MXPA02000614A

MXPA02000614A - Metodo para correlacionar la funcion de secuencia transfectando una secuencia de acido nucleico de un organismo donador dentro de un huesped vegetal en una orientacion de sentido positivo o antisentido.

Info

Publication number: MXPA02000614A
Application number: MXPA02000614A
Authority: MX
Inventors: L Erwin Robert
Original assignee: Large Scale Biology Corp
Priority date: 1999-07-21
Filing date: 2000-07-21
Publication date: 2002-07-02
Also published as: AU6608300A; IL147342A0; JP2003505078A; WO2001007600A1; BR0012565A; KR20020057945A; CA2380330A1; EP1196557A1

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo para correlacionar la funcion de un organismo huesped derivado de secuencia de acido nucleico por una expresion transiente de la secuencia de acido nucleico en una orientacion antisentido o sentido positivo en un huesped vegetal.

Description

MÉTODO PARA CORRELACIONAR IA FUNCIÓN DE SECUENCIA TRANSFECTANDO UNA SECUENCIA DE ÁCIDO NUCLEICO DE UN ORGANISMO DONADOR DENTRO DE UN HUÉSPED VEGETAL EN UNA ORIENTACIÓN DE SENTIDO POSITIVO O ANTISENTIDO Esta solicitud reclama la prioridad de las Solicitudes Norteamericanas Nos. de Serie 09/359,301, 09/359,305, 09/359,297, y 09/359,300, todas presentadas el 21 de julio de 1999.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere generalmente al campo de la biología molecular y la genética. Específicamente, la presente invención se refiere a un método para correlacionar la función de una secuencia de ácido nucleico derivada del organismo huésped por una expresión transiente de la secuencia de ácido nucleico en una orientación de sentido positivo o antisentido en un huésped vegetal.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Existe gran interés para lanzar proyectos de genoma en el proyecto de genoma humano y no humano. El genoma humano tiene entre 2.8 millones y 3.5 millones de pares de bases, aproximadamente 3% del cual está hecho de genes. En junio del 2000, el Proyecto Genoma Humano y la compañía de biotecnología Celera Genomics anunciaron que se había completado un esquema general del genoma humano (http: //www.ncbi .nlm.nih.gov) . Esta información, sin embargo, representará solamente una secuencia de referencia del genoma humano. La tarea restante radica en la determinación de las funciones de secuencia, que son importantes para el estudio, diagnóstico y tratamiento de enfermedades humanas. El genoma de ratón también se está secuenciando. El Genbank proporciona aproximadamente 1.2% del genoma de ratón de 3 billones de bases (http: //www. informatics.jax.org) y se espera estar disponible un esquema general del genoma de ratón alrededor del 2003 y un genoma terminado alrededor del 2005. Además, el Proyecto del Genoma Drosofila se ha completado recientemente (http://www.fruitfly.org). Los vegetales agrícolas valiosos y básicos, incluyendo maíz, soya y arroz también son objetivos para los proyectos genomas debido a que la información obtenida con estos puede probar ser muy beneficiosa para aumentar la producción de alimentos mundial y mejorar la calidad y valor de los productos agrícolas. El Congreso de los Estados Unidos está considerando lanzar un proyecto de genoma del maíz. Al ayudar a desenredar la genética escondida en el genoma de maíz, el proyecto podría auxiliar para entender y combatir las enfermedades comunes en los cultivos de grano. También podría proporcionar un gran empuje a los esfuerzos para diseñar vegetales para mejorar los rendimientos de granos y resistir la sequía, plaga, sal y otras condiciones ambientales extremas. Tales avances son críticos para una población mundial que se espera doblar alrededor del 2050. Actualmente, existen cuatro especies que proporcionar 60% de todo el alimento humano: trigo, arroz, maíz y papas y las estrategias para aumentar la productividad de estos vegetales es dependiente del rápido descubrimiento de la Presencia de un rasgo en estos vegetales, y la función de secuencias de gen desconocidas en estos vegetales. Una estrategia que se ha propuesto para asistir en tales esfuerzos es crear una base de datos de las marcas de secuencia expresadas (las EST) que pueden usarse para identificar los genes expresados. La acumulación y análisis de las marcas de secuencia expresadas (las EST) se ha vuelto un componente importante de la investigación del genoma. Los datos de EST pueden usarse para identificar productos de gen y acelerar con eso la clonación de genes. Diversas bases de datos de secuencia se han establecido en un esfuerzo para almacenar y relacionar la cantidad tremenda de información de secuencia que se genera por los esfuerzos de secuenciación en curso. Algunos han sugerido secuenciar 500,000 de las EST para maíz y 100,000 de las EST cada una para arroz, trigo, avena, cebada, y sorgo. Los esfuerzos para secuenciar los genomas de las especies vegetales descansaran indudablemente sobre estas bases de datos de computadora para compartir los datos de secuencia conforme se generen. Arabidopsis thaliana puede ser un descubrimiento objetivo atractivo de un rasgo y para el descubrimiento de la fusión del gen debido a que ya se ha producido un conjunto muy grande de EST en este organismo, y estas secuencias marcan más del 50% de los genes de Arabidopsis esperados. El uso potencial de la información de secuencia así generado es enorme si puede determinarse la función del gen. Puede ser posible diseñar semillas comerciales para uso agrícola para transportar cualquier número de rasgos deseables al alimento y cultivo de fibra y aumentando con eso la producción agrícola y el suministro de alimento mundial. La investigación y desarrollo de las semillas comerciales se ha enfocado así principalmente en la cría vegetal tradicional, sin embargo ha existido un interés aumentado en la biotecnología conforme se relaciona a las características del vegetal. El conocimiento de los genomas involucrados y la función de los genes contenidos en estos para vegetales monocotiledóneos y dicotiledóneos es esencial para realizar efectos positivos de tal tecnología. El impacto de la investigación genómica en las semillas es potencialmente de mucho alcance. Por ejemplo, el perfilado de genes en algodón puede conducir a un entendimiento de los tipos de genes que se expresan principalmente en células de fibra. Los genes o promotores derivados de estos genes pueden ser importantes en el diseño genético de fibra de algodón para resistencia aumentada para color de fibra "hecho en la estructura misma" . En la producción vegetal, el perfilado de genes acoplado al análisis de rasgos fisiológicos puede conducir a la identificación de marcadores predictivos que serán crecientemente importantes en los programas de producción asistidos por marcador. Explorar la secuencia de ADN de un cultivo particular para genes importantes para rendimiento, calidad, salud, apariencia, color, sabor, etc., son aplicaciones de importancia obvia para la mejora de cultivos. Se ha conducido trabajo en el área de desarrollar vectores adecuados para expresar ADN y ARN extraño en huéspedes vegetales y animales. Ahlquist, Patentes Norteamericanas Nos. 4,885,248 y 5,173,410 describen el trabajo preliminar hecho para diseñas vectores de transferencia que pudieran ser útiles para transferir material genético extraño dentro de un huésped vegetal con el propósito de expresión en él. Los aspectos adicionales de virus de ARN híbrido y vectores de transformación de ARN se describen por Ahlquist et al . en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,466,788, 5,602,242, 5,627,060 y 5,500,360. Donson et al . r Patentes Norteamericanas Nos. 5,316,931, 5,589,367 y 5,866,785 demuestran por primera vez vectores virales vegetales adecuados para la expresión sistémica de material genético extraño en vegetales. Donson et al describe vectores virales vegetales que tienen promotores subgenómicos heterólogos para la expresión sistémica de genes extraños. Carrington et al . , Patente Norteamericana 5,491,076, describe vectores potivirus particulares también útiles para expresar genes extraños en vegetales. Los vectores de expresión descritos por Carrington et al se caracterizan por utilizar la habilidad única de las poliprotein proteasas virales para desdoblar proteínas heterólogas de poliproteínas virales. Estos incluyen Potivirus tales como Virus Grabado del Tabaco. Los vectores adecuados adicionales se describen en la Patente Norteamericana 5,811,653 y la Solicitud de Patente Norteamericana No. de Serie 08/324,003. Condreay et al . , { Proc . Nati . Acad. Sci . USA 96:127-132) describe usar vaculovirus para suministrar y expresar genes eficientemente en tipos de célula de origen de humano primate y roedor. Price et al ( Proc . Nati . Acad. Sci . USA 93:9465-9570 (1996)) describe infectar células de insectos vegetales y mamíferos con Nodaviruses. La construcción de virus de ARN vegetal para la introducción y expresión de genes extraños no virales en vegetales también se ha demostrado por Brisson et al . r Methods in Enzymology 118: 659 (1986), Guzman et al . , Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 172-189 (1988), Dawson et al . , Virology 172:285-292 (1989), Takamatsu et al . , EMBO J. 6:307-311 (1987), French et al . , Science 231:1294-1297 (1986), y Takamatsu et al . , FEBS Letters 269:73-76 (1990). Sin embargo, estos vectores virales no han mostrado ser capaces de extensión sistémica en el vegetal y la expresión de los genes extraños no virales en la mayoría de las células vegetales en el vegetal completo. Además, en muchos de estos vectores virales no ha probado ser estable para el mantenimiento de genes extraños no virales. Sin embargo, los vectores virales descritos por Donson et al . , en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,316,931, 5,589,367, y 5,866,785, Turpén en la Patente Norteamericana No. 5,811,653, Carrington et al en la Patente Norteamericana No. 5,491,076 y en la Solicitud de Patente Norteamericana copendiente No. de Serie 08/324,003, han probado ser capaces de infectar células vegetales con material genético extraño y extenderse sistémicamente en el vegetal y expresar los genes extraños no virales contenidos en el mismo en las células vegetales localmente o sistémicamente. Morsy et al . , { Proc . Nati . Acad. Sci . USA, 95:7866-7871 (1998)) desarrolla unos vectores adenovirales dependientes de asistente que tienen hasta 37Kb de capacidad de inserto y que se propagan fácilmente.

Con la reciente llegada de la tecnología para clonar, los genes pueden desconectarse selectivamente. Un método es crear moléculas de ARN o ADN antisentido que se enlazan específicamente con un mensaje de ARN del gen seleccionado, interrumpiendo con eso el mecanismo molecular preciso que expresa un gen como una proteína. La tecnología antisentido que desactiva genes específicos proporciona una propuesta diferente de una propuesta genética clásica. La genética clásica normalmente estudia las mutaciones aleatorias de todos los genes en un organismo y selecciona las mutaciones responsables de características específicas.

La propuesta antisentido inicia con un gen clonado de interés y lo manipula para producir información acerca de su función. La expresión de ARN de sentido positivo o antisentido derivado de virus en vegetales transgénicos proporciona una expresión aumentada o reducida de un gen endógeno. En la mayoría de los casos, la introducción y la expresión subsecuente de un transgen aumentará (con un ARN de sentido positivo) o disminuirá (con un ARN antisentido) el nivel de flujo continuo de un producto de gen específico { Curr. Opin. Cell Biol 7:399-405 (1995)). También existe evidencia que la inhibición de genes endógenos ocurre en vegetales transgénicos que contienen ARN de sentido (Van der Krol et al . , Plant Cell 2 (4) : 291-299 (1990) , ?apoli et al . , Plant Cell 2:279-289 (1990) y Fray et al . , Plant Mol . Biol . 22:589-602 (1993) ) . El silenciamiento del gen pos-transcripcional (PTGS) en vegetales transgénicos es la manifestación de un mecanismo que suprime la acumulación de ARN en una forma específica de secuencias. Existen tres modelos para explicar el mecanismo de PTGS: transcripción directa de un ARN antisentido del transgen, un ARN antisentido producido en respuesta a la sobre expresión del transgen, o un ARN antisentido producido en respuesta a la producción de un producto de ARN de sentido aberrante del transgen (Baulcombe, Plant Mol . Biol . 32:79-88 (1996)). El mecanismo de silenciamiento del gen pos-transcripcional se tipifica por la degradación altamente específica del ARNm del transgen y el AR? objetivo, que contiene las mismas o complementarias secuencias de nucleótidos. En algunos casos el transgen silenciado es del mismo sentido que el gen endógeno objetivo o AR? genómico viral, se ha sugerido que una AR? polimerasa dependiente de AR? codificado de vegetal hace una hebra complementaria del AR?m del transgen y que los AR?c pequeños potencian la degradación del ARN objetivo. El AR? antisentido y los AR?c hipotéticos se han propuesto que actúan hibridizándose con el ARN objetivo para hacer al híbrido un sustrato para R?aasa de doble hebra (ds) o detener la traducción del AR? objetivo (Baulcombe, Plant Mol . Biol . 32:79-88 (1996)). También se propone que esta regulación a la baja o "co-supresión" por el ARN de sentido pudiera deberse a la producción de ARN antisentido por transcripción de lectura completa de promotores distales ubicados en la hebra opuesta del ADN cromosomal (Grierson et al . , Trends Biotechnol . 9:122-123 (1993) ) . Waterhouse et al (Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 10:13959-64 (1998)) preparó vegetales de tabaco transgénicos que contienen construcción de sentido o antisentido. Las construcciones Pro[s] y Pro [a/s] contienen la inclusión nuclear PVY Pro ORF en las orientaciones sentido y antisentido respectivamente. La construcción de alto de Pro[s] contienen el PVYPro ORF en la orientación de sentido pero con un codón de alto tres codones corriente abajo del codón de iniciación. Waterhouse et al muestra que cuando los genes de aquellas construcciones se transformaron en vegetales, los vegetales presentaron inmunidad a la forma de virus del cual el transgen se derivó. Smith et al (Plant Cell , 6:1441-1453, (1994)) preparó un vegetal transgénico del tabaco que contiene la estructura de lectura abierta de la proteína de recubrimiento (CP) del virus Y de la papa (PVY)=, que produjo un ARNm vuelto intraducibie por la introducción de un codón de alto inmediatamente después del codón de iniciación. La expresión del ARN de sentido intraducibie correlacionó inversamente con la resistencia al virus del vegetal transgénico. Kumagai et al ( Proc, Nati . Acad. Sci .

USA 92:1679 (1995)) reporta que la expresión del gen en Ni cotiana benthamiana transfectada se inhibió citoplásmicamente por el suministro viral de un ARN de una secuencia conocida derivada del ADNc que codifica fitoeno de saturasa de tomate (lycopersicon esculentum) en una orientación de sentido positivo o un antisentido. La tecnología de sentido positivo y sentido antisentido puede usarse para desarrollar una selección genómica funcional de un organismo donador de Monera , Protisca , Fungi , Plantae o Animalia . La presente invención proporciona un método para detectar la presencia de un rasgo en un huésped vegetal y determinar la función y secuencia de un ácido nucleico de un organismo donador expresando la secuencia de ácido nucleico en el huésped vegetal. Las proteínas que enlazan GTP ejemplifican esta invención. En células eucarióticas, las proteínas que enlazan GTP funcionan en una diversidad de procesos celulares, que incluyen transducción de señales, organización del citoesqueleto, y transporte de proteínas. Las proteínas de enlace de GTP de bajo peso molecular (20-25 K Daltons) incluyen ras y sus parientes cercanos (por ejemplo, Ran) , rho y sus parientes cercanos, la familia rab y la familia del factor de reibosilación de ADP (ARF) . Las proteínas de enlace de GTP heterotriméricas y monoméricas que pueden estar involucradas en la secreción y transporte intracelular se dividen en dos clases estructurales: Las familias rab y la ARF. Ran, una proteína de enlace de GTP pequeña soluble, ha demostrado ser esencial para la translocación nuclear de proteína y también se piensa que está involucrada para regular la progresión del ciclo celular en células de mamífero y levadura. Los ADNc que codifican las proteínas de enlace GTP se han aislado de una diversidad de vegetales que incluyen arroz, cebada, maíz, tabaco y A. thaliana . Por ejemplo, Verwoert et al (Plant Molecular Biol . 27:629-633 (1995)) reporta el aislamiento de un clon ADNc de Zea mays que codifica una proteína que enlaza GTP de la familia de ARF por selección genética directa en una mutante fabD de E. coli con una biblioteca de expresión de ADNc de maize . Regad et al ( FEBS 2:133-136 (1993) aisló un clon de ADNc que codifica la ARF de una biblioteca de ADNc de células cultivadas de Arabidopsis thaliana seleccionando aleatoriamente y secuenciando los clones de ADNc. Dallmann et al (Plant Molecular Biol . 19:847-857 (1992)) aisló dos de los ADNc que codifican proteínas de enlace a GTP pequeñas de bibliotecas de ADNc de hoja usando una propuesta PCR. Dallmann et al preparó los ADNc de hojas y los usó como plantillas en amplificaciones de PCR con oligonucleótidos degenerados que corresponden a los motivos altamente conservados, encontrados en miembros de la superfamilia ras, como cebadores. Haizel et al . , (Plant J. , 11:93-103 (1997)) aisló clones de ADNc genómicos que codifican proteínas de enlace a GTP pequeños parecidos a Ran de ADNc de Arabidopsis y bibliotecas genómicas usando un ADNc de Nt Ranl de tabaco de longitud completa como una sonda. La presente invención proporciona ventajas sobre los métodos anteriores para identificar la secuencia de ácido nucleico que codifica las proteínas que enlazan GTP en que solamente secuencia clones que tienen una función y no secuencia aleatoriamente los clones. Los insertos de ácido nucleico en clones que tienen una función se marcan y usan como sondas para aislar un ADNc que se hibridiza a ellos. La presente invención proporciona un método para detectar la presencia de un rasgo en un huésped vegetal expresando una secuencia de ácido nucleico derivada de un organismo donador en una orientación positiva o antisentido en el huésped vegetal. Una vez que la presencia de un rasgo se identifica por cambios fenotípicos, el inserto de ácido nucleico en el clon de ADNc o en el vector se secuencia después. El método presente proporciona un método rápido para determinar la presencia de un rasgo y un método para identificar una secuencia de ácido nucleico y su función en un huésped vegetal seleccionado cambios fenotípicos o bioquímicos en el huésped vegetal transfectado con una secuencia de ácido nucleico del organismo donador.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención involucra esencialmente los pasos de (1) introducir dentro de un vector viral una biblioteca de insertos de secuencia derivados de organismo huésped en una orientación positiva o de antisentido; (2) expresar cada inserto en un huésped vegetal, y (3) detecta cambios bioquímicos o fenotípicos del huésped vegetal como un resultado de la expresión. Un huésped vegetal puede ser un vegetal monocotiledóneo o dicotiledóneo, tejido vegetal o célula vegetal. Los organismos donadores incluyen especies de los reinos Monera , Protista, Fungi , Plantae, o Animalia, tales como humano, ratón, drosofila, etc. Si el organismo donador es también un vegetal, el vegetal donador y el vegetal huésped pertenecen típicamente a géneros, familia, órdenes, clases, subdivisiones o divisiones diferentes. La función de los insertos de secuencia en la biblioteca se desconoce típicamente. El número de insertos de secuencia en una biblioteca es típicamente mayor de aproximadamente 10, 15, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 5000, o 15,000, etc. La longitud de cada inserto es típicamente más larga de aproximadamente 50, 100, 200, o 500 pares de bases. Más específicamente, la presente invención se dirige a un método para cambiar el fenotipo o bioquímica de un huésped vegetal, un método para determinar un cambio en el fenotipo o bioquímica en un huésped vegetal, y un método para determinar la presencia de un rasgo en un huésped vegetal. El método comprende los pasos de expresar transientemente una secuencia de ácido nucleico de un organismo donador en una orientación antisentido de sentido positivo en un huésped vegetal, identificando los cambios en el huésped vegetal, y correlacionando la expresión de la secuencia con los cambios fenotípicos o bioquímicos . La secuencia de ácido nucleico no necesita aislarse, identificarse o caracterizarse antes de la transfección dentro del organismo huésped. La presente invención también se dirige a un método para hacer un perfil de gen funcional al expresar transientemente una biblioteca de secuencia de ácido nucleico en un organismo huésped, determinando los cambios fenotípicos o bioquímicos en el huésped vegetal, identificando un rasgo asociado con el cambio, identificando el gen donador asociado con el rasgo, identificando el gen huésped homólogo, si lo hubiera, y anotando la secuencia con su fenotipo o función asociada. La presente invención también se dirige a un método para determinar la función de una secuencia de ácido nucleico, que incluye un gen, en un organismo donador, al transfectar la secuencia de ácido nucleico dentro de un huésped vegetal en una forma como para afectar los cambios fenotípicos o bioquímicos en el huésped vegetal. En una modalidad, se preparan ácidos nucleicos virales recombinantes para incluir el inserto de ácido nucleico de un donador. Los ácidos nucleicos virales recombinantes infectan un huésped vegetal y producen los ARN de sentido positivo o antisentido en el citoplasma lo cual resulta en una expresión reducida o mejorada de genes celulares endógenos en el organismo huésped. Una vez que la presencia de un rasgo se identifica por cambios fenotípicos o bioquímicos, la función del ácido nucleico se determina. El inserto de ácido nucleico en un clon de ADNc o en un vector se secuencia después. La secuencia de ácido nucleico se determina por una análisis de secuencia estándar. Un aspecto de la invención es un método para identificar y determinar una secuencia de ácido nucleico en un organismo donador, cuya función es silenciar los genes endógenos en un huésped vegetal, al introducir el ácido nucleico dentro del huésped vegetal por medio de un ácido nucleico viral adecuado para producir la expresión del ácido nucleico en el vegetal transfectado. Este método utiliza el principio de silenciamiento del gen pos-transcripción del homólogo del gen huésped endógeno, por ejemplo, los ARN antisentido, o los ARN de sentido positivo. Particularmente, esta función de silenciamiento es útil para silenciar una familia de multigenes en un organismo donador. Además, la sobre expresión de un AR? de sentido más que resulte en la sobreproducción de una proteína puede causar cambios fenotípicos o bioquímicos en un huésped. Otro aspecto de la invención es descubrir genes en un organismo donador que tienen la misma función que esa en un huésped vegetal. El método inicia con la construcción de una biblioteca de ADNc, o una biblioteca de ADN genómico o una reunión de ARN de un organismo donador, por ejemplo, de tejidos o células de humano, ratón o drosofila. Después, un ácido nucleico viral recombinante que comprende un inserto de ácido nucleico derivado de la biblioteca se prepara y se usa para infectar un huésped vegetal. El huésped vegetal infectado se inspecciona por cambios fenotípicos o bioquímicos. El ácido nucleico viral recombinante que resulta en cambios fenotípicos o bioquímicos en el huésped vegetal se identifica y la secuencia del inserto de ácido nucleico se determina por un método estándar. Tal secuencia de ácido nucleico en el organismo donador puede tener homología de secuencia sustancial como esa en el huésped vegetal, por ejemplo las secuencias de ácido nucleico se conservan entre el donador y el huésped vegetal. Una vez que se secuencia el ácido nucleico, puede marcarse y usarse como una sonda para aislar los ADNc de longitud completa del organismo donador. Esta invención proporciona un medio rápido para elucidar la función y secuencia de ácidos nucleicos de un organismo donador; tal información que se expande rápidamente puede utilizarse subsecuentemente en el campo de la genómica.

Otro aspecto de la invención actual se dirige a un método para aumentar el rendimiento de un cultivo de grano. El método comprende expresar transientemente una secuencia de ácido nucleico de un vegetal donador en una orientación de antisentido o sentido positivo en un cultivo de granos, en donde la expresión resulta en el crecimiento atrofiado y la producción de semillas aumentada del cultivo de grano. Un método preferido comprende los pasos de clonar la secuencia de ácido nucleico dentro de un vector viral vegetal e infectar el cultivo de grano con un ácido nucleico viral recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico. Otro aspecto de la invención es descubrir genes que tienen la misma función en vegetales diferentes. El método inicia con una biblioteca de los ADNc, los ADN genómicos o una reunión de los ARN de un primer vegetal. Después, un ácido nucleico viral recombinante que comprende un inserto de ácido nucleico derivado de la biblioteca se prepara y se usa para infectar un vegetal huésped diferente. El vegetal huésped infectado se inspecciona por cambios fenotípicos o bioquímicos. El ácido nucleico viral recombinante que resulta en cambios fenotípicos o bioquímicos en el vegetal huésped se identifica y la secuencia del inserto de ácido nucleico se determina por un método estándar. Tal secuencia de ácido nucleico en el primer vegetal tiene homología de secuencia sustancial como aquel en el vegetal huésped: Las secuencias de ácido nucleico se conservan entre los dos vegetales. Esta invención proporciona un medio rápido para elucidar la función y secuencia de ácidos nucleicos de interés; tal información que se expande rápidamente puede utilizarse subsecuentemente en el campo de la genómica. Otro aspecto de la presente invención es producir proteínas humanas en un huésped vegetal. Después que se aislan e identifican ácidos nucleicos de funciones similares de un humano y un vegetal huésped, se comparan las secuencias de aminoácidos derivadas de los ADN. Las secuencias de ácido nucleico del vegetal se cambia de manera que codifican la misma secuencia de aminoácidos que la proteína humana. La secuencia de ácido nucleico puede cambiarse conforme a cualquier método convencional, tal como, mutagénesis dirigida al sitio o síntesis de ADN basada en polimerasa. Los huéspedes vegetales incluyen vegetales de interés comercial, tales como cultivos alimenticios, cultivos de semillas, cultivos de aceite, cultivos de ornamento y cultivos de silvicultura. Por ejemplo, puede seleccionarse trigo, arroz, maíz, papas, cebada, tabaco, soya, cañóla, maíz, semilla de aceite de colza, Arabidopsis, Nicotiana como un huésped vegetal. En particular, los vegetales huésped capaces de ser infectados por un virus que contiene un ácido nucleico viral recombinante se prefieren. Un vector viral vegetal puede comprender un promotor subgenómico nativo o no nativo, una secuencia que codifica proteína de recubrimiento, y al menos una secuencia de ácido nucleico no nativa. Algunos vectores virales usados de acuerdo con la presente invención pueden encapsularse por las proteínas de recubrimiento codificadas por el virus recombinante. El ácido nucleico viral recombinante es capaz de replicación en el huésped vegetal, y transcripción o expresión del ácido nucleico no nativo en el huésped vegetal para producir un cambio fenotípico o bioquímico. Cualquier construcción de vector adecuada útil para producir la expresión localizada sistémica de los ácidos nucleicos en un huésped vegetal está dentro del alcance de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIGURA 1 representa el plásmido pBS #735. La FIGURA 2 representa el plásmido pBS #740. La FIGURA 3 representa el plásmido TTU51A QSEO #3. La FIGURA 4 representa el plásmido TTOIA/Ca CCS+. La FIGURA 5 representa el plásmido TT01/PSY+. La FIGURA 6 representa el plásmido TT01/PDS+. La FIGURA 7 representa un Vector Viral de Monocotiledónea. La FIGURA 8 representa el plásmido TTU51 CTP CrtB. La FIGURA 9 representa el plásmido pBS 740 AT #2441 (No. de ATCC: PTA-332) . La FIGURA 10 representa la secuencia de nucleótidos de 740 AT #2441. La FIGURA 11 representa la comparación de las secuencias de nucleótidos de 740 AT #2441 y AF017991. La FIGURA 12 representa la comparación de secuencias de nucleótidos de 740 AT #2441 y L16787. La FIGURA 13 representa la comparación de secuencias de aminoácido de 740 AT #2441 y la proteína de enlace a GTP RAN-B1. La FIGURA 14 representa el plásmido pBS 740 AT #120 (No. de ATCC: PTA-325) . La FIGURA 15 muestra la comparación de secuencias de nucleótidos de A. thaliana 740 AT #120 y A. thaliana est AA042085. La FIGURA 16 muestra el alineamiento de la secuencia de nucleótidos de 740 AT #120 con el factor de ribosilación de ADP de arroz D17760 ( Oryza sativa) . La FIGURA 17 muestra el alineamiento de la secuencia de nucleótidos de 740 AT #120 al factor de ribosilación de ADP humano P16587. La FIGURA 18 muestra la alineación de la secuencia de nucleótidos de la secuencia humanizada 740 AT #120 H al factor de ribosilación de ADP humano M33384. La FIGURA 19 muestra el plásmido KS+Nb ARF #3 (No. de ATCC: PTA-324) . La FIGURA 20 muestra la comparación de secuencias de nucleótidos de A. thaliana 740 AT #120 y N. benthamida KS+?b ARF #3. La FIGURA 21 muestra un vector que silencia el gen del virus cascabel del tabaco. La FIGURA 22 muestra el plásmido pBS #740 AT #88 (?o. de ATCC: PTA-331) . La FIGURA 23 muestra la secuencia de 740 AT #88. La FIGURA 24 muestra la comparación de las secuencias de nucleótidos de AT #88 y Brassica rapa L35812. La FIGURA 25 muestra la comparación de secuencias de nucleótidos de AT #88 y Octopus Rhodopsin X07797. La FIGURA 26 muestra la comparación de secuencias de nucleótidos de AT # 88 y Octopus Rhodopsin P31356. La Figura 27 muestra el plásmido pBS#377 (?o. de ATCC: PTA-334) . La FIGURA 28 muestra la secuencia de nucleótidos de 740 AT #377. La FIGURA 29 muestra el plásmido pBS #2483 (?o. de ATCC: PTA-329) . La FIGURA 30 muestra la secuencia de nucleótidos de 740 AT #2483 La FIGURA 31 muestra el plásmido pBS 740 AT#909 (?o. de ATCC: PTA-330) .

La FIGURA 32 muestra la comparación de secuencia de nucleótidos de AT #909 y proteína Ribosomal L19 de una línea de células de cáncer de mama. La FIGURA 33 muestra la comparación de la secuencia de nucleótidos de AT #909 y proteína ribosomal L19 P14118 60S L19. La FIGURA 34 muestra el plásmido pBS AT #855 (No. de ATCC: PTA-325) . La FIGURA 35 muestra la comparación de secuencias de nucleótidos de AT #855 y la proteína HAT7 ho eobox ORF.

DESCRIPCIÓN DETALLA DE LA INVENCIÓN La presente invención involucra esencialmente los pasos de (1) introducir dentro de un vector viral una biblioteca de insertos de secuencia derivados de organismo huésped en una orientación positiva o de antisentido; (2) expresar cada inserto en un huésped vegetal, y (3) detecta cambios bioquímicos o fenotípicos del huésped vegetal como un resultado de la expresión. Un huésped vegetal puede ser un vegetal monocotiledóneo o dicotiledóneo, tejido vegetal o célula vegetal. Los organismos donadores incluyen especies de los reinos Monera, Protista, Fungi , Plantae, o Animalia, tales como humano, ratón, drosofila, etc. Si el organismo donador es también un vegetal, el vegetal donador y el vegetal huésped pertenecen típicamente a géneros, familia, órdenes, clases, subdivisiones o divisiones diferentes. La función de los insertos de secuencia en la biblioteca se desconoce típicamente. El número de insertos de secuencia en una biblioteca es típicamente mayor de aproximadamente 10, 15, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 5000, ó 15,000, etc. La longitud de cada inserto es típicamente más larga de aproximadamente 50, 100, 200, o 500 pares de bases. Más específicamente, la presente invención se dirige a un método para cambiar el fenotipo o bioquímica de un huésped vegetal, un método para determinar un cambio en el fenotipo o bioquímica en un huésped vegetal, y un método para determinar la presencia de un rasgo en un huésped vegetal. El método comprende los pasos de expresar transientemente una secuencia de ácido nucleico de un organismo donador en una orientación antisentido de sentido positivo en un huésped vegetal, identificando los cambios en el huésped vegetal, y correlacionando la expresión de la secuencia con los cambios fenotípicos o bioquímicos. La secuencia de ácido nucleico no necesita aislarse, identificarse o caracterizarse antes de la transfección dentro del organismo huésped. La presente invención también se dirige a un método para hacer un perfil de gen funcional al expresar transientemente una biblioteca de secuencia de ácido nucleico en un organismo huésped, determinando los cambios fenotípicos o bioquímicos en el huésped vegetal, identificando un rasgo asociado con el cambio, identificando el gen donador asociado con el rasgo, identificando el gen huésped homólogo, si lo hubiera, y anotar la secuencia con su fenotipo o función asociada. La presente invención también se dirige a un método para determinar la función de una secuencia de ácido nucleico, que incluye un gen, en un organismo donador, al transfectar la secuencia de ácido nucleico dentro de un huésped vegetal en una forma como para afectar los cambios fenotípicos o bioquímicos en el huésped vegetal. En una modalidad, se preparan ácidos nucleicos virales recombinantes para incluir el inserto de ácido nucleico de un donador. Los ácidos nucleicos virales recombinantes infectan un huésped vegetal y producen los ARN de sentido positivo o antisentido en el citoplasma lo cual resulta en una expresión reducida o mejorada de genes celulares endógenos en el organismo huésped. Una vez que la presencia de un rasgo se identifica por cambios fenotípicos o bioquímicos, la función del ácido nucleico se determina. El inserto de ácido nucleico en un clon de AD?c o en un vector se secuencia después. La secuencia de ácido nucleico se determina por una análisis de secuencia estándar. Un aspecto de la invención es un método para identificar y determinar una secuencia de ácido nucleico en un organismo donador, cuya función es silenciar los genes endógenos en un huésped vegetal, al introducir el ácido nucleico dentro del huésped vegetal por medio de un ácido nucleico viral adecuado para producir la expresión del ácido nucleico en el vegetal transfectado. Este método utiliza el principio de silenciamiento del gen pos-transcripción del homólogo del gen huésped endógeno, por ejemplo, los ARN antisentido, o los ARN de sentido positivo. Particularmente, esta función de silenciamiento es útil para silenciar una familia de multigenes en un organismo donador. Además, la sobre expresión de un ARN de sentido más que resulte en la sobreproducción de una proteína puede causar cambios fenotípicos o bioquímicos en un huésped. Otro aspecto de la invención es descubrir genes en un organismo donador que tienen la misma función que esa en un huésped vegetal. El método inicia con la construcción de una biblioteca de ADNc, o una biblioteca de ADN genómico o una reunión de ARN de un organismo donador, por ejemplo, de tejidos o células de humano, ratón o drosofila. Después, un ácido nucleico viral recombinante que comprende un inserto de ácido nucleico derivado de la biblioteca se prepara y se usa para infectar un huésped vegetal. El huésped vegetal infectado se inspecciona por cambios fenotípicos o bioquímicos. El ácido nucleico viral recombinante que resulta en cambios fenotípicos o bioquímicos en el huésped vegetal se identifica en la secuencia del inserto de ácido nucleico y se determina por un método estándar. Tal secuencia de ácido nucleico en el organismo donador puede tener homología de secuencia sustancial como esa en el huésped vegetal, por ejemplo las secuencias de ácido nucleico se conservan entre el donador y el huésped vegetal. Una vez que se secuencia el ácido nucleico, puede marcarse y usarse como una sonda para aislar los ADNc de longitud completa del organismo donador. Esta invención proporciona un medio rápido para elucidar la función y secuencia de ácidos nucleicos de un organismo donador; tal información que se expande rápidamente puede utilizarse subsecuentemente en el campo de la genómica. Otro aspecto de la invención actual se dirige a un método para aumentar el rendimiento de un cultivo de grano. El método comprende expresar transientemente una secuencia de ácido nucleico de un vegetal donador en una orientación de antisentido o sentido positivo en un cultivo de granos, en donde la expresión resulta en el crecimiento atrofiado y la producción de semillas aumentada del cultivo de grano. Un método preferido comprende los pasos de clonar la secuencia de ácido nucleico dentro de un vector viral vegetal e infectar el cultivo de grano con un ácido nucleico viral recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico. Otro aspecto de la presente invención se dirige a un método para producir proteínas humanas en un huésped vegetal. Después que se aislan e identifican ácidos nucleicos de funciones similares de un humano y un vegetal huésped, las secuencias de aminoácidos derivadas de los ADN se comparan. La secuencia de ácido nucleico vegetal se cambia de manera que codifica la misma secuencia de aminoácidos que la proteína humana. La secuencia de ácido nucleico puede cambiarse conforme a cualesquier métodos convencionales tal como mutagénesis dirigida al sitio o síntesis de ADN basada en polimerasa. Otro aspecto de la invención es descubrir genes que tienen la misma función en vegetales diferentes. El método inicia con una biblioteca de los ADNc, los ADN genómicos o una reunión de los ARN de un primer vegetal. Después, un ácido nucleico viral recombinante que comprende un inserto de ácido nucleico derivado de la biblioteca se prepara y se usa para infectar un vegetal huésped diferente. El vegetal huésped infectado se inspecciona por cambios fenotípicos o bioquímicos. El ácido nucleico viral recombinante que resulta en cambios fenotípicos o bioquímicos en el vegetal huésped se identifica y la secuencia de inserto de ácido nucleico y se determina por un método estándar. Tal secuencia de ácido nucleico en el primer vegetal tiene homología de secuencia sustancial como esa en el vegetal huésped: las secuencias de ácido nucleico se conservan entre los dos vegetales. Esta invención proporciona un medio rápido para elucidar la función y secuencia de ácidos nucleicos de interés; tal información que se expande rápidamente puede utilizarse subsecuentemente en el campo de la genómica. I . Introducir dentro de un vector viral vegetal una biblioteca de insertos de secuencia de un organismo donador . La construcción de vectores de expresión virales puede usar una diversidad de métodos conocidos en la técnica. En modalidades preferidas de la invención actual, los vectores virales se derivan de virus de ARN vegetal. Puede usarse una diversidad de familias de virus vegetales, tales como Bromoviridae, Bunyaviridae, Co oviridae, Geminiviridae, Potyviridae, y To busviridae, entre otros. Dentro de la familia de virus vegetales, diversos géneros de virus pueden ser adecuados para la invención actual, tales como alfamovirus, ilarvirus, bromovirus, cucumovirus, tospovirus, carlavirus, cauli ovirus, closterovirus, comovirus, nepovirus, diantovirus, furovirus, hordeivirus, luteovirus, necrovirus, potexvirus, potivirus, rimovirus, bimovirus, orizavirus, sobemovirus, tobamovirus, tobravirus, carmovirus, tombusvirus, timovirus, umbravirusa, entre otros. Dentro del género de virus vegetales, muchas especies se prefieren particularmente. Incluyen virus mosaico de la alfalfa, virus de pica del tabaco, virus mosaico de bromo, virus jaspeado de la haba, virus jaspeado clorótico del garbanzo, virus mosaico de pepino, virus de bronceado del tomate, virus latente del clavel, virus mosaico de coliflor, virus amarillo de la remolacha, virus mosaico del garbanzo, virus mosaico en anillo del tabaco, virus de mancha anular del clavel, virus mosaico del trigo transmitido por el suelo, virus mosaico dorado del tomate, virus latente de la yuca, virus mosaico rayado de cebada, virus enano amarillo de la cebada, virus de necrosis del tabaco, virus del ataque del tabaco, virus X de la papa, virus Y de la papa, virus de necrosis del arroz, virus mosaico del lino, virus mosaico amarillo de la cebada, virus achaparrado de sobrajo de arroz, virus mosaico del frijol del sur, virus mosaico del tabaco, virus mosaico latent lanceolado, cepa de sandía del virus mosaico del jaspeado verde del pepino, virus mosaico de la avena, virus rechinador del tabaco, virus jaspeado del clavel, virus que atrofia achaparrado del tomate, virus mosaico del nabo amarillo, virus jaspeado de la zanahoria, entre otros. Además, también pueden emplearse virus de ARN satélite, tales como satélite de necrosis del tabaco. Un virus vegetal dado puede contener AD? o AR?, que pueden ser de hebra doble o sencilla. Un ejemplo de virus vegetales que contienen AD? de hebra doble incluyen, pero no se limitan a, caulimovirus tales como virus mosaico de la coliflor, (CaMV) . Representativos de virus vegetales que contienen AD? de hebra sencilla son virus latente de la yuca, virus mosaico dorado del frijol (BGMV) y virus mosaico de estría del cloris. El virus enano del arroz y el virus de tumor de herida son ejemplos de virus vegetales del ARN de hebra doble. Los virus vegetales de ARN de hebra sencilla incluyen virus mosaico del tabaco (TMV) , virus mosaico del nabo amarillo (TYMV) , virus de necrosis del arroz (RNV) y virus mosaico de bromo (BMV) . Los virus de AR? de hebra sencilla pueden dividirse adicionalmente en virus de sentido más (o de hebra positiva) , sentido menos (o de hebra negativa), o virus ambisentido. El AR? genómico de un virus de AR? de sentido más es sentido mensajero, lo cual hace al ARN desnudo infeccioso. Muchos virus vegetales pertenecen a la familia de virus de AR? sentido más. Incluyen, por ejemplo, TMV, BMV, y otros. Los virus de AR? vegetal típicamente codifican diversas proteínas comunes, tales como proteínas replicasa/polimerasa esenciales para la replicación viral y la síntesis de AR?m, proteínas de recubrimiento que proporcionan cubiertas protectoras para el paso extracelular, y otras proteínas requeridas para el movimiento de célula a célula, la infección sistémica y el autoensamble de virus. Para información general que concierne a los virus vegetales, véase Matthews, Plant Virology, 3rd Ed., Academic Press, San Diego (1991) . Los grupos seleccionados de virus vegetales adecuados se caracterizan posteriormente. Sin embargo, la invención no debe interpretarse como limitada a usar estos virus particulares, sino más bien el método de la presente invención contempla incluir todos los virus vegetales a lo mínimo. Sin embargo, la invención no debe interpretarse como limitada a usar estos virus particulares, sino más bien la presente invención se contempla para incluir todos los virus adecuados. Algunos virus adecuados se caracterizan posteriormente .

GRUPO DEL TOBAMOVIRUS El virus mosaico del tabaco (TMV) es de interés particular a la invención actual debido a su habilidad para expresar genes a altos niveles en vegetales. El TMV es un miembro del grupo del toba ovirus. El virion de TMV es un filamento tubular, y comprende subunidades de proteína de recubrimiento dispuestas en una hélice de mano derecha sencilla con el ARN de hebra sencilla intercalado entre las vueltas de la hélice. El TMV infecta el tabaco así como otros vegetales. Los viriones de TMV son tubos de 300 nm x 18 nm con un canal hueco de 4 nm de diámetro, y consiste de 2140 unidades de una proteína de estructura sencilla helicoidalmente enredada alrededor de una molécula de ARN sencillo. El genoma es un ARN de sentido más de 6395 bases. El extremo 5' está tapado y el extremo 3' contiene una serie de pseudonudos y una estructura similar a ARNt que aceptará específicamente istidina. El ARN genómico funciona como ARNm para la producción de proteínas involucradas en la replicación viral: Una proteína de 126 kDa que inicia 68 nucleótidos a partir del término 5', y una proteína de 183 kDa sintetizada por la lectura completa de un codón de terminación ámbar aproximadamente 10% del tiempo. Solamente las proteínas virales de 183-kDa y 126 kDa se requieren para la replicación de TMV en trans. (Ogawa et al . , Virology 185:580-584 (1991)). Las proteínas adicionales se traducen del ARNm de tamaño subgenómico producidos durante la replicación (Dawson, Adv. Virus Res . , 38:307-342 (1990)). La proteína de 30 kDa se requiere para el movimiento de célula a célula; la proteína capside 17.5 kDa es la proteína estructural viral sencilla. La función de la proteína 54 kDa predicha se desconoce. El ensamble de TMV ocurre aparentemente en el citoplasma de células vegetales, aunque se ha sugerido que algún ensamble de TMV puede ocurrir en cloroplastos puesto que se han detectado copias de ADNct en viriones de TMV purificados. La iniciación del ensamble de TMV ocurre por interacción entre los agregados en forma de anillo ("discos") de la proteína de recubrimiento (consistiendo cada disco de dos capas de 17 subunidades) y un sitio de nucleación interno único en el ARN; una región de horquilla de aproximadamente 900 nucleótidos desde el extremo 3' en la cepa común de TMV. Cualquier ARN, incluyendo los ARN subgenómicos que contienen este sitio, pueden empacarse en viriones. Los discos aparentemente asumen una forma helicoidal en la interacción con el ARN, y el ensamble (elongación) procede después en ambas direcciones (pero mucho más rápidamente en la dirección 3'- a 5'- desde el sitio de nucleación). Otro miembro de los tobamovirus, la cepa de sandia del virus Mosaivo Moteado Verde del Pepino (CGMMV-W) se relaciona al virus del pepino. Nozu et al . , Virology 45:577 (1971) . La proteína de recubrimiento del CGMMV-W interacciona con el ARN del TMV y CGMMV para ensamblar partículas virales in vi tro . Kurisu et al . , Virology 70:214 (1976). Diversas cepas del grupo del tobamovirus se dividen en dos subgrupos, sobre la base de la ubicación del ensamble de origen. El subgrupo I, que incluye el vulgar, OM, y la cepa del tomate, tiene un origen de ensamble aproximadamente 800-1000 nucleótidos desde el extremo 3' del genoma de ARN, y fuera de la proteína de recubrimiento cistron. Lebeurier et al . , Proc . Nati . Acad. Sci . USA 74:149 (1977) y Fukuda et al . , Virology 101:493 (1980). El subgrupo II, que incluye CGMMV-W y cepa del garbanzo (Cc) tiene un origen de ensamble aproximadamente 300-500 nucleótidos desde el extremo 3' del genoma de ARN y dentro de la proteína de recubrimiento cistron. La proteína de recubrimiento cistron de CGMMV-W se ubica en los nucleótidos 176-661 desde el extremo 3'. La región que no codifica 3' es de 175 nucleótidos de largo. El origen del ensamble se coloca dentro de la proteína de recubrimiento cistron. Meshi et al . , Virology 127:54 (1983).

GRUPO VIRUS MOSAICO DE BROMO El virus mosaico de bromo (BMW) es un miembro de un grupo de virus vegetales que contienen ARN de hebra sencilla tripartita comúnmente referidos como los bromovirus. Cada miembro de los bromovirus infecta un rango estrecho de vegetales. La transmisión mecánica de los bromovirus ocurre fácilmente, y algunos miembros se transmiten por escarabajo. Además de BV, otros bromovirus incluyen virus jaspeado de la haba y virus jaspeado clorótico del garbanzo. Típicamente, un virion de bromovirus es un icosahedro, con un diámetro de aproximadamente 26 um, que contiene una especie sencilla de proteína de recubrimiento. El genoma del bromovirus tiene tres moléculas de ARN de hebra sencilla, sentido positivo lineal, y ARNm de proteína de recubrimiento también está encapsidado. Los ARN tienen cada uno un extremo 5' tapado, y una estructura similar a ARNt (que acepta tirosina) en el extremo 3'. El ensamble del virus ocurre en el citoplasma. La secuencia de nucleótidos completa de BMV se ha identificado y caracterizado como se describe por Ahlquist et al . , J Mol . Biol . 153:23 (1981).

VIRUS DE NECROSIS DEL ARROZ El virus de necrosis del arroz es un miembro del Grupo del Virus Y de la Papa o Potivirus. El Virion de Necrosis del Arroz es un filamento flexoso que comprende un tipo de proteína de recubrimiento (peso molecular aproximadamente 32,000 a aproximadamente 36,000) y una molécula de ARN de hebra sencilla de sentido positivo lineal.

El virus de Necrosis del Arroz se transmite por Polymyxa oraminis (un parásito intracelular eucariótico encontrado en vegetales, algas y hongos) .

GEMINIVIRUS Los geminivirus son un grupo de virus vegetales que contienen ADN de hebra sencilla pequeños con viriones de morfología única. Cada virión consiste de un par de partículas isométricas (icosahedro incompleto) , compuesto de un tipo sencillo de proteína (con un peso molecular de aproximadamente 2.7-3.4xl04) . Cada virion de geminivirus contiene una molécula de ADN de hebra sencilla de sentido positivo circular. En algunos geminivirus (es decir virus latente de la yuca y virus mosaico dorado del frijol) el genoma parece ser bipartita, conteniendo dos moléculas de ADN de hebra sencilla.

POTIVIRUS Los potivirus son un grupo de virus vegetales que producen poliproteína. Un potivirus particularmente preferido es el virus del ataque del tabaco (TEV) . El TEV es un potivirus bien caracterizado y contiene un genoma de ARN de hebra positiva de 9.5 kilobases que codifica una poliproteína grande sencilla que se procesa por tres proteinasas específicas de virus. La proteína de inclusión nuclear "una" proteinasa está involucrada en la maduración de diversas proteínas asociadas con la replicación y la proteína capside. La proteinasa de componente asistente (HC-Pro) y la proteinasa de 35 kDa catalizan el desdoblamiento solamente en sus respectivos términos C. El dominio proteolítico en cada una de estas proteínas se ubica cerca del término C. La proteinasa de 35 kDa y HC-Pro derivan de la región N-terminal de la poliproteína de TEV.

GRUPO DE HORDEIVIRUS Los hordeivirus son un grupo de virus vegetales que contiene ARN de sentido positivo, de hebra sencilla con tres o cuatro genomas de partes. Los hordeivirus tienen viriones de forma de varilla rígida y el virus mosaico rayado de cebada (BSMV) es el miembro tipo. El BSMV infecta un gran número de especies monocotiledóneas y dicotiledóneas que incluyen cebada, avena, trigo, maíz, arroz, espinaca y . »-. ..

Nicotiana benthamiana . Los huéspedes de lesión local incluyen Chenopodi um amaranti color, y Nicotiana tabacum ccv . Samsun. El BSMV no se trasmite por vector pero es transmisible mecánicamente y en algunos huéspedes, tales como cebada, también se transmite a través del polen y semilla. La mayoría de las cepas de BSMV tienen tres ARN genómicos referidos como alfa(a), beta(ß), y gamma (?) , al menos una cepa, la cepa blanda de Argentina (AM) tiene un cuarto ARN genómico que es esencialmente una mutante de sustracción del ARN g. Todos los ARN genómicos están tapados en el extremo 5' y tienen estructuras similares a ARNt en el extremo 3'. La replicación y ensamble del virus ocurre en el citoplasma. La secuencia de nucleótidos completa de diversas cepas de BSMV se ha identificado y caracterizado (revisado por Jackson, et al Annual Review of Phytophathology 27 : 95-121 (1989)), y los clones de ADNc infecciosos están disponibles (Petty, et al . Virology 171: 342-349 (1989)). La selección de la cadena principal genética para los vectores virales de la invención actual puede depender del huésped vegetal usado. El huésped vegetal puede- ser un vegetal monocotiledóneo o dicotiledóneo, tejido vegetal, o célula vegetal. Típicamente, los vegetales de interés comercial, tales como cultivos alimenticios, cultivos de semillas, cultivos de aceite, cultivos ornamentales y cultivos de silvicultura se prefieren. Por ejemplo, el trigo, arroz, grano, papa, cebada, tabaco, soya, cañóla, maíz, semilla de aceite de colza, azucenas, pastos, orquídeas, flor de lis, cebollas, palmas, tomate, las leguminosas, o Arabidopsis, pueden usarse como un huésped vegetal. Los vegetales huésped también pueden incluir aquellos fácilmente infectados por un virus infeccioso, tales como Ni cotiana, preferiblemente, Nicotiana benthamiana , o Nicotiana clevelandii . Una característica de la presente invención es el uso de ácidos nucleicos virales vegetales que comprenden una o más secuencias de ácido nucleico no nativas capaces de ser copiadas en un huésped vegetal. Estas secuencias de ácido nucleico pueden ser secuencias de ácido nucleico nativas que ocurren en un vegetal huésped. Preferiblemente, estas secuencias de ácido nucleico son secuencias de ácido nucleico no nativas que no ocurren normalmente en un vegetal huésped. Por ejemplo, los vectores virales vegetales pueden contener secuencias de más de un virus, incluyendo virus de más de un grupo taxonómico. Los ácidos nucleicos virales vegetales también pueden contener secuencias de fuentes no virales, tales como genes extraños, secuencias reguladoras, fragmentos de las mismas de bacterias, hongos, vegetales, animales u otras fuentes. Estas secuencias extrañas pueden codificar proteínas comercialmente útiles, polipéptidos, o productos de fusión de los mismos tales como enzimas, anticuerpos, hormonas, farmacéuticos, vacunas, pigmentos, polipéptidos antimicrobianos, y similares. O pueden ser secuencias que regulan la transcripción o traducción de ácidos nucleicos virales, ácido nucleico viral de empaque y facilitan la infección sistémica en el huésped, entre otros. En algunas modalidades de la invención actual, los vectores virales vegetales pueden comprender uno o más promotores subgenómicos nativos o no nativos adicionales que son capaces de transcribir o expresar las secuencias de ácidos nucleico adyacentes en el huésped vegetal. Estos promotores subgenómicos no nativos se insertan dentro de los ácidos nucleicos virales vegetales sin destruir la función biológica de los ácidos nucleicos virales vegetales usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el promotor de CaMV puede usarse cuando las células vegetales van a ser transfectadas. Los promotores subgenómicos son capaces de funcionar en el vegetal huésped específico. Por ejemplo, si el huésped es tabaco, TMV, virus mosaico del tomate, u otros virus que contienen promotor subgenómico pueden utilizarse. Los promotores subgenómicos insertado deben ser compatibles con el ácido nucleico de TMV y capaces de dirigir la transcripción o expresión de secuencias de ácido nucleico adyacentes en el tabaco. Se contempla específicamente que dos o más promotores subgenóminos no nativos heterólogos pueden usarse. Las secuencias de ácido nucleico no nativas pueden transcribirse o expresarse en el vegetal huésped bajo el control del promotor subgenómico para producir los productos de los ácidos nucleicos de interés. En algunas modalidades de la invención actual, los ácidos nucleicos virales vegetales recombinantes pueden modificarse adicionalmente por técnicas convencionales para sustraer toda o parte de la secuencia que codifica la proteína de recubrimiento nativa o poner la secuencia que codifica la proteína de recubrimiento nativa bajo el control de un promotor subgenómico viral vegetal no nativo. Si se sustrae o se inactiva de otra forma, una secuencia que codifica proteína de recubrimiento no nativa se inserta bajo el control de uno de los promotores subgenómicos no nativos, u opcionalmente bajo el control del promotor subgenómico del gen de la proteína de recubrimiento nativa. Así, el ácido nucleico viral vegetal recombinante contiene una secuencia que codifica la proteína de recubrimiento, que puede ser una secuencia de recubrimiento nativa o no nativa que codifica proteína, bajo el control de uno de los promotores subgenómicos nativos o no nativos. El gen de proteína de recubrimiento nativa o no nativa puede utilizarse en el ácido nucleico viral vegetal recombinante. La proteína de recubrimiento no nativa, como es el caso de la proteína de recubrimiento nativa, puede ser capaz de encapsidar el ácido nucleico viral vegetal recombinante y proporcionar la extensión sistémica del ácido nucleico viral vegetal recombinante en el vegetal huésped. En algunas modalidades de la invención actual, los vectores virales vegetales recombinantes se construyen para expresar una fusión entre una proteína de recubrimiento viral vegetal y los genes extraños o polipéptidos de interés. Tal virus vegetal recombinante proporciona la expresión de alto nivel de un ácido nucleico de interés. La o las ubicaciones en donde la proteína de recubrimiento viral se une al producto de aminoácido del ácido nucleico de interés puede referirse como la junta de fusión. Un producto dado de tal construcción puede tener una o más juntas de fusión. La junta de fusión puede ubicarse en el término carboxilo de la proteína de recubrimiento viral o la junta de fusión puede ubicarse en el término amino de la porción de la proteína de recubrimiento de la construcción. En casos en donde el ácido nucleico de interés se ubica interno con respecto a los residuos 5' y 31 de la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína de recubrimiento viral, existen dos juntas de fusión. Esto es, el ácido nucleico de interés puede ubicarse 5', 3' hacia el extremo 5', hacia el extremo 3' o dentro de la proteína de recubrimiento. En algunas modalidades de tales virus vegetales recombinantes, un codón de inicio o de alto "de gotera" puede ocurrir en una junta de fusión que algunas veces no resulta en la terminación de la traducción. En algunas modalidades de la invención actual, las secuencias nucleicas que codifican la o las proteínas reporteras o el o los genes de resistencia a antibióticos/herbicidas pueden construirse como la o las proteínas portadoras para los polipéptidos de interés, lo cual puede facilitar la detección de los polipéptidos de interés. Por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP) puede expresarse simultáneamente con los polipéptidos de interés. En otro ejemplo, un gen reportero, ß-glucuronidasa (GUS) puede utilizarse. En otro ejemplo, un fármaco marcador de resistencia, tal como un gen cuya expresión resulta en la resistencia a kanamicina, puede usarse. Puesto que el genoma de ARN es típicamente el agente infectivo, el AD?c se coloca adyacente a un promotor adecuado de manera que el AR? se produce en la célula de producción. El AR? se tapa usando técnicas convencionales, si el AR? tapado es el agente infectivo. Además, el AR? tapado puede empacarse in vi tro con proteína de recubrimiento agregada de TMV para hacer viriones ensamblados. Estos viriones ensamblados pueden usarse después para inocular vegetales o tejidos vegetales. Alternativamente, un AR? no tapado también puede emplearse en las modalidades de la presente invención. Contrario a la técnica practicada en la literatura científica y en la patente expedida (Ahlquist et al . , Patente Norteamericana No. 5,466,788), las copias no tapadas para los vectores de expresión del virus son infectivas en vegetales y en células vegetales. El tapado no es un pre-requisito para establecer una infección de un vector de expresión de virus en vegetales, aunque el tapado aumenta la eficiencia de la infección. Además, los nucleótidos pueden agregarse entre el sitio de inicio de transcripción del promotor y el inicio del ADNc de un ácido nucleico viral' para construir un vector viral infeccioso. Pueden agregarse uno o más nucleótidos. En algunas modalidades de la presente invención, la secuencia de nucleótidos insertada puede contener un G en el extremo 5' . Alternativamente, la secuencia de nucleótidos insertados puede ser GNN, GTN, o sus múltiplos, (GNN)X o (GTN)X. En algunas modalidades de la invención actual, más de un ácido nucleico se prepara para una construcción de vector viral ultipartita. En este caso, cada ácido nucleico puede requerir su propio origen de ensamble. Cada ácido nucleico puede prepararse para contener un promotor subgenómico y un ácido nucleico no nativo. Alternativamente, la inserción de ácido nucleico no nativo dentro del ácido nucleico de un virus monopartita puede resultar en la creación de dos ácidos nucleicos (es decir el ácido nucleico necesario para la creación de un vector viral bipartita) . Esto seria ventajoso cuando es deseable mantener la replicación y transcripción o expresión del ácido nucleico de interés separado de la replicación y traducción de algunas de las secuencias de codificación del ácido nucleico nativo. El ácido nucleico viral vegetal recombinante puede prepararse clonando un ácido nucleico viral. Si el ácido nucleico viral es ADN, puede clonarse directamente dentro de un vector adecuado usando técnicas convencionales . Una técnica es unir un origen de replicación al ADN viral que es compatible con la célula a ser transfectada. En esta forma, las copias de ADN de la secuencia de nucleótidos quimérica se producen en la célula transfectada. Si el ácido nucleico viral es ARN, una copia de AD? del ácido nucleico viral se prepara primero por técnicas bien conocidas. Por ejemplo, el AR? viral se transcribe dentro de AD? usando transcriptasa inversa para producir piezas de ADB subgenómico, y un AD? de hebra doble puede producirse usando AD? polimerasa. El AD?c se clona después dentro de vectores apropiados y se clona dentro de una célula a ser transfectada. En algunos casos, el AD?c se une primero a un promotor que es compatible con la célula de producción. El ácido nucleico viral vegetal recombinante puede clonarse después dentro de cualquier vector adecuado que sea compatible con la célula de producción. Alternativamente, el ácido nucleico viral vegetal recombinante se inserta en un vector adyacente a un promotor que sea compatible con la célula de producción. En algunas modalidades, el vector ligado a ADNc puede transcribirse directamente dentro del ARN infeccioso in vi tro e inocularse sobre el huésped vegetal. Las piezas de ADNc se mapean y se combinan en la secuencia apropiada para producir una copia de ADN de longitud completa del genoma de ARN viral, si es necesario. El organismo donador del cual se deriva una biblioteca de insertos de secuencia incluye Reino Monera, Reino Protista, Reino Fungi , Reino Plantae y Reino Animalia . El Reino Monera incluye el sub-reino Archaebacteriobionta (archaebacteria) : división Archaebacteriophyta (bacterias de metano, sal y sulfolobus) ; sub-reino Eubacteriobionta (bacteria verdadera) : división Eubacteriophyta; sub-reino Viroids; y sub-reino Viruses . El Reino Protista incluye el sub-reino Phycobionta : división Xanthophyta 275 (algas verde amarillas), división Chrysophyta 400 (algas café doradas), división Dinophyta (Pyrrhophyta) 1,000 (dinoflagelodos) , división Bacillariophyta 5,500 (diátomos), división Cryptophyta 74 (criptofitas) , división Haptophyta 250 (organismos haptonema) , división Euglenophyta 550 (euglenoides) , división Chlorophyta, clase Chlorophyceae 10,000 (algas verdes), clase Charophyceae 200 (algas calcáreas), división Phaeophyta 900 (algas cafés), y división Rhodophyta 2,500 (algas rojas); sub-reino Mastigobionta 960: división Chytridiomycota 750 (chytridiales) , y división Oomycota (mohos de agua) 475; sub-reino Myxobionta 320: división Acrasiomycota (mohos de limo celular) 21, y división Myxomycota 500 (mohos de limo verdadero) . El Reino Fungi incluye la división Zygomycota 570 (hongos cenocíticos) : subdivisión Zygomycotina ; y división Eumycota 350 (hongos septados) : subdivisión Ascomycotina 56,000 (hongos de copa), subdivisión Basidiomycotina 25, 000 (hongos club) , subdivisión Deuteromycotina 22,000 (hongos imperfectos), y subdivisión Lichenes 13,500. El Reino Plantae incluye la división Bryophyta, Hepatophyta, Anthocerophyta, Psilophyta, Lycophyta, Sphenophyta, Pterophyta, Coniferophyta, Cycadeophyta, Ginkgophyta, Gnetophyta y Anthophyta . El Reino Animalia incluye: Pori f era (Esponjas) , Cnidaria (medusas) , Ctenophora (medusas de cresta) , Platyhelminthes (gusanos planos) , Nemertea (Gusanos Proboscis) , Rotifera (Rotíferos) , Nematoda (gusanos redondos) , Mollusca (Caracoles, Almejas, Calamar y Pulpo) , Onychophora (Gusanos Velludos) , Annelida (Gusanos Segmentados) , Arthropoda (Arañas e Insectos) , Phoronida , Bryozoa (Briozoanos) , Brachiopoda (Lamp Shells) , Echinodermata (erizo de mar y estrella de mar) , y Chordata (peces vertebrados, Pájaros, Reptiles, Mamíferos) . Un organismo donador preferido es humano. Los organismos huésped son aquellos capaces de ser infectados por un ARN infeccioso o un virus que contiene un ácido nucleico viral recombinante. Los organismos huésped incluyen organismos de Monera , Protista , Fungi y Animalia . Los organismos huésped preferidos son organismos de Fungi , tales como levaduras (por ejemplo, S. cerevisiae) y Anamalia, tales como insectos (por ejemplo, C. elegans) . Para preparar un inserto de ADN que comprende una secuencia de ácido nucleico o un organismo donador, el primer paso es construir una biblioteca del ADNc, una biblioteca de ADN genómico, o una reunión de ARNm del organismo donador. Los ADNc de longitud completa o ADN genómico pueden obtenerse de depósitos privados o públicos. Por ejemplo, el ADNc y las bibliotecas genómicas de bovino, pollo, perro, drosofila, pez, rana, humano, ratón, porcino, conejo, rata, y levadura; y las bibliotecas retrovirales pueden obtenerse de Clontech (Palo Alto, CA) . Alternativamente, la biblioteca del ADNc puede prepararse de una muestra de campo por métodos conocidos para una persona con experiencia común, por ejemplo aislando los ARNm y trascribiendo los ARNm dentro de los ADNc por transcriptasa inversa (véase, por ejemplo., Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.) Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989), o 'Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al . , ed. Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987) ) . Las bibliotecas de los ADN genómicos representados en BAC (cromosoma artificial de bacterias) , YAC (cromosoma artificial de levadura) , o TAC (cromosoma artificial competente para transformación, Lin et al . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA. 96:6535-6540 (1999)) pueden obtenerse de depósitos públicos o privados. Alternativamente, una reunión de genes, que se sobre expresan en una línea de células de tumor comparadas con una línea de células normales, puede prepararse u obtenerse de depósitos públicos o privados. Zhang et ai (Science, 276: 1268-1272 (1997)) reporta que usando un método de análisis en serie de expresión de gen (SAGE) (Velculescu et al , Cell , 88:243 (1997)), se identificaron 500 copias que se expresaron a niveles significativamente diferentes en células normales y neoplásticas. La expresión de los ADN que se sobreexpresan en una línea de células de tumor en un organismo huésped, pueden causar cambios en el organismo huésped, así una reunión de tales ADN es otra fuente para insertos de ADN para esta invención. Los ADN de BAC/YAC/TAC, los ADN o ADNc pueden fraccionarse por tamaño mecánicamente o digerirse por una enzima en fragmentos más pequeños. Los fragmentos se ligan a adaptadores con extremos cohesivos, y se clonan por escopeta dentro de vectores de ácido nucleico virales recombinantes. Alternativamente, los fragmentos pueden ser ligados por el extremo romo dentro de vectores de ácido nucleico virales recombinantes. Los ácidos nucleicos virales recombinantes que contienen una secuencia de ácido nucleico derivada de la biblioteca de ADNc o biblioteca de ADN genómico se construye después usando técnicas convencionales. Los vectores de ácido nucleico virales recombinantes producidos comprenden el inserto de ácido nucleico derivado del organismo donador. La secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico viral recombinante se transcribe como ARN en un organismo huésped; el ARN es capaz de regular la expresión de un rasgo fenotípico por un mecanismo positivo o de antisentido. La secuencia de ácidos nucleicos puede también regular la expresión de más de un rasgo fenotípico. Las secuencias de ácido nucleico de Monera , Protista, Fungi , Plantae y Animalia pueden utilizarse para ensamblar las bibliotecas de ADN. Este método puede así usarse para descubrir fenotipos de gen dominantes útiles de bibliotecas de ADN a través de la expresión del gen en un organismo huésped. En el caso de usar vegetales como un organismo donador, el vegetal donador y el vegetal huésped pueden ser genéticamente remotos o no relacionados: pueden pertenecer a géneros, familias, órdenes, clases, subdivisiones o divisiones diferentes. Los vegetales donadores incluyen vegetales de interés comercial, tales como cultivos alimenticios, cultivos de semillas, cultivos de aceites, cultivos ornamentales y cultivos de silvicultura. Por ejemplo, pueden seleccionarse trigo, arroz, grano, papa, cebada, tabaco, soya, ca óla, maíz, semilla de aceite de colza, Arabidopsis, Nicotiana como un vegetal donador. Para preparar un inserto de ADN que comprende una secuencia de ácido nucleico de un vegetal donador, el primer paso es típicamente construir una biblioteca de los ADNc, los ADN genómicos, o una reunión de los ARN del vegetal de interés. Los ADNc de longitud completa pueden obtenerse de depósitos públicos o privados, por ejemplo, una biblioteca de ADNc de Arabidopsis thaliana puede obtenerse del Arabidopsis Biological Resourse Center. Alternativamente, la biblioteca de ADNc puede prepararse de una muestra de campo por métodos conocidos para una persona con experiencia común, por ejemplo, aislar los ARNm y transcribir los ARNm dentro de los ADNc por transcriptasa inversa (véase, por ejemplo, Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989), o Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al . , ed. Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987) ) . Los ADN genómicos representados en las bibliotecas de BAC (cromosoma artificial de bacteria) , YAC (cromosoma artificial de levadura) , o TAC (cromosoma artificial competente para transformación, Liu et al . , Proc Nati . Acad. Sci . USA, 96:6535-6540 (1999)) pueden obtenerse de depósitos públicos o privados, por ejemplo en Arabidopsis Biological Resource Center. Los ADN de BAC/YAC/TAC, los ADN o ADNc pueden fraccionarse por tamaño mecánicamente o digerirse por una enzima en fragmentos más pequeños y los fragmentos se ligan a adaptadores con extremos cohesivos, y se clonan por escopeta dentro de vectores de ácido nucleico virales recombinantes. Alternativamente, los fragmentos pueden ser ligados por el extremo romo dentro de vectores de ácido nucleico virales recombinantes. Los ácidos nucleicos virales recombinantes que contienen una secuencia de ácido nucleico derivada de la biblioteca de ADNc o biblioteca de ADN genómico se construye después usando técnicas convencionales. Los vectores de ácido nucleico virales recombinantes producidos comprenden el inserto de ácido nucleico derivado del vegetal donador. La secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico viral recombinante se transcribe como ARN en un vegetal huésped; el ARN es capaz de regular la expresión de un rasgo fenotípico por un mecanismo positivo o de antisentido. La secuencia de ácidos nucleicos puede también codificar para la expresión de más de un rasgo fenotípico. Las secuencias de trigo, arroz, grano, papas, cebada, tabaco, soya, cañóla, maíz, semilla de aceite de colza, Arabidopsis, y otras especies de cultivo pueden usarse para pueden utilizarse para ensamblar las bibliotecas de ADN. Este método puede así usarse para descubrir fenotipos de gen dominantes útiles de bibliotecas de ADN a través de la expresión del gen. Aquellos expertos en la técnica entenderán que estas modalidades son representativas solamente de muchas construcciones adecuadas para la invención actual. Todas las construcciones se contemplan e intentan estar dentro del alcance de la presente invención. La invención no intenta limitarse a ninguna construcción viral particular sino que específicamente contempla usar todas las construcciones operables. Una persona experta en la técnica será capaz de construir los ácidos nucleicos virales vegetales basados en técnicas de biología molecular bien conocidos en la técnica. Las técnicas adecuadas se han descrito en Sambrook et al . (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1989); Methods in Enzymol . (Vols. 68, 100, 101, 118, y 152- 155) (1979, 1983, 1986 y 1987); y DNA Cloning, D.M. Clover, Ed., IRL Press, Oxford (1985); Walkey, Applied Plant Virology, Chapman & Hall (1991) ; Matthews, Plant ( Virology, 3rd Ed., Academic Press, San Diego (1991); Turpén et al . , J. of Virological Methods, 42:227-240 (1993); Patentes Norteamericanas Nos. 4,885,248, 5,173,410, 5,316,931, 5,466,788, 5,491,076, 5,500,360, 5,589,367, 5,602,242, 5,627,060, 5,811,653, 5,866,785, 5,889,190, y 5,589,367, Solicitud de Patente Norteamericana No. 08/324,003. Las manipulaciones de ácido nucleico y los tratamientos enzimáticos se llevan a cabo de acuerdo con los procedimientos recomendados del fabricante para hacer tales construcciones .

II . Expresar miembros de insertos de secuencia derivados de organismos donadores en huéspedes vegetales Los huéspedes vegetales incluyen vegetales de interés comercial, tales como cultivos alimenticios, cultivos de semillas, cultivos de aceites, cultivos ornamentales y cultivos de silvicultura. Por ejemplo, trigo, arroz, grano, papa, cebada, tabaco, soya, cañóla, maíz, semilla de aceite de cañóla, Arabidopsis, Nicol tiana pueden seleccionarse como un vegetal huésped. En particular, los vegetales huésped capaces de ser infectados por un virus que contiene un ácido nucleico viral recombinante se prefieren. Los vegetales huésped preferidos incluyen Nicotiana preferiblemente Nicotiana benthamiana, o Nicotiana cleavlandii . Los clones individuales pueden transfectarse dentro del huésped vegetal: 1) protoplastos; 2) vegetales completos; o 3) tejidos vegetales, tales como hojas de plantas.

(Dijkstra et al . , Practical Plant Virology: Protocols and Exercises, Springer Verlag (1998); Plan, Virology Protocol : From Virus Isolation to Transgenic Resistance in Methods in Molecular Biology, Vol. 81, Foster and Taylor, Ed.,' Human Press (1998)). En algunas modalidades de la invención actual, el suministro de vectores de expresión de virus vegetales dentro del vegetal puede efectuarse por la inoculación de ARN transcrito in vi tro, inoculación de viriones, o inoculación interna de células vegetales de ADNc nuclear, o la infección sistémica resultante de cualquiera de estos procedimientos. En todos los casos, la coinfección puede conducir a una expresión sistémica rápida y pervasiva de las secuencias de ácido nucleico deseadas en células vegetales. El huésped puede infectarse con un ácido nucleico viral recombinante o un virus vegetal recombinante por técnicas convencionales. Las técnicas del cual se incluyen, pero no se limitan a, abrasión de hojas, abrasión en solución, rocío de agua a alta velocidad, y otras heridas de un huésped así como embeber semillas huésped con agua que contiene el ARN viral recombinante o virus vegetal recombinante. Más específicamente, las técnicas adecuadas incluyen: (a) Inoculaciones a Mano. Las inoculaciones a mano se realizan usando un regulador de fosfato de molaridad baja de pH neutro con la adición de celita o carborundo (normalmente aproximadamente 1%) . De una a cuatro gotas de la preparación se ponen sobre la superficie superior de una hoja y se frota suavemente. (b) Inoculaciones Mecanizadas de Lechos Vegetales.

Las inoculaciones de lechos vegetales se realizan rociando la solución de vector (impulsada por gas) dentro de una segadora impulsada por tractor mientras que se cortan las hojas. Alternativamente, el lecho vegetal se sega y la solución del vector se rocía inmediatamente sobre las hojas cortadas. (c) Rocío a Alta Presión de Hojas Sencillas. Las inoculaciones vegetales sencillas también pueden realizarse rociando las hojas con un rocío directo estrecho (50 psi, 6-12 pulgadas de la hoja) que contiene aproximadamente 1% de carborundo en la solución del vector regular. (d) Infiltración al Vacío. Las inoculaciones pueden lograrse sometiendo un organismo huésped a un ambiente de presión sustancialmente vacío para facilitar la infección. (e) Inoculación Robótica de Alta Velocidad. Especialmente aplicable cuando el organismo es un vegetal, los organismos individuales pueden hacerse crecer en disposición de masa tal como en placas de microtítulo. La maquinaria tal como la robótica puede usarse después para transferir el ácido nucleico de interés. (f) Inoculación Balística (Pistola de Alta Presión) . Las inoculaciones vegetales sencillas pueden también realizarse por bombardeo de partículas. Un sistema de suministro de partículas balísticas (BioRad Laboratories, Hercules, (A) puede usarse para transfectar vegetales tales como N. benthamiana como se describió previamente (?ágar et ai., Plant Cell , 7:705-719 (1995)). Un método alternativo para introducir ácidos nucleicos virales dentro de un huésped vegetal es una técnica conocida como agroinfección o transformación mediada por Agrojbac erium (también conocida como Agro-infección) como se describe por Grimsley et al . , Nature 325:177 (1987). Esta técnica hace uso de una característica común de Agrobacteri um que coloniza vegetales al transferir una porción de su ADN (el T-ADN) dentro de una célula huésped, en donde se integra dentro del ADN nuclear. El T-ADN se define por secuencias límite que son de 25 pares de bases de largo y cualquier ADN entre estas secuencias límite se transfiere a las células vegetales también. La inserción de un ácido nucleico viral vegetal recombinante entre las secuencias límite de T-ADN resulta en la transferencia del ácido nucleico viral vegetal recombinante a las células vegetales, en donde el ácido nucleico viral vegetal recombinante se replica, y después se extiende sistémicamente a través del vegetal. La agro-infección se ha logrado con viroide de tubérculo de espiga de papa (PSTV) (Gardner et al . , Plant Mol . Biol . 6:221 (1986); CaV (Grimsley et al . , Proc. Nati . Acad. Sci . USA 83:3282 (1986)); MSV (Grimsley et al . , Nature 325:177 (1987);, y Lazarowitz, S., Nucí . Acids Res . 16:229 (1988)) virus de la raya de digitaria (Donson et al . , Virology 162:248 (1988)), virus del trigo enano (Hayes et al . , J. Gen . Virol . 69: 891 (1988) ) y virus mosaico dorado del tomate (TGMV) (Elmer et al . , Plant Mol . Biol . 10:225 (1988) y Gardiner et al . , EMBO J. 7:899 (1988)). Por lo tanto, la agroinfección de un vegetal susceptible podría lograrse por un virion que contenga un ácido nucleico viral vegetal recombinante basado en la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los virus anteriores. El bombardeo de partículas o electroesporación o cualquier otro método conocido en la técnica también puede usarse. En algunas modalidades de la invención actual, la infección también puede obtenerse colocando una secuencia de ácido nucleico seleccionada dentro de un organismo tal como E coli , o levadura, integrarse dentro del genoma de tal organismo o no, y aplicando después el organismo a la superficie del organismo huésped. Tal mecanismo puede producir con eso la transferencia secundaria de la secuencia de ácido nucleico seleccionada dentro de un organismo huésped. Esta es una modalidad particularmente práctica cuando el organismo huésped es un vegetal. Igualmente, la infección puede lograrse empacando primero una secuencia de ácido nucleico seleccionada en un pseudo virus. Tal método se describe en la WO 94/10329. Aunque las enseñanzas de esta referencia pueden ser específicas para bacterias, aquellos con experiencia en la técnica apreciarán fácilmente que los mismos procedimientos podrían fácilmente adaptarse a otros organismos . El vegetal puede hacerse crecer de semillas en una mezcla de "Peat-Lite Mix™ (Speedling, Inc. Sun City, Fl) y fertilizante de liberación controlada Nutricote™ 14-14-14 (Chiss-Asahi Fertilizer Co . , Tokyo, Japan). Los vegetales pueden hacerse crecer en un ambiente controlado con la condición de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Pueden usarse Sylvania "Gro-Lux/Aquarium de luces de crecimiento de 40 wats fluorescentes de amplio espectro (Osram Sylvania Products, Inc. Danvers, MA) las temperaturas pueden mantenerse alrededor de 26.66°C (80°F) durante las horas de luz y 21.11°C (70°F) durante las horas de oscuridad. La humedad puede estar entre 60 y 85%.

III. Detectar cambios fenotípicos o bioquímicos como un resultado de la expresión Después de que un huésped vegetal se infecta con el clon individual de la biblioteca, uno o más cambios fenotípicos o bioquímicos pueden detectarse. Los cambios fenotípicos en un huésped vegetal pueden determinarse por cualesquier métodos conocidos en la técnica. Los cambios fenotípicos pueden incluir velocidad de crecimiento, color o cambios de morfología. Típicamente, estos métodos incluyen análisis visual macroscópico o microscópico. Por ejemplo, los cambios de crecimiento, tales como atrofia, cambios de color (por ejemplo amarillez de la hoja, moteado, blanqueado, clorosis) entre otros se visualiza fácilmente. Ejemplos de cambios morfológicos incluyen defectos del desarrollo, marchitamiento, necrosis entre otros.

Los cambios bioquímicos pueden determinarse por cualquier método analítico conocido en la técnica para detectar, cuantificar y aislar ADN, ARN, proteínas, anticuerpos, carbohidratos, lípidos y moléculas pequeñas. Los métodos seleccionados pueden incluir tinción Northern, Western, MALDI-TOF, LC/MS, GC/MS, IEF/SDS-PAGE de dos dimensiones, ELISA, etc. En particular, los métodos adecuados pueden realizarse en una forma de alta producción, completamente automatizada usando robótica. Ejemplos de cambios bioquímicos pueden incluir la acumulación de sustratos o productos de reacciones enzimáticas, cambios en rutas bioquímicas, inhibición o aumento de la expresión del gen endógena en el citoplasma de las células, cambios en el perfil del ARN o proteínas. Por ejemplo, los clones en la biblioteca del vector viral pueden clasificarse funcionalmente con base en la ruta metabólica aceptada o el fenotipo visual/seleccionable producido en el organismo. Si este proceso permite una determinación rápida de la función del gen para secuencias de ácido nucleico desconocidas de un organismo donador así como un organismo huésped. Además, este proceso puede usarse para confirmar rápidamente la función de los ADN de longitud completa de función desconocida. La identificación funcional de las secuencias de ácido nucleico desconocidas en una biblioteca de un organismo puede conducir después rápidamente a la identificación de secuencias desconocidas similares en las bibliotecas de expresión para otros organismos con base en la homología de secuencia. Tal información es útil en muchos aspectos incluyendo en medicina humana . Los cambios bioquímicos o fenotípicos en el vegetal huésped infectado pueden correlacionarse con la bioquímica o fenotipo de un vegetal huésped que no se infecta. Opcionalmente, los cambios bioquímicos o fenotípicos en el vegetal huésped infectado se correlacionan adicionalmente a un vegetal huésped que se infecta con un vector viral que contiene un ácido nucleico control de una secuencia conocida. El ácido nucleico control tiene tamaño similar pero es diferente en la secuencia del inserto de ácido nucleico derivado de la biblioteca. Por ejemplo, si el inserto de ácido nucleico derivado de la biblioteca se identifica como que codifica una proteína de enlace GTP en una orientación antisentido, un ácido nucleico derivado de un gen que codifica proteína fluorescente verde puede usarse como un ácido nucleico control. Se conoce que la proteína fluorescente verde no tiene el mismo efecto que la proteína de enlace GTP cuando se expresa en un vegetal huésped. En algunas modalidades, el rasgo fenotípico bioquímico puede terminarse por análisis de complementación, esto es observando el gen o genes endógenos cuya función se reemplaza o aumenta al introducir el ácido nucleico de interés. Una discusión de tal fenómeno se proporciona por Napoli et al., The Plant Cell 2:279-289(1990). El rasgo fenotípico o bioquímico también puede determinarse por (1) analizando las alteraciones bioquímicas en la acumulación de sustratos o productos de reacciones enzimáticas conforme a cualquier medio conocido por aquellos expertos en la técnica, (2) observando cualquier cambio en las rutas bioquímicas que pueda modificarse en un organismo huésped como un resultado de la expresión del ácido nucleico; (3) utilizando técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica para observar la inhibición de la expresión del gen endógeno en el citoplasma de células como un resultado de la expresión del ácido nucleico; (4) utilizando técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica para observar cambios en el perfil de ARN o proteína como un resultado de la expresión del ácido nucleico; o (5) por selección de organismos capaces de crecer o mantener la viabilidad en la presencia de sustancias nocivas o tóxicas, tales como, por ejemplo, ingredientes farmacéuticos. Un medio útil para determinar la función de los ácidos nucleicos transfectados dentro de un vegetal huésped es observar los efectos de silenciamiento del gen. Tradicionalmente, la inutilización del gen funcional se ha logrado después de la inactivación debido a la inserción de elementos transposables o de integración aleatoria de T-ADN dentro del cromosoma, seguido por la caracterización de mutantes recesivas homocigotas condicionales, obtenidas durante la cruza en retroceso. Algunas enseñanzas a este respecto se proporcionan por la WO 97/42210 la cual se incorpora en la presente para referencia. Como una alternativa al análisis de inutilización tradicional, una biblioteca de EST/ADN de un organismo donador, puede ensamblarse dentro de un plásmido de transcripción viral. Las secuencias de ácido nucleico en la biblioteca del plásmido de transcripción pueden introducirse después dentro de células huésped como parte de un virus de ARN funcional que silencia pos-transcricionalmente el gen objetivo homólogo. Las secuencias de EST/AD? pueden introducirse dentro de un vector viral en la orientación más o antisentido, y la orientación puede ser dirigida o aleatoria basada en la estrategia de clonación. Un esquema de clonación automatizado de alta producción basado en robótica puede usarse para ensamblar y caracterizar la biblioteca. Alternativamente, la secuencias de EST/AD?c pueden insertarse dentro del AR? genómico de un vector viral tal que sean representadas como AR? genómico durante la replicación viral en células huésped. La biblioteca de clones EST se transcriben después dentro de los AR? infecciosos y se inocula sobre un organismo huésped susceptible a infección viral. Los ARN virales que contienen las secuencias de EST/AD?c contribuidas desde la biblioteca original están ahora presentes en una concentración suficientemente alta en el citoplasma de las células del organismo huésped tal que causan el silenciamiento del gen pos-transcripcional del gen endógeno en un organismo huésped. Puesto que el mecanismo de replicación del virus produce secuencias de ARN de sentido y antisentido, la orientación del inserto ST/ADNc es normalmente irrelevante en términos de producir el fenotipo deseado en el organismo huésped. La presente invención proporciona un método para expresar transientemente los ARN antisentido o de sentido positivo derivado de virus en vegetales transfectados. Tal método es mucho más rápido que el tiempo requerido para obtener organismos transgénicos de antisentido genéticamente diseñados. La infección sistémica y la expresión del ARN de antisentido viral ocurre en tan poco tiempo como varios días después de la inoculación, mientras que toma varios meses o más crear un organismo transgénico sencillo. La invención proporciona un método para identificar genes involucrados en la regulación del crecimiento al inhibir la expresión de genes endógenos específicos que usan vectores virales. Esta invención proporciona un método para caracterizar genes específicos y rutas bioquímicas en organismos donadores o en vegetales huésped usando un vector viral de ARN. Se conoce que silenciar los genes endógenos puede lograrse con secuencias homologas de la misma familia vegetal. Por ejemplo, Kumagai et al . , (Proc . Nati . Acad. Sci . USA 92:1679 (1995)) reporta que el gen de Nicotiana benthamiana para fitoeno de saturasa (PDS) se silenció por transfección con un ARN viral derivado de un clon que contiene un ADNc de tomate parcial ( Lycopersi con esculentum) que codifica PDS estando en una orientación antisentido. Kumagai et al demostró que el gen que codifica PDS de un vegetal puede silenciarse transfectando un vegetal huésped con un ácido nucleico de una secuencia conocida, principalmente como un gen PDS, de un vegetal donador de la misma familia. La presente invención proporciona un método para silenciar un gen en un organismo huésped transfectando un organismo huésped no vegetal con un ácido nucleico viral que comprende un inserto de ácido nucleico derivado de una biblioteca de ADNc o una biblioteca de ADN genómico o una reunión de ARN de un organismo no vegetal. A diferencia de Kumagai et al , la secuencia del inserto de ácido nucleico en la presente invención no necesita identificarse antes de la transfección. Otra característica de la presente invención es que proporciona un método para silenciar un gen conservado de un reino no vegetal; la copia antisentido de un organismo resulta en reducir la expresión del gen endógeno de un organismo huésped de Monera , Protista , Fungi y Animalia . La invención se ejemplifica por proteínas de enlace a GTP. En células eucarióticas, las proteínas de enlace a GTP funcionan en una diversidad de procesos celulares, que incluyen transducción de señales, organización del citoesqueleto y transporte de proteína. Las proteínas de enlace a GTP de bajo peso molecular (20-25 K Daltons) incluyen ras y sus parientes cercanos (por ejemplo Ran) , rho y sus parientes cercanos, la familia rab, y la familia del factor de ADP de ribosilación (ARF) . Las proteínas de enlace a GTP heterotriméricas y monoméricas que pueden estar involucradas en la secreción del transporte intracelular se dividen en dos clases estructurales: la rab y las familias ARF. Las ARF de muchos organismos se han aislado y caracterizado. Las ARF comparten características estructurales con las familias de proteínas de enlace GTP triméricas y ras . La presente invención demuestra que los genes de un vegetal, tal como Nicotiana, que codifican proteínas de enlace a GTP, pueden silenciarse por transfección con los ARN infecciosos de un clon que contiene estructura de lectura abierta de proteína de enlace GTP que contiene un clon en una orientación antisentido, derivados de un vegetal de una familia diferente, tal como Arabidopsis . l a presente invención también demuestra 'que las proteínas de enlace a GTP son altamente homologas en el humano, rana, ratón, bovino, mosca y levadura no solamente en el nivel de aminoácidos, sino también al nivel de ácido nucleico. La presente invención proporciona así un método para silenciar un gen conservado de un organismo huésped, transfectando el huésped con los ARN infecciosos derivados de un gen homólogo de un organismo no vegetal. La secuencia de ácidos nucleico que pueden resultar en cambio de un fenotipo huésped incluyen aquellos involucrados en el crecimiento, proliferación, diferenciación y desarrollo celular; comunicación celular; y la ruta apoptótica. Los genes que regulan el crecimiento de las células u organismos incluyen, por ejemplo, genes que codifican a una proteína que enlaza GTP, una proteína L19 de proteína ribosomal, una proteína ribosomal S18, etc., Henry et al . ( Cáncer Res . , 531403-1408 (1993)) reporta que el gen erJ B-2 (o HR-2 o neu) se amplificó y sobre expresó en un tercio de los cánceres de mama, estómago y ovario; y el ARNm que codifica la proteína ribosomal L19 fue más abundante en las muestras de cáncer de mama que expresan altos niveles de er£B-2. Lijsebettens et ai (EMBO J. , 13:3378-3388 (1994)) reporta que en Arabidopsis, la mutación en PFL provocó primeras hojas punteadas, peso fresco reducido y retardo del crecimiento. El PFL codifica la proteína ribosomal S18, que tiene una alta homología con la proteína S18 de rata. Los genes involucrados en el desarrollo de las células u organismos incluyen, por ejemplo genes que contienen homeobox y genes que codifican las proteínas receptoras acopladas a la proteína G tales como la familia de rodopsina. Los genes de homeobox son una familia de genes reguladores que contienen una secuencia de 183 nucleótidos común (homeobox) y que codifican las proteínas nucleares específicas (homeoproteína) que actúan como factores de transcripción. La secuencia de homeobox en si misma codifica un dominio de 61 aminoácidos, el homeodominio, responsable del reconocimiento y enlace de los motivos de ADN específicos de secuencia. La especificidad de este enlace permite a las homeoproteínas activar o reprimir la expresión de bacterias de genes objetivo hacia el extremo 3'. Inicialmente identificados en los genes que controlan el desarrollo de Drosophila, el homeobox se ha aislado subsecuentemente en especies animales evolutivamente distintas, vegetales, y hongos. Diversos indicios sugieren la inclusión de genes de homeobox en el control del crecimiento celular y, cuando se desregulan, en oncogénesis. (Cilio et ai., Exp. Cell Res . , 248:1-9 (1999). Otras secuencias de ácido nucleico que pueden resultar en cambios de un organismo incluyen las proteínas receptoras que codifican los genes tales como receptores de hormonas, receptores de AMPc, receptores de serotonina, y la familia de receptores de calcitonina; y ADN regulado ligero que codifica un motivo de cremallera de leucina (Leu) (Zheng et al . , Plant Physiol . , 116:27-35 (1998)). La desregulación o alteración del proceso del crecimiento de proliferación de diferenciación y desarrollo celular; comunicación celular; y las rutas apoptóticas puede resultar en cáncer. Por lo tanto, identificar las secuencias de ácidos nucleico involucradas en esos procesos y determinar sus funciones son de beneficio para la medicina humana; también proporciona una herramienta para la investigación del cáncer. Una biblioteca de secuencia de ácido nucleico humano se clona dentro de vectores. Los vectores se aplican al huésped para obtener la infección. Cada huésped infectado se cultiva con un huésped no infectado y un huésped infectado con un vector nulo. Un vector nulo no mostrará cambio fenotípico o bioquímico distinto a los efectos del virus en sí mismo. Cada huésped se observa diariamente por diferencias visuales entre el huésped infectado y sus dos controles. En cada huésped que muestra un cambio fenotípico o bioquímico observable se identifica un rasgo. La secuencia de ácido nucleico donador se identifica, la secuencia del gen de longitud completa se obtiene y el gen de longitud completa en el huésped se obtiene, si un gen del huésped se asocia con el rasgo. Ambos genes se secuencian y la homología se determina. Una diversidad de pruebas bioquímicas también puede hacerse en el huésped o el tejido del huésped dependiendo de la información que se desee. Una diversidad de cambios fenotípicos o rasgos y pruebas bioquímicas se indican en este documento. Un perfil de gen funcional puede obtenerse repitiendo los procesos varias veces. Grandes cantidades de información de secuencia de ADN se generan en el dominio público, que puede meterse dentro de una base de datos de relación. Pueden hacerse conexiones entre las secuencias de diversas especies predichas para llevar a cabo funciones bioquímicas o reguladores similares. Las conexiones también pueden generarse entre las actividades enzimáticas predichas y las rutas bioquímicas y reguladoras mostradas visualmente. Igualmente, pueden generarse conexiones entre la actividad enzimática reguladora predicha e inhibidores, activadores, sustratos u análogos de sustratos de molécula pequeña conocidos. Los datos fenotípicos de las bibliotecas de expresión expresados en los huéspedes transfectados pueden conectarse automáticamente dentro de tal base de datos de relación. Los genes con papeles similares predichos de interés en otros organismos pueden descubrirse rápidamente. La presente invención también se dirige a un método para cambiar el fenotipo o bioquímica de un vegetal al expresar transientemente una secuencia de ácido nucleico de un vegetal donador en una orientación antisentido en un vegetal huésped, que inhibe una expresión del gen endógeno en el meristemo del vegetal huésped. Uno o más cambios fenotípicos o bioquímicos en el vegetal huésped se detectan por los métodos como se describe previamente. La expresión transiente de una secuencia de ácido nucleico en un vegetal huésped puede afectar la expresión del gen en el meristemo.

Los meristemos son de interés en el desarrollo de vegetales debido a que el crecimiento vegetal está impulsado por la formación de actividad de meristemos a través del ciclo completo de la vida. Esta invención se ejemplifica por una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína ribosomal S18. La actividad del promotor S18 se restringe a los meristemos (Lijsebettesn et al . , EMBO J. 13:3378-3388). La expresión transiente de una secuencia de ácido nucleico en un vegetal huésped puede disparar una señal que se transmite a los meristemos y afecta la expresión del gen en el meristemo. Un problema con el silenciamiento del gen en un huésped vegetal es que muchos genes vegetales existen en las familias multigen. Por lo tanto, el silenciamiento efectivo de una función de gen puede ser especialmente problemática. Conforme a la presente invención, sin embargo, los ácidos nucleicos pueden insertarse dentro del genoma viral para silenciar efectivamente una función de gen particular o para silenciar la función de una familia multigen. Actualmente se cree que aproximadamente 20% de los genes vegetales existen en las familias multigen. Una discusión detallada de algunos aspectos del efecto de "silenciamiento de gen" se proporciona en la solicitud de patente copendiente, Solicitud de Patente Norteamericana No. de Serie 08/260,546 (W095/34668 publicada el 12/21/95) la descripción de la cual se incorpora en la presente para referencia. El ARN puede reducir la expresión de un gen objetivo a través de las interacciones de ARN inhibitorio con ARNm objetivo que ocurren en el citoplasma y/o el núcleo de una célula. Una biblioteca de EST/ADNc de un vegetal tal como Arabidopsis thaliana puede ensamblarse dentro de una base plásmida de transcripción viral vegetal. Las secuencias de ADNc en la biblioteca plásmida de transcripción pueden después introducirse dentro de células vegetales como ARN citoplásmico para silenciar pos-transcripcionalmente los genes endógenos. Las secuencias de EST/ADNc pueden introducirse dentro del plásmido de transcripción viral vegetal en la orientación más antisentido (o ambas) , y la orientación puede ser dirigida o aleatoria con base en la estrategia de clonación. Una estrategia de clonación automatizada de alta producción que usa robótica puede usarse para ensamblar la biblioteca. Los clones de EST pueden insertarse detrás de un promotor subgenómico duplicado tal que sean representadas como copias subgenómicas durante la replicación viral en células vegetales. Alternativamente, las secuencias de ST/ADNc pueden insertarse dentro del ARN genómico de un vector viral vegetal que se representan como ARN genómico durante la replicación viral en células vegetales. La biblioteca de clones de EST se transcribe después dentro de los 7?RN infecciosos y se inoculan sobre un vegetal huésped susceptible de infección viral. Los ARN virales que contienen la secuencia de EST/ADNc aportados desde la biblioteca original, están ahora presentes en una concentración suficientemente alta en el citoplasma de las células vegetales huésped tal que causan el silenciamiento del gen pos-transcripcional del gen endógeno en un vegetal huésped. Puesto que el mecanismo de replicación del virus produce secuencias de ARN de sentido y antisentido, la orientación del inserto EST/ADNc es normalmente irrelevante en términos de producir el fenotipo deseado en el vegetal huésped. La presente invención también proporciona un método para aislar un gen conservado tal como un gen que codifica una proteína que enlaza GTP, de arroz, centeno, grano, soya, maíz, oleaginosas y otros vegetales de interés comercial, que usan otro gen que tiene homología con el gen que se aisla. Las bibliotecas que contienen los ADNc de longitud completa de un vegetal donador tales como arroz, cebada, maíz, soya y otros cultivos importantes puede obtenerse de fuentes públicas y privadas o puede prepararse de los ARNm vegetales. Los ADNc se injertan en vectores virales o en vectores de subclonación pequeños tales como pBluescript (Strategene) , pUCld, M13, o pBR322. Las bacterias transformadas se siembran después y se seleccionan los clones individuales por un método estándar. Las bacterias transformantes o los ADN se redisponen a alta densidad sobre filtros de membrana o porta objetos de vidrio. Los ADNc de longitud completa que codifican proteínas que enlazan GTP pueden identificarse por filtros de sondeo o porta objetos con insertos de ácido nucleico marcados que resultan en cambios en un vegetal huésped o sondas marcadas preparadas de ADN que codifican proteínas que enlazan GTP de Arabidopsis . Las marcas útiles incluyen moléculas radioactivas, fluorescentes o quimioluminiscentes, enzimas, etc. Alternativamente, las bibliotecas genómicas que contienen secuencias de arroz, centeno, maíz, soya y otros cultivos importantes pueden obtenerse de fuentes públicas y privadas, o pueden prepararse de los ADN genómicos vegetales. Los clones de BAC que contienen los genomas vegetales completos se han construido y organizado en un orden de traslapamiento mínimo. Los BAC individuales se cortan en fragmentos y se clonan directamente dentro de vectores virales. Los clones que cubren completamente una forma de BAC completa forman una sub-biblioteca de vector viral BAC. Los clones genómicos pueden identificarse por filtros de sondeo que contienen los BAC con insertos de ácido nucleico marcados que resultan en cambios en un vegetal huésped, o con sondas marcadas preparadas de los ADN que codifican las proteínas que enlazan GTP de Arabidopsis . Las marcas útiles incluyen moléculas radioactivas, fluorescentes o quimioluminiscentes, enzimas, etc. Los BAC que se hibridizan a la sonda se seleccionan y sus correspondientes vectores virales BAC se usan para producir los ARN infecciosos. Los vegetales que se transfectan con la sub-biblioteca de BAC y se seleccionan por cambios de función, por ejemplo, cambio de la velocidad de crecimiento o cambio de color. Una vez que se observa el cambio de la función, los insertos de estos clones o sus ADN plásmidos correspondientes se caracterizan por secuenciación didesoxi. Esto proporciona un método rápido para obtener la secuencia genómica de una proteína vegetal, por ejemplo, una proteína que enlaza GTP. Usando este método, una vez que se identifica la secuencia de ADN en un vegetal tal como Arabidopsis thaliana, puede usarse para identificar secuencias conservadas de fusión similar que existen en otras bibliotecas vegetales. Una selección genómica funcional se prepara usando una proteína capside de recubrimiento de TMV-0 virus mosaico del tabaco para la infección de Nicotiana benthamiana, un vegetal relacionado al vegetal del tabaco común. Para el ADNc de Arabidopsis thaliana se obtienen bibliotecas del Arabidopsis Biological Resource Center, los vectores fagémido Bluescript® se recuperan por digestión Notl . El AD?c se transforma dentro de un plásmido. El plásmido se transcribe dentro del AR? del vector viral. Los insertos están en la orientación antisentido como en la Figura hasta que todo el ADNc de cada biblioteca de ADNc se representa sobre los vectores virales. Cada vector viral se rocía sobre la hoja de un huésped vegetal de N. benthamiana de dos semanas de edad con fuerza suficiente para causar herida del tejido e infección viral localizada. Cada vegetal infectado se cultiva lado a lado con un vegetal no infectado y un vegetal infectado con un vector de inserto nulo como controles. Todos los vegetales se cultivan en un ambiente artificial que tiene 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Los lúmenes son aproximadamente iguales en cada vegetal. A intervalos de dos días se hace una observación visual y fotográfica del fenotipo y se registra para cada vegetal infectado cada uno de sus controles y se hace una comparación. Los datos se meten dentro de una base de datos de Laboratory Information Management System. Al final del periodo de observación las plantas atrofiadas se agrupan para análisis. El inserto de ácido nucleico contenido en el clon de vector viral 74OAT#120 es responsable de la atrofia severa de uno de los vegetales. El clon 740AT#120 se secuencia. El homólogo del huésped vegetal también se secuencia. El clon 740AT#120 se encontró tener 80% de homología con la secuencia de ácido nucleico del huésped vegetal. La secuencia de aminoácidos de homología es 96%. La secuencia de ADNc completa del inserto se obtiene secuenciando y se encuentra que codifica una proteína que enlaza GTP. El homólogo vegetal huésped se selecciona y secuencia. También codifica para una proteína que enlaza GTP. Se concluye que esta secuencia que codifica proteína que enlaza GTP se conserva altamente en la naturaleza. Esta información es útil en el desarrollo farmacéutico así como en estudios de toxicología. Un esquema de clasificación completa de la funcionalidad del gen para un organismo eucariótico completamente secuenciado se ha establecido para la levadura. Este esquema de clasificación puede modificarse para vegetales y dividirse dentro de las categorías apropiadas. Dicha estructura organizacional puede utilizarse para identificar rápidamente lugares objetivo de herbicidas que pueden conferir fenotipos letales dominantes, y por lo tanto es útil para ayudar a diseñar programas de herbicidas racionales. La presente invención también se dirige a un método para aumentar el rendimiento de un cultivo de granos. En ri ce Biotechnology Quarterly 37:4 (1999) y Ashikari et al . , Proc . Nati . Acad. Sci . USA 96:10284-10289 (1999)), se reporta que un vegetal de arroz transgénico transformado con un gen rgpi , que codifica una proteína que enlaza GTP pequeña del arroz, fue más, pequeña que un vegetal control, pero produjo más semillas que el vegetal control. Para aumentar el rendimiento de un cultivo de granos, el método presente comprende expresar trasientemente una secuencia de ácido nucleico de un vegetal donador en una orientación antisentido en el cultivo de granos, en donde los resultados expresan crecimiento atrofiado y aumentada producción de semillas del cultivo de grano. Un método preferido comprende los pasos de clonar la secuencia de ácido nucleico dentro de un vector viral vegetal e infectar el cultivo de grano con un ácido nucleico viral recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico. El vector viral vegetal preferido se deriva de un virus mosaico de brome, un virus de necrosis del arroz, o un genimivirus. Los cultivos de grano preferidos incluyen arroz, trigo y centeno. El ácido nucleico expresado en el vegetal huésped, por ejemplo, comprende una estructura de lectura abierta de proteína que enlaza GTP que tiene una orientación antisentido. El método presente proporciona una expresión transiente de un gen para obtener un vegetal atrofiado. Debido a que se mete menos energía dentro del crecimiento vegetal, más energía está disponible para la producción de semillas, lo cual resulta en el rendimiento aumentado de un cultivo de grano. El método presente tiene una ventaja sobre otros métodos que usan un vegetal transgénico, debido a que no tiene un efecto sobre el genoma de un vegetal huésped. Para proporcionar un entendimiento más consistente y aún más claro de la especificación y las reivindicaciones, incluyendo el alcance dado en la presente a dichos términos, se proporcionan las siguientes definiciones: Adyacente: Una posición en una secuencia de nucleótidos próxima a y 5' ó 3' para una secuencia definida. Generalmente, adyacente significa dentro de 2 ó 3 nucleótidos del sitio de referencia. Inhibición Antisentido: Un tipo de regulación de gen basado en inhibición citoplásmica, nuclear o de organelo de expresión, de gen debido a la presencia de una célula de una molécula de ARN complementaria al menos una porción del ARNn que se traduce. Se contempla específicamente que las moléculas de ARN pueden ser de un virus de ARN o ARNm del genoma de las células huésped o de un virus ADN. Cultivo Celular: Un grupo proliferante de células que pueden estar en un estado no diferenciado o diferenciado, creciendo continuamente o no continuamente. Secuencia Quimérica o de Gen: Una secuencia de nucleótidos derivada de al menos dos partes heterólogas. La secuencia puede comprender ADN o ARN. Secuencia de Codificación: Una secuencia de desoxiribonucleótido o ribonucleótido que, cuando se transcribe y traduce o se traduce simplemente, resulta en la formación de un polipéptido celular o una secuencia de ribonucleótido que, cuando se traduce, resulta en la formación de un polipéptido celular. Compatible: La capacidad de operar con otros componentes de un sistema. Un vector o ácido nucleico viral vegetal o animal que es compatible con un huésped es uno que es capaz de replicarse en ese huésped. Una proteína de recubrimiento que es compatible con una secuencia de nucleótidos viral es una capaz de encapsular esa secuencia viral . Análisis de Complementación: como se usa en la presente, este término se refiere a observar los cambios producidos en un organismo cuando se introduce una secuencia de ácido nucleico dentor de ese organismo después que un gen seleccionado se ha sustraído o mutado de manera que no funciona más completamente en su papel normal. Un gen complementario al gen sustraído o mutado puede restablecer el fenotipo genético del gen seleccionado. Sistema de Expresión de Promotor Subgenómico Heterólogo Dual (DHSPES) : un vector de ARN de hebra más que tiene un sistema de expresión promotor subgenómico heterólogo dual para aumentar, disminuir o cambiar la expresión de proteínas, péptidos o los ARN, preferentemente aquellos descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,316,931, 5811,653, 5,589,367, y 5,866,785, la descripción de las cuales se incorpora en la presente para referencia. Marcas de secuencia expresadas (EST) : las secuencias de ADN de paso sencillo relativamente cortas obtenidas de uno o más extremos de los clones de ADNc y ARN derivados de estos. Pueden estar presentes en la orientación 5' o 3'. Los EST han mostrado ser útiles para identificar genes particulares. Expresión: El término como se usa en la presente quiere decir incorporar uno o más de transcripción, transcripción inversa y traducción. Un Perfil de Gen Funcional: La colección de genes de un organismo que codifican un rasgo bioquímico o fenotípico. El perfil de gen funcional de un organismo se encuentra seleccionado secuencias de ácido nucleico de un organismo donador por sobre expresión o supresión de un gen en un organismo huésped. Un perfil de gen funcional requiere una colección o biblioteca de secuencias de ácido nucleico de un organismo donador. Un perfil de gen funcional dependerá de la habilidad de la colección o biblioteca de los ácidos nucleicos del donador para causar la sobre expresión o supresión en el organismo huésped. Por lo tanto, un perfil de gen funcional dependerá de la cantidad de genes donadores capaces de causar la sobre expresión o supresión de los genes huésped o de ser expresados en el organismo huésped en la ausencia de un gen huésped homólogo. Gen: Una secuencia de ácido nucleico discreta responsable de producir uno o más productos celulares y/o realizar una o más funciones intracelulares o intercelulares. Silenciamiento del Gen: Una reducción en la expresión del gen. Un vector viral que expresa secuencias de gen de un huésped puede inducir el silenciamiento del gel de secuencias de gen homologas. Homología: Un grado de similaridad de ácido nucleico en todas o algunas porciones de una secuencia de gen suficiente para resultar en la supresión del gen cuando las secuencias del ácido nucleico se suministra en la orientación antisentido. Huésped: Una célula, tejido u organismo capaz de replicar un ácido nucleico tal como un vector o ácido nucleico viral y que es capaz de ser infectado por un virus que contiene el vector viral o el ácido nucleico viral. Este término intenta incluir células procarióticas y eucarióticas, órganos tejidos u organismos, en donde sea apropiado. Las bacterias, hongos, levaduras y animales (células, tejidos, u organismos) son ejemplos de un huésped. Infección: La habilidad de un virus para transferir su ácido nucleico en un huésped o introducir un ácido nucleico viral dentro un huésped, en donde el ácido nucleico viral se replica, las proteínas virales se sintetizan, y se ensamblan nuevas partículas virales. En este contexto, el término "transmisible" e "inefectivo" se usan intercambiablemente en la presente. El término también quiere decir incluir la habilidad de una secuencia de ácido nucleico seleccionada para integrarse dentro de un genoma, cromosoma o gen de un organismo objetivo. Inserto: una extensión de secuencia de ácido nucleico, de típicamente más de 20 pares de bases de largo. Familia multigen: un conjunto de genes descendido por duplicación y variación de algún gen ancestral. Dichos genes pueden agruparse sobre el mismo cromosoma o dispersarse sobre diferentes cromosomas. Ejemplos de familias multigen incluyen aquellos que codifican las histonas, hemoglobinas, inmunoglobulinas, antígenos de histocompatibilidad, acciones, tubulinas, queratinas, colágenos, proteínas de shock térmico, proteínas de pegamento salival, proteínas de corion, proteínas de cutícula, proteínas de yema y faseolinas. No Nativo: Cualquier secuencia de ARN o ADN que no ocurre normalmente en la célula u organismo en el cual se coloca. Los ejemplos incluyen ácidos nucleicos virales recombinantes y genes o EST contenidos en los mismos. Esto es, una secuencia de ARN o ADN puede ser no nativa con respecto a un ácido nucleico viral. Dicha secuencia de ARN o AD? no ocurriría naturalmente en el ácido nucleico viral. También, una secuencia de AR? o AD? puede ser no nativa con respecto a un organismo huésped. Esto es, dicha secuencia de AR? o AD? no ocurriría naturalmente en el organismo huésped. Acido Nucleico: Como se usa en la presente, el término quiere decir incluir cualquier secuencia de ADN o ARN del tamaño de hasta 1 o más nucleótidos e incluyendo una secuencia de gen completa. El término intenta abarcar todos los ácidos nucleicos que ocurren naturalmente en una célula u organismo particular o que no ocurren naturalmente en una célula u organismo particular. Acido Nucleico de Interés: El término intenta referirse a la secuencia de ácido nucleico cuya función será determinada. La secuencia normalmente será no nativa a un vector viral pero puede ser nativa o no nativa a un organismo huésped. Rasgo Fenotípico: Una propiedad observable medible o detectable que resulta e la expresión o supresión de un gen o genes. Célula Vegetal: La unidad estructural y fisiológica de los vegetales, que consiste de un protoplasto y la pared celular. Órgano Vegetal: Una parte distinta y visiblemente diferenciada de un vegetal, tal como una raíz, tallo, hoja o embrión. Tejido vegetal: Cualquier tejido de un vegetal en el vegetal o en cultivo. Este término intenta incluir un vegetal completo, una célula vegetal, órgano vegetal protoplasto, cultivo celular o cualquier grupo de células vegetales organizadas dentro de una unidad estructural y funcional . Inhibición de Sentido Positivo: Un tipo de regulación de gen basado en la inhibición citoplasmática de la expresión del gen debido a la presencia en una célula de una molécula de ARN sustancialmente homologa a al menos una porción del ARNm que se traduce. Promotor: La secuencia que no codifica de flanqueo ' sustancialmente adyacente a una secuencia de codificación que está involucrada en la iniciación de la transcripción de la secuencia de codificación. Protoplasto: Un vegetal aislado o célula bacteriana con toda o algo de su pared celular. Acido Nucleico Viral Recombinante: Acido nucleico viral que se ha modificado para contener secuencias de ácido nucleico no nativas. Estas secuencias de ácido nucleico no nativas pueden ser de cualquier organismo o puramente sintéticas, sin embargo, también pueden incluir secuencias de ácido nucleico que ocurren naturalmente en el organismo dentro de las cuales el ácido nucleico viral recombinante será introducido. Virus Recombinante: Un virus que contiene el ácido nucleico viral recombinante. Promotor Subgenómico: Un promotor de un ARNm subgenómico de un ácido nucleico viral. Homología de secuencia sustancial: denota secuencias de nucleótidos que son funcionalmente sustancialmente equivalentes una con otra. Las diferencias de nucleótidos entre dichas secuencias que tienen homología de secuencias sustancial son insignificantes para afectar la función de los productos del gen o un ARN codificado por dicha secuencia. Infección Sistémica: Denota la infección a través de una parte sustancial de un organismo que incluye mecanismos de extensión distintos a la mera inoculación de células directa sino más bien incluyendo el transporte de una célula infectada a células adicionales cercanas o distantes. Expresión Transiente: Expresión de una secuencia de ácido nucleico en un huésped sin la inserción de la secuencia de ácido nucleico dentro del genoma del huésped, tal como por medio de un vector viral . Transposon: Una secuencia de nucleótidos tal como una secuencia de ADN o ARN que es capaz de transferir ubicación o movimiento dentro de un gen, un cromosoma o un genoma .

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la presente invención. Estos ejemplos intentan meramente ser ilustrativos de la presente invención y no deben interpretarse como siendo limitantes.

EJEMPLO 1 Construcción de biblioteca de ADNc de Arabidopsis thaliana en un vector promotor subgenómico dual. Las bibliotecas de ADNc de Arabidopsis thaliana obtenidas del Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) . Las cuatro bibliotecas del ABRC se fraccionaron por tamaño con insertos de 0.5-1 kb (CD4-13) , 1-2 kb (CD4-14), 2-3 kb (CD4-15), y 3-6 kb (CD4-16) . Todas las bibliotecas son de alta calidad y se han usado por varias docenas de grupos para aislar genes. Los fegémidos pBluescript® del vector Lambda ZAP II se sometieron a corte de masa y las bibliotecas se recuperaron como plásmidos conforme a procedimientos estándar. Alternativamente, los insertos de ADNc en el CD4-13 (vector Lambda ZAP II) se recuperaron por digestión con Notl . La digestión con Notl en la mayoría de los casos liberó el inserto de AD?c de Arabidopsis thaliana completo debido a que la biblioteca original se ensambló con adaptadores de Notl . El Notl es un cortador de 8 bases que desdobla frecuentemente AD? vegetal. Para insertar los fragmentos de Notl dentro de un plásmido de transcripción, el plásmido de transcripción pBS735 (FIGURA 1) se digirió con Pací/ Xhol y se ligó a una secuencia de AD? adaptadora creada de los oligonucleótidos 5'-TCGAGCGGCCGCAT-3' (SEC. DE IDE?T. ?O:l) y 5 ' -GCGGCCGC-3 ' . El plásmido pBS740 (FIGURA 2) contiene un sitio de restricción Notl único para la inserción bidireccional de fragmentos de Notl de la biblioteca de CD4-13. Las colonias recuperadas se prepararon de estos para minipreparaciones de plásmido con un Qiagen BioRobot 9600®. Las preparaciones de AD? de plásmido realizadas sobre el BioRobot 9600® se hicieron en formato de 96 pozos y produjeron AD? calidad de transcripción. Una biblioteca de AD?c de Arabidopsis se transformo dentro del plásmido y se analizó por electroforesis en gel de agarosa para identificar clones con inserto. Los clones con inserto se transcribieron in vi tro y se inocularon sobre N. benthamiana o Arabidopsis thaliana . Los discos de hoja seleccionados de vegetales transfectados se toman después para análisis bioquímico.

EJEMPLO 2 Construcción de biblioteca de AD? genómico en un vector de ácido nucleico viral recombinante El AD? genómico representado en BAC (cromosoma artificial de bacterias) , las bibliotecas se obtienen de Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) . Los AD?s BAC/YAC se fraccionan por tamaño mecánicamente, ligados a los adaptadores con extremos cohesivos y clonados por escopeta en vectores de ácido nucleico viral recombinante.

Alternativamente, AD?s genómicos fraccionados por tamaño mecánicamente se ligan al extremo romo en un vector de ácido nucleico viral recombinante. Las colonias recuperadas se prepararon por minipreparaciones de plásmido con un Qiagen BioRobot 9600®. Las preparaciones de ADN de plásmido realizadas sobre el BioRobot 9600® se ensamblan en formato de 96 pozos y producen ADN de calidad de transcripción. Una biblioteca de ADNc de Ara¿>idopsis/ácido nucleico viral recombinante se analizó por electroforesis de gel agarosa (paso de control de calidad templada) para identificar los clones con insertos. Los clones con inserto se transcriben in vi tro y se inoculan sobre N. benthamiana o Arabidopsis thaliana . Discos de hojas seleccionados de vegetales transfectados se toman después para análisis bioquímicos. El AD? genómico de Arabidopsis contiene típicamente un gen cada 2.5 kb (kilobases) en promedio. Los fragmentos de AD? genómico de 0.5 a 2.5 kb obtenidos por corte aleatorio de AD? se ensamblaron por escopeta en una biblioteca de vector de expresión/inutilización de ácido nucleico viral recombinante. Dado un tamaño de genoma de Arabidopsis de aproximadamente 120,000 kb, una biblioteca de AD? genómico de ácido nucleico viral recombinante aleatorio necesitaría contener mínimamente 48,000 insertos independientes de 2.5 kb de tamaño para lograr amplitud Ix del genoma de Arabidopsis . Alternativamente, una biblioteca de AD? genómico de ácido nucleico viral recombinante aleatoria necesitaría contener mínimamente 240,000 insertos independientes de 0.5 kb de tamaño para lograr amplitud lx del genoma de Arabidopsis. Las bibliotecas de vector de expresión/inutilización de ácido nucleico viral recombinante de ADN genómico más que de ADNc tiene el potencial de superar dificultades encontradas cuando se intenta clonar los ARNm de baja abundancia raros en una biblioteca de ADNc. Una biblioteca de vector de expresión/inutilización de ácido nucleico viral recombinante hecha con ADN genómico sería especialmente útil como una biblioteca de inutilización de silenciamiento del gen. Además, la biblioteca de vector de expresión/inutilización del Sistema de Expresión Promotor ?ubgenómico Heterólogo Dual (DHSPES) hecha con ADN genómico sería especialmente útil para la expresión de genes que carecen de intrones. Además, otras especies vegetales con genomas de moderados a pequeños (aproximadamente 80,000 kb) serían especialmente útiles para bibliotecas de vector de expresión de ácido nucleico viral recombinante hechas con ADN genómico. Una biblioteca de vector de expresión/inutilización de ácido nucleico viral recombinante puede hacerse de ADN genómico de BAC/YAC existente de los ADN genómicos recientemente prepara'dos para cualquier especie vegetal.

EJEMPLO 3 Construcción de la biblioteca de ADN genómico o ADNc en un vector DHSPES, y la transfección de clones individuales de la biblioteca del vector sobre T-ADN marcado o transposon marcado o vegetales mutados. La construcción de la biblioteca ADN genómico o ADNc en un vector de ácido nucleico viral recombinante, y la transfección de clones individuales de la biblioteca del vector sobre T-ADN marcado o transposon marcado o vegetales mutados puede realizarse conforme al procedimiento indicado en los Ejemplos 1 y 2. Dicho protocolo puede diseñarse fácilmente para complementar mutaciones introducidas por mutagénesis de inserción aleatoria de secuencias de T-ADN o secuencias transposon.

EJEMPLO 4 Construcción de una biblioteca de ADNc de Nicotiana benthamiana Se cosecharon vegetales de N. benthamiana vegetativos 3.3 semanas después de sembrar y se cortaron en tres grupos de tejidos: hojas, tallos y raíces. Cada grupo de tejidos se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y el ARN total se aisló de cada grupo separadamente usando el siguiente método de borato caliente. El tejido congelado se molió en un polvo fino con un mortero y manilla preenfriados, y se homogenizó adicionalmente después en molino de tejidos de vidrio preenfriado. Inmediatamente después, 2.5 ml/g de tejido se regulador XT caliente (~82°C) (borato decahidratado 0.2 M, 30 mM de EGTA, m 1% (p/v) de SDS. pH ajustado a 9.0 con NaOH 5N, tratado con 0.1% de DEPC y esterilizado en autoclave. Antes de usarse, se agregó 1% de desoxicolato (sal sódica), 10 mM de ditiotreitol, 15 Nonidet P-40 (NP-40) y 2% (p/v) de polivinilpirrolidona, PM 40,000 (PVP-40) ) al tejido molido. El tejido se homogenizó 1-2 minutos y se decantó rápidamente en un tubo de centrífuga Oak Ridge preenfriado que contiene 105 µl de 20 mg/ml de proteinasa K en agua tratada con DEPC. El molino de tejido se lavó con un 1 ml adicional de regulador XT caliente por g de tejido, el cual se agregó después al resto del homogenado. El homogenado se incubó a 42 °C a 100 rpm durante 1.5 h. Se agregó KCl 2M al homogenado a una concentración final de 160 mM, y la mezcla se incubó sobre hielo durante lh para precipitar proteínas. El homogenado se centrifugo a 12,000 x g durante 20 minutos a 4°C y el sobrenadante se filtró a través de miracloth estéril dentro de un tubo de centrífuga de Oak Ridge de 50 ml. Se agregó LiCl 8M a una concentración final de LiCl 2M y se incubó sobre hielo durante la noche. El ARN precipitado se recolecto por centrifugación a 12,000 x g durante 20 minutos a 4°C. La pella se lavó tres veces en 3-5 ml de LiCl 2M a 4°C. Cada vez la pella se resuspendió con una varilla de vidrio y después se giró a 12,000 x g durante 20 minutos a 4°C. La pella de ARN se suspendió en 2 ml de Tris-HCl 10 M (pH 7.5), y se purificó de los componentes celulares ^l^güHj insolubles girando a 12,000 x g durante 20 minutos a 4°C. El ARN que contiene el sobrenadante se transfirió a un tubo Corex de 15 ml y se precipitó durante la noche a -20°C con 2.5 volúmenes de etanol al 100%. El ARN se peletizó por centrifugación a 9,800 x g durante 30 minutos a 4°C. La pella de ARN se lavó en 1-2 ml de etanol a 70°C frío y se centrifugo a 9,800 x g durante 5 minutos a 4°C. El etanol residual se eliminó de la pella de ARN bajo vacío, y el ARN se resuspendió en 200 µl de agua dd tratada con DEPC y se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml. El tubo Corex se enjuagó en 100 µl de agua dd tratada con DEPC, lo cual se agregó después al resto del ARN. El ARN se precipitó después con 1/10 de volumen de acetato de sodio 3N pH 6.0 y 2.5 volúmenes de etanol al 100% frío a -20°C durante 1-2 h. El tubo se centrifugó durante 20 minutos a 16,000 x g, y la pella de ARN se lavó con etanol al 70% frío, y se centrifugó durante 5 minutos a 16,000 x g. Después de secar la pella bajo vacío, el ARN se resuspendió en agua tratada con DEPC. Este es el ARN total. El ARN mensajero se purificó del ARN total usando un equipo Poly (A) Puré (Ambion, Austin TX) , siguiendo las instrucciones del fabricante. Se uso una reacción de transcripción inversa para sintetizar ADNc de la plantilla de ARNm, usando los equipos de clonación de ADNc Stratagene (La Jolla, CA) o Gibco BRL (Gaithersburg, MD) . Para la biblioteca de Stratagene, los ADNc se subclonaron dentro del bacteriófago en el sitio EcoRl/Xhol ligando los brazos usando el equipo Gigapack III Gold (Stratagene, La Jolla, CA) , siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la biblioteca de Gibco BRL, los ADNc se subclonaron dentro de un vector tobamoviral que contenía una fusión de TMV-U1 y TMV-U5 en los sitios Notl /Xhol .

EJEMPLO 5 Expresión del clon pQ21D del ADNc de pepino Chino en vegetales transfectados en un sentido positivo confirma que codifica a-trichosantin. Se ha desarrollado un vector viral vegetal que dirige la expresión de a-trichosantina en vegetales transfectados. La estructura de lectura abierta (ORF) para a-trichosantin, del clon genómico SEO se colocó bajo el control del promotor subgenómico de proteína de recubrimiento de TMV. El ARN infeccioso de TTU51A QSEO #3 (FIGURA 3; secuencia de ácido nucleico como SEC. DE IDENT. NO: 2 y secuencia de aminoácidos como SEC. DE IDENT. NO: 3) se preparó por transcripción in vi tro usando ARN polimerasa dependiente de ADN SP6 y se usó para inocular mecánicamente N. benthamiana . El virus híbrido se extendió a través de todas las hojas superiores no inoculadas como se verificó por la prueba de infectividad de lesión local, y amplificación de PCR. Los síntomas virales consistieron de atrofia vegetal con clorosis moderada, distorsión de las hojas sitémicas. La a-trichosantin de 27-kDa se acumuló en las hojas superiores (14 días después de la inoculación) y reaccionó en forma cruzada con un anticuerpo anti-trichosanthin.

Construcciones de Plásmido Un fragmento Xhol, Avrll de 0.88 kb, que contiene la secuencia que codifica a-trichosantin se amplificó del ADN genómico aislado de Trichosanthes Kirilowii Maximowicz por mutagénesis de PCR usando oligonucleótidos QMLX: 5' -GCC TCG AGT GCA GCA TGA TCA GAT TCT TAG TCC TCT CTT TGC-3' (hacia el extremo 5') (SEC. DE IDENT. NO: 4) y Q1266A 5 '-TCC CTA GGC TAA ATA GCA TAA CTT CCA CAT CA AAGC-3' (hacia el extremo 3') (SEC. DE IDENT. NO: 5) . La estructura de lectura abierta de a-trichosantin se verificó por secuenciación didesoxi, y se colocó bajo el control del promotor subgenómico de proteína de recubrimiento de TMV-U1 subclonando dentro de TTU51A, creando el plásmido TTU51A QSEO#3.

Transcripciones in vi tro inoculaciones, y análisis de vegetales transfectados. Vegetales de N. benthaminana se inocularon con copias in vi tro de Kpnl digeridas con TTU51A QSEO#3. Los viriones se aislaron de hojas de N. benthamiana infectadas con copias de TTU15A QSEO#3.

Purificación, detección inmunológica, y prueba in vi tro de a-trichosantin Dos semanas después de la inoculación, la proteína soluble total se aisló de tejido de hoja de N. benthamiana no inoculada superior y se probó para reactividad cruzada con un anticuerpo para a-trichosantin. Las proteínas del tejido sistémicamente infectado se analizaron en un gel de 0.1% de SDS/12.5% de poliacrilamida y se transfirió electrotinción durante 1 hora a una membrana de nitrocelulosa. La membrana teñida se incubó durante 1 hora con una dilución de 2000 veces de antisuero anti a-trichosantin de rábano. La prueba de IgG anticabra de conejo enlazada a peroxidasa de rábano de quimioluminiscencia mejorada (Cappel Laboratories) se realizó conforme a las especificaciones del fabricante (Amersham) . La membrana teñida se convirtió a tiempos de exposición de película de hasta 10 segundos. Los tiempos de exposición de luminiscencia más cortos y más largos de la membrana teñida dieron los mismos resultados cuantitativos.

EJEMPLO 6 La expresión de ADNc del pimiento dulce en vegetales transfectados en una orientación de sentido positiva confirma que codifica capsantin-capsorubin sintasa La biosíntesis de carotenoides foliares en Nicotiana benthamiana se alteró reenrutando la ruta de la síntesis de capsantin, una xantofila específica para cromoplasto no nativa, usando un vector viral de ARN. Un ADNc que codifica capsantin-capsorubin sintasa (Ccs) , se colocó bajo el control transcripcional de un promotor subgenómico de tobamovirus. Las hojas de los vegetales transfectados que expresan la Ccs desarrollaron un fenotipo naranja y acumularon altos niveles de capsantin. Este fenómeno se asoció por distorsión de la membrana tilalcoide y la reducción de apilamiento de grana. En contraste con la situación que prevalece en los cromoplastos, la capsantin no se esterificó y su nivel aumentado se equilibró por una disminución concomitante de las xantofilas foliares principales, sugiriendo un control autoregulador de la composición de cloroplasto carotenoide. La capsantin se abasteció exclusivamente dentro de los complejos triméricos y monoméricos que recogen luz del Fotosistema II. Esta demostración de que los complejos de antena de vegetales superiores pueden acomodar carotenoides no nativos proporciona evidencia precisa de la remodelación funcional de las membranas fotosintéticas por el diseño racional de los carotenoides .

Construcción del vector de expresión de Ccs. Los sitios Xhol, •&&MS? JaanlU Avrll únicos se insertaron dentro de ADNc de capsantin-capsorubin sintasa (Ccs) de pepino dulce por mutagénesis de reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando oligonucleótidos : 5 ' -GCCTCGAGTGCAGCATGGAAACCCTTCTAAAGCTTTTCC-3' (hacia el extremo 5') (SEC. DE IDENT. NO.: 6), 5'-TCCCTAGGTCAAAGGCTCTCTATTGCTAGATTGCCC-3' (hacia el extremo 3') (SEC. DE IDENT. NO.: 7). El fragmento de ADNc Xhol, Avrll de 1.6 kb se colocó bajo el control del promotor subgenómico de proteína de recubrimiento TMV-U1 subclonando dentro de TTOIA, creando el plásmido TTOIA CCS+ (FIGURA 4; secuencia de ácido nucleico conforme a SEC. DE IDENT. NO.: 8 y secuencia de aminoácidos conforme a la SEC. DE IDENT. NO.: 9) en la orientación de sentido como se representa por la FIGURA 4.

Análisis de Carotenoide. Doce días después de la inoculación las hojas superiores de 12 vegetales se cosecharon y liofilizaron. Este extracto no saponificado resultante se evaporó a sequedad bajo argón y se pesó para determinar el contenido de lípidos totales. El análisis de pigmentos del contenido de lípidos totales se realizó por HPLC y también se separó por cromatografía en capa fina sobre gel de sílice G usando hexano/acetona (60:40 (V/V)). Los vegetales transfectados con TTOIA CCS+ acumularon altos niveles de capsantin (36% de los carotenoides totales) .

EJEMPLO 7 Expresión de los ADNc que codifican fitoeno sintasa de tomate y fitoeno desaturasa en una orientación positiva y de antisentido en Nicotiana benthamiana . Aislamiento de ADNc del virus mosaico del tomate.

Un fragmento de 861 pares de bases (5524-6384) del virus mosaico del tomate (cepa de necrosis de la fruta F; tom-F) que contienen el promotor subgenómico de proteína de recubrimiento putativa, gen de proteína de recubrimiento, y el extremo 3' se aisló por PCR usando cebadores 5'- CTCGCAAAGTTTCGAACCAAATCCTC-3' (hacia el extremo 5') (SEC. DE IDENT. NO.: 10) y 5 ' -CGGGGTACCTGGGCCCCAACCGGGGGTTCCGGGGG-3 ' (hacia el extremo 3') (SEC. DE IDENT. NO.: 11) y se subclonó dentro del sitio HincII de pBluescript KS-. Un virus híbrido que consiste de TMV-Ul y ToMV-F se construyó cambiando un fragmento de 874-bp BamEI-Kpnl ToMV dentro de pBGC152, creando el plásmido TTOl . El fragmento insertado se verificó por secuenciación de didesoxinucleótido. Un sitio Avrll único se insertó hacia el extremo 3' del sitio Xiiol en TTOl por mutagénesis de PCR, creando el plásmido TTOIA, usando los siguientes oligonucleótidos: 5'- TCCTCGAGCCTAGGCTCGCAAAGTTTCGAACCAAATCCTCA-3' (hacia el extremo 5') (SEC. DE IDENT. NO.: 12), 5'-CGGGGTACCTGGGCCCCAACCGGGGGTTCCGGGGG-3' (hacia el extremo 3') (SEC. DE IDENT. NO.: 13).

Aislamiento del ADNc que codifica fitoeno sintasa de tomate y un ADNc parcial que codifica fitoeno desaturasa de tomate. Los ADNc parciales se aislaron de ARN de fruta del tomate maduro por reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando los siguientes oligonucleótidos: PSY, 5'- TATGTATGGTGCAGAAGAACAGAT-3' (hacia el extremo 5') (SEC. DE IDE?T. ?O.: 14), 5 ' -AGTCGACTCTTCCTCTTCTGGCAT C-3* (hacia el extremo 3') (SEC. DE IDE?T. ?O. : 15); PDS 5'- TGCTCGAGTGTGTTCTTCAGTTTTCTGTCA-3' (SEC. DE IDE?T. ?O. : 16) (hacia el extremo 5'), 5'-AACTCGAGCGCTTTGATTTCTCCGAAGCTT-3 ' (hacia el extremo 3') (SEC. DE IDE?T. ?O. : 17).

Aproximadamente 3 X 104 colonias de una biblioteca de AD?c de Lycopersicon esculentum se seleccionaron por hibridización de colonias usando un producto de PCR fitoeno sintasa de tomate marcada con 32P. La hibridización se llevó a cabo a 42 °C durante 48 horas en 50% de formamida, 5X SSC, regulador de fosfato 0.02 M, solución de Denhart 5X, y 0.1 mg/ml de AD? de timo de becerro cortado. Los filtros se lavaron a 65°C en SSC 0.1X, 0.1% de SDS antes de la autoradiografía. Los productos de PCR y los clones de AD?c de fitoeno sintasa se verificaron por secuenciación de didesoxinucleótido.

Secuenciación de AD? y análisis de computadora. Un fragmento PstI, BamHI que contiene el AD?c de fitoeno sintasa y el AD?c parcial de fitoeno desaturasa se subclonó dentro de pBluescript® KS+ (Stratagene, La Jolla, California) . La secuenciación de nucleótidos de KS+/PDS #38 y KS+/5'3'PSY se llevó a cabo por terminación didesoxi usando plantillas de hebra sencilla (Maniatis, Molecular Cloning, lst Ed) El análisis de secuencia de nucleótidos y las comparaciones de secuencia de aminoácido se realizaron usando programas PCGENE® y ADN Inspector® HE.

Construcción del vector de expresión de fitoeno sintasa de tomate. Un fragmento Xhol que contiene el ADNc de fitoeno sintasa de tomate se subclonó dentro de TTOl. El vector TTOI/PSY + (FIGURA 5; secuencia de ácido nucleico conforme a la SEC. DE IDENT. NO.: 18 y la secuencia de aminoácido conforme a la SEC. DE IDENT. NO.: 19) contiene el ADNc de fitoeno sintasa en la' orientación positiva bajo el control del promotor subgenómico de proteína de recubrimiento TMV-Ul mientras que el vector TTOI/PSY - contiene el ADNc de fitoeno sintasa en la orientación antisentido.

Construcción de un vector viral que contiene un ADNc de fitoeno desaturasa de tomate parcial. Un fragmento Xhol que contiene el ADNc de fitoeno desaturasa de tomate parcial se subclonó dentro de TTOl. El vector TT01A/PDS + (FIGURA 6) contiene el ADNc de fitoeno desaturasa en la orientación positiva bajo el control del promotor subgenómico de proteína de recubrimiento TMV-Ul; mientras que el vector TTOIA/PDS - contiene el ADNc de fitoeno desaturasa en la orientación antisentido.

Análisis de N. benthamiana transfectada por TTQ1/PSY+, TTOI/PSY -, TTOIA/PDS +, TTOl/PDS -. Los ARN infecciosos de TT01/PSY+, TTOI/PSY-, TTOl/PDS +, y TTOl/PDS -, se prepararon por transcripción in vitro usando ARN polimerasa dependiente de ADN SP6 como se describió previamente (Dawson et ai., Proc . Nati . Acad. Sci . USA 85:1832 (1986)) y se usaron para inocular mecánicamente N. benthamiana . Los virus híbridos se extendieron a través de todas las hojas superiores no inoculadas como se verificó por microscopía de transmisión de electrones, prueba de infectividad de la lesión local, y amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Los síntomas virales que resultan de la infección consistieron de la distorsión de las hojas sistémicas y atrofia vegetal con clorosis moderada. Las hojas de los vegetales transfectados con TT01/PSY+ se volvieron naranja y acumularon altos niveles de fitoeno mientras que aquellas transfectadas con TT01/PDS+ y TTOl/PDS - se volvieron blancas. La electroforesis en gel de agarosa de ADNc de PCR aislado de ARN de virion y análisis de tinción Northern de ARN de virion indica que los vectores se mantienen en un estado extracromosomal y no han sufrido ningún rearreglo intramolecular detectable.

Purificación y análisis de carotenoides de vegetales transfectados. Los carotenoides se aislaron de tejido sistémicamente infectado y se analizaron por cromatografía de HPLC. Los carotenoides se extrajeron en etanol y se identificaron por su tiempo de retención pico y espectros de absorción en una columna de 25-cm Spherisorb® ODS-15-m usando acetonitrilo/metanol/2-propanol (85:10:5) como un solvente de desarrollo a una velocidad de flujo de 1 ml/minuto. Tuvieron tiempo de retención idéntico a un fitoeno sintético estándar y estándares de ß-caroteno de zanahoria y tomate. El pico de fitoeno de N. benthamiana transfectada con TTOI/PSY + tuvo una absorbancia óptica máxima a 276, 285, y 298 nm. Los vegetales transfectados con fitoeno sintasa codificada de virus mostró un aumento de diez veces el fitoeno en comparación a los niveles de los vegetales no infectados. La expresión de AD? de sentido y antisentido para un fitoeno desaturasa parcial en vegetales transfectados aumentó el nivel de fitoeno y alteró la ruta bioquímica; inhibió así la síntesis de carotenoides coloreados y causó de las hojas sistémicamente infectadas se volvieron blancas. El análisis por HPLC de estos vegetales reveló que también acumularon fitoeno. El fenotipo de hojas blancas también se observó en los vegetales tratados con el herbicida norflurazon que inhibe específicamente fitoeno desaturasa.

Este cambio en los niveles de fitoeno representa uno de los aumentos más, grandes de cualquier carotenoide (metabolito secundario) en cualquiera vegetal diseñado genéticamente. Los vegetales transfectados con fitoeno sintasa codificada de virus en un sentido más mostró un aumento de diez veces el fitoeno en comparación con los niveles de vegetales no infectados. Además, la acumulación de fitoeno en los vegetales transfectados con fitoeno desaturasa antisentido sugiere que los vectores virales pueden usarse como una herramienta potente para manipular las rutas en la producción de metabolitos secundarios a través de la inhibición antisentido citoplasmática. Las hojas de vegetales TT01A/PDS+ sistémicamente infectados también acumularon fitoeno y desarrollaron un fenotipo de blanqueado blanco. El mecanismo actual de inhibición no está claro. Estos datos se presentan por Kumagai et al . , Proc. Nati . Acad. Sci . USA 92:1679-1683 (1995) .

EJEMPLO 8 Expresión de fitoeno desaturasa en vegetales transfectados usando un vector viral multipartita. Construcción de un vector viral monocotiledoneo. El BSMV es un virus de ARN tripartita que infecta muchas especies de monocotiledóneas agrícolamente importantes tales como avena, trigo y cebada (McKinney y Greeley, "Biological -7ii?l???lTrÉT>" characteristics of baley stripe mosaic virus strains and their evolution" Technical Bulletin U. S. Department of Agricul ture 1324 (1965)). Un vector de expresión derivado del virus mosaico de la banda de cebada (BSMV) se construyó modificando un ADNc de BSMV ? (Gustafson et al . , Virology 158 (2) :394-406 (1987)) (FIGURA 7A) . En este ejemplo, se desarrolló un vector viral monocotiledóneo que dirige la expresión de secuencias de nucleótidos en vegetales transfectados. Los insertos extraños pueden colocarse bajo el control del promotor subgenómico ?b. El ADNc de BSMV ? infeccioso (?.42) se modificó por mutagénesis dirigida al sitio. Los nucleótidos 5098-5103 de ?.42 se reemplazaron con un sitio Nhe I. Usando mutagénesis por reacción en cadena de polimerasa (PCR) , un fragmento Nhe I de 646 bp, que contiene el gen de resistencia a zeomicina como un marcador de clonación, se amplificó de pZErO (Invotrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) usando los oligonucleótidos 5' TATGCTAGCTGATTAATTAAGTCGACGAGCTGATTTAACAAATTTTAAC 3' (hacia el extremo 5') (SEC. DE IDENT. NO.: 20) y 5' TATGCTAGCTGAGCGGCCGCGCACGTGTCAGTCCTGCTCCTCGG 3' (hacia el extremo 3') (SEC. DE IDENT. NO.: 21), y se insertó dentro del sitio Nhe del ADNc DE BSMV ?. Esto generó dos plásmidos, ?.?b.st .P/N-zeo (orientación positiva) y ?.?b.st .N/P-zeo (orientación negativa) , con sitios Pací y Notl flanqueando el gen de resistencia a zeomicina (FIGURA 7B) .

Para mejorar la expresión del ARN1 subgenómico ?, un ADNc (b) beta BSMV (ß42SpI) (Petty et ai., Virology 179 (2) :712-8 (1990)) se modificó sustituyendo la mayoría de la proteína de recubrimiento ORF por mutagénesis de PCR. Se amplificó un fragmento de 423 bp de ß42SpI usando los oligonucleótidos 5' GGAAAGCCGGCGAACGTGGCG 3' (hacia el extremo 5') (SEC. DE IDENT. NO.: 22) y 5' TATATTCGAATCTAGAATCGATGCTAGCTTGCATGCTGTGAAGTGGTAAAAGAAATGC 3 ' (hacia el extremo 3') (?EC. DE IDENT. NO.: 23) y se clonó dentro de los sitios NgoMIV y BstBl para crear el plásmido ß.?ßa. Esta construcción contiene solamente una porción no traducida de la proteína de recubrimiento ORF que se requiere para la expresión de las ORF de ARNß (FIGURA 7C) .

Construcción de vectores virales monocotiledóneos que contienen los ADNc de fitoeno desaturasa de maíz parciales. Los ADNc parciales que codifican fitoenos desaturasa (PDS) se amplificaron de ARN de tejido de hoja de maíz por RT-PCR usando 175 pares de oligonucleótido 5' ATATTAATTAACATGGACACTGGCTGCCTGTC 3' (hacia el extremo 5') (SEC. DE IDE?T. ?O.: 24) y 180 5' TATGCGGCCGCCTACAAAGCAATCAAAATGCACTG 3' (hacia el extremo 3') (SEC. DE IDE?T. ?O.: 25) que codifica 177 pares de PDS Met1- Leu290, 5' ATATTAATTAACAAGGTAGCTGCTTGGAAGGATG 3' (hacia el extremo 5') (SEC. DE IDE?T. ?O. : 26) y 178 5' ......^... A^ TATGCGGCCGCCTAGCAGGTTACTGACATGTCTGC 3' (hacia el extremo 3') (SEC. DE IDENT. NO.: 27) que codifica PDS Lys134 - Cys43\ y 179 pares 5' ATATTAATTAACCAGTGCATTTTGATTGCTTTG 3' (hacia el extremo 5') (SEC. DE IDENT. NO.: 28) y 176 5' TATGCGGCCGCCTAAGATGGGACGGGAACTTCTCC 3' (hacia el extremo 3') (SEC. DE IDENT. NO.: 29) que codifica PDS Gln284 - Ser571. Los fragmentos Pac I y Not I de 0.8 Kb amplificados que contienen los ADNc parciales que codifican PDS de maíz se colocaron bajo el control del promotor subgenómico BSMV ?b subclonando dentro de los sitios Pací y Notl ?.?b.st.P/N-zeo y ?.?b.st .N/P-zeo. Esto eliminó el gen de resistencia Zeocina y creó plásmidos con insertos de PDS en la orientación positiva (?.?b.st.P/N-mPDS-N, ?.?b.st .P/N-mPDS-M, y ?.?b.st .P/N-mPDS-C) y orientación negativa (?.?b.st .P/N-mPDS-N as, ?.?b.st.P/N-mPDS-M s, y ?.?b.st. P/N-mPDS-C as) .

Análisis de plantas de cebada transfectadas con ?.?b. st . P/N-mPDS . Los ARN de BSMV infecciosos de los clones de ADNc se prepararon por transcripción in vitro usando ARN polimerasa dependiente de T7 ADN (Ambion) como se describió previamente (Petty, et ai., Virology 171(2) :342-9 (1989)). Las transcripciones de cada uno de los tres genomas de BSMV se mezclaron en una relación de 1:1:1. Una alícuota de 7 ul de la mezcla de transcripción se combinó con 40 µL de FES y se aplicó directamente a plantas de cebada sin cascara negra de 12 días. Los virus híbridos BSMV: :mPDS se extendieron a través de las hojas no inoculadas. Los síntomas virales iniciales (1-7 días después de la inoculación) que resultan de las construcciones que contienen PDS presentaron síntomas similares a una infección de BSMV de tipo silvestre. 8-10 días después de la inoculación, las plantas BSMV-PDS empezaron a presentar rayas y parches de tejido inusualmente blanco. Las áreas afectadas carecían de la necrosis o desecación que se asocia frecuentemente con el blanqueado inducido por BSMV y se parecían más al tejido blanqueado encontrado en las plantas tratadas con el inhibidor químico de PDS, norflurazon. Estas rayas blancas se observaron en algún grado en todas las plantas infectadas con BSMV: :mPDS aunque las áreas más extensas de blanqueado se encontraron generalmente en las plantas infectadas con PDS que contiene BSMV en la orientación de sentido.

Purificación y análisis de carotenoides de plantas de cebada transfectadas . Los carotenoides se aislaron de 50 mg de tejido foliar sistémicamente infectado 18 días después de la inoculación y se analizó por cromatografía de HPLC. Los carotenoides se extrajeron en la oscuridad en metanol y se purificaron por su tiempo de retención pico y espectros de absorción sobre una columna Zorbax 4.6 X 15 cm C-18 usando acetonitrilo/metanol/2-propanol (85:10:5) como un solvente de desarrollo a una velocidad de flujo de 2 ml/min. Tuvieron tiempos de retención idénticos a un estándar de fitoeno sintético y estándares de ß-caroteno de tomate y zanahoria. La expresión de ARN de sentido y antisentido para el fitoeno desaturasa de maíz parcial en cebada transfectada inhibió la síntesis de carotenoides coloreados y causó que el tejido sistémicamente infectado se volviera blanco. El análisis por HPLC de estos vegetales reveló que también acumularon fitoeno. El genotipo de hojas blancas también se observó en plantas de cebada tratadas con el herbicida norflurazon que específicamente inhibe fitoeno desaturasa. El fitoeno extraído de cebada transfectada con BSMV-PDS se analizó por HPLC, tuvo un tiempo de retención similar al de un fitoeno estándar, y mostró un aumento de 10-60 veces o los niveles en un vegetal control transfectado con BSMV. Los resultados de que el fitoeno acumulado en las plantas de cebada transfectadas con fitoeno desaturasa de sentido positivo y antisentido parcial sugiere que los vectores virales vegetales pueden usarse para manipular las rutas biosintéticas en monocotiledóneas a través de la inhibición citoplasmática de la expresión del gen endógeno.

EJEMPLO 9 Expresión del gen Crt-B bacteriano en vegetales transfectados en una orientación de sentido positivo y confirma que codifica fitoeno sintasa. Se desarrolló un nuevo vector viral, TTU51, que consiste de la cepa del virus mosaico del tabaco Ul (TMV-Ul) (Goelet et al . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 79:5818-5822 (1982)), y el virus mosaico verde moderado del tabaco (TMGMV; cepa U5) (Solis et al . , 177:553-8 (1990)). La estructura de lectura abierta (ORF) para fitoeno sintasa de Erwinia herbicola ( CrtB) (Armstrong et ai., Proc . Nati . Acad. Sci . USA 87:9975-9979 (1990)) se colocó bajo el control del promotor subgenómico de proteína de recubrimiento del virus mosaico del tabaco (TMV) en el vector TTU51. Esta construcción también contiene el gen que codifica el péptido que selecciona cloroplasto (CTP) para la subunidad pequeña de ribulosa-1, 5-bisfosfato carboxilasa (RUBISCO) (O'Neal et al . , Nucí . Acids Res . 15:8661-8677 (1987)) y se llamó TTU51 CTP CrtB como se representa en la FIGURA 8 (Secuencia de ácido nucleico conforme a SEC. DE IDENT. NO.: 30 y secuencia de aminoácidos conforme a la SEC. DE IDENT. NO.: 31). El ARN infeccioso se preparó por transcripción in vitro usando ADN polimerasa dependiente de ADN SP6 (Dawson et ai, Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 83:1832-1836 (1986)); Susek et ai., Cell 7_4:787-799 (1993)) y se usó para inocular mecánicamente N. benthamiana . El virus híbrido se extendió a través de todas las hojas superiores no inoculadas y se verificó por la prueba de infectividad de lesión local y amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Las hojas de estas plantas transfectadas con TTU51 CTP CrtB desarrollaron una pigmentación naranja que se extendió sistémicamente durante el crecimiento del vegetal y la replicación viral. Las hojas de estos vegetales transfectados con TTU51 CTP CrtB tuvieron una disminución en el contenido de clorofila (resultados no mostrados) que excede la ligera reducción que se observa normalmente durante la infección viral. Puesto que los estudios previos han indicado que las rutas de la biosíntesis de carotenoides y clorofila están interconectadas (Susek et al . , Cell 74:787-799 (1993)), se decidió comparar la proporción de síntesis de fitoeno a clorofila. Dos semanas después de la inoculación, los cloroplastos de los vegetales infectados con las copias de TTU51 CTP CrtB se aislaron y probaron por actividad enzimática. La proporción de síntesis de fitoeno sintetasa a clorofila fue 0.55 en los vegetales transfectados y 0.033 en los vegetales no inoculados (control) . La actividad de fitoeno sintasa de los vegetales transfectados con TTU51 CTP CrtB se probó usando cloroplastos aislados y geranilgeranil PP [1C] . Hubo un aumento grande en fitoeno y un alcohol de C4o no identificado en los vegetales CrtB.

Prueba de fitoeno sintetasa. Los cloroplastos se prepararon como se describió previamente (Cámara, Methods Enzymol . 214:352-365 (1993)). Las pruebas de fitoeno sintasa se llevaron a cabo en una mezcla de incubación (0.5 ml de volumen final) regulada con Tris-HCL, pH 7.6, que contiene geranylgeranyl PP [1C] (100,000 cpm) (preparada usando GGPP synthase de pimiento expresada en E. coli ) , ATP lmM, MnCl2 5 mM, MgCl2 1 mM, Tritón X-100 (20 mg per mg de proteína de cloroplasto) y suspensión de cloroplasto equivalente a 2 mg de proteína. Después de 2 h de incubación a 30°C, los productos de reacción se extrajeron con cloroformo metanol (Cámara, supra) y se sometieron a TLC sobre una placa de silicegel desarrollada con benceno/acetato de etilo (90/10) seguido por autoradiografía.

Prueba de clorofila sintetasa. Para la prueba de clorofila sintetasa, los cloroplastos aislados se erizaron por choque osmótico antes de la incubación. La mezcla de reacción (0.2 ml de volumen final) que consiste de Tris-HCL 50 mM (pH 7.6) que contiene geranylgeranyl PP [14C] (100,000 cpm), 5 MgCl2, ATP 1 mM, y suspensión de plásmidos desorganizados equivalentes a 1 mg de proteína se incubó durante 1 hr a 30°C. Los productos de reacción se analizaron como se describió previamente.

Construcciones de Plásmido. El vector de expresión de fitoeno sintasa, que selecciona cloroplasto, TTU51 CTP CrtB como se representó en la FIGURA 8, se construyó en diversos pasos de subclonación. Primero, se insertó un sitio Sphl único en el codón de inicio del gen de fitoeno sintasa de Erwinia herbicola por mutagénesis de reacción en cadena de polimerasa (PCR) (Saiki et ai., Science 230:1350-1354 (1985)) usando los oligonucleótidos CrtB MIS 5' -CCA AGC TTC TCG AGT GCA GCA TGC AGC AAC CGC CGC TGC TTG CA-3' (hacia el extremo 5') (SEC. DE IDENT. NO.: 32) y CrtB P300 5 ' -AAG ATC TCT CGA GCT AAA CGG GAC GCT GCC AAA GAC CGG CCG G-3' (hacia el extremo 3') (SEC. DE IDENT. NO.: 33). El fragmento CrtB PCR se subclonó dentro de pBluescript® (Stratagene) en el sitio EcoRV, creando el plásmido pBS664. Un fragmento Sphl, Xhol CrtB de 938 bp de pBS664 se subclonó después dentro de un vector que contiene la secuencia que codifica el péptido que selecciona cloroplasto de N. tajacum (CTP) para la subunidad pequeña de RUBISCO, creando el plásmido pBS670. Después, el vector tobamoviral, TTU51, se construyó. Un fragmento de 1020 pares de bases del virus mosaico verde moderado del tabaco (TMGMV; cepa U5) que contiene el promotor subgenómico viral, el gen de proteína de recubrimiento, y el extremo 3' se aisló por PCR usando cebadores de TMGMV 5' -GGC TGT GAA ACT CGA AAA GGT TCC GG-3' (hacia el extremo 5') (SEC. DE IDE?T. ?O. : 34) y 5' -CGG GGT ACC TGG GCC GCT ACC GGC GGT TAG GGG AGG-3' (hacia el extremo 3*) (SEC. DE IDE?T. ?O. : 35), se subclonó dentro del sitio HincII de Bluescript KS-, y se verificó por secuenciación de didesoxinucleótido. Este clon contiene una duplicación que ocurre naturalmente de 147 base que incluye el dominio de pseudonudo hacia el extremo 5' completo en la región 3' que no codifica. El ADNc viral híbrido que consiste de TMV-Ul y TMGMV se construyó cambiando un fragmento 1-Kb Xhol-Kpnl TMGMV en TTOl (Kumagai et al . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 92:1679-1683 (1995)), creando el plásmido TTU51. Finalmente, el fragmento Xhol CTP CrtB de 1.1 Kb de pBS670 se subclonó dentro del Xhol de TTU51, creando el plásmido TTU51 CTP CrtB. Como un control negativo de CTP, un fragmento Xhol de 942 bp que contiene el gen CrtB del pBS664 se subclonó dentro de TTU51, creando el plásmido TTU51 CrtB #15.

EJEMPLO 10 Identificación de las secuencias de nucleótido involucradas en la regulación del crecimiento vegetal por la inhibición citoplasmática de la expresión del gen de sentido positivo usando ARN derivado de virus. En este ejemplo, se muestra: (1) un método para producir ARN de sentido más usando un vector viral de ARN, (2) un método para producir ARN de sentido derivado de virus en el citoplasma, (3) un método para mejorar o suprimir la expresión de proteínas vegetales endógenas en el citoplasma por ARN antisentido viral, y (4) un método para producir •<¿a vegetales transfectados que contienen ARN de sentido más viral; dichos métodos son mucho más rápidos que el tiempo requerido para obtener vegetales transgénicos de sentido genéticamente diseñados. La infección sistémica en la expresión de ARN de sentido más viral ocurre en tan poco como cuatro días después de la inoculación, mientras que toma varios meses o más crear un vegetal transgénico individual. Este ejemplo demuestra que los vectores virales de hebra positiva nuevos, que se duplique solamente en el citoplasma, pueden usarse para identificar genes involucrados en la regulación del crecimiento vegetal mejorando o inhibiendo la expresión de genes endógenos específicos. Este ejemplo también permite caracterizar genes específicos y rutas bioquímicas en vegetales transfectados usando un vector viral de ARN. Los vectores Tobamovirales se han desarrollado para la expresión heteróloga de secuencias de nucleótido no caracterizadas en vegetales transfectados. Una biblioteca de ADNc de Arabidopsis thaliana parcial se colocó bajo el control transcripcional de un promotor subgenómico de tobamovirus en un vector viral de ARN . Las colonias de E. coli transformadas se levantaron automáticamente usando un robot Flexys y se transfirieron a un bloque de fondo plano de 96 pozos que contiene caldo sobresaliente (TB) Amp 50 ug/ml. Aproximadamente se aislaron 2000 AD? de plásmido de cultivos durante la noche usando un BioRobot y los ARN infecciosos de 430 clones independientes se aplicaron directamente a los vegetales, de una a dos semanas después de la inoculación, los vegetales de Ni cotiana benthamiana transfectados se observaron visualmente por cambios en las velocidades de crecimiento, morfología, y color. Un conjunto de vegetales transfectados con 740 AT #2441 se atrofieron severamente. El análisis de secuencia de ADN reveló que este clon contenía una estructura de lectura abierta de proteína que enlaza GTP de Arabidopsis Ran (ORF) en una orientación de sentido más. Esto demuestra que un vector viral de ARN episomal puede usarse para alterar deliberadamente la ruta metabólica y causar la atrofia vegetal. Además, los resultados muestran que la copia de sentido positivo de Arabidopsis puede causar cambios fenotípicos en N. benthamiana .

Construcción de una biblioteca de ADNc de Arabidopsis thaliana en un vector viral de ARN . Se digirió una biblioteca de Adnc CD4-13 de Arabidopsis thaliana con Notl . Se aislaron fragmentos de AD? de entre 500 y 1000 bp por elución completa y se subclonaron dentro del sitio Notl de pBS740. Las células competentes de C600 de E. coli se transformaron con la biblioteca pBS740 y las colonias que contienen las secuencias de AD?c de Arabidopsis se seleccionaron en 50 ug/ml de LB Amp. Las células C600 recombinantes se levantaron automáticamente usando un robot Flexys y después se transfirieron a un bloque de fondo plano de 96 pozos que contiene caldo sobresaliente (TB) Amp 50 ug/ml. Aproximadamente 2000 ADN de plásmido se aislaron de cultivos durante la noche usando un BioRobot (Qiagen) y los ARN infecciosos de 430 clones independientes se aplicaron directamente a los vegetales.

Aislamiento de un gen que codifica una proteína que enlaza GTP. De una a dos semanas después de la inoculación, los vegetales Nicotiana benthamiana transfectados se observaron visualmente por cambios en las velocidades de crecimiento, morfología y color. Los vegetales transfectados con 740 AT #2441 (FIGURA 9) se atrofiaron severamente. El Plásmido 740 AT #2441 contiene las estructuras de lectura abierta (ORF) TMV-Ul que codifican las proteínas de 126-, 183-, y 30-kDa, el gen de proteína de recubrimiento TMV-U5 (cp U5) , el promotor T7, un fragmento Arabidopsis thaliana CD4-13 de Notl, y parte del plásmido pUC19. El promotor subgenómico TMV-Ul ubicado dentro de la cepa a menos de la ORF de 30-kDa controla la síntesis del ARN subgenómico CD4-13.

Secuenciación de ADN y análisis de computadora. Un fragmento Notl de 841 bp de 740 AT #2441 (FIGURA 10; secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos como SEC. DE IDENT. NO.: 36 y 37, respectivamente) que contiene el ADNc de la proteína que enlaza GTP Ran se caracterizó. La secuenciación de nucleótidos de 740 AT #2441 se llevó a cabo por terminación dideoxi usando plantillas de doble hebra. Las comparaciones del análisis de secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos se realizó usando los programas Strider, PCGENE y NCBI Blast de ADN. El 740 AT #2441 contiene una estructura de lectura abierta (ORF) en la orientación positiva que codifica una proteína de 221 aminoácidos con un peso molecular aparente de 25,058 Da. La masa de la proteína se calculó usando el programa Voyager (Perceptive Biosystems) . La FIGURA 11 muestra la alineación de la secuencia de nucleótidos de 740AT #2441 con AF017991 (SEC. DE IDENT. NO.: 38 y 39 respectivamente), una proteína A. thaliana que enlaza GTP pequeña inducible por tensión salina de Ranl. La FIGURA 12 muestra la alineación de nucleótidos de 740 AT #2441 en L16787 (SEC. DE IDENT. NO.: 40 y 41 respectivamente) , una proteína que enlaza GTP similar a ras pequeña de N. tabacum. La FIGURA 13 muestra la comparación de aminoácidos de 740 AT #2441 con la proteína que enlaza GTP de tabaco Ran-Bl (SEC. DE IDE?T. ?O. : 42 y 43 respectivamente) . El AD?c de A. thaliana presenta un alto grado de homología con los AD?c de proteínas que enlazan GTP a A. thaliana , tomate ( L . esculentum) , tabaco ( N. tabacum) , L . japonicus y frijol (V. /aba) (Tabla 1) . La secuencia de nucleótidos de 740 AT #2441 codifica una proteína que tiene fuerte similitud (100% a 95%) con las proteínas que enlazan GTP de A. thaliana, tomate, tabaco, y frijol (Tabla 2) . El AD? #2441 también presenta un alto grado de homología (67% a 83%) con los AD?c de proteínas que enlazan GTP de humano, levadura, ratón y drosofila (Tabla 3) . La proteína también tiene 67%-97% de identidades, y 79%-98% positivo con levadura, organismos mamíferos tales como humano *-*- Tabla 1. Comparación de secuencias de nucleótido de #2441 Q Cuenta Valor p Identidades Positivos A. thaliana AYO 17991 3645 (1007 .2 bits) 0.00E+O0 773/738 (99%) 733/738 (99%) ?. /?<!/iíiM«? ATU75601 3645 (1007 .2 bits) O.OOE+00 733/738 (99%) 773/738 (99%) A. thalianai X97381 3618 (999.7 bits) 0.00E+00 730/738 (99%) 733/738 (98%) L. csculentum L28 14 2341 (646.9 bits) 1.50E-189 561/677 (82%) 561/677 (82%) N. tabacum l 16787 2336 (645.5 bits) 3.90E-189 556/667 (83%) 556/667 (83%) L. esculentu L28713 2313 (639.1 bits) 3.00E-187 557/675 (82%) 557/675 (82%) L. csculentum L28715 2336 (645.5 bits) 4.10E-189 560/676 (82%) 560/676 (82%) V.fúba Z2A67S 2325 (642.4 bits) 3.30E-188 557/672 (82%) 557/672 (82%) M o N. tabacum L 16767 2272 (627.8 bits) 7.70E-I 84 548/665 (82% 548/665 (82%) L. japonicus Z73960 2194 (606.2 bits) 3.00E-177 526/635 (82%) 526/635 (82%) L. japónicas Z73959 2187 (604.3 bits) 9.70E-177 531/648 (81%) 531/648 (81%) Tabla 2. Comparación de secuencias de aminoácidos de 740 AT#2441 Cuenta Valor p Identidades Posilivos A. thaliana SP_PL: O04664 1 192 (554.1 bits) 1.50E-162 221/221 (100%) 221/221 (100%) A. thaliana SP_PL O04\ 48 1 172 (544.8 bits) 9.60E-160 217/221 (98%) 220/221 (99%) A. thaliatta SP_PL:O22495 1 172 (544.8 bits) 9.60E-1 0 217/221 (98%) 219/221 (99%) N. tabacum SW:RANA_TOBAC P41918 1 169 (543.4 bits) 2.50E-159 216/221 (97%) 218/221 (98%) V.faba SW:RAN_VICFA P38548 1155 (536.9 bits) 2.30E-157 2) 2/221 (95%) 216/221 (97%) A. thaliana SW:RAN2_ARATH P41917 1150 (534.6 bits) 1.10E-156 21 1/221 (95%) 217/221 (98%) L. esadenlum SW.RAN2_LYCES P38547 1 148 (533.7 bits) 2.20E-156 212/221 (95%) 214/221 (96%) N. tabacum SW:RANB_TOBAC P41 19 1 145 (532.3 bits) 5J0E-156 212/221 (95%) 214/221 (96%) L. csculentum SW:RAN 1_LYCES P38546 1 143 (531.3 bits) 1.10E-155 21 1/221 (95%) 213/221 (96%) M A. thaliana SW:RAN!_ARATH P41916 1 141 (530.4 bits) 2.10E-155 210/221 (95%) 215/221 (97%) L.japonicus SW:RANB_LOTJA P54766 1 1 1 1 (516.5 bits) 3.50E-I 51 205/209 (98%) 207/209 (99%) L.japonicus SW:RANA_LOTJA P 54765 1106 (514.1 bits) 1 J0E-150 204/209 (97%) 206/209 (98%) Tabla 2. Comparación de secuencias de aminoácidos Tabla 2. Comparación de secuencias de aminoácidos de 740 AT#2441 Análisis MALDI-TOF de N. benthamiana transfectada con 740 AT #2441 10 días después de la inoculación, el meristemo apical, las hojas, y tallos de N. benthamiana transfectada con 740 AT #2441. se congelaron en nitrógeno líquido. Las proteínas solubles se extrajeron en regulador de molienda (Tris 10 mM, pH 7.5, 2 mM de EDTA, 1 mM de PMSF, 10 mM de BME) usando un mortero y manilla. El homogenado se filtró a través de cuatro capas de manta y se giró a 10, 000 X g durante 15 minutos, . El sobrenadante se decantó y se giró a 100, 000 X g durante 1 hr. Un alícuota de 500 µl del sobrenadante se mezcló con 500 µl de TCA al 20% (acetona/0.07% de BME) y se almacenó a 4°C durante la noche. El sobrenadante se analizó por MALDI-TOF. (Karas et al . , Anal . Chem. 60:2299-9301 (1988)). Los resultados mostraron que las proteínas solubles contenían una proteína recientemente expresada de peso molecular 25,058.

Aislamiento de un clon genómico de proteína que enlaza GTP de Arabidopsis thaliana Un clon genómico que codifica proteínas que enlazan GTP de A. thaliana pueden aislarse por filtros de sondeo que contienen clones BAC de A. thaliana usando un inserto Notl de 740 AT #2441 marcado con j2P. Otros miembros de la familia multigen ARF de A. thaliana se han identificado usando programas del University of Wisconsin Genetic Computer Group.

EJEMPLO 11 Identificación de secuencias de nucleótidos involucradas en la regulación del crecimiento vegetal por la inhibición citoplasmática de la expresión del gen en una orientación antisentido usando ARN derivado de virus (proteínas que enlazan GTP) . En este ejemplo, se muestra: (1) un método para producir ARN antisentido usando un vector viral de ARN, (2) un método para producir ARN antisentido derivado de virus en el citoplasma, (3) un método para inhibir la expresión de proteínas vegetales endógenas en el citoplasma por ARN antisentido viral, y (4) un método para producir vegetales transfectados que contienen ARN antisentido viral, dicho método es mucho más rápido que el tiempo requerido para tener vegetales transgénicos antisentido genéticamente diseñados. La infección sistémica y el ARN antisentido viral ocurre tan pronto como varios días después de la inoculación, mientras que toma varios meses o más crear un vegetal transgénico sencillo. Este ejemplo muestra que los vectores virales de hebra positivo nuevos, que se replican en el citoplasma, pueden usarse para indicar genes involucrados en la regulación del crecimiento vegetal inhibiendo la expresión de genes endógenos específicos. Este ejemplo permite caracterizar genes específicos y rutas bioquímicas en vegetales transfectados usando un vector viral de ARN. Los vectores Tobamovirales se han desarrollado para la expresión heteróloga de secuencias de nucleótidos no caracterizadas en vegetales transfectados. Una biblioteca de ADN de Arabidopsis thaliana parcial se colocó bajo el control transcripcional de un promotor subgenómico de tobamovirus en un vector viral de ARN. Las colonias de E. coli transformadas se levantaron automáticamente usando un robot Flexys y se transfirieron a un bloque de fondo plano de 96 pozos que contiene caldo sobresaliente (TB) Amp 50 ug/ml. Aproximadamente se aislaron 2000 ADN de plásmido de cultivos durante la noche usando un BioRobot y los ARN infecciosos de 430 clones independientes se aplicaron directamente los vegetales. De una a dos semanas después de la inoculación, los vegetales de Nicotiana benthamiana transfectados se observaron visualmente por cambios en las velocidades de crecimiento, morfología y color. Un conjunto de vegetales transfectados con 740 AT #120 se atrofiaron severamente. El análisis de secuencia de ADN reveló que este clon contenía una estructura de lectura abierta de proteína que enlaza GTP de Arabidopsis (ORF) en la orientación antisentido. Esto demuestra que un vector viral de ARN episomal puede usarse para deliberadamente alterar la ruta metabólica y causar la atrofia vegetal. Además, los resultados sugieren que la copia antisentido de Arabidopsis puede desconectar la expresión del gen N. benthamiana .

Construcción de una biblioteca de AD?c de Arabidopsis thaliana en un vector viral de AR?. Una biblioteca de AD?c CD4-13 de Arabidopsis thaliana se digirió con Notl . Los fragmentos de AD? entre 500 y 1000 bp se aislaron por elución completa y se subclonaron dentro del sitio de Notl de pBS740. Las células competentes de E. coli C600 se transformaron con la biblioteca pBS740 AT y las colonias que contienen secuencias de AD?c de Arabidopsis se seleccionaron en LB Amp 50 ug/ml. Las células C600 recombinantes se levantaron automáticamente usando un robot Flexys y se transfirieron después a un bloque de fondo plano de 96 pozos que contiene caldo sobresaliente (TB) Amp 50 ug/ml. Aproximadamente 2000 AD? de plásmido se aislaron de cultivos durante la noche usando un BioRobot (Qiagen) y los AR? infecciosos de 430 clones independientes se aplicaron directamente a los vegetales.

Aislamiento de un gen que codifica una proteína que enlaza GTP. De una a dos semanas después de la inoculación, los vegetales de Nicotiana benthamiana transfectados se observaron visualmente por cambios en versiones de crecimiento, morfología, y color. Los vegetales transfectados con 740 AT #120 (FIGURA 14) se atrofiaron severamente. El plásmido 740 AT #120 contiene las ORF de TMV-Ul de 126-, 183-, y 30-kDa, el gen de proteína de recubrimiento TMV-U5 (U5 cp) , el promotor T7, un fragmento Notl CD4-13 de Arabidopsis thaliana y parte del plásmido pUC19. El promotor subgenómico TMV-Ul ubicado dentro de la hebra menos de la ORF de 30-kDa controla la síntesis del AR? subgenómico antisentido CD4-13.

Secuenciación de AD? y análisis de computadora. Un fragmento Notl de 782 bp de 740 AT #120 que contiene el AD?c del factor de ribosilación de ADP (ARF) se caracterizó. La secuencia de AD? de fragmento Notl de 740 AT #120 (774 pares de base) es como sigue: 5' - CCGAAACATTCTTCGTAGTGAAGCAAAATGGGGTTGAGTTTCGCCAAGCTGTTT AGCAGGCTTTTTGCCAAGAAGGAGATGCGAATTCTGATGGTTGGTCTTGATGCT GCTGGTAAGACCACAATCTTGTACAAGCTCAAGCTCGGAGAGATTGTCACCACC ATCCCTACTATTGGTTTCAATGTGGAAACTGTGGAATACAAGAACATTAGTTTCA CCGTGTGGGATGTCGGGGGTCAGGACAAGATCCGTCCCTTGTGAGACACTACTT CCAGAACACTCAAGGTCTAATCTTTGTTGTTGATAGCAATGACAGAGACAGAGT TGTTGAGGCTCGAGATGAACTCCACAGGATGCTGAATGAGGACGAGCTGCGTGA TGCTGTGTTGCITGTGTTTGCCAACAAGCAAGATCTTCCAAATGCTATGAACGCT GCTGAAATCACAGATAAGCTTGGCCTTCACTCCCTCCGTCAGCGTCATTGGTATA TCCAGAGCACATGTGCCACTTCAGGTGAAGGGCTTTATGAAGGTCTGGACTGGC TCTCCAACAACATCGCTGGCAAGGCATGATGAGGGAGAAATTGCGTTGCATCGA GATGATTCTGTCTGCTGTGTTGGGATCTCTCTCTGTCTTGATGCAAGAGAGATTA TAAATATTATCTGAACCI TITGCTTTTTTGGGTATGTGAATGTTTCTTATTGTGC AAGTAGATGGTCTTGTACCTAAAAATTTACTAGAAGAACCCTTTTAAATAGCTTT CGTGTATTGT-3' (SEQ ID ?O: 44).

La secuenciación de nucleótidos de 740 AT #120 se llevó a cabo por terminación didesoxi usando plantillas de doble hebra. Las comparaciones del análisis de secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos se realizó usando programas Strider, PCGENE y NCBI Blast de ADN. El 740 AT #120 contiene una estructura de lectura abierta (ORF) en la orientación antisentido que codifica una proteína de 181 aminoácidos con un peso molecular aparente de 20,579 Daltones.

Comparación de secuencias La FIGURA 15 muestra una comparación de secuencias de nucleótidos de A. thaliana 740 AT #120 y A. thaliana est AA042085 (SEC. DE IDENT. NO.: 45 y 46 respectivamente). La secuencia de nucleótidos de 740 AT #120 también se compara con un factor AF012896 de ribosilación (Oryza sativa) ADP de arroz, SEC. DE IDENT. NOS. 47 y 48 (FIGURA 16); que muestra 82% (456/550) positivos y identidades. La secuencia de nucleótido de 740 AT#120 muestra un grado elevado de homología (81-84% de identidad y positivo) en el arroz, cebada, zanahoria, maíz y ADN A. thaliana codifica ARFs y también un grado elevado de homología (71-84% de identidad y positivo) en levadura, plantas, insectos tales como moscas, anfibio y tales como rana, mamíferos tales como bovino, humano, y codificación de ADN ratón (Tabla 5) .

La secuencia de aminoácido derivada de 740 AT #120 muestra un grado más elevado de homología (96-98% de identidad y 97-98% positivo) en ARFs de arroz, zanahoria, maíz y A. thaliana y grado elevado de homología (61-98% identidad y 78-98% positivo; aún más elevado que la homología de secuencia de nucleótido) en ARFs de levadura, plantas, insectos tales como mosca, mamífero tales como bovino, humano y ratón (Tabla 6) . La homología elevada de ADNs que modifican las proteínas de enlace GTP de levadura, plantas, insectos, humano, ratón, y amfibians indican que ADNs de un organismo donador puede ser transfectado en otro organismo huésped y amordazar el gen del organismo huésped.

Tabla 5. Comparación de secuencia de nucleótidos de 740 AT#120 Cuenta Esperado Identidades Posilivos cebada El 0542 540.8 bits (1957) 1.4e-157 461/548(84%) 461/548(84%) A. thaliana 95166 538.5 bits (1949) 7.4e-157 461/550(83%) 461/550(83%) arroz AFO 12896 537.7 bits (1946) 1.3e-156 462/553 (83%) 462/553 (83%) zanahoriaD45420 531.4 bits (1923) 9.8e-155 471/579(81%) 471/579(81%) maíz X80042 512.3 bits(1854) 6.8e-149 450/549(81%) 450/549(81%) C. reinhardtii O21\20 480.0 bits (1740) 1.6e-139 436/546 (79%) 436/546 (79%) cerebro de ratón ARF3 D87900 431.1 bits (1560) 1.7e-l24 416/546(76%) 416/546(76%) Bovino J03794 426.9 bits (1545) 3.6e-123 409/534 (76%) 409/534 (76%) £ Humano ARF3 M33384 433.5 bits (1569) 4.9e-123 417/546(76%) 417/546(76%) S.pombeARFX L09551 430.2 bits (1557) l.le-121 409/531 (77%) 409/531 (77%) Humano ARF 1 AF05502 428 bits (1549) 5.8e-121 405/524 (77%) 405/524 (77%) rana U31350 414.5 bits(1500) 1.7e-119 412/552(74%) 412/552(74%) Humano ARF5 M57567 387.4 bits (1402) l.0e-107 390/527 (74%) 390/527 (74%) S. cerevisiae J03276 362.8 bits (1313) 1.6e-99 381/529(72%) 381/529(72%) Humano ARF4M36341 358.4 bits (1297) 4.3e-98 377/524(71%) 377/524(71%) C. elegans M36341 149.8 bits (542) 2.0e-90 154/211(72%) 154/211 (72%) N. tabacum NTGB1 U46927285.7 bits (1034) 4.8e-78 234/268 (87%) 234/268 (87%) cosmido Humano AC 00 57 107.5 bits (389) 9.7e-73 93/112(83%) 93/112(83%) mosca S62079 211.9 bits (767) 2.8e-72 195/247(78%) 195/247(78%) Tabla 6. Comparación de aminoácidos de 470 AT# con los ARF de otros organismos Cuenta Esperado identidades Positivos A. thaliana ARF1 g543841 365 bits (928) e-101 179/181 (98%) 179/181(98%) arrozgl 703380 363 bits (921) e-100 177/181 (97%) 179/181(98%) maíz gl 351974 356 bits (905) 3e-98 174/181 (96%) 179/181(98%) zanahoriag 1703375 362 bits (919) e-100 177/181 (97%) 178/181 (97%) C. reinhardtiig 1703374 354 bits (898) 2e-97 172/180(95%) 174/180(96%) Bovino 327 bits (829) 2e-89 160/177(90%) 166/177(93%) Humano ARF1 326 bits (827) 4e-89 160/177(90%) 166/177(93%) ratón 326 bits (827) 4e-89 160/177(90%) 166/177(93%) 00 mosca 325 bits (825) 7e-89 158/177(89%) 166/177(93%) Humano ARF3 P16587 321 bits (813) le-87 157/180(87%) 164/180(90%) Humano ARF5 gl 14127 305 bits (774) 7e-83 145/178(81%) 161/178(89%) Human ARF4 gl 14123 304 bits (770) 2e-82 145/178(81%) 160/178(89%) lavaduraARFl g!71072 298 bits (754) 2e-80 139/177 (78%) 161/177(90%) A. thaliana A F3 241 bits (608) 2e-63 109/177(61%) 140/177(78%) La proteína codificada por 740 AT #120, 120P, contiene tres dominios conservados: El motivo de lazo que enlaza fosfato, GLDAAGKT (SEC. DE IDENT. NO. 49), (consenso GXXXXGKS/T, SEC. DE IDENT. NO: 50); el motivo G*, DVGGQ (SEC. DE IDENT. NO. 51), (consenso DXXGQ, SEC. DE IDENT. NO. 52), una secuencia que interactúa con el fosfato gamma de GTP; y el motivo G de NKQD (SEC. DE IDENT. NO. 53), (consenso NKXD, SEC. DE IDENT. NO. 54), que es específico para enlazar guanidinilo. El 120P contiene un sitio de glicin-miristoilación putativo en la posición 2, un sitio de N-glicosilación (NXS) potencial en la posición 60, y diversos sitios de fosforilaciones de serina/treolina putativos.

ADN Humanizado La secuencia de nucleótidos de 740 AT #120 se compara también con un factor de ribosilación de ADP humano (ARF3)M33384, que muestra una marcada similitud (76% de identidad a nivel de nucleótidos y 87% de identidad a nivel de aminoácidos) . La alineación de secuencia de aminoácidos de 740 AT #120 con el factor de ribosilación de ARDP humano (ARF3)P16587 se compara en la FIGURA 17 (SEC. DE IDENT. Nos. 55-57), que muestra 87% de identidad y 90% positivo. La alta homología de la secuencia de aminoácidos y de ácidos nucleicos entre los dos hace práctico humanizar 740 AT #120. Una secuencia humanizada, secuencia de ácido nucleico 740 AT #120 H se prepara cambiando la secuencia de ácido nucleico 740 AT #120 de manera que codifica la misma secuencia de aminoácidos que codifica el M33384 humano. El ácido nucleico se cambia por un método estándar tal como mutagénesis dirigida al sitio o síntesis de ADN. La FIGURA 18 (SEC. DE IDENT. NOS: 58 y 59 para secuencias de nucleótidos y SEC. DE IDENT. NO: 60 para secuencia de aminoácidos) muestra la alineación de secuencia de 740 AT #120H para ARF3 M33384 humano .

Aislamiento de un clon genómico ARF de Arabidopsis thaliana Un clon genómico que codifica ARF de A. thaliana puede aislarse por filtros de sondeo que contienen clones de BAC de A. thaliana que usan un inserto 740 AT #120 Notl marcado con 32P. Otros miembros de la familia multigen ARF de A. thaliana se han identificado usando programas de la University of Wisconsin Genetic Computer Group. El clon de BAC T08I13 ubicado en el cromosoma II tiene un alto grado de homología con 740 AT #120 (78% a 86% de identidad a nivel de nucleótido) .

Aislamiento y caracterización de un AD?c que codifica ARF de Nicotiana benthamiana Un AD?c de 488 bp de la biblioteca de AD?c del tallo de N. benthamiana se aisló por reacción en cadena de polimeraza (PCR) usando los siguientes oligonucleótidos: ATARFK15, 5' AAG AAG GAG ATG CGA ATT CTG ATG GT 3' (hacia el extremo 5') (SEC. DE IDENT. NO: 61), ATARFN176, 5' ATG TTG TTG GAG AGC CAG TCC AGA CC 3' (hacia el extremo 3') (SEC. DE IDENT. NO. 62) . La polimerasa de paso en la reacción se inactivo usando fenol/cloroformo, y el producto de PCR se clonó directamente dentro del sitio HincII en Bluescrip KS+ (Strategen) . El mapa de plásmido de KS+ Nb ARF #3, que contiene la ORF ARF de N. benthamiaca en pBluescript KS+ se muestra en la FIGURA 19. La secuencia de nucleótidos de KS+ ?b ARF#3 de N. benthamiana que contiene la ORF del factor de ribosilación de ADP parcial, se determinó por secuenciación de didesoxinucleótidos . Las secuencia de nucleótidos de KS+ ?b ARF#3 tuvo una marca similitud con otras secuencias del factor de rebosilación de ADP vegetal (82 a 87% de identidades en nivel de nucleótidos) . Comparación de la secuencia de nucleótidos de KS+ ?b ARF#3 de N. benthamiana y 740 AT #120 de A. thaliana muestra una alta homología entre ellas (FIGURA 20, SEC. DE IDE?T. NOS: 63 y 64 respectivamente) . La secuencia de nucleótidos de KS+ NbARF #3 presenta un alto grado de homología (77-87% de identidades y positivos) con ADN de vegetal, levadura y mamífero que codifica las ARF (Tabla 7) . De nuevo, la alta homología de los ADN que codifican las proteínas que enlazan GTP de levadura vegetales humanos, bovino y ratones indica que los ADN de un organismo donador pueden transfectarse dentro de otro organismo huésped y silenciar efectivamente el gen endógeno del organismo huésped. «fi&á?j»a»¿¿É Tabla 7. Comparación de secuencias de aminoácidos de KS+NB ARF #3 Cuenta Esperado Identidades Positivos A thaliana M95166 448.2 bits (1622) 1.2e-129 366/418(87%) 366/418(87%) C. roseus AF005238 446.0 bits (1614) 5.3e-129 368/427 (86%) 370/427 (86%) S. bakko AB003377 444.9 bits (1610) l.le-128 366/421 (86%) 366/421 (86%) arroz AFO 12896 425.8 bits (1541) 5.1e-121 357/418(85%) 357/418(85%) V. unguiculata AF022389 425.8 bits (1541) 5.1ß-121 857/418(85%) 357/418(85%) cebada El 0542 413.4 bits (1496) 1.2e-ll5 356/427 (83%) 356/427 (83%) S. tuberosum X74461 405.9 bits (1469) 3.5c-115 353/427(82%) 353/427 (82%) zanahoria D45420 408.4.4 bits (1478) 3.3e-114 354/427 (82%) 354/427 (82%) maíz X80042 400.1 bits (1448) 2.3e-113 348/421 (82%) 348/421 (82%) arroz DI 7760 403.4 bits (1460) 3.7e-112 352/427 (82%) 352/427 (82%) Creinhar tii U27120 373.6 bits (1352) 5.0e-103 340/427 (79%) 340/427 (79%) Humano ARF3 33384 367.5.5 bits (1330) 7.1e-101 334/419(79%) 334/419(79%) cerebro de ratón ARF3 D87900 355.3 bits (1286) í.3e-97 330/421 (78%) 330/421 (78%) Bovino J03794 342.6 bits (1240) 1.4e-95 324/419(77%) 324/419(77%) Un ADNc de longitud completa que codifica ARF se aisló seleccionado la biblioteca de ADNc de N. benthamina por hibridización de colonias usando una sonda KS+/Nb ARF #3 de N. Benthamiana marcada con 32P. La hibridización se lleva a cabo a 42°C durante 48 horas en 50% de formamida, 5X SSC, regulador de fosfato 0.02 M, solución de Denhart 5X, y 0.1 mg/ml de ADN de timo de becerro cortado. Los filtros se lavaron a 65°C en 0.1X SSC, 0.1% de SDS antes de la auto radiografía.

Aislamiento rápido de los ADNc que codifican ARF, proteínas que enlazan GTP de arroz, cebada, maíz, soja y otros vegetales Los ADCc de longitud completa que contienen bibliotecas de arroz, cebada, maíz, soja y otros cultivos importante se obtienen de fuentes públicas y privadas o pueden prepararse de los ARNm vegetales. Los ADNc se insertan en vectores virales o en vectores de subclonación pequeños tales como pBluescript (Strategene) , pUC18, M13 ó pBR322. Las bacterias transformadas (E. coli ) se siembran después en placas de petri grandes o placas de bioensayo que contienen el medio y antibiótico apropiados. Los clones individuales se seleccionan usando un levantador de colonias robótico y se disponen en placas microtítulo de 96 pozos. Los cultivos se incuban a 37°C hasta que las células transformadas alcanzan la fase log. Se retiran alícuotas para preparar patrones de glicerol para almacenamiento a largo plazo a -80°C. Lo restante del cultivo se usa para inocular una placa microtítulo de 96 pozos adicional que contiene medio selectivo y se cultiva durante la noche. Los ADN se aislan de los cultivos y se almacenan a -20°C. Usando una unidad robótica tal como la Qbot (Genetix) , los transformantes o los ADN de E. coli se redisponen a alta densidad sobre filtros de nylon o porta-objetos de vidrio. Los ADNc de longitud completa que codifican las ARF de arroz, cebada, maíz, soja, y otros cultivos importantes se aislan seleccionando los diversos filtros de porta-objetos por hibridización usando una sonda de KS+/Nb ARF #3 de N. benthamiana fluorescente o marcada con 32P, o inserto 740 AT #120 Notl de Arabidopsis .

Aislamiento rápido de clones genómicos que codifican ARF, proteínas que enlazan GTP de arroz, cebada, maíz, soja y otros vegetales. Las bibliotecas genómicas que contienen secuencias de arroz, cebada, maíz, soja y otros cultivos importantes se obtienen de fuentes públicas y privadas como se preparan de los ADC genómicos vegetales. Los clones de BAC que contienen los genomas vegetales completos se han construido y organizado en orden de traslapamiento mínimo. Los BAC individuales se cortan en fragmentos de 500-1000 bp y se clonan directamente dentro de vectores virales. Aproximadamente 200-500 clones que cubren completamente un BAC completo formaran una sub-biblioteca de vector viral BAC. Estas bibliotecas pueden almacenarse como patrones de glicerol bacterianos a -80°C y como ADN a -20°C. Los clones genómicos se identifican sondeando primero filtros de los BAC con una sonda KS+/Nb ARF #3 de N. benthaniana fluorescente o marcada con 32P, o inserto 740 AT #120 Notl de Arabidopsi s marcada con 32P. Las BAC que se hibridizan a las sondas se seleccionan y su subbiblioteca vector viral BAC correspondiente se usa producir el AR? infeccioso. Los vegetales que se transfectan con la sub-biblioteca de BAC se seleccionan por pérdida de fusión (por ejemplo, vegetales atrofiados) . Los insertos de estos clones o sus AD? de plásmido correspondientes se caracterizan por secuenciación didesoxi. Esto proporciona un método rápido para obtener la secuencia genómica para los ARF vegetales o proteínas que enlazan GTP.

Aislamiento rápido de los AD?c que codifican el factor de ribosilación de ADP humano Las bibliotecas que contienen los AD?c de humano de longitud completa de organismos tales como cerebro, hígado, mama, pulmón, etc., se obtienen de fuentes públicas y privadas y se preparan de los AR?m humano. Los AD?c se insertan en vectores virales o en vectores de subclonación pequeños tales como pBluescript (Strategene) , pUC18, M13 o pBR322. Las bacterias transformadas (E. coli ) se siembran después en placas de petri grandes o placas de bioensayo que contienen el medio y antibiótico apropiados. Los clones individuales se seleccionan usando un levantador de colonias robótico y se disponen en placas microtítulo de 96 pozos. Los cultivos se incuban a 37 °C hasta que las células transformadas alcanzan la fase log. Se retiran alícuotas para preparar patrones de glicerol para almacenamiento a largo plazo a -80°C. Lo restante del cultivo se usa para inocular una placa microtítulo de 96 pozos adicional que contiene medio selectivo y se cultiva durante la noche. Los ADN se aislan de los cultivos y se almacenan a -20°C. Usando una unidad robótica tal como la Qbot (Genetix) , los transformantes o los ADN de E. coli se redisponen a alta densidad sobre filtros de nylon o nitrocelulosa o portaobjetos de vidrio. Los ADNc de longitud completa que codifican las ARF de arroz, cebada, maíz, soja, y otros cultivos importantes se aislan seleccionando los diversos filtros de portaobjetos por hibridización usando una sonda de KS+/Nb ARF #3 de N. benthamiana fluorescente o marcada con 32P, o inserto 740 AT #120 Notl de Arabidopsi s .

Construcción de un vector viral que contiene los AD?c humanos Un clon ARF 5 que contiene insertos de ácido nucleico de una biblioteca de ADNc de cerebro humano (Bobak et al . , Proc . Nati . Acad. Su . USA 86:6101-6105 (1989)) se aisló por reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando los siguientes oligonucleótidos: HARFMIA, 5' TAC CTA GGG CAA TAT CTT TGG AAA CCT TCT CAA G 3' (hacia el extremo 5') (SEC. DE IDENT. NO: 65), HARFK181X, 5' CGC TCG AGT CAC TTC TTG TTT TTG AGC TGA TTG TTG GCC AG 3' (hacia el estremo 3') (SEC. DE IDENT. NO: 66) . La polimerasa de paso en la reacción se inactivo usando fenol/cloroformo. Los productos de PCR se clonan directamente dentro del sitio Xhol, Avrll de TTOIA.

EJEMPLO 12 Silenciamiento de fitoeno de saturasa en nicotiana benthamiana usando un vector tobravirus El tobravirus de cascabel del tabaco (TRV) es un virus de ARN de hebra sencilla, de sentido positivo bipartita. El TRB es capaz de infectar un amplio rango de huéspedes vegetales, que incluyen Arabidopsis thaliana (datos no publicados) , especies Nicotiana , Brassica campestris, Capsicum annuum, Chenopodium amaranticolor, Glycine max, Lycopersicon esculentum, Narcissus pseudonarcissus , Petunia X hybrida , Pisum sativum, Solanum tuberosum, Spinacia olerácea , Vi ci a faba , (http://www.ncbi.nlm.nih.gOv/ICTVdb/ICTVdB/72010004.htm#SymptHost ) TRV RNA-1 codifica proteínas involucradas en la replicación viral (Replicasa, 134/194 kDa) y movimiento (Proteína de Movimiento (mp) 29 kDa) , así como Proteína Rica en Cisteina ((CRP) 16 kDa (FIGURA 21. ). Una mutante mejorada de TRV RNA-1, pLSB-1, se aisló de un vegetal de N. benthamiana que había sido inoculada con un extracto de sabia de paso PpK20 (MacFarlane and Popovich. Effici ent expression of foreign proteins in roots from tobravirus vectors . Virology, 267, 29- 35 (2000)) de otro vegetal de N. benthamiana . Los vegetales inoculados con pLSB-1 R?A-1 presentan silenciamiento del gen más extensamente en comparación con aquellos inoculados con PpK20 RNA-1 . Los viriones se purificaron del tejido de hoja por un método de precipitación PEG (Gooding GV Jr, Hebert TT (1967) A simple technique for purification of tobacco mosaic virus in large quanti ties. Phytopathology 57 (11) : 1285) , el AR? se aisló usando el Rneasy Mini Kit (Qiagen®) , después el AD?c se hizo usando el cD?A Synthesis System (Gibco BRL® usando el oligonucleótido 5'- TTAATTAAGCATGCGGATCCCGTACGGGCGTAATAACGCTTACGTAGGCGAGGGGTTTTAC -3'. El TRV R?A-1 de longitud completa se amplificó por PCR usando los oligonucleótidos ATGAAGAGCATGCTAATACGACTCACTATAGATAAAACATTTCAATCCTTTGAACGC-3 ' (hacia el extremo 5') y 5'- TTCATCTGGATCCCGGGCGTAATAACGCTTACGTAGGCG-3' (hacia el extrooqojjjjjjjjjhjemo 3') y se clono dentro de pUC18 en los 14: sitios Sphl/ Bam Hl . Esta construcción de TRV RNA-1, pLSB-1, se verificó por secuenciación de didesoxinucleótido y se encontró tener 29 mutaciones de punto en comparación con la secuencia publicada para PpK20 RNA-1 (Visser, P.B. and Bol, J.F. (1999). ACCESSION AF166084) . Todas estas mutaciones de punto estén en el gen replicasa, y muchas codifican pos sutituciones de aminiácidos. La secuencia de la secuencia viral TRV RNA-1 mutante contenida dentro de pLSB-1 es como sigue: 5'- ATAAAACATTTCAATCCTTTGAACGCGGTAGAACGTGCTAATTGGAG?TGGTG AGAACGCGGTAGAACGTACTTATCACCGACAGTTTTATTITGTTTTTCITGTT<^ TTAATCTATCCAGCTTAGTACCGAGTGGGGGAAAGTGACTGGTGTGCCTAAAAC CTTT CTTTGATACTTTGTAAAAATACATACAGATACAATGGCGAACGGTAACTT CAAGTTGTCTCAATTGCTCAATGTGGACGAGATGTCTGCTGAGCAGAGGAGTCA TTGCITGGACGTGATGCTGACTAAACCTGATTGTGAGATCGGGCAAATGATGCAA AGAGTTGTTGTTGATAAAGTCGATGACATGATTAGAGAAAGAAAGACTAAAGAT CCAGTGATTGTTCATGAAGTTCTTTCTCAGAAGGAACAGAACAAGTGGATGGAA ATTTATCCTGAATTCAATATCGTGTTTAAAGACGACAAAAACATGGTTCATGGG TTTGCGGCTGCGGAGCGAAAACGACAAGCITGATTGCTTITAGATAGAGTGCCGG CTCTGCAAGAGGTGGATGACATCGGTGGTCAATGGTCGTTTTGGGTAACTAGAG GTGAGAAAAGGATTCATTCCTGTTGTCCAAATCTAGATATTCGGGATGATCAGA GAGAAATTTCTCGACAGATATTTCTTACTGCTATTGGTGATCAAGCTAGAAGTG GTAAGAGACAGATGTCGGAGAATGAGCTGTGGATGTATGACCAATTTCGTGAAA ATATTGCTGCGCCTAACGCGGTTAGGTGCAATAATACATATCAGGGTTGTACAT GTAGGGGTTTTTCTGATGGTAAGAAGAAAGGCGCGCAGTATGCGATAGCTCTTC ACAGCCTGTATGACTTCAAGTTGAAAGACTTGATGGCTACTATGGTTGAGAAGA AAACTAAAGTCH3TGCATGCTGCTATGCITGTTGCTCCTGAAAGTATGTTAGTGGA CGAAGGTCCATTACCTTCTGTTGACGGTTACTACATGAAGAAGAACGGGAAGAT CTATTTCGGTTTTGAGAAAGATCCITCCTTTTCTTACATTCATGACTGGGAAGAG TACAAGAAGTATCTACTGGGGAAGCCAGTGAGTTACCAAGGGGATGTGTTCTAC TTCGAACCGTGGCAGGTGAGAGGAGACACAATGCTTTTTTCGATCTACAGGATA GCTGGAGTTCCGAGGAGGTCTCTATCATCGCAAGAGTACTACCGAAGAATATAT ATCAGTAGATGGGAAAACATGGTTGTTGTCCCAATTTTCGATCTGGTCGAATCA ACGCGAGAGTTGGTCAAGAAAGACCTGTTTGTAGAGAAACAATTCATGGACAA GTGTTTGGATTACATAGCTAGGTTATCTGACCAGCAGCTGACCATAAGCAATGT TAAATCATACTTGAGTTCAAATAATTGGGTCITATTCATAAACGGGGCGGCCGT GAAGAACAAGCAAAGTGTAGATTCTCGAGATTTACAGTTGTTGGCTCAAACTTT GCTAGTGAAGGAACAAGTGGCGAGACCTGTCATGAGGGAGTTGCGTGAAGCAA TTCTGACTGAGACGAAACCTATCACGTCATTGACTGATGTGCTGGGTTTAATATC AAGAAAACTGTGGAAGCAGTTTGCTAACAAGATCGCAGTCGGCGGATTCGTTGG CATGGTTGGTACTCTAATTGGATTCTATCCAAAGAAGGTACTAACCTGGGCGAA GGACACACCAAATGGTCCAGAACTATGTTACGAGAACTCGCACAAAACCAAGG TGATAGTATTTCTGAGTGTTGTGTATGCCATTGGAGGAATCACGCTTATGCGTCG AGACATCCGAGATGGACTGGTGAAAAAACTATGTGATATGTTTGATATCAAACG GGGGGCCCATGTCTTAGACGTTGAGAATCCGTGCCGCTATTATGAAATCAACGA TTTCTTTAGCAGTCTGTATTCGGCATCTGAGTCCGGTGAGACCGTRRTACCAGAT TTATCCGAGGTAAAAGCCAAGTCTGATAAGCTATTGCAGCAGAAGAAAGAAAT CGCTGACGAGTTTCTAAGTGCAAAATTCTCTAACTATTCTGGCAGTTCGGTGAGA ACTTCTCCACCATCGGTGGTCGGTTCATCTCGAAGCGGACTGGGTCTGTTGTTGG AAGACAGTAACGTGCTGACCCAAGCTAGAGTTGGAGTTTCAAGAAAGGTAGAC GATGAGGAGATCATGGAGCAGTTTCTGAGTGGTCTTATTGACACTGAAGCAGAA ATTGACGAGGTTGTTTCAGCCTTTTCAGCTGAATGTGAAAGAGOGGAAACAAGC GGTACAAAGGTGTTGTGTAAACCTTTAACGCCACCAGGATTTGAGAACGTGTTG CCAGCTGTCAAACCTTTGGTCAGCAAAGGAAAAACGGTCAAACGTGTCGATTAC TTCCAAGTGATGGGAGGTGAGAGATTACCAAAAAGGCCGGTTGTCAGTGGAGA CGATTCTGTGGACGCTAGAAGAGAGTTTCTGTACTACTTAGATGCGGAGAGAGT CGCTCAAAATGATGAAATTATGTCTCTGTATCGTGACTATTCGAGAGGAGTTATT CGAACTGGAGGTCAGAATTACCCGCACGGACTGGGAGTGTGGGATGTGGAGAT GAAGAACTGGTGCATACGTCCAGTGGTCACTGAACATGCTTATGTGTTCCAACC AGACAAACGTATGGATGATTGGTCGGGATACTTAGAAGTGGCTGTGTGGGAACG AGGTATGTTGGTCAACGACTTCGCGGTCGAAAGGATGAGTGATTATGTCATAGT ?GCGATCAGACGTATCTTTGCAATAACAGGTTGATCTTGGACAATTTAAGTGCC CGGGATCGAGGACCAGTTAACTGTTC?TTGAATTAGTGGACGGTGTACCTGGTT GTGGTAAGTCGACAATGATTGTCAACTCAGCTAATCCTTGTGTCGATGTGGTTCT CTCTACTGGGAGAGCAGCAACCGACGACTTGATCGAGAGATTCGCGAGCAAAG GTTTTCCATGCAAATTGAAAAGGAGAGTGAAGACGGTTGATTCTTTTTTGATGC ATTGTGTCGATGGTTCTTTAACCGGAGACGTGTTGCATTTCGACGAAGCTCTCAT GGCCCATGCTGGTATGGTGTACG?TGCGCTCAGATAGCTGGTGCTAAACGATGT ATCTGTCAAGGAGATCAGAATCAAATTTCTTTCAAGCCTAGGGTATCTCAAGTT GATTTGAGGTTTTCTAGTCTGGTCGGAAAGTTTGACATTGTTACAGAAAAAAGA GAAACTTACAGAAGTCCAGCAGATGTGGCTGCCGTATTGAACAAGTACTATACT GGAGATGTCAGAACACATAACGCGACTGCTAATTCGATGACGGTGAGGAAGAT TGTGTCTAAAGAACAGGTTTCGGGGAAGCCCGGTGCTCAGTACATAACTTTCCTT CAGTCTGAGAAGAAGGAGTTGGTAAATTTGTTGGCATTGAGGAAAGTGGCAGCT AAAGTGAGTACAGTACACGAGTCGCAAGGAGAGACATTCAAAGATGTAGTCCT AGTCAGGACGAAACCTACGGATGACTCAATCGCTAGAGGTCGGGAGTACTTAAT CGTGGCGTTGTCGCGTCACACACAATCACTTGTGTATGAAACTGTGAAAGAGGA CGATGTAAGCAAAGAGATCAGGGAAAGTGCCGCGCITACGAAGGCGGCTTTGG CAAGATTTTTTGTTACTGAGACCGTCHTATGACGGTTTCGGTCTAGGTTTGATGT CTTTAGACATCATGAAGGGCCTTGCGCCGTTCCAGATTCAGGTACGATTACGGA CTTGGAGATGTGGTACGACGCTTTGTTTCCGGGAAATTCGTTAAGAGACTCAAG CCTAGACGGGTATTTGGTGGCAACGACTGATTGCAATTTGCGATTAGACAATGT TACGATCAAAAGTGGAAACTGGAAAGACAAGTTTGCTGAAAAAGAAACGTTTC TGAAACCGGTTATTCGTACTGCTATGCCTGACAAAAGGAAGACTACTCAGTTGG AGAGTTTGTTAGCATTGCAGAAAAGGAACCAAGCGGCACCCGATCTACAAGAA AATGTGCACGCGACAGTTCTAATCGAAGAGACGATGAAGAAGCTGAAATCTGTT GTCTACGATGTGGGAAAAATTCGGGCTGATCCTATTGTCAATAGAGCTCAAATG GAGAGATGGTGGAGAAATCAAAGCACAGCGGTACAGGCTAAGGTAGTAGCAGA TGTGAGAGAGTTACATGAAATAGACTATTCGTCTTACATGTATATGATCAAATCT GACGTGAAACCTAAGACTGATTTAACACCGCAATTTGAATACTCAGCTCTACAG ACGGTTGTGTATCACGAGAAGTTGATCAACTCGTGGTTCGGTCCAATTTTCAAAG AAATTAATGAACGCAAGTTGGATGCTATGCAACCACATTTTGTGTTCAACACGA GAATGACATCGAGTGATTTAAACGATCGAGTGAAGTTCTTAAATACGGAAGCGG CTTACGACTTTGTTGAGATAGACATGTCTAAATTCGACAAGTCGGCAAATCGCTT CCATTTACAACTGCAGCTGGAGATTTACAGGTTATTTGGGCTGGATGAGTGGGC GGCCTTCCTTTGGGAGGTGTCGCACACTCAAACTACTGTGAGAGATATTCAAAA TGGTATGATGGCGCATATTTGGTACCAACAAAAGAGTGGAGATGCTGATACTTA TAATGCAAATTCAGATAGAACACTGTGTGCGCTCTTGTCTGAATTACCATTGGA GAAAGCAGTCATGGTTACATATGGAGGAGATGACTCACTGATTGCGTTTCCTAG AGGAACGCAGTTTGTTGATCCGTGTCCAAAGTTGGCTACTAAGTGGAATTTCGA GTGCAAGATTTTTAAGTACGATGTCCCAATGTTTTGTGGGAAGTTCTTGCTTAAG ACGTCATCGTGTTACGAGTTCGTGCCAGATCCGGTAAAAGTTCTGACGAAGTTG GGGAAAAAGAGTATAAAGGATGTGCAACATTTGGCCGAGATCTACATCTCGCTG AATGATTCCAATAGAGCTCTTGGGAACTACATGGTGGTATCCAAACTGTCCGAG TCTGTTTCAGACCGGTATTTGTACAAAGGTGATTCTGTTCATGCGCTTTGTGCGC TATGGAAGCATATTAAGAGTTTTACAGCTCTGTGTACATTATTCCGAGACGAAA ACGATAAGGAATTGAACCCGGCTAAGGTTGATTGGAAGAAGGCACAGAGAGCT GTGTCAAACTTTTACGACTGGTAATATGGAAGACAAGTCATTGGTCACCTTGAA GAAGAAGACTTTCGAAGTCTCAAAATTCTCAAATCTAGGGGCCATTGAATTGTT TGTGGACGGTAGGAGGAAGAGACCGAAGTATTTTCACAGAAGAAGAGAAACTG TCCGAAATCATGTTGGTGGGAAGAAGAGTGAACACAAGTTAGACGTTTTTGACC AAAGGGATTACAAAATGATTAAATCTTACGCGTTTCGAAAGATAGTAGGTGTAC AACTAGTTGTAACATCACATCTACCTGCAGATACGCCTGGGTTCATTCAAATCG ATCTGTTGGATGCGAGACTTACTGAGAAAAGAAAGAGAGGAAAGACTATTCAG AGATTCAAAGCTCGAGCTTGCGATAACTGTTCAGTTGCGCAGTACAAGGTTGAA ?ACAGTATTTCCACACAGGAGAACGTACTTGATGTCTGGAAGGTGGGTTGTATT TCTGAGGGCGTTCCGGTCTGTGACGGTACATACCCTTTCAGTATCGAAGTGTCGC TAATATGGGTTGCTACTGATTCGACTAGGCGCCTCAATGTGGAAGAACTGAACA GTTCGGAT?ACATTGAAGGCGATTTTACCGATCAAGAGGTTTTCGGTGAGTTCAT GTCTTTGAAACAAGTGGAGATGAAGACGATTGAGGCGAAGTACGATGGTCCTTA CAGACCAGCTACTACTAGACCTAAGTCATTATTGTCAAGTGAAGATGTTAAGAG AGCGTCTAATAAGAAAAACTCGTCTTAATGCATAAAGAAATTTATTGTCAATAT GACGTGTGTACTCAAGGGTTGTGTGAATGAAGTCACTGTTCTTGGTCACGAGAC GTGTAGTATCGGTCATGCTAACAAATTGCGAAAGCAAGTTGCTGACATGGTTGG TGTCACACGTAGGTGTGCGGAAAATAATTGTGGATGGTTTGTCTGTGTTGTTATC AATGATTTTACTTTTGATGTGTATAATTGTTGTGGCCGTAGTCACCTTGAAAAGT GTCGTAAACGTGTTGAAACAAGAAATCGAGAAATTTGGAAACAAATTCGACGA AATCAAGCTGAAAACATGTCTGCGACAGCTAAAAAGTCTCATAATTCGAAGACC TCTAAGAAGAAATTCAAAGAGGACAGAGAATTTGGGACACCAAAAAGA11111 AAGAGATGATGTrCCTTTCGGGATTGATCGTTtGTTTGCTTTTTGATTTTATTTTA TATTGTTATCTGTTTCTGTGTATAGACTGTTTGAGATTGGCGCTTGGCCGACTCA TTGTCTTACCATAGGGGAACGGACTTTGTTTGTGTTGTTATTI ATTTGTATpTA TTAAAATTCTCAATGATCTGAAAAGGCCTCGAGGCTAAGAGATTATTGGGGGGT GAGTAAGTACTTTTAAAGTGATGATGGTTACAAAGGCAAAAGGGGTAAAACCC CTCGCCTACGTAAGCGTTATTACGCCC-3' ARN-2 codifica la proteína capside y dos proteínas no estructurales, 2b y 2c (FIGURA 21.A). Una construcción TRV RNA-2 que expresa GFP se derivó de un clon de longitud completa de ARN2 de aislado de TRV PpK20 (Mueller et al 1997. Journal of General Virology, 78, 2085-2088 (1997), MacFarlane and Popovich. Efficient expression of foreign proteins in roots from tobravirus vectors. Virology, 267, 29-35 (2000) ) . Esta construcción TRV-GFP tiene el gen 2c de TRV RNA-2 reemplazo con el promotor de proteína de recubrimiento del virus de encafecimiento temprano del chícharo (PEBV) enlazado a GFP (MacFarlane and Popovich, 2000) . Esta construcción TRV-GFP se modificó adicionalmente reemplazando el gen GFP con sitios de clonación Pst I y Not I para producir el plásmido pK20-2b-P/N. El gen de fitoeno de saturasa (PDS) de N. benthamiana se amplificó por PCR del plásmido pWPF187 usando «&é&A*&** los siguientes oligonicleótidos 5'- TGGTTCTGCAGTTATGCATGCCCCAAATTGGACTTG-3' (hacia el extremo 5') y 5'-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAAACTACGCTTGCTTCTG-3' (hacia el extremo 3'). Este producto de PCR se subclonó después dentro de pK20-2b-P/N en la orientación positiva. La construcción resultante, TRV-PDS (FIGURA 21.B) se linearizó con Sma I y se transcribió usando T7 ARN polimerasa (Ambion mMessage mMachine) . La copia de ARN2 se mezcló con copias de un clon de longitud completa de TRV-RNA-1 (pLSB-1) . El TRV-PDS se inoculó sobre N. benthamiana . Después de 6-7 días, se empezaron a desarrollar áreas cloróticas en las hojas superiores que emergen. Después de 8-10 días, estas áreas cloróticas se desarrollaron en áreas blancas. Las muestras de vegetales infectados con TRV-PDS se analizaron usando HPLC. El análisis de HPLC reveló un nivel gramáticamente elevado de fitoeno en los vegetales infectados con TRV-PDS en comparación con un control no inoculado.

EJEMPLO 13 Identificación de secuencias de nucleótidos involucradas en la regulación del desarrollo vegetal por inhibición citoplasmática de la expresión de lgen en una orientación antisentido usano ARN derivado de virus (receptor acoplado a proteína G) Este ejemplo denuevo demuestra que un vector viral ARN episomal puede usarse para manipular deliberadamente una ruta de transducción de señales en vegetales. Además, los resultados sugieren que la copia antisentido de Arabidopsis puede desconectar la expresión del gen N. benthamiana . Una biblioteca de AD?c de Arabidopsis thaliana parcial se colocó bajo el control transcripcional de un promotor subgenómico de tobamovirus en un vector viral de AR?. Las colonias de E. coli transformadas se levantaron automáticamente usando un robot Flexys y se transfirieron a un bloque de fondo plano de 96 pozos que contiene caldo sobresaliente (TB) Amp 50 ug/ml. Aproximadamente 2000 AD? de plásmido se aislaron de cultivos durante la noche usando un BioRobot y los AR? infecciosos de 430 clones independientes se aplicaron directamente a los vegetales. De una a dos semanas después de la inoculación, los vegetales de Nicotiana benthamiana transfectados se observaron visualmente por cambios en las velocidades de crecimiento, morfología y color. Un conjunto de vegetales transfectados con 740 AT #88 (FIGURA 22) desarrollaron un fenotipo blanco sobre el tejido foliar infectado. El análisis de secuencia de AD? reveló que este clon contiene una estructura de lectura abierta (ORF) de receptor acoplado a proteína G de Arabidopsis en la orientación antisentido.

Secuenciación de ADN y análisis de computadora. Un fragmento 758 bp Notl de 740 AT#88 que contiene el AD?c de receptor acoplado a proteína G se caracterizó. La secuenciación de nucleótidos de 740 AT #88 se llevo a cabo por terminación didesoxi usando plantillas de hebra doble. Las comparaciones de análisis de secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos se realizó usando programas Strider, PCGE?E y ?CBI Blast de AD?. La FIGURA 23 muestra la secuencia de nucleótidos parcial (SEC. DE IDE?T. ?O: 69) y la secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDE?T. ?O: 70) del inserto 740 AT #88. La secuencia de nucleótidos de 740 AT #88 se comparó con AD?c de Brassica rapa L35812 (FIGURA 24, SEC. DE IDE?T. NOS: 71 y 72), 91% identidades y positivas; y el X07797 de ADNc de rodoxina de pulpo (FIGURA 25, SEC. DE IDENT. NOS: 73 y 74), 68% identidades y positivos. La homología de la ADN que codifica rodoxina de rodoxina vegetal y animal indica que los genes de un reino pueden inhibir la expresión del gen de otros reinos. La secuencia de aminoácidos derivados de 740 AT #88 se comparó con P31356 de rodopsina de pulpo (FIGURA 26, SEC. DE IDENT. Nos: 75-77), 65% de identidades y positivos. La Tabla 8 muestra la comparación de secuencia de aminoácidos de 740 AT #88 con D. discoideum y rodopsina de pulpo: 58-62% de identidades y 63-65% de positivos.

Tabla 8. Comparación de secuencia de aminoácido de AT#88 Clcfn Cuenta Valor p Identidades Positivos A., thaliana AC004625 430 (151.4 bits) 4.40E-52 70/70 ( 1 0%) 70/70 (100%) D. discoide m ANNEX1N VII P24639 246 (86.6 bits) 2.60E-20 58/98 (59%) 62/98 (63%) D. discoideum ANNEXIN Vil X60270 245 (86.2 bits) 3.00E-20 57/91 (62%) 60/91 (65%) Octopus rhodopsin X07797 235 (82.7 bits) 4.00E- 19 50/85 (58%) 54/85 (63%) EJEMPLO 14 Identificación de secuencias de nucleótidos que contienen una estructura de lectura abierta de proteína ribosomal S18 de Arabi dopsi s De una dos semanas después de la inoculación, los vegetales de Nicotiana benthamiana transfectados se observaron visualmente por cambios en las velocidades de crecimiento, morfología y color, un conjunto de vegetales transfectados con 740 AT #377 (FIGURA 27) se atrofiaron severamente. El análisis de secuencia ADN (FIGURA 28, SEC. DE IDENT. NO: 78) reveló que este clon contiene una estructura de lectura abierta (ORF) de proteína ribosomal S18 de Arabidopsis en la orientación antisentido.

EJEMPLO 15 Identificación del gen de proteina ribosomal L19 involucrado en la regulación del crecimiento vegetal por la inhibición citoplasmática de la expresión del gen usando ARN derivado de virus . De una dos semanas después de la inoculación, los vegetales de Nicotiana benthamiana transfectados se observaron visualmente por cambios en las velocidades de crecimiento, morfología y color, un conjunto de vegetales transfectados con 740 AT #2483 (FIGURA 29) se atrofiaron severamente. El análisis de secuencia ADN (FIGURA 30, SEC. DE IDENT. NO: 79) reveló que este clon contiene una estructura de lectura abierta (ORF) de proteína ribosomal L18 de Arabidopsis en la orientación antisentido. La secuencia de nucleótidos de 740 AT #2483 presentó un alto grado de homología (77-78% de identidades y positivos) con los genes de proteínas ribosomales L19 de vegetales (Tabla 9) . Además, la secuencia de nucleótidos de 740 AT #2483 presento un alto grado de homología (71-79% de identidades y positivos) con genes de proteínas ribosomales L19 de levadura, insectos y humanos (Tabla 9) . La comparación de la secuencia de aminoácidos de 740 AT #2483 con proteína ribosomal de humano, insecto y levadura L19 muestra 38-88% de identidades y 61-88% de positivos (Tabla 10) . La alta homología de los ADN que codifican la proteína L19 ribosomal de humano vegetal, levadura, insecto indica que los genes de un organismo pueden inhibir la expresión del gen de un organismo de otro reino.

Tabla 9. Comparación de secuencia de nucleótido de AT#2483 Clan Cuenta Valor p Identidades Positivos A., thaliana AF075597 389 (107.5 bits) 2.60E-38 101/130 (77%) 101/130 (77%) Proteína L19 D21304 ribosomal para ARN de arroz 198 (54.7 bits) 2.20E-10 50/64 (78%) 50/64 (78%) Proteína L19 mRNA 132181 de D. melanogaster 185 (51.1 bits) 3.40E-09 49/64 (76%) 49/64 (76%) N. tubaaim L1 mRNA Z3172Ü 194 (53.6 bits) 3.50E-05 50/64 (78%) 50/64 (78%) Proteína L 9 M62952 ribosomal de Mus musculus 166 (45.9 bits) 4.40E-04 42/53 (79%) 42/53 (79%) Human ribosomal prolein Ll 9 S56985 153 (42.3 bits) 8.30E-02 45/63 (71%) 45/63 (71%) Proteína L19556985 ribosomal humana Cp Tabla 10. Comparación de secuencia de aminoácido Valor p Identidades P2§UÍVQS O* , h ^7?58 bits) 5^09 12/31(380/0 ^ (38%) Proteína L19042699 ribosoma. de 5. pombe 56 258 s ) ^ g (gJ%) 5 8 83 /o Prote.na L19556985 ribosoma. humana L1 PMIIß 77 * b S g 20E.Q9 , 5 , 8 (83%) 83 Proteína L19 P22908ribosoma.de M musculus "< ** j.soE-OS 16/18(88%) 16/18(88/.) Proteína L19 nRNA L32181 ribosomal de D.melanogaster 70 (36.3 bits) (Jl (Jl Secuenciación de ADN y análisis de computadora El fragmento bp Notl de 740 AT#909 que contiene el ADNc de proteína L19 ribosomal se caracterizó. Las secuenciación de nucleótidos de 740 AT #909 (FIGURA 31) se llevó a cabo por terminación didesoxi usando plantillas de hebra doble. Las comparaciones del análisis de secuencia de nucleótidos y de secuencia de aminoácidos se realizó usando programas Strider, PCGENE y NCBI Blast de ADN. La FIGURA 32 muestra una alineación de nucleótidos de 740 AT #909 con la proteína L19 ADNc ribosomal S5 6985 humana (SEC. DE IDENT. NOS: 80 y 81 respectivamente). La FIGURA 33 (SEC. DE IDENT . NOS: 82-84) muestra la alineación de secuencia de aminoácidos de 740 AT #909 con la proteína L19 ribosomal P141118 60S humana. La Tabla 11 muestra la comparación de secuencias de nucleótidos de 740 AT #909 con vegetal drosofila, levadura y humano: 63-79% de identidades y positivos. La Tabla 12 muestra la comparación de aminoácidos de 740 AT #909 con la proteína ribosomal L19 de vegetal humano ratón levadura, insecto: 65-88% de identidades y 80-92% de positivos.

Tabla 12. Comparación de secuencia nucleótido 740 AT #909 Ol EJEMPLO 16 Construcción de un vector de inhibición citoplasmático en un sentido positivo que contiene secuencia de nucleótidos de cremayera homeobox-leucina de HAT7 de A. thaliana Una biblioteca de ADNc CD4-13 de Arabidopsis thaliana se digirió con Notl . Los fragmentos de AD? entre 500 y 1000 bp se aislaron por elución completa y se subclonaron dentro del sitio Notl de pBS740. Las células competentes de E. coli C600 se transformaron con la biblioteca pBS740 AT y las colonias que contienen las secuencias de AD?c de Arabidopsis se seleccionaron en LB Amp 50 µg/ml.

Aislamiento de un gen que codifica cremayera homeobox -leucina HAT7 De una a dos semanas después de la inoculación, los vegetales de Nicotiana benthamiana transfectados se observaron visualmente por cambios en las velocidades de crecimiento, morfología o color. Los vegetales transfectados con 740 AT #855 (FIGURA 34) se atrofiaron moderadamente. El plásmido 740 AT #855 contiene el TMV-Ul 126-, 193-, y las ORF de 30 kDa, el gen de proteína de recubrimiento TMV-U5 (U5 cp) , el promotor T7, un fragmento CD4-13 ?otl de Arabidopsis thaliana, y parte del plásmido pUC19. El promotor subgenómico TMV-Ul ubicado dentro de la hebra menos de la ORF de 30 kDa controla la síntesis del AR? subgenómico CD4-13.

Secuenciación de ADN y análisis de computadora El fragmento Notl de 740 AT #855 se caracterizó: las comparaciones del análisis de secuencia del nucleótido y secuencia de aminoácidos se realizó usando programas Strider, PCGE?E y ?CBI Blast de AD? 740 AT #855 contiene secuencia de AD?c de cremayera homeobox-leucina HAT 7 de A. thaliana . La alineación de secuencia de nucleótido de 740 AT #855 y la ORF de proteína homeobox HAT7 de Arabidopsis thaliana (UO9340) se comparó. La FIGURA 36 (SEC. DE IDE?T. NOS: 85-87) muestra las secuencias de nucleótidos de 740 #855 y ORF de proteína homeobox HAT7 de A. thaliana, y la secuencia de aminoácidos de las ORF de proteína homeobox HAT7 de A. thaliana . El resultado muestra que 740 AT#855 contiene una región 3' no traducida (UTR) de la ORF de proteína homeobox HAT7 de A. thaliana en una orientación positiva, inhibida así la expresión de la proteína homeobox HAT7 en la N. benthamiana transfectada. La Tabla 13 muestra la comparación de la secuencia de nucleótidos de 740 AT #855 con A. thaliana, rata y humano: 65-98% de identidades y positivos.

Tabla 13. Comparación de secuencia nucleótido 740 AT #805 I-» EJEMPLO 17 Identificación de secuencias de nucleótidos humanos involucrados en la relación del crecimiento vegetal por inhibición citoplasmática de la expresión del gen usando ARN derivado de virus que contiene secuencias de nucleótidos humanas Una biblioteca de ADNc de cerebro humano se obtiene de fuentes públicas y probadas o se prepara de los ARNm humanos. Los ADNc se insertan en vectores virales o en vectores de subclonación pequeños y los insertos de ADNc se aislan de los vectores de clonación con las enzimas apropiadas, se modifican y los enlazantes Notl se unen a los extremos romo de AD?c. Los insertos de AD?c humanos se subclonan dentro del sitio Notl de pBS740. Las células competentes de E. coli C600 se transforman con la sub-biblioteca pB740 y las colonias que contienen las secuencias de AD?c humano se seleccionan sobre LB Amp 50 ug/ml. Los AD? que contienen la biblioteca de AD?c de cerebro humano viral se purifican de las colonias transformadas y se usan para hacer los AR? infecciosos que aplican directamente' a los vegetales. De una a tres semanas después de la transfección, los vegetales que desarrollan fenotipos de atrofia severos se identifican y sus insertos vectores virales correspondientes se caracterizan por secuenciación de ácido nucleico. 16 Identif:icación de secuencias de nucleótidos humanas involuc:radas en la regulación del crecimiento de un organismo huésped por la inhibición de una expresión de gen endógeno usando ARN derivado de virus que contiene secuencias de nucleótidos humanos Una biblioteca de ADNc de cerebro humano se obtiene de fuentes públicas y probadas o se prepara de los ARNm humanos. Los ADNc se insertan en vectores virales o en vectores de subclonación pequeños y los insertos de ADNc se aislan de los vectores de clonación con las enzimas apropiadas, se modifican y los enlazantes Notl se unen a los extremos romo de AD?c. Los insertos de AD?c humanos se subclonan dentro del sitio Notl de pFastBacl. El inserto de AD?c humano se elimina del plásmido lanzadera pFasBac-HcD?A que contiene el inserto de AD?c humano para pFastBacMan 1 como un fragmento EcoRI-Xbal para construir pFastBacMaml-HcD?A conforme a Condreay et al . , (Proc . Nati . Acad. Sci . USA, 96: 127-132 (1999)). El virus recombinante se gerá usando el sistema Bac-to-Bac (Life Technologies) . El virus se amplifica adicionalmente por propagación en células de Spodopt ra frugiperda . Los cambios fenotípicos tales proporción doblada, forma, tamaño, actividad de cinasa, liberación de citoquinas, respuesta a excipientes (por ejemplo compuestos tóxicos, patógenos, etc.) división de cultivo celular, crecimiento libre de suero, activación de gen, y expresión del receptor se detectan microscópicamente, macroscópicamente, o por un método bioquímico. Las células con cambios fenotípicos o bioquímicos se detectan y el inserto de ácido nucleico en el clon de ADNc o en el vector que resulta en cambios se secuencia después.

Humanizando homólogo vegetal para expresión de proteína humana derivada de vegetal Para obtener los ADNc vegetales correspondientes, los clones humanos responsables de causar cambios en el fenotipo vegetal transfectado (por ejemplo atrofia) se usan como sondas. Los ADNc de vegetal de longitud completa se aislan por filtros de hibridización o porta objetos que contienen los ADNc de N. benthamiana con sondas de inserto de AD?c humano fluorescentes o marcadas con 32P. Los clones vegetales positivos se caracterizan por secuenciación de ácido nucleico y se comparan con sus homólogos humanos. Los codones vegetales que codifican para aminoácidos diferentes se cambian por mutagénesis dirigida al sitio para codones que codifican para los mismos aminoácidos que sus homólogos humanos. Los AD?c vegetales (humanizados resultantes codifican una proteína idéntica conforme el clon humano. Los clones vegetales "humanizados se usan para producir proteínas humanas en vegetales transfectados o transgénicos por técnicas estándar. Debido a que AD?c "humanizado es un origen vegetal, es óptimo para expresión en vegetales.

EJEMPLO 18 Silenciamiento del gen/cosupresión de genes inducida al suministrar un ARN capaz de aparear bases consigo mismo para formar regiones de hebra doble El silenciamiento del gen se ha usado para regular a la baja la expresión del gen en vegetales transgénicos. Evidencia experimental reciente sugiere que el ARN de hebra doble puede ser un estimulador efectivo del fenómeno de silenciamiento/cosupresión del gen en vegetales transgénicos. Por ejemplo, arterhouse et al (Proc. Nati . Acad. Sci USA 95:13959-13964 (1998), incorporada en la presente por referencia) describe que podría inducirse resistencia al virus y silenciamiento del gen en vegetales por la expresión simultánea de ARN de sentido y antisentido. El silenciamiento/cosupresión del gen de genes vegetales puede inducirse suministrando un ARN capaz de aparear bases consigo mismo para formar regiones de hebra doble. Este ejemplo muestra: (1) un nuevo método para generar un vector virus de ARN capaz de producir un ARN capaz de formar regiones de hebra doble, y (2) un proceso para silenciar genes vegetales usando dicho vector viral. Paso 1: Construcción de una secuencia de ADN la cual después que se transcribe generaría una molécula de ARN capaz de aparear bases consigo mismo. Dos secuencias de ADNs idénticas o casi idénticas se ligan juntas en una orientación invertida de una con otra (es decir, en una orientación cabeza con cola o cola con cabeza) con o sin una secuencia de nucleótidos de enlace entre las secuencias homologas. La secuencia de ADN resultante se clona después dentro de una copia de ADNc de un genoma de vector viral vegeta. Paso 2: Clonación, selección transcripción de clones de interés usando métodos conocidos en la técnica. Paso 3: Células vegetales infectadas con clones de copias. Conforme el virus expresa secuencia de gen extraño, el ARN del gen extraño forma pares de bases sobre sí mismo formando regiones de ARN de hebra doble. Esta propuesta se usa con cualquier gene vegetal o no vegetal y se usa para silenciar homólogos de gen vegetal para asistir en la identificación de la función de una secuencia de gen particular. Aunque la invención se ha descrito con referencia a las modalidades actualmente preferidas, debe entenderse que pueden hacerse diversas modificaciones sin apartarse del espíritu de la invención. Todas las publicaciones patentes, solicitudes de patente y sitios web se incorporan en la presente para referencia en su totalidad al mismo grado como si cada publicación de patente solicitud de patente o sitio web individual fuera específicamente e individualmente indicado para ser incorporado para referencia en su totalidad.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para correlacionar una secuencia de ácido nucleico de un organismo donador con su función que comprende los pasos de: (a) preparar una biblioteca de secuencias de ADN o
ARN de un organismo donador, y construir ácidos nucleicos virales recombinantes que comprenden un inserto de ácido nucleico no identificado obtenido de la biblioteca en una orientación de sentido positivo; (b) infectar un vegetal huésped con uno o más de los ácidos nucleicos virales recombinantes; (c) expresar transientemente los ácidos nucleicos no identificados en el vegetal huésped; (d) determinar uno o más cambios fenotípicos o bioquímicos en el vegetal huésped; (e) identificar el ácido nucleico viral recombinante que resulta en uno o más cambios en el vegetal huésped; y (f) correlacionar el inserto de ácido nucleico con los cambios fenotípicos o bioquímicos en el vegetal huésped. 2. Un método para correlacionar una secuencia de ácidos nucleicos de un organismo donador con su fusión que comprende los pasos de: (a) preparar una biblioteca de secuencias de ADN o ARN de un organismo donador, y construir ácidos nucleicos virales recombinantes que comprenden un inserto de ácido nucleico no identificado obtenido de la biblioteca en una orientación de sentido positivo; (b) infectar un vegetal huésped con uno o más de los ácidos nucleicos virales recombinantes; (c) expresar transientemente los ácidos nucleicos no identificados en el vegetal huésped; (d) determinar uno o más cambios fenotípicos o bioquímicos en el vegetal huésped; (e) identificar el ácido nucleico viral recombinante que resulta en uno o más cambios en el vegetal huésped; y (f) correlacionar el inserto de ácido nucleico con los cambios fenotípicos o bioquímicos en el vegetal huésped.
3. El método de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en donde el organismo donador es humano
4. El método de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en donde el organismo donador es de ratón
5. El método de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en donde el organismo donador es drosofila.
6. El método de acuerdo a la reivindicación 3-5, en donde la biblioteca se deriva de células de tumor.
7. El método de acuerdo a la reivindicación 3-5, en donde la biblioteca se deriva de los EST.
8. El método de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en donde el organismo donador es un vegetal donador y el vegetal donador y el vegetal huésped pertenecen a familias, orden, clase, subdivisiones o divisiones diferentes.
9. El método de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en donde el vegetal donador se selecciona del grupo que consiste de cultivos alimenticios, cultivos de semillas, cultivos de aceites, cultivos ornamentales y silvicultura.
10. El método de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en donde el vegetal huésped se selecciona del grupo que consiste de cultivos alimenticios, cultivos de semillas, cultivos de aceite, cultivos ornamentales y silvicultura.
11. El método de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en donde el vegetal huésped es Nicotiana .
12. El método de acuerdo a la reivindicación 11, en donde el huésped vegetal es Nicotiana benthamina o Nicotiana cleavlandii .
13. El método de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en donde el vegetal huésped es una monocotiledónea
14. El método de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en donde los ácidos nucleicos virales recombinantes se derivan de un virus de ARN de sentido positivo de hebra sencilla.
15. El método de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en donde los ácidos nucleicos virales recombinantes se derivan del grupo que consiste de un potivirus, un tobamovirus, un bromovirus, un geminivirus, un hordivirus y un tobravirus.
16. El método de acuerdo a la reivindicación 14, en donde el virus de 7?RN de sentido positivo de hebra sencilla 5 es un virus multipartita.
17. El método de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en donde los ácidos nucleicos virales recombinantes comprenden un promotor subgenómico nativo o no nativo.
18. El método de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, 0 en donde el inserto codifica una proteína selecciona del grupo que consiste de proteínas ribosomales, proteínas que enlazan GTP supresor de tumor, y receptores acoplados a proteína G.
19. El método de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, 5 en donde el cambio fenotípico comprende cambios en la velocidad de crecimiento, morfología o color.
20. El método de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el inserto causa inhibición citoplasmática de una expresión de gen. 0
21. El método de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el inserto causa la sobre expresión de un producto polipéptido.
22. El método de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, que comprende adicionalmente el paso de anotar cada secuencia de inserto con su cambio fenotípico o bioquímico asociado. ==*¡fie --t *-*«, ¿¿ ^A
23. El método de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, donde el método comprende adicionalmente los pasos de: (I) determinar la homología de secuencia de ácido nucleico entre las secuencias vegetales y humanas; y (II) alterar la secuencia nucleica de la secuencia vegetal tal que la secuencia vegetal alterada codifica la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia humana.
24. El método de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en donde la función es aumentar el rendimiento de un cultivo de grano.
25. El método de acuerdo a la reivindicación 15, en donde el tobravirus es un Virus Cascabel del Tabaco.
26. El método de acuerdo a la reivindicación 14, en donde el virus de ARN de sentido positivo de hebra sencilla es un virus mosaico de banda de la cebada.