MXPA02000220A - Produccion de vacunas quimericas humanas-bovinas atenuadas del virus sincitial respiratorio. - Google Patents

Produccion de vacunas quimericas humanas-bovinas atenuadas del virus sincitial respiratorio.

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Abstract

Los virus sincitiales respiratorios (RSV)quimericos humanos-bovinos son infecciosos y estan atenuados en humanos y otros mamiferos y son utiles en formulaciones vacunales para provocar una respuesta inmune anti-RSV. Tambien se facilitan moleculas polinucleotidicas aisladas y vectores que incorporan un genoma o antigenoma de RSV quimerico que incluye un genoma o antigenoma "de fondo" de RSV humano o bovino parcial o completo, combinado o integrado con uno o mas genes o segmentos genomicos heterologos de una cepa de RSV diferente. Los RSV quimericos humanos bovinos de la invencion incluyen un genoma o antigenoma de RSV "de fondo" parcial o completo derivado de, o modelado de acuerdo con, un virus de una cepa o subgrupo de RSV humano o bovino combinado con uno o mas genes o segmentos genomicos heterologos de un virus de una cepa o subgrupo de RSV diferente, para formar el genoma o antigenoma de RSV quimerico humano-bovino. En aspectos preferidos de la invencion, los RSV quimericos incorporan un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino parcial o completo combinado con uno o mas genes o segmentos genomicos heterologos de un RSV humano. Los genes de interes incluyen cualquiera de los genes NS1, NS2, N, P, M, SH, M2 (ORF1), M2(ORF2), L, F o G, o un segmento genomico que incluye una proteina o porcion de la misma. Se proporciona una variedad de mutaciones y de modificaciones nucleotidicas adicionales en los RSV quimericos humanos-bovinos de la invencion para obtener efectos fenotipicos y estructurales deseados.

Description

PRODUCCION DE VACUNAS QUIMERICAS HUMANAS-BOVINAS ATENUADAS DEL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El virus sincitial respiratorio humano ("HRSV") es el agente vírico principal de la enfermedad grave pediátrica del tracto respiratorio a nivel mundial (Collins y col., Fields Virology 2: 1313-1352, 1996). El RSV supera a todos los demás patógenos microbianos como causa de pneumo-nía y bronquiolitis en niños de menos de un año de edad. Virtualmente todos los niños se infectan hacia los dos años de edad y la reinfección ocurre con una apreciable frecuencia en niños de más edad y en adultos jóvenes (Chanock y col., en Viral Infections of Humans, 3a ed. , A.S. Evans, ed., Plenum Press, N.Y. 1989): El RSV es responsable de más de uno de cada cinco admisiones hospitalarias pediátricas debido a enfermedad del tracto respiratorio y, solamente en los Estados Unidos, causa casi 100.000 hospitalizaciones y 4.500 muertes anuales. (Heilman, J. Infect . Dis. 161: 402-6, 1990) . Además, hay pruebas de que una grave infección del tracto respiratorio en una fase temprana de la vida puede iniciar o exacerbar el asma (Sigurs y col . , Pedia-trics 95: 500-5, 1995). Mientras normalmente se piensa que el RSV huma-no se halla en el contexto de la población pediátrica, también se le reconoce como un importante agente de grave enfermedad entre las personas de edad (Falsey y col., J. In-fect. Dis. 172: 389-394, 1995). El RSV humano causa también una enfermedad mortal en determinados individuos inmunocom-prometidos, tales como los receptores de. trasplantes de médula ósea (Fouillard y col., Bone Marrow Transplant 9: 97-100, 1992).
Para el tratamiento del RSV humano, se dispone de un agente quimioterápico, la ribavirina. Sin embargo, su eficacia y uso son controvertidos. Existen también productos patentados para la intervención del RSV que están com-puestos por un pool de IgG de donantes (Groothuis y col . , N. Engl. J. Med. 329: 1524-30, 1993) o un anticuerpo mono-clonal específico de RSV humanizado. Éstos son administrados por como agentes de inmunoprofilaxis pasiva a individuos de alto riesgo. Mientras que estos productos son úti-les, su elevado coste y otros factores, tales como la falta de efectividad a largo plazo, hacen de ellos que resulten inapropiados para un uso extendido. Otros inconvenientes incluyen la posibilidad de transmitir virus transportados por la sangre y la dificultad y el gasto en la preparación y el almacenamiento. Más aún, la historia del control de las enfermedades infecciosas y, especialmente, de las enfermedades de origen vírico, indica la importancia primaria de las vacunas. A pesar de décadas de investigación para des-arrollar agentes vacunales efectivos frente al RSV, no se ha conseguido hasta la fecha una vacuna segura y efectiva para prevenir la grave morbilidad y la significativa mortalidad asociadas a la infección por RSV. El fallo en conseguir vacunas exitosas se relaciona en parte con el hecho de que los niños pequeños tienen respuestas disminuidas de anticuerpos séricos y secretores para los antígenos del RSV. Por lo tanto, estos individuos sufren infecciones más graves por RSV, mientras que la inmunidad acumulativa parece proteger a niños mayores y a adultos frente a impactos más graves del virus. Se ha prestado atención recientemente a los mecanismos de inmunidad en la infección por RSV. Los anti-cuerpos secretores parecen ser más importantes en la protección del tracto respiratorio superior, mientras que se piensa que altos niveles de anticuerpos en suero tienen un papel mayor en la resistencia a la infección por RSV en el tracto respiratorio inferior. Las células T citotóxicas específicas de RSV, otra rama efectora de la inmunidad inducida, son también importantes en la resolución de una infección por RSV. Sin embargo, aunque este último efector puede ser aumentado por inmunización previa para obtener una mayor resistencia a la inoculación del virus, el efecto tiene una breve duración. Las glicoproteínas de superficie F y G son los dos antígenos protectores mayores del RSV y son las dos únicas proteínas de RSV que han mostrado inducir anticuerpos neutralizantes para RSV y resistencia a largo plazo frente a la inoculación (Collins y col., Fields Virology, Fields y col., eds. 2: 1313-1352, Lippincott-Raven, Philadelphia, 1996; Connors y col., J. Virol . 65(3): 1634-7, 1991) . La tercera proteína de superficie del RSV, SH, no inducía anticuerpos neutralizantes de RSV o resis-tencia significativa a la inoculación de RSV. Un obstáculo en el desarrollo de vacunas RSV vivas es la dificultad en conseguir un equilibrio apropiado entre atenuación e inmunogenicidad, en parte debido a la inestabilidad genética de algunos virus atenuados, al rela-tivamente pobre crecimiento de RSV en cultivo de células y a la inestabilidad de la partícula vírica. Además, la inmunidad inducida por la infección natural no es totalmente protectora frente a la infección posterior. Una serie de factores probablemente contribuyen a ello, incluyendo la relativa ineficacia del sistema inmune en la restricción de la infección vírica sobre la superficie luminal del tracto respiratorio, la naturaleza de corta duración de la inmuni-dad local de mucosas, la rápida y extensa replicación vírica, las reducidas respuestas inmunes en los jóvenes debido a inmadurez inmunológica, la inmunosupresión por anticuerpos séricos maternos derivados transplacentariamente y de-terminadas características del virus, tales como un alto grado de glicosilación de la proteína G. Además, como se describirá a continuación, el RSV humano existe como dos subgrupos antigénicos A y B y la inmunidad contra un sub-grupo es de reducida efectividad contra el otro. Aunque el RSV puede reinfectar múltiples veces a lo largo de la vida, las reinfecciones se reducen normalmente en cuanto a gravedad debido a la inmunidad protectora inducida por la infección previa y, por lo tanto, es posible la inmunoprofilaxis . Una vacuna viva atenuada de RSV sería administrada intranasalmente para iniciar una leve infección inmunizante. Esto tiene la ventaja de la simplicidad y la seguridad en comparación con una vía parenteral . También proporciona una estimulación directa de la inmunidad local del tracto respiratorio, que tiene un papel mayor en la resistencia a RSV. También abroga los efectos inmuno-supresores de los anticuerpos séricos maternos específicos de RSV, que típicamente se encuentran en los muy jóvenes. Además, mientras que la administración parenteral de antí-genos RSV puede asociarse a veces a complicaciones inmuno-patológicas (Murphy y col., Vaccine 8(5): 497-502, 1990), no se ha observado esto nunca con un virus vivo. Se estudió una vacuna de virus inactivado con formalina frente al RSV a mediados de los años 60, pero ésta no pudo proteger frente a la infección o enfermedad por RSV y, de hecho, exacerbaba los síntomas durante la posterior infección por el virus (Kim y col., Am. J. Epidemiol . , 89: 422-434, 1969; Chin y col., Am. J. Epidemiol., 89: 449-463, 1969; Kapikian y col., Am. J. Epidemiol ¦ , 89: 405-421, 1969) . Más recientemente, el desarrollo de vacunas para RSV se ha centrado en los imitantes atenuados de RSV. Friedewald y col. (J. Amer. Med. Assoc. 204: 690-694, 1968) describieron un mutante pasado por frío de RSV (cpRSV) que parecía ser lo suficientemente atenuado como para ser un candidato a vacuna. Este mutante exhibía una eficacia ligeramente mayor de crecimiento a 26 °C en comparación con su virus parental de tipo salvaje ("wt"), pero su replicación no era sensible a la temperatura ni estaba significativamente adaptada al frío. El mutante pasado por frío, sin embargo, era atenuado para adultos. Aunque satisfactoriamente atenuado e inmunogénico para lactantes y niños que habían estado previamente infectados con RSV (es decir, individuos seropositivos) , el mutante cpRSV conservaba un bajo nivel de virulencia para el tracto respiratorio superior de lactantes seronegativos . De forma similar, Gharpure y col. (J. Virol . 3: 414-421, 1969) describieron el aislamiento de mutantes RSV sensibles a la temperatura (tsRSV) que también eran candidatos vacunales prometedores. Un mutante, ts-1, fue extensamente evaluado en laboratorio y en voluntarios. El mutante producía una infección asintomática en voluntarios adul-tos y confería resistencia a la inoculación con el virus de tipo salvaje 45 días después de la inmunización. De nuevo, mientras que los lactantes y niños seropositivos sufrían una infección asintomática, los lactantes seronegativos desarrollaban signos de rinitis y otros síntomas leves. Más aún, se detectó la inestabilidad del fenotipo ts. Aunque el virus que exhibía una pérdida parcial o completa de sensibilidad a la temperatura representaba una pequeña propor-ción del virus recuperable de los vacunados, no se asociaba a signos de enfermedad distintos de una rinitis leve. Éstos y otros estudios revelaron que determinadas cepas de RSV pasadas por frío y sensibles a la tempera-tura estaban infraatenuadas y causaban leves síntomas de enfermedad en algunos vacunados, particularmente en lactantes seronegativos, mientras que otras estaban sobreatenua-das y no podían replicarse suficientemente como para provocar una respuesta inmune protectora (Wright y col . , Infect . Immun. 37: 397-400, 1982). Más aún, la inestabilidad genética de los mutantes candidatos a vacuna ha dado como resultado la pérdida de su fenotipo sensible a la temperatura, impidiendo aún más el desarrollo de vacunas RSV efectivas. Véase, en general, Hodes y col., Proc . Soc . Ex . Biol . Med. 145: 1158-1164, 1974; Mclntosh y col., Pedriatr. Res. 8: 689-696, 1974, y Belshe y col., J. Med. Virol . 3: 101-110, 1978) . Como alternativa a las vacunas RSV vivas atenuadas, los investigadores han estudiado también candidatos a vacunas subunitarias utilizando glicoproteínas de la envuelta de RSV purificadas. Las glicoproteínas inducían resistencia a la infección por el virus RS en los pulmones de las ratas del algodón (Walsh y col., J. Infect . Dis. 155: 1198-1204, 1987), pero los anticuerpos tenían una actividad neutralizante muy débil y la inmunización de roedores con vacuna subunitaria purificada daba lugar a potenciación de la enfermedad (Murphy y col., Vaccine 8: 497-502, 1990). También se han explorado vacunas con virus de la vaccinia recombinante que expresan la glicoproteína de la envuelta F o G. Estos recombinantes expresan glicoproteínas de RSV que son indistinguibles de las de la auténtica contrapartida vírica y los roedores infectados intradér-micamente con recombinantes F y G de RSV-vaccinia desarrollaban altos niveles de anticuerpos específicos que neutralizaban la infectividad vírica. Ciertamente, la infección de ratas del algodón con recombinantes vaccinia-F estimula-ba una resistencia casi completa a la replicacion de RSV en el tracto respiratorio inferior y una resistencia significativa en el tracto superior (Olmsted y col . , Proc. Nati. Acad. Sei. USA 83: 7462-7466, 1986). Sin embargo, la inmunización de chimpancés con recombinante vaccinia-F y G casi no proporcionaba ninguna protección frente a la inoculación de RSV en el tracto respiratorio superior (Collins y col., Vaccine 8: 164-168, 1990) y daba una protección inconsistente en el tracto respiratorio inferior (Crowe y col., Vaccine 11: 1395-1404, 1993). A pesar de estos esfuerzos varios por desarrollar una vacuna RSV efectiva, no se ha aprobado aún ninguna vacuna patentada para el RSV. Las incumplidas promesas de las aproximaciones anteriores subrayan la necesidad de nuevas estrategias para desarrollar vacunas RSV y, en particu-lar, métodos para manipular RSV recombinantes para incorporar cambios genéticos que den nuevas propiedades fenotípi-cas en recombinantes RSV atenuados viables. Sin embargo, la manipulación del ARN genómico de RSV y otros virus ARN de sentido negativo no segmentados ha demostrado ser difícil hasta ahora. Como obstáculos mayores en este sentido se incluyen la no infectividad del ARN genómico desnudo de estos virus, el pobre crecimiento vírico en cultivo de tejidos, los prolongados ciclos de replicacion, la inestabilidad de los viriones, un genoma complejo y una organización refrac-taria de los productos génicos. La tecnología del ADN recombinante ha hecho posible recuperar virus ARN de hebra negativa no segmentados d infecciosos a partir de ADNc para manipular genéticamente clones víricos y construir nuevos candidatos vacunales y para evaluar rápidamente su nivel de atenuación y estabilidad fenotípica (para revisiones, véanse Conzelmann, J. Gen. Virol . 77: 381-89, 1996; Palese y col., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 93: 11354-58, 1996). En este contexto, se ha descrito el rescate recotnbinante para el virus sincitial respiratorio (RSV) infeccioso, para el virus de la parain-fluenza (PIV) , para el virus de la rabia (RaV) , para el vi-rus de la estomatitis vesicular (VSV) , para el virus del sarampión (MeV) , para el virus de la peste bovina y para el virus Sendai (SeV) a partir de ARN antigenómico codificado por ADNc en presencia de proteínas víricas esenciales (véanse, por ejemplo, Garcin y col., E BO J. 14: 6087-6094 (1995); Lawson y col., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 92: 4477-81 (1995); Radecke y col. EMBO J. 14: 5773-5784 (1995); Schnell y col., EMBO J. 13: 4195-203 (1994); Whelan y col., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 92: 8388-92 (1995); Hoffman y col., J. Virol. 71: 4272-4277 (1997); Pecters y col., J. Virol ¦ 73: 5001-5009, 1999; Kato y col., Genes to Cells 1: 569-579 (1996); Roberts y col., Virology 247(1), 1-6 (1998), Barón y col., (J. Virol. 71: 1265-1271 (1997); Publicación Internacional N° WO 97/06270; Solicitud de Patente Provisional EE.UU. N° 60/007.083, presentada el 27 de Septiembre de 1995; Solicitud de Patente EE.UU. N° 08/720.132, presentada el 27 de Septiembre de 1996; Solicitud de Patente Provisional EE.UU. N° 60/021.773, presentada el 15 de Julio de 1996; Solicitud de Patente Provisional EE.UU. N° 60/046.141, presentada el 9 de mayo de 1997; So-licitud de Patente provisional EE.UU. N° 60/047.634, presentada el 23 de Mayo de 1997; Patente EE.UU. N° 5.993.824, concedida el 30 de Noviembre de 1999 (correspondiente a la Publicación Internacional N° WO 98/02530) ; Solicitud de Patente EE.UU. N° 09/291.894, presentada por Collins y col. el 13 de Abril de 1999; Solicitud de Patente Provisional EE.UU. N° 60/129.006, presentada por Murphy y col. el 13 de Abril de 1999; Collins y col., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 92: 11563-11567 (1995); Bukreyev y col., J. Virol. 70: 6634-41, 1996; Juhasz y col., J. Virol. 71(8): 5814-5819, 1997; Durbin y col., Virology 235: 323-332, 1997; He y col., Virology 237:249-260 (1997); Barón y col., J. Virol. 71: 1265-1271 (1997); Whitehead y col., Virology 247(2): 232-9 (1998a); Bucholz y col., J. Virol. 73: 251-259 (1999); Whitehead y col., J. Virol. 72(5): 4467-4471 (1998b); Jin y col., Virology 251: 206-214 (1998); Whitehead y col., J. Virol. 73(4) : 3438-3442 (1999), y Bukreyev y col., Proc. Nat . Acad. Sci. USA 96: 2367-72, 1999, cada una de ellas aquí incorporada como referencia en su totalidad a todos los fines) . El RSV bovino ("BRSV"), que está antigénicamen-te relacionado con el RSV humano ("HRSV"), ofrece una aproximación alternativa al desarrollo de una vacuna de virus vivo atenuado para el HRSV. La primera vacuna usada en humanos, el virus vivo de la vaccinia que se pensaba era de origen bovino, fue desarrollada por Jenner hace casi 200 años para el control de la viruela. Durante los siglos si-guientes, el virus de la vaccinia tuvo éxito en controlar esta enfermedad y tuvo un papel esencial en la erradicación final de la viruela. En esta aproximación "Jenneriana" al desarrollo de vacunas, se usa un virus animal antigénica-mente relacionado como vacuna para humanos. Los virus ani-males que están bien adaptados a su hospedador natural a menudo no se replican eficientemente en humanos y son por ello atenuados. Actualmente, hay una falta de entendimiento completo en cuanto a la base genética para esta forma de restricción del rango de hospedadores . La evolución de un virus en su hospedador animal o aviar da lugar a una significativa divergencia de secuencias de nucleótidos (nt) y aminoácidos con respecto a las secuencias correspondientes en el virus humano relacionado. Esta secuencia divergente, consistente en un gran número de diferencias de secuencia, especifica el fenotipo de atenuación de rango de hospedado-res. El tener un fenotipo de atenuación basado en numerosas diferencias de secuencias es una propiedad deseable en un virus vacunal, ya que debería contribuir a la estabilidad del fenotipo de atenuación del virus animal después de su replicación en humanos. El recientemente patentado rotavirus tetrava-lente es un ejemplo de la aproximación Jenneriana al desarrollo de vacunas, en donde una cepa de rotavirus no humano, el rotavirus rhesus ("RRV") resultó estar atenuada en humanos y ser protectora frente al serotipo humano 3, con el que está antigénicamente muy relacionada (Kapikian y col., Adv. Exp. Med. Biol . 327: 59-69, 1992, aquí incorporada como referencia) . Dado que se necesitaba una vacuna multivalente que indujera resistencia a cada uno de los cuatro serotipos de rotavirus humanos mayores, se modificó la aproximación Jenneriana construyendo tres virus reclasi-ficados usando técnicas genéticas convencionales para la reclasificación génica en cultivo de tejidos. Cada virus con reclasificación génica por separado contenía 10 genes RRV más un solo gen de rotavirus humano que codificaba para el antígeno de neutralización mayor (VP7) del serotipo 1, 2 ó 4. La intención era preparar reclasificantes RRV de substitución génica independientes con las características de atenuación de este virus de simio y la especificidad de neutralización del rotavirus humano de serotipo 1, 2 ó 4. La vacuna tetravalente basada en la restricción de rango de hospedador del RRV de simio en humanos proporcionaba un alto nivel de eficacia contra la infección por rotavirus humano en lactantes y niños pequeños (Pérez-Schael y col., N. Engl. J. Med. 337: 1181-7, 1997, aquí incorporada como referencia) . Sin embargo, la vacuna patentada conserva una leve reactogenicidad en niños seronegativos de más edad que carecen de anticuerpos maternos, por lo que se está desarrollando una vacuna Jenneriana de segunda generación, basada en la cepa UK del rotavirus bovino, para reemplazar a la vacuna RRV. La aproximación Jenneriana está siendo también explorada para el desarrollo de vacunas para el virus de la parainfluenza tipo 1 y para el virus de la hepatitis A (Emerson y col.., J. Infect . Dis. 173: 592-7, 1996; Hur-witz y col., Vaccine 15, 533-40, 1997, cada una de ellas aquí incorporada como referencia) . La aproximación Jenneriana fue utilizada para el desarrollo de una vacuna viva atenuada para el virus de la influenza A, pero no pudo producir una vacuna consistentemente atenuada para uso en humanos (Steinhoff y col., Journal of Infectious Diseases 163: 1023-1028, 1991, aquí incorporada a modo de referencia) . En base a los desarrollos anteriores, es ahora posible recuperar RSV infecciosos de ADNc y diseñar y llevar a cabo diversas manipulaciones genéticas en clones de RSV para construir nuevos candidatos vacunales. A continuación, se puede evaluar y ajustar el nivel de atenuación y de estabilidad fenotípica, entre otras características fe-notípicas deseadas. El reto que queda, por lo tanto, es desarrollar un menú amplio y diverso de manipulaciones ge-néticas que puedan ser empleadas, solas o en combinación con otros tipos de manipulaciones genéticas, para construir clones de RSV atenuados infecciosos que sean útiles para amplio uso vacunal. En este contexto, sigue habiendo una urgente necesidad en la técnica de herramientas y métodos adicionales que permitan la ingeniería de vacunas seguras y efectivas para aliviar los graves problemas de salud atri-buibles a RSV. Sorprendentemente, la presente invención cumple con esta necesidad proporcionando herramientas adi-cionales para construir candidatos a vacuna de RSV atenuados infecciosos. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un virus sin-citial respiratorio (RSV) quimérico humano-bovino que es infeccioso y está atenuado en humanos y otros mamíferos. En aspectos relacionados, la invención proporciona nuevos métodos para diseñar y producir RSV quiméricos humanos-bovinos atenuados que son útiles en diversas composiciones para generar una respuesta inmune deseada contra el RSV en un hospedador susceptible de infección por RSV. Se incluyen dentro de estos aspectos de la invención nuevas moléculas polinucleotídicas aisladas y vectores que incorporan dichas moléculas, que consisten en un genoma o antigenoma de RSV quimérico que incluye un genoma o antigenoma de "fondo" de RSV humano o bovino parcial o completo combinado o integrado con uno o más genes o segmentos genómicos heterólogos de una cepa o subgrupo de virus RSV diferente. Los RSV quiméricos humanos-bovinos según la invención pueden provocar una respuesta inmune para un subgrupo o cepa específicos de RSV, o una respuesta poliespecífica frente a múltiples sub-grupos o cepas de RSV. Aún se proporcionan composiciones y métodos adicionales para diseñar y producto RSV quiméricos humanos-bovinos atenuados como vectores para incorporar determinantes antigénicos de otros patógenos y generar una respuesta inmune deseada contra diferentes patógenos de interés. También se proporcionan dentro de la invención méto-dos y composiciones que incorporan RSV quiméricos humanos-bovinos para la profilaxis y el tratamiento de la infección y la enfermedad causadas por RSV y otros patógenos . Los RSV quiméricos humanos-bovinos de la invención son sometidos a ingeniería recombinante para incorpo-rar secuencias nucleotldicas de cepas de RSV tanto humanas como bovinas y producir un virus o partícula subvírica quimérica infecciosa a partir de éstas. De esta forma, los virus vacunales candidatos son sometidos a ingeniería recombinante para provocar una respuesta inmune frente a RSV u otro patógeno en un hospedador mamífero susceptible de infección con el patógeno de interés, incluidos los humanos y los primates no humanos. Los RSV quiméricos humanos-bovinos ejemplares de la invención incorporan un genoma o antigenoma de RSV quimérico que contiene secuencias polinucleotídicas tanto humanas como bovinas, así como una proteína mayor de la nu-cleocápside (N) , una fosfoproteína de la nucleocápside (P) , una proteína gran polimerasa (L) y un factor de elongación de la ARN polimerasa. Se pueden incluir proteínas de RSV adicionales en varias combinaciones para obtener un rango de partículas subvíricas infecciosas, hasta una partícula vírica completa o una partícula vírica que contiene proteínas supernumerarias, determinantes antigénicos u otros componentes adicionales. Los RSV quiméricos humanos-bovinos de la invención incluyen un genoma o antigenoma de RSV de "fondo" parcial o completo derivado o modelado a partir de una cepa o subgrupo de virus RSV humano o bovino combinado con uno o más genes o segmentos genómicos heterólogos de una cepa o subgrupo de virus RSV diferente, para formar el genoma o antigenoma de RSV quimérico humano-bovino . En determinados aspectos de la invención, los RSV quiméricos incorporan un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino parcial o completo combinado con uno o más genes o segmentos genómicos heterólogos de un RSV humano. En aspectos alternativos de la invención, los RSV quiméricos incorporan un genoma o an-tigenoma de fondo de RSV humano parcial o completo combinado con uno o más genes o segmentos genómicos heterólogos de un RSV bovino. En realizaciones ejemplares, la invención se dirige a virus sincitiales respiratorios (RSV) quiméricos infecciosos que contienen una proteína mayor de la nucleo-cápside (N) , una fosfoproteína de la nucleocápside (P) , una proteína gran polimerasa (L) , un factor de elongación de la ARN polimerasa y un genoma o antigenoma de fondo de RSV parcial o completo de un RSV humano o bovino combinado con uno o más genes o segmentos genómicos heterólogos de un RSV diferente, para formar un genoma o antigenoma de RSV quimérico humano-bovino . El (los) gen(es) y/o segmento(s) genómi-co(s) heterólogo (s) que son útiles dentro de la invención incluyen uno o más genes o segmentos genómicos de RSV NS1, NS2, N, P, M, SH, M2 (ORF1) , M2(0RF2), L, F o G. Alternativamente, los genes y segmentos genómicos heterólogos para incorporación en el RSV quimérico humano-bovino pueden incluir una región líder, remolcadora o intergénica del genoma de RSV, o un segmento de éstas. Dentro de realizaciones más detalladas, los RSV quiméricos humanos-bovinos de la invención incorporan uno o más genes y/o segmentos genómicos heterólogos que codifican para una glicoproteína F, G y/o SH de RSV o un dominio o epitopo inmunogénico de ésta. Alternativamente, los RSV quiméricos humanos-bovinos pueden incorporar una glicoproteína quimérica que tenga dominios o epitopos inmunogénicos de glicoproteínas tanto humanas como bovinas. Por ejemplo, el último tipo de quimera puede ser construido por incorporación en un genoma o antigenoma de fondo bovino de un segmento genómico heterólogo codificante de un ectodominio de glicoproteína en marco de "lectura apropiado con un segmento genómico codificante de una porción restante funcional de la correspondiente glicoproteína en el genoma o antigenoma bovino, mediante lo cual el virus quimérico resultante expresa una glicoproteína quimérica funcional. En otras realizaciones alternativas de la in-vención, se facilitan RSV quiméricos humanos-bovinos donde un RSV humano es atenuado por incorporación de un gen, segmento genómico o pluralidad de genes o segmentos genómicos bovinos seleccionados. En determinadas realizaciones, se transfieren coordinadamente grupos de genes heterólogos se-leccionados de BRSV a un genoma o antigenoma de fondo de HRSV. Como genes RSV bovinos ejemplares entre los que pueden ser seleccionados grupos de genes individuales o coordinadamente transferidos se incluyen los genes de RSV N, P, NS1, NS2 , M2-1 y M, que pueden ser substituidos por separa-do o en cualquier combinación en un genoma o antigenoma de fondo de RSV humano por uno o más genes heterólogos de un RSV bovino para obtener un derivado quimérico atenuado. En aspectos más detallados, se substituyen genes tanto N como P de un RSV humano coordinadamente por genes N y P de con-trapartida de un RSV bovino. Este reemplazo coordinado de genes está facilitado por la cooperatividad funcional entre determinados genes en el genoma de RSV, que frecuentemente surge en el caso de parejas de genes vecinos en el genoma . Así, en otras realizaciones alternativas, tanto los genes NS1 como NS2 de un RSV humano son substituidos por genes NS1 y NS2 de contrapartida de un RSV bovino. En aún reali-zaciones adicionales, se substituyen dos o más de los genes M2-1, M2-2 y L de un HRSV por genes de contrapartida de un RSV bovino. Para determinados candidatos vacunales dentro de la invención para los que se desea un alto nivel de restricción del rango de hospedadores, cada uno de los genes N, P, NS1, NS2, M2-1 y M de un RSV humano son substituidos por genes N, P, NS1, NS2, M2-1 y M de un RSV bovino. Dentro de un aspecto diferente de la invención, se construyen RSV quiméricos humanos-bovinos donde el genoma o antigeno a quimérico consiste en un genoma o antigeno-ma de fondo de RSV bovino parcial o completo combinado con uno o más genes o segmentos genómicos heterólogos de un RSV humano. En determinadas realizaciones, se añaden o substituyen uno o más genes de glicoproteinas de RSV humano seleccionados entre F, G y SH, o uno o más segmentos genómi-eos codificantes de porción (es) de dominios citoplásmicos, dominios de transmembrana, ectodominios o epitopos inmuno-génicos de F, G y/o SH en un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino parcial o completo. Por ejemplo, se pueden substituir uno o más genes de glicoproteinas de RSV humano F y G para reemplazar uno o más genes de glicoproteinas F y G de contrapartida en un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino parcial. Dentro de éstas realizaciones y de otras relacionadas, el genoma o antigenoma quimérico humano-bovino puede incorporar determinantes antigénicos de uno o de ambos de los RSV humanos del subgrupo A y del subgrupo B. En aspectos más detallados, se substituyen ambos genes F y G de las glicoproteinas del RSV humano para reemplazar a los genes de contrapartida de las glicoproteínas F y G en el genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino.. Un RSV quimérico humano-bovino ejemplar portador de estas características descrito en los ejemplos que se darán a continuación es rBRSV/A2. Aún otros RSV quiméricos humanos-bovinos adicionales de la invención incorporan uno o más genes de glicoproteínas de RSV humano seleccionados entre F, G y SH, que son añadidos o substituidos en una posición que es más proximal al promotor en comparación con una posición en el orden génico de tipo salvaje de un gen o segmento genómico de contrapartida dentro de un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino parcial o completo. En una de tales realizaciones, ambos genes, G y F de las glicoproteínas del RSV humano están substituidas en las posiciones de orden génico 1 y 2, respectivamente, para reemplazar a los genes de las glicoproteínas G y F de contrapartida suprimidos en las posiciones del tipo salvaje 7 y 8, respectivamente, en un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino parcial. Un RSV quimérico humano-bovino ejemplar portador de estas características descrito en los ejemplos es rBRSV/A2-GlF2. Las transferencias génicas coordinadas dentro de los RSV quiméricos humanos-bovinos se dirigen también a la introducción de genes antigénicos humanos en un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino. En determinadas realizaciones, se añaden o substituyen uno o más genes asociados a la envuelta del RSV humano seleccionados entre F, G, SH y M en un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino parcial o completo. Por ejemplo, se pueden añadir o substituir uno o más genes asociados a la envuelta del RSV humano seleccionados entre F, G, SH y M en un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino parcial en el que se han suprimido uno o más genes asociados a la envuelta seleccionados entre F, G, SH y M. En aspectos más detallados, uno o más genes seleccionados entre un grupo de genes definidos como genes asociados a la envuelta del RSV humano F, G y M, son añadidos en un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino parcial en el que se han suprimidos los genes asociados a la envuelta F, G. SH y M. Un RSV quimérico humano-bovino ejemplar portador de estas características descrito en los ejemplos que se darán a continuación es rBRSV/A2-MGF. Tal como se usa aquí, "gen RSV" se refiere, en general, a una porción del genoma de RSV codificante de un ARNm y comienza típicamente en el extremo aguas arriba con una señal de iniciación de gen (GS) de 10 nucleótidos y acaba en el extremo aguas abajo con la señal de fin de gen (GE) de 12 a 13 nucleótidos. Se conocen diez de dichos genes para uso en la invención para RSV, a saber, NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 y L. El término "gen" es también utilizado aquí para hacer referencia a un "marco de lectura abierta de la traducción" (ORF) . El ORF es más específica-mente definido como un marco de lectura abierta de la traducción codificante de una proteína de RSV significativa, de la cual se reconocen actualmente 11: NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2-1 (alternativamente, M2 (ORF1) ) , M2-2 (alternativamente, M2(ORF2)) y L. Por lo tanto, el término "gen" se refiere de forma intercambiable a una secuencia de ARN ge-nómico que codifica para un ARN subgenómico y a un ORF (este último término se aplica particularmente en una situación tal como en el caso del gen M2 del RSV, donde un solo ARNm contiene dos ORF solapantes que codifican para proteí-ñas distintas). Collins y col., J. Gen. Virol . 71: 3015-3020, 1990; Bermingham y Collins, Proc . Nati. Acad. Sci . USA 96: 11259-11264, 1999; Ahmadian y col., EMBO J . 19: 2681-2689, 2000; Jin y col., J. Virol . 74: 74-82, 2000 (cada una de ellas aquí incorporada como referencia) . Cuando se usa el término "gen" en el contexto de la determinación de la posición génica en relación a la posición de un pro-motor, el término se refiere ordinariamente de un modo estricto a una secuencia codificante de ARNm limitada por motivos de señales de iniciación de gen y de final de gen de la transcripción (Collins y col., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 83: 4594-4598, 1986; Kuo y col., J. Virol. 70: 6892-6901, 1996, cada de ellas aquí incorporada como referencia) . Por "segmento genómico" se entiende cualquier longitud de nucleótidos continuos del genoma de RSV, que pueden ser parte de un ORF, de un gen o de una región ex-tragénica, o una combinación de éstos. El genoma o antigenoma de fondo parcial o completo actúa típicamente como un esqueleto receptor o vector en el que se importan los genes o segmentos genómicos heterologos del RSV humano o bovino de contrapartida. Los genes o segmentos genómicos heterologos del RSV humano o bovino de contrapartida representan genes o polinucleótidos "donantes", que son combinados con, añadidos a, o substituidos en, el genoma o antigenoma de fondo para obtener un RSV quimérico que exhibe nuevas características fenotípicas en comparación con uno o con ambos de los RSV contribuyentes. Por ejemplo, la adición o substitución de genes o segmentos genómicos heterologos en una cepa de RSV receptor seleccionada puede dar lugar a un aumento o a una reducción de la atenuación, a cambios en el crecimiento, a una inmunogeni-cidad alterada o a otros cambios fenotípicos deseados en comparación con un fenotipo (s) correspondiente (s) del receptor y/o donante no modificados.
Los genes y segmentos genómicos que pueden ser seleccionados para uso como insertos o adiciones hete-rólogas dentro de la invención incluyen genes o segmentos genómicos codificantes de una proteína NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(0RF1), M2(ORF2), L, F o G o una porción de la misma. También se pueden considerar regiones reguladoras, tales como las regiones líder o remolcadora extragénicas . En realizaciones preferidas de la invención, él RSV quimérico incorpora uno o más genes heterólogos que codifican para una glicoproteína F, G o SH de RSV. Alternativamente, el RSV quimérico puede incorporar un segmento genómico codificante de un dominio citoplásmico, un dominio de transmembrana, un ectodominio o un epitopo inmunogénico de una glicoproteína F, G o SH de RSV. Estas proteínas, dominios y epitopos in-munogénicos son particularmente útiles en un RSV quimérico humano-bovino, ya que generan nuevas respuestas inmunes en un hospedador inmunizado. Concretamente, las proteínas G y F y los dominios y epitopos inmunogénicos que hay en ellas, proporcionan antígenos mayores de neutralización y protec-tores. Además, los genes y segmentos genómicos codificantes de proteínas no RSV, por ejemplo una proteína SH tal como la encontrada en el virus de las paperas y el virus SV5, pueden ser incorporados en los PIV de la invención. Son también útiles regiones reguladoras, tales como las regio-nes extragénicas 3' líder o 5' remolcadora, y regiones in-tergénicas de iniciación de gen y finalización de gen, o regiones 3' y 5' no codificantes, como substituciones o adiciones heterólogas. Por ejemplo, la adición o substitución de uno o más genes o segmentos genómicos inmunogénicos de un subgru-po o cepa de RSV humano en un genoma o antigenoma receptor bovino da un virus o partícula subví ica quimérica recombi-nante capaz de generar una repuesta inmune dirigida contra el virus donante humano, incluyendo uno o más subgrupos o cepas de RSV humano específicos, mientras que el esqueleto bovino confiere un fenotipo atenuado que hace que la quime-ra sea un candidato útil para el desarrollo de vacunas. En una de tales realizaciones ejemplares, se añaden o substituyen uno o más genes de glicoproteínas de RSV humano F, SH y/o G en un genoma o antigenoma bovino parcial o completo para obtener una quimera humana-bovina infecciosa atenuada que provoca una respuesta inmune anti-RSV humano en un hos-pedador susceptible. En realizaciones alternativas, el RSV quimérico humano-bovino incorpora adicionalmente un gen o segmento genómico codificante de una proteína, dominio de proteína o epitopo inmunogenicos de múltiples cepas de RSV humano, por ejemplo dos proteínas F o G o porciones inmuno-génicas de éstas de ambos subgrupos A y B de RSV. En aún realizaciones adicionales alternativas, un genoma o antigenoma de RSV quimérico humano-bovino codifica para una gli-coproteína quimérica en el virus o partícula subvírica re-combinante que tiene dominios o epitopos inmunogénicos de glicoproteínas tanto humanas como bovinas. Por ejemplo, se puede unir un segmento genómico heterólogo codificante de un ectodominio de glicoproteína de una glicoproteína F, SH o G de RSV humano con un segmento genómico codificante de dominios citoplásmicos y ectodominios de glicoproteínas F, SH o G bovinas correspondientes en el genoma o antigenoma de fondo bovino . Según los métodos de la invención, se pueden construir RSV quiméricos humanos-bovinos substituyendo con el gen o segmento genómico heterólogo un gen o segmento gé-nico de contrapartida en un genoma o antigenoma de fondo de RSV parcial. Alternativamente, el gen o segmento genómico heterólogo puede ser añadido como gen o segmento genómico supernumerario en combinación con un genoma o antigenoma de fondo de RSV completo (o parcial si se suprime otro gen o segmento genómico) . Por ejemplo, se pueden incluir dos ge- nes o segmentos genómicos G o F de RSV, uno de cada uno de los subgrupos A y B de RSV. Frecuentemente, se añade un gen o segmento genómico heterólogo en una posición intergénica dentro de un genoma o antigenoma de fondo de RSV parcial o completo. Alternativamente, el gen o segmento genómico pueden ser colocados en otras regiones no codificantes del genoma, por ejemplo en las regiones 5' ó 3' no codificantes o en otras • posiciones en las que aparecen nucleótidos no codificantes dentro del genoma o antigenoma parcial o completo. En un aspecto, las regiones reguladoras no codificantes contienen señales de acción cis necesarias para una eficiente repli- cación, transcripción y traducción y, por lo tanto, representan sitios diana para modificación de estas funciones introduciendo un gen o segmento genómico heterólogo u otra mutación según se describe aquí. En aspectos más detallados de la invención, se introducen mutaciones atenuantes en regiones reguladoras de acción cis para obtener, por ejemplo, (1) una atenuación específica de tejido (Gromeier y col., J. Virol . 73: 958-64, 1999; Zimmermann y col., J. Virol . 71: 4145-9, 1997), (2) una mayor sensibilidad al interferon (Zimmermann y col., J. Virol. 71: 4145-9, 1997), (3) sensibilidad a la temperatura ( hitehead y col., Virology 247: 232-9, 1998) , (4) una restricción general en el nivel de replicación (Men y col., J. Virol. 70: 3930-7, 1996; uster y col., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 88: 5177-5181, 1991) y/o (5) restricción específica de hospedadores de la replicación (Cahour y col., Virology 207: 68-76, 1995): Estas mu-taciones atenuantes pueden ser conseguidas de varias formas para producir un RSV quimérico humano-bovino atenuado de la invención, por ejemplo por mutaciones puntuales, por intercambios de secuencias entre virus relacionados o por dele-ciones. En aún otros métodos alternativos adicionales aquí provistos, se puede añadir o substituir un gen o segmento genómico heterologo en una posición correspondiente a una posición de orden génico de tipo salvaje de un gen o segmento genómico de contrapartida dentro del genoma o antigenoma de fondo de RSV parcial o completo. En otras realizaciones, el gen o segmento genómico heterologo es añadido o substituido en una posición que es más proximal al promoto o más distal al promotor en comparación con una posición de orden génico de tipo salvaje de un gen o segmento genómico de contrapartida dentro del genoma o antigenoma de fondo, para aumentar o reducir la expresión, respectivamente, del gen o segmento genómico heterologo. En aspectos generales de la invención, se pue-den añadir o substituir genes o segmentos genómicos bovinos en un fondo de RSV humano para formar un RSV quimérico humano-bovino atenuado. Alternativamente, la quimera puede estar compuesta por uno o más genes o segmentos genómicos humanos añadidos o substituidos en un fondo de- RSV bovino para formar un candidato vacunal de RSV atenuado. En este contexto, un genoma o antigenoma de RSV quimérico está formado por un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino parcial o completo combinado con un gen o segmento genómico heterologo de un RSV humano. El RSV quimérico así formado puede incorporar un gen o segmento genómico heterologo de un RSV humano del subgrupo A o del subgrupo B, o de una cepa de RSV humano específica. En aspectos preferidos, se substituye con uno o más genes de glicoproteínas de RSV humano F, G y SH o un segmento genómico codificante de un dominio citoplásmico, un dominio de transmembrana, un ecto-dominio o un epitopo inmunogénico de un gen de glicoproteí-na de RSV humano un gen o segmento genómico de contrapartida dentro del genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino. En realizaciones ejemplares, se substituyen uno o ambos de los genes F y G de glicoproteínas del RSV humano para reemplazar a uno o a ambos de los genes de contrapar-tida de las glicoproteínas F y G en un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino. En un ejemplo específico descrito a continuación, se substituyen los dos genes F y G de glicoproteínas del RSV humano para reemplazar a los genes de las glicoproteínas F y G de contrapartida en el genoma o anti-genoma de fondo de RSV bovino. De forma paralela, el RSV quimérico humano-bovino de la invención puede ser fácilmente diseñado para incorporar determinantes antigénicos de más de una cepa o subgrupo de RSV, por ejemplo tanto el subgrupo A como el subgrupo B del RSV humano. En aspectos adicionales de la invención, se producen RSV quiméricos humanos-bovinos atenuados en los que el genoma o antigenoma quimérico es además modificado introduciendo una o más mutaciones atenuantes que especifican un fenotipo atenuantes en el virus o partícula vírica resultante. Estas mutaciones atenuantes pueden ser generadas de novo y estudiadas en cuanto a los efectos atenuantes según una estrategia de mutagénesis de diseño racional. Alternativamente, las mutaciones atenuantes pueden ser identificadas en RSV mutantes biológicamente derivados existen-tes y a continuación incorporadas en los RSV quiméricos humanos-bovinos de la invención. La invención proporciona una nueva base para la atenuación de una vacuna de virus vivo contra el RSV y otros patógenos, cuya atenuación se basa en parte en los efectos sobre el rango de hospedadores. Estudios anteriores implicaban un intercambio de una región líder extragénica de BRSV (45 nucleótidos) con una secuencia correspondiente de HRSV (44 nucleótidos) (Buchholz y col., J. Virol. 73: 251-259, 1999) . Ninguna de las secuencias codifica para una proteína y no se observó ningún efecto fenotípico significativo. La presente descripción proporciona RSV quiméricos atenuados por introducción de segmentos genómicos, genes enteros o múltiples genes en HRSV y BRSV. Las diferencias en cuanto a rango de hospedado-res entre HRSV y BRSV quedan ejemplificadas por el crecimiento altamente permisivo de HRSV en chimpancés en compa-ración con el crecimiento apenas detectable o indetectable de BRSV en el mismo animal. El chimpancé es un modelo ampliamente aceptado y fiable de infección por RSV y actividad inmunogénica en humanos, exhibiendo replicación del virus y enfermedad comparables a las de humanos. Tal como se ilustra aquí más adelante, las diferencias en el rango de hospedadores de los RSV quiméricos observadas en chimpancés guardan correlación con las diferencias en el rango de hospedadores observadas en cultivo de células, proporcionando un ensayo preliminar conveniente. Los efectos sobre el rango de hospedadores observados en los RSV quiméricos humanos-bovinos de la invención están generalmente relacionados con las diferencias en las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos observadas entre HRSV y BRSV. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de aminoácidos entre HRSV y BRSV para cada una de las siguientes proteínas es: NS1 (69%), NS2 (84%), N (93%), P (81%), M (89%), SH (38%), G (30%), F (81%), M2-1 (80%), L (77%) . Dada la extensa divergencia genética entre HRSV y BRSV (la substitución del gen N de HRSV con el de BRSV, por ejemplo, incluye aproximadamente 26 diferencias de aminoácidos) , los RSV quiméricos humanos-bovinos de la invención son particularmente útiles como candidatos vacunales. Como se e emplificará aquí más adelante, la substitución de las glicoproteínas G y F de BRSV con las de HRSV aumenta la permisividad del BRSV recombinante para la replicación en chimpancés. La implicación de múltiples genes y segmentos genómicos, que confieren cada uno múltiples diferencias de aminoácidos o nucleótidos, proporciona una amplia base para atenuación, que es altamente estable a la reversión. Este modo de atenuación contrasta marcadamente con los virus HRSV atenuados por una o varias mutaciones puntuales, donde la reversión de una mutación individual dará una readquisición significativa o completa de la virulencia. Además, las mutaciones puntuales atenuantes conocidas en el HRSV dan típicamente lugar a un fenotipo sensible a la temperatura. Esto es debido a que el fenotipo sensible a la temperatura era específicamente utilizado como primera criba para identificar la progenie alterada tras la exposición de HRSV a mutágenos. Un problema con la atenuación asociada con la sensibilidad a la temperatura es que el virus puede estar sobrerrestringido en cuanto a la replicación en el tracto respiratorio inferior, mientras que está subatenuado en el trato respiratorio superior. Esto es debido a que hay un gradiente de temperatura en el tracto respiratorio, siendo la temperatura mayor (y más restrictiva) en el tracto respiratorio inferior y menor (menos restrictiva) en el tracto respiratorio superior. La capacidad de un virus atenuado para replicarse en el tracto respiratorio superior puede dar lugar a complicaciones, entre las que se incluyen con-gestión, rinitis, fiebre y otitis media. Por lo tanto, la atenuación conseguida únicamente por mutaciones sensibles a la temperatura puede no resultar ideal. Por el contrario, las mutaciones de rango de hospedadores presentes en los RSV quiméricos humanos-bovinos de la invención no conferirán, en la mayoría de los casos, sensibilidad a la temperatura. Por lo tanto, este nuevo método de atenuación (i) será más estable genética y fenotípicamente y (ii) tendrá menor probabilidad de asociarse con la virulencia residual en el tracto respiratorio superior que otras aproximaciones de vacunas vivas . En combinación con los efectos fenotípicos sobre el rango de hospedadores provistos en los RSV quiméricos humanos-bovinos de la invención, es a menudo deseable ajustar el fenotipo de atenuación introduciendo mutaciones adicionales que aumenten o disminuyan la atenuación del virus quimérico. Por lo tanto, las cepas vacunales candidatas pueden ser aún atenuadas por incorporación de al menos una y, preferiblemente, dos o más mutaciones atenuante diferen-tes, por ejemplo mutaciones identificadas a partir de un panel de cepas de RSV mutantes biológicamente derivadas y conocidas . Las cepas de RSV mutantes humanas preferidas son mutantes pasados por frío ( "cp" ) y/o sensibles a la temperatura ("ts") , por ejemplo los mutantes designados como "cpts RSV 248 (ATCC VR 2450) , cpts RSV 248/404 (ATCC VR 2454), cpts RSV 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC VR 2452), cpts RSV 530/1009 (ATCC VR 2451), cpts RSV 530/1030 (ATCC VR 2455), RSV B-l cp52/2B5 (ATCC VR 2542) y RSV B-l cp-23 (ATCC VR 2579)" (cada una de ellos deposita-dos bajo los términos del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection (ATCC) , de 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, EE.UU. y a los que se dieron los números de acceso antes identificados) . A partir de este panel ejemplar de mutantes biológicamente derivados, se dispone de un gran "menú" de mutaciones atenuantes que pueden combinarse cada una con cual-quier (cualesquiera) otra(s) mutación (es) dentro del panel para calibrar el nivel de atenuación en los RSV quiméricos humanos-bovinos recombinantes para uso vacunal. Mutaciones adicionales pueden derivar de RSV que tengan mutaciones atenuantes no ts y no cp, según se identifica, por ejemplo, en las cepas mutantes de placa pequeña ("sp"), adaptadas al frío ( "ca" ) o de restricción de rango de hospedadores ("hr"). Las mutaciones pueden ser incorporadas en una secuencia antigenomica humana o bovina y se pueden transferir las mutaciones atenuantes identificadas en un mutante de RSV humano, bovino u otro al receptor de RSV heterólogo (por ejemplo, RSV bovino o humano, respectivamente) mapean-do la mutación en el sitio homólogo correspondiente en el genoma del receptor y mutando la secuencia nativa en el receptor al genotipo mutante (por una mutación idéntica o conservadora) , según se describe en la Solicitud de Patente Provisional EE.UU. N° 60/129.006, presentada por Murphy y col. el 13 de Abril de 1999 y aquí incorporada a modo de referencia . Los RSV quiméricos humanos-bovinos diseñados y seleccionados para uso vacunal tienen frecuentemente al menos dos y a veces tres o más mutaciones atenuantes para conseguir un nivel satisfactorio de atenuación para amplio uso clínico. En una realización, se produce al menos una mutación atenuante en el gen de la polimerasa L de RSV (en el gen donante o en el receptor) e implica a una o más substituciones nucleotídicas que especifican un cambio de aminoácido en la proteína polimerasa que especifica un fe-notipo de atenuación que puede o no implicar un fenotipo sensible a la temperatura (ts) . Los RSV quiméricos de la invención pueden incorporar una mutación atenuante en cualquier gen RSV adicional además de L, por ejemplo en el gen M2. Sin embargo, los RSV quiméricos humanos-bovinos preferidos en este contexto incorporan una o más substituciones nucleotídicas en el gen de la gran polimerasa L, que dan lugar a un cambio de aminoácidos en el aminoácido Asn43, Cys319, Phe521, Gln831, Metll69, Tyrl321 y/o Hisl690 en el gen de la polimerasa L de RSV, según se ejemplifica por los cambios lie para Asn43, Leu para Phe521, Leu para Gln831, Val para Metll69 y Asn para Tyrl321. Se pueden hacer, por supuesto, otros cambios de aminoácidos alternativos, cambios particularmente conservadores con respecto a residuos mutantes identificados, en estas posiciones para obtener un efecto similar a la substitución mutante identificada. Como mutaciones deseadas adicionales para incorporación en RSV quiméricos humanos-bovinos de la invención se incluyen mutaciones atenuantes que especifican una substitución de aminoácidos en Val267 en el gen N de RSV, Glu218 y/o Thr523 en el gen F de RSV, y una substitución nucleotídica en la secuencia de iniciación génica del gen M2. Se puede incorporar cualquier combinación de una o más mutaciones atenuantes aquí identificadas, hasta e incluyendo un comple-mentó completo de estas mutaciones, en los RSV quiméricos humanos-bovinos para obtener un virus recombinante adecuadamente atenuado para uso en poblaciones seleccionadas o en poblaciones amplias de receptores vacunales. Las mutaciones atenuantes para incorporación en los RSV quiméricos humanos-bovinos de la invención pueden ser seleccionadas en porciones codificantes de un gen de RSV donante o receptor o en regiones no codificantes, tales como una secuencia cis-reguladora . Como ejemplos de mutaciones no codificantes se incluyen cambios de bases simples o múltiples en una secuencia de iniciación génica, según se ejemplifica por una substitución de una sola base o de múl-tiples bases en la secuencia de iniciación del gen M2 en el nucleótido 7605 (nucleótido 7606 en la secuencia recombi-nante) . Los RSV quiméricos infecciosos según la invención pueden incorporar secuencias nucleotídicas heterólogas codificantes o no codificantes de cualquier virus RSV o de tipo RSV, por ejemplo pneumovirus humano, bovino, murino (virus de la pneumonía de ratones) o aviar (virus de la ri-notraqueítis de los pavos) , o de otro virus envuelto, por ejemplo el virus de la parainfluenza (PIV) . Como secuencias heterólogas ejemplares se incluyen secuencias de RSV de una cepa de RSV humano combinada con secuencias de una cepa de RSV humano diferente en un RSV quimérico humano-bovino. Por ejemplo, los RSV quiméricos de la invención pueden incorporar secuencias de dos o más cepas de RSV de tipo salvaje o mutantes, por ejemplo cepas mutantes seleccionadas entre cpts RSV 248, cpts 248/404, cpts 248/955, cpts RSV 530, cpts 530/1009 ó cpts 530/1030. Alterna ivamente, los RSV quiméricos humanos-bovinos pueden incorporar secuencias de dos o más subgrupos de RSV de tipo salvaje o mutantes, por ejemplo una combinación de secuencias del subgrupo A y del subgrupo B del RSV humano. En aún aspectos adicionales, se substituyen uno o más polinucleótidos codificantes o no codificantes del RSV humano con una secuencia de contrapartida de un virus heterólogo RSV o no RSV, sola o en combina-ción con una o más mutaciones atenuantes seleccionadas, por ejemplo mutaciones cp y/o ts, para obtener nuevas cepas vacunales atenuadas .
Las mutaciones incorporadas en ADNc quiméricos, vectores y partículas víricas de la invención pueden ser introducidas individualmente o en combinación en un ADNc de RSV quimérico humano-bovino de longitud completa y los fe-notipos de los virus rescatados que contienen las mutaciones introducidas pueden ser fácilmente determinados. En realizaciones ejemplares, se incorporan cambios de aminoácidos exhibidos por virus atenuados biológicamente derivados frente a RSV de tipo salvaje, por ejemplo cambios ex-hibidos por cpRSV o tsRSV, en combinación en un RSV quimérico humano-bovino recombinante para obtener un nivel deseado de atenuación. En aún aspectos adicionales de la invención, se pueden diseñar fácilmente RSV quiméricos humanos-bovinos como "vectores" para incorporar determinantes antigénicos de diferentes patógenos, incluyendo más de una cepa o grupo de RSV (por ejemplo, ambos subgrupos RSV A y RSV B humanos) , virus de la parainfluenza humano (HPIV) , incluyendo HPIV3, HPIV2 y HPIVl, virus del sarampión y otros patógenos (véanse la Solicitud de Patente Provisional EE.UU. N° de Serie 60/170.195, Solicitud de Patente EE.UU. N° 09/458.813 y Solicitud de Patente EE.UU. N° 09/459.062, cada una de ellas aquí incorporada como referencia) . En varias realizaciones, el genoma o antigenoma quimérico bovino-humano con-siste en un "genoma o antigenoma vector" de RSV parcial o completo combinado con uno o más genes o segmentos genómi-eos heterólogos codificantes de uno o más determinantes antigénicos de uno o más patógenos heterólogos . El patógeno heterólogo puede ser un RSV heterólogo (es decir, un RSV de una cepa o subgrupo diferente) y el gen o segmento genómico heterólogo puede codificar para una proteína NS1, NS2, N, P, M, SH, M2 (0RF1) , M2(ORF2), L, F o G de RSV o fragmento (por ejemplo, un dominio o epitopo inmunogénico) de ésta. Por ejemplo, el genoma o antigenoma vector puede ser un genoma o antigenoma de RSV A parcial o completo y el (los) gen (es) o segmento (s) genómico(s) heterólogo (s) puede (n) codificar para determinante (s) antigénico (s) de un virus del subgrupo B de RSV. En realizaciones alternativas, el genoma o antigenoma vector del RSV quimérico humano-bovino es un genoma o antigenoma de BRSV parcial o completo y el (los) gen (es) o segmento (s) genómico(s) heterólogo (s) codificante (s) del (de los) determinante (s) antigénico (s) es/son de uno o más HRSV. Por ejemplo, el genoma o antigenoma de BRSV parcial o completo puede incorporar uno o más genes o segmentos genómicos codificantes de uno o más genes de glico-proteínas de HRSV seleccionados entre F, G y SH, o uno o más segmentos genómicos codificantes de una porción (es) de dominio citoplásmico, dominio de transmembrana, ectodominio y epitopo inmunogénico de F, G y/o SH de HRSV. En otras realizaciones alternativas, los RSV quiméricos humanos-bovinos diseñados como "vectores" para llevar determinantes antigénicos heterólogos incorporan uno o más determinantes antigénicos de un patógeno no RSV, tal como un virus de la parainfluenza humano (PIV) . En una realización ejemplar, se añaden o incorporan en el genoma o antigenoma vector de HRSV parcial o completo uno o más genes o segmentos genómicos de HPIV1, HPIV2 o HPIV3 codificantes de una o más glicoproteínas HN y/o F o dominios antigénicos, fragmentos o epitopos de las mismas. En realizaciones más detalladas, se añade o incorpora una unidad de transcripción que contiene un marco de lectura abierta (ORF) de un gen HN o F de HPIV1, HPIV2 o HPIV3 en el genoma o antigenoma vector de HRSV quimérico.
En aún realizaciones alternativas adicionales, el genoma o antigenoma vector consiste en un genoma o anti-genoma de HRSV o BRSV parcial o completo y el patógeno heterólogo es seleccionado entre el virus del sarampión, los virus sincitiales respiratorios del subgrupo A y del subgrupo B, el virus de las paperas, los virus del papiloma humano, los virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 y de tipo 2, los virus herpes simplex, el citomegalovirus, el virus de la rabia, el virus de Epstein Barr, los filovi-rus, los bunyavirus, los flavivirus, los alfavirus y los virus de la influenza. En base a esta lista ejemplar de patógenos candidatos, se puede (n) seleccionar el (los) determinante (s) antigénico (s) heterólogo (s) seleccionado (s) entre las proteínas HA y F del virus del sarampión, las pro-teínas F, G, SH y M2 del virus sincitial respiratorio del subgrupo A o del subgrupo B, las proteínas HN y F del virus de las paperas, la proteína Ll del virus del papiloma humano, la proteína gpl60 del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 ó de tipo 2, las proteínas gB, gC, gD, gE, gG, gH, gl, gJ, gK, gL y gM del virus herpes simplex y del citomegalovirus, la proteína G del virus de la rabia, la proteína gp350 del virus de Epstein Barr, la proteína G de filovirus, la proteína G de bunyavirus, las proteínas E y NSl de flavivirus y la proteína E de alfavirus, y sus domi-nios, fragmentos y epitopos antigénicos. En una realización, el patógeno heterólogo es el virus del sarampión y el (los) determinante (s) antigénico (s) heterólogo (s) es/son seleccionados entre las proteínas HA y F del virus del sarampión y los dominios, fragmentos y epitopos antigénicos de las mismas. Para conseguir dicho constructo quimérico, se puede añadir o incorporar una unidad de transcripción que contenga un marco de lectura abierta (ORF) de un gen HA del virus del sarampión en un genoma o antigenoma vector de HRSV. La presente invención proporciona, por lo tanto, clones de RSV quiméricos humanos-bovinos, constructos de expresión polinucleotídicos (a los que también se hace referencia como vectores) y partículas que pueden incorporar múltiples mutaciones específicas de fenotipo introducidas en combinaciones seleccionadas en el genoma o antigenoma quimérico para producir un virus o partícula subvírica atenuada infecciosa. Este procedimiento, junto con la evaluación fenotípica rutinaria, proporciona RSV quiméricos humanos-bovinos que tienen características deseadas tales como atenuación, sensibilidad a la temperatura, inmunogeni-cidad alterada, adaptación al frío, pequeño tamaño de pla-ca, restricción del rango de hospedadores, etc. Las mutaciones así identificadas son compiladas en un "menú" e introducidas en varias combinaciones para calibrar un virus vacunal a un nivel seleccionado de atenuación, inmunogeni-cidad y estabilidad. En aspectos aún adicionales de la invención, se construyen RSV quiméricos humanos-bovinos, con o sin mutaciones atenuantes, para que tengan una modificación nucleo-tídica que dé un cambio fenotípico, estructural o funcional deseado. Típicamente, la modificación nucleotídica selec-cionada especificará un cambio fenotípico, por ejemplo un cambio en las características de crecimiento, en la atenuación, en la sensibilidad a la temperatura, en la adaptación al frío, en el tamaño de placa, en la restricción del rango de hospedadores o en la inmunogenicidad. Los cambios es-tructurales en este contexto incluyen la introducción o ablación de sitios de restricción en RSV codificantes de ADNc's para facilidad de manipulación e identificación.
En realizaciones preferidas, los cambios nu-cleotídicos en el RSV quimérico humano-bovino incluyen la modificación de un gen vírico por delecion del gen o ablación de su expresión. Los genes diana para la mutación en este contexto incluyen la proteína de unión (G) , la proteína de fusión (F) , la pequeña proteína hidrofóbica (SH) , la proteína de unión a AR (N) , la fosfoproteína (P) , la proteína gran polimerasa (L) , el factor de elongación de la transcripción (M2 0RF1) , el factor regulador del ARN M2 0RF2, la proteína de la matriz (M) y dos proteínas no estructurales, NS1 y NS2. Cada una de estas proteínas puede ser selectivamente suprimida, substituida o reorganizada, en todo o en parte, sola o en combinación con otras modificaciones deseadas, para conseguir nuevos recombinantes de RSV quiméricos. En un aspecto de la invención, se modifica un gen SH, NS1, NS2, G o 2-2 en el RSV quimérico humano-bovino. Por ejemplo, se puede suprimir cada uno de estos genes o se puede eliminar su expresión (por ejemplo, por introducción de un codon de parada) para alterar el fenotipo del clon de RSV quimérico humano-bovino resultante y mejorar el crecimiento, la atenuación, la inmunogenicidad u otras características fenotípicas deseadas. Por ejemplo, la delecion del gen SH en la porción de fondo o heteróloga (es decir, receptora o donante, respectivamente) del genoma o antigenoma recombinante dará, un RSV quimérico que tiene nuevas características fenotípicas, tales como un mayor crecimiento in vitro y/o atenuación in vivo. En un aspecto relacionado, se construye una delecion del gen SH, o una delecion de otro gen o segmento genómico no esencial seleccionado, tal como una delecion del gen NS1, NS2 , G o M2-2, en un RSV quimérico humano-bovino, sola o en combinación con una o más mutaciones diferentes que especifican un fenotipo atenuado, por ejemplo una mutación puntual adoptada directamente (o en forma modificada, por ejemplo por introducción de múltiples cambios nucleotídicos en un codon que especifica la mutación) de un mutante de RSV atenuado biológicamente derivado. Por ejemplo, se puede suprimir el gen SH, NS1, NS2, G o M2-2 en combinación con una o más mutaciones cp y/o ts adoptadas de cpts248/404, cpts530/1009 , cpts 530/1030 u otra cepa de RSV mutante seleccionada, para obtener un RSV quimérico que tiene un mayor rendimiento de virus, una mayor atenuación, una mejor inmunogenicidad y resistencia genética a la reversión a partir de un fenotipo atenuado debido a los efectos combinados de las diferentes mutaciones . Las modificaciones nucleotídicas alternativas pueden incluir una deleción, inserción, adición o reorganización de una secuencia reguladora de acción cis para un gen seleccionado en la quimera humana-bovina . En un ejemplo, se cambia una secuencia reguladora de acción cis de un gen de RSV para que se corresponda a una secuencia reguladora heteróloga, que puede ser una secuencia reguladora de acción cis de contrapartida del mismo gen en un RSV diferente o una secuencia reguladora de acción cis de un gen de RSV diferente. Por ejemplo, se puede modificar una señal de final de gen por conversión o substitución a una señal de final de gen de un gen diferente en la misma cepa de RSV. En otras realizaciones, la modificación nucleotídica puede consistir en una inserción, deleción, substitución o reorganización de un sitio de iniciación de la traducción en el genoma o antigenoma quimérico, por ejemplo para eliminar un sitio de iniciación de la traducción alternativo para una forma seleccionada de una proteína. En un ejemplo, el sitio de iniciación de la traducción para una forma segregada de la proteína G de RSV es eliminado para modificar la expresión de esta forma de la proteína G y producir así efectos deseados in vivo. Además, se puede producir una variedad de otras alteraciones genéticas en un genoma o antigenoma de RSV quimérico humano-bovino, solas o junto con una o más mutaciones atenuantes adoptadas a partir de un RSV mutante biológicamente derivado. Por ejemplo, se pueden insertar genes o segmentos genómicos de fuentes no RSV en todo o en parte. Alternativamente, se puede cambiar el orden de los genes, se puede eliminar el solapamiento génico o se puede substituir un promotor genómico de RSV con su contrapartida de antigenoma. Se pueden hacer modificaciones diferentes o adicionales en el genoma o antigenoma quimérico para facilitar las manipulaciones, tales como la inserción de sitios únicos de restricción en varias regiones intergénicas (por ejemplo, un sitio Stul único entre los genes G y F) o en cualquier otro sitio. Se pueden eliminar las secuencias gé-nicas no traducidas para aumentar la capacidad de inserción de secuencias extrañas. En aspectos aún adicionales, se pueden modificar las moléculas polinucleotídicas o vectores codificantes del genoma o antigenoma de RSV quiméricos para codificar secuencias no RSV, por ejemplo una citokina, un epitopo T "helper" , un marcador de sitio de restricción o una proteína de un patógeno microbiano (por ejemplo, virus, bacteria u hongo) capaces de provocar una respuesta inmune protectora en un hospedador pretendido. En una de tales realizaciones, se construyen RSV quiméricos humanos-bovinos que incorporan un gen o segmento genómico de un virus de la parainfluenza (PIV) , por ejemplo una glicoproteína HN o F de PIV o un dominio o epitopo inmunogénico de ésta.
Todas las modificaciones anteriores dentro del genoma o antigenoma del RSV quimérico humano-bovino, incluyendo las inserciones, reorganizaciones, deleciones o substituciones de nucleótidos que dan mutaciones puntuales, cambios nucleotídicos específicos de sitio y cambios que afectan a genes enteros o a segmentos genómicos, pueden ser realizadas en el gen o segmento genómico donante heterólogo o en el genoma o antigenoma de fondo receptor. En cada caso, estas alteraciones especificarán preferiblemente uno o más cambios fenotípicos en el RSV recombinante resultante, tales como un cambio fenotípico que dé como resultado atenuación, sensibilidad a la temperatura, adaptación al frío, tamaño pequeño de placa, restricción en el rango de hospe-dadores, alteración en la expresión génica o un cambio en un epitopo inmunogénico. En otro aspecto de la invención, se proporcionan composiciones (por ejemplo, polinucleótidos aislados y vectores que incorporan un ADNc codificante de RSV) y métodos para producir un RSV quimérico humano-bovino infeccioso aislado. Usando estas composiciones y métodos, se generan partículas víricas o subvíricas de RSV quiméricos infecciosas a partir de un genoma o antigenoma de RSV quimérico humano-bovino coexpresado con una proteína de la nucleocáp-side (N) , una fosfoproteína de la nucleocápside (P) , una proteína gran polimerasa (L) y un factor de elongación de la ARN polimerasa. En aspectos relacionados de la invención se proporcionan composiciones y métodos para introducir los cambios estructurales y fenotípicos antes mencionados en un RSV quimérico humano-bovino recombinante para obtener virus vacunales atenuados infecciosos. En una realización, se facilita un vector de expresión que consiste en una molécula polinucleotídica aislada codificante de un genotna o antigenoma de RSV quimérico humano-bovino. También se proporciona el mismo vector de expresión u otro diferente que contiene una o más moléculas polinucleotídicas aisladas codificantes de las pro-teínas N, P, L y factor de elongación de la ARN polimerasa. Las proteínas pueden ser entonces también expresadas directamente a partir del ADNc del genoma o antigenoma. El (los) vector (es) es/son preferiblemente expresado (s) o coexpresado (s) en una célula o un lisado libre de células, produ-ciendo así una partícula vírica o subvírica de RSV quimérico humano-bovino infecciosa. El genoma o antigenoma de RSV y las proteínas N, P, L y factor de elongación de la ARN polimerasa (preferiblemente, el producto del M2 (0RF1) de RSV) pueden ser co-expresados por los mismos o por diferentes vectores de expresión. En algunos casos, las proteínas N, P, L y factor de elongación de la ARN polimerasa son cada una codificadas en diferentes vectores de expresión. La molécula polinu-cleotídica codificante del genoma o antigenoma de RSV qui-mérico humano-bovino es una quimera de secuencias polinucleotídicas humanas y bovinas operablemente unidas para permitir la producción de virus o partículas víricas infecciosas a partir de las mismas. En aspectos alternativos de la invención, el genoma o antigenoma de RSV quimérico huma-no-bovino puede incluir secuencias de múltiples cepas o subgrupos (A y B) de RSV humano, así como otras secuencias de RSV no humanos (por ejemplo, murino) . En otros aspectos alternativos, el genoma o antigenoma del RSV quimérico humano-bovino puede incorporar secuencias no RSV, por ejem-pío un polinucleotido que contenga secuencias de RSV humano y bovino operablemente unidas con un nucleótido o polinucleotido codificante de una mutación puntual, proteína, do-minio proteico o epitopo inmunogénico de PIV o de otro virus ARN de hebra negativa. Los anteriores métodos y composiciones para producir RSV quiméricos humanos-bovinos dan partículas ví-ricas o subvíricas infecciosas, o derivados de éstas. Un virus infeccioso es comparable a la partícula vírica de RSV auténtica y es infeccioso tal cual. Pude infectar directamente células frescas. Una partícula subvírica infecciosa es típicamente un subcomponente de la partícula vírica que puede iniciar una infección en las condiciones apropiadas. Por ejemplo, una nucleocápside que contenga el ARN genómico o antigenómico y las proteínas N, P, L y M2 (ORF1) es un ejemplo de una partícula subvírica que puede iniciar una infección si se introduce en el citoplasma de las células . Las partículas subvíricas provistas en la invención incluyen partículas víricas que carecen de una o más proteínas, segmentos de proteínas u otros componentes víricos no esenciales para la infectividad. En otras realizaciones, la invención proporcio-na una célula o lisado libre de células que contiene un vector de expresión que consiste en una molécula polinu-cleotídica aislada codificante de un genoma o antigenoma de RSV quimérico humano-bovino según se ha descrito antes y un vector de expresión (el mismo vector u otro diferente) que consiste en una o más moléculas polinucleotídicas aisladas codificantes de las proteínas N, P, L y factor de elongación de la ARN polimerasa de RSV. También se puede expresar una o más de estas proteínas a partir del genoma o antigenoma ADNc . Al expresarse, el genoma o antigenoma y las pro-teínas N, P, L y factor de elongación de la ARN polimerasa se combinan para producir una partícula vírica o subvírica de RSV quimérico humano-bovino infecciosa.
El RSV quimérico humano-bovino atenuado de la invención es capaz de provocar una respuesta inmune protectora en un hospedador humano infectado y es aún lo suficientemente atenuado como para no causar síntomas inacepta^ bles de enfermedad respiratoria grave en el hospedador inmunizado. El virus o partícula subvírica quimérica atenuada puede estar presente en un sobrenadante de cultivo celular, ser aislada del cultivo o ser completamente purificada. El virus puede ser también liofilizado o puede combinarse con una variedad de otros componentes para almacenamiento o administración a un hospedador, según se desee. La invención proporciona además nuevas vacunas consistentes en un vehículo y/o adyuvante fisiológicamente aceptable y un RSV quimérico humano-bovino atenuado aisla-do. En una realización, la vacuna consta de un RSV quimérico humano-bovino que tiene al menos una y, preferiblemente, dos o más mutaciones atenuantes u otras modificaciones nu-cleotídicas según se ha descrito anteriormente. La vacuna puede ser formulada en una dosis de 103 a 106 PFU (unidades formadoras de placa) de virus atenuado. La vacuna puede consistir en virus quimérico atenuado que provoque una respuesta inmune frente a una sola cepa o subgrupo antigénico de RSV, por ejemplo A, o B, o frente a múltiples cepas o subgrupos de RSV. En este sentido, el RSV quimérico humano-bovino de la invención puede provocar individualmente una respuesta inmune monoespecífica o una respuesta inmune po-liespecífica frente a múltiples cepas o subgrupos de RSV. El RSV quimérico humano-bovino puede ser combinado en formulaciones vacunales con otros RSV quiméricos o RSV no qui-méricos que tengan diferentes características inmunogénicas para una protección más efectiva frente a una o múltiples cepas o subgrupos de RSV.
En aspectos relacionados, la invención proporciona un método para estimular el sistema inmune de un individuo con objeto de provocar una respuesta inmune frente a una o más cepas o subgrupos de RSV en un sujeto mamífero. El método consiste en administrar una formulación de una cantidad inmunológicamente suficiente de un RSV quimérico humano-bovino atenuado en un vehículo y/o adyuvante fisiológicamente aceptable. En una realización, la composición inmunogénica es una vacuna constituida por RSV quimérico humano-bovino que tiene al menos una y, preferiblemente, dos o más mutaciones atenuantes u otras modificaciones nu-cleotídicas que especifican un fenotipo deseado como se ha descrito anteriormente. La vacuna puede ser formulada en una dosis de 103 a 106 PFU de virus atenuado. La vacuna pue-de consistir en virus RSV quimérico humano-bovino atenuado que provoca una respuesta inmune frente a una sola cepa o subgrupo antigénico, por ejemplo A o B, de RSV. 0 frente a múltiples cepas o subgrupos de RSV. En este contexto, el RSV quimérico humano-bovino puede provocar una respuesta inmune monoespecífica o una respuesta inmune poliespecífica frente a múltiples cepas o subgrupos de RSV. Alternativamente, se puede combinar RSV quimérico humano-bovino que tenga diferentes características inmunogénicas en una mezcla vacunal o administrarlo por separado en un protocolo de tratamiento coordinado para provocar una protección más efectiva frente a una cepa de RSV o frente a múltiples cepas o subgrupos de RSV. Preferiblemente, la composición inmunogénica es administrada en el tracto respiratorio superior, por ejemplo por pulverización, gotículas o aerosol. Con frecuencia, la composición será administrada a un individuo seronegativo para anticuerpos para RSV o que posee anticuerpos maternos adquiridos transplacentariamente para RSV. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Fig. 1A y IB representan la substitución de los genes G y F de la cepa Atue51908 del RSV bovino (BRSV) recombinante (r) con los genes G y F de la cepa A2 del RSV humano (HRSV) para crear el virus quimérico recombinante rBRSV/A2. La Fig. 1A es un diagrama del genoma de rBRSV, que ilustra la substitución de los genes F y G con los de HRSV. La localización de los marcos de lectura abierta (ORF) es mostrada como rectángulos sombreados (BRSV) o blancos (HRSV) . Los genes G y F son mostrados como extensiones, en donde las señales de final de gen/poliadenilación están representadas por barras, las se-ñales de iniciación de gen están mostradas como triángulos rellenos y las posiciones de los sitios de restricción sintéticos que sirven como marcadores genéticos o límites de los fragmentos de restricción intercambiados están indicadas por cabezas de flecha con la posición en la secuencia del antigenoma completo mostrada debajo. El tamaño de los fragmentos enmarcados por los sitios de restricción marcadores está indicado entre paréntesis. La longitud del genoma de los virus recombinantes está indicada a la izquierda. Los números romanos (I, II y III) se refieren a regiones intergénicas que están expandidas en la Fig. IB. La Fig. IB ilustra la alineación de las regiones intergénicas SH/G (I), G/F (II) y F/M2 (III) de una cepa ATue51908 de BRSV biológicamente derivado (línea superior) ; la versión recombinante, rBRSV ATue51908 (segunda línea) , un virus quimérico recombinante rBRSV/A2 (tercera línea) y la cepa A2 del HRSV biológicamente derivado (línea inferior). Figura IB, Panel I: región intergénica SH/G: ATue51908 (línea superior) (SEC ID N° 1) ; rB SV (segunda línea (SEC ID N° 2) ; rBRSV/A2 (tercera línea) (SEC ID N° 3) ; HRSV cepa A2 (línea inferior (SEC ID N° 4) . Figura IB, Panel II: región intergénica G/F: ATue51908 (línea supe-rior) (SEC ID N° 5) ; rBRSV (segunda línea) (SEC ID N° 6) ; rBRSV/A2 (tercera línea) (SEC ID N° 7) ; HRSV A2 (línea inferior) (SEC ID N° 8). Figura IB, Panel III: región intergénica F/M2 : ATue51908 (línea superior) (SEC ID N° 9); rBRSV (segunda línea) (SEC ID N° 10) ; rBRSV/A2 (tercera lí-nea) (SEC ID N° 11) ; HRSV A2 (SEC ID N° 12) . Las secuencias son mostradas como hebra positiva de ADN. Los huecos están indicados por puntos, las señales de iniciación de gen y de final de gen están sombreadas y los codones de iniciación de la traducción están en negrilla. Las marcas picadas in-dican identidad de nucleótidos. Los sitios de restricción están indicados, con las secuencias de reconocimiento sombreadas. Orf es marco de lectura abierta. La numeración se refiere a las posiciones genómicas (para BRSV, cepa ATue51908: N° Acceso GenBank AF092942; para HRSV, cepa A2 : N° Acceso GenBank M74568) . Las Figs. 2A-2C demuestran los sitios de restricción marcadores en los genomas de BRSV biológicamente derivados (ATue51908) , su versión recombinante rBRSV y la quimera recombinante rBRSV-A2. Se llevó a cabo una RT-PCR sobre el ARN total de células BSR T7/5 infectadas con el virus indicado. Se sometieron los productos de la PCR a análisis de restricción y se analizaron en un gel de agaro-sa al 2% (Figs. 2A y 2B) o al 3% (Fig. 2C) . Las longitudes nucleotídicas son estimadas en base a los tamaños calcula-dos. En todos los casos, no se detectó un producto de PCR cuando se omitió la etapa RT. M, escalera de ADN de 1 kb (Life Technologies, Gaithersburg, Maryland) . El tamaño de algunos fragmentos marcadores está indicado a la derecha. La Fig. 2A muestra un análisis de los productos RT-PCR correspondientes a las posiciones 3612 a 4886 (ATue51908 y rBRSV) o a las posiciones 3612 a 4885 (rBRSV/A2) , que abarcan el sitio Salí (posición 4673) contenido en las regiones intergénicas SH/G de los aislados víricos recombinantes . Los productos de PCR correspondientes al tamaño predicho de aproximadamente 1273-1274 pb fueron digeridos con Salí. Éste no escindió el ATue51908 bio-lógicamente derivado, que carecía de este sitio introducido, mientras que, para los virus recombinantes, éste dio lugar a bandas de 1061 pb (ambos virus) y 213 pb (rBRSV) ó 212 pb (rBRSV/A2) . La Fig. 2B muestra un análisis de los productos de RT-PCR correspondientes a las posiciones 5372 a 5964 (ATue51908 y rBRSV) o a las posiciones 5452 a 6062 (rBRSV/A2) , que contienen las regiones intergénicas G/F y los sitios de restricción marcadores respectivos en los virus recombinantes (un sitio Sphl en la posición de rBRSV 5539 o un sitio Stul en la posición de rBRSV-A2 5619) . Los productos de la PCR eran del tamaño esperado de aproximadamente 592 (ATue51908 y rBRSV) ó 610 (rBRSV/A2) . Sphl digería sólo rBRSV, según se había predicho, dando lugar a fragmentos de 425 pb y 167 pb. Stul digería sólo rBRSV/A2, según se había predicho, dando lugar a fragmentos de 443 pb y 167 pb. La Fig. 2C muestra un análisis de los productos de RT-PCR que abarcaban las posiciones 7218 a 7852 (ATue51908 y rBRSV) ó 7316 a 7939 (rBRSV/A2) , que contenían la región intergénica F/ 2. Tal como se había predicho, la digestión con Xhol no escindió ATue51908, pero, en el caso de rBRSV y rBRSV/A2, dio lugar a fragmentos de 395 pb (am-bos virus) y 267 pb (rBRSV) ó 256 pb (rBRSV/A2) . Esto reveló la presencia del sitio Xhol introducido (posición de rBRSV 7471, posición de rBRSV-A2 7558) en los genomas de los virus recombinantes . La Fig. 3 muestra una comparación del crecimiento de rBRSV, rBRSV/A2 y HRSV cepa Long en células HEp-2 humanas (Panel A) y células MDBK bovinas (Panel B) . Se infectaron monocapas de células por duplicado en placas de 24 pocilios con una MOI (multiplicidad de infección) de 0,1 de cualquiera de los virus. Se tomaron alícuotas de sobrenadante en los tiempos indicados, se congelaron a -70°C y se titularon después por duplicado. Cada valor es el título medio del material de dos pocilios de células infectadas. La Fig. 4A proporciona un examen de microscopio electrónico de viriones de BRSV recombinante tras la fijación con glutaraldehído, seguido de mareaje con inmunooro y tinción negativa (vista general y ampliación) . La Figura 4B proporciona un examen de microscopio electrónico de viriones detectados en secciones ultradelgadas . La larga forma filamentosa del virión, así como los epitopos antigénicos sobre la superficie del virión se conservan con la técnica de preparación. (Fig. 4A barra: 2 , ampliación: barra: 100 nm, Fig. 4B barra: 150 nm) . La Fig. 5 muestra el mareaje de inmunooro usan-do anticuerpos monoclonales que reaccionan tanto con la proteína F de HRSV como con la proteína F de BRSV (Paneles A, C y E) o exclusivamente con la proteína F de HRSV (Paneles B, D y F) . Mareaje de las preparaciones de rBRSV (Paneles A y B) , rBRSV/A2 (Paneles C y D) y HRSV cepa Long (Pa-neles E y F) . Barra: 150 nm. La Fig. 6 muestra el mareaje de inmunooro usando anticuerpos monoclonales que reaccionan con la proteína G de BRSV (Paneles A, C y E) o con la proteína G de HRSV (Paneles B, D y F) . El mareaje de preparaciones de rBRSV (Paneles A y B) , rBRSV/A2 (paneles C y D) y de la cepa de HRSV Long (Paneles E, F) . Barra: 150 nm. Las Fig. 7A y 7B representan la substitución del gen F de la cepa de rBRSV ATue51908 con el gen F de la cepa de HRSV Long para crear el virus quimérico recombinan-te rBRSV/LongF. La Fig. 7A es un diagrama del genoma de rBRSV que ilustra la substitución del gen F con el de la cepa Long de HRSV. La localización de los marcos de lectura abierta (ORF) está mostrada como rectángulos sombreados (BRSV) o blancos (HRSV) . El gen F es mostrado como extensión, en donde las señales de final de gen/poliadenilación están representadas por barras, las señales de iniciación de gen están mostradas como triángulos rellenos y las posiciones de los sitios de restricción sintéticos que sirven como marcadores genéticos o como límites de fragmentos de restricción intercambiados están indicadas por cabezas de flecha con la posición de la secuencia del antigenoma completo mostrada debajo. El tamaño de los fragmentos enmarcados por los sitios de restricción marcadores está indicado (entre paréntesis) . La longitud del genoma de los virus re-combinantes está indicada a la izquierda. Los números roma-nos (I, II y III) se refieren a regiones intergénicas, que están ampliadas en la Fig. 8B. La Fig. 7B muestra la alineación de las regiones intergénicas SH/G (I) SH/G (I), G/F (II) y F/M2 (III) de la cepa ATue51908 de BRSV biológicamente derivado (línea superior) ; la versión recombinante, rBRSV ATue51908 (segunda línea) y el virus quimérico recombinante rBRSV/LongF (línea inferior) . Las anotaciones son como en la Fig. 1.
Figura 7B, Panel I: región intergénica SH/G: ATue51908 (línea superior) (SEC ID N° 1) ; rBRSV (segunda línea (SEC ID N° 2) ; rBRSV/LongF (tercera línea) (SEC ID N° 2) . Figura 7B, Panel II: región intergénica G/F: ATue51908 (línea su-perior) (SEC ID N° 5) ; rBRSV (segunda línea) (SEC ID N° 6) ; rBRSV/LongF (tercera línea) (SEC ID N° 13) . Figura 7B, Panel III: región intergénica F/M2 : ATue51908 (línea superior) (SEC ID N° 9); rBRSV (segunda línea) (SEC ID N° 10); rBRSV/A2 (tercera línea) (SEC ID N° 11) . La Fig. 8 proporciona el análisis de RT-PCR y restricción que confirma la identidad del aislado vírico recombinante rBRSV/LongF. Se hicieron dos RT-PCR usando AR total de células infectadas con los aislados víricos indicados. Los productos de la PCR fueron analizados en un gel de agarosa al 0,8%. No se obtuvo ningún producto de PCR si se omitía la etapa RT. Las longitudes nucleotídicas son estimaciones basadas en los tamaños calculados. M, escalera de ADN de 1 kb (Life Technologies, Gaithersburg, MD) . El tamaño de algunos fragmentos marcadores está indicado a la izquierda. La PCR 1 fue realizada usando un par de cebadores que se hibridaban con las secuencias del esqueleto de BRSV (ATue51908 nt 5380-5397 (gen G de BRSV) y ATue51908 nt 7567-7550 (gen M2 BRSV) , aguas arriba y aguas abajo del gen F. La PCR 1 dio productos de 2.187 nt para la cepa Atue51908 de BRSV y el análogo recombinante rBRSV y de 2.161 nt para rBRSV/LongF (estas bandas no son distinguibles por movilidad electroforética en estas condiciones) . Tal como se esperaba, no se obtuvo ningún producto de PCR del ARN de la cepa Long de HRSV usando la anterior pareja de cebadores de BRSV. Los productos de la PCR 1 fueron sometidos a análisis de restricción. Como se había predicho, los virus recombinantes , pero no la cepa estándar de BRSV ATue51908, fueron escindidos por Sphl (dando bandas de 2.028 pb y 159 pb para rBRSV y 2.002 pb y 159 pb para rBRSV/LongF) , lo que demuestra la existencia del sitio de restricción marcador Sphl sintético (pos. 5539 del genoma de rBRSV y rBRSV/LongF) . EcoRI escinde en el sitio natural EcoRI del gen F de BRSV ATue51908 y rBRSV (pos. Genómica 6233) para dar dos fragmentos de 1.334 nt y 853 nt, mientras que el fragmento que se origina de rBRSV/LongF no es escindido por EcoRI, según se había predicho. Cuando se di-gieren con PstI, tal como se esperaba, los fragmentos que contienen el gen F de BRSV permanecen sin escindir y el producto rBRSV/LongF es escindido en tres fragmentos de 1.351 pb, 586 pb y 224 pb, lo que revela la existencia de dos sitios PstI naturales (pos. 63 y 649) contenidos en el gen F de HRSV Long. La PCR 2 fue realizada usando un par de cebadores que se hibridaban con el gen F de la cepa Long de HRSV (cebador FL, 3 ' -GGGGCAAATAACAATGGAGTTGCCAATC-5 ' (SEC ID N" 19) , nt 1-28 de la secuencia del gen F de la cepa Long de HRSV, y cebador FLr, 5'-TTTTTATATAACTATAAACTAGGAATCTAC-3' (SEC ID N° 20), nt 1903-1874 del gen F de la cepa Long de HRSV) , dando un producto de PCR de 1.903 pb para rBRSV/LongF y para el virus paren-tai HRSV cepa Long. Tal como se esperaba, no se obtuvo ningún producto para rBRSV. La digestión con EcoRI y PstI die-ron el patrón de escisión esperado. La Fig. 9 proporciona un análisis microscópico inmunoelectrónico de las proteínas de superficie de rBRSV/LongF. Panel A: mAb G66 para la proteína G de BRSV; Panel B: mAb 021/21G para la proteína G de HRSV; Panel C: mAb 2F, reactivo con las proteínas F de HRSV y de BRSV, y Panel D: mAb 44F, específico para la proteína F de HRSV; barra: 150 nm.
La Fig. 10 detalla la construcción de un genoma quimérico rBRSV/HRSV en el que los genes G y F de BRSV han sido suprimidos y los genes G y F de HRSV han sido colocados en una posición proximal al promotor. Los genes de BRSV están sombreados; los genes de HRSV están claros. Los números de posición de la secuencia nucleotídica son relativos al antigenoma de rBRSV completo (Buchholz y col., J. Virol. 73: 251-259, 1999; Buchholz y col., J. Virol. 74: 1187-1199, 2000; número de acceso GenBank AF092942, o antigenoma de rHRSV completo en Collins y col., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 92: 11563-11567, 1995, cada una de ellas aquí incorporada como referencia) ; los números de posición de secuencia que se refieren a la secuencia de HRSV están subrayados . La Fig. 10, Panel A, detalla la estructura de rBRSV que con-tiene sitios Notl, Salí y Xhol que fueron añadidos en un trabajo previo (Buchholz y col., J. Virol. 73: 251-259, 1999; Buchholz y col., J. Virol. 74: 1187-1199, 2000). La Fig. 10, Panel B, representa modificaciones en rBRSV para crear rBRSV/A2-G1F2. Los genes G y F de BRSV fueron supri-midos por digestión con Salí y Xhol y religadura de los extremos cohesivos compatibles resultantes. La región del genoma de HRSV desde el nucleótido 4692 hasta el 7557, que contiene los genes G y F, fue amplificada por PCR usando cebadores que contenían cambios deseados para incorporación en cada extremo del ADNc . El producto de PCR amplificado contenía (en el orden de aguas arriba a aguas abajo) : un sitio Notl, un sitio BlpI, el ORF G de HRSV completo, su señal aguas abajo no codificante y GE, la secuencia de RSV G-F IG, el gen F de HRSV completo, 6 nucleótidos de la se-cuencia de HRSV F-M2 IG (CACAAT) , la señal GS de NS1, un sitio BlpI y un sitio Notl . Este ADNc fue clonado en el sitio único Notl en la posición 67 de rBRSV. La Fig. 10, Pa-nel C, ilustra la estructura del ARN genómico de rBRSV/A2-Gl F2. La Fig. 11 representa el crecimiento multicí-clico de rBRSV, rHRSV (rA2 ) , rBRSV/A2 y rBRSV/A2-Gl F2 en células humanas HEp (panel de la izquierda) y bovinas MDBK (panel de la derecha) . Se infectaron monocapas celulares por duplicado con el virus indicado a una MOI de 0,1 y se incubaron a 37 °C y se recogieron alícuotas de medio a los tiempos indicados, se congelaron instantáneamente, se guardaron a -70°C y se titularon después por duplicado. Cada valor es el título medio de dos pocilios. La Fig. 12 muestra la inmunofluorescencia indirecta de células HEp-2 infectadas con rBRSV/A2 -G1F2 , rBRSV/A2 o rA2. Las células fueron infectadas a una MOI de 0,1, incubadas a 37°C durante 96 horas, fijadas con acetona y permeabilizadas y se les hizo reaccionar con anticuerpo monoclonal 021/lG, específico para la proteína G de HRSV, o con anticuerpo monoclonal 44F, específico para la proteína F de HRSV. La unión de los anticuerpos fue visualizada por reacción con un anticuerpo marcado específico para IgG mu-rina. La Fig. 13 detalla la construcción de un rBRSV/HRSV quimérico que contenía los genes M, G y F de HRSV. Los genes de BRSV están sombreados; los genes de HRSV están claros. Los números de posición de secuencia que se refieren a los genes de HRSV están subrayados. La Fig. 13, Panel A, representa la modificación de rBRSV/A2 para contener un sitio único MluI en la posición 3204, dentro de la región intergénica entre los genes P y M (P-M IG) . Se mues-tra la secuencia de la IG, indicando las letras en minúscula las asignaciones de nucleótidos originales. Las letras subrayadas indican el sitio Afluí creado por las 5 substitu-ciones nucleotídicas . Los números de posición de la secuencia de nucleótidos son relativos al antigenoma de rBRSV completo (Buchholz y col., y col., J. Virol. 73: 251-259, 1999; Buchholz y col., J. Virol. 74: 1187-1199, 2000; núme-ro de acceso GenBank AF092942, o antigenoma de rHRSV completo en Collins y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92: 11563-11567, 1995; los números de posición de secuencia que se refieren a la secuencia de HRSV están subrayados. La Fig. 13, Panel B, ilustra la modificación de rBRSV/A2 para crear rBRSV/A2 -MGF . El fragmento Miul-Salí que contiene los genes M y SH de BRSV fue cortado y substituido con un fragmento Miul-Salí que contiene el gen M de HRSV. El fragmento Mlul-Sall que contiene el gen M de HRSV está mostrado en la caja. También se muestra la secuencia que está inmediata-mente aguas arriba del sitio MluI (SEC ID N° 17) , que incluye la secuencia de final de gen P de BRSV, y la secuencia inmediatamente aguas abajo del sitio del sitio Salí (SEC ID N° 18) , que incluye la secuencia intergénica entre los genes M y G (M-G IG) , la señal de iniciación de gen G de HRSV y el ATG (negrilla, cursiva) , que comienza el ORF G. La Fig. 13, Panel C, representa la estructura del genoma de rBRSV/A2 -MGF . DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES ESPECÍFICAS La presente invención proporciona virus sinci-tial respiratorio (RSV) recombinante clonado como una quimera de secuencias genomicas o antigenomicas de RSV humano y bovino para obtener un RSV quimérico humano-bovino . La construcción quimérica de RSV humano-bovino da una partícula vírica o una partícula subvírica que es infecciosa en mamíferos, particularmente humanos, y que es útil para generar composiciones inmunogénicas para uso clínico. También se proporcionan dentro de la invención nuevos métodos y composiciones para diseñar y producir RSV quiméricos humanos-bovinos atenuados, así como métodos y composiciones para la profilaxis y el tratamiento de la infección por RSV. Los RSV quiméricos humanos-bovinos y las composiciones in-munogénicas según la invención pueden provocar una respuesta inmune para una subgrupo o cepa de RSV específicos, o pueden provocar una respuesta poliespecífica frente a múltiples subgrupos o cepas de RSV. El RSV se caracteriza, en general, como un vi-rus ARN de hebra negativa no segmentado y envuelto de la familia de los paramyxovirus (Collins y col., Fields Viro-logy 2: 1313-1352, 1996). Su genoma, que tiene 15.222 nu-cleótidos (nt) de longitud para la bien conocida cepa A2, es transcrito en 10 ARN mensajeros que codifican para 11 proteínas (Collins y col., Fields Virology 2: 1313-1352, 1996; Atreya y col., J. Virol. 72: 1452-61, 1998; Bukreyev y col., J. Virol. 71: 8973-82, 1997; Collins y col., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 93: 81-5, 1996; Teng y Collins, J. Virol. 72: 5707-16, 1998; Teng y Collins, J. Virol. 73: 466-473, 1999; Whitehead y col., J. Virol . , 73: 3438-42, 1999, cada una de ellas aquí incorporada como referencia) . Cuatro de éstas son proteínas de la nucleocápside/polimerasas, a saber, la proteína mayor de la nucleocápside N, la fosfo-proteína P y la proteína polimerasa L, y la proteína anti-finalización de la transcripción M2-1. Tres son glicopro-teínas de superficie, a saber, la proteína de unión G, la glicoproteína de fusión F responsable de la penetración y formación de sincitios, y la pequeña proteína hidrofóbica SH de función desconocida. La proteína de la matriz es una proteína viriónica interna implicada en la formación de viriones. Hay dos proteínas no estructurales, NS1 y NS2 , de función desconocida. Finalmente, hay un segundo marco de lectura abierta (ORF) en el ARNm M2 que codifica para un factor regulador de ARN M2-2. Las proteínas G y F son los antígenos mayores de neutralización y protectores (Collins y col., Fields Vi-rology 2: 1313-1352, 1996; Connors y col., J. Virol . 66: 1277-81, 1992) . La resistencia a la reinfección por RSV está en gran medida mediada por anticuerpos séricos y mucosa-Ies contra estas proteínas . También se inducen células T citotóxicas específicas de RSV por la infección con RSV y éstas pueden dirigirse contra una serie de proteínas diferentes, pero este efector aún no ha mostrado ser un importante contribuidor a la resistencia a largo plazo a la reinfección. Sin embargo, las células tanto CD8+ como CD4+ pueden ser importantes en la regulación de la respuesta in-muñe y ambas pueden estar implicadas en la patogénesis del virus (Johnson y col., J. Virol . 72: 2871-80, 1998; Sri-kiatkhachorn y Braciale, J . Ex . ed . 186: 421-32, 1997) . Así, F y G son los determinantes antigénicos más importantes, pero otras proteínas pueden tener también papeles im-portantes en la respuesta inmune. Los aislados de RSV pueden ser segregados en dos subgrupos antigénicos, A y B, por reactividad con anticuerpos monoclonales (Anderson y col., J. Infect. Dis. 151: 626-33, 1985; Mufson y col., J. Gen. Virol. 66: 2111-24, 1985) . Los dos subgrupos exhiben diferencias a través del genoma, pero son los más divergentes en el ectodominio de la proteína G, donde el porcentaje de divergencia en la secuencia de aminoácidos puede superar el 50% y la divergencia antigénica es de un 95% en base a la reactividad de an-tisueros policlonales monoespecíficos (Johnson y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84: 5625-9, 1987; Johnson y col., J. Virol. 61: 3163-6, 1987). La proteína F es aproxi-madamente un 10% divergente por secuencia de aminoácidos y un 50% divergente antigénicamente entre los subgrupos A y B de RSV (Johnson y col., J. Virol . 61: 3163-6, 1987; Johnson y Collins, J. Gen. Virol . 69: 2623-8, 1988) . Así, ambos subgrupos deben estar representados en una vacuna. El RSV bovino (BRSV) está relacionado con el RSV humano (HRSV) y es un agente ubicuo comercialmente importante de la enfermedad del tracto respiratorio en ganado vacuno (Mohanty y col., Am. J. Vet . Res. 36:417-9, 1975; Van der Poel y col., J. Infect. 29: 215-28, 1994). La cantidad de divergencia de secuencia entre BRSV y HRSV es aproximadamente dos veces la que hay entre los subgrupos A y B de HRSV indicados anteriormente. Así, las proteínas F tienen aproximadamente un 20% de divergencia de aminoácidos entre BRSV y HRSV y las proteínas G aproximadamente un 70% de divergencia (Lerch y col., J. Virol. 64 5559-69, 1990; Lerch y col., Virology 181: 118-31, 1991; Mallipeddi y Sa-mal, J. Gen. Virol. 74: 2001-4, 1993; Mallipeddi y Samal, Vet . Microbiol . 36: 359-67, 1993; Samal y col., Virology 180: 453-456, 1991; Samal y Zamora, J. Gen. Virol. 72: 1717-1720, 1991; Zamora y Samal, Virus Res . 24: 115-121, 1992; ídem, J. Gen. Virol. 73: 737-741, 1992; Mallipeddi y Samal, J . Gen . Virol . 73: 2441-2444, 1992; Pastey y Samal, J. Gen. Virol. 76: 193-197, 1995; Walravens y col., J . Gen . Virol . 71: 3009-3014, 1990; Yunnus y col., J. Gen. Virol. 79: 2231-2238, 1998, cada una de ellas aquí incorporada a modo de referencia) . La capacidad para producir HRSV infeccioso a partir de ADNc ha sido ampliada para permitir la producción recombinante de BRSV y se ha producido así virus recombinante infeccioso (Buchholz y col., J. Virol. 73: 251-9, 1999) . Se ha evaluado BRSV en ratas del algodón (Piaz-za y col., J. Virol . 67: 1503-10, 1993), monos búho y chimpancés (Prince y col., Animal Models in Respiratory Syncy-tial Virus Infections, 1990) como vacuna frente a HRSV. El BRSV estaba altamente restringido en los tres animales ex-perimentales y las respuestas inmunes eran muy bajas. En ratas, se observó una resistencia significativa a la inoculación con HRSV en un estudio, pero la base de este efecto protector permanece poco clara. En monos, se detectaron respuestas de anticuerpos para la vacuna BRSV en sólo 2 de 9 animales. Tras posterior inoculación con HRSV, la duración de la eliminación estaba ligeramente reducida, pero no estaban afectados ni la magnitud de la eliminación ni los síntomas de la enfermedad. En un estudio paralelo de dos chimpancés que recibieron un alto inoculo de BRSV, hubo evidencia de replicación en sólo un animal y, tras posterior inoculación con HRSV, la duración de la eliminación estaba ligeramente reducida, pero, por lo demás, el título de HRSV y la magnitud de los síntomas clínicos no estaban disminuidos. Estos estudios indican que los aislados de BRSV encontrados en la naturaleza no son adecuados para uso vacunal directo. La presente invención permite el desarrollo de candidatos vacunales de RSV vivos atenuados en base a quimeras entre HRSV y BRSV. Las quimeras son construidas a través de un intermediario de ADNc y de un sistema de recuperación basado en ADNc. Los virus recombinantes hechos a partir de ADNc se replican independientemente y se propagan del mismo modo que si derivaran biológicamente y, ciertamente, sólo pueden distinguirse de los virus derivados bio-lógicamente por la presencia de mutaciones que han sido específicamente insertadas. Los candidatos vacunales quiméricos HRSV/BRSV llevan preferiblemente uno o más determinan-tes antigénicos mayores de HRSV en un fondo que está atenuado por la presencia de uno o más genes BRSV. Además, los RSV quiméricos humanos-bovinos según la invención pueden ser aún modificados para incorporar mutaciones atenuantes específicas, así como una variedad de otras mutaciones y modificaciones nucleotídicas, para obtener efectos estructurales o fenotípicos deseados. Se exponen descripciones detalladas de los materiales y métodos para producir RSV recombinantes a partir de ADNc y para hacer y estudiar el rango completo de mutaciones y modificaciones nucleotídicas aquí descritas como aspectos suplementarios de la presente invención en, por ejemplo, la Solicitud de Patente Provisional EE.UU. N" 60/007.083, presentada el 7 de Septiembre de 1995; Solici-tud de Patente EE.UU. N° 08/720.132, presentada el 27 de Septiembre de 1996; Solicitud de Patente Provisional EE.UU. N° 60/021.773, presentada el 15 de Julio de 1996; Solicitud de Patente Provisional EE.UU. N° 60/046.141, presentada el 9 de mayo de 1997; Solicitud de Patente Provisional EE.UU. N° 60/047.634, presentada el 23 de Mayo de 1997; Patente EE.UU. N° 5.993.824, concedida el 30 de Noviembre de 1999 (correspondiente a la Publicación Internacional N° O 98/02530); Solicitud de Patente EE.UU. N° 09/291.894, presentada por Collins y col. el 13 de Abril de 1999; Solici-tud de Patente Provisional EE.UU. N° 60/129.006, presentada por Murphy y col. el 13 de Abril de 1999; Crowe y col., Vaccine 12: 691-699, 1994, y Crowe y col., Vaccine 12: 783-790, 1994; Collins y col., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 92: 11563-11567, 1995; Bukreyev y col., J. Virol. 70: 6634-41, 1996; Juhasz y col., J. Virol. 71(8): 5814-5819, 1997; Dur-bin y col., Virology 235: 323-332, 1997; Karron y col., J. Infect. Dis. 176: 1428-1436, 1997; He y col., Virology 237:249-260, 1997; Barón y col., J. Virol . 71: 1265-1271, 1997; Whitehead y col., Virology 247(2): 232-9, 1998a; Whitehead y col., J. Virol. 72(5): 4467-4471, 1998b; Jin y col., Virology 251: 206-214, 1998; Bukreyev y col., Proc . Nat. Acad. Sci. USA 96: 2367-2372, 1999; Bermingham y Co-llins, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96: 11259-11264, 1999; Juhasz y col., J. Virol. 73: 5176-5180, 1999; Teng y Co-llins, J. Virol. 73: 466-473, 1999; Whitehead y col., Virol . 73: 871-877, 1999, y Whitehead y col., J. Virol. 73: 3438-3442, 1999. Los métodos ejemplares para producir RSV recombinantes a partir de ADNc implican la coexpresión in-tracelular, típicamente a partir de plásmidos cotransfecta-dos en células de cultivo de tejidos, de un ARN antigenómi-co de RSV y las proteínas N, P, M2-1 y L de RSV. Esto pro duce una infección productiva que da lugar a la producción de virus infeccioso derivado de ADNc, que es denominado virus recombinante . Una vez generado, el RSV recombinante es fácilmente propagado de la misma forma que el virus derivado biológicamente y no se puede distinguir un virus recom-binante de un virus de contrapartida biológicamente derivado a menos que el primero hubiera sido modificado para contener uno o más cambios introducidos como marcadores . En aspectos más detallados, los documentos antes incorporados describen métodos y procedimientos útiles en la invención para mutagenizar, aislar y caracterizar RSV para obtener cepas mutantes atenuadas (por ejemplo, cepas mutantes sensibles a la temperatura (ts) , pasadas por frío (cp) , adaptadas al frío (ca) , de placa pequeña (sp) y de restricción del rango de hospedadores (hr) y para identifi-car los cambios genéticos que especifican el fenotipo atenuado. Junto con estos métodos, los documentos anteriores detallan procedimientos para determinar la replicación, in-raunogenicidad, estabilidad genética y eficacia protectora del RSV humano atenuado biológicamente derivado y recombi-nan emente producido, incluyendo los subgrupos A y B del RSV humano, en sistemas modelo aceptados, incluyendo siste-mas modelo murinos y de primates no humanos. Además, estos documentos describen métodos generales para desarrollar y estudiar composicones inmunogénicas, incluyendo vacunas monovalentes y bivalentes, para la profilaxis y el tratamiento de la enfermedad por RSV. La capacidad para generar RSV infecciosos a partir de ADNc proporciona un método para introducir cambios predeterminados en virus infeccioso a través del intermediario de ADNc. Este método ha demostrado producir un amplio rango de derivados atenuados infecciosos de RSV, por ejemplo candidatos vacunales recombinantes que contienen una o más substituciones de aminoácidos en una proteína vírica, deleción de uno o más genes o ablación de la expresión génica y/o una o más substituciones nucleotídicas en señales de ARN de acción cis que dan efectos deseados sobre el fenotípico vírico (véanse, por ejemplo, Bukreyev y col., J . Virol . 71: 8973-82, 1997; Whitehead y col., J. Virol . 72: 4467-4471 1998; Whitehead y col., Virology 247: 232-239 1998; Bermingham y Collins, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 96: 11259-11264, 1999; Juhasz y col., Vaccine 17: 1416-1424, 1999; Juhasz y col., J. Virol. 73: 5176-5180, 1999; Teng y Collins, J . Virol . 73: 466-473, 1999; Whitehead y col., J. Virol . 73: 871-877, 1999; Whitehead y col., J. Virol. 73: 3438-3442 (1999), y Collins y col., Adv. Virus Res. 54: 423-451, 1999, todas ellas aquí incorporadas como referen-cia. Son ejemplares de las enseñanzas anteriores los métodos para construir y evaluar RSV recombinantes infec-ciosos modificados para incorporar mutaciones específicas de fenotipo identificadas en mutantes RSV biológicamente derivados, por ejemplo mutaciones cp y ts adoptadas en RSV recombinantes a partir de los biológicamente derivados de-signados como cpts RSV 248 (ATCC VR 2450) , cpts RSV 248/404 (ATCC VR 2454), cpts RSV 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC VR 2452) , cpts RSV 530/1009 (ATCC VR 2451) , cpts RSV 530/1030 (ATCC VR 2455), RSV B-l cp52/2B5 (ATCC VR 2542) y RSV B-l cp-23 (ATCC VR 2579) . Estos métodos son fá-cilmente adaptados para la construcción de los RSV quiméricos humanos-bovinos recombinantes de la invención. Los RSV recombinantes así obtenidos pueden incorporar dos o más mutaciones ts del (de los) mismo (s) o de diferente (s) imitante (s) de RSV biológicamente derivado (s), por ejemplo uno o más de los mutantes biológicos 248/404, 248/955, 530/1009 ó 530/1030. En el último contexto, recombinantes múltiplemente atenuados pueden tener una combinación de mutaciones atenuantes de dos, tres o más mutantes biológicos, por ejemplo una combinación de mutaciones atenuantes de los mu-tantes RSV 530/1009/404, 248/404/1009, 248/404/1030 ó 248/404/1009/-1030. En realizaciones ejemplares, una o más mutaciones atenuantes especifican una substitución sensible a la temperatura en el aminoácido Asn43, Phe521, Gln831, Metll69 ó Tyrl321 en el gen polimerasa de RSV o una substi-tución nucleotídica sensible a la temperatura en la secuencia de iniciación génica del gen M2. Preferiblemente, estas mutaciones implican cambios idénticos o conservadores con los siguientes cambios identificados en el RSV mutante biológicamente derivado, por ejemplo cambios conservadores pa-ra las siguientes substituciones identificadas en el gen de la L polimerasa: lie para Asn43, Leu para Phe521, Leu para Gln831, Val para Metll69 y Asn para Tyrl321.
Aún otras mutaciones adicionales que pueden ser incorporadas en los RSV quiméricos humanos-bovinos de la invención son mutaciones, por ejemplo mutaciones atenuantes, identificadas en RSV heterólogos o virus ARN de hebra negativa más distantemente relacionados. En particular, las mutaciones atenuantes y otras deseadas identificadas en un virus ARN de hebra negativa pueden ser "transferidas" , por ejemplo copiadas, a una posición correspondiente en un ge-noma o antigenoma de RSV humano o bovino, ya sea en el RSV quimérico humano-bovino o como medio de construcción del RSV quimérico humano-bovino. Resumiendo, se transfieren las mutaciones deseadas en un virus ARN de hebra negativa hete-rólogo al receptor RSV (por ejemplo, RSV bovino o humano, respectivamente) . Esto implica el mapeo de la mutación en el virus heterólogo, identificando así por alineación de secuencia el sitio correspondiente en el RSV humano o bovino, y mutando la secuencia nativa en el receptor RSV al genotipo imitante (por una mutación idéntica o conservadora) , según se describe en la Solicitud de Patente Provisional EE.UU. N° 60/129.006, presentada por Murphy y col. el 13 de Abril de 1999 y aquí incorporada como referencia. Tal como muestra esta descripción, es preferible modificar el genoma o antigenoma quimérico para que codifique una alteración en el sitio objeto de mutación que se corresponda de un modo conservador con la alteración identificada en el virus imitante heterólogo. Por ejemplo, si una substitución de aminoácido marca un sitio de mutación en el virus mutante en comparación con la secuencia correspondiente de tipo salvaje, entonces habría que hacer por ingeniería una substitu-ción similar en el (los) residuo (s) correspondiente (s) en el virus recombinante . Preferiblemente, la substitución consistirá en un aminoácido idéntico o conservador con respec-to al residuo substituto presente en la proteína vírica mu-tante. Sin embargo, es también posible alterar el residuo de aminoácido nativo en el sitio de la mutación de forma no conservadora con respecto al residuo substituto en la pro-teína mutante (por ejemplo, usando cualquier otro aminoácido para destruir o alterar la función del residuo de tipo salvaje) . Los virus ARN de hebra negativa a partir de los cuales se identifican las mutaciones ejemplares y se transfieren a un RSV quimérico humano-bovino de la invención in-cluyen otros RSV (por ejemplo, murino) , PIV, virus Sendai (SeV) , virus de la enfermedad de Newcastle ( DV) , virus si-miano 5 (SV5) , virus del sarampión (MeV) , virus de la peste bovina, virus del moquillo canino (CDV) , virus de la rabia (RaV) y virus de la estomatitis vesicular (VSV) . Se descri-be una variedad de mutaciones ejemplares, incluyendo, aunque sin limitación, una substitución de aminoácido de fenilalanina en la posición 521 de la proteína L de RSV (correspondiente a una substitución de fenilalanina en la posición 456 de la proteína L de HPIV3) . En el caso de las mutaciones marcadas por deleciones o inserciones, éstas pueden ser introducidas como deleciones o inserciones correspondientes en el virus recombinantes; sin embargo, el tamaño particular y la secuencia de aminoácidos del fragmento proteico suprimido o insertado pueden variar. Se describe también una variedad de tipos adicionales de mutaciones en las referencias anteriormente incorporadas y pueden ser fácilmente realizadas por ingeniería en un RSV quimérico humano-bovino recombinante de la invención para calibrar la atenuación o la inmunogenicidad o para obtener otros efectos estructurales y/o fenotípicos ventajosos. Por ejemplo, se introducen rutinariamente marcadores de sitios de restricción en el genoma o antigenoma quimérico humano-bovino para facilitar la construcción y manipulación del ADNc . También se describe en las referencias incorporadas un amplio rango de modificaciones nucleo-tídicas distintas de mutaciones puntuales o específicas de sitio que son útiles en la presente invención. Por ejemplo, se describen métodos y composiciones para producir RSV re-combinantes que expresan un gen extraño adicional, por ejemplo un gen de cloranfenicol acetil transferasa (CAT) o de luciferasa. Dichos recombinantes exhiben generalmente un crecimiento reducido asociado al gen insertado. Esta atenuación parece aumentar al aumentar la longitud del gen insertado. El descubrimiento de que una inserción de un gen extraño en un RSV recombinante reduce el nivel de replica-ción y es estable durante el pase in vitro proporciona otro método efectivo para atenuar RSV para uso vacunal. Se pueden conseguir, por lo tanto, efectos similares o mejorados por inserción de otros genes deseados, por ejemplo citoki-nas tales como interferon-?, interleukina-2 , interleukina-4 y GM-CSF, entre otros. Las modificaciones nucleotídicas adicionales descritas en las referencias anteriores para incorporación en los RSV quiméricos humanos-bovinos recombinantes de la invención incluyen la deleción o ablación parcial o completa de un gen de RSV seleccionado. Por lo tanto, se pueden suprimir genes o segmentos genómicos de RSV, incluyendo de-leciones parciales o completas de marcos de lectura abierta y/o secuencias reguladoras de acción cis de los genes NS1, NS2, N, P, M, G, F, SH, M2 (ORF1) , M2(ORF2) y/o L de RSV. En un ejemplo, se generó un RSV recombinante en el que la ex-presión del gen SH había sido eliminada por eliminación de una secuencia polinucleotídica codificante del ARNm y la proteína SH. La deleción del gen SH daba no sólo un RSV in-feccioso recuperable, sino que éste exhibía un crecimiento substancialmente mejor en cultivo de tejidos en base al rendimiento de virus infeccioso y al tamaño de placa. Este mejor crecimiento en cultivo de tejidos especificado por la deleción SH proporciona herramientas útiles para desarrollar vacunas de RSV quiméricos humanos-bovinos , por ejemplo superando los problemas de los pobres rendimientos de RSV en cultivo. Más aún, estas deleciones son altamente estables frente a la reversión genética, haciendo que los clo-nes de RSV derivados de ellas sean particularmente útiles como agentes vacunales. Los recombinantes de RSV SH-menos exhiben también atenuación específica de sitio en el tracto respiratorio superior de ratones, lo que presenta nuevas ventajas para el desarrollo de vacunas. Las cepas actuales de RSV en evaluación como vacunas de virus vivos, por ejemplo imitantes cp, no exhiben un crecimiento significativamente alterado en cultivo de tejidos. Éstas son mutaciones de rango de hospedador y restringen la replicación en el tracto res-piratorio de chimpancés y humanos aproximadamente 100 veces en el tracto respiratorio inferior. Otro tipo ejemplar de mutación, la mutación ts, tiende a restringir preferentemente la replicación del virus en el tracto respiratorio inferior debido al gradiente de temperatura corporal cre-ciente desde el tracto respiratorio superior hasta el inferior. Contrariamente a estos mutantes cp y ts, los imitantes de RSV SH-menos tienen fenotipos distintos de mayor restricción en el tracto respiratorio superior. Esto es particularmente deseable para virus vacunales para uso en lac-tantes muy jóvenes, ya que la restricción de la replicación en el tracto respiratorio superior es necesaria para asegurar una administración segura de la vacuna en este grupo de edad vulnerable cuyos miembros respiran predominantemente a través de la nariz. Además, en cualquier grupo de edad, la replicación reducida en el tracto respiratorio superior reducirá la morbilidad por otitis media. Además de estas ven-tajas, la naturaleza de las mutaciones de deleción de SH, que afectan a casi 400 nt, y ablación de todo un ARNm representan un tipo de mutación que será altamente refractaria a la reversión. También se discute en el contexto de las modi-ficaciones del gen SH una comparación de los genes SH entre diferentes RSV, incluyendo RSV humanos y bovinos, y otros pneumovirus para obtener herramientas y métodos adicionales para generar vacunas recombinantes de RSV de utilidad. Por ejemplo, los dos subgrupos antigénicos de RSV, A y B, ex-hiben un grado relativamente alto de conservación en determinados dominios de SH, En dos de tales dominios, la región N-terminal y los dominios putativos de extensión por membrana de RSV A y B exhiben un 84% de identidad a nivel de aminoácidos, mientras que los ectodominios putativos C-terminales son más divergentes (aprox. un 50% de identidad) . La comparación de los genes SH de dos cepas del sub-grupo B del RSV humano, 8/60 y 18537, identificó sólo una única diferencia de aminoácido (Anderson y col., antes citado) . Las proteínas SH del RSV humano frente al bovino son aproximadamente un 40% idénticas y comparten características estructurales mayores, incluyendo (i) una distribución asimétrica de residuos conservados; (ii) perfiles de hidro-fobicidad muy similares; (iii) la presencia de dos sitios de glicosilación N-unidos, estando un sitio a cada lado de la región hidrofóbica, y (iv) un residuo único de cisteína en el lado carboxi-terminal de la región hidrofóbica central de cada proteína SH. (Anderson y col., antes citado).
Evaluando éstas y otras similitudes y diferencias de secuencia, se pueden hacer selecciones de secuencia (s) hete-róloga(s) que puede (n) ser substituida (s) o insertada (s) en clones de RSV quiméricos humanos-bovinos infecciosos, por ejemplo para obtener vacunas que tengan efectos inmunogéni-cos multiespecífieos, alternativamente o además de efectos deseables, tales como la atenuación. También se describen en el contexto de las de-leciones de genes los efectos del cambio de la posición gé-nica. Por ejemplo, la deleción del gen SH da lugar a un cambio efectivo en la posición génica aguas abajo a una posición más proximal al promotor. Esto puede ir asociado a un aumento en la transcripción de genes aguas abajo en el virus recombinante . Por lo tanto, se proporcionan métodos para alterar los niveles de expresión génica de RSV cambiando el orden o la posición de los genes en el genoma o antigenoma. Se esperan que menores niveles de expresión de los genes aguas abajo especifiquen fenotipos de atenuación, mientras que una mayor expresión puede conseguir los efec-tos opuestos en los RSV recombinantes en hospedadores permisivos, por ejemplo chimpancés y humanos. En otro ejemplo descrito en las referencias antes incorporadas, la expresión del gen NS2 es eliminada por introducción de codones de parada en el marco de lectura abierta (ORF) de la traducción. La velocidad de liberación del virus infeccioso estaba reducida para este virus knock out NS2 en comparación con el tipo salvaje. Además, la comparación de las placas de los virus mutantes y de tipo salvaje mostró que las de los knock out NS2 estaban muy redu-cidas en cuanto a tamaño. Este tipo de mutación puede ser, por lo tanto, incorporado en RSV quiméricos humanos-bovinos recombinantes viables para obtener fenotipos alterados, en este caso una velocidad reducida de crecimiento del virus y un tamaño reducido de placa in vitro. Éstos y otros métodos y tnutantes knock out proporcionarán, por lo tanto, aún más agentes vacunales RSV recombinantes adicionales, en base a la correlación conocida entre el tamaño reducido de placa in vitro y la atenuación in vivo. La expresión del gen NS2 estaba también eliminada por la completa eliminación del gen NS2 , dando lugar a un virus con un fenotipo similar. Otros genes RSV que han sido suprimidos con éxito incluyen los genes NSl y M2-2. El primero de ellos fue suprimido por eliminación de la secuencia polinucleotí-dica codificante de la proteína respectiva y el último por introducción de un cambio de marco o alteración de los sitios de iniciación de la traducción e introducción de codo-nes de parada. Es interesante el hecho de que los virus NSl-menos recuperados produzcan placas pequeñas en cultivo de tejidos, aunque no tan pequeñas como las del virus con deleción de NS2. El hecho de que el virus NSl-menos pueda crecer, aunque con una reducida eficacia, identifica a la proteína NSl como una proteína accesoria, una de la que puede prescindir para el crecimiento del virus . El tamaño de placa del virus NSl-menos era similar al del virus knock out en NS2 , en donde la expresión de la proteína NS2 era eliminada por introducción de codones de parada de la tra-ducción en su secuencia codificante. El fenotipo de placa pequeña está comúnmente asociado con mutaciones atenuantes. Este tipo de mutación puede ser, por lo tanto, incorporado en RSV recombinantes viables para obtener fenotipos alterados. Éstos y otros métodos y imitantes knock out proporcio-narán, por lo tanto, aún más agentes vacunales de RSV quiméricos humanos-bovinos recombinantes adicionales, en base a la correlación conocida entre el tamaño de placa in vitro y la atenuación in vivo. El imitante knock out en NS2 exhibía un fenotipo moderadamente atenuado en el tracto respiratorio superior y un fenotipo altamente atenuado en el tracto respiratorio inferior en chimpancés que no habían tenido ningún contacto previo. Este mutante también provocaba síntomas de enfermedad muy reducidos en chimpancés, mientras que estimulaba una significativa resistencia a la inoculación por el virus de tipo salvaje (Whitehead y col., J. Virol. 73: 3438-3442, 1999, aquí incorporada como refe-rencia) . Aún otros métodos y composiciones adicionales proporcionados en las referencias incorporadas y útiles en la invención implican diferentes modificaciones nucleotídi-cas en los RSV quiméricos humanos-bovinos que alteran las secuencias reguladoras de acción cis en el genoma o antige-noma quimérico. Por ejemplo, se puede suprimir un sitio de iniciación de la traducción para una forma segregada de la glicoproteína G de RSV para destruir la expresión de esta forma de la glicoproteína G. La glicoproteína G de RSV es sintetizada en dos formas: como una proteína de membrana integral de tipo II anclada y como una forma reseccionada N-terminalmente que carece esencialmente de todos los anclajes de membrana y es segregada (Hendricks y col., J. Vi-rol . 62: 2228-2233, 1988). Las dos formas han mostrado de-rivar por iniciación de la traducción en dos sitios de iniciación diferentes: la forma más larga se inicia en el primer AUG del ORF G y la segunda se inicia en el segundo AUG del ORF en el codon 48 y es además procesada por proteoli-sis (Roberts y col., J. Virol. 68: 4538-4546, 1994). La presencia de este segundo sitio de iniciación está altamente conservada, estando presente en todas las cepas de RSV humano, bovino y ovino secuenciadas hasta la fecha. Se ha sugerido que la forma soluble de la proteína G podría mitigar la inmunidad del hospedador actuando como señuelo para atrapar anticuerpos neutralizantes. Además, se ha implicado a la G soluble en la estimulación preferencial de una res-puesta influida hacia Th2, que, a su vez, parece estar asociada a una mayor inmunopatología tras la posterior exposición a RSV. Con respecto a un virus vacunal RSV, es altamente deseable minimizar el atrapamiento de anticuerpos o la estimulación desequilibrada del sistema inmune y sería, por lo tanto, deseable eliminar la expresión de la forma segregada de la proteína G. Esto ha sido conseguido en virus recombinantes . Por lo tanto, esta mutación es particularmente útil para alterar cualitativa y cuantitativamente la respuesta inmune del hospedador provocada por el virus recombinante, más que para atenuar directamente el virus. Las referencias incorporadas describen también la modulación del fenotipo del RSV recombinante alterando las señales de transcripción de acción cis de genes ejemplares, por ejemplo NS1 y NS2. Los resultados de estas mo-dificaciones nucleotídicas son consistentes con la modificación de la expresión génica por alteración de los elementos cis-reguladores, por ejemplo para disminuir los niveles de los ARNm de lectura y aumentar la expresión de proteínas a partir de genes aguas abajo. Los virus recombinantes re-sultantes exhibirán preferiblemente una mayor cinética de crecimiento y un menor tamaño de placa. Como modificaciones ejemplares para las secuencias reguladoras de acción cis se incluyen modificaciones en las señales de final de gen (GE) e inicio de gen (GS) asociadas con genes RSV. En este con-texto, como cambios ejemplares se incluyen alteraciones de las señales GE de los genes NS1 y NS2 , que hacen que estas señales sean idénticas a la señal GE natural del gen N de RSV. El virus recombinante resultante exhibe una mayor cinética de crecimiento y tamaño de placa y, por lo tanto, proporciona aún más medios adicionales para modificar beneficiosamente los fenotipos de los candidatos vacunales de RSV quiméricos humanos-bovinos . Los RSV quiméricos bovinos-humanos formados con un genoma o antigenoma de fondo BRSV parcial o completo y un gen o segmento genómico heterólogo de HRSV pueden incorporar un gen o segmento genómico heterólogo de un HRSV del subgrupo A o del subgrupo B, tanto del subgrupo A como del B de HRSV o de una o más cepas de HRSV específicas. Las cepas de HRSV ejemplares en este contexto incluyen las bien conocidas cepas de RSV A2 y Long. En aspectos preferidos, se substituye con uno o más genes de glicoproteínas de HRSV : F, G y SH, o un segmento genómico codificante de un dominio citoplásmico, un dominio de transmembrana, un ectodominio o un epitopo inmunogénico de un gen de glicoproteína de HRSV un gen o segmento genómico de contrapartida en el genoma o antigenoma de fondo BRSV. En realizaciones alternativas, se substituye uno o los dos genes F y G de las glicoproteínas de HRSV para substituir uno o los dos genes de las glicoproteínas F y G de contrapartida en el genoma o antigenoma de fondo BRSV. En un ejemplo específico aquí descrito a continuación, el gen F de HRSV Long es substituido en la cepa de rBRSV ATue51908 en lugar del gen F de BRSV de contrapartida. En otro ejemplo, se substituyen ambos genes F y G de glicoproteínas de HRSV de la cepa A2 de HRSV para substituir a los genes de las glicoproteínas F y G de contrapartida en el genoma o antigenoma de fondo de la cepa ATue51908 de BRSV. En realizaciones alternativas, los RSV quiméricos humanos-bovinos de la invención incorporan determinantes antigénicos de más de una cepa o subgrupo de RSV, por ejemplo tanto del subgrupo A como del subgrupo B del RSV humano. De esta forma, se facilitan en las referencias antes incorporadas métodos y composiciones que permiten la producción de virus vacunales RSV quiméricos humanos-bovinos atenuados que contienen secuencias de ambos subgru-pos A y B de RSV, por ejemplo para obtener una vacuna A o B de RSV o una vacuna bivalente de RSV A/B (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente EE.UU. N° 09/291.894, présentada por Collins y col. el 13 de Abril de 1999 y aquí incorporada como referencia) . En este contexto, un RSV quimérico humano-bovino puede consistir en un BRSV en el que se introducen múltiples genes o segmentos genómicos de HRSV que codifican para determinantes antigénicos de ambos sub-grupos HRSV A y HRSV B. Este virus puede ser entonces atenuado a un nivel deseado por incorporación sistemática de mutaciones atenuantes como se ha descrito antes. Por ejemplo, como mutaciones atenuantes específicas que han sido incorporadas en virus RSV A/B quiméricos se incluyen: (i) tres de las cinco mutaciones cp, a saber, la mutación en N (V2671) y las dos en L (C319Y y H1690Y) , pero no las dos en F, ya que éstas son eliminadas por substitución con el gen Bl F; (ii) las mutaciones 248 (Q831L) , 1030 (Y1321N) y, eventualmente, 404-L (D1183E) , que han sido identificadas en los virus de la cepa atenuada A2 ,- (iii) la única substitución nucleotídica en la posición 9 en la señal de iniciación de gen del gen M2, y (iv) la deleción del gen SH. Otras mutaciones inmediatamente asequibles en RSV quiméricos humanos-bovinos portadores de genes o segmentos genómi-eos de RSV A y/o RSV B incluyen, aunque sin limitación, las deleciones de los genes NSl, NS2, G o M2-2 y las mutaciones 530 y 1009, solas o en combinación.
En otros aspectos detallados de la invención, se emplean los RSV quiméricos humanos-bovinos como vectores para antígenos protectores de patógenos heterólogos, incluyendo otros virus RSV y no RSV y patógenos no víricos. De-ntro de estos aspectos, el genoma o antigenoma quimérico bovino-humano consiste en un "genoma o antigenoma vector" de RSV parcial o completo combinado con uno o más genes o segmentos genómicos heterólogos codificantes de uno o más determinantes antigénicos de uno o más patógenos heterólo-gos (véanse, por ejemplo, la Solicitud de Patente Provisional EE.UU. N° de Serie 60/170.195, la Solicitud de Patente EE.UU. N° 09/458.813 y la Solicitud de Patente EE.UU. N° 09/459.062, cada una de ellas aquí incorporada como referencia) . El patógeno heterólogo en este contexto puede ser un RSV heterólogo (por ejemplo, una cepa o subgrupo de RSV diferente) y el (los) gen (es) o segmento (s) genómico(s) heterólogo (s) puede (n) ser seleccionado (s) para codificar una o más de las proteínas de RSV antes identificadas, así como dominios proteicos, fragmentos y regiones o epitopos inmunogénicos de las mismas. Las vacunas vectoras de RSV así construidas pueden provocar una respuesta inmune po-liespecífica y pueden ser administradas simultáneamente o en un protocolo de administración coordinado con otros agentes vacunales. Los RSV quiméricos humanos-bovinos ingenieriza-dos como vectores para otros patógenos pueden consistir en un genoma o antigenoma vector que sea un genoma o antigenoma de HRSV parcial o completo, el cual se combina o modifica para incorporar uno o más genes o segmentos genómicos heterólogos codificantes de determinante (s) antigénico (s) de uno o más RSV heterólogos, incluyendo HRSV heterólogos seleccionados entre HRSV A o HRSV B. En aspectos alternati-vos, el genoma o antigenoma vector es un genoma o antigenoma de HRSV parcial o completo y el (los) gen(es) o segmento (s) genómico(s) heterólogo (s) codificante (s) del (de los) determinante (s) antigénico (s) es/son de uno o más patógenos no RSV. Típicamente, el genoma o antigenoma quimérico incorpora uno o más genes o segmentos genomicos de un BRSV que especifica atenuación. Alternativamente, el virus vector puede consistir en un genoma o antigenoma de fondo BRSV parcial o completo que incorpora uno o más genes o segmen-tos genómicos de HRSV donde el virus vector RSV quimérico humano-bovino es modificado para incluir uno o más genes o segmentos genómicos donantes codificantes de un determinante antigénico de un patógeno no RSV. Así, en determinados aspectos detallados de la invención, se facilitan RSV quiméricos humanos-bovinos como vectores para un rango de patógenos no RSV (véanse, por ejemplo, la Solicitud de Patente Provisional EE.UU. N° de Serie 60/170.195, la Solicitud de Patente EE.UU. N° 09/458.813 y la Solicitud de Patente EE.UU. N° 09/459.062, cada una de ellas aquí incorporada como referencia) . El genoma o antigenoma vector para uso en estos aspectos de la invención puede consistir en un genoma o antigenoma de BRSV o HRSV parcial o completo que incorpora, respectivamente, un gen o segmento genómico de RSV o BRSV heterólogo y el patógeno heterólogo puede ser seleccionado entre el virus del sarampión, los virus sincitiales respiratorios del sub-grupo A y del subgrupo B, HPIV1, HPIV2 , HPIV3 , el virus de las paperas, los virus del papiloma humano, los virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 y de tipo 2, los virus herpes simplex, el citomegalovirus, el virus de la rabia, el virus Epstein-Barr, los filovirus, los bunyavirus, los flavivirus, los alfavirus y los virus de la influenza.
Por ejemplo, un genoma o antigenoma vector de HRSV o BRSV para construir RSV quiméricos bovinos-humanos de la invención puede incorporar determinante (s) antigéni-co(s) heterólogo (s) seleccionado (s) entre las proteínas HA y F del virus del sarampión, o dominios, fragmentos y epi-topos antigénicos de éstas. En realizaciones ejemplares, se añade o incorpora una unidad de transcripción consistente en un marco de lectura abierta (ORF) de un gen HA del virus del sarampión en un genoma o antigenoma vector de BRSV o HRSV3. Alternativamente, se puede usar los RSV quiméricos bovinos-humanos de la invención como vectores para incorporar determinante (s) antigénico (s) heterólogo (s) de un virus de la parainfluenza (PIV) , por ejemplo incorporando uno o más genes o segmentos genómicos que codifican para una gli-coproteína HN o F de HPIV1, HPIV2 o HPIV3 o dominio (s) o epitopo(s) inmunogénico (s) de ésta. Tal como se ha indicado antes, las realizaciones ejemplares de la invención presentan la substitución o adición de un gen (es) o segmento (s) genómico(s) heterólo-go(s) o nucleótidos simples o múltiples de un RSV humano o bovino, que son añadidos o substituidos en un genoma o antigenoma de RSV bovino o humano de fondo parcial o completo para producir el genoma o antigenoma de RSV quimérico humano-bovino. En un aspecto de la invención, los RSV quiméri-eos humanos-bovinos incorporan un genoma o antigenoma de RSV de fondo bovino parcial o completo combinado con uno o más genes o segmentos genómicos heterólogos de un subgru-po(s) o cepa(s) de RSV humano. Alternativamente, el RSV quimérico humano-bovino puede incorporar un genoma o anti-genoma de RSV de fondo humano parcial o completo combinado con un gen o segmento genómico heterólogo de uno o más RSV bovinos . Los genes o segmentos genómicos seleccionados para uso como insertos o adiciones heterólogas en el genoma o antigenoma de fondo incluyen cualquier gen o segmento géni-co de tipo salvaje o mutante codificante de una proteína NS1, NS2, N, P, M, SH, M2 (0RF1) , M2(ORF2), L, F o G de RSV o de una porción de éstos o cualquier segmento genómico adicional. Preferiblemente, el (los) gen(es) humano(s) hete-rólogo(s) codifica (n) para una glicoproteína F, G o SH de RSV para obtener efectos inmunogénicos deseados. En una realización ejemplar, se añaden o substituyen uno o más ge-nes de glicoproteínas de RSV humano F, SH y/o G en un genoma o antigenoma bovino parcial o completo para obtener una quimera humana-bovina infecciosa atenuada que provoca una respuesta inmune anti-RSV humano en un hospedador susceptible. Alternativamente, el RSV quimérico humano-bovino puede incorporar uno o más segmentos genómicos codificantes de un dominio citoplásmico, dominio de transmembrana, ectodominio o epitopo inmunogénico de una glicoproteína F, G o SH de RSV humano. Estas proteínas, dominios y epitopos inmunogénicos también generan nuevas respuestas inmunes en un hos-pedador inmunizado. Por ejemplo, la adición o substitución de uno o más genes o segmentos genómicos inmunogénicos de un subgrupo o cepa de RSV humano a o en un genoma o antigenoma de fondo bovino da un virus o partícula subvírica quimérica recombinante capaz de generar una respuesta inmune dirigida contra uno o más subgrupos o cepas "donantes" de RSV humano específicas, mientras que el esqueleto bovino confiere un fenotipo atenuado que hace que la quimera sea un candidato útil para el desarrollo de vacunas. Así, se combinan o substituyen genes o segmentos genómicos donantes heterólogos de una cepa o subgrupo de RSV en un genoma o antigenoma de RSV receptor que sirve como fondo para el gen o segmento genómico donante. El genoma o antigenoma recep-tor puede actuar como "vector" para importar y expresar genes o segmentos genómicos heterólogos codificantes de uno o más determinantes antigénicos de un virus diferente, para dar RSV quiméricos que exhiben nuevas características es-tructurales y/o fenotípicas, particularmente inmunogénicas . Alternativamente, la adición o substitución del gen o segmento genómico heterólogo en un RSV de fondo seleccionado da atenuación, cambios de crecimiento u otro cambios feno-típicos deseados, en comparación con fenotipos correspon-dientes del receptor y/o donante no modificados. La introducción de proteínas, dominios y epito-pos inmunogénicos heterólogos para producir RSV quiméricos es particularmente útil para generar nuevas respuestas inmunes en un hospedador inmunizado. La adición o substitu-ción de un gen o segmento genómico inmunogénico de un subgrupo o cepa de RSV donante en un genoma o antigenoma receptor de un subgrupo o cepa de RSV diferente puede generar una respuesta inmune dirigida contra el subgrupo o cepa donante, el subgrupo o cepa receptora, o tanto el subgrupo o cepa donante como el subgrupo o cepa receptora. Para conseguir este fin, el RSV quimérico humano-bovino puede ser también construido de forma que exprese una proteína quimérica, por ejemplo una glicoproteína inmunogénica que tiene una cola citoplásmica y/o un dominio de transmembrana espe-cífico para un RSV fusionado a un ectodominio de un RSV diferente para obtener, por ejemplo, una proteína de fusión humana-bovina, o una proteína de fusión que incorpora dominios de dos subgrupos o cepas de RSV humano diferentes. En una realización preferida, un genoma o antigenoma de RSV quimérico humano-bovino codifica para una glicoproteína quimérica en el virus o partícula subvírica recombinante que tiene dominios o epitopos inmunogénicos de glicoproteí-ñas tanto humanos como bovinos. Por ejemplo, se puede unir un segmento genómico heterólogo codificante de un ectodomi-nio de glicoproteína de una glicoproteína F, SH o G de RSV humano con una secuencia polinucleotídica (es decir, un segmento genómico) que codifica para los correspondientes dominios citoplásmicos y endodominios de las glicoproteínas F, SH o G bovinas para formar el genoma o antigenoma de RSV quimérico humano-bovino . En otras realizaciones, se puede modificar con-venientemente el RSV quimérico humano-bovino útil como formulación vacunal para acomodar los cambios antigénicos en el virus circulante. Típicamente, la modificación será en las proteínas G y/o F. Se incorpora un gen G o F completo, o un segmento genómico codificante de una región inmunogé-nica particular del mismo, de una cepa de RSV en un ADNc de genoma o antigenoma de RSV quimérico por substitución de una región correspondiente en un clon receptor de una cepa o subgrupo de RSV diferente, o añadiendo una o más copias del gen, de tal forma que se representen varias formas an-tigénicas. La progenie de virus producida a partir del clon RSV modificado puede ser entonces usada en protocolos de vacunación contra cepas emergentes de RSV. Una variedad de realizaciones adicionales de la invención incluyen la adición o substitución de sólo una porción del gen donante de interés en el genoma o antigenoma receptor. Comúnmente, los nucleótidos no codificantes, tales como elementos reguladores de acción cis y secuencias intergénicas, no necesitan ser transferidos con la región codificante génica donante. Así, se puede añadir o substi-tuir una secuencia codificante (por ejemplo, un marco de lectura abierta (ORF) parcial o completo) de un gen particular en el genoma o antigenoma de fondo parcial o completo bajo el control de un promotor heterólogo (por ejemplo, un promotor existente en el genoma o antigenoma de fondo) de un gen de contrapartida o un gen diferente en comparación con la secuencia donante. Una variedad de segmentos genómi-eos adicionales proporcionan polinucleótidos donantes útiles para inclusión en un genoma o antigenoma quimérico para expresar RSV quimérico que tiene nuevas y útiles propiedades. Por ejemplo, segmentos genómicos heterólogos pueden codificar para parte o toda de una región de cola citoplás-mica, dominio de transmembrana o ectodominio de una glico-proteína, un sitio o región epitópica, un sitio de unión o región que contiene un sitio de unión, un sitio activo o región que contiene un sitio activo, etc., de una proteína seleccionada de un RSV humano o bovino. Éstos y otros seg-mentos genómicos pueden ser añadidos a un genoma o antigenoma de fondo completo o substituir en él a un segmento ge-nómico de contrapartida para obtener nuevos recombinantes de RSV quiméricos. Determinados recombinantes expresarán una proteína quimérica, por ejemplo una proteína que tiene una cola citoplásmica y/o dominio de transmembrana de un RSV fusionado a un ectodominio de otro RSV. Según un aspecto de la invención, se construyen RSV quiméricos humanos-bovinos substituyendo con el gen o segmento genómico heterólogo un gen o segmento genómico de contrapartida en un genoma o antigenoma de fondo de RSV parcial. Alternativamente, el gen o segmento genómico heterólogo puede ser añadido como un gen o segmento genómico supernumerario en combinación con un genoma o antigenoma de fondo de RSV completo (o parcial si se suprime otro gen o segmento genómico) . El gen o segmento genómico heterólogo puede ser añadido en una posición intergénica en un genoma o antigenoma de fondo de RSV parcial o completo para no destruir un marco de lectura abierta en el genoma o antige-noma de fondo . El gen o segmento genómico heterólogo puede ser añadido o substituido en una posición correspondiente a una posición de orden génico de tipo salvaje de un gen o segmento genómico de contrapartida en el genoma o antigenoma de fondo de RSV parcial o completo, cuyo gen o segmento genómico de contrapartida es así substituido o desplazado (por ejemplo, a una posición más distal al promotor) . En aún realizaciones adicionales, el gen o segmento genómico heterólogo es añadido o substituido en una posición que es más proximal al promotor o más distal al promotor en comparación con una posición de orden génico de tipo salvaje del gen o segmento genómico de contrapartida en el genoma o an-tigenoma de fondo, lo que aumenta o reduce, respectivamente, la expresión del gen o segmento genómico heterólogo. Con respecto al orden génico, una serie de las referencias incorporadas anteriores se han centrado en la modificación del orden natural en RSV y otros virus. Por ejemplo, en RSV se suprimieron los genes NS1, NS2, SH y G individualmente y se suprimieron los genes NS1 y NS2 juntos, cambiando así la posición de cada gen aguas abajo en relación al promotor vírico. Por ejemplo, cuando NS1 NS2 son suprimidos conjuntamente, N se mueve de la posición 3 a la posición 1, P de la posición 4 a la posición 2, etc. Alternativamente, la deleción de cualquier otro gen en el orden génico afectará a la posición (en relación al promotor) sólo de aquellos genes que estén localizados más allá aguas abajo. Por ejemplo, SH ocupa la posición 6 en el virus de tipo salvaje y su deleción no afecta a M en la posición 5 (o a cualquier otro gen aguas arriba) , pero mueve G de la posición 7 a la 6 en relación al promotor. Habría que hacer notar que la deleción génica puede ocurrir también (raramente) en un virus mutante biológicamente derivado. Por ejemplo, un subgrupo B de RSV que había sido pasado extensamente en cultivo celular suprimía espontáneamente los ge-nes SH y G (Karron y col., Proc . Nati. Acad. Sci . USA 94: 13961-13966, 1997, aquí incorporada como referencia) . Obsérvese que "aguas arriba" y "aguas abajo" se refieren a las direcciones proximal al promotor y distal al promotor, respectivamente (el promotor está en el extremo 3' líder del ARN genómico de sentido negativo) . Las modificaciones de cambio de orden génico (es decir, las modificaciones de posición que mueven uno o más genes a una localización más proximal al promotor o distal al promotor en el genoma vírico recombinante) con RSV quiméricos humanos-bovinos de la invención dan lugar a virus con propiedades biológicas alteradas. Por ejemplo, los RSV que carecen de NS1, NS2, SH, G, NS1 y NS2 juntos o SH y G juntos, han mostrado estar atenuados in vi tro, in vivo o ambos. Es probable que este fenotipo se deba prima-riamente a la pérdida de expresión de la proteína vírica específica. Sin embargo, el mapa génico alterado probablemente también contribuía al fenotipo observado. Este efecto está bien ilustrado por el virus con deleción SH, que crecía más eficientemente que el tipo salvaje en algunos tipos celulares, probablemente debido a un aumento en la eficacia de la transcripción, de la replicación o de ambas, que se producía como resultado de la deleción génica y que daba lugar a cambio en el orden génico y posiblemente en el tamaño del genoma. En otros virus, tales como RSV en el que se habían suprimido NS1 y/o NS2 , el crecimiento alterado que podría haberse producido debido al cambio en el orden génico estaba probablemente obscurecido por el fenotipo más dominante debido a la pérdida de expresión de la(s) proteína (s) de RSV. Se han introducido aún más cambios adicionales para cambiar el orden génico de RSV en un esfuerzo por rae-jorar sus propiedades como vacuna viva atenuada (véase la Solicitud de Patente Provisional EE.UU. titulada VACUNAS DEL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO QUE EXPRESAN ANTÍGENOS PROTECTORES A PARTIR DE GENES PROXIMALES AL PROMOTOR, presentada por Krempl y col. el 23 de Junio de 2000 e identi-ficada por el Número de Expediente de Abogado 015280-424000US, aquí incorporada como referencia) . En particular, los genes G y F estaban cambiados, solos o en tándem, a una posición más proximal al promotor en relación a su orden génico de tipo salvaje. Estas dos proteínas ocupan normal-mente las posiciones 7 (G) y 8 (F) en el orden génico de RSV (NS1 -NS2 -N-P-M-SH-G-F-M2 -L) . Con objeto de aumentar la posibilidad del éxito en la recuperación, se llevaron a cabo las manipulaciones en una versión de RSV en la que el gen SH había sido suprimido (Whitehead y col . , J. Virol . 73: 3438-3442 (1999), aquí incorporada como referencia). Esto facilita la recuperación, ya que este virus hace placas de mayor tamaño in vi tro (Bukreyev y col., J. Virol. 71: 8973-82, (1997), aquí incorporada como referencia). G y F fueron entonces movidos individualmente a la posición 1, o fueron movidos conjuntamente a las posiciones 1 y 2, respectivamente . Sorprendentemente, se recuperaron con facilidad RSV recombinantes en los que G o F estaban movidos a la posición 1, o en los que G y F estaban movidos a las posicio-nes 1 y 2, respectivamente. Este resultado difería considerablemente de los estudios previos con VSV, donde el movimiento del único gen de la glicoproteína de VSV en sólo dos posiciones era muy deletéreo para el crecimiento del virus. La capacidad para recuperar estos virus alterados era también sorprendente, ya que RSV se replica ineficazmente y ya que RSV tiene un orden génico complejo y el movimiento de los genes de las glicoproteínas implicaba un gran número de cambios de posición. Ciertamente, los RSV reorganizados crecían al menos tan bien como su parental inmediato que tenia el orden de genes de tipo salvaje. Tal como se ha indicado anteriormente, esto es particularmente importante para RSV, ya que el virus de tipo salvaje crece ineficazmente en cultivo celular y una reducción más en la replica-ción in vitro haría probablemente que la preparación de vacunas no fuera factible. Por lo tanto, es notable que todas las proteínas NS1-NS2-N-P-M pudieran ser desplazadas en una o dos posiciones en relación al promotor sin una reducción significativa en la adecuación del crecimiento. Además, el examen de la expresión de la glicoproteína G mostró que estaba aumentada hasta varias veces sobre la de su virus parental. Esto indicaba que un virus vacunal que contenga G y/o F en la primera posición expresa una cantidad molar mayor de estos antígenos protectores en comparación con las otras proteínas víricas y, por lo tanto, representa un virus con propiedades vacunales deseadas . De forma similar, se consiguieron también modi-ficaciones extensivas en el orden génico con dos candidatos vacunales altamente atenuados en los que se suprimió el gen NS2 por sí solo, o en donde se suprimieron conjuntamente los genes NS1 y NS2. En estos dos candidatos vacunales, las glicoproteínas G y F fueron movidas conjuntamente a las po-siciones 1 y 2, respectivamente, y las glicoproteínas G, F y SH fueron eliminadas de su posición aguas abajo original. Así, los virus recuperados G1F2ANS2ASH y G1F2/A S1ANS2ASH tenían dos y tres genes suprimidos, respectivamente, además del cambio de los genes G y F. Para ilustrar el grado de los cambios implicados, se pueden comparar los órdenes gé-nicos del RSV de tipo salvaje (NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L) y del virus G1F2/ANS2ÁSH (G-F-NS1-N-P-M-M2-L) o el ANS1ANS2ÁSH (G-F-N-P-M-M2-L) . Esto muestra que las posiciones de la mayoría o de todos los genes en relación al promotor estaban cambiadas. No obstante, estos derivados altamente atenuados conservaban la capacidad de crecer en cul-tivo celular. Los ejemplos siguientes proporcionan un cons-tructo ejemplar de un RSV quimérico humano-bovino recombi-nante infeccioso (rBRSV/HRSV) en donde los genes G y F de HRSV están substituidos en un fondo de RSV bovino recombi-nante (rBRSV) . La quimera humana-bovina resultante contiene dos genes de HRSV, a saber, G y F, y ocho genes de BRSV, a saber, NS1, NS2, N, P, M, SH, M2 y L. Además de esta construcción básica de glicopro-teína substituida, los genes G y F de HRSV son cambiados a una posición más proximal al promotor en el esqueleto de rBRSV, es decir, en relación a la posición de orden génico de tipo salvaje de los genes F y G en el genoma de RSV. Más específicamente, los genes F y G fueron movidos de su localización habitual en relación al promotor, a saber, las po-siciones génicas 7 y 8, respectivamente, a las posiciones 1 y 2, respectivamente. El virus recombinante quimérico resultante, rBRSV/A2-GlF2, era muy similar en sus niveles de expresión de proteínas F y G, según se detectó por inmunofluorescen-cia, a la del HRSV wt, cuyo resultado es consistente con la mayor expresión de las glicoproteínas G y F atribuida al cambio proximal al promotor de los genes. Dado que el pre-senté virus rBRSV/A2-GlF2 lleva la misma constelación de genes BRSV en su fondo genético, es probable que comparta este fuerte fenotipo de restricción del rango de hospedado-res. En este contexto, la mayor expresión de los dos antí-genos protectores in vivo aumentará la inmunogenicidad de este virus para producir propiedades vacunales altamente deseables . Para construir RSV quiméricos, se pueden añadir o substituir genes heterólogos en todo o en parte en el ge-noma o antigenoma de fondo. En el caso de quimeras generadas por substitución, se substituye con un gen o segmento genómico seleccionado codificante de una proteína o región proteica (por ejemplo, una cola citoplásmica, un dominio de transmembrana o ectodominio, un sitio o región epitópica, un sitio o región de unión, un sitio activo o región que contiene un sitio activo, etc.) de un RSV humano o bovino un gen o segmento genómico de contrapartida en el genoma o antigenoma de RSV de fondo, para obtener nuevos recombinan-tes que tienen cambios fenotípicos deseados en comparación con una o con ambas de las cepas de RSV de tipo salvaje (o parentales mutantes) respectivas. Tal como se usa aquí, genes o segmentos genómicos de "contrapartida" se refiere a polinucleótidos de contrapartida de diferentes fuentes de RSV que codifican para proteínas o dominios proteicos, epi-topos o residuos de aminoácido homólogos o equivalentes, o que representan señales de acción cis homologas o equivalentes que pueden incluir, aunque sin limitación, especies y variantes alélicas entre diferentes subgrupos o cepas de RSV. Las cepas humanas y bovinas tienen el mismo mapa génico y codifican esencialmente para la misma constelación de AR m y proteínas. Por ejemplo, cada una tiene ORF que codifican para proteínas NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2-1, M2-2 y L. El porcentaje de identidad de aminoácidos entre las proteínas humanas y bovinas seleccionadas es : NS1 (69%), NS2 (84%), N (93%), P (81%), M (89%), SH (38%), G (30%), F (18%), 2-1 (80%), L (77%). En general, por lo tanto, existe una correspondencia claramente discernible entre los genes y segmentos genomicos de los dos virus y el diseño de substituciones, transferencias e inserciones es sencillo . Los genes y segmentos genomicos de contrapartida para uso en los RSV quiméricos humanos-bovinos de la invención abarcan un montaje de polinucleótidos alternativos que tienen un rango de tamaño y variación de secuencia. Los segmentos genomicos útiles en este sentido varían entre aproximadamente 15-35 nucleótidos en el caso de los segmentos genomicos codificantes de pequeños dominios funcionales de proteínas, por ejemplo sitios epitópicos, y aproximadamente 50, 75, 100, 200-500 y 500-1.500 ó más nucleótidos para segmentos genomicos codificantes de dominios o regio-nes proteicas de mayor tamaño. La selección de los genes y segmentos genomicos de contrapartida se basa en la identidad de secuencia o correspondencia lineal en el genoma entre las contrapartidas objeto. En este contexto, una "secuencia de referencia" polinucleotídica humana o bovina se-leccionada se define como una secuencia o porción de la misma presente en el genoma o antigenoma donante o receptor. Esta secuencia de referencia es usada como secuencia definida para obtener una base racional para la comparación de secuencias con la secuencia heteróloga de contrapartida. Por ejemplo, la secuencia de referencia puede ser un segmento definido de un ADNc o gen, o una secuencia de un ADNc o gen completo. En general, una secuencia de referencia pa-ra uso en la definición de genes y segmentos genómicos de contrapartida tiene al menos 20 nucleótidos de longitud, frecuentemente al menos 25 nucleótidos de longitud y, a menudo, al menos 50 nucleótidos de longitud. Dado que dos po-linucleótidos puede cada (1) contener una secuencia (es decir, una porción de la secuencia polinucleotídica completa) que es similar entre los dos polinucleótidos y (2) contener además una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencia entre dos (o más) polinucleótidos son típicamente realizadas comparando secuencias de los dos polinucleótidos sobre una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", tal como se utiliza aquí, se refiere a un segmento concep-tual de al menos 20 posiciones contiguas de nucleótidos, donde se puede comparar una secuencia de polinucleótidos con una secuencia de referencia de al menos 20 nucleótidos contiguos y donde la porción de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede contener adiciones o deleciones (es decir, huecos) de un 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no contiene adiciones o deleciones) para una alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación puede ser realizada por el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl . Math . 2: 482 (1981), por el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol . 48: 443 (1970) , por el método de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc . Nati. Acad. Sci . USA 85: 2444 (1988) (cada una de las cuales es aquí incorporada como referencia) , por implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en El Wisconsin Genetics Software Package Reléase 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, aquí incorporado como referencia), o por inspección, y se selecciona la mejor alineación (es decir, la que resulta en el mayor porcentaje de similitud de se-cuencia a lo largo de la ventana de comparación) generada por los diversos métodos. El término "identidad de secuencia" significa que dos secuencias polinucleotídicas son idénticas (es decir, en una base de nucleótido-a-nucleótido) a lo largo de la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" es calculado comparando dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo de la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que aparece la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, . G, U o I) en ambas secuencias para dar el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. Las posiciones de residuos correspondientes entre los RSV bovinos y humanos pueden ser divergentes o idénticas, o pueden diferir en substituciones conservadoras de aminoácidos. Substituciones conservadoras de aminoácidos se refiere a la intercambiabilidad de residuos que tiene cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo conservador de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáti-cas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáti-co-hidroxílicas es serina y treonina; un grupo de aminoáci-dos que tiene cadenas laterales que contienen amida es as-paragina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina, y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de substitución conservadora de aminoácidos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alani-na-valina y asparagina-glutamina . Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales, tales como aminoácidos a, a-disubstituidos, N-alquilaminoácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales, pueden ser también componentes adecuados para los polipéptidos de la presente invención. Como ejemplos de aminoácidos no convencionales se incluyen: 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-?,?,?-trimetillisina, e-?-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, ?-?-metilarginina y otros aminoácidos similares e iminoácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina) . Más aún, los aminoácidos pueden ser modificados por glicosila-ción, fosforilación y similares. La presente invención emplea métodos basados en el ADNc para construir una variedad de virus y partículas subvíricas de RSV quimérico humano-bovino recombinante. Estos RSV recombinantes ofrecen mejores características de atenuación e inmunogenicidad para uso como agentes vacunales. Entre los cambios fenotípicos deseados que son inge-nierizados en RSV quiméricos humanos-bovinos se incluyen, aunque sin limitación, atenuación en cultivo o en el ambiente de un hospedador seleccionado, resistencia a la re-versión a partir del fenotipo atenuado, características in-munogénicas intensificadas (por ejemplo, determinadas por el aumento o disminución de una respuesta inmune provoca- da) , regulación a más o regulación a menos de la transcripción y/o traducción de productos víricos seleccionados, etc. En aspectos preferidos de la invención, se producen RSV quiméricos humanos-bovinos atenuados en los que el ge- noma o antigenoma quimérico es además modificado por introducción de una o más mutaciones atenuantes que especifican un fenotipo atenuante. Estas mutaciones pueden ser generadas de novo y estudiadas en cuanto a los efectos atenuantes según una estrategia de mutagénesis de diseño racional, según se describe en las referencias anteriormente incorporadas. Alternativamente, las mutaciones atenuantes pueden ser identificada en un RSV imitante biológicamente derivado y a continuación incorporadas en el RSV quimérico humano-bovino de la invención. hae mutaciones atenuantes en RSV biológicamente derivados para incorporación en una cepa vacunal de RSV quimérico humano-bovino pueden ocurrir de forma natural o pueden ser introducidas en cepas de RSV de tipo salvaje por procedimientos conocidos de mutagénesis. Por ejemplo, se pueden producir cepas de RSV párenteles incompletamente atenuadas por mutagénesis química durante el crecimiento del virus en cultivos de células a los que se ha añadido un mutágeno químico, por selección de virus que ha sido sometido a pase a temperaturas subóptimas para introducir mutaciones de restricción del crecimiento, o por selección de un virus mutagenizado que produce pequeñas placas (sp) en cultivo celular, según se describe en general aquí y en la Patente EE.UU. USSN N* 5.922.32S, concedida el 13 de Julio de 1999, aquí incorporada como referencia. Por "RSV biológicamente derivado' se quiere decir cualquier RSV no producido por medios recombinantee. Así, los RSV biológicamente derivados incluyen los RSV na-turales de todos los subgrupos y cepas, incluyendo, por ejemplo, RSV naturales que tienen una secuencia genómica de tipo salvaje y RSV que tienen variaciones genómicas con respecto a una secuencia de RSV de tipo salvaje de referen-cia, por ejemplo RSV que tiene una mutación que especifica un fenotipo atenuado. De igual modo, los RSV biológicamente derivados incluyen mutantes de RSV derivados de una cepa de RSV parental por, entre otros, procedimientos de mutagéne-sis artificial y selección. Para producir un RSV satisfactoriamente atenuado a partir de cepas biológicamente derivadas, se introducen preferiblemente mutaciones en una cepa parental que ha sido atenuada incompleta o parcialmente, tal como los bien conocidos mutantes ts-1 ó ts-ING o cpRSV de la cepa A2 del subgrupo A de RSV, o derivados o subclones de éstos. Usando éstas y otras cepas parcialmente atenuadas, se pueden generar mutación (es) adicional (es) que atenúen aún más la cepa, por ejemplo a un nivel deseado de replicación restringida en un hospedador mamífero, conservando al mismo tiempo su-ficiente inmunogenicidad como para conferir protección a los vacunados . Se pueden producir mutantes parcialmente atenuados de los virus del subgrupo A o del B por métodos bien conocidos de clonación biológica de virus de tipo salvaje en un substrato celular aceptable y desarrollo, por ejemplo mutantes pasados en frió de éstos, sometiendo los virus a mutación química para producir mutantes ts, o seleccionando mutantes fenotípicos de placa pequeña o similares (véase, por ejemplo, Murphy y col., Publicación Internacional WO 93/21310, aquí incorporada como referencia) . Para los virus del subgrupo B, un virus parental parcialmente atenuado ejemplar es cp 23, que es un mutante de la cepa Bl del sub-grupo B. Se pueden combinar varias técnicas de selección conocidas para producir mutantes parcialmente atenuados a partir de cepas no atenuadas del subgrupo A o B que son útiles para mayor derivatización, según se describe aquí, Además, se pueden introducir mutaciones que especifiquen fenotipos atenuados individualmente o en combinación en virus incompletamente atenuados del subgrupo A o B para producir virus vacunal que tenga múltiples mutaciones atenuan-tes definidas que confieran un nivel deseado de atenuación e inmunogenicidad en los vacunados. Tal como se ha indicado antes, la producción de un mutante de RSV biológicamente derivado suficientemente atenuado puede ser realizada por varios métodos conocidos. Uno de tales procedimientos implica el sometimiento de un virus parcialmente atenuado a pase en cultivo de células a temperaturas atenuantes progresivamente más bajas. Por ejemplo, mientras que el virus de tipo salvaje es típicamente cultivado a aproximadamente 34-37°C, los mutantes parcialmente atenuados son producidos por pase en cultivos celulares (por ejemplo, células de riñon bovino primario) a temperaturas subóptimas, por ejemplo 20-26°C. Así, se adapta el mutante cp u otra cepa parcialmente atenuada, por ejemplo ts-1 o spRSV, a un crecimiento eficiente a una me-ñor temperatura por pase en células MRC-5 o Vero, descendiendo hasta una temperatura de aproximadamente 20-24 °C, preferiblemente de 20-22 °C. Esta selección de RSV mutantes durante el pase en frío reduce substancialmente cualquier virulencia residual en las cepas derivadas en comparación con el parental parcialmente atenuado. Alternativamente, se pueden introducir mutaciones específicas en RSV derivados biológicamente sometiendo un virus parental parcialmente atenuado a mutagénesis química, por ejemplo para introducir mutaciones ts o, en el caso de virus que ya son ts, mutaciones ts adicionales suficientes para conferir una mayor atenuación y/o estabili-dad del fenotipo ts del derivado atenuado. Los medios para la introducción de mutaciones ts en RSV incluyen la repli-cación del virus en presencia de un mutágeno, tal como 5-fluorouridina ó 5-fluorouracilo, en una concentración de aproximadamente 10"3 a 10"5 M, preferiblemente aproximada-mente 10"4 M; la exposición del virus a nitrosoguanidina a una concentración de aproximadamente 100 µg/mlí según el procedimiento general descrito en, por ejemplo, Gharpure y col., J. Virol. 3: 414-421, 1969, y Richardson y col., J. ed. Virol. 3: 91-100, 1978); o la introducción genética de mutaciones ts específicas. También se pueden usar otros mu-tágenos químicos. La atenuación puede producirse como resultado de una mutación ts en casi cualquier gen de RSV, aunque un blanco particularmente alcanzable para este fin ha resultado ser el gen de la polimerasa (L) . El nivel de sensibilidad a la temperatura de la replicacion en RSV atenuados ejemplares para uso en la invención es determinado comparando su replicacion a una temperatura permisiva con la replicacion a varias temperaturas restrictivas. La temperatura más baja a la que se reduce la replicacion del virus 100 veces o más en comparación con su replicacion a la temperatura permisiva es denominada la temperatura de cierre. En animales experimentales y humanos, tanto la replicacion como la virulencia de RSV guardan correlación con la temperatura de cierre del mutante. La replicacion de mutantes con una temperatura de cierre de 39°C está moderadamente restringida, mientras que mutantes con una temperatura de cierre de 38 °C se replican peor y los síntomas de la enfermedad están principalmente restringidos al tracto respiratorio superior. Un virus con una temperatura de cierre de 35 °C a 37 °C estará típicamente totalmente atenuado en chimpancés y substancialmente atenuado en humanos. Así, los RSV mutantes biológicamente derivados atenuados y los RSV quiméricos humanos-bovinos de la invención que son ts tendrán una temperatura de cierre en el rango de aproximadamente 35°C a 39°C y, preferiblemente, de 35CC a 38°C. la adición de una mutación ts a una cepa parcialmente atenuada produce un virus múltiplemente atenuado en composiciones vacunales de la invención. Se ha desarrollado una serie de cepas de RSV atenuadas como vacunas candidatas para administración in-tranasal usando múltiples vueltas de mutagénesis química para introducir mutaciones múltiples en un virus que ya había sido atenuado durante el pase en frío (por ejemplo, Connors y col., Virology 208: 478-484, 1995; Crowe y col., Vaccine 12: 691-699, 1994, y Crowe y col., Vaccine 12: 783-790, 1994, aquí incorporadas como referencia), la evalua-ción en roedores, chimpancés, adultos y lactantes indican que algunas de estas cepas vacunales candidatas son relativamente estables desde el punto de vista genético, son altamente inmunogénicas y pueden ser satisfactoriamente atenuadas. El análisis de la secuencia de nucleótidos de algu-nos de estos virus atenuados indica que cada nivel de mayor atenuación se asocia con substituciones específicas de nucleótidos y de aminoácidos. Las referencias antes incorporadas también describen cómo distinguir de manera rutinaria entre mutaciones incidentales silenciosas y las que son responsables de diferencias fenotípicas introduciendo las mutaciones, por separado y en varias combinaciones, en el genoma o antigenoma de clones de RSV infecciosos. Este pro- « cedimiento, junto con la evaluación de las características fenotípicas de los virus parentales y derivados, identifica mutaciones responsables de características tales como atenuación, sensibilidad a la temperatura, adaptación al frío, tamaño pequeño de placa, restricción del rango de hospeda-dores, etc. Las mutaciones así identificadas son compiladas en un "menú" y son entonces introducidas, según se desee, solas o en combinación, para calibrar un virus vacunal RSV quimérico humano-bovino a un nivel apropiado de atenuación, inmunogenicidad, resistencia genética a la reversión a partir de un fenotipo atenuado, etc., según se desee. Preferiblemente, los RSV quiméricos de la invención son atenuados por incorporación de al menos una y, más preferiblemente, dos o más mutaciones atenuantes identificadas a partir de dicho menú, que pueden ser definidas como un grupo de mutaciones conocidas dentro de un panel de cepas RSV mutantes biológicamente derivadas. Los paneles preferidos de cepas de RSV mutantes aquí descritas son mutantes pasados por frío (cp) y/o sensibles a la temperatura (ts) , por ejemplo un panel compuesto por mutantes de RSV designados como cpts RSV 248 (ATCC VR 2450), cpts RSV 248/404 (ATCC VR 2454), cpts RSV 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC VR 2452), cpts RSV 530/1009 (ATCC VR 2451), cpts RSV 530/1030 (ATCC VR 2455) , RSV B-l cp52/2B5 (ATCC VR 2542) y RSV B-l cp-23 (ATCC VR 2579) (cada uno depositado bajo los términos del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collec-tion (ATCC) de 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, EE.UU. y a los que se otorgaron los números de acceso identificados anteriormente) . Para este panel ejemplar de mutantes biológicamente derivados, se proporciona un gen menú de mutaciones atenuantes que pueden ser cada una combinadas con cualquier (cualesquiera) otra(s) mutación (es) en el panel para calibrar el nivel de atenuación en un RSV quimérico humano-bovino recombinante para uso vacunal. Mutaciones adiciona-les pueden derivar de RSV que tenga mutaciones atenuantes no ts y no cp, según se identifica, por ejemplo, en las cepas mutantes de placa pequeña (sp) , adaptadas al frío (ca) o de rango restringido de hospedadores (hr) . Se pueden seleccionar las mutaciones atenuantes en porciones codifican-tes de un gen de RSV donante o receptor o en regiones no codificantes, tales como una secuencia cis-reguladora. Por ejemplo, las mutaciones atenuantes pueden incluir cambios simples o múltiples de bases en una secuencia de iniciación génica, según queda ejemplificado por una substitución sim-pie o múltiple de bases en la secuencia de iniciación del gen M2 en el nucleótido 7605. Los RSV quiméricos humanos-bovinos diseñados y seleccionados para uso vacunal tienen frecuentemente al menos dos y a veces tres o más mutaciones atenuantes para al-canzar un nivel satisfactorio de atenuación para amplio uso clínico. En una realización, aparece al menos una mutación atenuante en el gen de polimerasa de RSV (en el gen donante o en el receptor) e implica una substitución de nucleótido que especifica un cambio de aminoácido en la proteína poli-merasa que especifica para un fenotipo sensible a la temperatura (ts) . Los RSV quiméricos humanos-bovinos ejemplares en este contexto incorporan una o más substituciones nu-cleotídicas en el gen de la gran polimerasa L, que dan como resultado un cambio de aminoácido en el aminoácido Asn43, Phe521, Gln831, Metll69 ó Tyrl321, según se ejemplifica por los cambios lie para Asn43, Leu para Phe521, Leu para Gln831, Val para Metll69 y Asn para Tyrl321. Alternativa o adicionalmente, los RSV quiméricos de la invención pueden incorporar una mutación ts en un gen RSV diferente, por ejemplo en el gen M2. Preferiblemente, se incorporan dos o más cambios nucleotídicos en un codon que especifica una mutación atenuante, por ejemplo en un codon que especifica una mutación ts, reduciendo así la probabilidad de reversión a partir de un fenotipo atenuado. Según los métodos de la invención, se pueden construir y caracterizar fácilmente RSV quiméricos húmanosbovinos que incorporen al menos una y hasta un complemento completo de mutaciones atenuantes presentes en un panel de cepas de RSV mutantes biológicamente derivadas. Así, se pueden montar mutaciones en cualquier combinación a partir de un panel seleccionado de mutantes, por ejemplo cpts RSV 248 (ATCC VR 2450), cpts RSV 248/404 (ATCC VR 2454), cpts RSV 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC VR 2452), cpts RSV 530/1009 (ATCC VR 2451) , cpts RSV 530/1030 (ATCC VR 2455) , RSV B-l cp52/2B5 (ATCC VR 2542) y RSV B-l cp-23 (ATCC VR 2579) . De esta forma, la atenuación de candidatos vacunales quiméricos puede ser finamente calibrada para uso en una o más clases de pacientes, incluyendo lactantes se-ronegativos . En realizaciones más específicas, los RSV quiméricos humanos-bovinos para uso vacunal incorporan al me-nos y hasta un complemento completo de mutaciones atenuantes que especifican una substitución de aminoácido sensible a la temperatura y/o atenuante en Asn43, Phe521, Gln831, Metll69 ó Tyrl321, en el gen L de la polimerasa de RSV, o una substitución nucleotídica sensible a la temperatura en la secuencia de iniciación génica del gen M2. Alternativa o adicionalmente, los RSV quiméricos reivindicados pueden incorporar al menos una y hasta un complemento completo de mutaciones de RSV atenuados pasados por frío, por ejemplo una o más mutaciones que especifican una substitución en Val267 en el gen N de RSV, Glu218 o Thr523 en el gen F de RSV, Cys319 ó Hisl690 en el gen L de la politnerasa de RSV. En otras realizaciones detalladas, el RSV quimérico humano-bovino de la invención es además modificado para incorporar mutaciones atenuantes seleccionadas entre (i) un panel de mutaciones que especifican substituciones de aminoácidos sensibles a la temperatura Gln831 a Leu y Tyrl321 a Asn en el gen L de polimerasa de RSV; (ii) una substitución nucleotídica sensible a la temperatura en la secuencia de iniciación génica del gen M2; (iii) un panel atenuante de mutaciones adoptadas de RSV pasados por frío que especifican substituciones de aminoácidos Val267 a lie en el gen N de RSV y Cys319 a Tyr e Hisl690 a Tyr en el gen L de polimerasa de RSV; o (iv) deleción o ablación de la expresión de uno o más genes SH, NS1, NS2 , G y M2-2 de RSV. Preferiblemente, éstos y otros ejemplos de RSV quiméricos humanos-bovinos incorporan al menos dos mutaciones atenúan-tes adoptadas entre RSV mutantes biológicamente derivados, los cuales pueden derivar de las mismas o de diferentes cepas de RSV mutantes biológicamente derivadas. También preferiblemente, estos mutantes ejemplares tienen una o más de sus mutaciones atenuantes estabilizadas por múltiples cam-bios nucleotídicos en un codon que especifica la mutación. Según la anterior descripción, la capacidad para producir RSV infeccioso a partir de ADNc permite la introducción de cambios ingenierizados específicos en RSV quiméricos humanos-bovinos . En particular, se emplean RSV recombinantes infecciosos para la identificación de mutación (es) específica (s) en cepas de RSV atenuadas biológicamente derivadas, por ejemplo mutaciones que especifiquen fenotipos ts, ca, att y otros. Las mutaciones deseadas son así identificadas e introducidas en cepas vacunales de RSV quiméricos humanos-bovinos recombinantes. La capacidad de producir virus a partir de ADNc permite la incorporación rutinaria de estas mutaciones, individualmente o en diversas combinaciones seleccionadas, en un clon de ADNc de longitud completa, tras de lo cual se pueden determinar fácilmente los fenotipos de los virus recombinantes rescatados que contienen las mutaciones introducidas. Identificando e incorporando mutaciones específicas biológicamente derivadas asociadas a fenotipos deseados, por ejemplo un fenotipo cp o ts, en clones de RSV quiméricos infecciosos, la invención proporciona otras modificaciones específicas de sitio en la mutación identificada o en estrecha proximidad a ella. Mientras que las mutaciones más atenuantes producidas en RSV biológicamente derivados son simples cambios nucleotídicos , también se pueden incorporar otras mutaciones "específicas de sitio" por técnicas recombinantes en RSV biológicamente derivados o recombinan-tes. Tal como se utiliza aquí, mutaciones específicas de sitio incluye inserciones, substituciones, deleciones o reorganizaciones de 1 a 3 hasta aproximadamente 5-15 ó más nucleótidos alterados (por ejemplo, alterados con respecto a una secuencia de RSV de tipo salvaje, a una secuencia de una cepa de RSV mutante seleccionada o a un clon de RSV re-combinante parental sometido a mutagénesis) . Tales mutaciones específicas de sitio pueden ser incorporadas en, o dentro de una región seleccionada de, una mutación biológicamente derivada seleccionada. Alternativamente, se pueden introducir mutaciones en otros varios contextos en un clon de RSV, por ejemplo en una secuencia reguladora de acción cis o secuencia nucleotídica codificante de un sitio acti-vo, sitio de unión, epitopo inmunogénico, etc. de proteína, o en su proximidad. Los mutantes de RSV específicos de sitio conservan típicamente un fenotipo atenuante deseado, pero pueden exhibir adicionalmente características fenotí-picas alteradas no relacionadas con la atenuación, por ejemplo una inmunogenicidad mayor o ampliada y/o un mejor crecimiento. Otros ejemplos de mutantes específicos de sitio deseados incluyen RSV recombinantes diseñados para incorporar mutaciones nucleotídicas adicionales estabilizado-ras en un codon que especifica una mutación atenuante. Cuando es posible, se introducen dos o más substituciones nucleotídicas en codones que especifican cambios de aminoácidos atenuantes en un clon de RSV parental mutante o re-combinante, dando un RSV biológicamente derivado o recombi-nante que tiene resistencia genética a la reversión a partir de un fenotipo atenuado. En otras realizaciones, se introducen substituciones, adiciones, deleciones o reorganizaciones nucleotídicas específicas de sitio aguas arriba (dirección N-terminal) o aguas abajo (dirección C-terminal), por ejemplo de 1 a 3, 5-10 y hasta 15 nucleóti-dos o más 5' 6 3', en relación a una posición nucleotídica blanco, por ejemplo para construir o eliminar un elemento regulador de acción cis existente. Además de mutaciones puntuales simples y múlti-pies y de mutaciones específicas de sitio, los cambios en el RSV quimérico humano-bovino aquí descritos incluyen deleciones, inserciones, substituciones o reorganizaciones de genes o segmentos genómicos enteros. Estas mutaciones pueden alterar pequeños números de bases (por ejemplo, de 15-30 bases hasta 35-50 bases o más) , grandes bloques de nu-cleótidos (por ejemplo, 50-100, 100-300, 300-500, 500-1.000 bases) o genes casi completos o completos (por ejemplo, 1.000-1.500 nucleótidos, 1.500-2.500 nucleótidos, 2.500-5.000 nucleótidos, 5.000-6.500 nucleótidos o más) en el ge-noma o antigenoma donante o receptor, dependiendo de la naturaleza del cambio (es decir, se puede cambiar un pequeño número de bases para insertar o eliminar un epitopo inmuno-génico o cambiar un pequeño segmento genómico, mientras que están implicados gran (des) bloque (s) de bases cuando se añaden, substituyen, " suprimen o reorganizan genes o grandes segmentos genómicos . En aspectos adicionales, la invención permite la suplementación de mutaciones adoptadas en un clon de RSV quimérico a partir de RSV biológicamente derivados, por ejemplo mutaciones cp y ts, con tipos adicionales de mutaciones que implican a los mismos, o a diferentes genes en otro clon de RSV quimérico modificado. RSV codifica para diez AR m y diez u once proteínas . Tres de éstas son proteínas superficiales de transmembrana, a saber, la proteína de unión (G) , la proteína de fusión (F) implicada en la penetración, y la pequeña proteína hidrofóbica (SH) . G y F son los antígenos víricos mayores de neutralización y protectores . Cuatro proteínas adicionales están asociadas con la nucleocápside del virus, a saber, la proteína de unión a ARN N, la fosfoproteína P, la gran proteína polimerasa L y el factor de elongación de la transcripción M2 ORF1. Un se-gundo ORF en M2 , el M2-2 ORF, codifica para un importante factor regulador de ARN. La proteína de la matriz es parte del virión interno y probablemente media en la asociación entre la nucleocápside y la envuelta. Finalmente, existen dos proteínas no estructurales, NS1 y NS2, de fun-ción desconocida. Cada una de estas proteínas puede ser selectivamente alterada en términos de niveles de expresión, o puede ser añadida, suprimida, substituida o reorganizada, en todo o en parte, sola o en combinación con otras modificaciones deseadas, para obtener un RSV quimérico humano-bovino que exhibe nuevas características vacunales. Por lo tanto, además de, o en combinación con, las mutaciones atenuantes adoptadas a partir de mutantes RSV biológicamente derivados, la presente invención proporciona también un rango de métodos adicionales para atenuar o modificar de algún otro modo el fenotipo de RSV quiméricos humanos-bovinos basados en la ingeniería recombinante de clones de RSV infecciosos. Se puede producir una variedad de alteraciones en una secuencia polinucleotídica aislada codificante del gen o segmento genómico donante o el genoma o antigenoma de fondo para incorporación en clones infecciosos. Más concretamente, para conseguir cambios es-tructurales y fenotípicos deseados en RSV quiméricos, la invención permite la introducción de modificaciones que supriman, substituyan, introduzcan o reorganicen un nucleóti-do o pluralidad de nucleotidos seleccionados a partir de un genoma o antigenoma quimérico parental, así como mutaciones que supriman substituyan, introduzcan o reorganicen gen (es) o segmento (s) genómico (s) completo (s), dentro de un clon de RSV quimérico humano-bovino . Las modificaciones deseadas de RSV quiméricos humanos-bovinos infecciosos son típicamente seleccionadas para especificar un cambio fenotípico deseado, por ejemplo un cambio en el crecimiento vírico, sensibilidad a la temperatura, capacidad para provocar una respuesta inmune en el hospedador, atenuación, etc. Estos cambios pueden ser efectuados en un genoma o antigenoma donante o en uno re-ceptor por, por ejemplo, mutagénesis de un clon de RSV parental, para eliminar, introducir o reorganizar un gen (es) o región (es) genómica(s) específica (s) (por ejemplo, un segmento genómico que codifica para un dominio estructural de proteína, tal como un dominio citoplásmico, de transmembrana o extracelular, un epitopo inmunogénico, una región de unión, un sitio activo, etc., o una señal de acción cis) . Los genes de interés en este sentido incluyen todos los genes del genoma de RSV: 3 ' -NS1-NS2 -N-P-M-SH-G-F-M21/M2-2-L-5' , así como genes heterólogos de otros RSV, otros virus y una variedad de otras fuentes no RSV, según se indica aquí . También se proporcionan modificaciones en un RSV quimérico humano-bovino que simplemente alteran o eliminan la expresión de un gen seleccionado, por ejemplo introduciendo un codon de finalización en una secuencia codificante de RSV seleccionada, cambiando la posición de un gen de RSV en relación a un promotor operablemente unido, introduciendo un codon de iniciación aguas arriba para alterar las velocidades de expresión, modificando (por ejemplo, cambiando la posición, alterando una secuencia existente o substituyendo una secuencia existente con una se-cuencia heteróloga) las señales de transcripción GS y/o GE para alterar el fenotipo (por ejemplo, crecimiento, restricciones de la temperatura sobre la transcripción, etc.) y otras varias deleciones, substituciones, adiciones y reorganizaciones que especifican cambios cuantitativos o cua-litativos en la replicación vírica, en la transcripción de gen (es) seleccionado (s) o en la traducción de proteína (s) seleccionada (s) . La capacidad para analizar e incorporar otros tipos de mutaciones atenuantes en RSV quiméricos humanos-bovinos para el desarrollo de vacunas se prolonga a un amplio montaje de cambios buscados en clones de RSV. Por ejemplo, la deleción del gen SH da un RSV recombinante que tiene nuevas características fenotípicas, incluyendo un mayor crecimiento. En la presente invención, se suprime un gen SH, NS1 o NS2 (o cualquier otro gen o segmento genómico no esencial seleccionado) en un RSV quimérico, que puede tener también una o más mutaciones adicionales que especifiquen un fenotipo atenuado, por ejemplo una o más mutaciones adoptadas a partir de un mutante de RSV atenuado biológicamente derivado. En realizaciones ejemplares, se suprime un gen SH, NS1 o NS2 en combinación con una o más mutacio-nes cp y/o ts adoptadas a partir de cpts248/404, cpts530/1009, cpts530/1030 u otra cepa de RSV mutante seleccionada, para obtener un RSV recombinante con un mayor rendimiento de virus, una mayor atenuación y resistencia a la reversión fenotípica, debido a los efectos combinados de las diferentes mutaciones. Se puede eliminar o modificar de alguna otra forma un gen RSV que no sea esencial para el crecimiento, por ejemplo los genes SH, NS1, NS2 o M2-2, en un RSV quimérico para obtener efectos deseados sobre la virulencia, la patogénesis, la inmunogenicidad y otros caracteres fenotí-picos. Por ejemplo, la ablación por deleción de un gen no esencial, tal como SH, da lugar a un mayor crecimiento del virus en cultivo. Sin desear inclinarnos por ninguna teoría, este efecto es probablemente debido en parte a una longitud nucleotídica reducida del genoma vírico. En el caso de un clon SH-menos ejemplar, el genoma vírico modificado tiene una longitud de 14.825 nt, 398 nucleótidos menos que el tipo salvaje. Mediante ingeniería de mutaciones similares que disminuyen el tamaño del genoma, por ejemplo en otras regiones codificantes o no codificantes en algún otro lugar del genoma RSV, tal como en los genes P, M, F y M2, la invención proporciona varios métodos y materiales fácil-mente obtenibles para mejorar el crecimiento de los RSV quiméricos . Además, se puede producir una variedad de otras alteraciones genéticas en un genoma o antigenoma de RSV pa-ra incorporación en RSV quiméricos humanos-bovinos infecciosos, solas o junto con una o más mutaciones atenuantes adoptadas de un RSV mutante biológicamente derivado. Se pueden insertar genes y segmentos genómicos heterólogos adicionales (por ejemplo, de diferentes genes de RSV, de diferentes cepas o tipos de RSV o de fuentes no RSV) en todo o en parte, se puede cambiar el orden de los genes, se puede eliminar el solapamiento génico, se puede substituir un promotor del genoma de RSV con su contrapartida antige-nómica, se pueden eliminar o substituir porciones de genes y se pueden suprimir incluso genes completos. Se pueden hacer modificaciones diferentes o adicionales en la secuencia para facilitar las manipulaciones, tales como la inserción de sitios únicos de restricción en varias regiones in-tergénicas o en algún otro lugar. Se pueden eliminar se-cuencias génicas no traducidas para aumentar la capacidad de inserción de secuencias extrañas. También se proporcionan mediante la invención modificaciones genéticas en un RSV quimérico humano-bovino que alteran o eliminan la expresión de un gen o segmento genómico seleccionado sin eliminar el gen o segmento genó-mico del clon de RSV quimérico. Por ejemplo, se puede conseguir esto introduciendo una mutación de cambio de marco o un codon de finalización en una secuencia codificante seleccionada, cambiando la posición de un gen o introduciendo un codon de iniciación aguas arriba para alterar su velocidad de expresión, o cambiando las señales de GS y/o GE de la transcripción para alterar el fenotipo (por ejemplo, crecimiento, restricciones de la temperatura sobre la transcripción, etc.). En uno de tales ejemplos, se elimina la expresión del ORF M2-2, lo que da cambios fenotípicos altamente deseados para el desarrollo de un virus vacunal, incluyendo una cinética de crecimiento alterada, una repli-cación de ARN reducida y una mayor transcripción. Por lo tanto, el knock out M2-2 exhibe una significativa atenuación con un aumento concomitante, más que una reducción, en la expresión antigénica. En aspectos más detallados de la invención, se proporciona un RSV quimérico humano-bovino en el que la expresión del gen NS2 es eliminada a nivel de traducción sin deleción del gen o de un segmento del mismo, por ejemplo introduciendo dos codones de finalización de la traducción en tándem en un marco de lectura abierta (ORF) de la traducción. Esto da virus viable en el que se ha silenciado un gen seleccionado a nivel de traducción sin suprimir su gen. Estas formas de virus knock out exhibirán con frecuencia velocidades de crecimiento menores y pequeños tamaños de placa en cultivo de tejidos. Por lo tanto, estos métodos proporcionan aún nuevos tipos adicionales de mutaciones atenuantes que eliminan la expresión gen un gen vírico que no es uno de los antígenos protectores víricos mayores. En este contexto, los fenotipos de virus knock out producidos sin deleción de un gen o segmento genómico pueden ser alternativamente producidos por mutagénesis de deleción, según se describe aquí, para impedir con eficacia las mutaciones correctoras que pueden restaurar la síntesis de una proteína diana. Se pueden hacer otros varios knock outs gé-nicos para los RSV quiméricos humanos-bovinos usando diseños y métodos alternativos conocidos en la técnica (según se describe, por ejemplo, en Kretschmer y col., Virology 216: 309-316, 1996; Radíele y col., Virology 217: 418-412, 1996, y Kato y col., EMBO J. 16: 578-587, 1997, y Schneider y col., Virology 277: 314-322, 1996, cada una de ellas aquí incorporada como referencia) . Otras mutaciones para incorporación en los RSV quiméricos humanos-bovinos de la invención incluyen mutaciones dirigidas hacia señales de acción cis, que pueden ser identificadas, por ejemplo, por análisis mutacional de minigemonas de RSV. Por ejemplo, el análisis de inserciones y deleciones de las secuencias líder y remolcadora y flanqueantes identifica promotores víricos y señales de transcripción y proporciona una serie de mutaciones asociadas con grados variables de reducción de replicación o transcripción del ARN. La mutagénesis de saturación (mediante la cual cada posición es modificada, a su vez, a cada una de las alternativas nucleotídicas) de estas señales de acción cis ha identificado también muchas mutaciones que reducían (o, en un caso, aumentaban) la replicación o transcripción del ARN. Se puede insertar cualquiera de estas mutaciones en un antigenoma o genoma de RSV quimérico humano-bovino según se describe aquí . La evaluación y manipulación de proteínas de acción trans y de secuencias de ARN de acción cis usando el ADNc completo del antigenoma está asistida por el uso de minigenomas de RSV (véase, por ejemplo, Gros-feld y col., J. Virol . 69: 5677-5686, 1995, aquí incorporada como referencia) , cuyo estado dependiente de "helper" es útil en la caracterización de aquellos mutantes que son demasiado inhibidores como para ser recuperados en virus infeccioso independiente de la replicación. Mutaciones adicionales en el RSV quimérico humano-bovino incluyen la substitución del extremo 3' gel genoma con su contrapartida del antigenoma, que está aso-ciada con cambios en la replicación y transcripción del ARN. Además, las regiones intergénicas (Collins y col., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 83: 4594-4598, 1986, aquí incorporada como referencia) , pueden ser acortadas o prolongadas o cambiadas en cuanto al contenido de secuencia, y el sola-pamiento génico natural (Collins y col., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 84: 5134-5138, 1987, aquí incorporada como referencia) puede ser eliminado o cambiado a una región inter-génica diferente por los métodos aquí descritos. En una realización ejemplar, el nivel de expresión de proteínas de RSV específicas, tales como los antígenos protectores F y G, puede aumentar substituyendo las secuencias naturales con unas que hayan sido construidas sintéticamente y diseñadas paras ser consistentes con una traducción eficiente. En este contexto, se ha visto que la utilización de codones puede ser un factor mayor en el nivel de traducción de proteínas víricas en mamíferos (Haas y col., Current Biol . 6: 315-324, 1996, aquí incorporada como referencia). El examen de la utilización de codones de los ARNm codificantes de las proteínas F y G de RSV, que son los antígenos protectores mayores, muestra que la utilización es consistente con una pobre expresión. Por lo tanto, la utilización de codones puede mejorar por los métodos recombinantes de la invención para conseguir una mejor expresión para los genes seleccionados. En otra realización ejemplar, se modifica una secuencia que rodea a un sitio de iniciación de la traducción (que preferiblemente incluye un nucleótido en la posición -3) de un gen de RSV seleccionado, sólo o en combinación con la introducción de un codon de iniciación aguas arriba, para modular la expresión del gen de RSV quimérico especificando una regulación a más o a menos de la traducción.
Alternativamente, o en combinación con otras modificaciones de RSV aquí descritas, se puede modular la expresión génica del RSV quimérico humano-bovino alterando una señal GS transcripcional de un gen(es) seleccionado (s) del virus. En una .realización ejemplar, la señal GS de NS2 es modificada para incluir una mutación definida (por ejemplo, la mutación 404 (M2) aquí descrita a continuación) para sobreponer una restricción ts sobre la replicación vírica. En realizaciones alternativas, se modifican los niveles de expresión génica en los RSV quiméricos humanos-bovinos a nivel de transcripción. En un aspecto, la posición de un gen seleccionado en el mapa génico de RSV puede ser cambiada a una posición más proximal al promotor o más. distal al promotor, mediante lo cual el gen se expresará más o menos eficientemente, respectivamente. Según este aspecto, se puede conseguir la modulación de la expresión para genes específicos, obteniéndose reducciones o aumentos de expresión génica de desde dos veces, más típicamente cuatro veces, hasta diez veces o más en comparación con los niveles de tipo salvaje alcanzados mediante un aumento proporcionado en los niveles de expresión para genes recíprocamente substituidos posicionalmente . En un ejemplo, el gen NS2 (segundo en el orden en el mapa génico de RSV) substituye en posición al gen SH (sexto en orden) , dando una re-ducción predicha en la expresión de NS2. En otras realizaciones ejemplares, los genes F y G sufren una transposición por separado o juntos a un sitio más proximal al promotor o distal al promotor en el mapa génico del RSV quimérico para conseguir niveles mayores o menores de expresión génica, respectivamente. Éstos y otros cambios transposicionales dan nuevos clones de RSV quiméricos que tienen fenotipos atenuados, por ejemplo debido a una mayor expresión de pro-teínas víricas seleccionadas implicadas en la replicación del AR , o que tienen otras propiedades deseables, tales como una mayor expresión antigénica. Los clones de RSV quiméricos humanos-bovinos infecciosos de la invención pueden ser también ingenieriza-dos según los métodos y composiciones aquí descritos para aumentar la inmunogenicidad e inducir un nivel de protección mayor que la aportada por la infección con un RSV de tipo salvaje o un RSV quimérico parental . Por ejemplo, se puede añadir un epitopo inmunogénico de una cepa o tipo de RSV heterólogo, o de una fuente no RSV, tal como PIV, a un clon quimérico por cambios nucleotídicos apropiados en la secuencia polinucleotídica codificante del genoma o antige-noma quimérico. Alternativamente, se puede ingenierizar RSV quimérico para añadir o eliminar (por ejemplo, por inserción, substitución o deleción de aminoácidos) proteínas in-munogénicas, dominios proteicos o formas de proteínas específicas (tales como la forma segregada de G) asociados con reacciones inmunológicas deseables o no deseables. Dentro de los métodos de la invención, se pueden insertar genes o segmentos genómicos adicionales en, o próximamente a, el genoma o antigenoma de RSV quimérico humano-bovino. Estos genes pueden estar bajo control común con genes receptores, o pueden estar bajo el control de un grupo independiente de señales de transcripción. Los genes de interés incluyen los genes RSV antes identificados, así como genes no RSV. Los genes no RSV de interés incluyen los que codifican para citokinas (por ejemplo, IL-2 a IL-18, especialmente IL-2, IL-6 e IL-12, IL-18, etc.), gamma-interferon y proteínas ricas en epitopos de células T hel-per. Estas proteínas adicionales pueden expresarse como una proteína aparte o como una quimera ingenierizada a partir de una segunda copia de una de las proteínas RSV, tal como SH. Esto proporciona capacidad para modificar y mejorar las respuestas inmunes frente a RSV tanto cuantitativa como cualitativamente . En realizaciones ejemplares de la invención, la inserción de genes o segmentos genómicos extraños y, en algunos casos, de secuencias nucleotídicas no codificantes, en un genoma de RSV quimérico humano-bovino da lugar a un aumento deseado en la longitud el genoma, que produce aún efectos fenotípicos deseados adicionales. Una mayor longitud del genoma da lugar a atenuación del RSV resultante, dependiente, en parte, de la longitud del inserto. Además, la expresión de determinadas proteínas, por ejemplo una ci-tokina, a partir de un gen no RSV insertado en un RSV qui-mérico humano-bovino dará lugar a atenuación del virus debido a la acción de la proteína. Como ejemplos de citokinas que dan un fenotipo vírico atenuado infeccioso y altos niveles de expresión de citokinas a partir de células trans-fectadas con RSV se incluyen interleukina-2 (IL-2), IL-4, GM-CSF e interferon-?. Efectos adicionales, incluyendo el aumento de las respuestas inmunes celulares o humorales, acompañarán también a la introducción de citokinas en los RSV quiméricos humanos-bovinos de la invención. Las deleciones, inserciones, substituciones y otras mutaciones que implican cambios de genes o segmentos genómicos víricos en los RSV quiméricos humanos-bovinos de la invención dan candidatos vacunales altamente estables, los cuales son particularmente importantes en el caso de individuos inmunosuprimidos . Muchos de estos cambios darán lugar a atenuación de las cepas vacunales resultantes, mientras que otros especificarán tipos diferentes de cambios fenotípicos deseados. Por ejemplo, los genes acceso- rios (es decir, no esenciales para el crecimiento in vitro) son excelentes candidatos para codificar proteínas que interfieren específicamente con la inmunidad del huésped (véase, por ejemplo, Kato y col., EMBO J. 16: 578-587, 1997, aquí incorporada como referencia) . La ablación de dichos genes en virus vacunales quiméricos se espera que reduzca la virulencia y la patogénesis y/o mejore la inmuno-genicidad. En aspectos alternativos de la invención, los RSV quiméricos humanos-bovinos infecciosos producidos a partir de un genoma o antigenoma expresado por ADNc pueden ser de las cepas de RSV o de tipo RSV, por ejemplo humanas, bovinas, murinas, etc., o de cualquier pneumovirus, por ejemplo virus de la pneumonía de ratones, pneumovirus aviar (previamente llamado virus de la rinotraqueítis de los pavos) . Para engendrar una respuesta inmune protectora, la cepa de RSV puede ser una que sea endógena para el sujeto que esté siendo inmunizado, tal como RSV humano que esté siendo usado para inmunizar a humanos. El genoma o antige-noma del RSV endógeno puede ser modificado, sin embargo, para expresar genes o segmentos genómicos de RSV a partir de una combinación de fuentes diferentes, por ejemplo una combinación de genes o segmentos genómicos de diferentes especies, subgrupos o cepas de RSV, o de un RSV y otro pa-tógeno respiratorio, tal como PIV. En determinadas realizaciones de la invención, se proporcionan RSV quiméricos humanos -bovinos en los que se substituyen genes o segmentos genómicos dentro de un RSV humano o bovino (por ejemplo, un genoma o antigenoma de fondo de RSV humano) con genes o segmentos genómicos hete-rólogos de contrapartida de un RSV no humano y no bovino, por ejemplo un RSV murino. Las substituciones, deleciones y adiciones de genes o segmentos genómicos de RSV en este contexto pueden incluir parte o todos de uno o más de los genes NS1, NS2 , N, P, M, SH, M2 (0RF1) , M2(ORF2) y L, o partes de los genes G y F que preferiblemente están fuera de los epitopos mayores de neutralización y protectores. Además, se pueden substituir secuencias de acción cis de RSV humanos o bovinos, tales como señales promotoras o de transcripción, con secuencias de contrapartida no humanas y no bovinas. Por lo tanto, el RSV quimérico humano-bovino infeccioso pretendido para administración a humanos pueden ser un RSV humano que haya sido modificado para contener genes de un RSV murino además de RSV bovino. La substitución de una secuencia codificante (por ejemplo, de NS1, NS2 , SH, G, M2-2) o secuencia no co-dificante (por ejemplo, un elemento promotor, de final de gen, de iniciación de gen, intergénico u otro de acción cis) de RSV humano con una secuencia de RSV bovino o murino de contrapartida da RSV quiméricos que tienen una variedad de posibles efectos atenuantes y otros efectos fenotípicos. En particular, el rango de hospedadores y otros efectos deseados surgen de la substitución de un gen de RSV bovino o murino importado en un fondo de RSV humano, donde el gen bovino o murino no funciona eficientemente en una célula humana, por ejemplo por incompatibilidad de la secuencia o proteína heteróloga con una secuencia o proteína de RSV humano biológicamente interactiva (es decir, una secuencia o proteína que ordinariamente coopera con la secuencia o proteína substituida para la transcripción, traducción, montaje, etc. del virus) o, más típicamente, en una res-tricción del rango de hospedadores, con una proteína celular o algún otro aspecto del medio celular que sea diferente entre el hospedador permisivo y el menos permisivo. En una de tales realizaciones, un RSV quimérico bovino-humano incorpora una substitución del gen o segmento genómico NP de RSV humano con un gen o segmento genómico NP bovino de contrapartida, cuya quimera puede ser eventualmente cons-truida para incorporar cambios genéticos adicionales, por ejemplo mutaciones puntuales o deleciones génicas. Los RSV quiméricos humanos-bovinos portadores de genes heterólogos o elementos de acción cis son seleccionados en cuanto a restricción del rango de hospedadores y otros fenotipos de-seados favorables para uso vacunal. En realizaciones ejemplares, se seleccionan secuencias de RSV bovino para introducción en RSV humano en base a aspectos conocidos de la estructura y función del RSV bovino, según se describe, por ejemplo, en Pastey y col., J. Gen. Virol. 76: 193-197, 1993; Pastey y col., Virus Res. 29: 195-202, 1993, Zamora y col., J. Gen. Virol. 73: 737-741, 1992; Mallipeddi y col., J. Gen. Virol. 74: 2001-2004, 1993; Mallipeddi y col., J. Gen. Virol . 73: 2441-2444, 1992, y Zamora y col., Virus Res . 24: 115-121, 1992, cada una de ellas aquí incorporada como referencia, y según las enseñanzas aquí descritas. En otras realizaciones de la invención, se modelan mutaciones de interés para introducción en RSV quiméricos humanos-bovinos según una cepa no patogénica adaptada al cultivo de tejidos de virus de la pneumonía de ratones (la contrapartida murina del RSV humano) , que carece de una cola citoplásmica de la proteína G (Randhawa y col., Viro-logy 207: 240-245, 1995). En consecuencia, en un aspecto de la invención, se añaden, suprimen, modifican o substituyen los dominios citoplásmicos y/o de transmembrana de una o más de las glicoproteínas de RSV humano, F, G y SH, en un RSV quimérico usando una secuencia de contrapartida heteró-loga (por ejemplo, una secuencia de un dominio citoplásmico o de transmembrana de una proteína F, G o SH del virus de la pneumonía murina) para obtener una atenuación deseada. Como otro ejemplo, se puede modificar una secuencia nucleo-tídica en el sitio de escisión de la proteína F, o en su proximidad, o el dominio de unión putativo de la proteína G, por mutaciones puntuales, cambios específicos de sitio o alteraciones que implican genes enteros o segmentos genómi-cos para conseguir nuevos efectos sobre el crecimiento del virus en cultivo de tejidos y/o la infección y la patogéne-sis. En aspectos más detallados de la invención, se emplean RSV quiméricos humanos-bovinos como vectores para antígenos protectores de otros patógenos, particularmente patógenos del tracto respiratorio, tales como el virus de la parainfluenza (PIV) . Por ejemplo, se pueden ingenierizar RSV que incorporen secuencias que codifiquen para antígenos protectores de PIV para producir virus vacunal atenuado infeccioso. Se da una descripción de la clonación de ADNc PIV y otras descripciones para poner en marcha éstos y otros aspectos más detallados de la invención en la Solicitud de Patente Estadounidense N° de Serie 09/083.793 (correspondiente a la Publicación Internacional N° WO 98/53078) y su prioridad, la Solicitud Provisional EE.UU. N° de Serie 60/047.575; Solicitud de Patente Estadounidense N° 09/350.821, y Solicitud de Patente Estadounidense N° 09/586.479 y su prioridad, la solicitud Provisional N° de Serie 60/143.134, cada una de ellas aquí incorporada como referencia. Estas descripciones incluyen la descripción de los siguientes plásmidos, que pueden ser empleados para producir clones víricos de PIV infecciosos: p3/7(131) (ATCC 97990), p3/7(131)2G (ATCC 97989) y p218(131) (ATCC 97991), cada uno depositado bajo los términos del Tratado de Buda-pest en la American Type Culture Collection (ATCC) de 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, EE.UU., y a los que se concedieron los números de acceso antes identificados. Según este aspecto de la invención, se proporciona un RSV quimérico humano-bovino que consiste en una quimera de una secuencia genómica o antigenómica de RSV bovino y humano y al menos una secuencia de PIV, por ejemplo un polinucleótido que contiene secuencias de RSV tanto bo-vino como humano y PIV1, PIV2, PIV3 o PIV bovino. Por ejemplo, se pueden substituir genes individuales de RSV como genes de contrapartida de PIV humano, tales como los genes de la glicoproteína F de PIV1, PIV2 o PIV3. Alternativamente, se substituye con un segmento genómico heterólogo se-leccionado, tal como una cola citoplásmica, un dominio de transmembrana o un ectodominio, un segmento genómico de contrapartida en, por ejemplo, el mismo gen en RSV, en un gen diferente en RSV o en una secuencia no codificante del genoma o antigenoma de RSV. En una realización, se substi-tuye con un segmento genómico de un gen F de HPIV3 un segmento genómico de RSV humano de contrapartida para obtener constructos codificantes de proteínas quiméricas, por ejemplo proteínas de fusión que tienen una cola citoplásmica y/o dominio de transmembrana de RSV fusionado a un ectodo-minio de RSV, para obtener un nuevo virus atenuado y/o una vacuna multivalente inmunogénica tanto frente a PIV como frente a RSV. La clonación de ADNc PIV y otras descripciones para llevar poner en práctica éstos y otros aspectos más detallados de la invención son facilitadas en la Soli-citud de Patente Estadounidense N° de Serie 09/083.793 (correspondiente a la Publicación Internacional N° WO 98/53078) y su prioridad, la Solicitud Provisional N° de Serie 60/047.575; Solicitud de Patente Estadounidense N° 09/350.821, y Solicitud de Patente Estadounidense N° 09/586.479 y su prioridad, la solicitud Provisional N° de Serie 60/143.134, cada una de ellas aquí incorporada como referencia. Los RSV quiméricos humanos-bovinos de la invención pueden ser empleados como vectores para expresar determinante antigénicos de una amplia variedad de otros patógenos. Típicamente, se emplea un genoma o antigenoma quimérico bovino-humano como genoma o antigenoma vector de RSV parcial o completo. En el genoma o antigenoma vector se incorporan uno o más genes o segmentos genómicos heterólogos codificantes de determinante (s) antigénico (s) de uno o más patógenos heterólogos. En determinadas realizaciones, el patógeno heterólogo es un RSV heterólogo y el (los) gen (es) o segmento(s) genómico(s) heterólogo (s) incorporado (s) en el genoma o antigenoma vector de RSV quimérico humano-bovino codifica (n) para una o más proteínas NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(0RF1), M2(ORF2), L, F o G de RSV o fragmentos de éstas. Por ejemplo, el genoma o antigenoma vector puede incluir un genoma o antigenoma de RSV A parcial o completo y el gen o segmento genómico heterólogo codificante del determinante antigénico puede ser de un virus del subgrupo B de RSV. En otras realizaciones alternativas, el RSV quimérico humano-bovino es empleado como vector para expresar uno o más determinantes antigénicos de un patógeno no RSV. El virus vector quimérico así construido puede expresar determinantes antigénicos de RSV, así como del patógeno no RSV, o puede provocar una respuesta inmune monoespecífi-ca contra el patógeno no RSV. En una realización, los RSV quiméricos humanos-bovinos incorporan uno o más genes o segmentos genómicos de HPIV1, HPIV2 o HPIV3 codificantes de una o más glicoproteínas HN y/o F o dominios, fragmentos o epitopos antigénicos de éstas. En aspectos más detallados, se añade o incorpora una unidad de transcripción que con-tiene un marco de lectura abierta (ORF) de un gen HN o F de HPIV2 en el genoma o antigenoma vector de HBRSV quimérico. Los RSV quiméricos humanos-bovinos empleados como vectores incluyen RSV quiméricos en los que el genoma o antigenoma vector es un genoma o antigenoma de BRSV parcial o completo y el (los) gen (es) o segmento (s) genómico(s) heterólogo (s) codificante (s) del (de los) determinante (s) antigénico (s) es/son de uno o más HRSV. Por ejemplo, el genoma o antigenoma de BRSV parcial o completo puede incorporar uno o más genes o segmentos genómicos codificantes de uno o más genes de glicoproteínas de HRSV seleccionados entre F, G y SH, o uno o más segmentos genómicos codificantes de porciones de dominio citoplásmico, dominio de transmembrana, ectodominio o epitopo inmunogénico de F, G y/o SH de HRSV. En aún constructos de vectores adicionales de la invención, el genoma o antigenoma vector incluye un genoma o antigenoma de HRSV o BRSV parcial o completo y el patógeno heterólogo es seleccionado entre el virus del sarampión, los virus sincitiales respiratorios del subgrupo A y del subgrupo B, el virus de las paperas, los virus del papiloma humano, los virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 y de tipo 2, los virus herpes simplex, el citome-galovirus, el virus de la rabia, el virus de Epstein Barr, los filovirus, los bunyavirus, los flavivirus, los alfavi-rus y los virus de la influenza. De éstos y de otros patógenos, se pueden seleccionar determinante (s) antigénico (s) heterólogo (s) para incorporación en el RSV quimérico huma-no-bovino entre las proteínas HA y F del virus del sarampión, las proteínas F, G, SH y M2 del virus sincitial respiratorio del subgrupo A o del subgrupo B, las proteínas HN y F del virus de las paperas, la proteína Ll del virus del papiloma humano, la proteína gpl60 del virus de la inmuno-deficiencia humana de tipo 1 ó de tipo 2, las proteínas gB, gC, gD, gE, gG, gH, gl , gJ, gK, gL y g del virus herpes simplex y del citomegalovirus, la proteína G del virus de la rabia, la proteína gp350 del virus de Epstein Barr, la proteína G de filovirus, la proteína G de bunyavirus, las proteínas E y NS1 de flavivirus y la proteína E de alfavi-rus, y sus dominios, fragmentos y epitopos antigénicos. Por ejemplo, se puede usar un RSV quimérico humano-bovino de la invención como vector en el que el patógeno heterólogo es el virus del sarampión y el (los) determinante (s) antigéni-co(s) heterólogo (s) es/son seleccionados entre las proteínas HA y F del virus del sarampión y dominios, fragmentos y epitopos antigénicos de éstas. Para construir dichos recom-binantes, se añade o incorpora una unidad de transcripción que contiene un marco de lectura abierta (ORF) de un gen HA del virus del sarampión en un genoma o antigenoma vector de HRSV. Se construyen fácilmente recombinantes similares para otros patógenos no RSV según las enseñanzas de la presente descripción. Además de las modificaciones antes descritas en los RSV quiméricos humanos-bovinos, se pueden hacer modificaciones diferentes o adicionales en clones de RSV para facilitar las manipulaciones, tales como la inserción de sitios únicos de restricción en varias regiones intergénicas (por ejemplo, un sitio único Stul entre los genes G y F) o en algún otro lugar. Se pueden eliminar las secuencias gé-nicas no traducidas para aumentar la capacidad de inserción de secuencias extrañas . En otro aspecto de la invención, se facilitan composiciones (por ejemplo, polinucleó idos aislados y vectores que incorporan un ADN codificante de RSV quimérico humano-bovino) para producir un RSV quimérico infeccioso aislado. Utilizando estas composiciones y métodos, se generan RSV quiméricos infeccioso a partir de un genoma o anti-genoma de RSV quimérico, una proteína de nucleocápside (N) , una fosfoproteína de nucleocápside (P) , una gran proteína polimerasa (LO) y un factor de elongación de la ARN polime-rasa. En aspectos relacionados de la invención, se proporcionan composiciones y métodos para introducir los cambios estructurales y fenotípicos antes mencionados en un RSV quimérico recombinante para obtener virus vacunales atenuádos infecciosos. La introducción de las mutaciones antes definidas en un clon de RSV quimérico humano-bovino infeccioso puede realizarse por una variedad de métodos bien conocidos. Por "clon infeccioso" con respecto a ADN, se quiere decir ADNc o su producto, sintético o cualquier otro, que puede ser transcrito en un ARN genómico o antigenómico capaz de servir como plantilla para producir el genoma de un virus o partícula subvírica infecciosa. Así, se pueden introducir mutaciones definidas por técnicas convencionales (por ejemplo, mutagénesis dirigida a sitio) en una copia de ADNc del genoma o antigenoma. El uso de subfragmentos de ADNc de antigenoma o de genoma para montar un ADNc de antigenoma o de genoma completo tal como se describe aquí tiene la ventaja de que cada región puede ser manipulada por se-parado (los ADNc más pequeños son más fáciles de manipular que los grandes) y luego fácilmente montada en un ADNc completo. De este modo, se puede usar el ADNc de antigenoma o genoma completo, o cualquier subfragmento del mismo, como plantilla para la mutagénesis dirigida a oligonucleótidos . Esto puede ser a través de una forma de fagémido de una sola hebra, tal como mediante la utilización del kit Muta-gene® de Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA) o mediante un método que utiliza un plásmido de doble hebra directamente como plantilla, tal como el kit de mutagénesis Chameleon de Stratagene (La Jolla, CA) , o por la reacción en cadena de polimerasa empleando un cebador oligonucleótido o plantilla que contiene la(s) mutación(es) de interés. Se puede montar entonces un subfragmento mutado en el ADNc del antigenoma o genoma completo. Se conoce una variedad de otras técnicas de mutagénesis y se dispone de ellas para la producción de las mutaciones de interés en el ADNc del antigenoma o geno-ma RSV. Las mutaciones pueden variar de simples cambios nu-cleotídicos a substitución de grandes piezas de ADNc que contienen una o más regiones génicas o genómicas. Así, en una realización ilustrativa, se introducen mutaciones usando el kit de mutagénesis in vitro de fagémidos Muta-gene de Bio-Rad. Resumiendo, se clona ADNc codificante de una porción de un genoma o antigenoma de RSV en el plásmido pTZ18U y se usa para transformar células CJ236 (Life Technologies) . Se hacen preparaciones de fagémidos según las recomendaciones del fabricante. Los oligo-nucleótidos son diseñados para la mutagénesis por introducción de un nucleótido alterado en la posición deseada del genoma o antigenoma. El plásmido que contiene el fragmento de genoma o antigenoma genéticamente alterado es entonces amplificado y la pieza mutada en entonces reintroducida en el clon de genoma o antigenoma de longitud completa. La capacidad para introducir mutaciones definidas en RSV infecciosos tiene muchas aplicaciones, incluyen-do los análisis de la biología molecular y la patogénesis del RSV. Por ejemplo, las funciones de las proteínas de RSV pueden ser investigadas y manipuladas por introducción de mutaciones que eliminan o reducen su nivel de expresión, o que dan proteína mutante. En una realización ejemplar, se construye RSV recombinante en el que la expresión de un gen vírico, a saber, el gen SH, es eliminada, por ejemplo, por deleción de la secuencia codificante de ARN y de las señales de transcripción flanqueantes. Sorprendentemente, no sólo se podía recuperar este virus, sino que crecía eficientemente en cultivo de tejidos. De hecho, su crecimiento estaba substancialmente aumentado sobre el del tipo salvaje, en base tanto al rendimiento de virus infeccioso como al tamaño de placa. Este mejor crecimiento en cultivo de tejidos gracias a la deleción SH y a otros derivados de RSV de la invención proporciona herramientas útiles para el desarrollo de vacunas RSV, que resuelven el problema del pobre rendimiento del RSV en cultivo de tejidos que había complicado la producción de virus vacunal en otros siste-mas. Estas deleciones son altamente estables frente a la reversión genética, lo que hace que los clones de RSV derivados de ellas sean particularmente útiles como agentes vacunales . En otra realización ejemplar, se proporcionan RSV quiméricos que incorporan una mutación que elimina el gen M2 (M20RF2) (Collins y ertz, J. Virol . 54: 65-71, 1985; Collins y col., J. Gen. Virol. 71: 3015-3020, 1990; Collins y col., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 93: 81-85, 1996, cada una de ellas aquí incorporada como referencia) o redu-ce o elimina la expresión de M2 0RF2 para dar nuevos candidatos vacunales de RSV (véase la Solicitud de Patente Provisional EE.UU. N° 60/143.097, presentada por Collins y col. el 19 de Julio de 1999, aquí incorporada como referencia) . En aspectos preferidos, la expresión de M2 0RF2 es reducida o eliminada modificando el genoma o antigenoma de RSV quimérico para incorporar una mutación de cambio de marco o uno o más codones de parada en M2 0RF2, dando un clon vírico "knock out" . Alternativamente, se suprime M2 0RF2 en todo o en parte para hacer que la proteína M2-2 sea parcial o completamente no funcional o para destruir su expresión conjuntamente, con objeto de obtener un RSV quimé-rico "mutante de deleción" M2 0RF2. Alternativamente, el M2-2 ORF puede ser transpuesto en el genoma o antigenoma a una posición más proximal al promotor o más distal al promotor en comparación con la posición de orden génico natural del gen M2-2, para regular a más o regular a menos la expresión del M2-2 ORF. En realizaciones adicionales, el M2-2 ORF es incorporado en el genoma o antigenoma como un gen aparte que tiene un señal de iniciación génica y de finalización génica, cuya modificación da lugar a la regulación a más del M2-2 ORF. El RSV quimérico de la invención aún modificado para incorporar mutaciones en M2 ORF2 posee características fenotípicas altamente deseables para el desarrollo de vacunas. Las modificaciones anteriormente identificadas en el genoma o antigenoma quimérico especifican uno o más cambios fenotípicos deseados en el virus o partícula subvírica resultante . Se generan así candidatos vacunales que exhiben una o más características identificadas como (i) un cambio en la transcripción del ARNm, (ii) un cambio en el nivel de expresión de las proteínas víricas, (iii) un cambio en la replicación del ARN genómico o antigenómico, (iv) un cambio en las características del crecimiento del virus, (v) un cambio en el tamaño de la placa vírica y/o (vi) un cambio en la citopatogenicidad. En quimeras ejemplares de RSV que incorporan una deleción o mutación knock out de M2 0RF2, los cambios fenotípicos deseados incluyen atenuación del crecimiento vírico en comparación con el crecimiento de una cepa de RSV parental de tipo salvaje o imitante correspondiente. En aspectos más detallados, el crecimiento vírico en cultivo de células puede estar atenuado aproximadamente 10 veces o más, lo cual es atribuible a mutaciones en M2 ORF2. La ci-nética del crecimiento vírico muestra también estar modificada de una forma que resulta beneficiosa para el desarrollo de vacunas. También se incluyen en la invención RSV imitantes de deleción y knock out .de M2-ORF2 quiméricos que ex-hiben una cinética retardada de síntesis del ARNm vírico en comparación con la cinética de la síntesis de ARNm de cepas de RSV parental de tipo salvaje o mutantes correspondientes. A pesar de esta cinética de transcripción retardada, estos nuevos candidatos vacunales exhiben un aumento en la síntesis acumulativa de ARNm en comparación con el virus parental. Estos cambios fenotípicos se asocian típicamente con un aumento en la acumulación de proteína vírica en las células infectadas en comparación con la acumulación de proteína en células infectadas con cepas de RSV parentales de tipo salvaje u otras. Al mismo tiempo, la replicación del ARN vírico se reduce en el RSV quimérico M2 0RF2 en comparación con la de una cepa de RSV parental que tiene una función M2 0RF2 normal, mediante lo cual se reduce la acumulación de ARN genómico o antigenómico. En aspectos preferidos de la invención, los RSV quiméricos con deleción y knock out en M2 0RF2 son ingenie-rizados para expresar niveles no disminuidos o, más típica-mente, aumentados de antígeno(s) vírico (s), exhibiendo al mismo tiempo un fenotipo atenuado, el potencial inmunogéni-co es así preservado debido a la no disminuida o aumentada transcripción del ARNm y expresión antigénica, mientras que se consigue la atenuación a través de la incorporación del (de los) gen (es) o segmento (s) génico(s) heterólogo (s) y de reducciones concomitantes en la replicación del ARN y el crecimiento del virus atribuibles a la mutación de deleción y knock out M2-ORF2. Este nuevo grupo de rasgos fenotípicos es altamente deseado para el desarrollo de vacunas. Otros cambios fenotípicos útiles que se observan en los RSV quiméricos con deleción y knock out en M2 0RF2 incluyen un fenotipo de. placa grande y citopatogenicidad alterada en comparación con cepas de RSV parental de tipo salvaje o mutan-tes correspondientes . La invención proporciona también métodos para producir un RSV quimérico humano-bovino infeccioso a partir de uno o más polinucleótidos aislados, por ejemplo uno o más ADNc. Según la presente invención, se construye ADNc codificante de un genoma o antigenoma de RSV para la coexpresión intracelular o in vitro con las proteínas víricas necesarias para formar RSV infeccioso. Por "antigenoma de RSV" se quiere decir una molécula polinucleotídica aislada de sentido positivo que sirve como plantilla para la sínte-sis de la progenie del genoma de RSV. Preferiblemente, se construye un ADNc que es una versión de sentido positivo del genoma de RSV, correspondiente al ARN intermediario re-plicativo, o antigenoma, para minimizar la posibilidad de hibridarse con los transcriptos de sentido positivo de las secuencias complementarias que codifican para proteínas necesarias para generar una nucleocápside que se transcribe y se replica, es decir, secuencias que codifican para las proteínas N, P, L y M2 (0RF1) . En un sistema de minigenoma de RSV, el genoma y el antigenoma eran igualmente activos en el rescate, tanto si estaban complementados por RSV o por plásmidos, lo que indica que tanto el genoma como el antigenoma pueden ser usados y, por lo tanto, se puede hacer la elección en base a campos metodológicos u otros. Un genoma de RSV nativo consiste típicamente en una molécula polinucleotídica de sentido negativo que, a través de AR m víricos complementarios, codifica para once especies dé proteínas víricas, es decir, las especies no estructurales NS1 y NS2, N, P, matriz (M) , pequeña proteína hidrofóbica (SH) , glicoproteína (G) , fusión (F) , M2(0RF1), M2(ORF2) y L, substancialmente según se describe en Mink y col., Virology , 185: 615-624, 1991; Stec y col., Virology 183: 273-287, 1991, y Connors y col., Virol . 208: 478-484, 1995; Collins y col., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 93: 81-85, 1996, cada una de ellas aquí incorporada como referencia. Para los. fines de la presente invención, el genoma o antigenoma del RSV recombinante de la invención sólo necesita contener aquellos, genes o porciones de los mismos necesarios para hacer- que las partículas víricas o subvíricas codificadas por . ellos sean infecciosas. Además, los genes o sus porciones pueden ser provistos por más de una molécula polinucleotídica, es decir, que un gen puede ser provisto por complementacion o similar a partir de una molécula polinucleotídica por separado, o puede ser expresado directamente a partir del ADNc del genoma o antigenoma. Por RSV recombinante se quiere decir una partícula vírica o subvírica de RSV o de tipo RSV derivada dire-cta o indirectamente de un sistema de expresión recombinante o propagada a partir de partículas víricas o subvíricas producidas gracias al mismo. El sistema de expresión recom-binante empleará un vector de expresión recombinante que contiene una unidad transcripcional operablemente unida consistente en un montaje de al menos un elemento o elementos genéticos que tienen un papel regulador en la expresión génica de RSV, por ejemplo un promotor, una secuencia estructural o codificante que se transcribe en ARN de RSV, y secuencias apropiadas de iniciación y finalización de la transcripción. Para producir RSV infeccioso a partir de genoma o antigenoma expresado por ADNc, se coexpresa el genoma o antigenoma con aquellas proteínas de RSV necesarias para (i) producir una nucleocápside capaz de replicación del ARN y (ii) hacer que la progenie de nucleocápsides sea competente para la replicación y para la transcripción del ARN. La transcripción por la nucleocápside del genoma proporciona las otras proteínas de RSV e inicia una infección productiva. Alternativamente, las proteínas de RSV adicionales necesarias para una infección productiva pueden ser suministradas por coexpresion. Se puede construir un antigenoma de RSV para uso en la presente invención, por ejemplo, montando segmentos de ADNc clonados, que representan de forma conjunta el antigenoma completo, por reacción en cadena de polimerasa o similar (PCR; descrita en, por ejemplo, las Patentes EE.UU. N° 4.683.195 y 4.683.202, y PCR Protocole: A Guide to Met-hods and Applications, Innis y col., eds . , Academic Press, San Diego (1990) , aquí incorporadas como referencia) de copias inversamente transcritas de ARNm o ARN genómico de RSV. Por ejemplo, se montan ADN que contienen el extremo izquierdo del antigenoma, que se extienden desde un promotor apropiado (por ejemplo, el promotor de la ARN polimerasa T7) y la región líder complementaria al gen SH, en un vector de expresión apropiado, tal como un plásmido (por ejemplo, pBR322) o diversos vectores disponibles de cósmi-do, fago o vector de virus ADN. El vector puede ser modificado por mutagénesis y/o inserción de un poliligante sinté-tico que contiene sitios únicos de restricción diseñados para facilitar el montaje. Por ejemplo, el vector plasmídi-co aquí descrito derivaba de pBR322 por substitución del fragmento PstI-EcoRI con un ADN sintético que contenía sitios de enzimas de restricción convenientes. El uso de pBR322 como vector estabilizaba los nucleótidos 3716-3732 de la secuencia de RSV, que de otra forma mantenía delecio-nes o inserciones de nucleótidos, y la propagación del plásmido se hizo en la cepa bacteriana DH10B para evitar una duplicación e inserción artifacticias que se producirí-an si no en la vecindad del nt 4499. Para facilidad de preparación, los genes G, F y M2 pueden ser montados en un vector aparte, al igual que las secuencias L y remolcadora. El extremo derecho (por ejemplo, secuencias L y remolcadora) del plásmido antigenómico puede contener secuencias adicionales según se desee, tales como una ribozima flanqueante y finalizadores transcripcionales T7 en tándem. La ribozima puede ser de tipo cabeza de martillo (por ejemplo, Grosfeld y col. J. Virol. 69: 5677-5686, 1995, antes citado) , lo que daría un extremo 3' que contiene un solo nu-cleótido no vírico, o puede ser cualquiera de las otras ri-bozimas adecuadas, tales como la del virus de la hepatitis delta (Perrotta y col., Nature 350: 434-436, 1991), lo que daría un extremo 3' libre de nucleótidos no RSV. Se inserta un segmento medio (por ejemplo, una pieza G-a-M2) en un si-tio de restricción apropiado del plásmido líder-a-SH, que, a su vez, es el receptor para la pieza L-remolcador-ribozima-finalizador, dando un antigenoma completo. En un ejemplo ilustrativo aquí descrito, el extremo del líder fue construido para que quedara contiguo al promotor para la ARN polimerasa T7, que incluía tres residuos de G transcritos para una actividad óptima; la transcripción dona tres G no víricas al extremo 5' del antigenoma. Estos tres residuos no víricos de G pueden ser omitidos para obtener un extremo 5' libre de nucleótidos no víricos. Para generar un extremo 3' casi correcto, se construyó el extremo remolcador para que quedara adyacente a una ribozima en cabeza de martillo, que, tras escisión, donaría un solo residuo de U 3 ' -fosforilado al extremo 3' del ARN codificado. En determinadas realizaciones de la invención, se proporcionan secuencias complementantes que codifican para proteínas necesarias para generar una nucleocápside de RSV que se transcribe y replica por uno o más virus helper. Dichos virus helper pueden ser de tipo salvaje o mutantes . Preferiblemente, el virus helper puede distinguirse fenotí-picamente del virus codificado por el ADNc de RSV. Por ejemplo, es deseable disponer de anticuerpos monoclonales que reaccionen inmunológicamente con el virus helper, pero no con el virus codificado por el ADNc de RSV. Dichos anticuerpos pueden ser anticuerpos neutralizantes. En algunas realizaciones, los anticuerpos pueden ser usados para neutralizar el fondo de virus helper para facilitar la identi-ficación y recuperación del virus recombinante , o en cromatografía de afinidad para separar el virus helper del virus recombinante. Se pueden introducir mutaciones en el ADNc de RSV que hagan que el virus recombinante no sea reactivo o que sea resistente a la neutralización con dichos anticuer-pos. Se puede hacer una variedad de inserciones y deleciones nucleotídicas en el genoma o antigenoma del RSV quimérico humano-bovino para generar un clon apropiadamente atenuado, la longitud nucleotídica del genoma del RSV humano de tipo salvaje (15.222 nucleótidos) es un múltiplo de seis y los miembros de los géneros Paramyxovirus y Morbi-llivirus se atienen a una "regla de seis", es decir, que los genomas (o minigenomas) se replican eficientemente sólo cuando su longitud nucleotídica es un múltiplo de seis (lo que se piensa que es un requerimiento para el espaciamiento preciso de los residuos de nucleótidos en relación a la proteína NP encapsidante) . La alteración de la longitud del genoma de RSV por incrementos de un solo residuo no tenía efecto sobre la eficacia de la replicación y el análisis de secuencia de varios imitantes minigenómicos diferentes después del pase mostró que las diferencias de longitud se mantenían sin cambios compensatorios. Así, el RSV carece del estricto requerimiento de que la longitud del genoma sea un múltiplo de seis y se pueden hacer inserciones y de-leciones nucleotídicas en el genoma o antigenoma de RSV sin estorbar a la replicación del RSV recombinante de la pre-senté invención. Como medios alternativos para construir ADNc codificante de un genoma o antigenoma de RSV quimérico humano-bovino se incluye la transcripción inversa-PCR usando condiciones mejoradas de PCR (por ejemplo, según descri-ben Cheng y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91: 5695-5699, 1994; Samal y col., J. Virol . 70: 5075-5082, 1996, aquí incorporadas a modo de referencia) para reducir el número de componentes subunitarios de ADNc a tan sólo una o dos piezas. En otras realizaciones, se pueden usar promotores di-ferentes (por ejemplo, T3, SP6) o ribozimas diferentes (por ejemplo, la del virus de la hepatitis delta) . Se pueden usar vectores diferentes de ADN (por ejemplo, cósmidos) pa-ra la propagación, para acomodar mejor el genoma o antigenoma de mayor tamaño. Las proteínas N, P y L, necesarias para la re-plicación del ARN, requieren un factor de elongación de la ARN polimerasa, tal como la proteína M2 (ORF1) , para la transcripción del proceso. Así, se necesita M2 (ORF1) o un factor de elongación de la transcripción substancialmente equivalente para virus ARN de hebra negativa para la producción de RSV infeccioso y es un componente necesario de las nucleocápsides funcionales durante la infección productiva. La necesidad de la proteína M2 (ORF1) es consistente con su papel como factor de elongación de la transcripción. La necesidad de expresión de la proteína factor de elongación de la ARN polimerasa para virus ARN de hebra negativa es una característica de la presente invención. El M2 (ORF1) puede ser suministrado por expresión del gen M2 completo, ya sea por el genoma o antigenoma quimérico o por coexpresión con él, aunque, en esta forma, el segundo ORF puede ser también expresado y tener un efecto inhibitorio sobre la replicación del ARN. Por lo tanto, para la producción de virus infeccioso utilizando el gen M2 completo, las actividades de los dos ORF deberían estar equilibradas con objeto de permitir una expresión suficiente de M(ORFl) para obtener actividad de elongación de la transcripción, pero no tanto M(ORF2) como para inhibir la replicación del ARN. Alternativamente, la proteína 0RF1 es obtenida a partir de un ADNc ingenierizado para carecer de ORF2 o que codifica para un ORF2 defectivo. La eficacia de la producción de vi-rus puede también mejorar por coexpresión de genes de proteínas víricas adicionales, tales como los que codifican para los constituyentes de la envuelta (es decir, las pro-teínas SH, M, G, F) . Se pueden insertar polinucleótidos aislados (por ejemplo, ADNc) o expresados a partir del ADNc del an-tigenoma o genoma, codificantes del genoma o del antigenoma del RSV quimérico humano-bovino y, por separado, o en cis, o expresadas a partir del ADNc del antigenoma o genoma, las proteínas N, P, L y M2(0RF1), por transfeccion, electropo-ración, inserción mecánica, transducción o similar en células capaces de soportar una infección productiva con RSV, por ejemplo células HEp-2, FRhL-DBS2 , MRC-5 y Vero. La transfeccion de secuencias polinucleotídicas aisladas puede ser introducida en células cultivadas, por ejemplo, por transfeccion mediada por fosfato de calcio (Wigler y col., Cell 14: 725, 1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Gene-tics 7: 603, 1981; Graham y Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), electroporación (Neumann y col., EMBO J. 1: 841-845, 1982) , transfeccion mediada por DEAE-dextrano (Ausubel y col. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987), transfeccion mediada por lípidos catiónicos (Hawley-Nelson y col., Focus 15: 73-79, 1993) o un reactivo de transfeccion comercial, por ejemplo LipofectACE® (Life Technologies) (cada una de las anteriores referencias es aquí incorporada en su totalidad como referencia) . Las proteínas N, P, L y M2 (ORF1) son codificadas por uno o más ADNc y vectores de expresión que pueden ser iguales o distintos del que codifica para el genoma o antigenoma, y varias combinaciones de éstos. Se pueden incluir proteínas adicionales como se desee, codificadas por su propio vector o por un vector codificante de una proteína N, P, L o M2(0RF1) y/o del genoma o antigenoma completo. La expresión del genoma o antigenoma y de las proteínas de a partir de plásraidos transfectados puede conseguirse, por ejemplo, estando cada ADNc bajo el control de un promotor para la ARN polimerasa T7, el cual es a su vez suministrado por infección, transfección o transducción con un sistema de expresión para la ARN polimerasa T7, por ejemplo un re-combinante de la cepa MVA del virus de la vaccinia que expresa la ARN polimerasa T7 (Wyatt y col., Virology 210: 202-205, 1995, aquí incorporado como referencia) . Las proteínas víricas y/o la ARN polimerasa T7 pueden ser también proporcionadas por células de mamífero transformadas o por transfección de un ARNm o proteína preformados. Alternativamente, la síntesis de antigenoma o genoma puede ser llevada a cabo in vitro (libre de células) en una reacción combinada de transcripción-traducción, se-guido de transfección en células. O el ARN del antigenoma o del genoma puede ser sintetizado in vitro y transfectado en células que expresan proteínas de RSV. Para seleccionar virus vacunales quiméricos candidatos según la invención, los criterios de viabilidad, atenuación e inmunogenicidad son determinados según métodos bien conocidos. Los virus que serán los más deseados en las vacunas de la invención deben mantener la viabilidad, tener un fenotipo estable de atenuación, exhibir replicación en un hospedador inmunizado (aunque a niveles inferiores) y provocar de manera efectiva la producción de una respuesta inmune en un vacunado suficiente para conferir protección frente a la grave enfermedad causada por posterior infección con el virus de tipo salvaje. Claramente, los mutantes del virus RS hasta ahora conocidos y descritos no cumplen todos estos criterios.1 Ciertamente, contrariamente a las expectativas basadas en los resultados descritos para los RSV atenuados conocidos, los virus de la invención no sólo son viables y más apropiadamente atenuados que los mutantes previos, sino que son más estables genéticamente in vivo que los mutantes previamente estudiados -conservando la capacidad de estimular una respuesta inmune protectora y, en algunos casos, de expandir la protección conseguida por múltiples modificaciones, por ejemplo de inducir protección frente a diferentes cepas o subgrupos víricos, o protección por una base inmunologica diferente, por ejemplo inmunoglo-bulinas secretoras frente a séricas, inmunidad celular y similares. Con anterioridad a la invención, la inestabilidad genética del fenotipo ts después de la replicación in vivo ha sido común para los virus ts (Murphy y col . , In-fect. Immun. 37: 235-242, 1982). Para propagar un virus RSV quimérico humano-bovino para uso vacunal y otros fines, se puede usar una serie de líneas celulares que permiten el crecimiento de RSV. El RSV crece en una variedad de células humanas y animales. Como líneas celulares preferidas para propagar el virus RS atenuado para uso vacunal se incluyen células DBS-FRhL-2, MRC-5 y Vero. Los mayores rendimientos víricos son normalmente conseguidos con líneas de células epiteliales, tales como las células Vero. Las células son típicamente inoculadas con virus a una multiplicidad de infección que varía entre aproximadamente 0,001 y 1,0 ó más y son culti-vadas en condiciones permisivas para la replicación del virus, por ejemplo a aproximadamente 30-37°C y durante aproximadamente 3-5 días, o durante el tiempo necesario para que el virus alcance un título adecuado. El virus es retirado del cultivo celular y separado de los componentes celulares, típicamente por procedimientos de clarificación bien conocidos, por ejemplo centrifugación, y puede ser además purificado como se desee usando procedimientos bien conocidos para los expertos en la técnica. Los RSV quiméricos humanos-bovinos que han sido atenuados y de algún otro modo modificados según se describe aquí pueden ser estudiados en varios modelos bien cono-cidos y generalmente aceptados in vitro e in vivo para confirmar la adecuada atenuación, la resistencia a la reversión fenotípica y la inmunogenicidad para uso vacunal. En los ensayos in vitro, el virus modificado (por ejemplo, un RSV biológicamente derivado o recombinante múltiplemente atenuado) es estudiado en cuanto a sensibilidad a la temperatura de la replicación del virus, es decir, en cuanto al fenotipo ts, y en cuanto al fenotipo de placa pequeña. Los virus modificados son además estudiados en modelos animales de infección por RSV. Se . ha descrito una variedad de mode-los animales y se resumen en Meignier y col., eds . Animal odels of Respiratory Syncytial Virus Infection, Mérieux Foundation Publication, 1991, aquí incorporada como referencia. Se describe un modelo en ratas del algodón de infección por RSV en EE.UU. 4.800.078 y en Prince y col., Vi-rus Res . 3: 193-206, 1985, aquí incorporadas como referencia, y se considera predictivo de atenuación y eficacia en humanos y primates no humanos. Además, un modelo en primate de infección por RSV que utiliza chimpancés es predictivo de atenuación y eficacia en humanos, según se describe con detalle en Richardson y col., J. Med. Virol . 3: 91-100, 1978; Wright y col., Infect. Immun. 37: 397-400, 1982, y Crowe y col., Vaccine 11: 1395-1404, 1993, cada una de ellas aquí incorporada como referencia. Los sistemas modelo para RSV, incluyendo los roedores y los chimpancés, para evaluar la atenuación y la infectividad de los candidatos vacunales de RSV son ampliamente aceptados en la técnica y los datos obtenidos de ellos guardan una buena correlación con la infección por RSV y la atenuación. Los modelos en ratón y en rata del algodón son especialmente útiles en aquellos casos en los que los virus RSV candidatos exhiben un crecimiento inadecuado en chimpancés, por ejemplo en el caso de virus del subgrupo B de RSV. Según la anterior descripción, y en base a los ejemplos que se dan a continuación, la invención proporciona también composiciones de RSV quimérico humano-bovino in-feccioso aislado para uso vacunal. El virus quimérico atenuado que es un componente de una vacuna está en forma aislada y típicamente purificada. Por aislado se quiere hacer referencia a RSV que está en un ambiente diferente al nativo de un virus de tipo salvaje, tal como la nasofaringe de un individuo infectado. Más en general, aislado pretende incluir el virus atenuado como componente de un cultivo celular u otro medio artificial donde puede propagarse y caracterizarse en un marco controlado. Por ejemplo, se pueden producir RSV atenuados de la invención por un cultivo celu-lar infectado, separarlos del cultivo de células y añadirlos a un estabilizador. Las vacunas RSV de la invención contienen como componente activo una cantidad inmunogénicamente efectiva de RSV producido como aquí se describe. El RSV biológica-mente derivado o recombinante puede ser usado directamente en formulaciones vacunales o liofilizado. El virus liofili-zado será típicamente mantenido a aproximadamente 4°C. Cuando esté listo para su uso, el virus liofilizado es reconstituido en una solución estabilizante, por ejemplo so-lución salina, o que contenga SPG, Mg++ y HEPES, con o sin adyuvante, como se describirá a continuación. El virus biológicamente derivado o recombinantemente modificado puede ser introducido en un hospedador con un vehículo y/o adyuvante fisiológicamente aceptable. Los vehículos útiles son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina al 0,4%, glicina al 0,3%, ácido hialurónico y similares. Las soluciones acuosas resultantes pueden ser empaquetadas para uso tal cual o liofilizadas, siendo combinada la preparación liofilizada con una solución estéril antes de la administración, como se ha mencionado anteriormente. Las composiciones pueden contener subs-tancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiere para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tal como agentes de ajuste del pH y tampones, agentes para el ajuste de la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina y similares. Como adyuvantes aceptables se incluyen adyuvante incompleto de Freund, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio o alumbre, que son materiales bien conocidos en la técnica. Como adyuvantes preferidos se incluyen también Stimulon® QS-21 (Aguila Biopharmaceuticals, Inc., Farmingham, MA) , MPL® (monofosforil lípido A 3-0-desacilado: RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) e interleukina-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA) . Tras la inmunización con una composición de RSV quimérico humano-bovino según se describe aquí, a través de aerosol, gotitas, por vía oral, tópica u otra, el sistema inmune del hospedador responde a la vacuna produciendo anticuerpos específicos para una o más de las proteínas del virus RSV, por ejemplo las glicoproteínas F y/o G. Como resultado de la vacunación, el hospedador se vuelve al menos parcial o completamente inmune a la infección por RSV, o se hace resistente al desarrollo de una infección moderada o grave por RSV, particularmente en el tracto respiratorio inferior . Las vacunas de RSV quiméricos humanos-bovinos de la invención pueden contener virus quimérico atenuado que provoque una respuesta inmune frente a una sola cepa o subgrupo antigénico de RSV, por ejemplo A o B, o frente a múltiples cepas o subgrupos de RSV. En este contexto, el RSV quimérico puede provocar una respuesta inmune monoespe-cífica o una respuesta inmune poliespecífica frente a múltiples cepas o subgrupos de RSV. Alternativamente, se pueden combinar RSV quiméricos que tengan diferentes características inmunogénicas en una mezcla vacunal o administrarlos por separado en un protocolo de tratamiento coordinado para provocar una protección más efectiva contra una cepa de RSV o contra múltiples cepas o subgrupos de RSV. El hospedador al que se administran las vacunas puede ser cualquier mamífero que sea susceptible de infección por RSV o un virus estrechamente relacionado y que sea capaz de generar una respuesta inmune protectora a los an-tígenos del virus de vacunación. Por lo tanto, como hospe-dadores adecuados se incluyen humanos, primates no humanos, bóvidos, équidos, suidos, óvidos, cápridos, lagomorfos, roedores, etc. En consecuencia, la invención proporciona métodos para crear vacunas para una variedad de usos humanos y veterinarios . Las composiciones vacunales que contienen los RSV quiméricos humanos-bovinos atenuados de la invención son administradas a un hospedador susceptible o que de al-gún otro modo tiene riesgo de sufrir una infección por RSV en una "dosis inmunogénicamente efectiva", que es suficiente para inducir o aumentar las capacidades de respuesta in-muñe del individuo frente a RSV. En el caso de sujetos humanos, el virus atenuado de la invención es administrado según protocolos de vacunas de RSV humano bien establecidos, según se describe, por ejemplo, en Wright y col., In-fect. Immun. 37: 397-400, 1982; Kim y col., Pediatrics 52: 56-63, 1973, y Wright y col., J. Pediatr. 88: 931-936, 1976, aquí incorporadas como referencia. Resumiendo, se inocula a adultos o niños intranasalmente por medio de go-tículas con una dosis inmunogénicamente efectiva de vacuna de RSV, típicamente en un volumen de 0,5 mi de un diluyente o vehículo fisiológicamente aceptable. Esto tiene la ventaja de la simplicidad y seguridad en comparación con la inmunización parenteral con una vacuna no replicativa. También proporciona una estimulación directa de la inmunidad local del tracto respiratorio. Además, este modo de vacunación evita de manera efectiva los efectos inmunosupresores de los anticuerpos séricos maternos específicos para RSV, que típicamente se encuentran en los muy jóvenes. Además, mientras que la administración parenteral de antígenos RSV puede esta a veces asociada con complicaciones inmunopato-lógicas, esto no ha sido nunca observado con un virus vivo. En todos los sujetos, se determinará la cantidad precisa de vacuna de RSV quimérico humano-bovino administrada y el calendario y la repetición de la administra-ción en base al estado de salud y al peso del paciente, al modo de administración, a la naturaleza de la formulación, etc. Las dosificaciones variarán, en general, entre aproximadamente 103 y aproximadamente 106 PFU de virus por paciente. En cualquier caso, las formulaciones vacunales deben proporcionar una cantidad de RSV atenuado de la invención suficiente para estimular o inducir con efectividad una respuesta inmune anti-RSV, por ejemplo, según puede deter-minarse por fijación del complemento, neutralización de placas y/o ensayo inmunosorbente ligado a enzimas, entre otros métodos. En este sentido, también se monitoriza a los individuos en cuanto a signos y síntomas de enfermedad del tracto respiratorio superior. Como con la administración a chimpancés, el virus atenuado de la vacuna crece en la na-sofaringe de los vacunados a niveles de aproximadamente 10 veces o más menores que el virus de tipo salvaje, o aproximadamente 10 veces o más menores en comparación con los ni-veles del RSV incompletamente atenuado. En neonatos y lactantes, puede ser necesaria una administración múltiple para provocar niveles suficientes de inmunidad. La administración deben comenzar en el primer mes de vida y a intervalos a través de la niñez, tal como a los dos meses, seis meses, un año y dos años, según sea necesario para mantener niveles suficientes de protección frente a la infección por RSV nativo (de tipo salvaje) . De forma similar, los adultos que son particularmente susceptibles a la infección repetida o grave por RSV, tales como, por ejemplo, los trabajadores del área de los cuidados de la salud, los trabajadores de cuidados de día, los miembros de la familia de niños pequeños, las personas de edad o los individuos con función cardiopulmonar comprometida, pueden requerir múltiples inmunizaciones para esta-blecer y/o mantener respuestas inmunes protectoras. Los niveles de inmunidad inducida pueden ser monitorizados midiendo las cantidades de anticuerpos neutralizantes secretores y séricos y las dosificaciones pueden ser ajustadas o las vacunaciones repetidas según sea necesario para mante-ner los niveles deseados de protección. Además, pueden estar indicados diferentes virus vacunales para la administración a diferentes grupos receptores. Por ejemplo, una cepa de RSV quimérico ingenierizado que exprese una citoki-na o una proteína adicional rica en epitopos de células T puede ser particularmente ventajosa para adultos más que para lactantes. Las vacunas RSV producidas según la presen-te invención pueden ser combinadas con virus que expresen antígenos de otro subgrupo o cepa de RSV para conseguir protección frente a múltiples subgrupos o cepas de RSV. Alternativamente, el virus vacunal puede incorporar epitopos protectores de múltiples cepas o subgrupos de RSV ingeníerizados en un clon de RSV según se describe aquí. Típicamente, cuando se usan diferentes virus vacunales, éstos serán administrados en mezcla simultáneamente, pero pueden ser también administrados por separado. Por ejemplo, como las glicoproteínas F de los dos subgrupos de RSV difieren en sólo aproximadamente un 10% en la secuencia de aminoácidos, esta similitud es la base para una respuesta inmune protectora cruzada, tal como se observa en animales inmunizados con RSV o antígeno F e inoculados con una cepa heteróloga. Así, la inmunización con una cepa pue-de proteger contra diferentes cepas del mismo subgrupo o de uno diferente. Sin embargo, la protección óptima probablemente requerirá inmunización frente a ambos subgrupos. Las vacunas de RSV quimérico humano-bovino de la invención provocan la producción de una respuesta inmune que es protectora frente a una enfermedad grave del tracto respiratorio inferior, tal como pneumonía y bronquiolitis, cuando el individuo resulta a continuación infectado con RSV de tipo salvaje. Mientras que el virus que circula de manera natural es aún capaz de causar infección, particu-larmente en el tracto respiratorio superior, existe una posibilidad muy reducida de rinitis como resultado de la vacunación y posible refuerzo de la resistencia por posterior infección por el virus de tipo salvaje. Después de la vacunación, existen niveles detectables de anticuerpos séricos y secretores engendrados por el hospedador que son capaces de neutralizar virus homólogos (del mismo subgrupo) de tipo salvaje in vitro e in vivo. En muchos casos, los anticuerpos del hospedador neutralizarán también el virus de tipo salvaje de un subgrupo no vacunal diferente. Los candidatos preferidos a vacunas de RSV quiméricos humanos-bovinos de la invención exhiben una dismi-nución muy substancial de la virulencia en comparación con el virus de tipo salvaje que circula de forma natural en humanos. El virus está suficientemente atenuado, de tal forma que no aparecerán síntomas de infección en la mayoría de. los individuos inmunizados. En algunos casos, el virus atenuado puede ser aún capaz de diseminación a individuos no vacunados. Sin embargo, su virulencia está suficientemente abrogada, de forma que no se producen graves infecciones del tracto respiratorio inferior en el hospedador vacunado o incidental . El nivel de atenuación del virus RSV quimérico humano-bovino puede ser determinado, por ejemplo, cuantifi-cando la cantidad de virus presente en el tracto respiratorio de un hospedador inmunizado y comparando la cantidad con la producida por el RSV de tipo salvaje u otros RSV atenuados que hayan sido evaluados como cepas vacunales candidatas. Por ejemplo, el virus quimérico atenuado de la invención tendrá un mayor grado de restricción de la replicación en el tracto respiratorio superior de un hospedador altamente susceptible, tal como un chimpancé, en compara-ción con los niveles de replicación del virus de tipo salvaje, por ejemplo 10 a 1.000 veces menos. Además, el nivel de replicación de la cepa vacunal de RSV atenuada en el tracto respiratorio superior del chimpancé debe ser menor que el del mutante RSV A2 ts-1, que, según se demostró previamente, estaba incompletamente atenuado en lactantes humanos seronegativos . Con objeto de reducir aún más el de-sarrollo de rinorrea, que se asocia a la replicación del virus en el tracto respiratorio superior, un virus candidato a vacuna ideal debe exhibir un nivel restringido de replicación tanto en el tracto respiratorio superior como en el inferior. Sin embargo, los virus atenuados de la inven-ción deben ser suficientemente infecciosos e inmunogénicos en humanos para conferir protección en los individuos vacunados. Los métodos para determinar los niveles de virus RS en la nasofaringe de un hospedador infectado son bien conocidos en la literatura. Se obtienen especímenes por aspiráción o lavado de las secreciones nasofaríngeas y se cuanti-fica el virus en cultivo de tejidos o mediante otro procedimiento laboratorial . Véanse, por ejemplo, Belshe y col., J. Med. Virol. 1: 157-162, 1977; Friedewald y col. (J. Amer. Med. Assoc. 204: 690-694, 1968; Gharpure y col. (J^ Virol . 3: 414-421, 1969, y Wright y col., Arch. Qes. Virus-forsch. 41: 238-247, 1973, aquí incorporadas como referencia. El virus puede ser convenientemente medido en la naso-faringe de animales hospedadores, tales como chimpancés. En algunos casos puede ser deseable combinar las vacunas de RSV quiméricos humanos-bovinos de la invención con vacunas que induzcan respuestas protectoras a otros agentes, particularmente otros virus de la infancia. Por ejemplo, se puede administrar una vacuna de RSV quimérico de la presente invención simultáneamente con vacuna del virus de la parainfluenza, tal como describen Clements y col., J. Clin. Microbiol . 29: 1175-1182, 1991, aquí incorporada como referencia. En otro aspecto de la invención, el RSV quimérico puede ser empleado como vector para antí-genos protectores de otros patógenos del tracto respiratorio, tales como PIV, incorporando las secuencias codificantes de estos antígenos protectores en el genoma o antigeno-ma de RSV quimérico que se usa para producir RSV quimérico infeccioso, tal como se describe aquí. En aún otro aspecto de la invención, se emplea un RSV quimérico como vector para la terapia génica transitoria del tracto respiratorio. Según esta realización, el genoma o antigenoma de RSV quimérico incorpora una secuencia que es capaz de codificar para un producto génico de interés. El producto génico de interés está bajo el control del mismo promotor o de uno diferente del que controla la expresión de RSV. El RSV infeccioso producido por coexpre-sión del genoma o antigenoma de RSV recombinante con las proteínas N, P, L y M2 (0RF1) y que contiene una secuencia codificante del producto génico de interés, es administrado a un paciente. Esto puede implicar a un RSV recombinante que sea totalmente infeccioso (es decir, competente para infectar células cultivadas y producir progenie infecciosa) , o puede ser un RSV recombinante que, por ejemplo, carezca de uno o más de los genes de las glicoproteínas de superficie G, F y SH y se propague en células que proporcionan una o más de estas proteínas en trans por expresión estable o transitoria. En tal caso, el virus recombinante producido sería competente para una infección eficiente, pero sería altamente ineficaz en la producción de partículas infecciosas. La falta de glicoproteínas de la superficie celular expresadas reduciría también la eficiencia del sistema inmune del hospedador en la eliminación de las células infectadas. Estas características aumentarían la durabilidad y seguridad de expresión del gen extraño.
Con respecto a la terapia génica, la administración es típicamente por aerosol, nebulizador u otra aplicación tópica en el tracto respiratorio del paciente que esté siendo tratado. El RSV quimérico humano-bovino es administrado en una cantidad suficiente para obtener como resultado la expresión de niveles terapéuticos o profilácticos del producto génico deseado. Como ejemplos de productos génicos representativos que son administrados en este método se incluyen los que codifican, por ejemplo, los particularmente adecuados para la expresión transitoria de, por ejemplo, interleukina-2 , interleukina-4 , gamma-interferon, GM-CSF, G-CSF, eritropoyetina y otras citoki-nas, glucocerebrosidasa, fenilalanina hidroxilasa, regulador de la conductancia de transmembrana en la fibrosis quística ( "CFTR" ) , hipoxantina-guanina fosforribosil trans-ferasa, citotoxinas, genes supresores de tumores, ARN's antisentido y antígenos vacunales. Los siguientes ejemplos son aportados a modo de ilustración, no de limitación. EJEMPLO I Construcción de ADNc codificante de un antxgenoma quimérico BRSV/HRSV y recuperación de virus quimérico rBRSV/A2 infeccioso. Se puede recuperar rBRSV infeccioso de ADNc clonados codificantes de un ARN antigenómico vírico y de las proteínas de soporte N, P, M2-1 y L (Bucholz y col., J. Virol . 73: 251-259, 1999) usando una estrategia similar a la descrita para HRSV (Collins y col., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 92: 11563-11567, 1995; Bermingham y Collins, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96: 11259-11264, 1999; Bukreyev y col., J. Virol. 70: 6634-41, 1996; Bukreyev y col., J. Vi-rol . 71: 8973-8982, 1997; Whitehead y col., J. Virol. 72: 4467-4471, 1998; Whitehead y col., Virology 247: 232-239, 1998; Collins y col., Virology 259: 251-255, 1999; Bukreyev y col., Proc. Nat . Acad. Sci . USA 96: 2367-2372, 1999; Juhasz y col., Vaccine 17: 1416-1424, 1999; Juhasz y col., J. Virol. 73: 5176-5180, 1999; Teng y Collins, J. Virol . 73: 466-473, 1999; Whitehead y col., J. Virol. 73: 9773-9780, 1999; Whitehead y col., J. Virol. 73: 871-877, 1999; Whitehead y col., J. Virol. 73: 3438-3442, 1999, y Murphy y col., Patente Estadounidense N° 5.993.824, cada una de ellas aquí incorporada como referencia) . Sin embargo, la ARN polimerasa T7 fue suministrada a través del uso de una línea celular que expresa de manera estable esta enzima, más que por infección con un recombinante de virus de la vaccinia que exprese la enzima (Buchholz y col., J. Virol. 73 : 251-259, 1999) . Se diseña el ADNc para rBRSV para que codifique para el ARN antigenómico completo de rBRSV con extremos 3' y 5' auténticos sin nucleótidos terminales heterologos adicionales . Este ADNc codifica para rBRSV infeccioso con pro-piedades de crecimiento in vitro que son esencialmente indistinguibles de las de su parental biológico, la cepa ATue51908 (ídem) , que deriva, a su vez, de la cepa A51908 suministrada por la American Type Culture Collection. Para uso en la presente invención, se modificó el plásmido anterior por mutagénesis dirigida a sitio según procedimientos estándar (Kunkel y col., Methods Enzymol . 154: 367-382, 1987, aquí incorporada como referencia) como sigue: primeramente, se eliminó el sitio sintético único Notl en la región no codificante NS1 ( (Bucholz y col., Virol . 73: 251-9, 1999, aquí incorporada como referencia) para obtener la secuencia de tipo salvaje ATue51908 (N° Acceso GenBank AF 092942) . En segundo lugar, se introdujeron sitios de restricción marcadores sintéticos en las regiones intergénicas SH/G (Salí, ATue51908 nt 4.673), G/F (Sphl, ATue51908 nt 5.539) y F/M2 (Xhol, ATue51908 nt 7.471 y Clal, ATue51908 nt 7.485) (Fig. IB) . Se denominó al plásmi-do resultante pBRSV18 (el número de acceso del GenBank para el ADNc de BRSV en pBRSV18 es AF092942) . Este ADNc servía como parental para construir quimeras BRSV/HRSV. El rBRSV recuperado de este ADNc parental era esencialmente indistinguible del virus ATue51908 biológicamente derivado en términos de las características de crecimiento in vitro y se considera, por lo tanto, que exhibe un fenotipo de crecimiento de tipo salvaje. Los genes G y F (nt 4.674 a 7.551) de la versión recombinante previamente descrita de HRSV cepa A2 (So-licitud de Patente Provisional EE.UU. N° 60/007.083, presentada el 27 de Septiembre de 1995; Solicitud de Patente EE.UU. N° 08/720.132, presentada el 27 de Septiembre de 1996; Solicitud de Patente Provisional EE.UU. N° 60/021.773, presentada el 15 de Julio de 1996; Solicitud de Patente Provisional EE.UU. N° 60/046.141, presentada el 9 de mayo de 1997; Solicitud de Patente Provisional EE.UU. N° 60/047.634, presentada el 23 de Mayo de 1997; Patente EE.UU. N° 5.993.824, concedida el 30 de Noviembre de 1999; Publicación Internacional N° WO 98/02530; Collins y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92: 11563-11567, 1995, cada una de ellas aquí incorporada como referencia) fueron amplificados con cebadores oligonucleotídicos que introducían un sitio Salí inmediatamente aguas arriba del gen G y un sitio Xhol inmediatamente aguas abajo del gen F (Fig. IB) . Se clonó el producto de la PCR y se confirmó la secuencia del inserto en su totalidad. A continuación, se usaron estos sitios de restricción Salí y Xhol para transferir un frag-mentó de aproximadamente 2.885 pb que abarcabas los genes G y F de HRSV, incluyendo las señales de inicio de gen y de final de gen/poliadenilación, a pBRSV18, substituyendo los genes de BRSV respectivos. Se denominó al plásmido resul-tante, codificante de un antigenoma quimérico de BRSV con los genes de glicoproteínas derivados de HRSV A2, pBRSV/A2-10. La Fig. 1A representa una vista general esquemática de la organización del genoma de los virus recombinantes (rBRSV y rBRSV/A2) expresados a partir de pBRSV18 y pBRSV/A2-10. El antigenoma quimérico sintetizado a partir del plásmido tiene 15.227 nt de longitud, 87 nt más largo que el del rBRSV parental . Se recuperaron RSV recombinantes a partir del ADNc esencialmente como se ha descrito en alguna otra parte y en las referencias anteriormente incorporadas. Se trans-fectaron placas de 32 mm de células BSR T7/5 subconfluentes que expresaban de manera estable la ARN polimerasa T7 de fago con 5 µg de los plásmidos de longitud total respectivos (pBRSV18 ó pBRSV/A2-10) y un grupo de cuatro plásmidos de soporte (2,5 g pN, 2,5 µg pP, 0,5 g pL y 0,5 µg pM2) a partir de los cuales se expresaban las proteínas N, P, L y M2 de BRSV. Se clonaron todos los constructos de ADNc bajo el control de un promotor T7. Los plásmidos de expresión contenían una secuencia EMCV IRES, lo que permitía la tra-ducción independiente de cápside. Se hicieron las transfec-ciones usando el reactivo de transfección Superfect (Qia-gen, Valencia, California) . Dos horas después de la transfección, se eliminó el sobrenadante, se lavaron las células y se mantuvieron en medio esencial mínimo suplementado con un 3% de suero fetal de ternera ("FCS") . A los tres días de la transfección, se disgregaron las células en una razón de 1 a 3. Se recogieron las células y el sobrenadante 7 días después de la transfección. Se cubrieron las transfecciones por duplicado con metilcelulosa, se incubaron 5 días sin disgregación y se examinaron por tinción inmunoquímica. Esto mostró que pBRSV18 y pBRSV/A2-10 daban niveles similares de virus recuperado, aproximadamente 100 focos por placa de 32 mm. Mediante este criterio, el virus rBRSV/A2 exhibía esencialmente la misma viabilidad que el parental rBRSV. Para verificar las identidades de los virus recuperados, se recuperó el ARN vírico de las células infec-tadas y se analizó por transcripción inversa (WRT")-PCR. Las reacciones fueron llevadas a cabo con cebadores diseñados para copiar y amplificar las tres regiones del ARN ge-nómico que contenían los sitios de restricción marcadores mostrados en la Fig. IB, que distinguirían entre ATue51908, rBRSV y rBRSV/A2. Los cebadores usados para la RT eran de sentido antigenómico, complementarios a una región del gen M del BRSV (cepa ATue51908) (ATue51908 nt 3612 a 3635) , al gen G de BRSV (ATue51908 nt 5372 a 5392) o al gen G de HRSV A2 (HRSV A2 nt 5442-5463) y al gen F de BRSV (ATue51908 nt 7218 a 7240) o al gen F de HRSV A2 (A2 nt 7309 a 7329) . Se usó una alícuota del producto de la RT para la PCR, usando el cebador de primera hebra indicado anteriormente respectivo y los cebadores inversos, correspondientes a las secuencias genómicas, aguas debajo de las regiones intergéni-cas respectivas (ATue51908 nt 4886 a 4862 y HRSV A2 4878 a 4856, cebadores inversos aguas debajo de la región intergé-nica SH/G; ATue51908 nt 5964 a 5941 y HRSV A2 nt 6055 a 6033, cebadores inversos aguas debajo de la región intergé-nica G/F, y ATue51908 nt 7852 a 7832, cebador inverso aguas debajo de la región intergénica F/M2) . Tal como se muestra en las Fig. 2A y 2B, las reacciones de RT-PCR daban cada una un solo producto de ADNc, cuya movilidad electroforética en cada caso era consistente con las predicciones calculadas. No se detectaba ningún producto de PCR si se omitía la etapa de la RT, lo que demuestra que el producto derivaba de ARN, más que de ADN contaminante. Los productos de RT-PCR fueron sometidos a digestión con enzimas de restricción de diagnóstico (Salí, Stul, Sphl y Xhol) y analizados por electroforesis en un gel de agarosa. En todos los casos, se obtuvo el patrón de restricción esperado, lo que indica que cada virus con-tenía los marcadores de sitio de restricción esperados. Concretamente, el virus derivado biológicamente ATue51908 carecía de los cuatro sitios en la región examinada, ambos recombinantes contenían un único Solí localizado en la región intergénica SH/G y un solo sitio Xhol en la región F/M2, rBRSV contenía un solo sitio Sphl en la región intergénica G/F y rBRSV/A2 contenía un solo sitio Stul en esta última región intergénica. Además, los productos de RT-PCR fueron secuenciados usando un secuenciador automatizado (LI-COR, MWG) , lo cual confirmó las secuencias esperadas. Por lo tanto, el virus quimérico rBRSV/A2 tenía la estructura esperada y no hubo cambios de secuencia durante la recuperación. EJEMPLO II Análisis in vitro del virus quimérico recombixiante rBRSV/A2. Para preparar stocks de virus para posterior análisis, se infectaron monocapas de células bovinas MDBK con una multiplicidad de infección ("MOI") de 0,1 con rBRSV o rBRSV/A2. Tras 90 minutos de adsorción, se retiró el inó-culo y se mantuvieron las células en medio esencial mínimo suplementado con un 3% de suero bovino fetal ("FBS"). Cuando el efecto citopático ("CPE") era pronunciado, típicamen-te después de 4 a 7 días de incubación, se ajustó el medio a 100 mM de MgS04 y a 50 mM de HEPES (pH 7,5) para estabilizar el virus (Fernie y Gerin, Virology 106: 141-4, 1980, aquí incorporada como referencia) y se sometió a las célu-las y al medio a tres tandas de congelación rápida a -70°C y descongelación rápida para liberar el virus. Se eliminaron los restos celulares por centrifugación. Se propagó HRSV cepa Long biológicamente derivado en células HEp-2 de la misma forma. La cepa Long es muy similar a la cepa A2 con respecto al análisis de secuencia y a la reactividad con la mayoría de los anticuerpos monoclonales y sirve, por lo tanto, como un substituto de la cepa A2 en estos ensayos particulares (Johnson y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84: 5625-9, 1987; Johnson y Collins, J. Gen. Virol . 70: 1539-47, 1989; López y col., Virus Res. 10: 249-61, 1988, cada una de ellas aquí incorporada como referencia) . El pa-rental biológicamente derivado ATue51908 no fue analizado en paralelo, ya que sus propiedades de crecimiento in vi tro son substancialmente las mismas que las de su derivado re-combinante rBRSV, el cual fue, por lo tanto, utilizado como control de BRSV. Las titulaciones víricas fueron realizadas como se ha descrito previamente (Buchholz y col., J. Virol. 73: 251-9, 1999, incorporada como referencia). La expresión de la proteína G en células HEp-2 humanas por rBRSV, rBRSV/A2 y HRSV cepa Long fue examinada por inmunofluorescencia indirecta. Se infectaron células HEp-2 con una MOI de 0,1 y, a las 36 h de la infección, se fijaron con 80% acetona y se incubaron a 37 °C durante 30 minutos con anticuerpo monoclonal ("mAb") de ratón G66 di-rigido a G de BRSV (dilución 1:1000) (Furze y col., J . Gen . Virol . 75: 363-70, 1994; Langedijk y col., J. Virol. 71: 4055-61, 1997, cada una de ellas aquí incorporada como re-ferencia) o mAb 021/01G dirigido contra G de HRSV (dilución 1:40) (García-Barreno y col., J. Virol. 63: 925-32, 1989; Martínez y Melero, J. Gen. Virol. 79: 2215-20, 1998, cada una de ellas aquí incorporadas a modo de referencia) . Las células fueron teñidas con una IgG de cabra anti-ratón conjugada a isotiocianato de fluoresceína (Dianova, Hamburgo) y contrateñidas con Azul de Evans al 0,01%. Tal como se esperaba, el mAb específico para BRSV reaccionaba con rBRSV, pero no con rBRSV/A2 o HRSV (Tabla 1) . Por el contrario, el mAb específico de HRSV reaccionaba rBRSV/A2 y HRSV, pero no con rBRSV. Los patrones de reactividad de rBRSV y HRSV eran consistentes con sus especificidades bovinas y humanas, respectivamente, y el patrón de reactividad de rBRSV/A2 confirmó que expresaba una proteína G de origen humano más que de origen bovino. Por otra parte, el virus rBRSV/A2 quimérico inducía un efecto citopático en células HEp-2 más similar al de rBRSV que al de HRSV. Por ejemplo, en cultivos infectados con HRSV, prácticamente un 100% de las células mostraban inmu-nofluorescencia positiva, en comparación con un 20% de células infectadas con rBRSV y un 20-30% infectadas con rBRSV/A2. Además, el HRSV inducía un pronunciado CPE con formación de grandes sincitios, mientras que rBRSV y rBRSV/A2 causaba un reducido nivel de CPE y formación de sincitios más pequeños. Por lo tanto, la infectividad y el CPE del virus quimérico rBRSV/A2 en esta línea celular humana se asemejan más estrechamente a los de su parental rBRSV. Esto indica que la transferencia de las glicoproteí-nas de superficie G y F solas a rBRSV no confiere una total permisividad de HRSV para crecimiento en células humanas -lo que sugiere que genes HRSV adicionales ayudan a determinar las características de crecimiento en células HEp-2.
Tabla 1. Confirmación por reactividad con anticuerpos mono- clónales* de la presencia de las glicoproteínas F y G apropiadas en los virus recombinantes rBRSV/A2 y rBRSV/LongF. a Reactividad en ensayo de inmunofluorescencia indirecta y microscopía inmunoelectrónica . Se comparó el crecimiento multicíclico de rBRSV, rBRSV/A2 y HRSV cepa Long en células MDBK y HEp-2 (Fig. 3) . Se infectaron números iguales de células MDBK y células HEp-2 subconfluentes en placas de 24 pocilios con virus a una MOI de 0,1. Después de 90 minutos de adsorción, se retiró el inoculo y se lavaron las células dos veces con medio que contenía un 3% de FBS. A varios tiempos después de la infección, se recogieron los pocilios por duplicado, se ajustó el medio a 100 mM de MgS04 y a 50 mM de HEPES (pH 7,5) y se congelaron y descongelaron rápidamente las células y el medio tres veces. Se clarificó el medio por centrifugación y se tituló el virus. En células HEp-2, el HRSV producía aproximadamente 10 veces más virus que el rBRSV (Fig. 3, Panel A), mientras que, en células MDBK, la situación estaba invertida (Fig. 3, Panel B) . en células MDBK, HRSV alcanzó un título máximo a los 2 días, mientras que rBRSV continuaba creciendo y alcanzaba un máximo a los 4 a 5 días. Estos resultados son consistentes con la restricción parcial del crecimiento para HRSV en esta línea celular bovina. Es interesante el hecho de que el rBRSV/A2 qui-mérico se replicaba mejor que el rBRSV en aproximadamente 2 veces tanto en la línea celular humana como en la bovina y de que, en las células bovinas, su curva de crecimiento se asemejaba a la de rBRSV más que a la de HRSV. Estos resul-tados indican que las características de crecimiento del virus quimérico no son idénticas a cualquiera de los paren-tales, lo que es consistente con su naturaleza quimérica. La capacidad para replicarse eficazmente en este experimento de crecimiento multicíclico indica que las proteínas G y F de HRSV son funcionales en el fondo rBRSV. Lo que es más importante, estos resultados indican que el virus quimérico es totalmente competente en cuanto a crecimiento en dos líneas celulares, una de origen humano y una de origen bovino. Se empleó microscopía inmunoelectrónica para examinar viriones en cuanto a la presencia de proteína G de la especificidad apropiada. Se infectaron células MDBK con una MOI de 0,1 de rBRSV, rBRSV/A2 o HRSV., A las 72 horas de la infección, cuando el CPE era pronunciado, se fijó el material con glutaraldehído al 0,05% tamponado durante 15 min para estabilizar la estructura de los viriones. Se raspó la monocapa de la placa y, después de centrifugación a baja velocidad, se resuspendió la pella en una pequeña cantidad de tampón. Se hicieron flotar rejillas de cobre de 300 mallas revestidas con formvar y descargadas de brillo, estabilizadas con carbón, sobre gotas de suspensión celular. Se bloqueó la adsorción no específica de anticuerpos tratando las rejillas con gelatina de pescado en agua fría al 1% (Sigma, Deisenhofen, Alemania) en solución salina tamponada con fosfatos ("PBS") estándar que contenía un 1% de seroalbúmina bovina (PBS-BSA) . A continuación, las rejillas flotaron durante 45 min sobre gotas de anticuerpos mo-nocionales (2F, específico para HRSV y BRSV F; 44F, específico para HRSV F 021/lG, específico para HRSV G, y 66G, específico para BRSV G (García-Barreno y col., J. Virol. 63: 925-932, 1989; Martínez y col., J. Gen. Virol. 79: 2215-2220, 1998)), diluidos en PBS-BSA. Después de varios lavados en PBS-BSA, se detectaron los anticuerpos unidos con Fab de inmunoglobulina de cabra anti-ratón marcado con oro coloidal (10 nm) (GAF10, BioCell Int., Cardiff, Reino Unido) y se tiñeron negativamente con ácido fosfotúngstico ("PTA"), pH 6,0. Se examinaron las rejillas en usando un microscopio electrónico de transmisión 400 T (Philips, Países Bajos) . Este proceso deja intacta la estructura de los viriones y permite la detección de antígenos de la superficie externa. Los análisis de microscopio electrónico revelaron grandes cantidades de partículas filamentosas con un diámetro de 100 a 200 nm y de varias µp? de longitud en las preparaciones de rBRSV (Fig. 4, Panel A), rBRSV/A2 y HRSV cepa Long. La comparación del material después de sección ultrafina y después de fijación con glutardialdehído mostró que la forma de los viriones se mantenía después de la fijación con glutardialdehído. Las variaciones observadas en el diámetro de los viriones después de la fijación con glutardialdehído podrían ser debidas a deshidratación de las partículas durante el procedimiento de fijación (Fig. 4, Paneles A y B) . Más aún, la estructura antigénica y la reactividad de los anticuerpos monoclonales no estaban afectadas (Fig. 4, Panel A, inserto). Las preparaciones víricas fueron sometidas a microscopía inmunoelectrónica usando el grupo de anticuerpos dirigidos a las proteínas G y F de BRSV y HRSV (Tabla 1) , seguido de mareaje con inmunoglobulina de cabra anti-ratón conjugada a oro, y sometidas a tinción negativa. Usando un anticuerpo monoclonal dirigido a HRSV F (Fig. 5, Paneles B, D y F) , se podía observar un denso mareaje con inmunooro de la superficie de los viriones rBRSV/A2 (Fig. 5, Panel D) , comparable a la intensidad de mareaje de la superficie de los viriones HRSV (Fig. 5, Panel F) , mientras que no se detectó mareaje específico de los viriones rBRSV (Fig. 5, Panel B) . Se usó el anticuerpo 2F, que reaccionaba con la proteína F tanto de BRSV como de HRSV (Fig. 5, Pane-les A, C y E) , como control para demostrar la estructura antigénica intacta de todas las preparaciones víricas, incluyendo la preparación de BRSV. Esto confirmaba que el virus quimérico rBRSV/A2 y el virus control positivo HRSV contenían la proteína F de HRSV, mientras que el virus con-trol negativo rBRSV no, tal como se esperaba. Un anticuerpo monoclonal dirigido a la proteína G de HRSV reaccionaba con rBRSV/A2 (Fig. 6, Panel D) , así como partículas de HRSV (Fig. 6, Panel F) , y no consiguió reaccionar con la superficie del virión rBRSV (Fig. 6, Pa-nel B) . Al utilizar un anticuerpo dirigido a G de BRSV como control, sólo la superficie del virión rBRSV era marcada con inmunooro (Fig. 6, Panel A), pero no la superficie vi-riónica de los viriones quiméricos (rBRSV/A2, Fig. 6, Panel C) o de HRSV (Fig. 6, Panel E) . Estos resultados confirma-ban que el virus quimérico rBRSV/A2 y el virus control HRSV contenían la proteína G de HRSV y no la de BRSV, mientras que el virus control rBRSV contenía la proteína G de BRSV y no la de HRSV. Así, el virus quimérico rBRSV/A2 llevaba ciertamente las proteínas G y F de HRSV como glicoproteínas superficiales y éstas estaban presentes en cantidades comparables a las del virus biológicamente derivado. EJEMPLO III Construcción de ADNc codificante de un virus quimérico BRSV/HRSV que contiene una sola substitución genica que implica a un virus del subgrupo A de HRSV diferente. El virus quimérico rBRSV/A2 antes descrito con-llevaba la substitución simultánea de dos glicoproteínas superficiales, G y F. Era de interés determinar si se podría hacer un virus quimérico BRSV/HRSV en el que la substitución implicara a sólo una de las dos glicoproteínas y si se podría hacer la substitución con una cepa del subgru-po A diferente, a saber, la cepa Long. Se construyó un segundo ADNc de antigenoma de BRSV que contiene el gen F de la cepa Long de HRSV en lugar del gen F de BRSV (Fig. 7A y 7B) . Se hizo el ARN total a partir de células HEp-2 infectadas con HRSV cepa Long. A continuación, se llevó a cabo la RT-PCR usando los cebadores FLa (5'-AGGAATTCGCATGCGGGGCAAATAACAATGGAGTTGCCAATC-3 ' (SEC ID N° : 21) , nt 1 a 28 de la secuencia del gen F de HRSV cepa Long, que contenía un adaptador EcoRl/Sphl, subrayado) y FLRa (5 ' -AGGAATTCTCGAGTTTTTATATAACTATAAACTAGGAATCTAC-3 ' (SEC ID N° : 22), gen F de HRSV cepa Long nt 1903 a 1874, adaptador EcoRI/X oI subrayado) , obteniéndose un producto de PCR de 1.930 pb. Se usaron los adaptadores EcoRI para clonar el producto de PCR en pBluescript SK- (Stratagene, la Jolla, CA) . Se secuenció el producto de PCR y se cortó un fragmen-to de 1.906 pb con Sphl y Xhol y se transfirió a la ventana Sphl-X ol de pBRSV18, obteniéndose pBRSV/LongF-12. Éste codifica para un antigenoma de RSV quimérico de 15.114 nt. Se transfectó el plásmido pBRSV/LongF-12 en células BSR T7/5 que expresaban de forma estable ARN polime-rasa T7, según se ha descrito antes. Cinco días después de la transfección, se pudo observar un efecto citopático de redondeamiento de células típico de RSV en todas las placas transfectadas . Las tasas de recuperación de rBRSV, rBRSV/A2 y rBRSV/LongF eran comparablemente altas, dando típicamente aproximadamente 100 focos por placa de 32 mm. Se produjeron stocks víricos por dos pases de los sobrenadantes de las transfecciones en células MDBK. Para estudiar la identidad de BRSV recombinan-tes que contenían el gen F de la cepa Long de HRSV en lugar de la secuencia del gen F de BRSV, se hicieron dos RT-PCR (Fig. 8) . Se hizo una primera RT-PCR (Fig. 8, PCR1) usando un par de cebadores que se hibridaban con las secuencias del esqueleto de BRSV, aguas arriba y aguas abajo del gen F, obteniéndose productos de 2.187 nt para la cepa ATue51908 de BRSV y el rBRSV análogo recombinante y de 2.161 nt para rBRSV/LongF. Tal como se esperaba, no se ob-tuvo ningún producto de PCR del ARN de la cepa Long de HRSV usando el anterior par de cebadores de BRSV. Cuando se sometieron a análisis de restricción, los virus recombinan-tes, pero no la cepa ATue51908 de BRSV estándar, fueron escindidos por Sphl (bandas de 2.028 pb y 159 pb para rBRSV y de 2.002 pb y 159 pb para rBRSV/LongF), lo que confirma la presencia del sitio de restricción marcador Sphl sintético (pos. 5539 de rBRSV y rBRSV/LongF) . EcoRI corta en el sitio EcoRI natural del gen F de BRSV ATue51908 y de rBRSV (pos. 6233 del genoma) para obtener dos fragmentos de 1.334 nt y 853 nt, mientras que el fragmento que se originaba de rBRSV/LongF no era escindido por EcoRI, tal como se había predicho. Cuando se digirieron con PstI, los fragmentos que contenían el gen F de BRSV permanecían sin escindir, mientras que el producto de rBRSV/LongF era escindido en tres fragmentos de 1.351 pb, 586 pb y 224 pb, lo que confirma la presencia de dos sitios PstI naturales (pos. 63 y 649) contenidos en la secuencia del gen F de HRSV Long (nótese que la secuencia de Long está indicada con respecto al gen individual, ya que no se dispone de una secuencia genómica completa) . Se hizo una segunda RT-PCR (Fig. 8, PCR2) usando un par de cebadores que se hibridaban con el gen F de la cepa Long de HRSV, dando un producto de PCR de 1.903 pb para rBRSV/LongF y para el virus parental HRSV cepa Long. Tal como se esperaba, no se obtuvo ningún producto de rBRSV. La digestión con PstI y EcoRI dio los patrones esperados de escisión (no mostrados) . Además, los productos de RT-PCR fueron secuenciados usando un secuenciador automatizado (LI-COR, MWG) , que confirmó las secuencias esperadas. Así, el virus recombinante quimérico rBRSV/LongF tenía la estructura esperada y no hubo cambios de secuencias durante la recuperación y el pase. Se analizó el virus quimérico rBRSV/LongF por microscopía inmunoelectronica como se ha descrito antes para el virus rBRSV/A2. El análisis de rBRSV/LongF con el mAb G66, que es específico para la proteína G de BRSV, demostró una fuerte reactividad (Fig. 9, Panel A) , mientras que no se observó esto con el mAb 021/21G, específico para la proteína G de HRSV (Fig. 9, Panel B) . También hubo una fuerte reactividad de rBRSV/LongF con el mAb 44F, específico para HRSV F (Fig. 9, Panel D) , así como con el mAb 2F, que es específico para las proteínas F de HRSV y BRSV (Fig. 9, Pa-nel C) . Esto mostró que este virus quimérico contenía la proteína G del BRSV parental junto con la glicoproteína F heteróloga de la cepa Long de HRSV. EJEMPLO IV Crecimiento del virus quimérico rBRSV/A2 en chimpancés jó- venes seronegativos Se inoculó a chimpancés jóvenes, de los que se había determinado que eran seronegativos para HRSV, por vía intranasal e intratraqueal con una dosis de 107 pfu por mi de rBRSV o rBRSV/A2 en cada sitio (Tabla 2) . Cada virus fue administrado a dos chimpancés. Después de la inoculación del virus, se tomaron muestras de hisopos nasofaríngeos di-ariamente los días 1-10 y 12 y se tomaron muestras de lavado traqueal los días 2, 5, 6, 8 y 12. Se congelaron las muestras y se midieron los títulos de RSV más tarde por ensayo de placas en células HEp-2. Se estimó la cantidad de rinorrea, una medida de enfermedad del tracto respiratorio superior, diariamente y se le asignó una puntuación de 0-4 (0=nada, l=traza, 2=leve, 3=moderada, 4=grave) . Los resultados fueron co comparados con los controles de historial de los animales que habían recibido (i) 104 pfu de virus de tipo salvaje HRSV cepa A2 recombinante por sitio (Whitehead y col., J. Virol. 72: 4467-4471, 1998, aquí incorporada como referencia) o (ii) 105 pfu del candidato vacunal rA2cp28/404 cepa A2 vivo atenuado por sitio (Whitehead y col., J. Virol., 73: 3438-3442, 1999, aquí incorporada como referencia) , administrados por las mismas vías (Tabla 2) .
Tabla 2. Replicacion de rBRSV y rBRSV/A2 quimérico reconbinantea en el cracto respiratorio superior e inferior de chimpancés " Cada virus fue administrado a una dosis de 107 pfu/ml en un inóculo de 1,0 m por sitio intranasal e intratraquealmente. Las muestras de hisopos nasofaríngeos fueron recogidas los días 1-10 y 12 y las muestras de lavado traqueal fueron recogidas los días 2, 5, 6, 8 y 12.
El virus rA2cp248/404 fue evaluado en 4 chimpancés a una dosis de 105 pfu/ml (whitehead y col., J. Virol . 73: 3438-3442, 1999) . ° El virus rA2 (sitios rA2) fue evaluado en 4 chimpancés a una dosis de 10* pfu/ml (Whitehead y col., J ¦ Virol ¦ 72: 4467-4471, 199B) . d Los títulos pico medios se calculan usando el título pico de virus alcanzado en cada animal. Como los títulos pico de virus se al canzaron en días diferentes para cada animal, el título pico medio supera al título medio cualquier día dado.
El HRSV de tipo salvaje es altamente permisivo en chimpancés seronegativos y, en este ejercicio, se replicaba hasta títulos pico medios de más de 4,5 logiopfu por mi de muestra de hisopo nasal o de lavado traqueal (Tabla 2) . La puntuación del pico de rinorrea era 2,5. El candidato vacunal vivo atenuado rA2cp248/404 (véanse, por ejemplo, la Patente EE.UU. N° 5.993.824, concedida el 30 de Noviembre de 1999; la Publicación Internacional N° WO 98/02530; Collins y col., Proc . Nati. Acad. Sei. USA 92: 11563-11567, 1995; hitehead y col., Virology 247: 232-239, 1998, cada una de ellas aquí incorporada como referencia) se replicaba hasta títulos pico medios de 2,5 y 1,4 logi0pfu por mi de hisopo/lavado en el tracto respiratorio superior e inferior, respecti-vamente, y tenía una puntuación de pico de rinorrea de 0,8. Por el contrario, no había replicación detectable de rBRSV en el tracto respiratorio superior o inferior ni evidencia de enfermedad. Así, incluso cuando se administró a 100-1.000 veces la dosis de HRSV, rBRSV estaba al-tamente restringido en cuanto a la replicación en chimpancés. La quimera rBRSV/A2 exhibía replicación a lo largo de varios días tanto en el tracto respiratorio superior como en el inferior. El que no se detectara eliminación hasta el día 3 ó 5 indica que no se trataba de una prolongación de la inoculación, al igual que el tiempo a lo largo del el cual se recuperó el virus . Los títulos eran mucho más bajos que los observados para el HRSV de tipo salvaje y moderadamente más bajos que los observados para el candidato vacunal rA2cp248/404. Estos resultados indican que el virus quimérico está altamente atenuado. Así, la substitución de los genes de las glicoproteínas G y F de rBRSV con sus contrapartidas de HRSV, que transferían los determinantes antigénicos mayores, confiere un mejor crecimiento en chimpancés, mientras que otros genes de BRSV contribuyen a una fenotipo altamente atenuado.
Los animales que recibieron el virus rBRSV o rBRSV/A2 fueron inoculados el día 30 con 104 pfu por sitio de HRSV de tipo salvaje administrado intranasal e in-tratraquealmente (Tabla 3) . Se tomaron los hisopos naso-faríngeos y los lavados traqueales a los 3, 5, 7 y 10 días después de la inoculación y se estudió el virus eliminado por ensayo de placas. La inmunización previa con cualquiera de los virus redujo modestamente los síntomas de la enfermedad durante la inoculación. Aunque el virus quimérico exhibía un mejor crecimiento en chimpancés con respecto a BRSV debido a la incorporación de secuencias de RSV humano, la naturaleza altamente restringida de la replicación en el virus quimérico indica que la sintonización precisa de este candidato vacunal implicará la re-ducción de la atenuación para primates.
Replicacidn del virus inoculado wtRSV ?2 en chimpancés previamente inoculados con rBRSV o con rBRSV/A2* 5 * Cada chimpancé fue inoculado el día 30 con wtRSV A2 administrado intranasal e intratraquealmente a una dosis de 104 pfu/ml en un inóculo de 1,0 mi por sitio, las muestras de hisopos nasofaríngeos y las muestras de lavados traqueales fueron recogidas los días indicados .
EJEMPLO V Construcción de un BRSV/HRSV quimérico que contiene los genes G y F de HRSV en una posición alterada proximal al promotor El presente ejemplo describe la construcción de una quimera rBRSV/HRSV infecciosa en la que los genes G y F de HRSV están substituidos en un fondo de RSV bovino recom-binante (rBRSV) . La quimera humana-bovina resultante contiene dos genes de HRSV, a saber, G y F, y ocho genes de BRSV, a saber, NS1, NS2, N, P, M, SH, M2 y L. Además de esta construcción básica de glicoproteína substituida, los genes G y F de HRSV fueron también cambiados a una posición más proximal al promotor en el esqueleto de rBRSV, es decir, en relación a una posición de orden génico de tipo salvaje de los genes F y G en el genoma de RSV. Más concretamente, se movieron los genes F y G desde su localización habitual en relación al promotor, a saber, las posiciones génicas 7 y 8, respectivamente, a las posiciones 1 y 2, respectivamente . Se produjo rBRSV infeccioso completo como antes, en donde se hicieron substituciones nucleotídicas para crear sitios únicos Notl, Salí y Xhol en las posiciones 67, 4.673 y 7.471, respectivamente (Fig. 10A) (Bucholz y col., J. Virol. 73: 251-259, 1999; Buchholz y col., J. Virol. 74: 1187-1199, 2000, aquí incorporadas como referencia) . El sitio iVotl está contenido en la región no traducida aguas arriba del gen NS1 de BRSV y los sitios Salí y Xhol están en regiones intergénicas . La digestión del ADNc antigenómi-co de rBRSV con Salí y Xhol cortaba los genes G y F de BRSV en su totalidad y creaba extremos cohesivos compatibles, que fueron ligados. Esto dio lugar a un ADNc antigenómico de rBRSV que carecía de los genes G y F y que contenía una región intergénica SH-M2 de 64 nucleotidos con la siguiente secuencia: TTAAAC-TTAAAAATGGTTTATGtcgaGGAATAAAATCGATTAACAACCAATCATTCAAAAAGAT (SEC ID N° : 23) (los extremos cohesivos tetranucleotídicos de los sitios originales escindidos Salí y Xhol están en letras minúsculas) . Con fines comparativos, la secuencia intergénica F-M2 de BRSV natural tiene 55 nucleótidos de longitud. Se preparó un ADNc que contenía los genes G y F de HRSV por PCR con cebadores mutagénicos usados para modificar los extremos de ADNc. Concretamente, se usó la PCR para amplificar los nucleótidos 4692-7551 del ADNc antige-nómico de HRSV completo (que se extendía desde el ATG del ORF G hasta el extremo de la señal de finalización de gen de F) y se diseñaron los cebadores para añadir, inmediatamente después de la señal de finalización del gen F, los primeros 6 nucleótidos de la F-M2 IG, seguidos de una copia de la señal de iniciación de gen de NSl . Los cebadores de PCR fueron también diseñados para añadir un sitio BlpI y un sitio Notl, cada uno a ambos extremos del ADNc. Se confirmó la secuencia del fragmento de ADNc sometido a PCR por se-cuenciación de didesoxinucleótidos . Se insertó entonces este ADNc como fragmento Notl en el sitio único Wotl del ADNc antigenómico de rBRSV que carecía de los genes G y F según se ha descrito anteriormente. Se identificó un recombinante correcto por mapeo de fragmentos de restricción y se le designó como rBRSV/A2-Gl F2. En la Fig. 10C, se muestra la estructura del ARN genómico codificado. Tal como se muestra, en este ADNc se movieron los genes G y F de las posi-ciones 7 y 8 en relación al promotor a las posiciones 1 y 2. Se transfectó un plásmido codificante del ARN antigenómico de rBRSV/A2-Gl F2 , junto con dos plásmidos codificantes de las proteínas de soporte N, P, M2-1 y L, en células BSR T7/5, las cuales expresan de manera estable la ARN polimerasa T7, según se ha descrito antes (véanse tam-bién Bucholz y col., J. Virol . 73: 251-259, 1999; Buchholz y col., J. Virol. 74: 1187-1199, 2000, aquí incorporadas como referencia) , y se recuperó virus infeccioso. Se comparó el virus rBRSV/A2 -G1F2 recuperado con rBRSV, rHRSV (también denominado rA2) y rBRSV/A2 con respecto a la eficacia del crecimiento multicíclico en células HEp-2 humanas y en células MDBK bovinas . Según se ha descrito antes (véase también Buchholz y col., J. Virol. 74: 1187-1199, 2000, aquí incorporadas como referencia) , rHRSV crece mucho más eficientemente que rBRSV en células HEp-2 y el virus rBRSV/A2 crece con una eficiencia intermedia entre la de cada parental . Tal como se muestra en la Fig. 11, la eficacia de replicación de rBRSV/A2 -G1F2 era indistinguible de la de rBRSV/A2. Así, de manera inesperada, el cambio en la localización de los genes G y F no reducía la eficacia del crecimiento in vitro, cuyo novedoso resultado permite la producción eficiente de virus vacunal RSV. Se llevó a cabo una inmunofluorescencia en células HEp-2 infectadas con HRSV t o con los virus quiméricos rBRSV/A2 o rBRSV/A2-GlF2. Se hizo esto usando dos anti-cuerpos monoclonales específicos para las proteínas G o F de HRSV, a saber, 021/01G y 44F, respectivamente (López y col., J. Virol. 72: 6922-6928, 1998; Melero y col., J. Gen. Virol . 78: 2411-2418, 1997, aquí incorporadas como referencia) . Se hizo la tinción con cada anticuerpo monoclonal in-dividualmente . Aunque este ensayo es sólo semicuantitativo, se ha determinado previamente que el ensayo distingue con flabilidad entre rBRSV wt y rBRSV/A2 (llevando este último los genes G y F de HRSV en la localización normal del geno-ma en el esqueleto de rBRSV) . Concretamente, HRSV t da un patrón extenso muy potente de inmunofluorescencia indicativo de una eficaz y extensa expresión antigénica, mientras que rBRSV/A2 da un patrón menos extenso, más difuso y más débil (Buchholz y col., J. Virol . 74: 1187-1199, 2000, aquí incorporada como referencia) . Un ensayo comparable realizado para rBRSV/A2-GlF2 (Fig. 12) muestra que el patrón de inmunofluorescencia para este virus quimérico alterado con respecto al promotor era muy similar al de HRSV wt . Este resultado es consistente con una mayor expresión de las glicoproteínas G y F. Al mismo tiempo, el efecto citopático asociado a rBRSV/A2-GlF2 estaba reducido en comparación con HRSV wt y se parece más estrechamente al de rBRSV/A2 , según se ha descrito previamente (Buchholz y col., J. Virol. 74: 1187-1199, 2000, aquí incorporada como referencia). Específicamente, rBRSV/A2 y rBRSV/A2-GlF2 inducían menos sinci-tios y más pequeños . Por lo tanto, el presente ejemplo documenta la modificación del virus rBRSV/A2, que contiene los genes para los antígenos protectores mayores de HRSV, las proteínas G y F, en el fondo de BRSV, que está fuertemente atenuado en cuanto a replicacion en el tracto respiratorio de primates. Tal como se muestra en el ejemplo precedente, el virus rBRSV/A2 tiene una fuerte restricción en el rango de hospe-dadores que lo hace altamente atenuado en primates . Dado que el presente virus rBRSV/A2-GlF2 lleva la misma constelación de genes de BRSV en su fondo genético, es probable que comparta este fenotipo de fuerte restricción en el ran-go de hospedadores, aumentando así la expresión de los dos antígenos protectores mayores. Se espera además que la mayor expresión de estos dos antígenos protectores in vivo aumenta la inmunogenicidad de este virus. Por lo tanto, el presente ejemplo modificaba y mejoraba el virus rBRSV/A2 moviendo los genes de HRSV a una localización proximal al promotor. Un cambio posicional de esta magnitud, es decir, donde los genes G y F son movidos desde las posiciones de tipo salvaje 7 y 8 en relación al promotor hasta las nuevas posiciones 1 y 2, no ha sido descrito previamente.
EJEMPLO VI Construcción de un BRSV/HRSV quimérico con proteínas M, G y F asociadas a la envuelta derivadas de HRSV El presente ejemplo demuestra aún otro RSV qui-mérico humano-bovino que incluye la modificación de un virus quimera antigénico que se parece a la quimera rBRSV/A2 (que tiene los genes de los antígenos protectores G y F de HRSV en un fondo atenuado en cuanto a rango de hospedador de BRSV) , antes descrita. Tanto BRSV como HRSV tienen 4 proteínas asociadas a la envuelta: las glicoproteínas G y F, que son los antígenos protectores mayores; la pequeña proteína hidrofóbica SH de función desconocida, que no parece ser un antígeno neutralizante o protector para HRSV (Whitehead y col., J. Virol . 73: 871-877, 1999 Whitehead y col., J. Virol. 73: 3438-3442, 1999; Connors y col., J. Vi-rol . 65: 1634-1637, 1991, aquí incorporadas como referencia) y la proteína M de la matriz interna no glicosilada, que no es un antígeno protector, pero es importante en el montaje de loso viriones (Teng y Collins, J. Virol. 72: 5707-16, 1998, aquí incorporada como referencia). En este ejemplo, se construyó un virus quimérico BRSV/HRSV en el que los cuatro genes de las proteínas asociadas a la envuelta de BRSV habían sido suprimidos, a saber, M, SH, G y F de BRSV, y en donde tres genes de proteínas asociadas a la envuelta de HRSV, a saber, M, G y F, fueron insertados en su lugar. Aunque el gen SH de HRSV no fue incluido en este recombinante particular, el constructo descrito en este ejemplo está diseñado de forma que SH pueda ser fácilmente añadido en su posición normal del genoma o en otras posiciones. El constructo rBRSV/A2 previamente descrito (Buchholz y col., J. Virol. 74: 1187-1199, 2000, aquí in-corporada como referencia) fue modificado para contener un sitio único Afluí en la posición 3204, dentro de la región intergénica entre los genes P y M (Fig. 13, Panel A; P-M IG) . Esto implicaba la introducción de 5 substituciones nu-cleotídicas. Los números de posición de la secuencia nu-cleotídica son relativos al antigenoma de rBRSV completo (Buchholz y col., J. Virol . 73: 251-259, 1999; Buchholz y col., J. Virol . 74: 1187-1199, 2000; número de acceso Gen-Bank AF092942, o antigenoma de rHRSV completo en Collins y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92: 11563-11567, 1995, cada una de ellas aquí incorporada como referencia) y los números de posición de secuencia que se refieren a la secuencia de HRSV están subrayados. Se cortó el fragmento Afluí -Sall y se substituyó por el fragmento o Mlul-Sall que lle-vaba el gen M. Haciendo referencia a la Fig. 13, Panel B, se amplificó un ADNc que contenía el gen M de HRSV y se modificó por PCR usando cebadores que introducían cambios en los extremos de los ADNc. Concretamente, se modificó el ADNc de M para que su extremo de aguas arriba contuviera un sitio Afluí, seguido del último nucleótido de la región intergénica P-M (que es la misma en HRSV y BRSV) , seguido del gen M de HRSV completo, seguido de los 4 primeros nucleóti-dos de la región intergénica SH-G de BRSV, seguido de un sitio Salí. La secuencia de este ADNc fue confirmada como correcta en su totalidad. Se digirió con luI y Salí y se clonó en la ventaja Mlul-Sall del antigenoma de rBRSV. Esto dio lugar a rBSRV/A2 -MGF . Tal como se muestra en la Fig. 13, Panel C, esta quimera contenía un esqueleto de seis ge-nes de BRSV, a saber, NSA, NS2, N, P, M2 y L, y tres genes de proteínas asociadas a la envuelta de HRSV, a saber, M, G y F.
Se transíectó este plásmido antigenómico, junto con plásmidos codificantes de las proteínas de soporte N, P, M2-1 y L, en células BSR T7/5, que expresan de manera estable la ARN polimerasa T7, según se ha descrito con de-talle previamente (Bucholz y col., J. Virol . 73: 251-259, 1999; Buchholz y col., J. Virol. 74: 1187-1199, 2000, aquí incorporadas como referencia) , y se recuperó virus infeccioso. Los ejemplos anteriores muestran nuevas compo-siciones y métodos para producir RSV quiméricos humanos-bovinos que tienen características adecuadas de crecimiento, atenuación e inmunogenicidad y capacidad para evocar una respuesta inmune protectora específica o multiespecífi-ca en hospedadores susceptibles. En aspectos más detalládos, los ejemplos anteriores demuestran dos extremos con respecto a la atenuación de RSV quiméricos humanos-bovinos portadores de los determinantes antigénicos mayores de RSV, las proteínas G y F. en un extremo, está el HRSV wt, que crece de un modo permisivo en humanos y chimpancés y es vi-rulento. En el otro extremo está rBRSV/A2 , que también lleva los determinantes antigénicos G y F de HRSV. Este nuevo virus quimérico fue construido según los métodos de la invención y se muestra que son viables, seguros y altamente atenuados en chimpancés. La diferencia entre HRSV wt y rBRSV/A2 viene determinada por 9 genes. Según las enseñanzas que aquí se dan, la substitución por etapas de genes BRSV con genes HRSV, por ejemplo en un esqueleto de rBRSV/A2, dará virus vacunales candidatos con niveles variables de atenuación. Un aspecto crítico de la invención es que los determinantes antigénicos mayores de HRSV han mostrado dar cepas viables para el desarrollo de vacunas. La estrecha correspondencia entre los genomas de HRSV y BRSV y la intercambiabilidad de las señales de transcripción, según se demuestra en estos ejemplos, simplifican los intercambios génicos para poner en práctica aspectos adicionales de la invención y desarro-llar cepas vacunales que tengan niveles deseados de atenuación. Para simplificar estos métodos, se pueden hacer los intercambios con pares de genes de cada vez. Tal como se indica mediante los ejemplos aquí facilitados, se pueden seleccionar genes para ser substi-tuidos en los RSV quiméricos humanos-bovinos que tengan probabilidad de interaccionar funcional o estructuralmente en base al conocimiento disponible de la estructura/función de RSV. Estos intercambios y otras modificaciones en los RSV quiméricos humanos-bovinos se simplifican aún más por el hecho de que las proteínas que interaccionan están yuxtapuestas en el genoma, por ejemplo las proteínas de la nu-cleocápside N y P, las proteínas de la envuelta M, SH, F y G y los componentes M2-1, M2-2 y L polimerasa. Así, se pueden conseguir cepas vacunales candidatas adicionales según la invención, por ejemplo, incorporando dos o más genes yuxtapuestos, por ejemplo seleccionados entre N y P, dos o más de los genes de la envuelta M, SH, F y G o dos o más de los genes M2-1, M2÷2 y L, junto con un inserto o unidad de substitución heteróloga en un genoma o antigenoma receptor o de fondo. Por ejemplo, se pueden substituir los genes M y SH juntos en rBRSV/A2 con sus contrapartidas de HRSV. Esto dará lugar a un virus en el que las proteínas de la envuelta vírica (G, F, SH y M) son todas de HRSV, mientras que las proteínas internas son de BRSV. Esto puede ir seguido, según sea necesario, de substitución de genes de BRSV adicionales con sus contrapartidas humanas, por ejemplo N y P como otro par, NS1 y NS2 como otro y M2-1, M2-2 y L como otro grupo. La yuxtaposición de cada par de genes simplificará las substituciones. Al mismo tiempo, la aproximación inversa de inserción de genes de BRSV individuales en HRSV, dejando sin alterar los determinantes antigénicos G y F de HRSV, también dará candidatos vacunales deseados dentro de la invención. Por ejemplo, se pueden substituir individualmente uno o más de los genes N, P, M2-1 y M de un RSV humano por sus contrapartidas bovinas. Los virus recombinantes recuperados son entonces evaluados en cuanto al fenotipo de atenuación en cultivo de tejidos, en roedores y en primates no humanos, según se ejemplifica aquí. De esta forma, la invención permite la identificación de los virus vacunales RSV quiméricos humanos-bovinos candidatos que tienen niveles deseados de atenuación y eficacia protectora para el tratamiento y la profilaxis de RSV en diversos sujetos. Información sobre el depósito de microorganismos Los siguientes materiales han sido depositados en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, bajo las condiciones del Tratado de Budapest y se les ha dado la siguiente designación: Plásmido N° de Acceso Fecha de depósito cpts RSV 248 ATCC VR 2450 22 de Marzo de 1994 cpts RSV 248/404 ATCC VR 2454 22 de Marzo de 1994 cpts RSV 248/955 ATCC CR 2453 22 de Marzo de 1994 cpts RSV 530 ATCC VR 2452 22 de Marzo de 1994 cpts RSV 530/1009 ATCC VR 2451 22 de Marzo de 1994 cpts RSV 530/1030 ATCC VR 2455 22 de Marzo de 1994 RSV B-l cp52/2B5 ATCC VR 2542 26 Septiembre 1996 RSV B-l cp-23 ATCC VR 2579 15 de Julio de 1997 p3/7 (131) ATCC 97990 18 de Abril de 1997 p3/7(131)2G ATCC 97989 18 de Abril de 1997 p218(131) ATCC 97991 18 de Abril de 1997 LISTA DE SECUENCIAS <110> EL GOBIERNO DE LOS ESTADOS UNIDOS DE AMERICA, como Buchholz, Ursula Collins, Peter L. Murphy, Brian R. W itehead, Step en S. Krempl, Christine D. <120> PRODUCCIÓN DE VACUNAS QUIMÉRICAS HUMANAS-BOVINAS ATENUADAS DEL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO <130> 1528O-398100PC <140> <141> <150> 60/143.132 <151> 09-07-1999 <160> 23 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 79 <212> ADN <213> Virus sincitial respiratorio bovino 1 agttatttaa aattaaactt aaaaatggtt tatggttaca tacagatgtt ggggcaaata 60 caagtatgtc caaccatacc <210> 2 <211> 80 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: SV bovino sintético <430> 2 agttatttaa aattaaactt aaaaatggtt tatgtcgaca tacagatgtt ggggcaaata 60 caagtatgtc caaccatacc .80 <210 3 <211> 70 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: RSV humano y bovino sintético <400> 3 agttatttaa aattaaactt aaaaatggtt tatgtcgact ggggcaaatg caaacatgtc 60 caaaaacaag 70 <210> 4 <211> 87 <212 ADN <213> Virus sincitial respiratorio humano <400> 4 agttaattaa aaatagtcat aacaatgaac taggatatca agactaacaa taacattggg 60 gcaaatgcaa acatgtccaa aaacaag 87 <210> 5 <211> 62 <212> ADN <213> Virus sincitial respiratorio bovino <400> 5 agttatttaa aaagatatgt ataattcact aattaaaact ggggcaaata aggatggcga 60 ca 62 <210> 6 <211> 62 <212> ANA <213> Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: RSV bovino sintético <400> 6 agttatttaa aaagatatgc atgcttcact aattaaaact ggggcaaata aggatggcga 60 ca 62 <210> 7 <211> 87 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: RSV humano y bovino sintético <400> 7 agttacttaa aaacatatta tcacaaaagg ccttgaccaa cttaaacaga atcaaaataa 60 actctggggc aaataacaat ggagttg 87 <210> 8 <211> 87 <212> ADN <213> Virus sincitial respiratorio humano <400> 8 agttacttaa aaacatatta tcacaaaaag ccatgaccaa cttaaacaga atcaaaataa 60 actctggggc aaataacaat ggagttg 87 <210> 9 <211> 86 <212> ADN <213> Virus sincitial respiratorio bovino <400> 9 ccatgttgat agttatataa aaatattata ttagtctcaa agaataaaat tatttaacaa 60 ccaatcattc aaaaagatgg ggcaaat 87 <210> 10 <211> 87 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: RSV bovino sintético <420> 10 ccatgttgat agttatataa aaatattata ttagtctcga ggaataaaat cgattaacaa 60 ccaatcattc aaaaagatgg ggcaaat 87 <211> <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: RSV humano y bovino sintético <400> 11 cctagtttat agttatataa aactcgagga ataaaatcga ttaacaacca atcattcaaa 60 aagatggggc aaat 74 <210> 12 <211> 77 <212> ADN <213> Virus sincitial respiratorio humano <400> 12 cctagtttat agttatataa aacacaattg aatgccagat taacttacca tctgtaaaaa 60 tgaaaactgg ggcaaat 77 <210> 13 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: RSV humano y bovino sintético <400> 13 agttatttaa aaagatatgc atgcggggca aataacaatg gagttg 46 <210> 14 <211> 55 <212> ADN <213> Secuencia artificial <222> Descripción de la secuencia artificial: virus sincitial respiratorio sintético <403> 14 ggggcaaata caagttaatt cgcggccgcc ccctctcttc tttctacaga aaatg 55 <210> 15 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial : Virus sincitial respiratorio sintético <400> 15 gcggccgcta aatttaactc ccttgcttag cgatg 35 <210> 16 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Virus sincitial respiratorio sintético <400> 16 cacaatgggg caaataagct tagcggccg 29 <210> 17 <211 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Virus sincitial respiratorio sintético <400> 17 agttagtaaa aataaagacg cgtt 24 <210> 18 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Virus sincitial respiratorio sintético <400> 18 ttatgtcgac tggggcaaat gcaaacatg 29 <210> 19 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: Virus sincitial respiratorio sintético <400> 19 ggggcaaata acaatggagt tgccaatc 28 <210> 20 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Virus sincitial respiratorio sintético <400> 20 tttttatata actataaact aggaatcta 29 <210> 21 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Virus sincitial respiratorio sintético <400> 21 aggaattcgc atgcggggca aataacaatg gagttgccaa tc 42 <210> 22 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Virus sincitial respiratorio sintético <400> 22 aggaattctc gagtttttat ataactataa actaggaatc tac 43 <210> 23 <211> 64 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Virus sincitial respiratorio sintético <400> 23 ttaaacttaa aaatggttta tgtcgaggaa taaaatcgat taacaaccaa tcattcaaaa 60 agat 64

Claims (101)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un virus sincitial respiratorio (RSV) quimérico infeccioso aislado consistente en una proteína mayor de la nucleocápside (N) , una fosfoproteína de la nucleocáp-side (P) , una proteína gran polimerasa (L) , un factor de elongación de la ARN polimerasa y un genoma o antigenoma de fondo de RSV parcial o completo de un RSV humano o bovino combinado con uno o más genes y/o segmentos genómicos hete-rólogos de un RSV diferente, para formar un genoma o anti-genoma de RSV quimérico humano-bovino.
  2. 2. El RSV quimérico de la reivindicación 1, donde dichos uno o más genes y/o segmentos genómicos hete-rólogos incluyen uno o más genes o segmentos genómicos NSl, NS2, N, P, M, SH, M2(0RF1), M2 (0RF2) , L, F o G de RSV o una región líder, remolcadora o intergénica del genoma de RSV o de un segmento del mismo.
  3. 3. El RSV quimérico de la reivindicación 2, donde dichos uno o más genes y/o segmentos genómicos hete-rólogos incluyen uno o más genes o segmentos genómicos co-dificantes de una glicoproteína F, G y/o SH de RSV o un dominio o epitopo inmunogénico de la misma.
  4. 4. El RSV quimérico de la reivindicación 1, donde el genoma o antigenoma de RSV quimérico humano-bovino codifica para una glicoproteína quimérica que tiene domi-nios o epitopos inmunogénicos de glicoproteínas tanto humanas como bovinas .
  5. 5. El RSV quimérico de la reivindicación 4, donde dichos uno o más genes y/o segmentos genómicos hete-rólogos incluyen un segmento génico codificante de un ecto-dominio de glicoproteína.
  6. 6. El RSV quimérico de la reivindicación 1, donde un gen o segmento genómico heterólogo substituye a un gen o segmento genómico de contrapartida en un genoma o antigenoma de fondo de RSV parcial.
  7. 7. El RSV quimérico de la reivindicación 1, donde se añade un gen o segmento genómico adyacente a, de-ntro de, o como substitución para, una región no codificante del genoma o antigenoma de fondo de RSV parcial o completo.
  8. 8. El RSV quimérico de la reivindicación 1, donde se añade o substituye un gen o segmento genómico heterólogo en una posición correspondiente a una posición del orden génico de tipo salvaje de un gen o segmento genómico de contrapartida en el genoma o antigenoma de fondo de RSV parcial o completo.
  9. 9. El RSV quimérico de la reivindicación 1, donde se añade o substituye un gen o segmento genómico heterólogo en una posición que es más proximal al promotor o distal al promotor en comparación con una posición del orden génico de tipo salvaje de un gen o segmento genómico de contrapartida dentro del genoma o antigenoma de fondo de RSV parcial o completo.
  10. 10. El RSV quimérico de la reivindicación 1, donde el genoma o antigenoma quimérico consiste en un genoma o antigenoma de fondo de RSV humano parcial o completo combinado con uno o más genes y/o segmentos genómicos hete-rólogos de un RSV bovino.
  11. 11. El RSV quimérico de la reivindicación 10, donde uno o más genes seleccionados entre N, P, NS1, NS2, 2-1 y M de un RSV humano están substituidos por uno o más genes heterólogos de un RSV bovino.
  12. 12. El RSV quimérico de la reivindicación 11, donde ambos genes N y P de un RSV humano están substituidos por genes N y P de contrapartida de un RSV bovino.
  13. 13. El RSV quimérico de la reivindicación 11, donde ambos genes NS1 y NS2 de un RSV humano están substituidos por genes NS1 y NS2 de contrapartida de un RSV bovino.
  14. 14. El RSV quimérico de la reivindicación 11, donde dos o más de los genes M2-1, M2-2 y L están substituidos por genes de contrapartida de un RSV bovino.
  15. 15. El RSV quimérico de la reivindicación 11, donde cada uno de los genes N, P, NS1, NS2, M2-1 y M de un RSV humano están substituidos por genes N, P, NS1, NS2, M2-1 y M de un RSV bovino.
  16. 16. El RSV quimérico de la reivindicación 1, donde el genoma o antigenoma quimérico consiste en un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino parcial o completo combinado con uno o más genes y/o segmentos genómicos hete-rólogos de un RSV humano.
  17. 17. El RSV quimérico de la reivindicación 16, donde se añaden o substituyen uno o más genes de glicopro-teínas de RSV humano seleccionados entre F, G y SH, o uno o más segmentos genómicos codificantes de porciones de dominios citoplásmicos, dominios de transmembrana, ectodominios o epitopos inmunogénicos de F, G y/o SH en un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino parcial o completo.
  18. 18. El RSV quimérico de la reivindicación 17, donde se substituyen uno o ambos de los genes F y G de gli-coproteínas de RSV humano para reemplazar uno o ambos de los genes de glicoproteínas F y G de contrapartida en un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino parcial.
  19. 19. El RSV quimérico de la reivindicación 17, donde el genoma o antigenoma quimérico humano-bovino incorpora determinantes antigénicos de uno o de los dos subgru-pos A y B del RSV humano.
  20. 20. El RSV quimérico de la reivindicación 17, donde se substituyen ambos genes F y G de glicoproteínas de RSV humano para reemplazar los genes de las glicoproteínas F y G de contrapartida en el genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino.
  21. 21. El RSV quimérico de la reivindicación 20, que es rBRSV/A2.
  22. 22. El RSV quimérico de la reivindicación 9, donde se añaden o substituyen uno o más genes de glicopro-teínas del RSV humano seleccionados entre F, G y SH en una posición que es más proximal al promotor en comparación con una posición del orden génico de tipo salvaje de un gen o segmento genómico de contrapartida en un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino parcial o completo.
  23. 23. El RSV quimérico de la reivindicación 22, donde se substituyen ambos genes G y F de glicoproteínas de RSV humano en las posiciones del orden génico 1 y 2, respectivamente, para reemplazar genes de las glicoproteínas G y F de contrapartida suprimidos en las posiciones 7 y 8, respectivamente, en un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino parcial .
  24. 24. El RSV quimérico de la reivindicación 23, que es rBRSV/A2-GlF2.
  25. 25. El RSV quimérico de la reivindicación 17, donde el genoma o antigenoma quimérico es además modificado por adición o substitución de uno o más genes o segmentos genómicos heterólogos adicionales de un RSV humano en el genoma o antigenoma de fondo bovino parcial o completo para aumentar la estabilidad genética o alterar la atenuación, la reactogenicidad o el crecimiento en cultivo del virus quimérico . 2S. El RSV quimérico de la reivindicación 16, donde se añaden o substituyen uno o más genes asociados a la envuelta de RSV humano seleccionados entre F, G, SH y M en un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino parcial o completo . 27. El RSV quimérico de la reivindicación 26, donde se añaden o substituyen uno o más genes asociados a la envuelta de RSV humano seleccionados entre F, G, SH y M en un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino parcial en el que se han suprimido uno o más genes asociados a la en-vuelta seleccionados entre F, G, SH y M. 28. El RSV quimérico de la reivindicación 27, donde se añaden los genes asociados a la envuelta de RSV humano F, G y M en un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino parcial en el que se han suprimido los genes F, G, SH y M asociados a la envuelta. 29. El RSV quimérico de la reivindicación 28, que es rBRSV/A2 -MGF . 30. El RSV quimérico de la reivindicación 1, donde el genoma o antigenoma quimérico incorpora al menos una y hasta un complemento completo de mutaciones atenuantes presentes en un panel de cepas de RSV humano mutantes, cuyo panel consiste en cpts RSV 248 (ATCC VR 2450) , cpts RSV 248/404 (ATCC VR 2454) , cpts RSV 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC VR 2452), cpts RSV 530/1009 (ATCC VR 2451), cpts RSV 530/1030 (ATCC VR 2455), RSV B-l cp52/2B5 (ATCC VR 2542) y RSV B-l cp-23 (ATCC VR 2579) . 31. El RSV quimérico de la reivindicación 30, donde el genoma o antigenoma quimérico incorpora mutaciones atenuantes adoptadas entre diferentes cepas de RSV mutan-tes. 32. El RSV quimérico de la reivindicación 1, donde el genoma o antigenoma quimérico incorpora al menos una y hasta un complemento completo de mutaciones atenuantes que especifican una substitución de aminoácido en Val267 en el gen N de RSV, Glu218 y/o Thr523 en el gen F de RSV, Asn43, Cys319, Phe521, Gln831, Metll69, Tyrl321 y/o Hisl690 en el gen de la polimerasa L de RSV y una substitución nucleotídica en la secuencia de iniciación génica del gen M2. 33. El RSV quimérico de la reivindicación 32, donde el genoma o antigenoma quimérico incorpora al menos dos mutaciones atenuantes. 34. El RSV quimérico de la reivindicación 32, donde el genoma o antigenoma quimérico incluye al menos una mutación atenuante estabilizada por múltiples cambios nu-cleotídicos en un codon que especifica la mutación. 35. El RSV quimérico de la reivindicación 1, donde el genoma o antigenoma quimérico incluye además una modificación nucleotídica que especifica un cambio fenotí-pico seleccionado entre un cambio en las características de crecimiento, atenuación, sensibilidad a la temperatura, adaptación al frío, tamaño de placa, restricción del rango de hospedadores o un cambio en la inmunogenicidad. 36. El RSV quimérico de la reivindicación 35, donde la modificación nucleotídica altera un gen SH, NS1, NS2, M20RF2 o G del virus quimérico. 37. El RSV quimérico de la reivindicación 36, donde se suprime un gen SH, NS1, NS2, 2 ORF2 o G del virus quimérico en todo o en parte o se elimina la expresión del gen por introducción de uno o más codones de parada en un marco de lectura abierta del gen. 38. El RSV quimérico de la reivindicación 35, donde la modificación nucleotídica consiste en una dele-ción, inserción, substitución, adición o reorganización de una secuencia reguladora de acción cis de un gen seleccionado en el genoma o antigenoma de RSV quimérico. 39. El RSV quimérico de la reivindicación 38, donde se modifica una señal de fin de gen (GE) del gen NS1 o NS2. 40. El RSV quimérico de la reivindicación 35, donde la modificación nucleotídica consiste en una inserción, deleción, substitución o reorganización de un sitio de iniciación de la traducción en el genoma o antigenoma quimérico. 41. El RSV quimérico de la reivindicación 40, donde se elimina el sitio de iniciación de la traducción para una forma segregada de la glicoproteína G de RSV. 42. El RSV quimérico de la reivindicación 35, donde se modifica el genoma o antigenoma quimérico para codificar para una molécula no RSV seleccionada entre una ci-tokina, un epitopo T-helper, un marcador de sitio de restricción o una proteína de un patógeno microbiano capaz de provocar una respuesta inmune protectora en un hospedador mamífero. 43. El RSV quimérico de la reivindicación 35, que incorpora uno o más genes y/o segmentos genómicos del virus de la parainfluenza (PIV) . 44. El RSV quimérico de la reivindicación 43, donde el genoma o antigenoma quimérico codifica para una glicoproteína HN o F de PIV o un dominio o epitopo inmuno-génico de la misma. 45. El RSV quimérico de la reivindicación 44, donde el genoma o antigenoma quimérico codifica para un ec-todominio o epitopo inmunogénico de HN o F de PIV1, PIV2 o PIV3. 46. El RSV quimérico de la reivindicación 1, que es un virus. 47. El RSV quimérico de la reivindicación 1, que es una partícula subvírica. 48. Un método para estimular el sistema inmune de un individuo para inducir protección frente a RSV, que consiste en administrar al individuo una cantidad inmunoló-gicamente suficiente del RSV quimérico de la reivindicación 1 combinado con un vehículo fisiológicamente aceptable. 49. El método de la reivindicación 48, donde el RSV quimérico es administrado en una dosis de 103 a 10e PFU. 50. El método de la reivindicación 48, donde el RSV quimérico es administrado en el tracto respiratorio superior. 51. El método de la reivindicación 48, donde el RSV quimérico es administrado por pulverización, gotículas o aerosol . 52. El método de la reivindicación 48, donde el RSV quimérico es administrado a un individuo seronegativo para anticuerpos frente a RSV o que posee anticuerpos ma-temos adquiridos transplacentariamente para RSV. 53. El método de la reivindicación 48, donde el RSV quimérico provoca una respuesta inmune contra el RSV A o contra el RSV B humanos. 54. El método de la reivindicación 48, donde el RSV quimérico provoca una respuesta inmune tanto contra el RSV A como contra el RSV B humanos. 55. El método de la reivindicación 48, donde el RSV quimérico provoca una respuesta inmune contra el RSV A o el RSV B humanos y es coadministrado con una cantidad in-muñológicamente suficiente de un segundo RSV atenuado capaz de provocar una respuesta inmune contra el RSV A o el RSV B humanos, mediante lo cual se provoca una respuesta inmune frente a ambos RSV y RSV B humanos. 56. El método de la reivindicación 55, donde el RSV quimérico y el segundo RSV atenuado son administrados simultáneamente como una mezcla. 57. Una composición inmunogénica para provocar una respuesta inmune contra el RSV, consistente en una cantidad inmunológicamente suficiente del RSV quimérico de la reivindicación 1 en un vehículo fisiológicamente aceptable. 58. La composición inmunogénica de la reivindi-cación 57, formulada en una dosis de 103 a 106 PFU. 59. La composición inmunogénica de la reivindicación 57, formulada para administración en el tracto respiratorio superior por pulverización, gotículas o aerosol. 60. La composición inmunogénica de la reivindi-cación 57, donde el RSV quimérico provoca una respuesta inmune contra el RSV A o contra el RSV B humanos. 61. La composición inmunogénica de la reivindicación 57, donde el RSV quimérico provoca una respuesta inmune contra ambos RSV A y RSV B humanos . 62. La composición inmunogénica de la reivindicación 57, donde el RSV quimérico provoca una respuesta inmune contra el RSV A o el RSV B humanos y donde la composición incluye además una cantidad inmunológicamente suficiente de un segundo RSV atenuado capaz de provocar una respuesta inmune frente al RSV A o el RSV B humanos, mediante lo cual la composición provoca una respuesta inmune frente a ambos RSV A y RSV B humanos. 63. Una molécula polinucleotídica aislada consistente en un genoma o antigenoma de RSV quimérico, que incluye un genoma o antigenoma de fondo de RSV parcial o completo de un RSV humano o bovino combinado con uno o más genes o segmentos genómicos heterólogos de un RSV diferen- te, para formar un genoma o antigenoma de RSV quimérico humano-bo ino . 64. El polinucleótido aislado de la reivindicación 63, donde dichos uno o más genes y/o segmentos genómi-cos heterólogos incluyen uno o más genes o segmentos genó-micos NS1, NS2, N, P, M, SH, M2 (0RF1) , M2(ORF2), L, F o G de RSV o una región líder, remolcadora o intergénica del genoma de RSV o de un segmento del mismo. 65. El polinucleótido aislado de la reivindicación 63, donde un gen o segmento genomico heterólogo substituye a un gen o segmento genomico de contrapartida en un genoma o antigenoma de fondo de RSV parcial. 66. El polinucleótido aislado de la reivindicación 63, donde se añade un gen o segmento genomico heterólogo adyacente a, dentro de, o como substitución para, una región no codificante del genoma o antigenoma de fondo de RSV parcial o completo. 67. El polinucleótido aislado de la reivindicación 63, donde se añade o substituye un gen o segmento genomico heterólogo en una posición que es más proximal al promotor o distal al promotor en comparación con una posición del orden génico de tipo salvaje de un gen o segmento genomico de contrapartida dentro del genoma o antigenoma de fondo de RSV parcial o completo. 68. El polinucleótido aislado de la reivindicación 63, donde el genoma o antigenoma quimérico consiste en un genoma o antigenoma de fondo de RSV humano parcial o completo combinado con uno o más genes y/o segmentos genó-micos heterólogos de un RSV bovino. 69. El polinucleótido aislado de la reivindicación 68, donde uno o más genes seleccionados entre N, P, NS1, NS2, M2-1 y M de un RSV humano están substituidos por uno o más genes heterólogos de un RSV bovino. 70. El polinucleótido aislado de la reivindicación 68, donde ambos genes N y P de un RSV humano están substituidos por genes N y P de contrapartida de un RSV bo-vino . 71. El polinucleótido aislado de la reivindicación 68, donde ambos genes NSl y NS2 de un RSV humano están substituidos por genes NSl y NS2 de contrapartida de un RSV bovino . 72. El polinucleótido aislado de la reivindicación 68, donde dos o más de los genes M2-1, M2-2 y L están substituidos por genes de contrapartida de un RSV bovino. 73. El polinucleótido aislado de la reivindicación 63, donde el genoma o antigenoma quimérico consiste en un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino parcial o completo combinado con uno o más genes y/o segmentos genó-micos heterólogos de un RSV humano. 74. El polinucleótido aislado de la reivindicación 73, donde se añaden o substituyen uno o más genes de glicoproteínas de RSV humano seleccionados entre F, G y SH, o uno o más segmentos genómicos codificantes de porciones de dominios citoplásmicos, dominios de transmembrana, ecto-dominios o epitopos inmunogénicos de F, G y/o SH en un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino parcial o comple-to. 75. El polinucleótido aislado de la reivindicación 74 , donde se substituyen uno o ambos genes F y G de glicoproteínas de RSV humano para reemplazar uno o ambos genes de las glicoproteínas F y G de contrapartida en un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino parcial. 76. El polinucleótido aislado de la reivindicación 75, donde se substituyen ambos genes F y G de glico-proteínas de RSV humano para reemplazar los genes de las glicoproteínas F y G de contrapartida en el genoma o anti-genoma de fondo de RSV bovino. 77. El polinucleótido aislado de la reivindica-ción 67, donde se añaden o substituyen uno o más genes de glicoproteínas del RSV humano seleccionados entre F, G y SH en una posición que es más proximal al promotor en comparación con una posición del orden génico de tipo salvaje de un gen o segmento genómico de contrapartida en un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino parcial o completo. 78. El polinucleótido aislado de la reivindicación 77, donde se substituyen ambos genes G y F de glicoproteínas de RSV humano en las' posiciones del orden génico 1 y 2, respectivamente, para reemplazar genes de las glico-proteínas G y F de contrapartida suprimidos en las posiciones 7 y 8, respectivamente, en un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino parcial . 79. El polinucleótido aislado de la reivindicación 73, donde el genoma o antigenoma quimérico es además modificado por adición o substitución de uno o más genes o segmentos genómicos heterólogos adicionales de un RSV humano en el genoma o antigenoma de fondo bovino parcial o completo para aumentar la estabilidad genética o alterar la atenuación, la reactogenicidad o el crecimiento en cultivo del virus quimérico. 80. El polinucleótido aislado de la reivindicación 73 , donde se añaden o substituyen uno o más genes asociados a la envuelta de RSV humano seleccionados entre F, G, SH y M en un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino parcial o completo. 81. El polinucleótido aislado de la reivindicación 80, donde se añaden los genes asociados a la envuelta de RSV humano F, G y M en un genoma o antigenoma de fondo de RSV bovino parcial en el que se han suprimido los genes F, G, SH y M asociados a la envuelta. 82. La molécula polinucleotídica aislada de la reivindicación 63, donde el genoma o antigenoma quimérico humano-bovino incorpora determinantes antigénicos tanto del subgrupo A como del subgrupo B del RSV humano. 83. La molécula polinucleotídica aislada de la reivindicación 63, donde el genoma o antigenoma quimérico es además modificado por incorporación de una o más mutaciones atenuantes . 84. La molécula polinucleotídica aislada de la reivindicación 63, que incluye además una modificación nu-cleotídica que especifica un cambio fenotípico seleccionado entre un cambio en las características de crecimiento, atenuación, sensibilidad a la temperatura, adaptación al frío, tamaño de placa, restricción del rango de hospedadores o un cambio en la inmunogenicidad. 85. La molécula polinucleotídica aislada de la reivindicación 63, donde se modifica un gen SH, NS1, NS2, M20RF2 o G. 86. La molécula polinucleotídica aislada de la reivindicación 85, donde se suprime el gen SH, NS1, NS2 , M2 ORF2 o G del virus quimérico en todo o en parte o se elimi-na la expresión del gen por introducción de uno o más codo-nes de parada en un marco de lectura abierta del gen. 87. La molécula polinucleotídica aislada de la reivindicación 59, donde la modificación nucleotídica consiste en una deleción, inserción, adición o reorganización de una secuencia reguladora de acción cis de un gen de RSV seleccionado en el genoma o antigenoma de RSV quimérico. 88. Un método para producir una partícula de RSV quimérico atenuado infeccioso a partir de una o más moléculas polinucleotídicas aisladas codificantes de dicho RSV, consistente en: expresar en una célula o lisado libre de célu-las un vector de expresión consistente en un polinucleotido aislado que incluye un genoma o antigenoma de fondo de RSV parcial o completo de un RSV humano o bovino combinado con uno o más genes o segmentos genómicos heterologos de un RSV diferente para formar un genoma o antigenoma de RSV quimé-rico humano-bovino, y las proteínas de RSV N, P, L y factor de elongación de la AR polimerasa. 89. El método de la reivindicación 88, donde el genoma o antigenoma de RSV quimérico y las proteínas N, P, L y factor de elongación de la ARN polimerasa son expresádos por dos o más vectores de expresión diferentes. 90. El RSV quimérico de la reivindicación 1, donde el genoma o antigenoma quimérico bovino-humano consiste en un genoma o antigenoma vector de RSV parcial o completo combinado con uno o más genes o segmentos genómi-eos heterólogos codificantes de uno o más determinantes an-tigénicos de uno o más patógenos heterólogos. 91. El RSV quimérico de la reivindicación 90, donde dichos uno o más patógenos heterólogos son un RSV heterólogo y dicho (s) gen (es) o segmento (s) genómico(s) heterólogo (s) codifica (n) para una o más proteínas de RSV NS1, NS2, N, P, M, SH, M2 (ORF1) , M2(ORF2), L, F o G o fragmentos de éstas . 92. El RSV quimérico de la reivindicación 90, donde el genoma o antigenoma vector es un genoma o antige-noma de RSV A parcial o completo y el (los) gen (es) o segmento (s) genómico(s) heterólogo (s) que codifica (n) para el (los) determinante (s) antigénico (s) es/son de un virus del subgrupo B de RSV. 93. El RSV quimérico de la reivindicación 90, donde el genoma o antigenoma quimérico incorpora uno o más genes o segmentos genómicos de un BRSV que especifica ate-nuación. 94. El RSV quimérico de la reivindicación 90, donde se añaden o incorporan uno o más genes o segmentos genómicos de HPIV1, HPIV2 o HPIV3 codificantes de una o más glicoproteínas HN y/o F o dominios, fragmentos o epitopos antigénicos de éstas en el genoma o antigenoma vector de HRSV parcial o completo. 95. El RSV quimérico de la reivindicación 90, donde se añade o incorpora una unidad de transcripción que contiene un marco de lectura abierta (ORF) de un gen HN o F de HPIV2 en el genoma o antigenoma vector de HRSV quimérico. 96. El RSV quimérico de la reivindicación 35, donde el genoma o antigenoma vector es un genoma o antigenoma de BRSV parcial o completo y el (los) gen (es) o segmen-to(s) genómico(s) heterólogo (s) codificante (s) del (de los) determinante (s) antigénico (s) es/son de uno o más HRSV. 97. El RSV quimérico de la reivindicación 96, donde el genoma o antigenoma de BRSV parcial o completo incorpora uno o más genes o segmentos genómicos codificantes de uno o más genes de glicoproteínas de HRSV seleccionados entre F, G y SH, o uno o más segmentos genómicos codificantes de porciones de dominios citoplásmicos, dominios de transmembrana, ectodominios o epitopos inmunogénicos de F, G y/o SH de HRSV. 98. El RSV quimérico de la reivindicación 90, donde el genoma o antigenoma vector es un genoma o antigenoma de HRSV o E-ESV parcial o completo y el patógeno hete- \ rólogo es seleccionado entre el virus del sarampión, los virus sincitiales respiratorios del subgrupo A y del sub-grupo B, el virus de las paperas, los virus del papiloma humano, los virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 y de tipo 2, los virus herpes simplex, el citomegalovirus, el virus de la rabia, el virus de Epstein Barr, los filovi-rus, los bunyavirus, los flavivirus, los alfavirus y los virus de la influenza. 99. El RSV quimérico de la reivindicación 98, donde dichos uno o más determinantes antigénicos heterólo-gos son seleccionados entre las proteínas HA y F del virus del sarampión, las proteínas F, G, SH y M2 del virus sinci-tial respiratorio del subgrupo A o del subgrupo B, las proteínas HN y F del virus de las paperas, la proteína Ll del virus del papiloma humano, la proteína gpl60 del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 ó de tipo 2, las proteínas gB, gC, gD, gE, gG, gH, gl, gJ, gK, gL y gM del virus herpes simplex y del citomegalovirus, la proteína G del virus de la rabia, la proteína gp350 del virus de Epstein Barr, la proteína G de filovirus, la proteína G de bunyavirus, las proteínas E y NSl de flavivirus y la proteína E de alfavirus, y sus dominios, fragmentos y epitopos antigénicos . 100. El RSV quimérico de la reivindicación 99, donde el patógeno heterólogo es el virus del sarampión y el (los) determinante (s) antigénico (s) es/son seleccionado (s) entre las proteínas HA y F del virus del sarampión y sus dominios, fragmentos y epitopos antigénicos. 101. El RSV quimérico de la reivindicación 100, donde se añade o incorpora una unidad de transcripción que contiene un marco de lectura abierta (ORF) de un gen HA del virus del sarampión en un genoma o antigenoma vector de HRSV.
MXPA02000220A 1999-07-09 2000-06-23 Produccion de vacunas quimericas humanas-bovinas atenuadas del virus sincitial respiratorio. MXPA02000220A (es)

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Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7485440B2 (en) 1995-09-27 2009-02-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines involving modification of M2 ORF2
US20030082209A1 (en) 2000-07-05 2003-05-01 Skiadopoulos Mario H. Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus (PIV) vaccines
US7951383B2 (en) 1997-05-23 2011-05-31 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Attenuated parainfluenza virus (PIV) vaccines
US7632508B2 (en) 1997-05-23 2009-12-15 The United States Of America Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus (PIV) vaccines
US7201907B1 (en) 1997-05-23 2007-04-10 The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus(PIV) vaccines
US7662397B2 (en) 1997-07-15 2010-02-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Respiratory syncytial virus vaccines expressing protective antigens from promoter-proximal genes
US20040005542A1 (en) 2001-06-22 2004-01-08 Krempl Christine D Respiratory syncytial virus vaccines expressing protective antigens from promotor- proximal genes
MXPA02000490A (es) * 1999-07-13 2004-09-27 Us Gov Health & Human Serv Produccion de virus sincitiales respiratorios recombinantes, que expresan moleculas inmunomoduladoras.
AU2003270824B2 (en) 2002-09-18 2009-02-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Recovery of recombinant human parainfluenza virus type 2 (HPIV2) from cDNA and use of recombinant HPIV2 in immunogenic compositions and as vectors to elicit immune responses against PIV and other human pathogens
CA2517394A1 (en) 2003-02-28 2005-02-17 The Government Of The United States Of America As Represented By The Sec Retary Of The Department Of Health And Human Services Recombinant human metapneumovirus and its use
EP1633860A2 (en) 2003-06-09 2006-03-15 Wyeth IMPROVED METHOD FOR THE RECOVERY OF NON-SEGMENTED, NEGATIVE-STRANDED RNA VIRUSES FROM cDNA
US7588770B2 (en) 2003-12-10 2009-09-15 The Uab Research Foundation Recombinant viruses of the paramyxoviridae family with heterologous envelope glycoproteins
WO2007060725A1 (ja) * 2005-11-24 2007-05-31 The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University 組換え多価ワクチン
US20100260792A1 (en) * 2007-10-22 2010-10-14 University Of Rochester Respiratory syncytial virus vaccine based on chimeric papillomavirus virus-like particles or capsomeres
WO2010003032A2 (en) * 2008-07-01 2010-01-07 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health A Recombinant human parainfluenza type 1 viruses (hpiv1s) containing mutations in or deletion of the c protein are attenuated in african green monkeys and in ciliated human airway epithelial cells and are potential vaccine candidates for hpiv1
BRPI0921424A2 (pt) 2008-11-05 2016-01-05 Merck Sharp & Dohme vírus sincicial respiratório atenuado, composição imunogênica, molécula de ácido nucléico, célula recombinante, método para produzir uma resposta imune protetiva em um paciente, e, uso de uma quantidade imunologicamente eficaz de um ou mais dos seguintes: um rsv atenuado, uma população de rsv atenuado e uma composição imunogênica.
GB201019240D0 (en) * 2010-11-15 2010-12-29 Vib Vzw Respiratory syncytical virus vaccine
WO2012085936A2 (en) * 2010-12-20 2012-06-28 Panacea Biotech Ltd Recombinant respiratory syncytial virus plasmids and vaccines
CN102210859B (zh) * 2011-05-31 2012-11-21 昆明理工大学 一种结核分枝杆菌esat-6-f2融合蛋白亚单位疫苗及其制备方法
EP3875112A1 (en) * 2012-04-13 2021-09-08 The United States of America, as Represented By the Secretary, Department of Health and Human Services Genetically stable live attenuated respiratory syncytial virus vaccine and its production
JP2014236748A (ja) * 2014-08-26 2014-12-18 一般財団法人阪大微生物病研究会 組換え多価ワクチン
JP7020917B2 (ja) 2015-01-20 2022-02-16 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ キメラｒｓｖ／ｂｐｉｖ３ ｆタンパクを発現する組換えヒト／ウシパラインフルエンザウイルス３（ｂ／ｈｐｉｖ３）およびその使用
MX2019011599A (es) * 2017-03-30 2019-12-19 Univ Queensland Moleculas quimericas y usos de las mismas.
JP7371009B2 (ja) * 2018-04-23 2023-10-30 アメリカ合衆国 キメラベクター
KR102567994B1 (ko) * 2018-10-12 2023-08-17 에스케이바이오사이언스(주) 재조합 rsv 생백신주 및 이의 제조 방법
CN110229219B (zh) * 2019-06-21 2021-03-30 中国科学院武汉病毒研究所 一种新型的呼吸道合胞病毒疫苗抗原的制备方法及其用途
WO2023183700A2 (en) * 2022-03-22 2023-09-28 Mayo Foundation For Medical Education And Research Morreton viruses and methods of use
CN116676275B (zh) * 2023-03-17 2024-06-07 北京赛尔富森生物科技有限公司 A基因型嵌合腮腺炎病毒株和制备方法及用途

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4800078A (en) 1987-05-28 1989-01-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Immunotherapeutic method of treating respiratory disease by intranasal administration of Igb
AU7007491A (en) 1990-02-02 1991-08-08 Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern Cdna corresponding to the genome of negative-strand rna viruses, and process for the production of infectious negative-strand rna viruses
GB9200117D0 (en) 1992-01-06 1992-02-26 Connaught Lab Production of recombinant chimeric proteins for vaccine use
IL105456A (en) 1992-04-21 1996-12-05 American Home Prod Vaccines of attenuated respiratory syncytial virus
AU3660893A (en) 1993-01-29 1994-08-15 Med Immune, Inc. Human-murine chimeric antibodies against respiratory syncytial virus
ATE257175T1 (de) 1994-07-18 2004-01-15 Conzelmann Karl Klaus Prof Dr Rekombinantes infektiöses nicht-in-segmente- geteiltes, negativ-strange-rns-virus
US20030054505A1 (en) * 1997-09-26 2003-03-20 Hong Jin Recombinant rsv expression systems and vaccines
WO1996010400A1 (en) 1994-09-30 1996-04-11 The Uab Research Foundation Gene therapy vectors and vaccines based on non-segmented negatives stranded rna viruses
US5716821A (en) 1994-09-30 1998-02-10 Uab Research Foundation Prevention and treatment of respiratory tract disease
DE69510207T3 (de) 1995-08-09 2007-02-15 Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern Verfahren zur Herstellung von infektiösen minussträngigen RNA-Viren
US6165774A (en) 1995-09-22 2000-12-26 Connaught Laboratories Limited Parainfluenza virus glycoproteins and vaccines
US6689367B1 (en) 1995-09-27 2004-02-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of attenuated chimeric respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences
US6923971B2 (en) 1995-09-27 2005-08-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Respiratory syncytial virus vaccines expressing protective antigens from promoter-proximal genes
JPH11512609A (ja) 1995-09-27 1999-11-02 アメリカ合衆国 クローン化されたヌクレオチド配列からの感染性ＲＳウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）の生産
US6713066B1 (en) 1996-07-15 2004-03-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines involving modification of M2 ORF2
US5869036A (en) 1995-12-08 1999-02-09 St. Louis University Live attenuated vaccines based on CP45 HPIV-3 strain and method to ensure attenuation in such vaccine
US6077514A (en) 1996-04-04 2000-06-20 The Regents Of The University Of Michigan Attenuated respiratory syncytial virus
EP2112220A3 (en) 1996-07-15 2010-01-06 The Government of the United States of America, as represented by The Department of Health and Human Services Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences
US6699476B1 (en) 1996-07-15 2004-03-02 Peter L. Collins Production of recombinant respiratory syncytial viruses expressing immune modulatory molecules
AU7797798A (en) 1997-05-23 1998-12-11 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Production of attenuated parainfluenza virus vaccines from cloned nucleotide sequences
PT1012244E (pt) 1997-07-11 2007-08-21 Univ Yale ''rabdovírus com revestimentos remanipulados''
AU1297299A (en) * 1997-11-10 1999-05-31 University Of Maryland Production of novel bovine respiratory syncytial viruses from cdnas
MXPA01010392A (es) 1999-04-13 2003-09-15 Us Gov Health & Human Serv Produccion de vacunas de virus con arn de hebra negativa atenuados a partir de secuencias de nucleotidos clonadas.
WO2000061611A2 (en) 1999-04-13 2000-10-19 The Government Of The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of attenuated chimeric respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences
AU5918100A (en) 1999-07-09 2001-01-30 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines involving modification of M2 ORF2
MXPA02000490A (es) 1999-07-13 2004-09-27 Us Gov Health & Human Serv Produccion de virus sincitiales respiratorios recombinantes, que expresan moleculas inmunomoduladoras.
KR100899030B1 (ko) * 2000-06-23 2009-05-21 더 가버먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카 애즈 리프리젠티드 바이 더 디파트먼트 오브 헬스 앤 휴먼 서비씨즈 프로모터 인접 유전자로부터 보호적 항원을 발현하는호흡기 신시티움 바이러스 백신

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Publication number Publication date
US20070184069A1 (en) 2007-08-09
EP1287152A2 (en) 2003-03-05
WO2001004335A2 (en) 2001-01-18
IL147447A (en) 2010-05-31
KR20020092343A (ko) 2002-12-11
AU5641500A (en) 2001-01-30
AU784216B2 (en) 2006-02-23
ATE419369T1 (de) 2009-01-15
JP2003530073A (ja) 2003-10-14
US7842798B2 (en) 2010-11-30
AU2006202170A1 (en) 2006-06-15
EP1287152B1 (en) 2008-12-31
CN101260386A (zh) 2008-09-10
WO2001004335A3 (en) 2002-12-19
BR0013195A (pt) 2002-07-23
CA2378552A1 (en) 2001-01-18
WO2001004335A8 (en) 2003-02-06
AU2006202170B2 (en) 2009-10-08
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US7829102B2 (en) 2010-11-09
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