MXPA02006266A

MXPA02006266A - Metodos para preparar formulaciones farmaceuticas..

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Publication number: MXPA02006266A
Application number: MXPA02006266A
Authority: MX
Inventors: Alison G Floyd
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 2000-12-13
Publication date: 2002-12-05
Also published as: WO2001045741A3; EP1239884A2; EP1239884B1; ES2284548T3; DK1239884T3; PT1239884E; ATE359092T1; DE60034366T2; AU2094501A; DE60034366D1; CA2394794A1; AU779889B2; WO2001045741A2; CA2394794C; JP2003518074A

Abstract

La invencion se refiere a formulaciones farmaceuticas y metodos para preparar formulaciones farmaceuticas de liberadores de histamina. La presente invencion proporciona metodos para determinar la concentracion del excipiente fisiologicamente aceptable para utilizarse en las formulaciones de la invencion. La presente invencion tambien proporciona metodos para suprimir la liberacion de histamina farmaceuticamente inducida administrando a un animal, las formulaciones de la presente invencion. Tambien se proporciona un equipo util para preparar formulaciones farmaceuticas de liberadores de histamina.

Description

MÉTODOS PARA PREPARAR FORMULACIONES FARMACÉUTICAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al uso de agentes farmacéuticamente activos conocidos por ocasionar una liberación de histamina cuando se administran intravenosamente a un animal. Más particularmente la invención se refiere a nuevos métodos para utilizar dichos agentes farmacéuticamente activos y nuevas formulaciones de dichos agentes, los cuales dirigen la liberación de histamina farmacéuticamente inducida. Los efectos cardiovasculares y respiratorios indicativos de grados indeseables de liberación de histamina, los cuales son específicos para algunos agentes farmacológicos convencionales, han sido problemáticos para los médicos durante décadas. Las observaciones clínicas asociadas con un grado indeseable de liberación de histamina se tipifican a través de enrojecimiento cutáneo alrededor de la cara, cuello y/o pecho, algunas veces acompañado por hipotensión y/o taquicardia y/o nausea y vómito. En algunos casos, las manifestaciones físicas de un grado indeseablemente alto de liberación de histamina pueden incluir reacciones muy serias y potencialmente fatales tales como broncoespasmos, respiración asmática y reacciones anafilactoides y choque anafiláctico. Una explicación de la razón(es) que esto agentes farmacológicos causen liberación de histamina in vivo ha .......- .i.._-j-a_-.í . ,. .. ...J^?**»-.. - * ** ? eludido a los científicos durante años. Los agentes farmacológicos convencionales que se sabe que ocasionan o tienen sospecha de ser capaces de ocasionar liberación de histamina incluyen hipnóticos intravenosamente administrados, analgésicos, optiatios, anestésicos, agentes bloqueadores neuromusculares, (es decir, "bloqueadores neuromusculares"), agentes de contraste empleados en formación de imágenes (es decir, medios de contraste radiográficos, agentes radioformadores de imágenes y otros agentes de contraste, de aquí en adelante denominados colectivamente "agentes formadores de imágenes"), hormonas para procedimientos de diagnóstico, y ciertos antibióticos, NSAIDs, anticoagulantes, inhibidores de ACE y antagonistas del receptor de benzodiazepima. Estos agentes pueden ser administrados intravenosamente como un bolo o una infusión rápida, los cuales pueden, además de su efecto terapéutico deseado, diagnosticar o tener un efecto medicinal, y pueden ocasionar la liberación de histamina. La liberación de histamina por lo general es la reacción adversa más importante de ciertos de estos agentes farmacológicos. La liberación de histamina puede ocurrir a través de mecanismos inmunológicos como no inmunológicos. Las reacciones más inmediatas producidas por estos agentes farmacológicos se cree que ocurren a través de la liberación de histamina mediante un mecanismo no inmunológico. Estos últimos por lo general son denominados como reacciones anafilactoides. .-j .A?? t El mecanismo preciso a través del cual estos fármacos pueden ocasionar la liberación de histamina no es claro. Las células cebadas y basófilos son posibles fuentes de la histamina liberada, pero también pueden existir otras fuentes in vivo. Los estudios de mecanismo, especialmente estudios conducidos in vitro con células cebadas son complicados por la tremenda heterogeneidad que existe no solamente entre las especies, sino que dentro de un solo individuo. Dado el número de diferentes fuentes de histamina, es posible que diferentes mecanismos en diferentes células y tejidos puedan estar involucrados en cualquier momento dado. Clínicamente, se sabe que al disminuir la velocidad de inyección de estos agentes de 5 segundos a 30 segundos, se reduce la incidencia de efectos cardiovasculares típicos de la liberación de histamina. La reducción de la velocidad de administración actualmente es el método preferido para evitar los riesgos asociados con liberación de histamina substancial. Sin embargo, la reducción de la velocidad de administración no es un curso aceptable de acción en algunas situaciones clínicas. Por ejemplo, la reducción de la velocidad de administración es inaceptable en situaciones médicas de emergencia, especialmente cuando la anestesia y la intubación, antes de procedimientos quirúrgicos de emergencia, deben ocurrir rápidamente. Además, se sabe que la reducción de la administración de ciertos agentes farmacológicos puede reducir desproporcionalmente la velocidad de inicio de actividad y/o la potencia del fármaco.

De esta manera, existe la necesidad de una técnica de métodos para dirigir el efecto lateral de liberación de histamina asociado con estos agentes farmacológicos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una gráfica de la tensión de superficie (mN/m) contra la concentración en incremento de (Z)-2-cloro-1-{3-{(1 R,2S)-6,7-dimetoxi-2-metil-1-[(3,4,5,-trimetoxifenil)metil)-1 ,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinilinio}propil}-4-{3-[(1S,2R)-6,7-dimetoxi-2-metil-1-(3,4,5-trimetoxifenil)-1 ,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinilinio]propil}-2-butanodioato diclorhidrato (designado como "Compuesto 1"). (mg/ml). La Figura 2 es una gráfica representando (- -) la velocidad de relajación de NMR de protón T, su valor en segundos) para soluciones conteniendo 80 mM (Z)-2-cloro-1-{3-{(1 R,2S)-6,7-dimetoxi-2-metil-1-[(3,4,5,-trimetoxifenil)metil)-1,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinilinio}propil}-4-{3-[(1S,2R)-6,7-dimetoxi-2-metil-1-(3,4,5-trimetoxifenil)-1 ,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinilinio]propil}-2-butanodioato diclorhidrato (designado como "Compuesto 1"), y varias concentraciones de d4 citrato (3.15, 6.25, 1.25, 25 y 50 mM) en una solución salina deuterizada a pD 3, y (-•-) la liberación de histamina farmacéuticamente inducida a partir de células de leucemia basofílicas de rata como un porcentaje del valor de control, el cual s inducido a través de la exposición de las células RBL a una formulación conteniendo 160 mM del mismo compuesto, y varias concentraciones de ácido cítrico (5, 10, 25 y 50 mM) en agua destilada a un pH de 3. 5 COMPENDIO DE LA INVENCIÓN De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para preparar una formulación farmacéutica conteniendo un liberador de histamina y un excipiente 10 fisiológicamente aceptable. El método comprende combinar una cantidad terapéuticamente efectiva del liberador de histamina con una concentración del excipiente fisiológicamente aceptable. La concentración del excipiente fisiológicamente aceptable, cuando se combina en una solución acuosa con el liberador de histamina a la, 15 o por arriba de la concentración de micela crítica, es suficiente para reducir la agregación del liberador de histamina en la solución acuosa aproximadamente por lo menos en un 25% comparado con la agregación del liberador de histamina en la solución acuosa conteniendo substancialmente nada de excipiente fisiológicamente 20 aceptable. De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona otro método para preparar una formulación farmacéutica conteniendo un liberador de histamina y un excipiente fisiológicamente aceptable. El método comprende combinar una 25 cantidad terapéuticamente efectiva del liberador de histamina con el &-»- _--g,«»¡---a, . - - .t i t fcjj i . -j-j- i-l-j,-. excipiente fisiológicamente aceptable. El excipiente fisiológicamente aceptable está presente en una concentración determinada por un método que comprende los pasos de: a) medir la agregación del liberador de histamina en una solución de referencia consistiendo esencialmente de liberador de histamina en una concentración a o por arriba de la concentración de micela crítica en una solución acuosa; b) medir la agregación de liberador de histamina en una solución comparativa consistiendo esencialmente del liberador de histamina y una concentración preseleccionada del excipiente fisiológicamente aceptable en la solución acuosa, en donde la concentración del liberador de histamina en la solución comparativa es substancialmente la misma como la concentración del liberador de histamina en la solución de referencia; c) opcionalmente repetir el paso b) una o más veces con una solución comparativa teniendo una concentración preseleccionada diferente del excipiente fisiológicamente aceptable; d) identificar una concentración de excipiente fisiológicamente aceptable que sea suficiente para reducir la agregación de liberador de histamina en una solución comparativa aproximadamente por lo menos en un 25% comparado con la agregación de liberador de histamina en la solución de referencia. La concentración identificada del paso d) es la concentración del excipiente fisiológicamente aceptable para combinarse con el liberador de histamina para preparar la formulación farmacéutica. De acuerdo con un tercer aspecto, se proporciona otro método .... ,-. AÍA AL ? JL ¡ para preparar una formulación farmacéutica conteniendo un liberador de histamina y un excipiente fisiológicamente aceptable. El método comprende combinar una cantidad terapéuticamente efectiva del liberador de histamina con una concentración de excipiente fisiológicamente aceptable. La concentración del excipiente fisiológicamente aceptable es determinada a través de un método que comprende los pasos de: a) medir la liberación de histamina a partir de una muestra biológica que contenga histamina en una mezcla de referencia consistiendo esencialmente de: i) la muestra biológica que contiene histamina en un medio y ii) una solución acuosa del liberador de histamina a una concentración suficiente para ocasionar la liberación de histamina a partir de la muestra biológica que contiene histamina; b) medir la liberación de histamina a partir de la muestra biológica que contiene histamina en una mezcla comparativa que consiste esencialmente de: i) la muestra biológica que contiene histamina en un medio y ii) una solución del liberador de histamina y una concentración preseleccionada del excipiente fisiológicamente aceptable, en donde el liberador de histamina de la mezcla comparativa está presente en una concentración que es substancialmente igual a la concentración del liberador de histamina en la mezcla de referencia del paso a); c) opcionalmente repetir el paso b) una o más veces con una mezcla comparativa teniendo una concentración preseleccionada diferente del excipiente fisiológicamente aceptable; y d) identificar una concentración del excipiente fisiológicamente aceptable suficiente para reducir la liberación de histamina a partir de la muestra biológica que contiene histamina en la mezcla comparativa aproximadamente por lo menos en un 10% comparado con la liberación de histamina de la muestra biológica que contiene histamina de la mezcla de referencia. La concentración identificada del paso d) es la concentración del excipiente fisiológicamente aceptable para combinarse con el liberador de histamina para preparar la formulación farmacéutica. De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos para determinar una concentración de un excipiente fisiológicamente aceptable para combinarse con el liberador de histamina para preparar la formulación farmacéutica. Estos métodos son como se describieron anteriormente con relación a métodos para preparar las formulaciones farmacéuticas de la presente invención. De acuerdo con un quinto aspecto de la presente invención, se proporciona un método para determinar una concentración de un excipiente fisiológicamente aceptable que sea suficiente para suprimir el liberador de histamina farmacéuticamente inducida en un animal que se está tratando con un liberador de histamina. El método comprende: a) medir la agregación del liberador de histamina en una solución de referencia consistiendo esencialmente de liberador de histamina en una concentración a, o por arriba de la concentración de micela crítica en una solución acuosa; b) medir la agregación de liberador de histamina en una solución comparativa consistiendo esencialmente del liberador de histamina y una concentración preseleccionada del excipiente fisiológicamente aceptable en la sol ución acuosa , en donde la concentración del liberador de histamina en la sol ución comparativa es substancialmente la misma a la concentración del liberador de histamina en la solución de referencia ; c) opcionalmente repetir el paso b) una o más veces con una solución comparativa teniendo una concentración preseleccionada d iferente del excipiente fisiológicamente aceptable; d) identificar una concentración de excipiente fisiológicamente aceptable q ue sea suficiente para reducir la agregación de liberador de histamina en una solución comparativa aproximadamente por lo menos en un 25% comparado con la agregación de liberador de h istamina en la solución de referencia . La concentración identificada del paso d) es la concentración del excipiente fisiológ icamente aceptable que es suficiente para su prim ir el liberador de histamina farmacéuticamente inducida en un ani mal q ue se está tratando con un liberador de histamina. El método anterior también puede ser empleado para determinar una concentración de u n excipiente fisiológicamente aceptable, el cual cuando se combina con una solución acuosa con e liberador de histamina a o por arriba de la concentración de micela crítica, es suficiente para reducir la agregación del liberador de h istamina en la solución acuosa aproxi madamente por lo menos en un 25% comparado con la ag regación de li berador de histamina en una solución acuosa conteniendo su bstancialmente nada de , . . , . .! excipiente fisiológicamente aceptable. De acuerdo con un sexto aspecto de la presente invención, se proporciona otro método para determinar una concentración de un excipiente fisiológicamente aceptable que es suficiente para suprimir la liberación histamina farmacéuticamente inducida en un animal que se está tratando con un liberador de histamina. El método comprende: a) medir la liberación de histamina a partir de una muestra biológica que contenga histamina en una mezcla de referencia consistiendo esencialmente de: i) la muestra biológica que contiene histamina en un medio y ii) una solución acuosa del liberador de histamina a una concentración suficiente para ocasionar la liberación de histamina a partir de la muestra biológica que contiene histamina; b) medir la liberación de histamina a partir de la muestra biológica que contiene histamina en una mezcla comparativa que consiste esencialmente de: i) la muestra biológica que contiene histamina en un medio y ii) una solución acuosa del liberador de histamina y una concentración preseleccionada del excipiente fisiológicamente aceptable, en donde el liberador de histamina en mezcla comparativa está presente en una concentración que es substancialmente igual a la concentración del liberador de histamina en la mezcla de referencia del paso a); c) opcionalmente repetir el paso b) una o más veces con una mezcla comparativa teniendo una concentración preseleccionada diferente del excipiente fisiológicamente aceptable; y d) identificar una concentración del excipiente fisiológicamente aceptable suficiente - - . yy-i . ii .Ll para reducir la liberación de histamina a partir de la muestra biológica que contiene histamina en la mezcla comparativa en aproximadamente por lo menos en un 10% comparado con la liberación de histamina de la muestra biológica que contiene histamina en la mezcla de referencia. La concentración identificada del paso d) es la concentración del excipiente fisiológicamente que es suficiente para suprimir la liberación de histamina farmacéuticamente inducida en un animal que está siendo tratado con un liberador de histamina. Esta concentración de excipiente ventajosamente es empleada para la preparación de formulaciones farmacéuticas del liberador de histamina. El método anterior también puede ser empleado para determinar la concentración de un excipiente fisiológicamente aceptable, el cual cuando se combina con una solución salina con el liberador de histamina a o por arriba de la concentración de micela crítica, es suficiente para reducir la agregación de liberador de histamina en la solución salina por lo menos aproximadamente en un 25% comparado con la agregación del liberador de histamina es una solución salina que contiene substancialmente nada de excipiente fisiológicamente aceptable. De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden un liberador de histamina y una concentración de excipiente fisiológicamente aceptable. Las formulaciones farmacéuticas pueden ser preparadas de acuerdo con cualquiera de los métodos de la presente invención. La concentración de excipiente fisiológicamente Ü aceptable puede ser determinada de acuerdo con cualquiera de los métodos de la presente invención. La presente invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende un liberador de histamina y un excipiente fisiológicamente aceptable, en donde la concentración del excipiente fisiológicamente aceptable es suficiente para suprimir el liberador de histamina farmacéuticamente inducida. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporcionar un método para suprimir el liberador de histamina farmacéuticamente inducida en un animal que se está tratando con un liberador de histamina. El método comprende administrar al animal una formulación farmacéutica de acuerdo con la presente invención. En otro aspecto, la presente invención proporcionar el uso de una formulación farmacéutica de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para suprimir la liberación de histamina farmacéuticamente inducida en un animal que se está tratando con un liberador de histamina. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método para prevenir efectos cardiovasculares y respiratorios mediados por la liberación de histamina farmacéuticamente inducida en un mamífero que se está tratando con un liberador de histamina. El método comprende administrar al animal una formulación farmacéutica de acuerdo con la presente invención. En otro aspecto, la presente proporciona el uso de una formulación farmacéutica de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para prevenir efectos cardiovasculares y respiratorios mediados por el liberador de histamina farmacéuticamente inducida en un animal que se está tratando con un liberador de histamina. En otro aspecto más, la presente invención proporciona un equipo para preparar una formulación farmacéutica de un liberador de histamina. El equipo comprende: a) un excipiente fisiológicamente aceptable, y b) instrucciones para preparar la formulación farmacéutica de acuerdo con los métodos de la presente invención. Un liberador de histamina preferido para utilizarse en las formulaciones farmacéuticas y métodos de tratamiento de la presente invención es (Z)-2-Cloro-1-{3-{(1 R,2S)-6,7-dimetoxi-2-meti 1-1 -[(3,4, 5,-trimetoxifenil)metil)- 1,2,3, 4-tetrahidro-2-isoquinilinio}propil}-4-{3-[(1S,2R)-6,7-dimetoxi-2-metil-1-(3,4,5-trimetoxifenil)-1 ,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinilinio]propil}-2-butanodioato diclorhidrato y sales farmacéuticamente aceptables del mismo. De esta manera, en otro aspecto, la presente invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de (Z)-2-Cloro-1-{3-{(1 R,2S)-6,7-d i metoxi -2-met i 1-1 -[(3,4, 5, -tri metoxif enil ) met i I)- 1,2,3, 4-tetrahidro-2-isoquinilinio}propil}-4-{3-[(1S,2R)-6,7-dimetoxi-2-metil-1-(3,4,5-trimetoxifenil)-1 ,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinilin¡o]propil}-2-butanodioato diclorhidrato y sus sales farmacéuticamente . . i -ázá, --Jt .....ítAttk tfciJLi aceptables; un excipiente seleccionado del grupo que consiste de glicina, en una concentración de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, ácido cítrico en una concentración de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM, EDTA en una concentración de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 0.5%, cloruro de calcio en una concentración de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM, y combinaciones de los mismos; y un diluyente fisiológicamente aceptable, en donde dicha formulación farmacéutica es adecuada para administración intravenosa. La presente invención también proporciona métodos para suprimir la liberador de histamina farmacéuticamente inducida en un animal que se está tratando con (Z)-2-Cloro-1-{3-{(1 R,2S)-6,7-dimetoxi-2-metil-1-[(3,4,5,-trimetoxifenil)metil)-1,2,3,4-tetrahidro-2-isoq u ini lin io}propil}-4-{3-[(1 S, 2 R)-6, 7-di me toxi -2-me ti 1-1 -(3,4,5-trime toxifenil )-1 , 2,3, 4-tetra hid ro-2-isoquinilinio]propil}-2-butanodioato diclorhidrato o sus sales farmacéuticamente aceptables. Estos y otros aspectos de la presente invención se describen más adelante en la descripción detallada de la invención, la cual sigue, y en las reivindicaciones.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I. Definiciones "Agente farmacéutico" como se utiliza en la presente, debe i-t. i. i i referirse a agentes que tienen actividad terapéutica (es decir, agentes administrados a un animal, preferiblemente un ser humano, para el tratamiento o prevención de una condición médica), agentes que tienen actividad de diagnóstico (es decir, agentes administrados a un animal, preferiblemente un ser humano, para ayudar o auxiliar en el diagnóstico de una condición médica), y agentes que tienen otra utilidad médica (es decir, agentes administrados para facilitar procedimientos médicos y/o quirúrgicos) cuando se administran a un animal, preferiblemente un ser humano (por ejemplo, bloqueadores neuromusculares, anestésicos, analgésicos y similares). "Liberador de histamina" como se utiliza en la presente, se refiere a un agente farmacéutico que se selecciona del grupo que consiste de anestésicos, opiatos, bloqueadores neuromusculares, agentes formadores de imágenes, hormonas para procedimientos de diagnóstico, antibióticos tricíclicos de glicopéptido, antibióticos de cefalosporina, penicilina y antibióticos derivados de penicilina, agentes anti-inflamatorios no esteroidales intravenosamente administrados (INSAIDs), anticoagulantes, inhibidores de ACE y antagonistas del receptor de benzodiazepina, los cuales cuando se administran intravenosamente como un bolo rápido o infusión rápida a un animal, ocasionan la elevación de concentraciones de histamina por arriba de los niveles fisiológicos normales en el plasma y/o tejido. Los liberadores de histamina se caracterizan por una estructura que tiene una o más porciones cargadas hidrofílicas (catiónicas o aniónicas) separadas de una o más porciones m. u _ .».-.. hidrofóbicas. Más particularmente, los "liberadores de histamína" incluyen agentes farmacéuticos que cuando se administran intravenosamente como un bolo rápido o una rápida infusión a un animal, ocasionan una liberación de histamina in vivo que es suficiente para producir manifestaciones fisiológicas seleccionadas del grupo que consiste de enrojecimiento cutáneo, comezón, urticaria, edema, nausea, vómito, secreción elevada de ácido gástrico, efectos vestibulares, efectos cardiovasculares tales como hipotensión (caída en la presión sanguínea), taquicardia (que surge en el ritmo cardiaco), y efectos respiratorios tales como broncoconstricción, reacciones anafilactoides, y choque anafiláctico, y combinaciones de cualquiera de dos o más de los anteriores. "Niveles normales fisiológicos de histamina" pueden diferir entre especies y entre miembros individuales de una sola especie, por lo tanto, los "niveles normales fisiológicos de histamina" se refiere a un nivel de histamina promedio en el plasma de un animal no tratado de la misma especie como aquel que se está tratando con el liberador de histamina. Los niveles normales fisiológicos de histamina de varias especies de animales se reportan en Inflamation: Basic Principies And Clinical Correlates (Eds. J. I. Gallin, I. M. Gaoldstein, y R. Snyderman, Capítulo 11, Measurement of Histamine, p. 202, Raven Press, New York, 1992; y Bertini, S y otros, Gen. Pharmac. 31:625-631 (1998). Como se utiliza en la presente, el término "cantidad terapéuticamente efectiva de un liberador de histamina" representa una cantidad del agente farmacéutico que es un liberador de histamina (definido anteriormente), dicha cantidad es suficiente para obtener la actividad farmacéutica deseada (la actividad terapéutica, actividad de diagnóstico o utilidad medicinal) del agente. De esta manera, en la modalidad en donde el liberador de histamina es un bloqueador neuromuscular, una "cantidad terapéuticamente efectiva del liberador de histamina" es la cantidad del neurobloqueador muscular que es suficiente para ocasionar la relajación del músculo esquelético en el animal, en donde se va a administrar el neurobloqueador muscular. En la modalidad en donde el liberador de histamina es un anestésico, una "cantidad terapéuticamente efectiva del liberador de histamina" es la cantidad de anestésico que es suficiente para inducir anestesia en el animal en donde se va a administrar el anestésico. En la modalidad en donde el liberador de histamina es un agente formador de imágenes, una "cantidad terapéuticamente efectiva del liberador de histamina" es la cantidad del agente formador de imagen que es suficiente para producir un nivel apropiado de contraste en la imagen en un procedimiento de diagnóstico en el animal al cual el agente formador de imagen va a ser administrado. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente la cantidad terapéuticamente efectiva de un liberador de histamina particular basándose en la explicación y ejemplos anteriores, y el conocimiento convencional en la técnica con respecto a estos agentes farmacéuticos. El término "excipiente fisiológicamente aceptable" significa un agente, distinto al agua, que se utiliza en la formulación de un agente farmacéutico como una formulación farmacéutica, que no es dañino al animal al cual se administrará la formulación, y que no afecta substancialmente la actividad farmacéutica del agente farmacéutico con el que se formula. Típicamente los excipientes fisiológicamente aceptables se emplean con el propósito de facilitar la formulación del agente farmacéuticamente activo. El término "solución acuosa" como se utilizan en la presente, se refiere a soluciones que contiene agua (incluyendo agua deuterizada), preferiblemente agua destilada, y "soluciones salinas" (definidas más adelante), y dichas soluciones contienen substancialmente ningún otro aditivo, pero pueden ser ajustadas en el pH con ácido clorhídrico o hidróxido de sodio, según sea necesario o deseable para estabilizar o facilitar la solubilización de ciertos liberadores de histamina en solución acuosa. El término "solución salina" como se utilizan en la presente, se refiere a soluciones que contienen aproximadamente 0.9% de cloruro de sodio solubilizado en agua (incluyendo agua deuterizada), preferiblemente agua destilada, y dichas soluciones contienen substancialmente ningún otro aditivo, pero pueden ser ajustadas en el pH con ácido clorhídrico o hidróxido de sodio, según sea necesario o deseable para estabilizar o facilitar la solubilización de ciertos liberadores de histamina en solución salina. El término "agregación" como se utilizan en la presente, se refiere al tamaño agregado promedio de un agente farmacéutico, ?*A.t?..< solubilizado en solución acuosa. El tamaño de agregado puede ser una función de la conformación de las moléculas o agregados, o el número de moléculas que forman el agregado, o el radio hidrodinámico del agregado.

II. Liberación de Histamina General Aunque la razón(es) de que estos liberadores de histamina inducen la liberación de histamina a eludido a los científicos durante años, nuestros estudios sugieren que la liberación de histamina es el resultado de una combinación de por lo menos, 2, factores posiblemente relacionados; principalmente la concentración del liberador de histamina y ciertas propiedades estructurales de los liberadores de histamina que pueden ocasionar la agregación del liberador de histamina en solución y en la sangre después de administración intravenosa a un animal. Ahora se cree que la liberación de histamina puede estar relacionada con la concentración inicial de bolo del liberador de histamina, y que los eventos críticos que conducen a la liberación de histamina se presentan muy rápidamente después de la inyección. La disminución de la velocidad de inyección efectivamente reduce la concentración de liberador de histamina, ya que los liberadores de histamina intravenosamente inyectados son diluidos por el flujo de sangre que pasa por el sitio de inyección mientras el agente se está inyectando. Al estudiar las propiedades de tensión de superficie de los liberadores de histamina, se ha encontrado que ciertos liberadores de histamina tienden a autoasociarse, o agregarse en solución acuosa. Ahora se cree que esta agregación del liberador de histamina activa el liberador de histamina. Se han identificado propiedades estructurales compartidas por los varios liberadores de histamina, las cuales pueden ocasionar agregación. Los liberadores de histamina denominados en la presente invención todos comparten las características estructurales comunes de una o más porciones hidrofílicas separadas de una o más porciones hidrofóbicas. Por ejemplo, los bloqueadores neuromusculares son sales de amonio bis-cuaternario que poseen dos cargas catiónicas en los extremos de la molécula, separados por un enlazador hidrofóbico, lipofílico. En el caso de bloqueadores neuromusculares no esteroidales (por ejemplo, del tipo bencil isoquinolina) el enlazador hidrofóbico típicamente es largo y flexible. En el caso de bloqueadores neuromusculares esteroidales, el enlazador hidrofóbico puede ser voluminoso y/o rígido. Debido a esta característica estructural los liberadores de histamina son solubles tanto en agua como solventes orgánicos. Las características solubles y de solubilidad de los liberadores de histamina son similares a las de los agentes tensioactivos y detergentes. Los agentes tensioactivos y detergentes son conocidos por agregarse en solución en una concentración dependiente de la forma. La presencia de una porción hidrofílica cargada separada de una porción hidrofóbica de la molécula puede imponer en el - ?mmn-n i , ti -nit a <é,»¿ , -t- liberador de histamina, una tendencia a autosolvatarse o agregarse en solución tal como detergente o agente tensioactivo, explicando así la observación de estas propiedades modificadoras de tensión de superficie de los liberadores de histamina. 5 Los estudios indican que los liberadores de histamina pueden agregarse en solución. Las posibles disposiciones de los agregados en solución incluyen, pero no se limitan a, dímeros, trímeros, mícelas, barras, placas y láminas. En general, los liberadores de histamina tienden a agregarse en disposiciones que buscan aislar la 10 porción(es) hidrofóbica de la molécula de la solución acuosa en donde se disuelve. Esto puede lograrse, por ejemplo, formando micelas en donde la porción hidrofóbica de la molécula del liberador de histamina es orientada hacia el centro de la micela y la porción hidrofílica cargada de la molécula es orientada hacia fuera del 15 centro de la micela. Por ejemplo, las moléculas de un bloqueador neuromuscular pueden flexionarse en la región de la porción hidrofóbica permitiendo que múltiples moléculas se agreguen colocando la porción hidrofóbica de cada molécula cerca de las porciones hidrofóbicas de otras moléculas, mientras se extiende la 20 porción hidrofílica catiónica hacia fuera. Esta disposición agregada de moléculas de bloqueador neuromuscular da como resultado la agregación con superficies poli-catiónicas extendiéndose hacia fuera del centro del agregado. Se ha encontrado que el grado de agregación depende de la concentración, de manera que, 25 concentraciones más altas de liberador de histamina dan como -~r*?¿??imMá?t _t t,A?.?.Í ._-_ t.t._ -Í?ZZ -_-4_- -—a. „____t~ .-a-*-* i-M-.*.» resultado más agregación y/o agregados de orden más alto (por ejemplo, micelas según comparado con dímeros). Muchos agentes farmacéuticos, incluyendo la mayoría de los bloqueadores neuromusculares, son administrados intravenosamente a concentraciones en la escala de milimolares (mM); una escala de concentración en donde probablemente el fármaco es parcialmente agregado y puede estar cerca de su concentración de micela crítica. La "concentración de micela crítica", es la concentración a la cual las moléculas, en un ambiente dado, se agregan para formar micelas. La concentración de micela crítica de un agente dado puede medirse utilizando técnicas descritas en la presente, así como otras técnicas convencionales, incluyendo aquellas descritas por Anacker, E. W. (1970), Micelle formation of cationic surfactants in aqueous media, Cationic Surfactants, E. Jurgermann, New York, Marcel Dekker, Inc.; Attwood, D (1995), Advances in Colloid and Interface Science 55:271-303; y Mukerjee, P. y K.J. Mysels (1971), Critical micelle concentrations in aqueous surfactant systems, Washington, D. C. U.S. Dept. of Commerce, las descripciones de las cuales se incorporan aquí por referencia. Como es conocido por aquellos expertos en la técnica, la concentración de micela crítica es dependiente de un número de factores. Ver, Attwood, D. y A. T. Florence (1983), Surfactant Systems; Their Chemistry, Pharmacy, And Biology, Londres, Chapman y Hall; Rosen, M. J. (1978), Surfactants and interfacial phenomena, New York, Wiley-lnterscience; Jungermann, E., Ed. -"*-'-•• - '"-"^ (1970), Cationic Surfactants, New York, Marcel Dekker, Inc.; y Jonsson, B., B. Lindman y otros (1998), Surfactants And Polymers In Aqueous Solution, Chichester, Jonh Wiley & Sons (las descripciones de las cuales se incorporan aquí por referencia), para una discusión 5 de los factores que pueden efectuar la concentración de micela crítica. Uno de estos factores es la naturaleza de la solución o suspensión en donde se forman los agregados. Por ejemplo, los datos obtenidos para (Z)-2-Cloro-1-{3-{(1 R,2S)-6,7-dimetoxi-2-metil- 1-[(3,4,5,-trimetoxifenil)metil)-1,2,3,4-tetrahidro-2- 10 isoquinilinio}propil}-4-{3-[(1S,2R)-6,7-dimetoxi-2-metil-1-(3,4,5- trimetoxifenil)-1 ,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinilinio]propil}-2- butanodioato diclorhidrato un bloqueador neuromuscular de acción ultracorta en agua es consistente con una concentración de micela crítica a aproximadamente 15 mg/ml (alrededor de 14 mM), mientras 15 que en salina, los datos obtenidos para este fármaco son consistentes con una concentración de micela crítica de entre 40 y 80 mM. La concentración de bloqueadores neuromusculares utilizados clínicamente, varía típicamente alrededor de 1 a aproximadamente 55 mM. 20 La agregación del liberador de histamina y la concentración de micela crítica altamente dependen de muchos factores. Un factor es la estructura de la molécula del liberador de histamina particular, incluyendo la presencia y la estructura de uno o más dominio s hidrofóbicos separados de uno o más dominios hidrofílicos que por 25 lo general contienen grupos catiónicos o aniónicos. Además, la agregación y concentración de micela crítica altamente dependen de la concentración del liberador de histamina en solución, la presencia y la concentración de otras moléculas en solución, el pH, la identidad y la valencia del contraión para cualquiera de los grupos catiónicos o aniónicos y de la temperatura y la presión de la solución. Después de la inyección de los liberadores de histamina a la sangre, la nueva solución resultante, (es decir, la solución del liberador de histamina en la sangre) se cree que cambia muchos de los factores listados anteriormente, en forma muy rápida. Dadas las condiciones de solución que cambian muy rápidamente, tales como la composición iónica de la sangre en la presencia de muchos otros solutos disueltos, células, proteínas, etc., es razonable esperar que estas condiciones pudieran favorecer la agregación incrementada y/o una concentración de micela crítica más baja. En general, es muy probable que estos liberadores de histamina ya estén altamente agregados en la formulación que se está administrando y que la acción física de mezclarse con la sangre en la vena después de la inyección puede favorecer la agregación incrementada y/o la formación de micelas. Ahora se cree que las moléculas de liberador de histamina agregadas inducen la liberación de histamina a partir de células, tejidos, y fluidos esencialmente de la misma forma como las moléculas agregadas de los agentes tensioactivos. Las moléculas agregadas de agentes tensioactivos pueden ocasionar una acción i. L * - *t ¿..i. jfcJL -t detergente que puede solubilizar las moléculas orgánicas en agua, extraer proteínas de membranas y hacer que las membranas de célula se vuelvan permeables. El incremento de la permeabilidad de la membrana hace más fácil que las moléculas entren a la célula y para las moléculas en la célula, tales como moléculas de histamina, sean liberadas, Ahora se ha observado que los liberadores de histamina tienden a agregarse. Estos agregados pueden exhibir propiedades similares al detergente. Por consiguiente, se cree que las propiedades del tipo detergente del liberador de histamina agregado pueden ocasionar que las membranas de célula se alteren, posiblemente al punto que las células se rompan. La alteración de membranas celulares de células que contienen histamina, o en tejidos o fluidos y/o la ruptura de estas células pueden ocasionar la liberación de componentes intracelulares y moléculas hacia el ambiente circundante. Se sabe que los agentes tensioactivos y detergentes ocasionan liberación de histamina rompiendo la membrana de células cebadas, las cuales se sabe que almacenan y liberan histamina. Otros tipos de célula pueden comportarse en forma similar. Por ejemplo, también se sabe que los basófilos presentes en la sangre almacenan y liberan histamina y se pueden esperar que se comporten en formar similar a las células cebadas cuando se exponen a un agente tensioactivo o liberador de histamina agregado. Aún los agregados de orden más bajo (es decir, dímeros y trímeros) pueden ocasionar la liberación de histamina que puede o no estar relacionada con efectos de tipo detergente. Ver, Read, G. W. y J. f. Lenney, Journal of Medicinal Chemistry 15(3): p. 320-23 (1972). Por ejemplo, ya que los agentes bis-catiónicos tales como bloqueadores neuromusculares, llevan dos grupos de amonio por molécula, actualmente se espera que los efectos de liberación de histamina pueden ser esperados cuando se agregan tan poco como 2-4 moléculas de bloqueador neuromuscular. Además de este mecanismo directo para explicar la liberación de histamina, también es posible que la liberación de histamina pueda ser causada por mecanismo indirectos. Las células que no almacenan histamina, tales como células endoteliales que cubren vasos sanguíneos pueden ocasionar la liberación de histamina a través de un mecanismo indirecto. Los agregadotes de los liberadores de histamina pueden ocasionar la liberación de componentes celulares a partir de células endoteliales (u otras células que no almacenan histamina)y sus componentes pueden viajar hacia células que contiene histamina y dar señal a la liberación de histamina a partir de esas células de almacenamiento. lll. Métodos para hacer formulaciones La presente invención proporciona varios métodos para hacer formulaciones farmacéuticas que contienen un liberador de histamina y un excipiente fisiológicamente aceptable, los cuales buscan dirigir las tendencias anteriormente mencionadas de los -S A tl J libradores de histamina para agregarse y ocasionar la liberación de niveles indeseables de histamina después de la administración in vivo.

A. Liberadores de Histamina En particular, los liberadores de histamina se denominan en la presente invención y son empleados en los métodos para hacer formulaciones farmacéuticas e incluyen anestésicos, opiatos, bloqueadores neuromusculares, agentes formadores de imágenes, hormonas para procedimientos de diagnósticos, antibióticos tricíclicos de glicopéptido, antibióticos de cefalosporina, penicilina y antibióticos derivados de penicilina, agentes anti-inflamatorios no esteroidales intravenosamente administrados (INSAIDs), anticoagulantes, inhibidores de ACE y antagonistas del receptor de benzodiazepina, los cuales tiene las características estructurales observadas anteriormente en la definición del "liberador de histamina". Preferiblemente, el liberador de histamina se selecciona del grupo que consiste de anestésicos, opiatos, bloqueadores neuromusculares y agentes formadores de imágenes. Muy preferiblemente el liberador de histamina es un bloqueador neuromuscular. Ejemplos de anestésicos incluyen, pero no se limitan a, tiopental y tiobutabarbital. Ejemplos de opiatos incluyen pero no se limitan a morfina, derivados de morfolínicos tales como oximorfona, clorhidrato de nalbufina, buprenorfina, hidromorfona, fentanil y ZlAliz.A, -_--t,Íl-L.l,,Í-t derivados de fentaníl incluyendo remifentanil, sufentanil y alfentanil. Ejemplos de bloqueadores neuromusculares incluyen pero no se limitan a agentes bloqueador neuromuscular no esteroidales tales como (Z)-2-C loro- 1 -{3-{(1 R,2S)-6, 7-di metoxi-2-meti 1-1 -[(3,4,5, -trimetoxifenil)metil)-1 ,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinilinio}propil}-4-{3- [(1S,2R)-6,7-dimetoxi-2-metil-1-(3,4,5-trimetoxifenil)-1,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinilinio]propil}-2-butanodioato di clorhidrato (algunas veces denominado de aquí en adelante "compuesto 1" para brevedad), mivacurio, atracurio, d-tubocurarina, metocurina, doxacuriom y galamina; agentes bloqueadores neuromusculares esteroidales tales como vecuronio, pancuronio, rocuronio, y rapacuronio; y otros bloqueadores neuromusculares tales como succinilcolina. Ejemplos de agentes formadores de imágenes incluyen pero no se limitan a, ácido ioxáglico (ioxaglato) y diatrizoato de sodio. Las sales farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores también se contemplan en la presente invención. De esta manera, la presente invención contempla el uso de besilato de atracurio, cloruro de mivacurio, bromuro vecuronio, bromuro de pancuronio, bromuro de rapacuronio, cloruro de doxacurio, cloruro de succinilcolina, sulfato de morfina, clorhidrato de hidromorfona, sales farmacéuticamente aceptables del Compuesto 1, y similares. Las combinaciones de cualquiera de dos o más de los liberadores de histamina anteriormente mencionados en una sola formulación también se contemplan, siempre que dos o más . é _ n .1 - . liberadores de histamina no reaccionen en una forma que impacte en forma dañina su actividad terapéutica. Los liberadores de histamina preferidos para utilizarse en ra presente invención incluyen morfina, Compuesto 1, mivacurio, atracurio, vecuronio, pancuronio, rocuronio, rapacuronio y cloruro de succinilcolina y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. El compuesto 1 y las formulaciones farmacéuticas y métodos de tratamiento que utilizan este compuesto se describen en las publicaciones de PCT Nos. 98/42674 y 98/42675, ambas publicadas el 1 de octubre de 1998, por Glaxo Wellcome Inc. y Cornell Research Foundation, la materia objeto de la cual se incorpora aquí por referencia en su totalidad. En una modalidad preferida, el liberador de histamina es el compuesto 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una modalidad preferida, el liberador de histamina es mivacurio o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una modalidad preferida, el liberador de histamina es atracurio o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, por ejemplo, besilato de atracurio.

B. Excipientes fisiológicamente aceptables De acuerdo con los métodos de la presente invención, el liberador de histamina se combina con un excipiente fisiológicamente aceptable, el cual puede ser un excipiente fisiológicamente aceptable individual o una combinación de 2, 3 o -.-.-* JJ-iá--t-J»--»----.-- ... », -y...»,. ~- fgr,-ff*' '-k-^fc más excipientes fisiológicamente aceptables. "Excipiente" como se utilizan en la presente, se refiere tanto a un excipiente fisiológicamente aceptable individual como a una combinación de 2, 3 o más excipientes fisiológicamente aceptables. 5 Los excipientes preferidos son aquellos que se emplean convencionalmente en formulaciones parenterales o inyectables aprobadas. Los excipientes empleados en la presente invención se caracterizan físicamente por la presencia de cargas (por ejemplo, excipientes iónicos) y/o la presencia de residuos orgánicos, los 10 cuales son capaces de efectuar la solvatación del liberador de histamina. Más particularmente, los excipientes son capaces de ionizar en solución y/o pueden estar solvatando el liberador de histamina o ayudando en la solvatación del liberador de histamina. Los excipientes adecuados para utilizarse en la presente 15 invención pueden ser seleccionados a partir de una variedad de categorías, incluyendo, pero no limitándose a sales inorgánicas divalentes, (es decir, sales inorgánicas que tienen anión divalente, un catión divalente o ambos), ácidos carboxílicos, orgánicos, ácido fosfórico, aminoácidos, agentes quelatadores, albúminas y 20 combinaciones de los mismos. Los excipientes preferidos se seleccionan del grupo que consiste de sales inorgánicas divalentes, ácidos carboxílicos inorgánicos, ácido fosfórico, aminoácidos, agentes quelatadores, albúminas y sus combinaciones. En una modalidad, el excipiente es una sal inorgánica divalente. En una 25 modalidad, el excipiente es un ácido orgánico. En una modalidad, el excipiente es un agente quelatador. En una modalidad, el excipiente es un aminoácido. Ejemplos de sales inorgánicas divalentes adecuadas incluyen pero no se limitan a cloruro de calcio, sulfato de magnesio, cloruro de magnesio, sulfato de sodio y sus combinaciones. El cloruro de calcio es un excipiente preferido para utilizarse en la presente invención. Ejemplos de ácidos carboxílicos orgánicos adecuados incluyen, pero no se limitan a ácido tartárico (el cual incluye ácido tartárico racémico, ácido D-tartárico, y ácido L-tartárico), ácido maleico, ácido acético, ácido cítrico, ácido succínico, ácido glucurónico y sus combinaciones. El "ácido cítrico" como se utilizan en la presente se refiere al ácido cítrico y cualesquiera hidratos y sales del mismo, es decir, citratos. El ácido cítrico es un excipiente preferido para utilizarse en la presente invención. El término "ácido fosfórico" como se utilizan en la presente, también incluye sales de ácido fosfórico tales como fosfato de sodio. Como será fácilmente evidente para algún experto en la técnica, el uso de ácido fosfórico como un excipiente en la presente invención requerirá que sea proporcionado en una concentración que sea fisiológicamente aceptable. Ejemplos de aminoácidos adecuados incluyen, pero no se limitan a, glicina, licina, arginina y sus combinaciones. La glicina es un excipiente preferido para utilizarse en la presente invención. Ejemplos de agentes quelatadores adecuados incluyen, pero jÜ... ÍA... -l.---4--ü A.Í.A ~z?* -AA no se limitan a, ácido etilenodiamino tetracético (EDTA), sales de EDTA (incluyendo EDTA-disódico y EDTA-calcio-disódico) y combinaciones de los mismos. El "EDTA" como se utiliza en la presente debe referirse a EDTA y cualesquiera de sus sales. El EDTA es un excipiente preferido para utilizarse en la presente invención. Ejemplos de albúminas adecuadas incluyen albúmina de suero de bovino, albúmina de suero humano y sus combinaciones. Un experto en la técnica apreciará que se pueden emplear excipientes adicionales los cuales exhiben sus características físicas observadas anteriormente y que son capaces de reducir la agregación del liberador de histamina en solución acuosa y/o suprimir de otra manera la liberador de histamina farmacéuticamente inducida. Estos otros recipientes pueden ser terminados utilizando las técnicas descritas más adelante con respecto a la determinación de concentraciones apropiadas de excipiente para utilizarse en la presente invención, y, por lo tanto, se contemplan por la presente invención. El excipiente puede ser una combinación de cualquiera de dos, tres o más excipientes todos seleccionados de una de las categorías anteriores o una combinación de cualquiera de dos, tres o más excipientes seleccionados de dos o más categorías anteriores. Por ejemplo, el excipiente puede ser una combinación de una sal inorgánica divalente y un ácido carboxílico orgánico. En otra modalidad, el excipiente puede ser un ácido carboxílico orgánico y i,-.. A ,- .H..Ü.-.---1-Í-- - tl--l.. .. ~*a?*&mi.*y atíli.t un agente quelatador. En otra modalidad, el excipiente puede ser una combinación de una sal inorgánica divalente y un agente quelatador. En otra modalidad, el excipiente puede ser una combinación de una sal inorgánica divalente, un ácido carboxílico inorgánico y agente quelatador. En otra modalidad más, el excipiente puede ser una combinación de sal inorgánica divalente y un aminoácido. El único requerimiento para utilizar combinaciones de excipientes en los métodos y formulaciones de la presente invención es que los excipientes seleccionados no interactúen uno con el otro en una forma que sea dañina en su habilidad para funcionar con los métodos y formulaciones de la presente invención. Otras combinaciones de dos o más excipientes fisiológicamente aceptables serán fácilmente evidentes para aquellos expertos en la técnica basándose en los ejemplos anteriores y se contemplan en la presente invención. Las técnicas descritas más adelante para la determinación de concentraciones apropiadas de excipiente son igualmente aplicables para la aplicación de varias otras combinaciones de dos, tres o más excipientes que puedan ser empleados en la presente invención. En una modalidad preferida, el excipiente es una combinación de cualquiera de dos o más (es decir, 2, 3 hasta 4) excipientes seleccionados del grupo que consiste de glicina, EDTA, ácido cítrico y cloruro de calcio. En una modalidad preferida el excipiente es una combinación de ácido cítrico y EDTA. En una modalidad preferida el i ... -á -i J. _i . * -*«-»-*-.* excipiente es una combinación de ácido cítrico y cloruro de calcio. En una modalidad preferida el excipiente es una combinación de glicina y EDTA. En una modalidad preferida el excipiente es una combinación de glicina y ácido cítrico. En una modalidad preferida el excipiente es una combinación de ácido cítrico, glicina y cloruro de calcio.

C. Métodos para determinar una concentración adecuada de excipiente 10 De acuerdo con los métodos de la presente invención, las formulaciones farmacéuticas se preparan combinando una cantidad terapéuticamente efectiva del liberador de histamina con una concentración del excipiente fisiológicamente aceptable. Los excipientes preferidos para utilizarse en estos métodos de la 15 presente invención se pueden seleccionar del grupo que consiste de sales inorgánicas divalentes, ácidos carboxílicos inorgánicos, ácido fosfórico, aminoácidos, agentes quelatadores, albúminas y combinaciones de los mismos. En general la concentración del excipiente es una concentración que es suficiente para suprimir la 20 liberación de histamina farmacéuticamente inducida en un animal que se está tratando con un liberador de histamina. En una modalidad, la concentración del excipiente es una concentración que, cuando se combina en una solución acuosa con el liberador de histamina a por arriba de la concentración de micela crítica del 25 liberador de histamina es suficiente para reducir la agregación del — <h-i?aai111»- 1 « -. . - -i-fc liberador de histamina en la solución acuosa por lo menos aproximadamente en un 25% comparado con la agregación del liberador de histamina a la misma concentración a la solución acuosa que contiene substancialmente ningún excipiente. 5 "Substancialmente ningún excipiente" representa que la solución o mezcla está substancialmente libre de algún excipiente, es decir, no contiene una cantidad de excipiente que sea suficiente para reducir la agregación del liberador de histamina en solución, o suprimir la liberación de histamina farmacéuticamente inducida in 10 vitro o in vivo. De preferencia, "substancialmente sin excipiente" significa que la solución o mezcla no contiene una cantidad de ese excipiente que sea suficiente para ya sea reducir la agregación del liberador de histamina en mas de un 10% o suprimir la liberador de histamina farmacéuticamente inducida in vitro o in vivo, en más de 15 5%. En otras palabras, en una solución acuosa que contiene el liberador de histamina en, o por arriba de su concentración de micela crítica y uno o más excipientes fisiológicamente aceptables en concentraciones adecuadas, la agregación de liberación de 20 histamina será de por lo menos aproximadamente 25% menor que la agregación del liberador de histamina en un solución acuosa que contiene substancialmente la misma concentración de liberador de histamina y substancialmente nada del excipiente fisiológicamente aceptable. La inclusión del excipiente fisiológicamente aceptable en 25 \a solución que contiene el liberador de histamina substancialmente reduce la agregación del liberador de histamina en la solución. "Agregación reducida", "agregación disminuida" o "agregación decreciente" se refieren a una reducción en el tamaño de agregado promedio (que puede ser una función de la moléculas o agregados o el número de moléculas que forman el agregado) y/o una disminución en el número de agregados por volumen unitario. Los métodos para medir la agregación del liberador de histamina y de esta manera identificar una concentración de excipiente que sea adecuada para preparar la formulaciones de la presente, se discuten a continuación. Preferiblemente, la concentración del excipiente será una concentración que es suficiente para el liberador de histamina y excipiente particulares empleados, para reducir la agregación del liberador de histamina en la solución acuosa por lo menos aproximadamente en un 50%, y muy preferiblemente por lo menos aproximadamente en un 60%, según comparado con una solución acuosa del liberador de histamina que contiene substancialmente nada de excipiente. En otra modalidad, la concentración del excipiente es una concentración que es suficiente para reducir substancialmente la liberación de histamina de una muestra biológica que contiene histamina y una mezcla de la muestra biológica que contiene histamina en el medio y una solución acuosa que contiene tanto el liberador de histamina en una concentración suficiente para hacer que el liberador de histamina, a partir de la muestra biológica y el excipiente fisiológicamente aceptable, comparado con la liberación del histamina de la muestra biológica que contiene histamina en una mezcla consistiendo de la muestra biológica que contiene histamina en el medio, y una solución acuosa conteniendo substancialmente la misma concentración de liberador de histamina substancialmente nada de excipientes. Es decir, la liberación de histamina a partir de la muestra biológica se reduce en aproximadamente por lo menos 10% comparado con la mezcla de referencia que contiene substancialmente nada de excipientes. En otras palabras, una mezcla de muestra biológica que contiene histamina en un medio y una solución acuosa que contiene liberador de histamina a una concentración suficiente para ocasionar la liberador de histamina de la muestra biológica que contiene histamina y el excipiente fisiológicamente aceptable en una concentración adecuada exhibirán una liberador de histamina a partir de la muestra biológica que contiene histamina, la cual es por lo menos alrededor de 10% menor que la liberador de histamina a partir de una muestra biológica que contiene histamina en una mezcla de la muestra biológica que contiene histamina en un medio y una solución acuosa que contiene la misma concentración de liberador de histamina y substancialmente nada de excipiente fisiológicamente aceptable. Más adelante se discuten los métodos para medir la liberador de histamina a partir de la muestra biológica que contiene histamina y métodos para identificar una concentración de excipiente que sea adecuada para la preparación de formulaciones de la presente invención basándose en la liberación •m -i k.-k Ét&stJL . i i de histamina medida a partir de la muestra biológica que contiene histamina. Preferiblemente, la concentración del excipiente será una concentración que es suficiente para el liberador de histamina particular y el excipiente empleados, para reducir, la liberación de 5 histamina a partir de la muestra biológica que contiene histamina por lo menos alrededor de 20%, y muy preferiblemente por lo menos alrededor de 25%, según comparado con la liberación de histamina a partir de la muestra biológica que contiene histamina y una mezcla que consiste de la muestra biológica que contiene histamina y un 10 medio, y una solución acuosa conteniendo el liberador de histamina substancialmente a la misma concentración y substancialmente sin excipiente. En otra modalidad más la concentración del excipiente es una concentración que, cuando se administra intravenosamente junto con 15 un liberador de histamina a un animal, es suficiente para suprimir una o más de las manifestaciones físicas de las concentraciones de histamina en el plasma y/o tejido que están por arriba de los niveles fisiológicos normales de histamina. La supresión de una o más manifestaciones físicas de las concentraciones de histamina en 20 plasma y/o tejido por arriba de los niveles fisiológicos normales puede ser observada cualitativa o cuantitativamente, y se discute más adelante. La presente invención proporciona múltiples métodos para determinar una concentración de excipiente, que sea adecuada para 25 combinarse con el liberador de histamina para preparar las formulaciones farmacéuticas de la presente invención. Una concentración adecuada de excipiente empleado en la presente invención dependerá de varios factores, incluyendo, por ejemplo, el liberador de histamina particular con el cual el excipiente va a ser combinado, el animal que se está tratando con el liberador de histamina o en donde será administrada la formulación farmacéutica, y el excipiente particular (o combinaciones de excipientes) empleados. En algunos casos, el valor de pH puede jugar un papel importante en la optimización de concentraciones de excipientes también. En general, la concentración adecuada del excipiente será una concentración fisiológicamente aceptable. 1. Métodos a base de solución De acuerdo con un método de la presente invención, la concentración de excipiente es determinada a través del método que comprende los pasos de: a) medir la agregación del liberador de histamina en una solución de referencia consistiendo esencialmente de liberador de histamina en una concentración a, o por arriba de la concentración de micela crítica en una solución acuosa; b) medir la agregación de liberador de histamina en una solución comparativa consistiendo esencialmente del liberador de histamina y una concentración preseleccionada del excipiente fisiológicamente aceptable en la solución acuosa, en donde la concentración del liberador de histamina en la solución comparativa es substancialmente la misma a la concentración del liberador de histamina en la solución de referencia; c) opcionalmente repetir el paso b) una o más veces con una solución comparativa teniendo una concentración preseleccionada diferente del excipiente fisiológicamente aceptable; d) identificar una concentración de excipiente fisiológicamente aceptable que sea suficiente para reducir la agregación de liberador de histamina en una solución comparativa aproximadamente por lo menos en un 25% comparado con la agregación de liberador de histamina en la solución de referencia. La concentración identificada del paso d) es la concentración del excipiente fisiológicamente aceptable para combinarse con el liberador de histamina para preparar la formulación farmacéutica. El orden de los pasos a), b) y c) no es crítico. Estos pasos pueden ser realizados en cualquier orden deseado, como será apreciado por aquellos expertos en la técnica, no es necesario que la agregación de liberador de histamina en la solución de referencia sea medido antes de la agregación de la liberador de histamina en la solución comparativa, y la presente invención contempla métodos que comprenden estos pasos en cualquier orden adecuado. El paso c) de repetir opcionalmente el paso b) una o más veces significa que el paso b) puede ser repetido con múltiples soluciones comparativas pero no es requerido. Un experto en la técnica es capaz de determinar si es deseable en un caso particular realizar el paso c) (es decir, repetir el paso b) o no. En general, los métodos preferidos de la invención incluyen repetir el paso b) por lo * i a- --. i-i ,A.,-t,M ... AÍÍÁ.I menos una vez y muy preferiblemente más de una vez. La solución de referencia y soluciones comparativas pueden ser preparadas utilizando técnicas convencionales. Por ejemplo, la solución de referencia puede ser preparada solubilizando el 5 liberador de histamina, a por arriba de la concentración de micela crítica del liberador de histamina en solución acuosa. Una o más soluciones comparativas, cada una incluyendo una concentración preseleccionada del excipiente, se pueden preparar de acuerdo con los varios diferentes métodos. Cada solución 10 comparativa, después de la adición de la concentración preseleccionada de excipiente tendrá una concentración de liberador de histamina que sea substancialmente igual a la concentración del liberador de histamina en la concentración de referencia. La concentración "substancialmente igual" representa que la diferencia 15 en la concentración de liberador de histamina entre la solución de referencia y la solución comparativa no es suficiente para producir un efecto medible sobre la agregación de liberador de histamina. Muy preferiblemente, la concentración del liberador de histamina en las soluciones comparativas se considerará como substancialmente 20 igual a la concentración en la solución de referencia cuando la concentración de las soluciones comparativas sea la concentración de la solución de referencia más o menos aproximadamente 5%. Para la comparación más informativa de la agregación del liberador de histamina en la solución de referencia contra la agregación del 25 liberador de histamina en la solución comparativa, cada uno de la laMaijttttM^ft------, ...... t <i.i.mj.? . .:--.-,-...-. . ./....... ... . - yz -. --tu-fca-aJ ->. ¡.?ta?áJ*4m?ii?»L solución de referencia y la soluciones comparativas contendrán una solución equivalente del liberador de histamina. De acuerdo con una modalidad, se preparan soluciones comparativas titulando concentraciones preseleccionadas, o de otra manera conocidas del excipiente, en una solución acuosa conteniendo la concentración apropiada del liberador de histamina. El excipiente puede ser titulado a la solución conteniendo el liberador de histamina titulando ya sea hacia arriba o hacia abajo, de acuerdo con las técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica. De esta manera, la presente invención proporciona un método para determinar una concentración adecuada de excipiente para combinarse con el liberador de histamina para preparar una formulación farmacéutica que comprende los pasos de: 1) medir la agregación del liberador de histamina en una solución de referencia consistiendo esencialmente del liberador de histamina en una concentración a, o por arriba de la concentración de micela crítica en una solución acuosa; 2) titular el excipiente fisiológicamente aceptable a la solución de referencia para preparar soluciones comparativas; y 3) identificar una concentración del excipiente fisiológicamente aceptable suficiente para reducir la agregación de liberador de histamina en la solución comparativa por lo menos en aproximadamente 25% comparado con la agregación medida del paso 1. La concentración identificada es la concentración del excipiente fisiológicamente aceptable para combinarse con el liberador de histamina para preparar la formulación farmacéutica. El . ---_- . -„_-_- -b -¿ --ii- .-j-j-l-i paso de "titular el excipiente" se refiere a agregar en forma incrementante cantidades conocidas de excipiente (o diluir a cantidades conocidas de excipiente), mientras se verifica la agregación del liberador de histamina en la solución. De acuerdo con otra modalidad, se preparan soluciones comparativas solubilizando una concentración preseleccionada del excipiente en solución acuosa para crear una solución de abastecimiento teniendo la concentración más alta de excipiente, diluyendo una porción de la solución de abastecimiento por un factor de dilución adecuado (por ejemplo, diluir en serie la solución de abastecimiento), una o más veces para preparar múltiples soluciones acuosas de excipiente, cada una conteniendo una concentración preseleccionada del excipiente, y después solubilizar la cantidad apropiada del liberador de histamina en cada una de la solución acuosa preparada de excipiente para obtener una o más soluciones comparativas, cada una teniendo una concentración de liberador de histamina substancialmente igual a la concentración de liberador de histamina en la solución de referencia. Las soluciones que contienen diferentes concentraciones de una combinación de dos o más excipientes se pueden utilizar en los métodos de la presente invención justo como soluciones comparativas conteniendo diferentes concentraciones solamente de un excipiente. Está dentro del alcance de algún experto en la técnica preparar múltiples soluciones comparativas, cada una conteniendo una concentración preseleccionada diferente de dos o .. -.-. -. i _.---*á más diferentes excipientes. Por ejemplo, esto se puede lograr preparando múltiples soluciones comparativas diferentes, cada una teniendo una concentración diferente solamente de uno de los dos o más excipientes mientras la concentración de los otros excipientes permanece constante. Alternativamente, se pueden preparar múltiples soluciones comparativas diferentes, cada una teniendo una concentración diferente de más de uno, o aún todos los excipientes. Cuando el excipiente empleado en los métodos y formulaciones de la presente invención, es una combinación de dos o más excipientes, todo lo que se requiere es que la concentración de cada uno de los dos o más excipientes en cada solución comparativa deba ser conocida. Los pasos a) y b) para medir la agregación de liberador de histamina en la solución de referencia y las soluciones comparativas pueden ser realizados en muchas formas diferentes. Ventajosamente, la agregación puede ser medida utilizando equipo convencional y técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica. (a) Análisis de Tensión de Superficie De acuerdo con una técnica los pasos a) y b) son realizados midiendo la agregación de liberador de histamina en solución acuosa utilizando un análisis de tensión de superficie. Los métodos para medir la agregación a través de tensión de superficie generalmente on descritos por Anacker, E. W. (1970), Micelle Formation of Cationic Surfactants in Aqueous Media, Cationic Surfactants. E. Jungermann, New York, Marcel Dekker, Inc.; Iwunze, M.O., M. Lambert, y otros (1997), Monatshefte fur Chemie, 128: 582-592; Atwood, D. y R. Natarajan (1979), J. Pharm. Pharmacology 32: 460-462; Moroi, Y. y otros (1990), Journal of Physical Chemistry, 94: 842-845; y Rosen M. J., J. H. Mathias, y otros (1999), Langmuir, 15(21): 7340-7346, las descripciones de las cuales se incorporan aquí por referencia. Cuando se mide la agregación a través de análisis de tensión de superficie, la solución acuosa preferiblemente es agua (incluyendo agua deuterizada), la cual puede ser ajustada en su pH con ácido clorhídrico o hidróxido de sodio, según sea necesario o deseable para estabilizar física y/o químicamente o facilitar la solubilización de ciertos liberadores de histamina en la solución acuosa suficientemente largo para permitir la medición la agregación de liberador de histamina utilizando el análisis de tensión de superficie. Ya que la tensión de superficie de la mayoría de los líquidos se reduce con un incremento en la temperatura, es necesario controlar la temperatura del sistema mientras se evalúa la tensión de superficie de la solución de referencia y las soluciones comparativas. La agregación del liberador de histamina en la solución de referencia y la soluciones comparativas se puede medir midiendo la tensión de superficie de cada solución de referencia y las soluciones de referencia utilizando el método de anillo de DuNouy como se ¡_ i ,í '..á i i..i--- ,á. . ¿..--fefai. ¡ ^ J- i-i-ii-i- describe en Physical Pharmacy; Physical Chemistry Principies in the Pharmaceutical Sciences, Editores: Alfred Martin, James Swarbrick, Arthur Cammarata, Tercera Edición, Lea & Febifer, Philadelphia, 1983. La superficie de tensión puede proporcionar una medida de la concentración de micela crítica del liberador de histamina en solución y por esta razón es un indicador de la agregación del liberador de histamina en la solución. La concentración de micela crítica del liberador de histamina en una solución puede ser identificada midiendo la tensión de superficie de soluciones que contienen concentraciones en incremento de liberador de histamina y observando en una gráfica de tensión de superficie (eje y) contra la concentración de liberador de histamina (eje x), el punto en donde una concentración elevado del liberador de histamina produce substancialmente la misma tensión de superficie o aún una más baja que la superficie de tensión de la concentración inferior precedente del liberador de histamina. La Figura 1 es una gráfica de la tensión de superficie de soluciones que contienen el liberador de histamina, el compuesto 1 contra la concentración en incremento del compuesto 1. Los datos son consistentes con una concentración de micela crítica a aproximadamente 15 mg/ml del Compuesto 1. Se sabe que la tensión de superficie de una solución que contiene un compuesto material que se agrega generalmente se reducirá a medida que la concentración del compuesto o material en la solución se incrementa debido a la adsorción del compuesto material en solución en la superficie de la solución. De esta manera, a medida que se agregan concentraciones en incremento del liberador de histamina a una solución acuosa, la tensión de superficie de la solución tenderá a reducir debido a la adsorción incrementada del liberador de histamina en la superficie de la solución hasta el punto en donde la superficie queda saturada. Además, la adición de liberador de histamina a la solución dará como resultado la formación de agregados en la solución voluminosa. En una escala de concentración relativamente estrecha es en donde esta agregación o concentración de micela ocurre, y ésta es la concentración de micela crítica. Una gráfica de tensión de superficie de soluciones comparativas conteniendo una concentración constante de liberador de histamina y varias concentraciones, típicamente en aumento, del excipiente permitirán la observación de un extremo o una inversión de la tendencia de reducción de la tensión de superficie o un desplazamiento en la concentración de micela crítica del liberador de histamina. Un extremo a la tendencia de reducción de tensión de superficie puede ser gráficamente observado a través de un cambio en la pendiente en la gráfica de la tensión de superficie contra concentración. Una inversión de la tendencia de reducción de la tensión de superficie puede ser gráficamente observada a través de un cambio en la dirección de la gráfica de tensión de superficie contra concentración. El extremo o inversión de la tendencia de reducción de tensión de superficie indica una reducción en la adsorción del liberador de histamina a la superficie de la solución izÁ? ¡i ?. tjt-i.- . »-. ... ------ata. «--Ai .i..-. en la solución comparativa, según comparado con la adsorción de liberador de histamina a la superficie de la solución en la solución de referencia. Esta reducción a su vez se correlaciona con una reducción de agregación de liberador de histamina en solución. Un desplazamiento en la concentración de micela crítica de liberador de histamina en la solución comparativa es otro medio para identificar la reducción en la agregación de liberador de histamina a través de análisis de tensión de superficie. Un desplazamiento en la concentración de micela crítica del liberador de histamina en la solución comparativa se identifica por la observación de una concentración de micela crítica más alta para el liberador de histamina en la solución comparativa, según comparado con la concentración de micela crítica del liberador de histamina en la solución de referencia. De esta manera se puede identificar una reducción en la agregación observando una concentración crítica de micela del liberador de histamina en la solución comparativa que ocurre en una concentración más alta de liberador de histamina que la concentración de micela crítica del liberador de histamina en la solución de referencia que contiene substancialmente nada de excipiente fisiológicamente aceptable. Con el propósito de comparar la agregación del liberador de histamina en la solución de referencia con la agregación de liberador de histamina en las soluciones comparativas, las propiedades de tensión de superficie de la solución de referencia on la agregación de liberador de histamina en la soluciones &.É .1, comparativas, las propiedades de tensión de superficie de la soluciones pueden ser observadas como una gráfica o curva de tensión de superficie (eje y) contra la concentración de excipiente (eje x). La solución de referencia y las soluciones comparativas, cada una representan un punto sobre la tensión de superficie contra la curva de concentración. De esta manera, las tendencia en la tensión de superficie de las soluciones a medida que la concentración de excipiente se altera (es decir, se eleva o se reduce) pueden ser observadas fácilmente. b) Método de NMR De acuerdo con otra técnica, los pasos a) y b) pueden ser realizados midiendo la agregación de liberador de histamina en solución acuosa utilizando espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR). Los métodos para medir la agregación a través de NMR se describen por Wiedmer, S. K., L. Riekkola, y otros (1997), Analytical Chemistry 69(8): 1577-184 y Jonsson, B., B. Lindam, y otros (1998); Surfactants and Polymers in Aqueous Solutíon, Chichester, John Wilet & Sons, las descripciones de las cuales se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Los espectros de NMR de protón de liberador de histamina en solución acuosa pueden ser medidos utilizando técnicas convencionales conocidas por aquellos expertos en el campo de espectroscopia de NMR en un espectrómetro convencional de NMR. Basándose en los espectros obtenidos, se pueden medir cambios de •?-tJ"A —*-*-> ,!.-«..... .i... ->A«-..t....--« Ji- - L-L. desplazamiento químico (Ver, Y.S. Lee y otros, Bull. Korean Chem. Soc, 1993, 14(3), 392-398) cambios de anchura de línea (Ver, J. H. Bradbury, y otros, Nature, 1968, 218, 1049-1050; L. Hwang, y otros, J. Phys. Chem. 1988, 92, 4753-4748), relajación (Constantes de 5 velocidad de relajación T y T2) (Ver, Y.S. Lee y otros, Bull. Korean Chem. Soc, 1993, 14(3), 392-398; B.P. Hills, y otros, Macromolecules, 1991, 24, 2944-2950), y los coeficientes de difusión (Ver, K.F. Morris y otros, JACS, 115, 4291-4299; P. Stilbs, Prog. Nucí. Magn. Reson. Spectros., 1987, 19, 1-45). Típicamente la 10 agregación de liberador de histamina en la solución de referencia y la solución comparativa se mide a través de la relajación de NMR. Existen dos tipos de relajación de NMR, la relajación del retículo del espín y relación de espín-espín, denominados como valores T, y T2, respectivamente. T^ y T2 son constantes de 15 velocidad que miden la relajación de la magnetización de NMR al equilibrio (de aquí en adelante colectivamente denominadas como "velocidades de relajación de NMR"). Para moléculas pequeñas en donde se denomina el límite de estrechamiento extremo, tanto T, como T2 se incrementan en proporción inversa la velocidad de 20 revolvimiento rotacional Tc, que, a su vez, es directamente proporcionar al tamaño promedio del agregado. De esta manera, para moléculas pequeñas, incrementos en las velocidades de 7, y/o T2 con la adición de excipiente a la solución conteniendo el liberador de histamina, en ausencia de cambios importantes en la 25 viscosidad de solución, indica una reducción en la agregación.

,.. .-,- ,«-^-*-Ci---._ -_. . H A ii.i --t-.a-.---_ - . AtAát -Szti -j-j-i i -jLtl - De acuerdo con una modalidad, los pasos a) e b) para medir la agregación del liberador de histamina en la solución de referencia y soluciones comparativas comprenden medir las velocidades de relajación de NMR de protón del liberador de histamina en la solución de referencia y la solución comparativa. La agregación de liberador de histamina en cada solución comparativa se mide y se compara con la medida de agregación del liberador de histamina en la solución de referencia. La comparación de la medida de agregación del liberador de histamina en la solución de referencia permitirá la fácil identificación de la soluciones comparativas, las cuales exhiben una medida de agregación de liberador de histamina que es por lo menos aproximadamente 25% menor que la medida de agregación del liberador de histamina en la solución de referencia. El paso de identificar la concentración del excipiente fisiológicamente aceptable, que es suficiente para reducir la agregación del liberador de histamina en la soluciones comparativas, por lo menos en aproximadamente un 25% comparado con la agregación del liberador de histamina en la solución de referencia puede lograrse después de comparar la agregación medida de liberador de histamina en cada solución de referencia y las soluciones comparativas, a medida que la concentración de excipiente en cada solución comparativa es preseleccionada o conocida. De esta manera, en una modalidad del método para determinar la concentración de excipiente, el paso d) de identificar una concentración de excipiente fisiológicamente aceptable que es ..ia-i- -i--.--. - ik-.í suficiente para reducir la agregación de liberador de histamina en la solución comparativa por lo menos en aproximadamente un 25% comparado con la agregación medida del liberador de histamina en la solución de referencia, comprende identificar una concentración de excipiente fisiológicamente aceptable suficiente para reducir las velocidades de relajación de NMR medidas del liberador de histamina en la solución comparativa por lo menos en aproximadamente 25%, muy preferiblemente alrededor de 50% y de preferencia aproximadamente 60%, comparado con las velocidades de relajación de NMR medidas del liberador de histamina en la solución de referencia. Un tiempo más largo en segundo para los valores medido de T. y T2 es indicativo de una velocidad de relajación más lenta. Como será evidente para aquellos expertos en el campo, se deben en tomar en cuenta los cambios de viscosidad cuando se mide la agregación con velocidades de relajación. También se puede utilizar la resonancia magnética nuclear de carbono 13 en los pasos a) y b) para medir la agregación de la solución de referencia y soluciones comparativas con el fin de determinar las concentraciones de excipiente que son adecuadas para la preparación de las formulaciones farmacéuticas de la invención. Este método involucra medir las velocidades de relajación o cambios de desplazamientos químicos para carbono en lugar del protón y tiene una ventaja ya que la relajación del carbono típicamente es menos complicada que la relajación del protón y de esta manera por lo general es más fácil de interpretar. Sin embargo, se observa que 13C-NMR es 100 veces menos sensible que 1H-NMR. Además, las mediciones pueden hacerse para otros núcleos activos de NMR (es decir, 31P, 19F) si la estructura del liberador de histamina contiene estos núcleos. Los métodos anteriores para preparar soluciones, medir la agregación e identificar la concentración del excipiente adecuado para utilizarse en las formulaciones farmacéuticas de la invención, son igualmente aplicables a 13C-NMR y para otros núcleos activos de NMR. Como se observó anteriormente, también se pueden medir los coeficientes de difusión a través de NMR y pueden proporcionar otra medición de agregación además de o en lugar de la medición de velocidad de relajación anteriormente descrita. Los coeficientes de difusión reflejan cambios en el tamaño de agregado promedio y/o el número de agregados, y, por lo tanto, son una medida principal de la agregación del liberador de histamina en la solución de referencia y la soluciones comparativas. Como será evidente para aquellos expertos en el campo, los cambios de viscosidad deben ser tomados en cuenta cuando se mide la agregación con coeficientes de difusión. Los métodos anteriores para medir la agregación del liberador de histamina en la solución de referencia y las soluciones comparativas e identificar una concentración de excipiente que es suficiente para reducir la agregación por lo menos en un 25% son ilustrativos de los métodos de la presente invención, pero no exhaustivos de todas las formas posibles para realizar este método l¿n-LLi-i-l.t-i ? de la presente invención. Un experto en el campo fácilmente apreciará las muchas formas en las que se puede medir la agregación del liberador de histamina, como los ejemplos anteriores que muestran que cualquier técnica adecuada para medir la agregación de una molécula de solución será útil en los métodos de la presente invención para medir la agregación de un liberador de histamina también. Los métodos adicionales (y referencias que describen dichos métodos) para medir la agregación incluyen los siguientes, los cuales se incorporan aquí por referencia: tensión interfacial (ver, Rosen, M. J., J.H. Mathias, y otros (1999), Langmuir 15(21): 7340-7346); difusión de luz (ver, Anacker, E.W. (1970), Micelle Formation of Cationic Surfactants in Aqueous Media, Cationic Surfactants, E. Jurgermann, New York, Marcel Dekker, Inc.; Attwood, D. y Natarajan (1979), J. Pharm. Pharmacology 32: 460-462; Moroi, Y. y otros (1990), Journal of Physical Chemistry, 94:842-845; Moroi, Y., Y. Murata y otros (1992), Journal of Physical Chemistry, 96:8610-13; and Roesn, M.J. (1978), Surfactants and Interfacial Phenomena, New York, Wiley-lnterscience); conductividad (ver, Anacker (1970) supra; Attwood, D. y Natarajan (1992) supra; Moroi, Y., Y. Murata y otros (1992), supra; Streng, W. H.-S. Yu, y otros (1996), internacional Journal of Pharmaceutics 135: 43-52; Iwunze, M. O., M. Lambert y otros, (1997), Monatshefte Cur Chemie , 128: 582-592; Wiedmer, S. K., M. L. Riekkola, y otros, (1997), Analytical Chemistry 69(8): 1577-1584; y Rosen (1978) supra); calorimetría (ver, Paula, S., W. Sus, y otros (1995), Journal of Physical Chemistry 99(39); 11742-11751; Streng, Yu y otros (1996), supra; y Cooper, A., M. A. Nutley, y otros, (1998), Analytical Chemistry 70(23): 5024-5028); ulracentrifugación (ver, Anacker (1970) supra; y Rosen (1978) supra); mediciones de difusión (ver, Anacker (1979)supra; y Jonsson, B., B. Lindman, y otros (1998); Surfactants and Polymers ¡n Aqueous Solution, Chichester, John Wiley & Sons); espectroscopia ultrasónica, densitometría, difusión de luz elástica y casi elástica, y difusión de neutrón de ángulo pequeño, y difusión de luz de Brillouin, (ver, D'Arrigo, G., F. Mallamace, y otros, (1991), Physical Review A 44(4): 2578-2587; y Rosen (1978) supra); mediciones de viscosidad (ver, Anacker (1979) supra; índice de refracción (ver, Anacker (1970) supra; Moroi, Y. y otros (1990), supra; Moroi, Y., Y. Murata, y otros (1992), supra; y Rosen (1978) supra); difracción de rayos X (ver, Anacker (1979) supra); solubilización de colorante (ver, Anacker (1979) supra; y Rosen (1978) supra); espectroscopia fluorescente (ver, Iwunze (1997) supra ; Rosen (1978) supra; y Jonsson (1998) supra); electroforesis capilar (ver, Wiedmer (1997) supra); potenciometría, espectrofotometría y métodos cinéticos (ver, Kopecky, F., Pharmazie 51(3): 135-144 (1996); osmometría (ver, Streng, W. H. y otros (1996) supra; y Rosen (1978) supra); y 5 microscopía, técnicas ópticas y no ópticas (ver, Binks, B. P., Ed. (1999), Modern Characterization Methods of Surfactants Systems. Surfactants Sciences Series, New York, Marcel Dekker). Las descripciones de estas referencias según pertenecen a los métodos para medir la agregación, se incorporan aquí por 10 referencia. La presente invención contempla, pero no está limitada por estos ejemplos específicos de técnicas para medir agregación y se define solamente por las reivindicaciones con otros métodos adecuados para medir la agregación que está contemplada por la 15 presente invención. Los métodos anteriores para determinar una concentración del excipiente para combinarse con el liberador de histamina para preparar una formulación farmacéutica son igualmente aplicables a la determinación del excipiente fisiológicamente aceptable, que es 20 suficiente para suprimir la liberador de histamina farmacéuticamente inducida a partir de un animal que está siendo tratado con un liberador de histamina. De esta manera, la presente invención proporcionar un método para determinar una concentración de un excipiente fisiológicamente aceptable que es suficiente para medir 25 la liberación de histamina farmacéuticamente inducida en un animal que está siendo tratado con un liberador de histamina. El método comprende: a) medir la agregación del liberador de histamina en una solución de referencia consistiendo esencialmente de liberador de histamina en una concentración a o por arriba de la concentración de micela crítica en una solución acuosa; b) medir la agregación de liberador de histamina en una solución comparativa consistiendo esencialmente del liberador de histamina y una concentración preseleccionada del excipiente fisiológicamente aceptable en la solución acuosa, en donde la concentración del liberador de histamina en la solución comparativa es substancialmente la misma como la concentración del liberador de histamina en la solución de referencia; c) opcionalmente repetir el paso b) una o más veces con una solución comparativa teniendo una concentración preseleccionada diferente del excipiente fisiológicamente aceptable; d) identificar una concentración de excipiente fisiológicamente aceptable que sea suficiente para reducir la agregación del liberador de histamina en una solución comparativa aproximadamente por lo menos en un 25% comparado con la agregación de liberador de histamina en la solución de referencia. La concentración identificada del paso d) es la concentración del excipiente fisiológicamente aceptable que es suficiente para suprimir la liberación de histamina farmacéuticamente inducida en un animal que se está tratando con un liberador de histamina. La supresión de la liberación de histamina farmacéuticamente inducida se discute más adelante. Las técnicas de tensión de superficie y NMR anteriores para realizar el , -. ü. -a----..----. -fc-.jil. i método para determinar una concentración de excipiente para combinarse con el liberador de histamina para preparar un método para la formulación farmacéutica son igualmente aplicables para este método. 2. Métodos in vitro De acuerdo con otro método de la presente invención la concentración de excipiente se determina a través del método que comprende los pasos de: : a) medir la liberación de histamina a partir de una muestra biológica que contenga histamina en una mezcla de referencia consistiendo esencialmente de: i) la muestra biológica que contiene histamina en un medio y ii) una solución acuosa del liberador de histamina a una concentración suficiente para ocasionar la liberación de histamina a partir de la muestra biológica que contiene histamina; b) medir la liberación de histamina a partir de la muestra biológica que contiene histamina en una mezcla comparativa que consiste esencialmente de: i) la muestra biológica que contiene histamina en un medio y ii) una solución acuosa del liberador de histamina y una concentración preseleccionada del excipiente fisiológicamente aceptable, en donde el liberador de histamina de la mezcla comparativa está presente en una concentración que es substancialmente igual a la concentración del liberador de histamina en la mezcla de referencia del paso a); c) opcionalmente repetir el paso b) una o más veces con una mezcla comparativa teniendo una concentración preseleccionada diferente , - t J. í -_---.__. del excipiente fisiológicamente aceptable; y d) identificar una concentración del excipiente fisiológicamente aceptable suficiente para reducir la liberación de histamina a partir de la muestra biológica que contiene histamina en la mezcla comparativa aproximadamente por lo menos en un 10% comparado con la liberación de histamina de la muestra biológica que contiene histamina de la mezcla de referencia. La concentración identificada del paso d) es la concentración del excipiente fisiológicamente aceptable para combinarse con el liberador de histamina para preparar la formulación farmacéutica. El término "muestra biológica que contiene histamina" como se utilizan en la presente incluye líneas de célula, tejidos, y fluidos biológicos que incluyen células que contienen histamina. Ejemplos de muestras biológicas que contiene histamina incluyen, pero no se limitan a basófilos, células cebadas, células de músculo liso, miocitos cardiacos; pulmón con reperfusión, piel, vaso sanguíneo, corazón, cerebro o tejido de intestinos; y sangre y linfa, estas muestras biológicas pueden ser de mamíferos, incluyendo seres humanos, ratas, perros, gatos, primates (por ejemplo, changos), y similares. Preferiblemente, la muestra biológica que contiene histamina se selecciona del grupo que consiste de: sangre humana, de rata, de perro o de primate; células de basófilo humanas, de rata, de perro o de primate; y células cebadas humanas, de rata, de perro o de primate. Muy preferiblemente la muestra biológica que contiene histamina se selecciona del grupo que consiste de células de -1 ?.Á Í.H.I--Í-. - basófilo de sangre humana, de sangre de rata, de sangre de perro y de rata, células cebadas humanas, y células cebadas de primate. La muestra biológica que contiene histamina de aquí en adelante algunas veces es denominada como "muestra biológica" para 5 brevedad. La muestra biológica se proporciona en un medio. Cuando la muestra biológica es células en cultivo, el medio es el medio de cultivo apropiado. Cuando la muestra biológica es un tejido u órgano aislado en un baño de órgano el medio es el fluido fisiológico 10 artificial. Cuando la muestra biológica es sangre, el medio es plasma. De esta manera, un medio adecuado dependerá de la muestra biológica particular empleada y será fácilmente determinada por aquellos expertos en la técnica basándose en conocimiento convencional. 15 El orden de los pasos a), b) y c) anteriores no es crítico. Estos pasos pueden ser realizados en cualquier orden deseado, como será apreciado por aquellos expertos en la técnica. No es necesario que la liberación de histamina en la muestra biológica en la mezcla de referencia sea medido antes de la liberación de histamina a partir de 20 la muestra biológica en la solución comparativa medida, y la presente invención contempla métodos que comprenden estos pasos en cualquier orden adecuado. El paso c) de repetir opcionalmente el paso b) una o más veces significa que el paso b) puede ser repetido con múltiples 25 mezclas comparativas, pero no es requerido. Un experto en la técnica es capaz de determinar si es deseable en un caso particular realizar el paso c) (es decir, repetir el paso b) o no. En general, los métodos preferidos de la invención incluyen repetir el paso b) por lo menos una vez y muy preferiblemente más de una vez. La mezcla de referencia y mezclas comparativas pueden ser preparadas utilizando técnicas convencionales. En general la mezcla de referencia y mezclas comparativas se preparan combinando o poniendo en contracto la muestra biológica en un medio con una solución acuosa. En el caso de la mezcla de referencia, la solución acuosa contiene el liberador de histamina a una concentración suficiente para ocasionar la liberador de histamina medible a partir de la muestra biológica, cuando esa concentración de liberador de histamina se pone en contacto con o se combina la muestra biológica en el medio. En el caso de las mezclas comparativas, la solución acuosa contiene el liberador de histamina y una concentración preseleccionada del excipiente, en donde la concentración de liberador de histamina en la solución acuosa, cuando se combina con la muestra biológica en el medio, es suficiente para producir una mezcla comparativa conteniendo substancialmente la misma concentración del liberador de histamina como en la mezcla de referencia. La concentración "substancialmente igual" representa que la diferencia en la concentración de liberador de histamina entre la mezcla de referencia de la mezcla comparativa no es suficiente para producir en efecto medible sobre la liberación de histamina a partir de la i I . I i. i - .I--.-.. , ) muestra biológica. Muy preferiblemente, la concentración de liberador de histamina en las mezclas comparativas se considerará como substancialmente igual a la concentración en la mezcla de referencia cuando la concentración de la mezcla comparativa sea la concentración de la mezcla de referencia más o menos aproximadamente 5%. Para la comparación mas informativa de la liberador de histamina en la mezcla de referencia contra la liberación de histamina en la mezcla comparativa, cada de una de la mezcla de referencia y las mezclas comparativas contendrán una concentración equivalente de liberador de histamina. Una concentración de liberador de histamina que es suficiente para ocasionar la liberador de histamina a partir de la muestra biológica, puede se determinada poniendo en contacto una o más concentraciones preseleccionadas del liberador de histamina en la prueba biológica en un medio y detectar la presencia o ausencia de liberación de histamina o medir la cantidad de histamina liberada de la muestra biológica. Más adelante se describen métodos para detectar la presencia o ausencia de liberación de histamina y métodos para medir la cantidad de histamina liberada a partir de la muestra biológica. Las soluciones acuosas para utilizarse en la preparación de la mezcla de referencia de las mezclas comparativas, pueden ser preparadas utilizando las mismas técnicas generales como se describió anteriormente con referencia a métodos para preparar soluciones de referencia y soluciones comparativas para análisis de agregación. Por ejemplo, la solución acuosa para utilizarse en la mezcla de referencia puede ser preparada solubilizando o suspendiendo el liberador de histamina, a una concentración suficiente para ocasionar liberación de histamina a partir de la 5 muestra biológica, en la solución acuosa. Una o más soluciones para la preparación de una de las mezclas comparativas, cada una incluyendo una concentración preseleccionada de excipiente diferente, puede ser preparada de acuerdo con varios métodos diferentes. De acuerdo con una 10 modalidad, se preparan soluciones acuosas para las mezclas comparativas titulando concentraciones preseleccionadas o de otra manera conocidas del excipiente en una solución acuosa conteniendo la concentración apropiada del liberador de histamina. El excipiente puede ser titulado a la solución conteniendo el 15 liberador de histamina titulando ya sea hacia arriba o hacia abajo, de acuerdo con técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica. De acuerdo con otra modalidad, se preparan soluciones acuosas para las mezclas comparativas solubilizando una 20 concentración preseleccionada del excipiente en la solución acuosa para crear una solución de abastecimiento teniendo la concentración más alta de excipiente, diluyendo una porción de la solución de abastecimiento a través de un factor de dilución adecuado (por ejemplo, diluir en serie la solución de abastecimiento) una o más 25 veces para preparar múltiples soluciones acuosas de excipiente, ^gH^|[ illÉt t í 1 I. ¿"* -y*-'?.?., At,-.. ' ---** *<~**yy t .álíkj cada una conteniendo una concentración preseleccionada del excipiente, y después solubilizando la cantidad apropiada del liberador de histamina en cada solución acuosa preparada de excipiente, de manera que cuando las soluciones acuosas son combinadas con la muestra biológica en el medio para preparar las mezclas comparativas, cada mezcla comparativa tendrá una concentración de liberador de histamina substancialmente igual a la concentración del liberador de histamina en la mezcla de referencia. Las mezclas comparativas que contienen diferentes concentraciones de una combinación de dos o más excipientes pueden ser utilizadas en los métodos de la presente invención como mezclas comparativas conteniendo diferentes concentraciones de solo un excipiente. Está dentro de la experiencia de un experto en la técnica preparar múltiples mezclas comparativas, cada una conteniendo una concentración preseleccionada diferente de cada uno de dos o más excipientes diferentes. Por ejemplo, esto puede lograrse preparando múltiples mezclas comparativas diferentes, cada una teniendo una concentración diferente de solo uno de los dos o más excipientes, mientras que la concentración de los otros excipientes permanece constante. Alternativamente, se pueden preparar múltiples mezclas comparativas diferentes, cada una teniendo una concentración diferente de más de uno o aún todos los excipientes. Cuando el excipiente empleado en los métodos y formulaciones de la presente invención es una combinación de dos o más excipientes, todo lo que se requiere es que la concentración de ,.t '« » *--.» *--- . - . ->..¿ ,.-..... y?3a?*HÍukiAA» cada uno de dos o más excipientes en una mezcla comparativa deba ser conocida. Los métodos para detectar la liberación de histamina a partir de la muestra biológica y los métodos para realizar los pasos a) y b) 5 para medir la liberación de histamina de la muestra biológica en la mezcla de referencia y las mezclas comparativas, pueden ser realizados utilizando técnicas convencionales. Ejemplos de técnicas convencionales para detectar y medir la liberación de histamina a partir de una muestra biológica incluyen aquellos descritos en 10 Inflammation: Basic Principies and Clinical Correlatos (Eds. J.l. Gallin, I.M. Goldstein, y R. Snyderman, Capítulo 11, Measurement of Histamine, p 202, Raven Press, New York, 1992, la materia objeto de la cual ya se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Específicamente, se pueden emplear método de ensayo con 15 inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) in vivo e in vitro y métodos de radioinmunoensayo (RÍA) y métodos de ensayo fluorométricos para detectar y medir la liberación de histamina a partir de la muestra biológica. Al utilizar los resultados del ensayo de ELISA, RÍA o fluorométrico, se puede determinar el porcentaje de 20 inhibición de liberación de histamina a partir de la muestra biológica para cada una de las mezclas comparativas con relación a la liberación de histamina a partir de la muestra biológica en la mezcla de referencia. Aunque la discusión anterior específicamente menciona métodos de ensayo de ELISA, RÍA y fluorométricos para 25 detectar la liberación de histamina, se pueden emplear otros tJÜjJtagüttiliSi-..i ¡t ?.?..ÍM?á? . i . A. -Z.....A . .»--._----- .- -- ---.-.. — --t- -_ •- métodos convencionales para determinar la liberación de histamina a partir de una muestra biológica. El paso de identificar las concentraciones de excipientes suficientes para reducir la liberación de histamina a partir de la muestra biológica por lo menos en aproximadamente un 10%, comprende identificar la concentración preseleccionada del excipiente en las mezclas comparativas lo cual ocasiona la liberación de histamina a partir de la muestra biológica para que sea de por lo menos aproximadamente 10% menor que la liberación de histamina en la muestra biológica en la mezcla de referencia. La concentración identificada del excipiente es la concentración para combinarse con el liberador de histamina para preparar las formulaciones farmacéuticas de la invención. Los métodos anteriores para determinar una concentración de excipiente para combinarse con el liberador de histamina para preparar una formulación farmacéutica son igualmente aplicables para la determinación de una concentración del excipiente fisiológicamente aceptable que es suficiente para suprimir la liberación de histamina farmacéuticamente inducida de un animal que se está tratando con un liberador de histamina. De esta manera, la presente invención proporciona un método para determinar una concentración de un excipiente fisiológicamente aceptable que es suficiente para suprimir la liberación de histamina farmacéuticamente inducida en un animal que está siendo tratado con un liberador de histamina, el método comprende: a) medir la liberación de histamina a partir de una muestra biológica que contenga histamina en una mezcla de referencia consistiendo esencialmente de: i) la muestra biológica que contiene histamina en un medio y ii) una solución acuosa del liberador de histamina a una concentración suficiente para ocasionar la liberación de histamina a partir de la muestra biológica que contiene histamina; b) medir la liberación de histamina a partir de la muestra biológica que contiene histamina en una mezcla comparativa que consiste esencialmente de: i) la muestra biológica que contiene histamina en un medio y ii) una solución acuosa del liberador de histamina y una concentración preseleccionada del excipiente fisiológicamente aceptable, en donde el liberador de histamina de la mezcla comparativa está presente en una concentración que es substancialmente igual a la concentración del liberador de histamina en la mezcla de referencia del paso a); c) opcionalmente repetir el paso b) una o más veces con una mezcla comparativa teniendo una concentración preseleccionada diferente del excipiente fisiológicamente aceptable; y d) identificar una concentración del excipiente fisiológicamente aceptable suficiente para reducir la liberación de histamina a partir de la muestra biológica que contiene histamina en la mezcla comparativa aproximadamente por lo menos en un 10% comparado con la liberación de histamina de la muestra biológica que contiene histamina de la mezcla de referencia. La concentración identificada del paso d) es la concentración del excipiente fisiológicamente aceptable que es suficiente para suprimir la liberación de histamina farmacéuticamente inducida en un animal que está siendo tratado con un liberador de histamina. 3. Métodos in vivo Aunque no el método muy preferido, la concentración del excipiente para utilizarse en la presente invención puede ser determinado a través de un método que comprende los pasos de: a) administrar intravenosamente un bolo rápido o infusión rápida de la formulación farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del liberador de histamina y una concentración preseleccionada del excipiente; b) opcionalmente repetir el paso a) una o más con una formulación farmacéutica comprendiendo una concentración preseleccionada diferente del excipiente; y c) cualitativa o cuantitativamente medir la supresión de liberación de histamina in vivo según comparado con una formulación farmacéutica que contiene substancialmente ningún excipiente fisiológicamente aceptable, en donde la concentración adecuada del excipiente es la concentración suficiente para suprimir cualitativa o cuantitativamente la liberación de histamina in vivo. La formulación del paso a) puede ser preparada de acuerdo con cualquiera de los métodos de la presente invención. El paso c) de medir cualitativa o cuantitativamente la supresión de liberación de histamina puede ser realizado utilizando los métodos descritos más adelante. , ,. 4. Concentraciones de excipientes Las concentraciones preferidas de excipientes varían dependiendo de factores tales como la categoría o el excipiente particular empleado y si el excipiente es una combinación de dos o más excipientes. En general, cuando el excipiente es una sal inorgánica divalente la concentración del excipiente será de por lo menos aproximadamente 15 mM, de preferencia alrededor de 15 mM a aproximadamente 200 mM, muy preferiblemente alrededor de 25 mM a aproximadamente 75 mM, sin considerar si el excipiente es empleado individualmente o en combinación con uno o más excipientes adicionales. En la modalidad de la invención, en donde el excipiente es una sal inorgánica divalente individual, las concentraciones preferidas del excipiente serán de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM y muy preferiblemente alrededor de 50 mM. En la modalidad en donde el excipiente es cloruro de calcio las concentraciones preferidas del excipiente serán de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 200 mM, muy preferiblemente alrededor de 25 mM a aproximadamente 75 mM y muy preferiblemente alrededor de 50 mM. Cuando la sal inorgánica divalente se emplea en combinación con uno o más excipientes adicionales, la concentración de la sal inorgánica divalente puede ser menor que aproximadamente 15 mM, particularmente tan baja como 10 mM, y de preferencia es de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75, y muy preferiblemente de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 50 mM. En general, cuando el excipiente es una ácido carboxílico orgánico, la concentración del excipiente será de por lo menos alrededor de 15 mM, de preferencia alrededor de 15 mM a aproximadamente 300 mM, muy preferiblemente alrededor de 25 mM a aproximadamente 75 mM, sin considerar sin considerar si el excipiente es empleado individualmente o en combinación con uno o más excipientes adicionales. La modalidad de la invención en donde el excipiente es un ácido carboxílico orgánico individual, las concentraciones preferidas del excipiente serán de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM, y muy preferiblemente alrededor de 50 mM. En la modalidad, en donde el excipiente es ácido cítrico, las concentraciones preferidas del excipiente serán de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 200 mM, de preferencia alrededor de 25 mM a 75 mM, y muy preferiblemente alrededor de 50 mM. Cuando el ácido carboxílico orgánico se emplea en combinación con uno o más combinaciones adicionales, la combinación del ácido carboxílico orgánico puede ser menor que aproximadamente menor que 15 mM, particularmente tan bajo como aproximadamente 10 mM, y de preferencia es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM, preferiblemente alrededor de 15 mM a 75 mM y muy preferiblemente alrededor de 25 mM a 50 mM. En la modalidad en donde el excipiente es ácido fosfórico, la , -J.-,,.-*. ü. Jkík.1. i . .. concentración del excipiente típicamente será de aproximadamente 6 mM a aproximadamente 100 mM, sin considerar si el excipiente es empleado individualmente o en combinación con uno o más excipientes adicionales. En general, cuando el excipiente es un aminoácido, la concentración del aminoácido será de por lo menos alrededor de 5 mg/ml, de preferencia alrededor de 10 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, muy preferiblemente alrededor de 10 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, y muy preferiblemente de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, sin considerar sin considerar si el excipiente es empleado individualmente o en combinación con uno o más excipientes adicionales. En la modalidad de la invención, en donde el excipiente es un aminoácido individual, las concentraciones preferidas del excipiente serán de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, y preferiblemente alrededor de 10 mg/ml y aproximadamente 30 mg/ml, y muy preferiblemente alrededor de 12.5 mg/ml. En particular cuando el excipiente es glicina o lisina, las concentraciones preferidas del excipiente serán de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, muy preferiblemente de alrededor de 10 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml y muy preferiblemente de alrededor de 12.5 mg/ml. Cuando se emplea el aminoácido en combinación con uno o más excipientes adicionales, la concentración de aminoácido deberá ser menor que aproximadamente 5 mg/ml, particularmente tan baja ..-_-.-. i A-t.-L M como alrededor de 2 mg/ml, y es preferiblemente de alrededor de 5 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, mas preferiblemente de alrededor de 10 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml y muy preferiblemente alrededor de 12.5 mg/ml. La concentración de aminoácidos se proporciona en unidades de mg/ml para conveniencia, sin embargo, un experto en la técnica fácilmente puede calcular las concentraciones correspondientes de aminoácido en unidades de mM utilizando el peso molecular del aminoácido particular empleado. Por ejemplo, el peso molecular de la glicina es de 75 y por consiguiente, una concentración de 12.5 mg/ml de glicina corresponde a 166.5 mM. En la modalidad en donde el excipiente es una gente quelatador, la concentración del agente quelatador será de aproximadamente 0.02%, de preferencia alrededor de 0.02% a aproximadamente 1%, muy preferiblemente alrededor de 0.1% a aproximadamente 0.5%, sin considerar si el excipiente es empleado individualmente o en combinación con uno o más excipientes adicionales. En la modalidad de la invención, en donde el excipiente es un agente quelatador individual, las concentraciones preferidas del excipiente serán de aproximadamente 0.02% a aproximadamente 15, muy preferiblemente alrededor de 0.1% a aproximadamente 0.5%, y muy preferiblemente alrededor de 0.1%. En particular las concentraciones preferidas de EDTA serán de entre aproximadamente 0.02% y aproximadamente 1%, de preferencia alrededor de 0.1% a aproximadamente 0.5%, muy preferiblemente alrededor de 0.1%. Los porcentajes se basan en peso a menos que se indique otra cosa. Cuando se emplean en combinación con uno o más excipientes adicionales, la concentración de los agentes quelatadores preferiblemente es de aproximadamente 0.05% a aproximadamente 1%, y muy preferiblemente alrededor de 0.1%. La concentración de los agentes quelatadores se proporciona en unidades de %, para conveniencia, sin embargo un experto en la técnica fácilmente puede calcular las concentraciones correspondientes de los agentes quelatadores en unidades de mM utilizando el peso molecular del agente quelatador particular empleado. Por ejemplo, el peso molecular de EDTA (ácido libre) es de 292.2 y por consiguiente una concentración de 0.1% de EDTA corresponde a 2.69 mM. En la modalidad en donde el excipiente es albúmina, la concentración del excipiente típicamente será de aproximadamente 1 mg/ml, de preferencia alrededor de 1 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, muy preferiblemente alrededor de 5 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, y muy preferiblemente alrededor de 10 mg/ml sin considerar si el excipiente es empleado individualmente, o en combinación con uno o más excipientes adicionales Para ilustrar más las concentraciones especificas de los excipientes de acuerdo con la presente invención, se proporcionan las siguientes modalidades incluyendo dos o más excipientes. En una modalidad el excipiente es una combinación de ácido cítrico en una concentración de no mas de aproximadamente 15 mM, preferiblemente alrededor de 15 mM a 100 mM, y muy preferiblemente aproximadamente de 50 mM, y EDTA en una concentración de aproximadamente 0.02% a aproximadamente 1%, 5 de preferencia de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 0.5% y muy preferiblemente alrededor de 0.1%. En una modalidad preferida el excipiente es una combinación de ácido cítrico en una concentración de no menos de aproximadamente 15 mM, preferiblemente alrededor de 15 mM a 100 mM, y muy 10 preferiblemente aproximadamente de 50 mM, y el cloruro de calcio en una concentración de no menos de aproximadamente 15 mM, de preferencia de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM y muy preferiblemente alrededor de 50 mM. En una modalidad el excipiente es una combinación de ácido cítrico en una concentración 15 de no mas de aproximadamente 15 mM, preferiblemente alrededor de 15 mM a 100 mM, y muy preferiblemente aproximadamente de 50 mM, y glicina en una concentración de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, de preferencia de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml y muy preferiblemente alrededor 20 de 12.5 mg/ml. En una modalidad el excipiente es una combinación de ácido cítrico en una concentración de no menos de aproximadamente 15 mM, preferiblemente alrededor de 15 mM a 100 mM, y muy preferiblemente aproximadamente de 50 mM, y glicina en una concentración de aproximadamente glicina en una concentración 25 de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, de J^JJ**"t"jfc' . .-1 . -1 .,li-..t A ----la.-..,- ......? ..iijijl. preferencia de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml y muy preferiblemente alrededor de 12.5 mg/ml, y EDTA en una concentración de aproximadamente 0.02% a aproximadamente 1%, de preferencia de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 0.5% y muy preferiblemente alrededor de 0.1%. Otros ejemplos específicos de combinaciones de excipientes serán fácilmente determinados por aquellos expertos en la técnica basándose en la descripción anterior para determinar concentraciones apropiadas y estos ejemplos específicos.

D. Combinación del Liberador de histamina y el excipiente El paso de combinar una cantidad terapéuticamente efectiva del liberador de histamina con la concentración del excipiente puede realizarse a través de cualquier medio adecuado conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, el liberador de histamina y el excipiente pueden ser mezclados en fases sólidas. Alternativamente, ya sea el liberador de histamina o el excipiente puede ser solubilizado o suspendido en una diluyente fisiológicamente aceptable, adecuado, y el otro componente puede ser agregado al mismo y solubilizado o suspendido en el diluyente. En una modalidad preferida, el excipiente es solubilizado en un diluyente fisiológicamente aceptable y el liberador de histamina es agregado a la solución conteniendo el excipiente solubilizado ahí. Si se desea, para la optimización de la formulación (como se describe más adelante) el pH de la solución conteniendo un componente o -.'-..- ... 'A: i, .1 d iluyente, es decir, ya sea el excipiente o el liberador de histamina , puede ser aj ustado antes de la adición de otro componente. En una modalidad , el liberador de histamina y el excipiente se combinan solubilizando el excipiente en un d i luyente fisiológicamente 5 aceptable aj ustando el pH y después agregando el liberador de histamina al d iluyente y solubilizando en el mismo.

E. Métodos para Optimizar la Formulación con pH La ag regación del l iberador de histamina y la liberación de 10 histamina in vivo pueden ser efectuadas en algunas circunstancias a través del pH . El pH de la formulación que contiene liberador de histamina también j uega un papel importante en la carga, y estado iónico o capacidades de solvatación del liberador de histamina. En algunos casos el pH puede jugar un papel importante en la 15 estabilización física y/o q u ímica de ciertos de liberadores de histamina en solución . Por ejemplo, ciertos bloqueadores neuromusculares no esteroidales , ta les como el Compuesto 1 , se sabe q ue son más q u ímicamente estables a un pH ácido, preferi blemente u n pH de entre a proximadamente 2 y 5. Por estas 20 razones puede ser deseable o ventajoso en algunos casos evaluar soluciones y mezclas comparativas de diferente pH , con el propósito de optimizar las formulaciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención y para incrementar al máximo la supresión de la liberación de h istamina farmacéuticamente inducida . De esta 25 manera, de acuerdo con una moda lidad de la presente invención , la i n?w?ifaMlÉt-JII,ifc--' * " -**---«--* .,.«. - .. .... x± -¿z - íníit ?,j-. 11 formulación farmacéutica es optimizada para su pH. El método para optimizar la formulación farmacéutica para pH comprende los pasos de: a) medir la agregación del liberador de histamina en una solución de referencia consistiendo esencialmente de liberador de histamina en una concentración a o por arriba de la concentración de micela crítica en una solución acuosa; b) medir la agregación de liberador de histamina en una solución comparativa consistiendo esencialmente del liberador de histamina y una concentración preseleccionada del excipiente fisiológicamente aceptable en la solución acuosa, en donde la concentración del liberador de histamina en la solución comparativa es substancialmente la misma como la concentración del liberador de histamina en la solución de referencia y en donde la solución comparativa tiene un pH preseleccionado; c) opcionalmente repetir el paso b) una o más veces con una solución comparativa teniendo substancialmente la misma concentración o una concentración preseleccionada diferente del excipiente fisiológicamente aceptable y un pH preseleccionado diferente y d) identificar el pH de la solución comparativa que proporciona la reducción óptima en la agregación de liberador de histamina en una solución comparativa. El paso identificado del paso d) es el pH para preparar una formulación farmacéutica optimizada de acuerdo con la presente invención. De acuerdo con otra modalidad, la formulación farmacéutica preparada de acuerdo con los métodos de la presente invención, es optimizada para pH utilizando el método que comprenden los pasos de: a) medir la liberación de histamina a partir de una muestra biológica que contenga histamina en una mezcla de referencia consistiendo esencialmente de: i) la muestra biológica que contiene histamina en un medio y ii) una solución acuosa del liberador de 5 histamina a una concentración suficiente para ocasionar la liberación de histamina a partir de la muestra biológica que contiene histamina; b) medir la liberación de histamina a partir de la muestra biológica que contiene histamina en una mezcla comparativa que consiste esencialmente de: i) la muestra biológica que contiene 10 histamina en un medio y ii) una solución acuosa del liberador de histamina y una concentración preseleccionada del excipiente fisiológicamente aceptable, en donde el liberador de histamina de la mezcla comparativa está presente en una concentración que es substancialmente igual a la concentración del liberador de histamina 15 en la mezcla de referencia del paso a) y en donde la mezcla comparativa tiene un pH preseleccionado; c) opcionalmente repetir el paso b) una o más veces con una mezcla comparativa teniendo substancialmente la misma concentración o una concentración preseleccionada diferente del excipiente fisiológicamente aceptable 20 y un pH preseleccionado diferente, y d) identificar el pH de la mezcla comparativa que proporciona la reducción óptima de la liberación de histamina a partir de la muestra biológica que contiene histamina en la mezcla comparativa. El pH identificado del paso d) es el pH para preparar una formulación farmacéutica optimizada de 25 acuerdo con la presente invención.

Con base en los ejemplos precedentes, un experto en la técnica puede adaptar las enseñanzas anteriores para optimizar las formulaciones farmacéuticas de la presente invención sin considerar el método que es empleado para determinar la concentración del excipiente. La presente invención expresamente contempla la optimización de dichos métodos para optimizar el pH de las formulaciones farmacéuticas de la presente invención. La formulación farmacéutica óptima más bien, tomará en cuenta el efecto del pH de la formulación sobre la estabilidad del liberador de histamina particular en la formulación. Como se observó anteriormente, algunos liberadores de histamina son más estables física y/o químicamente a un pH ácido. Otros liberadores de histamina pueden ser más estables física y/o químicamente a un pH básico. Como será evidente para aquellos expertos en la técnica, las formulaciones farmacéuticas preparadas de acuerdo con los métodos de la presente invención se ajustarán para pH titulando formulaciones de liberador de histamina y excipiente fisiológicamente aceptable con un agente adecuado para ajustar el pH. Los agentes adecuados para ajustar el pH serán evidentes para aquellos expertos en la técnica y pueden incluir, por ejemplo, ácidos, bases, reguladores de pH y sales. Típicamente, el pH de las formulaciones farmacéuticas optimizadas de la presente invención será ajustado según sea necesario para obtener un pH de la formulación farmacéutica, que .,. . - .i_»--i.._k- .d..-t-. está entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10. En una modalidad preferida, el pH de la formulación farmacéutica optimizado será de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8. En una modalidad preferida, el pH de la formulación farmacéutica 5 optimizada será de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5, muy preferiblemente de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 4. En la modalidad de la presente invención, en donde el liberador de histamina es el compuesto 1, la formulación farmacéutica optimizada típicamente tendrá un pH de 10 aproximadamente 2 a aproximadamente 5, de preferencia alrededor de 2 a 4, y muy preferiblemente alrededor de 3. 4. Formulaciones Las formulaciones farmacéuticas preparadas de acuerdo con 15 cualquiera de los métodos anteriores de la presente invención pueden incluir solamente la cantidad terapéuticamente efectiva del liberador de histamina y la concentración del excipiente fisiológicamente aceptable. Sin embargo, en modalidades preferidas, las formulaciones farmacéuticas de la invención también incluyen un 20 diluyente o vehículo fisiológicamente aceptable. Es diluyente facilita el suministro del liberador de histamina y el excipiente al animal que se está tratando con lo mismo. La selección de un diluyente adecuado dependerá del tipo de formulación farmacéutica (por ejemplo, solución, dispersión, emulsión, etc.), y fácilmente se 25 determina por aquellos expertos en la técnica y ciencias I II riíiilliliiilliitliWii 1 I T ?í il I *"***" "--- - ' --——- -- - • • - - - «~* .— — • .-t-^-^, «É-AJ-L farmacéuticas. Las formulaciones farmacéuticas de la invención están en una forma adecuada para administración parenteral, y de preferencia en una forma adecuada para administración intravenosa. Las formulaciones adecuadas para administración intravenosa incluyen soluciones de inyección estériles acuosas, suspensiones estériles acuosas y no acuosas, y emulsiones estériles. Las soluciones de inyección estériles acuosas típicamente comprenden el liberador de histamina y el excipiente en un diluyente fisiológicamente aceptable tal como agua para inyección, cloruro de sodio para inyección, o dextrosa para inyección. Las soluciones de inyección estériles también pueden contener otros aditivos fisiológicamente aceptables, tales como otros ácidos (por ejemplo, ácido clorhídrico) y bases (por ejemplo, hidróxido de sodio) para el ajuste de pH, reguladores de pH y co-solventes. Ejemplos de cosolventes adecuados que pueden ser empleados en las formulaciones de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, etanol, glicol propilénico, alcohol bencílico, y combinaciones de los mismos. Otros aditivos adecuados serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. Se pueden preparar soluciones de inyección estériles utilizando técnicas convencionales de las ciencias farmacéuticas. Las suspensiones estériles acuosas y no acuosas pueden incluir, además del liberador de histamina, excipientes, diluyentes y aditivos previamente mencionados, agentes de suspensión y agentes _.-. . ,«„ .¿. .^A,., .. ,„. — .... .„._. , ., tt,^--- ^....^A-.t ^MitmáiiiL espesantes, y liposomas y otros sistemas en micro partículas. Las suspensiones estériles no acuosas pueden emplear agua, parabenes, glicerol, aceite de soya, aceite de girasol y similares, y también combinaciones del los mismos como el eluyente. Las suspensiones pueden ser preparadas utilizando técnicas conocidas en el campo de ciencias farmacéuticas. Las emulsiones estériles pueden incluir emulsiones de aceite en agua y emulsiones de agua en aceite. Las emulsiones pueden incluir glicerol, aceite de soya, aceite de girasol, y similares, y combinaciones de los mismos como la fase de aceite. Las emulsiones estériles pueden ser preparadas utilizando técnicas conocidas en el campo de las ciencias farmacéuticas. Las emulsiones pueden incluir los otros aditivos previamente mencionados también. Las formulaciones también pueden ser presentadas como sólidos liofilizados para reconstitución, Dichas formulaciones liofilizadas típicamente son reconstituidas con agua para inyección, cloruro de sodio para inyección o solución de dextrosa. Las formulaciones liofilizadas pueden incluir agentes proporcionadores de volumen de liofilización convencionales tales como ß-ciclodextrina y lactosa. Dichas formulaciones típicamente son presentadas en formas de dosis unitarias tales como frascos o dispositivos de inyección desechable. También pueden estar presentes en formas de dosis múltiples tales como una botella a partir de la cual la dosis apropiada puede ser extraída. Todas estas .,... , ....-. m , y *. ... ?A Í formulaciones deben ser estériles. La dosis apropiada del liberador de histamina para incluirse en las formulaciones de la invención dependerá del liberador de histamina particular y el efecto terapéutico deseado, Ventajosamente, se pueden dosis convencionales de estos agentes en los métodos y formulaciones de la presente invención. Las formulaciones preferidas de la presente invención incluyen un bloqueador neuromuscular, muy preferiblemente el compuesto 1, como el liberador de histamina y uno o más excipientes, en una forma adecuada para administración intravenosa. Los excipientes preferidos para utilizarse en las formulaciones de la presente invención se pueden seleccionar del grupo que consiste de sales inorgánicas divalentes, ácidos carboxílicos inorgánicos, ácido fosfórico, aminoácidos, agentes quelatadores, albúminas y combinaciones de los mismos. Muy preferiblemente, la formulación también incluye un diluyente seleccionado del grupo que consiste de agua para inyección, cloruro de sodio para inyección y soluciones de dextrosa. La concentración del bloqueador neuromuscular es típicamente de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 55 mM. La concentración apropiada del excipiente se determina de acuerdo con los métodos precedentes. En una modalidad preferida, la formulación comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de (Z)-2-Cloro-1-{3-{(1 R,2S)-6,7-dimetoxi-2-metil-1-[(3,4,5,-trimetoxifenil)metil)-1,2,3,4-tetrahidro-2-isoq uinilinio}propi l}-4-{3-[(1S, 2 R)-6, 7-di metoxi-2-metil-1 -(3,4,5- '" •***-* --- *"- tri metoxif enil)- 1,2, 3,4-tetrahidro-2-isoquin ili nio]propil}-2-butanodioato diclorhidrato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con ácido cítrico en una concentración de aproximadamente 25 a aproximadamente 75 mM, muy preferiblemente alrededor de 50 mM. En una modalidad, la formulación comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de (Z)-2-Cloro-1-{3-{(1 R,2S)-6,7-dimetox¡-2-metil-1-[(3,4,5,-trimetoxifenil)metil)-1,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinilinio}propil}-4-{3-[(1S,2R)-6,7-dimetoxi-2-metil-1-(3,4,5-trimetoxifenil)-1 ,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinilinio]propil}-2-butanodioato diclorhidrato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con EDTA en una concentración de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 0.5%, muy preferiblemente alrededor de 0.1%. En una modalidad, la formulación comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de (Z)-2-Cloro-1 -{3-{(1 R,2S)-6,7-dimetoxi-2-metil- 1 -[(3,4,5 ,-tri metoxif eni l)metil)- 1,2, 3,4-tetrahidro-2-isoquinilinio}propil}-4-{3-[(1S,2R)-6,7-dimetoxi-2-metil-1-(3,4,5-trimetoxifenil)-1,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinilinio]propil}-2-butanodioato diclorhidrato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con una combinación de ácido cítrico en una concentración de aproximadamente 25 a aproximadamente 75 mM, muy preferiblemente alrededor de 50 mM, y EDTA en una concentración de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 0.5%, muy preferiblemente alrededor de 0.1%.

J Jtá.?ai L.1 En una modalidad, la formulación comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de (Z)-2-Cloro-1-{3-{(1 R,2S)-6,7-dimetoxi- 2-metil-1-[(3,4,5,-trimetoxifenil)metil)-1,2,3,4-tetrahidro-2- isoquinilinio}propil}-4-{3-[(1 S,2R)-6,7-dimetoxi-2-metil-1 -(3,4,5- trimetoxifenil)-1 ,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinilinio]propil}-2- butanodioato diclorhidrato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con cloruro de calcio en una concentración de aproximadamente 25 a aproximadamente 75 mM, muy preferiblemente alrededor de 50 mM. En una modalidad, la formulación comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de (Z)-2-Cloro-1-{3-{(1 R,2S)-6,7-dimetoxi- 2-metil- 1 -[(3,4, 5,-trimetoxifenil)metil)- 1,2,3, 4-tetrahidro-2- isoquinilinio}propil}-4-{3-[(1S,2R)-6,7-dimetoxi-2-metil-1-(3,4,5- trimetoxifenil)-1,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinilinio]propil}-2- butanodioato diclorhidrato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con una combinación de ácido cítrico en una concentración de aproximadamente 25 a aproximadamente 75 mM, muy preferiblemente alrededor de 50 mM y cloruro de calcio en una concentración de aproximadamente 25 a aproximadamente 75 mM, muy preferiblemente alrededor de 50 mM. En una modalidad, la formulación comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de (Z)-2-Cloro-1-{3-{(1 R,2S)-6,7-dimetoxi- 2-metil-1-[(3,4,5,-trimetoxifenil)metil)-1,2,3,4-tetrahidro-2- isoquinilinio}propil}-4-{3-[(1S,2R)-6,7-dimetoxi-2-metil-1 -(3,4,5- trimetoxifenil)-1 ,2,3,4-tetrahidro-2-¡soquinilinio]propil}-2- butanodioato diclorhidrato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con glicina en una concentración de aproximadamente 10 mg/ml, a aproximadamente 30 mg/ml, de preferencia alrededor de 12.5 mg/ml. En una modalidad, la formulación comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de (Z)-2-Cloro-1-{3-{(1 R,2S)-6,7-dimetoxi- 2-metil-1-[(3,4,5,-trimetoxifenil)metil)-1 ,2,3,4-tetrahidro-2- isoquinilinio}propil}-4-{3-[(1S,2R)-6,7-dimetoxi-2-metil-1-(3,4,5-trimetoxifenil)-1 ,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinilinio]propil}-2-butanodioato diclorhidrato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con una combinación de glicina en una concentración de aproximadamente 10 mg/ml, a aproximadamente 30 mg/ml, de preferencia alrededor de 12.5 mg/ml y EDTA en una concentración de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 0.5%, muy preferiblemente alrededor de 0.1%. En una modalidad, la formulación comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de (Z)-2-Cloro-1-{3-{(1 R,2S)-6,7-dimetoxi-2-metil-1-[(3,4,5,-trimetoxifenil)metil)-1,2,3,4-tetrahidro-2-isoq u ini lin io}propil}-4-{3-[(1S,2R)-6, 7-di metoxi-2-meti 1-1 -(3,4,5-trimetoxifenil)-1,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinilinio]propil}-2-butanodioato diclorhidrato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con una combinación de glicina en una concentración de aproximadamente 10 mg/ml, a aproximadamente 30 mg/ml, de preferencia alrededor de 12.5 mg/ml y ácido cítrico en una concentración de aproximadamente 25 a aproximadamente 75 mM, . . .. . i..í.A..i..t.z... ......... .. . .. - - - .,... '**-* A*.A.I~* muy preferiblemente alrededor de 50 mM. En una modalidad, la formulación comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de (Z)-2-Cloro-1-{3-{(1 R,2S)-6,7-dimetoxi-2-meti 1-1 -[(3,4,5, -tp metoxif eni l)met¡ I)- 1,2,3, 4-tetrahidro-2-isoquinilinio}propil}-4-{3-[(1S,2R)-6,7-dimetoxi-2-metil-1-(3,4,5-trimetoxifenil)-1 ,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinilinio]propil}-2-butanodioato diclorhidrato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con una combinación de glicina en una concentración de aproximadamente 10 mg/ml, a aproximadamente 30 mg/ml, de preferencia alrededor de 12.5 mg/ml, ácido cítrico en una concentración de aproximadamente 25 a aproximadamente 75 mM, muy preferiblemente alrededor de 50 mM y EDTA en una concentración de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 0.5%, muy preferiblemente alrededor de 0.1%. Particularmente preferidos de los ejemplos específicos anteriores de formulaciones farmacéuticas son formulaciones que tienen un pH de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5, muy preferiblemente de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 4, y de preferencia alrededor de 3. En las formulaciones observadas anteriormente, el ajuste de pH a las escalas observadas puede o no se necesario dependiendo de los excipientes particulares y concentraciones empleadas.

V. Métodos para suprimir la liberación de histamina La presente invención también proporciona métodos para i ..... ...» te- l--. -4.,. I suprimir la liberación de histamina farmacéuticamente inducida en un animal que se está tratando con un liberador de histamina. La "liberación de histamina farmacéuticamente inducida" como se utiliza en la presente, se refiere a la liberación de histamina in vivo la cual es inducida o por lo menos parcialmente causada por la rápida administración de bolo intravenosa o rápida infusión de un liberador de histamina. La liberación de histamina farmacéuticamente inducida se describe en Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9a. edición, McGraw-Hill, New York, (1996), pp. 581-593. Como se utiliza en la presente, para "suprimir la liberación de histamina farmacéuticamente inducida" representa prevenir substancialmente y completamente la liberación de histamina o reducir la cantidad o la velocidad de liberación de histamina a partir de células, tejidos o fluidos que contienen histamina in vitro después de la exposición a un liberador de histamina; o para prevenir substancial y completamente la liberación de histamina o reducir la cantidad o la velocidad de liberación de de histamina a partir de células, tejidos o fluidos que contienen histamina in vivo, después de la administración de una formulación que contiene un liberador de histamina a un animal. Más específicamente, "supresión de liberación de histamina farmacéuticamente inducida" in vivo, se refiere a la supresión de liberación de histamina in vivo después de administración intravenosa de un liberador de histamina como un bolo rápida o infusión rápida. La supresión de liberación de ¿a ae. ¿Éi¿j. I .1 histamina farmacéuticamente inducida puede ser observada cualitativa y/o cuantitativamente. La liberación de histamina farmacéuticamente inducida puede ser cualitativamente observada administrando intravenosamente un 5 bolo rápido o una infusión rápida del liberador de histamina al animal y observando las manifestaciones físicas descritas anteriormente, las cuales están asociadas con concentraciones elevadas de histamina en el plasma y/o tejido. La supresión de liberación de histamina farmacéuticamente inducida, por lo tanto, es 10 cualitativamente observada administrando intravenosamente al animal que se está tratando, un bolo rápido o infusión rápida de cualquiera de las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, y observando comparativamente manifestaciones fisiológicas menos severas, o aún ausencia de las manifestaciones 15 fisiológicas asociadas con niveles de histamina elevados en el plasma y/o tejido. La supresión de liberación de histamina farmacéuticamente inducida puede ser cuantitativamente observada administrando intravenosamente al animal que se está tratando un bolo rápido o 20 infusión rápida de la formulación farmacéutica de acuerdo con la presente invención y observando y midiendo los niveles de histamina en el plasma y/o tejido presentes en el animal después de la administración. Los niveles de histamina en el plasma presentes en el animal después de la administración pueden ser medidos tomando 25 una muestra sanguínea del animal después de la administración de pr?tf? <---li_--rj"*" • - '• • '"-> • - ..-- -. --tt-*M-t--i-. la formulación farmacéutica. La muestra sanguínea preferiblemente es extraída de la región en o cerca del sitio de administración de la formulación farmacéutica. Los niveles de histamina en el tejido presentes en el animal después de la administración pueden ser 5 medidos tomando una muestra de tejido del animal después de la administración de la formulación farmacéutica. La muestra preferiblemente es tomada de la región en o cerca del sitio de administración de la formulación farmacéutica. Los niveles de histamina presentes ya sea en la muestra del plasma del tejido 10 pueden ser medidos utilizando las técnicas descritas anteriormente para detectar la liberación de histamina a partir de una muestra biológica, por ejemplo, ensayos de ELISA, RÍA, y fluorométricos. En general, los métodos para suprimir la liberación de histamina farmacéuticamente inducida en animal que se está 15 tratando con un liberador de histamina, comprenden administrar al animal, cualquier formulación farmacéutica de acuerdo con al presente invención. En métodos preferidos, la formulación farmacéutica incluirá un excipiente seleccionado del grupo que consiste de sales inorgánicas divalentes, ácidos carboxílicos 20 inorgánicos, ácido fosfórico aminoácidos, agentes quelatadores, albúminas y combinaciones de los mismos. El paso de administrar comprende administrar parenteralmente la formulación farmacéutica al animal, muy preferiblemente administrar intravenosamente la formulación farmacéutica y de 25 preferencia administrar intravenosamente la formulación ,,-^^^yym^^?í . . . .. . i. ....i.,. ... .,.,„ ; A-J..I.Í-.J.J farmacéutica como un bolo rápido o infusión rápida. Las formulaciones de la presente invención ventajosamente permiten la administración intravenosa como un bolo rápido o infusión rápida, mientras suprimen la liberación concomitante de histamina que 5 típicamente es observada con administraciones de formulaciones convencionales de liberadores de histamina a través de esta técnica. Más específicamente, un método para supresión de liberación de histamina farmacéuticamente inducida en un animal que se está 10 tratando con un liberador de histamina, comprende administrar a un animal con la necesidad de lo mismo, una formulación farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del liberador de histamina y una concentración del excipiente fisiológicamente aceptable, dicha concentración, cuando se combina en una solución 15 acuosa con el liberador de histamina a o por arriba de la concentración de micela crítica es suficiente para reducir la agregación de liberador de histamina en la solución acuosa por lo menos aproximadamente un 25% comparado con la agregación del liberador de histamina en una solución acuosa que contiene 20 substancialmente nada de excipiente fisiológicamente aceptable. Otro método para supresión de liberación de histamina farmacéuticamente inducida en un animal que se está tratando con un liberador de histamina, comprende administrar a un animal con la necesidad de lo mismo, una formulación farmacéutica que 25 comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del liberador de histamina y una concentración del excipiente fisiológicamente aceptable, dicha concentración es determinada a través del método que comprende los pasos de: a) medir la agregación del liberador de histamina en una solución de referencia consistiendo esencialmente 5 de liberador de histamina en una concentración a o por arriba de la concentración de micela crítica en una solución acuosa; b) medir la agregación de liberador de histamina en una solución comparativa consistiendo esencialmente del liberador de histamina y una concentración preseleccionada del excipiente fisiológicamente 10 aceptable en la solución acuosa, en donde la concentración del liberador de histamina en la solución comparativa es substancialmente igual a la concentración del liberador de histamina en la solución de referencia; c) opcionalmente repetir el paso b) una o más veces con una solución comparativa teniendo una 15 concentración preseleccionada diferente del excipiente fisiológicamente aceptable; d) identificar una concentración del excipiente fisiológicamente aceptable que sea suficiente para reducir la agregación de liberador de histamina en una solución comparativa aproximadamente por lo menos en un 25% comparado 20 con la agregación de liberador de histamina en la solución de referencia; en donde la concentración identificada del paso d) es la concentración del excipiente fisiológicamente aceptable que es suficiente para suprimir la liberación de histamina farmacéuticamente inducida en un animal que se está tratando con 25 un liberador de histamina y es la concentración del excipiente fisiológicamente aceptable para combinarse con el liberador de histamina para preparar la formulación farmacéutica para administrarse al animal que se está tratando con lo mismo. Otro método para suprimir la liberación de histamina farmacéuticamente inducida en un animal que se está tratando con un liberador de histamina, comprende administrar a un animal con la necesidad de lo mismo, una formulación farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del liberador de histamina y una concentración del excipiente fisiológicamente aceptable, dicha concentración es determinada a través del método que comprende los pasos de: a) medir la liberación de histamina a partir de una muestra biológica que contenga histamina en una mezcla de referencia, b) medir la liberación de histamina a partir de la muestra biológica que contiene histamina en una mezcla comparativa, c) opcionalmente repetir el paso b) una o más veces con una mezcla comparativa teniendo una concentración preseleccionada diferente del excipiente fisiológicamente aceptable; y d) identificar una concentración del excipiente fisiológicamente aceptable suficiente para reducir la liberación de histamina a partir de la muestra biológica que contiene histamina en la mezcla comparativa aproximadamente por lo menos en un 10% comparado con la liberación de histamina de la muestra biológica que contiene histamina de la mezcla de referencia; en donde la concentración identificada del paso d) es la concentración del excipiente fisiológicamente aceptable para combinarse con el liberador de * 4 . ^^^^ -..-un, --.--.: histamina para preparar la formulación farmacéutica. La mezcla de referencia consiste esencialmente de: i) la muestra biológica que contiene histamina en un medio y ii) una solución acuosa del liberador de histamina y una concentración suficiente par ocasionar la liberación de histamina a partir de la muestra biológica que contiene histamina. La mezcla comparativa consiste esencialmente de: i) la muestra biológica que contiene histamina en un medio y ii) una solución acuosa del liberador de histamina y una concentración preseleccionada del excipiente fisiológicamente aceptable, en donde el liberador de histamina en la mezcla comparativa está presente en una concentración que es substancialmente igual a la concentración de liberador de histamina en la mezcla de referencia del paso a). La liberación de histamina in vivo puede ser activada en forma diferente entre y aún dentro de la especie del animal (por ejemplo, pueden estar involucrados diferentes sitios y diferentes animales pueden tener diferentes sensibilidades). Por consiguiente, los métodos de tratamiento pueden ser optimizados por algún experto en la técnica para alguna especie particular o sujeto individual. Los métodos de tratamiento son útiles para el tratamiento de una variedad de animales, preferiblemente mamíferos, incluyendo seres humanos, perros, y primates (por ejemplo, monos) y muy preferiblemente seres humanos. La presente invención también comprende métodos para prevenir efectos cardiovasculares y respiratorios mediados por liberación de histamina farmacéuticamente inducida en un animal ----- *- ?.t.í.At.,^.,. que está siendo tratado con un liberador de histamina. Los "efectos cardiovasculares y respiratorios mediados por la liberación de histamina farmacéuticamente inducida" como se utiliza en la presente, se refiere a efectos cardiovasculares y respiratorios 5 inducidos por niveles de histamina elevados en el plasma y/o tejido, es decir, niveles de histamina en el plasma o tejido por arriba de los niveles fisiológicos normales. Dichos efectos cardiovasculares y respiratorios inducidos por histamina pueden incluir, pero no se limitan, enrojecimiento, hipotensión, taquicardia, broncoconstricción, 10 reacciones anafilactoides, y choque anafiláctico, y combinaciones de cualquiera de dos o más de los anteriores. Los términos "prevenir" o "prevención", como se utilizan en la presente, con referencia a una condición particular se refieren a una reducción en la incidencia y/o severidad de la condición, así como 15 evitar la condición. El método para prevenir efectos cardiovasculares mediados por la liberación de histamina farmacéuticamente inducida en un animal que se está tratando con un liberador de histamina, comprende administrar a un animal cualquier formulación 20 farmacéutica de acuerdo con la presente invención. Al suprimir la liberación de histamina típicamente inducida por el bolo rápido intravenoso o administración de infusión rápida de un liberador de histamina, los efectos cardiovasculares indeseables que resultan de los niveles elevados de histamina en el plasma y tejido son 5 prevenidos. ^^&n j ..t A„.Í^£á *A i. -^_ VI. Equipos La presente invención también incluye un equipo útil para la preparación de formulaciones farmacéuticas de liberadores de histamina de acuerdo con la presente invención. El equipo 5 comprende: a) un excipiente fisiológicamente aceptable y b) instrucciones para preparar la formulación farmacéutica de acuerdo con la presente invención. El excipiente preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de sales inorgánicas divalentes, ácidos carboxílicos inorgánicos, ácido fosfórico, aminoácidos, 10 agentes quelatadores, albúminas y sus combinaciones. Muy preferiblemente el excipiente fisiológicamente aceptable se selecciona del grupo que consiste de cloruro de calcio, sulfato de magnesio, cloruro de magnesio, sulfato de sodio, ácido tartárico, ácido maleico, ácido acético, ácido cítrico, ácido succínico, ácido 15 glucurónico, ácido fosfórico, glicina, lisina, arginina, EDTA, albúmina de suero de bovino, albúmina de suero humano y combinaciones de los mismos. Las instrucciones incluyen instrucciones para combinar el liberador de histamina con la concentración del excipiente con el fin 20 de preparar cualquiera de las formulaciones farmacéuticas de la presente invención. Más específicamente, las instrucciones pueden incluir instrucciones para combinar el liberador de histamina con una concentración del excipiente que es suficiente, cuando se combina en una solución acuosa con el liberador de histamina a o por arriba 25 de la concentración crítica de micela para reducir la concentración ??mrfi?gnPll?rl*'*t • ' *• ' --"*' ' •"" ":> - - • ~ " * - ~ - - •-"*-- -^-* j y^ de liberador de histamina en la solución acuosa por lo menos en aproximadamente un 25% comparado con la agregación del liberador de histamina en la solución acuosa que contiene substanciaimente nada de excipiente fisiológicamente aceptable. Las instrucciones pueden incluir instrucciones para combinar el liberador de histamina con el excipiente en concentraciones suficientes para suprimir la liberación de histamina farmacéuticamente inducida del animal que está siendo tratado con el liberador de histamina. En una modalidad preferida, las instrucciones incluirán la cantidad precisa del liberador de histamina requerida para lograr el efecto terapéutico deseado de diagnóstico o médico, dicha cantidad será especifica para el liberador de histamina particular empleado. De esta manera, las instrucciones pueden incluir cantidades específicas para varios liberadores de histamina específicos diferentes, dicha cantidad específica para cada liberador de histamina específico es una cantidad terapéuticamente efectiva. En otra modalidad preferida, las instrucciones incluirán la cantidad precisa de excipiente para combinarse con el liberador de histamina, dicha cantidad será específica para el excipiente particular o combinación de excipientes para utilizarse con el liberador de histamina particular, con el excipiente que será combinado para preparar la formulación farmacéutica. La cantidad del excipiente provisto, habiendo sido determinado utilizando cualquiera de uno o más de los métodos de la presente invención para determinar la concentración del excipiente para combinarse con el liberador de histamina para preparar la formulación farmacéutica.

El equipo también puede incluir el liberador de histamina. En esta modalidad, las instrucciones incluyen instrucciones para preparar una formulación farmacéutica de acuerdo con la presente invención combinando una cantidad terapéuticamente efectiva del liberador de histamina provisto con una concentración del excipiente que es suficiente para suprimir la liberación de histamina farmacéuticamente inducida del animal que está siendo tratado con el liberador de histamina y a quien ser administrará la formulación preparada. En una modalidad preferido, el equipo incluye el liberador de histamina, (Z)-2-Cloro-1-{3-{(1 R,2S)-6,7-dimetoxi-2-metil-1-[(3,4,5,-trimetoxifenil)metil)-1,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinilinio}propil}-4-{3-[(1S,2R)-6,7-dimetoxi-2-metil-1-(3,4,5-trimetoxifenil)-1,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinilinio]propil}-2-butanodioato diclorhidrato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Dependiendo de liberador de histamina particular y los excipientes empleados en la preparación de la formulación farmacéutica, las instrucciones también pueden incluir instrucciones para ajustar el pH de la formulación farmacéutica de aproximadamente 2 a aproximadamente 8, de preferencia alrededor de 2 a aproximadamente 5, y muy preferiblemente alrededor de 3. El equipo también puede incluir componentes adicionales. Por ejemplo el equipo también puede incluir un diluyente fisiológicamente aceptable para solubilizar y/o reconstituir el .._...» .fc ..Í.itj liberador de histamina y el excipiente fisiológicamente aceptable. En esta modalidad, las instrucciones incluyen instrucciones para combinar el liberador de histamina y el excipiente fisiológicamente aceptable en el diluyente. Como otro ejemplo, el equipo puede incluir uno o más contenedores para combinar el liberador de histamina y el excipiente. Los siguientes ejemplos están destinados para ilustrar solamente y no pretenden limitar el alcance de la invención, la invención siendo definida por las reivindicaciones. Como se utiliza en la presente: "mM" representa milimolares; "nM" representa nanomolar; "mg/ml" representa miligramos por mililitro; "%" representa porcentaje por peso; "NaCI" representa cloruro de sodio; "D2O" representa agua deuterizada; "salina de D2O" representa solución salina deuterizada; "NaO2", representa hidróxido de sodio deuterizado; "DCI" significa ácido clorhídrico deuterizado; "d4-citrato" representa ácido cítrico deuterizado; "CaCI2" significa cloruro de calcio; "pD" significa pH no corregido para el efecto de isótopo de deuterio; "µl" significa microlitros; "µm" representa micrómetros; "MHz" representa megahertz; "ppm" representa partes por millón; "°C" representa grados centígrados; "mmHg" representa milímetros de mercurio; y "Compuesto 1" representa (Z)-2-Cloro-1-{3-{(1 R,2S)-6, 7-dimetoxi-2-metil-1 -[(3,4,5, -trimetoxifenil)metil)-1 ,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinilínio}propil}-4-{3-[(1S,2R)-6,7-dimetoxi-2-metil-1-(3,4,5-trimetoxifenil)-1,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinilinio]propil}-2-butanodioato diclorhidrato o una ^Ma_^^-^--fa>ddi?Í--i ^yySt^.?-Á?.A,, sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

EJEMPLO 1 Análisis de Tensión de Superficie Las propiedades de tensión de superficie del agente de liberación de histamina pueden ser evaluadas utilizando el método de anillo de DuNouy. Este y otros métodos para evaluar las propiedades de tensión de superficie se describen en la literatura. Ver, Physical Pharmacy: Physical Chemical Principies in the Pharmaceutical Sciences, Editores: Alfred Martin, James Swarbrick, Arthur Cammarata, Tercera Edición, Lea & Febiger, Philadelphia, 1983. El tensiómetro de DuNouy, comercialmente disponible de Cruz GMBH, Hamburgo, Alemania, se utilizó para medir la tensión de superficie y de superficie colindante de líquidos. El principio del instrumento depende del hecho de que la fuerza necesaria para separar un anillo de platino- iridio sumergido en la superficie es proporcional a la tensión de superficie. La fuerza requerida para separar el anillo de esta manera es provista por un cable de torsión y es grabada en dinas en un marcador calibrado. La tensión de superficie es dada por la fórmula: ? = lectura de marcación en dinas 2 x circunferencia de anillo x factor de corrección j y^ --.-¿-.It--. it-U-t en donde la circunferencia de anillo y el factor de corrección son específicos al equipo. La tensión de superficie de la mayoría de los líquidos se reduce casi linealmente con un incremento en la temperatura, y de esta manera es necesario controlar la temperatura del sistema cuando se realizan determinaciones de tensión de superficie. El tensiómetro es calibrado con agua filtrada y la tensión de superficie de una solución de 50 mg/ml del compuesto 1 en agua se evalúa a temperatura ambiente. La solución es diluida para obtener soluciones que tienen las siguientes concentraciones (mg/ml) del Compuesto 1: 47.5, 45, 42.5, 40, 37.5, 35, 32.5, 30, 27.5, 22.5, 20, 17.5, 15, 12.5, 10, 5, 3, 2, y 1. La tensión de superficie de cada solución se evalúa temperatura ambiente y los resultados se registran en una curva de tensión de superficie (eje y) contra la concentración del fármaco (eje x). Los resultados de registran en la Figura 1. La Figura 1 indica que el Compuesto 1 es un activo en la superficie a dosis terapéuticamente efectivas y revela la concentración que depende de la concentración de tensión de superficie. Haciendo referencia a la Figura 1, el cambio en la pendiente de la gráfica de tensión de superficie con la concentración en incremento del compuesto 1, que ocurre a aproximadamente 15-17.5 mg/ml indica la concentración de micela crítica del Compuesto 1, EJEMPLO 2 Análisis de NMR de Protón A. Procedimientos Generales 5 Se disolvieron el Compuesto 1 y el excipiente (en las varias cantidades observadas más adelante) en 200 ml µl de D2O con 0.15 M de NaCI ajustado a pD 3.0 con NaOD y /o DCI por razones de estabilidad del compuesto. Se utilizó una solución salina deuterizada en la solución de referencia debido a los picos del 10 compuesto críticos (o señales) se traslapan cuando se emplea agua deuterizada. Las muestras en una serie de titulación se prepararon a través de diluciones en serie. Todos los espectros de NMR se grabaron a 30°C en un espectrómetro de 500 MHz Varían Utility Plus. Los espectros se referenciaron a D2O a 4.65 ppm. Todos los 15 espectros se procesaron utilizando software Varían VNMR® v6.1a. Se midieron las velocidades de relajación Ti y T2 utilizando la inversión-recuperación estándar y experimentos de Carr-Purcell- Meiboom-Gill (CPMG) respectivamente, ambos están provistos con software Varian. Los experimentos CPMG están descritos en M. 20 Bulsing y otros, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1201-3 (1981); R. Freeman y otros, In Dynamic NMR Spectroscopy, eds. L. Jackman y F. Cotton (1975) pp 131-162, Academic Press, Londres y Nueva York; y D. Rabenstein, y otros, J. Magn. Reson. 64:541-546 (1985). 25 -i(jajii?á-e-<--B---i---i . .-. ,» -..... t,....i - . .,».,.

B. Determinación de la Concentración del Compuesto 1 para la Solución de Referencia Se preparó una serie de soluciones con concentraciones en aumento del Compuesto 1 en D2O salina, pD 3.0 y se midieron las constantes de velocidad de relajación de NMR. Tanto TiS como T2s se midieron ya que el fármaco, con un peso molecular de 1064.51, puede yacer fuera del límite de estrechamiento de movimiento extremo para NMR, en cualquier caso, As puede esperarse que se reduzca y se puede esperar que T2s se incremente con una reducción en agregación. Ver, K. Wüthrich, NMR of Proteins and Nucleic Acids, (1986) John Wiley & Sons, Nueva York. Sin embargo, los datos muestran un incremento tanto en As como en T2s con una agregación en reducción, indicando que el fármaco sigue dentro del límite de estrechamiento de movimiento extremo bajo estas condiciones. El Cuadro 1 resume los valores de Ti y T2 para el protón de vinilo del Compuesto 1, el cual está localizado en el centro de la molécula y se observa para exhibir los cambios más grandes.

CUADRO 1 -fe .. ^ -^ sjt fal .-J.-.I Los datos muestran que los valores tanto de T. como de T2 cambian a medida que la concentración del fármaco se incrementa. Aunque se puede intentar atribuir una porción del cambio en T^ y T2 a un incremento esperado en la viscosidad de la solución con una concentración en incremento del fármaco (esto fue observado visualmente), dicho cambio podría ser lineal en proporción al cambio en la concentración de fármaco. Los datos muestran un cambio relativamente pequeño en los valores de T. y T2 entre 10-40 mM de fármaco, una aguda reducción en Ti y T2 de entre 40-80 mM del fármaco y una reducción más pequeña en Ti y T2 de entre 80-60 mM del fármaco. La aguda reducción de Ti y T2 es una evidencia de que la concentración crítica de micela del compuesto 1 en salina D2O es entre 40-80 nM. Por esta razón, se seleccionó una concentración de 80 mM se seleccionó como la concentración del fármaco para la solución de referencia.

C. Excipiente de Prueba: Ácido Cítrico Se preparó una serie de soluciones conteniendo 80 mM del compuesto 1 con concentraciones en incremento de d4-citrato en salina D2O, pD 3.0, y se midieron las velocidades de relajación de NMR. Los datos obtenidos se resumen en el Cuadro 2 y se reportan gráficamente en la Figura 2. - . «-.a» A«-k-t.lt--i, CUADRO 2 Los datos muestran que los valores tanto de Ti como de T2 se incrementan con la concentración en aumento de d4-citrato. Esta tendencia es indicativa de la agregación en disminución con un efecto máximo obtenido a 50 mM de d4-citrato. Los cambios de viscosidad son discontinuados ya que tienen un efecto mínimo en lo valores de T, y T2 medidos, ya que no se observa ningún cambio visible en la viscosidad y no se espera que la adición de d4-citrato a una solución acuosa en estas concentraciones podrían substancialmente alterar la viscosidad. Los datos muestran que una concentración de 50 mM de d - citrato exhibieron velocidades de relajación de por lo menos 25% más lentas que la velocidad de relajación de la solución de referencia conteniendo la misma concentración de fármaco (un tiempo más largo en segundos para los valores T. y T2 medidos es indicativo de una velocidad de relajación más lenta, lo cual es Indicativo de una agregación reducida o disminuida). De esta manera, el ácido cítrico a una concentración de 50 mM es un excipiente adecuado para reducir la agregación del compuesto 1 en solución.

D. Excipiente de Prueba: Ácido Cítrico + Cloruro de Calcio Se preparó una serie de soluciones conteniendo 80 mM del compuesto 1 y concentraciones variables de CaCI2 y d4-citrato en salina D2O, pD 3.0, y se midieron las velocidades de relajación de NMR. Los datos obtenidos se resumen en el Cuadro 3.

CUADRO 3 Como se puede ver a partir de los datos, todas, solo dos concentraciones mas bajas CaCI2 producen un cambio en el valor de Ti (es decir, una disminución de la velocidad de relajación), el cual el mayor que 25% según comparado con la velocidad de la relajación de solución de referencia conteniendo la misma concentración del compuesto 1. Este resultado indica que combinaciones de cloruro de calcio y ácido cítrico a estas concentraciones son suficientes para reducir la agregación del compuesto 1 por lo menos en un 25% aproximadamente. Los resultados obtenidos indican que los excipientes a las concentraciones indicadas que producen un cambio en el valor de T (es decir, una disminución de la velocidad de relajación) que es mayor que 25% según comparado con la velocidad de relajación de la solución de referencia conteniendo la misma concentración de fármaco. Este resultado indica que estos experimentos y combinaciones de excipiente son suficientes para reducir la agregación del compuesto 1 en solución por lo menos en aproximadamente un 25%.

EJEMPLO 3 Estudios de Célula 2H3 de Leucemia Basofílica en Ratas (RBL) in Vitro La histamina liberada por el compuesto 1, en ausencia y presencia de excipientes agregados utilizando células 2H3 de leucemia de basófilo de rata (RBL) fue evaluada. Las células 2H3 de RBL son una línea de célula cebada de rata que almacena histamina preformada. Las células 2H3 de RBL (8 x 104 células) son sembradas en una placa de 96 cavidades durante la noche y se trataron con una formulación conteniendo 160 mM del compuesto 1 y varias concentraciones de ácido cítrico (0, 5, 10, 25 y 50 mM) en agua destilada a un pH de 3 durante 30 minutos a 37°C antes de recoger el medio libre de células. El control, utilizando los mismos ,A A-J?Á.i.i-i- cultivos de célula en el mismo día, involucra exponer las células a una formulación conteniendo 160 mM de fármaco y 0 mM de ácido cítrico en agua destilada a un pH de 3. La histamina es cuantificada utilizando el equipo de ensayo de histamina (ELISA) comercialmente disponible de Immunotech. Los datos obtenidos se reportan gráficamente en la Figura 2. La Figura 2 muestra los efectos, en términos de porcentaje de liberación de histamina farmacéuticamente inducida causados por el fármaco, contra control, de las varias concentraciones de ácido cítrico en la liberación de histamina a partir de células de RBL in vitro. La Figura 2 muestra una relación inversa entre las concentraciones de incremento de ácido cítrico y el porcentaje de histamina liberada de las células de RBL. La Figura 2 también muestra una relación inversa entre la liberación de histamina observada en células de RBL con una concentración en incremento de ácido cítrico y agregación del compuesto 1, como se indica por la velocidad de relajación de NMR (Ti), en soluciones que contienen concentraciones correspondientes de ácido cítrico.

EJEMPLO 4 Estudios de Sangre Humana La liberación de histamina inducida por el compuesto 1 se cuantificó en ausencia y presencia de varios excipientes en sangre ......^;-A s i periférica (venosa) obtenida de donadores humanos. La sangre fue heparinizada después de la recolección y diluida a 1:2 con regulador de pH de salina. Se prepararon soluciones de excipiente como soluciones acuosas a un pH de 3 y un pH de 7 solubilizando la cantidad apropiada del excipiente específico en agua para preparar una solución con la concentración deseada de excipiente. Una cantidad suficiente del compuesto 1 después se agregó a cada solución de excipiente para obtener una formulación conteniendo 40 mM de fármaco y la concentración especificada de excipientes. Las formulaciones se prueban a un pH tanto de 3 como a un pH de 7 para evaluar los efectos del fármaco en la sangre una vez que la formulación es regulada en su pH por la sangre. La sangre diluida se incubó con las formulaciones preparadas durante 5 minutos a 37°C antes de la recolección del medio libre de célula. Se realizó un control el mismo día utilizando una formulación conteniendo la misma concentración del fármaco y nada de excipientes adicionales. La cantidad de histamina en el medio se midió utilizando un equipo de inmunoensayo (ELISA) comercialmente disponible de Immunotech. Los resultados obtenidos para cada formulación se reportan en el Cuadro 5 a continuación en términos de porcentaje de inhibición de liberación de histamina al pH indicado basado en el control.

CUADRO 5 Se espera que los valores sean como ±SE medios de experimentos por duplicado. * Inhibición expresada como un porcentaje de la histamina liberada por el compuesto 1 de control en el mismo ensayo. Los resultados reportados en el Cuadro 5 indican que las varias formulaciones suprimen la liberación de histamina en la sangre humana. Los resultados demuestran que este método es útil para clasificar diferentes excipientes a diferentes concentraciones y bajo diferentes condiciones de pH para determinar los excipientes apropiados, concentraciones y pH para un fármaco dado. i a -£ i - ..vm. Jui .M.AAJ EJEMPLO 5 Formulaciones Las formulaciones conteniendo una variedad de fármacos o 5 sospechosas de poseer un efecto lateral adverso potencial para la liberación de histamina in vivo cuando se administran como bolo intravenoso rápido o infusión se preparan de acuerdo con el siguiente procedimiento. La cantidad deseada del excipiente se solubiliza en agua filtrada para inyección o cloruro de sodio para 10 inyección, el pH se ajusta como sea necesario para obtener una solución teniendo el valor de pH indicado, la solución se trae a un volumen con agua y cloruro de sodio para inyección para obtener la concentración de excipiente deseado, bien mezclado. La cantidad deseada del compuesto 1 es agregada, la formulación mezclada y 15 después filtrada estérilmente utilizando 0.22-0.45 µm de membrana tamaño de poro. Las formulaciones se reportan en el Cuadro 6. 20 25 CUADRO 6 ' - -" •" - - •" --«**-*•- -*-""- EJEMPLO 6 Clasificación de Perro in vivo Utilizando perros beagle anestesiados se clasificaron las formulaciones A-l de acuerdo con el ejemplo 5 por su habilidad para inhibir la liberación de histamina farmacéuticamente inducida in vivo. Todos los estudios se condujeron de acuerdo con el acta de USDA Animal Welfare Act y con adherencia estricta a las líneas de guía establecidas por el Insititutional Animal Care and Use Committee. Se anestesiaron perros beagle machos adultos, se entubaron y les colocó respiración artificial, la tráquea se entubó bajo anestesia tópica (2% de lidocaina) y la ventilación se controlo a concentraciones de CO2 de marea extrema de 25-30 mmHg. El A.. -fct-,i i 1 J animal se ventiló con una mezcla de oxígeno e isoflurano para mantener un quirúrgico de anestesia a través del experimento. Se verificaron continuamente la temperatura rectal, el CO2 de marea extrema, y saturación de O2 periférico (oximetría de pulso). Se introdujo un catéter en una arteria femoral y se conectó externamente a un transductor de presión. Continuamente se verificaron la presión sanguínea y el ritmo cardiaco en un registro de diagrama. En este experimento, se valuó la liberación de histamina a través de cambios en la presión sanguínea (marcador cardiovascular substituto del liberador de histamina) así como midiendo las concentraciones de histamina sobre el plasma. La respuesta de presión sanguínea a la liberación de histamina consiste de una breve caída característica a una latencia de aproximadamente 15-20 segundos desde el momento de la inyección del bolo. Una respuesta taquicárdica concomitante algunas veces es, pero no siempre, evidente. Se tomaron muestras de sangre en frascos congelados cubiertos con EDTA un minuto antes de la inyección y al pico de la respuesta de presión sanguínea, el plasma se extrajo siguiendo procedimientos estándares y se almacenó inmediatamente -70° hasta analizarse. Los niveles de histamina en el plasma se determinaron a través de inmunoensayo (ELISA) utilizando un equipo de ensayo comercialmente disponible de Immunotech. Cada animal sirvió como su propio control: primero se obtuvieron respuestas de línea de base (control) a dosis intravenosas en incremento de fármaco (en cloruro de sodio para inyección, pH 3) en cada animal. A intervalos de 2-3 semanas, se repitió un protocolo de dosificación idéntico en cada animal con una formulación del fármaco. El ingrediente activo se administró intravenosamente en dosis de bolo en incremento a intervalos de aproximadamente 20 minutos. Se volvieron a probar en forma intermitente los controles para seguridad contra cualquier desplazamiento en las respuesta de línea de base. Los resultados de ejemplos representativos se reportan en los Cuadros 7A-B a continuación: CUADRO 7A Efectos de las varias formulaciones en un perro beagle anestesiado ["Ethan") f Incremento de histamina en el plasma (nM) a partir de la . .. .-.¡^g iJBlíil'í I línea de base Cambio en la Presión Sanguínea Arterial Media (mmHg) a partir de la línea de base. * Formulación del Ejemplo 5.

CUADRO 7B Efectos de las varias formulaciones en un perro beagle anestesiado ["Dexter") 1 Incremento de histamina en el plasma (nM) a partir de la línea de base Cambio en la Presión Sanguínea Arterial Media (mmHg) a partir de la línea de base. * Formulación del Ejemplo 5. i á £ £,..--. A i ^¿^^gg j Los cuadros 7A-B muestran los efectos de varias formulaciones en la clasificación de perros beagle anestesiados. Mientras tanto, en algunos casos la magnitud de la respuesta del receptor relacionado con histamina al fármaco no parece ser consistentemente afectada por ciertas formulaciones, los niveles de histamina del plasma en cada caso se redujeron, especialmente a las dosis más altas. Esta discrepancia aparente atribuible a: 1) la selección de estos animales se basó en su habilidad para producir una fuerte respuesta relacionada con histamina al fármaco y 2) la prueba repetida a intervalos cortos puede estar carente de los almacenamientos de histamina de estos animales, conduciendo a una sensibilidad de receptor de histamina incrementada. Los Cuadros 7A-B también presentan, en algunos casos, desplazamientos en las respuestas de control para elevar los niveles de histamina en el plasma y/o caer en la presión arterial media (por ejemplo, Dexter, semana 11). Estos desplazamientos pueden ser atribuibles a cambios en la condición física del animal (por ejemplo, heridas de mordidas de otros perros, falta de apetito y peso, etc.) conduciendo a almacenamientos alterados se histamina y/o sensibilidad del receptor de histamina almacenado. Estos ejemplos muestran la necesidad de repetir los experimentos en animales que presentan respuestas de control más consistentes. También, los períodos de reposo más largos entre pruebas (3-4 semanas) podrían ayudar a rellenar los almacenamientos perdidos de histamina y retener la sensibilidad de receptor de histamina. El kz- A -.l *.,.-.. último régimen de prueba, por lo tanto, fue exitosamente aplicado a los estudios de mono in vivo descritos más adelante.

EJEMPLO 7 Estudios de Mono in vivo Se evaluaron las formulaciones A, B y E (tanto para NMB como para perfiles cardiovasculares9 en monos Rhesus anestesiados. Estos estudios se condujeron para asegurar que la formulación mejoró el perfil de liberación de histamina farmacéuticamente inducida del compuesto 1, sin afectar adversamente las propiedades bloqueadoras neuromusculares humanas (es decir terapéuticas) de fármaco en un modelo de primate. Todos los estudios se condujeron de acuerdo con el acta de USDA Animal Welfare Act y con adherencia estricta a las líneas de guía establecidas por Institucional Animal Care and Use Committee. Las propiedades bloqueadoras neuromusculares (NMD) y los efectos cardiovasculares relacionados con histamina del fármaco formulado en las formulaciones A, B y E de acuerdo con el Ejemplo 5, se evaluaron en monos Rhesus anestesiados como sigue: formulación A, 1 mono; formulación B, 3 monos y Formulación E, 6 monos. Se verificaron las caídas pasajeras en la presión sanguínea media (MAP) como un índice de liberación de histamina. Se utilizaron respuestas de estirón del extensor digitorum de la pata evocada por estimulación eléctrica del nervio peroneal como un ---.-A* **..., ¿- . índice de actividad neuromuscular. Los parámetros de NMB medidos o calculados incluyeron: ED95 (dosis produciendo un 95% de supresión de estirón) como un índice de potencia; inicio (tiempo a partir de la inyección a su presión pico de estirón) y duración del bloque (tiempo a partir de la inyección hacia una recuperación del 95% del estirón. La formulación del fármaco se administró intravenosamente en dosis de bolo en incremento (0.02-3.2 mg/kg) a intervalos de aproximadamente 30 minutos. Las primeras dosis (0.02-0.08 mg/kg se administraron datos para construir curvas de registro-probit de ED95. La siguiente dosis administrada fue de 0.08 mg/kg, después de lo cual, la dosis se duplicó sucesivamente hasta que se produjo una respuesta de MAP robusta. Cada animal sirvió como su propio control. Primero se obtuvieron, en cada animal respuestas de NMB y NAP de control (línea de base). La formulación de control incluye 10 mg/ml del fármaco y 10 mM de ácido cítrico en salina a un pH de 3. A intervalos (períodos de reposo de 3-4 semanas los efectos del fármaco en cada formulación se volvieron a evaluar en cada animal siguiendo un régimen de dosificación idéntico. El período de reposo de 3-4 semanas permitió que los animales rellenaran sus almacenamientos de histamina y se recuperaran de la cirugía menor del experimento. Además, en los 3 monos utilizados en los estudios de la formulación B se repitieron los experimentos de control a un intervalo de 13 semanas (durante este período se evaluaron otras formulaciones a intervalos de 3-4 semanas para determinar el grado de desplazamiento de las respuestas de NMB y MAP de línea de base (controles). Los resultados del estudio se reportan en el Cuadro 8.

CUADRO 8 * Dosis del fármaco en controles y experimentos de la formulación B y E no son idénticos debido a que se hicieron correcciones pequeñas con base en las pequeñas diferencias (aproximadamente 10%) en el contenido del fármaco entre los dos lotes de fármaco utilizados en estos estudios. Las ligeras diferencias en dosis no afectan materialmente los resultados del estudio. aa^iaat»-»---- El cuadro 8 indica los cambios de MAP producidos por las formulaciones B y E contra los controles. También se proporcionan en el cuadro los efectos de los controles que se volvieron a probar al final del estudio de formulación B para determinar la fidelidad de 5 cada respuesta. Como se muestra en el cuadro, tanto las formulaciones B como E incrementaron la dosis media de fármaco requerida para producir una respuesta de depresor relacionada con histamina comparable por un factor de aproximadamente 2 (escala: 1 a 4 veces). Los errores estándares grandes en estos valores de 10 MAP para la formulación B son una función del número limitado de animales de estudio y la variabilidad en la incidencia en la magnitud de las respuestas observadas a una dosis diaria. La prueba adicional de los controles al final de estudio de la formulación B reveló cierto grado de variabilidad en respuesta a dosis bajas, sin 15 embargo a dosis más altas, las respuestas permanecieron reproducibles. La duración de acción del compuesto 1 pareció ser un poco disminuida por la formulación E. Ninguna de las propiedades de NMB del fármaco parecieron ser adversamente afectadas por su formulación. Los datos indican que la formulación B y E suprimieron 0 la liberación de histamina farmacéuticamente inducida en los animales que se están tratando con el fármaco, sin afectar adversamente las propiedades de NMB del fármaco. La formulación A (n = 1) no pareció mostrar un cambio estadísticamente importante en los efectos de fármaco en la presión 5 sanguínea arterial media en el animal individual en donde se -¡«iMaja.i.. Ai ,. -.... tt?.i. zA AA^z... ....... ..... ..j..AÍ??án JLt.Í i. administró. Sin embargo los resultados obtenidos son de confiabilidad limitada debido a la población del estudio de 1. Se realizó un estudio adicional en 3 monos para habilitar una comparación directa de la potencia bloqueadora neuromuscular del 5 fármaco en formulaciones de control contra el fármaco en la formulación E. En este estudio cruzado, se obtuvieron varios puntos de datos (produciendo <99.9% de bloque del estirón del extensor digitorum) con dosis bajas (0.02-0.08 mg/kg) de los controles. Después de un intervalo de reposo de una hora, durante el cual se 10 interrumpió la estimulación de nervios, un protocolo de dosificación idéntico fue seguido por el fármaco en la formulación E. Los resultados de este estudio revelaron valores de ED95 medios virtualmente idénticos entre los controles y la formulación E (0.11 ± 0.02 mg/kg) indicando que la formulación no afecto adversamente la 15 potencia bloqueadora neuromuscular del fármaco. 20 25 rttrtñji-.?i-f?? ifrifT t i.. . 4t i - -..-- . -j- ..-*. ??.Í¡¡ t

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para preparar una formulación farmacéutica que contiene un liberador de histamina y un excipiente fisiológicamente aceptable, el método comprende combinar una cantidad terapéuticamente efectiva de dicho liberador de histamina con una concentración del excipiente fisiológicamente aceptable; en donde la concentración del excipiente fisiológicamente aceptable, cuando se combina en una solución acuosa con el liberador de histamina a, o por arriba de la concentración de micela crítica, es suficiente para reducir la agregación del liberador de histamina en la solución acuosa aproximadamente por lo menos en un 25% comparado con la agregación del liberador de histamina en la solución acuosa conteniendo substancialmente nada de excipiente fisiológicamente aceptable. 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el liberador de histamina es un bloqueador neuromuscular. 3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el liberador de histamina es (Z)-2-cloro-1-{3-{(1 R,2S)-6,7-dimetoxi-2-metil- 1 -[(3,4, 5,-trimetoxifenil)metil)- 1,2,3 ,4-tetrahidro-2-isoquinilinio}propil}-4-{3-[(1S,2R)-6,7-dimetoxi-2-metil-1-(3,4,5-trimetoxifenil)-1 ,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinilinio]propil}-2-butanodioato diclorhidrato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable se selecciona del grupo que consiste de sales inorgánicas divalentes, ácidos carboxílicos orgánicos, ácido fosfórico, aminoácidos, agentes quelatadores, albúminas y combinaciones de los mismos. 5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable se selecciona del grupo que consiste de cloruro de calcio, sulfato de magnesio, cloruro de magnesio, sulfato de sodio, ácido tartárico, ácido maleico, ácido acético, ácido cítrico, ácido succínico, ácido glucurónico, ácido fosfórico, glicina, lisina, arginina, EDTA, albúmina de suero de bovino, albúmina de suero humano y combinaciones de los mismos. 6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la concentración del excipiente fisiológicamente aceptable se determina por los pasos de: a) medir la agregación del liberador de histamina en una solución de referencia consistiendo esencialmente de liberador de histamina en una concentración a o por arriba de la concentración de micela crítica en una solución acuosa; b) medir la agregación de liberador de histamina en una solución comparativa consistiendo esencialmente del liberador de histamina y una concentración preseleccionada del excipiente fisiológicamente aceptable en la solución acuosa, en donde la concentración del liberador de histamina en la solución comparativa es substancialmente igual a la concentración del liberador de histamina en la solución de referencia; c) opcionalmente repetir el paso b) una o más veces con una solución comparativa teniendo una concentración preseleccionada diferente del excipiente fisiológicamente aceptable; d) identificar una concentración de excipiente fisiológicamente aceptable que sea suficiente para reducir la agregación de liberador de histamina en una solución comparativa aproximadamente por lo menos en un 25% comparado con la agregación de liberador de histamina en la solución de referencia; en donde la concentración identificada del paso d) es la concentración del excipiente fisiológicamente aceptable para combinarse con el liberador de histamina para preparar la formulación farmacéutica. 7. Una formulación farmacéutica preparada de acuerdo con la reivindicación 1. 8. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el liberador de histamina es un bloqueador neuromuscular. 9. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el liberador de histamina es (Z)-2-cloro-1 -{3-{(1R,2S)-6, 7-di metoxi-2-metil-1 -[(3,4,5 ,-trimetoxif enil)metil)-1,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinilinio}propil}-4-{3-[(1S,2R)-6,7-dimetoxi-2-metil-1-(3,4,5-trimetoxifenil)-1,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinilinio]-propil}-2-butanodioato diclorhidrato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 10. La formulación farmacéutica de acuerdo con la *-»—• * yt-z.-.Á? -jHJ.A-.L-t reivindicación 7, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable se selecciona del grupo que consiste de sales inorgánicas divalentes, ácidos carboxílicos orgánicos, ácido fosfórico, aminoácidos, agentes quelatadores, albúminas y combinaciones de 5 los mismos. 11. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable se selecciona del grupo que consiste de cloruro de calcio, sulfato de magnesio, cloruro de magnesio, sulfato de sodio, ácido tartárico, 10 ácido maleico, ácido acético, ácido cítrico, ácido succínico, ácido glucurónico, ácido fosfórico, glicina, lisina, arginina, EDTA, albúmina de suero de bovino, albúmina de suero humano y combinaciones de los mismos. 12. La formulación farmacéutica de acuerdo con la 15 reivindicación 7, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable es una combinación de cualquiera de uno o mas excipientes seleccionados del grupo que consiste de glicina, EDTA, ácido cítrico y cloruro de calcio. 13. La formulación farmacéutica de acuerdo con la 20 reivindicación 7, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable es ácido cítrico en una concentración de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 300 mM. 14. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable 25 es EDTA en una concentración de aproximadamente 0.02% a aproximadamente 1%. 15. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable es cloruro de calcio en una concentración de aproximadamente 15 5 mM a aproximadamente 200 mM. 16. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable es una combinación de ácido cítrico en una concentración de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 100 mM y EDTA en una 10 concentración de aproximadamente 0.02% a aproximadamente 1%. 17. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable es una combinación de ácido cítrico en una concentración de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 100 mM y cloruro de 15 calcio en una concentración de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM. 18. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable es lisina en una concentración de aproximadamente 10 mg/ml a 20 aproximadamente 100 mg/ml. 19. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable es una combinación de glicina en una concentración de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml y EDTA 25 en una concentración de aproximadamente 0.02% a líiiffíiiíiiliiiiaMlMiiiiliWlil i i ni. i i IÍI i 11 - — --- -•«**"- -' -*• - - - - »- ".íf-ir n i ' ?i _Én aproximadamente 1%. 20. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable es una combinación de glicina en una concentración de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml y ácido cítrico en una concentración de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 100 mM. 21. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable es una combinación de glicina en una concentración de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, ácido cítrico en una concentración de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 100 mM y EDTA en una concentración de aproximadamente 0.02% a aproximadamente 1%. 22. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable es ácido cítrico en una concentración de aproximadamente 50 mM. 23. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable es EDTA en una concentración de aproximadamente 0.1%. 24. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable es cloruro de calcio en una concentración de aproximadamente 50 mM. 25. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable es una combinación de ácido cítrico en una concentración de aproximadamente 50 mM y EDTA en una concentración de aproximadamente 0.1%. 26. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable es una combinación de ácido cítrico en una concentración de aproximadamente 50 mM y cloruro de calcio en una concentración de aproximadamente 50 mM. 27. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable es glicina en una concentración de aproximadamente 12.5 mg/ml. 28. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable es una combinación de glicina en una concentración de aproximadamente 12.5 mg/ml y EDTA en una concentración de aproximadamente 0.1%. 29. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable es una combinación de glicina en una concentración de aproximadamente 12.5 mg/ml y ácido cítrico en una concentración de aproximadamente 50 mM. 30. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable s una combinación de glicina en una concentración de aproximadamente 12.5 mg/ml, ácido cítrico en una concentración de aproximadamente 50 mM y EDTA en una concentración de aproximadamente 0.1%. 31. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende además un diluyente fisiológicamente aceptable. 32. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la formulación tiene un pH de aproximadamente 2 a aproximadamente 8. 33. Un método para suprimir la liberación de histamina farmacéuticamente inducida en un animal que se está tratando con el liberador de histamina, el método comprende administrar a dicho animal la formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7. 34. El método de acuerdo con la reivindicación 33, en donde el paso de administrar la formulación farmacéutica comprende administrar intravenosamente la formulación farmacéutica. 35. Un método para prevenir efectos cardiovasculares y respiratorios mediados por la liberación de histamina farmacéuticamente inducida en un animal que se está tratando con el liberador de histamina, el método comprende administrar a dicho animal la formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7. 36. El método de acuerdo con la reivindicación 35, en donde os efectos cardiovasculares y respiratorios mediados por la liberador de histamina farmacéuticamente inducida se seleccionan del grupo que consiste de enrojecimiento, hipotensión, taquicardia, broncoconstricción, reacciones anafilactoides, y choque anafiláctico, y combinaciones de cualquiera de dos o más de los mismos. 37. Un método para determinar una combinación de un excipiente fisiológicamente aceptable que es suficiente para suprimir la liberación de histamina farmacéuticamente inducida en un animal que se está tratando con histamina, el método comprende los pasos de: a) medir la agregación del liberador de histamina en una solución de referencia consistiendo esencialmente de liberador de histamina en una concentración en o por arriba de la concentración de micela crítica en una solución acuosa; b) medir la agregación de liberador de histamina en una solución comparativa consistiendo esencialmente del liberador de histamina y una concentración preseleccionada del excipiente fisiológicamente aceptable en la solución acuosa, en donde la concentración del liberador de histamina en la solución comparativa es substancialmente igual a la concentración del liberador de histamina en la solución de referencia; c) opcionalmente repetir el paso b) una o más veces con una solución comparativa teniendo una concentración preseleccionada diferente del excipiente fisiológicamente aceptable; d) identificar una concentración del excipiente fisiológicamente aceptable que sea suficiente para reducir el liberador de histamina ¡ ^^ yÉÉ í en una solución comparativa aproximadamente por lo menos en un 25% comparado con la agregación de liberador de histamina en la solución de referencia; en donde la concentración identificada del paso d) es la concentración del excipiente fisiológicamente 5 aceptable para combinarse con el liberador de histamina inducida farmacéuticamente en un animal que se está tratando con un liberador de histamina. 38. El método de acuerdo con la reivindicación 37, en donde el paso a) y el paso b) para medir la agregación comprenden medir las 10 velocidades de relajación de NMR del liberador de histamina en la solución de referencia y la solución comparativa, y el paso d) de identificar una concentración de excipiente fisiológicamente aceptable comprende identificar una concentración del excipiente fisiológicamente aceptable suficiente para reducir las velocidades de 15 relajación de NMR medidas del liberador de histamina en la solución comparativa en aproximadamente un 25% comparado con las velocidades de relajación de NMR medidas del liberador de histamina en la solución de referencia. 39. Un método para preparar una formulación farmacéutica que 20 contiene un liberador de histamina y un excipiente fisiológicamente aceptable, el método comprende combinar una cantidad terapéuticamente efectiva del liberador de histamina con un excipiente fisiológicamente aceptable, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable está presente en una concentración 25 determinada de acuerdo con el método de la reivindicación 37. 40. Una formulación farmacéutica preparada de acuerdo con la reivindicación 39. 41. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 40, en donde el liberador de histamina es un bloqueador neuromuscular. 42. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 40, en donde el liberador de histamina es (Z)-2-cloro- 1 -{3-{(1R,2S)-6, 7-di metoxi-2-met i 1-1 -[(3, 4, 5, -trimetoxifenil )metil )-1,2, 3,4-tetrahidro-2-¡soquinilinio}propil}-4-{3-[(1S,2R)-6,7-d ¡metoxi-2-met i 1-1 -(3,4, 5-tr¡ metoxif eni I )-1 ,2,3,4-tetrahidro-2-isoqu¡nil¡n¡o]-propil}-2-butanodioato diclorhidrato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 43. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 40, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable se selecciona del grupo que consiste de sales inorgánicas divalentes, ácidos carboxílicos orgánicos, ácido fosfórico, aminoácidos, agentes quelatadores, albúminas y combinaciones de los mismos. 44. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 40, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable se selecciona del grupo que consiste de cloruro de calcio, sulfato de magnesio, cloruro de magnesio, sulfato de sodio, ácido tartárico, ácido maleico, ácido acético, ácido cítrico, ácido succínico, ácido glucurónico, ácido fosfórico, glicina, lisina, arginina, EDTA, albúmina de suero de bovino, albúmina de suero humano y ^^^^ ^^^fe combinaciones de los mismos. 45. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 40, que además comprende un diluyente fisiológicamente aceptable. 5 46. Un método para suprimir la liberación de histamina farmacéuticamente inducida en un animal que se está tratando con un liberador de histamina, el método comprende administrar al animal la formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 40. 10 47. Un método para preparar una formulación farmacéutica que contiene un liberador de histamina y un excipiente fisiológicamente aceptable, el método comprende combinar una cantidad terapéuticamente efectiva del liberador de histamina con una concentración de excipiente fisiológicamente aceptable, en donde la 15 concentración del excipiente fisiológicamente aceptable es determinada a través de un método que comprende los pasos de: a) medir la liberación de histamina a partir de una muestra biológica que contenga histamina consistiendo esencialmente de: i) la muestra biológica que contiene histamina en un medio y 20 ii) una solución acuosa del liberador de histamina a una concentración suficiente para ocasionar la liberación de histamina a partir de la muestra biológica que contiene histamina; b) medir la liberación de histamina a partir de la muestra biológica que contiene histamina en una mezcla comparativa que 25 consiste esencialmente de: i) la muestra biológica que contiene histamina en un medio y ii) una solución del liberador de histamina y una concentración preseleccionada del excipiente fisiológicamente aceptable, en donde el liberador de histamina de la mezcla comparativa 5 está presente en una concentración que es substancialmente igual a la concentración del liberador de histamina en la mezcla de referencia del paso a); c) opcionalmente repetir el paso b) una o más veces con una mezcla comparativa teniendo una concentración preseleccionada 10 diferente del excipiente fisiológicamente aceptable; y d) identificar una concentración del excipiente fisiológicamente aceptable suficiente para reducir la liberación de histamina a partir de la muestra biológica que contiene histamina en la mezcla comparativa aproximadamente por lo menos en un 10% comparado 15 con la liberación de histamina de la muestra biológica que contiene histamina de la mezcla de referencia; en donde la concentración identificada del paso d) es la concentración del excipiente fisiológicamente aceptable para combinarse con el liberador de histamina para preparar la formulación farmacéutica. 20 48. Una formulación farmacéutica preparada de acuerdo con la reivindicación 47. 49. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 48, que comprende además un diluyente fisiológicamente aceptable. 25 50. Un método para suprimir la liberación de histamina I lllli jiriilllliti? t * ??.*-l.-l> -?-'y ---*«---- - -?-AA z- ^-. _.^, ^.¿..,1, .^-.^A^^má-MtrM.,-A^tm??- ?Í?. farmacéuticamente inducida en un animal que se está tratando con el liberador de histamina, el método comprende administrar al animal la formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 48. 5 51. Un método para prevenir efectos cardiovasculares y respiratorios mediados por la liberación de histamina farmacéuticamente inducida en un animal que está siendo tratado con el liberador de histamina, el método comprende administrar al animal la formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10 48. 52. Un equipo para preparar una formulación farmacéutica del liberador de histamina, el equipo comprende: a) un excipiente fisiológicamente aceptable, y b) instrucciones para preparar las formulaciones farmacéuticas 15 de acuerdo con al reivindicación 1. 53. El equipo de acuerdo con la reivindicación 52, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable se selecciona del grupo que consiste de sales inorgánicas divalentes, ácidos carboxílicos orgánicos, ácido fosfórico, aminoácidos, agentes quelatadores, 20 albúminas y combinaciones de los mismos. 54. El equipo de acuerdo con la reivindicación 53, en donde el excipiente fisiológicamente aceptable se selecciona del grupo que consiste de cloruro de calcio, sulfato de magnesio, cloruro de magnesio, sulfato de sodio, ácido tartárico, ácido maleico, ácido 25 acético, ácido cítrico, ácido succínico, ácido glucurónico, ácido fosfórico, glicina, lisina, argjjitna, EDTA, albúmina de suero de bovino, albúmina de suero humano y combinaciones de los mismos. 55. El equipo de acuerdo con la reivindicación 52, que comprende además un diluyente fisiológicamente aceptable e 5 instrucciones para combinar la cantidad terapéuticamente efectiva de dicho liberador de histamina con el excipiente fisiológicamente aceptable en el diluyente fisiológicamente aceptable. 56. El equipo de acuerdo con la reivindicación 52, en donde las instrucciones además comprenden instrucciones para ajustar el 10 pH de la formulación farmacéutica de aproximadamente 2 a aproximadamente 8. 57. Una formulación farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de es (Z)-2-cloro-1-{3-{(1 R,2S)-6,7- dimetoxi-2-metil-1-[(3,4,5,-trimetoxifenil)metil)-1,2,3,4-tetrahidro-2- 15 isoquinilinio}propil}-4-{3-[(1S,2R)-6,7-dimetoxi-2-metil-1-(3,4,5- trimetoxifenil)-1,2,3,4-tetrahidro-2-isoquinilinio]propil}-2- butanodioato diclorhidrato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; un excipiente seleccionado del grupo que consiste de glicina en una concentración de aproximadamente 10 mg/ml a 20 aproximadamente 30 mg/ml, ácido cítrico en una concertación de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM, EDTA en una concentración de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 0.5%, cloruro de calcio en una concentración de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM y combinaciones de los mismos; y un 25 diluyente fisiológicamente aceptable, en donde la formulación mggimm l A ,iAá?*t-.-.-»iBm-,- ^^^.-.- ...^.y _.., — .... , ^t.„,^.. JMáJ?iAt...n farmacéutica es adecuada para administración intravenosa. 58. Una formulación farmacéutica que comprende un liberador de histamina y un excipiente fisiológicamente aceptable, en donde la concentración del excipiente fisiológicamente aceptable es suficiente para suprimir la liberación de histamina farmacéuticamente inducida. 59. El uso de una formulación farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7, 40, 48, 57 o 58 para la fabricación de un medicamento para suprimir liberación de histamina farmacéuticamente inducida en un animal que se está tratando con el liberador de histamina. 60. El uso de acuerdo con la reivindicación 59, en donde el medicamento es administrado intravenosamente. 61. El uso de una formulación farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7, 40, 48, 57 o 58 para la fabricación de un medicamento para prevenir efectos cardiovasculares y respiratorios mediados por la liberación de histamina farmacéuticamente inducida en un animal que se está tratando con el liberador de histamina. 62. El uso de acuerdo con la reivindicación 61, en donde los efectos cardiovasculares y respiratorios mediados por la liberación de histamina farmacéuticamente inducida se seleccionan del grupo que consiste de enrojecimiento, hipotensión, taquicardia, broncoconstricción, reacciones anafilactoides y choque anafiláctico, y combinaciones de cualquiera de dos o más de los mismos. La invención se refiere a formulaciones farmacéuticas y métodos para preparar formulaciones farmacéuticas de liberadores de histamina. La presente invención proporciona métodos para determinar la concentración del excipiente fisiológicamente aceptable para utilizarse en las formulaciones de la invención. La presente invención también proporciona métodos para suprimir la liberación de histamina farmacéuticamente inducida administrando a un animal, las formulaciones de la presente invención. También se proporciona un equipo útil para preparar formulaciones farmacéuticas de liberadores de histamina.