MXPA02007818A - Tasa de implantacion mejorada utilizando ff-mas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona al uso del FF-MAS o sus analogos para incrementar la tasa de implantacion de embriones en estado de pre-implantacion.

Description

TASA DE IMPLANTACIÓN MEJORADA UTILIZANDO FF-MAS La presente invención se relaciona con un método de aumentar el tasa de implantación de embriones en estado de pre-implantación. La fertilización del óvulo de mamíferos está precedida por la maduración del oocito. Este proceso de maduración en los oocitos de mamíferos incluye cambios nucleares y citoplásmicos . La primera división meiótica de la profase I a la metafase II es reiniciada y completada. Se conoce muy poco del mecanismo que controla el inicio de la meiosis. La presencia de una sustancia reguladora de la eiosis difusible fue descrita primeramente por Byskov et al. en un sistema de cultivo de gónadas fetales de ratón (Byskov, A. G. et al. Dev Biol 52 (1976) 193-200) . Una sustancia activadora de la meiosis (MAS por sus siglas en inglés) era secretada por el ovario fetal de ratón en el cual la meiosis estaba ocurriendo, y una sustancia bloqueadora de la meiosis (MPS por sus siglas en inglés) era liberada por el testículo morfológicamente diferenciado con células germinales no meióticas en descanso. Se sugirió que las concentraciones relativas de MAS y MPS regularon el inicio, detención y reasunción de la meiosis en las células germinales masculinas y femeninas (Byskov, A.G. et al. en The Phisiology of Reproduction [editores Knobil.E y Neill, J.D., Raven Press, Nueva York (1994)]). Algunos esteróles (T-MAS y FF-MAS) que activan la meiosis . oocitica han sido aislados de testículos de toro y de fluido folicular humano (Byskov, A.G. et al. Nature 374 (1995), 559-562).

En experimentos de fertilización in vi tro (IVF por sus siglas en inglés) con oocitos de ratón, el FF-MAS ha mostrado incrementar la tasa de fertilización cuando se le agrega al medio de cultivo (Hegele-Hartung, C et al., Hum Reprod 13 (suppl) : 98 (1998 ) ) . Los primeros datos clínicos son oocitos humanos mostraron una mejora en la maduración nuclear y citoplásmica (Gretndahl, C et al, 1999, Proceedings from The Second International Alpha Congress) . Desafortunadamente, el FF-MAS es bastante inestable. Por esto, se desarrollaron análogos sintéticos estables. Estos compuestos que se conoce regulan la meiosis se describen en los documentos de las solicitudes internacionales de patente WO 96/00235, WO 96/27658, WO 97/00884, WO 989/28323, WO 98/52965 y WO 98/55498.

Después de la fertilización de los oocitos y del desarrollo del pre-embrión, el pre-e brión tiene que implantarse en el endometrio. La tasa de implantación del procedimiento de IVF usado en el presente es relativamente bajo. Tan sólo aproximadamente 15-25% de los embriones en estado de pre-implantación se implantan. En consecuencia, seria deseable tener un método para mejorar la tasa de implantación después del procedimiento de IVF.

La causa de infertilidad e? las mujeres es también .muy a menudo el bajo tasa de implantación del embrión en estado de pre-implantación. Por esto, se necesita un tratamiento in vivo que mejore la tasa de implantación .

- La presente invención proporciona métodos para aumentar la tasa de implantación de embriones en estado de pre-implantación en hembras, preferiblemente humanas, ün objeto de la presente invención es el uso del FF-MAS y/o uno ó más análogos del FF-MAS para aumentar la tasa de implantación de embriones en estado de pre-implantación.

El FF-MAS es 4 , 4-dimetil-5a-colesta-8 , 1 , 24-trieno-3ß-ol . Su síntesis se describe en el documento WO 99/52930. Los análogos del FF-MAS tienen un porcentaje de ruptura de vesícula germinal (GVB por sus siglas en inglés) que es significativamente más alto que el control. Los análogos, del FF-MAS preferibles son aquellos que tienen un porcentaje de GVB de al menos 50%, preferiblemente al menos 80%. Tasa de implantación significa la tasa por el cual un embrión en estado de pre-implantación es capaz de interactuar con el endometrio suscitando en consecuencia el desarrollo de un embrión post-implantación y un feto.

El FF-Mas y/o uno ó más análogos del FF-MAS pueden ser agregados a un medio usado en fertilización in vitro . El procedimiento de IVF se lleva a cabo en una manera conocida. Más detalles respecto a sacar oocitos de los folículos en los ovarios, cultivo de los oocitos aislados, el medio de cultivo a ser usado, la fertilización con esperma y la transferencia del embrión a la trompa de Fallopio se puede encontrar en la literatura, por ejemplo en el documento de la descripción de la solicitud de patente de los Estados Unidos N° 5,693,534 el cual se incorpora en el presente como referencia. Cuando el FF-MAS y/o uno ó más análogos del FF-MAS se agrega al medio de IVF, la tasa de implantación del embrión transferido aumenta en al menos 20%, preferiblemente en al menos 50%. La concentración del FF-MAS y/o uno ó más análogos del FF-MAS puede estar en el rango de aproximadamente 0.1-100µmol/l.

El FF-MAS y/o uno ó más análogos del FF-MAS también pueden ser usados in vivo aplicándolo ó aplicándolos a hembras. El FF-MAS y/o uno ó más análogos del FF-MAS pueden ser usados para la preparación de un medicamento que incrementa la tasa de implantación de oocitos .

Cuando se administra a una mujer antes ó durante la ovulación, el FF-MAS y sus análogos incrementa la tasa de implantación en al menos 20%. Más preferiblemente, la tasa de implantación es incrementada en al menos 50%.

Debido al incremento en la tasa de implantación, la tasa de embarazos también será más alto. El medicamento de esta invención puede consecuentemente ser usado para tratar mujeres que tienen problemas con la infertilidad.

También puede ser usado para incrementar la tasa de implantación en animales lo cual es importante en la cria de animales.

Otro objeto de la presente invención son las composiciones farmacéuticas que comprenden el FF-MAS y/o uno ó más análogos del FF-MAS. Las composiciones pueden comprender además excipientes farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica como vehículos, diluyentes, reforzadores de absorción, preservativos, cubiertas, agentes para ajustar la presión osmótica, agentes desintegrantes de tabletas y otros ingredientes que son usados convencionalmente en la técnica. Ejemplos de vehículos sólidos son el carbonato de magnesio, estearato de magnesio, dextrina, lactosa, azúcar, talco, gelatina, pectina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, ceras de bajo punto de fusión y manteca de cacao.

Las composiciones liquidas incluyen soluciones estériles, suspensiones y emulsiones. Estas composiciones liquidas pueden ser adecuadas para inyecciones. Las composiciones liquidas pueden contener otros ingredientes que son usados convencionalmente en la técnica, algunos de los cuales se mencionan en la lista anterior. Además, una composición para administración transdérmica del FF-MAS y/o uno ó más análogos del FF-MAS puede ser proporcionada en la forma de un parche y una composición para administración nasal puede ser proporcionada en la forma de un roció nasal en forma líquida ó en polvo.

La dosis del FF-MAS y/o uno ó más análogos del FF-MAS a ser usada será determinada por el médico y dependerá entre otros factores en el compuesto en particular utilizado y en la vía de administración. En general, las composiciones de la invención se preparan poniendo íntimamente en asociación el compuesto activo con los ingredientes auxiliares sólidos ó líquidos y luego, si es necesario, formar el producto en la formulación deseada.

Usualmente, no más de 1000 mg, preferiblemente no más de 100 mg, y en algunas instancias preferibles no más de 10 mg del FF-MAS y/o uno ó más análogos del FF-MAS deberá ser administrada a mamíferos, por ejemplo a humanos, por día. El tratamiento puede ser continuo ó intermitente. El tratamiento intermitente preferiblemente comienza antes de la ovulación y se continúa hasta algunos días después de la ovulación.

La via de administración del FF-MAS y/o uno ó más análogos del FF-MAS puede ser cualquier via que lleve el compuesto ó compuestos activos a su sitio de acción.

Ejemplos de vias de administración son administración intravenosa, subcutánea, oral, intranasal ó transdérmica.

La presente invención será ilustrada en detalle en los ejemplos siguientes.

Ejemplo 1 : Método usado para elegir compuestos MAS Se obtuvieron oocitos de ratones hembra no maduros (C57BI/6J x DBA/2J Fl-hibridos, Bomholtgaard, Dinamarca) que pesaban de 13 a 16 gramos, que se mantuvieron bajo iluminación y temperatura controladas. Los ratones recibieron una inyección intra-peritoneal de 0.2 ml de -gonadotropinas (Gonal F, de Serono, en Solna, Suecia, que contiene 20 IU FSH [unidades internacionales de hormona folículo-estimulante por sus siglas en inglés], alternativamente, Puregon, de Organon, en Swords, Irlanda que contiene 20 IU FSH [unidades internacionales de hormona folículo-estimulante por sus siglas en inglés] ) y 48 horas más tarde los animales fueron sacrificados por medio de dislocación cervical.

Se diseccionaron los ovarios y se aislaron los oocitos en un medio Hx (ver debajo) bajo un microscópico estéreo por ruptura manual de los folículos usando un par de agujas de 27 gauge . Los oocitos desnudos (NO), esféricos que exhibían una vesícula germinal (GV) intacta se colocaron en un medio esencial a-mínimo ( -MEM sin ribonucleósidos, de Gibco BRL, N° de catálogo 22561) suplementado con 3mM de hipoxantina (de Sigma, N° de catálogo H-9377), 8 mg/ml de Albúmina de Suero Humano (HSA por sus siglas en inglés, de State Serum Institute, Dinamarca), 0.23 mM de piruvato de Sigma, N° de catálogo S-8636), 2 mM de glutamina (de Flow, N° de catálogo 16-801), 100 IU/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina (de Flow, N° de catálogo 16-700) . Este medio fue designado medio Hx. Los oocitos fueron enjuagados tres veces en el medio Hx en cápsulas múltiples de 4-secciones (de Nuncion, Dinamarca) en donde cada sección contenia 0.4 ml de medio HX y 35 a 45 oocitos. Un control (por ejemplo 35 a 45 oocitos cultivados en medio Hx sin la adición de un compuesto de prueba) se practicó siempre simultáneamente con los cultivos de prueba, los cuales fueron hechos con diferentes concentraciones de los compuestos a ser ensayados .

Los cultivos se llevaron a cabo a 37°C y 100% de humedad con 5% de C02 en el aire. El tiempo de cultivo fue de 22 a 24 horas.

Al final del periodo de cultivo, el número de oocitos con vesícula germinal (GV) ó ruptura de vesícula germinal (GVB) y aquellos con cuerpo polar (PB por sus siglas en inglés) fue cuantificado usando un microscopio estéreo ó un microscopio invertido con equipo de contraste de interferencia diferencial. El porcentaje de oocitos con GVB por número total de oocitos y el porcentaje de oocitos con PB por número total de oocitos se calculó en los cultivos de ensayo y se comparó con los cultivos de control .

%GVB= ( (número de GVB + número de PB) /número total de oocitos) xlOO Ejemplo 2: Mejora de implantación de embriones con FF-MAS y succinato de FF-MAS en las ratas en ciclo .

Se usaron un total de 15 ratas Wistar hembras sexualmente maduras con un peso corporal de 200-220 g y un ciclo de 4 días Se dividió a los animales en un grupo de control (grupo 1) y dos grupos de tratamiento (grupos 2-3) que consistían de 5 animales por grupo, respectivamente.

Comenzando en el metestro (día 1-dl) los animales fueron tratados por ocho días (día 1 a día 8- dl-d8), una vez al día, subcutáneamente con los compuestos de prueba (grupos de tratamiento) ó vehículo (grupo de control) , respectivamente. Al día 7, en el proestro, los animales fueron apareados. El éxito del apareamiento fue verificado por la presencia de espermatozoides en la vagina en el día 8 (d8) . En el día 16 (dlß) fueron sacrificados. Los úteros fueron retirados y examinados por la presencia de lados de implantación. En cada animal se determinó el número de lados de implantación.

El grupo 1 de control recibió el vehículo sólo (etanol/araquisoil, 1+9 (v/v) ) . El grupo 2 recibió 20 mg/kg de FF-MAS, preparado en un vehículo de etanol/araquisoil. El grupo 3 recibió 20 mg/kg de succinato de FF-MAS, preparado en un vehículo de etanol/araquisoil Los resultados están presentes en la Tabla 1.

Tabla 1: Efecto del tratamiento subcutáneo con FF-MAS y succinato de FF-MAS en la tasa de implantación en ratas en ciclo adultas . * el tratamiento ce «nienza en e^ . metestro jemplo 3 : Método para determinar la tasa de implantación después de la IVF Cultivo de oocitos de ratón Los oocitos se obtienen por punción usando una aguja fina de los ovarios de ratones impregnados con PMSG (gonadotropina de suero de yegua preñada por sus siglas en inglés) . Los oocitos se cultivan por aproximadamente 20 horas en un medio de cultivo que contiene hipoxantina definido (medio Hx, ver arriba) con FF-MAS (lOµM) (37°C) . Los oocitos de control se cultivan en un medio de cultivo definido sin FF-MAS por el mismo periodo de tiempo. Tanto los oocitos con FF-MAS como los oocitos de control han comenzado la maduración meiótica al final del periodo de cultivo. Todos los oociotos obtenidos por punción en un día (de varios ratones) son mezclados y distribuidos en los dos grupos de estudio.

Fertilización in vitro (IVF) en ratones Los oocitos cultivados en el ensayo de cultivo de oocitos se procesan adicionalmente en este experimento. Estos son lavados brevemente 3 veces en un medio definido que no contiene FF-MAS y subsecuentemente transferidos a un medio de IVF que no contiene FF-MAS. Luego, un número definido de espermatozoides capacitados (obtenidos de los epidídimos de ratones macho) se agregan y se incuban los oocitos con los espermatozoides por aproximadamente 4 horas en un incubador a 37 °C. Enseguida de la incubación, se cuenta el número de oocitos inseminados .

Retransferencia tubal en ratones Un día antes de la retransferencia ratones hembra receptores (madres sustitutos) en el preestro son apareadas con machos vasectomizados para activar la pseudogestación. Un día después se lleva a cabo una inspección vaginal. Los animales con una carga vaginal libre de espermatozoides (apareamiento exitoso) entran en el estudio. Este es el día 0 de gestación (=día 0 después de la copulación estéril) . Aproximadamente 10 a 15 oocitos inseminados son transferidos dentro de un tubo (derecho) en las madres sustituto en el día 0 después de la copulación estéril bajo anestesia. El tubo contrario lateral permanece sin usar (verificación de pseudogestación) . Sólo se usan oocitos inseminados del experimento de IVF.

Las madres sustituto son sacrificadas en el dia 17 de gestación. Se retiran los úteros. Se cuantifican el número de fetos viables y muertos, el número de madres sustituto, el número de madres sustituto preñadas y el número de madres sustituto preñadas con fetos viables y con muerte fetal total, respectivamente.

Los resultados se proporcionan en la Tabla 2.

Tabla 2: Retransferencia de embriones de dos células a madres sustituto después del tratamiento de oocitos de ratón con FF-MAS y fertilización in vitro subsecuente .

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Uso del FF-MAS y/o uno ó más análogos de FF-MAS para incrementar la tasa de implantación de embriones en estado de pre-implantación.

2. Uso según la reivindicación 1, en donde el FF-MAS y/o uno ó más análogos de FF-MAS se agregan a un medio usado en fertilización in vitro .

3. Uso según la reivindicación 1, en donde el FF-MAS y/o uno ó más análogos de FF-MAS se aplican a hembras .

4. Uso del FF-MAS y/o uno ó más análogos de FF-MAS para preparar un medicamento que incrementa la tasa de implantación de embriones en estado de pre-implantación.

5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la tasa de implantación se incrementa al menos en 20%.