MXPA02007730A

MXPA02007730A - Receptor de quimiocina de proteina g humana (ccr5) hdgnr10.

Info

Publication number: MXPA02007730A
Application number: MXPA02007730A
Authority: MX
Inventors: Yi Li
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 2000-02-09
Filing date: 2001-02-09
Publication date: 2002-10-11
Also published as: US20020048786A1; JP2003523744A; US20020061834A1; AU2001241463A1; WO2001058916A2; AU2001243145A1; EP1263791A2; KR20030032916A; WO2001058915A2; CA2399593A1; EP1263791A4; CN1227265C; WO2001058915A8; WO2001058916A3; CN1454216A; WO2001058915A3; US20030166024A1

Abstract

La presente invencion se refiere a una proteina humana novedosa llamada receptor de quimiocina de proteina G (CCR5) (HDGNR10), y polinucleotidos aislados que codifican esta proteina; la invencion tambien esta dirigida a anticuerpos humanos que se unen al receptor de quimiocina de proteina G (CCR5) (HDGNR10) y a polinucleotidos que codifican estos anticuerpos; tambien se proveen vectores, celulas hospedero, anticuerpos y metodos recombinantes para producir receptor de quimiocina de proteina G (CCR5) (HDGNR10) y anticuerpos de receptor de quimiocina de proteina G (CCR5) (HDGNR10) humanos y anti-humanos; la invencion tambien se refiere a metodos de diagnostico y terapeuticos para diagnosticar y tratar enfermedades, trastornos y/o condiciones relacionadas con esta proteina humana novedosa y estos anticuerpos humanos novedosos.

Description

RECEPTOR DE QUIMIOC1NA DE PROTEINA G HUMANA (CCR5) HDGNR10 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un gen humano novedoso que codifica un polipéptido que es un miembro de la familia de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Muy específicamente, la presente invención se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido humano novedoso denominado receptor de quimiocina de proteína G humana (CCR5) HDGNR10, referido aquí como "receptor de quimiocina de proteína G" o ?DGNR10". Esta invención también se refiere a polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), así como vectores, células hospedero, anticuerpos dirigidos a polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), y a los métodos recombinantes para producir los mismos. También se proveen métodos de diagnóstico para detectar enfermedades, trastornos y/o condiciones relacionadas con el sistema inmune e infección por VIH, y método terapéuticos para tratar, prevenir y/o diagnosticar tales enfermedades, trastornos y/o condiciones. La invención se refiere además a métodos de selección para identificar agonistas y antagonistas de receptor de quimiocina "de proteína G (CCR5). El receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también se conoce como CCR5.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Está bien establecido que muchos procesos biológicos importantes desde el punto de vista médico son mediados por proteínas que 5 participan en las vías de transducción de señales que implican proteínas G y/o segundos mensajeros, por ejemplo, AMPc (Lefkowitz. Nature, 35 :353-354 (1991)). En la presente, estas proteínas se refieren como proteínas que participan en vías con proteínas G o proteínas PPG. Algunos ejemplos de estas proteínas incluyen los receptores de GPC, tales como aquellos para 0 agentes adrenérgicos y dopamina (Kobilka, B.K., eí af., PNAS, 84:46-50 11987); Kobilka, B.K., et al., Science, 238:650-656 (1987); Bunzow, J.R., et al., ' ' Nature, 336:783-787 (1988)), las proteínas G mismas, proteínas efectoras, por ejemplo, fosfolipasa C, adenilo ciclasa y fosfodiesterasa, y proteínas actuadoras, por ejemplo, proteína cinasa A y proteína cinasa C (Simón, M.I., 5 eí al., Science, 252:802-8 (1991 )). Por ejemplo, en una forma de transducción de señal, el efecto de unión de hormona es la activación de una enzima, adenilato ciclasa, dentro de la célula. La activación de enzima por hormonas depende de la presencia del nucleótido GTP y GTP también influye en la unión de hormona. Una proteína 0 G conecta los receptores de hormona a la adenilato ciclasa. Se mostró que la proteína G intercambia GTP en vez de GDP de unión cuando es activada por receptores de hormona. La forma portadora de GTP entonces se une a la adenilato ciclasa activada. La hidrólisis de GTP a GDP, catalizada por la proteína G misma, regresa la proteína G a su forma inactiva basal. De esta manera, la proteína G tiene un doble papel, como un intermediario que regresa la señal del receptor al efector, y como un reloj que controla la duración de la señal. La superfamilia de receptores acoplados a proteína G del gen de proteína de membrana se ha caracterizado por tener siete dominios de - trasmembrana putativos. Se cree que los dominios representan hélices a de trasmembrana conectados por bucles extracelulares o citoplásmicos. Los receptores acoplados a proteína G incluyen una amplia gamma de receptores biológicamente activos, tales como receptores hormonales, virales, factor de J crecimiento y neurorreceptores. Los receptores acopiados a proteína G se han caracterizado por incluir estas siete .extensiones hidrofóbicas conservadas de aproximadamente ''' * 20 a 30 aminoácidos, que conectan por lo menos a ocho bucles hidrofílicos divergentes. La familia de proteína G de receptores acoplados incluye receptores de dopamina que se unen a fármacos neurolépticos usados para el tratamiento de trastornos psicóticos y neurológicos. Otros ejemplos de membrana de esta familia incluyen la calcitonina, adrenérgicas, endotelina, AMPc; adenosina, muscarínica, acetilcolina, serotonina, histamina, trombina, quinina, hormona estimulante del folículo, opsinas, receptor de gen 1 de diferenciación endotelial y rodopsinas, odorante, receptores de citomegalovirus, etc.

, Los receptores acoplados a proteína G pueden ser intracelularmente acoplados por proteínas G heterotriméricas a varias f 1 enzimas intracelulares, canales de ¡ones y transportadores (véase Jonson eí ai, Endoc., Rev., 10:317-331 (1989)). Diferentes subunidades a de proteína G preferencialmente estimulan efectores particulares para modular varias funciones biológicas en una célula. La fosforilación de residuos citoplásmicos de receptores acoplados a proteína G han sido identificados como un mecanismo importante para la regulación de acoplamiento a proteína G de algunos receptores acoplados a proteína G. Los receptores acoplados a proteína G se encuentran en numerosos sitios dentro de un hospedero mamífero. ' Las quimiocinas, también referidas como citocinas intercrinas, son una subfamilia de citocinas estructuralmente y funcionalmente relacionadas. Estas moléculas son de 8-10 kd en tamaño. En general, la qúimiocinas presentan homología de 20% a 75% al nivel de aminoácido y se caracterizan por cuatro residuos de cisteína conservados que forman dos enlaces de disulfuro. Con base en la disposición de los primeros dos residuos de cisteína, las quimiocinas se han clasificado en dos subfamilias, alfa y beta. En la subfamilia alfa, las primeras dos cisteínas son separadas por un aminoácido y por lo tanto se refieren como la subfamilia "C-X-C". En la subfamilia beta, las dos cisteínas están en una posición adyacente y por lo tanto se refieren como la subfamilia "C-C". Por lo tanto, por lo menos nueve diferentes miembros de esta familia se han identificado en humanos.

Las cisteínas de intercrina presentan una amplia variedad de funciones. Una característica representativa es su capacidad para inducir migración quimiotáctica de distintos tipos de células, incluyendo monocitos, neutrófilos, linfocitos T, basófilos y fibroblastos. Muchas quimiocinas tienen actividad proinflamatoria y están implicadas en múltiples pasos durante una reacción inflamatoria. Estas actividades incluyen la estimulación de liberación de histamina, enzima lisosomal y liberación de leucotrieno, adherencia incrementada de células inmunes objetivo a células endoteliales, unión incrementada de proteínas de complemento, expresión inducida de moléculas de adhesión de granulocitos y receptores de complemento, y estallamiento respiratorio. Además de su implicación en la inflamación, ciertas quimiocinas se ha mostrado que presentan otras actividades. Por ejemplo, la proteína 1 inflamatoria de macrófagos (MIP-1) es capaz de suprimir la proliferación de células madre hematopoyéticas, del factor de plaquetas 4 (PF-4) es un inhibidor potente de crecimiento de células endoteliales; la interleucina 8 (IL-8) promueve la proliferación de queratinocitos, y GRO es un factor de crecimiento autócrino para células de melanoma. A la luz de las diversas actividades biológicas, no es sorprendente que las quimiocinas hayan estado implicadas en un número de condiciones fisiológicas y de enfermedad, incluyendo tráfico de linfocitos, cicatrización de heridas, regulación hematopoyética y trastornos inmunológicos tales como alergia, asma y artritis.

* Por lo tanto, existe la necesidad de polipéptidos que modulen la regulación del sistema inmune, ya que alteraciones de dicha regulación pueden estar implicadas en enfermedades, trastornos y/o condiciones relacionadas con el sistema inmune. Por lo tanto^ existe la necesidad de identificación y caracterización de dichos polipéptidos humanos que puedan jugar un papel en la detección, prevención, alivio o corrección de dichas enfermedades, trastornos y/o condiciones. El receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) es un receptor acoplado a proteína G de trasmembrana de paso siete que se expresa en las células del sistema inmune tales como, por ejemplo, macrófagos, incluyendo .f ' células dendríticas inmaduras tales como células de Langerhans, y células T, incluyendo célula efectoras ThO y Th1. El receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también se ha detectado en microglia, astrocitos, neuronas y células endoteliales vasculares del sistema nervioso central (CNS). El receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también se expresa en monocitos y células T en el líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide, y también ha sido implicado en otras formas de artritis. Ligandos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) ¡ncluyen MIP-1a, MIP-1ß, MCP-1 , MCP-2, MCP-3, MCP-4, RANTES y Eotaxina. CCR5 también es un co-receptor importante para VIH, y puede ser también reconocido por otros agentes infecciosos, tales como otros virus, para permitir la entrada a la célula. Se descubrió recientemente que algunos individuos que portan una mutación del gen CCR5, eran resistentes a infección por VIH a pesar de la exposición múltiple al virus. Esta mutación anuló la expresión de CCR5 en la superficie de la célula (Liu et al., Cell 86:1 (1996)). El VIH es actualmente la enfermedad infecciosa letal de más importancia en el mundo, causando 2.6 millones de muertes en 1999. El número de muertes que resultan de infección por VIH sigue incrementando; en 1999, hubo 5.6 millones de nuevos casos de infección por VIH y 33.6 millones de personas infectadas que viven en el mundo. Aunque actualmente hay 14 fármacos aprobados para tratar VIH, tantos como la mitad de los pacientes no son tratados exitosamente (siendo definido el éxito como ARN de VIH.no detectable en el suero (que en efecto es igual a 50 copias/ml de ARN de VIH-1) después de un año de régimen de fármaco. Las razones para la incapacidad de estos regímenes de fármaco para tratar efectivamente el VIH son múltiples: el uso de algunos fármacos da por resultado el desarrollo de cepas de VIH resistentes al fármaco; algunos individuos son intolerantes a ciertos fármacos o los fármacos tienen efectos colaterales negativos; los pacientes difícilmente acatan regímenes de dosis completos; y los fármacos pueden no ser capaces de tener acceso a depósitos de VIH en el cuerpo. Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de desarrollar vacunas y terapias contra VIH mejoradas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN *. La presente invención se refiere a polinucleótidos novedosos y los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Además, la presente invención se refiere a vectores, células hospedero, anticuefos y recombinantes y métodos de síntesis para producir los polipéptidos y polinucleótidos. También se proveen métodos de di >agnóstico para detectar enfermedades, trastornos y/o condiciones relacionadas con los polipéptidos y polinucleótidos, y métodos terapéuticos para tratar, prevenir y/o diagnosticar dichas enfermedades, trastornos y/o condiciones. La invención se refiere además a métodos de selección para identificar elementos asociados de unión de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proveen polipéptidos del sector maduros novedoso así como fragmentos biológicamente activos y útiles para diagnóstico o terapia, análogos y derivados de los mismos. Los polipéptidos de receptor de quimiocina de i proteína G (CCR5) de la presente invención son de origen humano. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proveen moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención, incluyendo ÁRNm, ADN, ADNc, ADN genómico así como análogos de antisentido de los mismos y fragmentos biológicamente activos y útiles para diagnóstico y terapia de los mismos.

» . De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proveen procedimientos para producir polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) mediante técnicas recombinantes que consisten en cultivar células hospederas procarióticas y/o eucarióticas recombinantes, que contienen secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos receptores de la presente invención, bajo condiciones que promueven la expresión de dichos polipéptidos y la recuperación subsecuente de dichos polipéptidos. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proveen anticuerpos que se unen a los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). La presente invención comprende anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden, o que consisten alternativamente de fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se unen inmunoespecíficamente a un polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o fragmento de polipéptido o variante de un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). En particular, la invención abarca anticuefos (incluyendo moléculas que comprenden, o que consisten alternativamente de fragmentos de anticuerpos o variantes de los mismos) que se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido o fragmento de polipéptido o variante de receptor de quimiocina de proteína G humana (CCR5) tales como aquellos de SEQ ID NO:2 o del polipéptido codificado por el clon depositado.

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para prevenir, tratar o aliviar una enfermedad o trastorno que consiste en administrar a un animal, preferiblemente un ser humano, una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos o fragmentos o variantes del mismo, o moléculas relacionadas, que se unen inmunoespecíficamente a un receptor de quimiocina de proteína G (CCRT) o un fragmento o variante del mismo. En modalidades específicas, la presente invención se refiere a métodos y composiciones para prevenir, tratar o aliviar una enfermedad o trastorno asociado con la función de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o función de ligando de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o receptor de quimiocina de proteína G aberrante (CCR5) o expresión de ligando de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), que consiste en administrar a un animal, preferiblemente un humano, una cantidad efectiva de uno más anticuefos o fragmentos o variantes del mismo, o moléculas relacionadas, que se unen inmunoespecíficamente a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o un fragmento o variante del mismo. En modalidades altamente preferidas, la presente invención se refiere a métodos basados en anticuefo y composiciones para prevenir, tratar o aliviar infección por VIH y/o condiciones asociadas con infección por VIH. Otras enfermedades y trastornos que se pueden tratar, prevenir o aliviar con los anticuefos de la invención incluyen, pero no se limitan a trastornos inmunes (por ejemplo, trastornos autoinmunes tales como esclerosis múltiple, enfermedad de Grave y artritis reumatoide), trastornos neurodegenerativos (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), trastornos inflamatorios (por ejemplo asma, trastornos alérgicos o enfermedades renales inflamatorias tales como glomerunefritis), enfermedades infecciones (por ejemplo infecciones de hepatitis, infecciones virales de herpes y otras infecciones virales) así como trastornos proliferativos. La presente invención también abarca métodos y composiciones para detectar, diagnosticar o pronosticar enfermedades o trastornos que consisten en administrar a un animal, preferiblemente un ser humano, una cantidad efectiva de uno o más anticuefos o fragmentos o variantes del mismo, o moléculas relacionadas, que se unen inmunoespecíficamente a receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o un fragmento o variante del mismo. En modalidades específicas, la presente invención también abarca métodos y composiciones para detectar, diagnosticar o pronosticar enfermedades o trastornos asociados con la función de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o la función de ligando de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o receptor de quimiocina de proteína G aberrante (CCR5) o expresión de ligando de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), que consiste en administrar a un animal, preferiblemente a un ser humano, una cantidad efectiva de uno o más antibióticos o fragmentos o variantes del mismo, o moléculas relacionadas, que se unen inmunoespecíficamente a receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o un fragmento o variante del mismo. En modalidades altamente preferidas, la presente invención se refiere a métodos basados en anticuerpos y composiciones para detectar, diagnosticar o pronosticar infección por VIH y/o condiciones asociadas con infección por VIH. Otras enfermedades y trastornos que pueden ser detectados, diagnosticados o pronosticados con los anticuerpos de la invención incluyen pero no se limitan a trastornos inmunes (por ejemplo, trastornos autoinmunes tales como esclerosis múltiple, enfermedad de Grave y artritis reumatoide), trastornos neurodegenerativos (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), inflamatorias (por ejemplo, asma, trastornos alérgicos o enfermedades renales inflamatorias tales como glomeruionefritis), enfermedades infecciosas (por ejemplo infecciones de hepatitis, infecciones virales de hefes y otras infecciones virales) y trastornos proliferativos. :' Otra modalidad de la presente invención incluye el uso de los anticuerpos de la invención como una herramienta de diagnóstico para monitorear la expresión de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) en células. La presente invención también abarca líneas, de células que expresan anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a uno o más polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (por ejemplo, SEQ ID NO:2), o el polipéptido codificado por el clon depositado). Además, la presente invención abarca los polinucleótidos que codifican los anticuefos expresados por dichas líneas de células, así como las secuencias de aminoácidos que codifican los anticuefos expresados por estas líneas de células. Las moléculas que comprenden, o alternativamente que consisten de fragmentos o variantes de esos anticuefos (por ejemplo, cadenas pesadas, dominios de VH, CDR de VH, cadenas ligeras, dominios de VL o CDR de VL, que tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de aquellos expresados por la línea de células que expresan anticuerpos de la invención, que se unen ¡nmunoespecíficamente a uno o más receptores de químiocina de proteína G (CCR5) o fragmentos o variantes del mismo también son abarcados por la invención, como son las moléculas de ácido nucleico que codifican estos anticuefos y/o moléculas. En modalidades altamente preferidas, la presente invención abarca anticuerpos, o fragmentos o variantes de los mismos, que se unen a regiones/dominios extracelulares de uno o más receptores de quimiocina de proteína G (CCR5) o fragmentos y vanantes de los mismos. Los inventores de la presente invención han generado líneas de células de hibridoma que expresan anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a uno o más polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (por ejemplo, SEG ID NO:2 o el polipéptido codificado por ei clon depositado). Por lo tanto, la invención abarca esas líneas de células, listadas en el cuadro 2 más adelante que se depositaron en la American Type Culture Collection (Depósito de Norteamericano de Cultivos Tipo" o "ATCC") en las fechas listadas en el cuadro 2 y a los que se dan los números de depósito de ATCC identificados en el cuadro 2. El ATCC está ubicado en 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, EUA. El depósito de ATCC se hizo de acuerdo con los términos del tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para propósitos de procedimiento de patente. Además, la presente invención abarca los polinucléotidos que codifican los anticuerpos expresados por estas líneas de células, así como las secuencias de aminoácidos que codifican los anticuerpos expresados por "estas líneas de células. Moléculas que comprenden, o que consisten alternativamente de, fragmentos o variantes de_ estos anticuefos (por ejemplo, cadenas pesadas, dominios de VH, CDR de VH, cadenas ligeras, dominios de VL o CDR de VL que tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de aquellos expresados por una o más líneas de células referidas en el cuadro 2), que se unen inmunoespecíficamente a uno o más receptores de quimiocina de proteína G (CCR5) o fragmentos o variantes de los mismos, son también abarcadas por la invención, como lo son moléculas de ácido nucleico que codifican estos anticuerpos y/o moléculas. En modalidades altamente preferidas, la presente invención abarca anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos, que se unen a las regiones/dominio extracelulares de uno o más receptores de quimiocina de proteína G (CCR5) o fragmentos o variantes de los mismos. La presente invención también provee anticuefos que se unen a uno o más polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que son acoplados a un marcador detectable, tal como una enzima, un marcador fluorescente, un marcador luminiscente o un marcador bioluminiscente. La presente invención también provee anticuerpos que se unen a uno o más polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que son acoplados a un agente terapéutico o citotóxico. La presente invención también provee anticuefos que se unen a uno o más polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que son acoplados a material radioactivo. La presente invención también provee anticuerpos que inhiben o eliminan la capacidad de VIH a unirse a, entrar a/fusionarse con (infectar), o replicarse en células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). En modalidades altamente preferidas de la presente invención, los anticuerpos anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCRT) de la presente invención se usan para tratar, prevenir o aliviar infección por VIH y/o condiciones asociadas con infección por VIH. En otras modalidades altamente preferidas, anticuefos anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención se administran a un individuo, solos o en combinación con otros compuestos terapéuticos, especialmente agentes retrovirales, para tratar, prevenir o aliviar infección por VIH y/o condiciones asociadas con infección por VIH. La presente invención también provee anticuerpos que se unen a uno o más polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que actúan como agonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). En modalidades específicas, los anticuerpos de la invención estimulan la quimiotaxis de células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). En otras modalidades específicas, los anticuefos de la invención inhiben el ligando de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). En otras modalidades específicas, los anticuerpos de la invención regulan ascendente la expresión de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). La presente invención también provee anticuerpos que regular descendentemente la expresión de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). En otras modalidades específicas, los anticuefos anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención regulan descendentemente la expresión de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) promoviendo la ¡nternalización de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). La presente invención provee además anticuerpos que inhiben o eliminan la unión de un ligando de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (por ejemplo, MIP1-beta MIP-1alfa, MCP-1 , MCP-2, MCP-3, MCP-4, RANTES y Eotaxina), a células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). La presente invención también provee molécula(s), de ácido nucleico, generalmente aislada, que codifica un anticuerpo (incluyendo moléculas tales como scFvs, dominios de VH o dominios de VL, que comprenden, o consisten alternativamente de un fragmento de anticuerpo o variante del mismo) de la invención. La presente invención también provee una célula hospedero transformada con una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo (incluyendo moléculas, tales como scFvs, dominios de VH o dominios de VL, que comprenden o consisten alternativamente de un fragmento de anticuefo o variante del mismo) de la invención y progenie del mismo. La presente invención también provee un método para la producción de un anticuefo (incluyendo una molécula que comprende, o que consiste alternativamente de un fragmento de anticuerpo o variante del mismo) de la invención. La presente invención también provee un método para expresar un anticuerpo ^(incluyendo una molécula que comprende o que consiste alternativamente de un fragmento de anticuerpo o variante del mismo) a partir dé una molécula de ácido nucleico. Estos y otros aspectos de la invención se describen con detalle más adelante. En otra modalidad, la presente invención provee vacunas que comprenden, o que consisten alternativamente de polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o fragmentos, variantes o derivados de los mismos. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proveen métodos para seleccionar compuestos que se unen a y activan o inhiben la activación de los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención. De acuerdo con otra modalidad adicional de la presente invención se proveen procedimientos de administración de compuestos a un hospedero que se unen a y activan al polipéptido receptor de la presente invención que son útiles en la estimulación de hematopoyesis, cicatrización de heridas, coagulación, angiogénesis, para tratar tumores sólidos, infecciones crónicas, leucemia, enfermedades autoinmunes mediadas por células T, infecciones parasitarias, psoriasis, y para estimular la actividad de factor de crecimiento. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se provee un método para administrar los polipéptidos receptores de la presente invención a través de terapia génica para tratar condiciones relacionadas con la subexpresión de los polipéptidos o subexpresión de un ligando para el polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). De acuerdo con otra modalidad de la presente invención se proveen procedimientos de administración de compuestos de un hospedero que se unen a e inhiben la activación de los polipéptidos receptores de la presente invención que son útiles en la prevención y/o tratamiento de alergia, aterogénesis, anafilaxis, malignidad, inflamación crónica y aguda, reacciones alérgicas mediadas por histamina e IgE, fiebre independiente de prostaglandina, insuficiencia de médula ósea, silicosis, sarcoidosis, artritis reumatoide, choque y síndrome hipereosinofílico. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proveen sondas de ácido nucleico que comprenden moléculas de ácido nucleico de suficiente longitud para hibridar específicamente a las secuencias de polinucleótidos de la presente invención. De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención, se proveen muestras de diagnóstico para detectar enfermedad relacionada con mutaciones en las secuencias de ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos y para detectar un nivel alterado de la forma soluble de los polipéptidos receptores. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proveen procedimientos para utilizar dichos polipéptidos de receptor, o polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos, para propósitos in vitro relacionados con investigación científica, síntesis de ADN y fabricación de vectores de ADN. Estos y otros aspectos de la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS ^ Los siguientes dibujos son ilustrativos de modalidades de la invención y no pretenden limitar el alcance la invención como lo abarcan las reivindicaciones. * La figura 1 muestra la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos deducida correspondiente del receptor acoplado a proteína G de la presente invención. Se usa la abreviatura estándar de una letra para aminoácidos. La secuenciación se realizó usando un secuenciador de ADN automatizado 373 (Applied Biosystems, Inc.). La figura 2 ilustra una alineación de aminoácidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención y el receptor de MCP-1 humano (SEQ ID NO:9). Esta figura muestra las regiones de identidad entre la secuencia de aminoácidos de la proteína de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) y el producto de traducción del receptor A de MCP-1 humano (MCP-1 RA) (SEQ ID NO:9), determinado por análisis de BLAST. Aminoácidos idénticos entre los dos polipéptidos son indicados por líneas, mientras que el aminoácido altamente conservativo se indica mediante comas y aminoácidos conservativos se indican mediante puntos. Eliminando las regiones de aminoácidos idénticos, altamente conservados y conservados, el experto en la técnica puede identificar fácilmente dominios conservados entre los dos polipéptidos. Estos dominios conservados son modalidades preferidas de la presente invención. La figura 3 muestra un análisis de la secuencia de aminoácidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Regiones alta, beta, giro y espiral; carácter hidrofílico e hidrofóbico; regiones anfifáticas; regiones flexibles; índice antigénico y probabilidad de superficie se muestran y todos se generaron usando fijaciones por omisión. En la gráfica de "índice antigénico o de Jameson-Wolf, los picos positivos indican ubicaciones de las regiones altamente antigénicas de la proteína de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), es decir, regiones a partir de las cuales se pueden obtener los polipéptidos que tienen epítope de la invención. Los dominios definidos por estas gráficas se contemplan en la presente invención. Los datos presentados en la figura 3 también están representados en forma tabular en el cuadro 1. Las columnas son marcadas con los encabezados "Res", "posición" y números romanos l-XIV. Los encabezados de columna se refieren a las siguientes características de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 3, y en el cuadro 1 : "Res": residuo de aminoácido de SEQ ID NO:2 y figuras 1A y 1B; "posición": posición del residuo correspondiente dentro de SEQ ID NO:2 y figuras 1A y 1B; I: alfa, regiones - Gamier-Robson; II: alfa, regiones - Chou-Fasman; lll: beta, regiones - Gamier-Robson; IV: beta, regiones - Chou-Fasman; V: vuelta, regiones - Gamier-Robson; VI: vuelta, regiones - Chou-Fasman; Vil: espiral, regiones - Gamier-Robson; VIII: gráfica de carácter hidrofílico - Kyte-Doolittle; IX: gráfica de carácter hidrofóbico - Hopp-Woods; X: alfa, regiones amfifáticas - Eisenberg; XI: beta, regiones amfifáticas - Eisenberg; XII: regiones flexibles - Karplus-Schulz; XIII: índice antigénico - Jameson-Wolf; y XIV; gráfica de probabilidad de superficie - Emini.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se provee un ácido nucleico aislado (polinucleótido) que codifica para el polipéptido maduro que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la figura 1 (SEQ ID NO:2) o para el polipéptido maduro codificado por el clon depositado como depósito de ATCC No. 97183 el 1o de junio de 1995. Una muestra del clon depositado, que contiene el marco de lectura abierta del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), se ha obtenido del ATCC y ha sido resecuenciado. Los datos de secuencia del clon resecuenciado se muestra en SEQ ID NO:21 y 22. SEQ ID NO:21 difiere de SEQ ID NO:1 en las posiciones -f 5 (nucleótidos 320, 433, 442, 646 y 1289 de SEQ ?D NO:1 ) SEQ ID NO:22 difiere de SEQ ID NO:2 en las posiciones 5 (residuos de aminoácidos 21 , 59, 62, 130 y 344). ~ El polinucleótido de esta invención se descubrió en una genoteca genómica derivada de mocitos humanos. Está estructuralmente relacionada con la familia de receptor acoplado a proteína G. Contiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de 352 residuos de aminoácidos. La proteína presenta el grado más alto de homología para un receptor de MCP-1 humano (SEQ ID NO:9) con 70.1% de identidad y 82.9% de similitud sobre una extensión de 347 aminoácidos. Los polinucleótidos de la invención incluyen, pero no se limitan a la secuencia de nucléotidos de SEQ ID NO:1 , la secuencia de nucleótidos del clon depositado HDGNR10 (número de depósito de ATCC 97183), la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO:21), y/o fragmentos, variantes o derivados de los mismos. ,EI polinucleótido de la presente invención puede estar en forma de ARN o en forma de ADN, dicho ADN incluye ADNc, ADN genómico y ADN sintético. El ADN puede ser de doble cadena o de una sola cadena, y la cadena única puede ser la cadena codificada o la cadena no codificada (antisentido). La secuencia de codificación que codifica el polipéptido maduro puede ser idéntica a la secuencia de codificación mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO:1) o la del clon depositado o puede ser una secuencia de codificación diferente que codifique la secuencia, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, codifique el mismo polipéptido maduro que el ADN de la figura 1 (SEQ ID NO:1) o el clon depositado. El polinucleótido que codifica para el polipéptido maduro de la figura 1 o para el polipéptido maduro codificado por el clon depositado puede incluir: sólo la secuencia de codificación para el polipéptido maduro; la secuencia de codificación para el polipéptido maduro y secuencia de codificación adicional tal como un dominio de trasmembrana (TM) o intracelular; la secuencia de codificación para el polipéptido maduro (y opcionalménte secuencia de codificación adicional) y secuencia de no codificación, tal como intrones o secuencia de no codificación 5' y/o 3' de la secuencia de codificación para el polipéptido maduro. Por lo tanto, el término "polinucleótido que codifica un polipéptido" comprende un polipéptido que incluye sólo la secuencia de codificación para el polinucleótido así como un polinucleótido que incluye la secuencia de codificación y/o de no codificación adicional. La presente invención se refiere además a variantes de los polinucleótidos descritos anteriormente que codifican para fragmentos, análogos y derivados del polipéptido que tienen la secuencia de aminoácidos deducida de la figura 1 o el polipéptido codificado por el clon codificado. La variante del polinucleótido puede ser una variante alélica que ocurre naturalmente del polinucleótido o una variante que ocurre de manera no natural de polinucleótido. Por lo tanto, la presente invención incluye polinucleótidos que codifican el mismo polipéptido maduro mostrado en la figura 1 (SEQ ID NO:2) o el mismo polipéptido maduro codificado por el clon depositado así como variantes de dichos polinucleótidos, dichas variantes codifican para un fragmento, derivado a análogo de polipéptido de la figura 1 , (SEQ ID NO:2) o el polipéptido codificado por el clon depositado. Dichas variantes de nucleótido incluyen variantes de deleción, variantes de sustitución y variantes de adición o inserción. Como se indicó anteriormente, el polinucleótido puede tener una secuencia de codificación que es una variante alélica que ocurre naturalmente de la secuencia de codificación mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO:1) o de la ' secuencia de codificación del clon depositado. Como se conoce en la técnica, una variante alélica es una forma alterna de una secuencia de polinucleótidos que puede tener una sustitución, deleción o adición de uno o más nucleótidos, que no altera sustancialmente la función del polipéptido codificado. Los polinucleótidos también pueden codificar para una forma soluble del polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que es la porción extracelular del polipéptido que ha sido dividida del dominio de TM e intracelular del polipéptido de longitud completa de la presente invención.

Los polinucleótidos de la presente invención también pueden tener la secuencia de codificación fusionada en el marco a una secuencia de marcador que permite la purificación del polipéptido de la presente invención. La secuencia de marcador puede ser una etiqueta de hexa-histidina suministrada por un vector pQE-9 para proveer purificación del polipéptido maduro fusionado al marcador en el caso de un hospedero bacteriano, o por ejemplo la secuencia de marcador puede ser una etiqueta de hemaglutinina (HA) cuando se usa un hospedero mamífero, por ejemplo células de COS-7. La etiqueta de HA corresponde a un epítope derivado de la proteína de hemaglutinina de influenza (Wilson, I., eí al., Cell, 37:767 (1984)). El término "gen" significa el segmento de ADN implicado en la producción de una cadena de polipéptido; incluye regiones que preceden y siguen a la región de codificación (anterior y posterior) así como secuencias de intervención (intrones) entre segmentos de codificación individuales (exones). Los fragmentos del gen de longitud completa de la presente invención se pueden usar como una sonda de hibridación para una genoteca de ADNc para aislar el ADNc de longitud completa y para aislar otros ADNc que tienen una similitud de secuencia alta al gen o actividad biológica similar. Las sondas de este tipo preferiblemente tienen por lo menos 30 bases y pueden contener, por ejemplo, 50 o más bases. La sonda también se puede usar para identificar un clon de ADNc que corresponde a una transcripción de longitud completa y un clon o clones genómicos que contienen el gen completo incluyendo regiones reguladoras y promotoras, exones e intrones. Un ejemplo de una selección consiste en aislar la región de codificación del gen usando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda de oligonucleótido. Los oligonucleótidos marcados que tienen una secuencia complementaria a la del gen de la presente invención se usan para seleccionar una genoteca de ADNc humano, ADN genómico o ARNm para determinar a qué miembros de la genoteca hibrida la sonda. La presente invención se refiere además a polinucleótidos que hibridan las secuencias anteriormente descritas si hay por lo menos 70%, preferiblemente por lo menos 90% y muy preferiblemente 95% de identidad entre las secuencias. La presente invención se refiere particularmente a polinucleótidos que hibridan bajo condiciones astringentes a los polinucleótidos anteriormente descritos. Tal como se usa aquí, el término "condiciones astringentes" significa que la hibridación ocurrirá sólo si hay por lo menos 95% y preferiblemente por lo menos 97% de identidad entre las secuencias. Los polinucleótidos que hibridan a los polinucleótidos anteriormente descritos en una modalidad preferida codifican polipéptidos que retienen sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por los ADN de la figura 1 (SEQ ID NO:1 ) o el clon depositado. Alternativamente, el polinucleótido puede tener por lo menos 20 bases, preferiblemente 30 bases y muy preferiblemente por lo menos 50 bases que hibridan a un polinucleótido de la presente invención y que tienen una identidad al mismo, como se describió anteriormente, y que pueden o no retener actividad. Por ejemplo, dichos polinucleótidos pueden emplearse como sondas para el polinucleótido de SEQ ID NO:1 o del clon depositado, por ejemplo, para recuperar el polinucleótido o como una sonda de diagnóstico o como un iniciador de PCR. Por lo tanto, la presente invención está dirigida a polinucleótidos que tienen por lo menos 70% de identidad, preferiblemente por lo menos 90% y muy preferiblemente por lo menos 95% de identidad a un polinucleótido que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:2 o que aquel codificado por el clon depositado así como fragmentos del mismo, dichos fragmentos tienen por lo menos 30 bases y preferiblemente por lo menos 50 bases y a polipéptidos , codificados por dichos polinucleótidos. El depósito(s) a los que se hace referencia aquí se mantendrá " bajo los términos del tratado de Budapest del reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para propósitos de procedimiento de patentes.

Estos depósitos se proveen simplemente como conveniencia para los expertos en la técnica y no deben ser una admisión de que se requiere un depósito de acuerdo con 35 U.S.C.^112. La secuencia de los polinucleótidos contenidos en los materiales depositados, así como la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos codificados por los mismos, se incorporan aquí por referencia y son de control en el caso de cualquier conflicto con alguna descripción de las secuencias de la presente invención. Se puede requerir una licencia para hacer o vender los materiales depositados, y dicha licencia no es otorgada por la presente. La presente invención se refiere además a un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la figura 1 (SEQ ID NO:2) o que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon depositado (SEQ ID NO:22), así como fragmentos, análogos y derivados de dicho polipéptido. Los términos "fragmento", "derivado" y "análogo" cuando se refiere al polipéptido de la figura 1 o a aquel codificado por el clon depositado, significa un polipéptido que retiene sustancialmente la misma función o actividad biológica que dicho polipéptido, es decir, funciona como un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o retiene la capacidad para unirse al ligando o al receptor aún cuando el polipéptido no funciona como receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), por ejemplo, una forma soluble del receptor. Un análogo incluye una proproteína que puede ser activada por digestión de la porción de proproteína para producir un polipéptido maduro activo. El polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido recombinante, un polipéptido natural o un polipéptido sintético, preferiblemente un polipéptido recombinante. El fragmento, derivado, o análogo del polipéptido de la figura 1 (SEQ ID NO:2) o aquel codificado por el clon depositado puede ser (i) uno en el cual uno o más de los residuos de aminoácidos son sustituidos con un residuo de aminoácidos conservado o no conservado (preferiblemente un residuo de aminoácido conservado) y dicho residuo de aminoácido sustituido puede o no ser uno codificado por el código genético, o (ii) uno en el cual uno o más de los residuos de aminoácido incluye un grupo sustituyente, o (iii) uno en el cual el polipéptido maduro es fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol) o (iv) uno en el cual los aminoácidos adicionales son fusionados al polipéptido maduro para purificación del polipéptido o (v) uno en el cual un fragmento de polipéptido es soluble, es decir, no unido a la membrana, pero que sin embargo una los ligandos al receptor unido a la membrana. Dichos fragmentos, derivados y análogos se consideran dentro del alcance los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente invención. Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención se proveen preferiblemente en forma aislada, y preferiblemente son purificados a homogeneidad. Los polipéptidos de la presente invención incluyen el polipéptido de SEQ ID NO:2 (en particular el polipéptido maduro) o aquel codificado por el clon depositado así como polipéptidos que tienen por lo menos 70% de similitud (preferiblemente un 70% de identidad) al polipéptido de SEQ ID NO:2) o a aquel codificado por el clon depositado y muy preferiblemente 90% de similitud (muy preferiblemente 90% de identidad) al polipéptido de SEQ ID NO:2) o a aquel codificado por el clon depositado y muy preferiblemente aún 95% de similitud (muy preferiblemente aún 90% de identidad) al polipéptido de SEQ ID NO:2 y a porciones de dicho polipéptido con dicha porción del polipéptido generalmente conteniendo por lo menos 30 aminoácidos y muy preferiblemente por lo menos 50 aminoácidos. Como se conoce en la técnica "similitud" entre dos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sustitutos de aminoácidos conservados para la misma del polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. Fragmentos o porciones de los polipéptidos de la presente invención se pueden emplear para producir el polipéptido de longitud completa correspondiente mediante síntesis de péptidos, por lo tanto, los fragmentos se pueden emplear como intermediarios para producir los polipéptidos de longitud completa. Fragmentos o porciones de los polinucleótidos de la presente invención se pueden usar para sintetizar polinucleótidos de longitud completa de la presente invención. El término "gen" significa el segmento de ADN implicado en la producción de una cadena de polipéptidos; incluye regiones que preceden y que siguen a la región de codificación "anterior y posterior" así como secuencias de intervención (intrones) entre segmentos de codificación individuales (exones). El término "aislado" significa que el material es removido de su ambiente original (por ejemplo, el ambiente natural si está ocurriendo en forma natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido que ocurre naturalmente presente en un animal vivo no es aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de algunos o todos los materiales existentes en el sistema natural, es aislado. Dichos polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o dichos polinucleótidos o polipéptido podrían ser parte de una composición, y sin embargo ser aislados de modo que dicho vector o composición no sea parte de su ambiente natural. Los polipéptidos de la presente invención incluyen al polipéptido de SEQ ID NO:2) o a aquel codificado por el clon depositado (en particular el polipéptido maduro) así como polipéptidos que tienen por lo menos 70% de similitud (preferiblemente por lo menos 70% de identidad) y muy preferiblemente por lo menos 90% de similitud (muy preferiblemente por lo menos 90% de identidad) y muy preferiblemente aún por lo menos 95% de similitud (muy preferiblemente aún por lo menos 95% de identidad) al polipéptido de SEQ ID NO:2) o a aquel codificado por el clon depositado y también incluyen porciones de dichos polipéptidos con dicha porción del polipéptido que generalmente contiene por lo menos 30 aminoácidos y muy preferiblemente por lo menos 50 aminoácidos. Como se conoce en la técnica, la "similitud" entre dos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos de aminoácidos conservados de un polipéptido a la secuencia de un segundo polipéptido. Fragmentos o porciones de los polipéptidos de la presente invención se pueden emplear para producir el polipéptido de longitud completa correspondiente por síntesis de péptidos; por lo tanto, los fragmentos se pueden emplear como intermediarios para producir los polipéptidos de longitud completa. Fragmentos o porciones de los polinucleótidos de la presente invención se pueden usar para sintetizar polinucleótidos de longitud completa de la presente invención. La presente invención también se refiere a vectores que incluyen polinucleótidos de la presente invención, células hospedero que son manipuladas genéticamente con vectores de la invención y la producción de polipéptidos de la invención por técnicas de recombinación. Las células hospedero son manipuladas genéticamente (transducidas, transformadas o transfectadas) con los vectores de esta invención que, por ejemplo, pueden ser un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Las células hospedero manipuladas genéticamente pueden ser cultivadas en un medio de nutrientes convencional modificado según sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes de la presente invención. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son aquellas previamente usadas con las célula hospedero seleccionada para expresión, y serán evidentes para el experto en la técnica. Los polinucleótidos de la presente invención se pueden emplear para producir polipéptidos mediante técnicas recombinantes. Por lo tanto, por ejemplo, el polinucleótido se puede incluir en cualquiera de una variedad de vectores de expresión para expresar un polipéptido. Dichos vectores incluyen secuencias cromosómicas, no cromosómicas y de ADN sintético, por ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fagos; baculovirus; plásmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, ADN viral tales como vaccinia, adenovirus, virus de viruela de aves de corral y pseudorrabia. Sin embargo, se puede usar cualquier otro vector siempre y cuando sea replicable y viable en el hospedero. La secuencia de ADN apropiada se puede insertar en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN es insertada en un sitio(s) de endonucleasa de restricción apropiado mediante procedimientos conocidos en la técnica. Dichos procedimientos y otros se consideran dentro del alcance de los expertos en la técnica. La secuencia de ADN en el vector de expresión está operativamente ligado a una secuencia(s) de control de expresión apropiada (promotor) para dirigir síntesis de ARNm. Como ejemplos representativos de dichos promotores, se pueden mencionar: el promotor LTR o SV40, el promotor E. coli, lac o trp, el promotor de fago lambda PL y otros promotores * conocidos para controlar la expresión de genes en células procarióticas o eucarióticas o sus virus. El vector de expresión también contiene un sitio de unión a ribosoma para la iniciación de la traducción y un terminador de transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión.

Además, los vectores de expresión preferiblemente contienen uno o más genes de marcador seleccionables para proveer un rasgo fenotípico para la selección de células hospedero transformadas tales como resistencia a dihidrofolato reductasa o a la neomicina para cultivo de células eucarióticas, o tal como resistencia a la tetraciclina o ampicilina en E. coli. El vector que contiene la secuencia de ADN apropiada como se describió anteriormente, así como una secuencia de promotor o control apropiada, se puede emplear para transformar un hospedero apropiado para permitir que el hospedero exprese la proteína. Como ejemplos representativos de hospederos apropiados, se pueden mencionar: células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; células de hongos, tales como levadura; células de insecto tales como Drosophila y Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, COS o melanoma de Bowes; adenovirus, células vegetales; etc. La selección de un hospedero apropiado se considera dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente invención. Muy particularmente, la presente invención también incluye construcciones recombinantes que comprenden una o más de las secuencias como se describió antes en forma amplia. La construcción comprende un vector, tal como un plásmido o un vector viral, en el cual se ha insertado una secuencia de la invención, en una orientación hacia adelante o en reversa. En un aspecto preferido de esta modalidad, la construcción comprende además secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un promotor, operablemente enlazado a" la secuencia. Grandes números de vectores y promotores adecuados son conocidos por los expertos en la técnica y están comercialmente disponibles. Los siguientes vectores se proveen a manera de ejemplo. Bacterianos: pQE7, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eukaryotic: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 , pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Sin embargo, se puede usar cualquier otro plásmido o vector siempre y cuando sean replicables y viables en el hospedero. Las regiones promotoras se pueden seleccionar a partir de cualquier gen deseado que use vectores CAT (cloramfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Dos vectores apropiados son PKK232-8 y PCM7. Los promotores bacterianos nombrados incluyen lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PL y trp. Los promotores eucarióticos incluyen CMV inmediato temprano, HSV timidina cinasa, SV40 temprano y tardío, LTRs de retrovirus, y metalotioneina-l de ratón. La selección del vector y promotor apropiados está dentro del nivel del experto en la técnica. En una modalidad adicional, la presente invención se refiere a células hospedero que contienen las construcciones anteriormente descritas. La células hospedera puede ser una célula eucariótica superior, tal como una célula de mamífero, o una célula eucariótica inferior, tal como una célula de levadura, o la célula hospedero puede ser una célula procariótica, tal como una célula bacteriana. La introducción de la construcción en la célula hospedero se puede efectuar mediante transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, o electroporación. (Davis, L., eí al., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)). Las construcciones en las células hospedero se pueden usar de cualquier manera convencional para producir el producto de gen codificado por la secuencia recombinante. Alternativamente, los polipéptidos de la invención se pueden producir sintéticamente por medio de sintetizadores de péptido convencionales. Las proteínas maduras pueden expresarse en células de mamífero, levaduras, bacterias u otras células bajo el control de promotores apropiados. Los sistemas de traducción libres de células también se pueden emplear para producir dichas proteínas usando ARN derivados de las construcciones de ADN de la presente invención. Los vectores de clonación y expresión apropiados para usarse con hospederos procarióticos y eucarióticos se describen en Sambrook, eí al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), cuya descripción se incorpora aquí por referencia. La transcripción del ADN que codifica los polipéptidos de la presente invención por eucarióticos superiores se incrementa insertando una secuencia incrementadora en el vector. Los incrementadores son elementos de acción cis de ADN, generalmente de alrededor de 10 a 300 pb que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Ejemplos incluyen el incrementador de SV40 en el último lado de las pares de bases de origen de replicación 100 a 270, un incrementador de promotor temprano de citomegalovirus, el incrementador de polioma en el lado último del origen de replicación, y los incrementadores de adenovirus. En general, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permiten la expresión de la célula hospedero, por ejemplo, el gen de resistencia a la ampicilina de E. coli y el gen TRP1 de S. Cerevisiae, y un promotor derivado de un gel altamente expresado para dirigir la trascripción de una secuencia estructural hacia el extremo tres prima. Dichos promotores se pueden derivar de operones que codifican enzimas glicolíticas tales como 3-fosfoglicerato cinasa (PGK), factor a, fosfatasa acida, o proteínas de choque térmico, entre otras. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en a fase apropiada con secuencias de iniciación y terminación de traducción, y preferiblemente, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de proteína traducida en el espacio periplásmico o el medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación N-terminal que imparte características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada de producto recombinante expresado. Los vectores de expresión útiles para uso bacteriano se consideran insertando una secuencia de ADN estructural que codifica una proteína deseada junto con señales de iniciación y terminación de traducción adecuadas en fase de lectura operable con un promotor funcional. El vector comprenderá uno más marcadores seleccionables fenotípicos y un origen de replicación para asegurar el mantenimiento del vector y, si es deseable, proveer amplificación dentro del hospedero. Los hospederos procarióticos adecuados para transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y varias especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque también se pueden emplear otros como un tema de elección. Como un ejemplo representativo pero no limitante, los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y origen bacteriano de replicación derivado de plásmidos comercialmente disponibles que comprenden elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017) . Dichos vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) y GEMÍ (Promega Blotec, Madison, Wl, USA). Estas secciones de "estructura de base"pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural que va a ser expresada. Después de la transformación de una cepa hospedera adecuada y el crecimiento de la cepa hospedera a una densidad de células apropiada, el promotor seleccionado es inducido por medios adecuados, (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) y las células son cultivadas durante un periodo adicional.

Las células son típicamente cosechadas por centrifugación, alteradas por medios físicos o químicos, y el extracto crudo resultante retenido para purificación adicional. Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden ser alteradas por cualquier método conveniente, incluyendo un ciclo de congelamiento-descongelamiento, sonicación, alteración mecánica, o el uso de agentes de lisis celular, dichos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Varios sistemas de cultivo de células de mamífero también se pueden emplear para expresar proteína recombinante. Ejemplos de sistemas de expresión en mamíferos ¡ncluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñon de mono, descritos por Gluzman, Cell 23:175 (1981), y otras líneas de células capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo las líneas de células C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión en mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor e incrementador adecuados, y también cualesquiera sitios de unión a ribosoma necesarios, sitio de poliadenilación, sitios de donador y aceptor de empalme, secuencias de terminación de transcripción, y secuencias no transcritas 5' flanqueables. Las secuencias de ADN derivadas del empalme de SV40, y los sitios de poliadenilación se pueden usar para proveer elementos genéticos no transcritos requeridos. Los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes mediante métodos que incluyen la precipitación de sulfato de amonio o metanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía de lectina. Se pueden usar pasos de redoblamiento de proteína, según sea necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, para los pasos de purificación finales se puede emplear cromatografía de líquidos de alto rendimiento (CLAR). Los polipéptidos de la presente invención pueden ser un producto naturalmente purificado, o un producto de procedimientos sintéticos químicos, o se puede producir mediante técnicas recombinantes a partir de un hospedero procariótico o eucariótico (por ejemplo, mediante cultivo de bacterias, levaduras, células de plantas superiores, de insectos y de mamíferos). Dependiendo del hospedero empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden ser glicosilados o pueden ser no glicosilados. Los poíipéptidos de la invención también pueden incluir un residuo de aminoácido de metionina inicial. Los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención se pueden emplear como reactivos y materiales de investigación para descubrir tratamientos y diagnósticos para enfermedades humanas. El receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención se puede emplear en un procedimiento para seleccionar compuestos que activen (agonistas) o inhiban la activación (antagonistas) del polipéptido receptor de la presente invención. En general, dichos procedimientos de selección implican proveer células apropiadas que expresen el polipéptido receptor de la presente invención sobre la superficie del mismo. Dichas células incluyen células de mamíferos, levadura, drosofila o E coli. En particular, un polinucleótido que codifica el receptor de la presente invención se emplea para transfectar células para que de esta manera expresen el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Ei receptor expresado después se pone en contacto con un compuesto de prueba para observar la unión, estimulación o inhibición de una respuesta funcional. Un procedimiento de selección de este tipo implica el uso de melanóforos que son transfectados para expresar el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención. Dicha técnica de selección se describe en PCT WO 92/01810 publicada el 6 de febrero de 1992. De esta manera, por ejemplo, dicha prueba se puede emplear seleccionando un compuesto que inhiba la activación del polipéptido receptor de la presente invención poniendo en contacto las células del melanóforo que codifican el receptor tanto con el ligando receptor como con un compuesto que va a ser seleccionado. La inhibición de la señal generada por ligando indica que un compuesto es un antagonista potencial para el receptor, es decir, inhibe la activación del receptor.

La selección se puede emplear para determinar un compuesto que active el receptor poniendo en contacto dichas células o compuestos que van a ser seleccionados y determinando si dicho compuesto genera una señal, es decir, activa al receptor. Otras técnicas de selección incluyen el uso de células que expresan el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (por ejemplo, células de CHO transfectadas) en un sistema que mide cambios de pH extracelulares producidos por activación de receptor, por ejemplo, como se describe en Science 246:181-296 (octubre de 1989). Por ejemplo, los compuestos se pueden poner en contacto con una célula que exprese el polipéptido receptor de la presente invención y la respuesta de un segundo mensajero, es decir, la transducción de señal o cambios de pH, se pueden mediar para determinar si el compuesto potencial activa o inhibe al receptor. Otra técnica de selección de este tipo implica introducir ARN que codifique el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) en oocitos de Xenopus para expresar transitoriamente el receptor. Los oocitos receptores, pueden entonces ponerse en contacto con el ligando receptor y un compuesto que va a ser seleccionado, seguido por la detección de la inhibición o activación de una señal de calcio en el caso de selección para compuestos que se piensa que inhiben la activación del receptor. Otra técnica de seíección implica expresar el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) en la cual el receptor es enlazado a un fosfolipasa C o D. Como ejemplos representativos de dichas células, se pueden mencionar células endoteliales, células de músculo liso, células de riñon embrionario, etc. La selección se puede lograr como se describió anteriormente detectando la activación del receptor o la inhibición de la activación del receptor a partir de la segunda señal de fosfolipasa. Otro método implica la selección de compuestos que inhiben la activación del polipéptido receptor de los antagonistas de la presente invención determinando la inhibición de la unión del ligando marcado a células que tienen el receptor sobre la superficie de las mismas. Dicho método implica la transfección de una célula eucariótica con ADN que codifica el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de tal manera que la célula exprese el receptor sobre su superficie y tenga en contacto la célula con un compuesto en presencia de una forma marcada de un ligando conocido. El ligando puede ser macado, por ejemplo, mediante radioactividad. La cantidad de ligando marcado unido a los receptores se mide, por ejemplo, midiendo la radioactividad de los receptores. Si el compuesto se une al receptor como lo determina una reducción de ligando marcado que se une a los receptores, la unión de ligando marcado a receptor es inhibida. Un anticuefo, o en algunos casos un oligopéptido, puede activar un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención, uniéndose al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) e iniciando una respuesta de un segundo mensajero. Los anticuefos incluyen anticuerpos antiidiotípicos que reconocen determinantes únicos generalmente asociados con el sitio de unión antígeno de un anticuefo. Los compuestos agonistas potenciales también incluyen proteínas que están estrechamente relacionadas con el ligando del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), por ejemplo, un fragmento de ligando. Un anticuerpo, o en algunos casos un oligopéptido puede antagonizar un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención, uniéndose al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) pero no pudiendo inducir una respuesta de un segundo mensajero de tal manera que la actividad del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se evita. Los anticuerpos incluyen anticuerpos antiidiotípicos que reconocen determinantes únicos generalmente asociados con el sitio de unión a antígeno de un anticuefo. Los compuestos antagonistas potenciales también ¡ncluyen proteínas que están estrechamente relacionadas con el ligando del receptor y de quimiocina de proteína G (CCR5), por ejemplo, un fragmento del ligando que ha perdido función biológica y no induce respuesta cuando se une al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). r Una construcción de antisentido preparada mediante el uso de tecnología antisentido, se puede usar para controlar la expresión de genes mediante la formación de triple hélice o ADN o ARN de antisentido, ambos métodos basados en la unión de un polinucleótido a ADN o ARN. Por ejemplo, la porción de codificación 5' de la secuencia de polinucleótidos que codifica para los polipéptidos maduros de la presente invención, se usa para designar un oligonucleótido de ARN de antisentido de alrededor de 10 a 40 pares de bases de longitud. Un ollgonucleótido de ADN está diseñado para ser complementario a una región del gen implicado en la transcripción (triple hélice; véase Lee et al., Nucí. Acids Res. 6:3073 (1979); Cooney et al, Science 241:456 (1988); y Dervan eí al., Science 25 1360 (1991)), evitando así la transcripción y la producción de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). El oligonucleótido de ARN de antisentido hidrida al ARNm in vivo y bloquea la traducción de moléculas de ARNm en receptor acoplado a proteína G (antisentido - Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988)).

Los oligonucleótidos anteriormente descritos también pueden suministrarse a células de tal manera que el ARN o ADN de antisentido puede ser expresado in vivo para inhibir la producción de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Una pequeña molécula que se une al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), haciéndolo inaccesible a ligandos de tal manera que se evita la actividad biológica normal, por ejemplo péptidos o moléculas similares a péptidos pequeñas, también se pueden usar para inhibir la activación del polipéptido receptor de la presente invención. Una forma soluble del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), por ejemplo, un fragmento de los receptores, se pueden usar para inhibir la activación de receptor uniéndose al ligando a un polipéptido de la presente invención y evitando que el ligando interactúe con receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) unido a membrana.

Los compuestos que se unen a e inactivan el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención se pueden emplear para estimular hematopoyesis, cicatrización de heridas, coagulación, angiogénesis, para tratar tumores sólidos, infecciones crónicas, leucemia, enfermedades autoinmunes mediadas por células T, infecciones parasitarias, psoriasis y para estimular la actividad del factor de crecimiento. Los compuestos que se unen a e inhiben el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención se pueden emplear para tratar alergia, aterogénesis, anafilaxis, malignidad, inflamación crónica y aguda, reacciones alérgicas mediadas por histamina e IgE, fiebre independiente de prostaglandina, insuficiencia de médula ósea, silicosis, sarcoidosis, artritis reumatoide, choque y síndrome hipereosinofílico. Los compuestos se pueden emplear en combinación con vehículo farmacéutico adecuado. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicho vehículo incluye pero no se limita a solución salina, solución salina regulada en su pH, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación debe adaptarse al modo de administración. , La invención también provee un paquete o equipo farmacéutico que comprenda uno o más contenedores llenados con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Asociado con dichos contenedores puede estar un aviso en forma prescrita por una agencia gubernamental que regule la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, dicho aviso refleja la aprobación por la agencia de fabricación, uso o venta para administración humana. Además, los compuestos de la presente invención se pueden emplear junto con otros compuestos terapéuticos. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de una manera conveniente tal como mediante vía tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intredérmica. Las composiciones farmacéuticas se administran en una cantidad que es efectiva para el tratamiento y/o profilaxis de la indicación específica, En general, las composiciones farmacéuticas se administrarán en una cantidad de por io menos aproximadamente 10 µg/kg de peso corporal y en la mayoría de los casos se administrarán en una cantidad que no exceda aproximadamente 8 mg/kg de peso coforal por día. En la mayoría de los casos, la dosis es de alrededor de 10 µg/kg a aproximadamente 1 mg/kg de peso coforal diario, tomando en cuenta las vías de administración, síntomas, etc. Los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) y antagonistas o agonistas que son polipéptidos, también se pueden emplear de acuerdo con la presente invención mediante la expresión de dichos polipéptidos in vivo, que a menudo se refieren como "terapia génica". Por lo tanto, por ejemplo, las células de un paciente pueden ser genéticamente manipuladas con un polinucleótido (ADN o ARN) que codifica un polipéptido ex vivo, con las células genéticamente modificadas siendo provistas después a un paciente que va a ser tratado con el polipéptido. Dichos métodos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células pueden ser genéticamente manipuladas mediante procedimientos conocidos en la técnica mediante el uso de una partícula retroviral que contiene ARN que codifica un polipéptido de la presente invención. De manera similar, las células pueden ser genéticamente manipuladas in vivo para la expresión de un polipéptido in vivo mediante, por ejemplo, procedimientos conocidos en la técnica. Como se conoce en la técnica, una célula productora para producir una partícula retroviral que contiene ARN que codifica el polipéptido de la presente invención se puede administrar a un paciente para manipular genéticamente células in vivo y expresar el polipéptido in vivo. Estos y otros métodos para administrar un polipéptido de la presente invención por dicho método serán evidentes para el experto en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente invención. Por ejemplo, el vehículo de expresión para manipular genéticamente células puede ser otro distinto a retrovirus, por ejemplo, un adenovirus, que se puede usar para manipular genéticamente células in vivo después de combinarse con un vehículo de suministro adecuado. Los retrovirus a partir de los cuales se pueden derivar vectores de plásmido retrovirales antes mencionados ¡ncluyen, pero no se limitan a virus de leucemia murina de Moloney, virus de necrosis de bazo, retrovirus tales como virus de sarcoma de Rous, virus de sarcoma de Harvey, virus de leucosis aviaria, virus de leucemia de gibon, virus de inmunodeficiencia humana, adenovirus, virus de sarcoma mieloproliferativa y virus de tumor de mama. En una modalidad, el vector de plásmido retroviral se deriva de virus de leucemia murina de Moloney. El vector incluye uno o más promotores. Los promotores adecuados que se pueden emplear incluyen pero no se limitan a LTR retroviral; el promotor SV40; y el promotor de citomegalovirus humano (CMV) descrito en Miller, eí al., Biotechniques 7:980-990 (1989), o cualquier otro promotor (por ejemplo, promotores celulares tales como promotores de células eucarióticas que ¡ncluyen pero no se limitan a la histona, pol lll y promotores de ß-actina). Otros pomotores virales que se pueden emplear incluyen pero no se limitan a promotores de adenovirus, promotores de timidinacinasa (TK) y promotores de parvovirus B19. La selección de un promotor adecuado será evidente para los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas que aquí están contenidas. La secuencia de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido de la presente invención está bajo el control de un promotor adecuado. Los promotores adecuados que se pueden emplear incluyen pero no se limitan a promotores adenovirales, tales como el promotor final principal adenoviral; o promotores heterólogos tales como el promotor de citomegalovirus (CMV); el promotor de virus sincicial respiratorio (RSV); promotores inducibles tales como el promotor MMT, el promotor de metalotioneina; promotores de choque térmico; el promotor de albúmina; el promotor de ApoAl; promotores de globina humana; promotores de timidinacinasa viral, tales como el promotor de timidinacinasa de herpes simple; LTR retrovirales (incluyendo los LTR retrovirales modificados anteriormente descritos); el promotor de ß-actina y promotores de hormona de crecimiento humana. El promotor también puede ser el promotor nativo que controla los genes que controlan los polipéptidos. El vector de plásmido retroviral se emplea para transducir líneas de células de empaque para formar líneas de células productoras. Ejemplos de células de empaque que pueden ser transfectadas ¡ncluyen pero no se limitan a las líneas de células PE501 , PA317, ?-2, ?-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, ?CRE, ?CRIP, GP+E-86, GP+envAM12 y DAN como se describe en Miller, Human Gene Therapy 1:5-14, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. El vector puede transducir las células de empaque a través de cualesquiera métodos conocidos en la técnica. Dichos medios incluyen pero no se limitan a electroporación, el uso de liposomas y precipitación de CaPO4. En una alternativa el vector de plásmido electroviral puede ser encapsulado en un liposoma, o acoplado a un lípido, y después administrado a un hospedero. La línea de células productora genera partículas de vector retroviral infecciosas que incluyen la secuencia(s) de ácido nucleico que codifica los polipéptidos. Dichas partículas de vector retroviral pueden entonces emplearse para transducir células eucarióticas, ya sea in vitro o in vivo. Las células eucarióticas transducidas expresarán la secuencia(s) de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido. Las células eucarióticas que pueden ser transducidas incluyen pero no se limitan a células madre embrionarias, células de carcinoma embrionario, así como las células madre hematopoyéticas, hepatocitos, fibroblastos, mioblastos, queratinocitos, células endoteliales y células epiteleales bronquéales. La presente invención también provee un método para determinar si un ligando que no se sabe que es capaz de unirse a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) puede unirse a dicho receptor que consiste en poner en contacto una célula de mamífero que exprese un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) con el ligando bajo condiciones que permiten la unión de ligandos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), detectando la presencia de un ligando que se une al receptor y determinando así si el ligando se une al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Los sistemas anteriormente descritos para determinar agonistas y/o antagonistas también se pueden emplear para detectar ligandos que se unen al receptor. Esta invención también provee un método para detectar la expresión de un polipéptido receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención sobre la superficie de una célula detectando la presencia de ARNm que codifica para el receptor que consiste en obtener ARNm total de la célula y poniendo en contacto el ARNm así obtenido con una sonda de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico de por lo menos 10 nucleótidos capaz de hidrolizar específicamente con una secuencia incluida dentro de la secuencia de una molécula de ácido nucleico que codifica el receptor bajo condiciones de hidrólisiSj detectando la presencia del ARNm hibridado a la sonda, y detectando así la expresión del receptor por la célula. La presente invención también provee un método para identificar receptores relacionados con los polipéptidos receptores de la presente invención. Estos receptores relacionados pueden ser identificados por homología a un polipéptido receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención, mediante hibridación cruzada de baja astringencia, o identificando receptores que interactúan con ligandos naturales o sintéticos relacionados y/o induciendo comportamientos similares después de bloqueo génico o farmacológico de los polipéptidos receptores de quimiocina de la presente invención. Los fragmentos de los genes se pueden usar como una sonda de hibridación para una genoteca de ADNc para aislar otros genes que tienen una alta similitud de secuencia a los genes de la presente invención, o que tienen actividad biológica similar. Las sondas de este tipo son de por lo menos 20 bases, preferiblemente por lo menos de 30 bases y muy preferiblemente por* lo menos de 50 bases o más. La sonda también se puede usar para identificar un clon de ADNc que corresponde a una transcripción de longitud completa y un clon o clones genómicos que contienen el gen completo de la presente invención incluyendo regiones reguladoras y promotoras, exones e intrones. Un ejemplo de una selección de este tipo consiste en aislar la región de codificación del gen usando la secuencia de ADN conocida para sintetizar la sonda de oligonucleótido. Los oligonucleótidos marcados que tienen una secuencia complementaria a la de los genes de la presente invención se usan para seleccionar una genoteca de ADNc humana, ADN genómico o ARNm para determinar a qué miembros de la genoteca hidrida la sonda. La presente invención también contempla el uso de los genes de la presente invención como un diagnóstico, por ejemplo, algunas enfermedades resultan de genes defectuosos heredados. Estos genes pueden ser detectados comparando las secuencias del gen defectuoso con la del normal. Subsecuentemente, se puede verificar que un gen "mutante" está asociado con actividad receptora anormal. Además, se puede insertar genes receptores mutantes en un vector adecuado para la expresión en un sistema de prueba funcional (por ejemplo, prueba colorimétrica, expresión en placas de MacConkey, experimentos de complementación, en una sepa deficiente de receptor de células HEK293) como otros medios para verificar o identificar mutaciones. Una vez que los genes "mutantes" han sido identificados, se puede seleccionar la población para portadores del gen receptor "mutante". Los individuos que portan mutaciones en el gen de la presente invención pueden ser detectados al nivel de ADN mediante una variedad de técnicas. Los ácidos nucleicos usados para el diagnóstico se pueden obtener a partir de una célula del paciente, incluyendo pero no sin limitarse a material sanguíneo, de orina, saliva, biopsia de tejido y autopsia. El ADN genómico se puede usar directamente para la detección o puede ser enzimáticamente amplificado usando PCR (Saiki, et al., Nature 324:163-166 (1986)) antes del análisis. El ARN o ADNc también se puede usar para el mismo propósito.

Como un ejemplo, los iniciadores de PCR complementarios al ácido nucleico de la presente invención se pueden usar para identificar y analizar mutaciones en el gen de la presente invención. Por ejemplo, se pueden detectar deleciones e inserciones mediante un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal. Las mutaciones puntuales se pueden identificar hibridando ADN amplificado a ARN radiomarcado de la invención o alternativamente secuencia de ADN antisentido radiomarcadas de la invención. Las secuencias perfectamente coincidentes se pueden distinguir de los dúplex no coincidentes por digestión de ARNasa A o por diferencias en temperaturas de fusión. Dicho diagnóstico sería particularmente útil para pruebas prenatales o incluso neonatales. Diferencias de secuencia entre el gen de referencia y "mutantes" pueden ser revelados por el método de secuenciación de ADN directo. Además, segmentos de ADN clonados se pueden usar como sondas para detectar segmentos de ADN específicos. La sensibilidad de esta método es incrementada en gran parte cuando se combina con PCR. Por ejemplo, un iniciador de secuencia se usa con un producto de PCR de doble cadena o una molécula de molde de una sola cadena generado por PCR modificado. La determinación de secuencia se realiza mediante procedimiento convencionales con ácidos nucleótido radiomarcado o mediante un procedimiento de secuenciación automático con etiquetas fluorescentes. La prueba genética basada en diferencias de secuencia de ADN se puede lograr mediante la detección de alteraciones en la movilidad electroforética de fragmentos de ADN en geles con o sin agentes desnaturalizantes. Los cambios de secuencias en sitios específicos también pueden ser revelados por prueba de protección de núcleo, tal como protección de ARNasa y S1 o el método de digestión química (por ejemplo, Cotton, et al., PNAS, EUA 85:4397-4401 (1985)). - Además, algunas enfermedades son el resultado de, o se caracterizan por cambios en la expresión de genes que puede ser detectada mediante cambios en el ARNm. Alternativamente, los genes de la presente invención se pueden usar como una referencia para identificar individuos que expresan una disminución de funciones asociadas con receptores de este tipo. La presente invención también se refiere a una prueba de diagnóstico para detectar niveles alterados de formas solubles de los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención en varios tejidos. Las pruebas usadas para detectar niveles de los polipéptidos de receptor solubles en una muestra derivada de un hospedero son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen radioinmunoensayos, pruebas de unión competitiva, análisis de Western blot y preferiblemente una prueba de ELISA. Una prueba de ELISA inicialmente consiste en preparar un anticuerpo específico para antígenos de los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), preferiblemente un anticuerpo monoclonal. Además se prepara un reportero contra el anticuefo monoclonal. Al anticuerpo reportero se fija un reactivo detectable tal como radioactividad, fluorescencia o en este ejemplo una enzima de peroxidasa de rábano. Una muestra es removida ahora de un hospedero e incubada en un soporte sólido, por ejemplo, una caja de poliestireno, que une las proteínas en la muestra. Cualesquiera sitios de unión de proteína libres en la caja son después cubiertos incubando con una proteína no específica tal como albúmina de suero de bovino. Enseguida, el anticuefo monoclonal es incubado en la caja, tiempo durante el cual los anticuerpo s monoclonales se fijan a cualesquiera proteínas del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) fijadas a la caja de poliestireno. Todo el anticuerpo monoclonal no unido es lavado con regulador de pH. El anticuerpo reportero enlazado a peroxidasa de rábano es colocado ahora en la caja dando por resultado la unión del anticuefo reportero a cualquier anticuefo monoclonal unido a proteínas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). El anticuefo reportero no unido es después lavado. Los sustratos de peroxidasa se añaden después a la caja y la cantidad de color revelado en un periodo dado es una medición de la cantidad de proteínas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) presentes en un volumen dado de muestra de paciente cuando se compara contra una curva estándar. Las secuencias de la presente invención también son valiosas para identificación de cromosomas. La secuencia es específicamente dirigida a y puede hibridar con un sitio particular en un cromosoma humano individual. Además, existe una necesidad actual de identificar sitios particulares en el cromosoma. Algunos reactivos de mareaje de cromosoma basados en datos de secuencia reales (polimorfismos repetidos) están actualmente disponibles para marcar la ubicación cromosómica. El mapeo de ADN a cromosomas de conformidad con la presente invención es un primer paso importante en la correlación de aquellas secuencias con genes asociados con enfermedad. En breve, las secuencias se pueden mapear a cromosomas preparando iniciadores de PCR (preferiblemente 15-25 pb) a partir del clon. El análisis por computadora de ADN del clon depositado se usa para seleccionar rápidamente iniciadores que no se expanden más de un exon en el ADN genómico, complicando así el procedimiento de amplificación. Estos iniciadores después se usan para selección por PCR de híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. Sólo aquellos híbridos que contienen el gen humano correspondiente al iniciador darán un fragmento amplificado. El mapeo por PCR de híbrido de célula somática es un procedimiento rápido para asignar un ADN particular a un cromosoma particular. Usando la presente invención con los mismos iniciadores de oiigonucleótidos, la sublocalización se puede lograr con paneles de fragmentos de cromosomas específicos o reservas de clones genómicos grandes en una forma análoga. Otras estrategias de mapeo que se pueden usar de manera similar para mapear a su cromosoma incluyen hibridación in situ, preselección con cromosomas de flujo distribuido marcados y preselección por hibridación para construir genotecas de ADN específicas de cromosoma. La hibridación in situ por fluorescencia (FISH) de un clon de ADN a una extensión cromosómica de metafase se puede usar para proveer una localización cromosómica precisa en un paso. Esta técnica puede usarse con ADN tan corto como de 50 ó 60 bases. Para una revisión de esa técnica, véase Verma eí al, Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988). Una vez que una secuencia ha sido mapeada a una localización cromosómica precisa, la posición física de la secuencia en el cromosoma se puede correlacionar con datos de mapa genético. Dichos datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponible en línea a través de Johns Hopkins University Welch Medical Library). La relación entre genes y enfermedades que han sido mapeadas a la misma región cromosómica son después identificados mediante análisis de enlace (coherencia de genes físicamente adyacentes). Enseguida, es necesario determinar las diferencias en la secuencia de ADNc o genómica entre individuos afectados y no afectados. Si se observa una mutación en algunos o todos los individuos afectados pero no se observa en ningún individuo normal, entonces la mutación probablemente es el agente causante de la enfermedad. Con resolución actual de técnicas de mapeo físico y mapeo genético, un ADNc precisamente localizado a una región cromosómicamente asociada con la enfermedad podría ser uno de entre 50 y 500 genes causantes potenciales (esto supone una resolución de mapeo de una megabase y un gen por 20 kb). Los polipéptidos, sus fragmentos u otros derivados, o análogos de los mismos, o células que los expresan se pueden usar como un inmunógeno para producir anticuerpos para el mismo. Estos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales. La presente invención también incluye anticuerpos quiméricos, de una sola cadena y humanizados, así como fragmentos Fab o el producto de una genoteca de expresión de Fab. Varios procedimientos conocidos en la técnica se pueden usar para la producción de dichos anticuerpos y fragmentos. Los anticuefos generados contra los polipéptidos correspondientes a una secuencia de la presente invención se pueden obtener por inyección directa de los polipéptidos en un animal o administrando los polipéptidos a un animal, preferiblemente un animal no humano. El anticuerpo así obtenido se unirá entonces a los polipéptidos mismos. De esta manera, incluso una secuencia que codifica solo un fragmento de los polipéptidos se puede usar para generar anticuerpos que se unen a todos los polipéptidos nativos. Dichos anticuerpos se pueden usar para aislar el polipéptido del tejido que expresa ese polipéptido. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede usar cualquier técnica que provea anticuerpos producidos por cultivos de línea celular continuos. Ejemplos de los mismos incluyen la técnica de hibridoma (Kohier y Milstein, Nature 256:495-497 (1975)), la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor eí al., Immunology Today 4:72 (1983)), y la técnica de EBV-hibridoma para producir anticuefos monoclonales humanos (Colé, eí al., en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), pp. 77-96). Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una sola cadena (patente de E.U.A. 4,946,778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de una sola cadena a productos de polipéptidos inmunogénicos de esta invención. También, se pueden usar ratones transgénicos para expresar anticuerpos humanizados a productos de polipéptidos inmunogénicos de esta invención. La presente invención se describirá además con referencia a los siguientes ejemplos; sin embargo, se debe entender que la presente invención no se limita a dichos ejemplos. Todas las partes o cantidades, a menos que se especifique otra cosa, son en peso. A fin de facilitar la comprensión de los siguientes ejemplos se describirán ciertos métodos y/o términos que ocurren frecuentemente. "Plásmidos" son designados por una p precedida y/o seguida por letras mayúsculas y/o números. Los plásmidos de inicio en la presente están ya sea comercialmente disponibles, públicamente disponibles en una base no restringida, o se pueden construir a partir de plásmidos disponibles de acuerdo con procedimientos publicados. Además, los plásmidos equivalentes a aquellos descritos se conocen en la técnica y serán evidentes para el experto en ía técnica. . "Digestión" de ADN se refiere a la digestión catalítica del ADN con una enzima de restricción que actúa sólo en ciertas secuencias en el ADN. Las diversas enzimas de restricción usadas en la presente están comercialmente disponibles y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requerimientos se usaron como lo conocería un experto en la técnica. Para propósitos analíticos, típicamente 1 µg de plásmido o fragmento de ADN se usa con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 µl de solución reguladora de pH. Para el propósito de aislar fragmentos de ADN para construcción de plásmido, típicamente 5 a 50 µg de ADN fueron digeridos con 20 a 250 unidades de enzima en un volumen grande. Los reguladores de pH apropiados y cantidades de sustrato apropiadas para enzima de restricción particulares son especificados por el fabricante. Los tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 37°C son ordinariamente usados, pero pueden variar de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Después de la digestión la reacción se somete a electroforesis directamente en un gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado. La separación por tamaños de los fragmentos digeridos se realiza usando 8 por ciento de gel de poliacriiamida descrito por Goeddel, D eí al., Nucíeid Acids Res. 8:4057 (1980). "Oligonucleótidos" se refiere a un polidesoxinucleótido de una sola cadena o dos cadenas de polidesoxinucleótido complementarias que pueden ser químicamente sintetizadas. Dichos oligonucleótidos sintéticos no tiene 5'fosfato y por lo tanto no se ligan a otro oligonucleótido sin la adición de un fosfato con un ATP en presencia de una cinasa. Un oligonucleótido sintético se ligará a un fragmento que no ha sido desfosforilado. "Ligación" se refiere al procedimiento de formar enlaces de fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico de doble cadena (Maniatis, T., eí al., Id., p. 146). A menos que se provea de otra manera, la ligación se puede lograr usando reguladores de pH conocidos y condiciones con 10 unidades de ADN ligasa de T4 ("ligasa") por 0.5 µg de aproximadamente cantidades equimolares de fragmentos de ADN que han de ser ligados. A menos que se establezca de otra manera, la transformación se realizó como se describe en el método de Graham, F. y Van der Eb, A., Virology 52:456-457 (1973). En la presente invención, "aislado" se refiere a material removido de su ambiente original (por ejemplo, el ambiente natural si está ocurriendo naturalmente), y por lo tanto es alterado "por la mano del hombre" a partir de su estado natural. Por ejemplo, un polinucelótido aislado podría ser parte de un vector o una composición de material, o podría ser contenido dentro de una célula, y sin embargo puede ser "aislado" debido a que el vector, composición de material o célula particular no es el ambiente original del polinucleótido. El término "aislado" no se refiere a las genotecas genómica o de ADNc, total de células enteras o preparaciones de ARNm, preparaciones de ADN genómico (incluyendo aquellas separadas por electroforesis y transferidas en manchas), preparaciones de ADN genómico de células enteras compartidas u otras composiciones en donde la técnica demuestra que no hay características de distinción del polinucleótido/secuencias de la presente invención. En la presente invención, una proteína de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) "secretada" o "soluble" se refiere a una proteína capaz de ser dirigida al retículo endoplásmico, vesículas secretoras o el espacio extracelular como resultado de una secuencia de señal, así como una proteína de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) liberada en el espacio extracelular sin que contenga necesariamente una secuencia de señal. Si la proteína secretada de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) es liberada en el espacio extracelular, la proteína secretada de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) puede pasar por un procesamiento extracelular para producir una proteína de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) "madura". La liberación en el espacio extracelular puede ocurrir por muchos mecanismos, incluyendo exocitosis y digestión proteolítica. Ejemplos de proteína de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) secretada o soluble incluye fragmentos que comprenden, o que consisten alternativamente de porciones de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) aquí descritas. Los fragmentos secretados o solubles preferidos comprenden un bucle extracelular, un bucle intracelular, el dominio extracelular N-terminal o ej dominio intracelular C-terminal o fragmentos de los mismos. Los fragmentos secretados o solubles preferidos adicionales comprenden un epítope del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), tal como se describe aquí. Como se usa aquí, un "polinucleótido" de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se refiere a una molécula que tiene una secuencia de ácidos nucleicos contenida en SEQ ID NO: 1 o el ADN de receptor de quimiocina de proteína G contenido dentro del clon depositado con el ATCC. Por ejemplo, el polinucleótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) puede contener la secuencia de nucleótidos de la secuencia genómica de longitud completa, incluyendo las secuencias no traducidas 5' y 3', la región de codificación, con o sin la secuencia de señal, la región de codificación de proteína secretada así como fragmentos, epítopes, dominios y variantes de la secuencia de ácido nucleico. Además, como se usa aquí, un "polipéptido" de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se refiere a una molécula que tiene la secuencia de aminoácidos traducida generada a partir del polinuleótido como se define ampliamente. En modalidades específicas, los polinucleótidos de la invención son por lo menos 15, por lo menos 30, por lo menos 50, por lo menos 100, por lo menos 125, por lo menos 500 o por lo menos 1000 nucleótidos continuos pero son menores que o ¡guales a a 300 kb, 200 kb, 100 kb, 50 kb, 15 kb, 10 kb, 7.5 kb, 5 kb, 2.5 kb, 2.0 kb o 1 kb de longitud. En una modalidad adicional, los polinucelótidos de la invención comprenden una porción de las secuencias de codificación, como se describe aquí, pero no comprenden todas o una porción de cualquier intrón. En otra modalidad, los polinucelótidos que comprenden secuencias de codificación no contienen secuencias de codificación de un gen blanqueador genómico (es decir, 5' o 3' al gen de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de interés en el genoma). En otras modalidades, ios polinucelótidos de la invención no contienen la secuencia de codificación de más de 1000, 500, 250, 100, 50, 25, 15, 10, 5, 4, 3, 2 ó 1 genes flanqueadores genómicos. Un clon representativo que contiene el marco de lectura abierto de la secuencia de SEQ ID NO: 1 se depositó en el American Type Culture Collection (Depósito Norteamericano de Cultivos Tipo o "ATCC") el 1o de junio de 1995, y se dio el húmero de depósito de 97183. El ATCC está ubicado en 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, E.U.A. El depósito de ATCC se hizo de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest en el reconocimiento internacional del depósito de microorganisos para propósitos del procedimiento de patentes. Un "polinucleótido" de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también incluye aquellos polinucleótidos capaces de hibridar, bajo condiciones de hibridación astringentes, a secuencias contenidas en SEQ ID NO:1 , el complemento de las mismas, o el ADN dentro del clon depositado. "Condiciones de hibridación astringente" se refiere a una incubación durante la noche a 42 grados C en una en una solución que comprende 50% de formamida, 5x SSC (750 mM de NaCI, 75 mM de citrato de trisodio), 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.6), solución de Denhardt 5x, 10% de sulfato de dextrano y 20 µg/ml de ADN de es esperma de salmón compartido desnaturalizado, seguido por lavado en filtros de 0.1 x SSC a aproximadamente 65 grados C. También se contemplan moléculas de ácido nucleico que hibridan a los polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) bajo condiciones de hibridación de astringencia inferior. Los cambios en la astringencia de hibridación y detección de señal se logran principalmente mediante la manipulación de la concentración de formamida (porcentajes inferiores de formamida dan por resultado astringencia reducida); condiciones de sal, o temperatura. Por ejemplo, las condiciones de astringencia inferiores incluyen una incubación durante la noche a 37 grados C en una solución que comprende 6X SSPE (20X SSPE = 3 M de NaCI; 0.2 M de NaH2PO4; 0.02 M de EDTA, pH 7.4), 0.5% de SDS, 30% de formamida, 100 µg/ml de ADN bloqueador de esperma de salmón; seguido por enjuagues a 50 grados C 1XSSPE, 0.1% de SDS. Además, para lograr astringencia aún más baja, los lavados realizados siguiendo la hibridación astringente se pueden hacer a concentraciones de sal mayores (por ejemplo 5X SSC). Nótese que variaciones en las condiciones anteriores se pueden logran mediante la inclusión y/o sustitución de reactivos bloqueadores internos usados para suprimir el fondo en experimentos de hibridación. Los reactivos bloqueadores típicos incluyen reactivos de Denhardt, BLOTTO, heparina, ADN de esperma de salmón desnaturalizado y formulaciones propias comercialmente disponibles. La inclusión de reactivos bloqueadores específicos puede requerir la modificación de las condiciones de hibridación anteriormente descritas, debido a problemas con compatibilidad. Desde luego, un polinucleótido que híbrida sólo a secuencias de poliA+ (tales como cualquier tracto de poliA+ 3' terminal de un ADN mostrado en el listado de secuencias), o a una extensión complementaria de residuos T (o U), no se incluiría en la definición de "polinucleótido", ya que dicho polinucleótido hibridaría a cualquier molécula de ácido nucleico que contuviera una extensión de poli (A) o el complemento de la misma (por ejemplo, prácticamente ningún ADNc de doble cadena generado usando oligo dT como un iniciador). El polinucleótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) puede estar compuesto de cualquier polirribonuclétido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN y ADN no modificado, o ARN o ADN modificado. Por ejemplo, los polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) puede estar compuesto de ADN de una sola cadena y de doble cadena, ADN que es una mezcla de regiones de una sola cadena y de doble cadena, ARN de una sola cadena y de doble cadena y ARN que es una mezcla de regiones de una sola cadena y de doble cadena, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser de una sola cadena o, muy típicamente, de doble cadena o una mezcla de regiones de una sola cadena y de doble cadena. Además, los polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden componer de regiones de triple cadena que comprenden ARN o ADN, o tanto ARN como ADN. Los polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también pueden contener una o más bases modificadas o estructuras de base de ADN o ARN modificadas para estabilidad o para otras razones. Las bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases no usuales tales como inosina. Una variedad de modificaciones se pueden hacer a ADN y ARN; por lo tanto, "polinucleótido" abarca formas químicamente, enzimáticamente o metabólicamente modificadas. Los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) pueden estar compuestos de aminoácidos unidos unos a otros por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isoésteres de péptidos y pueden contener aminoácidos distintos a los 20 aminoácidos codificados por genes. Los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) pueden ser modificados ya sea mediante procesos naturales, tales como procesos postraducción o mediante técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica. Dichas modificaciones son bien descritas en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una literatura de investigación voluminosa. Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier lado en un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), incluyendo la estructura de base de péptido, las cadenas laterales de aminoácidos y los grupos amino terminales o carboxilo terminales. Se apreciará que el mismo tipo de modificaciones puede estar presente en los mismos grados o grados variables en varios sitios en un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G dado (CCR5). También, un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) pueden ser ramificados, por ejemplo, como resultado de ubiquinitación, y pueden ser cíclicos con o sin ramificación. Los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden resultar de procesos naturales de postraducción o se pueden hacer mediante métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen la acetiiación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una porción heme, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfotidinositol, entrelazamiento, ciclización, formación de enlace de disulfuro, desmetilación, formación de entrelazamientos covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, giicosilación, formación de anclaje de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procedimiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tales como arginilación y ubiquitinación. (Véase, por ejemplo, PROTEINS -STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2a ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, ed., Academic Press, New York, págs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992).) "SEQ ID NO:1" se refiere a una secuencia de polinucleótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) mientras que "SEQ ID NO:2" se refiere a una secuencia de polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) "que tiene actividad biológica" se refiere a polipéptidos que presentan actividad similar, pero no necesariamente idéntica a una actividad de un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), incluyendo formas maduras, como se mide en una prueba biológica particular, con o sin dependencia de dosis. En el caso en el que la dependencia de dosis existe, no necesita ser idéntica a la del polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), sino más bien sustancialmente similar a la dependencia de dosis en una actividad dada en comparación con el polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (es decir, el polipéptido candidato presentará mayor actividad o no más de aproximadamente 25 veces menos y preferiblemente no menos de aproximadamente diez veces menos actividad, y muy preferiblemente aún no más de aproximadamente tres veces menos actividad en relación con el polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5)).

Polinucléotidos v polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) El clon HDGNR10 se aisló de una genoteca de ADN genómico de monocitos humanos. Este clon contiene la región de codificación entera identificada como SEQ ID NO:2. El clon depositado contiene un inserto de ADN que tiene un total de 1414 nucleótidos, que codifica un marco de lectura abierto predicho de 352 residuos de aminoácidos (véase figura 1 ). El marco de lectura abierto empieza en la metionina N-terminal ubicada en la posición 259 de nucleótido, y termina como la última completa tripleta que codifica para un aminoácido en la posición 1314 de nucleótido. El codón de detención está en las posiciones 1315-1317. El análisis de expresión subsecuente también mostró expresión de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) en macrófagos, incluyendo células dendríficas inmaduras tales como células de Langerhans, y células T, incluyendo células efectoras ThO y Th1 , un patrón consistente con la expresión específica del sistema inmune. El receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también se ha detectado en células de microgia, astrositos, neuronas y células endoteliales vasculares del sistema nervioso central (SNC). El receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también se expresa en monocitos y células T en el fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide y también se ha implicado en otras formas de artritis.

Receptores de quimiocina acoplados a proteína G Usando análisis BLAST, se encontró que SEQ ID NO:2 era homólogo a miembros de la familia de receptor de quimiocina acoplado a proteína G. Particularmente, SEQ ID NO:2 contiene dominios homólogos al producto de traducción del ARNm de MonoMac 6 para receptor de MCP-1 humano (MCP-1 R) A (figura 2) (acceso al banco de genes No. U03882; SEQ ID NO:9), incluyendo el dominio de trasmembrana conservada que contiene siete segmentos de trasmembrana característicos de la familia de receptor acoplado a proteína G, que empieza con el aminoácido 37 de SEQ ID NO:2 o el polipéptido codificado por el clon depositado. El receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también incluye el motivo DRY, que se sabe que se requiere para transducción de señal, encontrado en muchos receptores acoplados a proteína G inmediatamente después del tercer segmento de trasmembrana. Debido a que se piensa que MCP-1 R es importante en el sistema inmune, la homología entre MCP-1R y el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) sugiere que el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también puede estar implicado en el sistema inmune. También se ha aislado una segunda secuencia de MCP-1 R que es Idéntica a la secuencia de MCP-1 RA de la región no traducida 5' a través del séptimo dominio de trasmembrana putativo pero que contiene una cola citoplásmica diferente. Esta segunda secuencia, denominada MCP-1 RB, parece ser una versión alternativamente empalmada de MCP-1RA. Se describe además en la patente de E.U.A. No. 5,707,815.

Dominios Usando análisis de BLAST, se encontró que SEQ ID NO:2 era homólogo a miembros de la familia de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Particularmente, SEQ ID NO:2 contiene dominios homólogos al producto de traducción de ARNm de MonoMac para receptor de MCP-1 humano (MCP-1 R) A (figura 2) (acceso al banco de genes No. U03882; SEQ ID NO:9), incluyendo los siguientes dominios conservados: (a) un dominio extracelular N-terminal predicho localizado en aproximadamente los aminoácidos 1 a 36; (b) un dominio de trasmembrana predicho localizado en aproximadamente los aminoácidos 37 a 305; y (c) un dominio intracelular C-terminal predicho localizado en aproximadamente los aminoácidos 306 a 352. el dominio de trasmembrana predicho incluye: siete segmentos de trasmembrana en aproximadamente los aminoácidos 37 a 58 (segmento 1), 68 a 88 (segmento 2), 103 a 124 (segmento 3), 142 a 166 (segmento 4), 196 a 223 (segmento 5), 236 a 260 (segmento 6), y 287 a 305 (segmento 7); tres bucles intracelulares en aproximadamente los aminoácidos 59 a 67 (bucle intracelular 1), 125 a 141 (bucle intracelular 2), y 224 a 235 (bucle intracelular 3); y tres bucles extracelulares en aproximadamente los aminoácidos 898 a 102 (bucle extracelular 1), 167 a 195 (bucle extracelular 2), y 261 a 274 (bucle extracelular 3). Estos fragmentos de polipéptido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) como se definió antes o como es codificado por el clon depositado (SEQ ID NO:22) se contemplan específicamente en la presente invención, como lo son las combinaciones de éstas y otras regiones aquí descritas. También se contemplan polipéptidos que excluyen a uno o más de estos dominios, segmentos y bucles. Los "bucles" también referidos aquí como "regiones", "dominios" y "porciones" en la presente y en la técnica, por ejemplo, "regiones" extracelulares, "regiones" intracelulares "dominios" extracelulares, y "dominios" intracelulares, "porciones" extracelulares y "porciones" intracelulares. SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 traducida son suficientemente precisas y de otra manera adecuada para una variedad de usos bien conocidos en la técnica y descritos más adelante. Por ejemplo, SEQ ID NO:1 es útil para designar sondas de hibridación de ácido nucleico que detectarán secuencias de ácido nucleico contenidas en SEQ ID ÑO:1 o el ADN contenido én el clon depositado. Estas sondas también hibridarán a moléculas de ácido nucleico en muestras biológicas, habilitando así una variedad de métodos de pronóstico y diagnóstico de la invención. De manera similar, los polipéptidos identificados de SEQ ID NO:2 se pueden usar, por ejemplo, para generar anticuerpos que se unen específicamente a receptor de quimiocina de proteína G de proteínas. Sin embargo, las secuencias de ADN generadas mediante reacciones de secuenciación pueden contener errores de secuenciación. Los errores existen como nucleótidos mal identificados, o como inserciones o deleciones de nucleótidos en ]a secuencia de ADN generada. Los nucleótidos erróneamente insertados o suprimidos causan desplazamientos de marco en los marcos de lectura de la secuencia de aminoácidos predicha. En estos casos, la secuencia de aminoácidos predicha diverge de la secuencia de aminoácidos real, aún cuando la secuencia de ADN generada pueda ser mayor de 99.9% idéntica a la secuencia de ADN real (por ejemplo, una inserción o deleción de base en un marco de lectura abierto de aproximadamente 1000 bases). Por consiguiente, para aquellas aplicaciones que requieren precisión en la secuencia de nucleótidos o la secuencia de aminoácidos, la presente invención provee no sólo la secuencia de nucleótidos generada identificada como SEQ ID NO:1 y la secuencia de aminoácidos traducida predicha identificada como SEQ ID NO:2, sino también una muestra de ADN de plásmido que contiene un ADN humano de receptor de quimiocina de próteína G (CCR5) depositado con el ATCC. La secuencia de nucleótidos dei clon de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se puede determinar fácilmente secuenciando el clon depositado de acuerdo con métodos conocidos. La secuencia de aminoácidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) predicha se puede verificar entonces a partir de dichos depósitos. Además, la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el clon depositado también se puede determinar directamente mediante secuenciación de péptidos o mediante expresión de la proteína en una célula hospedera adecuada que contiene el ADN de receptor de quimiocina de proteína G humano depositado (CCR5), colectando la proteína y determinando su secuencia. Una muestra del clon depositado, que contiene el marco de lectura abierto del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), se ha obtenido a partir del ATCC y ha sido resecuenciado. Los datos de secuencia del clon resecuenciado se muestra en SEQ ID NO:21 y 22. Seq ID NO:21 difiere de SEQ ID NO:1 en 5 posiciones (nucleótidos 320, 433, 442, 646 y 1289 de SEQ ID NO:1) SEQ ID NO:22 difiere de SEQ ID NO:2 en 5 posiciones (residuos de aminoácidos 21 , 59, 62, 130 y 344). La presente invención también se refiere al gen de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) correspondiente a SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, o al clon depositado. El gen de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se puede aislar de acuerdo con métodos conocidos usando la información de secuencia que aquí se describe. Dichos métodos ¡ncluyen preparar sondas o iniciadores a partir de la secuencia descrita e identificando o amplificando ei gen de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de fuentes apropiadas de material genómico. En la presente invención también se proveen variantes alélicas, ortólogos y/u homólogos de especies. Los procedimientos conocidos en la técnica se pueden usar para obtener genes de longitud completa, variantes alélicas, variantes de empalme, porciones de codificación de longitud completa, ortólogos y/u homólogos de especies de genes correspondientes a SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, o al clon depositado, usando información de las secuencias que aquí se describen o los clones depositados con el ATCC. Por ejemplo, variantes alélicas y/o especies homologas se pueden aislar e identificar haciendo sondas o iniciadores adecuados de las secuencias provistas en la presente invención y seleccionando una fuente de ácido nucleico adecuada para variantes alélicas y/u homólogo deseado. Lo polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden preparar de cualquier manera adecuada. Dichos polipéptidos incluyen polipéptidos que ocurren en forma natural aislados, polipéptidos recombinantemente reproducidos, polipéptidos sintéticamente producidos o polipéptidos producidos por una combinación de estos métodos. Los medios para preparar dichos polipéptidos se entienden bien en la técnica. Los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) pueden estar en forma de la proteína secretada, incluyendo la forma madura o pueden ser una parte de una proteína más grande, tal como una proteína de fusión (véase más adelante). Es a menudo ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional que contiene secuencias secretoras o líderes, prosecuencias, secuencias que ayudan en la purificación, tales como residuos de histidina múltiples, o una secuencia adicional para estabilidad durante la producción de recombinante. Los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se proveen preferiblemente en una forma aislada, y preferiblemente son sustancialmente purificados. Una versión recombinantemente producida de un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), que incluye el polipéptido secretado, puede ser sustancialmente purificada usando técnicas descritas en la presente invención o de otra manera conocidas en la técnica, así como por ejemplo mediante el método de un paso descrito en Smith y Jonson, Gene 67:31-40 (1988). Los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también se pueden purificar a partir de fuentes naturales, sintéticas o recombinantes usando técnicas que aquí se describen o de otra manera conocidas en la técnica, tales como anticuerpos de la invención producidos contra la proteína de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). La presente invención provee un polinucleótido que comprende o que consiste alternativamente de la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:1 , y/o un clon contenido en el depósito de ATCC 97183. La presente invención también provee un polipéptido que comprende o alternativamente que consiste de la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO:2 y/o un polipéptido codificado por el clon contenido en el depósito de ATCC 97183. Los poiinucleótidos que contienen un polipéptido que comprende o alternativamente que consiste de la secuencia de polipéptido de SEQ ID NO:2 y/o una secuencia de polipéptido codificada por el clon contenido en el depósito de ATCC 97183 también es abarcado por la invención.

* Secuencias de señal Como se describe aquí, la presente invención también abarca fusiones de una secuencia de señal con el polipéptido de SEQ ID NO:2, y fragmentos del mismo, y/o el polipéptido codificado por el clon depositado, y fragmentos del mismo, para dirigir la secreción del polipéptido o fragmento.

Los polinucleótidos que codifican dichas fusiones también son abarcadas por la invención. La presente invención también abarca formas maduras del polipéptido que tienen la secuencia SEQ ID NO:2, y fragmentos del mismo, y/o la secuencia de polipéptido codificada por el clon depositado, y fragmentos del mismo. Los polinucleótidos que codifican las formas maduras (tales como, por ejemplo, la secuencia del polinucleótido en SEQ ID NO:1 , y fragmentos del mismo, y/o la secuencia de polinucleótidos contenida en el clon depositado, y fragmentos del mismo) también son abarcadas por la invención. De acuerdo con la hipótesis de señal, las proteínas secretadas por células de mamífero tienen una señal o secuencia líder secretora que es digerida de la proteína madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena de proteína G en crecimiento a través del retículo endoplásmico rugoso. La mayoría de las células de mamíferos e incluso células de insecto digieren proteínas secretadas con la misma especificidad. Sin embargo, en la mayoría de los casos, la digestión de una proteína secretada no es completamente uniforme, lo cual da por resultado dos o más especies maduras de la proteína. Además, se ha sabido desde hace mucho que la especificidad de digestión de una proteína secretada es finalmente determinada por la estructura primaria de la proteína completa, es decir, es inherente en la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Los métodos para predecir si una proteína tiene una secuencia de señal, así como el punto de segmentación para esa secuencia, están disponibles. Por ejemplo, el método de McGeoch, Virus Res. 3:271-286 (1985), usa la información de una región cargada N-terminal corta y una región no cargada subsecuente de la proteína completa (no digerida). El método de von Heinje, Nucleic Acids Res. 14:4683-4690 (1986) usa la información de los residuos que rodean al sitio de digestión. Típicamente los residuos -13 a +2, en donde +1 indica el amino terminal de la proteína secretada. La precisión de predicción de los puntos de digestión de proteínas secretoras de mamíferos conocidas para cada uno de estos métodos está en el ¡ntervalo de 75-80%. (von Heinje, supra). Sin embargo, los dos métodos no siempre producen los mismos puntos de segmentación predichos para una proteína dada. La secuencia de aminoácidos deducida de un polipéptido secretado puede ser analizada por un programa de computadora denominado SignalP (Henrik Nielsen et al., Protein Engineering 10:1-6 (1997)), que predice la localización celular de una proteína basada en la secuencia de aminoácidos. Como parte de esta predicción computacional de localización, se incorporan los métodos de McGeoch y von Heinje. Sin embargo, como lo apreciará un experto en la técnica, los sitios de digestión algunas veces varían de un organismo a otro y no pueden ser predichos con absoluta certidumbre. A digestión de una secuencia de señal heteróloga en una proteína de fusión puede ocurrir en la unión de las secuencias de polipéptidos o la digestión puede ocurrir en una posición en cualquier lado de la unión. Por consiguiente, la presente invención provee polipéptidos secretados que tienen una secuencia mostrada en SEQ ID NO:2, y fragmentos de los mismos, que tienen un N-terminal que empieza dentro de 5 residuos (es decir, + o -5 residuos) del punto de digestión predicho. De manera similar, también se reconoce que en algunos casos, la digestión de la secuencia de señal de una proteína secretada no es completamente uniforme, dando por resultado más de una especie secretada. Estos polipéptidos y fragmentos, y los polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos y fragmentos, se contemplan en la presente invención. Además, la secuencia de señal identificada por el análisis anterior puede no necesariamente predecir la secuencia de señal que ocurre naturalmente. Por ejemplo, la secuencia de señal que ocurre naturalmente puede ser hacia el extremo 5' desde la secuencia de señal predicha. Sin embargo, es probable que la secuencia de señal predicha sea capaz de dirigir la proteína secretada al retículo endoplásmico. Sin embargo, la presente invención provee la proteína madura o fragmento producido por expresión de la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO:1 o un fragmento de la misma y/o la secuencia de polinucleótido contenida en el clon depositado o un fragmento de la misma, en una célula de mamífero (por ejemplo, células COS como se describe más adelante). Estos polipéptidos, y los polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos, son contemplados en la presente invención.

' Variantes de polinucleótido v polipéptido La presente invención está dirigida a variantes de la secuencia de polinucleótido descrita en SEQ ID NO:1, la cadena complementaria a la misma y/o la secuencia contenida en un clon depositado. La presente invención también comprende variantes de la secuencia de polipéptido descrita en SEQ ID NO:2 y/o codificada por un clon depositado. "Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere del polinucleótido o polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), pero que retiene las propiedades esenciales del mismo. En general, las variantes son estrechamente similares y en muchas regiones idénticas al polinucleótido o polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). La presente invención también está dirigida a moléculas de ácidos nucleicos que comprenden, o que consisten alternativamente de una secuencia de nucleótidos que es por lo menos de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a por ejemplo la secuencia de codificación de nucleótidos en SEQ ID NO:1 o la cadena complementaria a la misma, la secuencia codificadora de nucleótidos contenida en un clon depositado o la cadena complementaria a la misma, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:2, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido codificado por el clon depositado HDGNR10, y/o fragmentos de polinucleótido de cualquiera de esta moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, aquellos fragmentos aquí descritos). Los nucleótidos que hibridan a estas moléculas de ácido nucleico bajo condiciones de hibridación astringentes o condiciones de astringencia inferior también son comprendidos por la invención, como lo son los polipéptidos codificados por estos polinucleótidos. La presente invención también está dirigida a polipéptidos que comprenden o que consisten alternativamente de una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idéntica a por ejemplo la secuencia de polipéptido mostrada en SEQ ID NO:2, la secuencia de polipéptido codificada por el clon depositado y/o " fragmentos de polipéptidos de cualquiera de estos polipéptidos (por ejemplo, aquellos fragmentos que aquí se describen). Por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos por lo menos por ejemplo 95% "idéntica" a la secuencia de nucleótidos de referencia de la presente invención, se pretende que la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico sea idéntica a ia secuencia de referencia excepto que la secuencia de nucleótidos pueda incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia que codifica el polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). En otras palabras, para obtener un ácido nucleico que tenga una secuencia de nucleótidos por lo menos 95% idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia puede ser deletada o sustituida con otro nucleótido, o un número de nucleótidos hasta 5% del total de nucleótidos en la secuencia de referencia puede ser insertada en la secuencia de referencia. La secuencia de búsqueda puede ser una secuencia entera mostrada de SEQ ID NO:1 , el ORF (marco de lectura abierto) del ADN de HDGNR10 en el clon depositado, o cualquier fragmento especificado como se describe aquí. Cualquier material práctico, ya sea cualquier molécula de ácido nucleico particular o polipéptido es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia de nucleótidos o polipéptido de la presente invención se puede determinar convencionalmente usando programas de computadora conocidos. Un método preferido para determinar la mejor correspondencia global entre una secuencia de búsqueda (una secuencia de la presente invención) y una secuencia de estudio, también referida como una alineación de secuencia global, se puede determinar usando el programa de computadora FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. (1990) 6:237-245). En una alineación de secuencias, las secuencias en búsqueda y de estudio son ambas secuencias de ADN. Una secuencia de ARN se puede comparar convirtiendo U's a T's. El resultado de dicha alineación de secuencia global está en por ciento de identidad. Los parámetros preferidos usados en la alineación de FASTDB de secuencias de ADN para calcular el por ciento de identidad son: matriz=unitaria, k-tuple=4, sanción por falta de correspondencia^ , sanción por unión=30, longitud de grupo de a leato rizado n=0, puntuación de corte=1 , sanción de espacio=5, sanción de tamaño de espacio=0.05, tamaño de ventana=500 o la longitud de la secuencia de nucleótidos de estudio, la que sea más corta. Si la secuencia de estudio es más corta que la secuencia de búsqueda debido a deleciones 5' ó 3', no debido a deleciones internas, se debe hacer una corrección manual a los resultados. Esto se debe a que el programa FASTDB no explica las truncaciones 5' y 3' de la secuencia de estudio cuando se calcula en por ciento de identidad. Para secuencias de estudio truncadas en los extremos 5' ó 3', en relación con la secuencia de búsqueda, el por ciento de identidad es corregido calculando el número de bases de la secuencia de búsqueda que son 5' y 3' de la secuencia de estudio, que no están en correspondencia/alineadas, como un por ciento del total de bases de la secuencia de búsqueda. El que un nucleótido no esté en correspondencia/esté alineado está determinado por los resultados de la alineación de secuencia FASTDB. Este porcentaje es después sustraído del por ciento de identidad, calculado por el programa FASTDB anterior usando los parámetros especificados para llegar a una puntuación de identidad en por ciento final. Esta puntuación corregida es lo que se usa para los propósitos de la presente invención. Sólo las bases fuera de las bases 5' y 3' de la secuencia de estudio, como se despliega mediante la alineación de FASTDB, que no están en correspondencia/alineadas con la secuencia de búsqueda, se calculan para los propósitos de ajustar manualmente la puntuación de identidad en por ciento.

Por ejemplo, una secuencia de estudio de 90 bases está alineada a una secuencia de búsqueda de 100 bases para determinar la identidad en por ciento. Las deleciones ocurren en el extremo 5' de la secuencia de estudio y por lo tanto, la alineación FASTDB no muestra una falta de correspondencia/alineación de las primeras 10 bases en el extremo 5'. Las 10 bases no pareadas representan 10% de la secuencia (número de bases en los extremos 5' y 3' que no están en correspondencia/números totales de bases en la secuencia de búsqueda) por lo que 10% es sustraído del por ciento de puntuación de identidad calculado por el programa FASTDB. Si las 90 bases restantes estuvieran perfectamente en correspondencia la identidad en por ciento final sería de 90%. En otro ejemplo, una secuencia de estudio de 90 bases se compara con una secuencia de búsqueda de 100 bases. Esta vez las deleciones son deleciones internas por lo que no hay bases en 5' ó 3' de la secuencia de estudio que no están en correspondencia/alineadas con la secuencia de búsqueda. En este caso, la identidad en por ciento calculada por FASTDB no es manualmente corregida. Una vez más, sólo las bases 5' y 3' de la secuencia de estudio que no están en correspondencia/alineadas con la secuencia de búsqueda son manualmente corregidas. No se hacen otras correcciones manuales para los propósitos de la presente invención. Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos, por ejemplo 95% "idéntica" a una secuencia de aminoácidos de búsqueda de la presente invención se entiende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido de estudio es idéntica a la secuencia de búsqueda excepto que la secuencia de polipéptido de estudio puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos para cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de búsqueda. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de búsqueda, hasta 5% de los residuos de aminoácidos en la secuencia de estudio pueden ser insertados, deletados, (indeles) o sustituidos con otro aminoácido. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones terminales amino o carboxilo de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier otra parte entre esas posiciones terminales, intercaladas ya sea en forma individual entre residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Como un asunto práctico, ya sea cualquier polipéptido particular es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntico a, por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o la secuencia de aminoácidos codificada por el clon depositado se puede determinar convencionalmente usando programas de computadora conocidos. Un método preferido para determinar la mejor correspondencia global entre una secuencia de búsqueda (una secuencia de la presente invención y una secuencia de estudio, también referida como alineación de secuencia global, se puede determinar usando el programa de computadora FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6:237-245(1990)). En una alineación de secuencia, las secuencias de búsqueda y de estudio son ya sea ambas secuencias de nucleótidos o ambas secuencias de aminoácidos. El resultado de dicha alineación de secuencia global está en por ciento de identidad. Los parámetros preferidos usados en una alineación de aminoácidos FASTDB son: matriz=PAM 0, k-tupie=2, sanción por falta de correspondencia^ , sanción de unión=20, longitud de grupo de aleatorización=0, puntuación de corte=1 , tamaño de ventana=longitud de secuencia, sanción de espacio=5, sanción de tamaño de espacio=0.05, tamaño de ventana=500 o la longitud de la secuencia de aminoácidos de estudio, la que sea más corta. Si la secuencia de estudio es más corta que la secuencia de búsqueda debido a las deleciones N-terminal o C-terminal, no debido a deleciones internas, se debe hacer una corrección manual a los resultados. Esto se debe a que el programa FASTDB no considera truncaciones N-terminal y C-terminal de la secuencia de estudio cuando calcula el por ciento de identidad global. Para secuencias de estudio truncadas en N-terminal y C-términal, en relación con la secuencia de búsqueda, el por ciento de identidad es corregido calculado el número de residuos de la secuencia de búsqueda que son N-terminal y C-terminal de la secuencia de estudio, que no están en correspondencia/alineadas con el residuo de estudio correspondiente, como un porcentaje del total de la secuencia de búsqueda. El que un residuo esté en correspondencia/alineado se determina por los resultados de la alineación de secuencia FASTDB. Este porcentaje después se sustrae del por ciento de . identidad, calculado por el programa FASTDB anterior usando los parámetros especificados, para llega a un por ciento de puntuación de identidad final. El por ciento de puntuación de identidad final es el que se usa para los propósitos de la presente invención. Sólo residuos para N-terminal y C-terminal de la secuencia de estudio que no están en correspondencia/alineados con la secuencia de búsqueda, se consideran para los propósitos de ajuste manual del por ciento de puntuación de identidad. Es decir, sólo posiciones de residuo de búsqueda fuera de los residuos N-terminal y C-terminal más lejanos de la secuencia de estudio. Por ejemplo, una secuencia de estudio de residuo de 90 aminoácidos está alineada con una secuencia de búsqueda de residuo de 100 aminoácidos para determinar el por ciento de identidad. La deleción ocurre en el N-terminal de la secuencia de estudio y por lo tanto, la alineación FASTDB no muestra una correspondencia/alineación de los primeros 10 residuos en N-terminal. Los 10 residuos no pareados representan el 10% de la secuencia (número de residuo en N-terminal y C-terminal que no corresponden/número total de residuos en la secuencia de búsqueda) por lo que 10% es sustraído del por ciento de identidad calculado por el programa FASTDB. Si los 90 residuos restantes correspondieron perfectamente, el por ciento de identidad final sería de 90%. En otro ejemplo, una secuencia de estudio de 90 residuos se compara con una secuencia de búsqueda de 100 residuos. Este tiempo las deleciones son deleciones internas por lo que no hay residuos en N-terminal o C-terminal de la secuencia de estudio que no correspondan/se alineen con la de búsqueda. En este caso, el por ciento de identidad calculado por FASTDB no es manualmente corregido. Una vez más, sólo las posiciones de residuos fuera de los extremos N-terminal y C-terminal de la secuencia de estudio, como se despliega en la alineación FASTDB, que no corresponden/se alinean con la secuencia de búsqueda son manualmente corregidas. No se hacen otras correcciones para los propósitos de la presente invención. Las variantes de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) pueden contener alteraciones en las regiones de codificación, regiones de no codificación o ambas. Especialmente preferidas son las variantes de polinucleótidos que contienen alteraciones que producen sustituciones, adhesiones o deleciones silenciosas, pero non alteran las propiedades del polipéptido codificado. Las variantes de polinucleótido producidas por sustituciones silenciosas debidas a la degeneración del código genético con preferidas. Además, variantes en las cuales 5-10, 1-5 ó 1-2 aminoácidos son sustituidos, deletados o añadidos en cualquier combinación son preferidas. Las variantes de polinucleótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden producir por una variedad de razones, por ejemplo, para optimizar la expresión de codones o para un hospedero particular (cambiar codones en el ARNm humano a aquellos preferidos por un hospedero bacteriano tal como E. coli). Las variantes de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que ocurren naturalmente son denominadas "variantes alélicas", y se refieren a una de las diversas formas alternas de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo. (Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)). Estas variantes alélicas pueden variar ya sea al nivel de polinucleótido y/o polipéptido y se incluyen en la presente invención. Alternativamente, se pueden producir variantes que no ocurren naturalmente mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa. Usando métodos conocidos de ingeniería de proteínas y tecnología de ADN recombinante, se pueden generar variantes para mejorar o alterar las características de los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Por ejemplo, uno o más aminoácidos pueden ser deletados del N-terminal o C-terminal de la proteína secretada sin pérdida sustancial de función biológica. Los autores de Ron et al., J. Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1993), reportaron proteínas de KGF variantes que tenían actividad de unión a heparina incluso después de deletar 3, 8 ó 27 residuos de aminoácidos amino-terminales. De manera similar, el Interferón gamma mostró hasta diez veces mayor actividad después de deletar 8-10 residuos de aminoácidos del carboxilo terminal de esta proteína (Dobeli et al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988)). Además, una amplia evidencia demuestra que las variantes a menudo retienen una actividad biológica similar a la de la proteína G que ocurre naturalmente. Por ejemplo, Gayle y colaboradores (J. Biol. Chem 268:22105-22111 (1993)) condujeron análisis mutacional extensivo de citocina IL-1a humana. Usaron mutagénesis aleatoria para generar aproximadamente 3,500 mutantes de IL-1a individuales que promediaron 2.5 cambios de aminoácidos por variante en toda la longitud de la molécula. Se examinaron mutaciones múltiples en cada posición posible de aminoácido. Los investigadores encontraron que "la mayor parte de la molécula pudo ser alterada con poco efecto sobre la actividad de unión o biológica]". (Véase el resumen). De hecho, sólo 23 secuencias de aminoácidos únicas, de más de 3,500 secuencias de nucleótidos examinadas, produjeron una proteína que difirió significativamente en actividad del tipo silvestre. Además, aun cuando la deleción de uno o más aminoácidos dei N-terminal o C-terminal de un polipéptido da por resultado la modificación o pérdida de una o más funciones biológicas, todavía pueden ser retenidas otras actividades biológicas. Por ejemplo, la capacidad de una variante de deleción para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconocen la forma secretada probablemente será retenida cuando menos de la mayoría de los residuos de la forma secretada sean removidos del N-terminal o C-terminal. El que un polipéptido particular que carece de residuos N-terminal o C-terminal de una proteína retenga dichas actividades inmunogénicas se puede determinar fácilmente mediante métodos de rutina descritos aquí o conocidos de otra manera e la técnica. ' Por lo tanto, la invención incluye además variantes de polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que muestras actividad biológica sustancial. Dichas variantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones seleccionadas de , , . acuerdo con las reglas generales conocidas en la técnica para tener poco efecto sobre ía actividad. La presente solicitud está dirigida a moléculas de ácidos nucleicos~por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idénticos a las ^ secuencias de ácidos nucleicos que aquí se describen (por ejemplo, la codificación de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una deleción N y/o C-terminal descrita más adelante como m-n de SEQ ID NO:2) o que corresponde al polipéptido codificado por el clon depositado, independientemente de si codifican un polipéptido que tiene actividad funcional de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Esto se debe incluso a que una molécula de ácido nucleico particular no codifica un polipéptido que tiene actividad funcional de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), un experto en la técnica sabría cómo usar la molécula de ácido nucleico, por ejemplo, como una sonda de hibridación o un iniciador de reacción de cadena de polimerasa (PCR). Los usos de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención no codifican un polipéptido que tiene actividad funcional de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) e incluyen, entre otros, (1) aislar un gen de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o variantes alélicas o de empalme del mismo en una genoteca de ADNc; (2) hibridación in situ (por ejemplo "FISH") a extensiones cromosómicas de metafase para proveer localización cromosómica precisa del gel de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), como se describe en Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988); y (3) análisis de Northern Blot para detectar expresión de ARNm de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) en tejidos específicos. Sin embargo, se prefieren moléculas de ácido nucleico que tengan secuencias por los menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idénticas a las secuencias de ácidos nucleicos que aquí se describen, que, de hecho, codifican un polipéptido que tiene actividad funcional de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Por "una actividad funcional de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5)" se entienden polipéptidos que presentan actividad similar, pero no necesariamente idéntica a una actividad funcional de los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención (por ejemplo, receptor de quimiocina de proteína G completo (longitud completa) (CCR5), receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) maduro y receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) soluble (por ejemplo, que tiene secuencias contenidas en el dominio o regiones extracelulares del receptor de quimiocina de proteína G) como se midió, por ejemplo, en un inmunoensayo particular o prueba biológica particular. Por ejemplo, una actividad funcional de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se puede medir rutinariamente determinando la capacidad de un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) para unirse a un ligando de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). La actividad funcional del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también se puede medir determinando la capacidad del polipéptido, tal como ligando cognado que es libre o expresado sobre una superficie celular, para inducir a las células a que expresen el polipéptido. Desde luego, debido a la degeneración dei código genético un experto en la técnica inmediatamente reconocerá que un gran número de las moléculas de ácido nucleico que tienen la secuencia por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia de ácidos nucleicos del clon depositado, la secuencia de ácidos nucleicos mostrado en la figura 1 (SEQ ID NO:1), o fragmentos de la misma, codificarán polipéptidos "que tienen actividad funcional de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5)". De hecho, puesto que las variantes degeneradas de cualesquiera de esta secuencia de nucleótidos codifican todas el mismo polipéptido, en muchos casos, estará claro para los expertos en la técnica aún sin realizar la prueba de comparación anteriormente descrita. Se reconocerá en la técnica, que, para dichas moléculas de ácido nucleico que no son variantes degeneradas, un número razonable también codificará un polipéptido un polipéptido que tiene actividad funcional de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Esto se debe a que el experto en la técnica está completamente consciente de que la sustituciones de aminoácidos que son menos probable o que no son probable que efectúen significativamente función de proteína (por ejemplo, reemplazando un aminoácido alifático por un segundo aminoácido alifático), como se describe más adelante. Por ejemplo, la guía referente a cómo hacer sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas se provee en Bowie et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247:1306-1310 (1990), en donde los autores indican que hay dos o más estrategias para estudiar la tolerancia de una secuencia de aminoácidos a cambiar. La primera estrategia explota la tolerancia de sustituciones de aminoácidos por selección natural durante el proceso de evolución. Comparando las secuencias de aminoácidos en diferentes especies, se pueden identificar aminoácidos conservados. Estos aminoácidos conservados son probablemente importantes para la función de la proteína. Por el contrario, las posiciones de aminoácidos en donde las sustituciones han sido toleradas por selección natural indican que estas posiciones no son críticas para la función de proteína. Por lo tanto, las posiciones que toleran sustitución de aminoácidos podrían ser modificadas mientras aún mantengan actividad biológica de la proteína. - La segunda estrategia utiliza ingeniería genética para introducir cambios de aminoácidos en posiciones específicas de un gen clonado para identificar regiones críticas para la función de la proteína. Por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis de escudriñamiento con alanina (introducción de mutaciones de alanina individual en cada residuo en la molécula) se pueden usar. (Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). Las moléculas mutantes resultantes se pueden probar para actividad biológica.

Como lo señalan los autores, estas dos estrategias han revelado que las proteínas son sofrendentemente tolerantes de sustituciones de aminoácidos. Los autores también indican que es probable que los cambios en aminoácidos sean permisibles en ciertas posiciones de aminoácidos en la proteína. Por ejemplo, la mayor parte de los residuos de aminoácidos enterrados (dentro de la estructura terciaria de la proteína) requieren cadenas laterales no polares, mientras que algunas características de las cadenas laterales superficiales son generalmente conservadas. Sin embargo, ias sustituciones de aminoácidos conservativas toleradas implican el reemplazo de los aminoácidos alifáticos o hidrofóbicos Ala, Val, Leu e He; el reemplazo de los residuos de hidroxilo Ser y Thr; el reemplazo de los residuos ácidos Asp y Glu; el reemplazo de los residuos de amida Asn y Gln, el reemplazo de los residuos básicos Lys, Arg e His; el reemplazo de los residuos aromáticos Phe, Tyr y Trp, y el reemplazo de aminoácidos de tamaño pequeño Ala, Ser, Thr, Met y Gly. Por ejemplo, los cambios dirigidos al sitio al nivel de aminoácido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden hacer reemplazando un aminoácido particular por un aminoácido conservativo. Las * mutaciones conservativas preferidas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (SEQ ID NO: 2) incluyen: M1 remplazado por A, G, I, L, S, T, o V; D2 remplazado por E; Y3 remplazado por F, o W; Q4 remplazado por N; V5 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; S6 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; S7 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; 19 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; Y10 remplazado por F, o W; D11 remplazado por E; 112 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; N13 remplazado por Q; Y14 remplazado por F, o W; Y15 remplazado por F, o W; T16 remplazado por A, G, I, L, S, M; o V; S17 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; E18 remplazado por D; K22 remplazado por H o R; I23 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; N24 remplazado por Q; V25 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; K26 remplazado por H o R; Q27 remplazado por N; I28 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; A29 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; A30 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; R31 remplazado por H, o K; L32 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; L33 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; L36 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; Y37 remplazado por F o W; S38 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; L39 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; V40 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; F41 remplazado por W o Y ;I42 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; F43 remplazado por W, o Y; G44 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; F45 remplazado por W, o Y; V46 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; G47 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; N48 remplazado por Q; M49 remplazado por A, G, I, L, S, T, o V; L50 remplazado por A,G, I, S, T, M, o V; V51 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; 152 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; L53 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; I54 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; L55 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; I56 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; N57 remplazado por Q; Q59 remplazado por N; R60 remplazado por H, o K; L61 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; E62 remplazado por D; S63 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; M64 remplazado por A, G, I, L, S, T, o V; T65 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; D66 remplazado por E; 167 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; Y68 remplazado por F, o W; L69 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; L70 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; N71 remplazado por Q; L72 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; A73 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; 174 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; S75 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; D76 remplazado por E; L77 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; F78 remplazado por W, o Y; F79 remplazado por W, o Y; L80 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; L81 remplazado por A, G, I, S,T, M, o V; T82 remplazado por A, GX, L, S, M, o V; V83 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; F85 remplazado por W, o Y; W86 remplazado por F, o Y; A87 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; H88 remplazado por K, o R; Y89 remplazado por F, o W; A90 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; A91 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; A92 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; Q93 remplazado por N; W94 remplazado por F, o Y; D95 remplazado por E; F96 remplazado por W, o Y; G97 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; N98 remplazado por Q; T99 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; M100 remplazado por A, G, I, L, S, T, o V; Q102 remplazado por N; L103, remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; L104 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; T105 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; G106 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; L107 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; Y108 remplazado por F, o W; F109 remplazado por W, o Y; 1110 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; G111 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; F112 remplazado por W, o Y; F113 remplazado por W, o Y; S114 remplazado por A, G, I, L,.T, M, o V; G115 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; 1116 remplazado por A, G, L, S, T, M,.o V; F117 remplazado por W, o Y; F118 remplazado por W, o Y; 1119 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; 1120 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; L121 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; L122 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; T123 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; 1124 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; D125 remplazado por E; R126 remplazado por H, o K; Y127 remplazado por F, o W; L128 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; A129 remplazado por G, I, L, S, T, M,.o V; 1130 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; V131 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; H132 remplazado por K, o R; A133 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; V134 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; F135 remplazado por W, o Y; A136 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; L137 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; K138 remplazado por H, o R; A139 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; R140 remplazado por H, o K; T141 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; V142 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; T143 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; F144 remplazado por W, o Y; G145 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; V146 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; V147 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; T148 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; S149 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; V150 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; 1151 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; T152 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; W153 remplazado por F, o Y; V154 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; V155 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; A156 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; V157 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; F158 remplazado por W, o Y; A159 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; S160 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; L161 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; G163 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; 1164 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; 1165 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; F166 remplazado por W, o Y; T167 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; R168 remplazado por H, o K; S169 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; Q170 remplazado por N; K171 remplazado por H, o R; E172 remplazado por D; G173 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; L174 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; H175 remplazado por K, o R; Y176 remplazado por F, o W; T177 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; S179 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; S180 remplazado por A, O, I, L, T, M, o V; H181 remplazado por K, o R; F182 remplazado por W, o Y; Y184 remplazado por F, o W; S185 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; Q186 remplazado por N; Y187 remplazado por F, o W; Q188 remplazado por N; F189 remplazado por W, o Y; W190 remplazado por F, o Y; K191 remplazado por H, o R; N192 remplazado por Q; F193 remplazado por W, o Y; Q194 remplazado por N; T195 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; L196 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; K197 remplazado por H, o R; 1198 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; V199 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; I200 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; L201 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; G202 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; L203 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; V204 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; L205 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; L207 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; L208 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; V209 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; M210 remplazado por A, G, I, L, S, T, o V; V211 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; 1212 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; Y214 remplazado por F, o W; S215 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; G216 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; 1217 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; L218 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; K219 remplazado por H, o R; T220 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; L221 remplazado por A, G, I, S, T, M. o V; L222 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; R223 remplazado por H, o K; R225 remplazado por H, o K; N226 remplazado por Q; E227 remplazado por D; K228 remplazado por H, o R; K229 remplazado por H, o R; R230 remplazado por H, o K; H231 remplazado por K, o R; R232 remplazado por H, o K; A233 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; V234 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; R235 remplazado por H, o K; L236 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; 1237 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; F238 remplazado por W, o Y; T239 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; 1240 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; M241 remplazado por A, G, I, L, S, T, o V; 1242 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; V243 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; Y244 remplazado por F, o W; F245 remplazado por W, o Y; L246 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; F247 remplazado por W, o Y; W248 remplazado por F, o Y; A249 remplazado por G, I, L, S, T, M o V; Y251 remplazado por F, o W; N252 remplazado por Q; I253 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; V254 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; L255 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; L256 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; L257 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; N258 remplazado por Q; T259 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; F260 remplazado por W, o Y; Q261 remplazado por N; E262 remplazado por D; F263 remplazado por W, o Y; F264 remplazado por W, o Y; G265 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; L266 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; N267 remplazado por Q; N268 remplazado por Q; S270 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; S271 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; S272 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; N273 remplazado por Q; R274 remplazado por H, o K; L275 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; D276 remplazado por E; Q277 remplazado por N; A278 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; M279 remplazado por A, G, I, L, S, T, o V; Q280 remplazado por N; V281 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; T282 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; E283 remplazado por D; T284 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; L285 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; G286 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; M287 remplazado por A, G, I, L, S, T, o V; T288 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; H289 remplazado por K, o R; 1292 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; N293 remplazado por Q; 1295 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; 1296 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; Y297 remplazado por F, o W; Al 98 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; F299 remplazado por W, o Y; V300 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; G301 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; E302 remplazado por D; K303 remplazado por H, o R; F304 remplazado por W, o Y; R305 remplazado por H, o K; N306 remplazado por Q; Y307 remplazado por F, o W; L308 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; L309 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; V310 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; F311 remplazado por W, o Y; F312 remplazado por W, o Y; Q313 remplazado por N; K314 remplazado por H, o R; H315 remplazado por K, o R; 1316 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; A317 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; K318 remplazado por H, o R; R319 remplazado por H, o K; F320 remplazado por W, o Y; K322 remplazado por H, o R; S325 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; l326 emplazado por A, G, L, .. íí S, T, M, o V; F327 remplazado por W, o Y; Q328 remplazado por N; Q329 remplazado por N; E330 remplazado por D; A331 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; E333 remplazado por D; R334 remplazado por H, o K; A335 remplazado por G, I, L, S, T, M, p V; S336 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; S337 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; V338 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; Y339 remplazado por F, o W; T340 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; R341 remplazado por H, o K; S342 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; T343 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; G344 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; E345 remplazado por D; Q346 remplazado por N; E347 remplazado por D; I348 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; S349 remplazado por A. G, I, L, T, M, o V; V350 remplazado por A, G, I, .L, S, T, o M; G351 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; y/o L352 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V. Las mutaciones conservativas preferidas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) tal como son codificadas por el clon HDGNR10 depositado (SEQ ID NO: 22) incluye: M1 remplazado por A, G, I, L, S, T, o V; D2 remplazado por E; Y3 remplazado por F, o W; Q4 remplazado por N; V5 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; S6 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; S7 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; 19 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; Y10 remplazado por F, o W; D11 remplazado por E; 112 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; N13 remplazado por Q; Y14 remplazado por F, o W; Y15 remplazado por F, o W; T16 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; S17 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; E18 remplazado por D; Q21 remplazado por N; K22 remplazado por H, o R; I23 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; N24 remplazado por Q; V25 remplazado por A, G, I, L, S, T o M; K26 remplazado por H, o R; Q27 remplazado por N; I28 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; A29 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; A30 remplazado por G, I, L, S, T , M, o V; R31 remplazado por H, o K; L32 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; L33 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; L36 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; Y37 remplazado por F, o W; S38 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; L39 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; V40 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; F41 remplazado por W, o Y; I42 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; F43 remplazado por W, o Y; G44 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; F45 remplazado por W, o Y; V46 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; G47 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; N48 remplazado por Q; M49 remplazado por A, G, I, L, S, T, o V; L50 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; V51 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; I52 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; L53 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; I54 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; L55 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; I56 remplazado por A, G, L, S, 1, M, o V; N57 remplazado por Q; K59 remplazado por H, o R; R60 remplazado por H, o K; L61 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; K62 remplazado por H, o R; S63 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; M64 remplazado por A, G, I, L, S, T, o V; T65 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; D66 remplazado por E; 167 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; Y68 remplazado por F, o W; L69 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; L70 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; N71 remplazado por Q; L72 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; A73 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; I74 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; S75. remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; D76 remplazado por E; L77 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; F78 remplazado por W, o Y; F79 remplazado por W, o Y; L80 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; L81 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; T82 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; V83 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; F85 remplazado por W, o Y; W86 remplazado por F, o Y; A87 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; H88 remplazado por K, o R; Y89 remplazado por F, o W; A90 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; A91 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; A92 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; Q93 remplazado por N; W94 remplazado por F, o Y; D95 remplazado por E; F96 remplazado por W, o Y; G97 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; N98 remplazado por Q; T99 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; M100 remplazado por A, G, I, L, S, T, o V; Q102 remplazado por N; L103 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; L104 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; T105 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; G106 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; L107 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; Y108 remplazado por F, o W; F109 remplazado por W, o Y; 1110 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; G111 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; F112 remplazado por W, o Y; F113 remplazado por W, o Y; S114 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; G115 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; 1116 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; F117 remplazado por W, o Y; F118 remplazado por W, o Y; 1119 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; 1120 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; L121 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; L122 remplazado por, G, I, S, T, M, o V; T123 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; 1124 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; D125 remplazado por E; R126 remplazado por H, o K; Y127 remplazado por F, o W; L128 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; A129 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; V130 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; V131 remplazado por A, G, I, L, S, .T, o M; H132 remplazado por K, o R; A133 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; V134 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; F135 remplazado por W, o Y; A136 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; L137 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; K138 remplazado por H, o R; A139 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; R140 remplazado por H, o K; T141 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; V142 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; T143 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; F144 remplazado por W, o Y; G145 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; V146 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; V147 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; T148 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; S149 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; V150 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; 1151 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; T152 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; W153 remplazado por F, o Y; V154 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; V155 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; A156 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; V157 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; F158 remplazado por W, o Y; A159 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; S160 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; L161 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; G163 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; 1164 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; 1165 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; F166 remplazado por W, o Y; T167 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; R168 remplazado por H, o K; S169 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; Q170 remplazado por N; K171 remplazado por H, o R; E172 remplazado por D; G173 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; L174 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; H175 remplazado por K, o R; Y176 remplazado por F,.o W; T177 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; S179 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; S180 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; H181 remplazado por K, o R; F182 remplazado por W, o Y; Y184 remplazado por F, o W; S185 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; Q186 remplazado por N; Y187 remplazado por F, o W; Q188 remplazado por N; F189 remplazado por W, o Y; W190 remplazado por F, o Y; K191 remplazado por H, o R; N192 remplazado por Q; F193 remplazado por W, o Y; Q194 remplazado por N; T195 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; L196 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; K197 remplazado por H, o R; 1198 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; V199 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; I200 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; L201 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; G202 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; L203 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; V204 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; L205 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; L207 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; L208 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; V209 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; M210 remplazado por A, G, I, L, S, T, o V; V211 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; 1212 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; Y214 remplazado por F, o W; S215 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; G216 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; 1217 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; L218 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; K219 remplazado por H, o R; T220 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; L221 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; L222 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; R223 remplazado por H, o K; R225 remplazado por H, o K; N226 remplazado por Q; E227 remplazado por D; K228 remplazado por H, o R; K229 remplazado por H, o R; R230 remplazado por H, o K; H231 remplazado por K, o R; R232 remplazado por H, o K; A233 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; V234 remplazado por A, G, I, L, S, t, o M; R235 remplazado por H, o K; L236 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; 1237 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; F238 remplazado por W, o Y; T239 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; 1240 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; M241 remplazado por A, G, I, L, S, T, o V; I242 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; V243 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; Y244 remplazado por F, o W; F245 remplazado por W, o Y; L246 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; F247 remplazado por W o Y; W248 remplazado por F, o Y; A249 remplazado por G, I, L, S, T, *M, o V; Y251 remplazado por F, o W; N252 remplazado por Q; I253 remplazado por A, G, L, S, T , M, o V; V254 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; L255 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; L256 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; L257 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; N258 remplazado por Q; T259 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; F260 remplazado por W, o Y; Q261 remplazado por N; E262 remplazado por D; F263 remplazado por W, o Y; F264 remplazado por W, o Y; G265 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; L266 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; N267 remplazado por Q; N268 remplazado por Q; S270 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; S271 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; S272 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; N273 remplazado por Q; R274 remplazado por H, o K; L275 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; D276 remplazado por E; Q277 remplazado por N; A278 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; M279 remplazado por A, G, I, L, S, T, o V; Q280 remplazado por N; V281 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; T282 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; E283 remplazado por D; T284 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; L285 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; G286 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; M287 remplazado por A, G, I, L, S, T, o V; T288 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; H289 remplazado por K, o R; 1292 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; N293 remplazado por Q; 1295 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; 1296 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; Y297 remplazado por F, o W; A298 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; F299 remplazado por W, o Y; V300 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; G301 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; E302 remplazado por D; K303 remplazado por H, o R; F304 remplazado por W, o Y; R305 remplazado por H, o K; N306 remplazado por Q; Y307 remplazado por F, o W; L308 remplazado por A, G, I, S, T , M, o V; L309 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V; V310 remplazado por A, G, I, L, S, T, o M; F311 remplazado por W, o Y; F312 remplazado por W, o Y; Q313 remplazado por N; K314 remplazado por H, o R; H315 remplazado por K, o R; 1316 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; A317 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; K318 remplazado por H, o R; R319 remplazado por H, o K; F320 remplazado por W, o Y; K322 remplazado por H, o R; S325 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; I326 remplazado por A, G, L, S, T, M, o V; F327 remplazado por W, o Y; Q328 remplazado por N; Q329 remplazado p r N; E330 remplazado por D; A331 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V; E333 remplazado por D; R334 remplazado por H, o K; A335 remplazado por G, I, L, S, T, M, o V;.S336 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; S337 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; V338 remplazado por A, G, I, L, S, T. o M; Y339 remplazado por F, o W; T340 remplazado por A, G, I, L, S, M, o V; R341 remplazado por H, o K; S342 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; T343 remplazado por A, G. I, L, S, M, o V; E344 remplazado por D; E345 remplazado por D; Q346 remplazado por N; E347 remplazado por D; I348 remplazado por A, G, L. S, T, M, o V; S349 remplazado por A, G, I, L, T, M, o V; V350 remplazado por A, G, I, L, S, T. o M; G351 remplazado por A, I, L, S, T, M, o V; y/o L352 remplazado por A, G, I, S, T, M, o V. Las construcciones resultantes pueden ser rutinariamente seleccionadas para actividades o funciones descritas en toda la memoria descriptiva y conocidas en la técnica. Preferiblemente, las construcciones resultantes tienen una actividad o función de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) incrementada y/o disminuida, mientras se mantienen las actividades o funciones de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) restantes. Muy preferiblemente, las construcciones resultantes tienen más de una actividad o función de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) incrementada y/o disminuida, mientras se mantienen las actividades o funciones de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) restantes. Además de las sustituciones de aminoácidos conservativas, las variantes de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) ¡ncluyen (i) sustituciones con uno o más de los residuos de aminoácidos no conservados, en donde los residuos de aminoácidos sustituidos pueden o no ser codificados por el código genético, o (ii) sustitución con uno o más de los residuos de aminoácido que tienen un grupo sustituyente, o (üi) fusión del polipéptido maduro con otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la estabilidad y/o solubilidad del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) fusión del polipéptido con aminoácidos adicionales, tales como por ejemplo un péptido de región de fusión IgG Fc, o una secuencia líder o secretora, o una secuencia que facilita la purificación. Dichos polipéptidos variantes se consideran dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente invención. Por ejemplo, variantes de polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que contienen sustituciones de aminoácidos de aminoácidos cargados con otros aminoácidos cargados o neutros pueden producir proteínas con características mejoradas, tales como menos agregación. La agregación de formulaciones farmacéuticas reduce la actividad e incrementa el aclarameinto debido a la actividad inmunogénica del agregado. (Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 2:331-340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36: 838-845 (1987); Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307:377 (1993)). Por ejemplo, las sustituciones no conservativas preferidas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (SEQ ID NO: 2) ¡ncluyen: M1 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; D2 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y3 remplazado por D, E,.H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; Q4 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; V5 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S6 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o .C; S7 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; P8 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; 19 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y10 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; D11 remplazado por H, K, R, A, a, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; 112 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; N13 remplazado por D, E, H, K, R, A, O, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; Y14 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; Y15 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; T16 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S17 remplazado por D, E, H, K,.R N, Q, F, W, Y, P, o C; E18 remplazado por H, K, R, A, a, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; P19 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; C20 remplazado por D, E, H, K, R, A, a, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, O P; P21 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; K22 remplazado por D, E, A, a, I, L, S, Y, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; 123 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; N24 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, Y, M, V, F, W, Y, P, o C; V25 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; K26 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, Y, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; Q27 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, Y, M, V, F, W, Y, P, o C; 128 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; A29 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; A30 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; R31 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, Y, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; L32 remplazado por D..E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L33 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; P34 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; P35 remplazado por D, E, H, K, R, A, O, I, L, S, Y, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; L36 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y37 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, Y, M, V, P, o C; S38 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L39 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V40 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F41 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; I42 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y..P, o C; F43 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S,*T, M, V, P, o C; G44 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, w, Y, P, o C; F45 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, O, I, L, S, T, M, V, P,"o C; V46 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; G47 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; N48 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; M49 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L50 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V51 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; I52 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L53 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; I54 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L55 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; 156 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; N57 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; C58 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; Q59 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; R60 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; L61 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; E62 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; S63 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; M64 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; T65 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; D66 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; 167 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y68 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; L69 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L70 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; N71 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; L72 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; A73 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; I74 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S75 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; D76 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; L77 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F78 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; F79 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; L80 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L81 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; T82 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V83 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; P84 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; F85 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; W86 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; A87 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; H88 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, or C; Y89 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; A90 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; A91 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; A92 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Q93 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; W94 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; D95 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; F96 remplazado por D, E, H, K, R,N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; G97 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; N98 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; T99 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; M100 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; C101 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; Q102 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; L103 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L104 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; T105 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, p) o C; G106 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W) Y, p) o C; L107 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y108 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; F109 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; 1110 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; G111 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F112 remplazado por D,.E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; F?13 remplazado por D, E, H, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; S114 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; G115 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; 1116 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F117 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; F118 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; 1119 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W. Y, P, o C; 1120 remplazado por D, E, H, K, R N, Q, F, W, Y, P, o C; L121 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L122 remplazado por D, E, H, K, R N,' Q) F, W, Y, P, o C; T123 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; 1124 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; D125 remplazado por H, K, R., A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; R126 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y127 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; L128 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, y P, o C; .fc-A129 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; 1130 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V131 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; H132 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F,' W, Y, P, o C; A133 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V134 remplazado por D, E, H,.K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F135 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; A136 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, y. P, o C; L137 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; K138 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P o C; A139 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; R140 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; T141 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V142 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; T143 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, y. P, o C; F144 remplazado por D, E, H, K, I, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; G145 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V146 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V147 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; T148 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S149 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V150 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; 1151 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; T152 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; W153 remplazado por D, E,. H, K, R, N, Q,. A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; V154 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V155 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; A156 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V157 remplazado por D, E, H, K, R., N, Q, F, W, Y, P, o C; F158 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; A159 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S160 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L161 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; P162 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; G163 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; 1164 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; 1165 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F166 remplazado por D, E, , K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; T167 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; R168 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; S169 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Q170 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; K171 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; E172 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; G173 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L174 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; H175 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y176 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; T177 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; C178 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, .W, Y, o P; S179 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S180 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; H181 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; F182 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; P183 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, Mj V, N, Q, F, W, Y, o C; Y184 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; S185 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Q186 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; Y187 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; Q188 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; F189 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; W190 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; K191 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; N192 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; F193 remplazado por D, É, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V) P, o C; Q194 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P o C; T195 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L196 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; K197 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; 1198 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V199 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; I200 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L201 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; G202 remplazado por D, E, H, K, R N, Q, F, W, Y, P, o C; L203 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V204 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L205 remplazado por D, E, H, K, R N, Q, F, W, Y, P, o C; P206 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; L207 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L208 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V209 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; M210 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V211 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; 1212 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; C213 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; Y214 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; S215 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; G216 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; 1217 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L218 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; K219 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; T220 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L221 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L222 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; R223 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; C224 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; R225 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; N226 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; E227 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; K228 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; K229 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; R230 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; H231 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; R232 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; A233 remplazado por D, E, H, ,K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V234 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; R235 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; L236 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; 1237 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F238 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; T239 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; 1240 remplazado por D, É, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; M241 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; I242 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V243 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y244 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; F245 remplazado por D, E, H,.K, R, N, Q, Á, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; L246 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F247 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; W248 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; A249 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; P250 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, Ñ, Q, F, W, Y, o C; Y251 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; N252 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; I253 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V254 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L255 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L256 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L257 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; N258 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; T259 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F260 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; Q261 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; E262 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; F263 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P o C; F264 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; G265 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L266 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W. Y, P, o C; N267 remplazado por D, E, H, K, R, Á, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; N268 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o .C; C269 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; S270 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S271 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S272 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; N273 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; R274 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; L275 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; D276 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; Q277 remplazado por D, E, H, K, R, A, G. I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; A278 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; M279 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Q280 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; V281 remplazado por D, E, H, K, R, N," Q, F, W, Y, P, o C; T282 1 remplazado por D, E, H, K, R. N, Q, F, W, Y, P,. o C; E283 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; T284 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L285 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; G286 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; M287 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; T288 remplazado por D, E, H, K, R N, Q, F, W, Y, P, o C; H289 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; C290 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; C291 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; I292 remplazado por D, E" H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; N293 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; P294 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, l, L, S, T ,M, V, N, Q, F, W, Y, o C; I295 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; I296 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y297 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I. L S, T, M, V, P, o C; A298 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F299 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; V300 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; G301 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; E302 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; K303 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; F304 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; R305 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W. Y, P, o C; N306 remplazado por D, E, H, K, R, A. G, I, L, S. T, M, V, F, W, Y, P, o C; Y307 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; L308 remplazado por D, E, H, K, R. N, Q, F, W, Y, P, o C; L309 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V310 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F311 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V. P, o C; F312 remplazado por D, E, H, K, R., N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; Q313 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; K314 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; H315 remplazado por D, E, A, G, I, L. S, T, M, -I" V, N, Q, F, W, Y, P, o C; 1316 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Á317 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; K318 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; R319 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q. F, W, Y, P, o C; F320 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; C321 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; K322 , remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; C323 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; C324 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; S325 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; 1326 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F327 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; Q328 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; Q329 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; E330 remplazado por H, K, R, A, G; I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; A331 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; P332 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; E333 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; R334 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; A335 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S336 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S337 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V338 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y339 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; T340 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; R341 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; S342 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; T343 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; G344 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; E345 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; Q346 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; E347 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; I348 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S349 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V350 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; G351 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; y/o L352 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C. Las sustituciones no conservativas preferidas de adición de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) tal como son codificadas por el clon depositado HDGNR10 (SEQ ID NO: 22) incluyen M1 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; D2 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y3 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; Q4 remplazado por D, E, H, K, R,. A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; V5 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, p, o C; S6 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S7 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; P8 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; 19 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y10 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, O, I, L, S, T, M, V, P, o C; D11 remplazado por H, K, R, A, O, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; 112 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; N13 remplazado por D, E, H, K, R, A, O, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; Y14 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, O, I, L, S, T, M, V, P, o C; Y15 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, O, I, L, S, T, M, V, P, o C; T16 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S17 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; E18 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; P19 remplazado por D, E, H, K, R, A, O, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; C20 remplazado por D, E, H, K, R, A, O, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; Q21 remplazado por D, E, H, K, R, A, O, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; K22 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; 123 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; N24 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; V25 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; K26 remplazado por D, E, A, O, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; Q27 remplazado por D, E, H, K, R, A, O..I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; I28 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; A29 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; A30 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; R31 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; L32 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q~ F, W, Y, P, o C; L33 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; P34 remplazado por D, E, H, K, R, A, O, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W," Y, o C; P35 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; L36 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y37 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, O, I, L, S, T, M,V, P, O C; S38 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L39 remplazado por D, E, E, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V40 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F41 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, O, I, L, S, T, M, V, P, o C; 142 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F43 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; G44 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F45 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; V46 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; G47 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; N48 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; M49 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L50 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V51 remplazado por D, E, H, K, R N, Q, F, W, Y, P, o C; I52 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L53 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; I54 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L55 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; I56 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; N57 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, C; C58 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; K59 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; R60 remplazado por D, E, A, G", I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; L61 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; K62 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; S63 remplazado por D, E, H, K, R., N, Q, F, W, Y, P, o C; M64 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; T65 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; D66 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; 167 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y68 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; L69 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q. F, W, Y, P, o C; L70 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; N71 remplazado por D, E, H, K, R, A. G, I, L, S, T, M, V. F, W, Y, P, o C; L72 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; A73 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; I74 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S75 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; D76 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; L77 remplazado por D,E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F78 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; F79 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I; L, S, T, M, V, P, o C; L80 remplazado por D, E, H, K, R, N; Q, F, W, Y, P, o C; L81 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; T82 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V83 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; P84 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; F85 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; W86 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; A87 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; H88 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y89 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; A90 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; A91 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; A92 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Q93 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; W94 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; D95 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; F96 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; G97 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; N98 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; T99 remplazado por D, E, H, K, R N, Q, F, W, Y, P, o C; M100 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; C101 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; Q102 remplazado por D, E, H, K, R A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; L103 remplazado por D, E, H, K, R N, Q, F, W, Y, P, o C; L104 remplazado por D, E, H, K, R N, Q, F, W, Y, P, o C; T105 remplazado por D, E, H, K, R N, Q, F, W, Y, P, o C; G106 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L107 remplazado por D, E, H, K, R N, Q, F, W, Y, P, o C; Y108 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; F109 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; 1110 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; G111 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F112 remplazado por D, E,.H, K, R, N, Q, A, Gt I, L, S, T, M, V, P, o C; F113 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; SIU remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; G115 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; 1116 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y P o C; F117 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P o C; F118 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; 1119 remplazado por D, E, H,.K, R, N, Q, F, W, Y, P o C; 1120 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L121 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L122 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; T123 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; 1124 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C D125 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; R126 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y127 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, Y, P, o C; 1128 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; A129 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V130 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V131 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; H132 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; A133 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y134 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F135 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; A136 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L137 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; K138 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, Y, N, Q, F, W, Y, P, o C; A139 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; R140 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; T141 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, p. o C; Y142 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; T143 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F144 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; G145 remplazado por D, E, H. K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y146 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V147 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; T148 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S149 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V150 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; 1151 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; T152 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; W153 remplazado por D, E, H, K, R, Nt Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; Y154 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V155 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; A156 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y157 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F158 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; A159 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S160 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L161 remplazado por D, E, H, K, R, N. Q, F, W, Y, P, o C; P162 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; G163 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q. F, W, Y, P, o C; 1164 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; 1165 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F166 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; T167 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P; o C; R168 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; S169 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o - C; Q170 remplazado por D, E, H, K, R. A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; K171 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; E172 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; G173 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L174 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; H175 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y176 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; T177 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; C178 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; S179 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S180 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; H181 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; F182 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; P183 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F; W, Y, o C; Y184 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; S185 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Q186 remplazado por D, E, H, K, R. A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; Y187 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; Q188 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; F189 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; W190 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; K191 remplazado por D, E, A, G,l, L, S, T, M, V, N, Q, F, W,?, P, o C; N192 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; F193 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; Q194 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; T195 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L196 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; K197 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; 1198 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V199 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; I200 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L201 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; G202 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L203 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V204 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q. F, W, Y, P, o C;~L205 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; P206 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; L207 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L208 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V209 remplazado por D, E, H,.K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; M210 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V211 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; 1212 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; C213 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; Y214 remplazado por D, E, H. K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; S215 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; G216 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; 1217 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q,F, W, Y, P, o C; L218 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; K219 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; T220 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L221 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L222 remplazado por D, E. H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; R223 remplazado por D, E, A, G, I, L, S. T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; C224 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; R225 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; N226 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; E227 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; K228 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; K229 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; R230 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W,Y, P, o C; H231 remplazado por D, E,.A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; R232 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; A233 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V234 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; R235 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; L236 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; I237 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F238 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; T239 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; I240 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; M241 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; I242 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V243 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y244 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; F245 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, I, M, V, P, o C; L246 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F247 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; W248 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; A249 remplazado por D, E, H, K,R, N, Q, F, W, Y, P, o C; P250 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; Y251 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; N252 remplazado por D, E, H, K, R, A, O, I, L, S, I, M, V, F, W, Y, P, o C; 1253 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V254 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L255 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L256 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L257 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; N258 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; T259 remplazado por D, E, H, K, R N, Q, F, W, Y, P, o C; F260 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, O, I, L, S, T, M, V, P, o C; Q261 remplazado por D, E, H, K, R, A, O, I, L, S, I, M, V, F, W, Y, P, o C; E262 remplazado por H, K, R A, O, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; F263 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, O, I, L, S, T, M, V, P, o C; F264 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; G265 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L266 remplazado por D, E, H, K, R N, Q, F, W, Y, P, o C; N267 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; N268 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; C269 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; S270 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S271 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S272 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; N273 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, w, Y, P, o C; R274 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; L275 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; D276 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; Q277 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; A278 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; M279 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Q280 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; V281 remplazado por D, E, H, K,.R, N, Q, F, W, Y, P, o C; T282 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; E283 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; T284 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L285 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; G286 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; M287 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C;.T288 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; H289 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; C290 replaced witll D, E, H, K, R, A, G,l, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; C291 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; I292 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; N293 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; P294 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T ,M, V, N, Q, F, W, Y, o C; 1295 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; 1296 remplazado por D, E. H, K., R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y297 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; A298.remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F299 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; V300 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; G301 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; E302 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; K303 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; F304 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; R305 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; N306 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; Y307 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; L308 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; L309 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V310 remplazado por D, E, H, K," R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F311 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; F312 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; Q313 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; K314 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; H315 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; 1316 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; A317 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; K318 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; R319. remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, Ñ, Q, F, W, Y, P, o C; F320 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; C321 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; K322 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; C323 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; C324 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o P; S325 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; I326 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; F327 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T,Jv1, V, P, o C; Q328 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; Q329 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; E330 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; A331 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; P332 remplazado por E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, o C; E333 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; R334 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; A335 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S336 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S337 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V338 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; Y339 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, A, G, I, L, S, T, M, V, P, o C; T340 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; R341 remplazado por D, E, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; S342 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; T343 remplazado por D, É, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, ?rC; E344 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; E345 remplazado por H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; Q346 remplazado por D, E, H, K, R, A, G, I, L, S, T, M, V, F, W, Y, P, o C; E347 remplazado por H, K, R, A; G, I, L, S, T, M, V, N, Q, F, W, Y, P, o C; 1348 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; S349 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; V350 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; G351 remplazado por D, E. H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C; y/o L352 remplazado por D, E, H, K, R, N, Q, F, W, Y, P, o C. Las construcciones resultantes pueden ser rutinariamente seleccionadas para actividades o funciones descritas en toda la memoria descriptiva y conocidas en la técnica. Preferiblemente, las construcciones resultantes tienen una actividad o función de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) incrementada y/o disminuida, mientras se mantienen las actividades o funciones del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) restantes. Muy preferiblemente, ias construcciones resultantes tienen más de una actividad o función de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) incrementada y/o disminuida, mientras se mantienen las actividades o funciones de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) restantes. Además, más de un aminoácido (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10) pueden ser remplazados por los aminoácidos sustituidos cornos e describió anteriormente (ya sea conservativos o no conservativos). Los aminoácidos sustituidos pueden ocurrir en la forma de longitud completa, madura o de pro-proteína de la proteína de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), así como los mutantes de deleción N-terminal y C-terminal, que tienen la fórmula general m-n, listada más adelante.

Una modalidad adicional de la invención se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene por lo menos una sustitución de aminoácidos, pero no más de 50 sustituciones de aminoácido, muy preferiblemente aún, no más de 40 sustituciones de aminoácidos, muy preferiblemente todavía no más de 30 sustituciones de aminoácidos, y muy preferiblemente aún no más de 20 sustituciones de aminoácidos. Desde luego, a fin de incrementar más la preferencia, es altamente preferible que un polipéptido tenga una secuencia 1 de aminoácidos que comprenda la secuencia de aminoácidos de polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), que contenga por lo menos uno, pero no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 sustituciones de aminoácidos.

En modalidades específicas, el número de adiciones, sustituciones y/o deleciones en la secuencia de aminoácidos de la figura 1 o aquella codificada por el clon depositado o fragmentos del mismo (por ejemplo, la forma madura y/u otros fragmentos aquí descritos) es 1-5, 5-10, 5-25, 5-50, 10-50 o 50-150, sustituciones de aminoácidos conservativos son preferibles.

Fragmentos de polinucleótidos y polipéptidos La presente invención también está dirigida a fragmentos de polinucleótidos de los polinucleótidos de la invención. En la presente invención, un "fragmento de polinucleótido" se refiere a un polinucleótido corto que tiene una secuencia de ácidos nucleicos que: es una porción de aquella contenida en el clon depositado, o que codifica el polipéptido codificado por el clon depositado; es una porción de aquella mostrada en SEQ ID NO: 1 o la cadena complementaria a la mis, o es una porción de una secuencia de polinucleótido que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 2. Los fragmentos de nucleótido de la invención son preferiblemente por lo menos aproximadamente 15 nt y muy preferiblemente por lo menos aproximadamente 20 nt, muy preferiblemente aún por lo menos aproximadamente 30 nt y muy preferiblemente aún por lo menos aproximadamente 40 nt, por lo menos aproximadamente 50 nt, por lo menos aproximadamente 75 nt o por lo menos aproximadamente 150 nt de longitud. Un fragmento "por lo menos 20 nt de longitud", por ejemplo, significa que incluye 20 o más bases contiguas de la secuencia de ADN de HDGNR10 contenida en el clon depositado o la secuencia de nucleótido mostrada en SEQ ID NO: 1. En este contexto "aproximadamente" incluye el valor particularmente mencionado, un valor más grande o un valor más pequeño por varios (5, 4, 3, 2 ó 1) nucleótidos, ya sea en un extremo a en ambos extremos. Estos fragmentos de nucleótidos tienen usos que incluyen pero no se limitan a, como sondas de diagnóstico e iniciadores como se describe aquí. Desde luego, se prefieren fragmentos más grandes (por ejemplo, 50, 150, 500, 600, 1000 nucleótidos). Además, ejemplos representativos de fragmentos de polinucleótido de la invención incluyen, por ejemplo, fragmentos que comprenden o que consisten alternativamente de una secuencia de aproximadamente el número de nucleótidos1-50, 51-100, 101-150, 151-200, 201-250, 251-300, 301-350, 351-400, 401-450, 451-500, 501-550, 551-600, 651-700/ 701-750, 751-800, 800-850, 851-900, 901-950, 951-1000, 1001-1050, 1051-1100, 1101-1150, 1151-1200, 1201-1250, 1251-1300, 1301-1350, 1351-1400, ó 1401 hasta el final de la SEQ ID NO: 1 , o la cadena complementaria a la misma, o el ADN de HDGNR10 contenido en el clon depositado. En este contexto "aproximadamente" incluye los intervalos particularmente mencionados, o intervalos más grandes o más pequeños por varios (5, 4, 3, 2, ó 1) nucleótidos, en cualquier extremo o en ambos extremos. Preferiblemente, estos fragmentos codifican un polipéptido que tiene actividad biológica. Muy preferiblemente, estos polinucleótidos se pueden usar como sondas o iniciadores como aquí se describe. Los polinucleótidos que hibridan a estas moléculas de ácido nucleico bajo condiciones de hibridación astringentes o condiciones de astringencia inferiores también son abarcados por la invención, como son los polipéptidos codificados por estos pólinucleótidos. En la presente invención, un "fragmento de polipéptido" se * refiere a una secuencia de aminoácidos que es una porción de aquella contenida en SEQ ID NO: 2 o codificada por el ADN de HDGNR10 contenido en el_ clon depositado. Fragmentos de proteína (polipéptido) pueden ser de '• % "forma libre" o estar comprendidos dentro de un polipéptido más grande del cua el fragmento forma una parte o región, muy preferiblemente como una región continua individual. Ejemplos representativos de fragmentos de polipéptido de la invención ¡ncluyen, por ejemplo, fragmentos que comprenden o que consisten alternativamente de aproximadamente el aminoácido número 1-20, 21-40, 41-60, 61-80, 81-100, 102-120- 121-140, 141-160 ó 161 hasta el extremo de la región de codificación. Además, los fragmentos de polipéptido * pueden ser de aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140' ó 150 aminoácidos de longitud. En este contexto "aproximadamente" incluye los intervalos o valores particularmente mencionados, y los intervalos o valores más grandes o más pequeños por varios (5, 4, 3, 2, ó 1 ) aminoácidos, en cualquier extremo o en varios extremos. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también son comprendidos por la invención. Incluso si la deleción de uno o más aminoácidos del N-terminal de una proteína da por resultado la modificación o pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína, otras actividades fucnionales (por ejemplo, actividades biológicas, capacidad para multimerizar, capacidad para unirse a un ligando de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5)) pueden ser retenidas. Por ejemplo, la capacidad de muteínas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) acortadas para inducir y/o unirse a los anticuerpos que reconocerán las formas completa o madura de los polipéptidos generalmente serán retenidas cuando menos de la mayoría de los residuos del polipéptido completo o maduro sean removidos del N-terminal. El que un polipéptido particular que carece de residuos N-terminales de un polipéptido completo retenga dichas actividades inmunológicas se pueden determinar fácilmente mediante métodos de rutina descritos aquí y de otra manera conocidos en la técnica. No es probable que una muteína de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) con un gran número residuos de aminoácido N-teminales deletados pueda retener algunas actividades biológicas o inmunogénicas. De hecho, los péptidos compuestos de tan pocos como seis residuos de ^aminoácido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) pueden a menudo inducir una respuesta inmune. Los fragmentos de polipéptido preferidos incluyen la proteína secretada así como la forma madura. Los fragmentos de polipéptldo preferidos adicionales incluyen la proteína secretada o la forma madura que tiene una serie continua de residuos deletados del amino terminal o carboxilo terminal o ambos. Por ejemplo, cualquier número de aminoácidos. Por consiguiente, los fragmentos de polipéptido ¡ncluyen la proteína de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) secretada así como la forma madura. Los fragmentos de polipéptido preferidos incluyen la proteína de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o la forma madura que tiene una serie continua de residuos deletados del amino terminal o carboxilo terminal o ambos. Por ejemplo, cualquier número de aminoácidos, que varía de 1-60, puede ser deletado del amino terminal ya sea de polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) secretado o de la forma madura. De manera similar, cualquier número de aminoácidos, que varía de 1-30 puede ser deletado del carboxilo terminal de la proteína de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) secretada o la forma madura. Además, cualquier combinación de las deleciones amino terminal o carboxilo terminal son preferidas. De manera similar, los polinucelótidos que codifican estos fragmentos de polipéptido también son preferidos. Particularmente, ias deleciones N-terminales de polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se puede describir mediante la fórmula general m-352, en donde m es un entero de 2 a 346, en donde m corresponde a la posición de residuo de aminoácidos identificados en SEQ ID NO: 2 o el polipéptido codificado por el clon depositado. Muy en particular, la invención provee poiinucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden o que consisten alternativamente de la secuencia de aminoácidos de residuos de deleciones N-terminales del polipéptido de la invención mostrado como SEQ ID NO: 2 incluyendo polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de los residuos: D-2 a L-352; Y-3 a L-352; Q-4 a L-352; V-5 a L-352; S-6 a L-352; S-7 a L-352; P-8 a L-352; 1-9 a L-352; Y-10 a L-352; D-11 a L-352; 1-12 a L-352; N-13 a L-352; Y-14 a L-352; Y-15 a L-352; T-16 a L-352; S-17 a L-352; E-18 a L-352; P-19 a L-352; C-20 a L-352; P-21 a L-352; K-22 a L-352; I-23 a L-352; N-24 a L-352; V-25 a L-352; K-26 a L-352; Q-27 a L-352; 1-28 a L-352; A-29 a L-352; A-30 a L-352; R-31 a L-352; L-32 a L-352; L-33 a L-352; P-34 a L-352; P-35 a L-352; L-36 a L-352; Y-37 a L-352; S-38 a L-352; L-39 a L-352; V-40 a L-352; F-41 a L-352; I-42 a L-352; F-43 a L-352; G-44 a L-352; F-45 a L-352; V-46 a L-352; G-47 a L-352; N-48 a L-352; M-49 a L-352; L-50 a L-352; V-51 a L-352; I-52 a L-352; L-53 a L-352; I-54 a L-352; L-55 a L-352; 1-56 a L-352; N-57 a L-352; C-58 a L-352; Q-59 a L-352; R-60 a L-352; L-61 a L-352; E-62 a L-352; S-63 a L-352; M-64 a L-352; T-65 a L-352; D-66 a L-352; 1-67 a L-352; Y-68 a L-352; L-69 a L-352; L-70 a L-352; N-71 a L-352; L-72 a L-352; A-73 a L-352; 1-74 a L-352; S-75 a L-352; D-76 a L-352; L-77 a L-352; F-78 a L-352; F-79 a L-352; L-80 a L-352; L-81 a L-352; T-82 a L-352; V-83 a L-352; P-84 a L-352; F-85 a L-352; W-86 a L-352; A-87 a L-352; H-88 a L-352; Y-89 a L-352; A-90 a L-352; A-91 a L-352; A-92 a L-352; Q-93 a L-352; W-94 a L-352; D-95 a L-352; F-96 a L-352; G-97 a L-352; N-98 a L-352; T-99 a L-352; M-100 a L-352; C-101 a L-352; Q-102 a L-352; L-103 a L-352; L-104 a L-352; T-105 a L-352; G-106 a L- 352; L-107 a L-352; Y-108 a L-352; F-109 a L-352; 1-110 a L-352; G-111 a L- 352; F-112 a L-352; F-113 a L-352; S-114 a L-352;G-115 a L-352; 1-116 a L-352; F-117 a L-352; F-118 a L-352; 1-119 a L-352; 1-120 a L-352; L-121 a L-352; L-122 a L-352; T-123 a L-352; 1-124 a L-352; D-125 a L-352; R-126 a L-352; Y-127 a L-352; L-128 a L-352; A-129 a L-352; 1-130 a L-352; V-131 a L-352; H-132 a L-352; A-133 a L-352; V-134 a L-352; F-135 a L-352; A-136 a L-352; L-137 a L-352; K-138 a L-352; A-139 a L-352; R-140 a L-352; T-141 a L-352; V-142 a L-352; T-143 a L-352; F-144 a L-352; G-145 a L-352; V-146 a L-352; V-147 a L-352; T-148 a L-352; S-149 a L-352; V-150 a L-352; 1-151 a L-352; T-152 a L-352; W-153 a L-352; V-154 a L-352; V-155 a L-352; A-156 a L-352; V- 157 a L-352; F-158 a L-352; A-159 a L-352; S-160 a L-352; L-161 a L-352; P-162 a L-352; G-163 a L-352; 1-164 a L-352; 1-165 a L-352; F-166 a L-352; T-167 a L-352; R-168 a L-352; S-169 a L-352; Q-170 a L-352; K-171 a L-352; E-172 a L-352; G-173 a L-352; L-174 a L-352; H-175 a L-352; Y-176 a L-352; T-177 a L-352; C-178 a L-352; S-179 a L-352; S-180 a L-352; H-181 a L-352; F-182 a L-352; P-183 a L-352; Y-184 a L- 352; S-185 a L-352; Q-186 a L-352; Y-187 a L-352; Q-188 a L-352; F-189 a L-352; W-190 a L-352; K-191 a L-352; N-192 a L-352; F-193 a L-352; Q-194 a L-352; T-195 a L-352; L-196 a L-352; K-197 a L-352; 1-198 a L-352; V-199 a L-352; I-200 a L-352; L-201 a L-352; G-202 a L-352; L-203 a L-352; V-204 a L-352; L-205 a L-352; P-206 a L-352; L-207 a L-352; L-208 a L-352; V-209 a L-352; M-210 a L-352; V-211 a L-352; 1-212 a L-352; C-213 a L-352; Y-214 a L-352; S-215 a L-352; G-216 a L-352; 1-217 a L-352; L-218 a L-352; K-219 a L-352; T-220 a L-352; L-221 a L-352; L-222 a L-352; R-223 a L-352; C-224 a L-352; R-225 a L-352; N-226 a L-352; E-227 a L-352; K-228 a L-352; K-229 a L-352; R-230 a L-352; H-231 a L-352; R-232 a L-352; A-233 a L-352; V-234 a L-352; R-235 a L-352; L-236 a L-352; I-237 a L-352; F-238 a L-352; T-239 a L-352; I-240 a L-352; M-241 a L-352; I-242 a L-352; V-243 a L-352; Y-244 a L-352; F-245 a L-352; L-246 a L-352; F-247 a L-352; W-248 a L-352; A-249 a L-352; P-250 a L-352; Y-251 a L-352; N-252 a L-352; l:253 a L-352; V-254 a L-352; L-255 a L-352; L-256 a L-352; L-257 a L-352; N-58 a L-352; T-259 a L-352; F-260 a L-352; Q-261 a L-352; E-262 a L-352; F-263 a L-352; F-264 a L-352; G-265 a L-352; L-266 a L-352; N-267 a L-352; N-268 a L-352; C-269 a L-352; .S-270 a L-352; S-271 a L-352; S-272 a L-352; N-273 a L-352; R-274 a L-352; L-275 a L-352; D-276 a L-352; Q-277 a L-352; A-278 a L-352; M-279 a L-352; Q-280 a L-352; V-281 a L-352; T-282 a L-352; E-283 a L-352; T-284 a L-352; L-285 a L-352; G-286 a L-352; M-287 a L-352; T-288 a L-352; H-289 a L-352; C-290 a L-352; C-291 a L-352; I-292 a L-352; N-293 a L-352; P-294 a L-352; I-295 a L-352; I-296 a L-352; Y-297 a L-352; A-298 a L-352; F-299 a L- -* 352; V-300 a L-352; G-301 a L-352; E-302 a L-352; K-303 a L-352; F-304 a L-352; R-305 a L-352; N-306 a L-352; Y-307 a L-352; L-308 a L-352; L-309 a L-352; V-310 a L-352; F-311 a L-352; F-312 a L-352; Q-313 a L-352; K-314 a L-352; H-315 a L-352; 1-316 a L-352; A-317 a L-352; K-318 a L-352; R-319 a L-352; F-320 a L-352; C-321 a L-352; K-322 a L-352; C-323 a L-352; C-324 a L-352; S-325 a L-352; I-326 a L-352; F-327 a L-352; Q-328 a L-352; Q-329 a L-352; E-330 a L-352; A-331 a L-352; P-332 a L-352; E-333 a L-352; R-334 a L-352; A-335 a L-352; S-336 a L-352; S-337 a L-352; V-338 a L-352; Y-339 a L-352; T-340 a L-352; R-341 a L-352; S-342 a L-352; T-343 a L-352; G-344 a L-352; E-345 a L-352; Q-346 a L-352; y/o E-347 a L-352 de SEQ ID NO:2. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también son comprendidos en la invención. Además, ia invención provee polinucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden o que consisten alternativamente de la secuencia de aminoácidos de residuos de deleciones N-terminal del polipéptido de la invención codificado por el clon HDGNR10 depositado (SEQ ID NO: 22) incluyendo polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de residuos: D-2 a L-352; Y-3 a L-352; Q-4 a L-352; V-5 a L-352; S-6 a L-352; S-7 a L-352; P-8 a L-352; I-9 a L-352; Y-10 a L-352; D-11 a L-352; 1-12 a L-352; N-13 a L-352; Y-14 a L-352; Y-15 a L-352; T-16 a L-352; S-17 a L-352; E-18 a L-352; P-19 a L-352; C-20 a L-352; Q-21 a L-352; K-22 a L-352; I-23 a L-352; N-24 a L-352; V-25 a L-352; K-26 a L-352; Q-27 a L-352; 1-28 a L-352; A-29 a L-352; A-30 a L-352; R-31 a L-352; L-32 a L-352; L-33 a L-352; P-34 a L-352; P-35 a L-352; L-36 a L-352; Y-37 a L-352; S-38 a L-352; "L-39 a L-352; V-40 a L-352; F-41 a L-352; I-42 a L-352; F-43 a L-352; G-44 a L-352; F-45 a L-352; V-46 a L-352; G-47 a L-352; N-48 a L-352; M-49 a L-352; L-50 a L-352; V-51 a L-352; I-52 a L-352; L-53 a L-352; I-54 a L-352; L-55 a L- 352; I-56 a L-352; N-57 a L-352; C-58 a L-352; K-59 a L-352; R-60 a L-352; L- 61 a L-352; K-62 a L-352; S-63 a L-352; M-64 a L-352; T-65 a L-352; D-66 a L-352; I-67 a L-352; Y-68 a L-352; L-69 a L-352; L-70 a L-352; N-71 a L-352; L-72 a L-352; A-73 a L-352; I-74 a L-352; S-75 a L-352; D-76 a L-352; L-77 a L-352; F-78 a L-352; F-79 a L-352; L-80 a L-352; L-81 a L-352; T-82 a L-352; V-83 a L-352; P-84 a L-352; F-85 a L-352; W-86 a L-352; A-87 a L-352; H-88 a L-352; Y-89 a L-352; A-90 a L-352; A-91 a L-352; A-92 a L-352; Q-93 a L-352; W-94 a L-352; D-95 a L-352; F-96 a L-352; G-97 a L-352; N-98 a L-352; T-99 a L-352; M-100 a L-352; C-101 a L-352; Q-102 a L-352; L-103 a L-352; L-104 a L-352; T-105 a L-352; G-106 a L-352; L-107 a L-352; Y-108 a L-352; F-109 a L-352; 1-110 a L-352; G-111 a L-352; F-112 a L-352; F-113 a L-352; S-114 a L-352; G-115 a L-352; 1-116 a L-352; F-117 a L-352; F-118 a L-352; 1-119 a L-352; 1-120 a L-352; L-121 a L-352; L-122 a L-352; T-123 a L-352; 1-124 a L-352; D-125 a L-352; R-126 a L-352; Y-127 a L-352; L-128 a L-352; A-129 a L-352; V-130 a L-352; V-131 a L-352; H-132 a L-352; A-133 a L-352; V-134 a L- 352; F-135 a L-352; A-136 a L-352; L-137 a L-352; K-138 a L-352; A-139 a L-352; R-140 a L-352; T-141 a L-352; V-142 a L-352; T-143 a L-352; F-144 a L-352; G-145 a L-352; V-146 a L-352; V-147 a L-352; T-148 a L-352; S-149 a L-352; V-150 a L-352; 1-151 a L-352; T-152 a L-352; W-153 a L-352; V-154 a L-352 V-155 a L-352; A-156 a L-352; V-157 a L-352; F-158 a L-352; A-159 a L-352 S-160 a L-352; L-161 a L-352; P-162 a L-352; G-163 a L-352; 1-164 a L-352 1-165 a L-352; F-166 a L-352; T-167 a L-352; R-168 a L-352; S-169 a L-352 Q-170 a L-352; K-171 a L-352; E-172 a L-352; G-173 a L-352; L-174 a L-352 H-175 a L-352; Y-176 a L-352; T-177 a L-352; C-178 a L-352; S-179 a L-352 S-180 a L-352; H-181 a L-352; F-182 a L-352; P-183 a L-352; Y-184 a L-352 S-185 a L-352; Q-186 a L-352; Y-187 a L-352; Q-188 a L-352; F-189 a L-352 W-190 a L-352; K-191 a L-352; N-192 a L-352; F-193 a L-352; Q-194 a L-352 T-195 a L-352; L-196 a L-352; K-197 a L-352; 1-198 a L-352; V-199 a L-352 I-200 a L-352; L-201 a L-352; G-202 a L-352; L-203 a L-352; V-204 a L-352 L-205 a L-352; P-206 a L-352; L-207 a L-352; L-208 a L-352; V-209 a L-352 M-210 a L-352; V-211 a L-352; 1-212 a L-352; C-213 a L-352; Y-214 a L-352 S-215 a L-352; G-216 a L-352; 1-217 a L-352; L-218 a L-352; K-219 a L-352 T-220 a L-352; L-221 a L-352; L-222 a L-352; R-223 a L-352; C-224 a L-352 R-225 a L-352; N-226 a L-352; E-227 a L-352; K-228 a L-352; K-229 a L-352 R-230 a L-352; H-231 a L-352; R-232 a L-352; A-233 a L-352; V-234 a L-352 R-235 a L-352; L-236 a L-352; I-237 a L-352; F-238 a L-352; T-239 a L-352 I-240 a L-352; M-241 a L-352; I-242 a L-352; V-243 a L-352; Y-244 a L-352 F-245 a L-352; L-246 a L-352; F-247 a L-352; W-248 a L-352; A-249 a L-352 P-250 a L-352; Y-251 a L-352; N-252 a L-352; I-253 a L-352; V-254 a L-352 L-255 a L-352; L-256 a L-352; L-257 a L-352; N-258 a L-352; T-259 a L-352 F-260 a L-352; Q-261 a L-352; E-262 a L-352; F-263 a L-352; F-264 a L-352 G-265 a L-352; L-266 a L-352; N-267 a L-352; N-268 a L-352; C-269 a L- 352; S-270 a L-352; S-271 a L-352; S-272 a L-352; N-273 a L-352; R-274 a L-352; L-275 a L-352; D-276 a L-352; Q-277 a L-352; A-278 a L-352; M-279 a L-352; Q-280 a L-352; V- 281 a L-352; T-282 a L-352; E-283 a L-352; T-284 a L-352; L-285 a L-352; G-286 a L-352; M-287 a L-352; T-288 a L-352; H-289 a L-352; C-290 a L-352; C-291 a L-352; I-292 a L-352; N-293 a L-352; P-294 a L-352; I-295 a L-352; I-296 a L-352; Y-297 a L-352; A-298 a L-352; F-299 a L-352; V-300 a L-352; G-301 a L-352; E-302 a L-352; K-303 a L-352; F-304 a L-352; R-305 a L-352; N-306 a L-352; Y-307 a L-352; L-308 a L-352; L-309 a L-352; V-310 a L-352; F-311 a L-352; F-312 a L-352; Q-313 a L-352; K-314 a L-352; H-315 a L-352; 1-316 a L-352; A-317 a L-352; K-318 a L-352; R-319 a L-352; F-320 a L-352; C-321 a L-352; K-322 a L-352; C-323 a L-352; C-324 a L-352; S-325 a L-352; I-326 a L-352; F-327 a L-352; Q-328 a L-352; Q-329 a L-352; E-330 a L-352; A-331 a L-352; P-332 a L-352; E-333 a L-352; R-334 a L-352; A-335 a L-352; S-336 a L-352; S-337 a L-352; V-338 a L-352; Y-339 a L-352; T-340 a L-352; R-341 a L-352; S-342 a L-352; T-343 a L-352; E-344 a L-352; E-345 a L-352; Q-346 a L-352; y/o E-347 a L-352 de SEQ ID NO:22. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también son comprendidos por la invención. La presente solicitud también está dirigida a moléculas de ácidos nucleicos que comprenden o que consisten alternativamente de una secuencia de pollnucleótidos por lo menos 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de polinucleótido que codifica el polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) anteriormente descrito. La presente invención también comprende las secuencias de polinucleótido fusionadas a una secuencia de polinucleótido heteróloga. También como se mencionó antes, aun cuando si la deleción de uno o más aminoácidos del C-terminal de una proteína da por resultado la modificación o pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína, otras -4 actividades fucnionales (por ejemplo, actividades biológicas, capacidad para multimerízar, capacidad para unirse a un ligando de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5)) pueden ser retenidas. Por ejemplo, la capacidad de muteínas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) acortadas para inducir y/o unirse a los anticuefos que reconocerán las formas completa o madura de los polipéptidos generalmente serán retenidas cuando menos de la mayoría de los residuos del polipéptido completo o maduro sean removidos del C-terminal. El que un polipéptido particular que carece de residuos C- terminales de un polipéptido completo retenga dichas actividades inmunológicas se pueden determinar fácilmente mediante métodos de rutina descritos aquí y de otra manera conocidos en la técnica. No es probable que * a- una muteína de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) con un gran _ número residuos de aminoácido C-teminales deletados pueda retener algunas actividades biológicas o inmunogénicas. De hecho, los péptidos compuestos de tan pocos como seis residuos de aminoácido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) pueden a menudo inducir una respuesta inmune. Por consiguiente, la presente invención provee además polipéptidos que tienen uno o más residuos deletados del carboxilo terminal de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) mostrado en la figura 1 (SEQ ID NO: 2) o el polipéptido codificado por el clon depositado, como se describe mediante la fórmula general 1-n, én donde n es un entero de 6 a 346; en donde n corresponde a la posición de residuo de aminoácido identificada en SEQ ID NO: 2 o en el polipéptido codificado por el clon depositado. Muy en particular, la invención provee polinucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden o que consisten alternativamente de la secuencia de aminoácidos de los residuos de D-2 a G-351; D-2 a V-350; D-2 a S-349; D-2 a I-348; D-2 a E-347; D-2 a Q-346; D-2 a E-345; D-2 a G-344; D-2 a T-343; D-2 a S-342; D-2 a R-341 ; D-2 a T-340; D-2 a Y-339; D-2 a V-338; D-2 a S-337; D-2 a S-336; D-2 a A-335; D-2 a R-334; D-2 a E-333; D-2 a P-332; D-2 a A-331 ; D-2 a E-330; D-2 a Q-329; D-2 a Q-328; D-2 a F-327; D-2 a 1-326; D-2 a S-325; D-2 a C-324; D-2 a C-323; D-2 a K-32-; D-2 a C-321 ; D-2 a F-320; D-2 a R 319; D-2 a K-318; D-2 a A-317; D-2 a 1-316; D-2 a H-315; D-2 a K-314; D-2 a Q-313; D-2 a F-312; D-2 a F-311 ; D-2 a V-310; D-2 a L-309; D-2 a L-308; D-2 a Y-307; D-2 a N-306; D-2 a R-305; D-2 a F-304; D-2 a K-303; D-2 a E-302; D-2 a G-301 ; D-2 a V-300; D-2 a F-299; D-2 a A-298; D-2 a Y-297; D-2 a I-296; D-2 a I-295; D-2 a P-294; D-2 a N-293; D-2 a I-292; D-2 a C-291 ; D-2 a C-290; D-2 a H-289; D-2 a T-288; D-2 a M-287; D-2 a G-286; D-2 a L-285; D-2 a T-284; D-2 a E-283; D-2 a T-282; D-2 a V-281 ; D-2 a Q-280; D-2 a M- 279; D-2 a A-278; D-2 a Q-277; D- 2 a D-276; D-2 a L-275; D-2 a R-274; D-2 a N-273; D-2 a S-272; D-2 a S-271 ; D-2 a S-270; D-2 a C-269; D-2 a N-268; D-2 a N-267; D-2 a L-266; D-2 a G- 265; D-2 a F-264; D-2 a F-263; D-2 a E-262; D-2 a Q-261 ; D-2 a F-260; D-2 a T-259; D-2 a N-258; D-2 a L-257; D-2 a L-256; D-2 a L-255; D-2 a V-254; D-2 a I-253; D-2 a N-252; D-2 a Y-251 ; D-2 a P-250; D-2 a A-249; D-2 a W-248; D- 2 a F-247; D-2 a L-246; D-2 a F-245; D-2 a Y-244; D-2 a V-243; D-2 a I-242; D-2 a M-241 ; D-2 a I-240; D-2 a T-239; D-2 a F-238; D-2 a I-237; D-2 a L-236; * D-2 a R-235; D-2 a V-234; D-2 a A-233; D-2 a R-232; D-2 a H-231 ; D-2 a R- 230; D-2 a K-229; D-2 a K-228; D-2 a E-227; D-2 a N-226; D-2 a R-225; D-2 a C-224; D-2 a R-223; D-2 a L-222; D-2 a L-221 ; D-2 a T-220; D-2 a K-219; D-2 a L-218; D-2 a 1-217; D-2 a G-216; D-2 a S-215; D-2 a Y-214; D-2 a C-213; D- 2 a 1-212; D-2 a V-211 ; D-2 a M-210; D-2 a V-209; D-2 a L-208; D-2 a L-207; D-2 a P-206; D-2 a L-205; D-2 a V-204; D-2 a L-203; D-2 a G-202; D-2 a L- 201 ; D-2 a I-200; D-2 a V-199; D-2 a 1-198; D-2 a K-197; D-2 a L-196; D-2 a T- 195; D-2 a Q-194; D-2 a F-193; D-2 a N-192; D-2 a K-191 ; D-2 a W-190; D-2 a F-189; D-2 a Q-188; D-2 a Y-187; D-2 a Q-186; D-2 a S-185; D-2 a Y-184; D-2 a P-183; D-2 a F-182; D-2 a H-181 ; D-2 a S-180; D-2 a S-179; D-2 a C-178; D- 2 a T-177; D-2 a Y-176; D-2 a H-175; D-2 a L-174; D-2 a G-173; D-2 a E-172; D-2 a K-171; D-2 a Q-170; D-2 a S-169-; D-2 a R-168; D-2 a T-167; D-2 a F- 166; D-2 a 1-165; D-2 a 1-164; D-2 a G-163; D-2 a P-162; D-2 a L-161 ; D-2 a S- 160; D-2 a Á-159; D-2 a F-158; D-2 a V-157; D-2 a A-156; D-2 a V-155; D-2 a V-154; D-2 a W-153; D-2 a T-152; D-2 a 1-151 ; D-2 a V-150; D-2 a S-149; D-2 a T-148; D-2 a V-147; D-2 a V-146; D-2 a G-145; D-2 a F-144; D-2 a T-143; D- 2 a V-142; D-2 a T-141; D-2 a R-140; D-2 a A-139; D-2 a K-138; D-2 a L-137; D-2 a A-136; D-2 a F-135; D-2 a V-134; D-2 a A-133; D-2 a H-132; D-2 a V- 131; D-2 a 1-130; D-2 a A-129; D-2 a L-128; D-2 a Y-127; D-2 a R-126; D-2 a D-125; D-2 a 1-124; D-2 a T-123; D-2 a L-122; D-2 a L-121; D-2 a 1-120; D-2 a 1-119; D-2 a F-118; D-2 a F-117; D-2 a 1-116; D-2 a G-115; D-2 a S-114; D-2 a F-113; D-2 a F-112; D-2 a G-111 ; D-2 a 1-110; D-2 a F-109; D-2 a Y-108; D-2 a L-107; D-2 a G-106; D-2 a T-105; D-2 a L-104; D-2 a L-103; D-2 a Q-102; D-2 a C-101 ; D-2 a M-100; D-2 a T-99; D-2 a N-98; D-2 a G-97; D-2 a F-96; D-2 a D-95; D-2 a W-94; D-2 a Q-93; D-2 a A-92; D-2 a A-91; D-2 a A-90; D-2 a Y-89; D-2 a H-88; D-2 a A-87; D-2 a W-86; D-2 a F-85; D-2 a P-84; D-2 a V-83; D-2 a T-82; D-2 a L-81; D-2 a L-80; D-2 a F-79; D-2 a F-78; D-2 a L-77; D-2 a D-76; D-2 a S-75; D-2 a 1-74; D-2 a A-73; D-2 a L-72; D-2 a N-71 ; D-2 a L-70; D-2 a L-69; D-2 a Y-68; D-2 a I-67; D-2 a D-66; D-2 a T-65; D-2 a M-64; D-2 a S-63; D-2 a E-62; D-2 a L-61 ; D-2 a R-60; D-2 a Q-59; D-2 a C-58; D-2 a N-57; D-2 a I-56; D-2 a L-55; D-2 a 1-54; D-2 a L-53; D-2 aJ-52; D-2 a V-51 ; D-2 a L-50; D-2 a M-49; D-2 a N-48; D-2 a G-47; D-2 a V-46?D-2 a F-45; D-2 a G-44; D-2 a F-43; D-2 a 1-42; D-2 a F-41 ; D-2 a V-40; D-2 a L-39; D-2 a S-38; D-2 a Y-37; D-2 a L-36; D-2 a P-35; D-2 a P-34; D-2 a L-33; D-2 a L-32; D-2 a R-31 ; D-2 a A-30; D-2 a A-29; D-2 a I-28; D-2 a Q-27; D-2 a K-26; D-2 a V-25; D-2 a N-24; D-2 a I-23; D-2 a K-22; D-2 a P-21 ; D-2 a C-20; D-2 a P-19; D-2 a E-18; D-2 a S-17; D-2 a T-16; D-2 a Y-15; D-2 a Y-14; D-2 a N-13; D-2 a 1-12; D-2 a D-11 ; D-2 á Y-10; D-2 a I-9; y/o D-2 a P-8 de SEQ ID NO:2. Además, una metionina se puede añadir al N-terminal de cada una de estas construcciones C-terminal. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también son comprendidos por la invención.

Además, la Invención provee polinucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden o que consisten alternativamente de la secuencia de aminoácidos de los residuos de D-2 a G-351; D-2 a V-350; D-2 a S-349; D-2 a I-348; D-2 a E-347; D-2 a Q-346; D-2 a E-345; D-2 a E-344; D-2 a T-343; D-2 a S-342; D-2 a R-341 ; D-2 a T-340; D-2 a Y-339; D-2 a V-338; D-2 a S-337; D-2 a S-336; D-2 a A-335; D-2 a R-334; D-2 a E-333; D-2 a P-332; D-2 a A-331 ; D-2 a E-330; D-2 a Q-329; D-2 a Q-328; D-2 a F-327; D-2 a I-326; D-2 a S-325; D-2 a C-324; D-2 a C-323; D-2 a K-322; D-2 a C-321 ; D-2 a F-320; D-2 a R-319; D-2 a K-318; D-2 a A-317; D-2 a 1-316; D-2 a H-315; D-2 a K-314; D-2 a Q-313; D-2 a F-312; D-2 a F-311 ; D-2 a V-310; D-2 a L-309; D-2 a L-308; D-2 a Y-307; D-2 a N-306; D-2 a R-305; D-2 a F-304; D-2 a K-303; D-2 a E-302; D-2 a G-301 ; D-2 a V-300; D-2 a F-299; D-2 a A-298; D-2 a Y-297; D-2 a I-296; D-2 a I-295; D-2 a P-294; D-2 a N-293; D-2 a I-292; D-2 a C-291; D-2 a C-290; D-2 a H-289; D-2 a T-288; D-2 a M-287; D-2 a G-286; D-2 a L-285; D-2 a T-284; D-2 a E-283; D-2 a T-282; D-2 a V-281 ; D-2 a Q-280; D-2 a M-279; D-2 a A-278; D-2 a Q-277; D-2 a D-276; D-2 a L-275; D-2 a R-274; D-2 a N-273; D-2 a S-272; D-2 a S-271 ; D-2 a S-270; D-2 a C-269; D-2 a N-268; D-2 a N-267; D-2 a L-266; D-2 a G-265; D-2 a F-264; D-2 a F-263; D-2 a E-262; D-2 a Q-261 ; D-2 a F-260; D-2 a T-259; D-2 a N-258; D-2 a L-257; D-2 a L-256; D-2 a L-255; D-2 a V-254; D-2 a 1-253; D-2 a N-252; D-2 a Y-251; D-2 a P-250; D-2 a A-249; D-2 a W-248; D-2 a F-247; D-2 a L-246; D-2 a F-245; D-2 a Y-244; D-2 a V-243; D-2 a I-242; D-2 a M-241; D-2 a I-240; D-2 a T-239; D-2 a F-238; D-2 a 1-237; D-2 a L-236; D-2 a R-235; D-2 a V-234; D-2 a A- 233; D-2 a R-232; D-2 a H-231 ; D-2 a R-230; D-2 a K-229; D-2 a K-228; D-2 a E-227; D-2 a'N-226; D-2 a R-225; D-2 a C-224; D-2 a R-223; D-2 a L-222; D-2 a L-221 ; D-2 a T-220; D-2 a K-219; D-2 a L-218; D-2 a 1-217; D-2 a G-216; D-2 a S-215; D-2 a Y-214; D-2 a C-213; D-2 a 1-212; D-2 a V-211 ; D-2 a M-210; D-2 a V-209; D-2 a L-208; D-2 a L-207; D-2 a P-206; D-2 a L-205; D-2 a V-204; D-2 a L-203; D-2 a G-202; D-2 a L-201; D-2 a I-200; D-2 a V-199; D-2 a 1-198; D-2 a K-197; D-2 a L-196; D-2 a T-195; D-2 a Q-194; D-2 a F-193; D-2 a N-192; D-2 a K-191 ; D-2 a W-190; D-2 a F-189; D-2 a Q-188; D-2 a Y-187; D-2 a Q-186; D-2 a S-185; D-2 a Y-184; D-2 a P-183; D-2 a F-182; D-2 a H-181 ; D-2 a S-180; D-2 a S-179; D-2 a C-178; D-2 a T-177; D-2 a Y-176; D-2 a H-175; D-2 a L-174; D-2 a G-173; D-2 a E-172; D-2 a K-171; D-2 a Q-170; D-2 a S-169; D-2 a R-168; D-2 a f-167; D-2 a F-166; D-2 a 1-165; D-2 a 1-164; D-2 a G-163; D-2 a P-162; D-2 a L-161 ; D-2 a S-160; D-2 a A-159; D-2 a F-158; D-2 a V-157; D-2 a A-156; D-2 a V-155; D-2 a V-154; D-2 a W-153; D-2 a T-152; D-2 a 1-151; D-2 a V-150; D-2 a S-149; D-2 a T-148; D-2 a V-147; D-2 a V-146; D-2 a G-145; D-2 a F-144; D-2 a T-143; D-2 a V-142; D-2 a T-141 ; D-2 a R-140; D-2 a A-139; D-2 a K-138; D-2 a L-137; D-2 a A-136; D-2 a F-135; D-2 a V-134; D-2 a A-133; D-2 a H-132; D-2 a V-131 ; D-2 a V-130; D-2 a A-129; D-2 a L-128; D-2 a Y-127; D-2 a R-126; D-2 a D-125; D-2 a 1-124; D-2 a T-123; D-2 a L-122; D-2 a L-121; Dr2 a 1-120; D-2 a 1-119; D-2 a F-118; D-2 a F-117; D-2 a 1-116; D-2 a G-115; D-2 a S-114; D-2 a F-113; D-2 a F-112; D-2 a G-111 ; D-2 a 1-110; D-2 a F-109; D-2 a Y-108; D-2 a L-107; D-2 a" G-106; D-2 a T-105; D-2 a L-104; D-2 a L-103; D-2 a Q-102; D-2 a C-101 ; D-2 a M-100; D-2 a T-99; D-2 a N-98; D-2 a G-97; D-2 a F-96; D-2 a D-95; D-2 a W-94; D-2 a Q-93; D-2 a A-92; D-2 a A-91; D-2 a A-90; D-2 a Y-89; D-2 a H-88; D-2 a A-87; D-2 a W-86; D-2 a F-85; D-2 a P-84; D-2 a V-83; D-2 a T-82; D-2 a L-81 ; D-2 a L-80; D-2 a F-79; D-2 a F-78; D-2 a L-77; D-2 a D-76; D-2 a S-75; D-2 a I-74; D-2 a A-73; D-2 a L-72; D-2 a N-71 ; D-2 a L-70; D-2 a L-69; D-2 a Y-68; D-2 a I-67; D-2 a D-66; D-2 a T-65; D-2 a M-64; D-2 a S-63; D-2 a K-62; D-2 a L-61; D-2 a R-60; D-2 a K- 59;D-2 a C-58; D-2 a N-57; D-2 a I-56; D-2 a L-55; D-2 a I-54; D-2 a L-53; D- 2 a I-52; D-2 a V-51 ; D-2 a L-50; D-2 a M-49; D-2 a N-48; D-2 a G-47; D-2 a V-46; D-2 a F-45; D-2 a G-44; D-2 a F-43; D-2 a I-42; D-2 a F-41; D-2 a V-40; D-2 a L-39; D-2 a S-38; D-2 a Y-37; D-2 a L-36; D-2 a P-35; D-2 a P-34; D-2 a L-33; D-2 a L-32; D-2 a R-31 ; D-2 a A-30; D-2 a A-29; D-2 a I-28; D-2 a Q-27; D-2 a K-26; D-2 a V-25; D-2 a N-24; D-2 a I-23; D-2 a K-22; D-2 a Q-21; D-2 a C-20; D-2 a P-19; D-2 a E-18; D-2 a S-17; D-2 a T-16; D-2 a Y-15; D-2 a Y-14; D-2 a N-13; D-2 a 1-12; D-2 a D-11 ; D-2 a Y-10; D-2 a 1-9; y/o D-2 a P-8 de SEQ ID NO:22. Además, una metionina se puede añadir al N-terminal de cada una de estas construcciones C-terminal. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también son comprendidos por la invención. La presenta solicitud también está dirigida a moléculas de ácidos nucleicos que comprenden o que consisten alternativamente de una secuencia de polinucleótidos por lo menos 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de pollnucleótidos que codifica el polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) anteriormente descrito. La . n*<• presente invención también abarca las secuencias de polinucleótido anteriores fusionadas a una secuencia de polinucleótido heteróloga. Además, cualquiera de las deleciones, N-terminal o C-terminal anteriormente listadas se pueden combinar para producir un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) deletado en N-terminal y C-terminal. La invención también provee polipéptidos que tienen uno o más aminoácidos deletados tanto del amino terminal como del carboxilo terminal, que se pueden describir generalmente como que tienen residuos m-n de SEQ ID NO: 2 o del polipéptido codificado por el clon depositado, en donde n y m son enteros como se describió antes. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también son comprendidos por la invención. También se incluyen una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que consiste de una porción de la secuencia completa de aminoácidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) codificada por el cion contenido en el depósito de ATCC No. 97183, en donde esta porción excluye cualquier entero de residuos de aminoácido de 1 a aproximadamente 342 aminoácidos del amino terminal de la secuencia de aminoácidos codificada por el clon contenido en el depósito de ATCC No. 97183, o cualquier entero de residuos de aminoácido de 1 a aproximadamente 342 aminoácidos del carboxilo terminal, o cualquier combinación de las deleciones de amino terminal y carboxilo terminal, de la secuencia de aminoácido * completa codificada por el clon contenido en el depósito de ATCC No. 97183.

También se proveen polinucleótidos que codifican todas las formas de polipéptido mutantes de deleción anteriores. La presente solicitud también está dirigida a proteínas que contienen polipéptidos por lo menos 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticos a la secuencia de polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) expuesta aquí m-n. En modalidades preferidas, la solicitud está dirigida a proteínas que contienen polipéptidos por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticos a polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de las deleciones específicas N-terminal y C-terminal de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) aquí mencionadas. Los polihucleótidos que codifican estos polipéptidos también son comprendidos con la invención. Los fragmentos de polipéptido preferidos adicionales comprenden o consisten alternativamente de la secuencia de aminoácidos de residuos: M-1 a Y-15; D-2 a T-16; Y-3 a S-17; Q-4 a E-18; V-5 a P-19; S-6 a C-20; S-7 a P-21; P-8 a K-22; I-9 a I-23; Y-10 a N-24; D-11 a V-25; 1-12 a K-26; N-13 a Q-27; Y-14 a I-28; Y-15 a A-29; T-16 a A-30; S-17 a R-31; E-18 a L-32; P-19 a L-33; C-20 a P-34; P-21 a P-35; K-22 a L-36; I-23 a Y-37; N-24 a S-38; V-25 a L-39; K-26 a V-40; Q-27 a F-41 ; I-28 a I-42; A-29 a F-43; A-30 a G-44; R-31 a F-45; L-32 a V-46; L-33 a G-47; P-34 a N-48; P-35 a M-49; L-36 a L-50; Y-37 a V-51; S-38 a I-52; L-39 a L-53; V-40 a I-54; F-41 a L-55; I-42 a I-56; F-43 a N-57; G-44 a C-58; F-45 a Q-59; V-46 a R-60; G-47 a L-61 ; N-48 a E-62; M-49 a S-63; L-50 a M-64; V-51 a T-65; I-52 a D-66; L-53 a I-67; I-54 a Y-68; L-55 a L-69; 1-56 a L-70; N-57 a N-71; C-58 a L-72; Q-59 a A-73; R-60 a I-74; L-61 a S-75; E-62 a D-76; S-63 a L-77; M-64 a F-78; T-65 a F-79; D-66 a L-80; I-67 a L-81 ; Y-68 a T-82; L-69 a V-83; L-70 a P-84; N-71 a F-85; L-72 a W-86; A-73 a A-87; I-74 a H-88; S-75 a Y-89; D-76 a A-90; L-77 a A-91 ; F-78 a A-92; F-79 a Q-93; L-80 a W-94; L-81 a D-95; T-82 a F-96; V-83 a G-97; P-84 a N-98; F-85 a T-99; W-86 a M-100; A-87 a C-101 ; H-88 a Q-102; Y-89 a L-103; A-90 a L-104; A-91 a T-105; A-92 a G-106; Q-93 a L-107; W-94 a Y-108; D-95 a F- 09; F-96 a 1-110; G-97 a G-111 ; N-98 a F-112; T-99 a F-113; M-100 a S-114; C-101 a G-115; Q-102 a 1-116; L-103 a F-117; L-104 a F-118; T-105 a 1-119; G-106 a 1-120; L-107 a L-121 ; Y-108 a L-122; F-109 a T-123; 1-110 a 1-124; G-111 a D-125; F-112 a R-126; F-113 a Y-127; S-114 a L-128; G-115 a A-129; 1-116 a 1-130; F-117 a V-131 ; F-11.8 a H-132; í-119 a A-133; 1-120 a V- 134; L-121 a F-135; L-122 a A-136; T-123 a L-137; 1-124 a K-138; D-125 a A- 139; R-126 a R-140; Y-127 a T-141 ; L-128 a V-142; A-129 a T-143; 1-130 a F-144; V-131 a G-145; H-132 a V-146; A-133 a V-147; V-134 a T-148; F-135 a S-149; A-136-a V-150; L-137 a 1-151 ; K-138 a T-152; A-139 a W-153; R-140 a V-154; T-141 a V-155; V-142 a A-156; T-143 a V-157; F-144 a F-158; G-145 a A-159; V-146 a S-160; V-147 a L-161 ; T-148 a P-162; S-149 a G-163; V-150 a 1-164; 1-151 a 1-165; T-152 a F-166; W-153 a T-167; V-154 a R-168; V-155 a S-169; A-156 a Q-170; V-157 a K-171 ; F-158 a E-172; A-159 a G-173; S-160 a L-174; L-161 a H-175; P-162 a Y-176; G-163 a T-177; 1-164 a C-178; 1-165 a S-179; F-166 a S-180; T-167 a H-181; R-168 a F-182; S-169 a P-183; Q-170 a Y-184; K-171 a S-185; E-172 a Q-186; G-173 a Y-187; L-174 a Q-188; H-175 a F-189; Y-176 a W-190; T-177 a K-191 ; C-178 a N-192; S-179 a F-193; S- 180 a Q-194; H-181 a T-195; F-182 a L-196; P-183 a K-197; Y-184 a 1-198; S- 185 a V-199; Q-186 a I-200; Y-187 a L-201; Q-188 a G-202; F-189 a L-203; W-190 a V-204; K-191 a L-205; N-192 a P-206; F-193 a L-207;Q-194 a L-208; T-195 a V-209; L-196 a M-210; K-197 a V-211 ; 1-198 a 1-212; V-199 a C-213; I- 200 a Y-214; L-201 a S-215; G-202 a G-216; L-203 a 1-217; V-204 a L-218; L-205 a K-219; P-206 a T-220; L-207 a L-221 ; L-208 a L-222; V-209 a R-223; M- 210 a C-224; V-211 a R-225; 1-212 a N-226; C-213 a"~E-227; Y-214 a K-228; S- 215 a K-229; G-216 a R-230; 1-217 a H-231 ; L-218 a R-232; K-219 a A-233; T-220 a V-234; L-221 a R-235; L-222 a L-236; R-223 a I-237; C-224 a F-238; R- 225 a T-239; N-226 a I-240; E-227 a M-241; K-228 a I-242; K-229 a V-243; R- 230 a Y-244; H-231 a F-245; R-232 a L-246; A-233 a F-247; V-234 a W-248; R-235 a A-249; L-236 a P-250; I-237 a Y-251 ; F-238 a N-252; T-239 a I-253; I- 240 a V-254; M-241 a L-255; I-242 a L-256; V-43 a L-257; Y-244 a N-258; F-245 a T-259; L-246 a F-260; F-247 a Q-261; W-248 a E-262; A-249 a F-263 P-250 a F-264; Y-251 a G-265; N-252 a L-266; I-253 a N-267; V-254 a N-268 L-255 a C-269; L-256 a S-270; L-257 a S-271 ; N-258 a S-272; T-259 a N-273 F-260 a R-274; Q-261 a L-275; E-262 a D-276; F-263 a Q-277; F-264 a A-278 G-265 a M-279; L-266 a Q-280; N-267 a V-281 ; N-268 a T-282; C-269 a E-283; S-270 a T-284; S-271 a L-285; S-272 a G-286; N-273 a M-287; R-274 a T- 288; L-275 a H-289; D-276 a C-290; Q-277 a C-291 ; A-278 a 1-292; M-279 a N- 293; Q-280 a P-294; V-281 a I-295; T-282 a I-296; E-283 a Y-297; T-284 a A-298; L-285 a F-299; G-286 a V-300; M-287 a G-301 ; T-288 a E-302; H- 289.a K-303; C-290 a F-304; C-291 a R-305; I-292 a N-306; N-293 a Y-307; P-294 a L-308; I-295 a L-309; I-296 a V-310; Y-297 a F-311 ; A-298 a F-312; F-299 a Q-313; V-300 a K-314; G-301 a H-315; E-302 a 1-316; K-303 a A-317; F- 304 a K-318; R-305 a R-319; N-306 a F-320; Y-307 a C-321 ; L-308 a K-322 L-309 a C-323; V-310 a C-324; F-311 a S-325; F-312 a I-326; Q-313 a F-327 K-314 a Q-328; H-315 a Q-329; 1-316 a E-330; A-317 a A-331 ; K-318 a P-332 R-319 a E-333; F-320 a R-334; C-321 a A-335; K-322 a S-336; C-323 a S-337 C-324 a V-338; S-325 a Y-339; I-326 a T-340; F-327 a R-341 ; Q-328 a S-342 Q-329 a T-343; E-330 a G-344; A-331 a E-345; P-332 a Q-346; E-333 a E-347; R-334 a 1-348; A-335 a S-349; S-336 a V-350; S-337 a G-351 ; y/o V-338 a L-352 DE SEQ ID NO: 2. Los fragmentos de polipéptido preferidos adicionales comprenden o consisten alternativamente de la secuencia de aminoácidos de los residuos: M-1 a Y-15; D-2 a T-16; Y-3 a S-17; Q-4 a E-18; V-5 a P-19; S-6 a C-20; S-7 a Q-21 ; P-8 a K-22; I-9 a I-23; Y-10 a N-24; D-11 a V-25; 1-12 a K-26; N-13 a Q-27; Y-14 a I-28; Y-15 a A-29; T-16 a A-30; S-17 a R-31 ; E-18 a L-32; P-19 a L-33; C-20 a P-34; Q-21 a P-35; K-22 a L-36; I-23 a Y-37; N-24 a S-38; V-25 a L-39; K-26 a V-40; Q-27 a F-41 ; I-28 a I-42; A-29 a F-43; A-30 a G-44; R-31 a F-45; L-32 a V-46; L-33 a G-47; P-34 a N-48; P-35 a M-49; L-36 a L-50; Y-37 a V-51 ; S-38 a I-52; L-39 a L-53; V-40 a I-54; F-41 a L-55; I-42 a I-56; F-43 a N-57; G-44 a C-58; F-45 a K-59; V-46 a R-60; G-47 a L-61 ; N-48 a K-62; M-49 a S-63; L-50 a M-64; V-51 a T-65; I-52 a D-66; L-53 a I-67; I-54 a Y-68; L-55 a L-69; I-56 a L-70; N-57 a N-71; C-58 a L-72; K-59 a A-73; R-60 a 1-74; L-61 a S-75; K-62 a D-76; S-63 a L-77; M-64 a F-78; T-65 a F-79; D-66 a L-80; I-67 a L-81 ; Y-68 a T-82; L-69 a V-83; L-70 a P-84; N-71 a F-85; L-72 a W-86; A-73 a A-87; I-74 a H-88; S-75 a Y-89; D-76 a A-90; L-77 a A-91 ; F-78 a A-92; F-79 a Q-93; L-80 a W-94; L-81 a D-95; T-82 a F-96; V-83 a G-97; P-84 a N-98; F-85 a T-99; W-86 a M-100; A-87 a C-101 ; H-88 a Q-102; Y-89 a L-103; A-90 a L-104; A-91 a T-105; A-92 a G-106; Q-93 a L-107; W-94 a Y-108; D-95 a F-109; F-96 a 1-110; G-97 a G-111 ; N-98 a F-112; T-99 a F-113; M-100 a S-114; C-101 a G-115; Q-102 a 1-116; L-103 a F-117; L-104 a F-118; T-105 a 1-119; G-106 a 1-120; L-107 a L-121; Y-108 a L-122; F-109 a T-123; 1-110 a 1-124; G-111 a D-125; F-112 a R-126; F-113 a Y-127; S-114 a L-128; G-115 a A-129; 1-116 a V-130; F-117 a V-131 ; F-118 a H-132; 1-119 a A-133; 1-120 a V-134; L-121 a F-135; L-122 a A-136; T-123 a L-137; 1-124 a K-138; D-125 a A-139; R-126 a R-140; Y-127 a T-141; L-128 a V-142; A-129 a T-143; V-130 a F-144; V-131 a G-145; H-132 a V-146; A-133 a V-147; V-134 a T-148; F-135 a S-149 A-136 a V-150; L-137 a 1-151; K-138 a T-152; A-139 a W-153; R-140 a V-154; T-141 a V-155; V-142 a A-156; T-143 a V-157; F-144 a F-158; G-145 a A-159; V-146 a S-160; V-147 a L-161; T-148 a P-162; S-149 a G-163; V-150 a 1-164; 1-151 a 1-165; T-152 a F-166; W-153 a T-167; V-154 a R-168; V-155 a S-169; A-?56 a Q-170; V-157 a K-171; F-158 a E-172; A-159 a G-173; S-160 a L-174; L-161 a H-175; P-162 a Y-176; G-163 a T-177; 1-164 a C-178; 1-165 a S-179; F-166 a S-180; T-167 a H-181; R-168 a F-182; S-169 a P-183; Q-170 a Y-184; K-171 a S-185; E-172 a Q-186; G-173 a Y-187; L-174 a Q-188; H-175 a F-189; Y-176 a W-190; T-177 a K-191; C-178 a N-192; S-179 a F-193; S- 180 a Q-194; H-181 a T-195; F-182 a L-196; P-183 a K-197; Y-184 a 1-198; S-185 a V-199; Q-186 a I-200; Y-187 a L-201; Q-188 a G-202; F-189 a L-203 W-190 a V-204; K-191 a L-205; N-192 a P-206; F-193 a L-207; Q-194 a L-208 T-195 a V-209; L-196 a M-210; K-197 a V-211; 1-198 a I- 212; V-199 a C-213 I-200 a Y-214; L-201 a S-215; G-202 a G-216; L-203 a 1-217; V-204 a L-218 L-205 a K-219; P-206 a T-220; L-207 a L-221 ; L-208 a L-222; V-209 a R-223 M-210 a C-224; V-211 a R-225; 1-212 a N-226; C-213 a E-227; Y-214 a K-228 S-215 a K-229; G-216 a R-230; 1-217 a H-231 ; L-218 a R-232; K-219 a A-233 T-22Ó a V-234; L-221 a R-235; L-222 a L-236; R-223 a I-237; C-224 a F-238 R-225 a T-239; N-226 a 1-240; E-227 a M-241; K-228 a I-242; K-229 a V-243 R-230 a Y-244; H-231 a F-245; R-232 a L-246; A-233 a F-247; V-234 a W-248; R-235 a A-249; L-236 a P-250; I-237 a Y-251 ; F-238 a N-252; T-239 a I-253; I-240 a V-254; M-241 a L-255; I-242 a L-256; V-243 a L-257; Y-244 a N-258; F-245 a T-259; L-246 a F-260; F-247 a Q-261 ; W-248 a E-262; A-249 a F-263; P-250 a F-264; Y-251 a G-265; N-252 a L-266; I-253 a N-267; V-254 a N-268; L-255 a C-269; L-256 a S-270; L-257 a S-271; N-258 a S-272; T-259 a N-273; F-260 a R-274; Q-261 a L-275; E-262 a D-276; F-263 a Q-277; F-264 a A-278;*G-265 a M-279; L-266 a Q-280; N-267 a V-281; N-268 a T-282; C-269 a E-283; S-270 a T-284; S-271 a L-285; S-272 a G-286; N-273 a M-287; R-274 a T-288; L-275 a H-289; D-276 a C-290; Q-277 a C-291 ; A-278 a I-292 M-279 a N-293; Q-280 a P-294; V-281 a I-295; T-282 a 1-296; E-283 a Y-297 T-284 a A-298; L-285 a F-299; G-286 a V-300; M-287 a G-301; T-288 a E-302 H-289 a K-303; C-290 a F-304; C-291 a R-305; I-292 a N-306; N-293 a Y-307 P-294 a L-308; 1-295 a L-309; 1-296 a V-310; Y-297 a F-311 ; A-298 a F-312; F-299 a Q-313; V-300 a K-314; G-301 a H-315; E-302 a 1-316; K-303 a A-317; F-304 a K-318; R-305 a R-319; N-306 a F-320; Y-307 a C-321 ; L-308 a K-322 L-309 a C-323; V-310 a C-324; F-311 a S-325; F-312 a I-326; Q-313 a F-327 K-314 a Q-328; H-315 a Q-329; 1-316 a E-330; A-317 a A-331 ; K-318 a P-332 R-319 a -333; F-320 a R-334; C-321 a A-335; K-322 a S-336; C-323 a S-337 C-324 a V-338; S-325 a Y-339; I-326 a T-340; F-327 a R-341 ; Q-328 a S-342 Q-329 a T-343; E-330 a E-344; A-331 a E-345; P-332 a Q-346; E-333 a E-347 R-334 a I-348; A-335 a S-349; S-336 a V-350; S-337 a G-351 ; y/o V-338 a L-352 de la SEQ ID NO: 22. # Estos fragmentos de polipéptido pueden retener la actividad biológica de polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención y/o pueden ser útiles para generar o seleccionar para anticuerpos, como se describe más adelante. Los polinucleótidos que codifican estos fragmentos de polipéptido también son comprendidos por la invención. La presente solicitud también está dirigida a moléculas de ácido nucleico que comprenden o que consisten alternatuvamente de una secuencia de polinucleótidos por lo menos 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) anteriormente descrito. La presente invención también comprende la secuencia de polinucleótido anteriores fusionadas a una secuencia de polinucleótido heteróloga.

Además, la presente solicitud también está dirigida a proteínas que contienen polipéptidos por lo menos 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idénticas a los fragmentos de polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) anteriormente expuestos. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también son comprendidos por la invención. Preferiblemente, los fragmentos de polinucleótido de la invención codifican un poiipéptido que demuestra una actividad funcional de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Por un polipéptido que demuestra una "actividad funcional" de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se entiende un polipéptido capaz de desplegar una o más actividades funcionales conocidas asociadas con una proteína de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de longitud completa (completa). Dichas actividades funcionales incluyen pero no se limitan a actividad biológica, antigenicidad [capacidad » * para unirse (o competir con un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) para unirse) a un anticuefo antireceptor de quimiocina de proteína G (CCR5)], inmunogenicidad (capacidad para generar anticuerpo que se une a un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5)), capacidad para formar multímeros con polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y la capacidad para unirse a un receptor o ligando para un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5).

La actividad funcional de polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) y fragmentos, variantes, derivados y análogos de los mismos se pueden probar por varios métodos. Por ejemplo, en una modalidad en donde se prueba la capacidad para unirse o competir con el polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de longitud completa para unirse a un anticuerpo antireceptor de quimiocina de proteína G (CCR5), varios inmunoensayos conocidos en la técnica se pueden usar, incluyendo pero sin limitarse a sistemas de prueba competitivos y no competitivos usando técnicas tales como radioinmunoensayos, ELISA (prueba inmunoabsorbente ligada a enzima), inmunoensayos "intercalados", prueba inmunoradiométricas, reacciones de precipitación por difusión de gel, pruebas de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (usando marcadores de oro coloidal, enzima o radioisótopo, por ejemplo), western blots, reacciones de precipitación, prueba de aglutinación (por ejemplo, pruebas de aglutinación de gel, pruebas de hemaglutinación), prueba de fijación de complemento, pruebas de íhmunofluorescencia, prueba de proteína A y pruebas de inmunoelectroforesis, etc. En una modalidad, la unión a anticuefo se detecta al detectar un marcador en el anticuefo primario. En otra modalidad, el anticuerpo primario es detectado al detectar la unión de un anticuefo secundario o reactivo secundario al anticuefo primario. En una modalidad adicional, el anticuerpo secundario es marcado. Se conocen muchos medios en la técnica para detectar la unión en un inmunoensayo y están dentro dei alcance de la presente invención. En otra modalidad, en donde se identifica un ligando de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o la capacidad de un fragmento de polipéptido, variante o derivado de la invención para multimerizar está siendo evaluado, se puede probar la unión, por ejemplo, por medios bien conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, cromatografía de gel reductora y no reductora, cromatografía de afinidad de proteína y blotting de afinidad. Véase generalmente, Phizicky. E., et al., 1995, Microbiol. Rev. 59:94-123. En otra modalidad, se pueden probar correlaciones fisiológicas de unión de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) a sus sustratos (transducción de señal). . Además, las pruebas que aquí se describen (véase ejemplos) y ? de otra manera conocidas en la técnica pueden aplicarse rutinariamente para T medir la capacidad de los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) y fragmentos, variantes, derivados y análogos de los mismos para Inducir la actividad biológica relacionada con receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (ya sea in vitro o in vivo). Otros métodos serán conocidos por el experto técnica y están dentro dei alcance de la invención. Fragmentos especialmente preferidos de la invención están fragmentos caracterizados por atributos estructurales o funcionales de ' receptor de quimiocina de proteína G. Dichos fragmentos incluyen residuos de aminoácidos que comprenden hélice alfa y regiones formadoras de hélice alfa ("regiones alfa"), lámina beta y regiones formadoras de lámina beta ("regiones beta"), vuelta y regiones formadoras de giro i ("regiones de giro"), espiral y regiones formadoras de espiral ("regiones de espiral"), regiones hidrofílicas, regiones hidrofóbicas, regiones anfifáticas alfa, regiones anfifábitas beta, regiones formadoras de superficie y regiones de índice antigénico elevado (es decir, que contienen cuatro o más aminoácidos contiguos que tienen un índice antigénico de más de o igual a 1.5, como se identifica usando los parámetros por omisión del programa de Jameson-Wolf) de receptor de quimiocina de proteína G completo (es decir, longitud completa) (CCR5) (SEQ ID NO: 2) o codificado por el clon depositado. Ciertas regiones preferidas son aquellas expuestas en la figura 3 e incluyen, pero no se limitan a regiones de los tipos antes mencionados identificados por análisis de la secuencia de aminoácidos ilustrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 2) o codificada por el clon depositado, dichas regiones preferidas incluyen: regiones alfa, regiones beta, regiones de giro y regiones de espiral predichas por Garnier- Robson, regiones alfa, regiones beta, regiones de giro y regiones de espiral predichas por Chou-Fasman, regiones hidrofílicas e hidrofóbicas predichas por Kyte-Doolittle; regiones anfifáticas alfa y beta de Eisenberg; regiones formadoras de superficie de Emini y regiones de índice antigénico elevado de Jameson-Woif, como se predice usando los parámetros por omisión de estos programas de computadora. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también son comprendidos por la invención. En modalidades adicionales, los polinucleótidos de la invención codifican atributos funcionales de receptor de quimiocina de proteína G. Las modalidades preferidas de la invención a este aspecto incluyen fragmentos que comprenden hélice alfa y regiones formadoras de hélice alfa ("regiones alfa"), lámina beta y regiones formadoras de lámina beta ("regiones beta"), vuelta y regiones formadoras de giro ("regiones de giro"), espiral y regiones formadoras de espiral ("regiones de espiral"), regiones hidrofílicas, regiones hidrofóbicas, regiones anfifáticas alfa, regiones anfifáticas beta, regiones flexibles, regiones formadoras de superficie y regiones de índice antigénico elevado de receptor de quimiocina de proteína G. Los datos que representan los atributos estructurales o funcionales del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) expuestos en la figura 1 o codificados por el clon depositado y/o cuadro 1 , como se describió antes, se generaron usando los diversos módulos y algoritmos del DNA*STAR expuesto en los parámetros por omisión. En una modalidad preferida, los datos presentados en las columnas VIII, IX, XIII y XIV del cuadro 1 se pueden usar para determinar regiones de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que presentan un alto grado de potencial para antigenicidad. Las regiones de alta antigenicidad se determinan a partir de los datos presentados en las* columnas VIII, IX, XIII y/o IV escogiendo valores que representan regiones del polipéptido que es probable que estén expuestas en la superficie del polipéptido en un ambiente en el cual puede ocurrir reconocimiento de antígeno en el procedimiento de iniciación de una respuesta inmune. Ciertas regiones preferidas con respecto a esto se exponen en la figura 3, pero como se muestra en el cuadro 1 pueden estar representadas o identificadas usando representaciones tabulares de los datos presentados en la figura 3. El algoritmo de computadora DNA*STAR usado para generar la figura 3 (expuesta en los parámetros por omisión originales) se uso para presentar los datos en la figura 3 en un formato tabular (véase cuadro 1). El formato tabular de los datos en la figura 3 se puede usar para determinar fácilmente fronteras específicas de una región preferida. Las regiones preferidas antes mencionadas expuestas en la figura 3 y en el cuadro 1 incluyen pero no se limitan a regiones de los tipos antes mencionados identificados por análisis de la secuencia de aminoácidos expuesta en la figura 1 o codificada por el clon depositado. Como se expone en la figura 3 y en el cuadro 1 , dichas regiones preferidas incluyen regiones alfa, regiones beta, regiones de giro y regiones en espiral de Garnier-Robson, 1 regiones alfa, regiones beta y regiones de espiral de Chou-Fasman, regiones hidrofílicas y regiones hidrofóbicas de Kyte-Doolittle, regiones anfifáticas alfa y beta de Eisenberg, regiones flexibles de Karplus-Schulz, regiones formadoras de superficie de Emini y regiones de índice antigénico elevado de Jameson-Woíf.

CUADRO 1 .' Re* Posición I s m IV v . VI vp vm K X XI J D xpi xrv 1 CUADRO 1 (Continuación) Re* Posición [ tt 01 IV V VI vp vm Di X xi xp xpr XIV An 57 B B -137 0.43 . * -0.60 0.39 Cyt 58 A. B B -0.46 0.43 . . -0.60 0.39 Ola 59 A A B 0.13 -036 * . . 030 0S6 Arg 60 A A B 0.34 -036 . . F 0.75 0.80 Leu 61 A A B 0.92 -034 . . F 0.60 1.47 Ohi 62 A B B osn -0.43 * F 0.60 133 Ser 63 A B 0.70 •0.83 * * F 0.90 1.05 Met 64 A 3 3 0.46 -0.14 * * F 0.45 0.89 Thr 65 A 3 B -0.47 -0.07 . * F 0.45 0.80 Asp 66 A A B -0.47 0.61 * . -0.60 0.50 He 67 A A 3 -0.47 0.91 -0.60 0.41 Tyr 68 A A 3 -0.98 0.70 -0.60 0.46 Leu 69 A A 3 -0.97 0.90 •0.60 033 Leu 70 A A I 3 -1.54 1.40 . •0.60 033 An 71 A A 3 3 •1.84 140 •0.60 0.15 Leu . 72 A 3 3 -0.96 1.03 * -0.60 034 Ala 73 A A 3 -132 034 * •030 0.48 Be 74 A A 1 3 -1.41 034 -030 035 Ber 75 A A B -130 0.73 . •0.60 036 A*p 76 A A ß -Zll 0.83 -0.60 032 Leu 77 A ] 3 3 •2.11 1.01 -O.60 036 Phß 78 A 3 3 -1.83 1.01 •0.60 0.16 Phß 79 A 3 B -130 1.11 -0.60 0.14 Leu 80 A ] 3 1 3 -1.71 1.76 * -0.60 0.13 Leu 81 A ] B 1 3 -Z41 1.50 • • .60 032 Ha- 82 A 3 3 -1.89 130 * -0.60 032 Vil 83 A 3 ( 2 -1.78 1.63 * -0.40 039 Pro 84 J A. A 3 -1.11 1.44 # -0.60 035 Phe 85 . k A ] 3 -0.54 136 . -0.60 033 O 86 . A. A 3 •032 133 * •0.60 0.70 Ak 87 . A. A ] B •0.60 139 , -0.60 0.45 IB* 88 k A 3 -033 1.46 . -0.60 033 T r 89 k A B • .I2 1.17 . -0.60 031 AU 90 A. A J 3 039 0.66 * -0.60 0.87 Ata 91 A. A 038 1.07 * -0.60 0.67 Ata 92 A. A. 0.47 037 * •0.60 0.72 Ola 93 k A 0.16 0.60 • •0.60 0.62 Tip 94 k A 0.40 033 • -0.60 0.60 A» 95 T T 0.68 043 « 030 0.96 Phe 96 T T 0.67 0.41 * 030 0.80 Gly 97 T T 039 0.63 • * F 035 0.75 An 98 T T 0.59 039 * * F 0.65 034 Ib- 99 B T 0.07 0.69 * . -030 048 Met 100 B T -0.74 039 * -030 0.40 Cyt 101 B B -036 034 * -0.60 031 Oln 102 B B -036 0.93 * -0.60 031 Leu 103 B B -1.17 037 * -0.60 031 Leu 104 B B •1.10 0.94 -0.60 032 Thr 105 B B -130 1.13 * -0.60 039 Oh/ 106 B B -142 131 * -0.60 030 Leu 107 B B -1.77 131 -0.60 036 Tyr 108 B B •1.66 136 •0.60 0.18 Phe 109 B B -134 136 . -0.60 0.15 lie 110 B B -133 1.91 . -0.60 0.16 Gfy 111 B B -133 Ul . -0.60 0.14 Ptte 112 B B -1.61 139 -0.60 0.16 CUADRO 1 (Continuación) Re* Posición 1 p m IV V VI vp vm K X XI xp xm xrv Phe 113 B B -2.07 1.19 -0.60 0.16 Ser 114 . B . C -2.07 1.29 -0.40 0.14 Oiy 115 . B . C -2.07 1.64 -0.40 0.14 Be 116 . B . C -2.61 1.54 -0.40 0.11 Phe 117 B B -2.72 1.44 -0.60 0.06 Phe 118 B B -233 1.74 -0.60 0.05 Be 119 B B -2.84 ZOO -0.60 0.06 Be 120 B B -339 1.80 * -0.60 0.10 Leu 121 B B -2.50 1.70 * -0.60 0.08 Leu 122 B B -1.69 0.91 * -0.60 0.18 Thr 123 J K '. B -133 • 033 * -030 0.52 Be 124 / k B -1.16 030 * -0.30 0.98 A» 125 i k . T -0.86 030 * F 0.25 0.98 Ars 126 i k . T -0.93 O.U * 0.10 0.69 T r 127 t k . T •0.98 031 * 0.10 0.69 Leu 128 J k . T -0.70 037 * 0.10 030 Ata 129 t k B -0.40 0.77 * •0.60 031 Be 130 k B -136 1.27 * •0.60 0.14 Val 131 y k B -2.07 1.16 * -0.60 ' 0.12 Hta 132 . k B -241 136 -0.60 0.11 Ata 133 i k B -241 136 * -0.60 0.15 Val 134 . k B -1.78 136 * -0.60 0.17 Pbe 135 . k B -1.48 0.61 » •0.60 035 Ata 136 i k B -031 0.61 * -0.60 035 Leu 137 > k B -0.79 0.11 * -030 0.65 Ly* 138 . k B -1.06 -0.04 * P 0.60 1.09 Ata 139 k B -031 -0.19 * 1 P 0.45 0.80 Arg 140 k B -031 -030 * P 0.60 1.40 T tf 141 B B -037 -0.10 * F 0.45 0.61 Val 142 B B -031 0.33 * -030 0.59 Thr 143 B B -131 0.47 * -0.60 033 Phe 144 B B -033 1.11 -0.60 0.12 0|y 145 B B -134 l.H -0.60 033 Vil 146 B B -1.89 0.86 -0.60 0.21 Vd 147 B B -1.92 1.01 -0.60 0.18 Thr 148 B B -132 031 -0.60 0.13 -Ser 149 B B -131 037 * -0.60 035 Val 150 B B -2.02 134 * -0.60 035 Be 151 B B -2.02 134 * -0.60 0.18 Thr 152 B B -1.76 1.40 * -0.60 0.10 Trp 153 B B -230 1.51 * •0.60 0.14 Val 154 B B -2.70 131 * •0.60 0.14 Val 155 B B -243 1.61 . * •0.60 0.09 Ata 156 B B -1.84 1.63 * •O.60 0.08 Val 157 B B -234 1.10 -0.60 0.15 Phe 158 B B -237 1.14 -0.60 0.17 Ata 159 B B -1.76 0.93 -0.60 035 Ser 160 . B C -1.79 0.86 -0.40 034 Leu 161 . B C -2.09 0.90 •O.40 037 Pro 162 . B C -1.93 • 0.80 -0.40 0.19 Gly 163 . B T '. -134 1.09 * •030 0.12 Be 164 B B -034 1.19 -0.60 032 Be 165 B B -0.84 030 • •0.60 037 Phe 166 B B -0.03 046 •036 037 Tkr 167 B « '. T 032 043 * F 0.63 031 Aig 168 B - T 037 •036 * F Z02 Z60 17 CUADRO 1 (Continuación) Re* Posición 1 p m rv V VI vp vm Di X XI XII ?ip xrv Ser 169 T C 1.11 -0.94 * F 2.86 531 Gln 170 r r 1.19 -1.30 * F 3.40 3.57 Ly* 171 r 1.86 -1.10 * F 2.86 1.50 Olu 172 G 1.92 -0.60 * F 2.52 1.53 Oly 173 . B G 1.50 -0.23 * * F 1.68 1.38 Leu 174 B B 1.13 •0.14 0.64 1.00 K* 175 B B 033 0.43 -0.60 0.31 T r 176 B B 049 0.81 -0.60 0.42 Thr 177 B B 0.46 0.77 * -0.60 0.68 Cy* 178 B G 0.10 0.59 * -030 0.68 Ser 179 G G 0.70 0.87 * 030 038 Ser 180 G r 0.49 034 . 030 0.40 Hl* 181 G r 0.43 0.81 . 035 1.18 Phe 182 G < C 0.74 0.63 . 0.15 1.18 Pro 183 T r ' 1.17 0.64 035 132 Tyr 184 ' G r 1.47 1.01 * 035 1.75 Sor 185 T r 1.07 0.91 . 035 330 Oln 186 B B 0.81 0.91 * -0.45 136 Tyr 187 1 3 G 136 1.40 * . -0.05 131 Obi 188 ] B r 1.77 064 * -0.05 1.96 Phe 189 . 3 T 131 0.66 • * -0.05 132 Trp 190 1 B T l 1.04 * * -0.05 1.01 Ly* 191 B B 130 0.69 • * -0.45 1.01 An 192 . 3 r 0,73 0.77 • -0.05 1.68 Phß 193 B T 0.78 0.67 * * -0.05 132 Oln 194 A . 3 039 •034 * . F 0.60 132 Thr 195 . 3 Z 0.02 0.44 * * F 435 0.57 Leu 196 B B -0.91 0.69 * -0.60 0.49 Ly* 197 B 3 -1.72 039 -0.60 030 Be 198 B 1 3 -137 0.87 * -0.60 0.11 Val 199 i B B -Z18 031 * * -0.60 0.14 Be 200 B i B -Z72 031 * -0.60 0.06 Leu 201 B B -Z72 146 * -0.60 0.06 <3¡y 202 B 3 -Z9I 1.46 * -0.60 0.07 Leu 203 B W -Z90 134 -0.60 0.15 Vil 204 B i -2.86 134 -0.60 0.15 Leu 205 B 3 -Z82 134 -0.60 012 Pro 206 B 1 3 •Z61 1.46 -0.60 0.1! Leu 207 B B -3.12 139 -0.60 0.15 Leu 208 B 3 -3-30 139 . -0.60 0.13 Val 209 B B •3.01 139 •0.60 0.06 Met 210 B B -Z44 133 -0.60 0.04 Val 211 B B •2.53 1.60 . -0.60 0.07 Be 212 B B -Z07 130 -0.60 0.13 05 213 B G -Z14 1.09 •030 0.13 Tyr 214 B T •Z10 1.16 -030 0.13 Ser 215 B r -1.46 130 •030 0.15 Qty 216 B r -0.91 031 * -030 055 He 217 B B -0.83 0.43 •0.60 031 Lou 218 B B -0.98 036 * * -030 031 I*» 219 B B -0.62 066 * * F -045 026 Thr 220 B B -0.99 033 * * -030 0.73 Leu 221 B B •053 011 • * . -030 047 Leo 222 A . B 036 -037 * • . 0.60 046 Arg 223 A . B 1.17 •0.17 * * 030 032 Qf 224 A • , T 1.17 -066 * . 1.15 1.08 CUADRO 1 (Continuación) ftßt Posición I p m rv vi vp vm K xi xp xm xrv Aig 225 A T 1.52 -134 p 130 2.63 An 226 A T Z44 •2.03 F 1.30 Z68 Olu 227 A T 3.22 -Z03 F 1.30 9.80 Ly* 228 A 3.22 •2.10 F 1.10 6.81 Ly* 229 A 330 -Z10 F 1.10 839 Arg 230 A 2.33 - OO P 1.10 4.83 HU 231 A B 244 -136 0.75 1.79 Arg 232 A B 1.63 -1.36 0.75 1.76 Ata 233 A B 0.70 -0.67 0.60 074 Val 234 A B -0.04 0.01 -030 038 Atg 235 A B -0.47 030 •030 0.17 Leu 236 B B -132 0.79 •0.60 034 Be 237 B B -2?3 0.97 -0.60 0.23 Phe 238 B B -233 0.94 -0.60 011 Thr 239 B B -233 1.63 -0.60 0.10 Be 240 B B -Z69 1.59 -0.60 0.10 Met 241 B B -238 1.66 -0.60 0.19 Be 242 B B -230 1.66 -0.60 0.11 Val 243 B B -230 136 -0.60 0.13 Tyr 244 B B -Z48 1.96 -0.60 0.12 Phe 245 B B -Z18 236 -0.60 0.17 Leu 246 B B -1.79 Z07 -0.60 034 Phe 247 B -1.14 136 -030 033 Tr 248 B C OZ19 1.86 -0.40 0.42 Ata 249 T C -0.93 147 0.00 0.82 Pro 250 T C -1.09 1.47 0.00 0.67 Tyr 251 T -1.09 133 030 0.47 An 252 B T -130 1.10 -030 038 Be 253 B B -1.72 139 -0.60 030 Val 254 B B -1.13 134 -0.60 0.11 Leu 255 B B -133 1.19 -O60 0.11 Leu 256 B B -1.69 137 •0.60 032 Leu 257 B B -1.69 137 -0.60 036 An 258 B B -0.80 1.13 -060 034 Thr 259 A B -0.64 0.44 -045 1.14 Phe 260 A B -0:53 034 -0.45 130 tíln" 261 B B •0.07 0.64 •0.60 0.64 Olu 262 B B -0.07 0.67 -0.60 0.44 Pbe 263 B -0.07 037 -040 042 Phe 264 T 034 049 0.00 0.39 Oh/ 265 T 038 049 0.00 036 Leu 266 T •0.02 1.06 0.00 032 An 267 T •032 0.66 O?O 035 An 268 T 0.08 036 F 045 047 Py» 269 T T 078 021 F 0.65 0.76 Ser 270 T T 133 -0.07 F 135 0.76 Ser 271 T T 133 -047 F 135 033 Ser 272 T 133 -019 F 130 1.43 An 273 A T 133 -07ÉL F 130 1.79 Arg 274 A T 131 -0.74 F 130 231 Leu 275 A A 1.01 -0.63 F 0.90 1.74 A» 276 A ? 131 -0.40 F 0.60 1.07 Ola 277 A A 076 •0.40 030 095 Ata 278 A B 0.44 034 •030 035 Met 279 B B 033 0.04 •030 0.74 Ola 280 B B 033 0.04 •030 0.74 CUADRO 1 (Continuación) Re* ] 'osición r n m iv V VI VII vm K X XI xp xra XIV Val 281 B B . . . 0.02 0.13 * -0.15 1.05 Thr 282 A B -032 0.31 * F -0.15 0.88 GÍu 283 A B -0.33 0.13 * F -0.15 0.50 Thr 284 A B -0.04 034 * F -0.15 0.67 Leu 285 A B -0.08 I9 . -030 0.67 aiy 286 B T 0.11 0.20 0.10 032 Met 287 B T -0.24 0.77 . -030 0.19 Thr 288 j B B -1.13 0.86 -0.60 0.13 HU 289 i B B -0.82 0.86 . -0.60 0.09 Cy* 290 B B -0.22 0.83 -0.60 0.15 Cy* 291 B B -0.77 0.64 -0.60 0.16 Be 292 B B -1.06 0.84 •0.60 0.08 Ara 293 1 3 B -0.99 1.03 * * -0,60 0.11 Pro 294 B B -1.54 131 * -0.60 0.31 Be 295 k ] 3 B -138 1.14 • -0.60 0.44 Be 296 A. B B -1.77 134 * -0.60 034 ty¿ 297 k B B -1.22 149 * -0.60 0.11 Ata 298 A B B -132 1.49 •0.60 0.16 Pbe 299 k B B -0.97 0.80 -0.60 " 0.40 Val" 300 A. ] 3 B -0.78 0.11 * * -030 0.51 <3fy 301 k IA. B 032 0.14 * * P -0.15 0.44 Olu 302 k A. 0.47 -036 * * P 045 0.99 Ly* 303 k A. 0.81 -074 » * P 0.90 I4 Phe 304 k T 0.70 -0.63 * * F 130 339 Airg 305 k T 0.74 •037 * * 0.85 1.62 An 306 A T 033 0.31 * * 0.10 0.67 t r 307 A T -0.47 0.96 * * •030 057 Leu 308 k B -131 0.96 * * -0.60 035 Leu 309 A B -0.51 1.74 * * -0.60 014 Val 310 A B -0.58 1.74 -0.60 0.15 Phe 311 A B -0.61 0.99 * -0.60 036 Phß 312 A B -136 0.80 * -0.60 0.60 Oto 313 A B -1.03 0.80 • -0.60 037 Lyt 314 A B -0.18 0.66 * -0.60 0.66 HU 315 A A 0.79 -0.13 * * 0.45 1.53 I 316 A k 0.79 -0.91 * 0.75 1.73 Ata 317 A 0.82 •0.53 * 088 075 Ly* 318 A A 0.87 0.04 * 036 030 Arg 319 A T 0.16 -0.46 * 134 084 Phß 320 A T -0.48 -037 * Z12 0.45 q£ 321 T T 0.11 -030 * Z80 0.12 Lyt 322 T T -0.19 -0.11 * Z22 0.08 Cy» 323 T T -0.93 0.57 * 1.04 0.07 cy* 324 T T -1.04 037 * 0.76 011 Ser 325 A T -034 040 * 038 0.09 Be 326 A B 032 030 * •0.60 030 Phß 327 A B •0.31 033 * -030 0.97 Ola 328 ? A 0.14 0.16 . F •0.15 0.73 Gln 329 A A 081 030 * P 0.00 1.61 Glu 330 A A 132 •0.49 . * F 0.60 332 Alt 331 ? A , C 132 -1.27 . * P 1.10 3.64 Pro 332 A A 1.92 -1.17 * * F 0.90 Z13 Glu 333 A A 1.62 -1.19 * * F OSO 1.64 Arg 334 A A 0.77 -0.80 « F 0.90 Z18 Ah 335 A A .' B 032 -0.66 * * F 030 Í.05 Ser 336 . A B B SO -033 * • P 045 0.95 CUADRO 1 (Continuación) Res Posición I n m IV vi vp vm Di xi xa xra XIV Ser 337 B B , 1.12 0.16 Val -0.15 338 0.70 B B 0.82 0.16 Tyr -0.15 135 339 B B . 0.40 0.04 F Thr 030 1.35 340 B B . 0.64 0.14 F 0.60 Arg 1.46 341 B c 0.94 019 F 1.10 Ser 1.94 342 T c 134 •0.46 F Z40 Thr c Z15 343 T 2.10 -0.81 F Oh 3.00 c Z58 344 T 1.46 -130 F Olu 2.70 Z28 345 T c 1.47 -0.61 F Ote Z40 346 1.19 B B 0.50 -0.61 F 1.50 Qlu I. I I 347 B B 0.46 -0.46 F 0.75 Be 0.83 348 B B -0.04 -0.46 F 0.45 Ser 0.47 349 B B -0.09 033 -030 Val 350 033 B B -0.48 036 -030 Gly 0.17 351 B B -037 0.69 •0.60 Leu 030 352 ? B -136 0.43 •0.60 039 Entre los fragmentos altamente preferidos con respecto a esto están aquellos que comprenden regiones de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que combinan varias características estructurales, tales como varias de las características anteriormente expuestas. Otros fragmentos de polipéptido preferidos son fragmentos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) biológicamente activos. Los fragmentos biológicamente activos son aquellos que presentan actividad similar pero no necesariamente idéntica a una actividad del polipéptido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). La actividad biológica de los fragmentos puede incluir una actividad deseada mejorada o una actividad no deseada disminuida. Los polinucleótidos que codifican estos fragmentos de polipéptido también son comprendidos por la invención. Sin embargo, muchas secuencias de polinucleótido, tales como secuencias EST, están públicamente disponibles y son accesibles a través de bases de datos de secuencias. Algunas de estas secuencias están relacionadas con SEQ ID NO: 1 o con el clon depositado y pueden haber sido públicamente disponibles antes de que se realizara la presente invención.

Preferiblemente, dichos polinucleótidos relacionados son específicamente excluidos del alcance de la presente invención. Sería muy tedioso listar cada secuencia relacionada. Por consiguiente, preferiblemente excluidos de la presente invención son uno o más polinucleótidos que comprenden una secuencia de ácidos nucleótidos descrita por la fórmula general de a-b, en donde a es cualquier entero entre 1 a 1400 de SEQ ID NO: 1, b es un entero de 15 a 1414, en donde tanto a como b corresponden a las posiciones de residuos de nucleótidos mostradas en SEQ ID NO: 1 o el clon depositado, y én donde b es mayor que o igual a a+14. Í Epítopes y anticuerpos La presente invención abarca polipéptidos que comprenden o que consisten alternativamente de un epítope del polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o un epítope de la secuencia de polipéptido codificada por una secuencia de polinucleótido contenida en el depósito de ATCC No. 97183 o codificada por un polinucleótido que híbrida al complemento de la secuencia de SEQ ID NO: 1 o contenido en el depósito de ATCC No. 97183 bajo condiciones de hibridación astringentes o condiciones de hibridación de astringencia más baja como se describió anteriormente. La presente invención además comprende secuencias de polinucleótidos que codifican un epítope de una secuencia de polipéptido de la invención (tal como, por ejemplo la secuencia descrita en SEQ ID NO: 1 o la secuencia del clon depositado), secuencias de polinucleótido de la cadena complementaria de una secuencia de polinucleótido que codifica un epítope de la invención, y secuencias de polinucleótido que hibridan a la cadena complementaria bajos condiciones de hibridación astringentes o condiciones de hibridación de astringencia más baja anteriormente definidas. El término "epítopes" como se usa aquí, se refiere a porciones de un polipéptido que tiene astringencia o actividad inmunogénica en un animal, preferiblemente un mamífero, y muy preferiblemente en un ser humano. En una modalidad preferida, la presente invención abarca un polipéptido que comprende un epítope, así como el polinucleótido que codifica este polipéptido. Un "epítope inmunogénico", como se usa aquí, se define como una porción de una proteína que induce una respuesta de anticuefo en un mamífero, como se dtermina por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, por los métodos para generar anticuerpos descritos más adelante. (Véase, por ejemplo, Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 81 :3998-4002 (1983)). El término "epítope antigénico", como se usa aquí, se define como una porción de una proteína a la cual un anticuefo puede unir inmunoespecíficamente su antígeno como se determina por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, por los inmunoensayos que aquí se describen. La unión inmunoespecífica excluye unión no específica pero no necesariamente excluye reactividad cruzada con otros antígenos. Los epítopes antigénicos no necesariamente son inmun génicos. Se puede usar proteína de longitud completa o un fragmento de péptido antigénico. Las regiones que tienen un índice de antigenicidad elevado se muestran en el cuadro 1 y la figura 3. Los anticuefos preferiblemente se preparan a partir de estas regiones o de fragmentos discretos en estas regiones. Sin embargo, los anticuerpos se pueden preparar a partir de cualquier región del péptido como se describe aquí. Un fragmento preferido produce un anticuerpo que disminuye o evita por completo la unión a ligando. Se pueden desarrollar anticuerpos contra el receptor completo o porciones del receptor, por ejemplo, el dominio carboxilo terminal intracelular, el dominio amino terminal extra celular, el dominio de trasmembrana completo o segmentos de trasmembrana específicos, cualquiera de los bucles intracelular o extracelular, o cualquier porción de estas regiones. También se pueden desarrollar anticuerpos contra -? , -i sitios funcionales específicos, tales como el sitio de unión a ligando, el sitio de acoplamiento de proteína G o sitios que son glicosilados, fosforilados, miristoilados o amilatados. Los fragmentos que funcionan como epítopes pueden ser producidos por cualesquiera medios convencionales. (Véase, por ejemplo, Houghten, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:5131-5135 (1985), descrita además en la patente de E.U.A. No. 4,631 ,211). - < En la presente invención, los epítopes antigénicos preferiblemente contienen una secuencia de por lo menos 4, por lo menos 5, por lo menos 6, por lo menos 7, muy preferiblemente por lo menos 8, por lo menos 9, por lo menos 10, por lo menos 11 , por lo menos 12, por lo menos 13, por lo menos 14, por lo menos 15, por lo menos 20, por lo menos 25, por lo menos 30, por lo menos 40, por lo menos 50 y muy preferiblemente entre aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos. Los polipéptidos preferidos que comprenden epítopes inmunogénicos o antigénicos son por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ó *• ? 100 residuos de aminoácidos de longitud. Los epítopes antigénicos preferidos no exclusivos adicionales incluyen los epítopes antigénicos que aquí se describen, así como porciones de los mismos. Los epítopes antigénicos son útiles, por ejemplo, para producir anticuefos, incluyendo anticuefos monoclonales, que se unen específicamente al epítope. Los epítopes antigénicos preferidos incluyen los epítopes antigénicos que aquí se describen, así como cualquier combinación de dos, tres, cuatro, cinco o más de estos epítopes antigénicos. Los epítopes antigénicos se pueden usar como las moléculas objetivo en inmunoensayos (Véase, por ejemplo, Wilson et al., Cell 37:767-778 (1984); Sutcliffe et al., Science 219:660-666 (1983)). Estos fragmentos no deben considerarse, sin embargo, como abarcando cualesquiera fragmentos que se puedan describir antes de la invención. De manera similar, los epítopes inmunogénicos se pueden usar, por ejemplo, para inducir anticuerpos de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sutcliffe et al., supra; Wilson et al., supra; Chow et al., Proa Nati. Acad. Sci. E.U.A. 82:910-914; y Bittle et al., J. Gen.

Virol. 66:2347-2354 (1985). Los epítopes inmunogénicos preferidos incluyen los epítopes inmunogénicos que aquí se describen, así como cualquier combinación de dos, tres, cuatro; cinco o más de estos epítopes inmunogénicos. Los polipéptidos que comprenden uno o más epítopes inmunogénicos pueden presentarse para inducir una respuesta de anticuerpo junto con una proteína portadora, tal como una albúmina, a un sistema animal (tal como un conejo o ratón), o si el polipéptido es de suficiente longitud (por lo menos de aproximadamente 25 aminoácidos), el polipéptido puede presentarse sin un portador. Sin embargo, los epítopes inmunogénicos que comprenden tan pocos como 8 a 10 aminoácidos se ha mostrado que son suficientes para inducir anticuefos capaces de unirse a, cuando menos, epítopes lineales en un polipéptido desnaturalizado (por ejemplo, en Western blotting). * Los polipéptidos que contienen epítope de la presente invención se pueden usar para inducir anticuerpos de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica incluyendo pero sin limitarse a inmunización in vivo, Inmunización in vitro y métodos de despliegue de fagos. Véase, por ejemplo, Sutcliffe et al., supra; Wilson et al., supra, y Bittle et al., J. Gen. Virol., 66:2347-2354 (1985). Si se usa inmunización in vivo, los animales pueden ser inmunizados con péptido libre; sin embargo, cualquier título de anticuefo antipéptido puede ser incrementado acoplando el péptido a un portador macromoiecular, tal como hemocianina de lapa (KLH) o toxoide tetánico. Por ejemplo, los polipéptidos que contienen residuos de cisteína se pueden acoplar a un portador usando un enlazador tal como éster de maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), mientras que otros péptidos se pueden acoplar a portadores usando un agente enlazador más general tal como glutaraldehído. Los polipéptidos que tienen epítope de la invención también se pueden sintetizar como péptidos de antígenos múltiples (MAP), primero descritos por J.P. Tam en Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 85:5409 que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. MAP consiste de múltiples copias de un polipéptido específico unido a un centro de lisina no inmunogénico. Los polipéptidos de mapa generalmente contienen cuatro u ocho copias del péptido a menudo referidos como polipéptidos MAP-4 o MAP-8. A" manera de ejemplo no limitante, los MAP se pueden sintetizar sobre una matriz de núcleo de lisina unida al soporte de polietilenglicol-poliestireno (PEG-PS). Él péptido de interés es sintetizado sobre los residuos de lisina usando química de 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). Por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA) ofrece resinas de MAP tales como, por ejemplo, Fmoc Resin 4 Branch y Fmoc Resin 8 Branch que se pueden usar para sintetizar MAP. La digestión de MAP a partir de la resina se realiza con mezclas estándares basadas en ácido trifluoroacético (TFA) conocidas en la técnica. La purificación de MAP excepto por desalación, no es necesaria. Se pueden usar péptidos de MAP como una vacuna inmunizante que induce anticuefos que reconocen tanto MAP como la porción nativa de la cual se deriva el péptido.

Los polipéptidos que contienen epítope de la invención también se pueden incoforar en una proteína de revestimiento de un virus que entonces se puede usar como un inmunógeno o una vacuna con la cual se inmunizan animales, incluyendo seres humanos, a fin de estimular la producción de anticuerpos antiepítope. Por ejemplo, el bucle V3 de la glicoproteína gp120 del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1 ) se ha manipulado genéticamente para ser expresado en la superficie de rinovirus. La inmunización con este rinovirus que despliega péptidos de bucle de V3 produjo imitaciones aparentemente efectivas de los inmunógenos de VIH-1 (como se midió por su capacidad para ser neutralizados por anticuerpos anti-VIH-1 así como su capacidad para inducir la producción de anticuerpos capaces de neutralizar VIH-1 en cultivo de células). Estas técnicas de usar partículas virales genéticamente manipuladas como un inmunógeno se describen con más detalle en Smith et al., Behring Inst Mitt Feb; (98):229-39 (1997), Smith et al, J Virol 72:651-9 (1998), y Zhang et al., Biol. Chem 380:365-74 (1999), que se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Los poiipéptidos que contienen epítope de la invención se pueden modificar, por ejemplo, mediante la adición de aminoácidos en el amino terminal y/o carboxilo terminal del péptido. Dichas modificaciones se pueden realizar, por ejemplo, para alterar la conformación del polipéptido que contiene epítope de tal manera que el epítope tendrá una conformación más estrechamente relacionada con la estructura del epítope en la proteína nativa. Un ejemplo de un polipéptido que contiene epítope modificado de la invención es un polipéptido en el cual uno o más residuos de cisteína se han añadido al polipéptido para permitir la formación de un puente de disulfuro entre dos cisteínas, dando por resultado una estructura de bucle estable del polipéptido que contiene epítope bajo condiciones no reductoras. Los puentes de disulfuro se pueden formar entre un residuo de cisteína añadido al polipéptido y un residuo de cisteína del epítope que ocurre naturalmente, o se pueden formar entre dos cisteínas que se han añadido al polipéptido que contiene epítope que ocurre naturalmente. Además, es posible modificar uno o más residuos de aminoácidos del polipéptido que contiene epítope que ocurre naturalmente sustituyéndolos con cisteínas para promover la formación de estructuras de bucle unidas por disulfuro. Las moléculas de tioéter cíclicas de péptidos sintéticos se pueden generar rutinariamente usando técnicas conocidas y que se describen en la publicación del PCT WO 97/46251 , incorporada aquí por referencia en su totalidad. Otras modificaciones de polipéptidos que contienen epítope contempladas por esta invención incluyen biotinilación. Los animales tales como conejos, ratas y ratones son inmunizados ya sea con péptidos libres o péptidos acoplados a portador o péptidos de MAP, por ejemplo, por inyección intraperitoneal y/o intradérmica de emulsiones que contienen aproximadamentel 00 µg de péptido o proteína portador y adyuvante de Freund o cualquier otro adyuvante que se sabe que estimula una respuesta inmune. Pueden ser necesarias varias inyecciones incrementadoras, por ejemplo, a intervalos de ^ aproximadamente dos semanas, para proveer un título útil de anticuefo antipéptido que puede ser detectado, por ejemplo, por prueba de ELISA usando el péptido libre adsorbido a una superficie sólida. El título de anticuerpos antipéptido en el suero de un animal inmunizado se puede incrementar mediante la selección de anticuerpos antipéptido, por ejemplo, por adsorción al péptido sobre un soporte sólido y elución de los anticuerpos seleccionados de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Como lo apreciará un experto en la técnica, y como se describió anteriormente^ los polipéptidos de la presente invención que comprenden un epítope inmunogénico o antigénico se pueden fusionar a otras secuencias de polipéptidos. Por ejemplo, los polipéptidos de la presente invención se pueden fusionar con el dominio constante de inmunoglobulinas (IgA, IgE, IgG, IgM) o porciones de las mismas (CH1 , CH2, CH3 o cualquier combinación de las mismas y porciones de las mismas) o albúmina (incluyendo pero sin limitarse a albúmina humana recombinante o fragmentos o variantes de la misma (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,876,969, expedida el 2 de marzo de 1999, patente europea 0 413 622 y patente de E.U.A. No. 5,766,833, expedida el 16 de junio de 1998, incorporada aquí por referencia en su totalidad)), dando por resultado polipéptidos quiméricos. Dichas proteínas de fusión pueden facilitar la purificación y pueden incrementar la vida media in vivo. Esto se ha mostrado para proteínas quiméricas que consisten de los primeros dos dominios del polipéptido CD4 humano y varios dominios de las regiones constantes de las cadenas pesadas o ligeras de inmnoglobulinas de mamíferos. Véase, por ejemplo, EP 394,827; Traunecker et al., Nature, 331:84-86 (1988). El suministro incrementado de un antígeno a través de la barrera epitelial al sistema inmune se ha demostrado para antígenos (por ejemplo, insulina) conjugada a un elemento asociado de unión FaRn tal como fragmentos IgG o Fc (véase, por ejemplo, publicaciones del PCT WO 96/22024 y WO 99/04813). Las proteínas de fusión de IgG que tienen una estructura dimérica enlazada por disulfuro debido a los puentes de disulfuro de la porción de IgG también se ha encontrado que son más eficientes para unirse y neutralizar otras moléculas que los polipéptidos monoméricos o fragmentos de los mismos solos. Véase, por ejemplo, Fountoulakis et al., J. Biochem, 270:3958-3964 (1995). Los ácidos nuclejcos que codifican los epítopes anteriores también pueden recombinarse con un gen de interés como una etiqueta de epítope (por ejemplo, la etiqueta o etiqueta de bandera de hemaglutinina ("HA") para ayudar a la detección y purificación del polipéptido expresado. Por ejemplo, un sistema descrito por Janknecht et al. permite la purificación fácil de proteínas de fusión no desnaturalizadas expresadas en líneas de células humanas (Janknecht et al., 1991 ; Proc. Nati. * . * J Acad. Sci. USA 88:8972-897). En este sistema, el gen de interés es subclonado en un plásmido de recombinación de vaccinia tal que el marco de lectura abierto del gen es fusionado por traducción^ a una etiqueta amino terminal que consiste de seis residuos de histidina. La etiqueta sirve como un dominio de unión a matriz para la proteína de fusión. Extractos de células infectadas con el virus de vaccinia recombinante se cargan en una columna de Ni2+ ácido nitriloacético-agarosa y proteínas etiquetadas con histidina 0 pueden ser selectivamente eluidas con reguladores de pH que contienen imidazol. Las proteínas de fusión adicionales de la invención se pueden generar mediante las técnicas de mezcla de genes, mezcla de motivos, mezcla de exones y/o mezcla de codones (colectivamente referidos como "mezcla de ADN"). La mezcla de ADN se puede emplear para modular las actividades de polipéptidos de la invención, dichos métodos se pueden usar para generar polipéptidos con actividad alterada, así como agonistas y antagonistas de los polipéptidos. Véase, en general, patentes de E.U.A. Nos. 5,605,793; 5,811 ,238; 5,830,721 ; 5,834,252; y 5,837,458 y Patten et al., Curr. Opinión Biotechnol. 8:724-33 (1997); Harayama, Trends Biotecnol. 16 (2):76-82 (1998); Hansson, et al., J. Mol. Biol. 287:267-76 (1999); y Lorenzo y Blasco, Biotechniques 24(2):308-13 (1998) (cada una de estas patentes y publicaciones se incorporan aquí por referencia en su totalidad). En una modalidad, la alteración de poligonucleótidos correspondientes a SEQ ID NO:1 y los polipéptidos codificados por estos poligonucleótidos se pueden lograr mediante mezcla de ADN. La mezcla de ADN implica el ensamble de dos o más segmentos de ADN por recombinación homologa o especifica de sitio para generar variación en la secuencia de poligonucleótido. En otra modalidad, los poligonucieótidos de la invención o los polipéptidos codificados pueden ser alterados al ser sometidos a mutagénesis aleatoria por PCR propensa a error, inserción de nucleótido aleatorio u otros métodos antes de la recombinación. Én otra modalidad, uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc., de un poligonucleótido que codifica un polipéptido de la invención se puede recombinar con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas.

Anticuefos Polipéptidos adicionales de la invención se refieren a anticuerpos y receptores de antígeno e células T (TCR) que se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido, fragmento de polipéptido o variante de SEQ ID NO:2 o el polipéptido codificado por el clon depositado y/o un epítope, de la presente invención (como se determina por inmunoensayos bien conocidos en la técnica para probar unión específica anticuerpo-antígeno). Se sabe que la unidad estructural básica de anticuerpo comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, cada para teniendo una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (de aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables de reconocimiento de antígeno. La porción carboxilo terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como cadenas mu, delta, gamma, alfa o epsilon y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Véase generalmente, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (incorporada por referencia en su totalidad para todos los propósitos). Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de unión a anticuerpo. De esta manera, un anticuerpo de IgG intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son los mismos. Las cadenas presentan todas la misma estructura general de regiones de marco relativamente conservadas (FR) unidas por tres regiones hipervariables también denominadas regiones de determinación de complementariedad o CDR. Las CDR de las cadenas pesadas y las cadenas ligeras de cada par están alineadas por las regiones de marco, permitiendo la unión a un epítope específico. De N-terminal a C-terminal, tanto la cadena ligera como la pesada comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 y FR4. la asignación de aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991 )), o Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989). Un anticuerpo bioespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadena pesada ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante una variedad de métodos incluyendo fusión de hibridomas o enlace de fragmentos Fab'. Véase Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990), Kostelny et al. J Immunol. 148:1547 1553 (1992). Además, r los anticuerpos biespecíficos se pueden formar como "diabodies" (Holliger et 5 al. "Diabodies":small bivalent and bispecific antibody fragments" PNAS USA 90:6444-6448 (1993)) o "Janusins" (Traunecker et al. "Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV ¡nfected cells" EMBO J 10:3655-3659 (1991) Traunecker et alX'Janusin: new molecular design for bispecific reagents" Int J. Cáncer Suppl 7:51 -52 (1992)). * * 0 Los anticuefos de la invención incluyen pero no se limitan a anticuefos policlonales, monoclonales, multiespecíficos, humanos, i humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena individual, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una genoteca de expresión Fab, anticuefos antiidiotípicos (anti-ld) (Incluyendo por ejemplo anticuefos 5 anti-ld a anticuerpos de la invención), anticuerpos hechos intracelularmente (es decir, intracuerpos), y fragmentos de unión a epítope de cualquiera de los anteriores. El término "anticuefo" como se usa aquí, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas o fragmentos de Í moléculas de inmunoglobulina, es decir moléculas que contienen un sitio de 0 unión a antígeno que se une inmunoespecíficamente a un antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina de la invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo lgG1 , lgG2), lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. En una modalidad preferida, la inmunoglobulina es un isotipo lgG1. En otra modalidad preferida, la inmunoglobulina es un isotipo lgG2. En otra modalidad preferida, la inmunoglobulina es un isotipo lgG4. Las inmunoglobulinas pueden tener tanto una cadena pesada como una ligera. Una disposición de cadenas pesadas de IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY puede ser pareada con una cadena ligera de las formas kappa y lambda. < , Muy preferiblemente, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno humano de la presente invención e ¡ncluyen, pero no se limitan a Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, cadena individual Fvs (scFv), anticuefos de cadena individual, Fvs enlazada a disulfuro (sdFv) y fragmentos que comprendan ya sea un dominio VL o VH. Fragmentos de anticuefo de unión a antígeno incluyendo anticuerpos de cadena individual, pueden comprender las regiones variables solas o en combinación con la totalidad o una porción de lo siguiente: región de bisagra, dominios CH1 , CH2 y CH3. En la invención también se incluyen fragmentos de unión a antígeno * que comprenden cualquier combinación de regiones variables con una región de bisagra, dominios CH1 , CH2 y CH3. los anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier origen animal incluyendo aves y mamíferos. Preferiblemente, los anticuerpos son humanos, murinos (por ejemplo, ratón y rata) burro, conejo, cabra, coballo, camello, caballo o gallina. Como se usa aquí, anticuefos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una ¡nmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados > de genotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describió anteriormente y, por ejemplo en la patente de E.U.A. No. 5,939,598 de Kucherlapati et al. Los anticuefos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos o de mayor multiespecificidad. Los anticuefos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopes de un polipéptido de la presente invención o pueden ser específicos tanto para un polipéptido de la presente invención como para un epítope heteróíogo, tal como un polipéptido heterólogo o un material de soporte sólido. Véase por ejemplo publicaciones del PCT WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al., J. Immunol. 147:60-69 (1991); U.S. Patent Nos. 4,474,893; 4,714,681 ; 4,925,648; 5,573;920; 5,601 ,819; Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). ' Los anticuefos de la presente Invención se pueden describir o especificar en términos del epítope(s) o porción(es) de un polipéptido de la presente invención que reconocen o se unen específicamente. El epítope(s) o porción(es) de polipéptido se pueden especificar como se describe aquí, por ejemplo, por posiciones N-terminal y C-terminal, por tamaño en residuos de aminoácido contiguos, o se pueden listar en los cuadros y figuras. Los epítopes preferidos de la invención incluyen: Thr16-Val25, Gln59-Thr65, Thr167-Leu174, Ser179-Ser185, Leu222-Ala233, Ásn268-Gln277, His315-Ser325, Glu330- Ser336, Tyr339-lle348 de SEQ ID NO:2 o del polipéptido codificado por el clon depositado, así como polinucléotidos que codifican estos epítopes. Epítopes aún más preferidos de la invención ¡ncluyen péptidos correspondientes a los bucles extracelulares del receptor de quimucina de proteína G (CCR5) de la Invención o fragmentos y variantes del mismo, por ejemplo, aminoácidos 89-102, 167-195 y/o 261-274* de SEQ ID NO:2 o del polipéptido codificado por el clon depositado. Los anticuerpos que se unen específicamente a cualquier epítope o polipéptido de la presente invención también se pueden excluir. Por lo tanto, la presente invención incluye anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos de la presente invención y permite ía exclusión de los mismos. Los anticuefos de la presente invención también se pueden describir o especificar en términos de su reactividad cruzada. Los anticuefos que no se unen a ningún otro análogo, ortólogo u homólogo de un polipéptido de la presente invención son incluidos. Los anticuefos que se unen a polipéptidos con por lo menos 95%, por lo menos 90%, por lo menos 85%, por lo menos 80%, por lo menos 75%, por lo menos 70%, por lo menos 65%, por lo menos 60%, por lo menos 55% y por lo 50% de identidad (como se calcula usando métodos conocidos en la técnica y se describe aquí) a un polipéptido de la presente invención también se incluyen en la presente invención. En modalidades específicas, los anticuefos de la presente invención reaccionan en forma cruzada con homólogos murinos, de mono, rata y/o conejo de proteínas humanas y los epítopes correspondientes de los mismos. Los anticuerpos que no se unen a polipéptidos con menos de 95%, menos de 90%, menos de 85%, menos de 80%, menos de 75%, menos de 70%, menos de 65%, menos de 60%, menos de 55% y menos de 50% de identidad (como se calcula usando métodos bien conocidos en la técnica y descrito aquí) a un polipéptido de la presente invención también se ¡ncluyen en la presente invención. En una modalidad específica, la reactividad cruzada anteriormente descrita es con respecto a algún polipéptido antigénico o ¡nmunogénico - específico individual, o combinación (es) de 2, 3, 4, 5 ó más de los polipéptidos antigénicos y/o ¡nmunogénicos específicos que aquí se describen. Además se incluyen en la presente invención anticuefos que se unen a polipéptidos codificados por polinucleótidos que hibridan a un golinucleótido de la presente invención bajo condiciones de hibridación astringente (como se describe aquí). Los anticuefos de la invención (incluyendo moléculas que comprenden o que consisten alternativamente de fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) se pueden unir inmunoespecíficamente a un polipéptido o fragmento o variante de polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) humana (SEQ ID NO:2 o del polipéptido codificado por el clon depositado) y/o receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de mono. Preferiblemente, los anticuefos de la invención se unen inmunoespecíficamente a receptor de quimiocina de proteína G humana. Preferiblemente, los anticuefos de la invención se unen inmunoespecíficamente al receptor de quimiocina de proteína G humano y de mono. También preferiblemente, los anticuerpos de la invención se unen inmunoespecíficamente a receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) humano y receptor de quimiocina de proteína G murino. Muy preferiblemente, los anticuerpos de la invención se unen inmunoespecíficamente y con mayor * afinidad a receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) humano que al receptor de qulmiocina de proteína G murino. En modalidades preferidas, los anticuefos de la presente invención (incluyendo moléculas que comprenden o que consisten alternativamente de fragmentos o variantes de anticuerpos de los mismos), se unen inmunoespecíficamente a receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) y no reaccionan en forma cruzada con otros antígenos. En modalidades preferidas, los anticuerpos de la invención se unen inmunoespecíficamente al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) y no reaccionan en forma cruzada con otros receptores de quimiocina tales como, por ejemplo US28, CCR1,* CCR2, CDR3, CCR4, CCR6, CCR7, CDR8, CCR9, CXCR1 , CXCR2, CXCR3, CXCR4 y/o CXCR5. En otras modalidades preferidas, los anticuerpos de la invención se unen inmunoespecíficamente a receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) y reaccionan en forma cruzada con otros receptores de quimiocina * tales como, por ejemplo, US28, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR6, CCR7, CCR8, CCRTj CXCR1 , CXCR2, CXCR3, CXCR4 y/o CXCR5. En modalidades más preferidas, los anticuerpos de la jnvención se unen ínmunoespecíficamente a receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) y reaccionan en forma cruzada con CCR3 y/o CXCR4.

En una modalidad preferida, los anticuefos de la invención se unen preferiblemente a receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (SEQ ID NO:2 o del polipéptido codificado por el clon depositado), o fragmentos y variantes del mismo en relación con su capacidad para unirse a otros antígenos (tales como, por ejemplo, otros receptores de quimiocina). A manera de ejemplo no limitante, un anticuerpo se puede considerar para unirse a un primer antígeno preferiblemente si se une a dicho primer antígeno con una constante de disociación (KD) que es menor que la KD del anticuerpo para el segundo antígeno. En otro anticuerpo no limitante, un anticuefo se puede considerar para unirse a un primer antígeno preferencíalmente si se une a dicho primer antígeno con una afinidad que es por lo menos de un orden de magnitud menor que la KD del anticuerpo para el segundo antígeno. En otra modalidad no limitante, un anticuefo se puede considerar para unirse a un primer antígeno preferencialmente si se une a "" * „ 5 - ~* * dicho primer antígeno con una afinidad que es de por lo menos dos órdenes X-de magnitud menor que la KD del anticuefo para el segundo antígeno. ' En otra modalidad no limitante, se puede considerar otro anticuerpo para unirse a un primer antígeno preferencialmente si se une a dicho primer antígeno con una velocidad desactivada (k es) que es menor que la k es del anticuefo para el segundo antígeno. En otra modalidad no t" limitante, un anticuefo se puede considerar para unirse a un primer antígeno preferencialmente si se une a dicho primer antígeno con una afinidad que es ¡ — por lo menos de un orden de magnitud menor que la k es del anticuefo para el segundo antígeno. En otra modalidad no limitante, un anticuerpo se puede consider rar para unirse a un primer antígeno preferencialmente si se une a dicho primer antígeno con una afinidad que es por lo menos de dos órdenes de magnitud menor que ia kdes del anticuerpo para el segundo antígeno. Los anticuefos de la presente invención también se pueden describir o especificar en términos de su afinidad de unión a un polipéptido de la invención. Las afinidades de unión preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación de Kd menor que 5 X 10"2 M, 10"2 M, 5 X 10"3 M, 10"3 M, 10"4 M. Las afinidades de unión más preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd menores que 5 X 10"5 M, 10"5 M, 5 X 10-6 M, 10"6 M, 5 X 10"7 M, 107 M, 5 X 10"8 M ó 10"8 M. Las afinidades de unión aún más preferidas ¡ncluyen aquellas con una constante de disociación o Kd menores que 5 X 10"9 M, 10"9 M, 5 X 10"10 M, 10"10 M, 5 X 10" 11 M, 10'11 M, 5 X 10"12 M, 1(M2 M, 5 X 10"13 M, 10"13 M, 5 X 10"14 M, 10"14 M, 5 X 10"15 M, Ó 10"15 M. En modalidades específicas, los anticuerpos de la invención se unen a polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o fragmentos o variantes de los mismos con una velocidad desactivada (kdes) menor que o igual a 5 x 10"2 seg"1, 10"2 seg"1, 5 x 10"3 seg"1 ó 10"3 seg"1. muy preferiblemente, los anticuefos de la invención se unen a polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o fragmentos o variantes de los - mismos con una velocidad desactivada (kdes) menor que o igual a 5 X 10"4 seg" \ 10"4 seg"1, 5 X 10"5 seg"1 ó 10"5 seg"1 5 X 10"6 seg"1, 10"6 seg"1, 5 X 10"7 seg"1 ó 10"7 seg"1. ;. En otras modalidades, los anticuefos de la invención se unen a polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o fragmentos o variantes de los mismos con una velocidad activada (kact) mayor que o igual a 103 M"1 seg"1, 5 X 103 M"1 seg"1, 104 M"1 seg"1 ó 5 X 104 M"1 seg"1. Muy preferiblemente, los anticuefos de la invención se unen a polipéptidos de * * i receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o fragmentos o variantes de los mismos con una velocidad activada (kact) mayor que o ¡gual a 105 M"1 seg'1, 5 X 105 M"1 seg"1 , 106 M""1 seg"1 ó 5 X 106 M"1 seg"1 ó 107 M"1 seg"1. La invepción también provee anticuerpos que inhiben competitivamente la unión de un anticuerpo a un epítope de la invención como se determina por cualquier método conocido en la técnica para determinar unión competitiva, por ejemplo, los inmunoensayos que aquí se describen. En modalidades preferidas, el anticuefo inhibe competitivamente la unión al epítope en por lo menos 95%, por lo menos 90%, por lo menos 85%, por lo menos 80%, por lo menos 75%, por lo menos 70%, por lo menos 60% o por lo menos 50%. Los anticuefos de la presente invención pueden actuar como agonistas o antagonistas de los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos que alteran las interacciones de receptor/ligando con los polipéptidos de la invención ya sea parcialmente o completamente. Preferiblemente, los anticuerpos de la presente invención se unen á un epítope antigénico que aquí se describe o a una porción del mismo. La invención tiene anticuerpos específicos de receptor y anticuerpos específicos de ligando. La invención también tiene anticuefos específicos de receptor que no evitan la unión a ligando pero evitan la activación del receptor. La activación dei receptor (es decir, señalización) se puede determinar mediante técnicas que aquí se describen o conocidas de otra manera en la técnica. Por ejemplo, la activación del receptor se puede determinar al detectar la fosforilación (por ejemplo, tirosina o serina/treolina) del receptor o su sustrato por inmunoprecipitación seguida por análisis de Western blot (por ejemplo, como se describió anteriormente). En modalidades específicas, se proveen anticuefos que inhiben la actividad del ligando o la actividad del receptor en por lo menos 95%, por lo menos 90%, por lo menos 85%, por lo menos 80%, por lo menos 75%, por lo menos 70%, por lo menos 60% o por lo menos 50% de la actividad en ausencia del anticuefo. La invención también tiene anticuefo específicos de receptor que evitan la unión a ligando y la activación del receptor así como anticuerpos que reconocen el complejo receptor-ligando y preferiblemente no reconocen específicamente al receptor no ligado o ai ligando no ligado. Asimismo, en la invención se ¡ncluyen anticuerpos neutralizantes que se unen al ligando y evitan ia unión del ligando al receptor, así como anticuefos que se unen al ligando, evitando así la activación del receptor, pero no evitan que el ligando se una al receptor. En la invención también se incluyen anticuerpos que activan al receptor. Estos anticuerpos pueden actuar como agonistas de receptor, es decir, que potencian o activan ya sea todas o un subconjunto de las actividades biológicas de la activación de receptor mediada por ligando, por ejemplo, induciendo dimerización del receptor. Los anticuerpos pueden ser específicos como agonistas, antagonistas o agonistas inversos para actividades biológicas que comprenden ias actividades biológicas específicas de los péptidos de la invención que aquí se describen. Los agonistas de anticuerpo anteriores se pueden hacer usando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, publicación del PCT WO 96/40281 ; patente de E.U.A. No. 5,811 ,097; Deng et al., Blood 92(6):1981 -1988 (1998); Chen et al., Cáncer Res. 58(16):3668-3678 (1998); Harrop et al., J. Immunol. 161 (4): 1786-1794 (1998); Zhu et al., Cáncer Res. 58(15):3209-3214 (1998); Yoon et al., J. Immunol. 160(7):3170-3179 (1998); Prat et al., J. Cell. Sci. 111 (Pt2):237-247 (1998); Pitard et al., J. Immunol. Methods 205(2): 177-190 (1997); Liautard et al., Cytokine 9(94):233-241 (1997); Carlson et al., J. Biol. Chem. 272(17):11295-11301 (1997); Taryman et al., Neuron 14(4):755-762 (1995); Mullen et al., Structure 6(9):1153-1167 (1998); Bartunek et al., Cytokine 8(1 ):14-20 (1996) (las cuales se incorporan todas aquí por referencia en su totalidad). En una modalidad de la presente invención, los anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o un fragmento o variante del mismo, comprenden un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las cadenas pesadas expresadas por el anticuefo anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que expresa la línea de células de la invención y/o cualquiera de las cadenas ligeras expresadas por un anticuerpo anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que expresa la línea de células de la invención. En otra modalidad de la presente invención, ios anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o un fragmento o variante del mismo, comprenden un poiipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los dominios de VH de una cadena pesada expresada por un anticuerpo anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que expresa la línea de células de la invención y/o cualquiera de los dominios de VL de una cadena ligera expresada por un anticuefo anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que expresa la línea de células de la invención. En modalidades preferidas, los anticuerpos de la presente invención comprenden la secuencia de aminoácidos de un dominio VH y dominio VL expresado por un anticuerpo anti-receptor de quimiocina dé proteína G (CCR5) individual que expresa la línea de células de la invención. En modalidades alternativas, los anticuerpos de la presente invención comprenden la secuencia de aminoácidos de un dominio VH y un dominio VL expresado por dos diferentes anticuerpos anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que expresan líneas de células de la invención. Las moléculas que comprenden o que consisten alternativamente de fragmentos o variantes de anticuerpo de los dominios VH y/o VL expresados por un anticuefo anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que expresa la línea de células de la invención que se unen inmunoespecíficamente a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también son comprendidas por la invención, como lo son las moléculas de ácido nucleico que codifican estos dominios, VH y VL, moléculas, fragmentos y/o variantes. La presente invención también provee anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido, o fragmento o variante de pdiipéptido de un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), en donde dichos anticuerpos comprenden o consisten alternativamente de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de cualesquiera uno, dos, tres o más de los CDR de VH contenidos en una cadena pesada i expresada por uno o más anticuerpos anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que expresa líneas de células de la invención. En particular, la invención provee anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), que comprende o que consiste altemativamente de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un CDR1 de VH contenido en una cadena pesada expresada por uno o más antícuefos anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que expresa las líneas de células de la invención. En otra modalidad, los anticuerpos que se unen, inmunoespecíficamente a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprenden o consisten alternativamente de un polipéptido que tiene »1 ( í la secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH contenido en una cadena pesada expresada por uno o más anticuefos anti-receptor de quimiocina de } proteína G (CCR5) que expresa las líneas de células de la invención. En una modalidad preferida, los anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprenden o consisten alternativamente de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un CDR3 contenido en una cadena pesada expresada por uno o más anticuerpos anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que expresa las líneas de células de la invención. Las moléculas que comprenden o que consisten alternativamente de estos anticuerpos o fragmentos o variantes de - anticuefo de los mismos que se unen específicamente a receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o un fragmento o variante de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) del mismo también son comprendidos por la invención, como lo son las moléculas de ácido nucleico que codifican estos anticuefos, moléculas, fragmentos y/o variantes. La presente invención también provee anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido, o fragmento o variante de polipéptido de un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), en donde dicho anticuefo comprende o consiste alternativamente de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de cualesquiera uno, dos, tres o más de los CDR de VL contenidos en la cadena pesada expresada por uno o más ariticuefos de receptor anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que «. expresa las líneas de células de la invención. En particular, ia invención provee anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a receptor de quimiociná de proteína G (CCR5), que comprenden o que consisten alternativamente de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un CDR1 de VL contenido en una cadena pesada expresada por uno o más anticuerpos anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que expresan las líneas de células de la invención. En otra modalidad, los anticuerpos que se unen específicamente al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprenden o que consisten alternativamente de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un CDR2 de VL contenido en una cadena pesada expresada por uno o más anticuerpos anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que expresa las líneas de células de la invención. En una modalidad preferida, los anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) comprenden o consisten alternativamente de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un CDR3 de VL contenido en una cadena pesada expresada por uno o más anticuefos anti-receptor de quimiocína de proteína G (CCR5) que expresa las líneas de células de la invención. Las moléculas que comprenden o que consisten alternativamente de estos anticuerpos o fragmentos o variantes de anticuefos de las mismas que se unen específicamente a receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o un fragmento o variante de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de los mismos también son comprendidos por la invención, como lo son las moléculas de ácido nucleico que codifican estos anticuefos, moléculas, fragmentos y/o variantes. La presente invención también provee anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden o que consisten alternativamente de fragmentos o variantes de anticuefos) que se unen específicamente a polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o fragmento o variante de polipéptido de un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) en donde dichos anticuerpos comprenden o consisten alternativamente de uno, dos, tres o más CDR de VH y uno, dos, tres o más CDR de VH como contenidos en una cadena pesada o cadena ligera expresada por uno o más anticuerpos anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que expresa las líneas de células de la invención. En particular, la invención provee anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido o fragmento o variante de poiipéptido de un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), en donde dichos anticuefos comprenden o consisten alternativamente de un CDR1 de VH y un CDR1 de VL, un CDR1 de VH y un CDR2 de VL, un CDR1 de VH y un CDR3 de VL, un CDR2 de VH y un CDR1 de VL, un CDR2 de VH y CDR2 de VL, un CDR2 de VH y un CDR3 de VL, un CDR3 de VH y un CDR1 de VH, un CDR3 de VH y un CDR2 de VL, un CDR3 de VH y un CDR3 de VL, o cualquier combinación de los mismos, de CDR de VH y CDR de VL contenidos en una cadena pesada o una cadena ligera expresada por uno o más anticuerpos anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que expresa línea de células de la invención. En una modalidad preferida, una o más de estas combinaciones son de un anticuerpo anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) individual que expresa las líneas de células de la invención. Las moléculas que comprenden o que consisten alternativamente de fragmentos o variantes de estas modalidades, que se unen inmunoespecíficamente al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también son comprendidos por la invención, como lo son las moléculas de ácidos nucleicos que codifican estos anticuerpos, moléculas, fragmentos y variantes. La presente invención también provee moléculas de ácido nucleico, generalmente aisladas, que codifican un anticuerpo de la invención (incluyendo moléculas que comprenden o que consisten alternativamente de ? fragmentos o variantes de anticuefo de los mismos). En una modalidad específica, una molécula de ácido nucleico de la invención codifica un anticuerpo (incluyendo moléculas que comprenden o que consisten alternativamente de fragmentos o variantes de anticuerpo del mismo), que comprenden o que consisten alternativamente de un dominio de VH que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de los dominios de VH de una cadena pesada expresada por un anticuefo anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que expresa la línea de células de la invención y un dominio de VL que tiene una secuencia de aminoácidos de una cadena ligera expresada por un anticuerpo anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que expresa la línea de células de la Invención. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico de la invención codifica un anticuerpo (incluyendo moléculas que comprenden o que consisten esencialmente de fragmentos o variantes de anticuefo de las mismas) que comprende o que consiste alternativamente de un dominio de VH que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de los dominios de VH de una cadena pesada expresada por un anticuefo anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que expresa la línea de células de la invención o un dominio de VL •que tiene una secuencia de aminoácidos de una cadena ligera expresada por un anticuefo anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que expresa la línea de células de la invención. . La presente invención también provee anticuerpos que comprenden o que consisten alternativamente de variantes (incluyendo derivados) de [as moléculas de anticuerpo (por ejemplo, los dominios VH y/o los dominios VL) que aquí se describen, dichos anticuerpos se unen inmunoespecíficamente a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o fragmento o variante del mismo. Las técnicas estándares conocidas por los expertos en la técnica se pueden usar para introducir mutaciones en la s cuencia de nucleótidos que codifica una molécula de la invención, incluyendo por ejemplo mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR que da por resultado sustituciones de aminoácidos. Preferiblemente, las variantes (incluyendo derivados) codifican menos de 50 sustituciones de aminoácidos, menos de 40 sustituciones de aminoácidos, menos de 30 sustituciones de aminoácidos, menos de 25 sustituciones de aminoácidos, menos de 20 sustituciones de aminoácidos, menos de 15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos o menos de 2 sustituciones de aminoácidos en relación con el dominio de VH de referencia, VHCDR1 , VHCDR2, VHCDR3, dominio de VL, VLCDR1, VLCDR2 o VLCDR3. Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la cual el residuo de aminoácidos es reemplazado por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral con una carga similar. Familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con cargas similares han sido identificadas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, ácido aspártíco, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, ¡soleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, feniialanina, triptofano, histidina). Alternativamente, se pueden introducir mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia de codificación, tal como mediante mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes pueden ser seleccionados para actividad biológica para identificar mutantes que retenga actividad (por ejemplo, la capacidad para unirse a un receptor de quimiocina de proteína G). Por ejemplo, es posible introducir mutaciones sólo en regiones del marco o sólo en la,s regiones de CDR de una molécula de anticuefo. Las mutaciones introducidas pueden ser mutaciones silenciosas o mutaciones sin sentido neutras, es decir, que no tienen o tienen poco efecto sobre la capacidad de un anticuerpo para unirse a un antígeno. Estos tipos de mutaciones pueden ser útiles para optimizar el uso de codones o mejorar la producción de un anticuefo de hibridoma. Alternativamente, las mutaciones sin sentido no neutras pueden alterar la capacidad de un anticuerpo a unirse a un antígeno. La localización de la mayoría de las mutaciones silenciosas y sin sentido neutras es probable que sea en las regiones del marco, aunque la localización de la mayoría de las mutaciones sin sentido no neutras es probable que sea en CDR, aunque esto no es un requerimiento absoluto. Un experto en la técnica podrá diseñar y probar moléculas mutantes con propiedades deseadas tales como sin alteración en la actividad d.e unión a antígeno o alteración en la actividad de unión (por ejemplo, mejoras en la actividad de unión a antígeno o cambio en la especificidad del anticuefo). Después de la mutagénesis, la proteína codificada puede ser rutinariamente expresada y la función y/o actividad biológica de la proteína codificada (por ejemplo la capacidad para unirse inmunoespecíficamente a un receptor de quimiocina de proteína G) se puede determinar usando técnicas que aquí se describen o mediante técnicas rutinariamente modificables conocidas en la técnica. ** > En una modalidad específica, un anticuefo de la Invención (incluyendo una molécula que comprende o que consiste alternativamente de un fragmento o variante de anticuerpo del mismo), que se une inmunoespecíficamente a polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o fragmentos o variantes del mismo comprende o alternativamente consiste de una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótido que hibrida a una secuencia de nucleótido que es complementaria a la que codifica uno de los dominios de VH o VL expresados por uno o más anticuerpos anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que expresa las líneas de células de la invención bajo condiciones astringentes, por ejemplo, hibridación a ADN unido mediante filtro en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6X a aproximadamente 45°C seguido por uno o más lavados en 0.2xSSC/0.1 % de SDS a aproximadamente 50-65°C, bajo condiciones astringentes, por ejemplo, hibridación a ácido nucleico unido mediante filtro en 6xSSC a aproximadamente 45°C seguido por uno o más lavados en 0.1xSSC/0.2% de SDS a aproximadamente 68°C, o bajo otras condiciones de hibridación astringentes que son conocidas por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al., eds., 1989 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., New York en las páginas 6.3.1-6.3.6 y 2.10.3). Las moléculas de ácido nucleico que codifican estos anticuerpos también son comprendidas por la invención. Es bien sabido dentro de la técnica que los polipéptidos o fragmentos o variantes de los mismos, con secuencia de aminoácidos similares a menudo tienen estructura similar y muchas de las mismas actividades biológicas. Por lo tanto, en una modalidad, un anticuerpo (incluyendo una molécula que comprende o que consiste alternativamente de un fragmento^ o variante de anticuefo del mismo), que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o fragmentos o variantes de un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprende o alternativamente consiste de un dominio de VH que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, o por lo menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de un dominio de VH de una cadena pesada expresada por un anticuerpo antireceptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que expresa la línea de células de la invención. En otra modalidad, un anticuerpo, (incluyendo una molécula que comprende o que consiste alternativamente de un fragmento o variante de anticuerpo del mismo) que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o fragmentos o variantes de un - poiipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprende o alternativamente consiste de un dominio que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, o por lo menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de un dominio de VL de una cadena ligera expresada por un anticuerpo anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que expresa la línea de células de la invención. t i La invención también abarca anticuefos (incluyendo moléculas que comprenden o que consisten alternativamente de fragmentos o variantes de anticuerpo de las mismas) que tienen una o más de las mismas características biológicas que uno de los anticuerpos que aquí se describe. Por "características biológicas" se entiende, las actividades o propiedades in vitro o in vivo de los anticuerpos, tales como por ejemplo la capacidad para unirse a receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (por ejemplo, receptor - de quimiocina de proteína G (CCR5) expresado sobre la superficie de la célula, receptor de qulmiocina de proteína G (CCR5) incrustrado en la membrana y/o un fragmento o variante de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5)); la capacidad para inhibir o eliminar sustancialmente la unión del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) a un ligando de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (por ejemplo, MIP1-beta, véase, por ejemplo, ejemplo 61); la capacidad para regular descendentemente la expresión de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) sobre la superficie de la célula; la capacidad para inhibir o eliminar la actividad biológica mediada - por receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (por ejemplo, unión de VIH a infección (entrada a/fusión), y/o replicación en células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (véase, por ejemplo, ejemplo 60), la capacidad para inhibir o eliminar quimotáxis inducida por MlP1-beta de las células mononucleares de sangre periférica PBMC (u otras células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCR5)), o la capacidad para inducir un flujo de calcio intracelular en células que expresan receptor de X quimiocina de proteína G (CCR5) (véase, por ejemplo, ejemplo 63). Opcionalmente, los anticuerpos de la invención se unirán al mismo epítope como por io menos uno de los anticuerpos a los que se hace referencia específicamente aquí. Dicha unión a epítope se puede determinar rutinariamente usando pruebas conocidas en la técnica. La presente invención también provee anticuefos (incluyendo moléculas que comprenden o que consisten alternativamente de fragmentos o variantes de anticuerpo del mismo) que neutralizan el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), dichos anticuerpos comprendiendo o consistiendo alternativamente de una porción (por ejemplo, CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL y/o CDR3 de VL) de un dominio de VH o VL de un anticuerpo de la invención. Un anticuerpo que "neutraliza al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o un fragmento o variante del mismo" es por ejemplo un anticuefo que disminuye o elimina la capacidad del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o fragmento o variante de mismo a unirse al ligando (por ejemplo, VIH y MlP1-beta); que disminuye o elimina quimiotáxis inducida por MIP1- beta de PBMC u otra célula que expresa CCR5; y/o que elimina o inhibe la cascada de señalización de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (por ejemplo, flujo de calcio iniciado por un receptor de quimiocina de proteína G activado (CCR5), véase, por ejemplo, ejemplo 63). En una modalidad, un anticuefo que neutraliza al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprende o alternativamente consiste de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio de VH de un anticuerpo de la invención, o un fragmento o variante del mismo y un dominio de VL de un anticuerpo de la invención, o un fragmento o variante de mismo. En otra modalidad, un anticuefo que neutraliza receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprende o consiste alternativamente de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio de VH y un dominio de VL de un anticuerpo individual (o fragmento scFv o Fab) de la invención, o fragmentos o variantes del mismo. En una modalidad, un anticuefo que neutraliza al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprende o alternativamente consiste de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio de VH de un anticuefo de la invención, o uh fragmento o variante de mismo. En otra modalidad, un anticuerpo que neutraliza al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprende o que consiste alternativamente de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio de VL de un anticuefo de la invención, o un fragmento o variante del mismo. En otra modalidad, un anticuerpo que neutraliza al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o un fragmento o variante del mismo, comprende o consiste alternativamente de un polipéptido que tiene al secuencia de aminoácidos de un dominio de CDR de VH de un anticuerpo de la invención, o un fragmento o variante del mismo. En una modalidad preferida, un anticuerpo que neutraliza al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o un fragmento o variante de mismo comprende o consiste alternativamente de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un CDR3 de VH de un anticuerpo de la invención, o un fragmento o variante de mismo. En otra modalidad, un anticuefo que neutraliza al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o un fragmento o variante de mismo, comprende consiste alternativamente de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un CDR de VL de un anticuefo de la invención, o un fragmento o variante de mismo. En otra modalidad preferida, un anticuefo que neutraliza al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o un fragmento o variante de mismo, comprende o alternativamente consiste de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un CDR3 de VL de un anticuefo de la invención, o un fragmento o variante de mismo. Las moléculas de ácido nucleico que codifican estos anticuerpos también son comprendidas por la invención. La presente invención también provee anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden o que consisten alternativamente de fragmentos o variantes de anticuerpo del mismo) que reduce o elimina la capacidad de virus de VIH, particularmente aquellos que utilizan el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) como un co-receptor, para unirse a, infectar (entrar a/fusionarse con), y/o replicarse en células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), como se determina por cualquier método conocido en la técnica tal como, por ejemplo, las pruebas descritas en el ejemplo 60. Dichos anticuefos pueden comprender o alternativamente consisten de una porción (por ejemplo CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL) de un dominio de VH o VL que tiene una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de la invención o un fragmento o variante del mismo: en una modalidad, un anticuerpo que reduce o elimina la capacidad de virus de VIH, particularmente aquellos que utilizan al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) como un co-receptor, para unirse a, infectar (entrar a/fusionarse con) y/o replicarse en células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprende o consiste alternativamente de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio de VH de un anticuerpo de la invención o un fragmento o variante del mismo y un dominio de VL de un anticuerpo de ia invención o un fragmento o variante de mismo. En otra modalidad, un anticuerpo que reduce o elimina la capacidad de virus de VIH, particularmente aquellos que utilizan al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) como un co-receptor, para unirse a, infectar (entrar a/fusionarse con) y/o replicarse en células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprenden o alternativamente consisten de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio de VH y un dominio de VL de un anticuerpo individual (o un fragmento scFv o Fab) de la invención, o fragmentos o variantes de los mismos. En una modalidad, un anticuefo que reduce o elimina la capacidad de virus de VIH, particularmente aquellos que utilizan receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) como un co-receptor, para unirse a, infectar (entrar a/fusionarse con), y/o replicarse en células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprende o alternativamente consiste de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio de VH de un anticuerpo de la invención, o un fragmentólo variante del mismo. En otra modalidad, un anticuerpo que reduce o elimina la capacidad de virus de VIH, particularmente aquellos que utilizan receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) como un co-receptor para unirse a, infectar (entrar a/fusionarse con), y/o replicarse en células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprende o alternativamente - consiste de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio de VL de un anticuerpo de la invención, o un fragmento o variante del mismo. En una modalidad preferida, un anticuerpo que reduce o elimina la capacidad de virus de VIH, particularmente aquellos que utilizan receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) como un co-receptor, para unirse a, infectar (entrar a/fusíbnarse con), y/o replicarse en células que expresan receptor de químiocina de proteína G (CCR5), comprende o alternativamente consiste de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de un CDR3 de VH de un anticuefo de la invención, o un fragmento o variante del mismo. En otra modalidad preferida, un anticuefo que reduce o elimina la capacidad de virus de VIH, particularmente aquellos que utilizan receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) como un co-receptor, para unirse a, infectar (entrar a/fusionarse con), y/o replicarse en células que expresan receptor de químiocina de proteína G (CCR5), comprende o alternativamente consiste de un polipéptido gue tiene la secuencia de aminoácidos de un CDR3 de VL de un anticuefo de la invención, o un fragmento o variante del mismo. Las moléculas de ácido nucleico que codifican esos anticuerpos también son comprendidas por la invención.

La presente invención también provee anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden o que consisten alternativamente de fragmentos o variantes de anticuerpos de las mismas), que inhiben o eliminan la quimotaxis inducida por MIP1-beta de células mononucleares de sangre periférica PBMC u otras células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), como lo determina cualquier método conocido en la técnica tal como, por ejemplo, las pruebas descritas en el ejemplo 62. Dichos anticuerpos pueden comprender o alternativamente consisten de una porción (por ejemplo, CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL) de un dominio de VH o VL que tiene una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de la invención o un fragmento o variante del mismo. En una modalidad, un ánticuefo que inhibe o elimina quimotaxis inducida por MIP1-beta de células mononucleares de sangre periférica PBMC u otras células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprende o alternativamente consiste de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio de VH de un anticuerpo de la invención, o un fragmento o variante del mismo y un dominio de VL de un anticuerpo de la invención o un fragmento o variante del mismo. En otra modalidad un anticuerpo que inhibe o elimina quimotaxis inducida por MIP1-beta de células mononucleares de sangre periférica PBMC u otras células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprende o alternativamente consiste de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio de VH y de un dominio de VL de un anticuerpo individual (o un fragmento de scFv o Fab) de la invención, o fragmentos o variantes del mismo. En una modalidad, un anticuefo que inhibe o elimina quimotaxis inducida por MIP1-beta de células mononucleares de sangre periférica PBMC u otras células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprende o alternativamente consiste de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio de VH de un anticuerpo de la invención, o un fragmento o variante del mismo. En otra modalidad, un anticuerpo que inhibe o elimina quimotaxis inducida por MIP1-beta de células mononucleares de sangre periférica PBMC u otras células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprende o alternativamente consiste de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio de VL de un anticuefo de la invención, o un fragmento o variante del mismo. En una modalidad preferida, un anticuefo que inhibe o elimina quimotaxis inducida por MIP1-beta de células mononucleares de sangre periférica PBMC u otras células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprende o alternativamente consiste de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de un CDR3 de VH de un anticuerpo de la invención o un fragmento o variante del mismo. En otra modalidad preferida, un anticuefo que inhibe o elimina quimotaxis inducida por MIP1-beta de células mononucleares de sangre periférica PBMC u otras células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprende o alternativamente consiste de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de un CDR3 de VL de un anticuerpo de la invención o un fragmento o variante del mismo. Las moléculas de ácido nucleico que codifican estos anticuerpos también son comprendidas por la invención. La presente invención también provee anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden o que consisten alternativamente de fragmentos o variantes de anticuerpos de las mismas), que regula descendentemente la expresión de superficie celular del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), como se determina por cualquier método conocido en la técnica tal como, por ejemplo análisis de FACS/las pruebas descritas en los ejemplos 61 ó 63. A manera de una hipótesis no limitante, dicha regulación descendente puede ser el resultado de ¡nternalización inducida por anticuerpo del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Dichos anticuerpos pueden comprender o alternativamente consisten de una porción (por ejemplo, CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL) de un dominio de VH o VL que tiene una secuencia de aminoácidos de un anticuefo de la invención o un fragmento o variante del mismo. En una modalidad, un anticuerpo que regula descendentemente la expresión de superficie celular de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprende o alternativamente consiste de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio de VH de un anticuefo de la invención o un fragmento o variante del mismo y un dominio de VL de un anticuerpo de la invención o un fragmento o variante del mismo. En otra modalidad, un anticuerpo que regula descendentemente la expresión de superficie celular de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprende o alternativamente consiste de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de un dominio de VH y un dominio de VI de un anticuerpo individual (o fragmento de scFv o Fab) de la invención o fragmentos o variantes del mismo. En una modalidad, un anticuefo que regula descendentemente la expresión de superficie celular de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprende o alternativamente consiste de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio de VH o un anticuerpo de la invención, o un fragmento o variante del mismo. En otra modalidad, un anticuerpo que regula descendentemente la expresión de superi?cie celular de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprende o alternativamente consiste de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio de VL de un anticuefo de la invención, o un fragmento o variante del mismo. En una modalidad preferida, un anticuerpo que regula descendentemente la expresión de superficie celular de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprende o alternativamente consiste de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un CDR3 de VH de un anticuerpo de la invención, o un fragmento o variante del mismo. En otra modalidad preferida, un anticuefo que regula descendentemente la expresión de superficie celular de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprende o alternativamente consiste de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un CDR3 de VL de un anticuerpo de la invención, o un fragmento o variante del mismo. Las moléculas de ácido nucleico que codifican estos anticuerpos también son comprendidas por la invención.

- La presente invención también provee * a•* nticue -* rpos (incluyendo moléc *ulas que comprenden o que consisten alternativ _*amente de fragmentos o variantes de anticuerpos de ias mismas), que incrementa la actividad de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), dichos anticuefos comprendiendo o alternativamente consistiendo de una porción (por ejemplo, CDRIjJe VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL) de un dominio de VH o VL de un anticuefo de la invención, o un fragmento o variante del mismo. A manera de ejemplo no limitante, un anticuerpo que "incrementa la actividad de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o un fragmento o variante del mismo" es un anticuerpo que - zx incrementa la capacidad de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) para unirse para estimular la quimotaxis de PBMC (u otras células que expresan receptor de quimiocina dé proteína G (CCR5)), y/o para estimular la cascada de señalización de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (por ejemplo, para iniciar un flujo de calcio intracelular, véase ejemplo 63). En una modalidad, un anticuefo que incrementa la actividad de receptor de químiocina de proteína G (CCR5) comprende o alternativamente consiste de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio de VH de un anticuefo de la invención, o un fragmento o variante del mismo y un domjnio de VL de un anticuefo de la invención, o un fragmento o variante del mismo. En otra modalidad, un anticuefo que incrementa la actividad de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) comprende o alternativamente consiste de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio de VH y un dominio de VL de un anticuerpo individual (o fragmento descFv o Fab) de la invención, o fragmentos o variantes del mismo. En una -modalidad^ un anticuerpo que incrementa la actividad de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o un fragmento o variante del mismo comprende o alternativamente consiste de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un^ dominio de VH de un anticuerpo de la invención o un fragmento o variante del mismo. En otra modalidad, un anticuerpo que incrementa la actividad de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o un fragmento o variante del mismo comprende o consiste alternativamente de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio de VL de un anticuerpo de la invención o un fragmento o variante del mismo. En otra modalidad, un anticuerpo que incrementa la actividad de un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o un fragmento o variante def mismo comprende o alternativamente consiste de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio de CDR de VH referido en el cuadro 2, o un fragmento o variante del mismo. En una modalidad preferida, un anticuerpo que incrementa la actividad de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o un fragmento o variante del mismo, comprende o alternativamente consiste de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un CDR3 de VH de un anticuerpo de la invención, o un fragmento o variante del mismo En otra modalidad, un anticuerpo que incrementa el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o un fragmento o variante del mismo comprende o alternativamente consiste de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un dominio de CDR de VL de un anticuerpo de la invención, o un fragmento o variante del mismo. En otra modalidad preferida, un anticuerpo que incrementa la actividad de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o un fragmento o variante del mismo, comprende o alternativamente consiste de un poiipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un CDR3 de VL de un anticuerpo de la invención o un fragmento o variante del mismo. Las moléculas de ácido nucleico que codifican esos anticuerpos también son comprendidas por la invención. . La presente invención también provee proteínas de fusión que comprenden o que consisten alternativamente de un anticuefo (incluyendo moléculas que comprenden o que consisten alternativamente de fragmentos de anticuefo o variantes del mismo), que se unen inmunoespecíficamente a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), y un péptido heterólogo. Preferiblemente, el péptido heterólogo al cual se fusiona el anticuerpo es útil para funcionar o es útil para dirigir las células de expresión de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), incluyendo pero sin limitarse a MIP-1-beta; un polipéptido de unión a CD4 tal como un anticuefo anti-CD4; polipéptidos de unión a CXCR4 tales como factor 1-alfa derivado de estroma (SDF1-alfa); y/o una proteína de unión a CCR3, tal como MIP1-alfa. En una modalidad preferida alternativa, el polipéptido heterólogo al cual está fusionado el anticuerpo es útil para la función de células T, macrófagos y/o monocitos o es útil para dirigir el anticuerpo a una células T, macrópfago o monocito incluyendo pero sin limitarse a MIP-1-beta; un polipéptido de unión a CD4 tal como un anticuerpo anti-CD4; polipéptidos de unión a CXCR4 tales como factor 1-alfa derivado de estroma (SDF1-aifa); y/o una proteína de unión a CCR3, tal como MIP1-alfa. En una modalidad, una proteína de fusión comprende o consiste alternativamente de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera o más de los dominios de VH de un anticuerpo de la invención o la secuencia de aminoácidos de cualquiera o más de los dominios de VL de un anticuefo de la invención o fragmentos o variantes del mismo, y una secuencia de polipéptido heterólogo. En otra modalidad, una proteína de fusión de la presente invención comprende o alternativamente consiste de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de cualesquiera uno, dos, tres o más de los CDR de VH de un anticuerpo de la invención, o la secuencia de aminoácidos de cualesquiera uno, dos, tres o más de los CDR de VL de un anticuerpo de ia invención, o fragmentos o variantes del mismo, y una secuencia de polipéptido heterólogo. En una modalidad preferida, la proteína de fusión comprende o consiste alternativamente de un poiipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH de un anticuerpo de la invención, o fragmento o variante del mismo, y una secuencia de polipéptido heterólogo, dicha proteína de fusión se une inmunoespecíficamente a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). En otra modalidad, una proteína de fusión comprende o consiste alternativamente de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de por lo menos un dominio de VH de un anticuerpo de la invención y una secuencia de aminoácidos de por lo menos un dominio de VL de un anticuefo de la invención o fragmentos o variantes del mismo, y una secuencia de polipéptido heterólogo. Preferiblemente, los dominios de VH y VL de la proteína de fusión corresponden a un anticuefo individual (o un fragmento de scFv o Fab) de la invención. En otra modalidad, una proteína de fusión de la invención comprende o alternativamente consiste de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de cualesquiera uno, dos, tres o más de los CDR de VH de un anticuerpo de la invención, y la secuencia de aminoácidos de cualesquiera uno, dos, tres o más de los CDR de VL de un anticuerpo de la invención, o fragmentos o variantes del mismo, y una secuencia de polipéptido heterólogo. Preferiblemente, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de los CDR de VH o CDR de VL corresponden a un anticuerpo individual (o un fragmento de scFv o Fab) de la invención. Las moléculas de ácido nucleico que codifican estas proteínas de fusión también son comprendidas por la invención. Los anticuerpos de la presente invención se pueden usar, por ejemplo, pero sin limitarse para purificar, detectar y dirigir los polipéptidos de la presente invención, incluyendo métodos de diagnóstico y terapéuticos in vitro e in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos tienen uso en inmunoensayos para mediar cualitativamente y cuantitativamente niveles de los polipéptidos de la presente invención en muestras biológicas. Véase, por ejemplo, Harlow et al., Ántibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988) (incoforada aquí por referencia en su totalidad).

- A manera de otro ejemplo no limitante, los anticuerpos de la invención se pueden administrar a individuos como una forma de inmunización pasiva. Alternativamente, los anticuerpos de ia presente invención se pueden usar para mapeo de epítope para identificar la unión al epítope(s) por el anticuefo. Los epítopes identificados de esta manera f pueden a su vez, por ejemplo, usarse como candidatos de vacuna, es decir, para inmunizar a un individuo para inducir anticuefos contra las formas que ocurren naturalmente de receptor de quimiocina de proteína G. Como se describe con más detalle más adelante, los anticuerpos de la presente invención se pueden usar ya sea solos o en combinación con otras composiciones. Los anticuefos pueden además fusionarse en forma recombinante a un polipéptido heterólogo en el grupo N-terminal o C-terminal o se pueden conjugar químicamente (incluyendo conjugaciones covalentes o no covalentes) a polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención se pueden fusionar recombinantemente o conjugar a moléculas útiles como marcadores en pruebas de detección y moléculas efectoras tales como polipéptidos heterólogos, fármacos, radionúclidbs o toxinas. Véase, por ejemplo, publicaciones del PCT WO -92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; patente de E.U.A. No. 5,314,995 y EP 396,387. , Los anticuefos de la invención incluyen derivados que son modificados, es decir, por unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuefo. Por ejemplo, pero sin limitarse, los derivados de anticuerpo incluyen anticuerpos que han sido modificados, por ejemplo, por glicosilación, * * acetilación, pegilación, fosfilación, amidación, derivación por grupos de protección/bloqueo conocidos, digestión proteolítica, enlace a un ligando celular u otra proteína, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas se pueden llevar a cabo mediante técnicas_conocidas que incluyen pero no se limitan a digestión química específica, acetilación, formilación, , síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, los derivados pueden contener uno o más aminoácidos no clásicos. Los anticuefos de lá presente invención se pueden generar por cualquier método adecuado conocido en la técnica. Los anticuerpos policlonales a un antígeno de interés se pueden producir mediante varios procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un polipéptido de la invención se puede administrar a varios animales hospedero que incluyen pero no se limitan a conejos, ratones, ratas, etc., para inducir la producción de suero que contiene sueros anticlonales específicos para el antígeno. Varios adyuvantes se pueden usar para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie hospedera e ¡ncluyen pero no se limitan a solución de Freund (completa e incompleta), geles de minerales tales como hidróxido de ajuminio, sustancias activas de superficie tales como lisolecitina, polioles plurónicos, poiianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de lapa, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo de Caimette-Guerin) y corynebacterium parvum. Dichos adyuvantes son bien conocidos en la técnica.

Los anticuefos monoclonales se pueden preparar usando una amplia variedad de técnicas conocidas que incluyen el uso de tecnología de hibridoma, recombinante y de despliegue de fagos, o una combinación de los mismos. Por ejemplo, los anticuerpos monocionales se pueden producir usando técnicas de hibridoma que ¡ncluyen aquellas conocidas en la técnica y enseñadas por ejemplo en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammeriing et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) (dichas referencias se incorporan aquí en su totalidad). El término "anticuerpo monpclonal", como se usa aquí no se limita a anticuefos producidos a través de tecnología de hibridoma. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuefo que se deriva de un clon Individual, incluyendo cualquier clon eucariótico,' procariótico o de fago, y no el método por el cual se produce. Los métodos para producir y seleccionar anticuerpos específicos usando tecnología de hibridoma son de rutina y bien conocidos en la técnica y se describen con detalle en los ejemplos. En un ejemplo no limitante, los ratones pueden ser inmunizados con un polipéptido de la Invención o una célula que exprese dicho péptido. Una vez que es detectada una respuesta inmune, por ejemplo, anticuerpos específicos para el antígeno son detectados en el suero de ratón, el bazo del ratón es cosechado y los esplenocitos son aislados. Los esplenocitos son después fusionados mediante técnicas bien conocidas a cualesquiera células de mieloma adecuadas, por ejemplo células de la línea celular SP20 o P3X63-AG8.653 disponibles de ATCC. Los hibridomas se seleccionan y se clonan por dilución limitada. Los clones de hibridoma después se someten a prueba mediante métodos conocidos en la técnica para células que secretan anticuefos capaces de unirse a un polipéptido de la invención. El fluido de ascitos, que generalmente contiene altos niveles de anticuerpos, se pueden generar mediante inmunización de ratones con clones de hibridoma positivos. Por consiguiente, la presente invención provee métodos para generar anticuefos monoclonales así como anticuefos producidos por el i método que consiste en cultivar una célula de hibpdoma que secreta un anticuerpo de la invención en donde preferiblemente el hibridoma es generado fusionando espienocitos aislados de un ratón inmunizado, con un antígeno de la invención con células de mieloma y después seleccionando los hibridomas que resultan de la fusión para clones de hibridoma que secretan un anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido de la invención. Otro método bien conocido para producir líneas de células B humanas policionales y monoclonales es la transformación usando virus de Epstein Barr (EBV). Los protocolos para generar líneas de células B transformadas por EBV se conocen comúnmente en la técnica, tal como por ejemplo el protocolo delineado en el capítulo 7.22 de Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds. 1994, John Willey & Sons, NY, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. La fuente de células B para transformación es comúnmente sangre periférica humana, pero las células B para transformación también se pueden derivar de otras fuentes que ¡ncluyen pero no se limitan a nodos linfáticos, anginas, bazo, tejido tumoral y tejidos infectados. Los tejidos generalmente se hacen en suspensiones de células individuales antes de la transformación por EBV. Además, se deben seguir pasos para remover ffsicamente o inactivar células B (por ejemplo, mediante tratamiento con ciclosporina A) en muestras que contienen células B, debido a que las células T de individuos seropositivos para anticuerpos anti-EBV pueden suprimir la inmortalización de células B por EBV. En general, la muestra que contiene células B humanas es inoculada con EBV y cultivada durante 3-4 semanas. Una fuente típica de EBV es el sobrenadante de cultivo de la línea de células B95-8 (ATCC-#VR-1492). Los signos físicos de transformación por EBV generalmente se pueden ver hacia el final del periodo de cultivo de 3-4 semanas. Por microscopía de contraste de fases, las células transformadas puede parecer grandes, claras, vellosas y tender a agregarse en agrupaciones apretadas de células. Inicialmente, las líneas de EBV son generalmente policlonales. Sin embargo, durante periodos prolongados de cultivos de, células, las líneas de EBV pueden volverse monoclonales o policionales como resultado del crecimiento selectivo de clones de células B particulares. Alternativamente, las líneas transformadas por EBV policlonales se pueden subclonar (por ejemplo mediante cultivo de dilución limitante) o fusionar con un elemento asociado de fusión adecuado y colocarse en placas a una dilución lirnitante para obtener líneas de células B monoclonales. Los elementos asociados de fusión adecuados para líneas de células transformadas por EBV incluyen líneas de células de mieloma de ratón (v.gr., SP2/0, X63-Ag8.653), líneas de células de heteromieloma (humano x ratón; v.gr., SPAM-8, SBC-H20 y CB-F7), y líneas de células humanas (v.gr., GM 1500, SKO-007, RPMl 8226 y KR-4). Por lo tanto, la presente invención también provee un método para generar anticuerpos humanos policlonales o monocionales contra polipéptidos de la invención o fragmentos de los mismos, que comprende la transformación por EBV de células B humanas. Los fragmentos de anticuefo que^ reconocen epítopes específicos pueden ser generados mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, fragmentos* de Fab y F(ab')2 de la invención se pueden producir mediante digestión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, usando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmento F(ab')2). Los fragmentos F(ab')2 que contienen la región variable, la región constante de cadena ligera y el dominio de CH1 de la cadena pesada. _. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención también se pueden generar usando varios métodos de despliegue de fagos conocidos en la técnica. En los métodos de despliegue de fagos, los dominios de anticuerpo funcionales se despliegan sobre la superficie de partículas de fago que portan las secuencias de polinucleótidos que los codifican. En una modalidad particular, dicho fago se puede utiiizar para desplegar dominios de unión a I -!' t c antígeno expresados a partir de un repertorio o genoteca de anticuefos de combinación (por ejemplo, humanos o murinos). Los fagos que expresan un dominio de unión a antígeno que se une al antígeno de interés se pueden seleccionar o ^identificar con antígeno, por ejemplo, usando antígeno marcado o antígeno unido o capturado en una superficie de sólido o en una esfera sólida. Los fagos utilizados en estos métodos son típicamente fagos 7 filamentosos incluyendo los dominios de unión de fd y M13 expresados a partir del fago con Fab, Fv o dominios de anticue/po Fv estabilizado por J disulfuro recombinantemente fusionados ya sea a la proteína del gen III o del * gen VIH del fago. Ejemplos de métodos de despliegue de fagos que se pueden usar para hacer los anticuerpos de la presente invención ¡ncluyen aquellos descritos en Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. , 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Ádvaces in Immunology 57:191-280 (1994); solicitud del PCT No. PCT/GB91/01134; publicaciones del PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401 ; y patentes de É.U.A. Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821 ,047; 5,571 ,698; 5,427,908; 5,516,637;'5,780,225; ¿ *. t 5,658,727; 5,733,743 y 5,969,108; cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Como se describe en las referencias anteriores, después de la selección de fagos, las regiones codificadoras de anticuefos del fago se pueden aislar y usar para generar anticuerpos enteros, incluyendo anticuerpos húmanos, p cualquier otro fragmento de unión a antígeno deseado, y expresarse en cualquier hospedero deseado, incluyendo células de mamífero, células de insecto, células vegetales, levadura y bacterias, por ejemplo, descritos con más detalle más adelante. Por ejemplo, las técnicas para producir recombinantemente fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 también se pueden emplear usando métodos conocidos en la técnica tales como aquellos 1 descritos en la publicación del PCT WO 92/22324; Muliinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); y Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); y Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) (dichas referencias se incorporan aquí por referencia en su totalidad). Ejemplos de técnicas que se pueden usar para producir Fvs y anticuefos de una sola cadena incluyen aquellos descritos en las patentes de E.U.A. 4,946,778 y 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); y Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988). Para algunos usos, incluyendo uso in vivo de anticuefos en humanos y pruebas de detección m vitro, puede ser preferible usar anticuefos quiméricos, humanizados o humanos. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual diferentes porciones del anticuerpo se derivan de diferentes especies de animales, tales como anticuefos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuefos quiméricos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et af., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; patentes de E.U.A. -* , Nos. 5,807,715, 4,816,567 y 4,816,397, que se incoforan aquí por referencia en su totalidad. Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de anticuefo de especies no humanas que se une al antígeno deseado que tiene una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la especie humana y una región de marco de la molécula de inmunoglobulina humana. A menudo, los residuos de marco en las regiones de marco humanas serán sustituidos por el residuo correspondiente del anticuerpo donador de CDR para alterar, preferiblemente mejorar, la unión a antígeno. Estas sustituciones de marco son identificadas por métodos bien conocidos en la técnica, mediante modelado de las interacciones de los residuos de CDR y de marco para identificar los residuos de marco importantes para unión a antígeno y comparación de secuencias para identificar residuos de marco poco usuales en posiciones particulares. (Véase, por ejemplo, Queen et al., patente de E.U.A. No. 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), que se incorporan aquí por referencia en su totalidad). Los anticuefos se pueden humanizar usando una variedad de técnicas conocidas que incluyen, por ejemplo, CDR-injerto (EP 239,400; publicación del PCT WO 91/09967; patentes de E.U.A. Nos. 5,225,539; 5,530,101 y 5,585,089), revestimiento o aplicación de nueva superficie (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnlcka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska et al., PNAS 91 :969-973 (1994)), y mezcla de cadena (patente de E.U.A. No. 5,565,332). * Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Los anticuefos se pueden hacer por una variedad de métodos conocidos en la técnica incluyendo métodos de despliegue de fagos descritos anteriormente usando genotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de te inmunoglobulina humana. Véase también, patentes de E.U.A. Nos. 4,444,887 y 4,716,111; y publicaciones del PCT WO 98/46645, WO 98/50433, W098/24893; WO 98/16654; WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741 ; cada una de ias cuales se incofora aquí por referencia en su totalidad. Los anticuefos humanos también se pueden producir usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pera que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, los complejos de genes de inmunoglobulina de cadena pesada y 'ligera humana se pueden introducir aleatoreamente o por recombinación homologa en células madre embrionarias de ratón. Alternativamente, las reglones variables humanas, región constante y región de diversidad se pueden introducir en células madre embrionarias de ratón además de los genes de cadena pesada y ligera humanos. Los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera de ratón se pueden hacer no funcionales por separado o en forma simultánea con la introducción de loci de inmunoglobulina humana por recombinación homologa. En particular, la deleción hom?cigótica de la región JH evita la producción de anticuerpos endógena. Las células madre embrionarias modificadas se expanden y se microinyectan en biastocitos para producir ratones quiméricos. Los ratones quiméricos después se reproducen para producir descendientes homoclgóticos que expresen anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos son inmunizados de la manera normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, todo o una porción de un polipéptido de la invención. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno se pueden obtener a partir de los ratones transgénicos inmunizados usando tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunogiobuiina humana portados por los ratones transgénicos se redistribuyen durante la diferenciación de células B y subsecuentemente sufren un cambio de clase y mutación somática. Por lo tanto, usando dicha tecnología es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para una visión general de esta tecnología para la producción de anticuerpos humanos, véase Lonberg y Huszar, Int. Rev.

Immunol. 13:65-93 (1995). Para una discusión detallada de esta tecnología ;. para producir anticuerpos humanos y anticuefos monoclonales humanos y protocolos para producir dichos anticuerpos véase por ejemplo, las solicitudes del PCT W098/24893; WÓ 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; patente -i europea No. 0 598 877; patentes de E.U.A. Nos/ 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661 ,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771 ; 5,939,598; 6,075,181 ; y 6,114,598, que se incorporan^aquí por referencia en su totalidad. Además, compañías tales como Abgenix, Inc. (Fremont, CA) y Genpharm (San José, CA) pueden ser contactadas para proveer anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando tecnología similar a la anteriormente descrita.

Los anticuefos completamente humanos que reconocen un * '" °^ epítope seleccionado se puede generar usando una técnica referida como "selección guiada". En este enfoque se usa un anticuerpo monocional no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, para guiar la selección de un anticuefo completamente humano que reconozca al mismo jepítope. ((Jespers et al., Bio/technology 12:899-903 (1988)). Además, los anticuefos para los polipéptidos de la invención a su vez se pueden utilizar para generar anticuefos anti-idiotipo que "imitan" a poFipéptidos de la invención usando técnica bien conocidas por los expertos en la técnica. (Véase v.gr., Greenspan & Bona, FASEB J. 7(5):437-444; (1989) y Nissinoff, J. Immunoi. 147(8):2429-2438 (1991)). Por ejemplo, los anticuefos que se unen a y que inhiben competitivamente la multimerización 1 ' m í dé polipéptidbs y/o la unión de un polipéptido de la invención a un ligando se pueden usar para generar anti-idiotipos que "imitan" la multimerización de polipéptidos y/o dominio de unión y, como consecuencia, se unen a y neutralizan el polipéptido y/o su ligando. Dichos anti-idiotipos neutralizantes o • fragmentos de Fab de dichos anti-idiotipos se pueden usar en regímenes terapéuticos para neutralizar el ligando de polipéptido. Por ejemplo, dichos anticuerpos anti-idiotípicos se pueden usar para unirse a un polipéptido de la t invención y/o* para unirse a sus ligandos/receptores, y de esta manera activar X o bloquear su actividad biológica. Los intracuefos son anticuefos, a menudo scFvs, que se expresan' a "partir de una molécula de ácido nucleico recombinante y se manipulan genéticamente para ser intracelularmente retenidos (por ejemplo, retenidos en el citoplasma, retículo endoplásmico o periplasma). Los intracuerpos se pueden usar, por ejemplo, para impedir la función de una proteína a la cual se une el intracuerpo. La expresión de intracuerpos también se pueden regular mediante el uso de promotores inducibles en el vector de expresión de ácido nucleico que comprende el intracuerpo. Los ¡ntracuefos de la invención se pueden producir usando métodos bien conocidos en la técnica, tales como aquellos descritos en Chen ef al., Hum. Gene Ther. 5:595- 601 (1994); Marasco, W.A., Gene Ther. 4:11-15 (1997); Rondón y Marasco, Annu. Rev. Microbiol. 51:257-283 (1997); Proba et al., J. Mol. Biol. 275:245- 253 (1998); Cohén et al., Oncogene 17:2445-2456 (1998) Ohage y Steipe, J.

Mol. Biol.. 297:1119-1128; Ohage et al., J. Mol. Biol. 291? 129-1134 (1999); Wirtz y Steipe, Protein Sci. 8:2245-2250 (1999): Zhu et al., J. Immunol.

Methods 231:207-222 81999); y referencias citadas en los mismos. En particular, un intracuefo de CCR5 ha sido producido por Steinberger et al., Proc. Nati.' Acad. Sci. EUA 97:805-810 (2000).

Tecnología de Xenomouse Los anticuerpos de acuerdo con la invención se preparan preferiblemente mediante la utilización de un ratón transgénico que tiene una porción sustancial del genoma productor de anticuefo humano insertado pero que se vuelve deficiente en la producción de anticuefos endógenos murinos (por ejemplo, cepas de Xenomouse disponibles de Abgenix Inc., Fremont, CA). Dichos ratones, después, son capaces de^ producir moléculas de inmunoglobulina humana y anticuerpos humanos y son deficientes en la producción de moléculas de inmunoglobulina murinas y anticuerpos murinos. Las tecnologías utilizadas para lograr los mismos se describen en las patentes, solicitudes y referencias que aquí se describen. La capacidad para clonar y reconstruir loci humanos de tamaño de megabase en YAC y para introducirlos en la línea germinal de ratón provee un enfoque poderoso para dilucidar los componentes funcionales de loci muy grandes y crudamente mapeados así como generar modelos útiles de enfermedad humana. Además, la utilización de dicha tecnología para la sustitución de loci de ratón por sus equivalentes humanos podría proveer perspectivas únicas en la expresión y regulación de productos de genes humanos durante el desarrollo, su comunicación con otros sistemas y su indicación en la inducción y progresión de enfermedades. Una aplicación práctica importante de dicha estrategia es ia "humanización" del sistema inmune humoral del ratón. La introducción de ioci de inmunoglobulina humana (Ig) en ratones en los cuales los genes Ig endógenos han sido inactivados ofrece la oportunidad para estudiar los mecanismos en los que se basa la expresión programada y ensamble de anticuerpos así como su papel en el desarrollo de células B. Además, dicha estrategia podría proveer una fuente ¡deal para la producción de anticuerpos monóclonales completamente humanos (Mabs), un progreso importante para satisfacer el compromiso de terapia con anticuerpos en enfermedad humana.

* Se espera que los anticuefos completamente humanos reduzcan al mínimo las respuestas inmunogénicas y alérgicas intrínsecas a los anticuefos de ratón o monoclonales derivados de ratón y por lo tanto incrementen la eficacia y seguridad de los anticuefos administrados. Se puede esperar que el uso de anticuefos completamente humanos provean una ventaja sustancial en el tratamiento de enfermedades humanas crónicas y recurrentes tales como cáncer, que requieren administraciones repetidas de anticuerpos. Un enfoque hacia esta meta fue manipular genéticamente cepas de ratón deficientes en la producción de anticuefo de ratón con grandes fragmentos de loci Ig humanos en prevención de que dichos ratones produjeran un gran repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de anticuefos de ratón. Los fragmentos Ig humanos grandes conservarían la gran diversidad de genes variables así como la regulación apropiada de producción y expresión de anticuerpos. Explotando la maquinaria de ratón ' . __ para diversificación y selección de anticuerpos y la falta de tolerancia r . . inmunológica a proteínas humanas, el repertorio de anticuerpos humanos reproducidos en estas cepas de ratón produciría anticuefos de alta afinidad contra cualquier antígeno de interés, incluyendo antígenos humanos. Usando la tecnología de hibridoma, los anticuerpos monoclonales humanos específicos de antígeno con la especificidad deseada podrían producirse y seleccionarse fácilmente.

Esta estrategia general se demostró en conexión con la • * generación de las primeras cepas de XenoMouse™ como se publicó en 1994.

Véase Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994). Las cepas XenoMouse™ se manipularon genéticamente con cromosomas artificiales de levadura •- t ' * ' i * 5 (YACS) que contenían fragmentos de configuración de línea germinal de tamaño de 245 kb y 10 190 kb de locus de cadena pesada humana y locus de cadena ligera kappa, respectivamente, que contenía secuencias de región variable y constante de núcleo Id. Los YAC que contenían Ig humana mostraron ser .compatibles con el sistema de ratón tanto para redistribución 10 como para expr sión de anticuefos y fueron capaces de sustituir a los genes de Ig de ratón inactivados. Esto se demostró por su capacidad para inducir desarrollo de células B, para producir un repertorio humano similar a adulto de anticuefos completamente humanos, y para generar anticuerpos monóclonales humanos específicos de antígeno. Estos resultados también 15 sugieren que la introducción de porciones más grandes de loci Ig humanos que contienen mayores números de genes V, elementos reguladores adicionales y regiones constantes de Ig humanas podrían recapitular sustancialmente el repertorio completo que es característico de la respuesta humoral humana a la infección e inmunización. El trabajo de Green et al., se ' t Jn f' 20 extendió recientemente a la introducción de más de aproximadamente 80% del repertorio de anticuefos humanos mediante la introducción de fragmentos de YAC de configuración de línea germinal de tamaño de megabase de loci de cadena pesada humana y loci de cadena ligera kappa, respectivamente, para producir ratones XenoMouse™. Véase Méndez et al. Nature Genetics 15:146- *° 156 (1997), Green and Jakobovits J Exp. Med. 188:483-495 (1998), Green, Journal of Immunological Methods 231 :11-23 (1999) y solicitud de patente de E.U.A. serie No. 08/759,620, presentada el 3 de diciembre de 1996, cuyas descripciones se incorporan aquí por referencia. , Dicho enfoque se describe y se delinea además en la solicitud de patente de E.U.A. con serie No. 07/466,008, presentada el 12 de enero de 1990, 07/710,515, presentada el 8 de noviembre de 1990, 07/919,297, presentada el 24 de julio de 1992, 07/922,649, presentada el 30 de julio de 1992, 08/031,801, 15 de marzo de 1993, 08/112,848, presentada el 27 de agosto de 1993, 08/234,145, presentada el 28 de abril de 1994, 08/376,279, presentada el 20 de enero de 1995, 08/430,938, presentada el 27 de abril de 1995, 0-8/464,584, presentada el 5 de junio de 1995, 08/464,582, presentada el 5 de junio de 1995, 08/471 ,191 , presentada el 5 de junio de 1995, 08/462,837, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486,853, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486,857, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486,859, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462,513, presentada el 5 de junio de 1995, 08/724,752, presentada el 2 de octubre de 1996 y 08/759,620, presentada el 3 de diciembre de 1996. Véase también Méndez et al. Nature Genetics 15:146-156 (199*7) y Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188:483 495 (1998). Véase también patente europea No. EP 0 471 151 B1 , concesión • * publicada el 12 de junio de 1996, solicitud de patente internacional WO t . 94/02602, publicada el 3 de febrero de 1994, solicitud de patente internacional número WO 96/34096, publicada el 31 de octubre de 1996, y WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998. Las descripciones de cada una de las patentes, solicitudes y referencias anteriormente citadas se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Las respuestas de anticuerpos anti-ratón humanos (HAMA) han llevado a la industria a preparar anticuefos quiméricos o humanizados de otra manera. Aunque los anticuerpos quiméricos tienen una región constante humana y una región variable murina, se espera que ciertas respuestas de anticuefo anti-quiméricos humanos (HACA) se observen, particularmente en utilizaciones crónicas o de dosis múltiples del anticuefo. Por lo tanto, sería conveniente proveer anticuerpos completamente humanos contra polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) a fin de viciar las preocupaciones y/o efectos de las respuestas de HAMA o HACA. Anticuerpos monoclonales específicos para polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se prepararon usando tecnología de hidridoma (Kohier et al., Nature 256:495 (1975); Kohier et al., Eur. J. Immunol. 6:551 (1976); Kohier et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hibridomas, Elsevier, N.Y., pp. 571-681 (1981)). En breve, ratones XenoMouse™ se inmunizaron con células transfectadas con vector de expresión de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (para detalles, véase ejemplo 54). Después de la inmunización, los esplenocitos de dichos ratones se extrajeron y se fusionaron con una línea de células de mieloma adecuada. Se puede emplear cualquier Jínea de células de mieloma adecuada de acuerdo con la presente invención; sin embargo, es preferible emplear la línea de células de mieloma progenitora (P3X63-AG8.653), disponible de ATCC. Después de la fusión, las células de hibridoma resultantes se mantienen selectivamente en un medio de HAT, y después se clonan mediante dilución limitante como se describe en Wands et al (Gastroenterology 80:225-232 (1981)). Las células de hibridoma obtenidas mediante dicha selección se someten a prueba después para identificar clones que secretan anticuefos capaces de unirse a los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). La presente invención está dirigida a anticuerpos completamente humanos, generalmente aislados, que se unen inmunoespecíficamente a polípéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Esencialmente, las líneas de XenoMouse de ratones de Abgenix, Inc. (Fremont, CA) que expresan anticuefos humanos fueron inmunizadas con células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (para detalles de protocolos de inmunización, véase ejemplo 54); células de bazo y/o nodo linfático (que contienen céjulas B) se recuperaron de los ratones que tenían altos títulos de anticuefos antirecept r de quimiocina de proteína G (CCR5); y dichas células recuperadas se fusionaron con una línea de células de tipo mieloide para preparar líneas de células de hibridoma inmortales. Líneas de célula de hibridoma se separaron para seleccionar e identificar líneas de células de hibridoma que producían anticuerpos específicos al inmunógeno. Los inventores de la presente invención utilizaron estas técnicas de acuerdo con la presente invención para la preparación de anticuefos específicos para pofipéptidos receptores de quimiocina de proteína G (CCR5). Aquí, se describe la producción de líneas de células de hibridoma múltiples que producen anticuerpos específicos para polipéptidos de receptor de quimiocina deß proteína G (CCR5). Además, se provee una caracterización de los ahticuefos producidos por dichas líneas de células. Los apticuefos derivados de líneas de células de hibridoma que aquí se describen se listan en el cuadro 2. Los anticuefos preferidos de la invención incluyen anticuefos expresados por las siguientes líneas de células: cepas de XenoMouse XF11.1 D8, XF11.4D10, XF11.4C4, XF11.5H1 y XF11.1G8 de ratones de Abgenix, Inc. expresan cadenas ligeras kappa humanas con lgG1 , lgG2, o lgG4 humana. La cepa lgG2 que expresa se uso para hacer las líneas de células y anticuerpos de la presente invención, por lo que cada uno de los anticuerpos producidos por ias líneas de células son cadenas pesadas lgG2 completamente humanas con cadenas ligeras kappa humanas. Estas líneas de células de hlbridoma se depositaron en el American Type Culture Collection (Depósito Norteamericano de Cultivos Tipo o "ATCC") en la fecha listada en el cuadro 2, y se dan números de depósito de ATCC listados en el cuadro 2. El ATCC está ubicado en 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, EUA. El depósito de ATCC se hizo de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para propósitos de procedimiento de patente.

El hibridoma XF11.1 D8 se depositó en el ATCC el 7 de febrero de 2001 y se dio el número de depósito de ATCC PTA-3030. El hibridoma XF11.4D10 se depositó en el ATCC el 7 de febrero de 2001 y se dio el número de depósito de ATCC PTA-3026. El hibridoma XF11.4C4 se depositó en el ATCC el 7 de febrero de 2001 y se dio el número de depósito de ATCC PTA-3028. El hibridoma XF11.5H1 se depositó en el ATCC el 7 de febrero de 2001 y se dio el número de depósito de ATCC PTA-3029. El hibridoma XF11.1G8 se depositó en el ATCC el 7 de febrero de 2001 y se dio el número de depósito de ATCC PTA-3027. Los números de depósito de ATCC y las designaciones de hibridoma también se presentan en el cuadro 2.

CUADRO 2 líneas de células de hibridoma que expresan anticuerpos antireceptor de quimiocina de proteína G (CCR5) En una modalidad, la presente invención provee líneas de células de hibridoma que expresan un anticuerpo de la invención. En modalidades específicas, la línea de células de hibridoma de la invención es XF11.1D8. En otra modalidad específica, la línea de células de hlbridoma de la invención es XF11.4D10. En otra modalidad específica, la línea de células de hibridoma de la invención es XF11.4C4. En otra modalidad específica, la línea de células de hibridoma de la invención es XF11.5H1. En otra modalidad específica, la línea de células de hibridoma de la invención es XF11.1G8. La presente invención comprende anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden o que consisten alternativamente de fragmentos o variantes de anticuerpos de las mismas) que se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o un fragmento, variante o proteína de fusión del mismo. Un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) incluye pero no se limitan ai polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de SEQ ID NO: 2 o al polipéptido codificado por el ADN en el clon HDGNR10 contenido en el depósito de ATCC 97183 depositado el 1 de julio de 1995; el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se puede producir mediante expresión recombinante de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de SEQ ID NO: 2 o el ADN de HDGNR10 en el número de depósito de ATCC 97183. En una modalidad de la presente invención, los anticuerpos que se unen específicamente a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o un fragmento o variante del mismo, comprenden un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las cadenas pesadasexpresadas por lo menos por una de las líneas de células referidas en el cuadro 2 y/o cualquiera de las cadenas ligeras expresadas por lo menos por una de las líneas de células referidas en el cuadro 2. En otra modalidad de la presente invención, ios anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o un fragmento o variante del mismo, comprenden un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los dominios de VH de una cadena pesada expresada por lo menos por una de ias líneas de células referidas en el cuadro 2 y/o cualquiera de los dominios de VL de una cadena ligera expresada por lo menos por una de las líneas de células referidas en el cuadro 2. En las modalidades í " prefepdas, los anticuerpos de la presente invención comprenden la secuencia de aminoácidos de un dominio de VH y un dominio de VL expresado por ia misma línea de células seleccionada del grupo que consiste de líneas de células referidas en el cuadro 2. En modalidades alternativas, los anticuerpos de la presente invención comprenden la secuencia de aminoácidos de un dominio de VH y un dominio de VL de diferentes líneas de células referidas en el cuadro 2. Las moléculas que comprenden o que consisten alternativamente de fragmentos o variante de anticuefo del dominio de VH y/o VL expresados por lo menos por una de las líneas de células referidas en el cuadro 2 que se unen inmunoespecíficamente al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también son comprendidos por la invención, como lo son las moléculas de ácido nucleico que codifican estos dominios de VH y VL, moléculas, fragmentos y/o variantes. La presente invención también provee anticuefos que se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido, un fragmento o variante de polipéptido de un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), en donde dichos anticuerpos comprenden o consisten alternativamente de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de cualesquiera uno, dos, tres o más de los CDR de VH contenidos en una cadena pesada expresada por una o más líneas de células referidas en el cuadro 2. En particular, la invención provee anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), que comprenden o que consisten alternativamente de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de un CDR1 de VH contenido en una cadena pesada expresada por una o más líneas de células referidas en el cuadro 2. En otra modalidad, los anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprenden o alternativamente consisten de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un CDR2 de VH contenido en una cadena pesada expresada por una o más * líneas de células referidas en el cuadro 2. En una modalidad preferida, los anticuefos que se unen inmunoespecíficamente a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprenden o alternativamente consisten de un poiipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un CDR3 de VH contenido eñ una cadena pesada expresada por una o más líneas de células referidas en el cuadro 2. Las moléculas que comprenden o que consisten alternativamente de estos anticuefos, o fragmentos o variantes de los mismos, que se unen inmunoespecíficamente a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o un fragmento o variante de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) del mismo también son comprendidos por la invención, como lo son las moléculas de ácido nucleico que codifican estos anticuefos, moléculas, fragmentos y/o variantes. " La presente invención también provee anticuefos que se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido, o fragmento o variante de poíipéptido de un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), en donde dichos anticuerpos comprenden o alternativamente consisten de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de cualesquiera uno, dos, tres o más de los CDR de VL contenidos en una cadena ligera expresada por una o más líneas de células referidas en el cuadro 2. En particular, la invención provee anticuefos que se unen inmunoespecíficamente a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), qué comprenden o que consisten alternativamente de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un CDR1 de VL contenido en una cadena ligera expresada por una o más líneas de células referidas en el cuadro 2. En otra modalidad, los anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprenden o alternativamente consisten t de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un CDR2 de VL contenido en una cadena ligera expresada por una o más líneas de células referidas en el cuadro 2. En una modalidad preferida, los anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprenden o alternativamente consisten de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de un CDR3 de VL contenido en una cadena ligera expresada por una o más líneas de células referidas en el cuadro 2. Las , moléculas que comprenden o que consisten alternativamente de estos anticuefos o fragmentos o variantes de anticuerpo de las mismas, que se unen ínmunoespecíficamente a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o un fragmento o variante de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de ios mismos también son comprendidos por la invención, como lo son las moléculas de ácido nucleico que codifican estos anticuefos, c t moléculas, fragmentos y/o variantes. La presente invención también provee anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden o que consisten alternativamente de fragmentos o variantes de anticuerpo) que se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o un fragmento o variante de polipéptido de un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), en donde dichos anticuerpos comprenden o alternativamente consisten de uno, dos, tres o más CDR de VH y uno, dos, tres o más CDR de VL contenidos en una "cadena pesada o cadena ligera expresada por una o más líneas de células referidas en el cuadro 2. En particular, la invención provee anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido o fragmento o variante de polipéptido de un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), en donde dichos anticuefos comprenden o alternativamente consisten de un CDR1 de VH y un CDR1 de VL, un CDR1 de VH y un CDR2 de* VL, un CDR1 de VH y •X -r - . -un CDR3 de VL un CDR2 de VH y un CDR1 de VL, CDR2 de VH y CDR2 de VL, un CDR2 dé VH y un CDR3 de VL, un^CDR3 de VH y u? CDR1 de VH, un 1 " % - f" CDR3 de VH y un CDR2 de VL* un CDR3 de VH ^y un CDR3 de VL, o cualquier combinación de los mismos, de CDR de VH y CDR de VL contenidos en una cadena pesada o cadena ligera expresada por una o más * líneas de células referidas en el cuadro 2. En una modalidad preferida, una o ffiás de estas combinaciones son del mismo scFv como se describe en el cuadro 2. Las moléculas que comprenden o que consisten alternativamente de fragmentos o variantes de estos anticuerpos, que se unen inmunoespecíficamente a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también son comprendidas por la invención, como lo son las moléculas que codifican estos anticuerpos, moléculas, fragmentos o variantes.

^Mo'léculas de ácido nucleico que codifican anticuefos anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) correspondientes a anticuerpos derivados de cepas de Xenomouse ' La presente invención también provee moléculas de ácidos nucleicos, generalmente aisladas, que codifican un anticuefo de la invención (incluyendo moléculas que comprenden o que consisten alternativamente de " ir- ' fragmentos o variantes de anticuefo de las mismas). En una modalidad específica, una molécula de ácido nucleico de la invención codifica un antícuéfo (incluyendo moléculas que comprenden o que consisten > alternativamente de fragmentos o variantes de anticuerpo de las mismas), que comprenden o que consisten alternativamente de un dominio de VH que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de los dominios de VH y una _ » cadena pesada expresada por lo menos por una de las líneas de células referidas en el cuadro 2 y un dominio de VL que tiene una secuencia de aminoácidos de una cadena ligera expresada por lo menos por una de las líneas de células referidas en el cuadro 2. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico de la invención codifica un anticuerpo (incluyendo moléculas que comprenden o que consisten alternativamente de fragmentos o variantes de anticuefo de las mismas), que comprende o que consiste _ alternativamente de un dominio de VH que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de los dominios de VH de una cadena pesada expresada por lo menos por una de las líneas de células referidas en el cuadro 2 o un dominio de VL que tiene una secuencia de aminoácidos de una cadena ligera expresada por lo menos por una de las líneas de células referida en el cuadro 2. - La presente invención también provee anticuerpos que comprenden o que consisten alternativamente de variantes (incluyendo derivados) de las moléculas de anticuerpo (por ejemplo, los dominios de VH y/o dominios de VL) aquí descritos, dichos anticuerpos se unen inmunoespecíficamente a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o fragmento o variante del mismo. Técnicas estándares conocidas por los expertos en la técnica se pueden usar para introducir mutaciones en la i secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de la invención, incluyendo por ejemplo mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR que da por resultado sustituciones de aminoácidos. Preferiblemente, las variantes (incluyendo derivados) codifican menos de 50 sustituciones de aminoácidos, menos de 40 sustituciones de aminoácidos, menos de 30 sustituciones de aminoácidos, menos de 25 sustituciones de aminoácidos, menos de 20 sustituciones de aminoácidos, menos de 15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos o menos _ de 2 sustituciones de t aminoácidos en relación con el dominio de VH de referencia, CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, dominio de VL, CDR1 de VL, CDR2 de VL o CDR3 de VL. Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la cual el residuo de aminoácido es reemplazado por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral con una carga similar. Familias de residuos de aminoácidos que tienen dichas cadenas con cargas similares han sido Identificadas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, Jiistidina). Alternativamente, se pueden introducir mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia de codificación, tal como por mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes se pueden seleccionar para actividad biológica para identificar mutantes que retengan actividad (por ejemplo, la capacidad para unirse a un receptor de quimiocina de proteína G). Por ejemplo, es posible introducir mutaciones sólo en regiones de marco o sólo en regiones de CDR de una molécula de anticuerpo. Las mutaciones introducidas pueden ser mutaciones silenciosas o sin sentido neutras, es decir, que no tienen o que tienen poco efecto sobre la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno. Estos tipos de mutaciones pueden ser útiles para optimizar el uso de codones o mejorar la producción de un anticuerpo de hibridoma. Alternativamente, las mutaciones sin sentido no neutras pueden alterar la capacidad de un anticuefo para unirse a un antígeno. La locaiización de la mayoría de las mutaciones silenciosas y sin sentido neutras es probable que estén en las regiones del marco, mientras que la localización de la mayoría de las mutaciones sin sentido no neutras es probable que estén en CDR, aunque esto no es un requerimiento absoluto. Un experto en la técnica podría diseñar y someter a prueba moléculas mutantes con propiedades deseadas tales como no alteración en la actividad de unión a antígeno o alteración en la actividad de unión (por ejemplo, mejoras en una actividad de unión a antígeno o cambio en especificidad de anticuerpo). Después de la mutagénesis, la proteína codificada puede ser expresada rutinariamente y la actividad funcional y/o biológica de la proteína codificada (por ejemplo, la capacidad para unirse inmunoespecíficamente a un receptor de quimiocina de proteína G) se puede determinar usando técnicas aquí descritas o mediante técnicas rutinariamente modificables conocidas en la técnica. En una modalidad específica, un anticuefo de la invención "* * * * t (incluyendo una molécula que comprende o que consiste alternativamente de un fragmento de anticuerpo o variante del mismo), que se une .* inmunoespecíficamente a polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o fragmentos o variantes del mismo, comprende o alternativamente consiste de una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de : nucleótido que hibrida a una secuencia de nucleótido que es complementaria a la que codifica uno de los dominios de VH o VL expresados por una o más „X T líneas de células referidas en el cuadro 2. Bajo condiciones astringentes, por ejemplo hibridación a ADN unido a filtro en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6X a aproximadamente 45° C seguido por uno o más lavados en 0.2XSSC/0.1% de SDS a aproximadamente 50-65°C, bajo condiciones altamente astringentes, por ejemplo, hibridación a ácido nucleico unido a filtro en 6xSSC a aproximadamente 45°C seguido por uno o más lavados en 0.1Xssc/0.2% SDS a aproximadamente 68°C, o bajo otras condiciones de hibridación astringentes que son conocidas por un experto en la técnica rrr ' * (véase, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al., eds., 1989, Current Protocols in . . ^* Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, "Inc., New York en las páginas 6.3.1-6.3.6 y 2.10.3). Las moléculas de ácido nucleico "que* codifican estos anticuerpos también son comprendidas por la invención. -^»r •» Es bien sabido dentro de la técnica que los polipéptidos o fragmentos o variantes de los mismos, consecuencia de aminoácidos similares a menudo tienen estructura similar y muchos tienen las mismas actividades biológicas. Por lo tanto, en una modalidad, un anticuerpo (incluyendo una molécula que comprende o que consiste alternativamente de un fragmento o variante de anticuefo de la misma), que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o fragmentos o variantes de un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5),*comprende o altemativamente consiste de un dominio de VH que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de un dominio de VH de una cadena pesada expresada por io menos por una de las líneas de células preferidas en el cuadro 2. * '' En otra modalidad, un anticuefo (incluyendo una molécula que comprende o que consiste alternativamente de un fragmento o variante de anticuerpo de la misma), que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o fragmentos o variantes de un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), comprende o consiste alternativamente de un dominio de VL que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, "por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por io menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de un dominio de VL de una cadena ligera expresada por lo menos por una de las líneas de célula referidas en el cuadro 2.

• Polinucleótidos que codifican anticuerpos Los anticuefos de la invención (incluyendo fragmentos o variantes de los anticuerpos) se pueden producir por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, se apreciará que los anticuerpos de conformidad con la presente invención se pueden expresar en líneas de células distintas a las líneas de células de hibridoma. Las secuencias que codifican los ADNc o clones genómicos para los anticuerpos particulares se pueden usar para la transformación de células hospedero de mamífero o no de mamífero o para generar genotecas de despliegue de fago, por ejemplo. Además, los anticuefos de polipéptido de la invención se pueden sintetizar químicamente o producir mediante el uso de sistemas de expresión recombinante. Una forma de producir los anticuefos de la invención sería clonar los dominios de VH y/o VL expresados por cualesquiera uno o más de las líneas de células de hibridoma referidas en el cuadro 2. A fin de aislar los dominios de VH y VL de las líneas de células de la hibridoma, los iniciadores que incluyen secuencias de nucleótidos de VH o VL (véase ejemplo 55), se pueden usar para amplificar las secuencias de VH y VL expresadas contenidas en ARN total aislado de líneas de células de hibridoma. Los productos de PCR entonces se pueden clonar usando vectores, por ejemplo, que tienen un sitio de clonación de producto de PCR que consiste de un sólo nucleótido T 5' y 3' colgante, es decir complementario al nucieótido de .adenina individual colgante añadido al extremo 5' y 3' de productos de PCR -por muchas ADN polimerasas usadas para las reacciones de PCR. Los dominios de VH y VL se pueden secuenciar usando métodos convencionales usados en la técnica. Los genes de VH y VL clonados se pueden colocar en uno o más vectores de expresión adecuados. A manera de ejemplo no limitante, los iniciadores de PCR que incluyen secuencias de nucleótido de VH o VL, un sitio de restricción y una secuencia flanqueadora para proteger ai sitio de restricción se pueden usar para amplificar las secuencias de VH o VL.

Utilizando técnicas conocidas por los expertos en la técnica, los dominios de VH amplificados por PCR se pueden clonar en vectores que expresan la región constante de inmunoglobulina apropiada, por ejemplo, la región constante de lgG1 o lgG4 humana para dominios de VH y las regiones constantes kappa o lambda humanas para dominios de VL kappa y iambda, respectivamente. Preferiblemente, los vectores para expresar los dominios de VH o VL comprenden un promotor adecuado para dirigir la expresión de las cadenas pesada y ligera en el sistema de expresión escogido, una señal de secreción, un sitio de clonación para el dominio variable de inmunoglobulina, dominios constantes de inmunoglobulinas y un marcador de selección tal como neomicina. Los dominios de VH y VL también se pueden clonar en un solo vector que expresa las regiones constantes necesarias. Los vectores de conversión de cadena pesada y los vectores de conversión de cadena ligera son después co-transfectados a líneas de células para generar líneas de células estables o transitorias que expresan anticuerpos de longitud completa, por ejemplo, IgG, usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Guo et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 82:925-31 (1997), y Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-86 (1995) que se incoforan aquí por referencia en su totalidad). La invención provee además polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótido que codifica un anticuerpo de la invención y fragmentos del mismo. La invención también comprende polinucleótidos que hibridan bajo condiciones de hibridación astringentes o de astringencia inferior, por ejemplo, como se definió antes, a polinucleótidos que codifican un anticue.rpo, preferiblemente, que se unen específicamente a un polipéptido de la invención, preferiblemente un anticuefo que se une a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o un polipéptido codificado por el clon despositado. Los polinucleótidos se pueden obtener y la secuencia de aminoácidos de los polinucleótidos se puede determinar por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, si la secuencia de nucieótidos del anticuerpo se conoce, un polinucleótido que codifica el anticuerpo se puede ensamblar a partir de oligonucleótidos químicamente sintetizados (por ejemplo, como se describe en Kutmeier et al., BioTechnlques 17:242 (1994)), . Jy > que en brev implica la síntesis de oligoñucleótidos traslapables que >- 5 contienen porciones de la secuencia que codifica ei anticuerpo, templado y ligación de esos oligonucieótidos y después amplificación de los oligonucleótidos ligados por PCR. Alternativamente, un polinucleótido que codifica un anticuefo se puede gen -, e , rar a partir de ácido nuc —leico d #e una fuente adecuada. Si un clon •? *? * - -* _ , 0 que contiene un ácido nucleico que contiene un anticuerpo particular no está disponible, pero la secuencia de la molécula de anticuefo se conoce, un ácido nucleico que codifica la inmunoglobuiina se puede sintetizar químicamente u obtener a partir de una fuente adecuada (por ejemplo, una *- genoteca de ADNc de anticuefo, o una genoteca de ADNc generada a partir 5 de, o ácido nucleico, preferiblemente poli Á + ARN, aislado de cualquier tejido o células que expresen en anticuerpo, tales como células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuefo de la invención) por amplificación de PCR usando iniciadores sintéticos hibridables en los extremos 3' y 5' de la secuencia (véase ejemplo 55) o por clonación usando una sonda de 0 oiigonucleótidos específica para la secuencia de gen particular para identificar, * • por ejemplo, un clon de ADNc a partir de una genoteca de ADNc que codifica ,- t ~ * el anticuerpo. Los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR pueden -t- entonces ser clonados en vectores de clonación replicables usando cualquier •* * método bien conocido en la técnica. Una vez que la "secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos correspondiente del anticuerpo se determina, la secuencia de i nucleótidos del anticuefo se puede manipular usando métodos bien conocidos en la técnica para la manipulación de secuencias de nucleótidos, por ejemplo, técnicas de ADN recombinantes, mutagénesis dirigida al sitio, PCR, etc. (véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY y Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, que se incorporan aquí por referencia en su totalidad), para generar anticuefos que tienen secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo para crear sustituciones, -* ' deleciones y/o inserciones de aminoácidos. En una modalidad específica, las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de cadena pesada y/o ligera se pueden inspeccionara para identificar las secuencias de las regiones determinantes de 4 complementariedad (CDR) por métodos que son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante comparación con secuencias de aminoácidos * C I y í conocidas de otras regiones variables de cadena pesada y ligera para determinar las regiones de hipervariabilidad de secuencia. Usando técnicas de ADN recombinante, una o más de las CDR se pueden insertar dentro de regiones del marco por ejemplo en regiones de marco humanas para humanizar un anticuefo no humano, como se describió anteriormente. Las regiones de marco pueden ser regiones de marco que ocurren naturalmente o de consenso y preferiblemente regiones de marco humanas (véase, por ¿ , -* , ejemplo Chothia et al., J. Mol. Biol.. 278: 457-479 (1998) para un listado de regiones de marco humanas). Preferiblemente, el polinucieótido generado por la combinación de las regiones de marco y las CDR codifica un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido de la invención. Preferiblemente, como se describió antes, una o más sustituciones de aminoácidos se pueden hacer dentro de las regiones de marco y preferiblemente las sustituciones de aminoácidos mejoran la unión del anticuefo a su antígeno. Además, dichos métodos se pueden usar para hacer sustituciones o deleciones de aminoácidos de uno o más residuos de cisteína de región variable que participan en un enlace de disulfuro de intracadena para generar moléculas de anticuefo que carecen de uno o más enlaces de disulfuro de intracadena. Otras alteraciones al polinucleótido están comprendidas por la presente invención y están dentro del alcance de la técnica. : Para algunos usos, tales como para maduración de afinidad in vitro de un anticuefo de la invención, puede ser útil expresar los dominios de VH y VL de las cadenas pesada y ligera de uno o más anticuerpos de la invención como anticuerpos de cadena individuales o fragmentos Fab en una genoteca de despliegue de fago. Por ejemplo, los ÁDNc que codifican ios dominios de VH y VL de uno o más anticuerpos de la invención se pueden expresar en todas las combinaciones posibles usando una genoteca de despliegue de fagos, permitiendo la selección de combinaciones de VH? L f I que se unen a polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) con características de unión preferidas tales como afinidad mejorada o velocidades desactivadas mejoradas. Además, los segmentos de VH y VL -las regiones de CDR de los dominios de VH y VL de uno o más anticuerpos de la invención, en particular, pueden mutarse in vitro. La expresión de dominios VH y VL con CDR "mutantes" en una genoteca de despliegue de fagos permite la selección de combinaciones de VH/VL que se unen a polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) con características de unión preferidas tales como afinidad mejorada o velocidades desactivadas mejoradas. En los métodos de despliegue de fago, los dominios de anticuefo funcionales se despliegan en la superficie de las partículas del fago que portan las secuencias de polinucleótidos que ios codifican. En particular, las secuencias de ADN que codifican dominios de VH y VL se amplifican a partir de genotecas de ADNc animales (por ejemplo, genotecas de ADNc humanas o murinas de tejidos limfoides) o genotecas de ADNc sintéticas. El ADN que codifica los dominios de VH y VL se unen entre sí por un enlazador de scFv por PCR y se clonan en un vector fagémido (por ejemplo, pCANTAB 6 o pComb 3 HSS). El vector se somete a electroporación en E. coli y E. coli es infectada con fagos auxiliares. Los fagos en estos métodos son típicamente •fagos filamentosos que incluyen fd y M13 y los dominios de VH y VL ^t generalmente se fusionan recombinantemente ya sea al gen del fago II o al gen de fago VIII. El fago que expresa un dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno de interés (es decir, un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G o un fragmento del mismo) se puede seleccionar o ' identificar con un antígeno, por ejemplo, usando antígeno marcado o antígeno unido o capturado a una superficie sólida o esfera sólida. Ejemplos de métodos de despliegue de fagos que se pueden usar para hacer los anticuerpos de la presente invención incluyen pero no se limitan a aquellos descritos en Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187~9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); solicitud del PCT No. PCT/GB91/0 134; publicaciones del PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18719; WO 93/1 1236; WO 95/15982; WO 95/20401 W097/13844; y patentes de E.U.A. Nos. 5,698,426, 5,223,409; 5,403,484 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821 ,047; 5,571 ,698; 5,427,908; 5,516,717 - • 5,780,225; 5,658,727; 5,735,743 y 5,969,108; cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Además, las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 81 :851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)) por genes de empalme de una molécula de anticuefo de ratón de especificidad de antígeno apropiada junto con genes de una molécula de anticuefo humano de actividad biológica apropiada se pueden que aquí se describen así como mediante el uso de tecnología de ADN recombinante, como se describe más adelante. • ~ La expresión recombinante de un anticuefo de la invención, o fragmento, derivado, variante o análogo del mismo (por ejemplo, una cadena 5 pesada o ligera de un anticuerpo de la invención o un anticuefo de una sola cadena de la invención) requiere la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el anticuerpo. Una vez que un polinucleótido que codifica una molécula de anticuerpo o una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, o porción de la misma (preferiblemente que contiene 10 el dominio variable de cadena pesada o ligera) de la invención se ha obtenido, ^ ' X .y * , eí vector para la producción de la molécula de anticuerpos se puede producir . 7 ~ % - mediante tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas.

De esta manera, los métodos para preparar una proteína mediante expresión de un polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica 15 anticuerpo se describen aquí. Los métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica se pueden usar para construir vectores de expresión que contienen secuencias de codificación de anticuefo y señales de control de transcripción y traducción apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vivo, técnicas sintéticas y 20 recombinación genética in vivo. La invención, por lo tanto, provee vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de anticuefo de la invención, o una cadena pesada o ligera de la *- X ' * misma, o un dominio variable de cadena pesada o ligera, operablemente . enlazado a un promotor. Dichos vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (véase, por ejemplo, la publicación del PCT WO 86/05807; publicación del PCT WO 89/01036; y patente de E.U.A. No. 5,122,464) y el dominio variable del anticuerpo se puede clonar en dicho vector para la expresión de la cadena pesada o ligera entera. El vector de expresión es transferido a^ una célula hospedero mediante técnicas convencionales y las células transfectadas después son cultivadas mediante técnicas convencionales para producir un anticuefo de la invención. Por lo tanto, la invención incluye células hospedero que contienen un polinucleótido que codifica un anticuefo de la invención o una cadena pesada o ligera del mismo, o un anticuerpo de una sola cadena de la invención, operablemente enlazado a un promotor heterólogo. En modalidades preferidas para la expresión de anticuefos de doble cadena, los vectores que codifican las cadenas pesada y ligera se pueden co-expresar en ia célula hospedero para la expresión de la molécula de inmunoglobulina entera, como se detalla más adelante. Una variedad de sistemas de vector de expresión de hospedero se pueden utilizar para expresar las moléculas de anticuerpo de la invención. Dichos sistepias de expresión de hospedero representan vehículos por los i. , - i » cuales las secuencias de codificación de interésa se pueden producir y ' Z * ** "subsecuentemente purificar, pero también representan células que, cuando son transformadas o transfectadas con las secuencias codificadoras de nucleótidos apropiadas pueden expresar una molécula de anticuerpo de la invención in situ. Estos incluyen pero no se limitan a microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN bacteriófago recombinante, ADN de plásmido o ADN de cósmido que contienen secuencias de codificación de anticuerpo; levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresión de levadura recombinante que contienen secuencias de codificación de anticuefos; sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias de codificación de anticuefo; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de^ expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV o transformadas con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias de codificación de anticuerpos; o sistemas de células de mamíferos (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, 3T3, NSO) que portan construcciones de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor final de adenovirus; el promotor de virus de vaccinia 7.5K). Preferiblemente, las células bacterianas tales como Escherichia coli y muy preferiblemente células eucarióticas, especialmente para la expresión de molécula de anticuefb recombinante entera, se usan para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante. Por ejemplo, células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino (CHO), junto con un vector tal como el promotor de gen temprano intermedio mayor de citomegalovirus humano es un sistema de expresión efectivo para anticuerpos (Foecking, et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)). En sistemas bacterianos, un número de vectores de expresión se puede seleccionar ventajosamente dependiendo del uso destinado para que la molécula de anticuefo se exprese. Por ejemplo, cuando una gran cantidad de dicha proteína se va a producir, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, los vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que son fácilmente purificados pueden ser convenientes. Dichos vectores incluyen " pero no se limitan al vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2:1791 (1983)), en el cual la secuencia que codifica el anticuerpo se puede ligar individualmente en el vector en marco con la región de codificación lac Z por lo que se produce una proteína de fusión; vectores pIN - (Inouye & Inquye, Nucleic Acids Res. 13:1301-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)); y similares. Los vectores pGEX también se pueden usar para expresar poiipéptidos extraños como proteínas de*fr?sión con glutathione S-transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden ser fácilmente purificadas a partir de células usadas mediante adsorción y unión a las esferas de glutathione- agarosa de matriz mediante la elución en presencia dé glutathione libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir sitios de digestión por proteasa de trombina o factor Xa de modo que el producto de gen objetivo clonado puede ser liberado de la porción de GST. í 3 l ' Én un sistema de insecto, se usa un virus de polihedrosis nuclear ' c .. de Autographa californica (AcNPV) como un vector para expresar genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia de codificación de anticuerpo se puede clonar individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo el gen de polihedrina) del virus y colocarse bajo - rt t control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de polihedpna). , - "3 ' En células hospedero de mamífero, un número de sistemas de -* "i expresión basados en virus se pueden utilizar. En casos en los que se usa un adenovirus como un vector de expresión, la secuencia de codificación de ! __ anticuerpo de interés se puede ligar a un complejo de control de * transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, el promotor final y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico puede ser entonces ser insertado en el genoma de adenovirus por recombinación in vitro o m vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, región E1 o E3) dará por resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la j molécula de anticuerpo en hospederos infectados (véase, por ejemplo Logan & Shenk, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 :355-359 0984)). Las señales de iniciación específicas también pueden requerirse para la traducción eficiente de secuencias de codificación de anticuerpo insertadas. Estas señales incluyen las secuencias de codón de iniciación de ATG y adyacentes. Además, el codón de iniciación puede estar en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificación deseada para asegurar la traducción del inserto entero. Estas señales de control de traducción exógenas y codones de iniciación pueden ser de una variedad^ de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de expresión se puede incrementar mediante ia inclusión de elementos de incrementador de transcripción apropiados, ferminadores de transcripción, etc. (véase Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51 :544 (1987)). Además, se puede escoger una cepa de célula hospedero que module la expresión de las secuencias insertadas, o que modifique y procese el producto de gen en la forma específica deseada. Dichas modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, digestión) de productos de proteína pueden ser importantes para la función de la proteína. Las diferentes células hospedero tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento de postraducción y la modificación de proteínas y productos de genes. Las líneas de células apropiadas o sistemas de hospedero se pueden escoger para asegurar la modificación y procesamiento correctos de la proteína extraña expresada. Para este fin, ias células hospedero eucarióticas que poseen ia maquinaria celular para procesar apropiadamente la transcripción primaria, glicosilación y fosforilación del producto de genes se puede usar. Dichas células hospedero de mamífero incluyen pero no se limitan a CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138 y en particular líneas de células de cáncer de mama tales como, por ejemplo, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D y línea de célula de glándula mamaria normal, por ejemplo, CRL7030 y Hs578Bst. Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, las líneas de células que expresan establemente la molécula de anticuefo pueden ser genéticamente manipuladas. Más que usar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales, las células hospedero pueden ser transformadas con ADN controlado por elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, promotor, incrementador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN extraño, las células genéticamente manipuladas^ pueden dejarse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido, y después cambiarse a un medio selectivo. El marcador selectivo en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células se integren establemente al plásmido en sus cromosomas y crezca para formar focos que a su vez pueden ser clonados y expandidos en líneas de células. Este método puede usarse ventajosamente para manipular genéticamente líneas de células que expresen la molécula de anticuerpo.

Dichas líneas de células genéticamente manipuladas pueden ser particularmente útiles en la selección y evaluación de los compuestos que interactúan directamente o indirectamente con la molécula de anticuerpo. Se puede usar un número de sistemas de selección, incluyendo V »• J pero sin limitarse a timidina cinasa de virus de hefes simple (Wigler et al., Cell 11 :223 (1977)), genes de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 48:202 (1992)), y adenina fosforilrribosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22:817 (1980)) se pueden usar en células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. También se puede usar resistencia a antimetabolito con la base de selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al., Nati. Acad. Sci. EUA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); gpt, que confiere resistencia a ácido micofenolico (Mulligan & Berg, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 78:2072 (1981)); neo, que confiere resistencia a aminoglucósido G-418 Ciinical Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu Biotherapy 3:87-95 (1991)); Tolstoshev, Ann, Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); y Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); Mayo, 1993, TIB TECH 11 (5): 155-215); y hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de tecnología de ADB recombinante se pueden aplicar rutinariamente para seleccionar el clon recombinante deseado, y dichos métodos se describen, por ejemplo, en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wlley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); y en los capítulos 12 y 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981), que se incoforan aquí por referencia en su totalidad.

Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo se pueden incrementar mediante amplificación de vector (para una revisión, f ~ ** véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, vol. 3. (Academic Press, New York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa anticuerpo es ampiificable, incrementa en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de células hospedero incrementará el número de copias del gen marcado. Puesto que la región amplificada está asociada con el gen de anticuerpo, la producción de anticuerpo también incrementará (Crouse et al., Mo? Cell. Biol. 3:257 (1983)). Los vectores que usan glutamina sintasa (GS) o DHFR como los marcadores seleccionables se pueden amplificar en presencia de los fármacos metionina, sulfoximina o metotrexato, respectivamente. Una ventaja de los vectores basados en glutamina sintasa son la disponibilidad de líneas de células (por ejemplo, la línea de células de mieloma murina, NSO) que son negativos a glutamina sintasa. Los sistemas de expresión de glutamina sintasa también pueden funcionar en células que expresan glutamina sintasa (por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO)) proveyendo un inhibidor adicional para prevenir el funcionamiento del gen endógeno. Los vectores que usan glutamina sintasa como el marcador seleccionable incluyen pero no se limitan al vector de expresión pEE6 descrito en Stephens y Cockett, Nucí. Acids. Res 17:7110 (1989). Un sistema de expresión de glutamina sintasa y componentes del mismo se detallan en las publicaciones del PCT: WO87/04462; WO86/05807; WO89/01036; WO89/10404; y WO91/06657 que se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Además, los vectores de expresión de glutamina sintasa que se pueden usar de acuerdo con la presente invención están comercialmente disponibles de proveedores que incluyen, por ejemplo, Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH). La expresión y producción de anticuerpos monoclonales que usan un sistema de expresión de GS en células de mieloma murina se describen en Bebbington et al, Bio/technology 10:169(1992) y_en Biblia y Robinson Biotechnol. Prog. 11 :1 (1995) que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. La célula hospedero puede ser co-transféctada con dos vectores de expresión de la invención, ei primer vector codificando un polipéptido derivado de cadena pesada y el segundo vector codificando un polipéptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten la expresión ¡gual de polipéptidos de * cadena pesada y ligera. Alternativamente, se puede usar un sólo vector que codifique y que sea capaz de expresar tanto polipéptido de cadena pesada como ligera. En tales situaciones -,y la cadena ligera se colocaría a ; ntes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre de tóxico (Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Kohier, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 77:2197 (1980)). Las secuencias de codificación para las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc o ADN genómico.

Una vez que una molécula de anticuerpo de la invención ha sido producida por un animal, se ha sintetizado químicamente o se ha expresado recombinantemente, se puede purificar por cualquier método conocido en la técnica para purificación de una molécula de inmunoglobullna, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, intercambio de iones, afinidad, particularmente por afinidad para el antígeno específico después de la proteína A, y cromatografía de columna de dimensionamiento), centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpo de la presente jnvención o fragmentos de los mismos se pueden fusionar a secuencias de polipéptido heterólogo ? descritas aquí o de otra manera conocidas en la técnica, para facilitar la purificación.

Conjugados de anticuerpo La presente invención comprende anticuerpos recombinantemente fusionados o químicamente conjugados (incluyendo conjugaciones covalentes y no cóvalentes) a un poiipéptido (o porción del mismo, preferiblemente por lo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100 aminoácidos del polipéptido) de la presente invención para generar proteínas de fusión. La fusión no necesariamente tiene que ser directa, pero puede ocurrir a través de secuencias de enlazador. Los anticuerpos pueden ser i a específicos para antígenos distintos a los polipéptidos (o porción de los mismos, preferiblemente por lo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100 aminoácidos del polipéptido) de la presente invención. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden usar para dirigir los polipéptidos de la presente invención a tipos de células particulares, ya sea in vitro o in vivo, mediante fusión o conjugación de los poiipéptidos de la presente invención a anticuerpos específicos para receptores de superficie celular particular. Los polipéptidos y/o anticuerpos de la presente invención (incluyendo fragmentos o variantes de los mismos) se pueden fusionar ya sea al extremo N-terminal o C-terminal de la proteína heteróloga (por ejemplo, poiipéptido de inmunoglobulina Fc o un poiipéptido de albúmina de suero humano). Los anticuerpos de la invención también se pueden fusionar a albúmina (incluyendo pero sin limitarse a albúmina de suero humano recombinante (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,876,969, expedida el 2 de marzo de 1999, patente europea 0 413 622 y patente de E.U.A. No. 5,766,883, expedida el 16 de junio de 1998, incorporadas aquí por referencia en su totalidad)), dando por resultado polipéptidos quiméricos. En una modalidad preferida, los polipéptidos y/o anticuerpos de ia presente invención (incluyendo fragmentos o variantes de los mismos) se fusionan con la forma madura de albúmina de suero humano (es decir, aminoácidos 1 - 585 de albúmina de suero humano como se muestra en las figuras 1 y 2 de la patente europea 0 322 094) que se incofora aquí por referencia en su totalidad. En otra modalidad preferida, los polipéptidos y/o anticuefos de la presente invención (incluyendo fragmentos o variantes de los mismos) se fusionan con fragmentos de polipéptido que comprenden o que consisten alternativamente de residuos de aminoácidos 1-z de albúmina de suero, en donde z es un entero de 369 a 419, como se describe en la patente de E.U.A. 5,766,883 incoforada aquí por referencia en su totalidad. Los polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de la Invención también son comprendidos por la invención. Dichas proteínas de fusión por ejemplo pueden facilitar la purificación y pueden incrementar la vida media in vivo. Los anticuerpos fusionados p conjugados a los polipéptidos de la presente invención también se pueden usar en inmunoensayos in vitro y métodos de purificación usando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Harbor et al., anterior, y publicación del PCT WO 93/21232; EP 439,095; Naramura et al., Immunol.

Lett. 39:91-99 (1994); patente de E.U.A. 5,474,981; Gillies et al., PNAS 89:1428-1432 (1992); Fell et al., J. Immunol. 146:2446-2452 (1991 ), que se incorporan aquí por referencia en su totalidad. La presente invención incluye además composiciones que comprenden los polipéptidos de la presente invención fusionados o conjugados a dominios de anticuefo distintos a las regiones variables. Por ejemplo, los polipéptidos de la presente invención se pueden fusionar o conjugar a una región de anticuefo Fc, o una porción del mismo. La porción de anticuefo fusionada a un polipéptido de la presente invención puede comprender la región constante, región de bisagra, dominio de CH1 , dominio de CH2 y dominio de CH3 o cualquier combinación de dominios enteros o porciones de los mismos. Los polipéptidos también se pueden fusionar o conjugar a las porciones de anticuefo anteriores para formar multímeros. Por ejemplo, las porciones Fc fusionadas a los polipéptidos de la presente . invención pueden formar dímeros a través de enlaces de disulfuro entre las ; porciones de Fc. Las formas multiméricas superiores se pueden hacer fusionando los polipéptidos a porciones de IgA e IgM. Los métodos para fusionar o conjugar ios polipéptidos de la presente invención a porciones de anticuefo se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, patente de E.U.A.

No. 5,336,603; 5,622,929; 5,359,046; 5,349,053; 5,447,851 ; 5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; publicaciones del PCT WO 96/04388; WO" 91/06570; Ashkenazi et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:10535-10539 (1991); Zheng et al., J. Immunol. 154:5590-5600 (1995); y Vil et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89:11337-11341 (1992) (dichas referencias incorporadas aquí en su totalidad). Como se describió anteriormente, los polipéptidos correspondientes a un poiipéptido, fragmento de polipéptido o una variante de SEQ ID NO:2 o del polipéptido codificado por el clon depositado se pueden fusionar o conjugar a las porciones de anticuerpo anteriores para incrementar la vida media in vivo de los polipéptidos o para usarse en inmunoensayos usando métodos conocidos en la técnica. Además, los polipéptidos correspondientes a SEQ ID NO:2 o al polipéptido codificado por el clon depositado se pueden fusionar conjugar a las porciones de anticuerpo anteriores para ^facilitar la purificación. Un ejemplo reportado describe proteínas quiméricas que consisten de ios dos primeros dominios del CDR- polipéptido y varios dominios "de las regiones constantes de las cadenas -i pesada o ligera de inmunoglobulinas de mamífero (EP 394,827; Traunecker et al., Nature 331 :84-86 (1988). Los polipéptidos de la presente invención fusionados o conjugados a un anticuerpo que tiene estructuras diméricas * enlazadas por disulfuro (debido a la IgG) también pueden ser más eficientes en unirse y neutralizar a otras moléculas, que la proteína secretada monomérica o el fragmento de proteína solo (Fountoulakis et al., J. Biochem. 270:3958-3964 (1995)). En muchos casos, ia parte Fc en una proteína de fusión es benéfico en terapia y diagnóstico y por lo tanto puede dar por resultado, por ejemplo, propiedades farmacocinéticas mejoradas (EP A 232,262). Alternativamente, la deleción de la parte Fc después de que la proteína dé fusión se ha expresado, detectado y purificado, sería deseada. . - _, Por ejemplo, la porción Fc puede impedir la terapia y diagnóstico si se usa la i-proteina de fusión como un antigeno para inmunizaciones. En el descubrimiento del fármaco, por ejemplo, las proteínas humanas tales como í hlL-5 se han fusionado con porciones Fc para el propósito de prueba de selección de alto rendimiento para identificar antagonistas de hlL-5. (Véase Bennett et al., J. Molecular Recognition 8:52-58 (1995); Johanson et al., J. Biol. Chem. 270:9459-9471 (1995). Más aún, los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la presente invención se pueden fusionar a secuencias marcadoras tales como un péptido para facilitar la purificación. En modalidades preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadores es un péptido de hexa-histidina, tal como la etiqueta provista en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Como se describe en Gentz et al., Proc. Nati.

Acad. Sci. EUA 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina provee purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras etiquetas de péptido t útiles para la purificación incluyen pero no se limitan a la etiqueta de "HA", que corresponde a un epítope derivado de la proteína de hemaglutinina de Influenza (Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) y la etiqueta de "bandera". La presente invención también comprende anticuefos o fragmentos de los mismos conjugados a un agente de diagnóstico o terapéutico. Los anticuefos se pueden usar en diagnóstico, por ejemplo, para monitorear el desarrollo o progreso de un tumor como parte de un procedimiento de prueba clínica para determinar, por ejemplo, la eficacia de un régimen de tratamiento. La detección se puede facilitar acoplando el anticuerpo a una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radioactivos, metales emisores de positrones usando varias tomografías de emisión de positrones, así como* iones metálicos paramagnétíco Ts no radioactivos. La sustancia detectable se puede acoplar o conjugar ya sea directamente al anticuerpo (o fragmento del mismo) o indirectamente a través de un intermediario (tal como, por ejemplo, un enlazador conocido en la técnica) usando técnicas conocidas en el campo. Véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 4,741 ,900, para iones metálicos que se pueden conjugar a anticuerpos para usarse como diagnóstico de acuerdo con la presente invención. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados ¡ncluyen umbeliferona, fluorescina, isotiocianato de fluorescina, rodamina, fluorescina de diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o picoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luclferesa, luciferina y aequorina; y ejemplos de material radioactivo adecuado incluyen yodo (121l, 123l, 125l, 131l), carbono (1 C), azufre (35S), tritio (3H), indio (111ln, 12ln, 113mln, 1 5mln), tecnetlo ("Tc, 99mTc), talio (20 T¡), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), moiibdeno (99Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh y 97Ru; En modalidades específicas, los polípéptidos de CCR5 y/o CCR5SV de la invención se unen a quelatadores macrocíclicos útiles para conjugar iones, incluyendo pero sin limitarse a 111ln, 77Lu, 90Y, 166Ho y 153Sm, a polipéptidos. En una modalidad preferida, el ion radiometálico asociado con los quelatadores macrocícllcos unidos a polipéptidos de CCR5 y/o CCR5SV de la invención es 111ln. En otra modalidad preferida, el ¡ón radiometállco asociado con el quelatador macrocíclico unido a polipéptidos de CCR5 y/o CCR5SV de la invención es 90Y. En modalidades específicas, el quelatador macrocíclico es ácido 1 , 4,7,10-tetraazacicIododecano-N,N',N",N",-tetraacético (DOTA). Én otras modalidades específicas, el DOTA se une al polipéptido de CCR5 y/o CCR5SV de la invención a través de una molécula enlazadora. Ejemplos de moléculas enlazadoras útiles para conjugar DOTA a un polipéptido se conocen comúnmente en la técnica -véase, por ejemplo, DeNardo et ai., Clin Cáncer Res. 4(10):2483-90; Petérson et al., Bioconjug. Chem. 10(4):553-7, 1999; y Zimmerman et al., Nucí. Med. Biol. 26(8)943-50, 1999 que se incoforan aquí por referencia en su totalidad. Además, las patentes de É.U.A. 5,652,361 y 5,756,065 que describen agentes quelatadores que se pueden conjugar anticuefos, y métodos para hacerlos y usarlos, se incoforan aquí por referencia en su totalidad. Aunque las patentes de E.U.A. 5,652,361 y 5,756,065 se enfocan en la conjugación de agentes quelatadores a anticuefos, un experto en la técnica podría adaptar fácilmente los métodos que aquí se describen para conjugar agentes quelatadores a otros polipéptidos. Una citotoxina o un agente citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial para las células. Ejemplos incluyen paclitaxol, citocalasin B, gramicidina D, bromuro de etilo, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrrubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocortic?ides, procaína, tetracaina, lidocaína, propanolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen pero no se limitan a antimetabolitos, (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracildecarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclotosfamlda, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cís-platino de diclorodiamina (II) (DDP) cisplatln), antraciclinas (por ejemplo, danorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC), y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). 'Los conjugados de anticuefo de la invención se pueden usar para modificar una respuesta biológica dada, el agente terapéutico o porción de fármaco no puede' considerarse como limitada a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la porción de fármaco puede ser una proteína o poiipéptido que posea una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir/por ejemplo, una toxina tal como abrina y ricina A, exotoxina de 4 pseudomonas, o toxina de difteria; una proteína tal factor de necrosis tumoral, a-interferón, J3-interferón, factor de crecimiento de nervio, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador de plasminógeno de tejido, un agente apoptótico, por ejemplo, FNT-alfa, FNT-beta, AIM I (véase publicación internacional No. WO 97/33899), AIM II (véase publicación internacional No. WO 97/349"11), ligando de Fas (Takahashi et al., Int. Immunol. 6:1567-1574 (1994)), VEGI (véase publicación internacional No. WO 99/23105), un agente trombótico o un agente antiangiogénico, por ejemplo, angiostatina o en endostatina; o modificadores de respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfocina, interleucina-1 ("1L-1"), interleucina-2 ("IL-2"), ¡nterleucina-6 ("IL-6"), * -factor estimulante de colonia de macrófagos de granulocitos ("GM-CSF"), factor de estimulación de colonia de granulocitos ("G-CSF"), u otros factores de crecimiento. Los anticuefos también se pueden unir a soportes sólidos que son particularmente útiles para inmunoensayos o purificación del antígeno objetivo. Dichos soportes sólidos incluyen pero no se limitan a vidrio, celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno. Las técnicas para conjugar dicha porción terapéutica a anticuerpos son bien conocidas, véase, por ejemplo Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.) pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug « 7 ' Delivery (2a. Ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Citotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospectíve Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.) págs. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., 'The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", immunol. Rev. 62:119-58 (1982). Alternativamente, un anticuefo se puede conjugar a un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo como lo describe Segal en la patente de E.U.A. No. 4,676,980, qué se incorpora aquí por referencia en su totalidad. „ Un anticuerpo con o sin una porción terapéutica conjugada al mismo, administrado solo o en combinación con un factor (es) citotóxico y/o citocina (s) se pueden usar como un compuesto terapéutico.

Inmunofenotipificación Los anticuerpos de la invención se pueden usara para inmunofenotipificación de líneas de células y muestras biológicas. El producto de traducción del gen de la presente invención puede se útil como un marcador específico de células o muy específicamente como un marcador celular que se expresa de manera diferente en varias etapas de diferenciación y/o maduración de tipos de células particulares. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra un epítope específico, o combinación de epítopes, permitirá la selección de poblaciones celulares que expresan el marcador. Se pueden utilizar varias técnicas usando anticuerpos monoclonales para seleccionar las poblaciones celulares que expresan el marcador(es) e incluyen separación magnética usando esferas magnéticas revestidas con anticuerpo, "selección no . específica" con anticuerpo unido a una matriz sólida (es decir placa), y citometría de flujo (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. 5,985,660; y Morrison et al., 96:737-49(1999)). Estas técnicas permiten la selección de poblaciones particulares de células, tal como se podría encontrar con malignidades hematológicas (es decir, enfermedad residual mínima MRD) en pacientes con leucemia aguda) y células "no propias" en transplantes para prevenir enfermedades de injerto versus hospedero (GVHD). Alternativamente, estas técnicas permiten la selección de células madre y progenitoras hematopoyéticas capaces de sufrir proliferación y/o diferenciación como se podría encontrar en la sangre de cordón umbilical humano.

Pruebas para unión de anticuerpos Los anticuefos de la invención se pueden someter a prueba para unión inmunoespecífica por cualquier método conocido en la técnica. Los inmunoensayos que se pueden usar incluyen pero no se limitan a sistemas de prueba competitivos y no competitivos usando técnicas tales como análisis de BIAnúcleo (véase por ejemplo, ejemplo 59), análisis de FACS (distribuidor de células activadas por fluorescencia) (véase por ejemplo, ejemplo 54), inmunofluorescencia (véase por ejemplo, ejemplo 56), inmunocitoquímica, western blot (ejemplo 64 y 65), radioinmunoensayos, ELISA (prueba inmunoabsorbente ligada a enzimas) (véase por ejemplo, ejemplo 54), ínmunoensayos "intercalados", pruebas de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina de difusión de gel, pruebas de inmunodifusión, pruebas de aglutinación, pruebas de fijación de complemento, pruebas ¡nmunorradiométricas, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A, para nombrar unas cuantas. Dichas pruebas son rutinarias y bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds, 1994; Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1 , John Wiley & Sons, Inc., New York, que se incofora aquí por referencia en su totalidad). Inmunoensayos ilustrativos se describen en forma breve más adelante (pero no pretenden se de ninguna manera limitantes). Los protocolos de inmunoprecipitación generalmente comprenden la lisis de una población de células en un regulador de pH de lisis tal corno regulador de pH RIPA (1% de NP-40 o Tritón X- 100, 1 % de desoxicolato de sodio, 0.1% de SDS, 0.15 M de NaCI, 0.01 M de fosfato de sodio a un pH de 7.2, 1% de trasilol) complementado con inhibidores de proteína fosfatasa y/o proteasa (por ejemplo EDTA, PMSF, aprotinina, vanadato de sodio), añadiendo el anticuerpo de interés al lisado de células, incubando durante un periodo (por ejemplo, 1-4 horas) a 4°C, añadiendo esferas de sefarosa de proteína A y/o proteína G al lisado de células, incubando durante aproximadamente una hora o más a 4°C, lavando las esferas en reguiador de pH de lisis y resuspendiendo las esferas en un regulador de pH de SDS/muestra. La capacidad del anticuerpo de interés para inmunoprecipitar un antígeno particular se puede evaluar, por ejemplo, mediante análisis de Western blot. Un experto en la técnica reconocería los parámetros que podrían se modificados para incrementar la unión de anticuefo a un antígeno y disminuir el fondo (por ejemplo, preaclaramiento del lisado de células con esperas de sefarosa). Para una descripción adicional referente a protocolos de inmunoprecipitación, véase Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols ¡n Molecular Biology, Vol. 1 , John Wiley & Sons, Inc., New York en 10.16.1. El análisis dé Western blot generalmente consiste en preparar muestras de proteína; electroforesis de proteína en un gel e poliacrilamida (por ejemplo, 8%- 20% de SDS-PAGE dependiendo del peso molecular del antígeno), transfiriendo la muestra de proteína de gel poiiacrilamida a una membrana tal como nltroceíulosa, PVDF o nylon, bloqueando la membrana en una solución bloqueadora (por ejemplo, PBS con 3% de BSA o leche descrer ata), lavando la membrana en regulador de pH de membrana (por ejemplo, PBS-Tween 20), bloqueando las membranas con anticuerpo primario (ef anticuefo de interés) diluido en regulador de pH bloqueador, lavando la membrana en reguiador de pH de lavado, bloqueando la membrana con un anticuefo secundario (que reconoce el anticuerpo primario, por ejemplo, un anticuefo antihumano) conjugado a un sustrato enzimático (por ejemplo, peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina) o una molécula radioactiva (por ejemplo 32P o 1251) diluida en regulador de pH bloqueador, lavando la X membrana en regulador de pH de lavado y detectando la presencia del antígeno. Un experto en la técnica reconocería los parámetros que podrían s r modificados para incrementar la señal detectada y reducir el ruido de fondo. Para una discusión referente a protocolos de western blot véase, por ejemplo Ausubel, et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York en 10.8.1.

ELISA consiste en preparar antígeno, recubrir el pozo de una placa de microtitulación de 96 pozos con el antígeno, añadir el anticuerpo de interés conjugado a un compuesto detectable tal como un sustrato enzimático (por ejemplo, peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina) al pozo e incubar durante un periodo y detectar la presencia del antígeno. En ELISA el anticuefo de interés no tiene que ser conjugado a un compuesto detectable; en vez de ello, un segundo anticuefo (que reconoce el anticuefo de interés) conjugado a un compuesto detect ble se puede añadir al pozo. Además, en vez de revestir el pozo con el antígeno, el anticuerpo se puede revestir al pozo. En este caso, un segundo anticuerpo conjugado a un compuesto detectable se puede añadir después de la adición del antígeno de interés al pozo revestido. Un experto en la técnica reconocería los parámetros que pueden ser modificados para incrementar la señal detectada así como otras variaciones de ELISA conocidas en la técnica. Para una descripción adicional referente a ELISA, véase, por ejemplo, Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1 , John Wiley & Sons, Inc., New York en 11.21.1. La afinidad de unión de un anticuefo a un antígeno y la velocidad desactivada de una interacción de anticuefo-antígeno se pueden determinar mediante pruebas de unión competitivas. Un ejemplo de una prueba de unión competitiva en un radioinmunoensayo que comprende la incubación de antígeno marcado (por ejemplo 3H ó T25l), o fragmento o variante del mismo, con el anticuefo de interés en presencia de cantidades cada vez mayores de antígeno no marcado, y la detección del anticuefo unido al antígeno marcado. La afinidad del anticuefo de interés para un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) y las velocidades desactivadas de unión se pueden determinar a partir de los datos por análisis de scatchard. La competencia con un segundo anticuerpo también se puede determinar usando radioinmunoensayos. En este caso, el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se incuba con el anticuerpo conjugado a un compuesto marcado (por ejemplo, un compuesto marcado con 3H ó 125l) en presencia de cantidades cada vez mayores de un segundo anticuerpo no marcado. Este tipo de prueba competitiva entre dos anticuerpos también se puede usar para determinar si dos anticuerpos se unen al mismo epítope o a diferentes epítopes. En una modalidad preferida, se usa análisis cinético de BIAnúcleo para determinar las velocidades activada y desactivada de unión de los anticuefos (incluyendo fragmentos o variantes de anticuefo de los mismos) a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o fragmentos de un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). El análisis cinético de BIAnúcleo consiste en analizar la unión y disociación de anticuefos de obleas con receptores de quimiocina de proteína G inmovilizados (CCR5) sobre su superficie como se describe en el ejemplo 59.

Usos terapéuticos La presente invención está dirigida además a terapias basadas en anticuerpo que implican la administración de anticuefos de la invención a un paciente animal, preferiblemente mamífero y muy preferiblemente un humano para tratar uno o más de las enfermedades, trastornos o condiciones descritas. Los compuestos terapéuticos de la invención incluyen pero no se limitan anticuerpos de la invención (incluyendo fragmentos, análogos y derivados de los mismos como se describe aquí) y ácidos nucleicos que codifican anticuefos de la invención (incluyendo fragmentos, análogos y derivados de los mismos y anticuefos antiidiotípicos como se describe aquí). Los anticuerpos de la invención se pueden tratar, inhibir o prevenir enfermedades trastornos o condiciones asociadas con expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de la invención, incluyendo pero sin limitarse a cualesquiera una o más de las enfermedades, trastornos o condiciones que aquí se describen. El tratamiento y/o prevención de enfermedades, trastornos o condiciones asociadas con expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de la invención incluyen pero no se limitan a aliviar síntomas asociados con esas enfermedades, trastornos o condiciones. Los anticuerpos de la invención se pueden proveer en composiciones farmacéuticamente aceptables como se conoce en la técnica o como se describe aquí. Un resumen de las formas en las cuales los anticuefos de la presente invención se pueden usar terapéuticamente incluye unir polinucleótidos o polipéptidos de la presente invención localmente o sistémicamente en el cuefo o por citotoxicidad directa del anticuerpo, por ejemplo, como se mide por complemento (CDC) o por células efectoras (DAC). Algunos de estos enfoques se describen con más detalle más adelante. Auxiliado con las enseñanzas que aquí se proveen, un experto en la técnica sabrá cómo usar ios anticuefos de la presente invención para propósitos de diagnóstico, monitoreo o terapéuticos sin experimentación suficiente. Los anticuerpos de esta invención se pueden utilizar ventajosamente en combinación con otros anticuerpos monoclonales o quiméricos, o con linfocinas o factores de crecimiento hematopoyéticos (tales como, por ejemplo IL-2, 1L-3 y IL-7), por ejemplo, que sirven para incrementar el número o actividad de células efectoras que actúan con los anticuefos. Los anticuefos de la invención se pueden administrar solos o en combinación con otros tipos de tratamiento (por ejemplo, terapia de radiación, quimioterapia, terapia hormonal, inmunoterapia, agentes antitumorales y agentes antirretrovirales (véase ejemplo 28 más adelante). En una modalidad altamente preferida, los anticuefos de la invención se pueden administrar solos o en combinación con y agentes antirretrovirales (véase ejemplo 28 más adelante). Generalmente, la administración de productos de origen de especie o reactividad de especie (en el caso de los anticuefos) es la misma especie que fa del paciente es preferida. Por lo tanto, en una modalidad preferida, anticuerpos humanos, derivados de fragmentos, análogos o ácidos nucleicos se administran a un paciente humano para terapia o profilaxis.

Se prefiere usar anticuerpos de inhibición y/o neutralización de I . ? alta afinidad y/o" potentes contra polipéptidos o polinucleótidos de la presente invención, fragmentos o regiones de los mismos, tanto para inmunoensayos dirigidos a y terapia de trastornos relacionados con polinucleótidos o poiipéptidos, incluyendo fragmentos de los mismos de la presente invención. Dichos .anticuerpos, fragmentos o regiones preferiblemente tendrán una afinidad para polinucleótidos o polipéptidos de la invención, incluyendo fragmentos de los mismos. Las afinidades de unión preferidas incluye aquellas con una constante de disociación o Kd menor que 5 I O"2 M, 10"2 M, 5 X 10"3 M, 10'3 M, 5 X 10"4 M, 10"4 M. Afinidades de unión más preferidas ¡ncluyen aquellas con una constante de disociación o Kd menores que 5 X 10"5 M, 10"5 M,*5 X 10"6 M, 10-* M, 5 X 10"7 M, 10"7 M, 5 X 10"8 M ó 10"8 M. Afinidades de unión más preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd menores que 5 X 10"9 M, 10"9 M, 5 X 10"10 M, 10"10 M, 5 X 10"11 M, 5 X 10"12 M, 10-12 M, 5 X 10"13 M, 10"13 M, 5 X 10"14 M, 10"14 M, 5 X 10"15 M, ó 10"15 M.

Terapia qénica En una modalidad específica, los ácidos nucleicos que comprenden secuencias que codifican ahticuefos o derivados funcionales de los mismos se administran para tratar, inhibir o prevenir una enfermedad o trastorno a asociado con expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido > de la invención, por medio de terapia génica. La terapia génica se refiere a terapia realizada ai administrar a un sujeto un ácido nucleico expresado o expresablé. En esta modalidad de la invención, los ácidos nucleicos producen su proteína codificada que es mediadora de un efecto terapéutico. Cualesquiera de los métodos para terapia" génica disponible en la técnica se puede usar de acuerdo con la presente invención. Más adelante se describen métodos ilustrativos. "2 * Para revisiones generales de los métodos de terapia génica, véase Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu y Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573- * 596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993);* y Morgan y Anderson, - -*. ? -*r? Ann. Rev. Biochem. 62: r191-217 (1993); May, TIBTECH 11 (5):155-215 (1993).

Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de tecnología de ADN recombinante que se pueden usar se describen Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993) y Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). En un aspecto preferido, el compuesto comprende secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo, dichas secuencias de ácido nucleico siendo parte de vectores de expresión que expresan el anticuerpo o fragmentos o proteínas quiméricas o cadenas pesadas o ligeras del mismo en un hospedero adecuado. En particular, dichas secuencias de ácido nucleico tiene promotores operablemente enlazados a la región de codificación de *>f - anticuerpo, dicho promotor siendo inducible o constitutivo y opcionalmente específico de tejido. En otra modalidad particular, se usan moléculas de ácido nucleico en las cuales las secuencias que codifican anticuefo y cualesquiera otras secuencias deseadas son flanqueadas por regiones que promueven recombinación homologa en un sitio deseado en el genoma, proveyendo así expresión intracromosomal de ios ácidos nucleicos que codifican anticuerpo (Koller y Smithies, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989). En modalidades específicas, la molécula de anticuerpo expresada es un anticuefo de una sola cadena; alternativamente, las secuencias de ácido nucleico incluyen secuencias que codifican tanto cadenas pesadas como ligeras, o fragmentos de las mismas, del anticuerpo. El suministro de ios ácidos nucleicos a un paciente puede ser directo, en cuyo caso el paciente es directamente expuesto al ácido nucleico o vectores portadores de ácido nucleico, o indirecto, en el caso en que las células son primero transformadas con los ácidos nucleicos in vitro y después trasplantadas al paciente. Estos dos enfoques se conocen respectivamente como terapia génica in vivo o ex vivo. En una modalidad específica, las secuencias de ácido nucleico se administran directamente in vivo, en donde se expresa para producir el producto codificado. Esto se puede lograr por cualquiera de los métodos numerosos conocidos en la técnica, por ejemplo construyéndolos como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolo de modo que sea intracelular, por ejemplo, por infección usando vectores retrovirales defectuosos o atenuados u otros vectores virales (véase patente de E.U.A. No. 4,980,286), o por inyección directa de ADN desnudo, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola de genes; Biolistic, Dupont), o revistiendo con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transfección, encapsulación en liposomas, micropartícuias o microcápsulas, o administrándolos en unión a un péptido que se sabe que entra al núcleo, administrándolo en unión a un ligando sometido a endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)) (que se puede usar para dirigir tipos de células que expresan específicamente los receptores), etc. En otra modalidad, se pueden formar complejos de ácido nucleico-ligando en los cuales el ligando comprende un péptido viral fusogénico para alterar endosomas, permitiendo al ácido nucleico evitar degradación lisosomal. En otra modalidad, el ácido nucleico se puede dirigir in vivo para absorción y expresión específica de células, dirigiendo un receptor específico (véase, por ejemplo, publicaciones del PCT WO 92/06180; WO 92/22635; WO92/20316; W093/14188; WO 93/20221). Alternativamente, el ácido nucleico se puede introducir intracelularmente e incorporar dentro del ADN de la célula hospedero para expresión, mediante recombinación homologa (Koller y Smithies, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)). En una modalidad específica, ios vectores virales que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo de la invención se utilizan. Por ejemplo, se puede usar un vector retroviral (véase Miller et al., Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)). Estos vectores retrovirales contienen los componentes necesarios para el empaque correcto del genoma viral e integración en el ADN de la célula hospedero. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo que se va a usar en terapia génica se clonan en uno o más vectores, lo que facilita el suministro del gen a un paciente. Más detalles acerca de vectores retrovirales se pueden encontrar en Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994), que describe el uso de un vector retroviral para suministrar el gen mdrl a células madre hematopoyéticas a fin de hacer las células madre más resistentes a quimioterapia. Otras preferencias que ilustran el uso de vectores retrovirales en terapia génica son: Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons y Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); y Grossman y Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114(1993). Los adenovirus son otros vectores virales que se pueden usar en terapia génica. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos para suministrar genes a epitelio respiratorio. Los adenovirus que infectan naturalmente epitelios respiratorios en donde causan una enfermedad moderada. Otros objetivos para sistemas de suministro basados en adenovirus son hígado, el sistema nervioso central, células endoteliales y músculo. Los adenovirus tienen la ventaja de ser capaces de infectar células que no están en división. Kozarsky y Wilson, Cunent Opinión in Genetis and Development 3:499-503 (1993) presentan una revisión de terapia génica basada en adenovirus. Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) demostraron el uso de vectores de adenovirus para transferir genes al epitelio respiratorio de monos rhesus. Otros ejemplos del uso de adenovirus en terapia génica se pueden encontrar en Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); publicación del PCT W094/12649; y Wang, et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995). En una modalidad preferida, se usan vectores de adenovirus. El virus adeno-asociado (AAV) también se ha propuesto para usarse en terapia génica (Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993); patente de E.U.A. No. 5,436,146). Otro enfoque a la terapia génica implica transferir un gen a células en cultivo de tejido por métodos tales como electroporación, lipofección, transfección mediada por fosfato de calcio o infección viral. Por lo general, el método de transferencia incluye la transferencia de un marcador seleccionable a las células. Las células son después colocadas bajo selección para aislar aquellas células que han sido absorbidas y están expresando el gen transferido. Aquellas células después son suministradas a un paciente. En esta modalidad, el ácido nucleico se introduce en una célula antes de administrarse in vivo la célula recombinante resultante. Dicha introducción se puede llevar a cabo por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector viral o de bacteriófago que contiene las secuencias de ácido nucleico, fusión celular, transferencia de gen mediada por cromosoma, transferencia de gen mediada por microcélula, fusión de esferoplasto, etc. Numerosas técnicas se conocen en la técnica para la introducción de genes extraños en células (véase, por ejemplo, Loeffler y Behr, Meth. Enzymol. 217:599-618 (1993); Cohén et al., Meth. Enzymol. 217:618-644 (1993); Cline, Pharmac. Ther. 29:69-92m (1985) y se pueden usar de acuerdo con la presente invención, siempre que las funciones de desarrollo y fisiológicas necesarias de las células receptoras no sean alteradas. La técnica deberá proveer la transferencia estable del ácido nucleico a la célula, por lo que el ácido nucleico es expresable por la célula y preferiblemente heredable y expresable por su progenie de células. Las células recombinantes resultantes pueden ser suministradas a un paciente mediante varios métodos conocidos en la técnica. Las células sanguíneas recombinantes (por ejemplo, células madre o progenitoras hematopoyéticas) son administradas preferiblemente por vía intravenosa. La cantidad de células contempladas para usarse depende del efecto deseado, estado del paciente, etc., y pueden ser determinadas por un experto en la técnica. Las células en las cuales un ácido nucleico se puede introducir para propósitos de terapia génica comprende cualquier tipo de células deseada, disponible e incluyen pero no se limitan a células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos; las células sanguíneas tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos; varias células madre o progenitoras, en particular células madre o progenitoras hematopoyéticas, por ejemplo, como se obtienen a partir de la médula ósea, sangre del cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal, etc. En una modalidad preferida, la célula usada para terapia génica es autóioga para el paciente. En una modalidad en la cual se usan células recombinantes en terapia génica, las secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo se introducen en las células de tal manera que son expresables por las células o su progenie, y las células recombinantes son entonces administradas in vivo para efecto terapéutico. En una modalidad específica, se usan células madre o progenitoras. Cualesquiera células madre y/o progenitoras que se puedan aislar y mantener in vivo se pueden usar potencialmente de acuerdo con la modalidad de la presente invención (véase, por ejemplo, publicación del PCT WO 94/08598; Stemple y Anderson, Cell 71 :973-985 (1992); Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A:229 (1980); y Pittelkow y Scott, Mayo Clinic Proc. 61:771 (1986)). En una modalidad específica, el ácido nucleico que se va a introducir para propósitos de terapia génica comprende un promotor inducible operablemente enlazado a la región de codificación, de tal manera que la ' expresión del ácido nucleico es controlable al controlar la presencia o ausencia del inductor apropiado de transcripción.

Demostración de actividad terapéutica o profiláctica Los compuestos o composiciones farmacéuticas de la invención son preferiblemente probadas in vitro, y después in vivo para la actividad terapéutica o profiláctica deseada, antes de usarse en seres humanos. Por ejemplo, las pruebas in vivo para demostrar la utilidad terapéutica o profiláctica de un compuesto o composición farmacéutica incluyen el efecto de un compuesto sobre una línea de células o una muestra de tejido del paciente. El efecto del compuesto o composición sobre la línea de células y/o muestra de tejido se pueden determinar utilizando técnicas conocidas por los expertos en la técnica incluyendo pero sin limitarse a pruebas de formación de rosetas y pruebas de lisis de células. De acuerdo con la invención, pruebas in vitro que se pueden usar para determinar si la administración de un compuesto específico está indicada, incluyen pruebas de cultivo de células in vitro en las cuales una muestra de tejido de un paciente se crece en cultivo, y se exponen a o de otra manera se administra un compuesto, y el efecto de dicho compuesto bajo la muestra de tejido se observa.

Administración y composición terapéutica/profiláctica La invención provee métodos de tratamiento, inhibición y profilaxis mediante la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de un compuesto o composición farmacéutica de la invención, preferiblemente un anticuerpo de la Invención. En un aspecto preferido, el compuesto es sustancialmente purificado (por ejemplo, sustancialmente libre de sustancias que limitan su efecto o producen efectos colaterales no deseados). El sujeto es preferiblemente un animal, incluyendo pero sin limitarse a animales tales como vacas, cerdos, caballos, gallinas, gatos, perros, etc., y es preferiblemente un mamífero y muy preferiblemente un ser humano. Las formulaciones y métodos de administración que se pueden emplear cuando el compuesto comprende un ácido nucleico o una ínmunoglobulina se describieron anteriormente; formulaciones apropiadas adicionales y vías de administración se pueden seleccionar de entre aquellas descritas más adelante. Varios sistemas de suministro se conocen y se pueden usar para administrar un compuesto de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas; micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el compuesto, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu, J. Biol.. Chem. 262:4429-4432 (1987)), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral u otro vector, etc. Los métodos de introducción incluyen pero no se limitan a vías transdérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. Los compuestos o composiciones se pueden administrar por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección de bolo, por absorción a través de revestimiento epitelial o mucocutáneo (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y se pueden administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, puede ser deseable introducir los compuestos farmacéuticos o composiciones farmacéuticas de la invención en el sistema nervioso central mediante cualquier vía adecuada, incluyendo inyección intraventricular o intratecal; la inyección intraventricular puede ser facilitada mediante un catéter intraventricuiar, por ejemplo, fijado a un depósito, tal como un depósito de Ommaya. También se puede emplear la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente de aerosol. En una modalidad específica, puede ser deseable administrar los compuestos o composiciones farmacéuticas de la invención localmente al área que necesita tratamiento; esto se puede lograr, por ejemplo, pero no a manera de limitación, mediante infusión local durante la cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, junto con una venta para heridas después de la cirugía, mediante inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio o por medio de un implante, dicho implante siendo de material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas o fibras. Preferiblemente, cuando se administra una proteína, incluyendo un anticuefo, de la invención, se debe tener cuidado de usar materiales a los cuales no absorba la proteína. En otra modalidad, el compuesto o composición se puede suministrar en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treta et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cáncer, López-Berestein, ibid., págs. 317-327; véase generalmente ibid).

En otra modalidad más, el compuesto o composición se puede suministrar en un sistema de liberación controlada. En una modalidad, se puede usar una bomba (véase Langer, anteriormente; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 31 :574 (1989)). En otra modalidad, se pueden usar materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Reléase, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Ratón, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); véase también Levy et al., 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71 :105 (1989)). En otra modalidad, un sistema de liberación controlada se puede poner en proximidad del objetivo terapéutico, es decir, el cerebro, requiriendo así sólo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Reléase, supra, vol. 2, págs. 115-138 (1984)). Otros sistemas de liberación controlada se discuten en la revisión de Langer (Science 249:1527-1533 (1990)). En una modalidad específica en donde el compuesto de la invención es un ácido nucleico que codifica una proteína, el ácido nucleico se puede administrar in vivo para promover ia expresión de su proteína codificada, construyéndolo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico y administrándolo de modo que se vuelva intracelular, por ejemplo, mediante el uso de un vector retroviral (véase patente de E.U.A. No. 4,980,286), o por inyección directa o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola de genes; Biolistic, Dupont), o revestimiento con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transfección, o administrándolo en un enlace a un péptido similar a una caja doméstica que se sabe que entra al núcleo (véase, por ejemplo, Joliot et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:1864-1868 (1991)), etc. Alternativamente, un ácido nucleico se puede introducir intracelularmente e incorporar dentro del ADN de la célula hospedero para expresión, por recombinación homologa. La presente invención también provee composiciones farmacéuticas. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o listada en la farmacopea de E.U.A. u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y muy particularmente en humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el cual se administra el agente terapéutico. Los vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tal como aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí y similares. El agua es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también se pueden emplear como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, greda, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada seca, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Si se desea, la composición también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes reguladores de pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición se puede formular como un supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos estándares tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martín. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad de vehículo adecuada para proveer la forma para administración apropiada al paciente. La formulación debe adaptase al modo de administración. En una modalidad preferida, la composición se formula de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en una solución reguladora de pH acuosa isotónica, estéril. En donde es necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizable y un anestésico local tal como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran ya sea por separado o se mezclan entre sí en forma de dosis unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un contenedor herméticamente sellado tal como una ampolleta o bolsa indicando la cantidad de agente activo. En donde la composición se ha de administrar por infusión, se debe suministrar con una botella de Infusión que contenga agua o solución salina de grado farmacéutico estéril. En donde la composición se administre por inyección, se puede proveer una ampolleta de agua estéril para inyección o solución salina para que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración. Los compuestos de la invención se pueden formular como formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con aniones tales como aquellas derivadas de ácido clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y aquellos formados con cationes tales como los que se derivan de hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc. La cantidad del compuesto de la invención que será efectiva en ei tratamiento, inhibición y prevención de una enfermedad o trastorno asociado con expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de la invención se puede determinar mediante técnicas clínicas estándares. Además, se pueden emplear opcionaimente pruebas in vitro para ayudar a identificar intervalos de dosis óptimos. La dosis precisa que se va a emplear en la formulación dependerá también de la vía de administración y la severidad de la enfermedad o trastorno, y deberá decidirse de acuerdo con el juicio del médico y las circunstancias de cada paciente. Las dosis efectivas se pueden extrapolar a partir de las curvas de respuesta a la dosis derivadas de sistemas de prueba de modelo in vitro o animal. Para anticuerpos, la dosis administrada a un paciente es típicamente de 0.1 mg/kg a 100 mg/kg del peso corporal del paciente. Preferiblemente, la dosis administrada a un paciente es entre 0.1 mg/kg y 20 mg/kg del peso corporal del paciente, muy preferiblemente 1 mg/kg a 10 mg/kg del peso coforal del paciente. Generalmente, los anticuefos humanos tienen una vida media más larga dentro cuerpo humano que los anticuerpos de otras especies debido a los polipéptldos extraños. Por lo tanto, dosis inferiores de anticuerpos humanos y la administración menos frecuente es a menudo posible. Además, la dosis y frecuencia de administración anticuerpos de la Invención se puede reducir mediante la absorción y penetración de tejido cada vez mayores (por ejemplo en el cerebro) de los anticuerpos por modificaciones tales como por ejemplo lipidaciones. La invención también provee un paquete farmacéutico o equipo farmacéutico que comprende uno o más contenedores llenados con uno o más ingredientes de la composición farmacéutica de la invención. Opcionalmente asociado con dicho contenedores) puede ser un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regule la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, dicho aviso refleja la aprobación por la agencia de fabricación, uso o venta para administración humana.

Diagnóstico y formación de imagen Los anticuerpos marcados y derivados y análogos de los mismos, que se unen específicamente a un polipéptido de interés se pueden usar para propósitos de diagnóstico para detectar, diagnosticar o monitorear enfermedades, trastornos y/o condiciones asociadas con la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido. La invención provee la detección de expresión aberrante de un polipéptido de interés, que consiste en (a) probar la expresión del polipéptido de interés en células o fluido corporal de un individuo usando uno o más anticuerpos específicos para el polipéptido de interés y (b) comparar el nivel de expresión de gen con un nivel de expresión de gen estándar, por lo que un incremento o disminución en el nivel de expresión de gen del polipéptido probado comparado con el nivel de expresión estándar es indicativo de expresión aberrante. La invención provee una prueba de diagnóstico para diagnosticar un trastorno que consiste en (a) probar la expresión del polipéptido de interés en células o fluido coforai de un individuo usando uno o más anticuerpos específicos para el polipéptido de interés y (b) comparar el nivel de expresión de gen con un nivel de expresión de gen estándar, por lo que un incremento o disminución en el nivel de expresión de gen del polipéptido probado comparado con el nivel de expresión estándar es indicativo de un trastorno particular. Con respecto al cáncer, la presencia de una cantidad relativamente alta de transcripción en tejido extraído como biopsia de un individuo puede indicar una predisposición para el desarrollo de la enfermedad, o puede proveer un medio para detectar la enfermedad antes de la aparición de síntomas clínicos reales. Un diagnóstico más definitivo de este tipo puede permitir a los profesionales de la salud emplear medidas preventivas o tratamiento agresivo y más temprano previniendo así el desarrollo o progreso posterior del cáncer. Los anticuefos de la invención se pueden usar para probar niveles de proteína en una muestra biológica usando métodos inmunohistológicos clásicos conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Jalkanen, et al., J. Cell. Bioi. 101 :976-985 (1985); Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). Otros métodos basados en anticuefos útiles para detectar expresión de gen de proteína G incluyen inmunoensayos, tales como la prueba inmunoabsorbente ligada a enzima (ELISA) y el radioinmunoensayo (RÍA). Marcadores de prueba de anticuerpos adecuados se conocen en la técnica e incluyen marcadores de enzimas, tales como glucosaoxldasa, radioisótopos, tales como yodo (1251, 1211), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (112ln) y tecnetio (99Tc); marcadores luminiscentes, tales como luminol; y marcadores fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, y biotina. Un aspecto de la invención es la detección y diagnóstico de una enfermedad o trastorno asociado con expresión aberrante de un polipéptido de interés en un animal, preferiblemente un mamífero y muy preferiblemente un humano. En una modalidad, el diagnóstico comprende: a) administrar (por ejemplo, por vía parenteral, subcutánea o intraperitoneal) a un sujeto una cantidad efectiva de una molécula marcada que se une específicamente al polipéptido de interés; b) esperar durante un intervalo de tiempo después de la administración para permitir que la molécula marcada se concentre preferencialmente en sitios en el sujeto en donde el polipéptido es expresado (y para que una molécula marcada no ligada sea aclarada al nivel de fondo); c) determinar el nivel de fondo; y d) detectar la molécula marcada en el sujeto, de tal manera que la detección de la molécula marcada por arriba del nivel de fondo indique que el sujeto tiene una enfermedad o trastorno particular asociado con expresión aberrante del polipéptido de interés. El nivel de fondo se puede determinar por varios métodos incluyendo la comparación de la cantidad de molécula marcada detectada a un valor estándar previamente determinado para un sistema particular. Se entenderá en la técnica que el tamaño del sujeto y el sistema de formación de imagen usado determinará la cantidad de porción de imagen necesaria para producir imágenes de diagnóstico. En el caso de una porción de radioisótopo, para un sujeto humano, la cantidad de radioactividad inyectada normalmente variará de alrededor de 5 a 20 miliCuries de 99mTc. El anticuerpo marcado o el fragmento de anticuerpo marcado entonces se acumulará preferencialmente en el sitio de las células que contienen la proteína específica. La formación de imagen de tumor in vivo se describe en S.W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments". (Capítulo 13 en Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cáncer, S.W. Burchiel y B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982). Dependiendo de varias variables, incluyendo el tipo de marcado usado y el modo de administración, el intervalo de tiempo después de la administración para permitir que la molécula marcada se concentre preferencialmente en sitios en el sujeto y para que la molécula marcada no ligada sea aclarada al nivel de fondo es de 6 a 48 horas ó 6 a 24 horas ó 6 a 12 horas. En otra modalidad, el intervalo de tiempo después de la administración es de 5 a 20 días o de 5 a 10 días. En una modalidad, el monitoreo de ia enfermedad o trastorno se lleva a cabo repitiendo el método para diagnóstico de la enfermedad o trastorno, por ejemplo, un mes después del diagnóstico inicial, seis meses después del diagnóstico inicial, un año después del diagnóstico inicial, etc. La presencia de la molécula marcada se puede detectar en el paciente usando métodos conocidos en la técnica para escudriñamiento in vivo. Estos métodos dependen del tipo de marcador usado. Los expertos en la técnica podrán determinar el método apropiado para detectar un marcador particular. Los métodos y dispositivos que se pueden usar en los métodos de diagnóstico de la invención ¡ncluyen pero no se limitan a tomografía computarizada (CT), escudriñamiento de cuerpo entero tal como tomografía de emisión de posición (PET), formación de imagen por resonancia magnética (MRI) y sonografía. En una modalidad específica, la molécula es marcada con un radioisótopo y es detectada en el paciente usando un instrumento quirúrgico que responde a la radiación (Thurston et al., patente de E.U.A. No. 5,441 ,050). En otra modalidad, la molécula es marcada con un compuesto fluorescente y se detecta en el paciente usando un instrumento de escudriñamiento de respuesta a la fluorescencia. En otra modalidad, la molécula es marcada con un metal emisor de positrón y es detectada en la patente usando tomografía de emisión de positrones. En otra modalidad, la molécula es marcada con marcador paramagnético y es detectada en un paciente usando formación de imagen por resonancia magnética (MRI).

Equipos La presente invención provee equipos que se pueden usar en los métodos anteriores. En una modalidad, un equipo comprende un anticuefo de la invención, preferiblemente un anticuerpo purificado, en uno o más contenedores. En una modalidad específica, los equipos de la presente invención contienen un poiipéptido sustancialmente aislado que comprende un epítope que es específicamente inmunorreactivo con un anticuerpo incluido en el equipo. Preferiblemente, los equipos de la presente invención comprenden además un anticuefo de control que no reacciona con ei polipéptido de interés. En otra modalidad específica, los equipos de la presente invención contienen un medio para detectar la unión de un anticuerpo a un polipéptido de interés (por ejemplo, el anticuerpo se puede conjugar a un sustrato detectable tal como un compuesto fluorescente, un sustrato enzimático, un compuesto radioactivo o un compuesto luminiscente, o un segundo anticuerpo que reconoce el primer anticuerpo se puede conjugar a un sustrato detectable). En otra modalidad específica de la presente invención, el equipo es un equipo de diagnóstico para usarse en la selección de suero que contiene anticuerpos específicos contra polinucleótidos y polipéptidos proiiferativos y/o cancerosos. Dicho equipo puede incluir un anticuerpo de control que no reaccione con el polipéptido de interés. Dicho equipo puede incluir un antígeno de polipéptido sustancialmente aislado que comprenda un epítope que es específicamente inmunorreactivo con por io menos un anticuefo para antígeno antipolipéptido. Además, dicho equipo incluye medios para detectar la unión de dicho anticuefo al antígeno (por ejemplo, el anticuerpo se puede conjugar a un compuesto fluorescente tal como fluoresceína o rodamina que puede ser detectada por citometría de flujo). En modalidades específicas, el equipo puede incluir un antígeno de polipéptido recombinantemente producido o químicamente sintetizado. El antígeno de polipéptido del equipo puede ser unido a un soporte sólido.

En una modalidad más específica, los medios de detección del equipo anteriormente descrito incluyen un soporte sólido al cual está unido dicho antígeno de polipéptido. Dicho equipo también puede incluir un anticuerpo antihumano marcado con reportero no unido. En esta modalidad, la unión del anticuefo al antígeno de polipéptido se puede detectar mediante unión de dicho anticuerpo marcado por reportero. En una modalidad adicional, la invención incluye un equipo de diagnóstico para usarse en la selección de suero que contiene antígenos de polipéptido de la invención. El equipo de diagnóstico incluye un anticuerpo sustancialmente aislado específicamente inmunorreactivo con antígenos de polipéptido o polinucleótido, y medios para detectar la unión del antígeno de polinucleótido o polipéptido al anticuerpo. En una modalidad, el anticuerpo está unido a un soporte sólido. En una modalidad específica, el anticuefo puede ser un anticuerpo monoclonal. Los medios de detección del equipo pueden incluir un segundo anticuefo monoclonal marcado. Altemativamente, o además, ios medios de detección pueden incluir un antígeno competente marcado. En una configuración de diagnóstico, el suero de prueba se hace reaccionar con un reactivo de fase sólida que tiene un antígeno unido a superficie obtenido por los métodos de la presente invención. Después de unirse con un anticuerpo específico de antígeno al reactivo y de remover los componentes del suero no unidos por lavado, el reactivo se hace reaccionar con un anticuerpo antihumano marcado por reportero para unir al reportero con el reactivo en proporción con la cantidad de anticuerpo antiantígeno unido sobre el soporte sólido. El reactivo nuevamente se lava para remover anticuerpo marcado no unido, y la cantidad de reportero asociado con el reactivo se determina. Típicamente, el reportero es una enzima que es detectada incubando la fase sólida en presencia de un sustrato fluorométrico, luminiscente o colorimétrico (Sigma, St. Louis, MO). El reactivo de superficie sólida en la prueba anterior se prepara mediante técnicas conocidas para unir material de proteína G a un material de soporte sólido, tal como esferas poliméricas, varillas de inmersión, placa de 96 pozos o material de filtro. Estos métodos de unión generalmente incluyen la adsorción no específica de la proteína al soporte o unión covalente de la proteína, típicamente a través de un grupo de amina libre, a un grupo químicamente reactivo sobre el soporte sólido, tal como un grupo carboxilo, hidroxilo o aldehido activado. Alternativamente, las placas revestidas con estreptavidina se pueden usar junto con antígeno(s) biotinilado. Por lo tanto, la invención provee un sistema de prueba o equipo de prueba para llevar a cabo este método de diagnóstico. El equipo generalmente incluye un soporte con antígenos recombinantes unidos a la superficie y un anticuerpo antihumano marcado por reportero para detectar el anticuerpo antiantígeno unido a la superficie.

Proteínas de fusión Cualquier polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se puede usar para generar proteínas de fusión. Por ejemplo, el polipéptido receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), cuando se fusiona a una segunda proteína, se puede usar como una etiqueta antigénica. Los anticuerpos producidos contra el polipéptido receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden usar para detectar indirectamente la segunda proteína mediante unión al receptor de quimiocina de proteína G. Además, debido a que los sitios celulares objetivo de proteínas secretadas basados en señales de tráfico, los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden usar como moléculas de dirección una vez fusionadas a otras proteínas. Ejemplos de dominios que se pueden fusionar a polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) incluyen no sólo secuencias de señal heterólogas, sino también otras regiones funcionales heterólogas. La función no necesita ser directa, sino que puede ocurrir a través de secuencias enlazadoras. En ciertas modalidades preferidas, las proteínas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención comprenden proteínas de fusión en donde los polipéptidos receptores de quimiocina de proteína G (CCR5) son aquellos descritos como m-n. En modalidades preferidas, la aplicación es dirigida a moléculas de ácido nucleico por io menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idénticas a las secuencias de ácido nucleico que . codifican polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de las deleciones N-terminales y C-terminales específicas que aquí se mencionan. Los polinucleótidos que codifican estos pollpéptidos también son comprendidos por la invención. Además, las proteínas de fusión también pueden ser manipuladas genéticamente para mejorar las características de polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, se puede añadir ai grupo N-terminal del polipéptido receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) para mejorar la estabilidad y persistencia durante la purificación a partir de la célula hospedero o el subsecuente manejo y almacenamiento. También, porciones de péptido pueden añadirse al polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) para facilitar la purificación. Dichas regiones pueden ser removidas para la preparación final de polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). La adición de porciones de péptido para facilitar el manejo de polipéptidos son técnicas familiares y rutinarias en la técnica. Como lo apreciará un experto en ia técnica, los polipéptidos de la presente invención y los fragmentos que contienen epítope de los mismos anteriormente descritos, se pueden combinar con secuencias de polipéptidos heterólogos. Por ejemplo, los polipéptidos de la presente invención (incluyendo fragmentos o variantes de los mismos) se pueden fusionar con el dominio constante de inmunoglobulinas (IgA, IgE, IgG, IgM), o porciones de las mismas (CH1 , CH2, CH3), o cualquier combinación de las mismas y porciones de las mismas, dando por resultado polipéptidos quiméricos. A manera de otro ejemplo no limitante, los polipéptidos y/o anticuerpos de la presente invención (incluyendo fragmentos o variantes de los mismos) se pueden fusionar con albúmina (incluyendo pero sin limitarse a albúmina de suero humano recombinante o fragmentos o variantes de la misma (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,876,969, expedida el 2 de marzo de 1999, patente europea 0 413 622 y patente de E.U.A. No. 5,766,833 expedida el 16 de junio de 1998, incorporadas aquí por referencia en su totalidad). En una modalidad preferida, los polipéptidos y/o anticuerpos de la presente invención (incluyendo fragmentos o variantes de los mismos) se fusionan con la forma madura de albúmina de suero humano (es decir, aminoácidos 1 -585 de albúmina de suero humana como se muestra en las figuras 1 y 2 de la patente europea 0 322 094) que se incofora aquí por referencia en su totalidad. En otra modalidad preferida, los polipéptidos y/o anticuerpos de la presente invención (incluyendo fragmentos o variantes del mismo) se fusionan con fragmentos de polipéptido que comprenden o que consisten alternativamente de residuos de aminoácidos1-z de albúmina de suero humana, en donde z es un entero de 369 a 419, como se describe en la patente de E.U.A. 5,766,883 incorporada aquí por referencia en su totalidad. Los polipéptidos y/o anticuefos de la presente invención (incluyendo fragmentos o variantes de los mismos) se pueden fusionar a cualquier extremo N-terminal o C-terminal de la porción heteróloga (por ejemplo, polipéptido de inmunoglobulina Fc o polipéptido de albúmina de suero humana). Los polipéptidos que codifican proteínas de fusión de la invención también son comprendidos por la invención. Estas proteínas de fusión facilitan la purificación y muestran una vida media incrementada in vivo. Un ejemplo reportado describe proteínas quiméricas que consisten de los dos primeros dominios del polipéptido de CD4 humano y varios dominios de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera de inmunoglobulina de mamífero (EP A 394,827; Traunecker et al., Nature 331 :84-86 (1998)). Las proteínas de fusión tienen estructuras diméricas enlazadas por disulfuro (debido a la IgG) también pueden ser más eficientes para unir y neutralizar otras moléculas, que la proteína o fragmento de proteína secretado monomérico solo (Fountoulakis et al., J. Biochem, 270:3958-3964 (1995)). De manera similar, EP-A-0 464 533 (contraparte canadiense 2045869) describe proteínas de fusión que comprenden varias porciones de región constante de moléculas de inmunoglobulina junto con otra proteína humana o parte de la misma. En muchos casos, la parte Fc en una proteína de fusión es benéfica en terapia y diagnóstico, y por lo tanto puede dar por resultado, por ejemplo, propiedades farmacocinéticas mejoradas (EP-A 0232 262). Alternativamente, la deleción de la parte Fc después de que la proteína de fusión se ha expresado, detectado y purificado, sería deseable. Por ejemplo, la porción Fc puede impedir la terapia y diagnóstico si ia proteína de fusión se usa como un antígeno para inmunizaciones. En el descubrimiento de fármacos, por ejemplo, las proteínas humanas tales como hlL-5, se han fusionado con porciones Fc para el propósito de pruebas de selección de alto rendimiento para identificar antagonistas de hlL-5 (véase D. Bennett et al., J. Molecular Recognition 8:52-58 (1995); K. Kohanson et al., J. Biol. Chem. 270:9459-9471 (1995)). Además, los polipéptidos receptores de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden fusionar a secuencias marcadoras, tales como un péptido que facilita la purificación de receptor de quimiocina de proteína G. En modalidades preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido d hexa-histidina, tal como la etiqueta provista en el vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales son comercialmente disponibles. Como se describe en Gentz et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina provee purificación conveniente de la proteína de fusión. Otra etiqueta de péptido útil para la purificación, la etiqueta "HA", corresponde a un epítope derivado de la proteína de hemaglutinina de influenza (Wllson et al., Cell 37:767 (1984)). Por lo tanto, cualquiera de estas fusiones anteriores se pueden manipular genéticamente usando los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5).

Vectores, células hospedero v producción de proteína La presente invención también se refiere a vectores que contienen el polinucleótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), células hospedero y la producción de polipéptidos mediante técnicas recombinantes. El vector puede ser, por ejemplo, un vector de fago, plásmido, viral o retroviral. Los vectores retrovirales pueden ser competentes de replicación o defectuosos de replicación. En el último caso, la propagación viral generalmente ocurrirá sólo en células hospedero complementarias. Los poiinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden unir a un vector que contiene un marcador seleccionable para la propagación en un hospedero. Generalmente, un vector de plásmido se introduce en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato de calcio, o en un complejo con un lípido cargado. Si el vector es un virus, se puede empacar in vitro usando una línea de células de empaque apropiadas y después se puede traducir en células hospedero. El inserto del polinucleótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) deberá ser operativamente enlazado a un promotor apropiado, tal como un promotor de fago lambda PL, los promotores E. coli lac, trp, phoA y tac, y los promotores PL tardío y temprano y promotores de LTR retroviraies, por nombrar algunos. Otros promotores adecuados serán conocidos por el experto en la técnica. Las construcciones de expresión contendrán además sitios para iniciación de transcripción, terminación y en la región transcrita, un sitio de unión a ribosoma para traducción. La porción de codificación de las transcripciones expresadas por las construcciones incluirán preferiblemente un codón de iniciación de traducción al principio y un codón de terminación (UAA, UGA o UAG) apropiadamente ubicado al final de polipéptido que va a ser traducido. Como se indicó, los vectores de expresión preferiblemente incluirán por lo menos un marcador seleccionable. Dichos marcadores incluyen dihidrofolato reductasa, G418, glutamina sintasa o genes de resistencia a la neomicina para cultivo de células eucarióticas y genes de resistencia a la tetraciclina, kanamicina o ampicilina para cultivarse en E. coli y otras bacterias. Ejemplos representativos de hospederos apropiados incluyen pero no se limitan a células bacterianas, tales como células de E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células de hongos, tales como células de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris (acceso a ATCC No. 201178)); células de insectos tales como células de Drosophlla S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, NSO, COS, 293, y células de melanoma de Bowes; y células vegetales. Los medios y condiciones de cultivo apropiados para las células hospedero anteriormente descritas se conocen en la técnica. Vectores que usan glutamina sintasa (GS) o DHFR como los marcadores seleccionabies se pueden amplificar en presencia de los fármacos metionina, sulfoximina o metotrexato, respectivamente. La disponibilidad de fármacos que inhiben la función de las enzimas codificadas por estos marcadores seleccionables permite la selección de líneas de células en las cuales la secuencias del vector han amplificadas después de la integración en el ADN de la célula hospedero. Una ventaja de vectores basados en glutamina sintasa son la disponibilidad de líneas de células (por ejemplo, la línea de células de mleloma murina, NSO) que son negativas a glutamina sintasa. Los sistemas de expresión de glutamina sintasa también pueden funcionar en células que expresan glutamina sintasa (por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO)) proveyendo un inhibidor adicional para evitar el funcionamiento del gen endógeno. Vectores que usan glutamina sintasa como el marcador seleccionable incluyen el vector de expresión pEE6 descrito en Stephens 6 Cockett, Nucí. Acids. Res. 17:1710 (1989). Un sistema de expresión de glutamina sintasa y componentes del mismo se detallan en publicaciones del PCT: WO87/04462; WO86/05807; WO89/01036; WO89/10404; y WO91/06657 que se incorporan aquí en su totalidad por referencia. Además, los vectores de expresión de glutamina sintasa que se pueden usar de acuerdo con la presente invención son comercialmente disponibles de proveedores que incluyen por ejemplo Lonza Bioioglcs, Inc. (Portsmouth, NH). La expresión de anticuerpos monoclonales que usan un sistema de expresión de GS en células de mieloma murina se describe en Bebbington et al., Bio/technology 10:169(1992) y en Biblia y Robinson Biotechnol. Prog. 11:1 (1995) que se incorporan aquí por referencia. Entre los vectores preferidos para usarse en bacterias se incluyen pQE70, pQE60 y pQE9, disponibles de QIAGEN Inc.; vectores pBluescript, vectores Phagescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponibles de Strategene Cloning Systems, Inc.; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles de Pharmacia Biotech, Inc. Entre los vectores eucarióticos preferidos están PWLNEO; pSV2CAT, pOG44, pXT1 y pSG disponibles de Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponible de Pharmacia. Los vectores de expresión preferidos para usarse en sistemas de levadura incluyen, pero no se limitan a pYES2, pYD1 , pTEF1/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalfa, pPIC9, pPIC3.5, pHIL-D2, pHIL-S1 , pPIC3.5K, pPIC9K y PA0815 (todos disponibles de Invitrogen, Caribad, CA). Otros vectores adecuados serán fácilmente evidentes para el experto en la técnica. La introducción de la construcción en la célula hospedero se puede efectuar por transfección de fosfato de calcio, transfección medida por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípido catiónico, electroporación, transducción, infección u otros métodos. Dichos métodos se describen en muchos manuales de laboratorio estándares, tales como Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986). Se contempla específicamente que los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de hecho pueden ser expresados por una célula hospedero que carezca de vector recombinante. Los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de célula recomblnantes por métodos bien conocidos incluyendo precipitación de sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía y cromatografía de lectina. Muy preferiblemente, se emplea cromatografía de líquido de alto rendimiento ("CLAR") para purificación. Los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), y preferiblemente la forma secretada, también se puede recuperar de: productos purificados de fuentes naturales, incluyendo fluidos corporales, tejidos y células, ya sea directamente aislados o cultivados; productos de procedimientos sintéticos químicos; y productos producidos por técnicas recombinantes a partir de un hospedero procariótico o eucariótico, incluyendo por ejemplo células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insectos y de mamíferos. Dependiendo del hospedero empleado en el procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) pueden ser glicosilados o pueden ser no glicosilados. Además, los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también pueden incluir un residuo de metionina modificado, en algunos casos como resultado de procedimientos mediados por hospedero. Por lo tanto, es bien sabido en la técnica que la metionina N-terminal codificada por el codón de iniciación de traducción generalmente es removida con alta eficiencia de cualquier proteína después de la traducción en todas las células eucarióticas. Aunque la metionina N-terminal en la mayoría de las proteínas es eficientemente removida en la mayoría de los procariotes, para algunas proteínas, este procedimiento de remoción procariótico es ineficiente, dependiendo de la naturaleza del aminoácido al cual está covalentemente enlazada la metionina N-terminal. En una modalidad, la levadura Pichia pastoris se usa para expresar proteína de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) en un sistema eucariótico. Pichia pastoris es una levadura metiiotrófica que puede metabolizar el metanol como su única fuente de carbono. Un paso principal en la vía de metabolización de metanol es la oxidación de metanol al formaldehído 02. Esta reacción es catalizada por la enzima alcohol oxidasa. A fin de metabolizar el metanol como su única fuente de carbono, Pichia pastoris debe generar altos niveles de alcohol oxidasa debido en parte a la afinidad relativamente baja de alcohol oxidasa para 02. Consecuentemente, en un medio de crecimiento que depende del metanol como una fuente de carbono principal, la región promotora de uno de los dos genes de alcohol oxidasa (AOXl) es altamente activo. En presencia de metanol, la alcohol oxidasa producida a partir del gen AOXl comprende hasta aproximadamente 30% de la proteína soluble total en Pichia pastoris. Véase Ellis, S.B., et al., Mol. Cell. Biol. 51 :1111-21 (1985); Koutz, P.J., et al., Yeast 5:167-77 (1989); Tschopp, J.F., eí al., por lo tanto, una secuencia de codificación heteróloga, tal como por ejemplo un polinucleótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de ia presente invención, bajo la regulación de transcripción de toda o una parte de la secuencia reguladora de AOXl se expresa a niveles excepcionalmente altos en levadura Pichia que crece en presencia de metanol.

En un ejemplo, el vector de plásmido pPIC9K se usa para expresar ADN que codifica un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, como se expone aquí, en un sistema de levadura de Pichea esencialmente como se describe en "Plchla Protocols: Methods in Molecular Biology, "D.R. Hlggins y J. Cregg, eds. The Humana Press, Totowa, NJ, 1998. Este vector de expresión permite la expresión y secreción de una proteína de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención debido al fuerte promotor AOXl enlazado al péptido de señal secretor de fosfatasa alcalina (PHO) de Pichia pastoris (es decir, líder) ubicado hacia el extremo cinco prima del sitio de clonación múltiple. Se podrían usar muchos otros vectores de levadura en lugar de pPIC9K, tales como pYES2, pYD1 , pTEF1/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalfa, pPIC9, pPIC3.5, pHIL-D2, pHIL-S1 , pPIC3.5K y PAO815, como lo apreciará un experto en la técnica, mientras la construcción de expresión propuesta provea señales apropiadamente localizadas para transcripción, traducción, secreción (si se desea) y similares, incluyendo un AUG dentro del marco según se requiera. En otra modalidad, la expresión de alto nivel de una secuencia de codificación heteróloga, tal como por ejemplo un pollnucleótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención se puede lograr clonando el poiinucleótido heterólogo de la invención en un vector de expresión, tal como, por ejemplo, pGAPZ o pGAPZalpha y haciendo crecer el cultivo de levadura en ausencia de metanol.

Además de comprender células hospedero que contienen las construcciones de vector que aquí se describen, la Invención también comprende células hospedero primarias, secundarias e inmortalizadas de origen de vertebrado, particularmente de origen de mamífero, que han sido genéticamente manipuladas para deletar o reemplazar material genético endógeno (por ejemplo, secuencia de codificación de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) y/o para incluir material genético, (por ejemplo, secuencias de polinucleótido heterólogas) que está operablemente asociado con polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención y que activa, altera y/o amplifica polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) endógenos. Por ejemplo, las técnicas conocidas en el campo se pueden usar para asociar operablemente regiones de control heterólogas (por ejemplo, promotor y/o incrementador) y secuencias de polinucleótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) endógeno a través de recombinación homologa, dando por resultado la formación de una nueva unidad de transcripción (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,641 ,670, expedida el 24 de junio de 1997; patente de E.U.A. NO. 5,733,761 , expedida del 31 de marzo de 1998; publicación internacional No. WO 96/29411 , publicada el 26 de septiembre de 1996; publicación internacional No. WO 94/12650, publicada el 4 de agosto de 1994; Koller et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); y Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989), las descripciones de cada una de ias cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad).

Además, los polipéptidos de la invención se pueden sintetizar químicamente usando técnicas conocidas en el campo (por ejemplo, véase Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principies, W.H. Freeman & Co., N.Y. y Hunkapiller et al., Nature, 310:105-111 (1984)). Por ejemplo, un polipéptido que corresponde a un fragmento de un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se puede sintetizar usando un sintetizador de péptido. Además, si se desea, aminoácidos no clásicos o análogos de aminoácidos químicos se pueden introducir como una sustitución o adición en la secuencia de polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Los aminoácidos no clásicos incluyen pero no se limitan a los isómeros D de los aminoácidos comunes, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido a-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-aminobutírico, g-Abu, e-Ahx, ácido 6-aminohexanóico, Aib, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminopropiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cisteíco, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciciohexilalanina, b-alanina, fluoroaminoácidos, aminoácidos designadores tales como b-metil aminoácidos, Ca-metil aminoácidos, Na-metil aminoácidos y análogos de aminoácidos en general. Además, el aminoácido puede ser D (dextrogiratorio) o L (levogiratorio). La invención comprende poiipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que son diferencialmente modificados durante o después de la traducción, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivación por grupos de protección/bloque conocidos, digestión proteoiítica, enlace a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Cualquiera de las modificaciones químicas numerosas se puede llevar a cabo mediante técnicas conocidas, incluyendo pero sin limitarse a digestión química específica por bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, papaína, V8 proteasa, NaBH4; acetilación, formilación, oxidación, reducción; síntesis metabólica en presencia de tunicamicina; etc. Las modificaciones de postraducción adicionales abarcadas por la invención incluyen, por ejemplo, cadenas de carbohidrato N-enlazadas u O-enlazadas, procesamiento de extremos N-terminal o C-terminal, unión de porciones químicas a la estructura de base de aminoácido, modificaciones químicas de cadenas de carbohidrato N-enlazadas u O-enlazadas, y adición o deleción de un residuo de metionina N-terminal como resultado de expresión de célula hospedero procariótica. Los polipéptidos también se pueden modificar con un marcador detectable, tal como un marcador enzimático, fluorescente, isotópico o de afinidad para permitir ia detección y aislamiento de la proteína. La invención también provee derivados químicamente modificados de los promotor de la invención que pueden proveer ventajas adicionales tales como solubilidad, estabilidad y tiempo de circulación del polipéptido incrementado, o inmunogenicidad disminuida (véase patente de E.U.A. No. 4,179,337). Las porciones químicas para derivación se pueden seleccionar de polímeros solubles en agua tales como polietilenglicol, copolímeros etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico y similares. Los polipéptidos se pueden modificar en posiciones aleatorias dentro de la molécula o en posiciones predeterminadas dentro de la molécula y pueden incluir una, dos, tres o más porciones químicas unidas. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificada o no ramificada. Para polietilenglicol, el peso molecular preferido es entre alrededor de 1 kDa y aproximadamente 100 kDa (el término "aproximadamente" indica que en las preparaciones de polietilengiicol algunas moléculas pesaran más, algunas menos, que el peso molecular establecido) para facilidad de manejo y fabricación. Se pueden usar otros tamaños, dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo, la duración de la liberación sostenida deseada, los efectos, si hay alguno en actividad biológica, la facilidad de manejo, el grado o falta de antigenicidad y cualesquiera otros efectos del polietilenglicol a proteína terapéutica o análogo). Las moléculas de polietilenglicol (u otras porciones químicas) deberían unirse a la proteína considerando los efectos sobre los dominios funcionales o antigénicos de la proteína. Hay un número de métodos de unión disponibles para los expertos en la técnica, por ejemplo, EP 0 401 384, incorporadas aquí por referencia (acoplamiento de PEG a G-CSF), véase también Malik et al., Exp. Hematol. 20:1028-1035 (1992) (reportando la pegilación de GM-CSF usando cloruro de tresilo). Por ejemplo, el polietilenglicol se puede unir covalentemente a través de residuos de aminoácidos mediante un grupo reactivo, tal como un grupo amino o carboxilo libre. Los grupos reactivos son aquellos a los cuales se puede unir una molécula de polietilenglicol activada. Los residuos de aminoácidos que tienen un grupo amino libre pueden incluir residuos de lisina y los residuos de aminoácido N-terminales; aquellos que tienen un grupo carboxilo libre pueden incluir residuos de ácido aspártico, residuos de ácido giutámico y residuo de ácido amino C-terminal. Los grupos sulfhidrilo también se pueden usar como un grupo reactivo para unirse a las moléculas de polietilenglicol. Para propósitos terapéuticos se prefiere la unión de un grupo amino, tal como unión en el grupo N-termlnal o lisina. Se puede desear específicamente proteínas químicamente modificadas en el grupo N-terminal. Usando polietilenglicol como una ilustración de la presente composición, se puede seleccionar de una variedad de moléculas de polietilenglicol (en peso molecular, ramificación, etc.), la proporción de las moléculas de polietilenglicol a moléculas de proteína (polipéptido) en la mezcla de reacción, el tipo de reacción de pegilación que se va a realizar, y el método para obtener la proteína N-terminalmente pegilada seleccionada. El método para obtener la preparación N-terminalmente pegiiada (es decir, separando esta porción de otras porciones monopegiladas si es necesario) puede ser por purificación del material N-terminalmente pegilado de una población de moléculas de proteína pegiladas. Las proteínas selectivas químicamente modificadas en la modificación N-terminal se puede lograr mediante alquilación reductiva que explota reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino primarios (lisina versus el grupo N-terminal) disponibles de la derivación en una proteína particular. Bajo las condiciones de reacción apropiadas, la derivación sustancialmente selectiva de la proteína en el grupo N-terminal con un grupo carbonilo que contiene polímero se logra. Los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención pueden estar en monómeros o multímeros (es decir, dímeros, trímeros, tetrámeros y multímeros superiores). Por consiguiente, la presente invención se refiere a monómeros y multímeros de los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, su preparación, y composiciones (preferiblemente, compuestos terapéuticos) que los contienen. En modalidades específicas, los polipéptidos de la invención son monómeros, dímeros, trímeros o tetrámeros. En modalidades adicionales, los multímeros de la Invención son por lo menos dímeros, por lo menos trímeros o por lo menos tetrámeros. Los multímeros comprendidos por la invención pueden ser homómeros o heterómeros. Como se usa aquí, el término homómero se refiere a un multímero que contiene sólo polipéptidos correspondientes a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o codificada por ADN HDGNR10 contenida en el clon depositado (incluyendo fragmentos, variantes, variantes de empalme y proteínas de fusión, correspondientes a los que se describen aquí). Estos homómeros pueden contener polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que tienen secuencias de aminoácidos idénticas o diferentes. En una modalidad específica, un homómero de la invención es un multímero que contiene sólo polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que tienen una secuencia de aminoácidos idéntica. En otra modalidad específica, un homómero de la invención es un multímero que contiene polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que tienen diferentes secuencias de aminoácidos. En modalidades específicas, el multímero de la invención es un homodímero (por ejemplo, que contiene polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que tienen secuencias de aminoácidos idénticas o diferentes) o un homotrímero (por ejemplo, que contiene polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que tienen secuencias de aminoácidos idénticas y/o diferentes). En modalidades adicionales, el multímero homomérico de la invención es por lo menos un homodímero, por lo menos un homotrímero o por lo menos un homotetrámero. Tal como se usa aquí, el término heterómero se refiere a un multímero que contiene uno o más polipéptidos heterólogos (es decir, polipéptidos de diferentes proteínas) además de los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención. En una modalidad específica, el multímero de la Invención es un heterodímero, un heterotrímero o un heterotetrámero. En modalidades adicionales, el multímeri heteromérico de la invención es por lo menos un heterodímero, por lo menos un heterotrímero o por lo menos un heterotetrámero. Los multímeros de la invención pueden ser el resultado de asociaciones hidrofóbicas, hidrofílicas, iónicas y/o covalentes y/o pueden ser indirectamente enlazadas, por ejemplo mediante formación de liposoma. Por lo tanto, en una modalidad, los multímeros de la invención, tales como por ejemplo homodímeros u homotrímeros se forman cuando los polipéptidos de la invención hacen contacto uno con otro en solución. En otra modalidad, los heteromultímeros de la invención, tales como por ejemplo heterotrímeros o heterotetrámeros se forman cuando los polipéptidos de la invención ponen en contacto anticuerpos con los polipéptidos de la invención (incluyendo anticuerpos con la secuencia de poiipéptido heteróloga en una proteína de fusión de la invención) en solución. En otras modalidades, los multímeros de fa invención se forman mediante asociaciones covalentes con y/o entre los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención. Dichas asociaciones covalentes pueden implicar uno o más residuos de aminoácidos contenidos en la secuencia de polipéptidos (por ejemplo, aquella mencionada en SEQ ID NO: 2, o contenida en el polipéptido codificado por el clon HDGNR10. En un ejemplo, las asociaciones covalentes son entrecruzamientos entre residuos de cisteína ubicados dentro de las secuencias de polipéptidos que ¡nteractúan en el polipéptido nativo (es decir, que ocurre naturalmente). En otro ejemplo, las asociaciones covalentes son la consecuencia de manipulación química o recombinante. Alternativamente, dichas asociaciones covalentes pueden implicar uno o más residuos de aminoácidos contenidos en la secuencia de polipéptidos heteróloga en una proteína de fusión de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). En un ejemplo, las asociaciones covalentes son entre la secuencia heteróloga contenida en una proteína de fusión de la invención (véase por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,478,925). En un ejemplo específico, las asociaciones covaientes son entre la secuencia heteróloga contenida en una proteína de fusión Fc- receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención (como se describe aquí). En otro ejemplo específico, las asociaciones covalentes de proteínas de fusión de la invención son entre secuencia de poiipéptidos heteróloga de otra proteína que es capaz de formar multímeros covalentemente asociados tales como por ejemplo osteoprotegerina (véase, por ejemplo, la publicación internacional NO: WO 98/49305, cuyo contenido se incorpora aquí por referencia en su totalidad. En otra modalidad, dos o más polipéptidos de la invención se unen mediante enlazadores peptídicos. Ejemplos de éstos ¡ncluyen aquellos enlazadores peptídicos descritos en la patente de E.U.A. No. 5,073,627 (incorporada aquí por referencia). Las proteínas que comprenden polipéptidos múltiples de ia invención separados por enlazadores peptídicos se pueden producir usando tecnología de ADN recombinante convencional. Otro método para preparar polipéptidos de multímero de la invención implican el uso de polipéptidos de la invención fusionados a una secuencia de polipéptidos de endentado de leucina o endentado de isoleucina. Los dominios de endentado de leucina y endentado de isoleucina son polipéptidos que promueven la multimerizacíón de las proteínas en las cuales se encuentran. Los endentados de leucina se identificaron originalmente en varias proteínas G que se unen a ADN (Landschulz et al., Science 240:1759, (1988)), y se ha encontrado desde entonces en una variedad de diferentes proteínas. Entre los endentado de leucina conocidos están los polipéptidos que ocurren naturalmente y derivados de los mismos que dimerizan o trimerizan. Ejemplos de dominios de endentado de leucina adecuados para producir proteínas multiméricas solubles de la invención son aquellas descritas en la solicitud de PCTWO 94/10308, incorporada aquí por referencia. Las proteínas de fusión recombinantes que comprenden un polipéptido de la invención fusionado a una secuencia de poiipéptido que dimeriza o trimeriza en solución se expresan en células hospedero adecuadas, y la proteína de fusión multimérica soluble resultante es recuperada del sobrenadante de cultivo usando técnicas conocidas en el campo. Los polipéptidos triméricos de la invención pueden ofrecer la ventaja de actividad biológica incrementada. Las porciones de endentado de leucina preferidas y las porciones de isoleucina son aquellas que forman preferiblemente trímeros. Un ejemplo es un endentado de leucina derivado de proteína D de agente tensioactivo pulmonar (SPD), como se describe en Hoppe et al (títulos de FEBS 344:191 , (1994)) y el las solicitudes de patente de E.U.A. Serie No. 08/446,922, incorporada aquí por referencia. Otros péptidos derivados de proteínas triméricas que ocunen naturalmente se pueden emplear en la preparación de polipéptidos triméricos de la invención. En otro ejemplo, las proteínas de la invención están asociadas mediante interacciones entre una secuencia de polipéptidos Flag® contenida en proteínas de fusión de la invención que contiene una secuencia de polipéptidos Flag®. En una modalidad adicional, las proteínas de asociaciones de la invención están asociadas mediante interacciones entre secuencia de polipéptido heteróloga contenida en proteínas de fusión Flag® de la invención y anticuerpo antiFlag® Los multímeros de la invención se pueden generar usando técnicas químicas conocidas en la materia. Por ejemplo, los polipéptidos que se desea que estén contenidos en los multímeros de la invención pueden ser químicamente entrelazados usando moléculas enlazadoras y técnicas de optimización de longitud de molécula enlazadora conocida en la técnica (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. número 5,478,925, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad). Además, los multímeros de la invención se pueden generar usando técnicas conocidas en la materia para formar uno o más entrelazamientos intermolécula entre los residuos de cisteína ubicados dentro de la secuencia de los polipéptidos que se desea que estén contenidos en el multímero (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. número 5,478,925, que se incofora aquí por referencia en su totalidad). Además, ios polipéptidos de la invención se pueden modificar rutinariamente mediante la adición de cisteína o biotina al grupo C-terminal o N-terminal del polipéptido y técnicas conocidas conocidas en la materia se pueden aplicar para generar multímeros que contienen uno o más de estos polipéptidos modificados (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. número 5,478,925 que se incofora aquí por referencia en su totalidad). Además, las técnicas conocidas en la materia se pueden aplicar para generar iiposomas que contienen los componentes de poiipéptido que se desea que estén contenidos en el multímero de la invención (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. número 5,478,925, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad). Alternativamente, los multímeros de la invención se pueden generar usando técnicas de ingeniería genética conocidas en la materia. En una modalidad, los polipéptidos contenidos en multímeros de la invención se producen recombinantemente usando tecnología de proteína de fusión que se describe aquí o conocida de otra manera en la técnica (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. número 5,478,925, que se incofora aquí por referencia en su totalidad). En una modalidad específica, los polinucleótidos que codifican un homodímero de la invención se generar ligando una secuencia de polinucleótidos que codifica un poiipéptido de la invención a una secuencia que codifica un polipéptido enlazador y después a un poiipéptido sintético que codifica el producto traducido del polipéptido en la orientación de reversa del grupo C-terminal original al grupo N-terminal (que carece de la secuencia líder) (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. número 5,478,925, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad). En otra modalidad, las técnicas recombinantes que aquí se describen o conocidos de otra manera en la técnica se aplican para generar polipéptidos recombinantes de la invención que contienen un dominio de transmembrana (o hidrofóbico o péptido de señal) y que se pueden incorporar mediante técnicas de reconstitución de membrana en liposomas (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. número 5,478,925, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad).

Uso de polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CQR5) Los polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) identificados aquí se pueden usar de numerosas formas como reactivos. La siguiente descripción se deberá considerar como ejemplo y utiliza técnicas conocidas. Existe la necesidad de identificar nuevos marcadores de cromosomas, ya que algunos reactivos marcadores de cromosomas, basados en datos de secuencia reales (polimorfismos de repetición) están actualmente disponibles. En breve, las secuencias se pueden mapear a cromosomas preparando iniciadores de PCR (preferiblemente 15-25 bp) de las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 1 o del clon depositado. Los iniciadores que se pueden seleccionar usando análisis de computadora de modo que no se expandan más que un exon predicho en el ADN genómico. Estos iniciadores se usan entonces para seleccionar por PCR híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. Sólo aquellos híbridos que contienen el gen de receptor de qulmiocina de proteína G (CCR5) correspondiente a SEQ ID NO: 1 o al clon depositado producirán un fragmento amplificado. De manera similar, los híbridos somáticos proveerán un método rápido de mapeo por PCR de los polinucleótidos a cromosomas particulares. Tres o más clones se pueden asignar por día usando un solo ciclador térmico.

Además, la sublocalización de los polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden lograr con paneles de fragmentos de cromosoma específico. Otras estrategias de mapeo de genes que se pueden usar incluyen hibridación in situ, preselección con cromosomas distribuidos por flujo marcados y preselección por hibridación para construir genotecas de ADNc específica de cromosoma. La locallzación cromosómica precisa de los polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también se puede lograr usando hibridación in situ por fluorescencia (FISH) de una preparación cromosómica en metafase. Esta técnica utiliza polinucleótidos tan cortos como de 500 ó 600 bases; sin embargo, se prefieren polinucleótidos de 2,000 a 4,000 pb. Para una revisión de esta técnica, véase Verma et al., "Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques", Pergamon Press, New York (1988). Para mapeo de cromosomas, los polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden usar individualmente (para marcar un solo cromosoma o un solo sitio en el cromosoma) o en paneles (para el mareaje de sitios múltiples y/o cromosomas múltiples). Los polinucleótidos preferidos corresponden a las regiones no codificadoras de los ADNc o clon genómico debido a que las secuencias de codificación son más probablemente conservadas dentro de familias de genes, incrementando así la probabilidad de hibridación cruzada durante mapeo cromosómico. Una vez que se ha mapeado un polinucleótido a una localización cromosómica precisa, la posición física del polinucleótido se puede usar en análisis de enlace. El análisis de enlace establece la coherencia entre una localización cromosómica y presentación de una enfermedad particular (los datos de mapeo de enfermedades se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance ¡n Man (disponible en línea a través de Johns Hopkins University Welch Medical Library). Suponiendo la resolución de mapeo de 1 megabase y un gen por 20 kb, un ADNc precisamente localizado para una región cromosómica asociada con la enfermedad podría ser uno de 50-500 genes causales potenciales. Por lo tanto, una vez que se establece la coherencia, las diferencias en el polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) y el gen correspondiente entre individuos afectados y no afectados se puede examinar, primero, las alteraciones estructurales visibles en los cromosomas, tales como deleciones o translocaciones, se examinan en preparaciones cromosómicas o por PCR. Si no existen alteraciones estructurales, la presencia de mutaciones puntuales se logra. Las mutaciones observadas en algunos de los individuos afectados o todos, pero en individuos normales, indica que la mutación puede causar la enfermedad. Sin embargo, la secuenciación completa del polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) y el gen correspondiente de algunos individuos normales se requiere para distinguir la mutación de un polimorfismo. Si se identifica un nuevo polimorfismo, este polipéptido polimórfico se puede usar para análisis de enlace adicional.

Además, la expresión incrementada o disminuida del gen en individuos afectados en comparación con individuos no afectados se puede evaluar usando polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Cualesquiera de estas alteraciones (expresión alterada, reordenamlento cromosómico o mutación) se puede usar como un marcador de diagnóstico o pronóstico. Por lo tanto, la invención también provee un método de diagnóstico útil durante el diagnóstico de un trastorno, que implica medir el nivel de expresión de polinucleótidos de la presente invención en células o fluido corporal de un individuo y compara el nivel de expresión del gen medido con un nivel estándar de nivel de expresión del pollnucleótido, por lo que un • incremento o disminución en el nivel de expresión de gen comparado con el estándar es indicativo de un trastorno. En otra modalidad, la invención incluye un equipo para analizar muestras para la presencia de polinucleótidos proliferativos y/o cancerosos derivados de un sujeto de prueba. En una modalidad general, ei equipo incluye por lo menos una sonda polinucleótido que contiene una secuencia de poiinucieótido que hibridará específicamente con un polinucleótido de la presente invención y un contenedor adecuado. En una modalidad específica, el equipo incluye dos sondas de polinucleótido que definen una región interna del polinucleótido de la presente invención, en donde cada sonda tiene una cadena que contiene un extremo 31 'mero interno a la región. En una modalidad adicional, las sondas pueden ser útiles como iniciadores para amplificación por reacción de cadena de poiimerasa. En donde un diagnóstico de un trastorno, ya se ha hecho de acuerdo con métodos convencionales, la presente invención es útil como un indicador de pronóstico, por lo que los pacientes que presentan polinucleótido incrementado o deprimido de la expresión de la presente invención experimentarán un resultado clínico peor en relación con pacientes que expresan el gen a un nivel más cercano al nivel estándar. Por "medición del nivel de expresión de polinucleótido de la presente invención" se entiende la medición o estimación cualitativa o cuantitativa del nivel de polinucleótido de la presente invención o el nivel de ARNm que codifica el polinucleótido en una primera muestra biológica ya sea directamente (por ejemplo, determinando o estimando el nivel de proteína absoluto o el nivel de ARNm) o relativamente (por ejemplo, comparando con el nivel de polipéptido o el nivel de ARNm en una segunda muestra biológica). Preferiblemente, el nivel de polipéptido o nivel de ARNm en la primera muestra biológica se mide o se estima y se compara con un nivel de polipéptido estándar o un nivel de ARNm, el estándar siendo tomado de una segunda muestra biológica obtenida de un individuo que no tiene el trastorno o que está siendo determinada promediando niveles de una población de individuos que no tienen un trastorno. Como se apreciará en la técnica, una vez que se conoce un nivel de polipéptido estándar o un nivel de ARNm, se puede usar repetidamente como un estándar para combinación.

Por "muestra biológica" se entiende cualquier muestra biológica obtenida de un individuo, fluido corporal, línea celular, cultivo de tejido u otra fuente que contenga el polipéptido de la presente invención o ARNm. Como se indicó, las muestras biológicas incluyen fluidos corporales (tales como semen, linfa, suero, plasma, orina, fluido sinovial y fluido espinal) que contienen el polipéptido de la presente invención, otras fuentes de tejido que se encuentran que expresan el polipéptido de la presente invención. Los métodos para obtener biopsias de tejido y fluidos corporales de mamífero son bien conocidos en la técnica. En donde la muestra biológica ha de incluir ARNm, la fuente preferida es una biopsia de tejido. El método(s) provisto anteriormente puede aplicarse preferiblemente en un método de diagnóstico y/o equipo de diagnóstico en los cuales polinucleótidos y/o polipéptidos se unen a un soporte sólido. En un método ilustrativo, el soporte puede ser una "oblea de gen" o una "oblea biológica" como se describe en las patentes de E.U.A. 5,837,832, 5,874,219 y 5,856,174. Además, dicha oblea de gen con polinucleótidos de la presente invención unidos se puede usar para Identificar polimorfismos entre las secuencias poiinucleótido con polinucleótidos aislados de un sujeto de prueba. El conocimiento de dichos polimorfismos (es decir, su localización, así como su existencia) sería benéfico para identificar loci de enfermedad para muchos trastornos, incluyendo enfermedades y condiciones cancerosas. Dicho método se describe en las patentes de E.U.A. 5,858,659 y 5,856,104. Las patentes de E.U.A. anteriormente referenciadas de incorporan aquí por referencia en su totalidad. La presente invención comprende polinucleótidos de la presente invención que son químicamente sintetizados o reproducidos como ácidos nucleicos de péptidos (PNA), o de acuerdo con otros métodos conocidos en la técnica. El uso de PNA serviría como la forma preferida si polinucleótidos de incorporaran en un soporte sólido, o una oblea de gen. Para los propósitos de la presente invención, un ácido nucleico de péptido (PAN) es un tipo de poliamida de análogo de ADN y las unidades monoméricas para adenina, guanina, timidina y cistosina están comercialmente disponibles (Perceptive Biosystems). Ciertos componentes de ADN tales como fósforo, óxido de fósforo o derivados de desoxirribosa no están presentes en PNA. Como se describe en, P.E. Nielsen, M. Egholm, R.H. Berg y O. Buchardt, Science 254-1497 (1991); y M. Egholm, O. Buchardt, L. Christensen, C.Behrens, S.M. Freier, D.A. Driver, R.H. Berg, S.K. Kim, B. Norden, y P.E. Nielsen, Nature 365, 666 (1993), se une específicamente y estrechamente a cadena s de ADN complementarias y no son degradados por nucleasas. De hecho, PNA se une más fuertemente a ADN que el ADN mismo. Esto es probablemente debido a que no hay repulsión electrostática entre las dos cadenas, y también la estructura de base de poliamida es más flexible. Debido a esto, los dúplex de PNA/ADN se unen bajo una escala más amplia de condiciones de astringencia que los dúplex de ADN/ADN, haciendo más fácil realizar la hibridación múltiple. Se pueden usar sondas más pequeñas que con ADN debido a la unión fuerte. Además, es más probable que las correspondencias erróneas de una sola base se puedan determinar con hibridación de PNA ADN debido a una sola correspondencia errónea en 15-mero de PNA/ADN reduce el punto de fusión (Tm) por 8°-20°C, vs. 4°-16°C para el dúplex de 15-mero de ADN/ADN. También, la ausencia de grupos de carga en PNA significa que la hibridación se puede hacer a resistencias iónicas bajas y reduce posible interferencia por sal durante el análisis. La presente invención es útil para detectar cáncer en mamíferos. En particular, la invención es útil durante el diagnóstico de neopasias proliferativas de células patológicas que incluyen pero no se limitan a: leucemias mielógenas agudas incluyendo leucemia monocítica aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia promlelocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, eritroleucemia aguda, leucemia megakariocítica agua aguda y leucemia no diferenciada aguda, etc.; y leucemias mielógenas crónicas incluyendo leucemia mielomonocítica crónica, leucemia granulocítica, etc. Los mamíferos preferidos incluyen monos, simios, gatos, perros, vacas, cerdos, caballos, conejos y humanos. Se prefieren particularmente los humanos. Los trastornos proliferativos de células patológicas a menudo están asociados con activación inapropiada de proto-oncogenes. (Gelmann, E.P. et al., "The Etiology of Acute Leukemia: Molecular Genetics and Viral Oncology", en Neoplastic Diseases of the Blood, Vol. 1., Wiernik, P.H. et al. eds., 161-182 (1985)). Ahora se cree que las neoplasias resultan de la alteración cualitativa de un producto de gen celular normal, o de la modificación cuantitativa de expresión de gen por inserción en el cromosoma de una secuencia viral, por translocación cromosómica de un gen a una región más activamente transcrita o por algún otro mecanismo (Gelmann et al., supra). Es probable que la expresión mutada o alterada de genes específicos esté implicada en la patogénesis de algunas leucemias, entre otros tejidos y tipos de células (Gelmann et al., supra). De hecho, las contrapartes humanas de los oncogenes implicados en la algunas neoplasias animales se han amplificado o translocado en algunos casos de leucemia humana y carcinoma humano (Gelmann et al., supra). Por ejemplo, la expresión de c-myc es altamente amplificada en la línea de células de leucemia no linfocítica HL-60. Cuando las células HL-60 son químicamente inducidas para detener la proliferación, el nivel de c-myc s encuentra que es regulado descendentemente (International Publicaton Number WO 91/15580). Sin embargo, se ha mostrado que la exposición de células HL-60 a una construcción de ADN que es complementaria a un extremo 5' de c-myc o c-myb bloquea la traducción de lo ARNm correspondientes que regula descendentemente la expresión de las proteínas c-myc o c-myb y provoca la detención de la proliferación y diferenciación celular de las células tratadas (International Publicación Number WO 91/15580; Wickstrom et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 85:1028 (1998); Anfossi et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 86-3379 (1989)). Sin embargo, un experto en la técnica apreciará que la utilidad de la presente Invención no se limitaría al tratamiento de enfermedades, trastornos y/o condiciones proliferativas de células y tejidos hematopoyéticos, a la luz de las numerosas células y tipos de células de orígenes variables que se sabe que presentan fenotipos proliferativos. Además de lo anterior, se puede usar un polinucleótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) para controlar la expresión de genes a través de ia formación de triple hélice o ADN o ARN de antisentido. Las técnicas de antisentido se describen, por ejemplo, en Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); "Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988). La formación de triple hélice se describe, por ejemplo, en Lee et al., Nucleic Acids Research 6:3073 (1979); Cooney et al., Science 241: 456 (1988); y Dervan et ai., Science 251: 1360 (1991). Ambos métodos se basan en la unión de polinucleótido a un ADN o ARN complementario. Para estas técnicas, los polinucleótidos preferidos son generalmente oligonucieótidos de 20 a 40 bases de longitud y complementarios a cualquiera de la región del gen implicado en la transcripción (triple hélice, véase Lee et al., Acids Res. 6:3073 (1979); Cooney et al., Science 241:456 (1988); y Dervan et al., Science 251:1360 (1991) o al ARNm mismo (antisentido - Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991); Oligodeoxy-neuclotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988)). La formación de triple hélice opcionalmente da por resultado una Inactivación de transcripción de ARN a partir de ADN, mientras que la hibridación de ARN de antisentido bloquea la traducción de una molécula de ARNm en polipéptido. Ambas técnicas son efectivas en sistemas de modelo y la información que aquí se describe se puede usar para designar polinucleótidos de antisentido o de triple hélice en un esfuerzo para tratar o prevenir una enfermedad. Los poiinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también son útiles en terapia génica. Una meta de la terapia génica es insertar un gen normal en un organismo que tiene un gen defectuoso, en un esfuerzo para corregir el defecto genético. El receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) ofrece un medio para dirigir dichos defectos genéticos de una manera altamente precisa. Otra meta es insertar un nuevo gen que no estaba presente en el genoma del hospedero, produciendo así un nuevo rasgo en la célula hospedero. Los polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también son útiles para identificar individuos a partir de muestras biológicas diminutas. Los cuerpos militares de los Estados Unidos, por ejemplo, están considerando el uso de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) para la identificación de personal. En esta técnica, el ADN genómico de un individuo es digerido con una o más enzimas de restricción, y sondeado en un método de Southern blot para producir bandas únicas para identificar al personal. Este método no adolece de las limitaciones actuales de "etiquetas de peno" que se pueden perder, cambiar o robar, haciendo difícil la identificación positiva. Los polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden usar como marcadores de ADN para RFLP. Los polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también se pueden usar como una alternativa a RFLP, determinado la secuencia de ADN de base por base real de porciones seleccionadas del genoma de un individuo. Estas secuencias se pueden usar para preparar iniciadores de PCR para amplificar y aislar dicho ADN seleccionado, que después puede ser secuenciado. Usando esta técnica, los individuos pueden ser identificados debido a que cada individuo tendrá un conjunto único de secuencias de ADN. Una vez que una base de datos de ID única se establece para un individuo, la identificación positiva de ese individuo, vivo o muerto, se puede hacer a partir de muestras de tejido extremadamente pequeñas. La biología forense también se beneficia del uso de técnicas de identificación basadas en ADN como se describe aquí. Las secuencias de ADN tomadas de varias muestras biológicas muy pequeñas tales como tejido, por ejemplo, cabello o piel, o fluidos corporales, por ejemplo, sangre, saliva, semen, líquido sinovial, líquido amniótico, leche materna, linfa, esputo pulmonar o agente tensioactivo, orina, material fecal, etc., se puede amplificar usando PCR. En una técnica anterior, las secuencias de genes amplificadas a partir de loci polimórficos, tales como gen de HLA de DQa de clase II se usan en biología forense para identificar individuos (Erlich, H., PCR Technology; Freeman and Co. (1992)). Una vez que estos loci polimórficos específicos son amplificados, son digeridos con una o más enzimas de restricción, produciendo un conjunto identificable de bandas en una sonda de Southern blot con ADN correspondiente al gen de HLA de DQa de clase II. De manera similar, los polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden usar como marcadores polimórficos para propósitos forenses. También existe la necesidad de reactivos capaces de identificar la fuente de un tejido particular. Dicha necesidad surge, por ejemplo, en investigación forense cuando se presenta con tejido de origen desconocido. Los reactivos apropiados pueden comprometer, por ejemplo, sondas de ADN o iniciadores específicos para un tejido particular preparado a partir de secuencias de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Paneles de dicho reactivo pueden identificar tejido por especie y/o por tipo de órgano. De una manera similar, esos reactivos se pueden usar para seleccionar cultivos de tejido para contaminación. Debido a que el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se expresa en macrófagos y células T de memoria, los polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) son útiles como sondas de hibridación para la identificación diferencial del tejldo(s) o tipo(s) de células presentes en una muestra biológica. De manera similar, los péptidos y anticuerpos dirigidos a polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) son útiles para proveen sondas inmunoiógicas para identificación diferencial del tejido (s) o tipo (s) de células. Además, para un número de enfermedades, trastornos, y/o condiciones de los tejidos anteriores o células anteriores, o en los cuales las células juegan un papel, los niveles significativamente mayores o menores de expresión de gen de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden detectar en ciertos tejidos (por ejemplo, tejidos cancerosos o lesionados) o fluidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovia! o liquido espinal) tomado de un individuo que tiene dicho trastorno, en relación con un nivel de expresión de gen de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) "estándar", es decir, el nivel de expresión de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) en tejido sano de un individuo que no tiene el trastorno relacionado con sistema inmune. Por lo tanto, la invención provee un método de diagnóstico de un trastorno, que implica: (a) probar el nivel de expresión de gen de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) en células o fluido corporal de un individuo; (b) comparar el nivel de expresión de gen de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) con un nivel de expresión de gen de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) estándar, por io que un incremento o disminución en el nivel de expresión de gen de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) probado comparado con el nivel de expresión estándar es indicativo de trastorno en el sistema inmune o relacionado con el sistema inmune. En una modalidad preferida, la invención provee un método para usar polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o fragmentos o variantes de los mismos como una vacuna para inducir una respuesta inmune al receptor de quimiocina de proteína G. En una modalidad preferida, la invención provee un método para usar polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o fragmentos o variantes de los mismos como una vacuna de ADN para inducir una respuesta inmune humoral (mediada por anticuerpo) al receptor de quimiocina de proteína G. En otras modalidadaes altamente preferidas, la invención provee un método para usar polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que comprende la secuencia de polinucieótido de uno o más bucles extracelulares de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (es decir, aminoácidos 89-102, 167-195 y/o 261-274 de SEQ ID NO:2 o el polipéptido codificado por ei clon depositado (SEQ ID NO:22)) como una vacuna de ADN para inducir respuesta inmune a un receptor de quimiocina de proteína G. En otras modalidades altamente preferidas, la invención provee un método para usar polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que comprenden la secuencia de polinucleótido del primer bucle extracelular del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (es decir, los aminoácidos 89-102 de SEQ ID NO: 2 o del polipéptido codificado por el clon depositado (SEQ ID NO: 22)) como una vacuna de ADN para inducir una respuesta inmune a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). En otras modalidades altamente preferidas, ia invención provee un método para usar polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que comprende la secuencia de nucleótidos del segundo bucle extracelular de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (es decir, aminoácidos 167-195 de SEQ ID NO:2 o el polipéptido codificado por el clon depositado (SEQ ID NO: 22)) como una vacuna de ADN para inducir una respuesta inmune a receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). En otras modalidades altamente preferidas, la invención provee un método para usar polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que comprenden la secuencia de polinucleótidos del tercer bucle extracelular de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (es decir, 261-274 de SEQ ID NO: 2) o del polipéptido codificado por el clon depositado (SEQ ID NO: 22)) como una vacuna de ADN para inducir una respuesta inmune a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). En otras modalidades altamente preferidas, la invención provee un método para usar polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que comprenden la secuencia de nucleótidos de uno o más bucles extracelulares de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (es decir, aminoácidos 89-102, 167-195 y/o 261-274 de SEQ ID NO:2 o el polipéptido codificado por el clon depositado (SEQ ID NO: 22)) como una vacuna de ADN para inducir una respuesta inmune humoral a receptor de quimiocina de proteína G. En otras modalidades altamente preferidas, la invención provee un método para usar polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que comprenden la secuencia de nucleótido del primer bucle extracelular de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (es decir, los aminoácidos 89-102 de SEQ ID NO: 2 o el polipéptido codificado por el clon depositado (SEQ ID NO: 22)) como una vacuna de ADN para inducir una respuesta inmune humoral al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). En otras modalidades altamente preferidas, la invención provee un método para usar polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que comprenden la secuencia de nucleótido del segundo bucle extracelular del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (es decir, los aminoácidos 167-195 de SEQ ID NO: 2 o del polipéptido codificado por el clon depositado (SEQ ID NO: 2) o del polipéptido codificado por el con depositado (SEQ ID NO: 22)) como una vacuna de ADN para inducir una respuesta inmune humoral al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). En otras modalidades altamente preferidas, la invención provee un método para usar polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que comprenden la secuencia de nucleótidos del tercer bucle extracelular del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (es decir, 261-274 de SEQ ID NO: 2 o del polipéptido codificado por el clon depositado (SEQ ID NO: 22)) como una vacuna de ADN para inducir una respuesta inmune humoral al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). En otra modalidad, la presente invención provee una vacuna e ADN que comprende o que consiste alternativamente de un polinucleótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o fragmento o variante del mismo. En otra modalidad preferida, la presente invención provee una vacuna de ADN que comprende o que consiste alternativamente de un polinucleótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que codifica la secuencia de nucleótidos de uno o más bucles extracelulares del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (es decir, los aminoácidos 89-102, 167-195 y/o 261-274 de SEQ ID NO: 2 o del polipéptido codificado por el clon depositado (SEQ ID NO: 22)). En otra modalidad preferida, la presente invención provee una vacuna de ADN que comprende o que consiste alternativamente de un polinucleótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que codifica la secuencia de nucleótido del primer bucle extracelular de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (es decir, los aminoácidos 89-102 de SEQ ID NO: 2 o del polipéptido codificado por el clon depositado (SEQ ID NO: 22)). En otra modalidad preferida, la presente invención provee una vacuna de ADN que comprende o que consiste alternativamente de un polinucleótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que codifica ia secuencia de nucleótido del segundo bucle extracelular del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (es decir, los aminoácidos 167-195 de SEQ ID NO: 2 o del polipéptido codificado por el con depositado (SEQ ID NO: 22)). En otra modalidad preferida, la presente invención provee una vacuna de ADN que comprende o que consiste alternativamente de un polinucieótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que codifica la secuencia de nucleótidos del tercer bucle extracelular de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (es decir, los aminoácidos 261-274 de SEQ ID NO: 2 o del polipéptido codificado por el clon depositado (SEQ ID NO: 22)). En modalidades altamente preferidas, las vacunas anteriormente descritas se administran a un animal, incluyendo humanos, para prevenir infección viral. En modalidades aún más altamente preferidas, las vacunas anteriormente descritas se administran a un animal, incluyendo humanos, para prevenir infección por VIH. En otras modalidades altamente preferidas, las vacunas anteriormente descritas se administran a un animal, incluyendo humanos, para prevenir infección por poxvirus. En otras modalidades altamente preferidas, las vacunas anteriormente descritas se administran a un animal, incluyendo humanos, para prevenir infección por citomegalovirus. Por último, los polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden usar como marcadores de peso molecular en geles Southern, como sondas de diagnóstico para la presencia de un ARNm específico en un tipo de célula particular, como una sonda para "sustraer" secuencias conocidas en el procedimiento de descubrir polinucleótidos novedosos, para seleccionar y hacer oligómeros para unirlos a una "oblea de gen" u otro soporte, para producir anticuerpos anti-ADN usando técnicas de inmunización de ADN, y como un antígeno para inducir una respuesta inmune.

Usos de polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) Los poiipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden usar de numerosas formas. La siguiente descripción deberá considerarse como ejemplo y utiliza técnicas conocidas. Los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden usar para probar niveles de proteína en una muestra biológica usando técnicas basadas en anticuefo. Por ejemplo, la expresión de proteína en tejidos se puede estudiar con métodos inmunohistológicos clásicos (Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 101 :976-985 (1985); Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar la expresión de gen de proteína G incluyen inmunoensayos, tales como la prueba inmunoabsorbente ligada a enzima (ELISA) y el radioinmunoensayo (RÍA). Los marcadores de prueba de anticuerpo adecuados se conocen en la técnica e incluyen marcadores de enzima tales como glucosa oxidasa y radioisótopos tales como yodo (1251, 1211), carbono (14C), azufre (35S); tritio (3H), indio (112ln) y tecnetio (99mTc), y marcadores fluorescentes tales como fluoresceína y rodamina, y biotina. Además de probar los niveles de proteína G en una muestra biológica, las proteínas también se pueden detectar in vivo mediante formación de imagen. Los marcadores de anticuefo o marcadores para formación de imagen in vivo de proteína incluyen aquellos detectables por radiografía de rayos X, RMN o ESR. Para radiografía de rayos X, los marcadores adecuados incluyen radioisótopos tales como bario o cesio, que emiten radiación detectable pero no provocan daño al sujeto. Los marcadores adecuados para RMN y ESR incluyen aquellos con un espín característico detectable, tales como deuterio, que se pueden incoforar en el anticuerpo marcando nutrientes para el hibridoma pertinente. Un anticuerpo específico de proteína y fragmento de anticuerpo que se ha marcado con una porción de formación de imagen detectable apropiada, tal como un radioisótopo (por ejemplo, 1311, 112ln, 99mTc), una sustancia radio-opaca o un material detectable por resonancia magnética nuclear, se introduce (por ejemplo, por vía parenteral, subcutánea o intraperitoneal) en el mamífero. Se entenderá en la técnica que el tamaño del sujeto y el sistema de formación de imagen determinarán la cantidad de porción de imagen necesaria para producir imágenes de diagnóstico. En el caso de una porción de radioisótopo, para un sujeto humano, la cantidad de radioactividad inyectada normalmente variará de alrededor de 5 a 20 milicuries de 99mTc. El anticuerpo marcado o fragmento de anticuefo marcado entonces preferencialmente se acumulará en ei sitio de las células que contienen la proteína específica. La formación de imagen de tumor in vivo se describe en S.W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments." (Capítulo 13 en Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cáncer, S.W. Burchiel y B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)). Por lo tanto, la Invención provee un método de diagnóstico de un trastorno, que implica (a) someter a prueba la expresión del polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) en células o líquido corporal de un individuo; (b) comparar el nivel de expresión de gen con un nivel de expresión de gen estándar, por lo que un incremento o disminución en el nivel de expresión de polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) probado comparado con el nivel de expresión estándar es indicativo de un trastorno. Con respecto al cáncer, la presencia de una cantidad relativamente alta de transcripción en tejido extraído como biopsia de un individuo puede indicar una predisposición para el desarrollo de la enfermedad, o puede probar un medio para detectar la enfermedad antes de la aparición de síntomas clínicos reales. Un diagnóstico más definitivo de este tipo puede permitir a los profesionales de la salud emplear medidas preventivas o tratamiento agresivo temprano evitando así el desarrollo o progreso posterior del cáncer. Más aún, los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden usar para tratar, prevenir y/o diagnosticar enfermedad. Por ejemplo, se puede administrar a los pacientes polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) en un esfuerzo para reemplazar niveles ausentes o disminuidos del polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (por ejemplo insulina), para complementar niveles ausentes o disminuidos de polipéptido diferente (por ejemplo, hemoglobina S para hemoglobina B, SOD, catalasa, proteínas de reparación de ADN), para inhibir la actividad de un polipéptido (por ejemplo, un supresor de oncogen o tumor), para activar la actividad de un polipéptido (por ejemplo, mediante unión a un receptor), para reducir la actividad de un receptor unido a membrana compitiendo con el mismo por ligando libre (por ejemplo, receptores de FNT solubles usados en reducción de inflamación), o para producir una respuesta deseada (por ejemplo, inhibición de crecimiento de vasos sanguíneos, incremento de la respuesta inmune a células o tejidos proliferativos). De manera similar, los anticuefos dirigidos a polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también se pueden usar para tratar, prevenir y/o diagnosticar enfermedad. Por ejemplo, la administración de un anticuefo dirigido a un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se puede unir y reducir la sobreproducción del polipéptido. De manera similar, la administración de un anticuefo puede activar el polipéptido, tal como mediante la unión a un polipéptido unido a una membrana (receptor). En una modalidad adicional, la invención provee un método para usar polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o fragmentos o variantes como una vacuna para inducir una respuesta inmune a receptor de quimiocina de proteína G. En una modalidad preferida, la invención provee un método para usar polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o fragmentos o variantes de los mismos como una vacuna para inducir una respuesta inmune humoral (mediada por anticuerpo) a receptor de quimiocina de proteína G. En otras modalidades altamente preferidas, la invención provee un método para usar polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que comprende la secuencia de aminoácidos de uno o más bucles extracelulares de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (es decir, los aminoácidos 89-102, 167-195 y/o 261-274 de SEQ ID NO: 2 o del polipéptido codificado por el clon depositado (SEQ ID NO: 22)) como una vacuna para inducir una respuesta inmune a un receptor de quimiocina de proteína G. En otras modalidades altamente preferidas, la invención provee un método para usar polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que comprenden la secuencia de aminoácidos del primer bucle extracelular del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (es decir, los aminoácidos 89-102 de SEQ ID NO: 2 o del polipéptido codificado por el clon depositado (SEQ ID NO: 22)) como una vacuna para inducir una respuesta inmune a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). En otras modalidades altamente preferidas, la invención provee un método para usar polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que comprenden la secuencia de aminoácidos del segundo bucle extracelular del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (es decir, los aminoácidos 167-195 de SEQ ID NO: 2 o el polipéptido codificado por el clon depositado (SEQ ID NO: 22)) como una vacuna para inducir una respuesta inmune a receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). En otras modalidades altamente preferidas, la invención provee un método para usar polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que comprende la secuencia de aminoácidos del tercer bucle extracelular de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (es decir, 261-274 de SEQ ID NO: 2 o del polipéptido codificado por el clon depositado (SEQ ID NO: 22)) como una vacuna para inducir una respuesta imune a receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). En otras modalidades altamente preferidas, la invención provee un método para usar polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que comprende la secuencia de aminoácidos de uno o más bucles extracelulares de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (es decir, los aminoácidos 89-102, 167-195 y/o 261-274 de SEQ ID NO: 2 o del polipéptido codificado por el clon depositado (SEQ ID NO: 22)) como una vacuna para inducir una respuesta inmune humoral a un receptor de quimiocina de proteína G. En otras modalidades altamente preferidas, la invención provee un método para usar polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que comprende la secuencia de aminoácidos del primer bucle extracelular del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (es decir, los aminoácidos 89-102 de SEQ ID NO: 2 o del polipéptido codificado por el clon depositado (SEQ ID NO: 22)) como una vacuna para inducir respuesta inmune humoral al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). En otras modalidades altamente preferidas, la invención provee un método para usar polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que comprenden la secuencia de aminoácidos del segundo bucle extracelular de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (es decir, los aminoácidos 167-195 de SEQ ID NO: 2 del polipéptido codificado por el clon depositado (SEQ ID NO: 22)) como una vacuna para inducir una respuesta inmune humoral al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). En otras modalidades altamente preferidas, la invención provee un método para usar polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que comprenden la secuencia de aminoácidos del tercer bucle extracelular del receptor de qulmiocina de proteína G (CCR5) (es decir, 261-274 de SEQ ID NO: 2 o del polipéptido codificado por el clon depositado (SEQ ID NO: 22) como una vacuna para inducir una respuesta inmune humoral al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). En otra modalidad, la presente invención provee una vacuna que comprende o que consiste alternativamente de un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o un fragmento o variante del mismo. En otra modalidad preferida, la presente invención provee una vacuna que comprende o que consiste alternativamente de un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que codifica la secuencia de aminoácidos de uno o más lazos extracelulares del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (es decir, los aminoácidos 89-102, 167-195 y/o 261-274 de SEQ ID NO: 2 del polipéptido codificado por el clon depositado (SEQ ID NO: 22)). En otra modalidad preferida, la presente invención provee una vacuna que comprende o que consiste alternativamente de un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que codifica la secuencia de aminoácidos del primer bucle extracelular del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (es decir, los aminoácidos 89-102 de SEQ ID NO: 2 o del polipéptido codificado por el clon depositado (SEQ ID NO: 22)). En otra modalidad preferida, la presente invención provee una vacuna que comprende o que consiste alternativamente de un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que codifica la secuencia de aminoácidos del segundo bucle extracelular de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (es decir, los aminoácidos 167-195 de SEQ ID NO: 2 o del polipéptido codificado por ei clon depositado (SEQ ID NO: 22)). En otra modalidad preferida, la presente invención provee una vacuna que comprende o que consiste alternativamente de un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que codifica la secuencia de aminoácidos del tercer bucle extracelular del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (es decir, los aminoácidos 261-274 de SEQ ID NO: 2 o del polipéptido codificado por el clon depositado (SEQ ID NO: 22)). En modalidades altamente preferidas, las vacunas anteriormente descritas se administran a un animal, incluyendo humanos, para prevenir infección viral. En modalidades aún más altamente preferidas, las vacunas anteriormente descritas se administran a un animal, incluyendo humanos, para prevenir infección por VIH. En otras modalidades altamente preferidas, las vacunas anteriormente descritas se administran a un animal, incluyendo humanos, para prevenir infección por poxvirus. En otras modalidades altamente preferidas, las vacunas anteriormente descritas se administran a un animal, incluyendo humanos, para prevenir infección por citomegalovirus. Por último los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden usar como marcadores de peso molecular en geles de SDS-PAGE o en columnas de filtración del gel de tamiz molecular usando métodos bien conocidos por ios expertos en la técnica. Los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también se pueden usar para producir anticuerpos que a su vez se usan para medir expresión de proteína a partir de una célula recombinante, como un medio para evaluar la transformación de la célula hospedero. Además, los polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden usar para probar las siguientes actividades biológicas.

Métodos de terapia de génica Otros aspectos de la presente invención son los métodos de terapia génica para tratar o prevenir trastomos, enfermedades y condiciones. Los métodos de terapia génica se refieren a la introducción de secuencias de ácido nucleico (ADN, ARN y ADN o ARN de antisentido) en un animal para lograr expresión del polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención. Este método requiere un polinucleótido que codifique un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) operativamente enlazado a un promotor y cualesquiera otros elementos genéticos necesarios para ia expresión del polipéptido por el tejido objetivo. Dichas técnicas de terapia génica y de suministro de genes son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo WO90/11092, que se incorpora aquí por referencia. Por lo tanto, por ejemplo, las células de un paciente pueden ser manipuladas genéticamente con un polinucleótido (ADN o ARN) que comprenda un promotor operablemente enlazado a un polinucleótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) ex vivo, con las células genéticamente manipuladas siendo después provistas a un paciente que va a ser tratado con el polipéptido. Dichos métodos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, véase, Belldegrun, A., et al., J. Nati. Cáncer Inst. 85: 207-216 (1993); Fenantini, M. et al., Cáncer Research 53: 1107-1112 (1993); Ferrantini, M. et al., J. Immunoiogy 153: 4604-4615 (1994); Kaido, T., et al., Int. J. Cáncer 60: 221-229 (1995); Ogura, H., et al., Cáncer Research 50: 5102-5106 (1990); Santodonato, L., et al., Human Gene Therapy 7:1-10 (1996); Santodonato, L., et al., Gene Therapy 4:1246-1255 (1997); and Zhang, J.-F. et a1., Cáncer Gene Therapy 3: 31-38 (1996)), que se incorpora aquí por referencia. En una modalidad, las células que son genéticamente manipuladas son células arteriales. Las células arteriales pueden ser reintroducidas en el paciente mediante inyección directa a la arteria, los tejidos que circundan la arteria o a través de inyección de catéter. Como se describe con más detalle más adelante, las construcciones de polinucleótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) pueden ser suministradas por cualquier método que suministre materiales inyectables a las células de un animal, tal como, inyección en el espacio intersticial de tejidos (corazón, músculo, piel, pulmón, hígado y similares). Las construcciones de polinucleótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) pueden ser suministradas en un vehículo líquido a acuoso farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, el polinucleótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) es suministrado como un polinucleótido desnudo. El término polinucleótido, ADN o ARN "desnudo" se refiere a secuencias que son libres de cualquier vehículo de suministre que actúe para ayudar, promover o facilitar la entrada a la célula, incluyendo secuencias virales, partículas virales, formulaciones de liposoma, agentes de lipofectina o precipitantes y similares. Sin embargo, los polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también pueden ser suministrados en formulaciones de liposoma y en formulaciones de lipofectina y similares se pueden preparar por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Dichos métodos se describen, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. Nos. 5,593,972, 5,589,466 y 5,5580,859, que se incoforan aquí por referencia. Las construcciones de vector de polinucleótido de receptor de quimiocina de proteína G usadas en el método de terapia génica son preferiblemente construcciones que no se integrarán en el genoma del hospedero ni contendrán secuencias que permitan la replicación. Los vectores apropiados incluyen pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 y pSG disponibles de Stratagene; pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles de Pharmacia; y pEF1A/5, pcDNA3.1 y pRc/CMV2 disponibles de Invitrogen. Otros vectores adecuados serán fácilmente evidentes para el experto en la técnica. Cualquier promotor fuerte conocido por los expertos en la técnica se puede usar para impulsar la expresión de secuencia de polinucleótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Los promotores adecuados incluyen promotores adenovirales, tales como el promotor último mayor adenoviral, o promotores heterólogos, tales como el promotor de citomegalovirus (CMV); el promotor de virus sincicial respiratorio (RSV); promotores inducibles tales como el promotor de MMT, el promotor de metalotioneina; promotores de choque térmico; el promotor de albúmina, el promotor de ApoAl; promotores de globina humana; promotores de timidinacinasa viral, tales como el promotor de timidinacinasa de herpes simple; LTR retrovirales; el promotor de ß-actina; y promotores de hormona de crecimiento humana. El promotor también puede ser el promotor nativo para el receptor de quimiocina de proteína G. A diferencia de otras técnicas de terapia génica, una ventaja importante de introducir secuencias de ácido nucleico desnudo en células objetivo es la naturaleza transitoria de la síntesis de pollnucleótido en las células. Los estudios han mostrado que las secuencias de ADN no replicables se pueden introducir en células para proveer la producción del polipéptido deseado durante periodos de hasta seis meses. La construcción de polinucleótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se puede suministrar al espacio intersticial de tejidos dentro de un animal, incluyendo de tejido muscular, de la piel, cerebro, pulmón, hígado, bazo, médula ósea, timo, corazón, linfa, sangre, hueso, cartílago, páncreas, riñon, vesícula biliar, estómago, intestino, testículos, ovario, útero, recto, sistema nervioso, ojos, glándulas y tejido conectivo. El espacio intersticial de los tejidos comprende la matriz de mucopolisacárido, fluida, intercelular entre las fibras reticulares de tejidos de órganos, fibras elásticas en las paredes de vasos sanguíneos o cámaras, fibras de colágena de tejidos fibrosos o esa misma matriz dentro de células musculares envolventes de tejido conectivo o en ias lagunas de los huesos. De manera similar es el espacio ocupado por el plasma de la circulación y el líquido linfático de los canales linfáticos. El suministro al espacio intersticial del tejido muscular es preferido por las razones que se discuten más adelante. Pueden ser convenientemente suministradas por inyección en tejidos que comprenden estas células. Son preferiblemente suministradas a y expresadas en células no divisibles persistentes que son diferenciadas, aunque el surtido y expresión se puede lograr en células no diferenciadas o menos completamente diferenciadas tales como, por ejemplo, células madre de la sangre o fibroblastos de la piel. En células de músculo vivas son particularmente competentes en su capacidad para absorber y expresar polinucleótidos. Para inyección de secuencia de ácido nucleico desnudo, una cantidad de dosis efectiva de ADN o ARN estará en el intervalo de aproximadamente 0.05 mg/kg de peso coforal a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. Preferiblemente, la dosis será de alrededor de 0.005 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg y muy preferiblemente de alrededor de 0.05 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg. Desde luego, un experto en la técnica apreciará que esta dosis variará de acuerdo con el sitio de inyección en el tejido. La dosis apropiada y efectiva de secuencia de ácidos nucleicos puede ser fácilmente determinada por los expertos en la técnica y puede depender de la condición que se esté tratando y la vía de administración. La vía de administración preferida es por la vía parenteral de inyección en el espacio intersticial de los tejidos. Sin embargo, también se pueden usar otras vías parenterales tales como inhalación de una formulación de aerosol particularmente para el suministro a los pulmones o tejidos bronquiales, garganta o membranas mucosas de la nariz. Además, las construcciones de ADN de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) 7 desnudas, pueden ser suministradas a arterias durante angioplastia por el catéter usado en el procedimiento. Los polinucleótidos desnudos son suministrados por cualquier método conocido en la técnica incluyendo pero sin limitarse a inyección directa con aguja en el sitio de suministro, inyección intravenosa, administración tópica, infusión de catéter y en las denominadas "pistolas de genes". Estos métodos de suministro son conocidos en la técnica. Las construcciones también pueden ser suministradas con vehículos de suministro tales como secuencias virales, partículas virales, formulaciones de liposoma, lipofectina, agentes precipitantes, etc. Dichos métodos de suministro son conocidos en la técnica. En ciertas modalidades, las construcciones de polinucleótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) están en complejo en una preparación de liposoma. Las preparaciones de liposoma para usarse en la presente invención incluyen preparaciones catiónícas (positivamente cargadas), aniónicas (negativamente cargadas) y neutras. Sin embargo, los iiposomas catiónicos son particularmente preferidos debido a que se puede formar un complejo de carga estrecho entre el liposoma catiónico y el ácido nucleico polianiónico. Se ha mostrado que los liposomas catiónicos son mediadores del suministro intracelular de ADN de plásmido (Felgner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1987) 84:7413-7416, que se incorpora aquí por referencia); ARNm (Malone et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. (1989) 86:6077-6081, que se incofora aquí por referencia); y factores de transcripción purificados (Debs et al., J. Biol.. Chem. (1990) 265:10189-10192, que se incofora aquí por referencia), en forma funcional. Los liposomas catiónicos están fácilmente disponibles. Por ejemplo, liposomas de N[1-2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trietilamonio (DOTMA) son particularmente útiles y están disponibles bajo el nombre comercial Lipofectin, de GIBCO BRL, Grand Island, N.Y. (Véase también Felgner et al., Proc. Nati. Acad. Sci E.U.A. (1987) 84:7413-7416. que se incorpora aquí por referencia). Otros liposomas comercialmente disponibles incluyen transfectasa (DDAB/DOPE) y DOTAP/DOPE (Boehringer). Otros liposomas catiónicos se pueden preparar a partir de materiales fácilmente disponibles usando técnicas bien conocidas en el campo. Véase, por ejemplo, la publicación del PCT No. WO 90/11092 (que se ¡ncofora aquí por referencia) para una descripción de la síntesis de liposomas DOTAP (1 ,2-bis(oieiloxi)-3-(trimetilamonio)propano). La preparación de liposomas de DOTMA se explica en la naturaleza, véase, por ejemplo, P. Felgner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 84:7413-7417, que se incorpora aquí por referencia. Métodos similares se pueden usar para preparar liposomas a partir de otros materiales lipidíeos catiónicos. De manera similar, los liposomas aniónicos y neutros están fácilmente disponibles, tales como de Avanti Polar Lipids (Birmingham, Ala.), o se pueden preparar fácilmente usando materiales fácilmente disponibles. Dichos materiales incluyen fosfatidilcolina, colesterol, fosfatidiletanolamina, dioleoilfosfatidiicolina (DOPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), entre otros. Estos materiales también se pueden mezclar con materiales de partida de DOTMA y DOTAP en relaciones apropiadas. Los métodos para hacer liposomas usando estos materiales son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, comercialmente la dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), y dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) se pueden usar en varias combinaciones para hacer liposomas convencionales, con o sin la adición de colesterol. Por lo tanto, por ejemplo, vesículas de DOPG/DOPC se pueden preparar secando 50 mg de DOPG y DOPC bajo una corriente de nitrógeno gaseoso en un frasco de sonicación. La muestra se coloca bajo una bomba de vacío durante la noche y se hidrata ai día siguiente con agua desionizada. La muestra después se somete a sonicación durante 2 horas en un frasco tapado, usando un sonicador Heat Systems modelo 350 equipado con una sonda de copa invertida (de tipo baño) en la fijación máxima mientras el baño es circulado a 15EC. Alternativamente, vesículas negativamente cargadas se pueden preparar sin sonicación para producir vesículas multilaminares o por extrusión a través de membranas de nucleoporo para producir vesículas uniiaminares de tamaño discreto. Otros métodos se conocen y están disponibles para los expertos en la técnica. Los liposomas pueden comprender vesículas multilaminares (MLV), vesículas unilaminares pequeñas (SUV) o vesículas unilaminares grandes (LUV), siendo preferidas las SUV. Los diversos complejos de liposoma-ácido nucleico se preparan usando métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Straubinger et al., Methods of Immunology (1983), 101 :512-527, que se incorpora aquí por referencia. Por ejemplo, los MLV que contienen ácido nucleico se pueden preparar depositando una película delgada de fosfolípido sobre las paredes de un tubo de vidrio y subsecuentemente hidratando con una solución del material que va a ser encapusulado. Los SUV se preparan mediante sonicación extendida de MLV para producir una población homogénea de liposomas unilaminares. El material que va a ser atrapado se añade a la suspensión de MLV preformadas y después se somete a sonicación. Cuando se usan liposomas que contienen lípidos catiónicos, la película de lípido seca se vuelve a suspender en una solución apropiada tal como agua estéril o una solución reguladora de pH isotónica tal como Tris/NaCI 10 mM, sonidcada y después los liposomas preformados se mezclan directamente con el ADN. El liposoma y el ADN forman un complejo muy estable debido a la unión de los liposomas positivamente cargados al ADN catiónico. Las SUV encuentran uso con fragmentos de ácido nucleico pequeños. Las LUV se preparan mediante un número de métodos bien conocidos en la técnica. Los métodos comúnmente usados incluyen quelatación con Ca2+-EDTA (Papahadjopoulos et al., Biochim. Biophys. Acta (1975) 394:483; Wilson et al., Cell (1979) 17:77); inyección con éter (Deamer, D. y Bangham, A., Biochim. Biophys. Acta (1976) 443:629; Ostro et al., Biochem. Biophys. Res. Común. (1977) 76:836; Fraley et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1979) 76:3348); diálisis con detergente (Enoch, H y Strittmatter, P., proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1979) 76:145); y evaporación de fase inversa (REV) (Fraley et al., J. Biol. Chem. (1980) 255:10431; Szoka, F. y Papahadjopoulos, D., proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1978) 75:145; Schaefer-Ridder et al., Science (1982) 215:166), que se incoforan aquí por referencia. En general, la relación de ADN a liposomas será de alrededor de 10:1 a aproximadamente 1 :10. Preferiblemente, la relación será de alrededor de 5:1 a aproximadamente 1 :5. Muy preferiblemente, la relación será de alrededor de 3:1 a aproximadamente 1 :3. Muy preferiblemente todavía, la relación será de aproximadamente 1 :1. La patente de E.U.A. No. 5,676,954 (que se incorpora aquí por referencia) reporta la inyección de material genético en complejo con vehículos de liposoma catiónicos en ratones. Las patentes de E.U.A. Nos. 4,897,355, 4,946,787, 5,049,386, 5,459,127, 5,589,466, 5,693,622, 5,580,859, 5,703,055 y la publicación internacional No. WO 94/9469 (que se incorporan aquí por referencia) proveen lípidos catiónicos para usarse en ADN transfectado en células de mamífero. Las patentes de E.U.A. Nos. 5,589,466, 5,693,622, 5,580,859, 5,703,055 y la publicación internacional No. WO 94/9469 (que se incoforan aquí por referencia) proveen métodos para suministrar complejos de lípidos catiónicos-ADN a mamíferos. En ciertas modalidades, las células son genéticamente manipuladas ex vivo o in vivo, usando una partícula retroviral que contiene ARN que comprende una secuencia que codifica receptor de quimiocina de proteína G. Los retrovirus de los cuales los vectores plasmídicos retrovirales se pueden derivar ¡ncluyen pero no se limitan a virus de leucemia murina de Moloney, virus de necrosis de bazo, virus de sarcoma de Rous, virud e sarcoma de Harvey, virus de leucosis de aves, virus de leucemia de simio gibbon, virus de inmunodeficiencia humana, virus de sarcoma mieloproiiferativo y virus de tumor mamario. El vector de plásmido retroviral se emplea para traducir líneas de célula de empaque para formar líneas de células productoras. Ejemplos de células de empaque que pueden ser transfectadas incluyen pero no se limitan a las líneas de células PE501 , PA317, R-2, R-AM, PAÍ2, T19-14X, VT-19-17-H2, RCRE, RCRIP, GP+E-86, GP+envAm12 y DAN como se describe en Miller, Human Gene Therapy 1 :5-14 (1990), que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. El vector puede traducir las células de empaque a través de medios conocidos en la técnica. Dichos medios incluyen pero no se limitan a electroporación, el uso de liposomas y precipitación de CaP04. En una modalidad, el vector de plásmido retroviral se puede encapsular en un liposoma, o acoplar a un lípido y después administrar a un hospedero. La líneas de células productora genera partículas de vector retroviral infecciosas que incluyen polinucleótido que codifica receptor de quimiocina de proteína G. Dichas partículas de vector retrovirales se pueden emplear entonces para traducir células eucarióticas ya sea in vitro o in vivo. Las células eucarióticas transducidas expresarán receptor de quimiocina de proteína G.

En algunas otras modalidades, las células son genéticamente manipuladas ex vivo o in vivo, con polinucleótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) contenido en un vector de adenovirus. El adenovirus puede ser manipulado de tal manera que codifique y exprese receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), y al mismo tiempo sea inactivado en términos de su capacidad para replicarse en un ciclo de vida viral lítico normal. Una expresión de adenovirus se logra sin integración del ADN viral en el cromosoma de la célula hospedero, aliviando así preocupaciones acerca de mutagénesis por inserción. Además, los adenovirus se han usado como vacunas entéricas vivas durante muchos años con un perfil de seguridad excelente (Schwartz, A. R. et al. (1974) Am. Rev. Respir. Dis 109:233-238). Finalmente, la transferencia de genes mediada por adenovirus se ha demostrado en un número de casos incluyendo transferencia de alfa-1 -antitripsina y CFTR a los pulmones de ratas algodoneras (Rosenfeld, M.A. et al. (1991) Science 252:431-434; Rosenfeld et al., (1992) Cell 68:143-155). Además, estudios extensivos para intentar establecer adenovirus como un agente causante en cáncer humano fueron uniformemente negativos (Green, M et al. (1979) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 76:6606). Los vectores adenovirales adecuados útiles en la presente invención se describen, por ejemplo en Kozarsky y Wilson, Curr. Opin. Genet. Devel. 3:499-503 (1993); Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992); Engelhardt et al., Human Genet Ther. 4:759-769 (1993); Yang et ai., Nature Genet. 7:362-369 (1994); Wilson et al., Nature 365:691-692 (1993); y la patente de E.U.A.

No. 5,652,224, que se incorporan aquí por referencia. Por ejemplo, el vector de adenovirus Ad2 es útil y se puede hacer crecer en 293 células humanas. Estas células contienen la región E1 de adenovirus y constitutivamente expresan E1a y E1b, que complementa los adenovirus defectuosos proveyendo los productos de los genes deletados del vector. Además de Ad2, las variedades de adenovirus (por ejemplo, Ad3, Ad5 y Ad7) también fueron útiles en la presente invención. Preferiblemente, los adenovirus usados en la presente invención son deficientes en replicación. Loa adenovirus deficientes en replicación requieren la ayuda de un virus auxiliar y/o líneas de células de empaque para formar partículas Infecciosas. El virus resultante es capaz de infectar células y puede expresar un polinucleótido de interés que operablemente enlazado a un promotor, pero que no se replica en la mayoría de las células. Los adenovirus deficientes en replicación se pueden deletar en una o más de todos o una porción de los siguientes genes: E1a, E1b, E3, E4, E2a o L1 a L5. En algunas otras modalidades, las células son genéticamente manipuladas ex vivo o in vivo, un virus adeno asociado (AAV). Los AAV son virus defectuosos que ocurren naturalemente que requieren virus auxiliares para producir partículas infecciosas (Muzyczka, N. Curr. Topics in Microbiol. Immunol. 158:97 (1992)). También es uno de los pocos virus que puede integrar su ADN en células no divisibles. Los vectores que contienen tan pocos como 300 pares de bases de AAV pueden ser empacados y pueden íntegrarase, pero el espacio para ADN endógeno es limitado a aproximadamente 4.5 kb. Los métodos para producir y usar dichos AAV son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,139,941 , 5,173,414, 5,354,678, 5,436,146, 5,474,935, 5,478,745 y 5,589,377. Por ejemplo, un vector de AAV apropiado para usarse en la presente invención incluirá todas las secuencias necesarias para la replicación de ADN, encapsulación e integración de célula hospedero. La construcción de poiinucleótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se inserta en el vector de AAV usando métodos de clonación estándares, tales como aquellos encontrados en Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989). El vector de AAV recombinante es después transferido en células de empaque que son infectadas con un virus auxiliar, usando cualquier técnica estándar, incluyendo lipofección, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, etc. Los virus auxiliares adecuados ¡ncluyen adenovirus, citomegalovirus, virus de vaccinia o virus de herpes. Una vez que las células de empaque son transfectadas e infectadas, producirán partículas virales de AAV infecciosas que contienen la construcción de polinucleótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Estas partículas virales son después usadas para transducir células eucarióticas, ya sea ex vivo o in vivo. Las células transducidas contendrán la construcción de pollnucleótido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) integrada a su genoma, y expresarán receptor de quimiocina de proteína G (CCR5).

Otro método de terapia génica implica regiones de control heterólogas operablemente asociables y secuencias de polinucleótidos endógenos (por ejemplo, que codifican receptor de quimiocina de proteína G) mediante recombinación homologa (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,641,670, expedida el 24 de junio de 1997; publicación internacional No. WO 96/29411, publicada el 26 de septiembre de 1996; publicación internacional No. WO 94/12650, publicada el 4 de agosto de 1994; Koller et al, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 86:8932:8935 (1989); y Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989). Este método implica la activación de un gen que está presente en las células objetivo, pero que normalmente no se expresa en las células, o se expresa a un nivel muy bajo que el deseado. Se hacen construcciones de poiinucleótidos usando técnicas estándares conocidas en la técnica, que contienen el promotor son secuencias de direccionamiento que flanquean al promotor. Aquí se describen promotores adecuados. La secuencia de direccionamiento es suficientemente complementaria a una secuencia endógena para permitir la recombinación homologa de la secuencia de direccionamiento de promotor con la secuencia endógena. La secuencia de direccionamiento estará suficientemente cerca del extremo 5' de la secuencia de polinucleótido endógena deseada de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) por lo que el promotor será operablemente enlazado a la secuencia endógena bajo recombinación homologa.

El promotor y las secuencias de direccionamiento se pueden amplificar usando PCR. Preferiblemente, el promotor amplificado contiene distintos sitios de enzima de restricción en los extremos 5' y 3'. Preferiblemente, ei extremo 3' de la primera secuencia de direccionamiento contiene el mismo sitio de enzima de restricción que el extremo 5' del promotor amplificado y el extremo 5' de la segunda secuencia de direccionamiento que contiene el mismo sitio de restricción que el extremo 3' del promotor amplificado. El promotor amplificado y las secuencias de direccionamiento son digeridas y ligadas entre sí. La construcción de secuencia de direccionamiento de promotor es suministrada a las células, ya sea como polinucleótido desnudo o junto con agentes que facilitan la transfección, tales como liposomas, secuencias virales, partículas virales, virus enteros, lipofección, agentes de precipitación, etc., descritos con más detalle anteriormente. La secuencia de direccionammiento de promotor P se puede surtir por cualquier método, incluyendo inyección directa con aguja, inyección intravenosa, administración tópica, infusión de catéter, aceleradores de partícula, etc. Estos métodos se describen con más detalle más adelante. La construcción de secuencia de direccionamiento de promotor es absorbida por las células. La recombinación homologa entre la construcción y la secuencia endógena tiene lugar de tal manera que una secuencia de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) endógena se coloca bajo el control del promotor. El promotor entonces impulsa la expresión de la secuencia de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) endógena. Los polinucleótidos que codifican receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden administrar junto con otros polinucleótidos que codifican una proteína angiogénica. Ejemplos de proteínas angiogénicas incluyen pero no se limitan a factores de crecimiento de fibroblastos ácidos y básicos, VEGF-1 , VEGF-2, VEGF-3, factor de crecimiento epidérmico alfa y beta, factor de crecimiento de células endoteliales derivadas de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de nercrosis tumoral alfa, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento similar a la insulina, factor estimulante de colonia, factor estimulante de colonia de macrófagos, factor estimulante de colonia de granulocitos/macrófagos, y óxido nítrico cintaza. En una modalidad preferida, el polinucleótido que codifica receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) contiene una secuencia de señal secretora que facilita la secreción de ia proteína. Típicamente, ia secuencia de señal está ubicada en la región de codificación del polinucleótido que se va a expresar hacia el extremo 5' de la región de codificación. La secuencia de señal puede ser homologa o heteróloga al nucleótido de interés y puede ser homologa o heteróloga a las células que van a ser transfectadas. Además, la secuencia de señal puede ser químicamente sintetizada usando métodos conocidos en la técnica.

Cualquier modo de administración de cualquiera de las construcciones de polinucleótidos anteriormente descritas se pueden usar siempre que el modo resulte en la expresión de una o más moléculas en una cantidad suficiente para proveer un efecto terapéutico. Este incluye inyección directa con aguja, inyección sistémica, infusión de catéter, inyección biolística, aceleradores de partículas (es decir, "pistolas de genes"), deposiciones de esponja de gel, otros materiales de deposición comercialmente disponibles, bombas osmóticas (por ejemplo, minibombas de Alza), formulaciones farmacéuticas sólidas orales (tabletas o pildoras) o de supositorio, y aplicaciones por decantación o tópicas durante la cirugía. Por ejemplo, la inyección directa de fosfato de calcio-plásmido precipitado desnudo en hígado de rata y bazo de rata o un plásmido recubierto con proteína en la vena portal ha dado por resultado al expresión de genes del gen anterior en los hígados de rata (Kaneda et al., Science 243:375 (1989)). Un método preferido de administración local es por inyección directa. Preferiblemente, una molécula recombinante de la presente invención en complejo con un vehículo de suministro se administra mediante inyección directa en o localmente dentro del área de las arterias. La administración de una composición localmente dentro del área de las arterias se refiere a inyectar la composición centímetros y preferiblemente milímetros dentro de las arterias. Otro método de administración local es poner en contacto una construcción de polinucleótido de la presente invención en una herida quirúrgica. Por ejemplo, un paciente puede estar bajo cirugía y la construcción de poiinucleótido puede aplicarse como revestimiento sobre la superficie del interior del tejido de la herida o la construcción se puede inyectar en áreas de tejido dentro de la herida. Composiciones terapéuticas útiles en administración sistémica incluyen moléculas recombinantes de la presente invención en complejo con vehículo de suministro direccionado de la presente invención. Los vehículos de surtido adecuados para usarse con administración sistémica comprenden liposomas que comprenden ligando para direccionamiento del vehículo a un sitio en particular. Los métodos preferidos de administración sistémica incluyen inyección intravenosa, suministro por aerosol, oral o percutáneo (tópico). Las inyecciones intravenosas se pueden realizar usando métodos estándares en la técnica. El suministro mediante aerosol se puede realizar usando métodos estándares en la técnica (véase, por ejemplo, Stribling et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 189:11277-11281 , 1992, que se incofora aquí por referencia). El suministro oral se puede realizar formando complejo con una construcción de polinucleótido de ia presente invención a un vehículo capaz de resistir la degradación por enzimas digestivas en el intestino de un animal. Ejemplos de dichos vehículos incluyen cápsulas de plástico o tabletas, tales como aquellas de la técnica. El suministro tópico se puede realizar mezclando una construcción de polinucleótido de la presente invención con un reactivo lipofílico (por ejemplo, DMSO) que es capaz de pasar hacia la piel.

La determinación de una cantidad efectiva de sustancia para ser suministrada puede depender del número de factores incluyendo por ejemplo la estructura química y actividad biológica de la sustancia, ia edad y el peso del animal, la condición precisa que requiere tratamiento y su severidad, y la vía de administración. La frecuencia de tratamiento depende del número de factores, tales como la cantidad de construcciones de poiinucleótido administradas por dosis, así como la salud e historia del sujeto. La cantidad precisa, número de dosis y tiempo de dosis serán determinadas por el médico o veterinario en cuestión. Las composiciones terapéuticas de la presente invención se pueden administrar a cualquier animal, preferiblemente a mamíferos y aves. Los mamíferos preferidos incluyen seres humanos, perros, gatos, ratones, ratas, conejos, ovejas, ganado vacuno, caballos y cerdos, siendo preferidos particularmente los humanos.

Actividades biológicas de receptor de quimiocina de proteína G Los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), se pueden usar en pruebas para probar una o más actividades biológicas. Si los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), presentan actividad en una prueba particular, es probable que el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) pueda estar implicado en las enfermedades asociadas con la actividad biológica. Por lo tanto, el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) podría usarse para tratar, prevenir y/o diagnosticar la enfermedad asociada. Ligandos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) incluyen MIP-1alfa, MIP-1beta, MCP-1 , MCP-2, MCP-3, MCP-4, RANTES y Eotaxin. El receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) es también un coreceptor importante para VIH, y también puede ser reconocido por otros agentes infecciosos tales como otros virus, para permitir la entrada a la célula. Por lo tanto, los polinucleótidos, polipéptidos, agonistas y antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de los mismos son útiles para tratar, prevenir y diagnosticar enfermedades asociadas con cualquiera de los ligando anteriores, tales como las enfermedades que aquí se describen. En modalidades altamente preferidas, los polinucleótidos, polipéptidos, agonistas y antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de los mismos son útiles para tratar, prevenir y diagnosticar infección por VIH y/o condiciones asociadas con infección por VIH, como se describe en la sección titulada "Tratamiento y prevención de infección por VIH". Ei receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se expresa predominantemente sobre monocitos y células T. La expresión de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se encuentra en células de microglia, dendríticas y algunas células madre hematopoyéticas. La activación de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) sobre macrófagos y linfocitos por ligandos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (especialmente, RANTES, MIP-1beta y MIP-1aIfa) principalmente da por resultado la quimiotracción de estos tipos de células a sitios de inflamación, a menudo sitios de infección. El receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también puede estar implicado en la inducción de quimiotaxis en células NK, eosinófilos y basófilos. La activación de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) sobre macrófagos y linfocitos por ligandos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (especialmente, RANTES, MIP-1beta y MIP-1alfa) pueden promover interacciones entre células T y células que presentan antígenos (por ejemplo, células dendríticas, macrófagos y células B). El receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también puede estar implicado en la adhesión de células y migración de células a través de vasos sanguíneos mediante moléculas de adhesión en tránsito al sitio de inflamación. Por consiguiente, las composiciones de la invención (incluyendo polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos de la invención, y fragmentos y variantes de los mismos) se pueden usar en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos asociados con defectos en las actividades biológicas del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) tales como aquellos anteriormente descritos. En las modalidades preferidas, las composiciones de la invención (incluyendo polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos de la invención y fragmentos y variantes de los mismos) se pueden usar en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos relacionados con la función inmune (por ejemplo, infección viral, especialmente infección por VIH, infección por virus de viruela y/o infección por citomegalovirus); enfermedades autoinmunes (tales como artritis reumatoide, enfermedad de Grave y esclerosis múltiple); quimiotaxis de células inmunes; condiciones inflamatorias; y/o como se describe en "Actividad inmune") y enfermedades neoplásicas tales como aquellas descritas bajo 'Trastornos hiperproliferativos" más adelante). Los polinucleótidos, polipéptidos, agonistas y antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (incluyendo anticuerpos) de la invención son útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos asociados con actividades que incluyen pero no se limitan a quimioatracción, activación de células inmunes, presentación de antígenos, inflamación e infección viral. Muy generalmente, los polinucleótidos, polipéptidos, agonistas y antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (incluyendo anticuefos) de la invención pueden ser útiles para el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos que se describen más adelante. Tratamiento v prevención de infección por VIH. Puesto que CCR5 es coreceptor de VIH para VIH trópico de macrófagos, tiene impacto importante sobre la infección de VIH y progresión de ia enfermedad, especialmente temprano en la infección de VIH cuando el VIH es predominantemente de cepas trópicas de macrófago R5. Por lo tanto, los polinucleótidos o polipéptidos, o agonistas (incluyendo anticuerpos) o antagonistas (incluyendo anticuefos) de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden usar para diagnosticar, tratar, prevenir y/o aliviar la infección por VIH. En modalidades específicas, los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas (incluyendo anticuerpos) o antagonistas (incluyendo anticuefos) de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden usar para diagnosticar, tratar, prevenir y/o aliviar enfermedades, trastornos o condiciones asociadas con infección por VIH. Las condiciones asociadas con infección por VIH incluyen pero no se limitan a neumonía por Pneumocystis carinii, síndrome de Wasting, sarcoma de Kaposi, candidiasis esofágica y candidiasis pulmonar, complejo de Mycobacterium avium-intracellulare diseminado o extrapulmonar, Mycobacterium kansassii^ diseminado o extrapulmonar, enfermedad por citomegalovirus, retinitis por citomegalovirus, encefalopatía por VIH, enfermedad por herpes simple, Cryptococcosis extrapulmonar, toxoplasmosis de cerebro, criptosporidiosis crónica, cryptosporidiosis intestinal crónica, linfoma inmunoblástico, Mycobacterium tuberculosis extrapulmonar, Mycobacterium tuberculosis pulmonar, enfermedad micobacteriana, enfermedad micobacteriana extrapulmonar, linfoma de Burkitt, leucoencefalopatía multifocal progresiva, linfoma de cerebro primario, isosporiasis crónica, isosporiasis intestinal crónica, coccidioidomicosis diseminada o extrapulmonar, septicemia por salmonela, infección bacteriana múltiple o recurrente, carcinoma cervical invasivo, histoplasmosis diseminada o extrapulmonar, neumonía intersticial linfoide, hiperplasia linfoide pulmonar, neumonía recurrente, inmunosupresión severa y/o demencia por SIDA. En modalidades preferidas, los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas (incluyendo anticuerpos) o antagonistas (incluyendo anticuerpos) de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), se pueden usar para diagnosticar, tratar, prevenir y/o aliviar infecciones oportunistas (por ejemplo, infección por virus de herpes, infección por Mycobacterium tuberculosis o infección por citomegalovirus) asociado por infección por VIH. En modalidades específicas, los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas (incluyendo anticuefos) o antagonistas (incluyendo anticuerpos) de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden usar para diagnosticar, tratar, prevenir y/o aliviar infección por Pneumocystis carinii oportunista asociada con infección por VIH. En modalidades específicas, los polinucleótidos o poiipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas (incluyendo anticuerpos) o antagonistas (incluyendo anticuefos) de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden usar para diagnosticar, tratar, prevenir y/o aliviar sarcoma de Kaposi asociada con infección por VIH. En modalidades específicas, los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas (incluyendo anticuerpos) o antagonistas (incluyendo anticuerpos) de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden usar para diagnosticar, tratar, prevenir y/o aliviar y etapas tempranas de infección por VIH. En modalidades específicas, los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas (incluyendo anticuerpos) o antagonistas (incluyendo anticuefos) de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden usar para diagnosticar, tratar, prevenir y/o aliviar las últimas etapas de infección por VIH. En modalidades específicas, los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas (incluyendo anticuerpos) o antagonistas (incluyendo anticuefos) de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden usar para diagnosticar, tratar, prevenir y/o aliviar las últimas etapas de infección por VIH. En otras modalidades más, los polinucleótidos o poiipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas (incluyendo anticuerpos) o antagonistas (incluyendo anticuefos) de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden usan como un profiláctico para prevenir infección por VIH en personas que tienen una pareja sexual infectada por VIH o personas con una razón para creer que han sido expuestas a VIH (por ejemplo, personas que se han pinchado con una aguja que previamente ha estado en contacto con el fluido biológico de otro individuo (o animal) o víctimas de violación. En otras modalidades más, los poiinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas (incluyendo anticuerpos) o antagonistas (incluyendo anticuerpos) de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden usan como un profiláctico para prevenir transmisión de VIH de la madre al feto. Actividad inmune. Los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades, trastornos y/o condiciones del sistema inmune, activando o inhibiendo la proliferación, diferenciación o movilización (quimiotaxis) de células inmunes. Las células inmunes se desarrollan a través de un proceso llamado hematopoyesis, produciendo células mieloides (plaquetas, glóbulos rojos, neutrófilos y macrófagos) y linfoides (linfocitos B y T) a partir de células madre pluripotenciales. La etiología de estas enfermedades, trastornos y/o condiciones inmunes pueden ser genéticos, somáticos tales como cáncer o algunas enfermedades, trastornos y/o condiciones autoinmunes, adquiridas (por ejemplo, quimioterapia o toxinas) o infecciosas. Más aún, los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), se pueden usar como un marcador o detector de una enfermedad o trastorno del sistema inmune particular. Los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos se pueden usar para modular la actividad hematopoyética (la formación de células de la sangre). Por ejemplo, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos se pueden usar para incrementar la cantidad de todos los subconjuntos de células de la sangre, tales como por ejemplo, eritrocitos, linfocitos (células B o T), células mieloides (por ejemplo, basófilos, eosinófilos, neutrófilos, células cebadas, macrófagos) y plaquetas. La capacidad para reducir la cantidad de células de la sangre o subconjuntos de células de la sangre puede ser útil para prevenir, detectar, diagnosticar y/o tratar anemias y leucopenias descritas más adelante. Alternativamente, los polipéptidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos se pueden usar para reducir la cantidad de todas o subconjuntos de las células de la sangre tales como, por ejemplo, eritrocitos, linfocitos (células B o T), células mieioides (por ejemplo, basófilos, eosinófilos, neutrófilos, células cebadas, macrófagos) y plaquetas. La capacidad para reducir la cantidad de células de la sangre o subconjuntos de células de ia ) sangre puede ser útil en la prevención, detección, diagnóstico y/o tratamiento de leucocitos tales como, por ejemplo, eosinofilia. Los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) pueden ser útiles en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de enfermedades, trastornos y/o condiciones de células hematopoyéticas. Los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se podrían usar para incrementar la diferenciación y proliferación de células hematopoyéticas, incluyendo las células madre pluripotenciales, en un esfuerzo para tratar o prevenir esas enfermedades o trastornos y/o condiciones asociadas con una disminución en ciertos tipos (o muchos) de células hematopoyéticas. Ejemplos de síndromes de deficiencia inmunológica incluyen pero no se limitan a enfermedades, trastornos y/o condiciones de proteína de la sangre (por ejemplo, agammaglobulinemia, disgammaglobulinemia), ataxia-telangiectasia, inmunodeficiencia variable común, síndrome de Digeorge, infección por VIH, infección por HTLV-BLV, síndrome de deficiencia de adhesión de leucocitos, linfopenia, disfunción bactericida de fagocitos, inmunodeficiencia combinada severa (SCID), trastorno de Wiskott-Aldrich, anemia, trombocitopenia, leucopenia, neutropenia, anemia o hemoglobinuria. Alternativamente, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos podrían usarse para incrementar la diferenciación y proliferación de células hematopoyéticas, incluyendo las células madres pluripotenciales, en un esfuerzo para tratar o prevenir aquellas enfermedades, trastornos y/o condiciones con un incremento en ciertos tipos (o muchos) de células hematopoyéticas, incluyendo pero sin limitarse a histiocitosis. En otra modalidad, un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, o poiinucleótidos, anticuerpos, agonistas o antagonistas correspondientes a ese receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), se pueden usar para tratar enfermedades y trastornos del sistema inmune y/o para inhibir o incrementar una respuesta inmune generada por células asociadas con el tejido(s) en el cuals se expresa el polipéptido de ia invención. Los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la Invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos puden ser útiles en el tratamiento, prevención, diagnóstico y/o pronóstico de inmunodeficiencias, especialmente inmunodeficiencias congénitas y adquiridas. Ejemplos de inmunodeficiencias de células B en las cuales los niveles de inmunoglobulina, la función de las células B y/o número de células B son disminuidos incluyen: agammaglobulinemia ligada a X (enfermedad de Bruton), agammaglobulineamia infantil ligada X, ínmunodeficiencia ligada a X con hiper IgM, inmunodeficiencia no ligada a X con hiper IgM, síndrome linfoproliferativo ligado a X (XLP), agammaglobulinemia incluyendo agammaglobulinemia congénita y adquirida, agammaglobulinemia de inicio en adultos, agammaglobulinemia de inicio tardío, disagammaglobulinemia, hipogammaglobulinemia, hlpogammaglobulinemia no especificada, agammaglobulinemia recesiva (tipo suizo), deficiencia de IgM selectiva, deficiencia de IgM selectiva, deficiencia de IgA selectiva, deficiencias de subclase IgG selectiva, deficiencia de subclase de IgG (con o sin deficiencia de IgA), deficiencia de Ig con deficiencia de IgM, lgG e IgA incrementada con IgM incrementada, deficiencia de anticuefos con Igs normal o elevada, deleciones de cadena pesada, deficiencia de cadena kappa, trastornos linfoproliferativo de células B (BLPD), inmunodeficiencia variable común (CVID), inmunodeficiencia variable común (CVI) (adquirida), e hipogammaglobulinemia transitoria de la infancia. En modalidades específicas, la ataxia-telangiectasia o condiciones asociadas con ataxia-telangiectasia se tratan, previenen, diagnostican y/o pronostican usando los polipéptidos o polinucleótidos de la invención, y/o agonistas y/o antagonistas de los mismos. Ejemplos de inmunodeficiencias congénitas en las cuales la función y/o número de células T y/o células B es disminuida incluyen pero no se limitan a: anomalía de DiGeorge, inmunodeficiencias combinadas severas (SCID) (incluyendo pero sin limitarse a SCID ligada a X, SCID recesiva autosómica, deficiencia de adenosina desaminasa, deficiencia de purina nucleósido fosforilasa (PNP), deficiencia de MHC de clase II (síndrome de linfocito de Bare), síndrome de Wiskott-Aldrich y ataxia-telangiectasia), hipoplasia tímica, síndrome de tercer y cuarto saco faríngeos, deieción de 22q11.2, candidiásis mucocutánea crónica, deficiencia de células asesinas naturales (NK); CD4+ T- linfocitopenia idiopática, inmunodeficiencia con defecto de células T predominante (no especificado), e inmunodeficiencia no especificada de inmunidad mediada por células. En modalidades específicas, la anomalía de DiGeorge o condiciones asociadas con anomalía de DiGeorge se tratan, previenen, diagnostican y/o pronostican usando polipéptidos o polinucleótidos de la invención, o antagonistas o agonistas de los mismos.

Otras inmunodeficiencias que se pueden tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar usando polipéptidos o polinucleótidos de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos, incluyen pero no se limitan a enfermedad granulomatosa crónica, síndrome de Chédiak-Higashi, deficiencia de mieloperoxidasa, deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, síndrome linfoproliferativa ligada a X (XLP), deficiencia de adhesión de leucocitos, deficiencias de componente de complemento (incluyendo deficiencias de C1 , C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 y/o C9), disginesis reticular, alinfoplasia-aplasia química, inmunodeficiencia con timoma, leucopemia congénita severa, displasia con inmunodeficiencia, neutropenia neonatal, enanismo de extremidades cortas, e inmunodeficiencia con Igs combinada con síndrome de Nezelof. En una modalidad preferida, las inmunodeficiencias y/o condiciones asociadas con las inmunodeficiencias anteriormente mencionadas se tratan, previenen, diagnostican y/o pronostican usando polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), y/o agonistas o antagonistas de los mismos. En una modalidad preferida, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos se podrían usar como un agente para incrementar la inmuno-respuesta entre individuos inmunodeficientes. En modalidades específicas, los poiinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos se podrían usar como un agente para incrementar las inmuno-respuestas entre individuos inmunodeficientes en células B y/o células T. Mas aún, los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), también se puede usar para modular actividad hemostática (la detención de sangrado) o trombolítica (formación de coágulos), por ejemplo, incrementando la actividad hemostática o trombolítica, los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), se podrían usara para tratar o prevenir enfermedades, trastornos y/o condiciones de coagulación de la sangre (por ejemplo, afibrinogenemia, deficiencias de factores), enfermedades, trastornos y/o condiciones de plaquetas de la sangre (por ejemplo, trombocitopenia), o heridas que resultan de trauma, cirugía u otras causas. Alternativamente, los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), que pueden reducir la actividad hemostática o trombolítica podrían usarse para inhibir o disolver la coagulación. Esas moléculas podrían ser importantes en el tratamiento prevención de ataques cardíacos (infartos), accidentes vasculares cerebrales o cicatrizaciones. Los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), también pueden ser útiles en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de enfermedades, trastornos y/o condiciones autoinmunes. Muchas enfermedades, trastornos y/o condiciones autoinmunes resultan de reconocimiento inapropiado de los mismos como material extraño por células inmunes. Este reconocimiento inapropiado da por resultado una respuesta inmune que conduce a la destrucción del tejido hospedero. Por lo tanto, la administración de polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que pueden inhibir una respuesta inmune, particularmente la proliferación, diferenciación o quimiotáxis de células T, puede ser una terapia efectiva en la prevención enfermedades, trastornos y/o condiciones autoinmunes. Ejemplos de enfermedades, trastornos y/o condiciones autoinmunes que se pueden tratar, prevenir, y/o diagnosticar o detectar por receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) incluyen pero no se limitan a: enfermedad de Addison, anemia hemolítica, síndrome de antifosfolípidos, artritis reumatoide, dermatitis, encéfalomielitis alérgica, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Grave, esclerosis múltiple, miastenia gravis, neuritis, oftalmía, fenfigoide ampuloso, pémfigo, poliendocrinopatías, púrpura, enfermedad de Reiter, síndrome de Stiff-Man, tíroiditis autoinmune, lupus heritematoso sistémico, inflamación pulmonar autoinmune, síndrome de Guillain-Barre, diabetes melitus dependiente de insulina, y enfermedad ocular inflamatoria autoinmune.

De manera similar, las reacciones y condiciones alérgicas tales como asma (particularmente asma alérgica) u otros problemas respiratorios, también se pueden tratar, prevenir, y/o diagnosticar por polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G. Más aún, estas moléculas se pueden usar para tratar anafilaxis, hipersensibilidad a una molécula antigénica o incompatibilidad de grupo sanguíneo. Además, los polipéptidos o pollnucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos, se pueden usar para tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar reacciones alérgicas mediadas por IgE. Dichas reacciones alérgicas incluyen pero no se limitan a asma, rinitis y eczema. En modalidades específicas los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos se pueden usar para modular concentraciones de IgE in vitro o in vivo. Los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), también se pueden usar para tratar, prevenir y/o diagnosticar rechazo de órganos o enfermedad de injerto versus hospedero (GVHD). El rechazo de órganos ocurre por destrucción de células inmune del hospedero del tejido trasplantado a través de una respuesta inmune. De manera similar, una respuesta inmune también está implicada en GVHD pero en este caso las células inmunes trasplantadas extrañas destruyen a los tejidos hospederos. La administración de polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), que inhiben una respuesta inmune, particularmente la proliferación, diferenciación o quimotaxis de células T, puede ser una terapia efectiva en la prevención de rechazo de órganos o GVHD. En modalidades específicas, los polipéptidos, anticuerpos o polinucleótidos de la invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos, que inhiben una respuesta inmune, particularmente la activación, proliferación, diferenciación o quimiotáxis de células T, puede ser una terapia efectiva para prevenir rechazo de xenoinjerto alérgico experimental e hiperagudo. De manera similar, los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) también se pueden usar para modular la inflamación. Por ejemplo, puesto que los polipéptidos, anticuerpos o polinucleótidos de la invención y agonistas o antagonistas de la invención pueden inhibir la activación proliferación y/o diferenciación de células implicadas en la respuesta inflamatoria, estas moléculas se pueden usar para prevenir y/o tratar condiciones inflamatorias crónicas y agudas. Dichas condiciones inflamatorias incluyen pero no se limitan a inflamación asociada con infección (por ejemplo, shock séptico, sepsis o síndrome de respuesta inflamatoria sistémica), isquemia-daño por reperfusión, letalidad endotóxica, rechazo hiperagudo mediado por complemento, nefritis, daño pulmonar inducido por citocina o quimiocina, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, sobre producción de citocinas (por ejemplo, FNT o IL-1), trastornos respiratorios (por ejemplo, asma y alergia); trastornos gastrointestinales (por ejemplo, enfermedad intestinal inflamatoria); cánceres (por ejemplo, gástrico, ovárico, de pulmón, vejiga, hígado y mama); trastornos del SNC (por ejemplo, esclerosis múltiple; daño cerebral isquémico y/o accidente vascular cerebral, daño cerebral traumático, trastornos neurodegenerativos (por ejemplo, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer); demencia relacionada con sida, enfermedad de priones); trastornos cardiovasculares (por ejemplo, aterosclerosis, miocarditis, enfermedad cardiovascular y complicaciones de derivación cardiopulmonar); así como muchas enfermedades, condiciones y trastornos adicionales que se caracterizan por inflamación (por ejemplo, hepatitis, artritis reumatoide, gota, trauma, pancreatitis, sarcoidosis, dermatitis, isquemia-daño por reperfusión, enfermedad de Grave, lupus heritematoso sistémico, diabetes melltus y rechazo de trasplantes alogénicos). Debido a que la inflamación es un mecanismo de defensa fundamental, los trastornos inflamatorios pueden afectar casi cualquier tejido del cuerpo. Por consiguiente, ios polinucleótidos, polipéptidos y anticuefos de la invención, así como agonistas o antagonistas de los mismos, tienen usos en el tratamiento de trastornos inflamatorios específicos de tejido incluyendo pero sin limitarse a adrenalitis, alveolitis, angiocolecistitis, apendicitis, baianitis, blefaritis, bronquitis, bursitis, carditis, celulitis, cervicitis, colecistitis, corditis, coclitis, colitis, conjuntivitis, cistitis, dermatitis, diverticulitis, encefalitis, endocarditis, esofagitis, eustaquitis, fibrositis, foliculitis, gastritis, gastroenteritis, gingivitis, glositis, hepatosplenitis, keratitis, labirintitis, laringitis, linfangitis, mastitis, media otitis, meningitis, mucitis, miocarditis, miocinitis, miringitis, nefritis, neuritis, orquitis, osteocondritis, otitis, pericarditis, peritendonitis, peritonitis, faringitis, flebitis, poliomielitis, prostatitis, pulpitis, retinitis, rinitis, salpingitis, escleritis, esclerocoroiditis, escrotitis, sinusitis, spondilitis, steatitis, stomatitis, sinovitis, siringitis, tendonitis, tonsilitis, uretritis y vaginitis. En otras modalidades, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos pueden ser útiles como un agente para incrementar la migración, fagocitosis, producción de superóxido, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos de neutrófilos, eosinófilos y macrófagos. En otra modalidad, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y trastornos caracterizados por o asociados con números incrementados o disminuidos de glóbulos blancos. La leucopenia ocurre cuando el número de glóbulos blancos disminuye por abajo del normal. Las leucopenias incluyen pero no se limitan a neutropenia y linfocitopenia. Un incremento en el número de glóbulos blancos en comparación en comparación con el normal se conoce como leucocitosis. El cuerpo genera números incrementados de glóbulos blancos durante la infección. Por lo tanto, la leucocitosis simplemente puede ser un parámetro fisiológico normal que refleja infección. Alternativamente, la leucocitosis puede ser un indicador de daño u otra enfermedad tal como cáncer. La leucocitosis incluye pero no se limita a eusinofilia y acumulaciones de macrófagos. En modalidades específicas, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de leucopenia. En otras modalidades específicas, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de leucocitosis. La leucopenia puede ser una disminución generalizada en todos los tipos de glóbulos blancos o puede ser un agotamiento específico de tipos particulares de glóbulos blancos. Por lo tanto, en modalidades específicas, los polinucieótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de disminuciones en números de neutrófilos, conocidos como neutropenia. Las neutropenias que pueden ser diagnosticadas, pronosticadas, prevenidas y/o tratadas por los poiinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos incluyen pero no se limitan a agranulocitosis genética infantil, neutropenla familiar, neutropenia cíclica, neutropenias que resultan de o asociadas con deficiencias dietéticas (por ejemplo, deficiencia de vitamina B12 o deficiencia de ácido fóiico), neutropenias que resultan de o asociadas con tratamientos de fármacos (por ejemplo, regímenes de antibióticos tales como tratamiento con penicilina, tratamiento con sulfonamida, tratamiento con anticoagulantes, fármacos anticonvulsivantes, fármacos antitiroideos y quimioterapia de cáncer), y neutropenias que resultan de destrucción de neutrófilos incrementada que pueden ocurrir en asociación con algunas infecciones bacterianas o virales, trastornos alérgicos, enfermedades autoinmunes, condiciones en las cuales un individuo tiene un vaso agrandado (por ejemplo, síndrome de Felty, malaria y sarcoidosis), y algunos regímenes de tratamiento de fármaco. Los poiinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de linfocitopenias (números disminuidos de linfocitos B y/o T) incluyendo pero sin limitarse a linfocítopenias que resultan de o asociadas con estrés, tratamientos de fármacos (por ejemplo, tratamiento de fármacos con corticosteroides, quimioterapias de cáncer y/o terapias de radiaciones), sida y/u otras enfermedades tales como, por ejemplo cáncer, artritis reumatoide, lupus heritematoso sistémico, infecciones crónicas, algunas infecciones virales y/o trastornos hereditarios (por ejemplo, síndrome de DiGeorge, síndrome de Wiskott-Aldrich, inmunodeficiencia combinada severa, ataxia-telangiectasia). Los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente Invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con números de macrófago y/o función de macrófagos incluyendo pero sin limitarse a enfermedad de Gaucher, enfermedad de Niemann-Pick, enfermedad de Letterer-Siwe y enfermedad de Hand-Schuller-Christian. En otra modalidad, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con números de eosinófilos y/o función de eosinófilos incluyendo pero sin limitarse a síndrome hipereosinofíiico ¡diopático, síndrome de eos?nofilia-i?ialgia y enfermedad de Hand-Schuller-Christian. En otra modalidad, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de leucemias y linfomas incluyendo pero sin limitarse a leucemia linfocítica aguda (linfoblástlca) (ALL), leucemia mieloide aguda (mielocítica, mielógena, mieloblástica o mielomonocítica), leucemia linfocítica crónica (por ejemplo, leucemias de células B, leucemias de células T, síndrome de Sezary y leucemia de células pilosas), leucemia mielocítica crónica (mieloide, mielógena, o granulocítica), linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de Burkitt y micosis fungoides. En otras modalidades, los polipéptidos, anticuerpos o polinucleótidos de la invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos, son útiles para diagnosticar, prevenir y/o trata enfermedades del complejo inmune, incluyendo pero sin limitarse a enfermedad del suero, glomerulonefritis post estreptocócica, poliarteritis nodosa y vasculitis inducida por complejo inmune. Los polipéptidos, anticuefos, polinucleótidos y/o agonistas o antagonistas de la invención se pueden usar para tratar, detectar, y/o prevenir agentes infecciosos. Por ejemplo, al incrementar la respuesta inmune, particularmente incrementando la actividad de proliferación y/o diferenciación de células B y/o T, las enfermedades infecciosas pueden ser tratadas, detectadas y/o prevenidas. La respuesta inmune se puede incrementar ya sea incrementando una respuesta inmune existente o iniciando una respuesta inmune nueva. Alternativamente, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos también pueden inhibir directamente al agente infeccioso (refiérase a la sección de aplicación que lista agentes infecciosos, etc.), sin inducir necesariamente una respuesta inmune.

En otra modalidad, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos se usan como un adyuvante de vacuna que incrementa la respuesta Inmune a un antígeno. En una modalidad preferida, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos se usan como un adyuvante para incrementar las respuestas inmunes específicas de tumores. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos se usan como un adyuvante para incrementar las respuestas inmunes antivirales. Las respuestas inmunes antivirales que se pueden incrementar usando las composiciones de la invención como un adyuvante, incluyen virus y enfermedades ó síntomas asociadas con virus descritos aquí o de otra manera conocidos en la técnica. En modalidades específicas, las composiciones de la invención se usan como un adyuvante para incrementar una respuesta inmune a un virus, enfermedad o síntoma seleccionado del grupo que consiste de: sida, meningitis, dengue, EBV y hepatitis (por ejemplo hepatitis B). En otra modalidad preferida, las composiciones de la invención se usan como un adyuvante para incrementar una respuesta inmune a un virus, enfermedad o síntoma seleccionado del grupo que consiste de: VIH/sida, virus sincicial respiratorio, dengue, rotavirus, encefalitis B japonesa, influenza A y B, parainfluenza, sarampión, citomegalovirus, rabia, Junin, Chikungunya, fiebre del valle de Rift, hefes simple y fiebre amarilla. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o poiipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos se usan como un adyuvante para incrementar respuestas inmunes antibacterianas o antimicóticas. Las respuestas inmunes antibacterianas o antimicóticas que se pueden incrementar usando las composiciones de la invención como un adyuvante, incluyen bacterias u hongos y enfermedades o síntomas asociados con bacterias u hongos descritos aquí o de otra manera conocidos en la técnica. En modalidades específicas, las composiciones de la invención se usan como un adyuvante para incrementar una respuesta inmune a una bacteria u hongo, enfermedad o síntoma seleccionado del grupo que consiste de: tétano, difteria, botulismo y meningitis de tipo B. En otra modalidad específica, las composiciones de la invención se usan como un adyuvante para incrementar una respuesta inmune a bacterias u hongos, enfermedad ó síntoma seleccionado del grupo que consiste de: Vibrio cholerae, Mycobacterium, leprae, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Meisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, estreptococos del grupo B, Shigella spp., Escherichia coli enterotoxigénica, E. coli enterohemonágica y Borrelia burgdorferi. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos se usan como un adyuvante para incrementar respuestas inmunes antiparasitarias. Las respuestas inmunes antiparasitarias que se pueden incrementar usando las composiciones de la invención como un adyuvante incluyen parásitos y enfermedades o síntomas asociados con parásitos descritos aquí o de otra manera conocidos en la técnica. En modalidades específicas, las composiciones de la invención se usan como un adyuvante para incrementar una respuesta inmune a un parásito. En otra modalidad específica, las composiciones de la invención se usan como un adyuvante para incrementar una respuesta inmune a Plasmodium (malaria) o Leishmania. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la Invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos también se pueden emplear para tratar enfermedades infecciosas incluyendo silicosis, sarcoidosis y fibrosis pulmonar idiopática; por ejemplo, previniendo el reclutamiento y activación de fagocitos mononucleares. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos se usan como un antígeno para ia generación de anticuerpos para inhibir o incrementar respuestas mediadas inmunes contra polipéptidos de la invención. En una modalidad, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos se administran a un animal (por ejemplo, ratón, rata, conejo, hámster, cobayo, cerdos, microcerdos, gallinas, camellos, cabra, caballo, vaca, oveja, perro, gato, primate no humano y seres humanos, muy preferiblemente seres humanos) para incrementar el sistema inmune para producir cantidades incrementadas de uno o más anticuerpos (v. gr., IgG, IgA, IgM e IgE), para inducir una mayor producción de anticuefos de afinidad y cambiar la clase de inmunoglobulina (v. gr., IgE, IgA, IgM e igE), y/o para incrementar una respuesta inmune. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos se usan como un estimulante de respuesta de células B a patógenos. En otra modalidad específica, los polinucieótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos se usan como un activador de células T. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos son usados como un agente que eleva el estatus inmune de un individuo antes de recibir terapias inmunosupresivas. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos son usados como un agente para inducir anticuerpos de afinidad superior. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos son usados como un agente para incrementar concentraciones de inmunoglobulina en el suero. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos son usados como un agente para acelerar la recuperación de individuos inmunocomprometidos. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la Invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos son usados como un agente para incrementar la Inmuno-respuesta entre poblaciones de edad y/o neonatos. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos son usados como un incrementador de sistema inmune antes de, durante o después de trasplante de médula ósea y/o de otros trasplantes (por ejemplo, trasplante de órganos alogénicos o xenogénicos). Con respecto al trasplante, las composiciones de la invención se pueden administrar antes de, concomitantem- ente con y/o después de trasplante. En una modalidad específica, las composiciones de la invención se administran después del trasplante, antes de empezar la recuperación de poblaciones de células T. En otra modalidad específica, las composiciones de la invención se administran primero después del trasplante después de empezar la recuperación de poblaciones de células T pero antes de la recuperación completa de poblaciones de células B. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos son usados como un agente para • incrementar la inmuno-respuesta entre individuos que tienen una pérdida adquirida de la función de células B. las condiciones que resultan en una pérdida adquirida de función de células B que se puede aliviar o tratar mediante la administración de polipéptidos, anticuefos, polinucleótidos y/o agonistas o antagonistas de los mismos, incluyen pero no se limitan a infección por VIH, SIDA, trasplante de médula ósea y leucemia linfocítica crónica de células B (CLL). En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos son usados como un agente para incrementar la inmuno-respuesta entre individuos que tienen deficiencia inmune temporal. Las condiciones que resultan en deficiencia inmune temporal que puede ser aliviada o tratada mediante la administración de polipéptidos, anticuerpos, polinucleótidos y/o agonistas o antagonistas de los mismos, incluyen pero no se limitan a recuperación de infecciones virales (por ejemplo, influenza), condiciones asociadas con desnutrición, recuperación de mononucleosis infecciosa o condiciones asociadas con estrés, recuperación de sarampión, recuperación de trasfusión sanguínea y recuperación de cirugía. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos son usados como un regulador de presentación de antígeno por monocitos, células dendríticas y/o células B. En una modalidad, los polinucleótidos y/o polipéptldos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos incrementan la presentación de antígenos o antagonizan la presentación de antígenos in vitro o in vivo. Además, en modalidades relacionadas, dicho incremento o antagonismo de presentación de antígeno puede ser útil como un tratamiento antitumorai o para modular el sistema inmune. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos son usados como un agente para dirigir el sistema inmune de un individuo hacia el desanollo de una respuesta humoral (es decir TH2) a diferencia de una respuesta celular TH1. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la Invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos son usados como un medio para inducir proliferación de tumor y por lo tanto para hacerlo más susceptible a agentes antineoplásicos. Por ejemplo, el mieloma múltiple es una enfermedad de división lenta y por lo tanto es refractaria casi a todos los regímenes antineoplásicos. Si estas células fueran forzadas a proiiferar más rápidamente, su perfil de susceptibilidad probablemente cambiaría. En otra modalidad específica, los polinucieótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos son usados como un estimulador de producción de células B en patologías tales como SIDA, trastorno de linfocitos crónico y/o inmunodeficiencia variable común. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos son usados como una terapia para la generación y/o regeneración de tejidos linfoides después de cirugía, trauma o defecto genético. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos se usan en el pretratamiento de muestras de médula ósea antes del trasplante. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos son usados como una terapia basada en genes para trastornos genéticamente heredados que resultan en inmunocompetencia/ inmunodeficiencia tal como se usa entre pacientes con SCID.

En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos son usados como un medio de activación de monocitos/macrófagos para defenderse contra enfermedades parasitarias que afectan a monocitos tales como Leishmania. En otra modalidad específica, los pollnucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos son usados como un medio para regular citocinas secretadas que son inducidas por polipéptidos de la invención. En otra modalidad, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos se usan en una o más aplicaciones aquí descritas, ya que se pueden aplicar a medicina veterinaria. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos son usados como un medio para bloquear varios aspectos de respuestas inmunes a agentes extraños o propios. Ejemplos de enfermedades o condiciones en las cuales el bloque de ciertos aspectos de respuestas inmune se puede desear incluyen trastornos autoinmunes tales como lupus y artritis, así como inmuno-respuestas a alergias de la piel, inflamación, enfermedad intestinal, lesión y enfermedades/trastornos asociados con patógenos.

En otra modalidad específica, ios polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos son usados como una terapia para prevenir la proliferación de células B y secreción de Ig asociada con enfermedades autoinmunes tales como púrpura trombocitopénica idiopática, lupus heritematoso sistémico y esclerosis múltiple. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos son usados como un inhibidor de migración de células B y/o células T en células endoteliales. Esta actividad altera la arquitectura de tejido o respuestas cognadas y es útil por ejemplo para alterar respuestas inmunes y bloquear sepsia. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos son usados como una terapia de hipergammaglobulinemia crónica evidente en enfermedades tales como gamopatía monoclonal de importancia no determinada (MGUS), enfermedad de Waldenstrom, gamopatías monocionales idiopáticas relacionadas y plasmacitomas. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos se puede emplear por ejemplo para inhibir quimiotáxis de polipéptidos y activación de macrófagos y sus precursores, y de neutrófilos, basófilos, linfocitos B y algunos subconjuntos de células T, por ejemplo, células T citotóxicas activadas y de CD8 y células asesinas naturales, en ciertas enfermedades autoinmunes, e inflamatorias e infecciosas crónicas. Ejemplos de enfermedades autoinmunes se describen aquí e incluyen esclerosis múltiple y diabetes dependiente de insulina. Los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos también se pueden emplear para tratar síndrome hipereosinofílico idiopático, por ejemplo, previniendo la producción y migración de eosinófilos. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos se usan para incrementar o inhibir lisis de células mediadas por complemento. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o pollpéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos se usan para incrementar o inhibir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptldos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos también se pueden emplear para tratar aterosclerosis, por ejemplo, previniendo la infiltración de monocitos en la pared arterial.

En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos se pueden emplear para tratar síndrome de insuficiencia respiratoria en adultos (ARDS). En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos pueden ser útiles para estimular la reparación de heridas y tejido, estimulando la angiogénesis y/o estimulando la reparación de enfermedades o trastornos vasculares o linfáticos. Además, los agonistas y antagonistas de la invención se pueden usar para estimular la regeneración de superficies de mucosa. En una modalidad específica, los poiinucleótidos o poiipéptidos, y/o agonistas de los mismos se usan para diagnosticar, pronosticar, tratar y/o prevenir un trastorno caracterizado por inmunodeficiencia primaria o adquirida, producción de inmunoglobulina en el suero deficiente, infecciones recurrentes y/o disfunción del sistema inmune. Además, los polinucleótidos o polipéptidos, y/o agonistas de los mismos se pueden usar para tratar o prevenir infecciones de las articulaciones, huesos, piel y/o glándulas parótidas, infecciones de la sangre (por ejemplo, sepsia, meningitis, artritis séptica y/o osteomielitis), enfermedades autoinmunes (por ejemplo, aquellas descritas aquí), trastornos inflamatorios y malignidades y/o cualesquiera enfermedad o trastorno o condición asociada con estas infecciones, enfermedades, trastornos y/o malignidades) incluyendo pero sin limitarse a CVID, otras deficiencias inmune primarias, enfermedad por VIH, CLL, bronquitis recurrente, sinusitis, otitis media, conjuntivitis, neumonía, hepatitis, meningitis, herpes zoster (por ejemplo, hefes zoster severo) y/o pneumocistitis camii. Otras enfermedades y trastornos que se pueden prevenir, diagnosticar, pronosticar y/o tratar con polinucleótidos o polipéptidos y/o agonistas de la presente invención incluyen pero no se limitan a infección por VIH, infección por HTLV-BLV, linfopenia, anemia por disfunción bacteriana de fagocitos, trombocitopenia y hemoglobinuria. En otra modalidad, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos se usan para tratar y/o diagnosticar a un individuo que tiene enfermedad de inmunodeficiencia variable común ("CVID"; también conocida como "agammaglobulinemia adquirida" y "hipogammaglobulinemia adquirida") o un subconjunto de esta enfermedad. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos se pueden usar para diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar cánceres o neoplasmas incluyendo cánceres o neoplasmas relacionados con células inmunes o tejidos inmunes. Ejemplos de cánceres o neoplasmas que pueden ser prevenidos, diagnosticados, tratados por polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos ¡ncluyen pero no se limitan a leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, enfermedad de Hodgkin, linfoma de no Hodgkin, anemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crónica, plasmacitomas, mieloma múltiple, enfermedad de Burkitt, enfermedades transformadas por EBV y/o enfermedades y trastornos descritos en la sección titulada "enfermedades hiperproliferativas" en otra parte de la presente invención. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos se usan como una terapia para disminuir la proliferación celular de linfomas de células B grandes. En otra modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos se usan como un medio para disminuir la implicación de células B e Ig asociadas con leucemia mielógena crónica. En modalidades específicas, las composiciones de la invención se usan como un agente para incrementar la inmuno-respuesta entre individuos inmunodeficientes en células B tales como, por ejemplo, un individuo que ha sufrido esplenoctomía parcial o completa. Los antagonistas de la invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos de unión y/o inhibidores, ácidos nucleicos de antisentido, ribozimas o formas solubles de los polipéptidos de la presente invención (por ejemplo, proteína de fusión Fc). Los agonistas de la invención incluyen por ejemplo anticuerpos de unión o estimuladores, y formas solubles de los polipéptidos (por ejemplo, proteínas de fusión Fc). Los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la Invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos se pueden emplear en una composición con un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, como se describe aquí. En otra modalidad, ios polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimlocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos se administran a un animal (incluyendo pero sin limitarse a aquellos listados anteriormente, y también incluyendo animales transgénicos) incapaces de producir moléculas de anticuefo endógeno funcionales o que tienen un sistema inmune endógeno de otra manera comprometido, pero que es capaz de producir moléculas de inmunoglobulina humana por medio del sistema inmune reconstituido o parcialmente reconstituido de otro animal (véase, por ejemplo, solicitud del PCT publicada No. W098/24893, WO/9634096, WO/9633735 y WO/9110741). La administración de polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de ia invención, y/o agonistas o antagonistas de ios mismos a dichos animales es útil en la generación de anticuerpos monoclonales contra polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos. Quimiotaxis. Los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), pueden tener actividad quimiotáctica. Una molécula quimiotáctica atrae o moviliza células (por ejemplo, monocitos, fibroblastos, neutrófilos, células T, células cebadas, eosinófilos, células epiteliales y/o endoteliales) a un sitio particular en el cuerpo, tal como inflamación, infección o sitio de hiperproliferación. Las células movilizadas pueden entonces combatir y/o sanar el trauma o anormalidad particular. Los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), pueden incrementar la actividad quimiotáctica de células particulares. Estas moléculas qulmiotácticas pueden entonces ser usadas para tratar, prevenir y/o diagnosticar enfermedades, trastornos y/o condiciones de inflamación, infección o hiperproliferativas, o cualquier trastorno del sistema inmune incrementando el número de células dirigidas a un sitio particular en el cuerpo. Por ejemplo, las moléculas quimiotácticas se pueden usar se pueden tratar para tratar, prevenir y/o diagnosticar heridas y otros traumas a tejidos atrayendo las células inmunes al sitio dañado. Las moléculas quimiotácticas de la presente invención también pueden atraer fibroblastos, que se pueden usar para tratar, prevenir y/o diagnosticar heridas. También se contempla que los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), pueden inhibir la actividad quimiotáctica. Estas moléculas también podrían usarse para tratar, prevenir y/o diagnosticar enfermedades, trastornos y/o condiciones. Por io tanto, los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se podrían usar como un inhibidor de quimitaxis. Enfermedad infecciosa. Los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), se pueden usar para tratar, prevenir y/o diagnosticar agentes infecciosos. Por ejemplo, incrementando la respuesta inmune, particularmente incrementando la proliferación y diferenciación de células B y/o células T, las enfermedades infecciosas se pueden tratar, prevenir y/o diagnosticar. La respuesta inmune se puede incrementar ya sea incrementando una respuesta inmune existente o iniciando una nueva respuesta inmune. Alternativamente, los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), también pueden inhibir directamente el agente infeccioso, sin inducir necesariamente una respuesta inmune. Los virus son un ejemplo de un agente infeccioso que puede causar enfermedad o síntomas que pueden ser tratados, prevenidos y/o diagnosticados por un polinucleótido o polipéptido y/o agonista o antagonista de la presente invención. Ejemplos de virus incluyen pero no se limitan a los siguientes y familias virales d ADN y ARN: Arbovirus, Adenoviridae, Arenaviridae, Arterivirus, Bimaviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Circoviridae, Coronaviridae, Dengue, EBV, VIH, Flaviviridae, Hepadnaviridae (Hepatitis), Herpesviridae (tales como, Cytomegalovirus, Hefes Simple, Hefes Zoster), Mononegavirus (v.gr., Paramyxoviridae, Morbillivirus, Rhabdoviridae), Orthomyxoviridae (v.gr., Influenza A, Influenza B y parainfluenza), virus de Papiloma, Papovaviridae, Parvoviridae, Piconamaviridae, Poxviridae (tales como viruela o vaccinia), Reoviridae (v.gr., Rotavirus), Retroviridae (HTLV-I, HTLV-II, lentivirus) y Togaviridae (v.gr., Rubivirus). Los virus que caen dentro de estas familias pueden causar una variedad de enfermedades o síntomas incluyendo pero sin limitarse a artritis, bronqueolitis, virus sincicial respiratorio, encefalitis, infecciones oculares (por ejemplo, conjuntivitis, queratitis), síndrome de fatiga crónica, hepatitis (A, B, C, E, activa crónica, Delta), encefalitis B japonesa, Junin, Chikungunya, fiebre del valle de Rift, fiebre amarilla, meningitis, infecciones oportunistas (por ejemplo, SIDA), neumonía, linfoma de Burkitt, varicela, fiebre hemorrágica, sarampión, paperas, parainfluenza, rabia, resfriado común, polio, leucemia, rubéola, enfermedades sexualmente transmitidas, enfermedades de la piel (por ejemplo, enfermedad de Kaposi, venugas) y viremia. Los poiinucieótidos o polipéptidos, o agonistas o antagonistas de la invención, se pueden usar para tratar, prevenir y/o diagnosticar cualquiera de estos síntomas o enfermedades. En modalidades específicas, los polinucleótidos, polipéptidos o agonistas o antagonistas de la invención se usan para tratar: meningitis, dengue, EBV y/o hepatitis (por ejemplo, hepatitis B). En una modalidad específica adicional, los polinucleótidos, polipéptidos o agonistas o antagonistas de la invención se usan para tratar pacientes que no responden a una o más vacunas de hepatitis comercialmente disponibles. En una modalidad específica adicional, los polinucleótidos, polipéptidos o agonistas o antagonistas de la invención se usan para tratar, prevenir y/o diagnosticar SIDA. En modalidades altamente preferidas, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos se usan para diagnosticar, tratar, prevenir o aliviar infección por VIH. En otras modalidades altamente preferidas, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos se usan para diagnosticar, tratar, prevenir o aliviar infecciones por citomegalovirus. En otras modalidades altamente preferidas, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de ia presente invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos se usan para diagnosticar, tratar, prevenir o aliviar infecciones por poxviridae. De manera similar, los agentes bacterianos o micóticos que pueden usar enfermedad o síntomas y que se pueden tratar, prevenir o diagnosticar por un polinucleótido o polipéptidos y/o agonistas o antagonistas de la presente invención incluyen pero no se limitan a las siguientes bacterias y familias de bacterias gram negativas y gram positivas y hongos: Actinomycetales (v.gr., Corynebacterium, Mycobacterium, Norcadia), Cryptococcus neoformans, Aspergillosis, Bacillaceae (v.gr., Anthrax, Clostridium), Bacteroidaceae, Blastomycosis, Bordetella, Borrelia (v.gr., Borrelia burgdorferi), Brucellosis, Candidiasis, Campylobacter, Coccidioidomycosis, Cryptococcosis, Dermatocycoses, £ coli (v.gr., E. coli enterotoxigénica y E coli enterohemonhágica), Enterobacteriaceae (Klebsiella, Salmonella v.gr., Salmonella typhi y Salmonella paratyphi), Serratia, Yersinia), Erysipelothrix, Helicobacter, Legionellosis, Leptospirosis, Listeria, Mycoplasmatales, Mycobacterium leprae, Vibrio cholerae, Neisseriaceae (v.gr., Acinetobacter, Gonorrea, Menigocócica), Meisseria meningitidis, infecciones por Pasteurellacea (v.gr., Actinobacillus, Heamophilus (v.gr., influenza hemof ílica tipo B), Pasteurella), Pseudomonas, Rickettslaceae, Chlamydiaceae, Syphillis, Shigella, spp., estafilocócica, men?ngiocócica, pneumocócica y estreptocócica (v.gr., Streptococcus pneumoniae y Streptococcus del Grupo B). Estas familias de bacterias u hongos pueden causar las siguientes enfermedades o síntomas, incluyendo pero sin limitarse a: bacteremia, endocarditis, infecciones oculares (conjuntivitis, tuberculosis, uveitis), gingivitis, infecciones oportunistas (por ejemplo, infecciones relacionadas son SIDA), panoniquia, infecciones relacionadas con próstesis, enfermedad de Reiter, infecciones del tracto respiratorio tales como tos ferina o empiema, sepsis, enfermedad de Lyme, enfermedad de arañazo de gato, disentería, fiebre paratifoidea, envenenamiento por alimentos, tifoidea, neumonía, gonorrea, meningitis (por ejemplo, meningitis de tipo A y B), Chlamydia, sífilis, difteria, lepra, paratuberculosis, tuberculosis, lupus, botulismo, gangrena, tétanos, impétigo, fiebre reumática, escarlatina, enfermedades transmitidas sexualmente, enfermedades de la piel (por ejemplo, celulitis, dermatocicosis), toxemia, infecciones del tracto urinario, infecciones por heridas. Los polinucleótidos o polipéptidos, agonistas o antagonistas de la invención, se pueden usar para tratar, prevenir y/o diagnosticar cualesquiera de estos síntomas o enfermedades. En modalidades específicas, los polinucleótidos, polipéptidos, agonistas o antagonistas de la invención se usan para tratar: tétanos, difteria, botulismo y/o meningitis del tipo B. Además, los agentes parasitarios que causan enfermedad o síntoma que se pueden tratar, prevenir y/o diagnosticar por un polinucleótido o polipéptido y/o agonista o antagonista de la presente invención incluyen pero no se limitan a ias siguientes familias o clases: Amibiasis, Babesiosis, Coccidiosis, Cryptosporidiosis, Dientamoebiasis, Dourina, Ectoparasítica, Giardiasis, Helmintiasis, Leishmaniasis, Teileriasis, Toxoplamosis, Tripanosomiasis y Tricomonas y Esporozoarios (por ejemplo, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparium, Plasmodium malatiae y Plasmoium ovale). Estos parásitos pueden causar una variedad de enfermedades o síntomas incluyendo pero sin limitarse a: sarna, trombiculiasis, infecciones oculares, enfermedades intestinales (por ejemplo, disentería, giardiasis), enfermedad hepática, enfermedad pulmonar, infecciones oportunistas (por ejemplo, relacionadas con SIDA), malaria, complicaciones del embarazo y toxoplasmosis. Los polinucieótidos o polipéptidos, o agonistas o antagonistas de la invención se pueden usar para tratar, prevenir y/o diagnosticar cualquiera de estos síntomas o enfermedades. En las modalidades específicas, los polinucleótidos, polipéptidos o agonistas o antagonistas de la invención se usan para tratar, prevenir y/o diagnosticar malaria. Preferiblemente, el tratamiento o prevención usando un polinucleótido o polipéptido y/o agonista o antagonista de la presente invención podría ser mediante administración de una cantidad efectiva de un polipéptido al paciente o removiendo células del paciente, suministrando a las células un polinucleótido de la presente invención y regresando las células genéticamente manipuladas al paciente (terapia ex vivo). Además, el polipéptido o polinucleótido de la presente invención se puede usar como un antígeno en una vacuna para producir una respuesta inmune contra enfermedad infecciosa. Enfermedades neurolóaicas. Las enfermedades, trastornos y/o condiciones del sistema nervioso, que pueden ser tratadas con las composiciones de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención (por ejemplo, polipéptidos, polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) y/o agonistas o antagonistas de los mismos), incluyen pero no se limitan a lesiones, y enfermedades, trastornos y/o condiciones del sistema nervioso que dan por resultado una desconexión de axones, una disminución o degeneración de neuronas o desmielinización. Las lesiones del sistema nervioso que pueden ser tratadas en un paciente (incluyendo pacientes humanos y mamíferos no humanos), de acuerdo con ia invención incluyen pero no se limitan a las siguientes lesiones del sistema nervioso central (incluyendo médula espinal, cerebro) o periférico: (1 ) lesiones isquémicas, en las cuales la falta de oxígeno en una porción del sistema nervioso da por resultado lesión neuronal o muerte neuronal, incluyendo infarto cerebral o isquemia, o infarto de médula espinal o isquemia; (2) lesiones traumáticas, incluyendo lesiones ocasionadas por daño físico o asociadas con cirugía, por ejemplo, lesiones que afectan una porción del sistema nervioso, o daños por compresión; (3) lesiones malignas, en las cuales una porción del sistema nervioso es destruida o dañada por tejido maligno que es una malignidad asociada con el sistema nervioso o una malignidad derivada de tejido de sistema no nervioso; (4) lesiones por infección, en las cuales una porción del sistema nervioso es destruida o dañada como resultado de infección, por ejemplo, por un abceso o asociada con infección por virus de inmunodeficiencia humana, virus de herpes zoster o virus de hefes simple, con enfermedad de Lyme, tuberculosis, sífilis; (5) lesiones degenerativas en ias cuales una porción del sistema nervioso es destruida o dañada como resultado de un proceso degenerativo que incluye pero no se limitan a degeneración asociada con enfermedad de Parkinson, enfermedad de Aizheimer, corea de Huntington o esclerosis lateral amiotrófica (ALS); (6) lesiones asociadas con enfermedades, trastornos y/o condiciones nutricionales, en las cuales una porción del sistema nervioso es destruida o dañada por un trastorno nutricional o un trastorno de metabolismo que incluye pero no se limitan a deficiencia de vitamina B12, deficiencia de ácido fólico, enfermedad de Wemicke, ambliopía por tabaco-alcohol, enfermedad de Marchiafava-Bignami (degeneración primaria del cuefo calloso), y degeneración cerebelar alcohólica; (7) lesiones neurológicas asociadas con enfermedades sistémicas que incluyen pero no se limitan a diabetes (neuropatía diabética, parálisis de Bell), lupus eritematoso sistémico, carcinoma o sarcoidosis; (8) lesiones causadas por sustancias tóxicas incluyendo alcohol, plomo o neurotoxinas particulares, y (9) lesiones desmielinadas en las cuales una porción del sistema nervioso es destruida o dañada por una enfermedad desmielinizante incluyendo pero no se limitan a esclerosis múltiples, mieiopatía asociada con virus de inmunodeficiencia humana, mielopatía transversa o varias etiologías, leucoencefalopatía mutifocal progresiva y mielinolisis pontina central. En una modalidad preferida, los polipéptidos, polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de la invención se usan para proteger a células neurales contra los efectos dañinos de hipoxia cerebral. De acuerdo con esta modalidad, las composiciones de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención se usan para tratar, prevenir y/o diagnosticar lesión celular neural asociada con hipoxia cerebral. En un aspecto de esta invención, los polipéptidos, polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o agonistas o antagonistas de la invención se usan para tratar, prevenir y/o diagnosticar daño de células neurales asociado con isquemia cerebral. En otro aspecto de esta invención, los polipéptidos, polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o agonistas o antagonistas de la invención se usan para tratar, prevenir y/o diagnosticar daño celular neural asociado con infarto cerebral. En otro aspecto de esta invención, los polipéptidos, polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o agonistas o antagonistas de la invención se usan para tratar, prevenir y/o diagnosticar daño celular neural asociado con un accidente vascular cerebral. En otro aspecto de esta modalidad, los polipéptidos, polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o agonistas o antagonistas de la invención se usan para tratar, prevenir y/o diagnosticar daño celular neural cerebral asociado con un accidente vascular cerebral. En un aspecto adicional de esta modalidad, los polipéptidos, polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o agonistas o antagonistas de la invención se usan para tratar, prevenir y/o diagnosticar daño celular neural asociado con ataque cardiaco. En otro aspecto de esta modalidad, los polipéptidos, polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o agonistas o antagonistas de la invención se usan para tratar, prevenir y/o diagnosticar daño celular neural asociado con ataque cardiaco. Las composiciones de la invención que son útiles para tratar, prevenir y/o diagnosticar un trastorno del sistema nervioso se pueden seleccionar probando la actividad biológica al promover la supervivencia o diferenciación de neuronas. Por ejemplo, y no a manera de limitación, las composiciones de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención que inducen cualquiera de los siguientes efectos puede ser útil de acuerdo con la invención: (1) tiempo de supervivencia incrementado de neuronas en cultivo; (2) surgimiento incrementado de neuronas en cultivo o in vivo; (3) producción incrementada de una molécula asociada con neuronas en cultivo o in vivo, por ejemplo, colinaacetiltransferasa o acetilcolinestearasa con respecto a las neuronas motoras; o (4) síntomas disminuidos de disfunción de neuronas in vivo. Dichos efectos se pueden medir por cualquier método conocido en la técnica. En modalidades no limitantes preferidas, la supervivencia incrementada de neuronas se pueden medir rutinariamente usando un método expuesto aquí o de otra manera conocido en ia técnica, tal como por ejemplo, el método expuesto en Arakawa et al. (J. Neurosci. 10:3507-3515 (1990)); el surgimiento incrementado de neuronas se puede detectar por métodos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, los métodos expuestos en Pestronk et al. (Exp. Neurol. 70:65-82 (1980)) o Brown et al. (Ann. Rev. Neurosci. 4:17-42 (1981)); la producción incrementada de moléculas asociadas con neuronas se puede medir por bioensayo, prueba enzimática, unión de anticuerpos, prueba de Northern blot, etc., usando técnicas conocidas en ei campo y dependiendo de la molécula que se va a medir; y ia disfunción de neuronas motoras se puede medir evaluando la manifestación física de trastorno de neuronas motoras, por ejemplo debilidad, velocidad de conducción de neuronas motoras o incapacidad funcional. En modalidades específicas, las enfermedades, trastornos y/o condiciones de neuronas motoras que se pueden tratar de acuerdo con la invención incluyen pero no se limitan a enfermedades, trastornos y/o condiciones tales como infarto, infección, exposición a toxina, trauma, daño quirúrgico, enfermedad degenerativa o malignidad que puede afectar las neuronas motoras así como otros componentes del sistema nervioso, así como enfermedades, trastornos y/o condiciones que afectan selectivamente a las neuronas tales como esclerosis lateral amiotrófica y que incluyen pero no se limitan a atrofia muscular espinal progresiva, parálisis bulbar progresiva, esclerosis lateral primaria,, atrofia muscular infantil y juvenil, parálisis bulbar progresiva de la niñez (síndrome de Fazio-Londe), poliomielitis y el síndrome de post polio, y neuropatía motosensorial hereditaria (enfermedad de Charcot-Marie-Tooth). Además, los polipéptidos o polinucleótidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención pueden jugar un papel en la supervivencia de las neuronas; formación de sinapsis; conductancia; diferenciación neural, etc. Además, las composiciones de la invención (incluyendo polinucleótidos y/o poiipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) y/o agonistas o antagonistas de los mismos) se pueden usar para diagnosticar y/o tratar o prevenir enfermedades o trastornos asociados con estas funciones, incluyendo pero no se limitan a trastornos de aprendizaje y/o cognición. Las composiciones de la invención también pueden ser útiles en el tratamiento o prevención de estados de enfermedad neurodegenerativos y/o trastornos conductuales. Dichos estados de enfermedad neurodegenerativos y/o trastornos conductuales incluyen pero no se limitan a enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, síndrome de Tourette, esquizofrenia, manía, demencia, paranoia, trastorno obsesivo-compulsivo, trastorno de pánico, incapacidades de aprendizaje, ALS, psicosis, autismo, y comportamientos alterados incluyendo trastornos en la alimentación, patrones del sueño, equilibrio y percepción. Además, las composiciones de la invención también pueden jugar un papel en el tratamiento, prevención y/o detección de trastornos del desanollo asociados con el desarrollo de embriones o trastornos sexualmente ligados. Además, los polinucleótidos y/o poiipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) y/o agonistas o antagonistas de los mismos, pueden ser útiles en la protección de células neurales de enfermedades, daño, trastornos o lesión, asociados con trastornos cerebrpvasculares incluyendo pero no se limitan a enfermedades de arteria carótida (por ejemplo, trombosis de arteria carótida, estenosis de carótida o enfermedad de Moyamoya), angiopatía amiloide cerebral, aneurisma cerebral, anoxia cerebral, arterioesclerosis cerebral, malformaciones arteriovenosas cerebrales, enfermedades de arteria cerebral, embolia cerebral y trombosis (por ejemplo, trombosis de arteria carótida, trombosis sinusoidal o síndrome de Wallenberg), hemorragia cerebral (por ejemplo, hematoma epidural o subdural, o hemorragia subaracnoidea), infarto cerebral, isquemia cerebral (por ejemplo, isquemia cerebral transitoria, síndrome de Subclavian Steal o insuficiencia vertebrobasiiar), demencia vascular (por ejemplo, de infartos múltiples), leucomalacia, cefalea periventricular y vascular (por ejemplo, cefalea de agregación o migrañas). De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se provee un procedimiento para utilizar polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), y/o agonistas o antagonistas de los mismos, para propósitos terapéuticos, por ejemplo, para estimular la proliferación y/o diferenciación de células neurológicas. Por io tanto, los polinucieótidos, polipéptidos, agonistas y/o antagonistas de la invención se pueden usar para tratar y/o detectar enfermedades neurológicas. Además, los polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), y/o agonistas o antagonistas de los mismos, se pueden usar como un marcador o detector de una enfermedad o trastorno del sistema nervioso particular. Ejemplos de enfermedades neurológicas que se pueden tratar o detectar con polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos, incluyen enfermedades cerebrales tales como enfermedades cerebrales que ¡ncluyen fenilcetonuria tales como fenllcetonuria materna, deficiencia de piruvato carboxilasa, deficiencia de complejo de piruvato deshidrogenasa, encefalopatía de Wemicke, edema cerebral, neoplasmas cerebrales tales como neoplasmas cerebelares que incluyen neoplasmas infratentorial, neoplasmas del ventrículo cerebral tales como neoplasmas del plexo coroidal, neoplasmas hipotalámicos, neoplasmas supratentorial, enfermedad de canavan, enfermedades cerebelares tales como ataxia cerebelar que incluye degeneración espinocerebelar tal como ataxia-telangiectasia, disinergia cerebelar, ataxia de Friederich, enfermedad de Machado-Joseph, atrofia olivopontocerebelar, neoplasmas cerebelares tales como neoplasmas infratentorial, esclerosis cerebral difusa tales como encefalitis periaxialis, leucodistrofia de células globoides, leucodistrofia metacromática y panencefalitis esclerosante subaguda. Enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos, incluyen trastornos cerebrovasculares (tales como enfermedades de arteria carótida que incluyen trombosis de arteria carótida, estenosis carotidea y enfermedad de Moyamoya), angiopatía amiloide cerebral, aneurisma cerebral, anoxia cerebral, arteriosclerosis cerebral, malformaciones arteriovenosas cerebrales, enfermedades de arterias cerebrales, embolia cerebral y trombosis tales como trombosis de arteria carótida, trombosis sinusoidal y síndrome de Wallenberg, hemonagia cerebral tal como hematoma epidural, hematoma subdural y hemorragia subaracnoidea, infarto cerebral, isquemia cerebral tal como isquemia cerebral transitoria, síndrome de Subclavian Steal e Insuficiencia vertebrobasilar, demencia vascular tal como demencia por muitiinfartos, leucomalacia periventricular, cefalea vascular tal como cefalea de agregación y migraña.

Enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de ia presente invención y/o agonistas o antagonistas de fos mismos, incluyen demencia tal como complejo de demencia por SIDA, demencia presenil tal como enfermedad de Alzheimer y síndrome de Creutzeldt-Jakob, demencia senil tal como enfermedad de Alzheimer y parálisis supranuclear progresiva, demencia vascular tal como demencia por infartos múltiples, encefalitis que incluye encefalitis periaxilis, encefalitis viral tal como encefalitis epidémica, encefalitis japonesa, encefalitis de St. Louis, encefalitis por garrapatas y fiebre del Nilo Occidental, encefalomieiitis diseminada aguda, meningoencefalitis tal como síndrome uveomeningoencefalítico, enfermedad de Parkinson postencefálica y panencefalitis esclerosante subaguda, encefalomalacia tal como leucomalacla periventricular, epilepsia tal como epilepsia generalizada que incluye espasmos infantiles, epilepsia con ausencia, epilepsia mioclónica que incluye síndrome de MERRF, epilepsia tónica-clónica, epilepsia parcial tal como epilepsia parcial compleja, epilepsia del lóbulo frontal y epilepsia del lóbulo temporal, epilepsia post-traumática, estado epiléptico tal como parálisis continua por epilepsia y síndrome de Hailervorden-Spatz. Enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos, incluyen hidrocéfalo tal como síndrome de Dandy-Walker e hidrocéfalo de presión normal, enfermedades hipotaiámicas tales como neoplasmas hipotalámicos, malaria cerebral, narcolepsia que incluye cataplexia, poliomielitis bulbar, pseudotumor cerebral, síndrome de Rett, síndrome de Reye, enfermedades talámicas, toxoplasmosis cerebral, tuberculoma intracranial y síndrome de Zellweger, infecciones del sistema nervioso central tales como complejo de demencia por SIDA, absceso cerebral, empiema subdural, encefalomlelitis tal como encefalomielitis equina, encefalomielitis equina venezolana, encefalomielitis hemorrágica necrotizante, Visna y malaria cerebral. Enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos, incluyen meningitis tal como aracnoiditis, meningitis aséptica tal como meningitis viral que incluye coriomeningitis iinfocítica, meningitis bacteriana que incluye meningitis hemofílica, listeria meningitis, meningitis menincocócica tal como síndrome de Waterhouse-Friderichsen, meningitis pneuomocócica y tuberculosis meningeal, meningitis fungal tal como meningitis criptocócica, efusión subdural, meningoencefalitis tal como síndrome uvemeningoencefalítico, mielitis tal como mielitis transversal, neurosífiiis tal como tabes dorsalis, poliomielitis que incluye poliomielitis bulbar y síndrome post-poliomielitis, enfermedad de priones (tal como síndrome de Creutzfeldt-Jakob, encefalopatía espongioforme de bovino, síndrome de Gerstmann-Straussler, Kuru, Scrapie) y toxopiasmosis cerebral.

Enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos, incluyen neoplasmas del sistema nervioso central tales como neoplasmas del cerebro que incluyen neoplasmas cerebelares tales como neoplasmas infratentoriales, neoplasmas del ventrículo cerebral tales como neoplasmas de plexo coroidal, neoplasmas hipotalámicos y neoplasmas supratentorial, neoplasmas meningiales, neoplasmas de la médula espinal que incluyen neoplasmas epidurales, enfermedades desmieiinizadoras tales como enfermedades de Canavan, esclerosis cerebral difusa que incluye adrenoleucodistrofia, encefalitis periaxialis, leucodistrofia de células globoides, esclerosis cerebral difusa tal como leucodistrofia metacromática, encéfalomielitis alérgica, encéfalomielitis hemorrágica necrotizante, ieucoencefalopatía multifocal progresiva, esclerosis múltiple, mielinolisis pontina central, mielitis transversal, neuromieiltis óptica, Scrapie, espalda caída, síndrome de fatiga crónica, Visna, síndrome nervioso por alta presión, meningismo, enfermedades de la médula espinal tales como amiotonia congénita, esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal tal como enfermedad de Werdnig-Hoffmann, compresión de la médula espinal, neoplasmas de la médula espinal tales como neoplasmas epidurales, siringomielia, Tabes Dorsalis, síndrome de hombre rígido, retrazo mental tal como Angelman, síndrome de Cri-du-Chat, síndrome de De Lange, síndrome de Down, gangliosidosis tal como gangliosidosis G(M1), enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Tay-Sachs, enfermedad de Hartnup, homocistinuria, síndrome de Laurence-Moon-Biedl, síndrome de Lesch-Nyhan, enfermedad de orina de jarabe de arce, mucolipidosis tal como fucusidosis, lipofuscinosis ceroide neuronal, síndrome oculocerebrorrenal, feniicetonuria tal como feniicetonuria materna, síndrome de Prader-Willi, síndrome de Rett, síndrome de Rubinstein-Taybi, esclerosis tuberosa, síndrome de WAGR, anormalidades del sistema nervioso tales como holoprosencefalia, defectos del tubo neural tales como anencefalia que incluye hidrangencefalia, deformidad de Arnold-Chairi, encefalocele, meningoceie, meningomielocele, disrafismo espinal tal como espina bífida cística y espina bífida oculta. Enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos, incluyen neuropatías motoras y sensoriales hereditarias que incluyen enfermedad de Charcot-Marie, atrofia óptica hereditaria, enfermedad de Refsum, paraplejia espástica hereditaria, enfermedad de Werdnig-Hoffmann, neuropatías sensorial y autónoma hereditarias tales como analgesia congénita y disautonomía familiar, manifestaciones neurológicas (tales como agnosia que incluyen síndrome de Gerstmann, amnesia tal como amnesia de retrogrado, apraxia, vejiga neurogénica, cataplexia, trastornos comunicativos tales como trastornos del oído que incluyen sordera, pérdida parcial del oído, aumento gradual del sonido y tinitus, trastornos del lenguaje tales como afasia que incluyen agrafía, anomia, broca afasia y afasia de Wemicke, dislexia tal como dislexia adquirida, trastornos de desarrollo del lenguaje, trastornos del habla tales como afasia que incluyen anomia, broca afasia y afasia de Wernicke, trastornos de articulación, trastornos comunicativos tales como trastornos del habla que incluyen disartria, ecolalia, mutismo y tartamudeo, trastornos de la voz tales como afonía y ronquera, estado desacerbado, delirio, fasciculación, alucinaciones, meningismo, trastomos del movimiento tales como síndrome de Angelman, ataxia, atetosis, coria, distonia, hipocinesia, hipotonía muscular, mioclono, tic, tortícolis y tremores, hipertonía muscular tal como rigidez muscular tal como síndrome de hombre rígido, espasticidad muscular, parálisis tal como parálisis facial que incluye oticus por Herpes Zoster, Gastroparesis, Hemiplejía, oftalmoplejia tal como diplopia, síndrome de Duane, síndrome de Horner, oftaimoplejia progresiva crónica tal como síndrome de Kearns, parálisis bulbar, paraparesis espástica tropical, paraplejia tal como síndrome de Brown-Sequard, cuadriplejia, parálisis respiratoria y parálisis de las cuerdas vocales, paresis, limbo fantasma, trastornos del gusto tales como ageusia y disgeusia, trastornos de la visión tales como ambliopía, ceguera, defectos de visión de color, diplopia, hemianoposia, escotoma y visión subnormal, trastornos del sueño tales como hipersomnia que incluye síndrome de Levin, insomnia y sonambulismo, espasmo tal como trismo, inconciencia tal como coma, estado vegetativo persistente y síncope y vértigo, trastornos neuromusculares tales como amiotonia congénita, esclerosis lateral amiotrófica, síndrome de Lambert-Eaton Myasthenic, enfermedad de neuronas motoras, atrofia muscular tal como atrofia muscular espinal, enfermedad de Charcot-Marie y enfermedad de Werdnig-Hoffmann, síndrome de post-poliomielitis, distrofia muscular, miastenia gravis, miotonia atrófica, miotonia congénita, miopatía neomalina, parálisis periódica familiar, paramiloclono múltiple, paraparesis espástica tropical y síndrome de hombre rígido, enfermedades del sistema nervioso periférico tal como acrodinia, neuropatías amiloides, enfermedades del sistema nervioso autónomo tales como síndrome de Adié, síndrome de Barre-Lieou, disautonomía familiar, síndrome de Horner, distrofia simpática refleja y síndrome de Shy-Drager, enfermedades del nervio cranial tales como enfermedades del nervio acústico tales como neuroma acústica que incluye neurofibromatosis 2, enfermedades del nervio facial tales como neuralgia facial, síndrome de Melkersson-Rosenthal, trastornos de movilidad ocular que incluye ambliopía, nistagmo, parálisis del nervio oculomotor, oftalmoplejia tal como síndrome de Duane, síndrome de Homer, oftalmoplejia extema progresiva crónica que incluye síndrome de Kearns, estrabismo tal como esotropía y exotropia, parálisis de nervio oculomotor, enfermedad de nervio óptico tal como atrofia óptica que incluye atrofia óptica hereditaria, rosetas de disco óptico, neuritis óptica tal como neuromielitis óptica, papiledema, neuralgia trigeminal, parálisis de las cuerdas vocales, enfermedades desmielinizadoras tales como neuromielitis óptica y espalda caída, y neuropatías diabéticas tales como pie diabético. Enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con polinucleótidos y/o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención y/o agonistas o antagonistas de los mismos, ¡ncluyen síndromes de compresión de nervios tales como síndrome de túnel cafal, síndrome de túnel tarsal, síndrome de salida torácica tales como síndrome de costilla cervical, síndrome de compresión de nervio ulnar, neuralgia tal como causalgia, neuralgia cérvico-braquial, neuralgia facial y neuralgia trigeminal, neuritis tales como neuritis alérgica experimental, neuritis óptica, polineuritis, polinadiculoneuritis y radiculltos tales polirradiculitis, neuropatías motoras y sensoriales hereditarias tales como enfermedad de Charcot-Marie, atrofia óptica hereditaria, enfermedad de Refsum, paraplejia espástica hereditaria y enfermedad de Werdnig-Hoffmann, neuropatías sensorial y autónoma hereditarias que incluyen analgesia congénita y disautonomía familiar, síndrome de POEMS, scíatica, sudoración gustatorial y tetania). Trastornos hipefroliferativos. Los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), se pueden usar para tratar, prevenir y/o diagnosticar enfermedades, trastornos y/o condiciones hiperproliferativas incluyendo neoplasmas. Los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), pueden inhibir la proliferación del trastorno a través de interacciones directas o indirectas. Alternativamente, Los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), pueden proliferar otras células que pueden inhibir el trastorno hipefroliferativo. Por ejemplo, incrementado una respuesta inmune, particularmente calidades antigénicas cada vez mayores del trastorno hipefroliferativo o por proliferación, diferenciación o movilización de células T, enfermedades, trastornos y/o condiciones hiperproliferativas pueden ser tratadas, prevenidas y/o diagnosticadas. Estas respuestas inmunes se pueden incrementar ya sea incrementando una respuesta inmune existente o iniciando una nueva respuesta inmune. Alternativamente, la reducción de una respuesta inmune también puede ser un método para tratar, prevenir y/o diagnosticar enfermedades, trastomos y/o condiciones hiperproliferativas tales como un agente quimioterapéutico. Ejemplos de enfermedades, trastornos y/o condiciones hiperproliferativas que pueden ser tratadas, prevenidas y/o diagnosticadas por los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), incluyen pero no se limitan a neoplasmas ubicados en: el colon, abdomen, hueso, mama, aparato digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (supranenales, paratiroidea, pituitaria, testículos, ovario, timo, tiroides), ojos, cabeza y cuello, nervios (centrales y periféricos), sistema linfático, pélvica, piel, tejido liso, baso, torácico y urogenital. De manera similar, otras enfermedades, trastornos y/o condiciones hiperproliferativas pueden ser tratadas, prevenidas y/o diagnosticadas por los pollnucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Ejemplos de dichas enfermedades, trastornos y/o condiciones hipefroliferativas incluyen pero no se limitan a: hipergammaglobulinemia, enfermedades linfoproliferativas, trastornos y/o condiciones, paraproteinemias, púfura, sarcaidosis, síndrome de Sezary, macroglobulinemia de Waldenstron, enfermedad de Gaucher, histocitosis y otra enfermedad hiperproiiferativa, además de noplasia, ubicada en un sistema de órganos anteriormente listado. Una modalidad preferida utiliza poilnucleótidos de la presente invención para inhibir división celular aberrante, por terapia génica usando la presente Invención, y/o fusiones de proteína o fragmentos de los mismos. Por lo tanto, la presente invención provee un método para tratar enfermedades, trastornos y/o condiciones proliferativas insertando en una célula anormalmente proliferante un polinucleótido de ia presente invención, en donde dicho poiinucleótido reprime dicha expresión. Otra modalidad de la presente invención provee un método para tratar enfermedades, trastornos y/o condiciones proliferativas de células en individuos que consiste en la administración de una o más copias de genes más activos de la presente invención a una célula o células anormalmente proliferantes. En una modalidad preferida, los polinucleótidos de la presente invención son una construcción de ADN que comprende un vector de expresión recombinante que es efectivo para expresar secuencia de ADN que codifica dichos poiinucleótidos. En otra modalidad preferida de la presente invención, la construcción de ADN que codifica los polinucleótidos de la presente invención se inserta en células que van a ser tratadas utilizando un retrovirus, o más preferiblemente un vector adenoviral (véase G J. Nabel, et al., PNAS 1999 96: 24-326, que se incorpora aquí por referencia. En una modalidad más preferida, el vector viral es defectuoso y no transformará células no proliferantes, sólo células proliferantes. Además, en una modalidad preferida, los polinucleótidos de la presente invención insertados en células proliferantes ya sea solos o en combinación o fusionados a otros poiinucleótidos, pueden ser modulados por medio de un estímulo externo (es decir, magnético, de molécula pequeña específica, químico o administración de fármacos, etc.), que actúa sobre el promotor hacia el extremo cinco prima de dichos polinucleótidos para inducir expresión del producto de proteína codificado. Como tal, el efecto terapéutico benéfico de la presente invención se puede modular expresamente (es decir, incrementar, disminuir o inhibir la expresión de la presente invención) con base en dicho estímulo externo. Los polinucleótidos de la presente invención pueden ser útiles para reprimir la expresión de genes oncogénicos o antígenos. Por "represión de expresión de los genes oncogénicos" se entiende la supresión de la transcripción del gen, la degradación de la transcripción del gen (ARN de premensaje), la inhibición de empalme, la destrucción del ADN mensajero, la prevención de las modificaciones de post-traducción de la proteína, la destrucción de la proteína o la inhibición de la función normal de la proteína.

Para la administración local a células anormalmente proliferantes, los polinucleótidos de la presente invención se pueden administrar por cualquier método conocido para los expertos en la técnica incluyendo pero sin limitarse a transfección, electroporación, microinyección de las células o en vehículos tales como liposomas, lipofectina o como poiinucleótidos desnudos, o cualquier otro método descrito en toda la especificación. Ei polinucleótido de la presente invención se puede suministrar por sistemas de suministro de genes conocidos tales como pero sin limitarse a vectores retrovirales (Gilboa, J. Virology 44:485 (1982); Hocke, Nature 320:275 (1986); Wilson, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 85:3014), sistema de virus de vaccinia (Chakrabarty et al., Mol. Cell Biol. 5:3403 (1985) u otros sistemas de suministro de ADN eficientes (Yates et al., Nature 313:812 (1985)) conocidos por los expertos en la técnica. Estas referencias son ilustrativas únicamente y se incorporan aquí por referencia. A fin de suministrar específicamente o transfectar células que son anormalmente proliferantes y no afectan a las células normales no divisibles de reserva, es preferible utilizar un retrovirus, o sistema de suministro adenoviral (como se describe en la técnica y en otra parte aquí) conocido por los expertos en la técnica. Puesto que la replicación de ADN de hospedero es requerida para que el ADN retroviral se integre y el retrovirus sea incapaz de auto-replicarse debido a la falta de los genes de retrovirus necesarios para su ciclo de vida. Utilizando dicho sistema de suministro retroviral para polinucleótidos de la presente invención se dirigirá dicho gen y construcciones a células anormalmente proliferantes y no afectarán a las células normales no divisibles. Los polinucleótidos de ia presente invención pueden ser suministrados directamente a sitios de trastorno/enfermedad proliferativa en órganos internos, cavidades corporales y similares mediante el uso de dispositivos formadores de imagen usados para guiar una aguja de inyección directamente al sitio de la enfermedad. Los polinucleótidos de la presente invención también se pueden administrar a sitios de enfermedad durante la intervención quirúrgica. Por "enfermedad proliferativa de células" se entiende cualquier enfermedad o trastorno humano o animal que afecta cualesquiera o cualquier combinación de órganos, cavidades o partes del cuerpo, que se caracteriza por proliferaciones anormales locales múltiples de células, grupos de células o tejidos, ya sea benignos o malignos. Cualquier cantidad de los polinucleótidos de la presente invención se puede administrar mientras tenga un efecto biológicamente inhibidor sobre la proliferación de las células tratadas. Además, es posible administrar más de uno de los polinucleótidos de la presente invención simultáneamente al mismo sitio. Por "inhibir biológicamente" se entiende la inhibición parcial o total del crecimiento así como disminución en la velocidad de proliferación o crecimiento de las células. La dosis biológicamente inhibidora se puede determinar evaluando los efectos de los polinucieótidos de fa presente invención sobre crecimiento celular maligno o anormalmente proliferante objetivo en cultivo de tejido, crecimiento de tumores en animales y cultivos de células, o cualquier otro método conocido por un experto en la técnica. La presente invención está dirigida además a terapias a base de anticuefos que implican la administración de anticuefos antipoiipéptidos y antipolinucleótidos a un mamífero, preferiblemente un humano, para tratar una o más de las enfermedades, trastornos y/o condiciones descritas. Los métodos para producir anticuerpos antipolipéptidos y antipolinucleótidos y anticuerpos monoclonales se describen con detalle aquí en otra parte. Dichos anticuerpos se pueden proveer en composiciones farmacéuticamente aceptables como se conoce en la técnica o como se describe aquí. Un resumen de las formas en las cuales los anticuerpos de la presente invención se pueden usar terapéuticamente incluye unir los polinucleótidos o polipéptidos de la presente invención localmente o sistémicamente en el cuerpo o mediante citotoxicidad directa anticuerpo, por ejemplo, mediada por complemento (CDC) o por células efectoras (ADCC): Algunos de estos enfoques se describen con más detalle más adelante. Apoyado con las enseñanzas que aquí se proveen, un experto en la técnica sabrá cómo usar los anticuerpos de la presente invención para propósitos de diagnóstico, monitoreo o terapéuticos sin mucha experimentación. En particular, los anticuefos, fragmentos y derivados de la presente invención son útiles para tratar a un sujeto que tiene o que desarrolla enfermedades, trastornos y/o condiciones proliferativas y/o de diferenciación de células como se describe aquí. Dicho tratamiento consiste en administrar un sola dosis o dosis múltiples del anticuerpo, o un fragmento, derivado o un conjugado del mismo. Los anticuerpos de esta invención se pueden utilizar ventajosamente en combinación con otros anticuerpos monoclonales o quiméricos, o con linfocinas o factores de crecimiento hematopoyético, por ejemplo, que sirven para incrementar el número o actividad de células efectoras que interactúan con los anticuerpos. Se prefiere usar anticuerpos de inhibición y/o neutralización in vivo de alta afinidad y/o potentes de la presente Invención, fragmentos o regiones de los mismos, tanto para inmunoensayos dirigidos a y terapia de enfermedades, trastornos y/o condiciones relacionadas con polinucleótidos o polipéptidos, incluyendo fragmentos de los mismos, de la presente invención. Dichos anticuerpos, fragmentos o regiones preferiblemente tendrán una afinidad para poiinucleótidos o polipéptidos, incluyendo fragmentos de los mismos. Las afinidades de unión preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd menor que 5 X 10"2 M, 10"2 M, 5 X 10"3 M, 10"3 M, 5 X 10"4 M, 10"4 M. Las afinidades de unión más preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd menor que 5 X 10"5 M, 10"5 M, 5 X 10"6 M, 10"6 M, 5 X 10"7 M, 10"7 M, 5 X 10"8 M, 10"8 M. Afinidades de unión aún más preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd menor que 5 X 10"9 M, 10"9 M, 5 X 10"10 M, 10"10 M, 5 X 10"11 M, 10"11 M, 5 X 10"12 M, 10"12 M, 5 X 10"13 M, 10"13 M, 5 X 10"14 M, 10"14 M, 5 X 10"15 M, 10"15 M. Además, los polipéptidos de la presente invención son útiles en la inhibición de la angiogénesis de células o tejidos proliferativos, ya sea solos, como una fusión de proteína o en combinación con otros polipéptidos directamente o indirectamente como se describe en otra parte de la presente invención. En una modalidad más preferida, dicho efecto anti-angiogénesis se pueden lograr indirectamente, por ejemplo, mediante la inhibición de células específicas de tumor hematopoyéticas, tales como macrófagos asociados con tumor (véase Joseph IB, et al. J. Nati Cáncer Inst, 90(21): 1648-53 (1998), que se incofora aquí por referencia). Los anticuerpos dirigidos a polipéptidos o polinucleótidos de fa presente invención también pueden dar por resultado la inhibición de angiogénesis directamente o indirectamente (véase Witte L. et al., Cáncer Metástasis Rev. 17(2):155-61 (1998), que se incorpora aquí por referencia). Los polipéptidos, incluyendo fusiones de proteína G de la presente invención o fragmentos de los mismos pueden ser útiles para inhibir células o tejidos proliferativos a través de la inducción de apoptosis. Dichos polipéptidos pueden actuar ya sea directamente o indirectamente para inducir apoptosis de células y tejidos proliferativos, por ejemplo en la activación de un receptor de dominio-muerte, tal como el receptor-1 de factor de necrosis tumoral (FNT), CD95 (Fas/APO-1), proteína mediada por apoptosis relacionado con receptor de FNT (TRAMP) y receptor-1 y -2 de ligando inductor de apoptosis relacionado con FNT (TRAIL) (véase Schulze-Osthoff K, et ai., Eur J Biochem 254(3):439-59 (1998), que se incorpora aquí por referencia). Además, en otra modalidad preferida de la presente invención, dichos polipéptidos pueden inducir apoptosis a través de otros mecanismos, tales como en la activación de otras proteínas que activarán la apoptosis, o a través de la estimulación de la expresión de dichas proteínas, ya sea solas o en combinación con fármacos de molécula pequeña o adyuvantes tales como apoptonina, galectinas, tioredoxinas, proteínas antiinflamatorias (véase por ejemplo, Mutat Res 400(1 -2):447-55 (1998), Med Hypotheses 50(5):423-33 (1998), Chem Biol. Interact. Apr 24.111-112:23-24 (1998), J. mol Med. 76(6):402-12 (1998), Int J Tissue React; 20(1):3-15 (1998), que se incorporan aquí por referencia). Los polipéptidos, incluyendo fusiones de proteína G a, o fragmentos de ios mismos, de la presente invención son útiles para inhibir la metástasis de células o tejidos proiiferativos. La inhibición puede ocurrir como un resultado directo de administrar polipéptidos o anticuefos dirigidos a dichos polipéptidos como se describe en otra parte de la presente invención, o indirectamente tales como activando la expresión de proteínas que se sabe que inhiben la metástasis, por ejemplo, alfa 4 integrinas (véase, por ejemplo Curr Top Microbiol Immunol 1998; 231 :125-41 , que se incorpora aquí por referencia). Dichos efetos terapéuticos de la presente invención se pueden lograr ya sean solos o en combinación con fármacos o adyuvantes de molécula pequeña.

En otra modalidad, la invención provee un método para suministrar composiciones que contienen los polipéptidos de la invención (por ejemplo, composiciones que contienen polipéptidos o anticuerpos de polipéptidos asociados con polipéptidos heterólogos, ácidos nucleicos heterólogos, toxinas o profármacos) a células dirigidas que expresan el polipéptido de la presente invención. Los polipéptidos o anticuerpos de polipéptido de la Invención se pueden asociar con polipéptidos heterólogos, ácidos nucleicos heterólogos, toxinas o profármacos mediante interacciones hidrofóbicas, hidrofílicas, iónicas y/o covalentes. Los polipéptidos, fusiones de proteína a o fragmentos de los mismos de la presente invención son útiles para incrementar la inmunogenicidad y/o antigenicidad de células o tejidos proliferantes, ya sea directamente tal como ocurriría si los polipéptidos de la presente invención "vacunaran" la respuesta inmune para responder a antígenos proliferativos o ¡nmunógicos, o indirectamente tal como en la activación de ia expresión de proteínas que se sabe que incrementan la respuesta inmune (por ejemplo quimiocinas), dichos antígenos e inmunógenos. Trastornos cardiovasculares. Los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), que codifican el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se pueden usar para tratar, prevenir y/o diagnosticar enfermedades, trastornos y/o condiciones cardiovasculares incluyendo enfermedad de arteria periférica tal como isquemia límbica.

Las enfermedades, trastornos y/o condiciones cardiovasculares incluyen anormalidades cardiovasculares tales como fístula arterio-arterial, fístula arteriovenosa, malformaciones arteriovenosas cerebrales, defedos cardiacos congénitos, atresia pulmonar y síndrome de Scimitar. Los defectos cardiacos congénitos ¡ncluyen coarctación aórtica, cor triatríatum, anormalidades de vasos coronarios, corazón cruzado, dextrocardia, ductus arteriosus evidente, anomalía de Ebstein, complejo de Eisenmenger, síndrome cardiaco izquierdo hipoplástlco, levocardia, tetralogía de Fallot, transposición de vasos grandes, ventrículo derecho de doble salida, atresia tricúspide, arteriosus truncus persistente y defedos de septos cardiacos, tales como defecto de septo aortopulmonar, defectos de cojín endocardial. síndrome de Lutembacher, trilogía de Fallot, defectos septales cardiacos ventricuiares. Las enfermedades, trastornos y/o condiciones cardiovasculares también incluyen enfermedad cardiaca tal como arritmias, enfermedad cardiaca carcinoide, salida cardiaca alta, salida cardiaca baja, taponamiento cardiaco, endocarditis (incluyendo bacteriana), aneurisma cardiaca, arresto cardiaco, insuficiencia cardiaca congestiva, cardiomiopatía congestiva, disfnea paroxismai, edema cardiaco, hipertrofia cardiaca, cardiomiopatía congestiva, hipertrofia ventricular izquierda, hipertrofia ventricular derecha, ruptura cardiaca de postinfarto, ruptura de septo ventricular, enfermedades de válvula cardiaca, enfermedades miocardiales, isquemia miocardial, efusión pericardial, pericarditis (incluyendo constrictiva y tuberculosa), neumopericardio, síndrome de postpericardiotomía, enfermedad cardiaca pulmonar, enfermedad cardiaca reumática, disfunción ventricular, hiperemia, complicaciones del embarazo cardiovasculares, síndrome de Scimitar, sífilis cardiovascular y tuberculosis cardiovascular. Las amtmias incluyen arritmia de senos, fibrilación atrial, palpitación atrial, bradicardia, extrasístole, síndrome de Adams-Stokes, bloqueo de paquete-rama, bloqueo sinoatrial, síndrome QT largo, parasístole, síndrome de Lown-Ganong-Levine, síndrome de preexitación de tipo Mahaim, síndrome de Wolf-Parkinson-White, síndrome de seno enfermo, taquicardias y fibrilación ventricuiar. Las taquicardias incluyen taquicardia paroxismal, taquicardia supraventricular, ritmo idioventricular acelerado, taquicardia de reentrada nodal atrioventricular, taquicardia atrial ectópica, taquicardia de unión ectópica, taquicardia de reentrada nodal sinoatrial, taquicardia de seno, Torsades de Pointes y taquicardia ventricular. La enfermedad de válvula cardiaca incluye insuficiencia de válvula aórtica, estenosis de válvula aórtica, soplos cardiacos, prolapso de válvula aortam prolapso de válvula mitral, prolapso de válvula tricúspide, insuficiencia de válvula mitral, estenosis de válvula mitral, atresia pulmonar, insuficiencia de válvula pulmonar, estenosis de válvula pulmonar, atresia tricúspide, insuficiencia de válvula tricúspide y estenosis de válvula tricúspide. Las enfermedades miocardiales incluyen cardiomiopatía alcohólica, cardiomiopatía congestiva, cardiomiopatía hipertrófica, estenosis subvalcular aórtica, estenosis subvalvular pulmonar, cardiomiopatía restridiva, cardiomiopatía de Chagas, fibroelastosis e é ndocardial, fibrosis endomiocardial, síndrome de Keams, lesión por reperfusión miocardial y miocarditis. Las isquemias miocardiales incluyen enfermedad coronaria tal como angina de pecho, aneurisma coronario, artereoesclerosis coronaria, trombosis coronaria, vasoespasmo coronario, infarto al miocardio y aturdimiento miocardial. Las enfermedades cardiovasculares también incluyen enfermedades vasculares tales como aneurismas, angiodisplasia, angiomatosis, angiomatosis bacilar, enfermedad de Hippel-Lindau, síndrome de Klippel-Trenaunay-Weber, síndrome de Sturge-Weber, edema angioneurótico, enfermedades aórticas, arteritis de Takayasu, aortitis, síndrome de Leriche, enfermedades oclusivas arteriales, arteritis, enarteritis, poliarteritis nodosa, enfermedades, trastornos y/o condiciones cerebrovasculares, angiopatías diabéticas, retinopatía diabética, embolias, trombosis, eritromelalgia, hemorroides, enfermedad veno-oclusiva hepática, hipertensión, hipotensión, isquemia, enfermedades vasculares periféricas, flebitis, enfermedad veno-oclusiva pulmonar, enfermedad de Raynaud, síndrome de CREST, oclusión de vena retinal, síndrome de Scimitar, síndrome de vena cava superior, telangiectasia, atacia-telangiectasia, telangiectasia hemorrágica hereditaria, varicocele, venas varicosas, úlcera varicosa, vasculitis e insuficiencia venosa. Los aneurismas incluyen aneurismas de disección, aneurismas falsos, aneurismas infectados, aneurismas rotos, aneurismas aórticos, aneurismas cerebrales, aneurismas coronarios, aneurismas cardiacos y aneurismas iliacos. Las enfermedades oclusivas arteriales ¡ncluyen arteroesclerosis, claudicación intermitente, estenosis carotidea, displasias fibromusculares, oclusión vascular mesentérica, enfermedad de Moyamoya, obstrucción de arteria renal, oclusión de arteria refinal y tromboangitis obliterans. Las enfermedades, trastornos y/o condiciones cerebrovasculares incluyen enfermedades de arteria carótida, angiopatía amiloide cerebral, aneurisma cerebral, anoxia cerebral, arterioesclerosis cerebral, malformación arteriovenosa cerebral, enfermedades de arteria cerebral, embolia y trombosis cerebrales, trombosis de arteria carótida, trombosis de seno, síndrome de Wallenberg, hemorragia cerebral, hematoma epidural, hematoma subdural, hemonagia subaracnoidea, infarto cerebral, isquemia cerebral (incluyendo transitoria), síndrome de toma de subclavia, leucomalacia periventricular, cefalea vascular, cefalea de agregación, migraña e insuficiencia vertebrobasilar. Las embolias incluyen embolias de aire, embolias de líquido amniótico, embolias de colesterol, síndrome de dedo del pie azul, embolia grasa, embolia pulmonar y tromboembolias. Las trombosis ¡ncluyen trombosis coronaria, trombosis de vena hepática, oclusión de vena retinal, trombosis de arteria carótida, trombosis de senos, síndrome de Wallenberg y tromboflebitis. La isquemia incluye isquemia cerebral, colitis isquémica, síndromes de compartimiento, síndrome de compartimiento anterior, isquemia miocardial, lesiones por reperfusión e isquemia de miembro periférico. La vasculitis incluye aortitis, arteritis, síndrome de Behcet, síndrome de Churg-Strauss, síndrome de nodo linfático monocutáneo, tromboangitis obliterans, vasculitis hipersensitiva, púfura de Schoenlein-Henoch, vasculitis cutánea alérgica y granulomatosis de Wegener. Los polinucleótidos o polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o agonistas o antagonistas de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), son especialmente efectivos para el tratamiento de isquemia de miembro crítica y enfermedad coronaria. Los polipéptidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se administran utilizando cualquier método conocido en ia técnica, incluyendo, pero no limitado a, inyección directa mediante aguja en el sitio de administración, inyección intravenosa, administración tópica, infusión mediante catéter, inyectores biolísticos, aceleradores de partículas, depósitos de esponja en espuma de gel, otros materiales de depósito comercialmente disponibles, bombas osmóticas, formulaciones farmacéuticas sólidas o en forma de supositorio, aplicaciones mediante decantamiento o tópicas durante la cirugía, administración mediante aerosol. Dichos métodos se reconocen en la técnica. Los polipéptidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) pueden administrarse como parte de un compuesto terapéutico, descrito con más detalle a continuación. Los métodos de administración de los polinucleótidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se describen con más detalle a continuación.

Tratamiento de trastornos del metabolismo de los carbohidratos. En modalidades específicas, los polinucleótidos y/o polipéptidos que corresponden a este gen y/o agonistas o antagonistas de los polipéptidos (incluyendo anticuefos) así como fragmentos y variantes de los polinucleótidos, polipéptidos, agonistas y antagonistas, son utilizados para diagnóstico, pronóstico, tratamiento, prevención o alivio de enfermedades y trastornos asociados con metabolismo aberrante de glucosa o metabolismo abenante de toma de glucosa dentro de las células. En una modalidad específica, los polinucleótidos y/o polipéptidos que conesponden a este gen y/o agonistas y/o antagonistas de los mismos pueden ser utilizados para diagnóstico, pronóstico, tratamiento, prevención, y/o alivio de la diabetes mellitus tipo I (diabetes mellitus insulino dependiente, IDDM). En otra modalidad, ios polinucleótidos y/o polipéptidos que corresponden a este gen y/o agonistas y/o antagonistas de los mismos puede ser utilizados para diagnóstico, pronóstico, tratamiento, prevención, y/o alivio de la diabetes mellitus tipo II (diabetes mellitus insuiino dependiente). Además, en otras modalidades, los polinucleótidos y/o polipéptidos que corresponden a este gen y/o antagonistas de los mismos (especialmente anticuerpos neutralizantes o antagonísticos) pueden ser utilizados para diagnósticos, pronóstico, tratamiento, prevención, y/o alivio de condiciones asociadas con diabetes mellitus (tipo I o tipo II), incluyendo, pero limitados a, cetoacidosis diabéticas, coma diabético, coma no cetótico hiperglicémico-hiperosmoiar, accesos, confusión mental, somnolencia, enfermedad cardiovascular (por ejemplo, enfermedad cardiaca, ateroesclerosis, enfermedad microvasculare, hipertensión, accidente cerebrovascular, y otras enfermedades y trastomos como se describe en la sección "Trastornos Cardiovasculares"), dislipidemia, enfermedad renal (por ejemplo, falla renal y nefropatía), daño nervioso, neuropatía, deterioro de la visión (por ejemplo, retinopatía diabética y ceguera), úlceras y deterioro de la cicatrización de herida, infecciones (por ejemplo, enfermedades infecciosas y trastornos como se describen en la sección "Enfermedades Infecciosas", especialmente en el tracto urinario y piel), síndrome de túnel carpal y contractura de Dupuytren. En otras modalidades, los polinucleótidos y/o polipéptidos que corresponden a este gen y/o agonistas o antagonistas de los mismos se administran un animal, preferiblemente un mamífero, y más preferiblemente a un humano con el objeto de regular el peso del animal. En modalidades específicas los polinucleótidos y/o polipéptidos que corresponden a este gen y/o agonistas o antagonistas de los mismos se administran a un animal, preferiblemente un mamífero, y más preferiblemente un humano con el objeto de controlar el peso del animal mediante la modulación de una ruta bioquímica que implica a insulina. Incluso en otras modalidades los polinucleótidos y/o polipéptidos que corresponden a este gen y/o agonistas o antagonistas de los mismos se administran un animal, preferiblemente un mamífero, y más preferiblemente un humano, con el objeto de controlar el peso del animal mediante ia modulación de una vía bioquímica que implica factor de crecimiento semejante a insulina. Actividad anti-angiogénesis. El equilibrio que ocurre de manera natural entre los estimulantes endógenos e inhibidores de angiogénesis es uno en el cual predominan las influencias inhibidoras. Rastinejad et al., Cell 56: 345-355 (1989). En aquellos casos raros en los que ocurre neovascularización bajo condiciones fisiológicas normales, tales como cicatrización de heridas, regeneración de órgano, desarrollo embrionario, y proceso reproductor femenino, la angiogénesis está fuertemente regulada y espacialmente y temporalmente delimitada. Bajo condiciones de angiogénesis patológica tales como aquellas caracterizadas por crecimiento tumoral sólido, estos controles reguladores fallan. La angiogénesis no regulada se vuelve patológica y sustenta la progresión de muchas enfermedades neoplásicas y no neoplásicas. Varias enfermedades graves son dominadas por la neovascularización, anormal incluyendo crecimiento de tumor sólido y metástasis, artritis, algunos tipos de enfermedades oculares, trastornos, y/o condiciones, y soriasis. Véase, por ejemplo, revisiones por Moses et al., Biotech. 9: 630-634 (1991); Folkman et al., N. Engl. J. Med., 333: 1757-1763 (1995); Auerbach et al., J. Microvasc. Res. 29: 401-411 (1985); Folkman, Advances in Cáncer Research, eds. Klein y Weinhouse, Academic Press, New York, pp. 175-203 (1985); Patz, Am. J. Ophtalmol. 94: 715-743 (1982); y Folkman et al., Science 221 : 719-725 (1983). En varias condiciones patológicas, el proceso de angiogénesis contribuye al estado de enfermedad.

Por ejemplo, se han acumulado datos significativos que sugieren que el crecimiento de tumores sólidos es dependiente de la angiogénesis. Folkman y Klagsbrun, Science 235: 442-447 (1987). La presente invención provee tratamiento de enfermedades,-trastornos y/o condiciones asociadas con neovascularización mediante la administración de los polinucleótidos y/o polipéptidos de la invención, así como agonistas o antagonistas de la presente invención. Las condiciones malignas y metastásicas las cuales pueden ser tratadas con los polinucleótidos y polipéptidos, o agonistas o antagonistas de la invención incluyen, pero no se limitan a, malignidades, tumores sólidos, y cánceres descritos en la presente y de otra manera conocidos en la técnica (para una revisión de dichos trastornos, véase Fishman et al., Medicine, 2a Ed., J. B. Lippincott Co., Filadelfia (1985)). Así, ia presente invención provee un método para tratar una enfermedad y/o trastorno relacionado con angiogénesis, que comprende administrar un individuo que lo necesite una cantidad terapéuticamente efediva de un poiinucleótido, polipéptido, antagonistas y/o agonistas de la invención. Por ejemplo, polinucleótidos, polipéptidos, antagonistas y/o agonistas pueden ser utilizados en una variedad de métodos adicionales con el objeto de tratar terapéuticamente o prevenir un cáncer. Los cánceres que pueden ser tratados con polinucleótidos, polipéptidos, antagonistas y/o agonistas incluyen, pero no se limitan a tumores sólidos, incluyendo cáncer de próstata, pulmón, mama, ovario, estómago, páncreas, laringe, esófago, testículos, hígado, parótida, tracto biliar, colon, recto, cérvix, útero, endometrio, riñon, vesícula biliar, tiroideas; tumores primarios y metástasis; melanomas; glioblastoma; sarcoma de Kaposi; leiomiosarcoma; cáncer de pulmón de células no pequeñas; cáncer colorectal; malignidades avanzadas; y tumores de origen sanguíneo tales como leucemias. Por ejemplo, polinucleótidos, polipéptidos, antagonistas y/o agonistas pueden administrarse prácticamente, con el objeto de tratar o prevenir cánceres tales como cáncer de piel, tumores de cabeza y cuello, tumores de mama, y sarcoma de Kaposi. Dentro de incluso otros aspectos, los polinucleótidos, polipéptidos, antagonistas y/o agonistas pueden ser utilizados para tratar, prevenir, y/o diagnosticar formas superficiales de cáncer de vesícula biliar mediante, por ejemplo, administración intravesical. Los polinucleótidos, polipéptidos, antagonistas y/o agonistas pueden administrarse directamente dentro del tumor, o cerca del sitio del tumor, mediante inyección o un catéter. Por supuesto, como un experto en la técnica apreciará, el método apropiado de administración variará de conformidad con el cáncer a ser tratado. Otros modos de administración se discuten en la presente. Los polinucleótidos, polipéptidos, antagonistas y/o agonistas pueden ser útiles para tratar otras enfermedades, trastornos y/o condiciones, además de cánceres, que incluyen angiogénesis. Estas enfermedades, trastornos, y/o condiciones incluyen, pero no se limitan a: tumores benignos, por ejemplo hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, traqueomas, y granulomas pirogénicos; placas ateroscleróticas; enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía de premadurez, degeneración macular, rechazo de injerto corneal, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosls, retinoblastoma, uveltis y pterigia (crecimiento anormal de vasos sanguíneos) del ojo; artritis reumatoide; soriasis; cicatrización retardada de herida; endometriosis; vasculogénesis; granulaciones; cicatrización hipertrófica (queloides); fracturas de no unión; escleroderma; traqueoma; adhesiones vasculares; angiogénesis miocardial; colaterales coronarios; colaterales cerebrales; malformaciones arteriovenosas; angiogénesis de extremidad isquémica; síndrome de Osler-Webber; neovascularización de placa; telangiectasia; uniones hemofiliacas; angiofibroma; displasia fibromuscular; granulación de herida; enfermedad de Crohn; y ateroesclerosis. Por ejemplo, dentro de un aspecto de la presente invención se proveen métodos para tratar cicatrices hipertróficas y queloides, comprendiendo el paso de administrar un polinucleótido, polipéptido, antagonistas y/o agonistas de la Invención a una cicatriz hipertrófica o queloide. Dentro de una modalidad de la presente invención los polinucleótidos, polipéptidos, antagonistas y/o agonistas se inyectan directamente dentro de una cicatriz hipertrófica o queloide, con el objeto de prevenir la progresión de estas lesiones. Esta terapia es de valor particular en el tratamiento profilácticos de condiciones que se sabe que resultan en el desarrollo de cicatrices hipertróficas y queloides (por ejemplo, quemaduras), y preferiblemente se inicia después de la fase proliferativa ha tomado lugar para progresar (aproximadamente 14 días después de la lesión inicial), pero antes del desarrollo de la cicatriz hipertrófica o queloide. Como se evidenció anteriormente, la presente invención también provee métodos para tratar enfermedades vasculares del ojo, incluyendo por ejemplo, neovascularización corneal, glaucoma neovascular, retinopatía diabética proliferativa, fibropiasia retrolental y degeneración macular. Además, las enfermedades oculares, trastornos, y/o condiciones asociadas con la neovascularización las cuales han sido tratadas con los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención (incluyendo agonistas y/o antagonistas) incluyen, pero no se limitan a: glaucoma neovascular, retinopatía diabética, retinoblastoma, fibroplasia retrolental, uveitis, retinopatía de degeneración macular prematura, neovascularización por rechazo corneal, así como otras enfermedades inflamatoria del ojo, tumores oculares y enfermedades asociadas con la neovascularización coroidal o del iris. Véase, por ejemplo, revisiones por Waltman et al., Am. J. Ophthal. 85: 704-710 (1978) y Gartner et al., Surv. Ophthal. 22: 291-312 (1978). Así, dentro de un aspecto de la presente invención se proveen métodos para tratar enfermedades neovasculares del ojo tales como neovascularización corneal (incluyendo neovascularización por injerto corneal), que comprenden el paso de administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto (como se describió anteriormente) a la cornea, que tal manera que la formación de vasos sanguíneos se inhibe.

Brevemente, la córnea es un tejido que normalmente carece de vasos sanguíneos. En ciertas condiciones patológicas sin embargo, los capilares pueden extenderse dentro de la córnea a partir del plexo vascular pericomeal de limbo. Cuando la córnea se vuelve vascularizada, ésta también se vuelve opaca, resultando en una pérdida de la agudeza visual del paciente. La pérdida visual puede volverse completa si la córnea se opacifica completamente. Una amplia variedad de enfermedades, trastornos, y/o condiciones puede resultar en neovascularización corneal, incluyendo por ejemplo, infecciones corneales (por ejemplo, traqueoma, queratitis por herpes simplex, leishmaniasis y oncocerciasis), procesos inmunológicos (por ejemplo, rechazo del injerto y síndrome de Stevens-Johnson), quemaduras alcalinas, trauma, inflamación (por cualquier causa), estados tóxico o de deficiencia nutricional, y como una complicación de uso de lentes de contacto. Dentro de las modalidades particularmente preferidas de la invención, estas pueden prepararse para administración tópica en solución salina (en combinación con cualesquiera de los conservadores y agentes antimicrobianos comúnmente utilizados en preparaciones oculares), y administrarse en forma de gotas oculares. La solución o suspensión puede prepararse en su forma pura y administrarse varias veces al día. Alternativamente, las composiciones anti-angiogénicas, preparadas como se describií anteriormente, también pueden administrarse diredamente a la córnea. Dentro de las modalidades preferidas, la composición antiangiogénica se prepara mediante un polímero muco-adhesivo el cual se une a la córnea. Dentro de modalidades adicionales, los factores anti-angiogénico o composiciones anti-angiogénicas pueden ser utilizadas como un aditamento para terapia esteroidea convencional. La terapia tópica también puede ser útil profilácticamente en las lesiones corneales las cuales se sabe que tienen una elevada probabilidad de inducir una respuesta angiogénica (tales como las quemaduras químicas). En estos casos el tratamiento, probablemente en combinación con esteroides, puede instituirse inmediatamente para ayudar a prevenir las complicaciones subsecuentes. Dentro de otras modalidades, los compuestos descritos anteriormente pueden inyectarse directamente dentro del estroma corneal por un oftalmólogo bajo guia con microscopio. El sitio preferido de infección puede variar con la morfología de la lesión individual, pero el objetivo de la administración podría ser colocar la composición en la parte frontal en avance de la vasculatura (es decir, interpuesta entre los vasos sanguíneos y la córnea normal). En la mayoría de los casos esto podría implicar inyección corneal perilímbica para "proteger" la córnea de los vasos sanguíneos en avance. Este método también puede utilizarse poco después del daño corneal con el objeto de prevenir profilácticamente la neovascularización corneal. En esta situación el material puede ser inyectado en la córnea perilímbica intefuesta entre la lesión corneal y su potencial abastecimiento sanguíneo no deseado. Dichos métodos también pueden utilizarse de manera similar para prevenir la invasión capilar de córneas trasplantadas. En una forma de liberación sostenida las inyecciones solamente pueden requerirse 2-3 veces por año. Un esferoide también puede añadirse a la solución de inyección para reducir la inflamación resultante a partir de la inyección misma. Dentro de otro aspecto de la presente invención, se proveen los métodos para tratar glaucoma neovascular, que comprende el paso de administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un polinucleótido, polipéptido, antagonistas y/o agonista al ojo, de manera que la formación de vasos sanguíneos se inhibe. En una modalidad, el compuesto puede administrarse tópicamente al ojo con el objeto de tratar o prevenir las formaciones tempranas de glaucoma neovascular. Dentro de otras modalidades, el compuesto puede implantarse mediante inyección dentro de la reglón del ángulo de la cámara anterior. Dentro de otras modalidades, el compuesto también puede colocarse en cualquier ubicación de tal manera que compuesto se libere continuamente dentro del humor acuso. Dentro de otro aspecto de la presente invención, se provee métodos para tratar la retinopatía diabética proliferativa, comprendiendo los casos de administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un polinucleótido, polipéptido, antagonistas y/o agonista a los ojos, de manera que la formación de vasos sanguíneos se inhibe. Dentro de modalidades particularmente preferidas de la invención, la retinopatía diabética proliferativa puede tratarse mediante inyección dentro del humor acuso o del humor vitreo, con el objeto de incrementar la concentración local del pollnucleótido, polipéptido, antagonistas y/o agonista en la retina. Preferentemente, este método debe iniciarse antes de la adquisición de la enfermedad severa que requiere fotocoagulación. Dentro de otro aspecto de la presente invención, se proveen métodos para tratar fibroplasia retrolental, que comprende los pasos de administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva que un polinucleótido, polipéptido, antagonista y/o agonista al ojo, de manera que la formación de vasos sanguíneos se inhibe. El compuesto puede administrarse tópicamente, mediante inyección intravítreal y/o mediante implantes intraoculares. Además, las enfermedades, trastornos, y/o condiciones que pueden ser tratados con los polinucleótidos, polipéptidos, antagonistas y/o agonistas incluyen, pero no se limitan a, hemangiomas, artritis, soriasis, angiofibroma, placas ateroscleróticas, cicatrización retardada de heridas, granulaciones, uniones hemofílicas, cicatrizaciones hipertróficas fracturas de no unión, síndrome de Osler-Weber, granuloma pirogénico, escleroderma, traqueoma, y adhesiones vasculares. Además, las enfermedades, trastornos, y/o condiciones y/o estados, los cuales pueden tratarse serán tratados con los polinucleótidos, poiipéptidos, antagonistas y/o agonistas incluyendo, pero no limitados a, tumores sólidos, tumores de origen sanguíneo tales como leucemias, metástasis tumoral, sarcoma de Kaposi, tumores benignos, por ejemplo hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, traqueomas, y granulomas pirogénicos, artritis reumatoide, soriasis, enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía de prematurez, degeneración vascular, rechazo del injerto corneal, glaucoma neovascular, y fibroplasia retrolental, rubeosis, retinoblastoma, y uveitis, cicatrización retrasada de herida, endometriosis, vasculogénesis, granulaciones, cicatrices hipertróficas (queloides), fracturas de no unión, escleroderma, traqueoma, adhesiones vasculares, angiogénesis miocardial, colaterales coronarias, colaterales cerebrales, malformaciones arteriovenosas, angiogénesis de extremidad isquémica, síndrome de Osler-Webber, neovascularización de placa, telangiectasia, uniones hemofiliacas, angiofíbroma, displasia fibromuscuiar, granulación de herida, enfermedad de Crohn, ateroesclerosis, agente de control de nacimiento mediante la prevención de vascularización requerida para el control de la menstruación para la implantación del embrión, enfermedades que tienen angiogénesis como una consecuencia patológica tales como enfermedad de arañazo de gato (Róchele minaiia quintosa), úlceras (Helicobacter pylori), Bartonellosis y angiomatosis bacilar. En un aspecto del método de control de nacimiento, una cantidad el compuesto suficiente para bloquear la implantación dei embrión se administra antes o después de que el intercurso y fertilización han ocurrido, proveyendo así un método efectivo de control del nacimiento, posiblemente un método "de la mañana siguiente". Los polinucleótidos, polipéptidos, antagonistas y/o agonistas también pueden utilizarse en el control de la menstruación o administrarse ya sea como un fluido del lavado peritoneal o para implantación peritoneal en el tratamiento de endometriosis. Los polinucleótidos, polipéptidos, antagonistas y/o agonistas de la presente invención también pueden incorporarse dentro de suturas quirúrgicas con el objeto de prevenir los granulomas en los puntos. Los polinucleótidos, polipéptidos, antagonistas y/o agonistas pueden utilizarse en una amplia variedad de procedimientos quirúrgicos. Por ejemplo, dentro de un aspecto de la presente invención se puede utilizar una composición (en la forma de, por ejemplo, una aspersión o películas) para cubrir o asperjar un área antes de la remoción de un tumor, con el objeto de aislar los tejidos vecinos normales del tejido maligno, y/o para prevenir la expansión de la enfermedad a los tejidos vecinos. Dentro de otros aspectos de la presente invención, las composiciones (por ejemplo, en la forma de una aspersión) pueden administrarse mediante procedimientos endoscópicos con el objeto de cubrir tumores, o inhibir la angiogénesis en una localidad deseada. Dentro de incluso otros aspectos de ia presente invención, las mallas quirúrgicas las cuales han sido cubiertas con composiciones anti-angiogénicas de la presente invención pueden utilizarse en cualquier procedimiento en donde una malla quirúrgica pueda ser utilizada. Por ejemplo, dentro de una modalidad de la invención una malla quirúrgica cargada con una composición anti-angiogénica puede ser utilizada durante la cirugía de resección de cáncer abdominal (por ejemplo, subsecuente a la resección de colon) con el objeto de proveer soporte a la estructura, y para liberar una cantidad del factor anti-angiogénico. Dentro de aspectos adicionales de la presente invención, se proveen métodos para tratar sitios de escisión de tumor, que comprenden administrar un polinucleótido, polipéptido, antagonista y/o agonista a los márgenes de la resección de un tumor subsecuente a la escisión, de manera que ia recunencia local de cáncer y la formación de nuevos vasos sanguíneos en el sitio se inhibe. Dentro de una modalidad de la invención, ei compuesto anti-angiogénico se administra directamente al sitio de escisión del tumor (por ejemplo, aplicado mediante uso de hisopos, cepillado u otro cubrimiento de los márgenes de la resección del tumor con el compuesto anti-angiogénico). Alternativamente, los compuestos anti-angiogénicos pueden ser incorporados dentro de pastas quirúrgicas conocidas antes de su administración. Dentro de modalidades particularmente preferidas de la invención, los compuestos anti-angiogénicos se aplican después de la resección hepática por malignidad, y después de operaciones neuroquirúrgicas. Dentro de un aspecto de la presente invención, los polinucleótidos, polipéptidos, antagonistas y/o agonistas pueden administrarse ai margen de ia resección de una amplia variedad de tumores, incluyendo por ejemplo, tumores de mama, colon, cerebro y hepáticos. Por ejemplo, dentro de una modalidad de la invención, los compuestos anti-angiogénicos pueden ser administrados al sitio de un tumor neurológico subsecuente a la escisión, de manera que la formación de nuevos vasos sanguíneos en el sitio se inhibe.

Los polinucleótidos, polipéptidos, antagonistas y/o agonistas de la presente invención también pueden administrarse junto con otros factores anti-angiogénicos. Los ejemplo representativos de otros factores antiangiogénicos incluyen: Factor Anti-lnvasión, ácido retinoico y derivados del mismo, paclitaxel, Suramina, Inhibidor de Metaloproteinasa-1 de tejido, Inhibidor de Metaloproteinasa-2 de tejido, Inhibidor del Activador del Plasminógeno-1 , Inhibidor del Activador del Plasminógeno-2, y varias formas de metales de transición más ligeros "del grupo d". Los metales de transición más ligeros del "grupo d" incluyen, por ejemplo, especies de vanadio, molibdeno, tungsteno, titanio, niobio, y tantalio. Dichas especies de metales de transición pueden formar complejos de metal de transición. Los complejos adecuados de las especies de metal de transición anteriormente mencionados incluyen complejos de metal de transición oxo. Los ejemplos representativos de los complejos de vanadio incluyen complejos de oxo vanadio tales como complejos de vanadato y vanadilo. Los complejos de vanadato adecuados incluyen metavanadato, metavanadato de sodio, y ortovanadato de sodio. Los complejos vanadilo adecuados incluyen, por ejemplo, acetilacetonato de vanadilo y sulfato de vanadilo incluyendo hidratos de sulfato de vanadilo tales como sulfato de vanadilo mono y trihidratado. Ejemplos representativos de complejos de tungsteno y molibdeno también incluyen complejos oxo. Los complejos de oxo tungsteno adecuados ¡ncluyen complejos de óxido de tungstato y tungsteno. Los complejos adecuados de tungstato ¡ncluyen tungstato de amonio, tungstato de calcio, tungstato de sodio dihidratado, y ácido túngstico. Los óxidos de tungsteno incluyen óxido de tungsteno (IV) y óxido de tungsteno (VI). Los complejos de molibdeno oxo adecuados ¡ncluyen molibdato, óxido de molibdeno, y complejos de molibdenilo. Los complejos de molibdato adecuados incluyen molibdato de amonio y sus hidratos, molibdato de sodio y sus hidratos, y molibdato de potasio y sus hidratos. Los óxidos de moiibdeno adecuados ¡ncluyen óxido de molibdeno (VI), óxido de molibdeno (VI), y ácido molíbdico. Los complejos de molibdenilo adecuados incluyen, por ejemplo, acetilacetonato de molibdenüo. Otros complejos de tungsteno y molibdeno adecuados incluyen derivados hidroxo derivados a partir de, por ejemplo, giicerol, ácido tartárico, y azúcares. Una amplia variedad de otros factores anti-angiogénicos también pueden utilizarse dentro del contexto de la presente invención. Los ejemplos representativos ¡ncluyen factor plaquetario 4; sulfato de protamina; derivados de quitina sulfatada (preparada a partir de caparazón de cangrejo reina), (Murata et al., Cáncer Res. 51: 22-26, 1991); complejos de Peptidoglucano de Poiisacárido Sulfatado (SP-PG) (la función de este compuesto puede potenciarse por la presencia de esteroides tales como estrógeno, y citrato de tamoxifén); Staurosporina; moduladores del metabolismo de la matriz, incluyendo por ejemplo, análogos de prolina, cishidroxiprolina, d,L-3,4-dehidroproiina, Tlaproiina, alfa.alfa-dipiridilo, fumarato de aminopropionitrilo; 4- propil-5-(4-piridinil)-2(3H)-oxazolona; Metotrexato; Mitoxantrona; Heparina; Interferones; 2 Macroglobulina-sérica; ChlMP-3 (Pavloff et al., J. Bio. Chem. 267: 17321-17326, 1992); Quimostatina (Tomkinson et al., Biochem. J. 286: 475-480, 1992); Tetradecasulfato de Clclodextrina; Eponemicina; Camptotecina; Fumagilina (Ingber et al., Nature 348: 555-557, 1990); Tiomalato de Sodio Oro ("GST"; Matsubara y Ziff, J. Clin. Invest. 79: 1440- 1446, 1987); suero anticolagenasa; antiplasmina-alfa2 (Holmes et al., J. Biol.

Chem. 262 (4): 1659-1664, 1987); Bisantreno (Instituto Nacional de Cáncer); Lobenzarit disódico (ácido N-(2)-carboxifenil-4-cloroantroníIico disódico o "CCA"; Takeuchi et al., Agents Action 36: 312-316, 1992); Talidomida; esteroide Angostático; AGM-1470; carboxinaminolmidazol; e inhibidores de metaloproteinasa tales como BB94. Actividad de unión. Los polipéptidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) pueden ser utilizados para seleccionar varias moléculas que se unen al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). La unión del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) y la molécula puede activar (agonista), incrementar, inhibir (antagonista), o disminuir la actividad del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o de la molécula de unión.

Ejemplos de dichas moléculas ¡ncluyen anticuefos, oligonucleótidos, proteínas (por ejemplo, receptores), o moléculas pequeñas. Preferiblemente, la molécula se relaciona cercanamente con el ligando natural del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), por ejemplo, un fragmento del ligando, o un sustrato natural, un ligando, un mimético estructural o funcional. (Véase, Coligan et al., Cunent Protocols in Immunology 1 (2): Capítulo 5 (1991).) de manera similar, la molécula puede estar cercanamente relacionada con el receptor natural al cual se une el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o al menos, un fragmento del receptor capaz de ser unido por el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (por ejemplo, sitio activo). En cada caso, la molécula puede diseñarse racionalmente utilizando técnicas conocidas. Preferiblemente, la selección de estas moléculas implica la producción apropiada de células las cuales expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), ya sea como una proteína secretada o en la membrana celular. Las células preferidas incluyen células a partir de mamíferos, levaduras, Drosophila, o E. coli. Las células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (o membrana celular que contiene el polipéptido expresado) se ponen en contacto preferiblemente con un compuesto prueba que potencialmente contiene la molécula para observar la unión, estimulación, o inhibición de la actividad ya sea del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o la molécula. La prueba puede simplemente evaluar la unión de un compuesto candidato a receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), mientras que la unión se detecta por una marca, o en una prueba que implica competencia con un competidor marcado. Además, la prueba puede evaluar si el compuesto candidato resulta en una señal generada por la unión a un receptor de quimiocina de proteína G.

Alternativamente, la prueba se puede llevar a cabo utilizando preparaciones libres de células, polipéptido/molécula fijada a un soporte sólido, genotecas químicas, o mezclas de productos naturales. La prueba también puede comprender simplemente los pasos de mezclar un compuesto candidato con una solución que contiene receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), midiendo la actividad o unión del receptor de quimiocina de proteína G/moIécula, y comparando la actividad o unión a un estándar del receptor de quimiocina de proteína G/molécuia. Preferiblemente, una prueba de ELISA puede medir el nivel o actividad del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) en una muestra (por ejemplo, muestra biológica) utilizando un anticuerpo monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede medir el nivel o actividad del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) ya sea mediante la unión, directamente o indirectamente, al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o mediante la competencia con el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) por un sustrato. Además, los ligandos a los cuales el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se une pueden identificarse mediante numerosos métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, selección no especifica del ligando y selección por FACS (Coligan et al., Current Protocols ¡n Immun., 1(2), Capítulo 5, (1991)). Por ejemplo, la clonación de expresión se emplea en donde el ARN poliadenilado se prepara a partir de una célula que responde los polipéptidos, por ejemplo, células NIH3T3 las cuales se sabe que contienen múltiples receptores para la familia de proteínas FGF, y células SC-3, y una genoteca de ADNc creada a partir de este ARN que se divide en grupos y se utiliza para transfectar células COS u otras células que no responden a los polipéptidos. Las células transfectadas que se crecen sobre cubreobjetos de vidrio se exponen al polipéptido de la presente invención, después de que éstos han sido marcados. Los polipéptidos pueden marcarse mediante una variedad de modos incluyendo iodinación o inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína cinasa sitio específica. Después de la fijación e incubación, los portaobjetos se someten a análisis autorradiográfico. Los grupos positivos se identifican y los subgrupos se preparan y se re-transfectan utilizando un subgrupo iterativo y un procedimiento de re-selección, que eventualmente produce clones particulares que codifican al receptor putativo. Como un método alternativo para la identificación del receptor, los polipéptidos marcados pueden ser enlazados mediante fotoafinidad con preparaciones de membrana celular o de extracto que expresan la molécula receptora. El material entrecruzado se resuelve mediante análisis en PAGE y se expone a película de rayos X. El complejo marcado que contiene lo receptores de ios polipéptidos puede escindirse, resolverse en fragmentos peptídicos, y someterse a microsecuenciación de proteína. La secuencia de aminoácidos obtenida mediante microsecuenciación podría ser utilizada para diseñar una serie de sondas oligonucleótidas degeneradas para seleccionar una genoteca de ADNc para identificar los genes que codifican a los receptores putativos. Además, las técnicas de entremezclado de gen, entremezclado de motivo, entremezclado de exón, y/o entremezclado de codón (colectivamente referidas como "entremezclado de ADN") pueden ser empleadas para modular las actividades del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) por lo tanto generando efectivamente agonistas y antagonistas del receptor de quimiocina de proteína G. Véase generalmente, patentes de E.U.A. Nos. 5,605,793, 5,811 ,238, 5,830,721 , 5 834,252, y 5,837,458, y Patten, P. A., et al., Curr. Opinión Biotechnology. 8: 724-33 (1997); Harayama, S. Trends Biotechnol. 16 (2): 76-82 (1998); Hansson, L. O., et al., J. Mol. Biol. 287-265-76 (1999); y Lorenzo, M. M. y Blasco, R. Biotechniques 24 (2): 308-13 (1998) (cada una de estas patentes y publicaciones se incorporan en la presente invención como referencias). En una modalidad, la alteración de los polinucleótidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) y polipéptidos correspondientes puede lograrse mediante entremezclado de ADN. El entremezclado de ADN implica el ensamblaje de dos o más segmentos de ADN dentro de una molécula deseada del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) mediante recombinación homologa, o sitio especifica. En otra modalidad, los polinucleótidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) y polipéptidos correspondientes pueden alterarse al ser sometidos a mutagénesis ai azar mediante PCR propenso a error, inserción de nucleótidos al azar u otros métodos antes de la recombinación. En otra modalidad, uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etcétera, del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) pueden ser recombinadas con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etcétera de una o más moléculas heterólogas. En modalidades preferidas, las moléculas heterólogas son miembros de la familia del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). En modalidades adicionales preferidas, la molécula heteróloga es un factor de crecimiento tal como, por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento semejante a insulina (IGF-I).T factor de crecimiento transformantes (TGF)-alfa, factor de crecimiento epidémico (EGF), factor de crecimiento fibroblástico (FGF), TGF-beta, proteína morfogenética de hueso (BMP)-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, activinas A y B, decapentaplégico (dpp), 60A, OP-2, dorsalina, factor de crecimiento para diferenciación (GDF), nodal, MIS, inhibina-alfa, TGF-beta1 , TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta5, y factor neurotrófico derivado de glia (GDNF). Otros fragmentos preferidos son fragmentos biológicamente activos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Los fragmentos bioiógicamente activos son aquellos que exhiben actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad del polipéptido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). La actividad biológica de los fragmentos puede incluir una actividad deseada mejorada, o una actividad no deseable disminuida.

Además, esta invención provee un método para seleccionar compuestos para identificar aquellos que modulan la acción del polipéptido de ia presente invención. Un ejemplo de dicha prueba comprende la combinación de células de fibroblasto de mamífero, el polipéptido de la presente invención, el compuesto a ser seleccionado y 3[H] timidina bajo condiciones de cultivo celular en donde las células de fibroblasto podrían proliferar normalmente. Una prueba control puede llevarse a cabo en la ausencia del compuesto a ser seleccionado y compararse con la cantidad de proliferación del fibroblasto en la presencia del compuesto para determinar si el compuesto estimula la proliferación mediante la determinación de la toma de 3[H] timidina en cada caso. La cantidad de proliferación de célula de fibroblasto se mide mediante cromatografía de centelleo en líquido la cual mide la incoforación de 3[H] timidina. Tanto los compuestos agonistas como antagonistas pueden identificarse mediante este procedimiento. En otro método, una preparación de célula de mamífero o de membrana que expresan un receptor para un polipéptido de la presente invención se incuba con un polipéptido marcado de la presente Invención en la presencia del compuesto. La capacidad del compuesto para mejorar o bloquear esta interacción puede entonces medirse. Alternativamente, la respuesta de un sistema conocido de segundo mensajero después de la interacción con el compuesto a ser seleccionado y el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se mide y la capacidad del compuesto para unirse al receptor y producir una respuesta de segundo mensajero se mide para determinar si el compuesto es un agonista o antagonista potencial. Dichos sistemas de segundos mensajeros incluyen pero no se limitan a, AMPc guanilato ciclasa, canales iónicos o hidrólisis de fosfoinositidos. Todas las pruebas anteriormente mencionadas pueden ser utilizadas como marcadores de diagnóstico o pronóstico. Las moléculas descubiertas utilizando estas pruebas pueden ser utilizados para tratar, prevenir, y/o diagnosticar enfermedad o para traer un resultado particular en un paciente (por ejemplo, crecimiento de vasos sanguíneos) mediante la activación o inhibición del polipéptido/molécula. Además, las pruebas pueden descubrir agentes que pueden inhibir o mejorar la producción de los polipéptidos en la invención a partir de células o tejidos adecuadamente manipulados. Por lo tanto, la invención incluye un método para identificar compuestos los cuales pueden unirse al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) comprendiendo los pasos de: (a) incubar un compuesto candidato de unión con receptor de quimiocina de proteína G; y (b) determinar si ia unión ha ocunido. Además, la invención incluye un método para identificar agonistas/antagonistas comprendiendo los pasos de: (a) incubar un compuesto candidato con receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), (b) probar una actividad biológica, y (c) determinar si una actividad biológica del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) ha sido alterada. También, uno podría identificar moléculas que se unen al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) experimentalmente al utilizar las regiones de lámina beta plegada descritas en la figura 3 y cuadro 1. Por consiguiente, las modalidades específicas de la invención se dirigen a polinucleótidos que codifican polipéptidos los cuales comprenden, o consisten alternativamente de la secuencia de aminoácidos de cada región de lámina beta plegada descrita en la figura 3/cuadro 1. Las modalidades adicionales de la invención se dirigen a poiinucleótidos que codifican polipéptido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) los cuales comprenden, o consisten alternativamente de, cualquier combinación o todas las regiones de lámina beta plegada descritas en la figura 3/cuadro 1. Las modalidades adicionales preferidas de la invención se dirigen a polipéptidos que comprenden, o alternativamente consisten de, secuencias de aminoácidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de cada una de las regiones de lámina beta plegada descritas en la figura 3/cuadro 1. Las modalidades adicionales de la invención se dirigen a polipéptidos de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que comprenden, o alternativamente consisten de, cualquier combinación o todas las regiones de lámina beta plegada descritas en la figura 3/cuadro 1.

Administración dirigida En otra modalidad, la invención provee un método para administrar composiciones a células dirigidas que expresan un receptor para un poiipéptido de la invención, o células que expresan una forma para unión celular de un polipéptido de la invención.

Como se discute en la presente, los polipéptidos o anticuerpos de la invención pueden asociarse con polipéptidos heterólogos, ácidos nucleicos heterólogos, toxinas, o profármacos mediante interacciones hidrófobas, hidrófilas, iónicas y/o covalentes. En una modalidad, la invención provee un método para la administración específica de composiciones de la invención a células mediante ia administración de polipéptidos de la invención (incluyendo anticuerpos) que están asociados con polipéptidos o ácidos nucleicos heterólogos. En un ejemplo, la invención provee un método para administrar una proteína terapéutica dentro de la célula dirigida. En otro ejemplo, la invención provee un método para administrar ácido nucleico de una sola cadena (por ejemplo, antisentido o ribozimas) o ácido nucleico de doble cadena (por ejemplo, ADN que puede integrarse dentro de genoma de la célula a replicarse de manera espisómica y que puede ser transcrito) dentro de la célula dirigida. En otra modalidad, la invención provee un método para la destrucción específica de células (por ejemplo, la destrucción de células tumorales) mediante la administración de polipéptidos de la invención (por ejemplo, polipéptidos de la invención o anticuefos de la invención) en asociación con toxinas o profármacos citotóxicos. Por "toxinas" se entiende compuestos que se unen y que activan sistemas efectores citotóxicos endógenos, radioisótopos, holotoxinas, toxinas modificadas, subunidades catalíticas de toxinas, o cualesquiera moléculas por enzimas que no está normalmente presentes en o sobre la superficie de una célula que bajo las condiciones definidas ocasiona la muerte celular. Las toxinas que pueden ser utilizadas de conformidad con ios métodos de la invención, incluyen pero no se limitan a, radioisótopos conocidos en la técnica, compuestos tales como, por ejemplo, anticuerpos (o porciones que contienen complementos fijos de los mismos) y que se unen a sistemas efectores citotóxicos endógenos inherentes o inducidos, timidina cinasa, endonucleasa, ARNasa, toxinas alfa, ricina, abrina, exotoxina A de Pseudomonas, toxina de difteria, saporina, momordina, gelonina, proteína antiviral de hierba carmín, sarcína-alfa y toxina de cólera. Por "profármaco citotóxico" se entiende un compuesto no tóxico que se convierte por una enzima, normalmente presente en la célula, hacia un compuesto citotóxico. Los profármacos citotóxicos que pueden ser utilizados de conformidad con los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, derivados glutamilo de agente alquilante de ácido benzoico mostaza, derivados fosfato de etopósido o mitomicina C, arabinósido citosina, daunorubisina, y derivados fenoxiacetamida de doxorubicina.

Selección de fármaco Además contemplado está el uso de los polipéptidos de ia presente invención, o los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos, para seleccionar moléculas que modifiquen las actividades de ios pollpéptidos de ia presente invención. Dicho método podría incluir poner en contacto del polipéptido de ia presente invención con un compuesto(s) seleccionado que se sospecha que tiene actividad antagonista o agonista, y probar la actividad de estos polipéptidos después de la unión. Esta invención es particularmente útil para seleccionar compuestos terapéuticos mediante el uso de polipéptidos de la presente invención, con fragmentos de unión de los mismos, en cualrdquiera de una variedad de técnicas de selección de fármaco. El polipéptido o fragmentos empleados en dicha prueba pueden fijarse a un soporte sólido, expresarse sobre una superficie, en forma libre en solución, o intraceluiarmente localizado. Un método de selección de fármaco utiliza células hospederas eucariontes o procariontes las cuales están transformadas establemente con ácidos nucleicos recombinante que expresan el polipéptido o fragmento. Los fármacos se seleccionan en contra de dicha células transformadas en pruebas de unión competitiva. Uno puede medir, por ejemplo, la formulación de complejos entre el agente a ser evaluado y un polipéptido de la presente invención. Así, la presente invención provee métodos para seleccionar fármacos o cualesquiera otros agentes que afectan las actividades mediadas por los polipéptidos de la presente invención. Estos métodos comprenden poner en contacto a dicho agente con un polipéptido de la presente invención o un fragmento del mismo y probar mediante métodos bien conocidos en la técnica para la presencia de un complejo entre el agente y el polipéptido o un fragmento del mismo. En dichas pruebas de unión competitiva, los agentes para selección se marcan típicamente. Después de la incubación, el agente libre se separa a partir de la que está presente en forma unida, y la cantidad de marca libre o no formando complejos es una medida de la capacidad de un agente particular para unirse a los polipéptidos de ia presente invención. Otra técnica para selección de fármaco provee una selección de alta resolución para compuestos que tienen afinidad de unión adecuada a los polipéptidos de la presente invención, y se describe con mayor detalle en la Solicitud de Patente Europea 84/03564, publicada el 13 de septiembre de 1984, la cual se incorpora en la presente como referencia. Brevemente expresado, grandes cantidades de diferentes compuestos prueba de péptido pequeño se sintetizan sobre un sustrato sólido, tal como extensiones plásticas o alguna otra superficie. Los compuestos prueba peptídicos se hacen reaccionar con polipéptidos de la presente invención y se lavan. Los polipéptidos unidos se detectan entonces mediante métodos bien conocidos en la técnica. Los polipéptidos purificados se cubren directamente sobre placas para uso en las técnicas de selección de fármaco anteriormente mencionadas. Además, los anticuerpos no neutralizantes pueden ser utilizados para capturar al péptido e inmovilizarlo sobre el soporte sólido. Esta invención también contempla el uso de pruebas de selección competitiva de fármaco en el que los anticuefos neutralizantes capaces de unirse a polipéptidos de la presente invención compiten específicamente con un compuesto prueba para la unión de los polipéptidos o fragmentos de ios mismos. De esta manera, los anticuerpos se utilizan para detectar la presencia de cualquier péptido que comparte uno o más epítopes antigénicos con un polipéptido de ia invención. Por lo tanto, los polipéptidos pueden ser utilizados para identificar compuestos que modulan la actividad del receptor. Tanto el receptor proteico como las variantes y fragmentos apropiados pueden ser utilizadas en selecciones de alta resolución para probar compuestos candidatos por su capacidad para unirse al receptor. Estos compuestos pueden seleccionarse adicionalmente en contra de un receptor funcional para determinar el efecto del compuesto sobre la actividad del receptor. Los compuestos pueden identificarse los cuales activan (agonista) o inactivan (antagonista) el receptor a un grado deseado. Los términos "agonista" y "antagonista" representa compuestos que incrementan o disminuyen una respuesta. Como una forma de un agonista, el compuesto se une al mismo sitio que el compuesto endógeno y produce el mismo tipo de señal, usualmente de igual con mayor magnitud que el agente endógeno. Otra forma de agonista se une a un sitio diferente al del primer agonista, no produciendo señal por sí mismo, sin embargo, una señal mejorada se genera cuando el agente endógeno también se une a su sitio. Esta se denomina una acción aiostérica. Una forma de antagonista se une al sitio utilizado por el agente endógeno y disminuye o bloquea la señal generada por el agente endógeno. Otra forma de antagonista se une a un sitio alostérico, similar a la segunda forma de agonista, pero produce una señal disminuida generada por el agente endógeno. Una tercera forma de antagonista se disuelve en la membrana o atraviesa la membrana e intercepta ia señal generada por el agente endógeno dentro de la membrana o en el lado intracelular. Un antagonista, por consiguiente, abarca agonistas negativos o "agonistas inversos", que tienen una actividad intrínseca negativa que reduce la actividad de la señal del receptor relativa a la actividad de señalización medida en la ausencia de agonista inverso. Dicho antagonista se distingue de un antagonista que no tiene actividad intrínseca en que no tiene efecto sobre la actividad basal del receptor. Por lo tanto, por ejemplo, un agonista inverso podría alterar la conformación del receptor, por lo tanto produciendo que se elimine la interacción con un ligando. Véase, Milligan et al., TIPS 16: 10 (1995). Los polipéptidos receptores puede ser utilizados para seleccionar un compuesto por su capacidad para estimular un inhibir la interacción entre la receptor proteico y una molécula blanco que interacciona normalmente con la receptor proteico. El blanco puede ser un ligando un componente de ia vía de señalización con la cual la receptor proteico interactúa normalmente (por ejemplo, una proteína G u otro interaccionador implicado en recambio por AMPc o fosfatidilinositol y/o adenilato ciclasa, o activación de fosfolipasa C). La prueba inciuye los pasos de combinar la receptor proteico con un compuesto candidato bajo condiciones que permitan que la receptor proteico o fragmento interadúe con la molécula blanco, para detectar la formación de un complejo entre la proteína y el blanco o para detectar la consecuencia bioquímica de la interacción con la receptor proteico y el blanco, de manera que cualesquiera de los efectos asociados de la transducción de la señal, tal como flujo de ion, fosforilación de proteína G, recambio por AMPc o fosfatidilinositol, y adenilato ciclasa o activación de fosforilasa C. Los polipéptidos receptores son útiles en las pruebas basadas en célula cuando éstos se sobreexpresan en una célula. Por consiguiente, dichas células que sobreexpresan el receptor son útiles para identificar compuestos que son capaces de modular o compensar la sobreexpresión. Las células que sobreexpresan al receptor pueden derivarse a partir de fuentes naturales o pueden ser creadas mediante método recombinante de rutina. Los polipéptidos receptores también son útiles para selección de compuestos en una prueba basada en célula cuando se activan constitutivamente en una célula. Dichas células que expresan receptores constitutivamente activados son útiles para seleccionar compuestos que modulan la activación del receptor. Dichas células pueden derivarse a partir de fuentes naturales o pueden crearse mediante modos recombinantes que se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, véase Sheer et al., J. Receptor Signal Transduction Res. 17: 57-73 (1997); Patente de E.U.A. No. 5, 750, 353. Los compuestos candidatos incluyen, por ejemplo, (1) péptidos tales como péptidos solubles, incluyendo péptidos de fusión con Ig en un extremo y miembros de genotecas peptídica al azar (véase, por ejemplo, Lam et al., Nature 354: 82-84 (1991); Houghten et al., Nature 354: 84-86 (1991 )) y genotecas moleculares derivadas a partir de química combinatorial elaboradas de aminoácidos con configuración D y/o L; (2) fosfopéptidos (por ejemplo, miembros de genotecas de fosfopéptidos dirigidos al azar y parcialmente degenerados, véase, por ejemplo, Songyang et al., Cell 72: 767-778 (1983)); (3) anticuefos (por ejemplo, policlonal, monoclonal, humanizado, anti-idiotípico, quimérico, intracuerpos, y anticuerpos de una cadena, así como Fab, F(ab)2, fragmentos de genoteca de expresión de Fab, fragmentos de unión a epítope de anticuefos); y (4) moléculas orgánicas pequeñas e inorgánicas (por ejemplo, moléculas obtenidas a partir de genotecas de productos combinatoriales y naturales). Un compuesto candidato es un receptor soluble de longitud total o fragmento que compite por la unión a ligando. Otros compuestos candidatos incluyen receptores mutantes de fragmentos apropiados que contienen mutaciones que afectan la función del receptor y por lo tanto compiten por el ligando. Por consiguiente, un fragmento que compite por el ligando, por ejemplo con una afinidad superior, o un fragmento que se une al ligando pero que no permite la liberación, se abarcan por la invención. La invención provee otros puntos finales para identificar compuestos que modulan (estimulan o inhiben) la adividad de receptor. Las pruebas típicamente implican una prueba de eventos en la vía de transducción de ia señal que indica actividad del receptor. Así, la expresión de genes que están sobrerreguiados o sub-regulados en respuesta a la cascada de señalización dependiente del receptor proteico pueden probarse. En una modalidad, la región reguladora de dichos genes puede estar operativamente unida a un marcador fácilmente detectable, tal como una luciferasa.

Alternativamente, la fosforilación del receptor proteico, o una receptor proteico blanco, también puede ser medida. También se entiende que un trastorno ocasionado por niveles abenantes o mutaciones en la proteína puede ser utilizada como una base para un punto final. Por consiguiente, las desviaciones específicas en el desarrollo o curso del trastorno en respuesta a un compuesto que actúa sobre el receptor pueden servir como un punto terminal. Cualesquiera de las funciones biológicas o bioquímicas mediadas por el receptor pueden ser utilizadas como una prueba de punto final. Estos incluyen todos los eventos bioquímicos y/o bioquímicos/biológicos descritos en la presente, en las referencias citadas en la presente Invención, incorporadas como referencia de estos blancos para prueba de punto final, y otras funciones conocidas por los expertos en la técnica. Los compuestos de unión y/o activación también pueden seleccionarse mediante el uso de receptor proteicos quiméricas en las que el dominio extracelular amino terminal, o partes del mismo, el dominio transmembranal total o subregiones, tales como cualesquiera de los siete segmentos transmembranales o cualesquiera de los bucles intracelular o extracelular, y dominio intracelular carboxilo terminal, o partes del mismo, pueden reemplazarse por dominios heterólogos o subregiones. Por ejemplo, una reducción de unión a proteína G puede ser utilizada la cual interactúa con una proteína G diferente que la que se reconoce por el receptor nativo. Por consiguiente, un componente diferente establecido para transducción de la señal esta disponible como una prueba de punto terminal para activación. Alternativamente, la porción transmembranal total o subregiones (tales como segmentos transmembranales o bucles intracelular o extracelular) pueden ser reemplazados con la porción transmembranal total o subreglones específicas a una célula hospedera diferente a partir de la célula hospedera a partir de la cual se derivan el dominio extracelular amlno terminal y/o la región de unión de la proteína G. Esto permite que las pruebas se lleven a cabo en otra célula que la célula hospedera específica a partir de la cual se deriva el receptor. Alternativamente, ei dominio extracelular amino terminal (y/o otras regiones de unión a ligando) pueden reemplazarse por un dominio (y/o otra región de unión) de unión a un ligando diferente, proveyendo así, una prueba para compuestos prueba que interactúan con el dominio extracelular amino terminal heterólogo (o región) pero aún así ocasionando transducción de la señal. Finalmente, la activación puede detectarse por un gen reportero que contiene una región codificante fácilmente detectable operativamente unida a una secuencia reguladora transcripcional que es parte de la vía nativa de transducción de la señal. Los polipéptidos del receptor también son útiles en pruebas de unión competitiva en métodos diseñados para descubrir compuestos que interactúan con el receptor. Así, un compuesto se expone a receptor polipeptídico bajo condiciones que permiten que el compuesto interactúe con el polipéptido de una manera o de otra. Dichos polipéptidos del receptor también se añaden a la mezcla. Si el compuesto prueba interactúa con el receptor polipeptídico soluble, se disminuye la cantidad de complejo formado o la adividad a partir del receptor blanco. Este tipo de prueba es particularmente útil en casos en los que se buscan compuestos que interactúan con regiones específicas de receptor. Así, el polipéptido soluble que compite con la región del receptor blanco se diseña para que contenga secuencias peptídicas que conesponden a la región blanco. Para llevar a cabo pruebas de selección del fármaco libre de célula, es deseable inmovilizar ya sea el receptor proteico, o fragmento, o su molécula blanco para facilitar la separación de los complejos a partir de las formas que no formado complejos de una o de ambas proteínas, así como la adaptación a la automatización de la prueba. Las técnicas para inmovilizar proteínas G sobre matrices pueden ser utilizadas en las pruebas de selección del fármaco. En una modalidad, una proteína de difusión puede perderse la cual añada un dominio que permite que las proteínas se unan a una matriz. Por ejemplo, las proteínas de fusión glutationa-S-transferasa/receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) pueden ser adsorbidas sobre glóbulos de glutationa-sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitulación derivadas de glutationa, las cuales se combinan luego con los lisados celulares (por ejemplo, marcadas con 35S) y el compuesto candidato, y la mezcla se incuba bajo condiciones conductivas para llevar a cabo formación del complejo (por ejemplo, a condiciones fisiológicas para sal y pH). Después de la incubación, los glóbulos se lavan para remover cualquier marca no unida, y la matriz inmovilizada y la radiomarca se determina directamente, o en el sobrenadante después de que los complejos se disocian. Alternativamente, los complejos pueden disociarse a partir de la matriz, separarse mediante SDS-PAGE, y el nivel de receptor de unión a proteína G se encuentra en la fracción globular cuantificada a partir de la utilización de técnicas electroforéticas estándares. Por ejemplo, ya sea el polipéptido o su molécula blanco puede ser inmovilizada utilizando conjugación de biotinila y estreptavidina utilizando técnicas bien conocidas en la técnica. Alternativamente, los anticuerpos reactivos con la proteína pero que interfieren con la unión de la proteína a su molécula blanco pueden derivarse a los pozos de la placa, y la proteína se atrapa en los pozos mediante conjugación con el anticuerpo. Las preparaciones de un Receptor de unión a proteína G y un compuesto candidato se incuban en los pozos presentadores del receptor proteico y la cantidad de complejo atrapado en el pozo puede ser cuantificado. Los métodos para detectar dichos complejos, además de aquellos descritos anteriormente para los complejos inmovilizados mediante GST, incluyen ¡nmunodetección de complejos utilizando anticuerpos reactivos con la molécula blanco del receptor proteico, o los cuales son reactivos con receptor proteico y compiten con la molécula blanco; así como pruebas asociados a enzima los cuales recaen en la detección de una actividad enzimática asociada con la molécula blanco. Los moduladores de la actividad del receptor proteico identificado de conformidad con estas pruebas de selección del fármaco pueden ser utilizados para tratar un sujeto con un trastorno mediado por la vía del receptor, mediante el tratamiento de las células que expresan el receptor proteico. Estos métodos de tratamiento incluyen los pasos de administrar los moduladores de actividad proteica en la composición farmacéutica como se describe en la presente, a un sujeto que necesite de dicho tratamiento.

Antisentido y ribozima (antagonistas) En modalidades específicas, los antagonistas de conformidad con la presente invención son ácidos nucleicos que corresponden a las secuencias contenidas en SEQ ID NO: 1, o las cadenas complementarias de las mismas, y/o las secuencias peptídicas contenidas en la clona depositada como 97183. En una modalidad, la secuencia antisentido se genera internamente, por el organismo, en otra modalidad, la secuencia antisentido se administra separadamente (véase, por ejemplo, O'Connor, J., Neurochem. 56: 560 (1991). Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press Boca Ratón, FL (1988). La tecnología antisentido puede ser utilizada para controlar la expresión génica a través de ADN o ARN antisentido, o a través de formación de triple hélice. Las técnicas antisentido se discuten por ejemplo, en Okano, J., Neurochem. 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press Boca Ratón, FL (1988). La formación de triple hélice se discute en, por ejemplo, Lee et al., Nucleic Acids Research 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science 241 : 456 (1988); y Dervan et al., Science 251 : 1300 (1991). Los métodos se basan en la unión de un polinucleótido a un ADN o ARN complementario. Por ejemplo, el uso de construcciones de ARN antisentido c-myc o c-myb para inhibir el crecimiento de la línea celular de leucemia no linfocítica HL-60 y otras líneas celulares se describió previamente. (Wickstrom et al. (1988); Anfossi et al. (1989)). Estos experimentos se llevaron a cabo in vitro mediante la incubación de células con el ollgoribonucleótido. Un procedimiento similar para uso in vivo se describió en WO 91/15580. Brevemente, un par de oligonucleótidos para un ARN antisentido dado se producen como se describe continuación: una secuencia complementaria a las primeras 15 bases del marco abierto de lectura está flanqueada por un sitio EcoR1 en el extremo 5 y un sitio Hind lll en el extremo 3. A continuación, el par de oligonucleótidos se calientan a 90°C por un minuto y luego se fijan en regulador pH para ligación 2X (TRIS 20 mM HCl pH 7.5, MgCl2 10 mM, ditiotreitol 10 mM (DTT) y ATP 0.2 mM) y luego se ligan al sitio EcoR1/Hind lll del vector retroviral PMV7 (WO 91/15580). Por ejemplo, la porción codificante hacia 5' de un polinucleótido que codifica el polipéptido maduro de la presente invención puede ser utilizada para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares de bases en longitud. Un oligonucleótido de ADN se diseña para que sea complementario a una región del gen implicada en la transcripción del mismo previniendo la transcripción y la producción del receptor. El oligonucleótido de ARN antisentido híbrida con el ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm ha a el receptor polipeptídico. En una modalidad, el ácido nucleico antisentido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención se produce intracelularmente mediante la transcripción a partir de una secuencia exógena. Por ejemplo, un vector o una porción del mismo, se transcribe, produciendo un ácido nucleico antisentido (ARN) de la invención. Dicho vector podría contener una secuencia que codifica el ácido nucleico antisentido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Dicho vector puede permanecer episomal o volverse cromosomalmente integrado, siempre y cuando pueda ser transcrito para producir el ARN antisentido deseado. Dichos vectores pueden construirse mediante métodos estándares de tecnología de ADN recombinante conocidos en la técnica. Los vectores pueden ser plasmídicos, virales, u otros conocidos en la técnica, utilizados para replicación y expresión en células dei vertebrado. La expresión de las secuencias que codifican al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), o fragmentos del mismo, pueden actuar en vertebrados, preferiblemente en células humanas, mediante cualquier promotor conocido en la técnica. Dichos promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Dichos promotores incluyen, pero no se limitan a, la región de promotor temprano SV40 (Bemoist y Chambón, Nature 29: 304-310 (1981), el promotor contenido en el repetido largo terminal hacia 3' de virus de sarcoma de Rous (Yamamoto et al., Cell 22:787-797 (1980), el promotor de timidina de herpes (Wagner et al., Proc.

Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441-1445 (1981), la secuencias reguladoras del gen de metalotioneina (Brinster, et al., Nature 296: 39-42 (1982)), etcétera. Los ácidos nucleicos antisentido de la invención comprenden una secuencia complementaria de al menos una porción de un transcrito de ARN de un gen del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Sin embargo, la complementariedad absoluta, aunque se prefiere, no se requiere. Una secuencia "complementaria a al menos una porción de un ARN," referida en la presente, significa una secuencia que tiene complementariedad suficiente como para ser capaz de hibridar con el ARN, formando un dúplex estable; en el caso de los ácidos nucleicos antisentido de doble cadena del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), una cadena sencilla de ADN dúplex puede evaluarse así, o se puede probar la formación de triplex. La capacidad para hibridar dependerá tanto de grado de complementariedad como de la longitud de ácido nucleico antisentido. Generalmente, a mayor ácido nucleico de hibridación, mayores desigualdades de bases con un ARN del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que puede contener pero aún así formar un dúplex estable (o triplex como sea el caso). Un experto en la técnica puede averiguar un grado tolerable de desigualdad mediante el uso de procedimientos estándares para determinar ei punto de fusión del complejo hibridado. Los oligonucleótidos que son complementarios con el extremo 5' del mensajero, por ejemplo, la secuencia no traducida hacia 5' y que incluyen el codón de inicio AUG, deberían trabajar más eficientemente en la inhibición de la traducción. Sin embargo, las secuencias complementarias a las secuencias no traducidas hacia 3' del ARNm también se han mostrado menos efectivas para inhibir ia traducción de ARNm. Véase generalmente, Wagner et al., 1994, Nature 372: 333-335. Así, la complementariedad de oligonucleótidos a ya sea las regiones no traducidas, no codificantes hacia 5' ó 3', del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) mostradas en la figura 1A-B o dentro de la región codificante de la clona depositada podría ser utilizada en un método de antisentido para inhibir la traducción de ARNm endógeno del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Los oiigonucleótidos complementarios a la región no traducida hacia 5' de ARNm deberían incluir el complemento del codón de inicio AUG. Los polinucleótidos antisentido complementarios a las regiones codificantes de ARNm son inhibidores menos eficientes de la traducción que pueden ser utilizados de conformidad con la invención. Si se diseñan para hibridar a la región 5' ó 3' o región codificante de ARNm del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o con la región codificante de la clona una depositada, los ácidos nucleicos antisentido deben ser de al menos seis nucleótidos en longitud, y preferiblemente son oligonucleótidos con un intervalo de seis a aproximadamente 50 nucleótidos en longitud. En aspectos específicos el oligonucleótido de al menos 10 nucleótidos, al menos 17 nucleótidos, al menos 25 nucleótidos o al menos 50 nucleótidos. Los polinucleótidos de la invención pueden ser ADN o ARN o mezclas quiméricas o derivados o versiones modificadas de los mismos, de una sola cadena o de doble cadena. El oligonucleótido puede modificarse en la porción base, porción azúcar, o estructura base de fosfato, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la molécula, hibridación, etcétera. El oligonucleótido puede incluir otros grupos anexos tales como péptidos (por ejemplo, los receptores para direccionamiento de célula hospedera in vivo), o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (véase, por ejemplo, Lestinger et al., 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 84: 648-652; publicación PCT No. WO 88/09810, publicado el 15 de diciembre de 1988) o la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo publicación PCT No. WO 89/10134, publicado el 25 de abril de 1988), agentes de escisión activados por hibridación. (Véase, por ejemplo, Krol et al., 1988, BioTechniques 6: 958-976) o agentes de intercalación. (Véase, por ejemplo, Zon, 1988, Pharm. Res. 5: 539-549). Para este fin, el oligonucleótido puede conjugarse a otra molécula, por ejemplo, polipéptido, agente de entrecruzamiento activado por hibridación, agente de transporte, agente de escisión activado por hibridación, etcétera. El oligonucleótido antisentido puede comprender al menos una porción modificada de base la cua! se selecciona partir del grupo incluyendo, pero no limitado a, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-clorouracil, 5-yodouracll, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetii) uracil, 5-carboximetiIaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluraciio, dihidrouracilo, beta-D-galactosilquosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiiguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5- metilaminometiluracilo, 5-metilaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, d'-metilcarboximetiluraciio, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, ácido uracil-5-oxiacético metiléster, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) . uracilo, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina. El oligonucleótido antisentido también puede comprender al menos una porción modificada de azúcar seleccionar a partir del grupo que incluye, pero no se limita a, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa, y hexosa. En incluso otra modalidad, el oligonucleótido antisentido comprender menos una estructura base de fosfato modificada seleccionada partir del grupo que incluye, pero no se limita a, un fosforotioato, un fosforoditioato, un fosforamidotioato, un fosforamidato, un fosforodiamidato, un metilfosfonato, un fosforotriéster de alquilo, y un formacetal o análogos de los mismos. En incluso otra modalidad, el oligonucleótido antisentido es un oiigonucleótido a-anomérico. Un oligonucleótido a-anomérico forma híbridos específicos de doble cadena con ARN complementario en el cual, de manera contraria a las unidades b usuales, las cadenas conen en paralelo entre sí (Gautier et al., 1987, Nucí. Acids Res. 15: 6625-6641). El oligonucleótido es un 2'-0-metilribonucleótido (Inoue et al., 1987, Nucí. Acids Res. 15: 6131-6148), o un análogo de ARN-ADN quimérico (inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215: 327-330). Los polinucleótidos de la invención pueden sintetizarse mediante métodos estándares conocidos en la técnica, por ejemplo mediante el uso de un sintetizador de ADN automatizado (tales como los comercialmente disponibles a partir de Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Como ejemplos, los oligonucleótidos fosforotioato pueden sintetizarse mediante el método de Stein et al., (1988, Nucí. Acids Res. 16: 3209), los oligonucleótidos metilfosfonato pueden prepararse mediante el uso de soportes de polímero de vidrio con poro controlado (Sarin et al., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 85: 7448-7451), etcétera. Mientras que los nucleótidos antisentido complementarios a la secuencia de la región codificante del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) pueden ser utilizados, aquellos complementarios a la región no traducida transcrita son más preferidos. Los antagonistas potenciales de conformidad con la invención también incluyen ARN catalítico, o una ribozima (Véase, por ejemplo, Publicación Internacional PCT WO 90/11364, publicada el 4 de octubre de 1990; Sarver et al., Science 247: 1222-1225 (1990). Mientras que la ribozimas que escinden el ARNm en secuencias de reconocimiento específicas de sitio pueden ser utilizadas para destruir los ARNm del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), se prefiere el uso de ribozimas cabeza de martillo. Las ribozimas cabeza de martillo escinden ARNm en ubicaciones dictadas por las regiones flanqueantes que forman pares de bases complementarias con el ARNm blanco. El único requerimiento es que el ARNm blanco tenga la siguiente secuencia de dos bases: 5'-UG-3'. La construcción y producción de ribozimas cabeza de martillo se conoce bien en la técnica y se describe más completamente en Haseloff y Gerlach, Nature 334: 585-591 (1988). Hay numerosos sitios potenciales de escisión para la ribozima cabeza de martillo dentro de la secuencia nucleotídicas del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (figuras 1A-B o la secuencia de la clona depositada). Preferiblemente, la ribozima se diseña de manera que el sitio de reconocimiento para escisión se localiza cerca del extremo 5' de ARNm del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5); es decir, para incrementar la eficiencia y minimizar la acumulación intercelular de transcritos de ARNm no funcionales. Como en ei método de antisentido, las ribozimas de la invención pueden estar compuestas de oligonucleótidos modificados (por ejemplo para mejorar la estabilidad, direccionamiento, etc.) y deberían ser administradas a las células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) in vivo. Las construcciones de ADN que codifican la ribozima pueden introducirse dentro de las células de la misma manera como se describió anteriormente para la introducción de ADN codificante antisentido. Un método preferido para administración implica el uso de una construcción de ADN "que codifica" la ribozima bajo el control de un promotor constitutivo fuerte, tal como, por ejemplo, promotor de Pol II o Pol lll, de manera que las células transfectadas producirán suficientes cantidades de la ribozimas para destruir los mensajeros endógenos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) e inhiben la traducción. Puesto que las ribozimas a diferencia de las moléculas antisentido, son catalíticas, para eficiencia se requiere una menor concentración intercelular. Los compuestos antagonistas/agonistas pueden ser empleados para inhibir los efectos de crecimiento celular y proliferación de los polipéptidos de la presente invención sobre células y tejidos neoplásicos, es decir estimulación de angiogénesis de tumores, y, por lo tanto, retardan o previenen el crecimiento y proliferación celular anormal, por ejemplo, en la formación o crecimiento del tumor. El antagonistas/agonista también puede emplearse para prevenir enfermedades hiper-vasculares, y prevenir la proliferación de células epiteliales del cristalino después de cirugía extracapsular de catarata. La prevención de la actividad mitogénica de los polipéptidos de la presente invención también puede desearse en casos tales como restenosis después de angioplastía con balón. El antagonistas/agonista también puede emplearse para prevenir el crecimiento de tejido cicatrizal durante la cicatrización de herida. El antagonistas/agonista también puede emplearse para tratar las enfermedades descritas en la presente invención. Por lo tanto, la Invención provee un método para tratar o prevenir enfermedades, trastornos, y/o condiciones, incluyendo pero no limitadas a las enfermedades, trastornos, y/o condiciones listadas a lo largo de esta solicitud, asociadas con la sobreexpresión de un polinucleótido de la presente invención mediante la administración a un paciente de (a) una molécula antisentido dirigida al poiinucleótido de la presente invención, y/o (b) una ribozima dirigida al polinucleótido de la presente Invención.

Uso de fragmentos transmembranales como antagonistas/ inhibidores En modalidades específicas, la presente invención se refiere a la modulación, especialmente inhibición, de actividades biológicas del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) mediante la exposición de éste a moléculas que interfieren con el ensamblaje conecto del receptor. En particular, la invención se refiere a fragmentos aislados o péptidos del dominio transmembranal del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que inhiben la transducción de la señal mediada por el receptor de quimiocina de proteína G o la unión al ligando. En ciertas modalidades, los residuos cargados se añaden un extremo del fragmento para promover ia orientación correcta del fragmento en la membrana. Se ha demostrado que los segmentos del dominio transmembranal (TM) del Receptor acoplado a proteína G (GPCR) interactúan de manera específica durante el ensamblaje de las moléculas receptoras. Estas interacciones no llevan a una estructura rígida debido que cierta flexibilidad se requiere para los cambios conformacionales después de la unión al ligando, lo cual permite que la molécula señalice de la superficie celular a las partes ¡ntracelulares. También se demostró para varias GPCR que el dominio transmembranal está implicado en la unión al ligando y por lo tanto contiene aberturas que permiten la penetración de los ligandos. Los reportes de que la expresión de los dominios transmembranales ausentes restablecen a las vasopresina V2, receptores beta adrenérgicos y M3 muscarínicos truncados inactivos (Schoneberg et al., EMBO J. 15: 1283 (1996); Wong et al., J. Biol. Chem. 265: 6219 (1990); Monnot et al., J. Biol. Chem. 271: 1507 (1996); Gudermann et al., Annu. Rev. Neurosci. 20: 399 (1997); Osuga et al., J. Biol. Chem. 272:25006 (1997)) sugieren que el péptido derivado a partir del sexto dominio transmembranal del receptor P2-adrenérgico que inhibe la activación del receptor y la dimerización (Hebert et al., J. Bio. Chem. 271(27): 16384-92 (1996)). Así, la función de GPCR puede ser rescatada mediante interacciones intramembranales dirigidas de GPCR. Además, la función de GPCR puede inhibirse mediante interacciones intramembranales dirigidas. Por ejemplo, los fragmentos que corresponden a los segmentos TM pronosticados de CCR5, ios cuales funcionan como un co-receptor durante la entrada de VIH dentro de las células, produce una inhibición potente de la entrada de VIH sin toxicidad aparente a las células. (Véase WO 99/43711). La utilidad de los métodos también se demostró mediante direccionamiento específico de CXCR4, el cual funciona como un co-receptor durante la entrada a las células de las cepas de VIH-1 trópico a la célula T. los fragmentos que contienen 20-25 residuos de aminoácidos inhibieron la señalización del receptor y la infección por VIH-1 in vitro a concentraciones tan bajas como de 0.2 micromolar. (Véase WO 99/43711). La naturaleza hidrófoba y/o amfipática de los fragmentos transmembranales permiten su penetración dentro de la bicapa. Además, la orientación dentro de la membrana puede controlarse mediante la adición de residuos cargados al extremo que está expuesto en el lado extracelular de la membrana en el receptor intacto. La inserción dentro de la membrana se evalúa mediante microscopía fluorescente de análogos peptídicos marcados utilizando metodología conocida por los expertos en la técnica, como se describe en WO 99/43711. En una modalidad particular, la invención abarca fragmentos transmembranales que modulan, y preferiblemente inhiben las propiedades biológicas y actividades del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), mediante direccionamiento del dominio transmembranal de este receptor. En una modalidad adicional, la invención comprende específicamente métodos para alterar la función del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) mediante el uso de estos antagonistas. La tecnología química o de ADN recombinante puede ser utilizada para obtener fragmentos transmembranales del receptor de qulmlocina de proteína G (CCR5), los cuaies preferiblemente se utilizan tan pequeños como desea posible mientras que aún retengan suficientemente una elevada afinidad para la unión a, o asociación con, receptor de quimiocina de proteína G. los ejemplos limitantes de los polipéptidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) incluyen fragmentos de 10 a 50 aminoácidos que corresponden a al menos un segmento transmembranal de los segmentos 1-7. En otra modalidad, la invención abarca una molécula que modula el receptor de quimiocina de proteína G que comprende un fragmento, un péptido, un peptidomimético que es un análogo estructural de una porción de un segmento transmembranal del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), en donde dicha molécula tiene un extremo extracelular y un extremo intracelular y dicha molécula tiene en dicho extremo extracelular un grupo negativamente cargado y en dicho extremo intracelular una carga neutra bajo condiciones fisiológicas; dicha molécula espontáneamente se inserta dentro de una membrana en la misma orientación que el dominio transmembranal a partir del cual se ha derivado; y dicha molécula modula una propiedad o actividad biológica de dicho receptor de quimiocina de proteína G. En una modalidad particular, las moléculas contienen un grupo cabeza no peptídico, hidrófilo, negativamente cargado y una cola no cargada, la cual asegura la orientación correcta de la molécula en la membrana celular. En otra modalidad, el grupo cabeza negativamente cargado es de uno a más aminoácidos ácidos. La actividad dei receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) modulada por dicho fragmento incluyen la inhibición de la liberación de Ca2+ intracelular mediada por el receptor de quimiocina de proteína G y la inhibición de la infección de VIH mediada por el receptor de quimiocina de proteína G. La actividad del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) modulada por dicho péptido también incluye la unión de un ligando del Receptor quimiocina de proteína G (CCR5). Las actividades adicionales del receptor de qulmiocina de proteína G (CCR5) moduladas por dicho péptido ¡ncluyen aquellas en la descripción y ejemplos en la presente invención. En otra modalidad, la invención comprende métodos para modular la actividad biológica del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) mediante poner en contacto una célula que expresa el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) con una molécula de la invención. En un método, la actividad biológica modulada es la inhibición de la Infección por VIH mediada por el receptor de quimiocina de proteína G. En otro método, la actividad biológica modulada es la inhibición de la liberación de Ca2+ intracelular mediada por el receptor de quimiocina de proteína G. Otras actividades moduladas incluyen aquéllas descritas en otra parte en la presente invención. Otra modalidad es un método para inhibir la infección por VIH-1 , que comprende poner en contacto una célula que expresa el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) el cual se une a VIH-1 con una molécula que comprende un fragmento de polipéptido, un péptido, o un peptidomimético que es un análogo estructural de una porción del dominio transmembranal de dicho receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), en donde se pone en contacto a las célula con dicha molécula que inhibe la infección por VIH-1. El péptido o peptidomimético puede ser un análogo estructural de una porción dei dominio transmembranal del receptor de quimiocina de proteína G.

En una modalidad, las moléculas de la presente invención imitan un segmento transmembranal del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) y bloquean el auto-ensamblaje del receptor, posiblemente mediante la inhibición competitiva con el segmento TM nativo. Estas bloquean así o inhiben la transducción de la señal en la célula afectada. La invención también incluye análogos peptídlcos y peptidomiméticos los cuales poseen propiedades benéficas tales como vida media incrementada, ausencia de inmunogenicidad, y la capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica. Los análogos peptídicos de la invención median los efectos químicos y/o biológicos de los agonistas/antagonistas hormonales u otros péptidos. Estos son útiles para el desanollo de técnicas farmacéuticas, terapéuticas, y de diagnóstico. Por consiguiente, la invención también provee métodos para producir una respuesta profiláctica o terapéutica en un mamífero mediante la administración al mamífero de una cantidad farmacéuticamente efectiva de uno o más péptidos análogos de la invención. En modalidades preferidas, la presente invención provee métodos para producir dicha respuesta mediante la modulación de la actividad del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) mediante la administración de una cantidad efectiva de uno o más análogos peptídicos de la invención. En otra modalidad, más de un péptido de ia invención se administra como un cóctel para modular la actividad biológica del receptor de quimiocina de proteína G.

El término "péptido transmembranal del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5)" puede incluir un fragmento del dominio transmembranal, un segmento transmembranal, un fragmento de un segmento transmembranal, y/o un péptido homólogo a los mismos. Los fragmentos preferidos incluyen aquellos del menos 4-50, y preferiblemente al menos 4-30, y preferiblemente al menos 10-30 aminoácidos en longitud, o cualquier intervalo en estos. Los fragmentos adicionalmente preferidos incluyen aquellos que 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 19, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 aminoácidos en longitud. También incluidos están cualesquiera secuencias correspondientes que tengan sustituciones conservativas de aminoácidos. Los fragmentos transmembranales de la muestra de la invención incluyen, pero no se limitan a, cualquier fragmento descrito en la presente Invención. Un fragmento transmembranal preferido de la presente invención, cuando se pone en contacto con una célula o estructura membranal (por ejemplo, liposomas) que contiene receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) biológicamente activo, modula la actividad biológica de dicho receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) in vitro, in vivo, o in situ. La concentración del fragmento en una solución que se pone en contacto con la célula in vivo (por ejemplo, plasma sanguíneo o fluido intersticial) o in vitro (por ejemplo, medio de cultivo) está entre 1 nanomolar y 50 micromolar, preferiblemente entre 1 nanomolar y 1 micromoiar, y más preferiblemente menor que 5 micromolar. "Negativamente cargado" se refiere a aquellos aminoácidos, derivados de aminoácidos, aminoácidos mimétricos y porciones químicas que están negativamente cargadas a pH fisiológico. Los aminoácidos negativamente cargados incluyen, por ejemplo Asp y Glu. Un residuo "acídico" es un residuo que está negativamente cargado a pH fisiológico. "Positivamente cargado" se refiere a aquellos aminoácidos, derivados de aminoácidos, mimétricos de aminoácidos y porciones químicas que están positivamente cargadas a pH fisiológico. Los aminoácidos positivamente cargados incluyen, por ejemplo, Lys y Arg. Un "residuo básico" es un residuo que está positivamente cargado a pH fisiológico. "Neutro" se refiere a aquellos aminoácidos, derivados de aminoácidos, mimétricos de aminoácidos y porciones químicas que no están ni positivamente ni negativamente cargadas a pH fisiológico El término "modula una propiedad o actividad biológica" significa que en la presencia de un fragmento transmembranal prueba un parámetro biológico o evento es incrementado o disminuido en relación a un control en la ausencia de dicho péptido. Los ejemplos de propiedad o actividad biológica incluyen: conformación del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), asociación dei receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) con otras moléculas, transducción de la señal, secreción extracelular de proteínas celulares, cambios conformacionales en proteínas, cambios en actividad enzimática, cambios en actividad metabólica, cambios en afinidad por un ligando, cambios en niveles de infección viral, cambios en vasodilatación, modulación de la velocidad cardiaca, modulación de la broncodilatación, modulación de ias secreciones endocrinas, y modulación de la peristalsis dei intestino. Nótese que la actividad biológica del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) no necesita ser una que esté limitada en el papel preciso in vivo llevado a cabo por el receptor de quimiocina de proteína G. El término también abarca las propiedades del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), tales como unión a proteína viral, que no son parte del papel biológico in vivo del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Se abarcan adicionalmente propiedades intrínsecas del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que solamente se muestran por manipulación experimental en el laboratorio, tal como la capacidad del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) en bicapas artificiales (por ejemplo, liposomas) para interactuar con los ligandos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). "Transducción de la señal" es el procedimiento mediante el cual la unión de un ligando a un receptor se traduce hacia un cambio fisiológico. En general, la unión de un ligando a un receptor ocasiona un cambio en la propiedad física del receptor, por ejemplo un cambio en su conformación, o en su orientación, o en su capacidad para unir otros ligandos. Este cambio en una propiedad física puede resultar, directamente o indirectamente, en flujos de iones incrementados o disminuidos, actividad enzimática incrementada o disminuida, fosforilación incrementada o disminuida, translocación del receptor o de cualquier molécula Incrementada o disminuida (por ejemplo, una porción inositol o una subunldad de proteína G) a partir de un compartimiento celular a otro. "Llgandos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5)" se refiere a moléculas biológicas que se unen al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) in vitro, in situ o in vivo, y pueden incluir hormonas, neurotransmisores, virus o dominios de unión a receptor de los mismos, proteínas G, opsinas, rodopsinas, nucleósidos, nucleótidos, factores de la cascada de coagulación, odorantes o feromonas, toxinas, factores estimulantes de la colonia, factores activadores de plaquetas, péptidos neuroactivos, neurohumores, o cualquier compuesto biológicamente activo, tales como fármacos o compuestos sintéticos o que ocurren naturalmente. La frase" inhibe infección por VIH" significa que un péptido de la intención inhibe la unión de un VIH a un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o inhibe una actividad biológica del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) y media la entrada y reproducción exitosa de un virus VIH dentro de una célula que expresa el receptor de quimiocina de proteína G. Polipéptidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente intención, o ácidos nucleicos que codifican a los mismos, incluyen una serie química de secuencias substancialmente correspondientes como péptidos de substitución o polinucieótidos los cuales pueden obtenerse rutinariamente por un experto en la técnica, sin llevar a cabo experimentación, basándose en las enseñanzas y guías presentadas en la presente intención.

Para una descripción detallada de la química y estructura de proteínas, véase Schulz et ai., PRINCIPLES OF PROTEIN STRUCTURE, Springer-Verlag, New York, 1978, y Creighton, T.E., PROTEINS: STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, los cuales incorporan en la presente como referencias. Para una presentación de las sustituciones de secuencias nucleotídicas, tales como preferencias de codón, véase Ausubel et al., anteriormente mencionado, en las secciones A.1.1-A.1.24, y Sambrook et al., anteriormente mencionado, en los Apéndices C y D. Los polipéptidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) ¡ncluyen secuencias homologas y/o fragmentos del dominio transmembranal, en particular, al menos un segmento transmembranal 1-7 del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) u homólogos de los mismos. Sin embargo, en el contexto de la presente intención, los polipéptidos dei receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de al menos 15-20 aminoácidos se prefieren, de tal manera que los polipéptidos del receptor de qulmiocina de proteína G (CCR5) son capaces de abarcar la bicapa iipídica. Se prefiere particularmente que los péptidos de la invención se seleccionen o modifiquen de manera que un extremo está cargado y el otro es neutral bajo condiciones fisiológicas. Esto es así de manera que el péptido se inserta espontáneamente dentro de una membrana. Es de particular importancia que el péptido se inserte en la misma orientación que en el dominio del receptor de qulmiocina de proteína G (CCR5) a partir del cual deriva. Los péptidos de la invención pueden derivarse a partir de 7 segmentos TM. La posición de los aminoácidos de los segmentos TM puede determinarse utilizado modelamiento molecular, combinado opcionalmente con análisis de hidrofobicidad (véase cuadro 1), y/o ajustado a hélices modelo, como ejemplos no limitantes. Dicho modelamiento puede lograrse de conformidad con los métodos conocidos, por ejemplo, ECEPP, INSIGHT, DISCOVER, CHEM-DRAW, AMBER, FRODO, y CHEM-X. Dichos algoritmos comparan los dominios transmembranales y los segmentos entre GPCR relacionadas, determinan probables estruduras de energía minimizada y definen secuencias transmembranales alternativas. Los fragmentos del dominio de transmembrana de receptor de quimiocina acoplado a proteína G que es útil como antagonistas comprende, o alternativamente consiste de las siguientes porciones de SEQ ID NO: 2 o del polipéptido codificado por el clon depositado: Segmento 1 : aminoácidos 31-58, 32-58, 33-58, 34-58, 35-58, 36- 58, 37-58, 38- 58, 31-57, 32-57, 33-57, 34-57, 35-57, 36-57, 37-57, 31-56, 32- 56, 33-56, 34-56, 35-56, 36-56, 31-55, 32-55, 33-55, 34-55, 35-55, 31-54, 32-54, 33-54, 34-54, 31-53, 32- 53, 33-53, 31-52, 32-52, 31-51 de la SEQ ID NO:2 o del polipéptido codificado por el clon depositado, o cualquier combinación del mismo, preferiblemente por lo menos 15 aminoácidos de longitud; Segmento 2: aminoácidos 68-97, 69-97, 70-97, 71-97, 72-97, 73-97, 74-97, 75- 97, 76-97, 68-96, 69-96, 70-96, 71-96, 72-96, 73-96, 74-96, 75-96, 76-96, 68-95, 69-95, 70-95, 71-95, 72-95, 73-95, 74-95, 75-95, 68-94, 69-94, 70-94, 71-94, 72-94, 73- 94, 74-94, 68-93, 69-93, 70-93, 71-93, 72-93, 73-93, 68-92, 69-92, 70-92, 71-92, 72-92, 68-91 , 69-91 , 70-91 , 71-91 , 68-90, 69-90, 70-90, 68-89, 69-89, 68-88 de la SEQ ID NO: 2 o del polipéptido codificado por el clon depositado, o cualquier combinación del mismo, preferiblemente por lo menos 15 aminoácidos de longitud; Segmento 3: aminoácidos 103-124, 104-124, 105-124, 106-124, 107-124, 108-124, 109-124, 103-123, 103-122, 103-121 , 103-120, 103-119, 103-118 de la SEQ ID NO: 2 o del polipéptido codificado por el clon depositado, o cualquier combinación del mismo, preferiblemente por lo menos 15 aminoácidos de longitud; Segmento 4: aminoácidos 142-169, 143-169, 144-169, 145-169, 146-169, 147-169, 148-169, 149-169, 142-168, 143-168, 144-168, 145-168, 146-168, 147-168, 148-168, 142-167, 143-167, 144-167, 145-167, 146-167, 147-167, 142-166, 143-166, 144-166, 145-166, 146-166, 142-165, 143-165, 144-165, 145-165, 142-164, 143-164, 144-164, 142-163, 143-163, 142-163 de ia SEQ ID NO: 2 o del polipéptido codificado por el clon depositado, o cualquier combinación del mismo, preferiblemente por lo menos 15 aminoácidos de longitud; Segmento 5: aminoácidos 196-223, 197-223, 198-223, 199-223, 200-223, 201- 223, 202-223, 203-223, 196-222, 197-222, 198-222, 199-222, 200-222, 201-222, 202-222, 196-221 , 197-221 , 198-221, 199-221 , 200-221, 201-221 , 196-220, 197-220, 198- 220, 199-220, 200-220, 196-219, 197-219, 198-219, 199-219, 196-218, 197-218, 198- 218, 196-217, 197-217, 196-216 de la SEQ ID NO: 2 o del polipéptido codificado por el clon depositado, o cualquier combinación del mismo, preferiblemente por lo menos 15 aminoácidos de longitud; Segmento 6: aminoácidos 236-260, 237-260, 238-260, 239-260, 240-260, 236- 259, 237-259, 238-259, 239-259, 236-258, 237-258, 238-258, 236-257, 237-257, 236-256 de la SEQ ID NO: 2 o del polipéptido codificado por el clon depositado, o cualquier combinación dei mismo, preferiblemente por lo menos 15 aminoácidos de longitud; Segmento 7: aminoácidos 275-305, 276-305, 277-305, 278-305, 279-305, 280-305, 281-305, 282-305, 283-305, 284-305, 285-305, 275-304, 276-304, 277-304, 278-304, 279-304, 280-304, 281-304, 282-304, 283-304, 284-304, 275-303, 276-303, 277-303, 278-303, 279-303, 280-303, 281-303, 282-303, 283-303, 275-302, 276-302, 277-302, 278-302, 279-302, 280-302, 281-302, 282-302, 275-301 , 276-301 , 277-301 , 278-301 , 279-301, 280-301 , 281-301 , 275-300, 276-300, 277-300, 278-300, 279-300, 280-300, 275-299, 276-299, 277-299, 278-299, 279-299, 275-298, 276-298, 277-298, 278-298, 275-297, 276-297, 277-297, 275-296, 276-296, 275-295 de la SEQ ID NO: 2 o del polipéptido codificado por el clon depositado, o cualquier combinación del mismo, preferiblemente por lo menos 15 aminoácidos de longitud; Los fragmentos de CCR5 descritos en WO 99/43711 se excluyen específicamente de las modalidades en esta sección. Los aminoácidos negativamente cargados, tales como Asp o Glu, pueden ser sustituidos o añadirse en el extremo extracelular del fragmento. El número de aminoácidos negativamente cargados es típicamente de 1 , 2 ó 3. Los aminoácidos neutros pueden ser sustituidos o añadidos en el extremo intracelular del fragmento. Véase también ejemplo 57.

Otras actividades Un polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la presente invención como resultado de la capacidad para estimular el crecimiento de células endoteliales, se puede emplear en el tratamiento para estimular la revascularización de tejidos isquémicos debido a varias condiciones de enfermedad tales como trombosis, arterieesclerosis y otras condiciones cardiovasculares. El polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la presente invención también se puede ' emplear para estimular la angiogénesis y regeneración de extremidades como se describió anteriormente. Un polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la presente invención también se puede emplear para tratar, prevenir y/o diagnosticar heridas debido a lesiones, quemaduras, reparación de tejido postoperatorio, y úlceras ya que son mitogénicas para varias células de diferentes orígenes, tales como células de fibroblastos y células de músculo esquelético, y por lo tanto facilita la reparación o reemplazo de tejido dañado o con enfermedad. Un polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la presente invención también se pueden emplear para estimular el crecimiento neuronal y para tratar y prevenir daño neuronal que ocurre en ciertas enfermedades, trastornos y/o condiciones neuronales o condiciones neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y complejo relacionado con SIDA. Un polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la presente Invención puede tener la capacidad para estimular el crecimiento de condrocitos, por lo tanto se puede emplear para incrementar la regeneración de hueso y periodontal y ayudar en transplantes de tejido o en injertos de hueso. Un polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la presente invención también se puede emplear para prevenir envejecimiento de la piel debido a quemadura por el sol, estimulando el crecimiento de queratinocitos. Un polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la presente invención también se puede emplear para prevenir pérdida del cabello ya que los miembros de la familia de FGF activan a las células formadoras de cabello y promueven el crecimiento de melanocitos. A lo largo de las mismas líneas, un polipéptido, poiinucleótido, agonista o antagonista de la presente invención se puede emplear para estimular el crecimiento y diferenciación de células hematopoyéticas y células de médula ósea cuando se usan en combinación con otras citocinas. Un polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la presente invención también se puede emplear para mantener a los órganos antes del transplante o para soportar cultivo de células de tejidos primarios. Un polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la presente invención también se puede emplear para inducir tejido de origen mesodérmico para diferenciar en embriones tempranos. Un polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la presente invención también puede incrementar o disminuir la diferenciación o proliferación de células madres embrionarias, además, como se describió antes, de linaje hematopoyético. Un polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la presente invención también se puede emplear para modular características de mamíferos, tales como altura del cuerpo, peso del cuerpo, color del pelo, color de los ojos, piel, porcentaje de tejido adiposo, pigmentación, tamaño, y forma (por ejemplo, cirugía cosmética). De manera similar, un polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la presente invención se puede usar para modular el metabolismo de mamíferos que afectan el catabolismo, anabolismo, procesamiento, utilización y almacenamiento de energía. Un polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la presente invención se puede usar para incrementar un estado mental o estado físico del mamífero por influencia de biorritmos, ritmos circadianos, depresión (incluyendo enfermedades, trastornos y/o condiciones depresivas), tendencia para violencia, tolerancia para el dolor, capacidades reproductivas (preferiblemente por actividad de activina o similar a inhibina), niveles hormonales o endocrino, apetito, libido, memoria, estrés u otras cualidades cognitivas. Un polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la presente invención también se puede usar como un aditivo o conservador de alimentos, tal como para incrementar o disminuir las capacidades de almacenamiento, contenido de grasas, lípidos, proteínas, carbohidratos, vitaminas, minerales, cofactores u otros componentes nutricionales. Las aplicaciones anteriormente mencionadas tienen uso en una amplia variedad de hospederos. Dichos hospederos incluyen pero no se limitan a humanos, murinos, conejo, cabra, cobayos, camello, caballo, ratón, rata, hámster, cerdo, microcerdo, pollo, cabra, vaca, oveja, perro, gato, primate no humano y humano. En modalidades específicas, el hospedero es un ratón, conejo, cabra, cobayo, pollo, rata, hámster, cerdo, oveja, perro o gato. En modalidades preferidas, el hospedero es un mamífero. En modalidades más preferidas, el hospedero es un humano. Habiendo descrito generalmente la invención, ésta se entenderá más fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos, los cuales se proveen a manera de ilustración y no se pretende que sean limitantes.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Expresión bacteriana y purificación de HDGNR10 La secuencia de ADN para HDGNR10, ATCC No. 97183 inicialmente se amplificó utilizando iniciadores oiigonucleótidos de PCR que corresponden a 5' y a ias secuencias de la proteína HDGNR10 (menos la secuencia de péptido señal) y las secuencias 3' del vector al gen HDGNR10. Los nucleótidos adicionales que corresponden a HDGNR10 se añadieron a las secuencias 5' y 3' respectivamente. El iniciador oligonucleótido 5' tiene la secuencia 5' CGGAATTCCTCCATGGATTATCAAGTGTCA 3' (SEQ ID NO: 3) y contiene un sitio para la enzima de restricción EcoRI seguido por 18 nucleótidos de la secuencia codificante HDGNR10 a partir del supuesto aminoácido terminal del codón de la proteína procesada. La secuencia 3' 5* CGGAAGCTTCGTCACAAGCCCACAGATAT 3' (SEQ ID NO: 4) contiene secuencias complementarias a un sitio Hindlll y está seguido por 18 nucleótidos de la secuencia codificante de HDGNR10. Los sitios para enzima de restricción conesponden a los sitios de enzima de restricción sobre el vector de expresión bacteriana pQE-9 (Qiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chastworth, CA, 91311). pQE-9 codifica resistencia a antibiótico (Ampr), un origen de replicación bacteriano (ori), un operador promotor regulable por IPTG (P/O), un sitio de unión al ribosomas (RBS), una marca 6-His y sitios para enzima de restricción. Luego pQE-9 fue digerido con EcoRi y Hindlll. Las secuencias amplificadas se ligaron dentro de pQE-9 y se insertaron en marco con la secuencia codificante para la marca de histidina y el RBS. La mezcla de ligación se utilizó luego para transformar E. coli cepa M15/rep4 (Qiagen, Inc.) mediante el procedimiento descrito en Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (1989). M15/rep4 contiene múltiples copias del plásmido pREP4, el cual expresa el represor lacl y también confiere resistencia a canamicina (Kanr). Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer sobre placas de LB y las colonias resistentes a ampicilina/canamicina fueron seleccionadas. El ADN plasmídico se aisló y se confirmó mediante análisis de restricción. Los clones que contenían las construcciones deseadas se hicieron crecer durante toda la noche (O/N) en cultivo líquido en medio LB complementado tanto con Amp (100 µg/ml) como con Kan (25 µg/ml). El cultivo O/N se utilizó para inocular un cultivo grande a una relación de 1 : 100 a 1: 250. Las células se crecieron a una densidad óptica 600 (D.O. 600) de entre 0.4 y 0.6. El IPTG ("Isopropil-B-D-tiogalacto piranósido) se añadió luego a una concentración final de 1 mM. El IPTG se induce mediante inactivación del represor lacl, liberando al P/O llevando a una expresión génica incrementada. Las células se crecieron por 3 a 4 horas extra. Las células se cosecharon luego mediante centrifugación. El concentrado celular se solubillzó en el agente caotrópico Guanidina HCl 6 Molar. Después de la clarificación, el HDGNR10 solubilizado se purificó a partir de esta solución mediante cromatografía en una columna de níquel-quelato bajo condiciones que permiten la unión estrecha por las proteínas que contienen la marca 6-His. Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411 : 177-184 (1984).HDGNR10 se eluyó a partir de la columna en guanidina HCl 6 molar pH 5.0 y para el propósito de la renaturalización se ajustó a guanidina HCl 3 molar, fosfato de sodio 100 mM, glutationa 10 mmolar (reducida) y glutationa 2 mmolar (oxidada). Después de la incubación en esta solución por 12 horas la proteína se dializó a fosfato de sodio 10 mmolar.

EJEMPLO 2 Expresión de HDGNR10 recombinante en células COS La expresión del plásmido HDGNR10 HA se deriva a partir de un vector pcDNAI/Amp (Invitrogen) que contiene: 1) origen de replicación de SV40, 2) gen de resistencia a ampicilina, 3) origen de replicación de E. coli, 4) promotor CMV seguido por una región de poliadaptador, un intrón SV40 y un sitio de poliadenilación. Un fragmento de ADN que codifica el precursor total HDGNR10 y una marca HA fusionada en marco a su extremo 3' se clonaron dentro de la región del poliadaptador del vector, por lo tanto, la expresión de la proteína recombinante está dirigida bajo el promotor CMV. La marca HA que corresponden a un epítope derivado a partir de la proteína de hemaglutinina de influenza se ha descrito previamente (I. Wilson, et al., Cell 37: 767 (1984)). La infusión de la marca HA a la proteína blanco permite la facilidad de detección de la proteína recombinante con un anticuerpo que reconoce ei epítope HA. La estrategia de construcción del plásmido se describe a continuación: La secuencia de ADN que codifica para HDGNR10, ATCC No. 97183, se construyó mediante PCR utilizando dos iniciadores: el iniciador 5' d'-GTCCAAGCTTGCCACCATGGATTATCA AGTGTCA 3' (SEQ ID NO: 5) y contiene un sitio Hindlll seguido por 18 nucleótidos de HDGNR10 que codifican la secuencia inicial a partir del codón de inicio; la secuencia 3' 5'-CTAGCTCGAGTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCACAAGCC CACAGATATTTC 3' (SEQ ID NO: 6) que contiene las secuencias complementarias a un sitio Xhol, codón de paro de la traducción, marca HA y los últimos 18 nucleótidos de la secuencia codificante de HDGNR10 (no incluyendo el codón de paro). Por lo tanto, el producto de PCR contiene un sitio Hindlll en la secuencia codificante de HDGNR10 seguido por una marca HA fusionada en marco, un codón de paro de término de la traducción contiguo a la marca HA, y un sitio Xhol. El fragmento de ADN amplificado mediante PCR y el vector, pcDNAI/Amp, se digirieron con enzimas de restricción Hindlll y Xhol y se iigaron. La mezcla de ligación se transformó dentro de E. coli cepa SURE (disponible a partir de Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Joila, CA 92037), el cultivo transformado se sembró sobre placas con medio con ampicilina y las colonias resistentes se seleccionaron. El ADN plasmídico se aisló a partir de los transformantes y se examinó mediante análisis de restricción para la presencia del fragmento correcto. Para la expresión de HDGNR10 recombinante, las células COS se transfectaron con el vector de expresión mediante el método de DEAE-DEXTRAN. (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (1989)). La expresión de la proteína HDGNR10 HA se detectó mediante el método de radiomarcado e inmunoprecipitación. (E. Harlow, D. Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Las células se marcaron por 8 horas con 35S-cisteína dos días post transfección. El medio de cultivo se colectó entonces y las células se usaron con detergente (regulador de pH RIPA (NaCI 150 mM, NP-40 al 1%, SDS al 0.1 %, NP-40 al 1%, DOC al 0.5%, Tris 50 mM, pH 7.5). (Wilson, I. et al., Id. 37: 767 (1984). Ambos lisados celulares y medio de cultivo se precipitaron con un anticuerpo monoclonal específico a HA. Las proteínas precipitadas se analizaron sobre geles de SDS-PAGE al 15%.

EJEMPLO 3 Clonación y expresión de HDGNR10 utilizando el sistema de expresión de baculovirus La secuencia de ADN que codifica la proteína HDGNR10 de longitud total, ATCC No. 97183, se amplificó utilizando iniciadores oligonucleótidos para PCR que corresponden a las secuencias 5' y 3' del gen: el iniciador 5' tiene secuencia 5" CGGGATCCCTCCATGGATTATCAAGTGTCA 3' (SEQ ID NO: 7) y contiene un sitio para enzima de restricción BamHl seguido por cuatro nucleótidos que semejan una señal eficiente para el inicio de la traducción en ias células eucariontes (Kozak, M., J. Mol. Biol. 196: 947-950 (1987)) y justo detrás de los primeros 18 nucleótidos del gen HDGNR10 (el codón de inicio para la traducción es "ATG"). El iniciador 3' tiene la secuencia 5' CGGGATCCCGCTCACAAGCCCACAGATAT 3' (SEQ ID NO: 8) y contiene un sitio de rompimiento para la endonucleasa de restricción BamHl y 18 nucleótidos complementarios a la secuencia no traducida hacia 3' del gen HDGNR10. Las secuencias amplificadas se aislaron a partir de un gel de agarosa al 1% utilizando un equipo comercialmente disponible ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). El fragmento se digirió entonces con la endonucleasa BamHl y se purificó como se describió anteriormente. Este fragmento se designó F2. El vector pRG1 (modificación del vector pVL941 , discutido a continuación) se utilizó para la expresión de la proteína HDGNR10 utilizando el sistema de expresión de baculovirus (para revisión véase: Summers, M.D. y Smith, G.E. 1987, A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimentation Station Bulletin No. 1555). Este vector de expresión contiene el promotor fuerte de polihedrina del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa caiifomica (AcMNPV) seguido por los sitios de reconocimiento para la endonucleasa de restricción BamHl. El sitio de poliadenilación del virus de simio (SV) 40 se utiliza para la poliadenilación eficiente. Para una selección fácil de los virus recombinantes el gen de beta-galactosidasa a partir de E. coli se inserta en la misma orientación que el promotor de polihedrina seguido por la señal de poliadenilación del gen de polihedrina. La secuencia de polihedrina está flanqueada en ambos lados por secuencias virales para la recombínación homologa mediada por célula del ADN viral de tipo silvestre cotransfectado. Muchos otros vedores de baculovirus pueden ser utilizados en lugar de pRG1 tales como pAc373, pVL941 y pAcIMI (Luckow, V.A. y Summers, M.D., Virology 170: 31-39). El plásmido se digirió con la enzima de restricción BamHl y luego se defosforiló utilizando fosfatasa intestinal de ternera mediante procedimientos conocidos en la técnica. El ADN se aisló entonces a partir de un gel de agarosa al 1 % como se describió anteriormente. Este vector de ADN se designó V2. El fragmento F2 y el plásmido V2 defosforilado se ligaron con ADN T4 ligasa. Las células E. coli HB101 se transformaron luego y se identificó la bacteria que contenía el plásmido (pBacHDGNRIO) con ei gen HDGNR10 utilizando la enzima BamHl. La secuencia del fragmento clonado se confirmó mediante secuenciación de ADN. 5 µg del plásmido pBacHDGNRIO se cotransfectaron con 1.0 µg de un baculovirus linearizado comercialmente disponible ("BaculoGold™ baculovirus DNA", Pharmigen, San Diego, CA.) utilizando el método de lipofección (Felgner, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417 (1987)). 1 µg de ADN del virus BaculoGold™ y 5 µg del plásmido pBacHDGNRIO se mezclaron en un pozo estéril de una placa de microtitulación que contenía 50 µg de medio de Grace libre de suero (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD). Después se añadieron 10 µl de Lipofectina más 90 µl de medio de Grace, se mezclaron e incubaron por quince minutos a temperatura ambiente. Entonces la mezcla de transfección se añadió gota a gota a las células de insecto Sf9 (ATCC CRL 1711) sembradas en un plato de cultivo de tejidos de 35 mm con 1 ml de medio de Grace sin suero. El plato de balanceó hacia adelante y hacia atrás para mezclar la solución recientemente añadida. El plato se incubó luego por cinco horas a 27°C. Después de 5 horas la solución de transfección se removió a partir del plato y se añadió 1 ml de medio para insecto de Grace suplementado con suero de ternera fetal al 10%. El plato se regresó adentro de la incubadora y el cultivo se continuó a 27°C por cuatro días. Después de cuatro días el sobrenadantes se colectó y se llevó a cabo una prueba de placa similar ai descrito por Summers y Smith (anteriormente mencionado). Como una modificación se utilizó un gel de agarosa con "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) lo cual permitió un aislamiento fácil de las placas teñidas de azul. (Una descripción detallada de una "prueba de placa" también puede encontrarse en the user's guide for insect cell culture and baculovirology distribuida por Life Technologies Inc., Gaithersburg, páginas 9-10). Cuatro días después de la dilución serial, los virus se añadieron a las células, las placas teñidas de azul se seleccionaron con la punta de una pipeta Eppendorf. El agar que contenía los virus recombinantes se resuspendió luego en un tubo Eppendorf que contenía 200 µl de medio de Grace. El agar se removió mediante una centrifugación breve y el sobrenadante que contenía los baculovirus recombinantes se utilizó para infectar células Sf9 sembradas en platos de 35 mm. Cuatro días después los sobrenadantes de estos platos de cultivo se cosecharon y luego se almacenaron a 4°C. Las células Sf9 se crecieron en medio de Grace suplementado con FBS al 10% inactivado mediante calor. Las células se infectaron con el baculovirus recombinante V-HDGNR10 a una multiplicidad de infección (MOI) de 2. Seis horas después el medio se removió y se reemplazó con medio SF900 menos metionina y cisteína (Life Technologies Inc., Gaithersburg). 42 horas después se añadieron 5 µCi de 35S-metionina y 5 µCi de 35S-cisteína (Amersham). Las células se incubaron adicionalmente por 16 horas antes de que se cosecharan mediante centrifugación y las proteínas marcadas se visualizaron mediante SDS-PAGE y autorradiograf ía.

EJEMPLO 4 Expresión mediante terapia génica Los fibroblastos se obtuvieron a partir de un sujeto mediante una biopsia de piel. El tejido resultante se colocó en medio para cultivo de tejido y se separó en piezas pequeñas. Fragmentos pequeños del tejido se colocaron sobre una superficie húmeda de una botella para cultivo de tejidos, aproximadamente diez piezas de colocaron en cada botella. La botella se volteó con la parte superior hacia abajo, se cerró estrechamente y se dejó a temperatura ambiente durante toda la noche. Después de 24 horas a temperatura ambiente, la botella se invirtió y los fragmentos de tejido permanecieron fijos al fondo de la botella y se añadió medio fresco (por ejemplo, medio de Ham F12, con 10% de FBS, penicilina y estreptomicina). Esto se incuba entonces a 37°C por aproximadamente una semana. Después de este tiempo, se añade medio fresco y subsecuentemente se cambia cada varios días. Después de dos semanas adicionales en cultivo, emerge una monocapa de fibroblastos. La monocapa se tripsiniza y se crece a escala dentro de botellas más grandes. pMV-7 (Kirschmeier, P.T. et al., DNA 7: 219-25 (1988) flanqueado por lo repetidos largos terminales del virus del sarcoma murino de Moloney, se digiere con EcoRI y Hindlll y subsecuentemente se trata con fosfatasa intestinal de ternera. El vector lineal se fracciona sobre un gel de agarosa y se purifica, utilizando glóbulos de vidrio.

El ADNc que codifica un polipéptido de la presente invención se amplifica utilizando iniciadores para PCR los cuales conesponden a las secuencias terminales 5' y 3' respectivamente. El iniciador 5' contiene un sitio EcoRI y el iniciador 3' contiene un sitio Hindlll. Cantidades iguales de la estructura base del virus lineal de sarcoma murino de Moloney y el fragmento EcoRI y Hlndlll se añaden juntos, en la presencia de ADN T4 ligasa. La mezcla resultante se mantiene bajo condiciones apropiadas para ligación de los dos fragmentos. La mezcla de ligación se utiliza para transformar a las bacterias HB101 , las cuales se siembran luego sobre agar que contiene canamicina para el propósito de confirmar que el vector tiene el gen de interés adecuadamente insertado. Las células empaquetadoras del amfotrópico pA317 o GP+aml2 se crecen en cultivo de tejido hasta densidad de confluencia en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 10% de suero de ternera (CS), penicilina y estreptomicina. El vector MSV que contiene el gen se añade luego al medio y las células empaquetadoras se transducen con el vector. Las células empaquetadoras producen ahora partículas virales infecciosas que contienen el gen (a las células empaquetadoras se les refieren ahora como células productoras). Se añade medio fresco a las células productoras transducidas, y subsecuentemente, el medio se cosecha a partir de un plato de 10 cm de células productoras confluentes. El medio gastado, que contiene las partículas virales infecciosas, se filtra a través de un filtro de miliporo para remover las células productoras separadas y este medio se utiliza entonces para infectar células tipo fibroblasto. El medio se remueve a partir de un sembrado subconfluente de fibroblastos y se reemplaza rápidamente con el medio a partir de las células productoras. Este medio se remueve y se reemplaza con medio fresco. Si el título del virus es alto, entonces virtualmente todos los fibroblastos se infectarán y no se requerirá selección. Si el título es muy bajo, entonces es necesario utilizar un vector retroviral que tenga un marcador de selección, tal como neo o his. Los fibroblastos diseñados se inyectan luego dentro del hospedero, ya sea solos o después de que han sido crecidos a confluencia sobre glóbulos de microvehículo cytodex 3. Los fibroblastos ahora producen el producto proteico.

EJEMPLO 5 Aislamiento del Receptor del ADN de la clona de quimiocina de proteína G (CCR5) a partir de la muestra depositada El ADN para el receptor de qulmiocina de proteína G (CCR5) se inserta dentro del sitio de clonación múltiple de pQE-9. (Qiagen, Inc.) pQE-9 contiene un gen de resistencia a ampicilina y puede transformarse dentro de E. coli cepa DH10B, disponible a partir de Life Technologies. (Véase, por ejemplo, Gruber, O E., et al., Focus 15:59-(1993)).

Los métodos pueden ser utilizados para aislar receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) aparte de la muestra depositada. Primero, la clona depositada se transforma dentro de un hospedero adecuado (tal como XL-1 Blue (Stratagene)) utilizando técnicas conocidas por los expertos en la técnica, tales como aquellas provistas por el abastecedor del vector o bien publicaciones o patentes relacionadas. Los transformantes se siembran sobre platos de agar al 1.5% (que contienen el agente de selección apropiado, por ejemplo, ampiciiina) a una densidad de aproximadamente 150 transformantes (colonias) por plato. Una colonia particular se utiliza luego para generar ADN utilizando técnicas de aislamiento de ácido núcleo bien conocidas por los expertos en la técnica. (Por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, (1989); Cold Spring Harbor Laborat ry Press). Alternativamente, dos iniciadores de 17-20 núcleotidos derivados a partir de ambos extremos de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 21 (es decir, dentro de la región de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 21 limitadas por la NT 5' y la NT 3' de la clona) se sintetizan y se utilizan para amplificar el ADN del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) utilizando el ADN plasmídico como un molde. La reacción en cadena de la polimerasa se lleva a cabo bajo condiciones rutinarias, por ejemplo, en 25 µl de mezcla de reacción con 0.5 µg del ADN molde anteriormente mencionado. Una mezcla de reacción conveniente es MgCI2 1.5-5 mM, gelatina al 0.01 % (p/v), 20 µM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 25 pmoles de cada iniciador y 0.25 Unidades de poiimerasa Taq. 35 ciclos de PCR (desnaturalización a 94 grados C por un minuto; fijación a 55 grados C por un minuto; elongación a 72 grados C por un minuto) se llevan a cabo con un termociclador Perkin-Elmer Cetus automatizado. El producto amplificado se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa y la banda de ADN con el peso molecular esperado se escinde y purifica. El producto de PCR se verifica para que sea ia secuencia seleccionada mediante subclonación y secuenciación del producto de ADN. Varios métodos están disponibles para la identificación de las porciones no codificantes 5' ó 3' del gen del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) el cual puede no estar presente en la clona depositada. Estos métodos incluyen pero no se limitan a, sonda adherida a un filtro, enriquecimiento de la clona utilizando sondas específicas, y protocolos similares o idénticos a los protocolos "RACE" 5' y 3' los cuales se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, un método similar a Race 5' esta disponible para generar el extremo faltante 5' de un transcrito deseado de longitud total. (Fromont-Racine et al., Nucleic Acids Res. 21 (7): 1683-1684 (1993)). Brevemente, un ollgonucleótido específico de ARN se liga a los extremos 5' de una población de ARN que presumiblemente contiene los transcritos de ARN del gen de longitud total. Un primer juego que contiene un iniciador específico para el oligonucieótido de ARN ligado-iniciador específico a una secuencia conocida del gen de interés del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se utiliza para amplificar mediante PCR la porción 5' del gen de longitud total del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Este producto amplificado puede entonces secuenciarse y utilizarse para generar el gen de longitud total. Este método anteriormente mencionado inicia con el aislamiento del ARN total a partir de ia fuente deseada, aunque el ARN poli-A+ puede ser utilizado. La preparación de ARN puede tratarse entonces con fosfatasa si es necesario, para eliminar los grupos fosfato 5' en el ARN degradado o dañado lo cual puede interferir posteriormente con el paso de ligación del ARN. La fosfatasa debe inactivarse luego y el ARN se trata con pirofosfatasa acida de tabaco con el objeto de remover la estructura en casquete presente en los extremos 5' de los ARN mensajeros. Esta reacción deja un grupo de fosfato 5' en el extremo 5' del ARN con casquete escindido el cual puede luego ligarse a un oligonucleótido de ARN utilizando una ARN T4 ligasa. Esta preparación de ARN modificado se utiliza como un molde para la síntesis de la primera hebra de ADNc utilizando un oligonucleótido específico del gen. La reacción de síntesis de la primera hebra se utiliza como un molde para amplificación mediante PCR del extremo 5' deseado utilizando un iniciador específico al oligonucleótido de ARN ligado y un iniciador específico a la secuencia conocida del gen de interés. El producto resultante se secuencia luego y se analiza para confirmar que la secuencia del extremo 5' pertenece al gen del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5).

EJEMPLO 6 Aislamiento de las clones enómicos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) Una genoteca genómica humana P1 (Genomic Systems, Inc.) se selecciona mediante PCR utilizando iniciadores seleccionados para la secuencia de ADN que corresponde a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 21 , de conformidad con el método descrito en el ejemplo 5. (Véase también, Sambrook).

EJEMPLO 7 Distribución en el tejido de los polipéptidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) La distribución en el tejido de la expresión del ARNm del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se determinó utilizando protocolos para análisis de Northern blot, descritos por, entre otros, Sambrook et al. Por ejemplo, una sonda del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) producida por el método descrito en el ejemplo 5 se marca con P32 utilizando el sistema de marcado de ADN rediprime™ (Amersham Life Science), de conformidad con las instrucciones del fabricante. Después de marcado, la sonda se purifica utilizando una columna de CHROMA SPIN-100™ (Clontech Laboratories, Inc.), de conformidad con el número PT1200-1 del protocolo del fabricante. La sonda marcada purificada se utiliza luego para examinar varios tejidos humanos para expresión de ARNm. Northern blots de tejidos múltiples (MTN) que contienen varios tejidos humanos (H) o tejidos del sistema inmune de humano (IM) (Clontech) de conformidad con el número de protocolo PT1190-1 del fabricante. Siguiendo a la hibridación y al lavado, los blots se montan y se exponen sobre una película a -70 grados C durante toda la noche, y las películas se desarrollan de conformidad con los procedimientos estándares.

EJEMPLO 8 Mapeo cromosomal del receptor de quimiocina de proteína G Una serie del iniciador oligonucleótido se diseña de conformidad con la secuencia en el extremo 5' de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 21. Este iniciador preferiblemente abarca aproximadamente 100 nucleótidos. Este primer iniciador se utiliza luego en una reacción en cadena de la polimerasa bajo la siguiente serie de condiciones: 30 segundos, 95 grados C; 1 minuto, 56 grados C; 1 minuto, 70 grados O Este ciclo se repite 32 veces seguido por un ciclo de 5 minutos a 70 grados C. El ADN de humano, ratón, hámster se utiliza como un molde en adición a un panel híbrido de célula somática que contiene cromosomas individuales o fragmentos de cromosomas (Bios, Inc). La reacción se analiza ya sea sobre geles de poliacrilamida al 8% o geles de agarosa al 3.5%. El mapeo cromosomal se determina mediante la presencia de un fragmento de PCR de 100 pb aproximadamente en el híbrido de célula somática particular.

EJEMPLO 9 Expresión bacteriana del receptor de quimiocina de proteína G El polinucleótido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que codifica un polipéptido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la invención se amplifica utilizando iniciadores oiigonucleótidos para PCR que corresponden a los extremos 5' y 3' de la secuencia de ADN, como se describe en el ejemplo 5, para sintetizar fragmentos de inserción. Los iniciadores utilizados para amplificar el inserto de ADNc preferiblemente deben contener sitios de restricción, tales como BamHl y Xbal, en el extremo 5' de los iniciadores con el objeto de clonar el producto amplificado dentro del vector de expresión. Por ejemplo, BamHl y Xbal conesponden a sitios para enzima de restricción en el vector de expresión bacteriano pQE-9. (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA). Este vector plasmídico codifica la resistencia al antibiótico (Ampr), un origen bacteriano de la replicación (ori), un promotor/operador regulable por IPTG (P/O), un sitio de unión al ribosoma (RBS), una marca 6-histidina (6-His), y sitios para clonación de enzimas de restricción. Ei vector pQE-9 se digiere con BamHl y Xbal y el fragmento amplificado se liga dentro del vector pQE-9 manteniendo el marco de lectura iniciado en el RBS bacteriano. La mezcla de ligación se utiliza luego para transformar E. Coii cepa M15/rep4 (Qiagen, Inc.) la cual contiene múltiples coplas del plásmldo pREP4, el cual expresa el represor lacl y también confiere resistencia a canamicina (Kan1). Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer sobre placas de LB y las colonias resistentes a ampicilina/canamicina fueron seleccionadas. El ADN plasmídico se aisló y se confirmó mediante análisis de restricción. Los clones que contenían las construcciones deseadas se crecieron durante toda la noche (O/N) en cultivo líquido en medio LB suplementado tanto con Amp (100 µg/ml) como con Kan (25 µg/ml). El cultivo O/N se utilizó para inocular un cultivo grande a una relación de 1 : 100 a 1 : 250. Las células se crecieron a una densidad óptica 600 (D.O. 60°) de entre 0.4 y 0.6. El IPTG ("Isopropil-B-D-tiogalacto piranósido) se añadió luego a una concentración final de 1 mM. El IPTG se induce mediante inactivación del represor lacl, liberando al P/O llevando a una expresión génica incrementada. Las células se crecieron por 3 a 4 horas extra. Las células se cosecharon luego mediante centrifugación (20 minutos a 6000Xg). El concentrado celular se solubiiizó en el agente caotrópico Guanidina HCl 6 Molar mediante agitación por 3-4 horas a 4 grados C. Los desechos celulares se removieron mediante centrifugación, y el sobrenadante que contenía el polipéptido se cargó sobre una columna de resina de afinidad de níquel-nitrilo-ácido tri-acético ("Ni-NTA") (disponible a partir de Qiagen, Inc., anteriormente mencionado). Las proteínas con una marca 6 x His unida a la resina Ni-NTA con alta afinidad pueden purificarse mediante un procedimiento simple de un paso (para detalles véase: The QIAexpressionist (1995) QIAGEN, Inc., anteriormente mencionado). Brevemente, el sobrenadante se carga sobre la columna en guanidina-HCI 6 M, pH 8, la columna se lava ¡nicialmente con 10 volúmenes de guanidina-HCI 6 M, pH 8, luego se lava con 10 volúmenes de guanidina- HCI 6 M pH 6, y finalmente el polipéptido se eluye con guanidina-HCI 6 M, pH 5. La proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) purificada se renaturaliza entonces mediante diálisis en contra de solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS) o regulador de pH de acetato de Na 50 mM, 6 más NaCI 200 mM. Alternativamente, la proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) puede replegarse exitosamente mientras que está inmovilizada sobre la columna de Ni-NTA. Las condiciones recomendadas son las siguientes: renaturalizar utilizando un gradiente lineal de urea 6M-1 M en NaCI 500 mM, glicerol al 20%, Tris/HCl 20 mM pH 7.4, que contiene inhibidores de proteasa. La renaturalización debe llevarse a cabo durante un periodo de 1.5 horas o más. Después de la renaturalización las proteínas se eluyen mediante ia adición de imidazol 250 mM. El imidazol se remueve mediante un paso final de diálisis en contra de PBS o regulador de pH de acetato de sodio 50 mM pH 6 más NaCI 200 mM. La proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) purificada se almacena a 4 grados C o se congela a -80 grados C.

Además del vector de expresión anteriormente mencionado, la presente invención además incluye un vector de expresión que comprende un operador fago y elementos promotores operativamente unidos a un poiinucleótido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), denominados pHE4a. (Número de acceso ATCC 209645, depositado el 25 de febrero de 1998). Este vector contiene: 1) un gen de neomicinfosfotransferasa como un marcador de selección, 2) un origen de replicación de E. coli, 3) una secuencia promotora de fago T5, 4) dos secuencias de operador lac, 5) una secuencia Shine-Delgamo, y 6) el gen del represor del operón de lactosa (laclq). El origen de replicación (oriC) se deriva a partir de pUC19 (LT1 , Gaithersburg, MD). La secuencia promotora y las secuencias del operador pueden elaborarse sintéticamente. El ADN puede insertarse dentro de pHEa mediante ia restricción del vector con Ndel y Xbal, BamHl, Xhol, o Asp718, corriendo el producto de restricción sobre un gel, y aislando el fragmento más grande (el fragmento componente debe ser de aproximadamente 310 pares de bases). El inserto de ADN se genera de conformidad con el protocolo de PCR descrito en el ejemplo 5, utilizando los iniciadores de PCR que tienen sitios de restricción para Ndel (iniciador 5') y Xbal, BamHl, Xhol, o Asp718 (iniciador 3'). El inserto de PCR se purifica mediante gel y se restringe con enzimas compatibles. El inserto y el vector se ligan de conformidad con los protocolos estándares.

El vector diseñado puede fácilmente ser sustituido en el protocolo anteriormente mencionado para expresar la proteína en un sistema bacteriano.

EJEMPLO 10 Purificación de polipéptido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) a partir de un cuerpo de inclusión El siguiente método alternativo puede ser utilizado para purificar el polipéptido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) expresado en E. coli cuando está presente en la forma de cuefos de inclusión. A menos que se especifique de otra manera, todos los siguientes pasos se conduce a 4-10 grados O Después del término de la fase de producción de la fermentación de E. coli, el cultivo celular se enfría a 4-10 grados C y las células se cosechan mediante centrifugación continua a 15,000 rpm (Heraeus Sepatech). Con base en el rendimiento esperado de proteína por unidad de peso de la pasta celular y la cantidad de proteína purificada requerida, una cantidad apropiada de pasta celular, por peso, se suspende en una solución reguladora de pH que contiene Tris 100 mM, EDTA 50 mM, pH 7.4. Las células se dispersan a una suspensión homogénea utilizando un mezclador de alto esfuerzo cortante.

Las células se lisan entonces mediante el paso de la solución a través de un microfluidizador (Microfuidics, Corp. o APV Gaulin, Inc.) dos veces a 4000-6000 psi. El homogeneizado se mezcla luego con una solución de NaCI a una concentración final de NaCI 0.5 M, seguido por centrifugación a 7000 x g por 15 minutos. El concentrado resultante se lava de nuevo utilizando NaCI 0.5 M, Tris 100 mM, EDTA 50 mM, pH 7.4. Los cuefos de inclusión lavados resultantes se solubilizan con hidrocloruro de guanidina (GuHCI) 1.5 M por 2-4 horas. Después de una centrifugación a 7000 x g por 15 minutos, el concentrado se desecha y el sobrenadante que contiene el polipéptido se incuba a 4 grados C durante toda la noche para permitir la extracción adicional mediante GuHCI. Después de la centrifugación a alta velocidad (30,000 x g) para remover las partículas ¡nsolubles, la proteína solubilizada en GuHCI se repliega mediante el mezclado rápido del extrado de GuHCI con 20 volúmenes del regulador de pH que contiene sodio 50 mM, pH 4.5, NaCi 150 mM, EDTA 2 mM mediante agitación vigorosa. La solución de proteína diluida replegada se mantiene a 4 grados C sin mezclar por 12 horas antes de llevar a cabo los pasos de purificación. Para clarificar la solución de polipéptido replegado, se empleó una unidad de filtración tangencial previamente preparada equipada con un filtro de membrana de 0.16 µm con un área de superficie apropiada (por ejemplo, Filtran), equipada con acetato de sodio 40 mM, pH 6.0. La muestra filtrada se cargó sobre una resina de intercambio catiónico (por ejemplo, Poros HS-50, Perseptive Biosystems). La columna se lava con acetato de sodio 40 mM, pH 6.0 y se eluye con NaCI 250 mM, 500 mM, 1000 mM, y 1500 mM en el mismo regulador de pH, de manera paso a paso. La absorbancia a 280 nm del efluyente se monitorea continuamente. Las fracciones se colectan y se analizan adicionalmente mediante SDS-PAGE. Las fracciones que contienen el polipéptido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se agrupan y se mezclan con cuatro volúmenes de agua. La muestra diluida se carga sobre una serie previamente preparada en tándem de columnas de resinas de intercambio de anión fuerte (Poros HQ-50, Perseptive Biosystems) y anión débil (Poros CM-20, Perseptive Biosystems). Las columnas se equilibran con acetato de sodio 40 mM, pH 6.0, NaCI 200 mM. La columna CM-20 se eluye luego utilizando un gradiente lineal de 10 volúmenes de columna con un intervalo de NaCI 0.2, acetato de sodio 50 mM, pH 6.0 a NaCI 1.0, acetato de sodio 50 mM, pH 6.5. Las fracciones se coledan bajo un monitoreo constante a A280 del efluyente. Las fracciones que contienen el polipéptido (determinado, por ejemplo, mediante SDS-PAGE al 16%) se agrupan. El polipéptido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) resultante debe exhibir una pureza mayor del 95% después del replegamiento y los pasos de purificación anteriormente mencionados. No deben observarse bandas grandes de contaminantes a partir del gel de SDS-PAGE al 16% teñido con azul Coomasie cuando se cargan 5 µg de la proteína purificada. La proteína de receptor de quimioclna de proteína G (CCR5) purificada también puede evaluarse para contaminación de endotoxina/LPS, y típicamente el contenido de LPS es menor que 0.1 ng/ml de conformidad con las pruebas LAL.

EJEMPLO 11 Clonación y expresión de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) en un sistema de expresión de baculovirus En este ejemplo, el vector plasmídico del lanzadera pA2 se utiliza para insertar el polinucleótido del Receptor de quimiocina de la proteína G (CCR5) dentro de un baculovirus para expresar el receptor de quimiocina de proteína G. Este vector de expresión contiene el promotor fuerte de polihedrina del virus de polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcMNPV) seguido por los sitios de restricción convenientes tales como BamHl, Xbal y Asp718. El sitio de polladenilación del virus 40 de simio ("SV40") se utiliza para la poliadenilación eficiente. Para ia facilidad de selección del virus recombinante, el plásmido contiene el gen de beta-galactosidasa a partir de E. coli bajo el control de un promotor débil de Drosophiia en la misma orientación, seguido por la señal de poliadenilación del gen de polihedrina. Los genes insertados están flanqueados en ambos extremos por secuencias virales de homólogos de recombinación mediados por célula con ADN de tipo silvestre para generar un virus viable que expresa el polinudeótido clonado del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5).

Muchos otros vectores de baculovirus pueden ser utilizados en lugar del vector anteriormente mencionado, tales como pAc373, pVL941 , y pAcIMI , como un experto de la técnica podría apreciar fácilmente, siempre y cuando la construcción provea señales apropiadamente localizadas para transcripción, traducción, secreción y similares, incluyendo un péptido señal y un AUG en marco como se requiera. Dichos vectores se describen, por ejemplo, en Luckow et al., Virology 170: 31-39 (1989). Específicamente, la secuencia de ADNc de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) contenida en la clona depositada, que incluye el codón de inicio AUG y cualquier secuencia líder naturalmente asociada, se amplifica utilizando el protocolo de PCR descrito en el ejemplo 5. Si la secuencia señal que ocurre naturalmente se utiliza para producir la proteína secretada, el vector pA2 no necesita un segundo péptido señal. Alternativamente, el vector puede modificarse (pA2 GP) para incluir una secuencia líder de baculovirus, utilizando los métodos estándares descritos en Summers et al., "A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures", Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555 (1987). El fragmento amplificado se aisla a partir de un gei de agarosa al 1% utilizando un equipo comercialmente disponible ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). El fragmento se digiere luego con enzimas de restricción apropiadas y se purifica de nuevo sobre un gel de agarosa al 1 %.

El plásmido se digiere con las enzimas de restricción conespondientes y opcionalmente, puede ser defosforilado utilizando fosfatasa intestinal de ternera, utilizando procedimientos rutinarios conocidos en la técnica. El ADN se aísia luego a partir de un gel de agarosa al 1% utilizando un equipo comercialmente disponible ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). El fragmento y el plásmido defosforiiado se ligan juntos con ADN T4 ligasa. E coli HB101 u otros hospederos E. coli adecuados tales como células XL-1 Blue (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) se transforman con la mezcla de liberación y se extienden sobre platos de cultivo. Las bacterias que contienen el plásmido se identifican mediante la digestión del ADN a partir de las colonias individuales y analizando el producto de digestión mediante electroforesis en gel. La secuencia del fragmento clonado se confirma mediante secuenciación del ADN. Cinco µg de un plásmido que contiene poiinucleótido se cotransfecta con 1.0 µg de un ADN de baculovirus linearizado comercialmente disponible (("BaculoGold™ baculovirus DNA", Pharmigen, San Diego, CA.) utilizando el método de lipofección descrito por Felgner, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417 (1987). Un µg de ADN del virus BaculoGold™ y 5 µg del plásmido se mezclaron en un pozo estéril de una placa de microtitulación que contenía 50 µg de medio de Grace libre de suero (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD). Después se añadieron 10 µl de Lipofectina más 90 µl de medio de Grace, se mezclaron e incubaron por 15 minutos a temperatura ambiente. Luego la mezcla de transfección se añadió gota a gota a las células de insecto Sf9 (ATCC CRL 1711) sembradas en un plato de cultivo de tejidos de 35 mm con 1 ml de medio de Grace sin suero. El plato se incubó luego por 5 horas a 27 grados C. La solución de transfección se removió luego a partir del plato y se añadió 1 ml de medio para insecto de Grace suplementado con suero de ternera fetal al 10%. El cultivo se continuó entonces a 27 grados C por cuatro días. Después de cuatro días el sobrenadante se colectó y se llevó a cabo una prueba de placa, como se describió por Summers y Smith, anteriormente mencionado. Un gel de agarosa con "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) se utilizó para permitir la facilidad de identificación y aislamiento fácil de los clones que expresaban gal, las cuales producen placas teñidas de azul. (Una descripción detallada de una "prueba de placa" de este tipo también puede encontrarse en the user's guide for insect cell culture and baculovirology distribuida por Life Technologies Inc., Gaithersburg, páginas 9-10). Después de la incubación apropiada, las placas teñidas de azul se seleccionaron con la punta de una micropipeta (Eppendorf). El agar que contenía los virus recombinantes se resuspendió luego en un tubo de microcentrífuga que contenía 200 µl de medio de Grace y la suspensión que contenía los baculovirus recombinantes se utilizó para infectar células Sf9 sembradas en platos de 35 mm. Cuatro días después los sobrenadantes de estos platos de cultivo se cosecharon y luego éstos se almacenaron a 4 grados C.

Para verificar la expresión del polipéptido, ias células Sf9 se crecieron en medio de Grace suplementado con FBS al 10% inactivado mediante calor. Las células se infectaron con el baculovirus recombinante que contenía el polinucleótido a una multiplicidad de infección (MOI) de aproximadamente 2. Si las proteínas radiomarcadas se desean, 6 horas después el medio se remueve y se reemplaza con medio SF900 menos metionina y cisteína (Life Technologies Inc., Gaithersburg). Después de 42 horas, se añaden 5 µCi de 35S-metionina y 5 µCi de 35S-cisteína (Amersham). Las células se Incuban adicionalmente por 16 horas y luego se cosechan mediante centrifugación. Las proteínas en el sobrenadante así como las proteínas intracelulares se analizan mediante SDS-PAGE seguido por auto adiografía (si están marcadas). La microsecuenciación de la secuencia de aminoácidos del extremo amino de la proteína purificada puede ser utilizada para determinar la secuencia amino terminal de la proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5).

EJEMPLO 12 Expresión del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) en células de mamífero El polipéptido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) puede ser expresado en una célula de mamífero. Un vedor de expresión de mamífero típico contiene un elemento promotor, el cual median el inicio de la transcripción del ARNm, una secuencia codificante de proteína, y señales requeridas para el término de la transcripción y la poliadenilación del transcrito. Elementos adicionales incluyen potenciadores, secuencias Kozak y secuencias interventoras flanqueadas por sitios donantes y aceptores para procesamiento de ARN. La transcripción altamente eficiente se logra con los promotores tempranos y tardíos a partir de SV40, los repetidos terminales largos (LTR) a partir de Retrovirus, por ejemplo, RSV, HTLV1 , HIVI y el promotor temprano del citomegalovirus (CMV). Sin embargo, los elementos celulares también pueden ser utilizados (por ejemplo, el promotor de actina de humano). Los vectores de expresión adecuados para uso en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, vectores tales como pSLV y pMSG (Pharmacia, Uppsala, Suecia), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2DHFR (ATCC 37146), pBC12MI (ATCC 67109), pCMVSport 2.0, y pCMVSport 3.0. Las células hospederas de mamífero que pueden ser utilizadas ¡ncluyen, Hela de humano, 293, células H9 y Jurkat, NIH3T3 de ratón y células C127, Cos 1 , Cos 7 y CV1 , células QC1-3 de codorniz, células L de ratón y células de ovario de hámster chino (CHO). Alternativamente, el polipéptido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) puede ser expresado en líneas celulares estables que contienen el polinucleótido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) integrado dentro de un cromosoma. La cotransfección con un marcador de selección tal como DHFR, gpt, neomicina, higromicina permite la identificación y aislamiento de las células transfectadas. El gen dei receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) transfectado también puede amplificarse para que exprese grandes cantidades de la proteína codificada. El marcador DHFR (dihidrofolato reductasa) es útil para desarrollar líneas celulares que portan varios cientos o incluso varios miles de copias del gen de interés. (Véase, por ejemplo, Alt, F. W., et al., J. Biol. Chem. 253: 1357-1370 (1978); Hamlin, J. L. y Ma, C, Biochem. et Biophys. Acta, 1097: 107-143 (1990); Page, M. J. y Sydenham, M. A., Biotechnology 9: 64-68 (1991 )). Otro marcador de selección útil es la enzima glutamina sintasa (GS) (Mufhy et al., Biochem J. 227:277-279 (1991 ); Bebbington et al., Bio/Technology 10: 169-175 (1992). Utilizando estos marcadores, las células de mamífero se crecen en medio de selección y se seleccionan las células con la mayor resistencia. Estas líneas celulares contienen el gen(es) amplificado integrado dentro de un cromosoma. Las células de ovario de hámster chino (CHO) y NSO frecuentemente se utilizan para la producción de proteínas. Los derivados del plásmido pSV2-DHFR (número de acceso ATCC 37146), los vectores de expresión pC4 (número de acceso ATCC 209646) y pC6 (número de acceso ATCC 209647) contienen el promotor fuerte (LTR) del virus del sarcoma de Rous (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-447 (marzo, 1985)) más un fragmento del potenciador CMV (Boshart et al., Cell 41 : 521-530 (1985)). Los sitios de clonación múltiple, por ejemplo, con los sitios de escisión de la enzima de restricción BamHl, Xbal y Asp718, facilitan la clonación del receptor de quimiocina de proteína G. Los vectores también contienen el intrón 3', la señal de poliadenilación y señal de terminación del gen de preproinsulina de rata, y el gen DHFR de ratón bajo el control del promotor temprano de SV40. Específicamente, el plásmido pC6 o pC4 se digiere con enzimas de restricción que cortan dentro del sitio de clonación múltiple y luego se defosforila utilizando fosfatasa intestinal de ternera mediante procedimientos conocidos en la técnica. El vector se aisla luego a partir de un gel de agarosa al 1 %. El vector puede ser modificado para incluir una secuencia señal heterogénea en un esfuerzo para secretar la proteína a partir de la célula. (Véase, por ejemplo, WO 96/34891). El fragmento amplificado se digiere luego con enzimas de restricción que generan los extremos complementarios a aquellos del vector digerido y se purifican sobre un gel de agarosa al 1 % utilizando un equipo comercialmente disponible ("Geneclean", BIO Inc., La Joya, Ca.). El fragmento aislado y el vector defosforiiado se ligan entonces con ADN T4 ligasa. Células E. coli HB101 o XL-1 Blue se transforman luego y se identifican las bacterias las cuales contienen el fragmento insertado dentro dei plásmido pC6 o pC4 utilizando, por ejemplo, análisis por enzima de restricción. Las células de ovario de hámster chino que carecen de un gen DHFR activo se utilizan para transfección. Cinco µg del plásmido de expresión pC6 o pC4 se cotransfectan con 0.5 µg del plásmido pSVneo utilizando lipofectina (Felgner et al., anteriormente mencionado). El plásmldo pSV2-neo contiene un marcador de selección dominante, el gen neo a partir de Tn5 que codifica una enzima que confiere resistencia a un grupo de antibióticos incluyendo G418. Las células se siembran en MEM menos alfa suplementado con 1 mg/ml de G418. Después de dos días, las células se tripsinizan y se siembran en placas de clonación para hibridoma (Greiner, Alemania) en MEM menos alfa suplementado con 10, 25, o 50 ng/ml de metotrexato más 1 mg/ml de G418. Después de aproximadamente 10-14 días los clones particulares se tripsinizan y luego se siembran en cajas de Petri de 6 pozos o en botellas de 10 ml utilizando concentraciones diferentes de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Las zonas creciendo a las mayores concentraciones de metotrexato se transfieren entonces a cajas nuevas de 6 pozos que contienen incluso concentraciones superiores de metotrexato (1 µM, 2 µM, 5 µM, 10 µM, 20 µM). El mismo procedimiento se repite hasta que se obtienen los clones que crecen a una concentración de 100 - 200 µM. La expresión del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se analiza, por ejemplo, mediante SDS-PAGE y Western blot o mediante análisis de HPLC de fase reversa.

EJEMPLO 13 Construcción de mutantes con deleción N-terminal y/o C-terminal El siguiente método general puede ser utilizado para clonar un mutante de deleción del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) con deleción N-terminai o C-terminal. Generalmente, dos iniciadores oligonucleótidos de aproximadamente 15-25 nucleótidos se derivan a partir de las posiciones 5' ó 3' deseadas de un polinucleótido de SEQ ID NO: 1 o de la clona depositada (SEQ ID NO: 21). Las posiciones 5' y 3' de dos iniciadores están determinadas basándose en el fragmento deseado del pollnucleótido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Un codón de inicio y de paro se añaden a ios iniciadores 5' y 3' respectivamente, si es necesario, para expresar el fragmento del polipéptido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) codificado por el fragmento polinucleótido. Los fragmentos polinucleótidos preferidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) son aquellos que codifican a los mutantes de deleción N-terminal y C-terminal descritos anteriormente en la sección "polinucleótido y fragmentos polipeptídicos" de ia especificación. Los nucieótidos adicionales que contienen sitios de restricción para facilitar la clonación del fragmento polinucleótido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) en un vector deseado también pueden ser añadidos a las secuencias iniciadoras 5' y 3'. El fragmento polinucleótido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se amplifica a partir del ADN genómico o a partir de la clona de ADNc depositada utilizando los iniciadores oligonucleótidos para PCR apropiados y las condiciones discutidas en ia presente invención o conocidas en la técnica. Los fragmentos polipéptidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) codificados por los fragmentos pollnucleótidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de la presente invención pueden expresarse y purificarse de la misma manera general que los polipéptidos de longitud total, aunque las modificaciones rutinarias pueden ser necesarias debido a las diferencias en las propiedades químicas y físicas entre un fragmento particular y un polipéptido de longitud total. Como un modo de ejemplificar pero no de limitar la presente invención, el polinucleótido que codifica el fragmento polipeptídico del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) Y-37 a Q-280 se amplifica y se clona como sigue: un Iniciador 5' se genera comprendiendo un sitio de enzima de restricción seguido por un codón de inicio en marco con la secuencia polinucleotídica de codifica la porción N-terminal del fragmento polipeptídico que inicia con Y-37. Se genera un iniciador complementario 3' comprendiendo un sitio de enzima de restricción seguido por un codón de paro en marco con ia secuencia poiinucieotídica que codifica la porción C-terminal del fragmento polipeptídico del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) finalizando con Q-280. El fragmento polinucleotídico amplificado y el vedor de expresión se digieren con enzimas de restricción las cuales reconocen los sitios en los iniciadores. Luego los polinucleótidos digeridos se ligan juntos. El fragmento polinucleotídico del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se inserta dentro del vector de expresión restringido, preferiblemente de manera que se coloca a la región codificante del fragmento polipeptídico del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) hacia el extremo 3' a partir del promotor. La mezcla de ligación se transforman dentro de células E. coli competentes utilizando procedimientos estándares y como se describe en los ejemplos en la presente invención. El ADN plasmídico se aisla a partir de colonias resistentes y la identidad del ADN clonado se confirma mediante análisis de restricción, PCR y secuenciación del ADN.

EJEMPLO 14 Proteína de fusión del receptor de quimiocina de proteína G Los polipéptidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) preferiblemente se fusionan a otras proteínas. Estas proteínas de fusión pueden ser utilizadas para una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, la fusión de los poiipéptidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) a una marca His, marca HA, proteína A, dominios IgG, y proteína G de unión a maltosa facilitan la purificación. (Véase Ejemplo 9; véase también EP A 394, 827; Traunecker, et al., Nature 331 : 84-86 (1988)). Similarmente, la fusión a lgG-1 , lgG-3, y albúmina incrementa el tiempo de vida media in vivo. Las señales de localización nuclear fusionadas a los polipéptidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) pueden dirigir la proteína a una localización subcelular específica, mientras que heterodímeros y homodímeros covalentes pueden incrementar o disminuir la actividad de una proteína de fusión. Las proteínas de fusión también pueden crear moléculas quiméricas teniendo más de una función. Finalmente, las proteínas de fusión pueden incrementar la solubilidad y/o estabilidad de la proteína fusionada en comparación con la proteína no fusionada. Todos los tipos de proteínas de fusión descritas anteriormente pueden elaborarse mediante la modificación del siguiente protocolo, el cual esboza la fusión de un polipéptido a una molécula IgG, mediante el protocolo descrito en el Ejemplo 9. Brevemente, la porción Fc de humano de la molécula IgG puede ser amplificada mediante PCR, utilizando iniciadores que abarcan los extremos 5" y 3' de la secuencia descrita a continuación. Estos iniciadores también deben tener sitios convenientes para enzima de restricción que facilitarán la clonación dentro de un vector de expresión, preferiblemente un vector de expresión de mamífero. Por ejemplo, si se utiliza pC4 (número de acceso 209646), la porción Fc de humano puede ligarse dentro del sitio de clonación de BamHl. Nótese que el sitio BamHl 3' debe ser destruido. A continuación, el vector que contiene la porción Fc de humano se somete de nuevo a restricción con BamHl, linearizando el vector, y se aisla el poiinucleótido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), mediante el protocolo de PCR descrito en el Ejemplo 5, y se liga dentro de este sitio BamHl. Nótese que el polinucleótido se clona sin un codón de paro, de otra manera no se produciría una proteína de fusión. Si la secuencia señal que ocurre naturalmente se utiliza para producir la proteína secretada, pC4 no necesita un segundo péptido señal. Alternativamente, si la secuencia señal que ocurre naturalmente no se utiliza, el vector puede modificarse para incluir una secuencia señal heteróloga. (Véase, por ejemplo, WO 96/34891 ).

Región Fc de IgG de humano: GGGATCCGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGC CCAGCACCTGAATTCGAGGGTGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAA ACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACTCCTGAGGTCACATGCGTGG TGGTGGACGTAAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTG GACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGT ACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGAC TGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCC AACCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAAC CACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAG GTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCAAGCGACATCGCCGT GGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCT CCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGT GGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATG CATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCC GGGTAAATGAGTGCGACGGCCGCGACTCTAGAGGAT (SEQ ID NOMO) EJEMPLO 15 Producción de un anticuerpo Tecnología de hibridoma Los anticuerpos de la presente invención pueden prepararse mediante una variedad de métodos. (Véase, Current Protocols, capítulo 2). Como un ejemplo de dichos métodos, las células que expresan el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se administran a un animal para inducir la producción de suero que contiene anticuerpos policlonales. En un método preferido, una preparación de proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se prepara y purificar para hacerla sustancialmente libre de contaminantes naturales. Dicha preparación se introduce luego dentro de un animal con el objeto de producir antisuero policlonal de mayor actividad específica. Los anticuerpos monoclonales específicos para proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se preparan utilizando tecnología de hibridoma. (Kohier et al., Nature 256:495 (1975); Kohier et al., Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); Kohier et al., Eur. J. Immunol. 6: 292 (1976); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-681 (1981 )). En general, un animal (preferiblemente un ratón) se inmuniza con polipéptido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o, más preferiblemente con una célula que expresa polipéptido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Dichas células que expresan el polipéptido se cultivan en cualquier medio de cultivo de tejidos adecuado, preferiblemente en medio Eagle modificado por Earle suplementado con 10% de suero bovino fetal (inactivado a aproximadamente 56°C), y suplementado con aproximadamente 10 g/i de aminoácidos no esenciales, aproximadamente 1 ,000 U/ml de penicilina, y aproximadamente 100 µg/ml de estreptomicina. Los esplenocltos de dicho ratón y se extraen y se fusionan con una línea celular adecuada de mieloma. Cualquier línea celular adecuada de mieloma puede emplearse de conformidad con la presente invención; sin embargo, se prefiere emplear la línea celular parental de mieloma (SP2O), disponible a partir de ATCC. Después de la fusión, las células de hibridoma resultantes se mantiene selectivamente en medio HAT, y luego se clonan mediante dilución limitante como se describe por Wands et al. (Gastroenterology 80:225-232 (1981 )). Las células de hibridoma obtenidas a través de dicha selección se prueban para identificar clones que secretan anticuerpos capaces de unirse al poiipéptido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Alternativamente, los anticuerpos adicionales capaces de unirse al polipéptido dei receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) pueden producirse en un procedimiento de dos pasos utilizando anticuerpos anti-¡diotípicos. Dicho método hace uso del hecho de que los anticuerpos son por sí mismos antígenos, y por lo tanto, es posible obtener un anticuerpo el cual se una a un segundo anticuefo. De conformidad con este método, los anticuerpos específicos a proteína se utilizan para inmunizar un animal, preferiblemente un ratón. Los esplenocitos de dicho animal se utilizan entonces para producir células de hibridoma, y las células de hibridoma se seleccionan para identificar clones las cuales producen un anticuerpo cuya habilidad para unirse al anticuerpo específico de proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) puede bloquearse por un receptor de quimiocina de proteína G. Dichos anticuerpos comprenden anticuefos antiidiotípicos para el anticuerpo específico a la proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) y son utilizados para inmunizar un animal para inducir la formación de anticuerpos adicionales específicos a la proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Para uso in vivo de anticuerpos en humanos, un anticuerpo se "humaniza". Dichos anticuefos pueden producirse utilizando construcciones genéticas derivadas a partir de células de hibridoma que producen los anticuefos monoclonales descritos anteriormente. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos y humanizados se conocen en la técnica y se discuten en la presente invención. (Véase, para revisión, Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4: 214 (1986); Cabiliy et al., patente de E.U.A. número 4, 816, 567; Taniguchi et al., EP 171496; Morrison et al., EP 173494; Neuberger et al., WO 8601533; Robinson et al., WO 8702671 ; Bouiianne et al., Nature 312:643 (1984 ); Neuberger et al., Nature 314: 268 (1985)).

Aislamiento de fragmentos de anticuerpo dirigidos contra el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) a partir de una genoteca de scFvs Los genes V que ocunen de manera natural aislados a partir de PBL de humano se construyen dentro de una genoteca de fragmentos de anticuerpo la cual contiene reactividades contra el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) a la cual el donante puede o no haber sido expuesto (por ejemplo, patente de E.U.A. 5, 885, 793 incorporada dentro de la presente como referencia en su totalidad). Rescate de la genoteca. Una genoteca de scFvs se construye a partir del ARN de PBL de humano como se describe en la publicación PCT WO 92/01047 para rescatar fragmentos del anticuerpo que exhiben al fago, aproximadamente 109 E. coli que contienen el fagémido se utilizan para inocular 50 ml de TY 2x que contiene glucosa al 1% y 100 µg/ml de ampicilina (TY 2x-AMP-GLU) y se crece a una D.O. de 0.8 con agitación. Cinco ml de este cultivo se utilizan para inocular 50 ml de TY 2x-AMP-GLU, 2 x 108 TU del gen 3 delta auxiliar (gen III delta M13, véase publicación PCT WO 92/01047) se añaden y el cultivo se incuba a 37°C por 45 minutos con agitación. El cultivo se centrifuga a 4000 r.p.m. por 10 minutos y el concentrado se resuspende en 2 litros de TY 2x que contiene 100 µg/ml de amplcilina y 50 µg/ml de canamicina y se crece durante toda la noche. Los fagos se preparan como se describe en la publicación PCT WO 92/01047.

El gen lll delta M13 se prepara como sigue: el fago auxiliar del gen lll delta M13 no codifica ia proteína del gen lll, por lo tanto los fragmentos del anticuerpo que exhiben al fago (a crecimiento logarítmico medio) tienen una mayor avidez de unión al antígeno. Las partículas infecciosas del gen lll delta M13 se elaboran mediante crecimiento del fago auxiliar en las células que contienen un derivado de pUC19 que abastece de la proteína del gen lll de tipo silvestre durante la morfogénesis del fago. El cultivo se incuba por 1 hora 37°C sin agitación y luego por una hora adicional a 37°C con agitación. Las células se centrifugan (lEC-Centra 8,400 r.p.m. por 10 minutos), se resuspenden en 300 ml de caldo TY 2x que contiene 100 µg de ampicilina/ml y 25 µg de canamicina/ml (TY 2x-AMP-KAN) y se crece durante toda la noche, con agitación a 37°C. Las partículas del fago se purifican y se concentran a partir del medio de cultivo mediante dos precipitaciones en PEG (Sambrook et al., 1990), se resuspenden en 2 ml de PBS y se pasan a través de un filtro de 0.45 µm (Ministart NML; Sartorius) para dar una concentración final de aproximadamente 1013 unidades de transduccción/ml (clones resistentes a ampicilina). Selección no específica de la genoteca. Los inmunotubos (Nunc) se cubrieron durante toda la noche en PBS con 4 ml ya sea de 100 µg/ml o 10 µg/ml de un polipéptido de la presente invención. Los tubos se bloquearon con Marvel al 2%-PBS por dos horas a 37°C y luego se lavaron 3 veces en PBS. Aproximadamente 1013 TU del fago se aplica al tubo y se Incuba por 30 minutos a temperatura ambiente mezclando hacia adelante y hacia atrás en una mezcladora y luego dejando reposar por otras 1.5 horas. Los tubos se lavaron 10 veces con PBS-Tween 20 al 0.1% y 10 veces con PBS. El fago se eluyó mediante la adición de 1 ml de trietilamina 100 mM y rotando 15 minutos hacia adelante y hacia atrás en una agitadora después de lo cual la solución se neutraliza inmediatamente con 0.5 ml de Tris-HCl 1.0 M, pH 7.4. El fago se utiliza luego para infectar 10 ml de E. coli TGI a crecimiento logarítmico medio mediante la incubación del fago eluído con la bacteria por 30 minutos a 37°C. La E. coli se coloca luego sobre platos de TYE que contienen glucosa al 1 % y 100 µg/ml de ampiciiina. La genoteca bacteriana resultante se rescata entonces con fago auxiliar del gen 3 delta como se describe anteriormente para preparar el fago para una ronda subsecuente de selección. Este procedimiento se repite luego por un total de cuatro rondas de purificación por afinidad con lavado a los tubos incrementado a 20 veces con PBS, Tween 20 al 0.1 % y 20 veces con PBS por 3 y 4 rondas. Caracterización de los adaptadores. El fago eluído a partir de la 3a y 4a rondas de selección se utiliza para infectar E. coli HB 2151 y se produce scFv soluble (Marks, et al., 1991) a partir de colonias particulares para prueba. El Se lleva a cabo una prueba de ELISA con placas de microtitulación recubiertas con 10 pg/ml del polipéptido de la presente invención en 50 mM de bicarbonato pH 9.6. Los clones positivos en el ELISA se caracterizan adicionalmente mediante "huellas dactilares" dei PCR (véase, por ejemplo, publicación PCT WO 92/01047) y luego mediante secuenciación. Los clones positivos al ELISA también pueden caracterizarse adicionalmente mediante técnicas conocidas en la técnica, tales como, por ejemplo, mapeo del epítope, unión por afinidad, transduccción de la señal por receptor, capacidad de bloquear o inhibir competitivamente la unión al anticuerpo/antígeno, y actividad agonística o antagonística competitiva.

EJEMPLO 16 Producción de proteína o ligando del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) para pruebas de selección de alta resolución El siguiente protocolo produce un sobrenadante que contiene un polipéptido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o un ligando del Receptor quimiocina de proteína G (CCR5) a ser evaluado. Los ligados del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) incluyen MlP-1a, MIP-1ß, MCP-1 , MCP-2, MCP-3, MCP-4, Exotaxina, RANTES, y VIH. Este sobrenadante puede ser utilizado en las pruebas de selección descritos en los ejemplos 18-25. Primero, se diluye la solución de almacenamiento de Poli-D-Lisina (644 587 Boheringer Mannheim) (1 mg/ml en PBS) 1 : 20 en PBS (c/s calcio o magnesio 17-516F Biowhittaker) para una solución de trabajo de 50 µg/ml. Añadir 200 µl de esta solución a cada pozo (placas de 24 pozos) e incubar a TA por 20 minutos. Asegurarse de distribuir la solución sobre cada pozo (nota: una pipeta de 12 canales puede ser utilizada con puntas en cada otro canal). Aspirar la solución de Poli-D-Lisina y enjuagar con 1 ml de PBS (solución salina regulada en su pH con fosfato). El PBS debe permanecer en el pozo justo antes de sembrar las células y las placas pueden estar recubiertas con poli-lisina anteriormente por hasta dos semanas. Sembrar las células 293T (no trabajar con células después de P+20) a 2 x 105 células/pozo en .5 ml de DMEM (medio Eagle modificado por Dulbecco) (con 4.5 G/L de glucosa y L-glutamina (12-604F Biowhittaker))/FBS inactivado con calor al 10% (14-503F Biowhittaker)/Penstrep 1x (17-602E Biowhittaker). Dejar crecer las células durante toda la noche. Al día siguiente, mezclar juntos en una vasija para solución estéril: 300 µl de lipofectamina (18324-012 Gibco/BRL) y 5 ml de Optimem I (31985070 Gibco/BRL)/placa de 96 pozos. Con una pipeta de multicanales de volumen pequeño, alicuotar aproximadamente 2 µg de un vector de expresión que contiene un inserto polinucleótido, producido por los métodos descritos en los ejemplos 8-10, dentro de una placa de 96 pozos con fondo redondo apropiadamente marcada. Con una pipeta de multicanal, añadir 50 µl de la mezcla Lipofectamina/Optimem I a cada pozo. Verter y mezclar lentamente. Incubar a TA 15-45 minutos. Después de aproximadamente 20 minutos, utilizar una pipeta de multicanal para añadir 150 µl de Optimem I a cada pozo. Como un control, una placa del ADN vector que carece de un inserto debe transfectarse con cada serie de transfecciones. Preferiblemente, la transfección debe llevarse a cabo mediante un equipo de trabajo en las siguientes pruebas. Mediante equipo de trabajo, el tiempo de trabajo se reduce a la mitad, y las células no pasan mucho tiempo en PBS. Primero, la persona A aspira el medio a partir de las placas de 24 pozos de las células, y luego la persona B enjuaga cada pozo con .5-1 ml de PBS. La persona A entonces aspira el PBS de enjuague, y la persona B, utilizando una pipeta de 12 canales con puntas en cada otro canal, añade los 200 µl del complejo ADN/Lipofectamina/Optimem I a los pozos impares primero, luego a los pozos pares, a cada hilera de las placas de 24 pozos. Incubar por 6 horas a 37°C. Mientras que las células se incuban, preparar el medio apropiado, ya sea BSA al 1 % en DMEM con penstrep 1x, o medio HGS CHO-5 (116. 6 mg/L de CaCl (anhidro);0.00130 mg/L de CuS04-5H20; 0.050 mg/L de Fe(N03)3-9H20; 0.417 mg/L de FeS04-7H20; 311.80 mg/L de KCl; 28.64 mg/L de MgCI2; 48.84 mg/L de MgS04; 6995.50 mg/L de NaCI; 2400.0 mg/L de NaHCO3; 62.50 mg/L de NaH2PO4-H2O; 71.02 mg/L de Na2HPO4; .432 mg/litro de ZnSO4-7H20; .002 mg/litro de Acido Araquidónico; 1.022 mg/L de Colesterol; .070 mg/L de DL-alfa-Tocoferol-Acetato; 0.0520 mg/litro de Acido Linoleico; 0.010 mg/L de Acido Linoienico; 0.010 mg/L de Acido Mirístico; 0.010 mg/L de Acido Oleico; 0.010 mg/L de Acido Palmítrico; 0.010 mg/L de Acido Palmítico; 100 mg/L de Pluronic F-68; 0.010 mg/L de Acido Esteárico; 2.20 mg/L de Tween 80; 4551 mg/L de D-Glucosa; 130.85 mg/ml de L-Alanina; 147.50 mg/ml de L-Arglnina-HCI; 7.50 mg/ml de L-Asparagina-H20; 6.65 mg/mi de Acido L-Aspártico; 29.56 mg/ml de L-Cisteína-2HCI-H20; 31.29 mg/ml de L-Cisteína-2HCI; 7.35 mg/ml de Acido L-Glutámico; 365.0 mg/ml de L-Glutamina; 18.75 mg/ml de Glicina; 52.48 mg/ml de L-Histidina-HCI-H20; 106.97 mg/ml de L-lsoleucina; 111.45 mg/ml de L-Leucina; 163.75 mg/ml de L-Lisina HCl; 32.34 mg/ml de L-Metionina; 68.48 mg/ml de L-Fenllalanina; 40.0 mg/ml de L-Prolina; 26.25 mg/ml de L-Serina; 101.05 mg/ml de L-Treonina; 19.22 mg/ml de L-Triptofano; 91.79 mg/ml de L-Tirosina-2Na-2H20; y 99.65 mg/ml de L-Valina; 0.0035 mg/L de Biotina; 3.24 mg/L de D-Ca Pantotenato; 11.78 mg/L de Cloruro de Colina; 4.65 mg/L de Acido Fólico; 15.60 mg/L de i-Inositol; 3.02 mg/litro de Niacinamida; 3.00 mg/L de Piridoxai HCl; 0.031 mg/L de Piridoxina HCl; 0.365 mg/L de Timidina; 0.680 mg/L de Vitamina B12; 25 mM de regulador de pH HEPES; 2.39 mg/L de Hipoxantina sódica; 0.105 mg/L de Acido Lipoico; 0.081 mg/L de Putrescina sódica-2HCI; 55.0 mg/L de Piruvato de Sodio; 0.0067 mg/L de Selenita Sódica; 20 µM de Etanolamina; 0.122 mg/L de Citrato Férrico; 41.70 mg/litro de Metil-B-Ciclodextrina en complejo con Acido Linoleico; 33.33 mg/L de Metil-B-Ciclodextrina en complejo con Acido Oleico; 10 mg/L de Metil-B-Ciclodextrina en complejo con Acetato de Retinal. Ajustar la osmolaridad a 327 mOsmlos) con glutamina 2 mM y penstrep 1x. (BSA (81-068-3 Bayer) 100 gm disueltos en 1 L de DMEM para una solución de almacenamiento con BSA al 10%). Filtrar el medio y colectar 50 µl para la prueba de endotoxina en un tubo cónico de poliestireno de 15 ml. La reacción de transfección se termina, preferiblemente mediante un equipo de trabajo, al fin del periodo de incubación. La persona A aspira el medio de transfección, mientras que la persona B añade 1.5 ml de medio apropiado a cada pozo. Incubar a 37 grados C por 45 o 72 horas dependiendo del medio utilizado: BSA al 1% por 45 horas o CHO-5 por 72 horas. Al día cuatro, utilizando una pipeta multicanal de 300 µl, poner alícuotas de 600 µl en una placa con pozos de 1 ml de profundidad y el sobrenadante restante dentro de un pozo de 2 ml de profundidad. Los sobrenadantes a partir de cada pozo pueden ser utilizados en las pruebas descritas en los ejemplos 18-25. Se entiende específicamente que cuando la actividad se obtiene en cualesquiera de las pruebas descritas a continuación utilizando un sobrenadante, la actividad se origina a partir de ya sea el polipéptido del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) directamente (por ejemplo, como una proteína secretada, soluble, o proteína asociada de membrana) a partir del ligando del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) directamente, o mediante la expresión inducida por el ligando del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) de otras proteínas, las cuales se secretan luego dentro del sobrenadante. Por lo tanto, la invención provee adicionalmente un método para identificar la proteína en el sobrenadante caracterizado mediante una actividad en una prueba particular.

EJEMPLO 17 Construcción de una construcción reportera GAS Una vía de transfección de la señal implicada en la diferenciación y proliferación de las células se denomina la vía Jaks-STAT. Las proteínas activadas en la vía Jaks-STAT se unen a elementos "GAS" de sitios de activación gamma o elementos que responden mediante sensibilidad al interferón ("ISRE"), localizados en el promotor de muchos genes. La unión de una proteína a estos elementos altera ia expresión del gen asociado. Los elementos GAS e ISRE se reconocen por una clase de factores de transcripción denominados Transductores de Señal y Activadores de la Transcripción o "STAT". Estos son seis miembros de la familia STAT. Stat 1 y Stat3 están presentes en muchos tipos celulares, tal como Stat2 (como la respuesta a IFN-alfa está ampliamente extendida). Stat4 está más restringido y no se encuentra en muchos tipos celulares a pesar de que se ha encontrado en la clase I de células auxiliares T, después del tratamiento con 1L-12. Statd originalmente se denominó factor de crecimiento de mamífero, pero se ha encontrado a concentraciones más altas en otras células incluyendo céiulas mieioldes. Este puede ser activado en células en cultivo de tejidos por varias citocinas. Los STAT se activan para translocarse a partir del citoplasma hacia el núcleo después de la fosforilación de la tirosina mediante una serie de cinasas conocidas como la familia Janus de Cinasa ("Jaks"). Jaks representa una familia distinta de tirosin cinasas solubles e incluye Tyk2, Jak1 , Jak2, y Jak3. Estas cinasas exhiben similitud de secuencia significativa y generalmente están inactivas catalíticamente en células en reposo. Los Jaks se activan mediante un amplio intervalo de receptores resumidos en el cuadro 3 a continuación. (Adaptado a partir de la revisión por Schidler y Darnell, Ann. Rev. Biochem. 64: 621-51 (1995)). Una familia dei receptor de citocina, capaz de activar a Jaks, está dividida en dos grupos: (a) la Clase 1 incluye lo receptores para IL-2, iL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11 , IL-12, IL-15, Epo, PRL, GH, G-CSF, GM-CSF, LIF, CNTF, y trombopoietina; y (b) la Clase 2 incluye a IFN-a, IFN-g, e IL-10. Los receptores de la Clase 1 comparten un motivo conservado de cisteína (una serie de cuatro cisteínas conservadas y un triptofano) y un motivo WSXWS (una región proximal de membrana que codifica Trp-Ser-Xxx-Trp-Ser (SEQ ID NO: 11 )). Por lo tanto, durante la unión de un ligando a un receptor, los Jaks se activan, lo cual a su vez activa a STAT, los cuales entonces se translocan y se unen a los elementos GAS. Este procedimiento total está abarcado en la vía de transfección de la señal tipo Jaks-STAT. Por lo tanto, la activación de la vía Jaks-STAT, reflejada por la unión del elemento GAS o del elemento ISRE, puede ser utilizada para indicar a las proteínas implicadas en la proliferación y diferenciación de las células. Por ejemplo, factores de crecimiento y citocinas que se sabe que activan la vía Jaks-STAT. (Véase cuadro 3 a continuación). Por lo tanto, mediante el uso de los elementos GAS unidos a moléculas reporteras, los activadores de la vía Jaks-STAT pueden ser identificados.

CUADRO 3 JAKs STATS (Elementos) GAS o ISRE Ligando tyk2 jakl jak2 jak3 Familia IFN IFN-a/B + + - - 1 ,2,3 ISRE IFN-g + + - 1 GAS(IRF1>Lys6>IFP) 11-10 + ? ? - 1 ,3 Familia gp130 IL-6 (Pleiotróico) + + + ? 1 ,3 IL-11(Pleiotróico) ? + ? ? 1 ,3 OnM(Pleiotróico) ? + + ? 1 ,3 LIF (Pleiotróico) ? + + ? 1 ,3 CNTF(Pleiotróico) -/+ + + ? 1,3 G-CSF ? + ? ? 1 ,3 (Pleiotróico) IL-12 (Pleiotróico) + - + + 1 ,3 Familia g-C IL-2 (linfocitos) + - + 1 ,3,5 GAS IL-4 + - + 6 GAS(IRF1=IFP»Ly6)(lgH) (linfocito/mieloide) IL-7 (linfocitos) + - + 5 GAS IL-9 (iinfocitos) + - + 5 GAS IL-13 (linfocito) + ? ? 6 GAS IL-15 + ? + 5 GAS Familia gp140 IL-3 (mieloide) + - 5 GAS(IRF1 >IFP»Ly6) IL-5 (mieloide) + - 5 GAS GM-CSF + - 5 GAS (mieloide) Familia de la hormona de crecimiento GH ? - + 5 PRL ? +/- + 1 ,3,5 EPO ? + 5 GAS(B- ' CAS>IRF1 =IFP»Ly6) Receptor Ti rosin Cinasas EGF ? + + 1 ,3 GAS (IRF1) PDGF ? + + 1 ,3 CSF-1 ? + + 1 ,3 GAS (no lRFI) Para construir un elemento promotor que contiene un GAS sintético, el cual se utiliza en los Ensayos Biológicos descritos en los ejemplos 18-19, una estrategia basada en PCR se empleó para generar una secuencia promotora GAS-SV40. El iniciador hacia 5' contiene cuatro copias en tándem para el sitio de unión a GAS encontrado en el promotor IRF1 y que previamente ha demostrado que se une a STAT después de la inducción con varias citocinas (Rothman et al., Immunity 1 : 457-468 (1994).), aunque otros elementos GAS o ISRE pueden ser utilizados en su lugar. El iniciador hacia 5' también contiene 10 pb de una secuencia complementaria a la secuencia del promotor temprano de SV40 y está flanqueada con un sitio Xhol. La secuencia del iniciador hacia 5' es: d^GCGCCTCGAGATTTCCCCGAAATCTAGATTTCCCCGAAATCTAGATTTC CCCGAAATGATTTCCCCGAAATGATTTCCCCGAAATATCTGCCATCTCAAT TAG:3' (SEQ ID NO: 12) El iniciador hacia ei extremo 3' es complementario al promotor SV40 y está flanqueado con un sitio Hind lll: d': GCGGCAAGC I I I I I GCAAAGCCTAGGC:3' (SEQ DI NO: 13) La amplificación mediante PCR se lleva a cabo utilizando el molde del promotor SV40 presente en el plásmido B-gal:promotor obtenido a partir de Clontech. El fragmento de PCR resultante se digiere con Xhol/Hind lll y se subclona dentro de BLSK2-. (Stratagene). La secuenciación con iniciadores hacia adelante y reversos confirma que el inserto contiene la siguiente secuencia: 5':C ^S ATTTCCCCGAAATCTAG ATTTCCCCGAAATGATTTCCCCG AAA TGATTTCCCCGAAATATCTGCCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCG CCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATT CTCCGCCCCATGGCTGACTAA l i l i l í TTATTTATGCAGAGGCCGAGGCC GCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGC l i l i l í GGAG GCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTT:3' (SEQ ID NO: 14) Con este elemento promotor GAS unido al promotor SV40, una construcción reportera GAS:SEAP2 se diseña a continuación. Por lo tanto, la molécula reportera es una fosfatasa alcalina secretada, con "SEAP". Claramente, sin embargo, cualquier moléculas reportera puede ser utilizada en lugar de SEAP, en éste o cualesquiera de los otros Ejemplos. Las moléculas reporteras bien conocidas que pueden ser utilizadas en lugar de SEAP incluyen cloramfenicol acetiltransferasa (CAT), luciferasa, fosfatasa alcalina, B-galactosidasa, proteína fluorescente verde (GFP), o cualquier proteína detectable mediante un anticuerpo. La secuencia anteriormente mencionada con un elemento promotor GAS-SV40 sintético confirmado se subclonó dentro del vector pSEAP-Promotor obtenido a partir de Clontech utilizando Hindlll y Xhol, reemplazando efectivamente el promotor SV40 con el elemento promotor GAS:SV40 amplificado, para crear el vector GAS-SEAP. Sin embargo, este vector no contiene un gen de resistencia a neomicina, y por lo tanto, no se prefiere para sistemas de expresión en mamífero. Por lo tanto, con el objeto de generar una línea celular estable de mamífero que expresa el reportero GAS-SEAP, el cassette GAS-SEAP se removió a partir del vector GAS-SEAP utilizando Salí y Notl, e insertando dentro un vector de estructura base que contiene el gen de resistencia a neomicina, tal como pGFP-1 (Clontech), utilizando estos sitios de restricción en el sitio de clonación múltiple, para crear el vector GAS-SEAP/Neo. Una vez que este vector se transfecta dentro de las células de mamífero, este vector puede ser utilizado como una molécula reportera para unión a GAS como se describe en los ejemplos 18-19. Otras construcciones pueden elaborarse utilizando la descripción anteriormente mencionada y reemplazando GAS con una secuencia promotora diferente. Por ejemplo, la construcción de moléculas reporteras que contienen secuencias promotoras NFK-B y EGR se describen en los ejemplos 20:21. Sin embargo, muchos otros promotores pueden ser sustituidos utilizando los protocolos descritos en estos ejemplos. Por ejemplo, los promotores SRE, IL-2, NFAT, u Osteocalcina pueden ser sustituidos, solos o en combinación (por ejemplo, GAS/NF-KB/EGR, GAS/NF-KB;IL-2/NFAT, o NF-KB/GAS). Similarmente, otras líneas celulares pueden ser utilizadas para evaluar la actividad de una construcción reportera, tales como HELA (epitelial), HUVEC (endotelial), Reh (célula B), Saos-2 (osteoblasto), HUVAC (aórtica), o Cardiomiocito.

EJEMPLO 18 Ensayo de selección de alta resolución para actividad de célula T El siguiente protocolo se utiliza para evaluar la actividad de la célula T mediante la identificación de factores, y determinando si el sobrenadante contiene un polipéptido de la invención o un ligando del mismo que hace que ias células T proliferen y/o se diferencien. La actividad de la célula T se evalúa utilizando la construcción GAS/SEAP/Neo producida en el ejemplo 17. Por lo tanto, los factores que incrementan la actividad SEAP indica ia capacidad para activar la vía de transducción de la señal tipo Jaks-STAT. Las células T utilizadas en esta prueba son las células T Jurkat (número de acceso ATCC TIB-162), aunque las células Molt-3 (número de acceso ATCC CRL-1552) y las células Molt-4 (número de acceso ATCC CRL-1d82) también pueden ser utilizadas.

Las células T Jurkat son células auxiliares Th1 CD4+ linfoblásticas. Con el objeto de generar líneas celulares estables, aproximadamente 2 millones de células Jurkat se transfectan con el vector GAS-SEAP/neo utilizando DMRIE-C (Life Technologies) (procedimiento de transfección descrito a continuación). Las células transfectadas se siembran a una densidad de aproximadamente 20,000 células por pozo y los transfectantes resistentes a 1 mg/ml de geneticina se seleccionan. Las colonias resistentes se expanden y luego se evalúan por su respuesta a concentraciones en incremento de interferón gamma. La dosis respuesta de una clona seleccionada se demuestra. Específicamente, el siguiente protocolo producirá suficientes células para 75 pozos que contiene 200 µl de células. Por lo tanto, esto se crece a escala, o se lleva a cabo en pozos múltiples para generar suficientes células para múltiples placas de 96 pozos. Las células Jurkat se mantienen en RPMl + 10% de suero con 1% de penicilina-estreptomicina. Combinando 2.5 mis de OPTI-MEM (Life Technologies) con 10 µl de ADN plasmídico en una botella T25. Añadir 2.5 ml de OPTI-MEM que contiene 50 µl de DMRIE-C e incubar a temperatura ambiente por 15-45 minutos. Durante el periodo de incubación, contar la concentración celular, centrifugar el número requerido de células (107 por transfección), y resuspenderlas en OPTI-MEM a una concentración final de 107 células/ml. Luego añadir 1 ml de 1 x 107 células en OPTI-MEM a una botella T25 e incubar a 37 grados C por 6 horas. Después de la incubación, añadir 10 ml de RPMl + 15% de suero. Las líneas reporteras estables Jurkat:GAS-SEAP se mantienen en RPMi + 10% de suero, 1 mg/ml de Geneticina, y 1% de penicilina-estreptomicina. Estas células se tratan con sobrenadante que contiene poiipéptidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) o los polipéptidos inducidos por el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) como se producen mediante el protocolo descrito en el ejemplo 16. Al día de tratamiento con el sobrenadante, las células deben lavarse y resuspenderse en RPMl fresco + 10% de suero a una densidad de 500,000 células por ml. El número exacto de células requeridas dependerá del número de sobrenadantes a ser evaluados. Para una placa de 96 pozos, se requieren aproximadamente 10 millones de células (para 10 placas, 100 millones de células). Las células se transfieren a un recipiente de reservorio triangular, con el objeto de dispersar las células dentro de una placa de 96 pozos, utilizando una piqueta de 12 canales. Utilizando una piqueta de 12 canales se transfieren 200 µl de células dentro de cada pozo (por lo tanto se añaden 100,000 células por pozo). Después de que todas las placas han sido sembradas, 50 µl de los sobrenadante se transfieren directamente a partir de la placa de 96 pozos que contiene los sobrenadantes dentro de cada pozo utilizando una piqueta de 12 canales. Además, una dosis de interferón gamma exógeno (0.1 , 1.0, 10 ng) se añade a los pozos H9, H10, y H11 para servir como controles positivos adicionales para la prueba. Las placas de 96 pozos que contienen células Jurkat tratadas con sobrenadante se colocan dentro de una incubadora por 48 horas (nota: este tiempo es variable entre 48-72 horas). 35 µl de las muestras a partir de cada pozo se transfieren entonces a una placa de 96 pozos opaca utilizando una piqueta de 12 canales. Las placas opacas deben estar recubiertas (utilizando revestimientos sellophene) y almacenarse a -20 grados C hasta que las pruebas SEAP se lleven a cabo de conformidad con el ejemplo 18. Las placas que contienen las células tratadas remanentes se colocan a 4 grados C y sirven como una fuente de material para repetir la prueba en un pozo especifico si se desea. Como un control positivo, pueden utilizarse 100 Unidades/ml de interferón gamma el cual se sabe que activa a las células T Jurkat. Típicamente se observa una inducción mayor a 30 veces en los pozos que sirven como control positivo. El protocolo anterior puede ser utilizado en la generación tanto de células transfectadas de manera transitoria, así como de células transfectadas de manera estable, ias cuales pueden ser evidentes a los expertos en la técnica.

EJEMPLO 19 Prueba de selección de alta resolución para identificar actividad mieloide El siguiente protocolo se utiliza para evaluar la actividad mieloide del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) mediante la determinación de si el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) o el ligando del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) hace que las células mieloides proliferen y/o se diferencien. La actividad de células mieloide se evaluó utilizando la construcción GAS/SEAP/Neo producida en el ejemplo 17. Por lo tanto, los factores que incrementan la actividad SEAP indican ia capacidad para activar la vía de transduccción de la señal Jaks-STAT. La célula mieloide utilizada en esta prueba es U937, una línea celular pre-monocito, aunque TF-1 , HL60, o KG1 pueden ser utilizadas. Para transfectar transitoriamente a las células U937 con la construcción GAS/SEAP/Neo producida en el ejemplo 17, se utilizó un método DEAE-Dextrán (Kharbanda et ai., 1994, Cell Growth & Differentiation, d: 269-266). Primero, se cosecharon 2 x 10e7 células U937 y se lavaron con PBS. Las células U937 usualmente se crecen en medio RPMl 1640 que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) inadivado mediante calor suplementado con 100 unidades/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina. A continuación, las células se suspenden en 1 ml de regulador de pH Tris-HCl 20 mM (pH 7.4) que contiene O.d mg/ml de DEAE-Dextrán, 8 µg de ADN plasmídico de GAS-SEAP2, NaCI 140 mM, KCl d mM, Na2HP04.7H20 375 µM, y MgCI2 675 µM. Incubar a 37 grados C por 45 minutos. Lavar las células con medio RPMl 1640 que contiene 10% de FBS y luego resuspender en 10 ml de medio completo e incubar a 37 grados C por 36 horas. Las células estables GAS-SEAP/U937 se obtienen mediante crecimiento de las células en 400 µg/ml de G418. El medio libre de G418 se utiliza para crecimiento rutinario pero cada uno a dos meses, las células deben re-crecerse en 400 µg/ml de G418 por un par de pasajes. Estas células se evalúan mediante la cosecha de 1 x 108 células (esto es suficiente para 10 pruebas en placas de 96 pozos) y lavado con PBS. Suspender las células en 200 ml de medio de crecimiento anteriormente descrito, con una densidad final de 5 x 105 células/ml. Sembrar 200 µl de células por pozo en la placa de 96 pozos (o 1 x 105 células/pozo). Añadir 50 µl del sobrenadante preparado mediante protocolo descrito en el ejemplo 16. Incubar a 37 grados C por 48 a 72 horas. Como un control positivo, se pueden utilizar 100 Unidades/ml de interferón gamma el cual se sabe que activa a las células U937. Típicamente se observa una inducción mayor a 30 veces en los pozos de control positivo. Ensayo SEAP del sobrenadante de conformidad con el protocolo descrito en el ejemplo 22.

EJEMPLO 20 Prueba de selección de alta resolución para identificar actividad neuronal Cuando las células llevan a cabo diferenciación y proliferación, un grupo de genes se activa a través de muchas vías diferentes de transducción de la señal. Uno de estos genes, EGR1 (gen temprano 1 de respuesta al crecimiento), se induce en varios tejidos y tipos celulares después de la activación. El promotor de EGR1 es responsable de dicha inducción. Utilizando el promotor EGR1 adaptado a las moléculas reporteras, puede evaluarse la adivación de las células mediante el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) o un ligando del mismo. Particularmente, el siguiente protocolo se utiliza para evaluar la actividad neuronal en líneas celulares PC12. Las células PC12 (células de fenocromocitoma de rata) se sabe que proliferan y/o se diferencian mediante ia activación con varios mitógenos, tales como TPA (acetato de tetradecanoil forbol), NGF (factor de crecimiento nervioso), y EGF (factor de crecimiento epidémico). La expresión del gen EGR1 se activa durante éste tratamiento. Por lo tanto, mediante las células PC12 establemente transfectadas con una construcción que contiene un promotor EGR adaptado a un reportero SEAP, se puede evaluar la activación de las células PC12 mediante el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) o ligando del mismo.

La construcción reportera EGR/SEAP puede ensamblarse mediante el siguiente protocolo. La secuencia promotora EGR-1 (-633 a +1) (Sakamoto K et al., Oncogene 6: 867-871 (1991)) puede ser amplificada mediante PCR a partir del ADN genómico de humano utilizando los siguientes iniciadores: 5' GCGCTCGAGGGATGACAGCGATAGAACCCCGG-3' (SEQ ID NO: 15) 5' GCGAAGCTTCGCGACTCCCCGGATCCGCCTC-3' (SEQ ID NO: 16) Utilizando el vector GAS:SEAP/Neo producido en el ejemplo 17, el producto amplificado de EGR1 puede entonces insertarse dentro de este vector. Se lineariza el vector GAS:SEAP/Neo utilizando enzimas de restricción Xhol/Hindlll, removiendo el fragmento componente GAS/SV40. Restringir el producto amplificado de EGR1 con estas mismas enzimas. Ligar el vector y el promotor EGR1. Para preparar placas de 96 pozos para cultivo celular, dos ml de una solución de recubrimiento (dilución 1:30 de colágena tipo I (Upstate Biotech Inc. Número de catálogo 08-115) en etanol al 30% (esterilizado mediante filtro)) se añaden por cada plato de 10 cm o 50 ml por pozo de una placa de 96 pozos, y se deja secar al aire por 2 horas. Las células PC12 se crecen rutinariamente en medio RPMI-1640 (Bio Whittaker) que contiene 10% de suero de caballo (JRH BIOSCIENCES, No. de catálogo 12449-78P), suero bovino fetal inactivado mediante calor al 5% (FBS) suplementado con 100 unidades/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina sobre un plato de cultivo de tejidos de 10 cm pre-recubierto. De una a cuatro divisiones se hacen cada tres a cuatro días. Las células se remueven a partir de los platos mediante raspado y se resuspenden con pipeteo hacia arriba y hacia abajo más de 1d veces. Se transfecta la construcción EGR/SEAP/Neo dentro de PC12 utilizando el protocolo de Lipofectamina descrito en el ejemplo 16. Las células estables EGR-SEAP/PC12 se obtienen mediante crecimiento de las células en 300 µg/ml de G418. El medio libre de G418 se utiliza para crecimiento rutinario pero cada uno a dos meses, las células deben ser re-crecidas en 300 µg/ml de G418 por un par de pasajes. Para probar la actividad neuronal, un plato de 10 cm con células alrededor del 70 a 80% de confluencia se selecciona mediante la remoción del medio viejo. Las células se lavan una vez con PBS (solución salina con regulación de pH de fosfato). Entonces las células se colocan en condiciones de privación en medio con poco suero (RPMI-1640 que contiene 1% de suero de caballo y 0.5% de FBS con antibióticos) durante toda la noche. A la mañana siguiente, se remueve el medio y se lavan las células con PBS. Raspar las células del plato, suspender las células en dos ml de medio con poco suero. Contar el número celular y añadir más medio con poco suero para alcanzar una densidad celular final de 5 x 105 células/ml. Se añaden 200 µl de la suspensión celular a cada pozo de la placa de 96 pozos (equivalente a 1 x 105 células/pozos). Añadir 50 µl del sobrenadante producido en el ejemplo 12, a 37 grados C por 48 a 72 horas. Como un control positivo, un factor de crecimiento que se sabe que activa las células PC12 a través de EGR puede ser utilizado, tal como 50 ng/µl de Factor de Crecimiento Nervioso (NGF). Típicamente se observa una inducción de SEAP mayor a 50 veces en los pozos de control positivo. Ensayo SEAP de sobrenadante de conformidad con el ejemplo 22.

EJEMPLO 21 Prueba de selección de alta resolución para actividad de célula T NF-KB (Factor Nuclear KB) es un factor de transcripción activado mediante una amplia variedad de agentes incluyendo la citocinas inflamatorias IL-1 y TNF, CD30 y CD40, linfotoxina-alfa y linfotoxina-beta, mediante el exposición a LPS o trombina, y mediante la expresión de ciertos productos de genes virales. Como un factor de transcripción, NF-KB regula la expresión de los genes implicados en la activación de la célula inmune, control de ia apoptosis (NF-KB parece proteger a las células de la apoptosis), desarrollo de ia célula B y T, respuestas anti-virales y antimicrobianas, y respuestas a estrés múltiple. En condiciones no estimulantes, NF-KB se retiene en el citoplasma con l-KB (inhibidor KB). Sin embargo, después de la estimulación, I-KB se fosforila y se degrada, ocasionando que NF-KB sea enviado al núcleo, por lo tanto activado ia transcripción de los genes blanco. Los genes blanco activados por NF-KB incluyen IL-2, IL-6, GM-CSF, ICAM-1 y la clase 1 de MHC.

Debido a su papel central y capacidad para responder a un intervalo de estímulos, las construcciones reporteras que utilizan el elemento promotor NF-KB se utilizan para seleccionar los sobrenadante producidos en el ejemplo 16. Los activadores o inhibidores de NF-KB podrían ser útiles para tratar, prevenir, y/o diagnosticar enfermedades. Por ejemplo, los inhibidores de NF-KB podrían ser útiles para tratar aquellas enfermedades relacionadas con la activación aguda o crónica de NF-KB, tal como artritis reumatoide. Para construir un vector que contiene el elemento promotor NF-KB, se empleó una estrategia basada en PCR. El iniciador hacia el extremo 5' contiene cuatro copias en tándem del sitio de unión a NF-KB (GGGACTTTCCC) (SEQ ID NO: 17), 18 pb de la secuencia complementaria al extremo d' de ia secuencia del promotor temprano de SV40, y está flanqueada con un sitio Xhol: 5':GCGGCCTCGAGGGGACTTrCCCGGGGACTTTCCGGGGACTTTCCGGG ACTTTCCATCCTGCCATCTCAATTAG: 3' (SEQ ID NO: 18) El iniciador hacia el extremo 3' es complementario al extremo 3' del promotor de SV40 y está flanqueado con un sitio Hind lll: d': GCGGCAAGCTTTTTGCAAAGCCTAGGC: 3' (SEQ ID NO: 19) La amplificación mediante PCR se lleva cabo utilizando el molde del promotor de SV40 presente en el plásmido pB-gal:promotor obtenido a partir de Clontech. El fragmento de PCR resultante se digiere con Xhol e Hind III y se subclona dentro de BLSK2-. (Stratagene). La secuenciación con los iniciadores T7 y T3 confirma que el Inserto contiene la siguiente secuencia: d TCGAGGGGACTTTCCCGGGGACTTTCCGGGGACTTTCCGGGACTTTC CATCTGCCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGC CCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGG CTGACTAA I l l i l l l IATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTG AGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGC l i l i l í GGAGGCCTAGGCTTTTGC AAAAAGCTT:3' (SEQ ID NO: 20) A continuación, se reemplaza el elemento promotor mínimo de SV40 presente en el plásmido pSEAP2-promotor (Clontech) con este fragmento NF-KB/SV40 utilizando Xhol e Hind lll. Sin embargo, este vector no contiene un gen de resistencia a neomicina, y por lo tanto, no se prefiere para sistemas de expresión de mamífero. Con el objeto de generar líneas celulares de mamífero estables, el cassette NF-KB/SV40/SEAP se remueve a partir del vector NF-KB/SEAP anteriormente mencionado utilizando enzimas de restricción Salí y Notl, e insertando dentro un vector que contiene resistencia a neomicina. Particularmente, el cassette NF-KB/SV40/SEAP se insertó dentro de pGFP-1 (Clontech), reemplazando al gen GFP, después de restringir pGFP-1 con Salí y Notl. Una vez que el vector NF-KB/SV40/SEAP/Neo se crea, las células T Jurkat estables se crean y se mantienen de conformidad con el protocolo descrito en el ejemplo 18. Similarmente, el método para probar los sobrenadante con estas células T Jurkat estables también se describe en el ejemplo 18. Como un control positivo, el TNF alfa exógeno (0.1 , 1 , 10 ng) se añade a los pozos H9, H10 y H11 , observándose típicamente una activación de 5-10 veces.

EJEMPLO 22 Prueba para actividad SEAP Como una molécula reportera para las pruebas descritas en los ejemplos 18-21 , la actividad de SEAP se evalúa utilizando el equipo Tropix Phospho-light (Cat. BP-400) de conformidad con el siguiente procedimiento general. El equipo Tropix Phospho-light abastece los reguladores de pH para Dilución, Ensayo y Reacción utilizados a continuación. Se llena un dispensador con regulador de pH para Dilución 2.5 x y se dispensan 1d µl de regulador de pH para dilución 2.d x dentro de Optiplacas que contiene 3d µl de un sobrenadante. Los platos se sellan con un sellador plástico y se incuban a 65 grados C por 30 minutos. Los Optiplacas se separan para evitar calentamiento no homogéneo. Las muestras se enfrían a temperatura ambiente por 15 minutos. Se vacía el dispensador y se llena con el regulador de pH para Ensayo. Se añaden 50 ml de regulador de pH para Ensayo y se incuba a temperatura ambiente por 5 minutos. Se vacía el dispensador y se llena con el regulador de pH para Reacción (véase el cuadro a continuación). Se añaden 50 µl de regulador de pH para Reacción y se incuba a temperatura ambiente por 20 minutos. Puesto que la intensidad de la señal quimioluminiscente es dependiente del tiempo, y toma aproximadamente diez minutos para leer 5 platos en el luminómetro, uno debe tratar cinco platos en cada ocasión y empezar la segunda serie diez minutos después. Se lee la unidad de luz relativa en el luminómetro. Establecer H12 como blanco, e Imprimir los resultados. Un incremento en la quimioluminiscencia indica actividad del reportero.

Formulación de regulador de pH para Reacción: EJEMPLO 23 Prueba de selección de alta resolución para identificar cambios en la concentración de moléculas pequeñas y permeabilidad de la membrana Se sabe que la unión de un ligando a un receptor altera los niveles intracelulares de moléculas pequeñas, tales como calcio, potasio, sodio, y el pH, así como altera el potencial de membrana. Estas alteraciones pueden medirse en una prueba para identificar los sobrenadantes que se unen a los receptores de una célula particular. A pesar de que el siguiente protocolo describe una prueba para calcio, este protocolo puede modificarse fácilmente para detectar cambios en potasio, sodio, pH, potencial de membrana, o cualquier otra molécula pequeña la cual sea detectable mediante una sonda fluorescente. La siguiente prueba utiliza el lector de placas Fluorometric Imaging ("FLIPR") para medir cambios en las moléculas fluorescentes (Molecular Probes) que se unen a moléculas pequeñas. Claramente, cualquier molécula fluorescente que detecta una molécula pequeña puede ser utilizada en lugar de la molécula fluorescente a calcio, fluo-4 (Molecular Probes, Inc.; número de catálogo F-14202), utilizada en la presente invención. Para obtener células adherentes, sembrar las células a 10,000- 20,000 célula/pozo en una placa negra de 96 pozos Costar. La placa se incuba en una incubadora de CO2 por 20 horas. Las células adherentes se lavan dos veces en un lavador Biotek con 200 µl de HBSS (solución salina balanceada de Hank) dejando 100 µl de regulador de pH después del lavado final. Una solución de almacenamiento de 1 mg/ml de fluo-4 se elabora en DMSO con 10% de ácido plurónico. Para cargar las células con fluo-4, 50 µl de 12 µg/ml de fluo-4 se añaden a cada pozo. La placa se incuba a 37 grados C en una incubadora de C02 por 60 minutos. La placa se lava cuatro veces en el lavador Biotek con HBSS dejando 100 µl de regulador de pH. Para obtener células no adherentes, las células se centrifugan a partir del medio de cultivo. Las células se resuspenden a 2-5 x 106 células/ml con HBSS en un tubo cónico de 50 ml. 4 µl de 1 mg/ml de solución de fluo-4 en DMSO con 10% de ácido plurónico se añade a cada ml de la suspensión celular. El tubo se coloca luego en un baño de agua a 37 grados C por 30-60 minutos. Las células se lavan dos veces con HBSS, se resuspenden a 1 x 106 células/ml, y se dispensan dentro de una micropiaca, 100 µl/pozo. La placa se centrifuga a 1000 rpm por cinco minutos. La placa se lava entonces una vez en solución de lavado celular Denley con 200 µl, seguido por un paso de aspiración para llegar a un volumen final de 100 µl. Para una prueba no basado en célula, cada pozo contiene una molécula fluorescente, tal como fluo-4. El sobrenadante se añade al pozo, y se detecta un cambio en la fluorescencia. Para medir la fluorescencia del calcio intracelular, el FLIPR se establece para los siguientes parámetros: (1) ganancia del sistema es 300- 800 mW; (2) tiempo de exposición es 0.4 segundos; (3) F/paro de la cámara es F/2; (4) excitación es 488 nm; (5) emisión es 530 nm; y (6) adición de la muestra es 50 µl. La emisión incrementada 530 nm indica un evento de señalización extraceluiar ocasionado por una molécula, tal como receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) o ligando del mismo, una molécula inducida por el receptor de qulmiocina de proteína G (CCRd), ei cual ha resultado en un incremento en la concentración de Ca++ intracelular.

EJEMPLO 24 Prueba de selección de alta resolución para identificar la actividad de tirosina cinasa La proteína tirosina cinasa (PTK) representa un grupo diverso de cinasas transmembranales y citoplásmicas. Dentro del grupo del receptor de la proteína tirosina cinasa (RPTK) están los receptores para una intervalo de fadores de crecimiento mitógenos y metabólicos incluyendo las subfamilias del receptor de PDGF, FGF, EGF, NGF, HGF e Insulina. Además hay una familia grande de RTPK para la cual se desconoce el ligando conespondiente. Los ligandos para RPTK incluyen principalmente proteínas pequeñas secretadas, pero también proteínas unidas a la membrana y proteínas de matriz extracelular. La adivación de RTPK mediante ligandos implica la dimerización del receptor mediada por el ligando, resultando en una transfosforilacíón de la subunidades del receptor y la activación de las tirosina cinasas citoplásmicas. Las tirosina cinasas citoplásmicas incluyen tirosina cinasas asociadas al receptor de la familia src (por ejemplo, src, yes, Ick, lyn, fyn) y tirosina cinasas proteicas no unidas al receptor y citosólicas, tales como la familia Jak, miembros de la cual median el disparo de la transducción de la señal mediante la superfamilia de receptores tipo citocina (por ejemplo, las Interleucinas, Interferones, GM-CSF, y Leptina). Debido al amplio intervalo de factores conocidos capaces de estimular la actividad de tirosina cinasas, es de interés el identificar si el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) o ligando del mismo, o una molécula inducida por el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) es capaz de activar ia vía de transducción de señal mediante tirosina cinasa. Por lo tanto, el siguiente protocolo se diseña para identificar dichas moléculas capaces de activar la vía de transducción de la señal mediante tirosina cinasa. Las células blanco sembradas (por ejemplo, queratinocitos primarios) a una densidad de aproximadamente 25,000 células por pozo en la placa de 96 pozos Loprodyne Silent Screen obtenidas a partir de Nalge Nunc (Naperville, IL). Las placas se esterilizan con dos enjuagues de 30 minutos con etanol al 100%, enjuague con agua y secado durante toda la noche. Algunas placas se recubren por 2 horas con 100 ml de colágena tipo I grado cultivo celular (50 mg/ml), gelatina (2%) o polilisina (50 mg/ml), todas las cuales pueden obtenerse partir de Sigma Chemicals (St. Louis, MO) o 10% de Matrigel obtenido a partir de Bedon Dickinson (Bedford, MA), o suero de ternera, se enjuagan con PBS y se almacenan a 4 grados O El crecimiento celular sobre estas placas se prueba mediante el sembrado de d,000 células/pozo en medio de crecimiento y cuantificación indirecta del número celular a través del uso de azul alamar como se describe por el fabricante Alamar Biosciences, Inc. (Sacramento, CA) después de 48 horas. Las cubiertas de ias placas Falcon # 3071 a partir de Becton Dickinson (Bedford, MA) se utilizan para cubrir las placas Loprodyne Silent Screen. Las placas de cultivo celular Falcon Microtest lll también pueden utilizarse en algunos experimentos de proliferación. Para preparar los extractos, las células A431 se siembran sobre membranas de nylon de las placas Loprodyne (20,000/200 ml/pozo) y se cultivan durante toda la noche en medio completo. Las células alcanzan quiescencia mediante incubación en medio basal libre de suero por 24 horas. Después de d-20 minutos de tratamiento con EGF (60 ng/mi) o 50 µl del sobrenadante producido en el ejemplo 16, el medio se removió y 100 ml del regulador de pH para extracción ((HEPES 20 mM pH 7.5, NaCI 0.15 M, Tritón X-100 al 1 %, SDS al 0.1%, Na3VO4 2 mM, Na4P2O7 2 mM y un cóctel de inhibidores de proteasa (#1836170) obtenida partir de Boehringer Mannheim (Indianápolis, IN) se añaden a cada pozo y la placa se agita sobre un agitador rotatorio por 5 minutos a 4°C. La placa se coloca luego en un múltiple de transferencia al vacío y el extracto se filtra a través del fondo de la membrana de 0.4d mm de cada pozo utilizando vacío doméstico. Los extractos se conectan en una placa de 96 pozos de captación/prueba en el fondo del múltiple de vacío e inmediatamente se colocan sobre hielo. Para obtener extractos clarificados mediante centrifugación, el contenido de cada pozo, después de la solubilización mediante detergente por 5 minutos, se remueve y se centrifuga por 15 minutos a 4 grados C a 16,000 x g. Evaluación de los extractos filtrados para niveles de actividad de tirosina cinasa. A pesar de que se conocen muchos métodos para detectar ia actividad de tirosina cinasa, un método se describe en la presente invención. Generalmente, la actividad de tirosina cinasa de un sobrenadante se evalúa mediante la determinación de su capacidad para fosforilar un residuo de tirosina sobre un sustrato específico (un péptido biotinilado). Los péptidos biotinilados que pueden ser utilizados para este propósito incluyen PSK1 (que conesponde a los aminoácidos 6-20 de la cinasa cdc2-p34 de la división celular) y PSK2 (que corresponde a los aminoácidos 1-17 de la gastrina). Ambos péptidos son sustratos para un intervalo de tirosina cinasas y están disponibles a partir de Boehringer Mannheim. La reacción de tirosina cinasa se establece mediante la adición de los siguientes componentes en orden. Primero, añadir 10 µl de Péptido Biotinilado 5 µM, luego 10 µl de ATP/Mg2+ (ATP 5 mM/MgCI2 50 mM), luego 10 µl de Regulador de pH para Ensayo 5x (hidrocloruro de imidazol 40 mM, pH 7.3, beta-glicerofosfato 40 mM, EGTA 1 mM, MgCI2 100 mM, MnCI2 5 mM, BSA 0.5 mg/ml), luego 5 µl de Vanadato de Sodio (1 mM), y luego 5 µl de agua. Mezclar los componentes suavemente y preincubar la mezcla de reacción a 30 grados C por 2 minutos. Iniciar la reacción mediante la adición de 10 µl de la enzima control o el sobrenadante filtrado. La reacción de la prueba de tirosina cinasa se termina entonces mediante la adición de 10 µl de EDTA 120 mM y la reacción se coloca sobre hielo. La actividad de tirosina cinasa se determina mediante la transferencia de una alícuota de 60 µl de la mezcla de reacción a un módulo de placa para microtitulación (MTP) e incubando a 37 grados C por 20 minutos. Esto permite que la placa de 96 pozos cubierta con estreptavidina se asocie con el péptido biotiniiado. Se lava el módulo MTP con 300 µl/pozo de PBS cuatro veces. A continuación añadir 7d µl de anticuerpo anti-fosfotirosina conjugado, peroxidasa de rábano (anti-P-Tyr-POD (O.d µ/ml)) a cada pozo e incubar a 37 grados C por una hora. Lavar el pozo como anteriormente se mencionó. A continuación se añaden 100 µl de solución de sustrato de peroxidasa (Boehringer Mannheim) e incubar a temperatura ambiente por al menos 5 minutos (hasta 30 minutos). Se mide la absorbancia de la muestra a 405 nm mediante el uso de un lector de ELISA. El nivel de actividad de peroxidasa unida se cuantifica utilizando un lector de ELISA y reflejando el nivel de la actividad de tirosina cinasa.

EJEMPLO 25 Prueba de selección de alta resolución para identificar actividad defosforilación Como una alternativa potencial y/o favorable a la prueba de la actividad de proteína tirosina cinasa descrita en el ejemplo 24, también puede utilizarse una prueba que detecta la activación (fosforilación) de los intermediarios principales de la transducción de la señal intracelular. Por ejemplo, como se describe a continuación, una prueba particular puede detectar la fosforilación de tiroslna de las cinasas Erk-1 y Erk-2. Sin embargo, ia fosforilación de otras moléculas, tales como Raf, JNK, p38 MAP, Map cinasa cinasa (MEK), MEK cinasa, Src, cinasa específica de Músculo (MuSK), IRAK, Tec, y Janus, así como cualquier otra molécula de fosfoserina, fosfotirosina, o fosfotreonina, puede ser detectada mediante la sustitución de estas moléculas por Erk-1 y Erk-2 en la siguiente prueba. Específicamente, las placas de prueba se elaboran mediante el recubrimiento de los pozos de una placa para ELISA de 96 pozos con 0.1 ml de proteína G (1 µg/ml) por 2 horas a temperatura ambiente, (TA). Las placas se enjuagan luego con PBS y se bloquean con BSA a 3%/PBS por una hora a temperatura ambiente. Las placas con proteína G se tratan luego con 2 anticuerpos monoclonales comerciales (100 ng/pozo) en contra de Erk-1 y Erk-2 (1 h a TA) (Santa Cruz Biotechnology). (Para detedar otras moléculas, este paso puede modificarse fácilmente mediante la sustitución de un anticuerpo monoclonal que detecta cualquiera de las moléculas anteriormente descritas). Después de 3-5 enjuagues con PBS, las placas se almacenan a 4 grados C hasta que se utilicen. Las células A431 se siembran a 20,000/pozo en una placa con filtro de 96 pozos Loprodyne y se cultivan durante toda la noche en medio de crecimiento. Las células se cosechan luego por 48 horas en medio basal (DMEM) y luego se tratan con EGF (6 ng/pozo) con 50 µl de los sobrenadante obtenidos en el ejemplo 16 por 5-20 minutos. Las células se solubilizan luego y los extractos se filtran directamente dentro de la placa de prueba. Después de la incubación con el extracto por una hora a temperatura ambiente, los pozos se enjuagan de nuevo. Como un control positivo, una preparación comercial de MAP cinasa (10 ng/pozo) se utiliza en lugar del extracto A431. Las placas se tratan luego con un anticuerpo poiiclonal comercial (conejo) (1 µg/ml) el cual reconoce específicamente el epítope fosforiiado de las Erk-1 y Erk-2 cinasas (1 hora a temperatura ambiente). Este anticuerpo se biotinila mediante procedimientos estándares. El anticuerpo policlonal unido se cuantifica entonces mediante incubaciones sucesivas con Europio-estreptavidina y readivo mejorador de la fluorescencia Europio en el instrumento Wallac DELFIA (fluorescencia resuelta por tiempo). Una señal de fluorescencia incrementada sobre el fondo indica una fosforilación por el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) con un ligando del mismo o una molécula inducida por el receptor de quimiocina de proteína G.

EJEMPLO 26 Método de determinación de las alteraciones en el gen del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) El ARN aislado a partir de familias enteras o de pacientes individuales que presentan un fenotipo de interés (tai como una enfermedad) debe ser aislado. El ADNc se genera luego a partir de estas muestras de ARN utilizando protocolos conocidos en la técnica. (Véase, Sambrook.) El ADNc se utiliza entonces como un molde para el PCR, empleando Iniciadores que rodean las regiones de interés en SEQ ID NO: 1. Las condiciones sugeridas para PCR consisten de 3d ciclos a 9d grados C por 30 segundos; 60-120 segundos a 62-68 grados C; y 60-120 segundos a 70 grados C, utilizando las soluciones reguladoras de pH descritas en Sidransky, D., et al., Science 252: 706 (1991). Luego los productos de PCR se secuencian utilizando iniciadores marcados en sus extremos 5' con polinucleótido T4 cinasa, empleando SequiTherm Polimerasa. (Epicentre Technologies). Los límites intrón-exón de los exones seleccionados del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) también se determinan y los productos de PCR genómicos se analizan para confirmar los resultados. Los productos de PCR que se sospecha que contienen mutaciones en el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) se clonan entonces y se secuencian para validar los resultados de la secuenclación directa.

Los productos de PCR del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) se clonan dentro de los vectores con extensiones T como se describe en Holton, T.A. y Graham, M.W., Nucleic Acids Research, 19:1166 (1991 ) y se secuencian con T7 polimerasa (United States Biochemical). Los individuos afectados se identifican mediante mutaciones en el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) que no están presentes en individuos no afectados. Los rearreglos genómicos también se observan como un método para determinar alteraciones en un gen que corresponde al receptor de quimiocina de proteína G. Los clones genómicos aislados de conformidad con el ejemplo 6 se someten a nick translation con digoxigenindeoxi-uridina d'-trifosfato (Boehringer Mannheim), y se lleva a cabo FiSH como se describe en Johnson, Cg. et al., Methods Cell Biol. 3d: 73-99 (1991). La hibridación con la sonda marcada se lleva a cabo utilizando un vasto exceso de ADN de cot-1 de humano para la hibridación específica con el locus genómico del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). Los cromosomas se contratiñen con 4,6-diamino-2-fenilidol e yoduro de propidio, produciendo la combinación de bandas C y R. Las imágenes alineadas para el mapeo preciso se tienen utilizando una serie de filtros de triple banda (Chroma Technology, Brattleboro, VT) en combinación con una cámara con dispositivo acoplado a carga enfriada (Photometrics, Tucson, AZ) y filtros de longitudes de ondas de excitación variable. (Johnson, Cv. et al., Genet. Anal. Tech. Appl., 8: 76 (1991)). La recolección de la imagen, análisis y mediciones de longitud cromosomal fraccional se llevan a cabo utilizando el sistema de programa ISee Graphical. (Inovision Corporation, Durham, NC.) Las alteraciones cromosomales en la región genómica del receptor de qulmiocina de proteína G (CCRd) (hibridado mediante la sonda) se identifican como inserciones, deleciones, y translocaciones. Estas alteraciones del Receptor de quimiocina de la proteína G (CCRd) se utilizan como un marcador diagnóstico para una enfermedad asociada.

EJEMPLO 27 Método para detectar niveles anormales de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) en una muestra biológica Los polipéptidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) pueden detectarse en una muestra biológica, y si un nivel incrementado o disminuido del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) se detecta, este polipéptido es un marcador para un fenotipo particular. Los métodos de detección son numerosos, y por lo tanto, se entiende que un experto en la técnica puede modificar la prueba siguiente ajusfándolo a sus necesidades particulares. Por ejemplo, el ELISA intercalado con anticuefo se utiliza para detectar el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) en una muestra, preferiblemente una muestra biológica. Los pozos de una placa de microtitulación se cubren con anticuefos específicos al receptor de quimiocina de proteína G (CCRd), a una concentración final de 0.2 a 10 µg/ml.

Los anticuefos son ya sea monoclonales o policlonales y se producen mediante el método descrito en el ejemplo 16. Los pozos se bloquean de manera que la unión no específica del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) al pozo está reducida. Los pozos cubiertos se incuban entonces por > 2 horas a temperatura ambiente con una muestra que contiene receptor de quimiocina de proteína G. Preferiblemente, diluciones seriales de la muestra deben utilizarse para validar los resultados. Las placas se lavan entonces tres veces con agua deionizada o destilada para remover el receptor de qulmiocina de proteína G no unido. A continuación, se añaden dO µl del conjugado de fosfatasa alcalina-anticuerpo específico, a una concentración de 25-400 ng, y se incuban por 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavan de nuevo tres veces con agua deionizada o destilada para remover el conjugado no unido. Añadir 75 µi de solución de sustrato de 4-metilumbeliferil fosfato (MUP) o p-nitrofenil fosfato (NPP) a cada pozo e incubar por 1 hora a temperatura ambiente. Medir la reacción mediante un lector de placas de microtitulación. Preparar una curva estándar, utiliza diluciones seriales de una muestra control, y graficar la concentración del polipéptido del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) en el eje X (escala logarítmica) y la fluorescencia o absorbancia en el eje Y (escala lineal). Interpolar la concentración del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) en la muestra utilizando la curva estándar.

EJEMPLO 28 Formulación La invención también provee métodos de tratamiento y/o prevención de enfermedades, trastornos, y/o condiciones (tales como, por ejemplo, cualesquiera o más de las enfermedades, trastornos, y/o condiciones descritas en la presente invención) mediante la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de un compuesto terapéutico. Por compuesto terapéutico se entienden polinucleótidos o polipéptidos de la invención (incluyendo fragmentos y variantes), agonistas o antagonistas de los mismos, y/o anticuerpos de ios mismos, en combinación con un tipo de vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, un vehículo estéril). El compuesto terapéutico será formulado y dosificado de manera consistente con la buena práctica médica, tomando en consideración la condición clínica del paciente individual (especialmente los efectos laterales del tratamiento con el compuesto terapéutico sólo), el sitio de administración, ei método de administración, el programa de administración, y otros factores conocidos por los practicantes. La "cantidad efectiva" para propósitos en la presente invención se determina así mediante dichas consideraciones.

Como una proposición general, la cantidad farmacéuticamente efectiva del compuesto terapéutico administrado parenteralmente por dosis estará en el ¡ntervalo de aproximadamente 1 µg/kg/día a 10 mg/kg/día de peso corporal del paciente, aunque, como se evidenció anteriormente, esto se someterá a la discreción terapéutica. Más preferiblemente, esto dosis es de al menos 0.01 mg/kg/día, y más preferiblemente para humanos entre aproximadamente 0.01 y 1 mg/kg/día para la hormona. Si se da continuamente, el compuesto terapéutico se administra típicamente a una relación de dosis de aproximadamente 1 µg/kg/hora a aproximadamente 60 µg/kg/hora, ya sea mediante 1-4 inyecciones por día o mediante infusiones subcutáneas continuas, por ejemplo, utilizando una mini-bomba. Una solución intravenosa en bolsa también puede ser empleada. La longitud del tratamiento necesaria para observar cambios y el intervalo después del tratamiento para que ocurran las respuestas parece variar dependiendo de los efectos deseados. Los compuestos terapéuticos pueden ser administrados oralmente, rectamente, parenteralmente, intracistemalmente, intravaginalmente, intraperitonealmente, tópicamente (mediante polvos, ungüentos, geles, gotas o parche transdermal), bucalmente, o como una aspersión oral o nasal. "Vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un llenador, diluyente, material encapsulante o cualquier auxiliar de formulación no tóxico sólido, semisólido o líquido. El término "parenteral" como se utiliza en la presente invención se refiere a los modos de administración los cuales incluyen inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraestemal, subcutánea e intraarticular. « Los compuestos terapéuticos de la invención también se administran adecuadamente mediante sistemas de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de compuestos terapéuticos de liberación sostenida se administran localmente, rectamente, parenteralmente, intracistemalmente, intravaginalmente, intraperitonealmente, tópicamente (mediante polvos, ungüentos, geles, gotas o parche transdermal), bucalmente, o como una aspersión oral o nasal. "Vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un llenador, diluyente, material encapsulante o cualquier auxiliar de formulación no tóxico sólido, semisólido o líquido. El término "parenteral" como se utiliza en la presente invención se refiere a los modos de administración los cuales ¡ncluyen inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, subcutánea e intraarticular. Los compuestos terapéuticos de la invención también se administran adecuadamente mediante sistemas de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de compuestos terapéuticos de liberación sostenida incluyen materiales poliméricos adecuados (tales como, por ejemplo, matrices poliméricas semipermeables en la forma de artículos con figura, por ejemplo, películas, o microcápsulas), materiales hidrófobos adecuados (por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, y derivados escasamente solubles (tales como, por ejemplo, una sal escasamente soluble).

Las matrices de liberación sostenida incluyen poliláctidos (patente de E.U.A. No. 3, 773, 919, EP 68, 481), con polímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers 22: 647-656 (1983)), poli (2-hidroxietil metacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981), y Langer, Chem. Tech. 12: 98-105 (1982)), acetato de etilen vinilo (Langer et al., Id.) o ácido poli-D-(-)-3- hidroxibutírico (EP 133, 988). Los compuestos terapéuticos de liberación sostenida también incluyen compuestos terapéuticos de la invención atrapados liposomalmente (véase generalmente, Langer, Science 249: 1627-1633 (1990); Treat et al., en Liposomes in the Therapy of Infedious Disease and Cáncer, Lopez-Berestein y Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 317-327 y 363-366 (1989)). Los liposomas que contienen el compuesto terapéutico se preparan mediante métodos conocidos per se: DE 3, 218, 121; Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 82: 3688-3692 (1986); Hwang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 77: 4030-4034 (1980); EP 62, 322; EP 36, 676; EP 88, 046; EP 143, 949; EP 142, 641 ; solicitud de patente japonesa 83-118008; patentes de E.U.A. Nos. 4, 485, 045 y 4, 544, 546; y EP 102, 324. Ordinariamente, los llposomas son de tipo unilamelar más pequeño (aproximadamente 200-800 Angstroms) en los cuales el contenido de líquido es mayor que aproximadamente 30 moles porcentuales de colesterol, la proporción seleccionada siendo ajustada para el compuesto terapéutico óptimo.

En incluso una modalidad adicional, los compuestos terapéuticos de la invención se administran por medio de una bomba (véase Langer, anteriormente mencionado; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88: 507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321 : 574 (1989)). Otros sistemas de liberación controlada se discuten en la revisión por Langer (Science 249:1527-1633 (1990)). Para la administración parenteral, en una modalidad, el compuesto terapéutico se formula generalmente mediante mezclado al grado deseado de pureza, en una unidad de dosis en forma inyectable (solución, suspensión, o emulsión), con un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, uno que no es tóxico a los recipientes a las dosis y concentraciones empleadas y es compatible con otros ingredientes de la formulación. Por ejemplo, la formulación preferiblemente no incluye agentes oxidantes y otros compuestos que se sabe que son deletéreos al compuesto terapéutico. Generalmente, las formulaciones se preparan mediante el contado del compuesto terapéutico uniformemente e íntimamente con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos, o ambos. Entonces, si es necesario, ai producto se le da forma hacia la formulación deseada. Preferiblemente el vehículo es un vehículo parenteral, más preferiblemente una solución que es isotónica con la sangre del recipiente. Los ejemplos de dichos vehículos portadores incluyen agua, solución salina, solución de Ringer, y solución de dextrosa. Los vehículos no acuosos tales como aceites fijados y etil oleato también son útiles en la presente invención, así como ios liposomas. El vehículo adecuadamente contiene cantidades menores de aditivos tales como sustancias que mejoran la isotonicidad y la estabilidad química. Dichos materiales no son tóxicos a los recipientes a las dosis y concentraciones empleadas, incluyen reguladores de pH tales como fosfato, citrato, succinato, ácido acético, y otros ácidos orgánicos o sus sales; los antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menores de aproximadamente 10 residuos), por ejemplo, poliarginina o tripéptidos; proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico, o arginina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones tales como sodio; y/o agentes tensioactivos no iónicos tales como polisorbatos, poloxámeros, o PEG. , El compuesto terapéutico típicamente se formula en dichos vehículos a una concentración de aproximadamente 0.1 mg/ml a 100 mg/ml, preferiblemente 1-10 mg/ml, a un pH de aproximadamente 3 a 8. Se entenderá "que el uso de ciertos excipientes externos, vehículos, o estabilizantes resultará en la formación de sales polipeptídicas.

Cualquier compuesto farmacéutico utilizado para administración - terapéutica puede estar estéril. La esterilidad se logra fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles (por ejemplo, membranas de 0.2 mieras). Los compuestos terapéuticos generalmente se colocan dentro de un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón capaz de ser perforado mediante una aguja de inyección hipodérmica. Los compuestos terapéuticos ordinariamente se almacenarán en recipientes unitarios o recipientes de múltiples dosis, por ejemplo, ampolletas selladas o viales, como una solución acuosa o como una formulación liofilizada para reconstitución. Como un ejemplo de una formulación liofilizada, viales de 10 ml se llenan con d ml de solución Terapéutica acuosa al 1 % (p/v) esterilizada mediante filtración, y la mezcla resultante se liofiliza. La solución de infusión se prepara mediante la reconstitución del compuesto terapéutico liofilizado utilizando agua bacteriostática para inyección. La invención también provee un paquete o equipo farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenados con uno o más de los ingredientes de los compuestos terapéuticos de la invención. Asociado con dicho recipientes(s) puede estar una nota en la forma prescrita por una agencia gubernamental regulando la elaboración, uso o venta de los compuestos farmacéuticos o productos biológicos, cuya nota refleja la aprobación por la agencia de la elaboración, uso o venta para administración en humanos. Además, los compuestos terapéuticos pueden emplearse en conjunción con otros compuestos terapéuticos. Los compuestos terapéuticos de la Invención pueden administrarse solos con en combinación con adyuvantes. Los adyuvantes que pueden administrarse con los compuesto terapéuticos de la invención incluyen, pero no se limitan a, alumbre, alumbre más deoxicolato (ImnunoAg), MTP-PE (Biocine Cof.), QS21 (Genentech, Inc.), BCG, y MPL. En una modalidad específica, los compuestos terapéuticos de la invención se administran en combinación con alumbre. En otra modalidad específica, los compuestos terapéuticos de la invención se administran en combinación con • . — , QS-21. Los adyuvantes adicionales que pueden administrarse con los compuesto terapéuticos de la invención incluyen, pero no se limitan a, inmunomodulador monofosforil lípido, AdjuVax 100 a, QS-21, QS-18, CRL1006, sales de aluminio, MF-59, y tecnología de adyuvante Virosomal. Las vacunas que pueden ser administradas con los compuestos terapéuticos de la invención incluyen, pero no se limitan a, vacunas dirigidas hacia la protección en contra de MMR (sarampión, parotiditis, rubéola), polio, varicela, tétanos/difteria, hepatitis A, hepatitis B, influenza hemófila B, tosferina, neumonía, influenza, enfermedad de Lyme, rotavirus, cólera, fiebre amarilla, encefalitis japonesa, poliomielitis, rabia, fiebre tifoidea, y pertussis. Las combinaciones pueden administrarse ya sea concomitantem- ente, por ejemplo, como una mezcla, separadamente pero simultáneamente o concurrentemente; o seriamente. Esto incluye presentaciones en las cuales los agentes combinados se administran juntos como una mezcla terapéutica, y también procedimientos en los que los agentes combinados se administran separadamente pero simultáneamente, por ejemplo, como a través de líneas intravenosas separadas dentro del mismo individuo. La administración "en combinación" incluye adicionalmente la administración separada de uno de los compuestos o agentes dados inicialmente, seguido por el segundo. Los compuestos terapéuticos de la invención pueden administrarse solos o en combinación con otros agentes terapéuticos. Los agentes Terapéuticos que pueden ser administrados en combinación con los compuestos terapéuticos de la invención, incluyen pero no se limitan a, otros miembros de la familia TNF, agentes quimioterapéuticos, antibióticos, antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos, agentes inmunoterapéuticos convencionales, citocinas y/o fadores de crecimiento. Las combinaciones pueden administrarse ya sea concomitantemente, por ejemplo, como una mezcla, separadamente pero simultáneamente o concurrentemente; o secüencialmente. Esto incluye presentaciones en las cuales los agentes combinados se administran juntos como una mezcla terapéutica, y también procedimientos en los que los agentes combinados se administran separadamente pero simultáneamente, por ejemplo, como a través de líneas intravenosas separadas dentro del mismo individuo. La administración "en combinación" incluye adicionalmente la administración separada de uno de los compuestos o agentes dados inicialmente, seguido por el segundo.

En una modalidad, los compuestos terapéuticos de la invención se administran en combinación con miembros de la familia TNF, TNF, molecular relacionadas con TNF o moléculas semejantes a TNF también pueden administrarse con los compuestos terapéuticos de la invención incluyendo, pero no limitadas a, formas solubles de TNF-alfa, linfotoxina-alfa (LT-alfa, también conocida como TNF-beta), LT-beta (encontrada en complejo heterotrímero LT-alfa2-beta), OPGL, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, 4-1 BBL, DcR3, OX40L, TNF-gamma (publicación internacional No. WO 96/14328) AIM-I (publicación internacional No. WO 97/33899), endocina-alfa (publicación internacional No. WO 98/30694), TR6 (publicación internacional No. WO 98/30694), OPG, y neurocina-alfa (publicación internacional No. WO 98/18921, OX40, y factor de crecimiento nervioso (NGF), y formas solubles de Fas, CD30, CD27, CD40 y 4-IBB, TR2 (publicación internacional No. WO 96/34095), DR3 (publicación internacional No. WO 97/33904), DR4 (publicación internacional No. WO 98/32856), TR5 (publicación internacional No. WO 98/30693), TR6 (publicación internacional No. WO 98/30694), TR7 (publicación internacional No. WO 98/41629), TRANK, TR9 (publicación internacional No. WO 98/56892), TR10 (publicación internacional No. WO 98/54202), 312C2 (publicación internacional No. WO 98/06842), y TR12, y formas solubles de CD154, CD70, y CD153. En ciertas modalidades, los compuestos terapéuticos de la invención se administran en combinación con agentes antiretrovirales, inhibidores de transcriptasa reversa nudeósido/nucleótido (NRTI), inhibidores de transcriptasa reversa no nucleósido (NNRTi), y/o inhibidores de proteasa (Pl). NRTI que pueden ser administradas en combinación con los compuestos terapéuticos de la invención, incluyen, pero no se limitan a, RETROVIR™ (zidovudina/AZT), VIDEX™ (didanosina/ddl), HMD™ (zaicitabina/ddC), ZERIT™ '(stavudina/d4T), EPIVIR™ (lamivudina/3TC), y COMBIVIR™ (zidovudina/lamívudina). NNRTI que pueden administrarse en combinación con los compuestos terapéuticos de la invención, incluyen, pero no se limitan a, VIRAMUNE™ (nevirapina), RESCRIPTOR™ (delavirdina), y SUSTIVA™ (efavirenz). Los inhibidores de proteasa que pueden administrarse en combinación con los compuestos terapéuticos de la invención, incluyen pero no se limitan a, CRIXIVAN™ (indinavir), NORVIR™ (ritonavir), INVIRASE™ (saquinavir), y V1RACEPT™ (nelfinavir). En una modalidad específica, los agentes antiretrovirales, inhibidores de transcriptasa reversa de nucleósido, inhibidores de transcriptasa reversa no nucleósido, y/o inhibidores de proteasa pueden ser utilizados en cualquier combinación con los compuestos terapéuticos de la invención para tratar el SIDA y/o para prevenir o tratar la infección por VIH. NRTI adicionales incluyen LODENOSIDE ™ (F-ddA; una NRT1 adenosina ácido-estable); Triangle/Abbott; COVIRACIL ™ (emtricitabina/FTC; estructuralmente relacionada a lamivudina (3TC) con una adividad in vitro de 3 a 10 veces mayor parte, triangle/Abbott); dOTC (BCH-10652, también estructuralmente relacionada con lamivudina retiene adividad en contra de una proporción substancial de aislados resistentes a lamivudina; Biochem Pharma); Adefovir (sin aprobación para terapia anti-HIV por FDA; Gilead Sciences); PREVEON® (Adefovir Dipivoxil, ei profármaco activo de adefovir; su forma activa es PMEA-pp); TENOFOVIR™ (bis-POC PMPA, un profármaco PMPA; Gilead); DAPD/DXG (metabolito activo de DAPD; Tríangle/Abbott); D-D4FC (relacionada con 3TC, con actividad en contra de virus resistentes a AZT/3TC); GW420867X (Glaxo Wellcome); ZIAGEN™ (abacavir/159U89; Glaxo Wellcome Inc.); CS-87 (3' azIdo^'.S'-dideoxiuridina; WO 99/66936); y S-acil-2-tioetil (formas de profármacos de ß-L-FD4C y ß-L-FddC que contienen (SATE) (WO 98/17281). NNRTI adicionales incluyen COACTINON™ (Emivirine/MKC-442, un NNRTI potente de la clase HEPT; Tríangle/Abbott); CAPRAVIRIDINE™ (AG-1549/S-1163, una siguiente generación NNRTI con actividad en contra de virus que contienen la mutación K103N; Agouron); PNU-14721 (tiene de 20 a 60 veces mayor actividad que su predecesor delavirdina y es adivo en contra de mutantes K103N; Pharmacia & Upjohn); DPC-961 y DPC-963 (derivados de segunda generación de efavirenz, diseñado para ser adivo en contra de virus con la mutación K103N; DuPont); GW-420867X (tiene 25 veces mayor actividad que HBY097 y es activo en contra de mutantes K103N; Galxo Wellcome); CALANOLIDE A (agente que ocurre de manera natural a partir del árbol de látex; adivo en contra de virus que contienen ya sea alguna o ambas mutaciones Y181C y K103N); y Propolis (WO 99/49830). Los inhibidores de proteasa adicionales incluyen LOPINAVIR™ (ABT378/p Abbott Laboratories); BMS-232632 (un azapéptido; Brystol-Myres Squibb); TIPRANAVIR™ (PNU-140690, una dihidropirona no peptídica; Pharmacia & Upjohn); PD-178390 (una dihidropirona no peptídica; Parke-Davis); BMS 232632 (un azapéptido; Bristol Myers Squibb); L-756, 423 (un análogo de indinavir; Merck); DMP-450 (un compuesto cíclico de urea; Avid y DuPont); AG-1776 (un peptidomimético con adividad in vitro en contra de virus resistentes a inhibidores de proteasa, Agouron); VX-176/GW-433908 (profármaco de fosfato de amprenavir; Vértex & Glaxo Wellcome); CGP 61755 (Ciba); y AGENERASE™ (amprenavir; Glaxo Wellcome Inc). Los agentes antinetrovirales adicionales incluyen inhibidores de fusión/eniazadores a gp41. Los inhibidores de fusión/enlazadores a gp41 incluyen a T-20 (un péptido a partir de los residuos 643-378 del ectodominio de proteína transmembranal VIH gp41 el cual se une a gp41 en su estado en reposo y previene la transformación al estado fusogénico; Trimeris) y T-1349 (un inhibidor de fusión de segunda generación; Trimeris). Los agentes antirretrovirales adicionales incluyen inhibidores de fusión/antagonistas del receptor de quimiocina. Los inhibidores de fusión/antagonistas del receptor de quimiocina incluyen antagonistas CXCR4 tales como AMD 3100 (un biciciamo), SDF-1 y sus análogos, y ALX40-4C (un péptido catiónico), T22 (un péptido de 18 aminoácidos; Trimeris) y los análogos de T22, T134 y T140; antagonistas CCRd tales como RANTES (9-68), AOP-RANTES, NNY-RANTES, y TAK-779; y antagonistas CCR5/CXCR4 tales como NSC 651016 (un análogo de distamicina). También se incluyen los antagonistas CCR2B, CCR3, y CCRd. Los antagonistas al receptor de quimiocina tales como RANTES, SDF-1 , MIP-1a, MIP-1ß, etc., también pueden inhibir la fusión. Los agentes antirretrovirales adicionales incluyen inhibidores de integrasa. Los inhibidores de integrasa incluyen ácidos dicafeilqu ínicos (DFQA); ácido L-chicórico (un ácido dicafeoiltartárico (DCTA)); quinalizarina (QLC) y antraquinonas relacionadas; ZINTEVIR™ (AR 177, un oligonucleótido que probablemente adúa en la superficie celular más bien que a través de un verdadero inhibidor de integrasa; Arondex); y naftoles tales como aquellos descritos en WO 98/50347. Los agentes antinetrovirales adicionales incluyen compuestos semejantes a hidroxiurea tales como BCX-34 (un inhibidor de purina nucleósido fosforilasa; Byocryst); inhibidores de ribonucleótido reductasa tales como DI DOX™ (Moiecules for Health); inhibidores de inosina monofosfato deshidrogenasa (IMPDH) tales como VX-497 (Vértex); y ácidos mivofólicos tales como CelICept (mofetil micofenolato; Roche). Los agentes antirretrovirales adicionales incluyen inhibidores de integrasa viral, inhibidores de transiocación nuclear del genoma viral tales como compuestos de arilen (bis)metilcetona; inhibidores de la entrada dei VIH tales como AOP-RANTES, NNY-RANTES y proteína de fusión RANTES-lgG, complejos solubles de RANTES y glucosaminoglucanos (GAG), y AMD-3100; inhibidores de dedos de zinc de la nucleocápslde tales como compuestos de ditiano; blancos a Tat y Rev HIV; y fármacopotenciadores tales como ABT-378.

Otras terapias antirretrovirales y terapias adjuntas incluyen cítocinas y linfocinas tales como MIP-1a, MIP-1ß, SDF-1 a, IL-2, PROLEUKIN™ (aldeleukin/L2-7001 ; Chiron), IL-4, IL-10, IL-12, e IL-13; interferones tales como IFN-c.2a; antagonistas de TNF, NFKB, GM-CSF, M- CSF, e IL-10; agentes que modulan la activación inmune tales como ciclosporina y prednisona; vacunas tales como Remune™ (HIV Immunogen), APL 400-003 (ApoIIon), gp120 recombinante y fragmentos, glucoproteína de cubierta bivalente recombinante (B/E), rgp 120CM 235, MN rgp 120, SF-2 rgp 120, complejo gp 120/CD4 soluble, proteína Delta JR-FL, péptido sintético ramificado derivado a partir del dominio discontinuo gp 120 C3/c4, ¡mnunógenos competentes de fusión, y vacunas Gag, Pol, Nef, y Tat; terapias basadas en gen tales como elementos supresores genéticos (GSE; WO 98/54366), e ¡ntracinas (quimiocinas CC genéticamente modificadas dirigidas al RE para bloquear la expresión superficial de CCRd recientemente sintetizado (Yang et al., PNAS 94: 11667-72 (1997); Chen et al., Nat. Med. 3: 1110-16 (1997)); anticuerpos (por ejemplo, anticuefos anti-CXCR4 tales como el anticuerpo anti-CXCR4 12G5, anticuerpos anti-CCR5 tales como los anticuefos anti-CCRd 2D7, 6C7, PA8, PA9, PA10, PA11, PA12, y PA14, anticuerpos anti-CD4 tales como los anticuefos anti-CD4 Q4120 y RPA-T4, anticuefos anti-CCR3 tales como el anticuefo anti-CCR3 7B11 , anticuefos "anti-gp120 tales como los anticuerpos anti-gp120 17b, 48d, 447-62D, 257-D, 268-D, y 50.1 , anticuerpos anti-Tat, anticuerpos anti-TNF-a, y anticuefo monoclonal 33A); agonistas y antagonistas del receptor de aril hidrocarbono , (AH) tales como TCDD, S.S'^^'.d-pentaclorobifenil.S.S'^^'-tetraclorobifenilo, y a-naftoflavona (WO 98/30213); y antioxidantes tales como éster ?-L-glutamil- L-cistein etilo (?-GCE; WO 99/66764). Los agentes adicionales que pueden ser utilizados con compuestos terapéuticos de la presente invención con o sin los agentes anteriormente mencionados incluyen agentes anti-linfoproliferativos tales como los ácidos all-trans-retinoicos (all-trans-RA), IFN-?, EPOCH, y Cidofovir; inhibidores de la angiogénesis tales como talidomida; agentes quimioterapéuticos cistostáticos tales como hidroxiurea; agentes anti-infección tales como Rifabutina, Isoniazida, y Rifampicina; y agentes anti-demencia tales como LU 02-584 (PCI-1189; Centuar Pharmaceuticals Inc.). Las dosis de estos diversos agentes se conocen en la técnica, y puede encontrarse en, por ejemplo, referencias de consulta del médico y la literatura científica. Los virus muían muy rápidamente debido a la propensión al error ' de la transcriptasa reversa (RT), desarrollando así resistencia a múltiples agentes terapéuticos. Mediante la dirección a múltiples puntos en la vía viral (RT, proteasa, entrada viral y neutralización viral) utilizando terapias de combinación, la alta velocidad de mutación debe atacarse efedivamente. Por lo tanto, los compuestos terapéuticos de la invención pueden utilizarse con combinaciones de agentes antirretrovirales, incluyendo combinaciones de dos-fármacos, tres-fármacos, cuatro-fármacos, cinco-fármacos, seis-fármacos, siete-fármacos, ocho-fármacos, nueve-fármacos y combinaciones mayores.

Dichas combinaciones y agentes antinetrovirales pueden ser referidos en la literatura como terapia antirretroviral activa (ART), terapia antirretrovirai altamente activa (HAART), HAART continua, HAART intermitente, HAART "mega" (más de 4, 5, 6, 7, u 8, y preferiblemente más de 9 agentes), terapia intensiva de multi-fármaco a dosis elevadas, intensificación temprana del tratamiento (ETI), terapia máximamente asistida (MAT), terapia auto-administrada (SAT), IL-2 recombinante de humano subcutánea en pacientes infectados con VIH con conteos bajos de CD4+ bajo terapia antirretroviral activa (SILCAAT), y terapia de mantenimiento. Preferiblemente, los compuestos terapéuticos de la invención se utilizan en combinación con terapia antinetroviral altamente activa. Los compuestos terapéuticos de la invención también pueden utilizarse en combinación con agentes adjuntos, tales como aquellos anteriormente mencionados y descritos de otra manera en la presente invención y aquellos bien conocidos en la técnica, ya sea solos o junto con agentes antirretrovirales. Cuando los compuestos terapéuticos de la invención se combinan con cualesquiera de los agentes anteriormente mencionados o combinaciones de agentes, las dosis se ajustan como sea necesario. NRTI generalmente no requieren ajuste de dosis cuando se combinan, pero NNRTI y Pl pueden afedar cada uno otros niveles y potencias. La guía para dichos ajustes de dosis y para iniciar, continuar, manejar, alterar, y mantener la terapia antinetroviral en general se conoce bien por los pradicantes y está fácilmente disponible en, por ejemplo, Guidelínes for the Use of Antiretroviral Agents In HlV-Infected Adults and Adolescents, Panel on Clinical Practices for Treatment of HIV Infection, Dept. Helath and Human Services y Fundación Henry J. Kaiser, enero 28 del 2000, y «http://www.hivatis.org» y otra literatura científica. En otras modalidades, los compuestos terapéuticos de la invención pueden administrarse en combinación con agentes anti-infección oportunista. Los agentes anti-oportunista que pueden administrarse en combinación con los compuestos terapéuticos de la invención, incluyen, pero no se limitan a, TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLE™, DAPSONE™ PENTAMIDINE™, ATOVAQUONE™, ISONIAZID™ TMRIFAMPIN™ PYRAZINAMIDE™, ETHAMBUTOL™, RIFABUTIN™, CLARITHROMYCIN™ AZITHROMYCIN™, GANCICLOVIR™, FOSCARNET™, CIDOFOVIR™ FLUCONAZOLE™, ITRACONAZOLE™, KETOCONOZOLE™, ACYCLOVIR™ FAMCICOLVIR™, PYRIMETHAMINE™, LEUCOVORIN™, NEUPOGEN™ (filgastrim/G-CSF), y LEUKINE™ (sargramostim/GM-CSF). En una modalidad específica, los compuestos terapéuticos de la invención se utilizan en cualquier combinación con TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLE™, DAPSONE™, PENTAMIDINE™, y/o ATOVAQUONE™ para tratar profilácticamente o prevenir una infección oportunista por Pneumocytis carinii. En otra modalidad específica, los compuestos terapéuticos de la invención se utilizan en cualquier combinación con ISONIAZID™, RIFAMPIN™, PYRAZINAM1DE™, y/o ETHAMBUTOL™ para tratar profilácticamente o prevenir una infección compleja oportunista por Mycobacterium avium. En otra modalidad específica, los compuestos terapéuticos de la invención se utilizan en cualquier combinación con RIFABUTIN™, CLARITHROMYCIN™, y/o AZITHROMYCIN™ para tratar profilácticamente q^ prevenir una infección oportunista por Mycobacterium tuberculosis. En otra modalidad específica, los compuestos terapéuticos de la invención se utilizan en cualquier combinación con GANCICLOV1R™, FOSCARNET™, y/o CIDOFOVIR™ para tratar profilácticamente o prevenir una infección oportunista por citomegalovirus. En otra modalidad específica, los compuestos terapéuticos de la invención se utilizan en cuenta combinación con FLUCONAZOLE™, ITRACONAZOLE™, y/o KETOCONOZOLE™ para tratar profilácticamente o prevenir una infección oportunista fungal. En otra modalidad específica, los compuestos terapéuticos de la invención se utilizan en cualquier combinación con ACYCLOVIR™, y/o FAMCICOLVIR™ para tratar profilácticamente o prevenir una infección oportunista por virus de herpes simplex tipo I y/o tipo II. En otra modalidad específica, los compuestos terapéuticos de la invención se utilizan en cualquier combinación con PYRIMETHAMINE™, y/o LEUCOVORIN™ para tratar profiládicamente o prevenir una infección oportunista por Toxopiasma gondii. En otra modalidad específica, los compuestos terapéuticos de la invención se utilizan en combinación con LEUCOVORIN™, y/o NEUPOGEN™ para tratar profilácticamente o prevenir una infección oportunista bacteriana. En una modalidad adicional, los compuestos terapéuticos de la invención se administran en combinación con un agente antiviral. Los agentes antivirales que pueden administrarse con los compuestos terapéuticos de la invención incluyen, pero no se limitan a, acyclovir, ribavirin, amantadina, y remantidina. En una modalidad adicional, los compuestos terapéuticos de la invención se administran en combinación con un agente antibiótico. Los agentes antibióticos , que pueden administrarse con los compuestos terapéuticos de la invención incluyen, pero se limitan a, amoxicilina, beta-lactamasas, aminoglucósidos, beta-ladamo (glucopéptido), beta-lactamasas, Clindamicina, cloramfenicol, cefalosporinas, ciprofloxaclna, ciprofloxacina, eritromicina, fluoroquinolonas, macrólidos, metronidazol, penicilinas, quinolonas, rifampicina, estreptomicina, sulfonamida, tetraciciinas, trimetoprima, trimetoprim-sulfamtoxazol, y vancomicina. Los agentes inmunosupresores no específicos convencionales, que pueden administrarse en combinación con los compuestos terapéuticos de la invención incluyen, pero no se limitan a, esteroides, ciclosporina, análogos de ciclosporina, ciciofosfamida metilprednisona, prednisona, azatioprina, FK-506, 1 d-deoxiespergualina, y otros agentes inmunosupresores que actúan mediante la supresión de la función de las células T de respuesta. En modalidades específicas, ios compuestos terapéuticos de la invención se administran en combinación con ¡nmunosupresores. Las preparaciones de inmunosupresores que pueden administrarse con los compuestos terapéuticos de la invención incluyen, pero no se limitan a, OTHOCLONE™ (OKT3), SANDIIMUNE™ /NEORAL™ / SANGDYA™ (ciclosporina), PROGRAF™ (tacrolimus), CELLCEPT (micofenolato), Azatioprina, glucorticosteroides, y RAPAMUNE™ (sirolimus). En una modalidad específica, los inmunosupresores pueden ser utilizados para prevenir el rechazo de órganos o transplante de médula ósea. En una modalidad adicional, los compuestos terapéuticos de la invención se administran solos o en combinación con una o más preparaciones intravenosas de globulina inmune. Las preparaciones intravenosas de globulina inmune que pueden administrarse con los compuestos terapéuticos de la invención incluyen, pero no se limitan a, GAMMAR™, IVEEGAM™, SANDOGLOBULIN™, GAMMAGARD S/D™, y GAMIMUNE™. En una modalidad específica, los compuestos terapéuticos de la invención se administran en combinación con preparaciones intravenosas de globulina inmune en terapia de transplante (por ejemplo, transplante de médula ósea). En una modalidad adicional, los compuestos terapéuticos de la invención se administran solos o en combinación con un agente antiinflamatorio. Los agentes anti-inflamatorios que pueden administrarse con los compuestos terapéuticos de la invención incluyen, pero no se limitan a, glucocorticoides y los anti-inflamatorios no esteroideos, derivados del ácido aminoarilcarboxílico, derivados del ácido arilacético, derivados del ácido arilbutírico, ácidos arilcarboxílicos, derivados del ácido arilpropiónico, pirazoles, pirazolonas, derivados del ácido salicílico, triazincarboxamidas, ácido e-acetamidocaproico, S-adenosilmetionina, ácido 3-amino-4-hidroxibutírico, amixetrina, bendazac, benzidamina, bucoloma, difenpiramida, ditazol, emorfazona, guaiazulen, nabumetona, nimesulido, orgoteina, oxaceprol, paranilina, perisoxal, pifoxima, procuazona, proxazol, y tenidap. En otra modalidad, las composiciones de ia invención se administran en combinación con un agente quimioterapéutico. Los agentes quimioterapéuticos que pueden ser administrados con los compuestos terapéuticos de la invención incluyen, pero no se limitan a, derivados de antibióticos (por ejemplo, doxorubicina, bleomicina, daunorubicina, y dactinomicina); antiestrógenos (por ejemplo, tamoxifén); antimetabolitos (por ejemplo, fluorouracilo, d-FU, metotrexato, floxuridina, interferón a!fa-2b, ácido glutámico, plicamicina, mercaptopurina, y 6-tioguanina); agentes citotóxicos (por ejemplo, carmustina, BCNU, lomustina, CCNU, arabinósido citosina, ciciofosfamida, estramustina, hidroxiurea, procarbazina, mitomicina, busulfán, cis-platina, y sulfato de vincristina); hormonas (por ejemplo, medroxiprogesterona, fosfato sódico de estramustina, etinil estradiol, estradiol, acetato de megestrol, metiltestosterona, difosfato de dietilstilbestrol, clorotrianiseno, y testolactona); derivados de mostaza nitrogenada (por ejemplo, nefalen, corambucii, mecloretamina (mostaza nitrogenada) y tiotepa); esteroides y combinaciones (por ejemplo, fosfato sódico de betametasona); y otros (por ejemplo, dicarbazina, asparaginasa, mitotano, sulfato de vincristina, sulfato de vinblastina, y etopósido). En una modalidad específica, los compuestos terapéuticos de la invención se administran en combinación con CHOP (ciciofosfamida, doxorubicina, vincristina, y prednisona) o cualquier combinación de los componentes de CHOP. En otra modalidad, los compuestos terapéuticos de la invención se administran en combinación con Rituximab. En una modalidad adicional, los compuestos terapéuticos de la invención se administran con Rituxmab y CHOP, o Rituxmab y cualquier combinación de los componentes de CHOP. En una modalidad adicional, los compuestos terapéuticos de la invención se administran en combinación con citocinas. Las citocinas que pueden administrarse con los compuestos terapéuticos de la invención incluyen, pero no se limitan a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-d, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-16, anti-CD40, CD40L, IFN-gamma y TNF-alfa. En otra modalidad, los compuestos terapéuticos de la Invención pueden administrarse con cualquier interieuclna, incluyendo, pero no limitadas a, IL-1alfa, IL-1beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-d, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 , IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, e lL-21. Én una modalidad adicional, los compuestos terapéuticos de la invención se administran en combinación con proteínas angiogénicas. Las proteínas angiogénicas que pueden ser administradas con los compuestos terapéuticos de la invención incluyen, pero no se limitan a, Factor de Crecimiento Derivado de Glioma (GDGF), como se describe en la patente Europea número EP-399816; Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas-A (PDGF-A), como se describe en la patente Europea número EP-282317; Factor de Crecimiento de Placenta (PIGF), como se describe en la publicación internacional número WO 92/06194; Fador de Crecimiento de PIacenta-2 (PIGF-2), como se describe en Hauser et al., Growth Factors, 4: 259-268 (1993); Factor de Crecimiento Vascular Endotelial (VEGF), como se describe en la publicación internacional número WO 90/13649;Factor de Crecimiento Vascular Endotelial-A (VEGF-A), como se describe en la patente europea número EP-506477; Fador de Crecimiento Vascular Endotelial-2 (VEGF-2), como se describe en la publicación internacional número WO 96/39515; Factor de Crecimiento Vascular Endotelial B (VEGF-3); Factor de Crecimiento Vascular Endotelial B-186 (VEGF-B186), como se describe en la publicación internacional número WO 96/26736; Factor de Crecimiento Vascular Endotelial-D (VEGF-D), como se describe en la publicación internacional número WO 98/02543; Factor de Crecimiento Vascular Endotelial-D (VEGF-D), como se describe en la publicación internacional número WO 98/07832; y Factor de Crecimiento Vascular Endotelial-E (VEGF-E), como se describe en -t * " la pate'nte alemana número DE 19639601. Las referencias anteriormente mencionadas se incorporan aquí como referencia en la presente invención. En una modalidad adicional, los compuestos terapéuticos de la invención se administran en combinación con factores de crecimiento hematopoiéticos. Los factores de crecimiento hematopoiéticos que pueden administrarse con los compuestos terapéuticos de la invención incluyen, pero no se limitan a, LEUKINE™ (SARGRAMOSTIM™) y NEUPOGEN™ (FILGRASTIM™). En una modalidad adicional, ios compuestos terapéuticos de la invención se administran en combinación con factores de crecimiento de fibroblasto. Los fadores de crecimiento de fibroblasto que pueden administrarse con los compuestos terapéuticos de la invención incluyen, pero no se limitan a, FGF-1 , FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-11 , FGF-12, FGF-13, FGF-14, y FGF-1 d. En otras modalidades, los compuestos terapéuticos de la invención pueden administrarse en combinación con insulina de porcino o de humano o mezclas de las mismas; análogos de insulina; insulina humana recombinante tales como HUMULIN™ y NOVOLIN™; agentes hlpoglucémlcos orales tales como ORAMIDE™ y ORINASE™ (tolbutamida), DIABINESE™ (clorpropamida), TOLAMIDA™ y TOL1NASE™ (tolazamida), DYMELOR™ (acetohexamida), glibenclamida, MICRONASE™, DIBETA™ y GLYMASE™ (gliburida), GLUCOTROL™ (glipzida), y DIAMICRON™ (gliclazida), GLUCOPHAGE™ (metformina), PRECOSE™ (acarbosa), AMARYL™ (giimepirida), y ciglitazona; tiazolidinedionas (TZD) tales como rosigiitazona, AVANDIA™ (maleato de rosiglitazona), ACTOS™ (piogliatazona), y troglitazona; inhibidores de alfa-glucosidasa; glucagon de bovino o de porcino; somatostatinas tales como SANDOSTATIN™ (odreótido); y diazóxidos tales como PROGLYCEM™ (diazóxido). En incluso otras modalidades, los compuestos terapéuticos de la invención se administran en combinación con uno o más de los siguientes: un agente antidiabético de biguanida, un agente antidiabético de giitazona, y un agente antidiabético de sulfonilurea.

- En modalidades adicionales, los compuestos terapéuticos de la invención se administran en combinación con otros regímenes terapéuticos o profilácticos, tales como, por ejemplo, terapia de radiación.

EJEMPLO 29 Métodos de tratamiento para niveles disminuidos del receptor de quimiocina de proteína G La presente invención se refiere a un método para tratar a un individuo que necesita un nivel incrementado de polipéptido de la invención en el cuefo comprendiendo la administración a dicho individuo de una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efediva de un agonista de la invención (incluyendo polinucleótidos de la invención). Además, se apreciará que las condiciones ocasionadas por una disminución en el nivel de expresión estándar o normal del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) en un individuo podrá ser tratado mediante la administración de un agonista del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5), preferentemente en la forma secretada. Por lo tanto, la invención también provee un método de tratamiento para un individuo que necesita un nivel incrementado de polipéptido del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) que comprende administrar a dicho individuo un compuesto terapéutico que comprende una cantidad del agonista del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) para 42 incrementar el nivel de actividad del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) en dicho individuo. Por ejemplo, un paciente con niveles disminuidos de polipéptido del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) recibe una dosis diaria de 0.1-100 µg/kg del agonista por seis días consecutivos. Los detalles exactos del esquema de dosificación, basándose en la administración y formulación, se proveen en el ejemplo 28.

EJEMPLO 30 Método de tratamiento de niveles incrementados del receptor de quimiocina de proteína G La presente invención también se refiere a un método para tratar a un individuo que necesita de un nivel disminuido de un pollpéptido de la invención en el cuefo que comprende administrar a dicho individuo una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efediva de un antagonista de la invención (incluyendo polipéptidos y anticuerpos de la invención). En un ejemplo, la tecnología de antisentido se utiliza para inhibir la producción del receptor de quimiocina de proteína G. Esta tecnología es un ejemplo de un método para disminuir los niveles del polipéptido del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd), preferiblemente una forma soluble, debido a una variedad de etiologías, tales como cáncer.

Por ejemplo, un paciente diagnosticado con niveles anormalmente incrementados del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) se administra intravenosamente con polinucleótido antisentido a O.d, 1.0, 1.5, 2.0 y 3.0 mg/kg por día por 21 días. Este tratamiento se repite después de un período de descanso de 7 días si el tratamiento se toleró bien. La formulación de polinucleótido antisentido se provee en el ejemplo 28. Otros métodos para disminuir el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) o para inhibir su actividad se describen en la presente invención (tal como en el ejemplo 57).

EJEMPLO 31 Método de tratamiento utilizando terapia génica - ex vivo Un método de terapia génica transplanta fibroblastos, los cuales son capaces de expresar polipéptidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd), dentro de un paciente. Generalmente, los fibroblastos se obtienen a partir un sujeto mediante biopsia de piel. El tejido resultante se coloca en medio de cultivo de tejidos y se separa en piezas pequeñas. Los fragmentos pequeños del tejido se colocan sobre una superficie húmeda de una botella para cultivo de tejidos, aproximadamente 10 piezas se colocan en cada botella. La botella se voltea con la parte superior hacia abajo, se cierra estrechamente y se deja a temperatura ambiente durante la noche. Después de 24 horas a temperatura ambiente, las botellas se invierten y los fragmentos de tejido permanecen fijos a ia parte inferior de la botella y se añade medio fresco (por ejemplo, medio de Ham F12, con 10% de FBS, penicilina y estreptomicina). Las botellas se incuban entonces a 37 grados C por aproximadamente una semana. En este tiempo, se añade medio fresco y subsecuentemente se cambia cada varios días. Después de dos semanas adicionales en cultivo, surge una monocapa de fibroblastos. La monocapa se tripsiniza y se crece a escaía en botellas más grandes. ' pMV-7 (Kirschmeier, P.T. et al., DNA, 7: 219-26 (1988)), flanqueado por los repetidos terminales largos del virus de sarcoma de murino de Moloney, se digiere con EcoRI y Hindlll y se trata subsecuentemente con fosfatasa intestinal de ternera. El vector lineal se fracciona sobre gel de agarosa y se purifica, utilizando glóbulos de vidrio. El ADN que codifica el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) puede amplificarse utilizando iniciadores de PCR los cuales conesponden a las secuencias terminales 5' y 3' respedivamente como se establecieron en el ejemplo 5. Preferiblemente, el iniciador 5' contiene un sitio EcoRI y el iniciador 3' incluye un sitio Hindlll. Cantidades iguales de la estructura base lineal del virus dei sarcoma de murino de Moloney y del fragmento amplificado de EcoRI e Hindlll se añaden juntos, en la presencia de T4 DNA ligasa. La mezcla resultante se mantiene bajo condiciones apropiadas para ligación de los dos fragmentos. La mezcla de ligación se utiliza entonces para transformar bacterias HB101 , las cuales se siembran entonces sobre placas de agar que contienen canamicina con el propósito de confirmar que el vector contiene el receptor de quimiocina de proteína G adecuadamente insertado. Las células empaquetadoras de pA317 o GP+am12 anfotróficas se hacen crecer en cultivo de tejidos hasta densidad confluente en Medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 10% de suero fetal (CS), penicilina y estreptomicina. El vector MSV que contiene el gen del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) se añade al medio y las células empaquetadoras transducidas con el vector. Las células empaquetadoras producen ahora partículas virales infecciosas que contienen el gen del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) (a las células empaquetadoras se les refiere como células produdoras). Se añade medio fresco a las células productoras trasducidas, y subsecuentemente, el medio se cosecha a partir de una placa de 10 cm de células productoras confluentes. El medio gastado, que contiene las partículas vírales infecciosas, se filtra a través de un filtro de miliporo para remover las células productoras despegadas y este medio se utiliza entonces para infectar células tipo fibroblastos. El medio se remueve a partir de una placa subconfluente de fibroblastos y es reemplazado rápidamente con el medio a partir de las células productoras. Este medio se remueve y se reemplaza con medio fresco. Si el título de virus es alto, entonces virtualmente todos los fibroblastos serán infectados y no se requerirá selección. Si el título es muy bajo, entonces es necesario utilizar un vedor retroviral que tenga un marcador de selección, tal como neo o his. Una vez que los fibroblastos han sido eficientemente infectados, los fibroblastos se analizan para determinar si se produce la proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). . . Los fibroblastos genéticamente manipulados se transplantan luego dentro del hospedero, ya sea solos o después de haber sido crecidos a confluencia sobre glóbulos de microvehículo cytodex 3.

" EJEMPLO 32 Terapia génica utiliz -a*" ndo el gen endógeno del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) Otro método de terapia génica de conformidad con la presente invención implica asociar de manera operable la secuencia endógena del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) con un promotor mediante recombinación homologa como se describe, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. d, 641 , 670, expedida el 24 de junio de 1997; publicación * internacional número WO 96/29411 , publicada el 26 de septiembre de 1996; publicación internacional número WO 94/12660, publicada el 4 de agosto de 1994; Koller et al., Proc. Nati. Acad. Sci- USA 86: 8932-8935 (1989); y Zijlstra et al., Nature 342: 435-438 (1989). Este método implica la activación de un gen el cual está presente en las células blanco, pero el cual no se expresa en las células, o se expresa a un nivel más bajo del deseado.

Se elaboran las construcciones de polinucleótido las cuales contienen un" promotor y secuencias direccionadoras, las cuales son homologas a la secuencia no codificante 5' del Receptor endógeno de quimiocina de proteína G (CCRd), que flanquea al promotor. La secuencia direccionadora estará suficientemente cercana al extremo 5' del receptor de quimíocina de proteína G (CCRd) de manera que el promotor estará operativamente unido a la secuencia endógena después de la recombinación homologa. El promotor y las secuencias direccionadoras pueden amplificarse utilizando PCR. Preferiblemente, el promotor amplificado contiene distintos sitios para enzimas de restricción en los extremos 5* y 3". Preferiblemente el extremo 3' de la primera secuencia direccionadora contiene el mismo sitio de enzima de restricción que el extremo d' del promotor amplificado y el extremo 5' de la segunda secuencia direccionadora contiene el mismo sitio de restricción que el extremo 3' del promotor amplificado. El promotor amplificado y las secuencias direccionadoras amplificadas se digieren con las enzimas de restricción apropiadas y se tratan subsecuentemente con fosfatasa intestinal de ternera. El promotor digerido y las secuencias direccionadoras digeridas se añaden juntos en la presencia de T4 DNA ligasa. La mezcla resultante se mantiene bajo condiciones apropiadas para ligación de los dos fragmentos. La construcción se fracciona por tamaño sobre un gen de agarosa y luego se purifica mediante extracción de fenol y precipitación con etanoi.

En este ejemplo, las construcciones de polinucleótido se administran como polinucleótidos desnudos mediante electroporación. Sin embargo, las construcciones de polinucleótido también pueden administrarse con agentes que facilitan la transfección, tales como liposomas, secuencias virales, partículas virales, agentes de precipitación, etc. Dichos métodos de administración se conocen en la técnica. Una vez que las células están transfectadas, la recombinación homologa tomará lugar lo cual resulta en el promotor estando operativamente unido a una secuencia endógena del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). Esto resulta en la expresión del receptor de quimiocina de proteína G (CCRdj en las células. La expresión puede detedarse mediante tinción inmunológica, o cualquier otro método conocido en la técnica. Los fibroblastos se obtienen a partir de un sujeto mediante biopsia de piel. El tejido resultante se coloca en DMEM + 10% de suero fetal de ternera. Los fibroblastos en fase de crecimiento exponencial o en fase estacionaria temprana se t ipsinizan y se enjuagan a partir de la superficie plástica con medio nutriente. Una alícuota de la suspensión celular se remueve para conteo, y las células remanentes se someten a centrifugación. El sobrenadante se aspira y el concentrado se resuspende en 6 ml de regulador de pH para electroporación (HEPES 20 mM pH 7.3, NaCi 137 mM, KCl d mM, Na2HP04 0.7 mM, dextrosa 6 mM). Las células se recentrifugan, el sobrenadante se aspira, y las células se suspenden en regulador de pH para eledroporación que contiene 1 mg/ml de albúmina de suero de bovino acétilada. La suspensión celular final contiene aproximadamente 3 X 106 céíulas/ml. La eiectroporación debe llevarse a cabo inmediatamente después de la resuspensión. El ADN plasmídico se prepara de conformidad con las técnicas estándares. Por ejemplo, para construir un plásmido para direccionamiento del locus del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd), el plásmldo pUC18 (MBI Fermentas, Amherst, NY) se digiere con Hindlil. El promotor CMV se amplifica mediante PCR con un sitio Xbal en el extremo 5' y un sitio BamHl en el extremo 3'. Dos secuencias no codificantes del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) se amplifican mediante PCR: una secuencia no codificante del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) (fragmento 1 del receptor de quimiociria de proteína G (CCRd)) se amplifica con un sitio HindIII en el extremo d' y un sitio Xbal en el extremo 3'; la otra secuencia no codificante del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) (fragmento 2 del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd)) se amplifica con un sitio BamHl en el extremo d' y un sitio Hindlll en el extremo 3'. El promotor CMV y los fragmentos (1 y 2) del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) se digieren con las enzimas apropiadas (promotor CMV - Xbal y BamHl; fragmento 1 del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) - Xbal; fragmento 2 del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) - BamHl) y se ligan juntos. El producto de ligación resultante se digiere con Hindlll, y se liga con el plásmido pUC18 digerido con Hindlll.

El ADN plasmídic? se añade a una cubeta estéril con un orificio para electrodo de 0.4 cm (Bio-Rad). La concentración final de ADN generalmente es de al menos 120 µg/ml. O.d ml de la suspensión celular (que contiene aproximadamente 1.5 x 106 células) se añade entonces a la cubeta, y la suspensión celular y las soluciones de ADN se mezclan suavemente. La electroporación se lleva cabo con un aparato Gene-Pulser (Bio-Rad). La capacitancia y voltaje se establecen a 960 µF y 250-300 V, respectivamente. Conforme el voltaje se incrementa, la supervivencia celular disminuye, pero el porcentaje de células supervivientes que incorporan establemente el ADN introducido dentro de sus genomas se incrementa dramáticamente. Dados estos parámetros, debe observarse un pulso de tiempo de aproximadamente 14-20 mSeg. Las células eledroporadas se mantienen a temperatura ambiente por aproximadamente d minutos, y los contenidos de la cubeta se remueven suavemente con una pipeta estéril para transferencia. Las células se añaden directamente a 10 mi de medio nutriente precalentado (DMEM con 16% de suero de ternera) en un plato de 10 cm y se incuban a 37 grados C. AI siguiente día, el medio se aspira y se reemplaza con 10 ml de medio fresco y se incuban por 16-24 horas adicionales. Los fibroblastos diseñados se inyectan entonces dentro del hospedero, ya sea solos o después de haber sido crecidos a confluencia en glóbulos de microvehículo cytodex 3. Los fibroblastos producen ahora el producto proteico. Los fibroblastos pueden ser Introducidos dentro de un * . - * paciente como se describió anteriormente.

: EJEMPLO 33 Método de tratamiento utilizando terapia génica -in vivo Otro aspecto de la presente invención es utilizar métodos de terapia génica in vivo para tratar trastornos, enfermedades y condiciones. Ei método de terapia génica se refiere a la introducción de secuencias de ácido núcleo desnudo (ADN, ARN, y ADN o ARN antisentido) del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) dentro de un animal para incrementar o disminuir la expresión del polipéptido del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). Eí polinucleótido del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) puede estar operativamente unido a un promotor o cualquier otro elemento genético necesario para la expresión del polipéptido del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) por el tejido blanco. Dicha terapia génica y técnicas de administración y métodos se conocen en la técnica, véase, por ejemplo, WO 90/11092, WO 98/11779; patente de E.U.A. No. 6693622, 6706161 , 5580859; Tabata H. et al., (1997) Cardiovasc. Res. 35 (3): 470-479, Chao J et al., (1997) Pharmacol: Res. 35 (6): 517-522, Wolff J.A. (1997) NeuromuscuL Disqrd. 7(5): 314-318, Schwartz B. et al., (1996) Gen. Ther. 3 (5): 405-411 , Tsurumi Y. et al., (1996) Circulation 94 (12): 3281-3290 (incoforado en la presente como referencia).

Las construcciones de polinucleótido del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) pueden administrarse mediante cualquier método que administre materiales inyectables a las células de un animal, tales como, inyección dentro del espacio intersticial de los tejidos (corazón, músculo, piel, pulmón, hígado, intestino y similares). Las construcciones de polinucleótido del receptor de quimlocina de proteína G (CCRd) pueden ser administradas en un líquido o vehículo acuoso farmacéuticamente aceptable. El término polinucleótido, ADN o ARN "desnudo", se refiere a las secuencias que están libres de cualquier otro vehículo de administración que actúa para ayudar, promover, o facilitar la entrada dentro de la célula, incluyendo secuencias virales, partículas virales, formulaciones de liposoma, lipofectamina o agentes de precipitación y similares. Sin embargo, los polinucleótido del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) también pueden administrarse en formulaciones de liposoma (tales como aquellas enseñanzas en Felgner P.L. et al. (1996) Ann. NY Acad. Sci. 772: 126-139 y Abdallah B. et al. (1996) Biol. Cell 8d (1): 1-7) las cuales pueden prepararse mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Las construcciones de vector de polinucleótido del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) utilizadas en el método de terapia génica preferiblemente son construcciones que no se integrarán dentro del genoma del hospedero ni contendrán secuencias que les permita replicarse. Cualquier promotor fuerte conocido por los expertos en la técnica puede ser utilizado para dirigir la expresión del ADN. A diferencia de otras técnicas de terapias génicas, una ventaja principal de introducir secuencias de ácido nucleico desnudo dentro de células blanco es la naturaleza transitoria de la síntesis de polinucleótido en las células. Los estudios han demostrado que las secuencias de ADN no replicantes pueden ser introducidas dentro de células para promover la producción del polipéptido deseado por periodos de hasta seis meses. La construcción de polinucleótido del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) puede administrarse al espacio intersticial de tejidos dentro de un animal, incluyendo tejido de músculo, piel, cerebro, pulmón, hígado, bazo, médula ósea, timo, corazón, linfa, sangre, hueso, cartílago, páncreas, riñon, vesícula biliar, estómago, intestino, testículos, ovario, útero, recto, sistema nervioso, ojo, glándula, y tejido conectivo. El espacio intersticial de los tejidos comprende ei fluido intercelular, matriz de mucopolisacárido entre las fibras articulares de tejidos de órganos, fibras elásticas en las paredes de los vasos o cámaras, fibras de colágena de tejidos fibrosos, o la misma matriz dentro de tejido conectivo que delimita a las células musculares o en la lacunae del hueso. Este es similarmente el espacio ocupado por el plasma de la circulación y el fluido linfa de los canales linfáticos. La administración al espacio intersticial del tejido muscular se prefiere por las razones discutidas a continuación. Estos se pueden administrar convenientemente mediante inyección dentro de los tejidos que comprenden estas células. Estos se administran preferiblemente y se expresan en células persistentes, que no están en división las cuales están diferenciadas, aunque la administración y expresión puede lograrse en células no diferenciadas o menos completamente diferenciadas, tales como, por ejemplo, células madre de sangre o fibroblastos de piel. In vivo ias células musculares son particularmente competentes en su capacidad para tomar y expresar polinucleótidos. Para la inyección de polinucleótido del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd), una cantidad de dosis efediva de ADN o ARN estará en el intervalo de aproximadamente 0.05 g/kg de peso coforal a aproximadamente 50 mg/kg de peso coforal. Preferiblemente la dosis será de aproximadamente 0.006 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg y más preferiblemente de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg. Por supuesto, como el experto en la técnica apreciará, esta dosis varía dependiendo del sitio de inyección del tejido. La dosis apropiada y efectiva de la secuencia de ácido nucleico puede determinarse fácilmente por aquéllos expertos en la técnica y puede depender de la condición a ser tratada y la vía de administración. La vía preferida de administración es mediante la vía parenteral de inyección dentro del espacio intersticial de los tejidos. Sin embargo, otras vías parenterales también pueden utilizarse, tales como, inhalación de una formulación en aerosol particularmente para administración a los tejidos pulmonares o bronquiales, garganta o membranas mucosas de ia nariz. Además, las construcciones de polinucleótido del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) pueden administrarse a las arterias durante la angioplastía mediante el catéter utilizado en el procedimiento.

Los efectos de respuesta a la dosis de polinucleótido del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) en el músculo in vivo se determinan como sigue.* El ADN molde adecuado del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) para la producción del ARNm que codifica para el polipéptido del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) se prepara de conformidad con una metodología estándar de ADN recombinante. El ADN molde, el cual puede ser ya sea circular o lineal, se utiliza ya sea como ADN desnudo o en complejo con liposomas. Luego ios músculos cuadríceps de los ratones se inyectan con varias cantidades del ADN molde. Ratones hembra y macho Balb/C de cinco a seis semanas de edad se anestesian mediante inyección intraperitoneál con 0.3 ml de Avertina ai 2.d %. Una incisión de 1.6 cm se elabora en el muslo anterior, y el músculo cuadríceps se visualiza directamente. El ADN molde del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) se inyecta en 0.1 ml de vehículo en una jeringa de 1 cc a través de una aguja hipodérmica 27 durante un minuto, aproximadamente 0.6 cm a partir del sitio de la inserción distal del músculo dentro de la rodilla y a aproximadamente 0.2 cm de profundidad. Una sutura se coloca sobre el sitio de inyección para localización futura, y la piel se cierra con grapas de acero inoxidable. Después del tiempo de incubación apropiado (por ejemplo, siete días) los extractos de músculo se preparan mediante la escisión de todo el cuadríceps. Cada quinta sección de las secciones transversales de 15 µm de i los músculos cuadríceps individuales se tiñen histoquímicamente para expresión de proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). Un curso de tiempo para la expresión de proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) puede realizarse de manera similar excepto que los cuadríceps a partir de diferentes ratones se cosechan a tiempos diferentes. La persistencia del ADN del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) en músculo después de la inyección puede determinarse mediante análisis de Southern blot después de preparar el ADN celular total y los sobrenadantes H1RT a partir de ratones inyectados y control. Los resultados de la experimentación anteriormente mencionada en lo ratones pueden utilizarse para extrapolar las dosis adecuadas y otros parámetros del tratamiento en humanos y otros animales utilizando ADN desnudo del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5).

EJEMPLO 34 Animales transgénicos al receptor de quimlocina de proteína G (CCR5) Los polipéptido del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) también pueden expresarse en animales transgénícos. Los animales de cualesquiera especies, incluyendo, pero no limitados a, ratones, ratas, conejos, hámster, conejillos de Guinea, cerdos, micro-cerdos, cabras, ovejas, vacas y primates no humanos, por ejemplo, babuinos, monos, y chimpancés pueden ser utilizados para generar animales transgénicos. En una modalidad específica, las técnicas descritas en la presente invención de otra manera conocidas en la técnica, se utilizan para expresar polipéptidos de la invención en humanos, como parte de un protocolo de terapia génica. Cualquier técnica conocida en la técnica puede ser utilizada para introducir en transgén (por ejemplo, polinucleótido de la invención) dentro de animales para producir las líneas fundadoras de animales transgénicos. Dichas técnicas incluyen, pero no se limitan a, microinyección pronuclear (Paterson et al., Microbiol. Biotechnol. 40: 691- 698 (1994); Carver et al., Biotechnology (NY) 11 : 1263- 1270 (1973); Wright et al., Biotechnology (NY) 9: 830-834 (1991); y Hoppe et al., patente de E.U.A. No. 4, 873, 191 (1989)); transferencia del gen mediada por retrovirus dentro de líneas germinales (Van der Putten et al., Proc. Nati. Acad. Sci., USA 82: 6148- 6152 (1985)), blastocistos o embriones; direccionamiento del gen en células madre embrionarias (Thompson et al., Cell 56: 313- 321 (1989)); electroporación de células o embriones (Lo, 1983, Mol. Cell. Biol. '13:1803- 1814 (1983)); introducción de los polinucieótidos de la invención utilizando una pistola de genes (véase, por ejemplo, Ulmer et al., Science 269: 1746 (1993); introducción de las construcciones de ácido nucleico dentro de células madre embrionarias pluripotenciales y transferencia de las células madre de regreso dentro del blastocisto; transferencia del gen mediada por esperma (Lavitrano et al., Cell 57: 717- 723 (1989)); etc. Para una revisión de dichas técnicas, véase Gordon, "Transgenic Animáis", Int. Rev. Cytol. 115: 171- 229 (1989), el cual se incofora como referencia aquí en su totalidad.

Cualquier técnica conocida en la técnica puede ser utilizada para producir clones transgénicos que contienen polinucléótidos de la invención, por ejemplo, transferencia nuclear dentro de ovocitos enucleados de núcleos a partir de células embrionarias, fetales, o adultas cultivadas inducidas a quiescencia (Campell et al., Nature 380: 64- 66 (1996); Wiimut et al., Nature 385: 810- 813 (1997)). La presente invención provee animales transgénicos que portan el transgén en todas sus células, así como animales los cuales portan el transgén en algunas, pero no en todas sus células, es decir, animales en mosaico o quiméricos. El transgén puede ser integrado como un transgén particular o como múltiples copias tal como en concatámeros, por ejemplo, tándems cabeza a cabeza o tándems, cola a cola. El transgén también puede inducirse selectivamente dentro y adivarse en un tipo celular particular mediante el siguiente método, por ejemplo, la enseñanza de Lasko et al., (Lasko et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 6232- 6236 (1992)). Las secuencias reguladoras requeridas para dicha activación específica de tipo celular dependerán del tipo celular particular de interés, y serán evidentes a los expertos en la técnica. Cuando se desee que el transgén poiinucleótido se integre dentro del sitio cromosomal del gen endógeno, se prefiere el direccionamiento génico. Brevemente, cuando dicha técnica va a ser utilizada, los vectores que contienen algunas secuencias nucleotídicas homologas al gen endógeno se diseñan para el propósito de integración, mediante recombinación homologa con secuencias cromosomales, dentro y alterando la función de la secuencia nucleotídica del gen endógeno. El transgén también puede introducirse seledivamente dentro del tipo celular particular, inactivando así al gen endógeno en solamente ese tipo celular, pero siguiendo, por ejemplo, las enseñanzas de Gu et al., (Gu et al., Science 266: 103- 106 (1994)). Las secuencias reguladoras requeridas para dicha inactivación específica de tipo celular dependerán del tipo celular particular de interés, y serán evidentes a los expertos en la técnica. Los contenidos de cada uno de los documentos mencionados en este párrafo se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Además de expresar el polipéptido de la presente invención en una manera ubicua o específica del tejido en animales transgénicos, también podría ser rutinario para los expertos en la técnica el generar construcciones las cuales regulen la expresión del polipéptido mediante una variedad de otros medios (por ejemplo, expresión regulada por el desarrollo o regulada químicamente). Una vez que los animales transgénicos han sido generados, la expresión del gen recombinante puede probarse utilizando técnicas estándares. La selección inicial puede lograrse mediante análisis de Southern blot o técnicas de PCR para analizar tejidos animales para verificar que la integración del transgén ha tomado lugar. El nivel de expresión del ARNm del transgén en los tejido de los animales transgénicos también puede evaluarse utilizando técnicas las cuales incluyen, pero no se limitan a, análisis Northern blot de muestras de tejidos obtenidos a partir del animal, análisis de hibridación ¡n situ, y tde ranscriptasa reversa- PCR (rt- PCR). Las muestras de los tejidos que expresan el gen transgénico también pueden evaluarse inmunocitoquímicamente o inmunohistoquímicamente utilizando anticuerpos específicos para el producto del transgén. Una vez que los animales fundadores han sido producidos, éstos se cruzan, intercruzan, exocruzan, o entrecruzan para producir colonias del animal particular. Los ejemplos de dichas estrategias de cruza incluyen, pero no se limitan a: exocruza de animales fundadores con más de un sitio integración con el objeto restablecer líneas separadas; intercruza de líneas separadas con el objeto de producir compuestos transgénicos que expresan el transgén a niveles mayores debido a los efectos de la expresión aditiva de cada transgén; entrecruzamiento de animales transgénicos heterocigotos para producir animales homocigotos a un sitio de integración dado con el objeto ^ tanto de aumentar la expresión como de eliminar la necesidad para seleccionar animales mediante análisis de ADN; la entrecruza de líneas homocigotas separadas para producir líneas de compuestos heterocígotos u homocigotos; y la cruza para colocar el transgén sobre un ambiente distinto que sea apropiado para un modelo experimental de interés. Los animales transgénicos de la invención tienen muchos usos los cuales incluyen, pero no se limitan a, sistemas de modelos animales útiles para elaborar la función biológica de los polipéptidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd), estudiar enfermedades, trastornos, y/o condiciones asociadas con la expresión aberrante del receptor de qulmiocina de proteína G (CCRd), y para la selección de compuestos efectivos para mejorar dichas enfermedades, trastornos, y/o condiciones. rf EJEMPLO 35 Animales knock-out para el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) La expresión del gen endógeno del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) también puede reducirse mediante la inactivación o "knock-out" del gen del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) y/o su promotor utilizando recombinación homologa dirigida. (Por ejemplo, véase Smithies et al., 'Nature 317: 230- 234 (1985); Thomas & Capecchl, Cell 51: 503- 512 (1987); Thompson et al., Cell 5: 313- 721 (1989); cada uno de los cuales se incofora como referencia aquí en su totalidad). Por ejemplo, un polipéptido de la invención no funcional, mutante (una secuencia de ADN completamente no relacionada) flanqueada por ADN homólogo a la secuencia polinucleotídica endógena (ya sea a las regiones codificantes o las regiones reguladoras del gen) puede ser utilizada, con o sin un marcador de selección y/o un marcador de selección negativa, para transfedar celular que expresan polipéptidos de la invención in vivo. En otra modalidad, las técnicas conocidas en la fécnica se utilizan para generar knock-outs en las células que contienen, pero que no expresan el gen de interés. La inserción de la construcción de ADN, mediante la recombinación homologa dirigida, resulta en la inactivación del gen blanco. Dichos métodos son particularmente adecuados en la investigación y en campos relacionados con la agricultura en donde las modificaciones a las células madre embrionarias pueden ser utilizadas para generar animales descendientes con un gen blanco inactivo (por ejemplo, véase Thomas & Capecchi 1987 y Thompson 1989, anteriormente mencionados). Sin embargo este método puede adaptarse rutinariamente para uso en humanos con la condición de que las construcciones de ADN recombinante se administren directamente o se dirijan a un sitio requerido in vivo utilizando vedores virales apropiados que serán evidentes a los expertos en la técnica. En modalidades adicionales de la invención, las células que se diseñan genéticamente para expresar los polipéptidos de la invención, o alternativamente, que se diseñan genéticamente para no expresar los polipéptidos de la invención (por ejemplo, knock-outs) se administran a un paciente in vivo. Dichas células pueden obtenerse a partir del paciente (por ejemplo, animal, incluyendo humanos) o un donante compatible con MHC y pueden incluir, pero 'no se limitan a fibroblastos, células de médula ósea, células sanguíneas (por ejemplo, linfocitos), adipocitos, células musculares, células endoteliales etc. Las células están diseñadas genéticamente in vitro utilizando técnicas , de ADN recombinante para introducir la secuencia codificante del polipéptido de la invención dentro de las células, o alternativamente, para alterar la secuencia codificante y/o secuencia reguladora endógena asociada con los polipéptidos de la invención, por ejemplo, mediante transducción (utilizando vectores virales, y preferiblemente vectores que integran el transgén dentro del genoma celular) o procedimientos de transfección, incluyendo, pero no limitados a, el uso de piásmidos, cósmidos, YAC, ADN desnudo, electroporación, liposomas, etcétera. La secuencia codificante de los polipéptidos de la invención puede colocarse bajo el control de un promotor fuerte constitutivo o inducible o un promotor/potenciador para lograr la expresión, y preferiblemente la secreción, de los polipéptidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). Las células diseñadas las cuales expresan y, en una modalidad, preferiblemente secretan los polipéptido de la invención pueden introducirse dentro del paciente sistémicamente, por ejemplo, en la circulación, o intraperitonealmente. Alternativamente, las células pueden incoforarse dentro de una matriz e implantarse en el cuefo, por ejemplo, los fibroblastos genéticamente diseñados pueden implantarse como parte de un injerto de piel; las células endoteliales genéticamente diseñadas pueden implantarse como parte de un injerto linfático o vascular. (Véase, por ejemplo, Anderson et al., patente de E.U.A. No. d, 399, 349; y Mulligan & Wilson, patente de E.U.A. No. d, 460, 959 cada uno de los cuales se incorpora como referencia aquí en su totalidad). Cuando las células a ser administradas son células compatibles no autólogas o no MHC, éstas pueden administrarse utilizando técnicas bien conocidas las cuales previenen el desanollo de una respuesta inmune del hospedero en contra de las células introducidas. Por ejemplo, las células pueden introducirse en una forma encapsulada la cual, mientras que permite un intercambio de componentes con el ambiente extracelular inmediato, no permite que las células introducidas sean reconocidas por el sistema inmune del hospedero. Los animales knock-out de la invención tienen usos los cuales incluyen, pero no se limitan a, sistemas de modelo animal útiles para elaborar la función biológica de los polipéptidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd), estudiar enfermedades, trastornos, y/o condiciones asociadas con la expresión aberrante del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd), y para seleccionar compuestos efedivos para mejorar dichas enfermedades, trastornos, y/o condiciones.

EJEMPLO 36 Ensayos para detectar la estimulación o inhibición de la proliferación y diferenciación de la célula B La generación de respuestas inmunes humorales funcionales requiere tanto una señalización soluble y afín entre las células del linaje B y su microambiente. Las señales pueden impartir un estímulo positivo que permite que una célula de linaje B continúe su desarrollo programado, o un desarrollo negativo que instruye a la célula a detener su vía de desarrollo actual. Hasta ia fecha, numerosas señales estimulantes e inhibidoras se han encontrado para influir en la respuesta de la célula B incluyendo IL-2, IL-4, IL-d, IL-6, IL-7, IL-10,* IL-13, IL-14 y IL-16. De manera interesante, estas señales son por si mismas efectores débiles pero pueden, en combinación con varias proteínas coestimulantes, inducir la activación, proliferación, diferenciación, permanencia, tolerancia y muerte entre poblaciones de células B. Una de las clases mejor estudiadas de proteínas co-estimulantes de célula B es la superfamllla TNF. Dentro de esta familia CD40, CD27, y CD30 junto con sus ligandos respectivos CD164, CD70, y CD163 se han encontrado que regulan una variedad de respuestas inmunes. Las pruebas que siguen para ia detección y/o observación de la proliferación y diferenciación de estas poblaciones de células B y sus precursores son herramientas valiosas para determinar los efectos que varias proteínas pueden tener sobre estas poblaciones de células B en términos de proliferación y diferenciación. A continuación se listan dos pruebas diseñadas para permitir la detección de la diferenciación, proliferación, o inhibición de poblaciones de células B y sus precursores. , Prueba in vitro: la proteína purificada del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd), o formas truncadas de la misma, o ligando purificado del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) se evalúan por su capacidad para inducir activación, proliferación, diferenciación o inhibición y/o muerte en poblaciones de células B y sus precursores. La adividad de la proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) sobre las células B tonsilares ^purificadas de humano, medida cualitativamente en el intervalo de dosis de 0.1 a 10,000 ng/mL, se evalúa en una prueba estándar de co-estimulación de linfocito B en el que las células B tonsilares purificadas se cultiva en la presencia ya sea de Staphylococcus aureus Cowan I fijados con formalina (SAC) o anticuefo IgG anti-humano inutilizado como el agente de cebado. Las señales secundarias tales como IL-2 e IL-d sinergizan con SAC e IgG entrecruzando para producir proliferación de la célula B como se mide mediante la incoforación de timidina tritiada. Los agentes sinergistas numerosos pueden identificarse fácilmente utilizando esta prueba. Ensayo implica el aislamiento de células B tonsilares de humano mediante agotamiento de células positivas a CD3 en una matriz magnética (MACS). La población celular resultante es mayor de 9d% de células B como se evalúa mediante la expresión de CD4dR(B220). Varias diluciones de cada muestra se colocan dentro de pozos individuales de una placa de 96 pozos a la cual se le han añadido 105 células B suspendidas en medio de cultivo (RPMl 1640 que contiene 10% de FBS, 5 X 10"5 M 2ME, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 10 µg/ml, y dilución 10"5 de SAC) en un volumen total de 150 µl. La proliferación o inhibición se cuantifica mediante un pulso de 20 horas (1 µCi/pozo) con 3H-timidina (6.7 Ci/mM) empezando 72 horas después de la adición del factor. Los controles positivos y negativos son IL-2 y medio respectivamente. Prueba in vivo: los ratones BALB/c se inyectan (i.p.) dos veces al día con regulador de pH solamente, o 2 mg/kg de proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd), o formas truncadas de la misma o ligando del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). Los ratones recibieron este tratamiento por cuatro días consecutivos, a cuyo tiempo fueron sacrificados y se colectan varios tejidos y suero para análisis. La comparación de las secciones de H&E a partir de bazos normales y tratados con proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) identificaron los resultados del actividad de la proteína del receptor de qulmiocina de proteína G (CCRd) sobre las células del bazo, tal como la difusión de las láminas linfáticas peri-arteriales, y/o incrementos significativos en la celularidad nucleada de las regiones de pulpa roja, las cuales pueden Indicar la activación de la diferenciación y proliferación de las poblaciones de células B. Los estudios inmunohistoquímicos utilizando un marcador para célula B, anti-CD4dR(B220), se utilizan para determinar si cualquier cambio fisiológico a las células esplénicas, tal como desorganización esplénica, se deben a una representación incrementada de la células B dentro de zonas de células B escasamente definidas que infiltran las regiones de células T establecidas. Los análisis de citometría de flujo de los vasos de los ratones tratados con proteína del Receptor que quimiocina de proteína G (CCRd) se utilizan para indicar si la proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) incrementa específicamente la proporción de células B CD4dR(B220) debilitadas ThB+ sobre lo que se observa en los ratones control. Similarmente, una consecuencia pronosticada de la representación incrementada de la células B maduras in vivo es un incremento relativo en los títulos de Ig del suero. Por consiguiente, los niveles de IgM e IgA en suero se comparan entre los ratones tratados con regulador de pH y ios ratones tratados con proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). ' Los estudios descritos en este ejemplo prueban la actividad en la proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). Sin embargo, un experto eñ la técnica podría modificar fácilmente los estudios ejemplificados para evaluar la adividad de los polinucleótidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) (por ejemplo, terapia génica), agonistas (incluyendo ligandos), y/o antagonistas del receptor de quimiocina de proteína G.

EJEMPLO 37 Prueba de proliferación de la célula T Una prueba de proliferación inducida por CD3 lleva a cabo en PBMC y se mide mediante la toma de 3H-timidina. La prueba se lleva a cabo como sigue. Placas de noventa y seis pozos se cubren con 100 µl/pozo de i-» mAb a CD3 (HIT3a, Pharmigen) o Mab control con isotipo de coincidencia (B33.1) durante toda la noche a 4°C (1 µg/ml en regulador de pH con bicarbonato .06 M, pH 9.6), luego se lavan tres veces con PBS. PBMC se aislan mediante centrifugación en gradiente de F/H a partir de periférica de humano y se añade a los pozos por cuadruplicado (5 x 104/pozo) de placas cubiertas con mAb en RPMl que contiene 10% de FCS y P/S en la presencia de varias concentraciones de proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (volumen total de 200 µl). El regulador de pH relevante para proteína y el medio solo son controles. Después de 48 horas de cultivo a 37°C, las placas se centrifugan por 2 minutos a 1000 rpm y se remueven 100 µl de sobrenadante y se almacena a -20°C para medición de IL-2 (u otras citocinas) si se observa el efecto sobre la proliferación. Los pozos se complementan con 100 µl de que contiene 0.5 µCi de 3H-timidina y se cultivan 37°C 18-24 horas. Los pozos se cosechan y la incorporación de 3H-timidina utiliza como una medida de proliferación. Anti-CD3 solo es el control positivo para la proliferación. IL-2 (100 U/ml) también se utiliza como un control el cual potencia la proliferación. El anticuerpo control el cual no induce la proliferación de la célula T se utiliza como el control negativo para los efectos de ia i - ' - - - ' proteína del receptor de quimlocina de proteína G (CCRd). ,- Los estudios descritos en este ejemplo prueban la adividad en la proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). Sin embargo, un experto en la técnica podría modificar fácilmente los estudios ejemplificados para evaluar la actividad de los polinucleótidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) (por ejemplo, terapia génica), agonistas (incluyendo ligandos), y/o antagonistas del receptor de quimiocina de proteína G.

EJEMPLO 38 * Efecto del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) sobre la expresión de la clase II de MHC. moléculas co-estimulantes y de adhesión y diferenciación celular de monocitos y células dendríticas de humano derivadas de monocito Las células dendríticas se generan mediante ia expansión de precursores en proliferación encontrados en la sangre periférica: PBMC adherentes o fracciones monocíticas elutriadas se cultivan por 7-10 días con GM-CSF (50 ng/ml) e IL-4 (20 ng/ml). Estas células dendríticas tienen el fenotipo característico de células inmaduras (expresión de CD1 , CD80, CD86, CD40 y antígenos de la clase I i de MHC). El tratamiento con factores activadores, tales como TNF-a, ocasiona un rápido cambio en el fenotipo de superficie (expresión incrementada de la clase I y II de MHC, moléculas co-estimulantes y de adhesión, subregulación de FCSIGNORII, sobrerregulación de CD83). Estos cambios se correlacionan con la capacidad presentadora del antígeno incrementada y con maduración funcional de las células dendríticas. El análisis FACS de antígenos de superficie lleva a cabo como sigue. La células se tratan 1-3 días con concentraciones en incremento del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) o un ligando del mismo o LPS (control positivo), se lavan con PBS que contiene 1% de BSA y azida de sodio 0.02 mM, y luego se incuban con una dilución 1 :20 de anticuerpos monoclonales marcados con FITC o PE 30 minutos a 4°C. Después de un lavado adicional, la células marcadas se analizan mediante citometría de flujo en un FACScan (Becton Dickinson). Efecto sobre la producción de citocinas. La citocinas generadas mediante células dendríticas, en particular IL-12, son importantes en el inicio de las respuestas inmunes dependientes de célula T. IL-12 influye fuertemente el desarrollo de la respuesta inmune ocasionada por célula T auxiliar Th1 , e induce la función de la célula citotóxica T y NK. Un ELISA se utiliza para medir la liberación de IL-12 como sigue. Las células dendríticas (106/ml) se tratan con concentraciones en incremento del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) 24 horas. Se añade LPS (100 ng/ml) al cultivo celular como control positivo. Los sobrenadantes a partir de los cultivos celulares se colectan entonces y se analizan para contenido de IL-12 utilizando un equipo de ELISA comercial (por ejemplo, R & D Systems (Mineápolis, MN)). Se utilizan los protocolos estándares provistos con los equipos. • Efecto sobre la expresión de moléculas de clase II MHC, coestimulantes y de adhesión. Tres familias principales de los antígenos de superficie celular podrán ser identificadas en monocitos: moléculas de adhesión, moléculas implicadas en la presentación del antígeno, y receptor Fc. La modulación de la expresión de los antígenos de clase II MHC y otras moléculas co-estimulantes, tales como B7 e ICAM-1 , puede resultar en cambios en la capacidad de presentación del antígeno de los monocitos y la capacidad para inducir la activación de la célula T. El incremento en la expresión de receptores Fc puede relacionarse con un alivio en la adividad citotóxica del monocito, liberación de citocina y fagocitosis. El análisis FACS se utiliza para examinar los antígenos de superficie como sigue. Los monocitos se tratan por 1-d días con concentraciones en incremento del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) o LPS (control positivo), se lavan con PBS que contiene 1 % de BSA y azida de sodio 0.02 mM, y luego se incuban con una dilución 1 :20 apropiadas de anticuerpos monoclonales marcados con FITC o PE por 30 minutos a 4°C. Después de un lavado adicional, las células marcadas se analizan mediante citometría de flujo en un FACScan (Becton Dickinson). Activación v/o supervivencia incrementada del monocito. Las pruebas para moléculas que activan (o alternativamente, inadivan) monocitos y/o incrementa la supervivencia del monocito (o alternativamente, disminuyen la supervivencia del monocito) se conocen en la técnica y pueden aplicarse rutinariamente para determinar si una molécula de la invención funciona como un inhibidor o activador de monocitos. El receptor de quimiocina de proteína G (CCRd), agonistas, o antagonistas del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) pueden seleccionarse utilizando tres pruebas descritas a continuación. Para cada una de estas pruebas, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se purifican a partir de paquetes de leucocitos de donantes únicos (Cruz Roja Americana, Baltimore, MD) mediante centrifugación a través de un gradiente de Histopaque (Sigma). Los monocitos se aislan a partir de PBMC mediante elutriación centrífuga a contra flujo.

Prueba de supervivencia del monocito. Los monocitos de sangre periférica de humano progresivamente pierden viabilidad cuando se cultivan en ausencia de suero o de otros estímulos. Su muerte resulta a partir de procesos internamente regulados (apoptosis). La adición al cultivo de factores activadores, tales como TNF-alfa mejoran dramáticamente la supervivencia celular y previenen la fragmentación del ADN. La tinción con yoduro de propídio (Pl) se utiliza para medir la apoptosis como sigue. Los monocitos se cultivan por 48 horas en tubos de polipropileno en medio libre de suero (control positivo), en la presencia de 100 ng/ml de TNF-alfa (control negativo), y en la presencia de concentraciones variables del compuesto a ser evaluado. Las células se suspenden a una concentración de 2 x 106/ml en PBS que contiene Pl a una concentración final de d µg/ml, y luego se Incuban a temperatura ambiente por 5 minutos antes del análisis FAScan. Se ha demostrado que la toma de Pl se conelacionan con la fragmentación del ADN en este modelo experimental. Efecto de la liberación de citocinas. Una función importante de los monocitos/macrófagos es su actividad de regulación sobre otras poblaciones celulares del sistema inmune a través de la liberación de citocinas después de la estimulación. Un ELISA para medir la liberación de citocinas se lleva a cabo como sigue. Los monocitos humanos se incuban a una densidad de 5 x 105 células/ml con concentraciones en incremento del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) y bajo las mismas condiciones, pero en ausencia del receptor de quimiocina de proteína G. Para la producción de IL- 12, las células se ceban durante toda la noche con IFN (100 U/ml) en la presencia del receptor de quimiocina de proteína G. Luego se añade LPS (10 ng/ml). El medio condicionado se colecta después de 24 horas y se mantiene en congelamiento hasta su uso. La medición de TNF-alfa, IL-10, MCP-1 e IL-8 » se lleva a cabo entonces utilizando un equipo de ELISA comercialmente disponible (por ejemplo, R & D Systems (Mineápoiis, MN)) y se aplican los protocolos estándares provistos con el equipo. Estallamiento oxidativo. Los monocitos purificados se siembran en placas de 96 pozos a 2-1 x 105 células/pozo. Las concentraciones en incremento del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) se añaden a los pozos en un volumen total de 0.2 mi de medio de cultivo (RPMl 1640 + 10% de FCS, glutamina y antibióticos). Después de tres días de incubación, las placas se centrifugan y el medio se remueve a partir de los pozos. Para las monocapa de macrófagos, se añaden 0.2 ml por pozo de solución de rojo fenol (NaCI 140 mM, regulador de pH con fosfato y potasio 10 mM, pH 7.0, dextrosa d.d mM, rojo fenol 0.66 mM y 19 U/ml de HRPO), junto con el c * estimulante (PMA 200 nM). Las placas se incubaron a 37°C por dos horas y la reacción se detuvo mediante la adición de 20 µl de NaOH 1 N por pozo. La absorbancia se lee a 610 nm. Para calcular la cantidad de H202 producido por ios macrófagos, se lleva a cabo un estándar de una solución de H202 de moiaridad conocida para cada experimento. Los estudios descritos en este ejemplo prueban la actividad en la protema del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). Sin embargo, un experto en la técnica puede modificar fácilmente los estudios ejemplificados para evaluar la actividad de los polinucleótidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) (por ejemplo, terapia génica), agonistas (incluyendo ligandos), y/o antagonistas del receptor de quimiocina de proteína G.

EJEMPLO 39 Efectos biológicos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) Pruebas con astrocitos v neuronales El receptor recombinante de quimiocina de proteína G (CCRd), expresado en Escherichia coli y purificado como se describió anteriormente, puede ser evaluado para actividad en la promoción de la supervivencia, éxocrecimiento de neuritas, o diferenciación fenotípica de células neuronales corticales para inducir la proliferación de células inmunopositivas a la proteína acida fibrilar de glia, astrocitos. La selección de las células corticales para el bioensayo se basa en la expresión prevalente de FGF-1 y FGF-2 en las estructuras corticales y en la mejora previamente reportada de la supervivencia neuronal cortical que resulta a partir del tratamiento con FGF-2. Una prueba de incorporación de timidina, por ejemplo, se puede usar para dilucidar la actividad del receptor de quimiocina de proteína G en estas células. Además, los reportes previos que describen los efectos biológicos de FGF-2 (FGF básico) sobre las neuronas corticales o del hipocampo in vitro ha demostrado incremento tanto en la supervivencia neuronal como en el exocrecimiento de neuritas (Walicke, P. et al., "Fibroblast growth factor promotes survival of dissociated hippocampal neurons and enhances neurite extensión". Proc. Nati. Acad ScL USA 83: 3012-3016. (1986), prueba incoforada aquí como referencia en su totalidad). Sin embargo, los reportes a partir de experimentos realizados en células PC-12 sugieren que estas respuestas no son necesariamente sinónimas y pueden depender o no solamente de cuál FGF se evalúa sino que también sobre cuál receptores) se expresa en las células blanco. Utilizando el modelo de cultivo primario de neuronas corticales, la capacidad del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) para inducir exocrecimiento de neuritas puede compararse con la respuesta lograda con FGF-2 utilizando, por ejemplo, una prueba de incorporación de timidina.

. Pruebas realizadas c n fibroblastos v células endoteliales Fibroblastos de pulmón humano se obtienen de Clonetics (San Diego, CA) y se mantienen en un medio de crecimiento de Clonetics. Las células endoteliales t microvasculares dermales se obtienen de Cell Applications (San Diego, CA). Para las pruebas de proliferación, los fibroblastos de pulmón de humano y las células endoteliales microvasculares dermales pueden cultivarse a 6,000 células/pozo en una placa de 96 pozos por un día en medio de crecimiento. Las células se incuban luego por un día en BSA al 0.1% en medio basal. Después de reemplazar el medio con medio fresco con BSA al 0.1%, las células se incuban con las proteínas de prueba por tres días. Azul Alamar (Alamar Biosciences, Sacramento, CA) se añade a cada pozo a una concentración final de 10%. Las células se incuban por cuatro horas. La viabilidad celular se mide mediante, lectura en un lector de fluorescencia CytoFluor. Para las pruebas PGE2, los fibroblastos de pulmón de humano se cultivan a 5,000 células/pozo en una placa de 96 pozos por un día. Después de un cambio de medio a medio basal con BSA al 0.1 %, las células se incuban con FGF-2 o receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) con o sin IL-1a por 24 horas. Los sobrenadante se coledan y se prueban para PGE2 mediante equipo ElA (Cayman, Ann Arbor, Ml). Para las pruebas IL-6, los fibroblastos de pulmón de humano se cultivan a 6,000 células/pozo en una placa de 96 pozos por un día. Después de un cambio de medio a medio basal con BSA al 0.1,%, las células se incuban con FGF-2 o receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) con o sin IL-1a por 24 horas. Los sobrenadantes se coledan y se prueban para IL-6 mediante equipo de ELISA (Endogen, Cambridge, MA). Los fibroblastos de pulmón de humano se cultivan con FGF-2 o receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) por tres días en medio basal antes de la adición de Azul Alamar para evaluar los efectos sobre el crecimiento de los fibroblastos. FGF-2 debería mostrar una estimulación a 10-2600 ng/ml lo cual puede ser utilizado para comparar la estimulación con el receptor dé quimiocina de proteína G.

Modelos de Parkinson La pérdida de función motora en la enfermedad de Parkinson se atribuye a la deficiencia de dopamina de células del cuerpo estriado que resulta de la degeneración de las proyecciones de neuronas del cuerpo estriado de la sustancia nigra dopaminérgicas. Un modelo animal para Parkinson que ha sido caracterizado extensivamente implica la administración sistémica de 1-metiI-4 fenil 1 ,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP). En el SNC, MTPT se toma por los astrocitos y se cataboliza por la monoamina oxidasa B a una 1-metiI-4-fenil piridina (MPP+) y se libera. Subsecuentemente, MPP+ se acumula activamente en las neuronas dopaminérgicas mediante el transportador de retoma de alta afinidad para dopamina. MPP+ se concentra luego en la mitocondrial mediante el gradiente electroquímico e inhibe selectivamente a la nicotidamida adenina difosfato: ubiquinona oxidorredudasa (complejo I), por lo tanto interfiriendo con el transporte de electrones y eventualmente generando radicales de oxígeno. Se ha demostrado en modelos de cultivo de tejido que FGF-2 (FGF básico) tiene actividad trófica hacia las neuronas dopaminérglcas de la nigra (Fenari et al., Dev. Biol.1989). Recientemente, el grupo del Dr. Unsicker ha demostrado que la administración de FGF-2 en implantes de espuma de gel en el cuerpo estriado resulta en la protección casi completa de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra a la toxicidad asociada con la exposición a MTPT (Otto y Unsicker; J. Neuroscience, 1990).

. Con base en los datos con FGF-2, el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) puede ser evaluado para determinar si éste tiene una acción similar a ia de FGF-2 para mejorar la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas in vitro y también puede evaluarse in vivo para protección de 5 neuronas dopaminérgicas en el cuefo estriado del daño asociado con el tratamiento de MPTP, El efecto potencial del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) se examina primero in vitro en un modelo de cultivo de células neüronales dppaminérgicas. Los cultivos se preparan mediante la disección del piso inferior del cerebro medio a partir de embriones de rata 10 Wistar de 14 días de gestación. El tejido se disocia con tripsiniza y se siembra a una densidad de 200, 000 céluías/cm2 sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos con poíiornitina-Iaminina. Las células se mantienen en medio Eagle modificado por Dulbecco y medio F12 que contiene suplementos • hormonales (N1 ). Los cultivos se fijan con paraformaidehído después de 8 15 días i? vitro y se procesan para tinción inmunohistoquímica de tirosina hidroxilasa, un marcador específico para neuronas dopaminérgicas. Los cultivos de células disociadas se preparan a partir de ratas embrionarias. El .medio de cultivó se cambia cada tercer día y los factores se añaden luego a ese tiempo. ^20, ^ Puesto que las neuronas dopaminérgicas se aislan a partir de íanimales a los 14 días de gestación, un tiempo de desanollo el cual es .después de la etapa cuando las células precursoras dopaminérgicas están en Z' ' " . - ' - - • ; proliferación, un incremento en el número de neuronas inmunopositivas a tirosina hjdroxilasa podría representar un incremento en el número de neuronas dopaminérgicas supervivientes in vitro. Por lo tanto, si el receptor de X quimiocina de proteína G (CCRd) actúa para prolongar la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas, esto podría sugerir que el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) puede estar implicado en la enfermedad de Parkinson.

: Los estudios descritos en.este ejemplo prueban la actividad en la proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). Sin embargo, un experto en la técnica podría modificar fácilmente los estudios ejemplificados para evaluar la actividad de los polinucleótidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) (por ejemplo, terapia génica), agonistas (incluyendo ligandos), y/o antagonistas del receptor de quimiocina de proteína G.

EJEMPLO 40 Eí efecto del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) sobre el i 4 crecimiento de las células endoteliales vasculares Al día 1 , las células endoteliales de vena umbilical de humano (HUVEC) se siembran a una densidad de 2-d x 104 células/plato de 35 mm en medio M199 que contiene 4% de suero bovino fetal (FBS), 16 unidades/ml de heparina, y 50 unidades/ml de complementos para crecimiento de célula endotelial (ECGS, Biotechnique, Inc.). Al día 2, el medio se reemplaza con M199 que contiene 10% de FBS, unidades/ml de heparina. La proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 22, y controles positivos, tales como VEGF y FGF básico (FGFb) se añaden, a concentraciones variables. A los días 4 y 6, el medio se reemplaza. Al día 8, el número celular se determina con un contador Coulter. Un incremento en el número de células HUVEC indica que el receptor dé qulmiocina de proteína G (CCRd) puede hacer que proliferen las células endoteliales vasculares. Los estudios descritos en este ejemplo prueban la actividad en la proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). Sin embargo, un experto en la técnica podría modificar fácilmente los estudios ejemplificados para evaluar la actividad de los polinucleótidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) (por ejemplo, terapia génica), agonistas (incluyendo ligandos), y/o antagonistas del receptor de quimiocina de proteína G.

EJEMPLO 41 Efecto estimulante del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) sobre la proliferación de las células endoteliales vasculares - t Para la evaluación del actividad mitogénica de los factores de crecimiento, se llevó a cabo la prueba colorimétrico MTS (3-(4,d-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2- (4-sulfofenil)2H-tetrazolio) con el reactivo acoplador de eledrones PMS (metosulfato de fenazina) (CellTiter 96 AQ, Promega). Las células se sembraron en una placa de 96 pozos (5,000 células/pozo) en 0.1 mL de medio suplementado con suero y se dejaron adherir durante toda la noche. Después de la ausencia de suero por 12 horas en FBS 0.6%, ias condiciones (FGFb, VEGF165 o receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) en FBS al 0.5%) con o sin heparina (8 U/ml) se añadieron á los pozos por 48 horas. 20 mg de la mezcla MTS/PMS (1 :0.05) se añadieron por pozo y se dejaron incubar por 1 hora a 37°C antes de medir la # absorbancia a 490 nm en una placa de lectura de ELISA. La absorbancia de fondo a partir de los pozos control (un poco de medio, sin células) se sustrae, y siete pozos se llevan a cabo en paralelo para cada condición. Véase, Leak et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 30A: 512-618 (1994). Los estudios descritos en este ejemplo prueban la actividad en la proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). Sin embargo, un experto en la técnica podría modificar fácilmente los estudios ejemplificados para evaluar la actividad de los polinucleótidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) (por ejemplo, terapia génica), agonistas (incluyendo ligandos), y/o antagonistas del receptor de quimiocina de proteína G.

EJEMPLO 42 Estimulación de la migración endotelial Este ejemplo se utilizará para explorar la posibilidad de que el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) puede estimular la migración de célula endotelial linfática.

Las pruebas de migración de célula endotelial se llevan a cabo utilizando una cámara de microquimiotaxis de 48 pozos (Neuroprobe Inc., Cabin John, MD; Falk, W. et al., J. Immunological Methods 1980; 33: 239-247). Los filtros de policarbonato libres de pollvinilpirrolidona con un tamaño de poro de 8 µm (Nucleopore Cof. Cambridge, MA) se cubren con 0.1 % de gelatina por al menos 6 horas a temperatura ambiente y se secan bajo aire estéril. Las sustancias prueba se diluyen a concentraciones apropiadas en M199 suplementado con 0.25 % de albúmina de suero de bovino (BSA), y 25 µl de la dilución final se colocan en la cámara inferior del aparato Boyden modificado. Los cultivos de HUVEC o BMEC subconfluentes, de ios pasajes iniciales (2-6) se lavan y tripsinizan por el mínimo tiempo requerido para lograr separación celular. Después de colocar el filtro entre las cámaras inferior y superior, 2.5 x 105 células suspendidas en 60 µl de M199 que contiene 1 % de FBS se siembran en el compartimiento superior. El aparato se incuba entonces por 6 horas a 37°C en una cámara de humidificación con d% de CO2 para permitir la migración celular. Después del periodo de incubación, el filtro se remueve y la parte superior de filtro con las células que no han migrado se raspa con un raspador de goma. Los filtros se fijan con etanol y se tiñen con una solución de Giemsa (Diff-Quick, Baxter, McGraw Park, 1L). La migración se cuantifica mediante conteo celular de tres campos al azar a alto poder (40x) en cada pozo, y todos los grupos se llevan a cabo por cuadruplicado. Los estudios descritos en este ejemplo prueban la actividad en la proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). Sin embargo, un experto en la técnica podría modificar fácilmente los estudios ejemplificados para evaluar la actividad de los polinucleótidos del receptor de quimiocina de 'proteína G (CCRd) (por ejemplo, terapia génica), agonistas (incluyendo ligandos), y/o antagonistas del receptor de quimiocina de proteína G.

EJEMPLO 43 Efecto del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) sobre la formación del cordón en la angiogénesis Otro paso en la angiogénesis es la formación del cordón, elaborado mediante la diferenciación de células endoteliales. Este bioensayo mide la capacidad de las células endoteliales microvasculares para formar estructuras semejantes a capilares (estruduras con hueco) cuando se cultivan in vitro. CADMEC (células endoteliales microvasculares) se obtienen a partir de Cell Applications, Inc. como células en proliferación (pasaje 2) y se cultivan en medio de crecimiento CADMEC para aplicaciones celulares y se utilizan en el pasaje d. Para la prueba de angiogénesis in vitro, los pozos de una placa de cultivo celular de 48 pozos se cubren con Medio de factor de adhesión para aplicaciones celulares (200 ml/pozo) por 30 minutos a 37°C. CADMEC se siembran sobre los pozos cubiertos a 7,600 células/pozo y se cultivan durante toda noche en Medio de Crecimiento. El Medio de Crecimiento se reemplaza luego con 300 mg de Medio de formación de cordón para aplicaciones celulares que contiene regulador de pH control o receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) (0.1 a 100 ng/ml) y las células se cultivan por 48 horas adicionales. Los números y longitudes de los cordones semejantes a capilares se cuantifican a través del uso de un analizador de vídeo imagen Boeckeler VIA-170. Todas las pruebas se realizan por triplicado. VEGF comercial (R&D) (60 ng/ml) se utiliza como un control positivo, b-estradiol (1 ng/ml) se utiliza como un control negativo. El regulador de pH apropiado (sin proteína) también se utiliza como un control. Los estudios descritos en este ejemplo prueban la adividad en la proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). Sin embargo, un experto en la técnica podría modificar fácilmente los estudios ejemplificados para evaluar ia actividad de los pofinucleótidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) (por ejemplo, terapia génica), agonistas (incluyendo ligandos), y/o antagonistas del receptor de quimiocina de proteíña G.

EJEMPLO 44 Efecto angiogénico de la membrana corioalantoidea de pollo La membrana corioalantoidea de pollo (CAM) es un sistema bien establecido para examinar la angiogénesis. La formación de vasos sanguíneos sobre CAM en fácilmente visible y cuantificable. La capacidad del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) o de un ligando del mismo para estimular la angiogénesis en CAM puede ser examinada. Los huevos fertilizados del pollo White Leghorn (Gallus gallus) y de codorniz japonesa (Cotumix coturnix) se incuban a 37.8 °C y a 80% de humedad. Las CAM diferenciadas de embriones de pollo de 16 días de edad y de codornices de 13 días de edad se estudian con los siguientes métodos. JAI día 4 de desarrollo, se hace una ventana sobre el cascarón de pollo. Los embriones de monitorean para desanollo normal y los huevos se sellan con cinta adhesiva cellotape. Estos se incuban adicionalmente hasta el día 13. Los cubreobjetos Thermanox (Nunc, Naperville, IL) se cortan en discos de aproximadamente 5 mm de diámetro. Los factores de crecimiento estériles y libres de sales serie destilada y aproximadamente 3.3 mg/d ml se pipetean en los discos. Después de secar al aire, los discos invertidos se aplican sobre CAM. Después de tres días, los especímenes se utilizan en glutaraldehído al 3% y formaldehído al 2% y se enjuagan en regulador de pH de cacodilato de sodio 0.12 M. Estos se fotografían con un estereomicroscopio [Wild M18] y se embeben para seccionado semi y uitrafino como se describió anteriormente. Los controles se llevan a cabo con los discos con vehículo solamente. Los estudios descritos en este ejemplo prueban la actividad en la proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). Sin embargo, un experto en la técnica podría modificar fácilmente los estudios ejemplificados para evaluar la actividad de los polinucleótidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) (por ejemplo, terapia génica), agonistas (incluyendo ligandos), y/o antagonistas del receptor de quimiocina de proteína G.

* EJEMPLO 45 Prueba de angiogénesis utilizando un implante de Matrigel en el ratón La prueba de angiogénesis in vitro del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) mide la capacidad de una red capilar existente para formar nuevos vasos sanguíneos en una cápsula implantada de material de matriz extracelular de murino (Matrigei). La proteína se mezcla con el Matrigel líquido a 4 grados C y la mezcla se inyecta entonces subcutáneamente en los ratones en donde ésta solidifica. Después de 7 días, el "tapón" sólido de Matrigel de examina para la presencia de nuevos vasos sanguíneos. El Matrigel se obtiene a partir de Becton Dickinson Labware/Collaborative Biomedical Products. Cuando se calienta a 4 grados C el material Matrigel en un líquido. El Matrigel se mezcla con receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) a 150 ng/ml a 4 grados C y se toma dentro de jeringas de 3 ml frías. Ratones C57B1/6 hembras de aproximadamente 8 semanas de edad se inyectan con la mezcla de Matrigel y proteína experimental en los sitios en el sitio medio ventral del abdomen (0.6 ml/sitio). Después de 7 días, los ratones se sacrifican mediante dislocación cervical, los tapones de Matrigel se remueven y se limpian (por ejemplo, se remueven todas las membranas adheridas y tejido fibroso). Los tapones totales por replicado se fijan en -'regulador de pH neutro con formaldehído al 10%, se embeben en parafina y se utilizan para producir secciones para examinación histológica después de a tinción con Tricrómica de Masson. Las secciones transversales a partir de 3 regiones diferentes de cada tapón se procesan. Las secciones seleccionadas se tiñen para la presencia de vWF. El control positivo para esta prueba es FGF básico de bovino (160 ng/ml). El Matrigel solo se utiliza para determinar los niveles básales de angiogénesis. Los estudios descritos en este ejemplo prueban la actividad en la proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). Sin embargo, un experto en la técnica podría modificar fácilmente los estudios ejemplificados para evaluar la acfividad de los polinucleótidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) (por ejemplo, terapia génica), agonistas (incluyendo ligandos), y/o antagonistas del receptor de quimiocina de proteína G.

EJEMPLO 46 Rescate de la isquemia en el modelo de extremidad inferior de conejo Para estudiar los efectos in vitro del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) sobre la isquemia, se creó un modelo de isquemia en una extremidad inferior dé conejo mediante remoción quirúrgica de una arteria femoral como se describió previamente (Takeshita, S. et al., Am. J. Pathol 147: 1649-1660 (1996)). La escisión de la arteria femoral resulta en la programación retrógrada de trombos y oclusión de la arteria ilíaca externa. Consecuentemente, el flujo sanguíneo a la extremidad isquémica depende de los vasos colaterales que se originan a partir de ia arteria iliaca interna (Takeshita, S. et al., Am. J. Pathol 147: 1649-1660 (1995)). Un intervalo de diez días se permite para recuperación post-operativa de los conejos y el desarrollo de vasos colaterales endógenos. A los 10 días post-operativamente •* (día 0), después de llevar a cabo un angiograma de línea basal, la arteria iliaca interna de la extremidad isquémica se transfecta con 500 mg de plásmido desnudo de expresión del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) mediante tecnojogía arterial de transferencia del gen utilizando un catéter de balón cubierto con hidrogel como se describe (Riessen, R. et al., - Hum. Gene Ther. 4; 749-768 (1993); Leclerc, G. et al., J. Clin. Invest. 90: 936- 944 (1992)). Cuando el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) se utiliza en el tratamiento, un bolo único de 600 mg de proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) o control se administra dentro de la arteria iliaca interna de la extremidad isquémica durante un período de 1 minuto a través de un catéter de infusión. Al día 30, varios parámetros se miden en estos conejos: (a) relación BP - la relación de presión sanguínea de la presión sistólica de la extremidad isquémica con respecto a la extremidad normal; (b) flujo sanguíneo y flujo de reserva - FL de reposo: el flujo de sangre durante condiciones no dilatadas y FL máximo: el flujo de sangre durante la condición dilatada completamente (también una medida indirecta de la cantidad de vasos sanguíneos) y flujo de reserva que se refleja mediante la relación de FL máximo: FL de reposo; (c) evaluación angiográfica -ésta se mide mediante el angiograma de los vasos sanguíneos colaterales. Una evaluación se determina por el porcentaje de círculos en una malla sobrepuesta con arterias opacadas cruzadas dividido entre el número total m de muslos de conejo; (d) densidad capilar -el número de capilares colaterales determinados en secciones a microscopía de luz tomadas a partir de las extremidades inferiores. Los estudios descritos en este ejemplo prueban la actividad en la proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). Sin embargo, un experto en la técnica podría modificar fácilmente los estudios ejemplificados para evaluar ia actividad de los polinucleótidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) (por ejemplo, terapia génica), agonistas (incluyendo igandos), y/o antagonistas del receptor de quimiocina de proteína G.

EJEMPLO 47 Modelo de enfermedad arterial periférica La terapia angiogénica utilizando el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) es una estrategia terapéutica novedosa para obtener el restablecimiento del flujo sanguíneo alrededor de la isquemia en caso de enfermedades arteriales periféricas. El protocolo experimental incluye: a) un lado de la arteria femoral se liga para crear músculo isquémico en la extremidad inferior, el otro lado de la extremidad inferior sirve como un control. b) la proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd), en un intervalo de dosis de 20 mg-600 mg, se administra intravenosamente y/o muscularmente tres veces (tal vez más) por semana por 2-3 semanas. c) el tejido muscular isquémico se colecta después de la ligación de la arteria femoral a 1, 2, y 3 semanas del análisis de la expresión e histología del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). La biopsia también se lleva cabo en el otro lado del músculo normal de la extremidad inferior contralateral. Los estudios descritos en este ejemplo prueban la actividad en la proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). Sin embargo, un experto en la técnica podría modificar fácilmente los estudios ejemplificados para evaluar la actividad de los polinucleótidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) (por ejemplo, terapia génica)^ agonistas (incluyendo ligandos), y/o antagonistas del receptor de quimiocina de proteína G.

EJEMPLO 48 Modelo de enfermedad míocardial isquémica -•4 El receptor de qulmiocina de proteína G (CCRd) se evalúa como un mitógeno potente capaz de estimular el desanollo de vasos colaterales, y re-estructurar vasos sanguíneos nuevos después de la oclusión arterial coronaria. La alteración de la expresión del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) se investiga in situ. El protocolo experimental incluye: a) el corazón se expone a través de una toracotomía en el lado izquierdo en ia rata. Inmediatamente, la arteria coronaria izquierda se ocluye ?c » 1 con una sutura delgada (6-0) y el tórax se cierra. * * • b) la proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd), en un intervalo de dosis de 20-500 mg, se administra intravenosamente y/o íntramuscularmente tres veces (tal vez más) por 2-4 semanas. c) treinta días después de la cirugía, el corazón se remueve y se secciona transversalmente para análisis de fotometría e in situ. Los estudios descritos en este ejemplo prueban la actividad en la proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). Sin embargo, un experto en la técnica podría modificar fácilmente los estudios ejemplificados para evaluar la actividad de los polinucieótidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) (por ejemplo, terapia génica), agonistas (incluyendo ligandos), y/o antagonistas del receptor de quimiocina de proteína G.

; " EJEMPLO 49 Supresión de la expresión de la molécula de adhesión inducida por T F- alfa mediante ei receptor de quimiocina de proteína G El reclutamiento de linfocitos a las áreas de inflamación y angíogénesis implica interacciones específicas receptor-ligando entre las moléculas de adhesión de superficie celular (CAM) en los linfocitos y el endotelio vascular. El procedimiento de adhesión, en ambos estados normal y patológico, sigue una cascada de múltiples pasos que implica la expresión de - - . la molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1), molécula de adhesión de célula vascular-1 (VCAM-1), y molécula de adhesión de leucocito endotelial-1 (E-selectina) en células endoteliales (EC). La expresión de estas moléculas y otras en el endotelio vascular determina la eficiencia con la cual los leucocitos pueden adherirse a la vasculatura local y extravasarse dentro del tejido local i rr. tj ' durante el desanollo de una respuesta inflamatoria. La concentración local de citocinas y factor de crecimiento participa en la modulación de la expresión de estas CAM. El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), una citocina ^ proinflamatoria potente, es un estimulador de las tres CAM en células endoteliales y puede estar implicado en una amplia variedad de respuestas inflamatorias, frecuentemente resultando en un resultado patológico. El potencial del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) para mediar una supresión de la expresión de CAM inducida por TNF-a puede ser examinado. Una prueba de ELISA modificado el cual utiliza EC como una fase sólida absorbente se emplea para medir la cantidad de expresión de CAM en EC tratadas con TNF-a cuando se coestimulan con un miembro de la familia FGF de proteínas. Para llevar a cabo el experimento, cultivos de células endoteliales de vena umbilicaj humana (HUVEC) se obtienen a partir de cordones agrupados cosechados y mantenidos en medio de crecimiento (EGM-2; Clonetics, San Diego, CA) suplementado con 10% de FCS y 1 % de penicilina estreptomicina en una incubadora humidificada a 37 grados C que contiene d% de C02. Las HUVEC se siembran en placas de 96 pozos a concentraciones de 1 x 104 células/pozo en medio EGM a 37 grados C por 18- 24 horas o „ hasta que están confluentes. Las monocapas se lavan subsecuentemente 3 veces con una solución libre de suero de RPMI-1640 * X suplementado con 100 U/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina, y se tratan con una citocina dada y/o factores) de crecimiento por 24 horas a 37 X grados C. Después de la incubación, las células se evalúan entonces para expresión de CAM. Las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) se crecen en una placa estándar de 96 pozos hasta confluencia. En medio de crecimiento se remueve a partir de las células y se reemplaza con 90 µl de Medio 199 (10% de FBS). Las muestras para evaluar y los controles positivos o negativos se añaden a la placa por triplicado (en volúmenes de 10 µl). Las placas se incuban a 37 grados C por ya sea 5 horas (expresión de selectina e integrina) o 24 horas (expresión de integrina solamente). Las placas se ?-aspíran para remover el medio y 100 µl de paraformaldehído al 0.1%-PBS (con Ca++ y Mg++) se añaden a cada pozo. Las placas se mantienen a 4°C por 30 minutos. El fijador se remueve luego a partir de los pozos y los pozos en r lavan 1 X con PBS (+Ca, Mg)+ 0.6% de BSA y se escunen. No permitir que los pozos se sequen. Añadir 10 µl del anticuefo primario diluido a ios pozos de prueba y control. Anti-ICAM-1 -Biotina, Anti-VCAM-1 -Biotina y Anti-E-seledina-Biotina se utilizan a una concentración de 10 µg/ml (dilución 1 :10 de w anticuerpo de almacenamiento 0.1 mg/ml). Las células se incuban a 37°C por 30 minutos en un ambiente humidificado. Los pozos se lavan X3 con PBS (+Ca, Mg)+ CÜ5%" de BSA. Luego se añaden 20 µl de ExtrAvidin diluída/Fosfatasa Alcalina (dilución 1 : 6,000) a cada pozo y se incuban a 37°C por 30 minutos. Los pozos se lavan X3 con PBS (+Ca, Mg)+ 0.5% de BSA. Una tableta de p-NItrofenol Fosfato pNPP se disuelve en 5 ml de regulador de pH de glicina (pH 10.4). 100 µi de sustrato pNPP en regulador de pH de glicina se añaden a cada pozo prueba. Los pozos estándares en triplicado se preparan a partir de la dilución de trabajo de la ExtrAvidin diluída/Fosfatasa Alcalina en regulador de pH de glicina: 1: 6,000 (10°)> 10"°5> 10"1> 10"1 5. d µl de cada dilución se añaden a los pozos por triplicado y el contenido de AP resultante en cada pozo es 6.50 ng, 1.74 ng, 0.5d ng, 0.18 ng. 100 µl de reactivo pNPP debe añadirse luego a cada uno de los pozos estándares. La placa debe incubarse a 37 grados centígrados por 4 horas. Un volumen de 50 µl de NaOH 3M se añade a todos los pozos. Los resultados se cuantifican en un ledor de placas a 405 nm. La opción de sustracción del fondo se utiliza en ios pozos control llenos con regulador de pH de glicina solamente. El molde se establece para indicar las concentraciones de conjugado-AP en cada pozo estándar [d.60 ng, 1.74 ng, O.dd ng, 0.18 ng]. Los resultados se indican como cantidad de conjugado-AP unido en cada muestra. Los estudios descritos en este ejemplo prueban la actividad en ia proteína def receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). Sin embargo, un experto en la técnica podría modificar fácilmente los estudios ejemplificados pa a evaluar la actividad de los polinucleótidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) (por ejemplo, terapia génica), agonistas (incluyendo ligandos), y/o antagonistas del receptor de quimiocina de proteína G.

' EJEMPLO 50 Métodos para inhibir la actividad del receptor acoplado a proteína G t ' utilizando fragmentos transmembranales WO 94/06695 y la patente de E.U.A. No. 5,508,384 establecen secuencias de regiones transmembranales para 74 GPCR. La publicación de patente WO 94/05696 describe y reclama polipéptidos que corresponden a fragmentos o secuencias homologas de GPCR las cuales pueden unirse a un lígándos GPCR o las cuales pueden modular la unión al ligando. Ambas referencias describen que un fragmento de membrana que abarca el tercer - dominio TM del receptor de dopamina D2 se une específicamente a un ligando del receptor intado en un modelo de vesícula unilamelar simple, pequeña. El fragmento utilizado se terminó con una lisina (la cual está positivamente cargada a pH fisiológico) en un extremo y con un ácido aspártico (el cual está negativamente cargado a pH fisiológico) en el otro. No se esperaría que este péptido se insertara fácilmente dentro de una membrana biológica. Por el contrario, este ejemplo se refiere a la modulación, especialmente inhibición, de las actividades biológicas del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) mediante la exposición de éste a moléculas que interfieren con el ensamblaje correcto del receptor. En particular, los péptidos sintéticos, aislados y/o recombinantes, fragmentos y/o péptidos consensos del dominio transmembranal del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) inhiben la transducción de señal mediada por el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). Los residuos cargados pueden añadirse a un extremo para promover lá orientación conecta del péptido en la membrana. En particular, la adición de dos residuos negativamente cargados, tales como Asp, y el extremo extracelular del fragmento potencian la adividad antagonista. Los fragmentos del dominio transmembranal pueden sintetizarse mediante síntesis de péptido en fase sólida a través de flujo en un sintetizador peptídico Applied Biosystems 432A utilizando derivados Fmoc de aminoácidos. Para resolver la agregación que puede ocunir durante la síntesis de los péptidos y que puede llevar a un bloqueo de la cadena peptídica en crecimiento, los derivados FmocHmb de Ala, Val, y Leu se introducen. Los residuos cargados se añaden al extremo peptídico para asegurar una a 5 orientación adecuada de los péptidos durante la penetración dentro de la membrana celular, y para mejorar la solubilidad de los péptidos hidrófobos. La pureza de los péptidos se evalúa mediante CLAR en fase reversa y las estructuras se confirman mediante espectrometría de masas de absorción láser asistida por matriz durante el tiempo de viaje (MALDI-TOF) (Tarasova et 10 al., Ad. Exp. Med. Biol., Plenum Press, NY, pp. 201-206 (1998)). EI efecto antagonista de los fragmentos se evalúa en células de carcinoma de riñon de humano (HEK) que expresan de manera estable el receptor de quimiocina de proteína G. RANTES de utiliza como el agonista. Las cél *ulas en crecimiento en cámaras para portaobjetos con cubierta de * * 15 vidrio, de Nunc se incuban con 1 µM de Fura-2/AM por 20 minutos en una incubadora con C02, se enjuagan con PBS, y se montan en la plataforma de un microscopio invertido Zeiss Axiovert (Atto Instruments). La fluorescencia se mdnltorea mediante una cámara CCD intensificadora utilizando un filtro con límite de dOd. Las calibraciones de [Ca2+]¡ se llevan a cabo utilizando Ca2+ 20 estándar que contiene 1 µM de Fura. La adividad antagonista de los fragmentos se optimiza adicionalmente como se describió los ejemplos 1 -4 de WO 99/43711.

La actividad antagonista de los fragmentos también se evalúa mediante la capacidad para inhibir la fusión del receptor de quimiocina de proteína G-célula con VIH, y la capacidad para inhibir la unión de un ligando - * - * marcador del receptor de quimiociná de proteína G (CCR5), mediante métodos bien conocidos en la técnica y como se describe para CXCR4 en WO 99/43711.

EJEMPLO 51 Células T inmortalizadas con virus de herpes que expresan el receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) La construcción de una línea de célula T inmortalizada con virus herpes que expresa el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) se describe en Vella, et al., J. Virol. Methods 79: 51-63 fl999). Esta o una línea celular similar es útil para probar agonistas y antagonistas en los métodos descritos en la presente invención.

EJEMPLO 52 Aislamiento del ligandos CCR5 y anticuerpos anti-CCR5 Un método general para solubilizar CCRd en su estado nativo que puede ser utilizado en pruebas de selección de ligando y anticuefo se describe en Mirzabekov et al., J. Biol. Chem. 274: 28746-50 (1999). Un método para seleccionar anticuefo CCR5 a partir de una genoteca de exhibición del fago de anticuerpos humanos se describe en Osbum et al., Nat. Biotechnol. 16:778-81 (1998). Lee et al. describen que el epítope reconocido por el anticuefo específico a CCRd 2D7 es un blanco preferido para los anticuerpos para inhibir la entrada de VIH. Lee et al., J. Biol. Chem. 274: 9617-26 (1999). Otros métodos de selección para ligandos y anticuefos se conocen bien en la técnica y se describen en la presente invención.

EJEMPLO 53 Pruebas para neutralización del anticuerpo Una prueba basada en una línea celular para medir la neutralización de VIH-1 mediante anticuefos se describe en Trkola et al., J.

Virol. 73: 8966-74 (1999). Una prueba para anticuerpo neutralizante de VIH y selección para una molécula que inhibe la unión a VIH o la entrada en cualquier etapa se describe en Boritz et al., J. Virol. 73: 6937-46 (1999). Un método para analizar la inhibición del co-receptor se describe en Klasse et al., J. Virol. 73: 7463-66 (1999). Métodos adicionales para probar la neutralización de la entrada de VIH, fusión, replicación, etcétera, se conocen bien en la técnica y se describen en la presente invención.

EJEMPLO 54 Generación de anticuerpos anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) utilizando cepas Xenomouse™ Las cepas Xenomouse™ de ratones diseñados para expresar un repertorio de anticuerpos lgG2/kappa de humano se obtuvieron a partir de Abgenix, Inc., (Fremont, CA). Los grupos de ratones fueron inmunizados de conformidad con los siguientes calendarios: Calendario de inmunización 1 (fusión XF3): Los ratones Xenomouse™ (n = 6) se inyectaron inicialmente en la base de la cola con 100 µgramos de PBS de un vector de expresión de ADN plasmídico que codifica el gen de longitud total del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) (CCRd pcDNA3T). Esto se siguió por tres inyecciones subcutáneas dadas a intervalos de dos semanas, cada una consistiendo de 10 millones de células CHO transfectadas con un vector de expresión de CCRd (en adelante "células CHO CCRd") en adyuvante incompleto de Freund. Los animales se dejaron descansar por 12 semanas y luego se les dieron dos inyecciones subcutáneas más separadas por dos semanas, cada una consistiendo de 10 millones de células NSO transfectadas con un vector de expresión CCRd (en adelante "células CSO CCRd") en adyuvante incompleto de Freund. Tres días después de la última inyección. Los ratones se sacrificaron y las células de los bazos y/o de los nodulos linfáticos se colectaron con el propósito del generar hibridomas. Los hibridomas generados a partir de esta fusión se denominaron como "XF3.-~" (cuadro 4).

Calendario de inmunización 2 (fusión XF6): Los ratones Xenomouse™ (n = 5) se inyectaron inicialmente con 7 millones de células CHO CCR5 en adyuvante incompleto de Freund. Esto se siguió por seis inyecciones intraperitoneal dadas a intervalos de dos semanas, cada una consistiendo de 10 millones de células CHO CCRd. Los animales se dejaron descansar por 5 semanas y luego se les dieron dos inyecciones intraperitoneal más separadas por dos semanas, cada una consistiendo de 10 millones de células NSO CCRd en adyuvante incompleto de Freund. Tres días después de la última inyección. Los ratones se sacrificaron y las células de los bazos y/o de los nodulos linfáticos se colectaron con el propósito del generar hibridomas. Los hibridomas generados a partir de esta fusión se denominaron como "XF6.— " (cuadro 4). Calendario de inmunización 3 (fusión XF7): Los ratones Xenomouse™ (n = 5) se inyectaron inicialmente en la base de la cola con 7 millones de células CHO CCRd en adyuvante completo de Freund. Esto se siguió por seis inyecciones adicionales en la base de la cola dadas a intervalos de dos semanas, cada una consistiendo de 10 millones de células CHO CCRd. Los animales se dejaron descansar por 5 semanas y luego se les dieron dos inyecciones más en la base de la cola con una separación de dos semanas, cada una consistiendo de 10 millones de células NSO CCRd en adyuvante incompleto de Freund. Tres días después de la última inyección. Los ratones se sacrificaron y las células de los bazos y/o de los nodulos linfáticos se colectaron con el propósito del generar hibridomas. Los hibridomas generados a partir de esta fusión se denominaron como "XF7.— " (cuadro 4).

Calendario de inmunización 4 (fusión XF11 : Los ratones Xenomouse™ (n = d) se inyectaron mediante inyección en las almohadillas de las patas dadas a intervalos de dos semanas.

Cada inmunización consistió de un total de 10 millones de células NSO CCRd en adyuvante RIBI. Se administraron un total de ocho inmunizaciones. Tres días después de la última inyección. Los ratones se sacrificaron y las células de los bazos y/o de los nodulos linfáticos se colectaron con el propósito del generar hibridomas. Los hibridomas generados a partir de esta fusión se denominaron como "XF11.--" (cuadro 4). Calendario de inmunización d (fusión XF12): Los ratones Xenomouse™ (n = d) se inmunización inicialmente con 10 millones de células NSO CCRd transfectadas en adyuvante Incompleto de Freund administradas mediante una combinación de vías intraperitoneales y subcutáneas. Esto se siguió por seis inmunizaciones adicionales, dadas a intervalos de dos semanas, cada una consistiendo de 10 millones de células CHO CCRd en adyuvante incompleto de Freund, también administradas mediante una combinación de vías intraperitoneai y subcutánea. Un animal se sacrificó para fusión tres días después de la tercera inmunización en adyuvante incompleto de Freund. Tres días después de la última inyección, los ratones remanentes se sacrificaron y las células de los bazos y/o de los nodulos linfáticos se colectaron con el propósito del generar hibridomas. Los hibridomas generados a partir de esta fusión se denominaron como "XF12.— " (cuadro 4). Los hibridomas se generaron de conformidad con los protocolos que son comúnmente conocidos en la técnica. El copartícipe de fusión utilizando para generar estos hibridomas fue P3X63-AG8.663 obtenido a partir de ATCC, Lote F11d4d. Los anticuefos producidos mediante estos hibridomas se seleccionan por su capacidad para unirse a CCRd tanto mediante ELISA como en selección FACS.

Selección de membrana mediante ELISA para anticuefos específicos a anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) Preparación de membrana plasmática. Las membranas plasmáticas a partir de células CHO CCR5 y las células CHO transfectadas con el vector control se prepararon. Brevemente entre 108 y 109 células CHO CCRd o CHO se suspendieron en 40-60 mililitros de Tris 12 mM frío, pH 7.6, sucrosa 260 mM. Las células se usaron sobre hielo, mediante homogeneización utilizando un homogeneizador eléctrico de velocidad variable. La lisis celular se confirmó mediante microscopía. El homogeneizado celular se centrifugó a 270 xg, por 10 minutos a 4°C. El sobrenadante (que contenía las membranas plasmáticas) se colectó mientras que el concentrado (que contenía la fracción nuclear) se descartó. A continuación, el sobrenadante se centrifugó a 8000 x g, por 10 minutos a 4°C. De nuevo, el sobrenadante (que contenía las membranas plasmáticas) se colectó mientras que el concentrado (que contenía las fracciones mitocondrial y lisosomal) se descartó. Luego las membranas plasmáticas se centrifugaron fuera del sobrenadante mediante centrifugación en una ultracentrífuga a 100,000 x g, por 60 minutos a 4°C. El sobrenadante se descartó. Las membranas plasmáticas concentradas se resuspendieron en aproximadamente 1 ml de PBS. Después de la resuspensión, el volumen de membranas plasmáticas se llevó a 5-10 ml con PBS adicional. La solución de membranas se mantuvo sobre hielo y se sónico (sobre hielo) hasta que se obtuvo una solución uniforme. Se tuvo cuidado para no sobrecalentar la solución durante la sonícación. La concentración de proteína en membrana plasmática se determinó utilizando el equipo para determinación de proteína BCA disponible a partir de Pierce Chemical Company (Rockford Illinois). Las membranas plasmáticas se almacenaron a -70°C hasta su uso. ELISA de membrana. 4 placas Immulon (Dynex) se cubrieron con 50 microlitros ya sea de membranas plasmáticas de CHO CCRd o membranas plasmáticas de CHO transfectadas con vector control (las soluciones membranales estuvieron a una concentración de 20 microgramos/mililitros) durante toda la noche a 4°C. A la mañana siguiente, las placas se lavaron tres veces con PBST (PBST = PBS que contiene 0.01% de Tween 20). Las placas se bloquearon luego por 1 hora a temperatura ambiente con 200 microlitros/pozo de muestras (sobrenadante de hibridoma) y los controles se añadieron a las placas y se Incubaron por 2 horas a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4°C. Cada muestra/control se evaluó por su unión tanto a las membranas de CHO CCRd así como a las membranas de CHO transfectadas con vector control. A continuación las placas se lavaron tres veces con PBST. Después del lavado, se añadieron a los pozos 50 microlitros/ pozo de anticuefo secundario (Vedor IgG de cabra anti-humano (H+L) a 0.25 µg/ml en 0.1 % de BSA/PBST+1% de Suero de Cabra) y se incubaron por 1 hora a temperatura ambiente. Mientras que las placas se incubaban, se preparó el reactivo (Vedor Laboratories). La placa se lavó luego tres veces con PBST. A continuación, 60 microlitros/pozo de ABC diluido se añadieron a las placas y se incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron luego seis veces con PBST. 100 microlitros/pozo de reactivo TMB (Sigma Chemicals Company, St. Louis, MO) se añadieron a los pozos y se incubaron por 10 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo luego a mediante la adición de 2d mícrolitros/pozo de H2S042M. La placa se leyó a 40d nm. Resultados. 238 hibridomas muestran unión a membranas de células CHO CCRd, de las cuales aproximadamente una mitad muestra una unión incrementada a membranas de CHO CCR5 en comparación con las membranas de células CHO transfectadas con el vector control. 217 (cuadro 4) de estos hibridomas se expandieron y el ELISA de membrana se repitió. Los resultados a partir de la segunda selección demuestran que los resultados de este procedimiento de selección fueron reproducibles.

CUADRO 4 Hibridomas que secretan anticuerpos que unen CCR5 a membranas de CHO 10 15 20 Selección mediante FACS para anticuefos específicos antireceptor de quimiocina de proteína G (CCRd) Las células CHO transfectadas con el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) o transfectadas con el vector control se cosecharon, lavaron con regulador de pH FACS (PBS acón 0.1% de NaN3 y BSA al 0.1%). Un millón de células en 100 µl se dispensaron en tubos FACS (Falcon 2060). Diez µl del sobrenadante del hibridoma se añadieron a cada tubo y se incubaron por 20 minutos a 4°C. Cada sobrenadante se analizó para unión tanto a CHO CCRd como a las células CHO transfectadas con el vector control. Las células se lavaron, y se suspendieron en 100 microlitros de regulador de pH FACS y 10 microlitros de IgG de cabra anti-humano biotinilado (H+L). (Vector) se añadieron a los tubos 1 microgramo/mililitro y se incubaron 20 minutos a 4°C. Las células se lavaron, se suspendieron en 100 microlitros de regulador de pH FACS y se añadieron d microlitros de Streptavidin PE (DAKO) siguiendo por una incubación de 10 minutos a 4 grados C. Las células se lavaron, se resuspendieron en 200 microlitros de regulador de pH FACS que contenía O.d microgramos/mililitro de yoduro de propidio y se analizaron en FACScan (Becton Dickinson). Resultados. De los 217 sobrenadante de hibridomas seleccionados por análisis de FACS, XF11.1D8, XF11.4D10, XF11.4C4, XF11.5H1 , y XF11.1G8 se identificaron como que mostraban una unión significativamente incrementada a CHO CCRd en comparación con las células CHO transfectadas con el vector control.

EJEMPLO 55 Identificación v clonación de dominios VH v VL Un método para identificar y clonar dominios VH y VL a partir de líneas celulares que expresan un anticuefo particular es llevar a cabo PCR con iniciadores específicos a VH y VL de ADNc elaborado a partir de las líneas celulares que expresan el anticuerpo. Brevemente, el ARN se aisla a partir de las líneas celulares y se utiliza como un templado para RT-PCR diseñado para amplificar los dominios VH y VL de los anticuefos expresados por las líneas celulares EBV. Las células se pueden lisar en el reactivo TRIzol (R) (Life Technologies, Rockville. MD) y se extraen con un quinto del volumen de cloroformo. Después de la adición del cloroformo, la solución se deja incubar a temperatura ambiente por 10 minutos, y se centrifuga a 14,000 rpm por 16 minutos a 4°C en una centrifuga de mesa. El sobrenadante se colecta y el ARN se precipita utilizando un volumen igual de isopropanol. El ARN precipitado se concentra mediante centrifugación a 14,000 fm por 1d minutos a 4°C en una centrifuga de mesa. Después de la centrifugación, el sobrenadante se descarta y se lava con etanol al 75%. Después del lavado, el ARN se centrifuga de nuevo a 800 rpm por 5 minutos a 4°C. El sobrenadante se descarta y el concentrado se deja secar al aire. El ARN se disuelve luego en agua DEPC y se calienta a 60°C por 10 minutos. Las cantidades de ARN pueden determinarse utilizando mediciones de densidad óptica.

El ADNc puede sintetizarse, de conformidad con los métodos bien conocidos en la técnica, a partir de 1.5-2.5 microgramos de ARN utilizando transcriptasa reversa e iniciadores de hexámeros al azar. El ADNc se utiliza luego como un molde para amplificación mediante PCR de los dominios VL y HL. Los iniciadores utilizados para amplificar los genes VH y VL se muestran en el cuadro 5. Típicamente una reacción de PCR hace uso de un iniciador particular hacia d' y un iniciador particular hada 3'. Algunas veces, cuando la cantidad de ADN molde disponible está limitada, o para mayor eficiencia, los grupos de iniciadores hacia 6' y/o hacia 3' pueden ser utilizados. Por ejemplo, algunas veces todos los cinco iniciadores VH-5' y todos los iniciadores JH3' se utilizan en una reacción de PCR particular. La reacción de PCR se lleva a cabo en un volumen de 50 microlitros que contiene regulador de pH de PCR 1X, 2 mM de cada dNTP, 0.7 unidades de Taq polimerasa de alta fidelidad, mezcla del iniciador 5', mezcla del iniciador 3' y 7.5 microlitros el ADNc. La mezcla de iniciadores 5' y 3' de ambos VH y VL puede realizarse mediante agrupación de 22 pmoles y 28 pmoles, respectivamente, de cada uno de los iniciadores individuales. Las condiciones para PCR son: 96°C por d minutos; seguido por 25 ciclos de 94°C por 1 minuto, 50°C por 1 minuto, y 72°C por 1 minuto; seguido por un ciclo de extensión de 72°C por 10 minutos. Después de que la reacción ha terminado, los tubos de muestra se almacenan a 4°C.

CUADRO 5: secuencias iniciadoras utilizados para amplificar dominios VH v VL.

Nombre del iniciador SEQ ID NO Secuencia del iniciador (5'-3') Iniciadores VH Hu VH 1-5' 23 CAGOTOCAGCTGGTGCAGTCTGG Hu VH2-5' 24 CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG Hu VH3-5' 25 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG Hu VH4-5' 26 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG Hu VHS-5' 27 GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC Hu VH6-5' 28 CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG Hu JH1,2-5' 29 TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC Hu JH3-5' 30 TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC Hu JH4.5-5' 31 TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC Hu JH6-5' 32 TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC Iniciadores VL Hu Vkappal-5' 33 GACATCCAGATGACCCAGTCTCC Hu Vkappa2a-5' 34 GATGTTGTGATGACTCAGTCTCC Hu Vkappa2b-5' 35 GATATTGTGATGACTCAGTCTCC Hu Vkappa3-5' 36 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCC Hu Vkappa4-5" 37 GACATCGTGATGACCCAGTCTCC Hu Vkappa5-5' 38 GAAACGACACTCACGCAGTCTCC Hu Vkappa6-5' 39 GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC Hu Viambda1-5' 40 CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCC Hu Vlambda2-5' 41 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGC Hu Vlambda3-5' 42 TCCTATGTGCTGACTCAGCCACC Ru Vlambda3b-5' 43 TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC Hu Vlambda4-5' 44 CACGTTATACTGACTCAACCGCC Hu Vlambda5-5' 45 CAGGCTGTOCTCACTCAGCCGTC Hu V1ambda6-5' 46 AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA Hu Jkappal-3' 47 ACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC Hu Jkappa2-3' 48 ACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC Hu Jkappa3-3' 49 ACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC Hu Skappa4-3' 50 ACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCC Hu Jkappa5-3' 51 ACGTTTAATCTTCCAGTCGTGTCCC Hu Jlambdal-3' 52 CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCC Hu Jlambda2-3' 53 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGC Hu Jlambda3-3' 54 TCCTATGTGCTGACTCAUCCACC Hu Jlambda3b-3' 55 TCTTCTOAGCTOACTCAGGACCC Ru Jlambda4-3' 56 CACGTTATACTGACTCAACCGCC Hu Jlambda5-3' 57 CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTC Hu Jlambda6-3' 58 AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA Las muestras de PCR se someten a eledroforesis en un gel de agarosa al 1.3%. Las bandas de ADN de los tamaños esperados (~ 606 pares de bases para los dominios VH, y 344 pares de bases para los dominios VL) pueden cortarse del gel y purificase utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Los productos de PCR purificados pueden ligarse dentro de un vector de clonación para PCR (vector TA a partir de Invitrogen Inc., Carisbad, CA). Los productos de PCR individuales clonados pueden aislarse después de la transfección de E. coli y selección de color azul/blanco. Los productos de PCR clonados pueden secuenciarse luego utilizando métodos comúnmente conocidos en la técnica. Las bandas de PCR que contienen el dominio VH y los dominios VL también pueden ser utilizadas para crear vectores de expresión Ig de longitud total. Los dominios VH y VL pueden ser clonados dentro de vedores que contienen las secuencias nucleotídicas de una región constante de cadena pesada (por ejemplo, lgG1 de humano o lgG4 de humano) o cadena ligera (kappa de humano o lambda de humanos) de tal manera que la molécula completa de cadena pesada o ligera puede expresarse a partir de estos vedores cuando se transfedan dentro de una célula hospedera apropiada. Además, cuando las cadenas pesadas y ligeras clonadas se expresan ambas en una línea celular (a partir ya sea de uno de dos vectores), éstas pueden ensamblarse hacia una molécula completa de anticuerpo funcional que se secreta dentro del medio de cultivo de la célula. Los métodos que utilizan poiinucleótidos que codifican un dominio de anticuefo VH o VL para generar vectores de expresión que codifican moléculas de anticuerpo completas se conocen bien en la técnica.

EJEMPLO 56 Prueba de inmunofluorescencia El siguiente protocolo de inmunofluorescencia puede ser utilizado, por ejemplo, para verificar la expresión de receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) en células, o para verificar la presencia de uno o más anticuerpos que se unen al receptor de quimiocina de proteína (CCRd) expresado sobre la superficie de las células. Brevemente, portaobjetos para cámara Lab-Tek II se cubrieron a 4°C durante toda la noche con diez microgramos/mililitro de colágena que bovino Tipo II en DPBS que contenía calcio y magnesio (DPBS++). Los portaobjetos se lavaron entonces dos veces con DPBS++ frío y se sembraron con 8000 células CHO-CCRd o células CHO pC4 transfectadas en un volumen total de 126 microlitros y se incubaron a 37°C en la presencia de 9d% de oxigeno/5% de dióxido de carbono. El medio de cultivo se expiró suavemente y las células adherentes se lavaron dos veces con DPBS++ a temperatura ambiente. Los portaobjetos se bloquearon con DPBS++ que contenía 0.2% de BSA (bloqueador) a 0-4°C por una hora. La solución del bloqueo se aspiró suavemente y 125 microlitros de solución que contenía anticuefo (una solución que contiene anticuefo puede ser, por ejemplo, un sobrenadante de cultivo de hibridoma el cual usualmente no se diluye, o suero/plasma el cual usualmente se diluye -alrededor de una dilución 1/100). Los portaobjetos se incubaron por una hora a 0-4°C. Las soluciones con anticuefo se aspiraron suavemente y ias células se lavaron d veces con 400 microlitros de solución del bloqueo enfriada con hielo. A continuación, 12d microlitros de anticuerpo secundario marcado con rodamina 1 microgramo/mililitro (por ejemplo, IgG anti-humano) en el bloqueador se añadió a las células. De nuevo, las células se incubaron por 1 hora a 0-4°C. La solución del anticuerpo secundario se aspiró suavemente y las células se lavaron 3 veces con 400 microlitros de solución del bloqueo enfriada con hielo d veces con DPBS++. Las células se fijaron entonces con 126 microlitros de formaldehído al 3.7% en DPBS++ por 1d minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron 5 veces con 400 µl de DPBS++ a temperatura ambiente. Finalmente, las células se montaron en glicerol acuoso al 50% y se observaron en un microscopio de fluorescencia utilizando filtros para rodamina.

EJEMPLO 57 Western Blot para detectar unión al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) El receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) es una proteína embebida en membrana. Con el objeto de llevar a cabo un westem blot de las proteínas del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd), las membranas celulares debieron ser primero solubilizadas. El siguiente protocolo se elaboró por Mirzabekov et al., J. Biol. Chem. 274: 28745 (1999) ei cual se ¡ncofora aquí en su totalidad como referencia en la presente invención. Una suspensión celular particular de células CHO con el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) o células pC4-CHO (CHO control transfectadas con el vector), se concentran y se resuspenden en regulador de pH para solubiiización compuesto de (NH4)2S04 100 mM, Tris-HCl 20 mM (ph 7.6) y Cymal TM-5 al 1 % (p/v) (Anatrace Inc., Maumee, OH), y mezcla de inhibidor de proteasa (una tableta de Complete TM (Roche Molecular Biochemicals) por 25 ml. Después de una incubación de 30 minutos a 4°C sobre una plataforma con agitación, las muestras se centrifugaron por 30 minutos a 14,000 x g para remover los restos celulares. El receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) se inmunoprecipitó a partir de las membranas solubilizadas utilizando, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) 2D7 descrito en Wu et al., J. Exp. Med. 186: 1373 (1979) conjugado con glóbulos de sefarosa. Después de la inmunoprecipitación, los glóbulos se lavaron extensivamente con regulador de pH para solubilización y se suspendieron en regulador de pH muestra-SDS 2X. Las muestras se incubaron en regulador de pH muestra-SDS por una hora a 5d°C antes de someterlas a electroforesis a través de un gel de poliacrilamida-SDS al 11%. El Westem blot de las muestras del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) puede llevarse a cabo de conformidad con los protocolos estándar desconocidos en la técnica.

EJEMPLO 58 Western blot. inmunoprecipitación. y purificación dei receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) El protocolo de solubilización de membrana o Mirzabekov et al.

Descrito en el ejemplo 67 anteriormente mencionado también puede ser utilizado para preparar muestras que contienen el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) para western blot, inmunoprecipitación o purificación.

EJEMPLO 59 Análisis BIAcore de la afinidad de los péptidos de unión al receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) La unión de los anticuerpos anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) al receptor de quimíocina de proteína G (CCRd), por ejemplo, puede ser analizado mediante análisis BIAcore. Ya sea el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) (u otro antígeno del cual uno desea conocer la afinidad de un anticuefo anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5)) o el anticuefo anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) pueden inmovilizarse covalentemente a un fragmento para sensibilidad BIAcore (fragmento CMd) mediante grupos amino utilizando química de N-etil-N'-ídimetilamlnopropi carboiimida N-hidroxisuccinimida. Varias diluciones de los anticuefos anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) o receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) (u otro antígeno del cual uno desea conocer la afinidad de un anticuerpo anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCR5)), respectivamente se hacen fluir sobre el fragmento derivado CM5 en células en flujo a 15 microlitros/minuto por un volumen total de 50 microlitros. La cantidad de proteína unida se determina durante el lavado del flujo celular con regulador de pH HBS (HEPES 10 mM, pH 7.4, NaCI 150 mM, EDTA 3.4 mM, agente tensioactivo p20 al 0.005%). La especificidad de la unión para la proteína de interés se determina mediante la competencia con un competidor soluble en la presencia de la proteína de interés. El flujo celular de superficie puede regenerarse mediante el desplazamiento de la proteína unida por el lavado con 20 microlitros de glicina-HCI 10 mM, pH 2.3. Para análisis de cinética, las células en flujo se evalúan a diferentes velocidades de flujo y diferentes densidades de polipéptido sobre la oblea CM5. Las velocidades activadas y velocidades desactivadas pueden determinar utilizando el programa de evaluación cinética en un software BIAevaluation 3.

EJEMPLO 60 Prueba de neutralización del virus Los anticuefos de la invención pueden probarse por su capacidad para inhibir o reducir la viabilidad de VIH-1 para infectar células (que expresan CCRd) utilizando una prueba de neutralización del virus tal como la prueba descrita en Zolla-Pazner y Shafe, AIDS Res. Hum. Retrovir. 11 : 1449 (1995) el cual se incorpora en su totalidad como referencia en la presente. Brevemente, 2 x 105 PBCM en reposo se añadieron a dilución(es) apropiada de los anticuerpos de la invención. Después de una hora de incubación, ias células se expusieron al virus por dos horas, se lavaron y de suspendieron en medio de cultivo que contenía PHA e IL-2. A varios puntos de tiempo después de la infección, tal como a los días 7 y 9, la cantidad del antígeno VIH p24 en el sobrenadante de cultivo se midió utilizando ELISA. El porcentaje de neutralización se calculó con relación a un experimento control en el que VIH se permitió que infectara a células en la ausencia de anticuefos de la invención, o alternativamente (o en adición), en la presencia de un anticuefo control (de isotipo coincidente, si es necesario) con especificidad inelevante. Una variación de esta prueba es llevarlo a cabo en PBMC activadas, más que en PBMC en reposo. Esto puede lograrse mediante el cultivo de las PBMC en la presencia de PHA e IL-2 por dos días antes de llevar a cabo la prueba de neutralización del virus.

EJEMPLO 61 Prueba de unión a MIP-1beta Los anticuefos de la invención pueden probarse por su capacidad para prevenir que un ligando natural de CCRd, por ejemplo, MIP1-beta, se una al receptor CCRd. La siguiente prueba de unión a 125l-MIP1-beta es un ejemplo de una prueba que puede llevarse a cabo para determinar la capacidad de un anticuefo de la invención para prevenir que un ligando natural de CCRd, MIP1-beta, se una al receptor CCRd. Veinticinco microCuries de 25l-MIP1-beta (Amersham Pharmacia Biotech, # de Cat. IM310, 25 microCuries, 2000 Ci/mmoles) se disuelven en 1 ml de agua destilada para hacer una solución de almacenamiento 12.5 nM. Si las células cultivadas, tales como células CHO CCRd, se utilizan en este experimento, éstas se tripsinizan, se lavan y resuspenden a 10 x 106 células/ml en regulador de pH para unión (CaCI2 1 mM, MgCI2 64 mM, Hepes 50 mM, BSA al 0.1 %, NaN3 al 0.1%, pH 7.5). Si las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se van a utilizar en esta prueba, entonces se aislan a partir de donantes saludables y se resuspenden en 2 x 106 células/ml en regulador de pH para unión. Para determinar qué concentración o cantidad de MIP-1 beta podría saturar a las células en esta prueba, se elaboran una serie de diluciones de i25l-MIP-1beta a cuatro veces la concentración final deseada.

(Por ejemplo, para las concentraciones finales de 3 nM, debe prepararse una solución 12 nM). Típicamente, la concentración final deseada de 125I-MIP-1beta tiene un intervalo de 3 nM hacia abajo hasta 0.05 nM. Además, se elaboran una solución de MIP-1beta frío (no radiactivo) a cuatro veces la concentración final deseada. Típicamente, la concentración final deseada de MIP-1 beta frío es de 200 nM, de manera que se prepara una solución 800 nM. Para medir la unión total de 125l-MIP-1beta a las células, 25 microlitros de regulador de pH para unión, 25 microlitros de 125l-MIP-1 beta caliente, y 50 microiitros de suspensión celular se añaden a una microplaca de 96 pozos con fondo en forma de U (Costa, # de Cat. 3799). Las células siempre se añaden al final. Si la unión de 125l-MIP-1beta no es específica, ésta no competirá efectivamente con MIP-1beta frío. Por lo tanto, para evaluar la especificidad de la unión, 25 microlitros de MIP-1 beta frío (800 nM), 25 microlitros de 125l-MIP-1beta caliente (varias diluciones), y 50 microlitros de suspensión celular se añaden a una microplaca de 96 pozos con fondo en forma de U. De nuevo las células se añaden ai final. Las mezclas se incuban entonces a temperatura ambiente en un agitador por una hora. Después de la incubación, cada muestra se transfiere a la parte superior de tubos que contienen 200 microlitros de una mezcla de aceite (ftalato de dibutilo: ftalato de dioctilo 2:1). Los tubos se centrifugan a 12,000 fm por 20 segundos utilizando una microcentrífuga. El fondo del tubo, que contiene el concentrado celular, se corta y se cuenta en un contador gamma. Si la unión de MIP-1beta es específica, menos radioactividad será medida en el contador gamma en la prueba de competencia. Como un control para asegurar que MIP-1beta está unido, al receptor de quimiocina de proteína G (CCRd), uno puede elegir el llevar a cabo el experimento en células adecuadas que no expresan CCRd, por ejemplo, células CHO transfectadas con el vedor. Para llevar a cabo una prueba de competencia para determinar si una quimiocina u anticuerpo puede competir con MIP-1 beta para la unión al mismo Receptor acoplado proteína G, se prepara una serie de diluciones de quimiocina u anticuefo frío a cuatro veces la concentración final deseada. Además, se prepara una solución de 125l-MIP-1beta a cuatro veces la concentración final deseada. Para este tipo de prueba de competencia, se prepara una solución 2 nM de 125l-MIP-1 beta , la cual dará una concentración final de O.d nM. Para medir la unión total de 125l-MIP-1beta a las células, 25 microlitros del regulador de pH, 25 microlitros de 125l-MIP-1 beta caliente (2 nM), y 50 microlitros de la suspensión celular se añaden a una microplaca de 96 pozos con fondo en forma de U. Las células siempre se añaden al final. Si otra sustancia (por ejemplo, anticuefo anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCRd), u otra quimiocina) se unen al Receptor de MIP-1 beta (es decir, receptor de quimiocina de proteína G (CCRd)) la presencia de cantidades en incremento de la substancia fría (no radiactiva) (por ejemplo, anticuefo anti-Receptor quimiocina de proteína G (CCRd), u otra quimiocina) competirá para la unión del Receptor MIP-1beta (es decir, receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). Por lo tanto, para determinar si una substancia se une al receptor MIP-1beta (es decir, receptor de quimiocina de proteína G (CCRd), e inhibe a MIP-1beta (radiactivamente marcado) para la unión a su receptor (es decir, Receptor quimiocina de proteína G (CCRd), 26 microlitros de substancia fría (por ejemplo, anticuefo anti-Receptor quimiocina de proteína G (CCRd) a varias diluciones), 26 microlitros de 125l-MIP-1beta caliente (2 nM), y 60 microlitros de suspensión celular se añaden a una microplaca de 96 pozos con fondo en forma de U. De nuevo las células se añaden al final. Las mezclas se incuban luego a temperatura ambiente en un agitador por una hora. Después de la incubación, cada muestra se transfiere a la parte superior de tubos que contienen dos microlitros de una mezcla de aceite (ftalato de dibutilo: ftalato de dioctilo 2:1). Los tubos se centrifugan a 12,000 rpm por 20 segundos utilizando una microcentrífuga. La parte inferior del tubo, que contiene el concentrado celular, se corta y se cuenta en un contador gamma. Si la unión de MIP-1beta es específica, menos radioactividad de medida en el contador gamma en la prueba de competencia. Como un control para asegurar que MIP-1beta está unido, al Receptor quimiocina de proteína G (CCRd), uno puede elegir el llevar a cabo el experimento sobre células adecuadas que no expresan CCRd, por ejemplo, células CHO transfectadas con el vedor. Una prueba alternativa, pero similar, para determinar la capacidad de un anticuefo de la invención para prevenir que un ligando natural de CCR5, MIP1-beta, se una al receptor CCRd se describe en Lopalco et al:; J. Immunol., 164: 3426 (2000) y en Trkola et al:; Nature, 364: 184 (1996) los cuales incoforan en su totalidad como referencias en la presente invención. Previamente, 106 células expresan CCRd (es decir, células T CD4+, células CHO transfectadas con CCRd) se incuban sobre hielo con dilución(es) apropiada de anticuerpo de la Invención. Después de 45 minutos de incubación, 0.2 microCuries de MIP1-beta radio marcado (es decir, 125l-MIP-1 beta (DuPont-NEN, Boston, MA) se añaden a una concentración final de 0.1 nM. Después de una incubación por dos horas sobre hielo, la radioactividad no unida se remueve utilizando un gradiente de dos pasos, como se describe en Grassi et al., J Exp Med. 174: 53 (1991) el cual se incorpora en su totalidad como referencia en la presente invención, en el cual la capa inferior consiste de suero de ternera fetal que contiene 10% de sucrosa, y la capa superior consiste de 80% de silicón (Sigma Aldrich) y 20% de aceite mineral (Sigma Aldrich). La radioadividad unida en los concentrados celulares se mide en un contador gamma.

EJEMPLO 62 Prueba de quimiotaxis Los polipéptidos, y agonistas o antagonista de los mismos de la invención pueden probarse por su capacidad para mejorar, inhibir, o no alterar significativamente la quimiotaxis de las células que expresan el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) en respuesta a MIP-1 beta. Las células que expresan el Receptor quimiocina de proteína G (CCRd) pueden ser una población homogénea de células purificadas que expresan Receptor quimiocina de proteína G (CCRd) o una población heterogénea, (es decir, células mononucleares que sangre periférica, PBMC). La siguiente prueba para medir la quimiotaxis inducida por MIP-1 beta de células que expresan CCRd implica el uso de células marcadas con una molécula trazadora (fluorescente), inducción de la quimiotaxis en un pozo de una placa de 96 pozos que contiene un filtro a través del cual las células pueden pasar, y medición del número de células migrantes mediante la emisión del fluoresceno. Para llevar a cabo esta prueba los siguientes materiales se necesitan: HBSS, sin calcio, sin magnesio (Biofluids # de Cat. p 326-000) Albúmina, en polvo de bovino, fracción V, libre de IgG (Sigma # de Cat. A-2068) ChemoTx# 105-2 (para célula T, PBMC, célula NK), 108-1 (para eosinófilo, PMN) (Neuro Probé, Inc.) Calceina, AM (1 miligramo/mililitro en DMSO seco) (Molecular Probes # de Cat. C-3099) PBS, 1X, pH 7.4, sin calcio y magnesio (Biofluids # de Cat. p 312-00) Brevemente, las células (por ejemplo PBMC) se lavaron dos veces con HBSS (Biofluids # de Cat. p 325-000)/BSA al 0.1% y se resuspendieron en el regulador de pH a 10 x 106 células/mililitro, d microlitros de calceina AM (solución de almacenamiento 1 miligramo/mililitro) se añade a 1 mililitro de la suspensión celular. Las células se incuban a 37°C en una incubadora con ei tapón suelto por 30 minutos. Después de la incubación, las células se lavan dos veces con HBSS/BSA al 0.1% y se resuspenden a 10 x 106/mililitro en regulador de pH HBSS/BSA al 0.1 %. Veintinueve microlitros de quimiocina prueba o regulador de pH control se añaden dentro de la cámara inferior de la microplaca para quimiotaxis. El filtro se coloca rápidamente sobre la posición de la placa de 96 pozos asegurándose de que no quedan burbujas de aire entre el filtro y la solución. A continuación, de microlitros de las células se cargaron en la parte superior del filtro y la placa se cubrió para prevenir la evaporación. La placa se incubó a 37°C por dos horas para células T, PBMC, PMN y células NK y tres horas para eosinófilos. Después de la incubación, se lavó a presión cuidadosamente la superficie superior del filtro con regulador de pH PBS y luego se retiraron suavemente las células no migrantes de la parte superior del filtro con una escobilla de goma. Se leyó la placa y el filtro excitación de 485 nm/inducción 530 nm utilizando un lector de fluorescencia CytoFluor. Los resultados se expresan como índice de quimiotaxis, el cual representa el Incremento en veces en número de células migratorias en respuesta a quimiocina sobre la migración de células espontáneas en el medio control. Este protocolo fácilmente puede ser modificado para probar si un agonista o antagonista del receptor de quimiocina de proteína G (por ejemplo, anticuerpos anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) pueden mejorar, inhibir o no alterar significativamente la capacidad de MIP-1beta para inducir la quimiotaxis en células que expresan CCRd. Para hacer esto, uno puede preincubar las células con anticuerpos anti-receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) (posiblemente a varias concentraciones con el objeto de generar una curva dosis-respuesta) antes de cargar las células sobre la parte superior del filtro. Una prueba alternativo para medir la capacidad de los polipéptidos, y agonistas o antagonistas de los mismos de la invención mejorar, inhibir, o alterar significativamente la quimiotaxis de las células que expresan el receptor quimiocina de proteína G (CCRd) en respuesta a MIP-1beta puede llevarse o en una cámara de transpozo, más que en una microplaca 96 pozos. Para llevar a cabo esta prueba los siguientes materiales se necesitan: RPMI-1640 (GIBCO-BRL # de Cat. 21870-084) Albúmina, en polvo de bovino, fracción V, libre de IgG (Sigma # de Cat. A-2058) Placa de transpozos (Costar # de Cat. 3421), 6.5 mm de Diámetro, 5.0 µm de tamaño de poro MIP-1ß (R&D Systems # de Cat. 271 -BME) Medio de separación de linfocito (ICN Biochemicals # de Cat. 60494) Brevemente, las PBMC se aislaron a partir de sangre periférica fresca de humano mediante el uso de medio de separación de linfocitos y se cultivaron en RPMI-1640 con 10% de FBS por 2 días. Las PBMC cultivadas se resuspendieron en RPMI-1640/BSA al 0.5% a 20 x 106 células/mililitro. MIP-1beta se diluyó en RPMI-1640/ BSA al 0.5% a concentraciones finales de 10, 100 y 1000 nanogramos/mililitro. 600 microlitros de solución de MIP-1beta o RPMI-1640/BSA al 0.5% se añadieron a la cámara inferior de transpozo y 100 microlitros de la suspensión celular se añadieron a la parte superior del filtro. Las células se incubaron a 37°C por cuatro horas. Después de la incubación, se colectaron las células que habían migrado a la parte inferior de la cámara y luego se llevó a cabo un análisis FACS, por ejemplo, para determinar el número y tipo de población(es) de células migratorias. Los resultados se expresan como índice quimiotáctico, el cual representa las veces de incremento en el número de células migratorias en respuesta a quimiocina sobre la migración espontánea de la célula en el medio control. Una prueba adicional para determinar la capacidad de un anticuerpo de la invención para prevenir que un ligando natural de CCRd, MIP-1 beta, induzca quimiotaxis en células que expresan MIP-1 beta se describe en Lopalco et al., J. Immunol., 164: 3426 (2000). Brevemente las PBMC se activan (por ejemplo, con fitohemaglutinina e IL-2) por tres días en la presencia de anticuefos de la invención. Luego 3 x 105 PBMC activadas en 50 microlitros de RPMl 1640 que contiene 3% albúmina de suero humano se colocan en la cámara superior de un filtro desnudo de traspozo con tamaño de poro de 5 micrómetros (CoStar). 1.5 microgramos de MIP-1beta se siembra en las cámaras inferiores. Se permitió que ocurriera la quimiotaxis por media hora mientras que la cámara de transpozo se incubó a 37 grados Celcius. Las células que migraron de la cámara superior a cámara inferior se cuantificaron luego mediante análisis FACS. Los resultados se expresan en términos de índice de migración, (es decir el número de células en migración a una cámara inferior que contiene MIP-1beta /el número de células en migración a una cámara inferior que contiene solamente medio de control).

EJEMPLO 63 Movilización de calcio después de la activación de la proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) Cuando el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) se activa, el calcio a partir de los almacenes intracelulares y a partir de los espacios extracelulares se moviliza. Esta movilización de calcio puede monitorearse utilizando indicadores fluorescentes de Ca++ que pueden ser excitados con luz UV, tal como por ejemplo, Fura-2, AM disponible partir de Molecular Probes; Eugene, OR (# de Cat. F-1221). Una prueba para monitorear la movilización de calcio utilizando Fura-2 AM se describe a continuación. Brevemente, las células (por ejemplo, PBMC purificadas o células transfectadas con CCR5 tales como células CHO CCRd) se suspendieron a d x 106 células/mililitro en regulador de pH de calcio (regulador de pH Hepes 20 mM, NaC1 126 mM, KCl d mM, Glucosa O.d mM, CaCI2 1 mM, MgCI2 1 mM, BSA al 0.025%, pH 7.4). Fura-2, AM (50 µg/vial) se disuelve en 24 µl de DMSO. Las células se marcan con colorante mediante la adición de 1 µg de Fura-2 AM a 2 ml de suspensión celular. Las células se incuban luego por 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la incubación, las células se lavan dos veces con regulador de pH de calcio y se suspenden a 1 x 106 células/mililitro en regulador de pH de calcio. Dos mililitros de la suspensión celular se colocan en una cubeta con agitación continua a 37°C. La concentración de [Ca++]i se mide utilizando longitudes de onda dual para excitación a 340 nm y 380 nm, y una longitud de onda de emisión particular a 610 nm en un espectrofotómetro Hitach. Se establece una línea base por 60 segundos antes de añadir la quimiocina prueba, o el anticuefo anti-Receptor acoplado a la proteína G (CCRd). Veinte microlitros de la quimiocina prueba (100 veces la concentración final) se añaden luego a la cubeta y los cambios en la concentración intracelular de calcio se monitorean utilizando el espectrofotómetro. Esta prueba puede ser utilizada, por ejemplo, si un anticuerpo anti-Receptor acoplado a proteína G (CCRd) es agonístico (induce movilización de calcio) o antagonístico (no induce movilización de calcio).

EJEMPLO 64 Ratón diabético y modelos de cicatrización deficiente de herida por glucocorticoide Modelo de ratón diabético db+/db+ Para demostrar que el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) acelera el proceso de cicatrización, se utiliza el modelo de cicatrización de herida de ratón genéticamente diabético. El modelo de cicatrización de herida de grosor total en el ratón db+/db+ es un modelo bien caracterizado, clínicamente relevante y reproducirle de cicatrización deteriorada de herida. La cicatrización de la herida diabética depende de la formación de tejido de granulación y de la re-epitelialización más que de la contracción (Gartner, M.H. et al., J. Surg. Res. 62: 389 (1992); Greenhalgh, D.G. et al., Am. J. Pathol. 136: 275 (1990)). Los animales diabéticos tienen muchas de las características clave observadas en la diabetes mellitus Tipo II. Los ratones homocigotos (db+/db+) son obesos en comparación con sus compañeros heterocigotos normales (db+/+m). Los ratones diabéticos mutantes (db+/db+) tienen una mutación recesiva autosomal particular en el cromosoma 4 (db+) (Coleman et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77: 283-293 (1982)). Los animales muestran polifagia, polidipsia y poliuria. Los ratones diabéticos mutantes (db+/db+) tienen elevados niveles de glucosa, niveles incrementados o normales de insulina, e inmunidad suprimida mediada por célula (Mandel et al., J. Immunol. 120: 1375 (1978); Debray-Sachs, M. et al., Clin. Exp. Immunol. 61 (1): 1-7 (1983); Leiter et al., Am. J. of Pathol. 114: 46-dd (1985)). La neuropatía periférica, complicaciones miocardiales, y lesiones microvasculares, engrosamiento de la membrana basal y anormalidades en la filtración glomerular se han descrito en estos animales (Norido, F. et al., Exp. Neurol. 83 (2): 221-232 (1984); Robertson et al., Diabetes 29 (1): 60-67 (1980); Giacomelli et al., Lab Invest. 40 (4): 460-473 (1979); Coleman, D.L., Diabetes 31 (suplemento): 1-6 (1982)). Estos ratones diabéticos homocigotos desarrollan hiperiipidemia que es resistente a análogos de insulina para la diabetes humana Tipo II (Mandel et al., J. Immunol. 120: 1375-1377 (1978)). Las características observadas en estos animales sugieren que la cicatrización en este modelo puede ser similar a la cicatrización observada en la diabetes humana (Greenhalgh, et al., Am. J. of Pathol. 136: 1235-1246 (1990)). Ratones C57BL/KsJ (db+/db+) hembras genéticamente diabéticos y ratones hembras heterocigotos no diabéticos (db+/+m) se utilizaron en este estudio (Jakson Laboratories). Los animales se obtuvieron a las 6 semanas de edad y tuvieron 8 semanas de edad al inicio del estudio. Los animales se alojaron individualmente y recibieron comida y agua ad libitum. Todas las manipulaciones se llevaron a cabo utilizando técnicas asépticas. Los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con las reglas y guías de Human Genome Sciences, Inc. Institutional Animal Care and Use Committee and the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animáis.

El protocolo de realización de la herida se llevó a cabo de conformidad con los métodos previamente reportados (Tsuboi, R. y Rifkin, D.B. J. Exp. Med. 172: 245-251 (1990)). Brevemente, al día de la realización de la herida, los animales se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de Avertin (0.01 mg/mL), de 2,2,2-tribromoetanol y 2-meti!-2-butanol disueltos en agua deionizada. La región dorsal del animal se rasuró y la piel se lavó con una solución de etanoi al 70% e yoduro. El área quirúrgica se secó con una gasa estéril antes de efectuar la herida. Una herida de 8 mm de grosor total se creó luego utilizando un punzón para tejido Keyes. Inmediatamente después de la realización de la herida, la piel de los alrededores se estiró suavemente para eliminar la expansión de la herida. Las heridas se dejaron abiertas por la duración del experimento. La aplicación del tratamiento se dio tópicamente por 5 días consecutivos comenzando el día de la realización de la herida. Antes del tratamiento, las heridas se limpiaron a suavemente con solución salina estéril y esponjas de gasa. Las heridas se examinaron visualmente y se fotografiaron a una distancia fija el día de la cirugía y a intervalo de dos días posteriormente. El cierre de la herida se determinó mediante mediciones diariamente a los días 1-d y al día 8. Las heridas se midieron horizontalmente y verticalmente utilizando un calibrador Jameson calibrado. Las heridas se consideraron cicatrizadas si el tejido de granulación ya no era visible y la herida estaba cubierta por un epitelio continuo.

El receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) se administra utilizando dosis con diferentes intervalos del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd), de 4 mg a 500 mg por herida por día por 8 días en un vehículo. Los grupos control con vehículo recibieron 50 mL de solución de vehículo. Los animales se sacrificaron al día 8 con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (300 mg/kg). Las heridas y la piel de los alrededores se colectaron luego para histología e ¡nmunohistoquímica. Los especímenes de tejidos se colocaron en formalina neutra en regulador de pH al 10% en cassettes de tejido entre esponjas de biopsia para procesamiento adicional. Tres grupos de 10 animales cada uno (d diabéticos y d controles no diabéticos) se evaluaron: 1) control con placebo de vehículo, 2) grupo no tratado; y 3) grupo tratado. El cierre de la herida se analizó mediante la medición del área en el eje vertical y horizonta y obteniendo el área cuadrada total de la herida. Luego se estimó la contracción mediante el establecimiento de diferencias entre el área inicial de la herida (día 0) y la de pos- tratamiento (día 8). El área de la herida al día 1 es de 64 mm2, el tamaño conespondlente del punzón dermal. Los cálculos se elaboraron utilizando la siguiente fórmula: [área abierta al día 8]-[área abierta al día 1]/[área abierta al día 1] Los especímenes se fijaron en formalina con regulador de pH al 10% y los bloques embebidos en parafina se seccionaron de manera pefendicular a la superficie de la herida (6 mm) y se cortaron utilizando un mícrotomo Reichert-Jung. La tinción rutinaria con hematoxilina-eosina (H&E) se llevó a cabo en las secciones transversales de heridas bisecadas. La examinación histológica de las heridas se utiliza para evaluar si el proceso de cicatrización y la apariencia morfológica de la piel en preparación se altera por el tratamiento con receptor de quimiocina de proteína G. Esta evaluación incluyó la verificación de la presencia de la acumulación celular, células inflamatorias, capilares, fibroblastos, re-epitelialización y madurez epidemial (Greenhalgh, et al., Am. J. of Pathol. 136: 1236-1246 (1990)). Una lente micrométrica calibrada se utilizó por un observador ciego. Las secciones de tejido también se tiñeron inmunohistoquímicamente con un anticuefo policlonal de conejo anti-queratina de humano utilizando un sistema de detección ABC Élite. La piel de humano se utilizó como un control positivo para tejido mientras que se utilizó IgG no inmune como un control negativo. El crecimiento de queratinocitos se determinó mediante la evaluación del grado de re-epitelialización de la herida utilizando una lente micrométrica calibrada. El antígeno nuclear/ciclina en célula en proliferación (PCNA) en especímenes de piel se demostró mediante el uso de anticuefo anti-PCNA (1: 60) con un sistema de detección ABC Élite. El cáncer de colon de humano puede servir como un tejido control positivo y el tejido de cerebro humano puede ser utilizado como un tejido control negativo. Cada espécimen incluye una sección con omisión del anticuerpo primario y substitución con IgG de ratón no inmune. La clasificación de estas acciones se basa en el grado de proliferación en una escala de 0-8, el lado inferior de la escala reflejando la poca proliferación con respecto a la proliferación intensa que refleja el lado superior. Los datos experimentales se analizaron utilizando una prueba de t no aparejada. Un valor p de < O.Od se considera significativo.

Modelo de rata con deficiencia esteroidal La inhibición de la cicatrización del herida por esteroides se ha documentado bien en varios sistemas in vitro e in vivo (Wahl, S:M: Glucocorticoids and Wound Healing. En: Anti-lnflamatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects. 280-302 (1989); Wahl, S. M. et al., J. Immunol. 116: 476-481 (1976); Werb, Z. et al., J. Exp. Med. 147: 1684-1694 (1978)). Los glucocorticoides retrasan la cicatrización de la herida por la inhibición de la angiogénesis, disminuyendo la permeabilidad vascular (Ebert, R.H., et al., An. Intern. Med. 37: 701-705 (1972)), proliferación de fibroblastos, y síntesis de colágena (Beck, L.S. et al., Growth Factors. 5: 296-304 (1991); Haynes, B. F. et al., J. Clin. Invest. 61 : 703-797 (1978)) y produciendo una reducción transitoria de los monocitos circulantes (Haynes, B. F. et al., J. Clin. Invest. 61 : 703-797 (1978); Wahl, S:M: Glucocorticoids and Wound healing. En: Anti-Inflamatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspeds. 280-302 (1989)). La administración sistémica de esteroides para la deficiencia en la cicatrización de heridas es un fenómeno bien establecido en las ratas (Beck, L.S. et al., Growth Factors. 5: 296-304 (1991); Haynes, B. F. et al., J. Clin. Invest. 61 : 703-797 (1978); Wahl, S:M: Glucocorticoids and Wound healing. En: Anti-Inflamatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspeds. Academic Press, New York, pp. 280-302 (1989); Pierce, G. F. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 2229-2233 (1989)). Para demostrar que el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) puede acelerar el proceso de cicatrización, se han evaluado los efectos de las múltiples aplicaciones tópicas del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) sobre el grosor total de las heridas de extirpación de piel en ratas en las cuales la cicatrización ha sido deteriorada por la administración sistémica de metilprednisolona. Ratas macho adultas jóvenes Sprague Dawley con peso de 250-300 g (Charles River Laboratories) se utilizaron en este ejemplo. Los animales se obtuvieron a las 8 semanas de edad y tuvieron 9 semanas de edad al inicio del estudio. La respuesta de cicatrización de las ratas está deteriorada por la administración sistémica de metilprednisolona (17 mg/kg/rata intramuscularmente) en el momento de la realización de la herida. Los animales se alojaron individualmente y recibieron comida y agua ad libitum. Todas las manipulaciones se llevaron a cabo utilizando técnicas asépticas. Este estudio se realizó de conformidad con las reglas y guías de Human Genome Sciences, Inc. Institutional Animal Care and Use Committee and the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animáis.

El protocolo de realización de la herida se siguió de conformidad con la sección A, anteriormente mencionada. Al día de la realización de la herida, los animales se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de cetamina (50 mg/kg) y xilazina (5 mg/kg). La región dorsal del animal se rasuró y la piel se lavó con soluciones de etanol al 70% e yoduro. El área quirúrgica se secó con una gasa estéril antes de efectuar la herida. Una herida de 8 mm de grosor total se creó luego utilizando un punzón para tejido Keyes. Las heridas se dejaron abiertas por la duración del experimento. Las aplicaciones de los materiales prueba se dieron tópicamente por 7 días consecutivos comenzando el día de la realización de la herida y subsecuente a la administración de metilprednidolona. Antes del tratamiento, las heridas se limpiaron a suavemente con solución salina estéril y esponjas de gasa. Las heridas se examinaron visualmente y se fotografiaron a una distancia fija el día de la cirugía y al término del tratamiento. El cie e de la herida se determinó mediante mediciones diariamente a los días 1-5 y al día 8. Las heridas se midieron horizontalmente y verticalmente utilizando un calibrador Jameson calibrado. Las heridas se consideraron cicatrizadas si el tejido de granulación ya no era visible y la herida estaba cubierta por un epitelio continuo. El receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) se administra utilizando dosis con diferentes intervalos del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd), de 4 mg a 600 mg por herida por día por 8 días en un vehículo. Los grupos control con vehículo recibieron 60 mL de solución de vehículo. Los animales se sacrificaron al día 8 con una inyección intraperitoneal de pentobarbltal sódico (300 mg/kg). Las heridas y la piel de los alrededores se colectaron luego para histología. Los especímenes de tejidos se colocaron en formalina neutra en regulador de pH al 10% en cassettes de tejido entre esponjas de biopsia para procesamiento adicional. Cuatro grupos de 10 animales cada uno (d con metilprednisolona y d sin glucocorticoide) se evaluaron: 1) grupo no tratado, 2) control con placebo de vehículo, 3) grupo tratado con receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). El cierre de la herida se analizó mediante la medición dei área en el eje vertical y horizonta y se obtuvo el área total de la herida. Luego se estimó el cierre mediante el establecimiento de diferencias entre el área inicial de la herida (día 0) y la del post-tratamiento (día 8). El área de la herida al día 1 es de 64 mm2, el tamaño correspondiente del punzón dermal. Los cálculos se elaboraron utilizando la siguiente fórmula: [área abierta al día 8]-[área abierta al día 1]/[área abierta al día 1] Los especímenes se fijaron en formalina con regulador de pH al 10% y los bloques embebidos en parafina se seccionaron de manera pefendicular a la superficie de ia herida (6 mm) y se cortaron utilizando un microtomo Olympus. La tinción rutinaria con hematoxilina-eosina (H&E) se llevó a cabo en las secciones transversales de heridas bisecadas. La examinación histológica de las heridas permite la evaluación de si el proceso de cicatrización y la apariencia morfológica de la piel reparada se mejora por el tratamiento con receptor de quimiocina de proteína G. Una lente micrométrica calibrada se utilizó por un observador ciego para determinar la distancia dei espacio de la herida. Los datos experimentales se analizaron utilizando una prueba t no aparejada. Un valor p de < 0.05 se considera significativo. Los estudios descritos en este ejemplo prueban la actividad en la proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). Sin embargo, un experto en la técnica podría modificar fácilmente los estudios ejemplificados para evaluar la actividad de los polinucleótidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) (por ejemplo, terapia génica), agonistas (incluyendo ligandos), y/o antagonistas del receptor de quimiocina de proteína G.

EJEMPLO 65 Evaluación del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) en modelo de ratón diabético El modelo de ratón diabético utilizado en el ejemplo 64 también puede utilizarse para determinar si el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) el sépticas para prevenir, tratar y/o mejorar la condición diabéticas per se. El receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) se administra a ratones db+/db+ parenteralmente por varios períodos de tiempo ya sea antes o después de que los ratones han desanollado diabetes, y niveles de glucosa sanguínea, y/o niveles de insulina, u otros métodos conocidos de la técnica para medir la severidad de la enfermedad, se miden para determinar si la administración previene, retrasa, o disminuye eliminación o severidad de la diabetes. Este ejemplo prueba actividad de la proteína del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). Sin embargo, un experto en la técnica podría modificar fácilmente los estudios ejemplificados para evaluar la actividad de los polinucleótidos del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) (por ejemplo, terapia génica), agonistas (incluyendo ligandos), y/o antagonistas del receptor de quimiocina de proteína G.

EJEMPLO 66 Evaluación del receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) en modelo de enfermedad de intestino inflamatorio y colitis El propósito de este estudio es determinar si el receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) es eficaz en modelo de colitis murina inducida por exposición ad libitum a sulfato de sodio dextrán en el agua para beber. Ratones Swiss Webster hembras de seis a ocho semanas de edad (20-26 g, Charles River, Raleigh, NC)) se utiliza en modelo de enfermedad de intestino inflamatorio inducida con una solución ai 4% de sulfato de sodio (DSS, PM 36,000-44,000, American International Chemistry, Natick, MA)) administrado ad libitum durante una semana. Los agonistas, antagonistas, preferiblemente anticuerpos de la presente invención, del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) serán mediante administración parenteral diaria (n = 10). Tres parámetros se utilizan para determinar la eficiencia: 1) evaluación clínica, basada en la evaluación de la evacuación; 2) evaluación histológica, basada en la evaluación del colon; y 3) cambio de peso. La evaluación clínica está comprendida de dos partes que totalizan una evaluación máxima de cuatro. La consistencia de la evacuación se graduó como: 0 = firme; 1 = suelta; 2 = dianea. La sangre en la evacuación también se evaluó en una escala de = a 2 con 0 = sin sangre; 1 = sangre oculta; y 2 = sangrado rectal abundante. Una media de la evaluación del grupo de aproximadamente 3 indica letalidad probable, y enfermedad la cual ha progresado más allá de su etapa tratable. Las evaluaciones clínicas se toman a los días = 0, 4, d, 6, y 7. Para llegar a una evaluación histológica, las secciones de colon ascendente, transverso y descendente se evaluaron de manera ciega basándose en la evaluación de inflamación (0-3) y la evaluación de cripta (0-4). El peso coforal se midió diariamente. Los datos expresan como media + SEM. Una prueba t de Student no aparejada se utiliza para determinar diferencias significativas en comparación con la enfermedad control (*p <0.0d; **p < 0.01 ; ***p < 0.001). Los resultados de este estudio pueden sugerir el papel del Receptor quimiocina de proteína G (CCRd) en IBD y colitis, incluyendo colitis ulcerativa. Por lo tanto, los agonistas, antagonistas, incluyendo anticuerpos de la presente invención, y fragmentos del receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) pueden ser utilizados para tratar, prevenir, o mejorar pacientes que tienen IBD, colitis, y/o colitis ulcerativa, o cualquier otra inflamación de intestino. Estará claro que la invención puede ponerse en práctica de otra manera que como se ha descrito particularmente en la descripción y ejemplos anteriores. Numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención son posibles a la luz de las enseñanzas anteriormente mencionadas y, por lo tanto, están dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. La descripción completa de cada documento citado (incluyendo patentes, solicitudes de patentes, artículo de revistas especializadas, abstracts, manuales de laboratorio, libros, u otras descripciones) en los antecedentes del invención, descripción detallada, y ejemplos se incoforan aquí en la presente invención como referencia. La descripción de la solicitud de E.U.A. No. 09/196, 662, presenta del 18 de noviembre de 1998, se incorporan la presente como referencia. Las descripciones de solicitudes provisionales de E.U.A. Nos. 60/181 , 268 presenta el 9 de febrero de 2000; 60/187, 999; y 60/234, 336 presentas el 22 de septiembre de 2000 se incoforan en la presente como referencia. La descripción de la publicación internacional WO 98/64317 se incorporan la presente como referencia. Además, el listado de secuencias de la patente de E.U.A. No. d, 707, 81 d se incoforan la presente como referencia.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> aunan Gßnomß Soiencßs, Inc. Roe en, Craig A. Rosch ß, Viktor Li, Yi Rubén, Steven, M. <120> Receptor de quimiocina de proteina G human (CCR5) HDGNR10 <130> 1488.115PC0D <150> EUA 60/181, 258 <151> 2000-02-09 <L50> EUA 60/187, 999 <151> 2000-03-09 <150> EUA 60/234, 336 <151> 2000-09-22 <160> 58 <170> Patentln versión 3.0 <210> 1 <211> 1414 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (259).. (1314) <400> 1 gtgagatgg gctttcatga attoooccaa caagagoaaa gotstcoatc tagtggacag 60 ggaagctagc agcaaacctt cccttcacta cgaaacttca ttgcttggcc caaaagagag 120 ttaattcaat gtagacatct atgtaggsaa ttaaaaacct attgatgtat aaaacagttt 180 gcattcatgg agggcaacta aatasattct aggactttat aaaagatcac tttttattta 240 tgcacagggt ggaacaag atg gat tat ca gtg tca agt cea ate tat gac 291 Mßt Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro lie Tyr Asp 1 5 10 at aat tat tat aca tcg gag ccc tgc cea aaa ate aat gtg aag caa 339 lie Aan Tyr Tyr Thr Ser Glu Pro Cys Pro Lys lie Asn Val Lys Gln 15 20 25 ate gca gec cgc ctc ctg cct ccg ctc tac tca ctg. gtg ttc ate ttt 387 He Ala .Ala Arg Leu Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe He Phß 30 35 40 ggt ttt gtg ggc aac atg ctg gtc ate ctc ato ctg ata aac tgc oaa 435 Gly Phe Val Gly .Asn Met Leu Val Zle Leu Zle Leu Zle Aßn Cys Gln 45 50 55 agg ctg gag age atg -act gao ate tac ctg ctc aac ctg goc ate tet 483 .Arg Leu Glu Ser Met Thr Asp Z ß Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Zle Ser 60 65 70 75 gac ctg ttt ttc ctt ctt act gtc eco ttc tgg gct cae tat gct gcc 531 Aap Leu Phe Phe Leu Leu Thr Val Pro Phe Trp Ala His Tyr Ala Ala 80 85 90 gcc cag tgg gac ttt gga aat aca atg tgt caa ctc ttg aca ggg ctc 579 Ala G n Trp A-sp Phe Gly Asn Thr Mßt Cys Gln Leu Leu Thr Gly Leu 95 100 105 tat ttt ata ggc ttc ttc tet gga ate ttc ttc ate ate ctc ctg aca 627 Tyr Phs Zle Gly Phe Phe Ser Gly Zle Phe Phe Zle Zle Leu Leu Thr 110 115 120 ate gat agg tac ctg gct ate gtc cat gct gtg ttt gct tta aaa gca 675 Zle Asp Arg Tyr Leu Ala Zle Val His Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala 125 130 135 agg acg gtc acc ttt ggg gtg gtg aca agt gtg ate act tgg gtg gtg 723 Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Val Thr Ser Val Zle Thr Trp Val Val 140 145 150 155 gct gtg ttt gcg tet ctc cea gga ate ate ttt acc aga tet caa aaa 771 Ala Val Phe Ala Ser Leu Pro Gly Zle Zle Phß Thr Arg Ser Gln Lys 160 165 170 gaa ggt ctt cat tac aoc tgc age tet cat ttt cea tac agt cag tat 819 Glu Gly Leu His Tyr Thr Cys Ser Ser His Phe Pro Tyr Ser Gln Tyr 175 180 185 caa ttc tgg aag aat ttc cag aca tta aag ata gtc ate ttg ggg ctg 867 Gla Phe Trp Lys Asn Phß Gln Thr Leu Lys lie Val Zlß Leu Gly Leu 190 195 200 gtc ctg ccg ctg ctt gtc atg gtc ate tgc tac tcg gga ato cta aaa 915 Val Leu Pro Leu Leu Val Mßt Val ?lß Cys Tyr Ser Gly lie Leu Lys 205 210 215 act ctg ctt cgg tgt cga aat gag aag aag agg cae agg gct gtg agg 963 Thr Leu Leu Arg Cys Árg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg Ala Val Arg 220 225 230 235 ctt ate ttc aec ate atg att gtt tat ttt ctc ttc tgg got ccc tac 1011 Leu lie Phß Thr Zlß Mßt Zlß Val Tyr Phe Leu Phe Trp Ala Pro Tyr 240 245 250 aac att gtc ctt ctc ctg aac acc ttc cag gaa ttc ttt ggc ctg aat 1059 Asn He Val Leu Leu Leu Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe Gly Leu Asn 255 260 265 aat tgc agt age tet aac agg ttg gac caa gct atg cag gtg aca gag 1107 Asn Cys Ser Ser Ser Aßn Arg Leu Asp Gln Ala Met Gln Val Thr Glu 270 275 280 act ctt ggg atg acg cae tgc tgc ate aac eco ate ate tat gcc ttt 1155 Thr Leu Gly Met Thr His Cys Cys Zlß Asn Pro Zle Zle Tyr Ala Phß 285 290 ' 295 gtc ggg gag aag ttc aga aac tac ctc tta gtc ttc ttc caa aag cae 1203 Val Gly Glu Lyß Phe Arg Asn Tyr Leu Leu Val Phß Phß Gln Lys His 300 305 310 315 att gcc aaa cgc ttc tgc aaa tgc tgt tet att ttc cag caa gag gct 1251 He Ala Lys Arg Phe Cys Lys Cys Cys Ser He Phe Gln Gln Glu Ala 320 325 330 ccc gag cga gca age tca gtt tac acc cga tec act ggg gag cag gaa 1299 Pro Glu Arg Ala Ser Ser Val Tyr Thr Arg Ser Thr Gly Glu Gln Glu 335 340 345 ata tet gtg ggc ttg tgacacggac tcaagtgggc tggtgaccca gtcagagttg 1354 Zle Ser Val Gly Leu 350 tgsacatggc ttagttttca tacacagcct gggctggggg tggggtggaa gaggtctttt 1414 <210> 2 <211> 352 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro lie Tyr Asp He Asn Tyr Tyr Thr 1 5 10 . 15 Ser Glu Pro Cys Pro Lys He Aan Val Lys Gln He Ala ?la ?rg Leu 20 25 30 Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe He Phe ßly Phe Val Gly ?sn 35 40 45 Mßt Leu Val He Leu Zle Leu Zlß Asn Cys Gln Arg Leu Glu Ser Met 50 55 60 Thr Asp Zle Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Zlß Ser Asp Leu Phß Phß Leu 65 70 75 80 Leu Thr Val Pro Phe Trp Ala His Tyr Ala Ala Ala Gln Trp Asp Phe 85 90 95 Gly Asn Thr Met Cys Gln Leu Leu Thr Gly Leu Tyr Phe Zlß Gly Phß 100 105 110 Phß Ser Gly He Phe Phe Zle Zle Leu Leu Thr He .Asp Arg Tyr Leu 115 120 125 Ala Zle Val Bis Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe 130 135 140 Gly Val Val Thr Ser Val He Thr Trp Val Val Ala Val Phß Ala Ser 145 150 155 160 - Leu Pro Gly He He Phe Thr Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu Hiß Tyr 165 • 170 175 Thr Cys Ser Ser His Phß Pro Tyr Ser Gln Tyr Gln Phß Trp Lys Asn 180 185 190 Phe Gln Thr Leu Lys Zle Val Zle Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu 195 200 205 Val Mßt Val Zle Cys Tyr Ser Gly He Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys 210 215 220 Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg Ala Val Arg Leu He Phe Thr He 225 230 235 240 Met He Val Tyr Phe Leu Phe Trp Ala Pro Tyr Asn He Val Leu Leu 245 250 • 255 Z«eu Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe Gly Leu ?sn Asn Cys Ser Ser Ser 260 265 270 Asn ?rg Leu ?sp Gln ?la Met Gln Val Thr Glu Thr Leu Gly Mßt Thr 275 280 285 His Cys Cys Zle Asn Pro Zle Xle Tyr Ala Phe Val Gly Glu Lys Phe 290 295 300 Arg Asn Tyr Leu Leu Val Phß Phß Gln lys Hiß He ?la Lyß ?rg Phß 305 310 315 320 Cys Lys Cys Cys Ser He Phe Gln Gln Glu Ala Pro Glu Arg Ala Ser 325 330 335 Ser Val Tyr Thr Arg Ser Thr Gly Glu Gln Glu He Ser Val Gly Leu 340 345 . 350 <210> 3 <211> 30 <212> ADN <213> Oligonucleótido <400> 3 cggaattcct ccatggatta tcaagtgtca 30 <210> 4 <211> 29 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 4 aggaagctta gtcacaagoc caaagatat 29 <210> 5 <21Í> 34 <212> ADN <213> Oligonucleótido <400> 5 gtccaagatt gßßacaatgg attatcaagt gtca 34 <210> 6 <211> 61 <212> ADN <213> Oligonucleótido <400> 6 ctagctcgag tcaagcgtag tctgggaegt cgtatgggta gcacaagccc acagatattt 60 61 <210> 7 <211> 30 <212> ADN <213> Oligonucleótido <400> 7 cgggatccct ccatggatta tcaagtgtca 30 <210> 8 <211> 29 <212> ADN <213> Oligonucleótido <400> 8 cgggatcccg ctcacaagcc cacagatat 29 <210> 9 <211> 344 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Glu Glu Val Thr Thr Phe Phe ?sp Tyr Asp Tyr Gly Ala Pro Cys His 1 5 10 15 Lys Phe ?sp Val Lys Gln He Gly ?la Gln Leu Leu Pro Pro Leu Tyr 20 25 30 Ser Leu Val Phe He Phe Gly Phe Val Gly Asn Met Leu Val Val Leu 35 40 45 He Leu He ?ßn Cys Lyß Lys Leu Lyß Cyß Leu Thr ?ßp He Tyr Leu 50 55 60 Leu ?ßn Leu ?la He Ser ?sp Leu Leu Phe Leu He Thr Leu Pro Leu 65 70 75 80 .Trp Ala His Ser Ala Ala Asn Glu Trp Val Phß Gly Asn Ala Mßt Cys 85 90 95 Lys Leu Phe Thr Gly Leu Tyr His He Gly Tyr Phe Gly Gly He Phß 100 105 110 Phß He Zlß Leu Leu Thr He .Asp Arg Tyr Leu Ala He Val His Ala 115 120 125 Val Phß Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phß Gly Val Val Thr Ser 130 135. 140 Val Zlß Thr Trp Leu Val Ala Val Phß Ala Ser Val Pro Gly Zlß Zlß 145 150 155 160 Phe Thr Lyß Cys Gln Lys Glu Asp Ser Val Tyr Val Cys Gly Pro Tyr 165 170 , 175 Phe Pro Arg Gly Trp Aßn Asn Phe His Thr He Met Arg Asn Zle Leu 180 185 190 Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu Zle Met Val Zle Cys Tyr Ser Gly He 195 200 205 !<*u Ly8 Thr Leu Leu Arg Cys Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg Ala 210 215 220 Val Arg Val He Phe Thr Zlß Mßt He Val Tyr Phß Leu Phß Trp Thr 225 230 235 240 Pro Tyr Aßn He Val Zlß Leu Leu Asn Thr Phß Sin Glu Phe Phe Gly 245 250 255 Leu Ser Asn Cys Glu Ser Thr Ser Gln Leu Asp Gln Ala Thr Gln Val 260 265 270 Thr Glu Tbx Leu Gly Mßt Thr His Cyß Cys ?lß Asn Pro Zlß Zlß Tyr 275 280 285 Ala Phe Val Gly Glu Lys Phe Arg Ser Leu Phe His Zle Ala Leu Gly 290 295 300 Cys Arg He Ala Pro Leu Gln Lys Pro Val Cys Gly Gly Pro Gly Val 305 310 315 320 ?rg Pro Gly Lyß Aßn Val Lyß Val Thr Thr Gln Gly Leu Leu .Asp Gly 325 330 335 Arg Gly Lys Gly Lys Ser He Gly 340 <210> 10 <211> 733 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 10 gggatccgga gcccaaatct tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg 60 aattcgággg tgcaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga 120 tctcccggac tcctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt aagccacgaa gaccctgagg 180 tcaagttcaa stggtaogtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg 240 aggagoagta caacagcacg taccgtgtgg tcagogtcct caccgtcctg caccaggact 300 ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca acccccatcg 360 agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc 420 catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct 480 atccaagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga 540 ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg 600 acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc 660 acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtstccggg taaatgagtg cgacggccgc 720 gactctagag gat 733 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Motivo de región proximal de membrana <220> <221> INCIERTO <222> (3).. (3) <223> Puede ser cualquier aminoácido <400> 11 Txp Ser Xaa Tzp áer 1 5 <210> 12 <211> 86 <212> ADN <213> Oligonucleótido <400> 12 gcgcctcgag atttccccga aatctagatt tccccgaaat gatttceccg aaatgatttc 60 cocgaaatat otgccatctc aattag 86 <210> 13 <211> 27 <212> ADN <213> Oligonucleótido <400> 13 gcggcaagct ttttgcaaag cctaggc 27 <210> 14 <211> 271 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 14 ctcgagattt ccccgaaatc tagatttccc cgaaatgatt tccccgaaat gatttccccg 60 aaatatctgc catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc ogoocatccc 120 gcccctaact ccgcccagtt ccgccoattc tccgocccat ggctgactaa ttttttttat 180 ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt 240 ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct t 271 <210> 15 <211> 32 <212> ADN <213> Oligonucleótido <400> 1.5 gcgctogagg gatgacagcg atagaacccc gg 32 <210> 16 <211> 31 <212> ADN <213> Oligonucleótido <400> 16 gcgaagcttc gsgactscec ggatecgcct c 31 <210> 17 <211> 12 <212> ADN <213> Iniciador <400> 17 ggggactttc cs 12 <210> 18 <211> 73 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 18 góggcctcga ggggactttc ccggggactt tccggggact ttccgggact ttccatcctg 60 ccatctcaat tag 73 <210> 19 <211> 27 <212> ADN <213> oligonucleótido <400 19 gcggcaagct ttttgcaaag cctaggc 27 <210> 20 <211> 256 <212> ADN <213> Hono sapiens <400> 20 ctcgagggga ctttcccggg gactttccgg ggactttocg ggactttcca tctgccatct 60 caattagtca gcaaecatag tcccgccact aactocgccc atcccgcccc taactocgcc 120 cagttccgcc cattctccge cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga 180 ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcetagg 240 cttttgcaaa aagctt 256 <210> 21 <211> 1056 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) .. (1056) <400> 21 atg gat tat caa gtg tca agt cea ate tat gac ate aat tat tat aca 48 Mßt Aap Tyr Gln Val Ser Ser Pro He Tyr Asp Zle Asn Tyr Tyr Thr 1 5 10 15 tcg gag cca tgc caa aaa ate aat gtg aag caa ate gca gcc cgc ctc 96 Ser Glu Pro Cys Gln Lys Zle Asn Val Lys Gln He Ala Ala Arg Leu 20 25 30 ctg cct ccg ctc tac tca ctg gtg' ttc ate ttt ggt ttt gtg ggc aac 144 Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe He Phß Gly Phe Val Gly Asn 35 40 45 atg ctg gtc ate ctc ate ctg ata aac tgc aaa agg ctg aag age atg 192 Met Leu Val He Leu He Leu Zle Asn Cys Lys Arg Leu Lys Ser Met 50 55 60 act gac ate tac ctg ctc aac ctg gßc ate tet gac ctg ttt tto ctt 240 Thr ?ap Zle Tyr Leu Leu ?sn Leu Ala He Ser Asp Leu Phe Phe Leu 65 70 75 80 ctt act gtc coc ttc tgg gct cae tat gct gco goc cag tgg gac ttt 288 Leu Thr Val Pro Phe Trp Ala Hiß Tyr Ala Ala ?la Gln Trp Aßp Phß 85 90 95 gga aat aca atg tgt caa oto ttg aca ggg cto tat ttt ata ggo ttc 336 Gly ?ßn Thr Mßt Cyß Gln Leu Leu Thr Gly Leu Tyr Phe He Gly Phe 100 105 110 ttc tet gga ate ttc ttc ate ato ctc ctg aca ate gat agg tac ctg 384 Phe Ser Gly He Phe Phe He He Leu Leu Thr He ?ßp ?rg Tyr Leu 115 120 125 gct gtc gtc cat gct gtg ttt gct tta aaa gcc agg acg gtc acc ttt 432 Ala Val Val His Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe 130 135 140 ggg gtg gtg aca agt gtg ate act tgg gtg gtg gct gtg ttt gcg tet 480 Gly Val Val Thr Ser Val He Thr Trp Val Val Ala Val Phe Ala Ser 145 150 155 160 ctc cea gga ate ate ttt acc aga tet caa aaa gaa ggt ctt cat tac 528 Leu Pro Gly Zlß Zlß Phß Thr Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr 165 170 175 acc tgc age tet cat ttt cea tac agt cag tat caa ttc tgg aag aat 576 Thr Cys Ser Ser His Phß Pro Tyr Ser Gln Tyr Gln Phß Trp Lys Aan 180 185 190 ttc cag aca tta aag ata gtc ate ttg ggg ctg gtc ctg ccg ctg ctt 624 Phf Gln Thr Leu Lys lie Val He Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu 195 200 205 gtc atg gtc ate tgc tac tcg gga ate cta aaa act ctg ctt cgg tgt 672 Val Mßt Val lie Cys Tyr Ser Gly Zlß Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys 210 215 220 ega aat gag aag aag agg cae agg gct gtg agg ctt ate ttc acc ate 720 Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg Ala Val Arg Leu Zle Phe Thr Zle 225 230 235 240 atg att gtt tat ttt stc ttc tgg gct coc tac aac att gtc ctt ctc 768 Mßt lie Val Tyr Phß Leu Phß Trp Ala Pro Tyr fi Zlß Val Leu Leu 245 250 255 ctg aac acc ttc cag gaa ttc ttt ggc ctg aat aat tgc agt age tet 816 Leu Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser Ser 260 265 270 aac agg ttg gac caa gct atg cag gtg aca gag act ctt ggg atg acg 864 Asn Arg Leu Asp Gln Ala Mßt Gln Val Thr Glu Thr Leu Gly Mßt Thr 275 280 285 cao tgc tgc ato aac ccc ate ate tat gcc ttt gtc ggg gag aag ttc 912 His Cys Cys Zlß Asn Pro Zlß Zlß Tyr Ala Phe Val Gly Glu Lyß Phß 290 295 300 aga aac tac ctc tta gtc ttc ttc caá aag cae att gcc aaa cgc tta 960 Arg .Asn Tyr Leu Leu Val Phe Pbe Glp Lys His He Ala Lys Arg Phe 305 310 315 320 tgc aaa tgc tgt tet att ttc cag caa gag gct eco gag aga gca age 1008 Cys Lys Cys Cys Ser He Phß Gln Gln Glu ?la Pro Glu ?rg ?la Ser 325 330 335 tca gtt tac acc cga tec act gag gag cag gaa ata tet gtg ggc ttg 1056 Ser Val Tyr Thr ?rg Ser Thr Glu Glu Gln Glu Xle Ser Val Gly Leu 340 345 350 <210> 22 <211> 352 <212> PRT <213> Ho o sapiens <400> 22 Mßt Asp Tyr Gln Val Sax Sar Pro Zlß Tyr Aap Zlß Asn Tyr Tyr Thr 1 5 10 15 Ser Glu Pro Cys Gln Lys He Asn Val Lys Gln Zlß Ala Ala Arg Leu 20 25 30 Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phß Zlß Phe Gly Phß Val Gly Aßn 35 40 45 Met Leu Val Zle Leu Xle Leu Zlß Asn Cys Lys Arg Leu Lys Ser Mßt 50 55 60 Thr Asp Zle Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Zle Ser Asp Leu Phe Phe Leu 65 70 75 80 Leu Thr Val Pro Phe Trp Ala His Tyr Ala Ala Ala Gln Trp Asp Phe 85 90 ' 95 Gly Asn Thr Met Cys Gln Leu Leu Thr Gly Leu Tyr Phe Zle Gly Phe 100 105 110 Phe Ser Gly He Phe Phe He He Leu Leu Thr He Asp Arg Tyr Leu 115 120 125 Ala Val Val His Ala Val Phe Ala Leu Lyß Ala Arg Thr Val Thr Phe 130 135 140 Gly Val Val Thr Ser Val He Thr Trp Val Val ?la Val Phß ?la Ser 145 150 155 160 Leu Pro Gly He He Phe Thr .?rg Sax Gln Lya Glu Gly Leu Hiß Tyr 165 - 170 175 Thr Cyß Sex Ser Hiß Phe Pro Tyr Ser Gln Tyr Gln Phe Trp Lyß ?ßn 180 185 190 Phe Gln Thr Leu Lyß He Val He Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu 195 200 205 Val Met Val Xle Cyß Tyr Ser ßly He Leu Lyß Thr Leu Leu ?rg Cyß 210 215 220 Arg Aßn Glu Lyß Lyß Arg Hiß Arg Ala Val Arg Leu He Phe Thr He 225 230 235 240 Mßt He Val Tyr Phe Leu Phe Trp Ala Pro Tyr Aßn He Val Leu Leu 245 250 255 Leu Asn Thr Phe Gln Glu Phß Phe Gly Leu Asn Aßn Cys Ser Ser Ser 260 265 270 Asn Arg Leu Asp Gln Ala Met Gln Val Thr Glu Thr Leu ßly Met Thr 275 280 285 His Cya Cyß He Aßn Pro He He Tyr Ala Phe Val Gly Glu Lys Phe 290 295 300 Arg Asn Tyr Leu Leu Val Phe Phe Gln Lys Hiß He Ala Lys Arg Phe 305 310 315 320 Cys Lys Cys Cys Ser He Phe Gln Gln Glu Ala Pro ßlu Arg Ala Ser 325 330 335 Ser Val Tyr Thr Arg Ser Thr Glu Glu Gln Glu Xle Ser Val Gly Leu 340 345 350 <210> 23 <211> 23 <212> ADN <213> Iniciador <400> 23 caggtgcagc tggtgcagtc tgg 23 <210> 24 <211> 23 <212> ADN <213> Iniciador <400> 24 caggtoaact taagggagtc tgg 23 <210> 25 <211> 23 <212> ADN <213> Iniciador <400> 25 gaggtgcage tggtggagte tgg 23 <210> 26 <211> 23 <212> ADN <213> Iniciador <400> 26 caggtgcagc tgcaggagtc ggg 23 <210> 27 <211> 23 <212> ADN <213> Iniciador <400> 27 gaggtgcagc tgttgcagtc tgc 23 <210> 28 <211> 23 <212> ADN <213> Iniciador <400> 28 caggtacagc tgcagcagtc agg 23 <210> 29 <211> 24 <212> ADN <213> Iniciador <4O0> 29 tgaggagacg gtgaccaggg tgcc 24 <210> 30 <211> 24 <212> ADN <213> Iniciador <400> 30 tgaagagacg gtgaccattg toce 24 <210> 31 <211> 24 <212> ADN <213> Xniciador <400> 31 tgaggagacg gtgaccaggg ttcc 24 <210> 32 <211> 24 <212> ADN <213> Xniaiador <400> 32 tgaggagacg gtgaccgtgg tcoo 24 <210> 33 <211> 23 <212> ADN <213> Iniciador <400> 33 gacatccaga tgacccagtc tec 23 <210> 34 61 <211> 23 <212> ADN <213> Zniciador <400> 34 gatgttgtga tgacteagtc toe 23 <210> 35 <211> 23 <212> ADN <213> Zniciador <400> 35 gatattgtga tgaotcagto tec 23 <210> 36 <211> 23 <212> ADN <213> Zniciador <400> 36 gaaattgtgt tgacgcagtc tec 23 <210> 37 <211> 23 <212> ADN <23> Zniciador <400> 37 gacatcgtga tgacocagto tec 23 <210> 38 <211> 23 <212> ADN <213> Zniciador <400> 38 gaaacgacac tcacgcagtc tec 23 <210> 39 <211> 23 <212> ADN <213> Zniciador <400> 39 gaaattgtgc tgactcagtc tec 23 <210> 40 <211> 23 <212> ADN <213> Zniciador <400> 40 cagtctgtgt tgacgcagcc gcc 23 <210> 41 <211> 23 <212> ADN <213> Zniciador <400> 41 cagtctgccc tgactcagcc tgc 23 <210> 42 <211> 23 <212> ADN <213> Zniciador <400> 42 tcetatgtgc tgactcagcc acc 23 <210> 43 <211> 23 <212> ADN <213> Zniciador <400> 43 tcttctgago tgacteagga eco 23 <210> 44 <211> 23 <212> ADN <213> Xniciador <400> 44 cacgttatac tgactcaacc gcc 23 <210> 45 <211> 23 <212> ADN <213> Iniciador <400> 45 caggctgtgc tcactoagcc gtc 23 <210> 46 <211> 23 <212> ADR <213> Zniciador <400> 46 aattttatgc tgactcagcc cea 23 <210> 47 <211> 24 <212> ADN <213> Zniciador <400> 47 acgtttgatt tccaccttgg tccc 24 <210> 48 <211> 24 <212> ADN <213> Iniciador <400> 48 asgtttgatc tccagettgg tccc 24 <210> 49 <211> 24 <212> ADN <213> Iniciador <400> 49 acgtttgata tcCactttgg teco 24 <210> 50 <211> 24 <212> ADN <213> Iniciador <400> 50 acgtttgatc tccaccttgg tccc 24 <210> 51 <211> 24 <212> ADN <213> Iniciador <400> 51 acgtttaatc tccagtcgtg tccc 24 <210> 52 <211> 23 <212> ADN <213> Iniciador <400> 52 cagtetgtgt tgacgcagcc gcc 23 <210> 53 <211> 23 <212> ADN <213> Iniciador <400> 53 cagtctgccc tgactcagcc tgc 23 <210> 54 <211> 23 <212> ADN <213> Iniciador <400> 54 tcstatgtgc tgactcagcc acc 23 <210> 55 <211> 23 <212> ADN <213> Iniciador <400> 55 tcttctgagc tgactcagga ccc 23 <210> 56 <211> 23 <212> ADN <213> Iniciador <400> 56 cacgttatac tgactcaacc gcc 23 <210> 57 <211> 23 <212> ADN <213> Iniciador <400> 57 caggctgtgc tcactcagcc gtc 23 <210> 58 <211> 23 <212> ADN <213> Iniciador <400> 58 aattttatgc tgactcagcc cea 23

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un polinucleótido aislado que codifica un primer anticuefo por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, o por lo menos 100% idéntico a un segundo anticuefo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.1 D8; (b) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.4D10; (c) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.4C4; (d) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.5H1 ; (e) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.1G8; (f) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.1 D8; (g) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.4D10; (h) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.4C4; (i) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.5H1 ; (j) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.1G8; (k) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.1D8; (I) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.4D10; (m) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.4C4; (n) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.5H1 ; (o) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.1G8; (p) por lo menos una región CDR de un dominio de VL del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.1 D8; (q) por lo menos una región CDR de un dominio de VL del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.4D10; (r) por lo menos una región CDR de un dominio de VL del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.4C4; (s) por lo menos una región CDR de un dominio de VL del antlcuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.6H1 ; (t) por lo menos una región CDR de un dominio de VL del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.1G8; (u) por lo menos una región CDR de un dominio de VL del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.1 D8; (v) por lo menos una región CDR de un dominio de VL del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.4D10; (w) por lo menos una región CDR de un dominio de VL del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.4C4; (x) por lo menos una región . CDR de un dominio de VL del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.5H1 ; (y) por lo menos una región CDR de un dominio de VL del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.1G8; (z) d por lo menos una región CDR de un dominio de VL del anticuefo expresado por la línea de células de hlbridoma XF11.1 D8; (aa) por io menos una región CDR de un dominio de VL del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.4D10; (ab) por lo menos una región CDR de un dominio de VL del anticuerpo expresado por ia línea de células de hibridoma XF11.4C4; 0 (ac) por lo menos una región CDR de un dominio de VL del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.5H1 ; (ad) por lo menos una región CDR de un dominio de VL del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.1 G8. 2.- El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación d 1 , caracterizado además porque dicho primer anticuefo es por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, o por lo menos 100% idéntico a un segundo anticuefo que comprende el dominio de VH del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma seleccionadas del grupo que consiste de: (a) XF11.1 D8; (b) 0 XF11.4D10; (c) XF11.4C4; (d) XF11.5H1; y (e) XF11.1G8. 3.- El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicho primer anticuefo es por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, o por lo menos 100% idéntico a un segundo anticuefo que comprende el dominio de VL del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma seleccionadas del grupo que consiste de: (a) XF11.1 D8; (b) XF11.4D10; (c) XF11.4C4; (d) XF11.5H1 ; y (e) XF11.1 G8. 4.- El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho primer anticuefo es por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, o por lo menos 100% idéntico a un segundo anticuefo que comprende el dominio de VH y el dominio constante del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma seleccionadas del grupo que consiste de: (a) XF11.1 D8; (b) XF11.4D10; (c) XF11.4C4; (d) XF11.5H1; y (e) XF11.1G8. 5.- El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho primer anticuerpo es por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, o por lo menos 100% idéntico a un segundo anticuefo que comprende el dominio de VL y el dominio constante del anticuefo expresado por la línea de células de hlbridoma seleccionadas del grupo que consiste de: (a) XF11.1 D8; (b) XF11.4D10; (c) XF11.4C4; (d) XF11.5H1 ; y (e) XF11.1G8. 6.- El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho primer anticuefo es por lo menos 96%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, o por lo menos 100% idéntico a un segundo anticuefo que comprende el dominio de VH y el dominio de VL del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma seleccionadas del grupo que consiste de: (a) XF11.1 D8; (b) XF11.4D10; (c) XF11.4C4; (d) XF11.dH1 ; y (e) XF11.1G8. 7.- El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho primer anticuerpo es por lo menos d 96%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, o por lo menos 100% idéntico a un segundo anticuefo que comprende el dominio de VH y el dominio constante y el dominio de VL y el dominio constante del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma seleccionadas del grupo que consiste de: (a) XF11.1 D8; (b) XF11.4D10; (c) 0 XF11.4C4; (d) XF11.5H1 ; y (e) XF11.1G8. 8.- El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho dominio constante es un dominio constante de IgG o un dominio constante de IgA. 9.- El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación d 5, caracterizado además porque dicho dominio constante es un dominio constante kappa o un dominio constante lambda. 10.- El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho primer anticuefo es un fragmento Fab, un fragmento Fab', un F(ab')2, un Fv, un Fv de una sola 0 cadena o un Fv ligado por disulfuro. 11.- El polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado además porque dicho primer anticuefo es un anticuefo monoclonal. 12.- El polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , caracterizado además porque dicho primer anticuerpo se une inmunoespecíficamente a una porción extracelular del polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) seleccionado del d grupo que consiste de: (a) región extracelular N-terminal; (b) bucle extracelular 1 ; (c) bucle extracelular 2; y (d) bucle extracelular 3. 13.- El polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado además porque dicho primer anticuerpo es un anticuerpo humano. 0 14.- El polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado además porque dicho primer anticuerpo es un anticuerpo humanizado. 1d.- El polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado además porque dicho polinucleótido d se fusiona a un polinucleótido heterólogo. 16.- Un vector que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15. 17.- Una célula hospedero que comprende el vector de la reivindicación 16. 0 18.- Una célula hospedero que comprende el polinucleótido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15. 19.- Un método para hacer un anticuerpo que consiste en: (a) expresar el anticuerpo codificado por el polinucleótido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.; y (b) recuperar dicho anticuerpo. 20.- El anticuerpo hecho por el método de la reivindicación 19. 21.- Un primer anticuerpo aislado es por lo menos 9d%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, o por lo menos 100% idéntico a un segundo anticuefo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.1 D8; (b) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.4D10; (c) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.4C4; (d) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.5H1 ; (e) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.1G8; (f) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.1 D8; (g) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.4D10; (h) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.4C4; (i) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.5H1 ; (j) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.1G8; (k) por lo menos una región CDR de un dominio de VH dei anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.1 D8; (I) por lo menos una región CDR de un dominio de VH d del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.4D10; (m) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.4C4; (n) por lo menos una región CDR de un dominio de VH del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.5H1 ; (o) por lo menos una región CDR de un dominio de VH 0 del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.1G8; (p) por lo menos una región CDR de un dominio de VL del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.1 D8; (q) por lo menos una región CDR de un dominio de VL del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.4D10; (r) por lo menos una región CDR de un dominio de VL d del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.4C4; (s) por lo menos una región CDR de un dominio de VL del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.5H1 ; (t) por lo menos una región CDR de un dominio de VL del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.1G8; (u) por lo menos una región CDR de un dominio de VL 0 del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.1D8; (v) por lo menos una región CDR de un dominio de VL del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.4D10; (w) por lo menos una región CDR de un dominio de VL del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.4C4; (x) por lo menos una región CDR de un dominio de VL del anticuefo expresado por ia línea de células de hibridoma XF11.5H1 ; (y) por lo menos una región CDR de un dominio de VL del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.1G8; (z) por lo menos una región CDR de un dominio de VL del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.1 D8; (aa) por lo menos una región CDR de un dominio de VL del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.4D10; (ab) por lo menos una región CDR de un dominio de VL del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.4C4; (ac) por lo menos una región CDR de un dominio de VL del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.5H1 ; (ad) por lo menos una región CDR de un dominio de VL del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma XF11.1G8. 22.- El primer anticuefo aislado de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicho primer anticuefo es por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, o por lo menos 100% idéntico a un segundo anticuefo que comprende el dominio de VH del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma seleccionadas del grupo que consiste de: (a) XF11.1 D8; (b) XF11.4D10; (c) XF11.4C4; (d) XF11.5H1 ; y (e) XF11.1G8. 23.- El primer anticuefo aislado de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicho primer anticuefo es por lo menos 9d%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, o por lo menos 100% idéntico a un segundo anticuerpo que comprende el dominio de VL del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma seleccionadas del grupo que consiste de: (a) XF11.1 D8; (b) XFH .4D10; (c) XF11.4C4; (d) XF11.dH1 ; y (e) XF11.1G8. d 24.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicho primer anticuefo es por lo menos 9d%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, o por lo menos 100% idéntico a un segundo anticuerpo que comprende el dominio de VH y el dominio constante dei anticuerpo 0 expresado por la línea de células de hlbridoma seleccionadas del grupo que consiste de: (a) XF11.1 D8; (b) XF11.4D10; (c) XF11.4C4; (d) XF11.5H1 ; y (e) XF11.1G8. 2d.- El primer anticuefo aislado de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicho primer anticuefo es d por lo menos 96%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, o por lo menos 100% idéntico a un segundo anticuefo que comprende el dominio de VL y el dominio constante del anticuefo expresado por la línea de células de hibridoma seleccionadas del grupo que consiste de: (a) XF11.1 D8; (b) XF11.4D10; (c) XF11.4C4; (d) XF11.5H1 ; y (e) 0 XF11.1G8. 26.- El primer anticuefo aislado de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicho primer anticuefo es por lo menos 9d%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, o por lo menos 100% idéntico a un segundo anticuerpo que comprende el dominio de VH y el dominio de VL del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma seleccionadas del grupo que consiste de: (a) XF11.1 D8; (b) XF11.4D10; (c) XF11.4C4; (d) XF11.dH1 ; y (e) XF11.1G8. 27.- El primer anticuefo aislado de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicho primer anticuerpo es por lo menos 9d%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, o por lo menos 100% idéntico a un segundo anticuerpo que comprende el dominio de VH y el dominio constante y el dominio de VL y el dominio constante del anticuerpo expresado por la línea de células de hibridoma seleccionadas del grupo que consiste de: (a) XF11.1 D8; (b) XF11.4D10; (c) XF11.4C4; (d) XF11.5H1 ; y (e) XF11.1G8. 28.- El primer anticuefo aislado de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicho dominio constante es un dominio constante de IgG o un dominio constante de IgA. 29.- El primer anticuefo aislado de conformidad con la reivindicación 2d, caracterizado además porque dicho dominio constante es un dominio constante kappa o un dominio constante lambda. 30.- El primer anticuefo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 29, caracterizado además porque el primer anticuefo se une inmunoespecíficamente a un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). 31.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 30, caracterizado además porque el primer anticuefo se une inmunoespecíficamente a una porción extracelular del polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) seleccionado del grupo que consiste de: (a) región extracelular N-terminal; (b) bucle extracelular 1 ; (c) bucle extracelular 2; y (d) bucle extracelular 3. 32.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 31 , caracterizado además porque el primer anticuerpo es un anticuefo monoclonal. 33.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 32, caracterizado además porque el primer anticuerpo es un fragmento Fab, un fragmento Fab', un F(ab')2, un Fv, un Fv de una sola cadena o un Fv ligado por disulfuro. 34.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 33, caracterizado además porque el primer anticuerpo tiene una constante de disosiación (KD) de por lo menos 10"7 M. 36.- El primer anticuefo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 33, caracterizado además porque el primer anticuefo tiene una constante de disosiación (KD) de por lo menos 10"8 M. 36.- El primer anticuefo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 33, caracterizado además porque el primer anticuefo tiene una constante de disosiación (KD) de por lo menos 10"9 M. 37.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 33, caracterizado además porque el primer anticuerpo tiene una constante de disosiación (KD) de por lo menos 10"10 M. 38.- El primer anticuefo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 33, caracterizado además porque el primer anticuerpo tiene una constante de disosiación (KD) de por lo menos 10"11 M. 39.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 33, caracterizado además porque el primer anticuefo tiene una constante de disosiación (KD) de por lo menos 10"12 M. 40.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 33, caracterizado además porque el primer anticuefo tiene una velocidad desactivada de por lo menos 10"3/seg. 41.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 33, caracterizado además porque el primer anticuefo tiene una velocidad desactivada de por lo menos 10^/seg. 42.- El primer anticuefo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 33, caracterizado además porque el primer anticuefo tiene una velocidad desactivada de por lo menos 10"5/seg. 43.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 33, caracterizado además porque el primer anticuefo tiene una velocidad desactivada de por lo menos lO^/seg. 44.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 33, caracterizado además porque el primer anticuefo tiene una velocidad desactivada de por lo menos 10"7/seg. 4d.- El primer anticuefo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 44, caracterizado además porque el primer anticuerpo es un agonista de un receptor de quimiocina de proteína G (CCR5). 46.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 44, caracterizado además porque el primer anticuerpo es un antagonista de un receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). 47.- El primer anticuefo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 44, caracterizado además porque el primer anticuerpo neutraliza al receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). 48.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 44, caracterizado además porque el primer anticuefo inhibe la capacidad de virus de VIH para unirse a células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). 49.- El primer anticuefo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 44, caracterizado además porque el primer anticuefo inhibe la capacidad de virus de VIH para infedar células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). 60.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 44, caracterizado además porque el primer anticuerpo inhibe la unión de RANTES a células que expresan receptor de y quimiocina de proteína G (CCRd). d 51.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 44, caracterizado además porque el primer anticuerpo inhibe la quimiotaxis inducida por RANTES a células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). 62.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera 0 de las reivindicaciones 20 a 44, caracterizado además porque el primer anticuerpo inhibe la unión de MCP-1 a células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). 53.- El primer anticuefo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 44, caracterizado además porque el primer d anticuefo inhibe la quimiotaxis inducida por MCP-1 a células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). 64.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 44, caracterizado además porque el primer anticuerpo inhibe la unión de MCP-2 a células que expresan receptor de 0 quimiocina de proteína G (CCRd). dd.- El primer anticuefo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 44, caracterizado además porque el primer 2 anticuefo inhibe la quimiotaxis inducida por MCP-2 a células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). 66.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 44, caracterizado además porque el primer anticuerpo inhibe la unión de MCP-3 a células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). 67.- El primer anticuefo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 44, caracterizado además porque el primer anticuefo inhibe la quimiotaxis inducida por MCP-3 a células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). 68.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 44, caracterizado además porque el primer anticuerpo inhibe la unión de Eotaxin a células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). 59.- El primer anticuefo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 44, caracterizado además porque el primer anticuefo inhibe la quimiotaxis inducida por Eotaxin a células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). 60.- El primer anticuefo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 44, caracterizado además porque el primer anticuefo inhibe la unión de MIP-1alfa a células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). 61.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 44, caracterizado además porque el primer anticuerpo inhibe la quimiotaxis inducida por MIP-1alfa a células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). 62.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 44, caracterizado además porque el primer anticuerpo inhibe la unión de MIP-1beta a células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). 63.- El primer anticuefo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 44, caracterizado además porque el primer anticuerpo inhibe la quimiotaxis inducida por MIP-1beta a células que expresan receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). 64.- El primer anticuefo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 44, caracterizado además porque el primer anticuefo regula descendentemente la expresión de receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). 65.- El primer anticuefo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 44, caracterizado además porque el primer anticuefo regula ascendentemente la expresión de receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). 66.- El primer anticuefo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 6d, caracterizado además porque el primer anticuefo es acoplado o conjugado a un marcador detectable. 67.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado además porque el marcador detectable es una enzima, primer anticuefo, un marcador luminiscente o un marcador bioluminiscente. 68.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 65, caracterizado además porque el primer anticuerpo es acoplado o conjugado a un marcador radiactivo. 69.- El primer anticuefo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 65, caracterizado además porque el primer anticuerpo es conjugado a un agente terapéutico. 70.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado además porque el agente terapéutico es un antimetabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citocina o un agente anti-angiogénico. 71.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado además porque el agente terapéutico es un agente anti-mitótico, una antraciciina, una toxina o un agente apoptótico. 72.- El primer anticuefo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 66, caracterizado además porque el primer anticuefo es conjugado a un agente citotóxico. 73.- Un anticuefo que se une al mismo epítope en un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) como el primer anticuefo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 6d. 74.- El primer anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 65, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. 75.- Una línea de células manipulada genéticamente para expresar el primer anticuefo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 65. 76.- El primer anticuerpo aislado expresado de la línea de células de la reivindicación 75. 77.- El uso del primer anticuefo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 74 ó 76, para la elaboración de un medicamento para tratar, prevenir o aliviar una enfermedad o trastorno en un animal. 78.- El uso como se reclama en la reivindicación 77, en donde el animal es un humano. 79.- El uso como se reclama en la reivindicación 77, en donde ia enfermedad o trastorno está asociado con inflamación. 80.- El uso como se reclama en la reivindicación 77, en donde la enfermedad o trastorno está asociado con quimiotaxis defectuosa o aberrante de células inmunes. 81.- El uso como se reclama en la reivindicación 77, en donde la enfermedad o trastorno está asociado con interacción de células que presentan antígenos de células T defectuosos o aberrantes. 82.- El uso como se reclama en la reivindicación 77, en donde la enfermedad o trastorno es una enfermedad infecciosa. 83.- El uso como se reclama en la reivindicación 77, en donde la enfermedad o trastorno es una enfermedad autoinmune. 84.- El uso como se reclama en la reivindicación 83, en donde la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide. 85.- El uso como se reclama en la reivindicación 77, en donde la enfermedad o trastorno es un trastorno degenerativo. 86.- El uso como se reclama en la reivindicación 77, en donde la enfermedad o trastorno es una infección viral. 87.- El uso como se reclama en la reivindicación 86, en donde la infección viral es infección por VIH. 88.- El uso como se reclama en la reivindicación 87, en donde la infección por VIH es una infección por VIH de etapa temprana. 89.- El uso como se reclama en la reivindicación 87, en donde la infección viral es una infección por citomegalovirus. 90.- El uso como se reclama en la reivindicación 87, en donde la infección viral es una infección por poxvirus. 91.- El uso como se reclama en la reivindicación 77, en donde la enfermedad o trastorno es una condición asociada con virus de VIH. 92.- El uso como se reclama en la reivindicación 91, en donde la condición asociada con infección por VIH es pneumonía por Pneumocystis carinii. 93.- El uso como se reclama en la reivindicación 91 , en donde la condición asociada con infección por VIH es sarcoma de Kaposi. 94.- El uso como se reclama en la reivindicación 77, en donde el primer anticuerpo aislado es administrable en combinación con un agente quimioterapéutico. 95.- El uso como se reclama en la reivindicación 77, en donde el primer anticuerpo aislado es administrable en combinación con terapia anti-retroviral. 96.- El uso como se reclama en la reivindicación 77, en donde el primer anticuefo aislado es administrable profilácticamente al animal. 97.- El uso como se reclama en la reivindicación 77, en donde la enfermedad o trastorno está asociado con expresión aberrante de receptor de quimiocina de proteína G (CCRd), carencia de función de receptor de quimiocina de proteína G (CCRd), expresión aberrante de ligando de receptor de quimiocina de proteína G (CCRd), o carencia de función de ligando de receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). 98.- Un método para detectar la expresión de un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCR5) que consiste en: (a) probar la expresión de un polipéptido de de receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) en una muestra biológica de un individuo usando el primer anticuefo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 74 ó 76; y (b) comparar el nivel de un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) con un nivel estándar de un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) (v.gr., el nivel en muestras biológicas normales. 99.- Un método para detectar, pronosticar o monitorear cánceres y otros trastornos hiperproliferativos que consiste en: (a) probar la expresión de un polipéptido de de receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) en una muestra biológica de un individuo usando el primer anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 74 ó 76; y (b) comparar el nivel de un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCRd) con un nivel estándar de un polipéptido de receptor de quimiocina de proteína G (CCRd). 100.- Un equipo que comprende el primer anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 74 ó 76. 101.- El equipo de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado además porque comprende un anticuefo de control. 102.- Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de por lo menos 95% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: (a) un fragmento de polinucleótido de SEQ ID NO:1 o un fragmento de polinucieótido que tiene la secuencia de ADNc incluida en el depósito de ATCC No: 97183; (b) un polinucleótido que codifica un fragmento de polipéptido de SEQ ID NO:2 o la secuencia de ADNc incluida en el depósito de ATCC No: 97183; (c) un polinucleótido que codifica un dominio de polipéptido de SEQ ID NO:2 o la secuencia de ADNc incluida en el depósito de ATCC No: 97183; (d) un polinucleótido que codifica un epítope de polipéptido de SEQ ID NO:2 o la secuencia de ADNc incluida en el depósito de ATCC No: 97183; (e) un polinucleótido que codifica un polipéptido de SEQ ID NO:2 o la secuencia de ADNc incluida en el depósito de ATCC No: 97183 que tiene actividad biológica; (f) un polinucleótido que es una variante de SEQ ID NO:1 ; (g) un polinucleótido que es una variante alélica de SEQ ID NO:1 ; (h) un polinucleótido que codifica una especie homologa de la SEQ ID NO:2; (I) un polinucleótido capaz de hibridar bajo condiciones astringentes a cualquiera de los polinucleótidos especificados en (a)-(h), en donde dicho polinucleótido no hibrida bajo condiciones astringentes a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido únicamente de residuos A o únicamente de residuos T.