilo, dietilo o de isopropilo se utiliza para la producción de cianoacrilato de polialquilo.
8. Proceso para la producción de microcápsulas rellenadas con gas, como se describen en las reivindicaciones 1 a 5, en donde se realizan las siguientes etapas de proceso: (a) Mezclado del monómero funcional con uno o más cianoacrilatos de alquilo, -^•n iÉÉii ii i iü ¡^^ j ^j ** (b) y acumulación de microcápsulas bajo condiciones de dispersión en una etapa de proceso.
9. Proceso para la producción de microcápsulas rellenadas con gas, como se describen en las reivindicaciones 1 a 5, en donde se realizan las siguientes etapas de proceso: (a) Mezclado del monómero funcional con uno o más cianoacrilatos de alquilo, (b) Copolimerización in si tu, en solución acuosa acida, bajo condiciones de agitación, y (c) Acumulación de microcápsulas bajo condiciones de dispersión, de manera separada de la copolimerización.
10. Proceso para la producción de microcápsulas rellenadas con gas, como se describen en las reivindicacioner 1, 6 o 7, en donde se realizan las siguientes etapas de proceso: (a) Polimerización in si tu de uno o más cianoacrilatos de alquilo y acumulación de microcápsulas en solución acuosa acida bajo condiciones de dispersión en una etapa de proceso, (b) Implementación de hidrólisis parcial de cadena lateral por adición de lye, (c) Detención de la reacción por la adición de ácido.
11. Proceso para la producción de microcápsulas rellenadas con gas, como se describen en las reivindicaciones 1 6, o 7, en donde se realizan las siguientes etapas de proceso: (a) Polimerización in si tu de uno o más cianoacrilatos de alquilo en solución acuosa acida, bajo condiciones de agitación, (b) Acumulación de microcápsulas bajo condiciones de dispersión, de manera separada de la copolimerización, (c) Implementación de hidrólisis parcial de cadena lateral por adición de lye, (d) Detención de la reacción por adición de ácido.
12. Proceso para la producción de microcápsulas rellenadas con gas, como se describen en las reivindicaciones 1, 6 o 7, en donde se realizan las siguientes etapas de proceso: (a) Polimerización in si tu de uno o más cianoacrilatos de alquilo en solución acuosa acida, bajo condiciones de agitación, (b) Implementación de hidrólisis parcial de cadena lateral por adición de lye en dispersión primaria, (c) Detención de la reacción por adición de ácido, (d) Acumulación de microcápsulas bajo condiciones de dig^trsión opcionalmente con adición renovada de uno o má-f¡ íl.. cianoacrilatos de alquilo.
13. Proceso para la producción de microcápsulas rellenadas con gas, como se describen en una de las reivindicaciones 8 a 12, en donde se realizan opcionalmente las siguientes etapas de proceso: (a) Después de que se ha llevado a cabo la acumulación de microcápsulas, una o más flotaciones con captación subsecuente del material que flota, en un medio fisiológicamente compatible, (b) Incluso en el caso en el que ya se haya realizado la funcionalización por copolimerización con un monómero funcional, una funcionalización adicional por hidrólisis parcial de cadena lateral al agregar lye y retener la reacción por la adición de ácido, (c) Filtración, ultrafiltración o centrifugación para purificación.
14. El proceso como se describe en una de las reivindicaciones 10 a 13, en donde la hidrólisis parcial de cadena lateral se realiza a valores de pH de entre 9 y 14 y un tiempo de reacción de entre 15 minutos y 5 horas.
15. El proceso como se describe en una de las ...... ^HljMe....^.-,..^ ^ ^ 10 a 14, en donde la hidrólisis parcial de cadena lateral se detiene en donde se establece un pH inferior a 7 por la adición de ácido.
16. El proceso como se describe en una de las reivindicaciones 10 a 15, en donde el monómero o los monómeros se agregan a solución acuosa acida, a una concentración de 0.1 a 60%, preferiblemente 0.1 a 10%.
17. El proceso como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 16, en donde se utilizan uno más de los siguientes tensioactivos: Sales alcalinas de alquilarilpoli (oxietileno) sulfato, dextranos, poli (oxietilenos) , polímeros de bloque de poli (oxipropileno) -poli (oxietileno) , alcoholes grasos etoxilados (cetomacrogoles) , ácidos grasos etoxilados, alquilfenolpoli (oxietilenos) , copolímeros de alquilfenolpoli (oxietileno) (s) y aldehidos, esteres de ácido graso parcial de sorbitano, esteres de ácido graso parcial de poli (oxietilen) sorbitano, esteres de ácido graso de poli (oxietileno) , éteres de alcohol graso de poli (oxietileno) , esteres de ácido graso de sacarosa o éster de macrogolglicerol, alcoholes polivinílicos, esteres de ácido graso de poli (oxietilen) hidroxi, macrogoles de alcoholes multivalentes, y esteres ácidos grasos parciales.
18. El proceso como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 17, en donde se utilizan uno o más de los siguientes tensioactivos: nonilfenoles etoxilados, octilfenoles etoxilados, copolímeros de aldehidos y octilfenolpoli (oxetileno) , esteres de ácido graso parcial de glicerol etoxilado, aceite de ricino hidrogenado etoxilado, hidroxiestearato de poli (oxietileno) , polímeros de bloque de poli (oxipropileno) -poli (oxietileno) con una masa molar < 20,000.
19. El proceso como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 18, en donde se utilizan uno o más de los siguientes tensioactivos: Para-octilfenol-poli (oxietileno) con 9-10 grupos etoxi en promedio (=octoxinol 9,10), para-nonilfenol-poli (oxietileno) con 30/40 grupos etoxi en promedio (= por ejemplo EmulanMR SO/Emulan"* 40) , sal de sodio de sulfato de para-nolilfenol-poli (oxietileno) con 28 grupos etoxi en promedio (= por ejemplo Disponil"1* AES) , monoestearato de poli (oxietilen) glicerol (por ejemplo TagatMR S) , alcohol polivinílico con un grado de polimerización de 600-700 y un grado de hidrólisis de 85%-90% (= por ejemplo MowiolMR 4-88) , éster de ácido poli (oxietilen) -660-hidroxiesteárico (= por ejemplo SolutolMR HS 15) , copolímero de formaldehído y para-octilfenol-poli (oxietileno) (= por ejemplo Tritón"11 WR1339) , polímeros de bloque de polioxipropileno-polioxietileno con una masa molar de aproximadamente 12,000 y una proporción de polioxietileno de aproximadamente 70% (= por ejemplo Lutol"1* F127) , alcohol cetilestearílico etoxilado (= por ejemplo CremophorMR A25) , aceite de ricino etoxilado (= por ejemplo CremophorMR EL) .
20. El proceso como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 19, en donde el tensioactivo o los tensioactivos se utilizan a una concentración de 0.1 a 10%.
21. El proceso como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 20, en donde se utilizan los siguientes ácidos: ácido clorhídrico, ácido fosfórico o ácido sulfúrico.
22. El proceso como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 21, en donde la polimerización y la acumulación de microcápsulas se llevan a cabo a temperaturas de -10°C hasta 60°C, preferiblemente en el intervalo entre 0°C y 50°C, de manera especialmente preferible entre 5°C y 35°C.
23. El proceso como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 22, en donde el período de polimerización y la acumulación de microcápsulas está entre 2 minutos y 2 horas. -__________ __ ___-,>-- M__-_t_fc ^,_^_______h_-M__..^-^ ^__._-_. .^_->_. „»_«.,— • -
24. El procesfo- como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 23, en donde las microcápsulas rellenadas con gas se separan del medio de reacción por flotación, captación en un medio fisiológicamente compatible y 5 opcionalmente liofilizado después de que se ha agregado un crioprotector.
25. El proceso como se describe en la reivindicación 24, en donde se utiliza agua o solución salina común 10 fisiológica para la captación del material que flota.
26. El proceso como se describe en la reivindicación 24, en donde se utiliza un crioprotector, polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico, gelatina o albúmina sérica humana. 15
27. Las microcápsulas rellenadas con gas, en donde se pueden obtener de acuerdo con el proceso de una de las reivindicaciones 8 a 26. 20
28. Las microcápsulas rellenadas con gas, como se describen en una de las reivindicaciones 1 a 7 o de acuerdo con la reivindicación 27, en donde esta última contiene moléculas que se unen específicamente o las sustancias que alteran la cinética. 25
29. Las microcápsulas rellenadas con gas, como se describen en una de las reivindicaciones 1 a 7 o de acuerdo con la reivindicación 27, en donde estas últimas se acoplan con moléculas que se unen específicamente o las sustancias que alteran la cinética.
30. Las microcápsulas rellenadas con gas, como se describen en la reivindicación 28 o 29, en donde estas últimas se utilizan como moléculas que se unen específicamente, anticuerpos, preferiblemente anticuerpos contra EDB-FN, anticuerpos contra endostatina, anticuerpos contra CollXVIII, anticuerpos contra CM201, anticuerpos contra el ligando de L-selectina, tales como anticuerpos contra PNAd (anticuerpos MECA79) , anticuerpos contra CD105, anticuerpos contra ICAM1 o ligandos endogénicos, preferiblemente L-selectina, y de manera especialmente preferida quimera de L-selectina.
31. Las microcápsulas rellenadas con gas, como se describen en la reivindicación 28 o 29, en donde, como sustancias que alteran la cinética, los polímeros sintéticos, preferiblemente polietilenglicol (PEG) , proteínas, preferiblemente albúmina sérica humana o sacáridos, preferiblemente dextrano, están contenidos o se acoplan a estos últimos. m**~^???M *~M
32. Las microcápsulas rellenadas con gas, como se describen en las reivindicaciones 29 a 31, en donde las moléculas que se unen específicamente o las sustancias que alteran la cinética se acoplan directamente a los grupos funcionales de los cianoacrilatos de polialquilo funcionalizados .
33. Las microcápsulas rellenadas con gas, como se describen en las reivindicaciones 29 a 31, en donde las moléculas que se unen específicamente o las sustancias que alteran la cinética se acoplan, vía un separador, por ejemplo proteína G, a los grupos funcionales del cianoacrilato de polialquilo funcionalizado.
34. Las microcápsulas rellenadas con gas, como se describen en las reivindicaciones 29 a 31, en donde las moléculas que se unen específicamente o las sustancias que alteran la cinética se someten a biotinación por medio de acoplamiento de estreptavidina-biotina a los grupos funcionales del cianoacrilato de polialquilo funcionalizado.
35. Las microcápsulas rellenadas con gas, como se describen en las reivindicaciones 28 a 34, en donde están activados los grupos funcionales del cianoacrilato de polialquilo funcionalizados.
36. Las microcápsulas rellenadas con gas, como se describen en las reivindicaciones 28 a 35, en donde los grupos funcionales del cianoacrilato de polialquilo funcionalizado se activan por EDC (clorhidrato l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida) .
37. El uso de microcápsulas rellenadas con gas, como se describe en las reivindicaciones 1 a 7 y 27 a 36, para diagnóstico por ultrasonido. -..^.....; t !___*__.___—__ ..._«__,_._. rc m
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