MXPA02004540A - Activadores transcripcionales. - Google Patents

Abstract

La invencion provee un promotor eucarionte inducible por sintesis que tiene una actividad transcripcional, ejemplo, una secuencia de ADN sensible a metal pesado, derivada a partir e un promotor natural, de una secuencia de bases de cualesquiera de SEQ ID NO: 1 a 4; un inductor de la actividad de activacion transcripcional de la misma; un vector de expresion recombinante que comprende un sitio para la insercion de un gen externo ligado al promotor anteriormente mencionado; un equipo de expresion eucarionte que comprende celulas eucariontes transfectadas con el vector anteriormente mencionado' y el inductor anteriormente mencionado; un metodo para la expresion de un gen externo en un sistema eucarionte mediante el uso del mismo.

Description

ACTIVADORES TRANSCRIPCIONALES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere un promotor eucarionte mejorado inducible por síntesis y a un inductor que activa el iniciador transcripcional de dicho promotor, particularmente el inductor que comprende un compuesto de oro. La presente invención se refiere además un vector de expresión recombinante que tiene unido a éste dicho promotor eucarionte inducible por síntesis, un equipo de expresión que comprende dicho vector de expresión recombinante y dicho inductor, y un método novedoso para la expresión de un gen externo de cual comprende el uso de dicho equipo.

TÉCNICA ANTERIOR RELACIONADA Como el promotor de expresión de mamífero, los promotores presentes en el gen de metalotioneina (MT) y el repetido terminal largo del virus del tumor de mama del ratón (MMTV-LTR) se han utilizado ampliamente. Como el inductor del promotor MT, un metal pesado tal como cadmio o zinc generalmente se considera como el más apropiado. La activación transcripcional por dicho metal es mediante el factor de transcripción unido al elemento ¡nducible de respuesta metálico (MRE) presente en el promotor MT. Como elementos de respuesta para la activación transcripcional como ocurre los promotores, se conocen, así como los elementos metálicos de respuesta anteriormente mencionados, dexametasona y otros elementos de respuesta a glucocorticoide o elementos de respuesta a hormona, elementos de respuesta a choque térmico, elementos de respuesta a temperatura, elementos de respuesta al interferón, elementos de respuesta a citosina, etcétera. Además se conocen los sistemas de expresión que consisten de uno o una combinación de dos o más de dichos elementos de respuesta que comprende secuencias específicas y un inductor de activación transcripcional (por ejemplo, publicaciones de patentes japonesas no examinadas No. H07-501456, H07-83715 y H11-502705.). Recientemente, se ha descubierto el MARE (elemento de reconocimiento de Maf -por sus siglas en inglés). El producto del gen tumoral Maf descubierto a partir del retrovirus de pollo AS42 como un promotor que activa la transcripción de Maf es un factor de transcripción que tiene una estructura básica de cierre de leucína (bZip), el cual, como un homodímero, se une a MARE (elemento de reconocimiento de Maf) teniendo una secuencia de ADN que se parece al elemento de respuesta TPA (TRE) y al elemento de respuesta a AMPc (CRE) para activar la transcripción (Igarashi, K., et al., Nature, 367, 568-572 (1994): Mol. Cell. Biol., 14, 700-712 (1994)). Para dilucidar este mecanismo de control transcripcional mediado por MARE que tiene dicha secuencia de ADN, los inventores investigaron las respuestas de MARE a varios estímulos a nivel de células cultivadas. Como resultado, ellos descubrieron que la actividad de dicho MARE secuestro prominente en la presencia de un compuesto de un metal pesado tal como plata, mercurio, cadmio u oro, por ejemplo. El objetivo de la presente invención es proveer un vector de expresión recombinante que tiene un promotor eucarionte mejorado ¡nducible por síntesis ligado a éste y un compuesto de metal pesado que sirve como un inductor para activar la iniciación transcripcional de este promotor y para establecer así un sistema de expresión para una eficiencia mejorada de la expresión de un gen externo. Después de investigación extensiva los inventores encontraron que los objetivos anteriormente mencionados pueden lograrse de conformidad con la invención, las características principales de la cual se describen ahora a continuación y han desarrollado la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un promotor eucariontes inducible por síntesis que tiene actividad de activación de la transcripción que comprende la siguiente secuencia de ADN que responde a un metal pesado (a) o (b) derivada a partir del promotor natural: (a) la secuencia de bases de cualquiera de SEQ ID NO: 1 hasta (b) la secuencia de bases homologas en al menos 6 bases a la secuencia de bases de SEQ ID NO: 1 y que tiene actividad de activación de la transcripción. Particularmente, la invención provee dicho promotor eucarionte inducible por síntesis que tiene una secuencia de ADN de cualquiera de SEQ ID NO: 1 hasta 4; dicho promotor eucariontes ¡nducible por síntesis el cual responde a metales pesados seleccionados a partir del grupo de consiste de (2, 3, 4, 6-tetra-O-acetil-1-tio-a-D-glucopiranosato-S) (trietilfosfina)oro, (1-tio-D-glucopiranosato)oro, y aurotiomalato de sodio. Además, la invención provee un inductor para inducir la actividad de activación de la transcripción de dicho promotor eucarionte inducible por síntesis, cuyo inductor se selecciona a partir del grupo que consiste de compuestos de metales pesados, particularmente dichos inductor es de activación de la transcripción seleccionados a partir del grupo que consiste de compuestos de plata, mercurio, cadmio y oro; y dicho inductor de activación transcripcional de cual es un compuesto de oro seleccionado partir del grupo que consiste de (2, 3, 4, 6-tetra-O-acetil-1-tio-a-D-glucopiranosato-S) (trietilfosfina)oro, (l-tio-D-glucopiranosato)oro, y aurotiomalato de sodio. Además, la invención provee un vector de expresión recombinante que tiene un sitio para reinserción de un gen externo unido al dicho promotor eucarionte inducible por síntesis; un equipo de expresión eucarionte que comprende células eucariontes transfectadas con dicho vector de expresión recombinante y dicho inductor de activación transcripcional; y un método para la expresión de un gen externo en un sistema eucarionte que comprende poner al dicho vector de expresión recombinante que contiene un gen externo en contacto con dicho inductor de activación transcripcional para activar el promotor eucarionte inducible por síntesis y dicho vector para promover así la inducción de la expresión del gen externo. Particularmente en el método anteriormente mencionados para la expresión, el inductor de activación transcripcional es preferiblemente unos seleccionado a partir del grupo que consiste de compuestos de plata, mercurio, cadmio, y u oro, más preferiblemente unos seleccionado de entre (2, 3, 4, 6-tetra-O-acetil-1-tio-a-D-glucopiranosato-S) (trietilfosfina)oro, (1-tio-D-glucopiranosato)oro, y aurotiomalato de sodio. Por medio de este promotor eucarionte ¡nducible por síntesis, el doctor de activación transcripcional, vector de expresión recombinante, y método para la expresión recombinante que los utiliza de conformidad con la invención, la expresión de un gen externo puede realizarse a una elevada velocidad en comparación con la tecnología de expresión de genes externos convencional. También, el promotor de la invención puede ser utilizado como un vector capaz de inducir un fármaco para terapia génica. Además, de conformidad con la presente invención, se puede desarrollar una tecnología de aplicación la cual pueda comprender administra un compuesto de u lo aún ratón experimental y ocasionar que un gen relacionado con enfermedad se induzca en un ratón knockout o en un ratón transgénico. Además, el equipo de la presente invención también puede ser utilizado como un equipo para la inducción de genes en células cultivadas. La siguiente representación de aminoácidos, tejidos, secuencias de bases, y ácidos nucleicos mediante abreviaturas en esta especificación conforme a las reglas de IUPAC-IUB [lUPAC-lUBC Communication on Biologial Nomenchlature, Eur. J. Biochem., 138:9 (1984)], the Guideline for Drafting Patent Specifications and the Like wich contain Nucleotide Sequences or Amino Acid Sequences - la Directriz para el anteproyecto de ley de especificaciones de patente y similares que contienen Secuencias de Nucleótidos o Secuencias de Aminoácidos -(the Patent Office of Japan (ed.), y las convenciones en la técnica. La síntesis de ADN, producción de vectores (vectores de expresión) que contienen un gen externo, células hospederas transfectadas con dicho vectores, y producción de proteínas expresadas secretadas por la células hospederas, etc. pueden llevarse a cabo fácilmente mediante las técnicas de ingeniería genética general [Molecular Cloning. 2a Ed., Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); Zoku Seikagaku Jikken Koza, "Idenshi Kenkyuho I, II, III" (Serie de Bioquímica Experimental-continuación, " Métodos para Investigación Génica I, II, lll "), ed. por Japanese Biochemical Society (1986), etc.]. Particularmente, el ADN puede ser sintetizado mediante un método químico de síntesis, tal como el método de fosforamidita o el método de triéster, y también puede llevarse a cabo mediante el uso de sintetizadores comerciales automatizados de oligonucleótidos. Los fragmentos de ADN de doble hebra pueden obtenerse a partir de hebras sencillas químicamente sintetizadas mediante un procedimiento que comprende la síntesis de hebras complementarias y fijación de estas bajo condiciones adecuadas o acoplamiento de hebras complementarias mediante el uso de ADN de polimerasa con secuencias iniciadoras adecuadas. La presente invención además se refiere a un material y a un método, los cuales son efectivos en la preparación selectiva de secuencias de ADN específicas mediante control externo de la transcripción. En la presente, en una secuencia continua de ADN, una cierta secuencia de ADN situada hacia delante de un gen dado usualmente determina el sitio de inicio de la transcripción a partir del ADN hacia ARNm. Éstas generalmente se denominan secuencias promotoras. Otras secuencias de ADN también se unen a las proteínas determinantes de la frecuencia (o proporción) del inicio de la transcripción hacia el extremo 5' de un gen dado en una secuencia continua de ADN. Éstas se conocen como secuencias reguladoras. Así, en una secuencia de ADN funcional, la secuencias de ADN localizadas hacia el extremo 5' de un gen seleccionado y adaptado para determinar si la transcripción de genes y la expresión subsecuente del gen toma lugar se denominan globalmente una secuencia promotora y una secuencia reguladora. El promotor generalmente funciona para modular la transcripción de un gen de conformidad con las condiciones físicas y químicas adentro y alrededor de la célula. Y como un método para la modulación externa del papel de este promotor, es decir la transcripción de la secuencia del gen y expresión de la misma, uno puede descubrir un elemento de respuesta inducido por la expresión situado hacia el extremo 5' de un gen y que especifica unas sustancias o factor de respuesta para asegurar así una inserción más positiva y la integración estable de la secuencia de ADN dentro de la célula. La presente invención provee una descripción acerca de la respuesta de una secuencia promotora específicas a un metal pesado, particularmente un compuesto de oro. Como se mostraron los ejemplos presentados a continuación, la invención se basa en el hallazgo de que una alta velocidad de replicación puede ser posible al cultivar un vector de expresión recombinante que contiene un gen externo que se expresa unido a un promotor que comprende una secuencia de ADN específicas. Como metal pesado, particularmente un compuesto de oro, en células eucariontes. El promotor de la presente invención contiene al menos una secuencia natural inducible. Esta puede ser una secuencia MARE que se parece a la secuencia AP1. Dicho inserto MARE puede ser una molécula sintética que comprende un par de oligonucleótidos complementarios que contienen una secuencia consenso MARE. Una pluralidad de MARE pueden tratarse dentro de un promotor natural en la forma de una secuencia unida tal como una unión doble, triple o cuádruple o secuencias de bases arbitrarias pueden flanquear la secuencia MARE en una secuencia lineal que tiene una longitud dada. El promotor de la presente invención puede ser una secuencia unida que contiene una pluralidad de secuencias MARE de 13 nucleótidos, tales como aquellas de SEQ ID NO: 1 a NO: 4, de manera doble, triple o cuádruple. En la presente invención, la secuencia MARE se define con la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 1 que se toma como un estándar. Esto incluye una secuencia de ADN homologa en al menos 6 nucleótidos, preferiblemente una secuencia de ADN homologa en al menos 7 nucleótidos, mas preferiblemente una secuencia de ADN homologa en al menos 8 nucleótidos, incluso más preferiblemente una secuencia de ADN homologa en al menos 9 nucleótidos, mas preferiblemente una secuencia de ADN homologa en al menos 10 nucleótidos, la cual tiene una función de activación de la transcripción. Los ejemplos específicos de dicha secuencias de bases se conocen en SEQ ID NO: 2-4 y SEQ ID NO: 16-19. La modalidad particularmente preferida de la invención incluyó promotor que tiene un sitio de inserción que capacita la expresión de un gen externo como se ha modificado para que contenga al menos un MARE ¡nducible, preferiblemente transmitiendo un producto génico mejorado de expresión, de manera que, en un sistema de expresión eucarionte, particularmente un sistema de expresión de mamífero, un gen de expresión se logra con la inducción de MARE.

Esta modalidad particularmente preferida puede incrementarse mediante la sustitución-inserción de una pluralidad de secuencias MARE dentro de la región promotora de un vector replicable conocido y dando los ya sea directamente o a través de un adaptador. Un ejemplo específico de dicha secuencia de ADN se muestra en SEQ ID NO: 20 la cual es una secuencia de ADN provista con tres unidades de la secuencia de ADN que contiene el MARE de SEQ ID NO: 2. Un ejemplo más específico de la secuencia de ADN se muestra en SEQ ID NO:21. Por supuesto, la secuencia MARE anteriormente mencionadas no está restringida a SEQ ID NO: 2 pero puede por ejemplo, ser cualquiera de las otra secuencias MARE de SEQ ID NO: 1 , 3 y 4 o cualquiera de la secuencias ARE de SEQ ID NO: 16-19, y esto no se restringe solamente a repetidos de la misma secuencia MARE o secuencia ARE sino que puede ser una combinación de diferentes secuencias MARE y/o diferentes secuencias ARE. La secuencia de SEQ ID NO: y las secuencias de SEQ ID NO: 16-19 son secuencias parciales de genes conocidos de ratón, rata, rata, ratón y humano, respectivamente, y estos genes conocidos se describen en la siguiente literatura. GST-Ya de ratón: Biochemical and Biophysical Research Communication, 236, pp. 313-322 (1997) GSt-Pi de rata: Proc. Nati. Acad. Sci., USA., 85, pp. 9456-9460 (1988).

(Invitrogen) y pBAD/His (Invitrogen).

Para los casos en los que las células de vertebrado se utilizan como el hospedero, el vector de expresión contiene un promotor hacia el extremo 5' del gen de la invención el cual se va a expresar, sitio de procesamiento de ARN, sitio de poliadenilación, secuencia determinación de la transcripción. Este vector puede tener opcionalmente una región de replicación. Un ejemplo específico de dicho vector es pSV2 dhfr que contiene el promotor temprano de SV40 [Mol. Cell. Biol., 1 :854 (1981)]. Aparte de los anteriormente mencionados, varios vectores comerciales conocidos pueden emplearse. Los vectores comerciales para uso en los sistemas de expresión se utilizan células animales incluyen, por ejemplo, pEGFP-N, pEGFP-C (Clontech), pIND (Invitrogen), pcDNA3.1/His (Invítrogen) y vectores similares para células animales; y pFastBac HT (Gibco BRL), pAcGHLT (PharMingen), pAc5/V5-His, pMT/V5-H¡s, pMT/Bip/V5-his (todos de Invitrogen) y vectores similares para células de insecto. Un ejemplo específico del vector de expresión del cual puede emplearse cuando las células de levaduras utilizan como el hospedero es pAM82 que tiene un promotor para el gen de la fosfatasa acida [Proc. Nati. Acad. Sci., USA., 80:1 (1983)]. Los vectores de expresión comerciales para uso de células de levaduras incluyen pPICZ (Invitrogen), pPICZá (Invitrogen), etcétera. La secuencia de ADN que responde a metal pesado derivada a partir de un promotor natural, más específicamente una secuencia MARE, puede sustituirse por cualquier sitio de inserción deseado de un promotor conocido. El promotor sustituido, es decir el promotor que tiene una secuencia MARE insertada, puede utilizarse como el promotor objetivo que tiene una actividad de activación transcripcional por metal pesado. Más particularmente, al remover al menos una secuencia constitutivas de un promotor y/o insertar al menos una secuencia MARE en dicha región de secuencia constitutiva, el promotor particular puede inhabilitarse. En la sección de ejemplos se aparece a continuación, se presenta un caso en el cual dicha secuencia constitutiva se inhabilitarse al aplicar ambos procedimientos, es decir la remoción de secuencias constitutivas y la inserción de una, secuencias MARE. La inserción de una secuencia MARE puede ser la inserción de una molécula sintética que consiste de un par de oligonucleótidos complementarios que contienen una secuencia consenso MARE. El promotor objetivo también puede obtenerse al insertar una pluralidad de secuencias MARE en la forma de una secuencia unida. La modalidad particularmente preferida de la presente invención incluye un promotor de á-globina de conejo del origen SV40 modificada de manera que contiene al menos una secuencia MARE ¡nducible de manera que en un sistema de expresión eucarionte el efecto de expresión del gen puede lograrse mediante la inducción del MARE inducible, preferiblemente acompañado por un nivel global mejorado de la expresión génica. En ésta modalidad particularmente preferida, una pluralidad de secuencias MARE se insertan dentro de promotor de a-globina de conejo derivada a partir del SV40 natural. Por ejemplo específico de una pluralidad de secuencias MARE se muestra en SEQ ID NO: 21. El promotor sustituible con las secuencias MARE no está particularmente restringido, sin embargo, cuando una cepa del género Escherichia se utiliza como el hospedero, el promotor de triptofano (trp), promotor Ipp, promotor lac, promotor recA, promotor PL/PR, etc. puede ser utilizado con ventaja. Cuando el hospedero es una cepa del género Bacillus, el promotor SP01 , promotor SP02, promotor penP, etc. se prefiere. Como el promotor para uso cuando el hospedero es una levadura, el promotor pH05, promotor PGK, promotor GAP, promotor ADH, etc., puede ser utilizado con ventaja. El promotor preferido para casos en donde las células animales se utilizan como el hospedero incluye el promotor derivado de SV40, promotor de retrovirus, promotor de metalotioneina, promotor de choque térmico, promotor de citomegalovirus, y promotor SRá. Debe entenderse que como el vector de expresión para el gen de la invención, también puede utilizarse con ventaja el vector de expresión de la proteína quimérica ordinaria. Un ejemplo específico de éste vector es pGEX (Promega) para la expresión de una proteína quimérica con glutatión-S-transferasa. El promotor eucarionte novedoso inducible por síntesis, particularmente en los casos en donde éste está operativamente unido a un gen a ser expresado mediante un sistema de expresión, puede integrarse dentro de un vector para expresión eucarionte del producto génico. Dicho sistema de expresión incluye células eucarionte es transfectadas con el vector, particularmente células de mamífero, por ejemplo células Vero, CHO, HeLa, células de fibroblastos de rata II y células epiteliales de tracto digestivo transfectadas con el vector. En conexión con lo anterior, la sustitución e inserción de la secuencia objetivo MARE dentro de promotor puede ser llevada a cabo fácilmente mediante la tecnología rutinaria de ingeniería genética. Así se puede construir un vector de expresión recombinante equino sitio para la inserción de un gen externo unido al promotor eucarionte inducible por síntesis que contiene un elemento de respuesta a metal pesado que tiene actividad de activación transcripcional de conformidad con la invención. El método para ocasionar la expresión del gen externo objetivo a partir del vector de expresión recombinante mejorado de la invención y la producción de polipéptido recombinante como el producto de expresión comprende la elaboración de un ADN recombinante (vector de expresión) que capacita a un gen externo que codifica para la proteína deseada a ser expresado en las células hospederas, transfectando las células hospederas, creciendo los transformantes resultantes, y recuperan de polipéptido a partir del cultivo obtenido. Como la célula hospedera, cualquier célula procariontes y eucarionte puede emplearse. Así, la célula hospedera procarlonte incluye un espectro amplio de cepas bacterianas ordinarias tales como aquellas de Escherichia coli y Bacillus subtilis, preferiblemente cepas de Escherichia coli, por ejemplo E. coli K12, en particular. La célula hospedera eucarionte incluye células de vertebrado y células de levadura, los ejemplos preferidos de lo anterior siendo la línea COS de células de mono [Cell, 23:175 (1981 )], línea células de ovario de hámster chino y su línea celular deficiente en dihidrofolato reductasa [Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 77: 4216 (1980)], etcétera. Para esto último, las células Saccharomyces de levadura, por ejemplo, pueden utilizarse con ventaja. Por supuesto, éstas no son elecciones exclusivas. El método para la introducción del ADN recombinante deseado (vector de expresión) dentro de las células hospederas y el método de transformación utilizando el mismo no están particularmente restringidos sino que varios métodos rutinarios pueden ser utilizados. El transformante obtenido puede ser cultivado de la manera rutinaria y mediante este cultivo, la proteína objetivo codificada por el gen externo diseñado se expresa y produce (acumula o secreta) intracelularmente, intracelularmente o en la membrana celular del transformante. Como el medio para utilizar para llevar a cabo este cultivo, varios medios los cuales son de uso rutinario para las células hospederas adoptadas puede utilizarse selectivamente y el cultivo también puede llevarse a cabo bajo condiciones que favorecen el crecimiento de las células hospederas. El procedimiento para ocasionar que un gen externo que codifica para una proteína deseada exprese células hospederas puede comprender la elaboración de un vector de expresión recombinante de conformidad con la invención en primer lugar, transfectar las células hospederas mediante la introducción del vector, crecer las células transformantes resultantes, y estimular la expresión mediante la edición de un metal pesado que tiene la propiedad de inducir la actividad transcripcional de promotor eucarionte de la invención inducible por síntesis, en donde la proteína objetivo puede producirse con deficiencias y a una escala de alta producción. En la presente, como el metal pesado (inductor de activación transcripcional) el cual actúa sobre el elemento de respuesta a metal pesado, es decir la secuencia MARE, del promotor de la invención, oro, cobalto, plata, mercurio, cadmio, y compuestos estos metales se ejemplifican. Los metales preferidos son oro, mercurio, cadmio, y los compuestos de oro. El inductor no está restringido a dichos compuestos de metal pesado pero puede estar en cualquier otra forma, tal como un ion metálico, que es capaz de actuar sobre el transformante para estimular la expresión. El compuesto de metal pesado como el inductor anteriormente mencionado el cual influye sobre la secuencia de ADN del MARE (secuencia de respuesta a metal pesado) para evocar la activación transcripcional y la estimulación del expresión puede usualmente ser fácilmente modificado para que forme una sal farmacológicamente aceptable con un ácido ordinario y dicha sal también se incluye en el concepto del inductor de la invención como es el compuestos libres. El ácido del cual puede formar dicha sal farmacológicamente aceptable incluye ácidos orgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido bromhídrico, etc. y ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido p-toluensulfónico, ácido etansulfónico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico, ácido benzoico, y otros. El cloruro de cobalto, sulfuro de cadmio, cloruro de mercurio, tetracloroaureato de sodio (lll), y aurotiomalato de sodio son ejemplos específicos del inductor de la invención. Además, los aductos metálicos de sacáridos o polisacárido, tales como glucopiranosato, S-glucopiranósido, S-glucosa, S-maltosa, S-fructosa, N-glucopiranósido, N-glucosa, N-maltosa, N-fructosa, P-glucopiranósido, P-glucosa, P-maltosa, P-fructosa, etc. también pueden ser ejemplificadas como otros inductores de la invención. La particularmente, el inductor incluye ( (2, 3, 4, 6-tetra-O-acetil-1-tio-a-D-glucopiranosato-S) (trietilfosfina)oro, (1-tio-D-glucopiranosato)oro, y aurotiomalato de sodio: auranofin, y (1-tio-D-glucopiranosato) oro. Estos compuestos de metal pesado, por ejemplo compuestos que contiene oro, puede producirse mediante la tecnología convencional. Por ejemplo, los compuestos que contiene oro puede producirse mediante los procedimientos descritos en las publicaciones de patentes japonesa no examinadas Nos. S61-26916 y S 53-132528. El compuesto metálico anteriormente mencionado puede ser utilizado como el activador de transcripción en el método para expresar un gen externo de conformidad con la invención, dicha terapia génica, mediante el uso del vector de expresión recombinante de la invención, y en tales casos, generalmente se utiliza en la forma de una preparación farmacéutica ordinaria. Dicha preparación puede ser producida al utilizar un diluyente excipientes, tal como el llenador convencional, extensor, aglutinante, humectantes, desintegrantes, agente tensioactivo, lubricante, y otros. La preparación farmacéutica puede protegerse en varias formas de dosis seleccionadas de conformidad con el objetivo terapéutico y, como formas representativas, incluyen tabletas, pildoras, polvos, soluciones, suspensiones, emulsiones, granulos, cápsulas, supositorios, inyecciones (soluciones, suspensiones, etc.), cuotas para los ojos, cuotas para la nariz, e inhalantes. La cantidad el compuesto el ingrediente activo a ser formulada en dicha preparación activador de la transcripción no está particularmente restringida pero puede ser juiciosamente seleccionada a partir de un amplio intervalo. Usualmente, esta puede ser de 0.1 - 70 porcentaje en peso, preferiblemente 0.5 - 30 porcentaje en peso, basándose en la composición total. El método de administrar dicho activador de la transcripción no está particularmente restringidos pero se selecciona de conformidad con la forma de dosis, la edad del paciente, sexo y otros factores, la severidad de la enfermedad, y otras circunstancias. Las tabletas, pildoras, soluciones, suspensiones, emulsiones, granulos y cápsulas se administran oralmente. Las inyecciones se administran ya sea solas o con una mezcla con glucosa, aminoácidos u otra infusión ordinaria medíante la ruta intravenosa o, donde sea necesario, se administra sola por la ruta intramuscular, intradermal, subcutánea o intraperitoneal. Los supositorios se administran rectalmente, las gotas para los ojos se instilan dentro del ojo y las gotas para la nariz dentro de los nostrilos, y los inhalantes se administran dentro de la cavidad oral. La dosis del activador de transcripción puede seleccionarse viciosamente de conformidad con el método de administración, la edad del paciente, el sexo y otros factores, la severidad de la enfermedad, y otras condiciones, y usualmente la cantidad del ingrediente activo de compuesto de metal pesado a ser dado diariamente a un paciente adulto que puede seleccionarse a partir del intervalo de aproximadamente 0.1 - 30 mg por kg de peso corporal. También es recomendable asegurarse que la forma de unidad de dosis contiene aproximadamente 1-1000 mg del ingrediente activo. Como se mencionó anteriormente, la administración del inductor de activación transcripcional (activador de la transcripción) de la invención resulta en la promoción de la operación del promotor eucarionte objetivo inducible por síntesis en las células cultivadas con las células animales de mamífero dentro de las cuales el transformante (vector de expresión) ha sido integrado de manera que la inducción de la expresión del vector de expresión recombinante puede ser promovida. De esta manera, el producto de expresión del gen externo deseado puede producirse con buena eficiencia a una escala de producción alta. La proteína recombinante obtenida mediante el método para la expresión del gen recombinante externo de conformidad con la invención puede aislarse y purificarse opcionalmente mediante varios procedimientos de separación utilizando sus propiedades físicas, químicas y otras [Biochemical Data Book II, pp. 1175-1259, primera edición, primera impresión, junio 23, 1980, publicado por Kabushiki Kaisha Tokio Kagaku Dojin; Biochemistry, 25 (25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987), etcétera.]. La tecnología relevante específicamente incluye el tratamiento de constitución rutinario, tratamiento con un agente precipitador de proteína (extracción con sal), centrifugación, método de choque osmótico, rompimiento sónico, ultrafiltración, cromatografía en tamiz molecular (filtración en gel), cromatografía por adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por afinidad, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y otras cromatografía críticas, diálisis y varias combinaciones de dichas técnicas. La técnica particularmente preferida de la cromatografía por afinidad lisa una columna a la cual un anticuerpo específico a la proteína externa objetivo se ha acoplado. Un ejemplo de trabajos del método de expresión recombinante del gen externo anteriormente mencionado de conformidad con la invención es una terapia génica. Esta terapia génica incluye la terapia génica de un enfermedad a través de la condición de que un fármaco sentido para crear ARNm y promover la traducción para mejorar el nivel de expresión de un gen externo en las células blanco mediante el uso de un vector de expresión recombinante capaz de expresar el gen externo objetivo de conformidad con la invención. De conformidad con la terapia génica anteriormente mencionada utilizando un oligonucleótido sentido, el efecto medicinal deseado puede lograrse mediante la integración de dicho oligonucleótido sentido en el vector de expresión recombinante derivado de retrovirus, adenovirus, o AAV, infectando células pancreática á con la construcción, y administrando el inductor de activación transcripcional (compuesto de metal pesado) de la invención para mejorar así la eficiencia de la expresión de dicho oligonucleótido sentido. Los vectores de terapia génica para introducir el gen deseado tanto para la recombinación como para el mantenimiento extracromosomal ya se conocen en la técnica y cualquiera de dicho vectores puede ser utilizado en la presente invención. Por ejemplo, un vector viral o vector plasmídico se utiliza el cual contiene una copia del oligonucleótido de gen externo deseado unido a la secuencia MARE (elemento de respuesta a metal pesado) y es capaz de expresar el producto oligonucleótido correspondientes dentro de las células blanco. Como dicho vector, los vectores de expresión mencionados anteriormente puede ser utilizados pero los preferidos son los vectores preparados mediante el uso de los vectores descritos en USP 5252479 y PCT WO93/07282 (pWP-7A, pWP-19, pWU-1 , pWP-8A, pWP-21 , pRSVL, etc.), pRC/CMV (Invitrogen), etc. como vectores de origen. Los más preferidos son los diversos vectores virales descritos a continuación. La introducción del vector de expresión recombinante de la invención dentro de células puede llevarse a cabo mediante varios métodos conocidos en la técnica para la introducción de ADN dentro de células, tal como electroporación, transfección mediante fosfato de calcio o co- precipitación, transducción viral, y otros. Las células transformadas con el oligonucleótido objetivo pueden ser utilizadas en el estado aislado per se como un fármaco para mejorar el estado de enfermedad de humano asociado con un gen externo o como un sistema modelo para investigación terapéutica. En la terapia génica y utiliza la presente invención, la tecnología para introducir el gen deseado dentro de las células o tejidos blanco incluye dos métodos representativos. El primer método es uno (una técnica ex vivo) la cual comprende cosechar las células blanco a partir de un paciente a ser tratado, crecer las células ex vivo en la presencia de un activador de transcripción que comprende el inductor de activación transcripcional de la invención como un ingrediente activo para introducir el oligonucleótido de gen objetivo contenido por un vector retrovirus, y retransplantar las células resultantes. Este método es adecuado para la terapia de enfermedades genéticas asociadas con genes defectuosos, tales como eficiencia en ADA, cánceres y SIDA. El segundo método es un método de introducción directa del gen (técnica directa) la cual comprende inyectar el oligonucleótido objetivo (el oligonucleótido del gen externo objetivo) directamente dentro del cuerpo del paciente o sitio blanco tal como un tejido tumoral. A particularmente, dicho primer método para terapia génica se lleva a cabo en la práctica, por ejemplo como sigue. Por lo tanto, el método comprende separar las células mononucleares cosechadas a partir de un paciente (a partir de monocitos) con un fraccionador sanguíneo, crecer las células separadas en la presencia de un activador de transcripción que comprende el inductor de la invención como un ingrediente activo en un medio adecuado tal como medio AIM-V por aproximadamente 72 horas, y añadir el vector de expresión recombinante de la invención del cual contiene el oligonucleótido a ser introducido (el oligonucleótido del gen objetivo). Con el objeto de mejorar la eficiencia de introducción del oligonucleótido, las células se centrifugan ocasionalmente a 2500 rpm en la presencia de protamina a 32°C por una hora y, entonces, se cultivan en atmósferas de dióxido de carbono al 10% a 37°C por 24 horas. Después de que procedimiento anterior se repite varias veces, las células se cultivan adicionalmente en la presencia del activador de transcripción que comprende el inductor de la invención como un ingrediente activo en un medio, tal como medio AIM-V, por 48 horas y, entonces, se lavan con solución salina. El conteo de células viables se registra y la eficiencia de la introducción del oligonucleótido sentido se determina mediante PCR in situ o, cuando el objetivo de interés es la actividad enzimática, el grado de actividad se mide para confirmar el efecto de la introducción del oligonucleótido objetivo. Entonces, se realizan monitoreos satisfactorios, tales como cultivo para bacterias y hongos entre células cultivadas, pruebas para infección de micoplasma, y búsqueda para endotoxinas, y, después de la confirmación de la seguridad, las células cultivadas se transfectadas con la dosis pronosticada efectiva del oligonucleótido sentido (el oligonucleótido del gen objetivo) se regresan al paciente mediante conteo intravenoso. La terapia génica se consuma como el procedimiento anteriormente mencionado que se repite a intervalos de, por ejemplo, pocas semanas hasta pocos meses. La dosis del vector viral se selecciona juiciosamente de conformidad con las células blanco. Usualmente, la dosis preferida en términos del título de virus puede por ejemplo estar en el ¡ntervalo de 1 x 103 cfu a 1 x 108 cfu para 1 x 108 células blanco. Una modalidad alternativa del primer método anteriormente mencionado comprende el co-crecimiento de las células virales transfectadas con un vector de retrovirus que contiene el oligonucleótido sentido objetivo (el oligonucleótido del gen objetivo) junto con las células del paciente para introducir el oligonucleótido (el oligonucleótido del gen objetivo) dentro de las células blanco. Para llevar a cabo el segundo método (técnica directa) para terapia génica, es una buena práctica es llevar a cabo un experimento preliminar ex vivo antes, medíante una búsqueda en PCR para el ADNc del gen del vector o un análisis de PCR in situ, para observar si el oligonucleótido objetivo (el oligonucleótido del gen objetivo) puede introducirse de hecho mediante este método de introducción del gen o si una elevación de la actividad específica o crecimiento o inhibidor de crecimiento de las células blanco, del cual es el efecto terapéutico esperado de la introducción del oligonucleótido sentido objetivo (el oligonucleótido del gen objetivo), puede tomar lugar de hecho. Además, cuando un vector viral se emplea, por supuesto es importante confirmar la seguridad de la introducción del oligonucleótido para terapia génica a llevar a cabo una búsqueda de PCR para retrovirus proliferativos, medición de la actividad de transcriptasa reversa, o llevar a cabo un monitoreos en PCR del gen de la proteína membranales (env). La presente invención además provee una composición farmacéutica o preparación farmacéutica (gen agente terapéutico) que comprende células transfectadas con el vector de expresión recombinante o el oligonucleótido objetivo (el oligonucleótido del gen objetivo) de la invención como un ingrediente activo en una cantidad farmacéuticamente efectiva y un vehículo o diluyente farmacéutico adecuado no tóxico. El vehículo farmacéutico el cual puede formularse en la composición farmacéutica (preparación farmacéutica) de la presente invención incluye a aquellos diluyentes, excipientes y similares los cuales generalmente se utilizan de conformidad con las formas de dosis, tales como llenadores, extensores, aglutinantes, humectantes, desintegradores, agentes tensioactivos, lubricantes, y otros. Estos pueden usarse selectivamente de conformidad con la forma de dosis unitaria para la preparación. Las formas de dosis unitaria para la preparación farmacéutica de la invención pueden ser las mismas que aquellas mencionadas para la preparación del polipéptido codificado por el gen objetivo, y pueden ser juiciosamente seleccionadas a partir de varias formas de conformidad con los propósitos terapéuticos.

Por ejemplo, la preparación farmacéutica que contiene el vector de expresión recombinante de la invención se prepara en la forma en la cual el vector se atrapa en liposomas o en la forma de células cultivadas infectadas con un virus que contiene un vector retroviral que contiene el oligonucleótido sentido deseado. Estos pueden adicionalmente procesar se hacía dichas formas como se formulan en solución salina amortiguada con fosfato (pH 7.4), en solución de Ringer o en una composición intracelulares inyectables en forma del fluido. Además, estos pueden proveerse en dichas formas como se puedan administrar juntas con una sustancia conductiva para una eficiencia incrementada de introducción del gen, tal como protamina. El método para la administración de dicha preparación farmacéutica no está particularmente restringido pero puede seleccionarse de conformidad con la forma de dosis, la edad del paciente, el sexo y otros factores, y la severidad de la enfermedad, entre otras condiciones. La cantidad del ingrediente activo a estar contenido en dicha preparación farmacéutica y la dosis del mismo no se restringen particularmente sino que pueden seleccionarse libremente a partir de una intervalo en consideración de la eficiencia terapéutica esperada, el método de administración, el período de tratamiento y la edad del paciente, sexo, y otros factores, entre otros. Generalmente, la dosis del vector retroviral que contiene al oligonucieótido sentido objetivo como una preparación farmacéutica por kg de peso corporal para un adulto humano puede por ejemplo seleccionarse, como la regla del pulgar, a partir del intervalo de aproximadamente 1 x 103 pfu hasta aproximadamente 1 x 1015 pfu en términos del título de retrovirus. En el caso de las células que contiene el oligonucleótido objetivo o el vector de expresión recombinante de la invención, la dosis adecuada puede seleccionarse a partir del intervalo de aproximadamente 1 x 104 células/cuerpo hasta 1 x 1015 células/cuerpo. Esta preparación farmacéutica puede administrarse una vez al día o en unas pocas dosis divididas en el día, o administrarse intermitente mente aún ¡ntervalo de 1 a unas pocas semanas. Preferiblemente, el inductor de activación transcripcional de la invención (activador de la transcripción) puede administrarse en combinación con una sustancia capaz de incrementar la eficiencia de la introducción del gen, tal como protamina, una preparación farmacéutica que contiene la misma. El método para la expresión del gen externo de conformidad con la presente invención puede aplicarse a selección de fármacos y, como tal, la presente invención además provee un método para selección de fármaco. Este método de selección puede llevarse a cabo al utilizar un sistema de expresión de gen externo que comprende un gen externo no funcional de conformidad con invención o células que expresan un gen externo. Mediante dicho sistema de expresión del gen externo de la invención o células que expresan el gen externo para crecer y multiplicado en la presencia de una sustancia fármaco a ser seleccionada por un periodo predeterminado de tiempo y midiendo la velocidad de crecimiento de las células, se puede determinar si, por ejemplo, el compuesto candidato es capaz de modular el crecimiento de las células, modulando el acoplamiento proteína-proteína, o modulando la capacidad para formar complejos. Como un modo para medir la velocidad de crecimiento o proliferación, la actividad biológica del receptor del gen externo también puede ser medida. Además, de conformidad con la presente invención, al construir un ratón nocaut (ratón mutante) que contiene gen blanco, se puede confirmar que sitio de la secuencia de gen blanco influye sobre dichos cambios en las células o tejido in vivo, es decir que funciones desempeñan in vivo el producto del gen externo blanco y el producto del gen externo modificado. Este método es una técnica para la modificación intencional de la información genética de un organismo vivo al tomar ventaja de la recombinación homologa de los genes e incluye el método utilizando células madre embrionarias Guerra D. (células ES) como un ejemplo (Capecchi, M. R., Science, 244, 1288-1292 (1989)). El método anteriormente mencionado de elaboración de un ratón mutante es una tecnología rutinaria para los expertos en la técnica, y al aplicar un gen típico silvestre del gen objetivo y un gen mutante, por ejemplo, a esta tecnología modificada (Jikken Igaku (Medicina Experimental), ed. por Tetsuo Noda, Suplemento, 14 (20) (1996), Youdosha), un ratón mutante puede elaborarse fácilmente. Por lo tanto, a través de la aplicación de la tecnología anteriormente mencionada, es posible diseñar y desarrollar fármacos que tienen una actividad biológica mejorada de un tipo dado o estabilidad o fármacos que actúan como inhibidores, a comunistas o antagonistas de una actividad biológica dada. Además, la presente invención provee un sistema de expresión eucarionte o equipo de expresión que comprende células eucarionte transfectadas con un vector de expresión recombinante que tiene un sitio para la inserción de un gen externo para llevar a cabo la expresión del gen inducido y un inductor de activación transcripcional de la invención. Mediante la utilización del sistema de expresión eucarionte o equipo de expresión de la invención, la detección del gen externo objetivo, diagnóstico de enfermedades relacionadas con el gen objetivo, morbidez o estado de la investigación, y estudios sobre sustancia influye en el gen objetivo, e influencias sobre agonistas y antagonistas se pueden llevar a cabo de manera que se puede hacer grandes contribuciones en el campo de la medicina y del diagnóstico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una gráfica que muestra el grado de activación del MARE que resulta de la adición de un compuesto metálico del cual influye la actividad de transcripción del promotor eucarionte ¡nducible por síntesis de la invención.

La figura 2 es una gráfica que muestra la dependencia de la dosis del grado de activación del MARE que resulta de la adición del inductor de activación transcripcional (compuesto de oro) de la invención. La figura 3 es una gráfica que muestra la operación y el efecto del inductor de activación transcripcional (compuesto de oro) de la invención en cada una de las secuencias MARE. La figura 4 es una gráfica que muestra la operación y el efecto del inductor de activación transcripcional (compuesto de oro) sobre la secuencia ARE.

MEJOR MODO PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención en detalle adicional sin definir el alcance de la invención.

EJEMPLO 1 El siguiente es un ejemplo que muestra la construcción de un vector de expresión provisto con una secuencia de ADN responsable a un metal pesado, particularmente oro, es decir la secuencia MARE, de conformidad con la invención y el efecto de la invención a través de la medición de la actividad del vector de expresión. (a) construcción de un vector recombinante Como el esqueleto basal del vector recombinante, se utilizó pGL2-Basic (producto de Promega). Este vector es un vector de expresión de luciferasa. El promotor SV40 del esqueleto basal anteriormente mencionado pGL2-Basic se sustituyó con oligonucleótidos (SEQ ID NO: 8 y NO: 9, cada uno de 41 elementos) que contenían la secuencia TATA del promotor de a-globina de conejo en el sitio Bgl Il/Hind lll para construir pRBGP3 (Nature, 367, 568-572 (1994)). Entonces, tres copias (Mol Cel. Biol., 14, 700-712 )1994)) de varios oligonucleótidos (de 32 elementos) que contenían las secuencias MARE de SEQ ID NO:1 hasta 7, secuencias MARE comparativas o control (SEQ ID NO; 1 - 4, 6 y 7), y secuencias ARE (SEQ ID NO: 5) se insertaron respectivamente dentro del sitio Xhol del vector pUC118 con una secuencia poliadaptadora modificada. Además, la porción que contiene los tres repetidos de la secuencia MARE se escindió en el sitio Kpnl/BamHl y se insertó dentro del sitio Kpnl/BamHl de pRBGP3. Como un ejemplo de la secuencia anterior de 32 elementos, la que contenía MARE de SEQ ID NO: 2 se muestra en SEQ ID NO: 20. En la presente, tcgag representa el sitio Xhol. Así se obtuvieron los plásmidos 3xMARE/RBGP-Luc y 3xARE/RBGP-Luc que contenían tres repetidos de secuencias de 32 oligonucleótidos que contienen los 13 oligonucleótidos mostrados en SEQ ID NO: 1 hasta 7 (secuencias MARE, secuencias ARE, y las secuencias comparativas y control correspondientes). La SEQ ID NO: 21 es un ejemplo de la secuencia contenida en el 3xMARE/RBGP-Luc resultante utilizando SEQ ID NO: 2 como MARE. Los vectores de expresión recombinante obtenidos se utilizaron para las transfecciones subsecuentes. (b) método de expresión Las transfecciones se llevaron a cabo utilizando el reactivo de transfección Superfect (Qiagen) de conformidad con el protocolo anexo al reactivo. La línea celular de carcinoma hepatocelular de humano HepG2 se subcultivó sobre una caja de 35 mm y, después de 24 horas, la transfección se llevó a cabo. Así, una solución de transfección que contenía 100 µl de una solución de vector que contenía 0.25 µl del plásmido anteriormente mencionado, 100 µl de Superfect, y 600 µl de medio DMEM líderes fueron se añadieron a una placa de células lavados con PBS. Después de dos horas de incubación a 37°C, el medio se cambió a medio DMEM suplementado con 10% de FCS. Después de dos horas, los reactivos estimulantes que contenían varios compuesto de metal pesado inclusivos de auranofin; Ridaura TM, producto de Sigma; (2, 3, 4, 6-tetra-O-acetil-1-tio-a-D-glucopiranosato-S) (trietilfosfina)oro se añadieron y el cultivo se continuó. La actividad de luciferasa en la células se ensayó 15-18 horas después. (c) método de medición de la actividad El ensayo de actividad de luciferasa se llevó a cabo utilizando un sistema de ensayó reportero Dual-Luciferase (producto de Promega) de conformidad con el protocolo del fabricante. A la placa de cultivo se le añadieron 100 µl del amortiguador citolítico incluido en el equipo de 200 µl para lisar las células, se utilizó una centrífuga de mesa, el lisado se centrifugó a 15,000 rpm por cinco segundos. El sobrenadante, 20 µl, del lisado se mezcló con 100 µl del reactivo unido LARII y la primera quimoluminiscencia se midió con un luminómetro. Entonces, 100 µl del agente de paro (Stop & Glo Reagent) se añadió y la segunda quimoluminiscencia se midió. La relación de la primera y segunda quimoluminiscencias se determinó para calcular la actividad de luciferasa. (1 ) Estudios sobre los efectos de la variación de los ¡ones de metal pesado sobre la responsabilidad al metal de la secuencia MARE El vector de expresión recombinante (plásmido reportero) ligado con la secuencia MARE de SEQ ID NO: 2 como se elaboró bajo (a) anteriormente mencionado, es decir 3xMARE/RBGP-Luc, se utilizó. Los reactivos estimulantes que contenían varios compuesto de metal pesado, es decir 100 µl cada uno de cloruro de manganeso (MnCI2), cloruro de cobalto (CoCI2), cloruro de níquel (NiCI2), sulfato de cobre (CdS?4), sulfato de zinc (ZnSO4), sulfato de cadmio (CdSO4), cloruro de mercurio (HgCI2) y tetracloroaureato de sodio (lll) (Na(AuCI4)) y 5 µl de auranofin, se añadieron respectivamente y las células se cultivaron mediante el procedimiento anteriormente mencionado (b) por 18 horas. Entonces, la actividad de luciferasa se midió mediante procedimiento descrito bajo (c) anteriormente mencionado. Los resultados se muestran en la figura 1. En la figura 1 , "tratamiento" representa un control sin la adición de ningún compuesto de metal pesado y la abscisa (veces de activación) representa la relación de la actividad de luciferasa con dicho control siendo tomada como 1. Se confirmó a partir de la figura 1 , que de los varios metales pesados añadidos, las actividades de luciferasa en los múltiples controles no tratados fue de 6.9 para cloruro de cobalto, 27.3 para sulfato de cadmio, 10 para cloruro de mercurio, y 4.3 para tetracloroaureato de sodio (lll). Particularmente con auranofin, la actividad luciferasa fue prominentemente tan alta como de 142. 4 veces. (2) Estudios sobre la operación v efecto de varios compuesto de oro sobre la secuencia MARE El vector de expresión recombinante (plásmido reportero) ligado con la secuencia MARE de SEQ ID NO: 2 como se elaboró bajo (a) anteriormente mencionado, es decir 3xMARE/RBGP-Luc, se utilizó. De conformidad con el método anteriormente mencionado (b), tres tipos de compuestos de oro se añadieron: auranofin (representado por "AUR" en el dibujo) a los niveles de 0.5, 1 , 2, 5, 10 y 20 µM, (l-tio-D-glucopiranosato)oro ("AuTG" en el dibujo) a los niveles de 20, 100, 250 y 500 µM, y aurotiomalato de sodio ("AuTM" en el dibujo) a los niveles de 10, 25, 50, 100, 250 y 500 µM, y la misma prueba como (1 ) anteriormente mencionadas se llevó a cabo. Los resultados muestran en la figura 2 (ordenada: relación de actividad de luciferasa (veces de activación), abscisa: concentración de cada compuesto). Se confirmó a partir de la figura 2 de los tres tipos de compuestos de oro añadidos activan MARE de manera dosis dependiente. Auramofin, en particular, ocasiona una impresionante de activación de luciferasa en comparación con los otros dos tipos de compuestos de oro. (3) Estudios sobre la operación y efecto de auranofin sobre cada secuencia MARE Los vectores de expresión recombinante (plásmidos reporteros) que tienen unidos a estos las secuencias MARE de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 4, 6 y 7, respectivamente, denominados plásmidos 3xMARE/RBGP-Luc, y como controles positivos, elementos de respuesta a suero (SRE), NAMELY dxSRE(c-fos) [Cell, 42, pp. 889-902 (1985), SRE contenido en el promotor c-fos] y 5xkB (IL2R-a) [Oncogene, 10, pp. 1199-1207 (1995), el elemento kB contenido en el promotor á receptor IL-2], respectivamente, se elaboraron mediante el mismo procedimiento como se describió bajo (a).

Se sabe que SRE (elemento de respuesta a suero) se activa por SRF (factor de respuesta a suero), mientras que kB esta activada por NFkB (factor nuclear kB). Cada uno de los vectores anteriormente mencionados se cultivó mediante procedimiento anteriormente mencionado (b) por 18 horas en la presencia de 5 µM de auranofin en ausencia del mismo y la actividad de luciferasa se midió mediante el procedimiento anteriormente mencionado (c). Los resultados se muestran en la figura 3 (ordenada: cada vector, abscisa: relación de actividad de luciferasa, hilera superior; sin auranofin, hilera interior: 5 µM de auranofin añadida). Se puede observar a partir de la figura 3 que auranofin no actúa sobre ninguno de los MARE control de SEQ ID NO: 6, el elemento AP-1 (proteína activadora-1 ) de SEQ ID NO: 7, y las secuencias de control positivo, es decir 5xSRE (c-fos) y 5xkB (IL2R-a), pero actúa específicamente sobre las secuencias MARE respectivas de SEQ ID NO: 1 , 2, 3 y 4. Las relaciones de actividad de la transcripción de estas secuencias MARE fueron 53.3, 158.7, 30.8, y 112.9. (4) Estudios de las operaciones y efectos de varios compuestos de oro sobre las secuencias ARE El vector de expresión recombinante (plásmido reportero) que tiene una unión a ía secuencia ARE de SEQ ID NO: 5, la cual se parece a MARE en la secuencia, como se elaboró mediante el procedimiento descrito bajo (a), es decir 3xARE/RBGP-Luc, se cultivó mediante el procedimiento anterior (b) en la presencia de 3 compuestos de oro, es decir auranofin (AUR, 5 µM), (1-tio-D- glucopiranosato) de oro (AuTG, 500 µM) y aurotiomalato de sodio (AuTM, 100 µM), respectivamente, o en la presencia de tiomalato (TM, 100 µM), el cual está estructuralmente relacionado al aurotiomalato de sodio pero no contiene oro, o tBHQ (2,5-di-tert-butilhidroquinona, producto de Wako, 60 µM), el cual se sabe que es un activador de transcripción de ARE, como en (1) y la relación de actividad de luciferasa se determinó. Los resultados se muestran en la figura 4 de manera similar a la figura 1 (las abreviaturas de los reactivos añadidos son las mismas que anteriormente; cada relación de actividad de luciferasa se calculó con el valor control encontrado mediante el cultivo del vector en ausencia del reactivo prueba lo cual se toma como 1). Se puede observar a partir de la figura 3 que en el plásmido reportero que tiene una unión a la secuencia ARE del gen Ya de la glutatión S-transferasa, cada auranofin, (1-tio-D-glucopiranosato) de oro y aurotiomalato de sodio actúan sobre un inductor de activación transcripcional. El grado de activación fue ya sea equivalente (AuTM; relación de actividad: 8.1+/-0.4) a la de tBHQ (relación de actividad: 6.0+/-3.8) la mayor (AuTG; relación de actividad: 21.7±15.4, AUR; relación de actividad: 102.9±53.4). En el caso de AUR, en particular, la actividad fue prominentemente tan alta como aproximadamente 30 veces que en tBHQ. En contraste, el tiomalato el cual está estructuralmente relacionado al aurotiomalato de sodio pero carece de oro no induce el activación transcripcional de ARE (relación actividad: 2.1±0.6).

Es aparente a partir de los resultados de las pruebas anteriores que las secuencias MARE y las secuencias ARE de SEQ ID NO: 1 - 5 y 7, es decir que las secuencias base de SEQ ID NO: 1 y las secuencias de ADN homologas a la misma en al menos 6 bases son secuencias de ADN que responden a metal pesado y, como tales, ocasionan en la activación transcripcional de MARE y ARE en la presencia del metal pesado particular. Además, se confirmó que sobre estas secuencias MARE y ARE, los compuestos de plata, cadmio, cobalto y oro, particularmente los compuestos de oro, son prominentes en el efecto de inducir la activación transcripcional de MARE y ARE. Por lo tanto, el sistema de expresión o el equipo de expresión que comprende un vector de expresión recombinante al cual cualquiera de las secuencias MARE de SEQ ID NO: 1 y las secuencias homologas a la misma en al menos seis nucleótidos han sido unidas o ligadas y dicho compuesto de metal pesado puede ser utilizado como un vector capaz de inducir un fármaco para terapia génica en la aplicación de tecnologías en donde un ratón experimental se hace que ingiera un metal pesado, particularmente un compuesto de oro, y por lo tanto induce un gen relacionado con enfermedad en un ratón knockout un ratón transgénico.

Aplicabilidad industrial De conformidad con la presente invención se puede proveer un vector capaz de inducir un fármaco para terapia génica. Además, de 0 conformidad con la invención se puede proveer una aplicación de tecnología en donde un gen relacionado a enfermedad puede ser inducido en un ratón knockout un ratón transgénico, por ejemplo. Además, de conformidad con la presente invención se puede proveer un equipo para inducción de genes en células cultivadas, por ejemplo.

LISTADO DÉ SECUENCIA <110> Otsuka Pharmaceut ical Co. , 1 td. <120> Activador ranscripr-donal <130> P99-66 <160> 21 <170>Patente enVer. 2.0 <210> 1 <211> 13 <212>A?Í. < 13> Secuencia Artificial <220> <223> ELe-nepto de recaxxñjniento Maf <400> 1 t-gctgactca gca 13 <210> 2 <211> 13 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Elemento de recx»ocÍBiiento Maf <400> 2 ígcttactaa gca 13 <210> 3 <211> 13 <212> -a8 <213> Secuencia ArtificdLal <220> <223> Elemento de reconoc-Lniento Maf <400> 3 tgaígactca tea 13 <210> 4 <211> 13 <212> ATO <213> Secuencia Artificial <220> <223> ELementp de -reconocimiento Maf <400> 4 tgccgac tca t tg 13 <210> 5 <211> 13 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Elemento de ratón sensible, a antioxidante <400> 5 tggtgacaaa gca 13 <210> 6 <211> 13 <2 I2> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Secuencia central del elemento de recanocú-áento Maf <m> 6 tgaggactcc tea 13 <210> 7 <211> 13 <212> AD <213> Secuencia Artificial <220> < 223> Elemento de -reconocimiento AP-1 <400> 7 ccatgactca ttg 13 <210> 8 <211> 41 <212> ADN < 13> Secuencia 5' del promotor de eta-gldbina de conejo <220> <223> Caja TATA de beta-giobina de conejo <400> 8 gatcttgggc ataaaaggca gageactgea gctgctgctt a 41 <210> 9 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia 3' del promotor de betarglobina de conejo <220> <223> Caja TATA de beta¿globina de conejo <400> 9 agcttaagca gcagctgcag tgctctgcct tttatgccca a 41 <210> 10 <211> 12 <212> ™ <213> Secuencia Artificial <220> <223> Secuencia adaptadora de MARE <400> 10 tcgagctcgg aat 13 <210> 11 <211> 6 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> < 23/ Secuencia adaptadora de MARE <400> 11 ttactc <210> 12 <211> 9 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> < 3> Secuencia adaptadora de MARE <400> 9 cgagagtaa <210> 13 <211> 10 <212> .ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> JSe8e8i3 adaptadora de MARE <400> 13 attccgagct 10 <210> 14 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia adaptadora de pDCllß <400> 14 ggtaccactc gaggatcc 18 <210> 15 <211> 18 <212> DN <213> Secuencia adaptadora de pOC118 <400> 15 ggtaccactc gaggatcc <210> 16 <211> 13 <212> AON <213> GSt-Pi de Rata <220> <223> Elemento de rata GSt-Pi sensible á antioxidante <400> 16 ct atgat tca gca 13 <210> 17 <211> 13 <212> AOM <213> ßSt-P1 de Rata <220> \223> Elemento de rata GSt-PI sensible a antloxldante <400> 17 cagtgacttg gca 13 <210> 18 <211> 13 <212> AOM <213> SSt-P1 de Rata <220> <223> Eleaento de rata ßSt-PI sensible a antloxldante <400> 18 gggtgactca gca 13 <210> 19 <211> 13 <212>ADM <213> GSt-PI de Rata <220> < 3> Elemento de rata GSt-P sensible a antlox dante <400> 19 cgctgactca cgg 13 <210> 20 <211> 32 <2Í2> ADM <213> Secuencia artificial <220> 023> Ollgonucledtldo que contiene secuencia HARÉ <400> 32 tcgagctcgg aattgcttac taagcattac tc 32 <210> 21 <211> 146 <212> AD <213> Secuencia artificial <220> <223> Secuencia 3xHARE/RBG-Luc <400> 32 tcgagctcgg aattgcttac taagcattac tctcgagctc ggaattgctt actaagcatt 60 actctcgagc tcggaattgc ttactaagca ttactctcga ggatcttggg cataaaaggc 12Q agagcactgc agctgctgct taagct 146

Claims (4)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.-Un inductor de activación transcripcional para inducir la actividad de activación transcripcional de un promotor eucarionte inducible por síntesis que contiene una secuencia de ADN derivada a partir de un promotor natural como se selecciona a partir del grupo que consiste de las secuencias de bases de SEQ ID NO: 1 - 4 y los homólogos a las secuencias de bases en al menos 6 bases a la secuencia de bases de SEQ ID NO: 1 y teniendo actividad de activación transcripcional, cuyo inductor comprende un compuesto metálico seleccionado a partir del grupo que consiste de compuestos de plata, mercurio, cadmio y oro como un ingrediente activador.

2.- El inductor de activación transcripcional de conformidad con la reivindicaciones 6, caracterizado además porque compuesto de oro se selecciona a partir del grupo que consiste de (2, 3, 4, 6-tetra-O-acetil-1 -tio-a-D-glucopiranosato-S) (trietilfosfina)oro, (l-tio-D-glucopiranosato)oro, y aurotiomalato de sodio.

3.- Un equipo de expresión eucarionte que comprende células eucariontes que contiene un vector de expresión recombinante que contiene un sitio para la inserción de un gen externo el cual está unido a un promotor eucarionte inducible por síntesis que comprende una secuencia ADN derivada a partir de un promotor natural como se selecciona a partir del grupo que consiste de las secuencias de bases de SEQ ID NO: 1- 4 y los homólogos de las secuencias de bases en al menos seis bases a la secuencia de bases de SEQ ID NO: 1 y que tienen actividad activación transcripcional e inductor de activación transcripcional de conformidad con la reivindicación 6 ó 7.

4.- Un método para la expresión de un gen externo en un sistema eucarionte que comprende poner al vector de expresión recombinante de conformidad con la reivindicación 9 y que contiene un gen externo en contacto con el inductor de activación transcripcional de conformidad con la reivindicación 6 ó 7 para activar el promotor eucarionte poseído por dicho vector y por lo tanto promover la inducción de la expresión del gen externo.