MXPA02003634A - Metodo y sistema de expresion de proteina de alto rendimiento. - Google Patents

Abstract

Celula transformada metabolicamente la cual sobreexpresa piruvato carboxilasa para permitir una produccion mejorada de una proteina o peptido en comparacion con una celula comparable que no realiza dicha sobreexpresion. Ademas se refiere al correspondiente metodo para mejorar la produccion de por lo menos una proteina o peptido en una celula huesped.

Description

MÉTODO Y SISTEMA DE EXPRESIÓN DE PROTEINA DE ALTO RENDIMIENTO DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La producción comercial de proteinas recombinantes para uso industrial y médico ha aumentado significativamente en los años recientes. Por ejemplo, los procesos de síntesis basados en la química convencionales están siendo reemplazados en forma creciente por los procesos a gran escala que utilizan catálisis enzimática (biocatálisis). Las industrias de los alimentos y de los detergentes son dos de las principales industrias que utilizan procesos biológicos a gran escala. Las enzimas importantes en la industria de la leche incluyen el cuajo, lactasa, papaina y pectinesterasas; en el procesamiento del almidón la alfa-amilasa, glucoamilasa y glucosa isomerasa: en la industria de los detergentes, proteasa, lipasa y amilasa; en la textil, amilasa; y en la industria del papel y la celulosa, las celulasas. El mercado para las proteinas y péptidos de diagnóstico y terapéuticos también se está expandiendo. Las principales drogas péptidos incluyen la eritropoyetina, insulina, el factor de estimulación de colonias de granulocitos, la hormona de crecimiento humano e interferón. A pesar de que los costos para la producción industria recombinante y de las proteinas y péptidos terapéuticos incluyen aquellos asociados con los procesos de fermentación y de purificación, el factor limitante es la concentración REF 136881 de la proteína activa o del péptido que se puede alcanzar a partir del proceso de fermentación. En consecuencia, un método para incrementar el rendimiento de las proteinas recombinantes permitiría ahorros significativos en los costos en la industria. La Escherichia coli es el organismo usado mas extensamente en ia producción de proteinas recombinantes. Se ha caracterizado bien, es de crecimiento rápido y económico y relativamente fácil de alterar genéticamente. Algunas cepas son capaces de producir tanto como el 30% del total de su proteina como producto de gen expresado. Las proteinas producidas a partir de E. coli recombinante incluyen la insulina, las interferonas, hormonas del crecimiento, interleucinas, hidrolasas, reductasa y transferasas. Con el objeto de generar masa celular y producir proteínas, todas las células tienen que catabolizar glucosa u otros carbohidratos para producir energía y metabolitos claves. Estos carbohidratos son procesados vía glicólisis y convertidos en fosfoenolpiruvato (PEP). El PEP es convertido en dos importantes intermediarios metabólicos, piruvato y oxaloacetato (ver Figura 1). Luego se convierte el piruvato en acetil-CoA. En presencia de oxígeno, como es típicamente el caso en la producción de proteina recombinante, se combinan la acetil-CoA y el metabolito oxaloacetato de 4-carbonos para entregar el metabolito citrato de 6-carbonos, entregando con ello energía al ciclo del ácido tricarboxplico (TCA), entregando energía y metabolitos claves para la célula (ver Figura 1 ). Alternativamente, el acetil-CoA puede experimentar un proceso de dos etapas para formar acetato, mientras que el oxaloacetato se puede usar para generar varios amino ácidos. Los intentos anteriores destinados a incrementar la eficiencia de la sintesis a gran escala de la proteina recombinante en E. coli se han centrado en la reducción de la cantidad de acetato acumulado durante las fermentaciones, debido a que se ha sospechado que la acumulación de acetato es el factor limitante en la obtención de rendimientos altos de proteina. Sin embargo, a pesar de los vigorosos esfuerzos de investigación en esta área, este enfoque no ha permitido alcanzar avances significativos en la producción de proteina recombinante. Los progresos continuados en las técnicas de producción de proteina recombinante son muy deseados y buscados en una forma activa por la industria de procesamiento biológico emergente. Claramente, se requiere un nuevo enfoque hacia un mayor rendimiento de proteina en la fermentación a gran escala. La piruvato carboxilasa es una enzima dependiente de la biotina la cual es capaz de realizar reacciones anapleróticas mediante la conversión de piruvato y dióxido de carbono en oxaloacetato. Esta enzima se ha encontrado en numerosos tipo de células diferentes que van desde las bacterias hasta las humanas. Sorprendentemente se ha encontrado que la actividad aumentada de piruvato carboxilasa dentro de una célula huésped tiene como resultado una mejora en la producción de polipéptido. En consecuencia, la invención comprende un aumento de la actividad de piruvato carboxilasa dentro de una célula huésped que produce una proteina o péptido. Se espera que el incremento en la producción de polipétido por medio de la invención es totalmente independiente del tipo de célula huésped, la fuente del gen piruvato carboxilasa y la naturaleza de la proteina o del péptido a ser expresado. Así la presente invención representa un inesperado avance en la ingeniería de las proteinas recombinantes; virtualmente cualquier célula que se utiliza para producir proteinas o péptidos se puede transformar genéticamente de acuerdo a la invención con el objeto de mejorar el rendimiento de la proteina o de péptido. Por lo tanto, la presente invención comprende un método para mejorar la producción de proteina o de péptido en una célula huésped usada para la producción de proteina. El método comprende la transformación metabólica de la célula huésped mediante la introducción en la célula un fragmento de ácido nucleico natural (es decir, endógeno) y/o extraño ( es decir heterólogo) el cual codifica funcionalmente una piruvato carboxilasa de tal modo de sobreproducir piruvato carboxilasa en la célula huésped, en comparación con una célula que no se ha transformado. Sorprendentemente y en forma ventajosa, la trasnformación de la célula huésped para producir piruvato carboxilasa aumenta la producción de la proteina o del péptído de interés. Alternativamente, el ADN de una célula que exprese endógenamente una piruvato carboxilasa puede ser mutado para incrementar la expresión del gen piruvato carboxilasa natural o nativo y con ello la enzima piruvato carboxilasa, de tal modo que la célula exhiba una producción aumentada de proteina o de péptido.

La sobreexpresión de piruvato carboxilasa se realiza preferentemente transformando una célula huésped con un fragmento de ADN que codifica una piruvato carboxilasa derivada de un organismo que expresa endógenamente piruvato carboxilasa, tales como Rhizobium eí//, Corynebacterium glutamicum, Methanobacterium thermoautotrophicum o Pseudomonas fluorescens. La piruvato carboxilasa puede ser expresada dentro de la célula transformada metabólicamente a partir de un vector de expresión, o alternativamente a partir de un fragmento de ADN el cual se ha integrado cromosómicamente al genoma de la célula huésped. La célula huésped no está limitada de ninguna manera, pudiendo ser cualquier tipo de célula usada para la producción de proteinas o péptidos. En una modalidad particularmente preferida de la invención, la célula transformada metabólicamente es una célula de bacteria tal como E. coli o Bacillus subtilis, una célula de levadura, una célula de planta, una célula de insecto o una célula de mamífero tal como una célula de ratón o humana. La presente invención comprende además un método para producir una proteina o un péptido. El método para producir la proteína o péptido incluye proveer una célula transformada metabólicamente la cual sobreexprese piruvato carboxilasa seguido por el cultivo de la célula transformada metabólicamente para producir la expresión aumentada de la proteina o del péptido. Opcionalmente, el método incluye transformar la célula huésped con un fragmento de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótido que codifica una enzima piruvato carboxilasa para obtener la célula transformada metabólicamente. También, opcionalmente, se puede aislar la proteina o el péptido a partir de la célula. En un método alternativo, se puede mutar el ADN de una célula huésped que expresa endógenamente una piruvato carboxilasa con el objeto de alterar la transcripción del gen piruvato carboxilasa nativo de tal modo de producir una sobreproducción de la enzima nativa. La invención también provee un novedoso sistema de expresión de proteína. El sistema de expresión de proteina incluye cualquier célula o cultivo de células que sea útil para la expresión de las proteinas o péptidos, en el cual la o las células han sido modificadas para sobreexpresar piruvato carboxilasa de acuerdo con la invención, incrementado con ello la producción de proteina o de péptido. El sistema de expresión de proteina de la invención es capaz de producir rendimientos superiores de las proteinas o péptidos que el sistema de expresión que utiliza la célula o el cultivo celular análogo y el cual no sobreexprese piruvato carboxilasa. La invención provee además una célula transformada metabólicamente para usar en la producción de una proteina o de un péptido, donde la célula se ha transformado metabólicamente para sobreexpresar PEP carboxilasa con el objeto de obtener una producción mejorada de la proteina o el péptido comparada con una célula comparable y que no sobreexprese PEP carboxilasa. Preferentemente la célula es una que no utiliza PEP para efectuar el transporte de glucosa al interior de la célula. También se entrega un método para producir proteina o un péptido el cual incluye cultivar una célula transformada metabólicamente y que sobreexprese PEP cartboxilasa durante un período de tiempo y bajo condiciones para producir la proteina o el péptido.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una vía metabólica aeróbica en E. coli representando la glicólisis, el ciclo TCA, y la biosíntesis de los compuestos bioquímicos derivados de oxaloacetato; las lineas de trazos significan que se requieren múltiples etapas para biosintetizar el compuesto, mientras que las líneas continuas significan una conversión en una sola etapa; la participación de PEP en la recuperación de glucosa se muestra en una línea delgada o tenue; la vía mostrada no es estequiométrica y ella tampoco incluye cofactores. La Figura 2 es un gráfico mostrando el análisis cinético de las actividades píruvato carboxilasa para MG1655 pUC18 (O) y MG1655 pUC18-pyc (•) con respecto del piruvato. La Figura 3 es un gráfico mostrando los efectos del aumento de las concentraciones del aspartato sobre ia actividad de la piruvato carboxilasa. La Figura 4 es un gráfico mostrando el análisis cinético de la piruvato carboxilasa con respecto del ATP y ADP: la actividad pi vato carboxilasa se determinó en ausencia de ADP (•) y en presencia de 1 ,5 mM ADP (O).

La Figura 5 es un plato de Petri, mostrando el crecimiento de una cepa ppc nuil E. coli la cual contiene una construcción pUC18 o la pUC18-pyc en un medio mínimo el cual utiliza glucosa como única fuente de carbono. La Fuente 6 muestra una vía anaeróbica en E. coli representando la glicólisis o la biosíntesis de compuestos bioquímicos derivados de oxaloacetato seleccionados; la participación de PEP en la recuperación de glucosa se muestra en la línea de trazos; la vía tal como se muestra no es estequiométrica y tampoco incluye todos los cofactores. La Figura 7 es un gráfico mostrando el efecto de los nucleótidos nicotinamida sobre la actividad piruvato carboxilasa : NADH(O); NAD + (D), NADPH ( ? ) y NADP+ ( 0 ). La Figura 8 es un gráfico mostrando el patrón de crecimiento y determinados productos de fermentación de la cepa tipo silvestre (MG1655) bajo estrictas condiciones aneróbicas en un medio con glucosa limitado (10 g/L), se midieron las concentraciones de la glucosa (•), succinato (B), lactato (O), formiato (D) y de la masa celular seca ( ? ). La Figura 9 es un gráfico mostrando el patrón de crecimiento y productos de fermentación seleccionados de la cepa tipo silvestre con clonado pUC18/ vector de expresión (MG1655/pUC18) bajo estrictas condiciones anaeróbicas en un medio limitado en glucosa (10 g/L); se midieron las concentraciones de la glucosa (•), del succinato (B), lactato (O), formiato (D) y la masa celular seca (?).

La Figura 10 es un gráfico mostrando mostrando el patrón de crecimiento y determinados productos de la fermentación de la cepa tipo silvestre con el gen pyc (MG1655/pUC18-pyc) bajo estrictas condiciones anaeróbicas en un medio limitado en glucosa (10 g/L); se midieron las concentraciones de la glucosa (•), del succinato (B), lactato (O), formiato (D) y la masa celular seca (?). La Figura 11 es un gráfico mostrando el patrón de crecimiento y la producción de treonina en la cepa productora de treonina betalM-4 (ATCC 21277) conteniendo pTrc99A o pTrc99A-pyc bajo estrictas condiciones aeróbicas en un medio limitado en glucosa (30 g/L) ; se midió la densidad óptica en la cepa conteniendo pTrc99A (O), la densidad óptica en la cepa conteniendo pTrcA-pyc (D), las conceptrcaiones de treonina en la cepa conteniendo pTrc99A-pyc (•). La Figura 12 es un gráfico representando la producción de beta-galactosidasa por E. coli MG1655pTrc99-pyc pACYC-lacZ (•) y E Coli MG1655 pY¡Trc99A pACYC-lacZ ( O) crecido en frascos agitados de 100 mL. La Figura 13 es un gráfico mostrando la producción de catecol 2,3-dioxigenasaa partir de E. coli MG1655 pTrc99A-pyc pACYC-xylE (•) y E coli MG1655 pTrc99ApACYC-xylE (O) cultivados en frascos agitados de 100 mL. La Figura 14 es un gráfico representando la concentracaión de la masa celular de E. coli MG 1655 pTrc99A-pyc pACYCJacZ. (•) y E. coli MG1655 pTrc99A pACYC-lacZ, conjuntamente con la producción de beta-galactosidasa para E coli MG1655 pTrc99A-pyc pACYCJacZ (O) E coli MG1655pTrc99A pACYC-/acZ (-*- ) crecidos en fermentadores de 2 L usando hidróxido de sodio para el control del pH. La Figura 15 es un gráfico representando la concentración de la glucosa del E. coli MG1655 pTrc99A-pyc pACYC-/acZ (•) y E coli MG1655 pTrc99A pACYCJacZ (O) conjuntamente con la concentración de acetato para E coli MG1655 pTrc99A-pyc pACYC-/acZ ( ) y E. coli MG1655 pTrc99A pACYC-/acZ (?) crecidos en ferementores de 2L usando hidróxido de sodio para el control del pH. La Figura 16 es un gráfico representando la concentración de la masa celular de E. coli MG1655 pTrc99A-pyc pACYCJacZ (•) y E. coli MG1655 pTrc99A pACYCJacZ (O), conjuntamente con la producción de beta-galactosida de E. coli MG1655 pTrc99A-pyc pACYJacZ (^ ) y E. coli MG1655 pTrc99A pACYCJacZ (?) crecido en ferementadores de 2 L usando carbonato de sodio para el control del pH. La Figura 17 es un gráfico representando la concentración de la glucosa del E coli MG1655 pTrc99A-pyc pACYC-/acZ (•) y E. coli MG1655 pTrc99A pACY-/acZ (O), conjuntamente con la concentración de acetato para E. coli MG 1655 pTrc99A-pyc pACYJacZ (A ) y £ coli MG1655 pTrc99A pACYCJacZ (?) crecido en fermentadores de 2L usando carbonato de sodio para el control del pH. La Figura 18 es un gráfico representando la fermentación del E. coli MG1655 pTrc99A pACYCJacZ en un medio definido de glucosa (Medio C2, Ejemplo IX). Símbolos (•) glucosa, (B) beta-galactosidasa, (O) densidad óptica, (?) acetato. La Figura 19 es un gráfico representando la fermentación del E. coli MG1655 pTrc99A-pyc pACYC-lacZ en un medio definido de glucosa (Medio C2, Ejemplo IX). Símbolos : (•) glucosa, (B) beta galactosida, (O) densidad óptica, (?) acetato.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Tal como se indicó anteriormente, los esfuerzos realizados anteriormente para aumentar los rendimientos de proteina en los sistemas recombinantes se han centrado en la reducción de la producción de acetato. La presente invención sigue un enfoque totalmente diferente, centrándose alternativamente en la transformación metabólica de una célula para regular en una forma ascendente una reacción anaplerótica que rellena los intermediarios del ciclo TCA para sobreproducir piruvato carboxilasa. El éxito logrado con este enfoque fue altamente inesperado. En primer lugar, la regulación metabólica del flujo de carbono en una célula está estrictamente regulado. Se han seguido diferentes estrategias de ingeniería metabólica, con poco éxito, en un esfuerzo de vencer la rigidez de la red que rodea al metabolismo del carbono. Por ejemplo, se observó que la sobreexpresión de la enzima nativa PEP carboxilasa en el E. coli aumenta el flujo de carbono hacia el oxaloacetato. (O Milard et al., Appli. Environ.

Microbiol., 62, 1808-1810 (1996) ; W. Framer et al., Appl. Env. Microbiol.. 3205- 3210 (1997); sin embargo, tales manipulaciones genéticas también producen una reducción en la recuperación de glucosa (P. Chao et al., Appli. Env. Microbiol., 59, 4261-4265 (1993)), dado que el PEP es un cosubstrato requerido para el transporte de la glucosa vía el sistema de la fosfotransferasa. En general, el flujo de carbono hacia el importante intermediario oxaloacetato en el ciclo TCA permanece constante independientemente de las perturbaciones del sistema (J. Vallino et al., Biotechnol. Bioeng., 41 , 633-6446 (1993)). En segundo lugar, solamente diez amino ácidos (glutamato, arginina, prolina, glutamina, aspartato, asparagina, lisina, metionina, treonina e isoleucina) son producidos a partir de los intermediarios del ciclo TCA, y en consecuencia no se espera un aumento de la producción de proteinas y péptidos (todos los cuales utilizan 20 amino ácidos) incluso si el carbono se pudiera dirigir exitosamente en un ciclo TCA. En consecuencia, contrariamente a lo que se podría haber predicho a partir de los conocimientos científicos en este campo, los solicitantes han descubierto que la sobreproducción de piruvato carboxilasa, la cual cataliza la reacción del piruvato al oxaloacetato, repone el carbono al ciclo TCA de tal modo que los componentes del ciclo TCA permanecen en niveles elevados, asegurando con ello un crecimiento celular continuo y la producción de proteina independientemente del hecho que en el cultivo se acumula acetato o no se acumula. Los términos "piruvato carboxilasa" y "enzima piruvato carboxilasa" significan una enzima que presenta actividad piruvato carboxilasa, es decir la cual es capaz de catalizar la carboxilación del piruvato para entregar oxaloacetato. El témino "piruvato carboxilasa" incluye así las enzimas piruvato carboxilasa que ocurren narturalmente, conjuntamente con fragmentos, derivados u otras modificaciones químicas, enzimáticas o estructurales de los mismos, incluyendo las enzimas codificas por inserción, eliminación o mutantes de lugar de los genes piruvato carboxilasa de ocurrencia natural, en la medida que sea retenida la actividad piruvato carboxilasa. La actividad piruvato carboxilasa se mide convenientemente mediante el método acoplado de J. Payne et al., (J. Gen. Microbiol., 59 :97-101 , (1969)). El término "gen piruvato carboxilasa " significa un gen que codifica funcionalmente una enzima piruvato carboxilasa. Una proteina o péptido que es "codificado funcionalmente" por un gen u otro ácido nucleico, es aquel el cual al ser introducido en una célula huésped, es capaz de ser expresado por la célula huésped. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica la proteina o el péptido puede incluir o codificar elementos reguladores transcripcionales o traductores tales como promotores, operadores, mejoradores, señales de término inicio de transcripción, y codones de témino y otros similares, los cuales permiten una transcripción o traducción constitutiva o inducible de la proteina codificada. Una enzima es "sobreexpresada" o "sobreproducida" en una célula huésped cuando la enzima es expresada en la célula huésped a un nivel superior que el nivel en el cual es expresada en una célula comparable del tipo silvestre. En las células que no expresan endógenamente una enzima particular, cualquier nivel de expresión de aquellas enzima en la célula se considera una "sobreexpresión" o una "sobreproducción" de dicha enzima para ios fines de la presente invención. Las células transfomadas genéticamente se refieren aquí como células "transformadas metabólicamente" cuando la transformación genética está dirigida a la interrupción o alteración de una vía metabólica de tal modo de producir un cambio en el metabolismo del carbono. La piruvato caboxilasa sobreexpresada por una célula transformada metabólicamente de acuerdo a la invención puede ser endógena o heteróloga. Una enzima "heteróloga" es aquella codificada por una secuencia de nucleótido que se encuentra normalmente presente en la célula. Por ejemplo, una célula bacteriana que ha sido transformada con y que expresa un gen de una especie diferente o un género que codifica una piruvato carboxilasa contiene una piruvato carboxilasa heteróloga. El fragmento ácido nucleico heterólogo puede o no puede estar integrado en el genoma huésped. Las enzimas piruvato carboxilasa y, en algunos casos, los genes que han sido caracterizados incluyen piruvato carboxilasa humana. (GenBank K02282 ; S. Feytag et al., J. Biol. Chem.. 259. 12831-12837 (1984)) ; piruvato carboxilasa del Saccharomyces cerevisiae (GenBank X59890.J 03889,y M16595 ;R. Stucka et al., Mol. Gen. Genet, 229. 305-315 (1991 ) ; F. Lim et al. J. BjoJ. Chem.. 263. 11493-11497 (1988) ; D. Myers et al., Biochemitrv. 22, 5090-5096 (1983) ; piruvato carboxilasa del Schizosaccharamyces pombe (GenBank D78170) ; piruvato carboxilasa de R. etli (GenBank U51439 ; M. Dunn et al., J. Bactertiol.. 178, 5960-5070 (1996) ; piruvato carboxilasa de Rattus norvegicus (GenBank U81515 ; S.

Jitrapakdee et la., J. BjoJ. Chem.. 272. 20522-20530 (1997)) ; piruvato carboxilasa del Bacillus stearothermophilus (GEnBank D83706 ; H. Kondo ; Gene 191. 47-50 (1997) :, S. Libor, Biochemistrv, 18. 3647-3653 (1979)), piruvato carboxilasa del P. fluorescens (R. Silvia et al., J. Gen. Microbiolo. 93, 75-81 (1976) ; píruvato carboxilasa del M. thermoautotrophicum (B. Mukhapodhyay et al., ; J. Biol. Chem.. 273. 5155-5166 (1998)) y piruvato carboxilasa del C. glutamicum (Genbank Y09548). Preferentemente, la piruvato carboxilasa que es sobreexpresada por la célula transformada metabólicamente dentro de esta invención se ha derivado del R.etli o P. fluorescens. La piruvato carboxilasa en el R. etli es codificada por el gen pyc. (M. Dunn et la., J. Bacteriol., 178, 5960-5970 (1996)). La enzima R. etli se ha clasificado como una alfa4 piruvato carboxilasa, la cual es inhibida por aspartato y requiere acetil CoA para su activación. Los miembros de esta clase de piruvato carboxilasas podrían no parecer particularmente bien adecuados para ser usados en la presente invención, dado que se podría esperar de la reorientación del flujo de carbono desde el piruvato al oxaloacetato una menor producción de acetil CoA, y una mayor producción de aspartato, donde ambos reducirán la actividad piruvato carboxilasa. Sin embargo, se encontró que la expresión de la piruvato carboxilasa de R. etli en un huésped bacteriano es efectiva para aumentar la producción de oxaloacetato y sus metabolitos derivados. (Ejemplos II y IV). Por otra parte, esto se puede realizar sin afectar adversamente la recuperación de glucosa por le huésped (Ejemplo lll), lo cual ha sido el bloque "stumbling" en los esfuezos anteriores de derivar el carbono al oxaloacetato por sobreexpresión de PEP carboxilasa (P. Chao etl al., Appli. Env. Microbiol.. 59, 4261-4265 (1993)). En una modalidad particularmente preferida, la célula transformada metabólicamente expresa la alfa4beta4 piruvato carboxilasa.. Los miembros de esta clase de piruvato carboxilasas, no requieren acetil CoA para la activación, tampodo son inhibidas por el aspartato, haciéndolas particularmente adecuadas para utilizar en la presente invención. El P. fluorescens es un organims conocido por expresar la alfa4beta4 piruvato carboxilasa. Por lo tanto, la célula transformada metabólicamente de la invención es preferentemente una que ha sido transformada con un fragmento de ácido nucleico aislado del P. fluorescens, el cual contiene una secuencia nucleótido que codifica una piruvato carboxilasa expresada en él, mas preferentemente la piruvato carboxilasa aislada y descrita por R. Silva et al., J. Gen. Microbiol., 93, 75-81 (1976). Preferentemente, la célula transformada metabólicamente de la invención sobreexpresa piruvato carboxilasa. Planteado de otra forma, la célula transformada metabólicamente expresa preferentemente piruvato carboxilasa a un nivel superior que el nivel de piruvato carboxilasa expresado en una célula comparable de tipo silvestre. Esta comparación se puede hacer de cualquier número de manera conocidas por los técnicos en el arte y se realiza bajo condiciones de crecimiento comparables. Por ejemplo, la actividad piruvato carboxilasa se puede cuantificar y comparar usando el método de Payne y Morris (¿J. Gen. Microbiol.. 59. 97-101 (1969)). La célula transformada metabólicamente que sobreexpresa píruvato carboxilasa presentará una mayor actividad que una célula silvestre en este ensayo. Adicionalmente o alternativamente, se puede cuantificar y comparar la cantidad de piruvato carboxilasa mediante la preparación de los extractos de proteina de las células, sometiéndolas a SDS-PAGE, transfiriendo a un Western blot y detectando la proteina piruvato carboxilasa biotinilada usando kits de detección disponibles comercialmente de por ejemplo la firma Pierce Chemical Company (Rockford, II.), Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) o Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN.) para visualizar las proteinas biotiniladas en Western blots. En algunas células huésped adecuadas, la expresión piruvato carboxilasa en la célula no transformada del tipo silvestre puede ser inferior a los niveles detectables. La célula transformada metabólicamente usada en la invención no está limitada en ninguna forma a un tipo particular o clase de célula. Puede ser una célula eucariótica o una célula procariótica, sin limitación ;. asi puede incluir una célula de una bacteria, una planta, un protist (tal como un protozoo o un alga), un hongo (tal como levadura), o un animal. Una célula de animal incluye por ejemplo, una célula de un vertebrado o de un invertebrado, tal como una célula de insecto, o de mamífero, preferentemente una célula de ratón o humana. Una célula bacteriana incluye, por ejemplo, la célula de un bacterium o archaebacterium. Preferentemente, la célula es una célula de bacteria, una célula de levadura, una célula de planta, una célula de insecto, o una célula de mamífero. Las células bacterianas particularmente preferidas son las células de E. coli y las células de fí. subtilis. Las células de mamífero preferidas son las células humanas y las células de ratón. Numerosos organismos pueden sintetizar oxaloacetato ya sea a partir de PEP vía la enzima PEP caraboxilasa, o a partir de piruvato vía la enzima piruvato carboxilasa. Los miembros representativos de esta clase de organismos incluyen el C. glutamicum, R. etli, P. fluorescens, Pseudomonas citronellolis, Azotobactert vinelandii, Aspergillus nidulans, y las células de hígado de ratón. Otros organismos no pueden sintetizar directamente oxaloacetato a partir de piruvato debido a que ellos carecen de la enzima piruvato carboxilasa E coli, Salmonella typhimurium, Fibrobacter succinogenes y Ruminococcus flavefaciens son representativos de esta clase de organismos. En cualquier caso, puede utilizar el enfoque de la ingeniería o transformación metabólica de la presente invención para redirigir el carbono al oxaloacetato y, como un resultado de esto, mejorar los rendimientos de proteina y de péptidos Otra alternativa comprende interferir con la trayectoria metabólica usada para producir acetao a partir de acetil CoA. La interrupción de esta trayectoria debería producir niveles superiores de acetil CoA, lo cual indirectamente produce mayores cantidades de oxaloacetato. Por otra parte, cuando la enzima piruvato carboxilasa expresada en la célula huésped es una que es activada por acetil CoA, los niveles mas altos de acetil CoA en estos mutantes producen una mayor actividad de la enzima, produciendo un flujo adicional de carbono desde le piruvato al oxaloacetato. En consecuencia, los mutantes acetato son las células huéspedes preferidas. En un método, la célula transformada metabólicamente usada en la invención se produce transformando una célula huésped con un fragmento de ácido nucleico, comprendiendo una secuencia nucleótido que codifica una enzima piruvato carboxilasa. Los método para la transformación de células de bacterias, plantas y animales son muy conocidos en el arte. Los métodos de transformación de bacterias comunes ¡ncluyen la elecroporación y la modificación química. La transformación entrega una célula transformada metabólicamente la cual sobreexpresa pimvato carboxilasa. Opcionalmente se transforman adicionalmente las células con un un fragmento ácido nucleico, comprendiendo una secuencia de nucleótido que codifica una enzima que tiene actividad PEP carboxilasa. Preferentemente el fragmento ácido nucleico se introduce en la célula usando un vectora pesar de que también se puede utilizar "ADN desnudo". El fragmento ácido nucleico puede ser circular o lineal, de una sola hebra o de doble hebra, y puede ser ADN, ARN o cualquier modificación o combinación de los mismos. El vector puede ser un plásmido, un vector viral o un cósmido. La elección de un vector o de una estructura principal plásmido depende de una variedad de características deseadas en la construcción resultante, tales como un marcador de selección, tasa de reproducción de plásmido y otras similares. Los plásmidos adecuados para la expresión en E. coli ¡ncluyen, por ejemplo, pUC(X), pKK223-3, pKK233-2, pTrc99A y pET-(X) donde (X) indica una familia de vector en la cual se dispone de numerosas construcciones. Los vectores pUC(X) se pueden obtener de Pharmacia Biotech (Piscataway, NH) o Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO) Los pKK223-3, pKK233-2 y pTrc99A se pueden obtener de Phramacia Biorech. Los vectores PET-(X) se pueden obtener de Promega (Madison, Wl), Stratagene (La Jolla, CA) y Novagen (Madison, Wl). Para facilitar la replicación en el interior de la célula huésped, el vector incluye preferentemente un origen de replicación (conocido como un "ori") o replicón. Por ejemplo, los replicones ColE1 y P15A se utilizan usualmente en los plásmidos a ser propagados en E.coli. El fragmento ácido nucleico usado para transformar de célula de acuerdo a la invención puede incluir opcionalmente una secuencia promotora unida operativamente con la secuencia nucleótido codificando la enzima a ser expresada en la célula huésped. Un promotor es un fragmento de ADN que produce la transcripción del material genético. Transcripción es la formación de una cadena ARN de acuerdo con ia información genética contenida en el ADN. La invención no está limitada por el uso de ningún promotor particular, conociéndose una extensa variedad. Los promotores actúan como señales reguladoras que unen la polimerasa ARN en una célula para iniciar la transcripción de una secuencia codificadora aguas abajo (dirección 3'). Un promotor se encuentra "unido o enlazado operativamente" con una secuencia de ácido nucleico si realiza o puede ser usado para controlar o regular la transcripción de aquella secuencia de ácido nucleico. El promotor usado en la invención puede ser un promotor constitutivo o uno inducible . Puede, pero no necesita ser, heterólogo con respecto de la célula huésped. Los promotores preferidos para la transformación bacteriana incluyen lac, /acUV5, tac, trc, T7, SP6 y ara. El fragmento ácido nucleico usado para transformar la célula huésped puede incluir, opcionalmente, un lugar Shine Dalgarno (por ejemplo, un lugar de unión ribosoma) y un lugar de partida (por ejemplo el codón ATG) para iniciar la traducción del mensaje transcrito para producir la enzima. También puede incluir opcionalmente una secuencia de terminación para terminar la traducción. Una secuencia de terminación es típicamente para el cual no existe el correspondiente aminoacetit-rARN, terminado así la síntesis del polipéptido El fragmento ácido nucleico. Usado para transformar la célula huésped puede incluir además opcionalmente una secuencia de terminación de transcripción. El terminador rrmB, el cual es un estirado del ADN que contiene dos terminadores, T1 y T2, es el terminador mas usado comúnmente el cual es incorporado en los sistemas de expresión bacterial. (J. Brosius et al., J. Mol. Biol. 148, 107-127 (1981 )). El fragmento ácido nucleico usado para transformar la célula huésped incluyen opcionalmente uno o mas secuencias marcadoras, las cuales codifican típicamente un gen de producto, usualmente una enzima, la cual inactiva o detecta de otra forma o es detectada por un compuesto en el medio de crecimiento. Por ejemplo, la inclusión de una secuencia marcadora puede hacer que la célula transformada sea resistente a un antibiótico o puede conferir un metabolismo específico al compuesto en la célula transformada. Ejemplos de una secuencia marcadora son secuencias que confieren resistencia a la kanamicina, ampicilina, cloramfenicol y tetraciclina. La piruvato carboxilasa puede ser expresada en la célula huésped por un vector expresión conteniendo un fragmento ácido nucleico compendiendo la secuencia nucleótido que codifica la piruvato carboxilasa. Alternativamente, el fragmento ácido nucleico, comprendiendo la secuencia nucleótido que codifica piruvato carboxilasa se puede integrar en el cromosoma del huésped. Las secuencias ácido nucleico, ya sea heterólogas o endógenas, con respecto de la célula huésped, se pueden introducir en el cromosoma de la célula, usando por ejemplo la recombinación homologa. En la bacteria el gen de interés y un gen que codifica un marcador de resistencia la droga son insertados en un trozo de ADN en un plásmido que es homólogo a la región del cromosoma dentro de la cual se deberá insertar el gen de interés. A continuación se introduce este ADN recombinagénico en la bacteria y se seleccionan clones en los cuales el fragmento de ADN conteniendo el gen de interés y el marcador resistente a la droga se han recombinado en los cromosomas en el lugar deseado. El marcador del gen y resistente a la droga se puede introducir en la bacteria vía transformación ya sea como una pieza linearizada de ADN que se ha preparado a partir de cualquier vector de clonación o como parte de un vector suicida recombinante especializado que no puede replicar en el huésped bacteriano, preferentemente un huésped bacterial recD. Luego se verifican los clones usando PCR y cebadores que amplifican el ADN a través de la región de la inserción Los productos PCR a partir de los clones no-recombinates serán de menor tamaño y solo contendrán la región del cromosoma donde debió haber ocurrido el evento de la inserción, mientras que los productos PCR a partir de los clones recombinantes serán de mayor tamaño y contiene la región de los cromosomas mas el gen insertado y la resistencias a la droga. En otro método, la célula transformada metabólicamente usada en la invención se prepara mutando el ADN de una célula que expresa endógenamente una piruvato carboxilasa para alterar la transcripción del gen piruvatocarboxilasa nativo para producir una sobreproducción de la enzima nativa. Por ejemplo, se puede obtener un cromosoma mutado empleando una mutagénesis química o de transposón y luego seleccionando los mutantes que tienen una actividad piruvato carboxilasa mejorada usando métodos muy conocidos en el arte. Opcionalmente, la célula transformada metabólicamente usada en la invención también sobreexpresa PEP carboxilasa. En otras palabras, la célula transformada metabólicamente opcionalmente expresa PEP carboxilasa a un nivel superior que el nivel de la PEP carboxilasa expresada en una célula comparable de tipo silvestre. Tal como se indicó anteriormente, se ha demostrdao que la sobreproducción de PEP carboxilasa sola dificulta la recuperación de glucosa en E. coli. Sin embargo, la sobreproducción de PEP carboxilasa sola o en combinación con la sobreproducción de piruvato carboxilasa puede no obstante mejorar la producción de proteina o de péptido en otra células, tales como aquellas que no se basan en la PEP para la recuperación de la glucosa.

Adicionalmente en las fermentaciones que utilizan una fuente de carbono diferente a la glucosa, tal como la fructosa, se espera que la sobreproducción de ia PEP carboxilasa no afecte negativamente la recuperación de la fuente alternativa de carbono. Además, mientras que la sobreproducción de ia PEP carboxilasa sola puede afectar adversamente la recuperación de la glucosa, es posible que la sobreproducción simultánea de ambas piruvato carboxilasa y PEP carboxilasa no la afecte. Los niveles de PEP carboxilasa en diferentes poblaciones de células se pueden comparar de diferentes maneras por un técnico en el arte y ello se realiza bajo condiciones de crecimiento comparables. Por ejemplo, la actividad PEP carboxilasa se puede ensayar, cuantificar y comparar. En una ensayo se midió la actividad de la PEP carboxilasa en ausencian de ATP, usando PE en vez de piruvato como el sustrato, monitorenado la aparición de la formación de tionitrobenzoato dependiente de CoA en los 412 nm (ver Ejemplo II). La célula transformada metabólicamente que sobreexpresa PEP carboxilasa entregará una mayor actividad PEP carboxilasa que la célula tipo silvestre. Adicionalmente o alternativamente, se puede cuantificar y comparar la cantidad de PEP carboxilasa mediante la preparación de extractos de proteína a partir de células, sometiéndolas a SDS-PAGE, transfiriendo a un Western blot, luego detectando la proteina PEP carboxilasa usando anticuerpos PEP en combinación con kits de detección disponibles de la firma Pierce Chemical Company (Rockford.IL), Sigma Chemical Company (ST. Louis MO,) o Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) para visualizar los complejos antígeno-anticuerpo en Western blots. En una modalidad preferida la célula transformada metabólicamente expresa PEP carboxilasa derivada de una cianobacíeria, mas preferentemente de Anacystis nidulans. La invención incluye un método para preparar una proteina o un péptido mejorando o aumentado la producción de la proteina o del péptido en una célula la cual, antes de la trasnformación como la descrita aquí, es capaz de biosintetizar la proteina o el péptido. Una célula transformada metabólicamente que sobreexprese piruvato carboxilasa de acuerdo a la invención y la cual también produce una proteina o péptido de interés es cultivada para producir la expresión de la proteina o péptido. Se puede usar cualquire tipo de cultivo celular o de fermentación incluyendo, pero sin estar limitado, las fermentaciones discontinuas o "batch", las fementaciones tipo alimetación - batch, los cultivos continuos y los cultivos de perfusión. El método de la invención permite alcanzar una producción aumentada de la proteina o del péptido, por ejempio, produciendo un aumento en la actividad de la proteina o en la cantidad por célula, produciendo un incremento en la actividad de la proteina o en la cantidad por mililitro de medio, permitiendo que los cultivos o las fermentaciones continúen eficientemente durante períodos de tiempo mas largos, o a través de una combinación de estos efectos. La producción de proteina o de péptido aumenta o mejora con respecto del nivel de producción que puede alcanzar una célula comparable la cual no sobreexprese piruvato carboxilasa. Ventajosamente se obtiene un mayor rendimiento de proteina o de péptido en la célula transformada metabólicamente en relación a un cultivo similar de una célula huésped comparable la cual no " sobreexprese piruvato carboxilasa. El término "rendimiento" según se emplea en relación con la producción de proteina o de péptido en las fermentaciones se expresa usualmente como un cuociente de unidades volumétricas, por ejemplo, como unidades de actividad por unidad de volumen (típicamente mililitros) de medio, dividido por el cambio de la concentración del substrato durante la fermentación, típicamente expresado en unidades de gramos de substrato por litro de medio. A modo de un ejemplo, una fermentación de E. coli produciendo beta- galactosidasa podría entregar o rendir 2667 unidades de enzima (EU) de beta- galactosidasa (beta-gal) por gramo (g) de glucosa consumida como sigue: 80 EU de beta-gal/mL de medio Rendimiento= =2667 EU beta-gal/g gluc. 30 g glucosa/L de medio Opcionalmente, el método además incluye la transformación metabólica de la célula huésped para sobreexpresar piruvato carboxilasa, según se describió anteriormente, antes del cultivo. También opcionalmente, el método además incluye aislar la proteina o el péptido de las células cultivadas. Las proteinas y los péptidos se pueden aislar a partir de las células usando protocolos, métodos y técnicas muy conocidos en el arte. Los ejemplos de las técnicas de aislación de la proteina ¡ncluyen las precipitaciones, tal como la precipitación con sulfato de amonio, las técnicas de filtración, diálisis, extracciones de fase, las técnicas cromatográficas incluyendo el intercambio aniónico o catiónico, hidroxiapatita, filtración en gel, y cromatografía de afinidad. La invención incluye además un método para incrementar la producción de proteina o de péptido en una célula huésped la cual antes de aplicar el método de la invención produce una cantidad dada de proteina o de péptido de interés. La proteina o pétido de interés puede ser una proteina nativa o recombinante y la célula huésped puede ser una célula de tipo silvestre o una célula que se ha transformado genéticamente. De acuerdo a un método de la invención la célula huésped productora de proteina o péptido se ha transformado con un fragmento de ácido nucleico, comprendiendo una secuencia nucleótido la cual funcionalmete codifica una enzima piruvato carboxilasa para producir una célula transformada metabólicamente la cual produce una mayor cantidad o tiene un mayor rendimiento de proteina o pétido, comparado con la célula huésped antes de la transformación. Alternativamente, el método comprende mutar un gen piruvato carboxilasa de la célula huésped de tal modo que la célula huésped sobreexprese piruvato carboxilasa para producir una célula transformada metabólicamente que produce una mayor cantidad de proteina o de péptido comparado con la célula huésped antes de la transformación. Las células huésped que producen proteina o péptido y cuya producción de proteina o de péptido se puede aumentar de acuerdo al método de la invención son como se describen detalladamente a continuación y ellas no están limitadas de ninguna manera a un tipo o clase particular de célula.

Las proteinas y péptidos que son producidas o sobreproducidas en y aisladas desde las células transformadas metabólicamente de acuerdo al método de la invención no están limitadas en ninguna forma e ¡ncluyen los poiipétidos nativos, mutantes y recombinates, incluyendo las proteinas de fusión. Ellas se pueden marcar con una marca detectable, tal como una marca radioactiva o fluorescente, y pueden incluir secuencias de amino ácido y actividades conocidas o desconocidas y secuencias de aminoácido predeterminadas o randomizadas. A pesar de que es posible producir cualquier polipéptido de acuerdo la presente invención, la invención es particularmente adecuada para la producción de enzimas industriales, enzimas para investigación y diagnóstico, y proteinas y péptidos terapéuticos. Enzimas industriales son aquellas usadas en los procesos industriales o en ia producción de bienes y servicios de consumo, tales como amilasa, glucoamilasa, glucosa isomerasa, proteasa, lipasa y celulasa. Enzimas de investigación y diagnóstico incluyen aquellas enzimas usadas en los fines científicos o de investigación tales como las enzimas de restricción, por ejemplo Hind lll, EcoR I y MjBamHI y las enzimas modificadoras del ADN/ARN, por ejemplo las ADN o ARN polimerasas, metilasas, ligasas, exonucieasas y quinasas. Otras proteinas usadas en investigación ¡ncluyen la mioglobina, amidasa, la proteina streptavidin ras y diferentes factores de crecimiento humano. Las proteinas terapéuticas o drogas proteina son aquellas usadas para fines médicos, nutricionales o veterinarios, e ¡ncluyen, por ejemplo, la eritropoyetina, insulina, el factor de estimulación de la colonia de granulocitos, la hormona de crecimiento humano e interferón. Las drogas proteináceas recombinantes que son producidas usualmente en E coli incluiyen la aldesleucina (interleucina-2 ;IL-2), asparaginasa, denileucin diftitox, filgrastim, hormona del crecimiento, insulina, interferon alfa-2a, interferon alfa-2b, interferon beta, interferon gaa-1 b, oprelvekin (interleucina 11) y reteplase. Otras drogas recombinantes proteináceas ¡ncluyen el alteplase, ancestim. basiliximab, becaplermin, el factor de coagulación Vlla, daclizumab, domase alfa (deoxirribonucleasa humana recombinante ; ADNasa,), epoetin alfa (eritropeyeina ; EPO), etanercept-a inhibidor TNFalfa, vacuna follitropins hepatitis B, imiglucerasa, ¡nfliximab, lepirudin, vacuna para la enfermedad "lyme" (OspA recombinante), palivizumab, tituxinab, sargramsotim (factor de estimulación de colonia de granulocito macrófago ; GM-CSF) y trastuzumab. La invención provee además un novedosos sisterma de expresión de proteína caracterizado por una célula de expresión de proteina o de expresión de péptido la cual sobreexpresa piruvato carboxilasa. Cualquier sistema de expresión de proteina celular capaz de expresar una proteina o pétido de interés se puede modificar de acuerdo a la invención mediante una alteración de la célula que produce proteina o péptido para sobreexpresar piruvato carboxilasa según se describe aquí, para entregar un sistema de expresión de proteina con rendimientos mejorados de proteina o de péptido.

EJEMPLOS La presente invención se ilustrará por medio de los siguientes ejemplos. Se deberá tener presente que los ejemplos particulares, materiales, cantidades y procedimientos se deberán interpretar en forma amplia de acuerdo con el alcance y el espíritu de la invención tal como se describe aquí. Eiemplo I: La expresión de la enzima piruvato carboxilasa del R. etli le permite al E coli convertir piruvato en oxaloacetato. El gen del R. etli se clonó dentro de un vector de expresión de E.coli y se realizaron varias experiencias para determinar si es posible expresar la enzima piruvato carboxilasa activa en E coli. Materiales y Métodos Cepas bacterians, plasmidios y condiciones de crecimiento: Las cepas bacterianas y los plasmidios usados en este estudio se indican en la Tabla 1. Las cepas de E. coli se hicieron crecer en el caldo (rico) de LB Miller en un medio mínimo M9 (J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1972)). Las cepas portadoras de un plasmidio fueron suplementadas con el antibiótico adecuado para detectar el gen marcador; se utilizó ampicilina en una concentración de 10 microg/ml en medio rico y 50 microg/ml en el medio mínimo, mientras que se usó cloramfenicol a 20 micog/l en el medio rico y 10 microg/l en el medio mínimo. Cuando se usó isopropil beta-D-tiogalactopiranosida (IPTG) para inducir la construcción del pUC18-pyc, esta se agregó a una concentración final de 1 mM.

TABLA 1 : Cepas y Plasmidios Cepas Genotipo Referencia o fuente MC1061 araD139 (ara?BOIC-/eu)7679 M. Casadaban et a!.. J. Mol. Biol.. (Iac)74 gañJ galK rpsL hsr 12& 179-207 (1980) sm+ ALS225 MC1061 F?acItl1Z+Y+A+ E. Altman, University of Georgia MG1665 wt M. Guyer et al., Quant. Biol.. Cold Spring Harbor Svmp..45, 135-140 (1980) JCL 1242 {argF-lac)V 169 ppc::Kn P. Chao et al., Appl. Env. Microbio!.. 59. 4261-4265 (1993) Plasmidio Características reí antes Referencia o fuente pUC18 Amp(R), ColEl ori J. Norrander et al., Gene.t 2J 101-106 (1983) pPCl Tet(R), pyc M. Dunn et al., J. Bacteriol.. 178. 5960-59 (1996) p\JCl&-pyc Amp(R) , pyc regulada por, .Este ejemplo Plac, ColEl ori pBAl l Cam(R), birA, P15A ori D. Barker et al., J. Mol. Biol.. 146.469-4 (1981) Construcción del pUC18-p?c. El gen R. etli pyc, el cual codifica piruvato carboxilasa, se amplificó usando la reacción en cadena polimerasa (PCR). Se utilizó polimerasa Pfu (Stratagene, La Jolla, CA) en lugar de la polimerasa Taq y el plasmidio pPC1 sirvió como el ADN patrón. Los cebadores fueron designados basado en la secuencia del gen pyc publicada. (M. Dunn et al., J. C. Bacteriol., 178, 5960-5970 (1996)) para convertir las señales de comienzo de traducción pyc y ajustarías con aquellas del gen lacZ. Estos cebadores también introdujeron un lugar de restricción Kpnl (GGTACC) al comienzo del fragmento amplificado y un lugar de restricción Bgl II (AGATCT) al final del fragmento amplificado ; cebador de avance 5' TAC TAT GGT ACC TTA GGA AAC AGC TAT GCC CAT ATC CAA GAT ACT CGT T 3' (SEQ ID No1 ) ; cebador inverso 5' ATT CGT ACT CAG GAT CTG AAA GAT CTA ACA GCC TGA CTT TAC ACA ATC G 3' (SEQ ID No 2) (el Kpnl, Shine Dalgarno, y los lugares comienzo de ATG y Bgl II se han subrayado). El fragmento resultante de 3,5 kb se aisló en gel, se restringió con Kpnl y Bgl II y luego se ligó en el pUC18 ADN aislado en gel el cual se había retringido con Kpn y SamHII para formar la construcción pUC18-.pyc. Esta construcción, identificada como "Plasmidio en E. coli ALS225 pUC18-pyc" se depositó en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University BIvd, Manassas, VA, 20110-2209, EEUU, siendo asignado el número ATCC 207111. El depósito fue recibido por el ATCC el 16 de Febrero de 1999. Geles de proteina y Western blotting. Los extractos celulares desnaturalizados térmicamente fueron separados sobre geles 10% SDS-PAGE según Altman et al., (J. Badt., 155, 1130-1137 (1983) y se realizaron Western blots según Carroll y Gherradini (Infect. Immun., 64, 392-398 (1996)). Se hicieron crecer céluals ALS225 E coli conteniendo pUC18 o pUC18-pyc hasta una longitud mediana en medio rico a 37°C tanto en presencia como en ausencia de IPTG.

Debido a que ALS225 contiene lac en la F, no debería ocurrir una inducción significativa de la construcción pUC18-pyc hasta agregar IPTG. Se prepararon extractos de proteina, se sometieron a SDS-PAGE y a Western blotting. Luego se detectaron las proteinas las cuales se habían biotiniladas in vivo usando el kit de detección de proteina Sigma-Blot (Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO). Se siguieron las instrucciones del fabricante excepto que durante el desarrollo de los Western blots se omitió la etapa de biotinilado de la proteina, permitiendo así solamente la detección de aquellas proteinas las cuales se habían biotinilado in vivo. Ensayo de la enzima piruvato carboxilasa (PC). Para las mediciones de la actividad piruvato carboxilasa, se cosecharon 100 mL de cultivo de fase media-log por medio de centrifugación a 7000xg durante 15 minutos a 4°C y se lavó con 10 mL de 100 mM Tris-CI (pH 8,0). Luego se resuspendieron en 4 mL de 100 mM Tris-CI (pH 8,0) y luego sometidas a rotura celular mediante sonicación. Se removieron los restos celulares por centrifugación a 20.000 x g durante 15 minutos a 4°C. Se midió la actividad piruvato carboxilasa mediante el método de Payne y Morris (J. Gen. Microbiol., 59, 97-101 (1969)). En este ensayo se convierte el oxaloacetato producido por la piruvato carboxilasa en citrato mediante la incorporación de citrato sintasa en presencia de acetil CoA y 5,5-ditio-bis(2- nitro-benzoato) (DTNB) (Aldrich Chemical Co.,) ; la enzima homotetrámero piruvato carboxilasa del R. etli requiere para la activación la acetil coenzima A. Se •monitoreó la tasa de incremento de la absorbancia a 412 nm debido a la presencia de la formación dependiente de CoA del 5-tio-2-nitrobenzoato, primero después de la incorporación de piruvato y luego después de la incorporación de ATP. La diferencia entre estas dos tasas se consideró como la actividad de piruvato carboxilasa dependiente de ATP la concentración de los componentes de reacción por mililitro de mezcla fue la siguiente : 100 mM Tris-CI (pH 8,0), 5 mM MgCI2.H2O, 50 mM NaHCO3, 0,1 mM acetil-CoA, 0,25 mM DTNB y 5 unidades (U) de citrato sintasa. Se agregó piruvato, ATP, ADP o aspartato según se especifica en la sección Resultados siguiente. Se inició la reacción mediante la incorporación de 50 microl de extracto de célula. Una unidad de actividad piruvato carboxilasa corresponde a la formación de 1 micomol de 5-tio-2-nitrobenzoato por mg de proteina por minuto. Todos los ensayos de enzima se realizaron en triplicado y se observó un error standard inferior al 10%. Se determinó la proteina total en los extractos celulares mediante el método de Lowry (O Lowry et al., J. Biol. ChemJ93, 265-275 (1951)).

Resultados Expresión de la enzima piruvato carboxilasa R. etli en E.coli. Se amplificó el gen R. etli pyc, el cual codifica la piruvato carboxilasa por PCR del pPC1 y se subclonó en el vector de clonación/expresión pUC18 según se describió anteriormente. Debido que las señales de inicio de la traducción del gen R. etli pyc no fueron óptimas (el pyc del R. etli utiliza el raro codón de partida TTA como también una corta distancia de separación entre el Shine Dalgarno y el codón de partida), se convirtieron las señales de traducción de partida para coincidir con aquellas del gen lacZ el cual se puede expresar a niveles mas altos en E.coli usando una variedad de vectores de expresión. Cuando se ensayaron los extractos de célula de la construcción pUC18-pyc vía Western blots desarrollados para detectar las proteinas biotiniladas, se detectó una banda de alrededor de 120 kD. Este valor es consistente con las evaluaciones de tamaño informadas anteriormente para la enzima piruvato carboxilasa de R etli (M. Dunn et al., J. Bacteriol. 178, 5960-5970 1996)). Mediante la comparación de diluciones seriadas de la piruvato carboxilasa expresada por la construcción del pUC18-pyc con la enzima piruvato carboxilasa purificada obtenida comercialmente se determinó que bajo condiciones plenamente inducidas la piruvato carboxilasa del R. eí//fue expresada en el 1 % de la proteina celular total en E. coli. Efectos de la biotina y de sintasa holoenzima biotina en la expresión de la píruvato catboxilasa R. etli biotinada en E. coli. La piruvato carboxilasa es una enzima dependiente de biotina, mediando la formación del oxaloacetato por una carboxilación de dos etapas del piruvato. En la primera etapa de la reacción, la biotina es carboxilada con ATP y bicarbonatos como substratos, mientras que en la segunda reacción se transfiere el grupo carboxilo de la carboxibiotina al piruvato. Se ha encontrado que todas las piruvato carboxilasas estudiadas hasta el momento son dependientes de la biotina y existen como proteinas multiméricas, pero el tamaño y la estructrura de las subunidades asociadas puede variar considerablemente. Se ha encontrado que las piruvato carboxilasas de diferentes bacterias forman estructuras alfa4 o alfa4beta, variando el tamaño de la subunidad alfa desde 65 hasta 130 kD. Sin embargo,, se ha encontrado que en todos los casos la subunidad alfa de la enzima piruvato carboxilasa contiene tres dominios catalíticos- un dominio de biotina carboxilasa, un dominio transcarboxilasa y un dominio de proteina portadora de biotina carboxilo los cuales trabajan colectivamente para catalizar la conversión de dos etapas del piruvato al oxaloacetato. En la primera etapa, es carboxilado un grupo prostético biotina unido a un residuo lisina con ATP y HCO3", mientras que en la segunda etapa, se transfiere el grupo carboxilo al piruvato. La biotinilación de la piruvato carboxilasa ocurre posteriormente a la traducción y es catalizda por la enzima biotina holoenzioma sintasa. En esta experiencia se hicieron crecer células de E. coli conteniendo la cosntrucción pUC18-pyc bajo condiciones inductoras en un medio definido mínimo el cual no contenía biotina o la contenía agregada en una concentración de 50 o 100 ng/mL. Específicamente, se hicieron crecer células MG1655 pUC 18-pyc hasta una logaritmo medio a 37°C en el medio M9 que contenía cantidades variables de biotina. Las proteinas que se habían biotiniladas in vivo se detectaron luego usando el kit de detección de proteina Sigma-Blot, descrito anteriormente. En esta experinecia se usó MG1655 debido a que crece significativamente mas rápido que ALS225 en el medio mínimo. Debido a que MG1655 no contiene laclq1 se pudo alcanzar la máxima expresión de piruvato carboxilasa sin agregar IPTG. Se determinó la cantidad de piruvato carboxilasa biotinilada presente en cada muestra usando un Stratagene Eagle II Still Video.

La biotinilación de la piruvato carboxilasa expresada por la construcción pUC18-pyc fue claramente afectada por los niveles de biotina. Las células que tuvieron que producir toda su biotina de novo expresaron cantidades significativamente menores de proteina biotinilada. La incorporación de biotina a una concentración final de 50 ng/mL fue suficiente para biotinilar toda la piruvato carboxilasa que fue expresada via la constrccion pUC118-pyc. En atención a que la biotinilación post traducción de la piruvato carboxilasa es realizada por la enzima biotina holoenzima sintasa, se investigó el efecto del exceso de biotina holoenzima sintasa en la biotinilación de piruvato carboxilasa. Este análisis se realizó introduciendo el plasmidio multicopia pBA11 (el cual contiene el gen bir A que codifica la biotina holoenzima sintasa) en las células E. cou que también contenían la construcción pUC18-pyc ; pBA11 es un derivado de pACYC184 y en consecuencia es compatible con pUC18-pyc. Los efectos del exceso de enzima biotina holoenzima sintasa fueron examinados en un medio rico en el cual también estaba presente un exceso de biotina. Especifícamete se hicieron crecer células ALS225 conteniendo pUC18-pyc o pBA11 hasta un logaritmo, medio a 37°C en un medio rico que contenía IPTG. Se prepararon extractos de proteina, se sometieron a SDS PAGE y sometidos a Western blot, y aquellas proteinas que habían sido biotiniladas in vivo fueron luego detectadas usando el kit de detección de proteina Sigma-Blot, según se describió anteriormente. Barker et al. (J. Mol. Biol., 146, 469-492 (1981 )) han demostrado que el pBA11 produce un incremento de 12 veces en los niveles de la enzima biotina holoenzima sintasa. La cantidad de piruvato carboxilasa biotinilada presente en cada una de las muestras fue cuantificada usando el Stratagene Eagle Eye II Still Video System. Los extractos de proteina preparados a partir de las células que solamente contenían pUC18-pyc o ambos pUC18-pyc y pBA11 entregaron cantidades iguales de proteina piruvato carboxilasa biotinilada. Este resultado sugiere que es suficiente una sola copia cromosómica de bir/K para biotinilar toda la piruvato carboxilasa que es expresada cuando la biotina se encuentra presente en un exceso. La piruvato carboxilasa R etli puede convertir el piruvato en oxaloacetato en E coli. Para confirmar que la proteina expresada piruvato carboxilasa era enzimáticamente activa en E. coli, se utilizó el ensayo de la enzima acoplada desarrollado por Payne y Morris para evaluar la actividad piruvato carboxilasa. (J. Payne et al., J. Gen. Microbiol., 59,97-101 (1969). Fueron ensayados extractos de células conteniendo la construcción inducida pUC18-pyc (MG1655 pUC18-pyc) en relación a su actividad piruvato caraboxilasa, usando diferentes cantidades de piruvato, y comparados con controles conteniendo la construcción pUC18 (MG1655 pUC18). Se incorporó ATP a una concentración final de 5 mM a la mezcla de reacción y se determinó la actividad piruvato carboxilasa en presencia de cantidades crecientes de pimvato. La Figura 2 muestra que el E.coli conteniendo la construcción pUC18-pyc pudo convertir efectivamente el piruvato en oxaloacetato y que la actividad piruvato carboxilasa observada siguió la cinética de Michaeiis-Menten. Un gráfico Lineweaver-Burke de estos datos reveló que la constante de saturación (Km) para la piruvato carboxilasa expresada fue de 0,249 mM con respecto del piruvato. Este valor coincide en forma excelente con otras enzimas piruvato carboxilasa que han sido estudiadas (H. Feir et al., Can. J. Biochem. 47. 698-710 (1969) ; H. Modak et al., Microbiol., 141 , 2619-2628 (1995); M. Scrutton et al. Arch. Biochem. Biophys., 164, 641-654 (1974)). Está bien documentado que las enzimas alfa4 piruvato carboxilasa pueden ser inhibidas por aspartato o adenosina difosfato (ADP). Aspartato es el primer aminoácido que es sintetizado a partir de oxaloacetato y el ADP es liberado cuando la piruvato carboxilasa convierte piruvato en oxaolacetato. Se evaluó la actividad piruvato carboxilasa en presencia de cada uno de estos inhibidores usando extractos de células MG1655 que contenían la construcción pUC18-pyc. El efecto del aspartato fue analizado incorporando ATP y piruvato a la mezcla de reacción hasta concentraciones finales de 5 mM y 6 mM, respectivamente, determinando luego la actividad piruvato carboxilasa en presencia de cantidades crecientes de aspartato. En la Figura 3 se muestra la actividad piruvato carboxilasa obtenida en presencia de diferentes concentraciones de aspartato. Como se esperaba, la actividad piruvato carboxilasa fue inhibida por el aspartato y la actividad específica se redujo hasta aproximadamente un 43% en presencia de 8 mM aspartato. El efecto del ADP fue analizado incorporado piruvato a la mezcla de reacción hasta una concentración final de 5 mM, determinando luego la actividad piruvato carboxilasa en presencia de cantidades crecientes de ATP. La Figura 4 muestra que el ADP afecta severamente la actividad piruvaro carboxilasa observada y actuó como un inhibidor competitivo de ATP. Un gráfico Lineweaver-Burke de estos datos reveló que la constante de saturación (Km) para la piruvato carboxilasa expresada fue de 0J 93 con respecto del ATP y que la constante de inhibición para ADP fue de 0J42 mM. Nuevamente estos datos estuvieron en excelente acuerdo con otras enzimas piruvato carboxilasa que han sido estudiadas (H. Feir et al., Can. J. Biochem., 47, 698-710()1969) ; H. Modak et al., Microbiol., 141 , 2619-2628 (1995) ; M. Scrutton et al., Arch. Boochem. Biophys., 164, 641-654 (1974)). Para demostrar que la expresión de la piruvato carboxilasa R etli en E.coli puede derivar verdaderamente el flujo de carbono desde piruvato al oxaloacetato, se ensayó si la construcción pUC18-pyc podría permitir que una cepa de E. coli la cuai contenía un alelo cero ppc (ppc codifica PEP carboxilasa) a crecer en un medio mínimo de glucosa. Debido a que el E. coli carece de piruvato carboxilasa y en consecuencia solamente es capaz de sintetizar oxaloacetao a partir de PEP, las cepas de E coli que contienen un gen interrumpido ppc no pueden crecer en un medio mínimo que utiliza glucosa como la única fuente de carbono (P. Chao et al., Appl.Env.. Microbiol., 59, 4261-4265 (1993)). La línea celular usada en esta experiencia fue la JCL 1242 (ppc : :kan), la cual contiene un cassette resistente a la kanamicina insertado en el gen ppc y así no expresa la enzima PEO carboxilasa. Se pegaron células JCL242 conteniendo ya sea pUC18 o la construcción pUC18-pyc en platos mínimos M9 glucosa tiamina ampicilina IPTG y se incubaron a 37°Cdurante 48 horas. Tal como se muestra en la Figura 5 las células de E. coli que contenían el alelo cero ppc y la construcción pUC18-pyc fueron capaces de crecer sobre los platos de glucosa mínima. Esta complementación demuestra que se puede crear un punto de ramal a nivel del piruvato lo cual produce un redireccionamiento del flujo de carbono hacia le oxaloacetato, y muestra claramente que la piruvato carboxilasa es capaz de derivar el flujo de carbono desde el piruvato al oxaloacetato en E coli. Eiemplo II. Expresión de piruvato carboxilasa de R. etli peñera una producción aumentada de succinato en E coli. Se realizaron experiencias para ¡nvsetigar si la sobreproducción de piruvato carboxilasa en E. coli podría incremetar la producción de un bioquímico derivado del oxaloacetato en una fermentación anaeróbica. Los productos finales que ocurren en una fermentación anaeróbica se muestran en la Figura 6. Para este estudio inicial se eligió el succinato debido a que este bioquímico se deriva directamente del oxaloacetato y se puede medir fácilmente. Materiales y Métodos. Cepas bacterianas y plasmidios. Las cepas de E. coli usadas en este estudio se indican en la Tabla 2. La cepa mutante lactato deshidrogenasa identificada como REO2 fue derivada del MG1655 por transducción fago P1 usando la cepa E coli NZN111 (P. Bunch et al., Microbiol. 143, 187-195 (1997)).

TABLA 2: Cepas y plasmidios utilizados. Cepas Genotipo Referencia o fuente MGÍ655 Wild type M. Guyer et al., Ouant. Biol.. Cold gpring Harbor Synf.. 45, 135-140 (1980) RE02 MG1655 W? Este ejemplo Plasmidio Características relevantes Referencia o fuente p\ ClS-pyc Amp(R) , pyc regulada por Plac Ejemplo I pTrc99A Amp(R), lactf, Pire E. Amann et al., Gene, 69:301-315 (1988) pTrc99A-pyc Amp(R), lacl1!, pyc regulada por Ptrc Este ejempl El gen pyc del R. etli fue clonado originalmente bajo el control del promotor fac (Ejemplo I). Debido a que este promotor es sometido a una represión catabólica en presencia de glucosa, se ligó un fragmento de 3,5 kb ?al-Kpnl del pUVC18-pyc en el vector de expresión pTrc99A el cual se había digerido con Xdal y Kpnl. El nuevo plasmidio se denominó como pTrc99A-pyc. Este plasmidio, identificado como "Plasmidio en E. coli ALS225 pTrc99A-pyc" fue depositado en el American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University BIvd., Manassas, VA, 20110-2209, EEUU, y se le asignó el número ATCC 207112. El depósito fue recibido por el ATCC el 16 de Febrero de 1999. En esta nueva construcción, la transcripción del gen pyc está bajo el control del promotor artificial trc y así no está sometido a la represión catabólica en la presencia de glucosa. Medio y condiciones de crecimiento. Para la construcción de la cepa, se hicieron crecer las cepas de E coli aeróbicamente en el medio de Luria-Bertani (LB). Se realizaron fermentaciones anaeróbicas en botellas de suero de 100 mL con 50 mL de medio LB suplementado con 20 g/L de glucosa y 40 g/L de MgCO3. Las fermentaciones se terminaron a las 24 horas, momento en el cual los valores del pH de todas las fermentaciones fue de aproximadamente pH 6,7 y la glucosa se había usado completamente. Para las cepas portadoras de plasmidios se agregó ampicilina o cabenicilina para introducir presión selectiva durante la fermentación. Cada uno de estos antibióticos fue introducido inicialmente a 100 m¡crog/mL. En un conjunto de experiencias, no se agregó una cantidad adicional de antibiótico durante la fermentación, mientras que en un segundo conjunto de experiencias se incorporó una cantidad adicional de 50 microg/mL a 7 horas y 14 horas. Fue inducida la piruvato carboxilasa agregando 1 mM IPTG. Para los ensayos de enzima se hicieron crecer las células en el medio de LB suplementado con 20 g/L de glucosa y tamponado con 3,2 g/L de Na2CO3. Análisis del producto de la fermentación y ensayos de la enzima. La glucosa, succinato, acetao, formiato, lactato, piruvato y etanol fueron analizados por medio de cromatografía líquida de alta presión (HPLC), usando una columna Coregel 64-H de exclusión iónica (Interactive Chromatography, San José, CA) y un detector del índice de refracción diferencial (Modelo 410, Watres, Milford, MA). El eluyente fue H2SO 4 mM y la columna se mantuvo a 60°C. Para las mediciones de la actividad de la enzima, se cosecharon 50 mL de cultivo de fase log mediano por medio de centrifugación (10.000x g durante 10 minutos a 4°C) y se lavó con 10 mL de tampón de 100mM Tris-HCl (pH 8,0). Luego se resuspendieron ias células en 2 mL de tampón de 10 mM Tris-HCl y sometidas a rotura celular por medio de sonicación. Los residuos celulares se removieron por centrifugación (20.000x g durante 14 minutos a 4°C. Luego se midió la actividad piruvato carboxilasa (J. Payne et al. J. Gen Microbiol., 59, 97-101 , (1969); ver también el Ejemplo I), y las actividades endógenas de la PEP carboxilasa (K. Terada et al., J. Biochem., 109, 49-54 (1991 ), malato deshidogenasa y iactato deshidrogenasa (P. Bunch et al., Micobiol., 143, 187-195 (1997). La proteina total en el extracto celular se determinó usando el método de Lowry. Resultados. En la Tabla 3 se indica que la actividad piruvato carboxilasa se pudo detectar cuando se introdujo la construcción pTrc99A-pyc ya sea en las células del tipo silvestre (MG1655) o en las células del tipo silvestre que contenían una mutación cero ldh~ (RE02). La presencia de IPTG no afectó significativamente la expresión de otras enzimas metabólicas importantes tales como la PEP carboxilasa, lactato deshidrogenasa y malato deshidrogenasa.

M O Cp cp TABLA 3 : Actividad de la enzima en cultivos de fase exponencial Actividad específica (micromol/min mg proteina) Cepa IPTG Piruvato PEP Lactato Malato carboxiiasa carboxilasa deshidrogenasa deshidrogepasa MG1655 0.00 0.15 0.31 0.06 0.00 0.18 Oí 0.38 0.06 MG1655 pTrc99A- 0.00 0.15 0.32 0.05 0.22 0.11 0.32 0.05 RE02 0.00 0.15 0.00 0.04 0.00 0.13 0.00 0.04 RE02 pTrc99A-/7yc 0.00 0.15 0.00 0.04 0.32 0.12 0.00 0.05 H o Cp o cp TABLA 4 : Efecto de piruvato carboxilasa en la distribución del producto de la fermentación de glucosa por E. coli.

Cepa Forma Antibiótico Piruvato Succinato Lactato Formiato ¡nccrp. Acetato Etanol (g L) (g/L) (g/L) antiob. S/L) (g L) (g/L) MG1655 (wt) 0.00 (0.00) 1.57 (0.17) 4.30(0.73) 4.34 (0.50) 334 (036) 143 (024) MG1655 pTrc99A-/yc Amp lx 0.00 (0.00) 4.36 (0.45) 222 (0.49) 3.05 (0.57) 3.51 (0.03) 127 (030) MG1655 pTtc99A-p c Car lx 4¡- 0.00 (0.00) | 4.42(0.44) 2.38 (0.76) 2.94 (0.46) 3.11 (036) 127(036) MG1655pTrc99A-/yc Amp 3x 0.00 (0.00) 4.41 (0.07) 1.65(0.08) 4J7 (0J5) 193 (0.11) 191 (0.34) MG1655 pTrc99A-fyc Car 3x 0.00 (0.00) 4.37 (0.06) 1.84 (0.07) | 4.09 (0.08) 3.88 (0.06) 2.58 (0.09) RE02 (Idh-) 0.61 (0.06) 1.73 (0J2) 0.00 (0.00) 637 (0.46) 4.12 (030) 3.10 (026) RE02 pTrc99A-¿yc Amp lx 033 (0.11) 2.92 (0.12) 0.00 (0.00) 538 (0J2) 4X9 (0.16) 153 (0.03) RE02 pTrc99A-¿yc Car lx 0.25 (0.05) 2.99 (0.55) 0.00 (0.00) 5.50 (0.90) 423 (0.71) 150 (0.44) RE02pTrc99A-/yc Amp 3x 0.30 (0.04) 2.74 (0.07) 0.00 (0.00) 6.48 (0.04) 4.75(0.06) 199 (0.03) E02 pTrc99A-pyc Car 3x 0.33 (0.04) 2.65 (0.05) 0.00 (0.00) 6.21 (0.18) 4.60(0.12) 3.05 (0.07) Con el objeto de dilucidar el efecto de la expresión piruvato carboxilasa sobre la distribución de los productos finales de la fermentación se realizaron varias fermentaciones en frascos de suero de 50 mL (ver Tabla 4) Los antibióticos fueron agregados una vez a las 0 horas en una cincentración de 100 microg/mL (1x) o se incorporaron a las 0 horas en una concentración de 100 microg/mL y nuevamente a las 7 horas y 14 horas en una concentración de 50 microg/mL (3x). Los valores son la media de tres réplicas, indicándose la desviación standard entre paréntesis. Para calcular la producción neta de cada producto por gramo de glucosa consumida, se dividió la concentración del producto final por 20 g/L de glucosa. Tal como se muestra en la Tabla 4, la expresión de la piruvato carboxilasa produjo un significativo incremento en la producción de succinato en ambos tipos MG1655 (tipo silvestre) y RE02 (ldh~).. Con MG1655 la inducción de piruvato carboxilasa aumentó la producción de succinato en 2,7 veces desde 1 ,57 g/L en la cepa control hasta 4,36 g/L, haciendo así el succinato el principal producto en la fermentación de la glucosa. Este aumento en la cantidad de succinato estuvo acompañado de una reducción en la formación de lactato y formiato, indicando que el carbono fue desviado desde el lactato hacia la formación de succinato. Una desviación similar del carbono desde el lactato hacia el succinato se logró previamente por la sobreexpresión de la PEP carboxilasa nativa (C. Millard et al., Appl. Environ. Microbiol., 62, 1808-1810 (1996)). La Tabla 4 también muestra que la ampicilina y la carbenicilina fueron igualmente efectivas en mantener una presión selectiva suficiente, y que la incorporación de una cantidad adicional de cada uno de los antibióticos durante la fermentación no aumentó adicionalmente la producción de succinato. Esta evidencia indica que una dosis inicial (de 100 m?crog/mL) es suficiente para mantener la presión selectiva a través de la fermentación, un resultado que se puede deber al pH final relativamente alto (6,8) observado en estos estudios de la fermentación versus el pH final (6,0) observado en los estudios anteriores (C. Millard et al., Appl. Environ. Microbiol., 623, 1808-1810 (1996)). Debido a que la introducción de la piruvato carboxilasa en E coli fue tan exitosa al dirigir mas carbono hacia la rama del succinato, los autores también estuvieron interesados en determinar si se podría dirigir carbono adicional hacia el succinato por medio de la eliminación de lactato deshidrogenasa, dado que esta enzima también compite con el piruvato. En la Tabla 4 se comparan los resultados de las fermentaciones usando la cepa RE02 (ldh~) con o sin el plasmidio pTrc99A-.pyc. Comparada con la cepa de tipo silvestre (MG1655), la cepa RE02 no presewntó un cambio significativo en la producción de succinato. Al contrario, las fermetaciones con la cepa RE02, ya sea conteniendo o no el plasmidio pTrc99A-pyc, produjeron una mayor cantidad de formiato, acetato y etanol, acompañado por una secreción de piruvato. El hecho que el piruvato fue secretado al caldo de fermentación indica que la velocidad o tasa de glicólisis fue superior que la tasa de utilización de piruvato. El incremento en las concentraciones de formiato observadas en el mutante ldh~ puede ser causado por la acumulación de piruvato, un compuesto que es conocido porque ejerce un efecto alostérico positivo en la liasis de piruvato formiato (G. Sawers et al., J. Bacteriol., 170, 5330-5336 (1988)). Con RE02 la inducción de piruvato carboxilasa aumentó la producción de succinato en 1 ,7 veces desde 1 ,73 g/L en la cepa control hasta 2,92 g/L. En consecuencia, el aumento de succinato obtenido en las cepas mutantes ldh~ fue significativamente menor que el obtenido en ia cepa de tipo silvestre (MG1655). Una posible explicación de esta observación podría ser que la actividad piruvato carboxilasa fue inhibida por un compuesto celular el cual se acumuló en los mutantes ldh~. Durante la glicólisis dos moles de dinucleótido nicotinamida adenina reducida (NADH) son generados por mol de glucosa. La NADH es luego oxidada durante la formación de etanol, lactato y succinato bajo condiciones anaeróbicas. La incapacidad de los mutantes ldh~ de consumir NADH a través de la formación de lactato puede enfatizar la capacidad oxidante de esta cepas, llevando a una acumulación de NADH. En efecto, anteriormente se había demostrado que este cofactor reducido inhibe la piruvato carboxilasa aislada del Saccharomyces cerevisiae (J. Cazzulo et al., Biochem J., 112, 755-762 (1969)). Con el objeto de dilucidar si esta tensión oxidante podría ser la causa del beneficio atenuado observado cuando la piruvato carboxilasa fue expresada en los mutantes ldh~, los autores investigaron el efecto de ambos dinucleotidos nicotinamida adenina oxidados y reducidos (NADH/NAD+) y el dinucleótido fosfato (NADPH/NADP+) sobre la actividad de la piruvato carboxilasa. Se realizaron ensayos de enzima con el extracto crudo libre de células obtenido de MG1655pTrc99A-pyc. Todos los ensayos se efectuaron en triplicado y los valores promedio se exponen en la Figura 7. La desviación standard no fue superior al 5% para todos los puntos de los datos. La NADH inhibió la piruvato carboxilasa, mientras que NAD+, NADP+ y NADPH no lo hicieron. Hipotéticamente se cree que el menor incremento del succinato con RE02 el mutante ldh~ que es el resultado de la acumulación de NADH intracelular, un cofactor que pareciera inhibir la actividad la actividad de la pruvato carboxilasa. Ejemplo lll. La expresión de la piruvato carboxilasa de R. etli no afecta la recuperación de glucosa en el E coli en la fermentación anaeróbica. Se realizaron experiencias destinadas a determinar si la sobreporducción de piruvato carboxilasa en E. coli afecta adversamente la recuperación de glucosa. Métodos. Microorganismos y plasmidios. Cepa MG1655 de E. coli (tipo sivestre F lambda; M. Guyer et al., Quant. Biol.., Cold Spring Harbor Symp., 45, 135 -140 (1980); ver también el ejemplo I) y el plasmidio pUC18-pyc el cual contiene el gen pyc del R. etli (ver Ejemplo I). Medio y fermentación. Todas las fermentaciones de 2,0 L se realizaron en fermentadores de 2,5 L New Brunswick BioFlo lll de banco (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) en Luria-Bertani (LB) suplementado con glucosa, 10 g/L; Na2PHO4.7H2O, 3 g/L; KH2PO4 1 ,5 g/L; NH4CI, 1 g/L; MgS04.7H2O, 0,25 g/L; y CaCI2.2H2O,0,02 g/L. Los fermentadores fueron inoculados con 50 mL de cultivo crecido anaeróbicamente. Los fermentadores fueron operados a 150 rpm, 0% de saturación de oxígeno (sensor polarográfico de oxígeno Ingold, New Brunswick Scientific, Edison,. NJ), 37°C y pH de 6,4, el cual fue controlado con NaOH de 10%). Se mantuvieron condiciones anaeróbicas lavando el espacio de cabeza del fermentador con dióxido de carbono libre de oxígeno. Cuando era necesario, se suplemento el medio con una concentración inicial de 100 microg/mL de ampicilina, lo cual demostró previamente que era suficiente para mantener la presión selectiva (Ejemplo II). Métodos analíticos. El crecimiento celular fue monitoreado midiendo la densidad óptica (OD) (espectrofotómetro DU-650, Beckman Instruments, San José, CA) a 600 nm. Esta densidad óptica se correlacionó con la masa celular seca usando una curva de calibración de la masa celular seca (g/L) = 0.48OD. La glucosa y los productos de la fermentación fueron analizados mediante cromatografía líquida de alta presión usando una columna de exclusión iónica Coregel 64-H. (Ineractive Chromatography, San José, CA) según se describió en el Ejemplo II. La actividad de la píruvato carboxilasa y la actividad endógena de la PEP carboxilasa fueron medidas haciendo crecer separadamente cada cepa y clon en frascos de suero de 160 mL bajo estrictas condiciones anaeróbicas. Los cultivos fueron cosechados en condiciones de un crecimiento logarítmico mediano, se laaron y se rompieron las células mediante sonicación. Los residuos celulares se removieron por medio de centrifugación (20.000g durante 15 minutos a 4°C). la actividad piruvato carboxilasa fue medida según se describió anteriormente (Payne y Morris, 1969), y la actividad PEP carboxilasa fue medida en ausencia de ATP usando PEP en vez de piruvato como el substrato, siendo monitoreada la formación del tionitrobenzoato dependiente de CoA a 412 nm. El total de la proteina en el extracto celular se determinó usando el método de Lowry. Resultados Se hizo crecer el E coli MG1655 anaeróbicamente con 10g/L de glucosa como fuente de energía y de carbono. En la Figura 8 se muestra la masa celularseca, y las concentraciones de succinato, lactato, formiato y glucosa a lo largo del tiempo en una fermentación típica de 2-litros de esta cepa tipo silvestre. La Figura 9 muestra estas concentraciones a lo largo del tiempo en una fermentación de esta cepa de tipo silvestre con el vector de clonación/expresión pUC18. Después del consumo total de la glucosa, la concentración media final del succinato para la cepa de tipo silvestre fue de 1 ,8 g/L, mientras que para la cepa de tipo silvestre con el vector pUC18 la concentración final de succinato fue de 1 ,00 g/L. Para estas fermentaciones, la concentración media final del lactato fue de 2,33 g/L para la cepa de tipo silvestre y de 2,27 g/L para la misma cepa con pUC18. La Figura 10 muestra las concentraciones a lo largo del tiempo de la masa celular seca, del succinato, lactato, formiato y de la glucosa en una fermentación de la cepa conteniendo el plasmidio pUC18-pyc. Esta figura muestra que la expresión de piruvato carboxilasa produce un substancial incremento en la concentración final de succinato y una reducción en la concentración de lactato. Específicamente para el tipo silvestre con pUC18-pyc la concentración media final de succinato fue de 1 ,77 g/L, mientras que la concentración media final de lactato fue de 1 ,88 g/L. Estas concentraciones corresponden a un 50% de aumento en la concentración del succinato y alrededor de un 20% de reducción en la concentración del lactato, indicado que se ha dirigido el carbono hacia la formación de succinato en presencia de la piruvato carboxilasa. Las actividades de la PEP carboxilasa y piruvato carboxilasa fueron determinadas en extractos libres de células de las cepas de tipo silvestre y portadoras del pasmidio, mostrándose los resultados en la Tabla 5. En la cepa de tipo silvestre y la cepa portadora del vector no se detectó actividad piruvato carboxilasa, mientras que esta actividad fue detectada en el clon MG1655/pUC18-pyc. La actividad PEP carboxilasa se observó en todas las tres cepas.

TABLA 5. Actividad de enzima en el cultivo de crecimiento medio logaríitmico. Act. Específica (micromol/min mg proteina) Cepa Piruvato PEP carboxilasa carboxi lasa MG1655 0,0 OJO MG1655/pUC18 0,0 0,12 MG1655/pUC18-pyc 0,06 0,08 Para determinar las tasas de consumo de glucosa, producción de succinato y producción de masa celular durante las fermentaciones se ajustó cada conjunto de datos de concentración a un polinomio de quinto orden. (Estas curvas de mejor ajuste se muestran en las Figuras 8-10 con las concentraciones medidas) Calculando la primera derivada de esta función con respecto del tiempo, se obtiene una función la cual entrega estas tasas en función del tiempo. Este procedimiento es similar a los métodos previos. (E. Paputsakis et al., Biotechnol. Bioeng., 27, 56B66 (1985); K. Reardon et al., Biotechnol. Prog., 3, 153B167 (1987) usados para calcular los flujos metabólicos. Sin embargo, los casos de las fermentaciones con ambas piruvato carboxilasa y PEP carboxilasa presentes, no se puede completar el análisis de flujo debido a la singularidad matemática en los nodos PEP/piruvato (S. Park etal., Biotechnol. Bioeng., 55.864B879 (1997)). No obstante, usando este enfoque es posible determinar la recuperación de glucosa y las tasas de producción de succinato y de la masa celular. La Tabla 6 muestra los resultados de los cálculos de las tasa de recuperación de glucosa, y la producción de succinato y de masa celular en una cepa de tipo silvestre de E coli (MG1655), la cepa de tipo silvestre con el vector de clonación/expresión pUC18 (MG1655/pUC18) y la cepa de tipo silvestre con MG1655/pUC18-pyc. Todas las unidades están en g/Lh y los valores entre paréntesis representan la desviación standard de las mediciones.

O 01 O Cp TABLA 6 : Tasas de recuperación/consumo de glucosa, producción de succinato y producción celular.

Todos estos resultados demuestran, que la incorporación del vector de clonación o el vector con le gen pyc, no tuvo un efecto significativo sobre la recuperación media de glucosa durante las 4 horas finales de la fermentación. En efecto, la presencia del gen pyc realmente incrementó la recuperación máxima de glucosa en alrededor de de un 14% desde 2J 7 g/Lh hasta 2,47 g/Lh. La presencia del vector de clonación pUC18 redujo levemente las tasas de producción de succinato. Tal como se esperaba de los datos mostrados en la Fig. 10, la expresión del gen pyc produjo un 82% de aumento en la producción de succinato en el momento de máxima recuperación de glucosa y un 68% de aumento en la tasa de producción de succinato durante las 4 horas finales de las fermentaciones. La máxima tasa de crecimiento celular (la cual ocurrió a 4-5 horas para cada una de las fermentaciones) fue de 0,213 g/Lh para la cepa de tipo silvestre, pero se redujo en presencia de pUC18 (0,169 g/Lh) o del pUC18-pyc (0,199 g/Lh). Análogamente, las producción celular global fuede 0,0946 g de células secas/g de gluciosa consumida para el tipo silvestre, pero de 0,0895 g/g para ele tipo silvestre con pUC18 y de 0,0882 g/g para la cepa de tipo silvetre con pUC18-pyc. Esta reducción en la biomasa puede deberse el consumo de un mol de unidad de enregía (ATP) por mol de piruvato convertido al oxaloacetato por la piruvato carboxilasa y las mayores demandas de síntesis de proteina en las cepas portadoras de plasmidios. No se pudo calcular una tasa específica de crecimiento celular debido a que el crecimiento de esta cepa presentó un crecimiento logarítmico solamente durante las primeras pocas horas de crecimiento.

En resumen, la expresión de piruvati carboxilasa a partir del R. etli en E. coli produce un aumento significativo en la producción de succinato sin afectar la recuperación o el consumo de glucosa. Este resultado tiene repercusiones dramáticas en los procesos de fermentación bacteriana los cuales se utilizan para producir productos bioquímicos derivados del oxaloacetato. Debido a que la sobreexpresión de piruvato caraboxilasa produce cantidades mayores de los bioquímicos derivados del oxaloacetato, sin afectar la recupercaión o el consumo de glucosa, es posible utilizar esta tecnología en los procesos de fermentación con el objeto de obtener mas producto por cantidad de glucosa alimentada. Eiemplo V. La expresión de piruvato carboxilasa de R. etli genera una producción incrementada de treonina en E. coli. Se realizaron experiencias con el objeto de investigar si la sobrepoducción de piruvato carboxilasa en E. coli durante una fermentación aeróbica podría aumentar la producción de un amino ácido derivado del oxaloacetato. Materiales y Métodos. Cepas bacterianas y plasmidios. En este estudio se usó la cepa productora de treonina beta IM-4 (ATCC 21277) (I. Shiio etal., Agr. Biol. Chem., 33, 1152-1160 (1969) ; I Shiio et al. Patente U.S. N° 3.580.810 (1971 )). Esta cepa se transformó con pTrc99A-pyc (ver Ejemplo II) o con pTrc99A (E. Amann et al., Gene, 69, 301 -315 (1988)). Medio y condiciones de crecimiento. Las fermentaciones aeróbicas se desarrollaron en fermentadores Bioflow II con un volumen de 2,0L. El medio usado para esta fermentación contenía (por litro): glucosa, 30,0 g ; (NH4)2SO4 10,0 g; FeS04.H20, 10,0 mg; MnS04.H2O, 5,5 mg/L; L-prolina, 300 mg; L-isoleucina, 100 mg; L-metionina., 100 mg; MgSO4.7H2O, 1 g; KH2P0 , 1 g; CaCO3, 20 g; tiamina HCl, 1 mg; d-biotina, 1 mg. Con el objeto de mantener la presión selectiva para las cepas portadoras de plasmidios, se suplemento inicialmente el medio con 50 mg/L ampicilina. También se agregó IPTG hasta una concentración final de 1mmol/L a 2 horas a las fermentaciones realizadas con cada una de estas cepas. Análisis del producto de la fermentación. El crecimiento celular se determinó midiendo la densidad óptica a 550 nm de una muestra diluía al 1 : 21 en HCl 0,1 M. La glucosa, el ácido acético y otros ácidos orgánicos fueron analizados por medio de cromatografía líquida de alta presión según se describió anteriormente (M. Eitemann et al., Anal. Chim. Acta, 338, 69-75 (1997) usando una columna de exclusión iónica Coregel 64-H. La treonina se cuantificó por medio de cromatografía líquida de alta presión usando el método de derivatización del ortoftaldialdehido. (D. Hill et al., Anal. Chem. 51 , 1338-1341 (1979); V. Svedas et al., Anal. Biochem., 101 , 188-195 (1980)). Resultados. La cepa productora de treonina beta IM-4 (ATCC 21277, llevando ya sea el plasmid?o de control pTrc99A o el plasmidio pTrc99A-pyc el cual sobreproduce piruvato carboxilasa, se hizo crecer aeróbicamente con 30 g/L de glucosa como fuente de energía y de carbono, midiéndose la producción de treonina. Tal como se muestra en la Figura 11 , 1a sobreproducción de piruvato carboxilasa ocasionó un significativo aumento en la producción de treonina en la cepa E coli productora de treonina. A 17 horas, cuando se había consumido ia glucosa alimentada inicialmente, se detectó una concentración de 0,57 g/L de treonina en la cepa padre portadora del plasmidio de control pTrc99A, mientras se detectó una concentración de 1 ,37 g/L de treonina en la cepa padre portadora del plasmidio pTrcA-pyc. Dado que el OD550 final de ambos cultivos estuvo dentro de los 10% del otro al final de la fermentación, el incremento del 240%» en la concentración de treonina producida por la piruvato carboxilasa se puede considerar como significativa. Tal como en estos estudios de la fermentación aneróbica (ver Ejemplo lll), se ha encontrado que el consumo o la recuperación de glucosa no fue afectado adversamente por la sobreproducción de piruvato carboxilasa. Eiemplo V. Mejora en la producción bioguímica usando piruvato carboxilasa del P. fluorescens.. Uno de los principales motivos de! control tan estrecho de la red metabólica resopnsable de la regulación intracelulares del oxaloacetato se debe al hecho que las enzimas claves involucradas en este proceso están reguladas positiva y negativamente. En la mayoría de los organismos tales como el R. etli, la piruvato carboxilasa requiere la molécula efectora positiva acetil coenzima A para su activación, siendo reprimida debido a la inhibición de la retroalimentación por el aspartato. (P. Attwood, Intl J. Biochem.Cell Biol., 27, 231-249 (1995) ; M. Dunn et al., J. Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)). Los beneficios obtenidos de la sobreproducción de piruvato carboxilasa del R. etli están así limitados al hecho que la desviación del carbono desde el piruvato al oxaloacetato agota los niveles de la acetil coenzima A y aumenta los niveles de aspartato. Sin embargo, la piruvato carboxilasa del P. fluorescens no requiere de la acetil coenzima A para su activación y no es afectada por la inhibición de la retroalimentación causada por el aspartato. (R. Silvia et al., J. Gen. Microbiol. ,93, 75-81 (1976)). La sobreproducida piruvato carboxilasa del P. fluorescens debería permitir un flujo aún mayor de carbono derivado hacia el oxaloacetato. Debido a que los genes que codifican piruvato carboxilasa en las bacteriasparecen ser altamente homólogos, se deberían poder aislar fácilmente el gen P. fluorescen pyc a partir de una biblioteca genómica uasndo sondas que se han preparado a partir del gen R. etii. El gen para piruvato carboxilasa en el P. fluorescens será así identificado, aislado y clonado en un vector de expresión usando técnicas estandarizadas de ingeniería genética. Alternativamente, se puede asilar y purificar ia enzima píruvato carboxilasa a partir del P. fluorescens siguiendo la actividad piruvato carboxilasa (tal como se describió en los Ejemplos anteriores) y también determinando la proteina biotinilada usando Western blots.

Se determinó la secuencia amino ácido N-terminal de la proteina purificada, luego se preparó una sonda oligonucleótido degenerada la cual se usó para aislar el gen que codifica piruvato carboxilasa a partir de una biblioteca genómica que se ha preparado del P. fluorescens. Se secuenció el clon pyc así obtenido. A partir de la información de la secuencia, se designaron cebadores oligonucleótidos que permiten la clonación de este gen en un vector de expresión de tal modo que se pueda sobreproducir piruvato carboxilasa en la célula huésped. Cualesquiera de los métodos se puede emplear para obtener un vector que codifica el gen P. fluorescens, siendo luego usado para transformar la célula huésped E coli o la célula C. glutamicum. La piruvato carboxilasa del P. fluorescens se expresa en la célula huésped, y se mejora la producción bioquímica según se describe en los ejemplos anteriores. Ejemplo VI. Mejora de la producción bioguímica por medio de la sobreexpresión de ambas carboxilasa piruvato y PEP carboxilasa. En numerosos organismos es posible carboxilar PEP al oxaloacetato vía PEP carboxilasa o se puede convertir en piruvato por la pi vato quinasa. (I. Shiio et al., J. Biochem., 48, 110-120 (1960) ; M. Jetten et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 41 , 47-52 (1994)). Una estrategia posible que se intentó fue aumentar el flujo de carbono hacia el oxaloacetato en el C. glutamicum, bloqueando el flujo de carbono desde el PEP hacia el piruvato. Sin embargo, la produción de lisina por los mutantes piruvato quinasa fue un 40% inferior que por una cepa padre, indicando que el piruvato es esencial para el alto nivel de producción de lisina (M. Gubler et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 60, 47-52 (1994)). El flujo de carbono hacia el oxaloacetato se puede aumentar por medio de la sobreexpresión de la PEP carboxilasa conjutamente con la sobreexpresada piruvato carboxilasa sin bloquear concomitantemente el flujo de carbono desde PEP hacia el piruvato o afectar la recuperación de glucosa. Sin embargo, en heterotrofos tales como el C. glutamicum ^la PEP carboxilasa requiere acetil-CoA para su activación y es inhibida por el aspartato (S. Mike et al., Annals NY Acad. Sci., 272, 12-29 (1993)) ; por lo tanto la amplificación de los genes PEP carboxilasa del C. glutamicum no ha entregado rendimientos aumentados de lisina (J. Kremer et al., Appli. Environ. Microbiol., 57,1746-1752 (1991)). Sin embargo, la PEP carboxilasa aislada de la cianobacteria Anacystis ridulans no requiere acetil CoA para su activación y tampoco es inhibida por aspartato (M. Utter et al., Enzymes, 6, 117-135 (1972). Por lo tanto, esta enzima heteróloga se puede usar para aumentar el flujo de carbono hacia el oxaloacetato en el C. glutamicum. Los genes que codifican la PEP carboxilasa en el A. nidulans se han aislado y clonado (T. Kodaki et al., J. Biochem. 97. 533-539 (1985)). Eiemplo Vil. Aumento de la producción bioquímica por medio de la rotura del gen pck que codifica la PEP carboxiguinasa en coniunto con piruvato carboxilasa sobreexpresada. Una parte del carbono que es desviado hacia el oxaloacetato vía piruvato carboxilasa sobreproducida es análogamente retroconvertido al PEP debido a la présenecia de PEP carboxiquinasa. En estos sistemas se puede desviar mas carbono hacia el oxaloacetato si la célula huésped contiene un gen pck interrumpido, talcomo una cepa E. coli el cual contiene un alelo cero pck. (por ejemplo A. Goldie, J. Bacteriol., 141 , 1115-1121 , (1980)). Eiemplo VIH. Rendimiento mejorado de proteinas recombinantes en E coli que expresan piruvato carboxilasa. Para determinar el efecto que tiene la piruvato carboxilasa sobre la producción de proteinas recombinantes, se realizaron varias experiencias usando cepas de £ coli las cuales sobreproducían la enzima beta-galactosida nativa o la enzima no nativa catecol 2,3-dioxogenasa. Materiales y Métodos. Cepas bacterianas y plasmidios. Todas las experiencias de clonación se realizaron en la cepa E coli R"M+ ALS226, la cula es MC1061/F/ac/°1 Z : :Tn5 Y*A+ (E. Altman, University of Georgia). Se usó la cepa tipo silvestre E. coli MG1655, F-lambda- (M. Guyer et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 45 :135-140 (1980)) para todos los otros estudios. Los plasmidios usados en este trabajo se describen en la Tabla 7. h-1 O cp o Cp TABLA 7. Plasmidios Construcción de pACYC184-/acZ y pACYC184-xy/E. Inicialmente fueron clonados los genes lacZ y xylE en el vector de expresión pTrc99A. Para construir pTrc99A-/acZ, se usaron los cebadores 5' TAT CAT GGA TCC AGG AAA CAG CTA JGA CCA TGA TTA CGG ATT CAC TG 3' (SEQ ID No 3) y 5' TAC ATA CTC GAG CAG GAA AGC TTG GCC TGC CCG GTT ATT ATT JT3' (SEQ ID No 4) para PCR amplificar un fragmento (bp) del par de bases 3138 del plasmidio pTer77 (los lugares de la ezima de restricción se indican subrayados con linea doble, mientas que las regiones de homología con lacZ se indican con un subrayado simple). El fragmento resultante se aisló en gel, se digirió con BamH I e Hind lll, y luego se ligó en el vector pTrc99A, el cual se había digerido con las mismas dos enzimas de restrticción. Para construir pTrc99A-xylE, se usaron los cebadores 5' ATC AGA CTG CAG GAG GTA ACA GCT AJ_G AAC AAA GGT GTA ATG CGA CC 3' (SEQ ID No 5) y 5' TAG CAG TGG CAG CTC TGA AAG C T TGC ACA ATC TCT GCA ATA AGT CG 3' (SEQ ID. No 6) para amplificar por PCR un frgamento 1006 bp del plasmidio pXE60 el cual contenía el gen xylE del tipo silvestre de Pseudomonas putida asilado del plasmidio TOLpWWO (los sitios de la enzima de restricción se indican con un subrayado doble, mientras que la regiones de homología con xylE se indican con un subrayado simple). El fragmento resultante fue aislado en gel, digerido con Pst e Hind lll y luego ligado en el vecto pTrc99A, el cual se había digerido con las mismas dos enzimas de restricción.

Para construir pACYC184-/acZ, se ligó un fragmento de 3504 bp de pTrc99A-/acZ que contenía el gen lacZ y el promotor trc con un fragmento de 3178 bp del pACYC184 que contenía ei gen cat y el ori de replicación. El fragmento 3054bp lac Z sepreoaró digeriendo pTrc99A-/acZ con Nar I e Hind lll y luego rellenando con Klenow, mientras que el fragmento 3178 bp conteniendo cat y el ori se preparó digeriendo pACYC184 con Hind lll. Luego se eligió un clon el cual trasncribía lacZ en la dirección de los punteros del reloj con respecto a pACYC184. Para construir pACYC184-xy/E, se ligó un fragmento 1365 bp del pTrc99A-xy/E que contenía el gen xylE y el promotor trc con un fragmento 3178 bp de pACYC184 que contenía el gen cat y el ori de replicación. El fragmento 1365 bp xylE se preparó digeriendo pTrc99A-xy/E con Nar I e Hind lll y luego rellenando con Klenow, mientras que el fragmento 3178 bp conteniedo cat y el ori se preparó digeriendo pACYC184 con Hind lll. Luego se seleccionó un clon el cual transcribía xylE en la dirección de los punteros del reloj con respecto a pACYC184. Medio. En ambos estudios en frasco agitado y de fermentación, se agregó ÍPTG a una concentración final de 1 mM como inductor gratuito de los vectores de expresión basados en lac, que se usaron en este estudio. Se agregó ampicilina a una concentracaión final de 100 microg/ml como presión selectiva para los plasmidios con replicones ColEl y cloramfenicol se incorporó a una concentración final de de 20 microg/ml como presión selectiva de los plasmidios con los replicones P15A.

Para los estudios en los frascos agitados se usó el caldo LB Miller. Se inocularon muestras de 2 mL de volumen desde una placa y se hicieron crecer - durante aproximadamente 12 horas en el caldo LB Miller conteniendo ampicilina y cloramfenicol. Estas muestras se diluyeron en la relación 1 : 200 en 50 ml de caldo fresco LB Miller conteniendo ampicilina y cloramfenicol y se dejó crecer hasta haber alcanzado un OD 50 de 0,5. Luego se diluyeron los cultivos hasta un OD550 de 0,1 usando 100 mL de caldo fresco LB Miller conteniendo ampicilina y cloramfenicol. Se agregó IPTG y las muestras fueron procesadas a intervalos regulares y analizadas en relación a sus actividades de beta-galactosida o catecol 2,3-dioxigenasa. Para los estudios de fermentación, el medio contenía : 30 g/L glucosa ; 10g/L triptona, 5 g/L extracto de levadura, 5g/L NaCI ; 5 g/L Na2HPO4 ; 1 ,5 g/L KH2PO4, 1.0 g/L NH4CI, 0,25 g/L MgSO4.7H2O, 20 mg/L CaCI2.2H2O, 1 ,0 mg/L biotina. Se inocularon muestras con un volumen de 10 mL a partir de una placa y se hicieron crecer durante aproximadamente 10 horas en le medio de fermentación conteniendo ampicilina y cloramfenicol. El volumen de 10 mL se usó para inocular un frasco agitado de 100 mL conteniendo el mismo medio fresco. Cada frasco agitado se dejó crecer durante 5-6 horas antes de usar para inocular el fermentador. Después de la inoculación del fermentador se agregó IPTG. Las fermentaciones discontinuas o "batch" se desarrollaron en fermentadores de 2L (New Brunswick Scientific Co., New Brunswick, NJ), usando 1 ,6 L de medio a una temperatura controlada de 37°C, un pH de 7,0 y agitación a 800 rpm. Se hizo burbujar continuamente aire estéril filtrado a una tasa de 3 L/min. Para controlar el pH se empleó NaOH de 10% o Na2CO3 2M como una base y H2SO al 10% como un ácido. Ensayos de enzima. Los ensayos de la beta-galactosidasa fueron realizados de acuerdo a lo descrito por A. Pardee et al., J. Mol. Biol. 1 J65-178 (1959) y por J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1972). Una unidad de enzima (EU) de beta-galactosida se define como la cantidad de enzima que produce un micromol de orto-nitrofenol por minuto a 30°C y un pH 7. El orto-nitrofenol tiene una capacidad de absorción de 7,5 unidades de absorbancia/mM para una trayectoria de luz de 1,0 cm. Los ensayos o determinaciones de catecol 2,3-dioxigenasa fueron realizados de acuerdo a lo descrito por Sala-Trepat y Evans (European J. Biochem. 68 :69 (1990) y por M. Zukowski et al., (Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU 80, 1101-1105 (1983)). Una unidad de enzima (EU) de catecol 2,3-dioxigenasa se ha definido como la cantidad de enzima que convierte un micromol de catecol en 2-hidroxímucónico semialdehido por minuto a 30°C y un pH 8. El catecol tiene una capacidad de absorción de 36 unidades de absorbancia/mM para una trayectoria de luz de 1 ,0 cm. La actividad piruvato carboxilasa se midió mediante el método acoplado de J. Payne et al. (J. Gen. Microbiol. 59 :97-101 (1969)). Una unidad de enzima (EU) de piruvato carboxilasa se ha definido como la cantidad de enzima que convierte un micromol de piruvato en oxaloacetato por minuto a 30°C y un pH 8.

Métodos analíticos. El crecimiento celular se monitoreó midiendo la densidad óptica (OD) (espectrofotómetro DU-650, Beckman Instruments, San José, CA) a 550 nm, y esta medición se utilizó para correlacionar con la concentración celular seca. La glucosa y los productos de la fermentación de bajo peso molecular se analizaron por medio de cromatografía líquida de alta presión usando una columna de exclusión iónica Coregel 64-H según lo descrito por Eiteman et al., (Anal. Chim. Acta, 338: 69-75 (1997)). Resultados y Discusión. En la primera experiencia se transformó el plasmidio pTrc99A-pyc, el cual sobreproduce piruvato carboxilasa, y el plasmidio de control pTrc99A en la cepa E. co// MG1655 pACYC-/acZ la cual sobreproduce beta-galactosidasa. Las cepas resultantes, MG1655 pTrc99A pACYC-/acZ yMG1655 pTrc99A-pyc pACYC-lacZ se hicieron crecer simultáneamente en medio rico retirando muestras para el análisis de la actividad beta-galactosidasa. Los resultados se exponen en la Figura 12. Para ambas cepas, debido a que ocurrió el crecimiento celular y se registraron mayores densidades ópticas, se observó una actividad creciente de beta-galactosidasa. En el punto en el cual la densidad óptica alcanzó alrededor de 1 ,70 unidades de absorbancia, la actividad de la beta-galactosidasa alcanzó 4,65 EU/mL en el frasco agitado conteniendo el plasmidio pTrc99A-pyc, mientras la actividad había alcanzado tan solo 2,88 EU/mL en el frasco agitado conteniendo el plasmidio pTrc99A. En este caso, ia presencia del gen pyc codificando para la piruvato carboxilasa, incrementó la síntesis de la beta- galactosidasa activa en un 61 % sobre la base de una densidad celular normalizada. En el segundo estudio, se transformó el plasmidio pTrc99A-pyc el cual sobreproduce piruvato carboxilasa y el plamidio de control pTrc99A en la cepa E. coli MG1655 pACYC-xy/E la cual sobreproduce catecol 2,3 dioxigenasa. Las cepas resultantes, MG1655 pTrc99A pACYC-xy/E y MG1655 pTrc99A-pyc pACYC-xy/E, se hicieron crecer simultáneamente en medio rico y se retirando muestras para el análisis de la catecol 2,3-dioxigenasa. Los resultados se exponen en la Figura 13. Debido a que ocurrió el crecimiento celular y se registraron mayores densidades ópticas, se observó una actividad creciente de catecol 2,3-dioxigenasa. En el punto en el cual la densidad óptica alcanzón alrededor de 1 ,70 unidades de absorbancia, la actividad de la catecol 2,3-dioxigenasa alcanzó 3,28 EU/mL en el frasco agitado conteniendo el plasmidio pTrc99A-pyc, mientras que la actividad alcanzó tan solo 2,40 EU/ml en le frasco agitado conteniendo el plasmidio pTrc99A. En este caso, la presencia del gen pyc que codifica para la piruvato carboxilasa incrementó la sintesis de catecol 2,3-dioxigenasa activa en un 37% sobre la base de una densidad celular normalizada.

Debido a que las experiencias realizadas en el frasco agitado fueron tan exitosas, se hicieron crecer a continuación las cepas poductoras de beta-galactosidasa en un fermentador de 2 L, donde la temperatura, el control del pH y de la agitación permiten alcanzar mayores concentraciones celulares, y con ello entregar una mayor producción de proteina. El primer par de fermentaciones (es decir, una con el gen pyc, una sin este) se realizó usando NaOH a 10% como la base y en la Figura 14 se muestran los resultados. Ambas cepas pTrc99A y pTrc99A-pyc crecieron a una tasa similar, alcanzando una concentración celular de alrededorde 4,5 g/L después de seis horas de ferementación. (Esta concentración celular corresponde a una densidad óptica de 15,0). Ambas cepas pTrc99A y la pTrc99A-pyc entregaron alrededor de 10-15 EU/mL de beta-galactosidasa después de 4 horas de fermentación. Sin embargo, pasado este tiempo la cepa conteniendo el gen pyc siguió generando beta-galactosidasa, mientras que la producción de esta enzima por la cepa que no contiene el gen pyc practícamete se detuvo. A las 12 horas, la actividad de la beta-galactosidasa generada por la cepa pTrc99A-pyc fue de 30,6 EU/ml, mientras que la actividad generada por la cepa sin el gen pyc fue de solamente 12,9 EU/ml. Por lo tanto, la actividad de la beta-galactosida fue un 137% superior en la fermentación usando la cepa con el gen pyc que en la fermentación sin el gen. La presencia de piruvato carboxilasa fue confirmada por medio de un ensayo de enzima. Los autores estaban interesados en saber si la glucosa fue consumida a tasas similares durante estas dos fermentaciones y si otros compuestos químicos de bajo peso molecular fueron sintetizados por las células, particularmente acetato. Para ello, se midieron las concentraciones de la glucosa y del acetato durante estas fermentaciones de 2L; la Figura 15 muestra estos resultados. La cepa sin pyc consumió la mayor parte de la glucosa después de 6 horas de fermentación. Sin embargo, la cepa con pyc consumió la glucosa mas lentamente, quedando alrdedor de 7 g/L de glucosa después de 6 horas y aún alrededor de 3 g/I después de 12 horas. Según se muestra en la Figura 15 la tasa mas lenta de consumo de glucosa en la cepa pTrc99A-pyc no dio como resultado una menor tasa de cercimiento celular. Dado que la piruvato carboxilasa utiliza el dióxido de carbono como un co-substrato en la conversión del piruvato en el oxaloacetato, se investigó si el uso de carbonato de sodio en lugar de hidróxido de sodio como la base incorporada para controlar el pH, afectaría o no los resultados obtenidos. Las mismas fermentaciones realizadas con hidróxido de sodio fueron completadas con esta nueva base y las Figuras 16 y 17 muestran los resultados. Los resultados indican que la cepa pTrc99A creció algo más rápidamente que la cepa pTrc99A-pyc. A las 4 horas de fermentación, ambas cepas produjeron una actividad de beta-galactosidasa de alrededor de 20 EU/ml. Sin embargo, después de 4 horas, la cepa pTrc99A-pyc produjo más rápidamente actividad beta-galactosidasa. A las 12 horas, se había esencialmente agotado la glucosa para la cepa pTrc99A, la cual solamente había producido 82,0 EU/ml de actividad beta-galactosidasa. Por otra parte, a las 15 horas, la cepa pTrc99A-pyc aún tenía 2 g/L de glucosa, y había producido 131 ,8 EU/mL de actividad beta-galactosidasa. En consecuencia, en el momento que se había agotado la glucosa, la actividad de beta-galactosidasa fue superior en un 61%) en la fermentación usando la cepa con el gen pyc que en la fermentación usando la cepa sin el gen pyc.

Independientemente del hecho que las células sobreexpresaron piruvato carboxilasa, las fementaciones que usaron carbonato como la base entregaron mayores rendimientos que las experiencias análogas en las que se usó hidróxido como una base, presumiblemente debido a que las reacciones principales en la célula requieren dióxido de carbono. Independientemente de la base usada en las fementaciones, la actividad piruvato carboxilasa prolongó el tiempo durante el cual se consumió la glucosa, extendiendo el tiempo de operación del ciclo TCA, sin estar limitado por la disponibilidad de carbono. La glucosa se consumió mas eficientemente cuando estaba presente el gen pyc. Por lo tanto, la presencia del gen pyc fue un medio muy efectivo para cada fermentación para dirigir el carbono hacia el oxaloacetato para lograr la mayor producción de proteina. Ejemplo IX. Mayor producción de una proteina recombinante en E. coli expresando piruvato carboxilasa usando un medio definido mínimo. Debido a que el medio definido mínimo es utilizado rutinariamente por las compañías que fabrican enzimas industriales y drogas proteináceas con el objetode minimizar la variabilidad del poceso y reducir las complicaiones siguientes en la purificación, se procedió a examinar la producción del modelo de proteina beta-galactosidasa usando un medio establecido definido. Materiales y Métodos. Cepas bactrianas y plasmidios. La cepa huésped fue E. coli MG1655. En la Tabla 7, Ejemplo VIII, se describen los plasmidios usados para expresar beta-galactosidasa y piruvato caraboxilasa en este estudio. Debido a que ambos plasmidios de expresión pTrc99A y pACYX184 contienen el promotor lac, se agregó isopropil-beta-tiogalactopiranisido (IPTG) para la inducción de la proteina. Medio y condiciones de crecimiento. Todas las fementaciones se realizaron en fermentadores de banco (Bioflow lll, New Brunswick Scientific, Co., Edison, N.J). El medio de cultivo fue modificado con respecto del de Horn et al., (Appl. Microbiol. Biotechnol. 46, 524-532 (1996)). Se usaron varias colonias para inocular 1 mL de caldo Luria-Bertani (LB), incubado a 250 rpm y 37°C durante apoximadamente 6 horas antes de transferir los contenidos a 100mL de medio C1. El medio C1 en frascos agitados de 500 mL se utilñizó para hacer crecer los precultivos para los fermentadores y contenían por litro: Na2HPO .2H2O, 6,42 g; KH2PO4, 3,00g; NH4CI, 1 ,00 g; NaCI, 0,50 g; ácido cítrico, 2,0 g; Fe2(SO4)3, 50 mg; H3BO3, 3,0 mg; MnCI2.4H2O, 15 mg; EDTA disódico.2H2O, 9,6 mg; CuCI2.2H2O, 1 ,5 mg; Na2MoO4.2H2O, 2,5 mg; CoCI2.6H2O, 2,5 mg; ZnCI2.2H2O, 5,0 mg; glucosa, 20 g; MgSO4.7H2O, 0,6g; CaCI2.2H2O, 70 mg; ampicilina, 100 mg y cloramfenicol, 20 mg. Los componentes del medio fueron incorporados en el orden indicado para evitar la precipitación de los metales. Los precultivos se hicieron crecer a 250 rpm y 37°C hasta una densidad óptica cercana a 1 ,5. El medio de fermentación C2 contenía (por L): KH2PO4, 6,00g; (NH4)2HPO , 8,00g; ácido cítrico 2,1 g; Fe2(SO4)3 62 mg; H3BO3, 3,8 mg; MnCI2..4H2O, 18,8 mg; EDTA disódico.2H2O,12 mg; CuCI2.2H2O, 1 ,9 mg; Na2MoO .2H2O, 3,1 mg; CoCI2.6H2O, 3,1 mg; Zn(CH3COO)2.2H2O, 10 mg; glucosa, 30 g, MgSO4.7H2O, 1 ,5 g; CaCI2.2H2O 70 mg; biotina, 1 mg; tiamina.HCI, 1 mg; ampicilina, 100 mg; y cloramfenicol, 20 mg. Los componentes del medio se agregaron en el orden idicado. Cada fermentador se hizo operar a 1000 rpm, 37°C y con un caudal de aire esterilizado de 1 ,2 L/min. Se usó NaOH de 10% y H2S04 de 10% para controlar el pH a 6,5-6,7. Los cultivos fueron inducidos con 1 mM IPTG cuando la densidad óptica fue de aproximadamente 1 ,5. Las muestras fueron almacenadas a -20°C para el análisis siguiente. Métodos analíticos. Durante el desarrollo de una fermentación se tomaron muestras para determinar las concentraciones de la glucosa, biomasa y producto. El crecimiento celular se moinotoreó midiendo la densidad óptica a 550 nm (OD550) (espectrofotómetroDU-650, Beckman Instruments, San José, CA) y esta medición se correlacionó co la cencentración de la masa celular seca. La glucosa y el acetato fueron analizados medíante cromatografía líquida de alta presión de acuerdo a lo descrito anteriormente. (M. Eiterman et al, Anal. Chem. Acta., 338, 69-70 (1997)) usando una columna de exclusión iónica Coregel 64-H. ( Interactive Chromatography, San José, CA). El CO2 y O2 se midieron continuamente en el gas de salida de la fermentación (analizador de gas Ultramat 23; Siemens, Munich, Alemania). Ensayos de la enzima. Se descongelaron alícuotas (1 ,5 mL) de muestras y se centrifugaron (6000xg durante 20 minutos). Las células se lavaron y resuspendieron en tampón 1 ,0M Tris (pH 8,0), se rompieron con un instrumento French (M.R.) Pressure Cell (850 psi) y se centrifugaron (25.000xg durante20 minutos a 4°C). El extracto libre de células se analizó en relación a piruvato carboxilasa siguiendo el método de Payne y Morris (J. Payne et al., J. Gen. Microbiol., 59, 97-101 (1969)). Una unidad de actividad piruvato carboxilasa convierte un micromol de piruvato por miuto en oxaloacetato a 30°C y un pH de 8. Para la actividad beta-galactosidasa, se descongelaron alícuotas (1 ,5 mL) y se diluyeron hasta una OD550 de 0,1 con un caldo de Luria-Bertani (R. L. Rodríguez et al., Biotechnolog. Bioeng., 57, 712-78 (1983)). Las muestras diluidas fueron analizadas en relación a su actividad beta-gaiactosidasa siguiendo el protocolo de A. B. Pardee et al., J. Mol. Biol. 1 , 165-178 (1959). Una unidad de actividad beta -galactosidasa produjo un nmol de o-nitroifenol por minuto a 30°C y un pH 7. Para la determinación del contenido de proteina celular, se descongleron las muestras y se centrifugaron (6000xg durante 20 minutos a 4°C) Las células del medio complejo se lavaron y resuspendieron en tampón 1 ,0M Tris (pH 8,0) y luego se rompieron con una French (M.R.9 Pressure Cell (850 psi, celda de presión) y se centrifugaron (25.000 x g durante 20 minutos a 4°C). Las muestras de las fermentaciones en un medio definido se rompieron con el reactivo de extracción de proteina bacteriana Bper II (M.R.). El contenido total de proteina celular se determinó en las muestras tomadas de las fementaciones en un medio definido usando un kit de ensayo de proteina BCA (M.R.). (Pierce). Resultados y Discusión. El medio C2 contenía 30 g/L de glucosa y 2, 18 g/L de ion amonio (NH4+). La concentración relativamente alta de NH4+ fue necesaria debido a que no había otra fuente de nitrógeno (tal como un hidrolizado de proteina) para proveer moléculas precursoras para obtener amino ácidos. Adicionalmente al hecho que se trata de un medio que se puede utilizar para generar una densidad celular muy alta, mediante un procesamiento "fed-batch", este medio no debería demostar ninguna diferencia causada por la incorporación de una trayectoria anaplerótica adicional al metabolismo central del E. coli. En las Figuras 18 y 19 se presentan los perfiles de fermentación representativos para el E coli, usando el Medio C2 para las cepas pyc y pyc', rerspectvamente. En la cepa que no contenía piruvato carboxilasa, se niveló la actividad beta-galactosidasa después de 10 horas. Al contrario, la actividad de este modelo de proteína recombinante continuó aumentando después de 17 horas en la cepa que contenía actividad piruvato carboxilasa. La presencia de pimvato carboxilasa fue confirmada mediante un ensayo de enzima. Los resultados de las fermentaciones múltiples se han resumido en la Tabla 8. La cepa de E coli teniendo piruvato carboxilasa promedió un 65,5% de aumento en la actividad máxima beta-galactosidasa. Por otra parte, la cepa conteniendo pyc presentó un 24% de incremento en la concentración celular máxima. A diferencia de las fementaciones anaeróbicas en el Ejemplo lll, la - presencia de pyc tuvo como resultado una reducción en la tasa específica de consumo de glucosa y una pequeña redución en la tasa de crecimiento específico. Cada una de estas diferencias es significativa en el nivel alfa = 0,025. La actividad pruvato carboxilasa en estas fermentaciones aeróbicas fue de 0,42 EU/ml a diferencia de 0,06 EU/ml en la fermentación aneróbica. El hecho que la actividad piruvato carboxüasa fue siete veces mas alta podría explicar el efecto sobre el consumo específico de glucosa y la tasa de crecimiento específico. De todos modos, el resultado final fue un significativo aumento en la actividad máxima del modelo de proteina recomnbinante que se pudo obtener. A pesar de que la concentración máxima media de acetato en las fermentaciones de E.coli conteniendo pyc fue mas baja que para aquellas fermentaciones de E coli que no contenían pyc, la diferencia no fue significativa. Por otra parte, dado que ninguna de las cepas produjo suficiente acetato para alcanzar el umbral publicado para la inhibición del acetato de por lo menos 3,0 g/L ( E. Jensen et al., Biotechnol. Bioeng. 36, 1-11, (1990)), se podría concluir que el acetato no juega un papel en la inhibición del crecimiento o la producción de proteina en este estudio. El acetato no está correlacionado significativamente con la producción de proteína o la tasa de crecimiento específico (alfa = 0,10). Este trabajo ha demostrado que es posible aumentar la producción de proteina mediante la incorporación de una trayectoria anaplerótica adicional a los cultivos crecidos aeróbicamente de £ coli. Este estudio demuestra además que el acetato no juega un papel directo en la inhibición de la producción de proteina recombinante. Dado que solamente 1 mg de acetato puede proveer suficiente carbono para alrededor de 10.000U de actividad beta-galactosida, es posible que una cantidad relativamente pequeña de redireccionamineto no observado de carbono desde el acetato o su precursor a la proteina, contribuye significativamente a la actividad incrementada mas allá de todo efecto de inhibición.

TABLA 8. Comparación de E.coli pTrc99A pACYC184-/acZ (sin pyc) y E.coli p Trc99A-pACYC184-/acZ (con pyc) en la producción de beta-galactosidasa en un medio definido. Las desviaciones standard de cada medición aparecen entre paréntesis.

Parámetro £ coli sin pyc E coli con ove Máx act. beta-galactosidasa 63,5 2,40) 105, 1 (3,75) (U/mL) Tasa recup. glucosa esp.(mmoi/L) 5,89(0,06) 4,06 (0,47) Tasa de crecimiento específico (/h) 0,340 (0,024) 0,300 (0,013) Máx. densidad celular (g/L) 5,96 (0,60) 7,40 (0., 01) Máx. concentr. acetato (g/L) 1 ,84(1 ,58) 1 ,20 (0,35) Ejemplo X. Uso de piruvato carboxilasa sobreexpresada para afectar la expresión de proteína en células eucarióticas Esta tecnología se puede aplicar fácilmente a los sistemas eucarióticos usando metodologías análogas a aquella descritas en los Ejemplos VIII y IX. Por ejemplo, para utilizar esta tecnología en células de hongos tales como la levadura Saccharomyces cerevisiae, se construyen dos plasmidios compatibles. El primer plasmidio expresa la enzima piruvato carboxilasa, mientras que el segundo plasmidio expresa la proteina cuya expresión se busca aumentar. En el S. cerevisiae pueden coexistir múltiples plasmídios en la misma célula y cada plasmídio se elige para usar una presión de selección positiva diferente. Mientras usualmente se utilizan antibióticos para proveer la presión selectiva para los plasmidios en las bacterias, para lograr esto en el S. cerevisiae usualmente se utilizan enzimas biosintéticas tales como aquellas involucradas en la síntesis de histidina, leucina, triptófano o uracilo. Específicamente se utilizan rutinariamente los genes HIS3, LEU2, TRP1 o URA3. Un cierto número de plasmidios están disponibles en la levadura los cuales son muy adecuados para la expresión de las proteínas heterólogas, tales como pG-3 (M. Schena et al., Meth. Enzymol., 194, 389-398 (1991)), pRA-6 (T. Nagashima et al. Biosci. Biotech. Biochem, 58, 1292-1296 (1994), pTRP11 (K. Kitamoto etal., Agrie. Biol. Chem., 54, 2979-2987 (1990), y ?YcDE-1 (G. L Knight et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80. 4412-4416 (1983)). El gen piruvato carboxilasa y el gen que codifica la proteína a ser investigada son clonados en dos vectores de expresión compatibles de la levadura que contienen diferentes enzimas biosintéticas seleccionables. Los dos plasmidios resultantes se transforman luego en una célula receptora de levadura que carece ambas enzimas biosintéticas que se están usando como marcadores seleccionables. Para realiza lo ensayos de fermentación se comparó una célula de levadura que sobreproduce piruvato carboxilasa y la proteina a ser ensayada con una céliula de levadura que sobreproduce la proteina a ser ensayada, pero no sobreproduce piruvato carboxilasa. En este caso el plasmidio padre se ha remplazado por el plasmidio que sobreproduce piruvato carboxilasa. Las dos células de levadura se hacen crecer en un medio mínimo definido el cual permite la selección de las enzimas biosintéticas que son expresadas en los dos plasmidios . Dicho medio contiene típicamente 6,7 g/L de base de nitrógeno de levadura Difco sin amino ácidos y 20 g/L de glucosa. El amino ácido y los suplementos de base se agregan luego separadamente. Se pueden agregar diferentes sales para faciitar el crecimiento hasta elevadas densidades y/o aumentar la capacidad de regulación del pH. Análogamente, se pueden emplear diferentes estrategias de alimentación para facilitar el crecimiento hasta altas densidades celulares. Se debe tener presente que la proteína o el péptido que está sobreexpresado se puede codificar en un ácido nucleico integrado cromosómicamente, a pesar de que se prefiere el uso de un plasmidio que codifica al polipéptido. La divulgación completa de todas las patentes, solicitudes de patentes, publicaciones y registros de bases de datos de secuencias de ácido nucleico y proteina, por ejemplo, la información de acceso público en relación con los depósitos del GenBank, que se mencionan aquí se incorporan con esto a modo de referencia. La descripción detallada anterior y los ejemplos, se han entregado solamente para mayor claridad y comprensión. De los mismos no se desprende una limitación innecesaria de la materia de la invención. La invención no está limitada a los detalles exactos mostrados y descritos. Aquellas variaciones obvias para los técnicos en el arte estarán incluidas en la invención definida por las reivindicaciones. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por ia solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

USTAPQ PE gECUENCIAS <110> THE UNIVERSITY OF GEORGIA RESEARCH FOUNDATION, INC, *t al. <120> Sistema dß expresión de protelpa de alto rendimiento y métodos <130> 235.00280201 <140> Sin asignar <141> 2000-10-13 <150> 60/159,467 <151> 1999-10-13 <160> 6 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 49 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial, partidor de avance <400> 1 tactatggta ccttaggaaa cagctatgcc catatccaag atactcgtt <210> 2 <211> 49 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial, partidor reverso <400> 2 attcgtactc aggatctgaa agatctaaca gcctgacttt acacaatcg <210> 3 <211> 47 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial; partidor <400> 3 tatcatggat ccaggaaaca gctatgacca tgattacgga ttcactg <210> 4 <211> 47 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial; partidor <400> 4 tacatactcg agcaggaaag cttggcctgc ccggttatta ttatttt <210> 5 <211> 47 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial; partidor <400> 5 atcagactgc aggaggtaac agctatgaac aaaggtgtaa tgcgacc <210> 6 <211> 47 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial; partidor <400> 6 tagcagtggc agctctgaaa gctttgcaca atctctgcaa taagtcg

Claims (66)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones.

1. Una célula transformada metabólicamente caracterizada porque ella sobreexpresa piruvato carboxilasa de tal modo de producir una mayor cantidad de proteína ó de péptido en comparación con una célula comparable que no sobreexprese piruvato carboxi lasa.

2. La célula transformada metabólicamente de acuerdo a la reivindicación 1 , caracterizada porque se selecciona del grupo consistente en una célula bacteriana, una célula de planta, una célula protist, una célula de hongo y una célula animal.

3. La célula transformada metabólicamente de acuerdo a la reivindicación 2, caracterizada porque la mencionada célula es una célula bacteriana.

4. La célula trasformada metabólicamente de acuerda la reivindicación 3, caracterizada porque la célula bacteriana se elige del grupo consistente en una célula £ coli y una célula B. subtilis.

5. La célula transformada metabólicamente de acuerdo a la reivindicación 2, caracterizada porque la célula es una célula de planta.

6. La célula transformada metabólicamente de acuerdo a la reivindicación 2, caracterizada porque la célula es una célula protist.

7. La célula transformada metabólicamente de acuerdo a la reivindicación 2, caracterizada porque la célula es de hongo.

8. La célula transformada metabólicamente de acuerdo a la reivindicación 7, caracterizada porque la célula de hongo es una célula de levadura.

9. La célula trasformada metabólicamente de acuerdo a la reivindicación 2, caracterizada porque la célula es una célula de animal.

10. La célula transformada metabólicamente de acuerdo a la reivindicación 9, caracterizada porque la célula animal se selecciona del grupo consistente en una célula de mamífero o una célula de insecto.

11. La célula transformada metabólicamente de acuerdo a la reivindicación 10, caracterizada porque la célula de mamífero se selecciona del grupo consistente en una célula de ratón y una célula humana.

12. La célula transformada metabólicamente de acuerdo a la reivindicación 1 , caracterizada porque se ha introducido una secuencia de ácido nucleico que codifica funcionalmente la piruvato carboxilasa.

13. La célula trasformada metabólicamente de acuerdo a la reivindicación 12, caracterizada porque expresa una piruvato carboxilasa heteróloga.

14. La célula transformada metabólicamente de acuerdo a la reivindicación 13, caracterizada porque la secuencia de ácido nucleico que codifica funcionalmente la piruvato carboxilasa heteróloga se ha derivado del R. etli o del P. fluorescens.

15. La célula transformada metabólicamente de acuerdo a la reivindicación 1 , caracterizada porque la expresión de la piruvato carboxilasa es inducible.

16. La célula transformada metabólicamente de acuerdo a la reivindicación 1 , caracterizada porque comprende un gen piruvato carboxilasa endógeno el cual sobreexpresa una píruvato carboxilasa endógena.

17. La célula transformada metabólicamente de acuerdo a la reivindicación 16, caracterizada porque el gen piruvato carboxilasa endógeno se ha mutado de tal modo de producir la sobreexpresión de la piruvato carboxilasa endógena.

18. La célula transformada metabólicamente de acuerdo a la reivindicación 1 , caracterizada porque la célula se ha transformado adicionalmente en forma metabólica para sobreexpresar la fosfoenolpiruvato (PEP) carboxilasa.

19. La célula transformada metabólicamente de acuerdo a la reivindicación 18, caracterizada porque la célula no utiliza el PEP para realizar el transporte de glucosa al interior de le célula.

20. La célula transformada metabólicamente caracterizada porque es en un cultivo celular.

21. La célula transformada metabólicamente de acuerdo a la reivindicación 20, caracterizada porque el cultivo celular se selecciona de un cultivo batch o discontinuo, un cultivo tipo "fed-batch", un cultivo continuo y un cultivo de perfusión.

22. La célula transformada metabólicamente de acuerdo a la reivindicación 3, caracterizada porque es en una fermentación bacteriana.

23. La célula transformada metabólicamente de acuerdo a la reivindicación 7, caracterizada porque es en una fermentación de un hongo.

24. Un método para aumentar o mejorar la producción de por lo menos una proteína o péptído en una célula huésped, caracterizado porque comprende: transformar la célula huésped con un ácido nucleico comprendiendo una secuencia de nucleótido que codifica funcionalmente una enzima piruvato carboxilasa para obtener una célula transformada metabólícamente capaz de aumentar la producción de la proteína o del péptido.

25. El método de acuerdo a la reivindicación 24, caracterizado porque la célula huésped se selecciona del grupo consistente en una célula de bacteria, una célula de planta, una célula protist, una célula de hongo y una célula animal.

26. El método de acuerdo a la reivindicación 24, caracterizado porque la secuencia del nucleótido codifica funcionalmente una enzima piruvato carboxilasa heteróloga.

27. El método de acuerdo a la reivindicación 26, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico se ha derivado del R. etli.

28. El método de acuerdo a la reivindicación 26, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico se ha derivado del P. fluorescens.

29. El método de acuerdo a la reivindicación 24, caracterizado porque la proteína o péptido es una proteína o péptido recombinante.

30. El método de acuerdo a la reivindicación 24, caracterizado porque la expresión de la piruvato carboxilasa en la célula huésped es ¡nducible y donde dicho método además incluye inducir la expresión de la piruvato carboxilasa en la célula transformada metabólicamente.

31. El método de acuerdo a la reivindicación 24, caracterizado porque la secuencia del nucleótido codifica funcionalmente una enzima piruvato carboxilasa endógena.

32. El método de acuerdo a la reivindicación 24, caracterizado porque la célula transformada metabólicamente se ha transformada adicionalmente en forma metabólica para sobreexpresar PEP carboxilasa.

33. El método de acuerdo a la reivindicación 24, caracterizado porque además comprende cultivar o fermentar la célula transformada metabólicamente durante un período de tiempo y bajo condiciones tales de producir una proteína o un péptído.

34. El método de acuerdo a la reivindicación 33, caracterizado porque la actividad o la cantidad producida por célula de la proteína o péptido en la célula transformada metabólicamente en la etapa de cultivo está incrementada con respecto de la actividad o la cantidad producida por célula de la proteína o péptido producidos bajo condiciones similares de cultivo de células comparables que no sobreexpresan piruvato carboxiiasa.

35. El método de acuerdo a ¡a reivindicación 33, caracterizado porque la densidad celular alcanzable por las células transformadas metabólicamente en la etapa de cultivo es mas alta que la densidad celular alcanzable bajo condiciones similares por un cultivo de células comparables que no sobreexpresan piruvato carboxilasa.

36. El método de acuerdo a la reivindicación 33, caracterizado porque la etapa de cultivar se realiza durante un tiempo definido en el cual la producción de proteína o de péptido continua aumentando, donde la duración de la etapa de cultivo es mayor que la duración de una etapa de cultivo, definida en una forma similar, de un cultivo de células comparables las cuales no sobreexpresan piruvato carboxilasa.

37. El método de acuerdo a la reivindicación 33, caracterizado porque el rendimiento de proteína o péptido alcanzado para las células transformadas metabólicamente es mayor que el rendimiento o la producción de proteína o péptido logrado bajo condiciones similares de cultivo por un cultivo de células similares que no sobreexpresan piruvato carboxilasa.

38. El método de acuerdo a la reivindicación 33, caracterizado porque adicionalmente comprende aislar la proteína o el péptido.

39. Un método para aumentar la producción de proteína o péptido en una célula huésped, caracterizado porque comprende: mutar un gen piruvato carboxilasa de una célula huésped que produce un rendimiento de proteína o péptido tal que la célula huésped sobreexpresa piruvato carboxilasa para entregar una célula transformada metabólicamente capaz de una producción aumentada de proteína o péptido.

40. El método de acuerdo a la reivindicación 39, caracterizado porque la célula huésped se selecciona del grupo consistente en una célula bacteriana, una célula de planta, una célula protist, una célula de hongo y una célula animal.

41. Un método para fabricar una proteína o péptido, caracterizado porque comprende: cultivar una célula transformada metabólicamente que sobreexpresa piruvato carboxilasa durante un período de tiempo y bajo condiciones para producir la proteína o el péptido.

42. El método de acuerdo a la reivindicación 41 , caracterizado porque la célula transformada metabólicamente se elige del grupo consistente en una célula bacteriana, una célula de planta, una célula protist, una célula de hongo y una célula animal.

43. El método de acuerdo a la reivindicación 41 , caracterizado porque la célula sobreexpresa una piruvato carboxilasa endógena.

44. El método de acuerde a la reivindicación 41 , caracterizado porque la célula sobreexpresa una piruvato carboxilasa heteróloga.

45. El método de acuerdo a la reivindicación 44, caracterizado porque la piruvato carboxilasa se ha derivado del R. etli.

46. El método de acuerdo a la reivindicación 44, caracterizado porque la piruvato carboxilasa se ha derivado del P. fluorescens.

47. El método de acuerdo a la reivindicación 41 , caracterizado porque la proteína o el péptido es una proteína o péptido recombinante.

48. El método de acuerdo a la reivindicación 41 , caracterizado porque la expresión de la piruvato carboxilasa en la célula transformada metabólicamente es ?nducible, y donde el mencionado método comprende además inducir la expresión de la piruvato carboxilasa en la célula transformada metabólicamente.

49. El método de acuerdo a la reivindicación 41 , caracterizado porque la célula transformada metabólicamente se ha transformado adicionalmente en forma metabólica para sobreexpresar PEP carboxilasa.

50. El método de acuerdo a la reivindicación 41 , caracterizado porque la actividad por cantidad, por célula, de la proteína o el péptido producido por las células transformadas metabólicamente en la etapa de cultivo está incrementada con respecto de la actividad por cantidad, por célula, de la proteína o de péptido producido bajo condiciones similares de cultivo por un cultivo de células comparables que no sobreexpresan piruvato carboxilasa.

51. El método de acuerdo a la reivindicación 41 , caracterizado porque la densidad celular alcanzada por las células transformadas metabólicamente en la etapa de cultivo es mayor que la densidad celular alcanzada bajo condiciones similares por un cultivo de células comparables que no sobreexpresan piruvato carboxilasa.

52. El método de acuerdo a la reivindicación 41 , caracterizado porque la etapa de cultivo se realiza durante un período de tiempo definido por el tiempo durante el cual la producción de proteína o de péptido continúa aumentando y donde la extensión de la etapa de cultivo es mayor que la extensión de la etapa de cultivo, definida en forma similar, de un cultivo de células comparables las cuales no sobreexpresan piruvato carboxilasa.

53. El método de acuerdo a la reivindicación 41 , caracterizado porque la producción o el rendimiento de proteína o de péptido alcanzado por las células transformadas metabólicamente durante la etapa la etapa de cultivo es mayor que la producción o el rendimiento alcanzado bajo condiciones similares de cultivo por un cultivo de células comparables que no sobreexpresan piruvato carboxilasa.

54. El método de acuerdo a la reivindicación 41 , caracterizado porque además comprende aislar la proteína o el péptido aislado.

55. El método de acuerdo a la reivindicación 54, caracterizado porque la proteína o el péptido producido se elige del grupo de una enzima industrial, una enzima para investigación o diagnóstico y una proteína o péptido terapéutico.

56. El método de acuerdo a la reivindicación 41 , caracterizado porque además comprende transformar una célula huésped con un fragmento de ácido nucleico comprendiendo una secuencia de nucleótido la cual codifica funcíonalmente una enzima piruvato carboxilasa para obtener una célula transformada metabólicamente que sobreexpresa piruvato carboxilasa.

57. El método de acuerdo a la reivindicación 56, caracterizado porque la secuencia de nucleótido codifica funcionalmente una enzima piruvato carboxilasa heteróloga.

58. El método de acuerdo a la reivindicación 41 , caracterizado porque además comprende mutar un gen piruvato carboxilasa endógeno de una célula huésped para obtener una célula transformada metabólicamente que sobreexpresa piruvato carboxilasa.

59. Una célula transformada metabólicamente, caracterizada porque sobreexpresa PEP carboxilasa de tal modo de producir una cantidad aumentada de proteína o de péptido con respecto de una célula comparable que no sobreexpresa PEP carboxilasa.

60. La célula transformada metabólicamente de acuerdo a la reivindicación 59, caracterizada porque la célula no utiliza PEP para realizar el transporte de la glucosa al interior de la célula.

61. Una célula transformada metabólicamente que sobreexpresa PEP carboxilasa, caracterizada porque ella no utiliza PEP para efectuar el transporte de glucosa al interior de la célula.

62. Un método para fabricar una proteína o péptido, caracterizado porque comprende cultivar una célula transformada metabólicamente que sobreexpresa PEP carboxilasa durante un tiempo y bajo condicione para producir la proteína o el péptido.

63. El método de acuerdo a la reivindicación 62, caracterizado porque la célula transformada metabólicamente no utiliza PEP para efectuar el transporte de la glucosa al interior de la célula.

64. El método de acuerdo a la reivindicación 62, caracterizado porque además comprende aislar la proteína o el péptido.

65. El método de acuerdo a la reivindicación 62, caracterizado porque además comprende transformar una célula huésped con un fragmento de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica funcionalmente una enzima PEP carboxilasa para obtener una célula transformada metabólicamente que sobreexpresa PEP carboxilasa.

66. El método de acuerdo la reivindicación 62, caracterizado porque además comprende mutar un gen PEP carboxilasa endógena de una célula huésped para obtener una célula transformada metabólicamente que sobreexpresa PEP carboxilasa.