MXPA01006491A

MXPA01006491A - Expresion de antigenos de superficie de hepatitis b inmunogenicos en plantas transgenicas.

Info

Publication number: MXPA01006491A
Application number: MXPA01006491A
Authority: MX
Inventors: Thanavala Yasmin
Original assignee: Thompson Boyce Plant Res
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-23
Publication date: 2003-06-06
Also published as: CN100410268C; EP1230257A2; CA2357004A1; WO2000037610A3; AU776855B2; AU2594900A; WO2000037610A2; CN1378553A; BR9916522A; EP1230257A4; US6551820B1; US20040086530A1; JP2003512812A

Abstract

La presente invencion describe vectores de expresion en plantas que comprenden al menos dos casetes de expresion, que funcionan para reducir el silencio transcripcional de la expresion de polinucleotidos. Ademas, se describe nuevos vectores de expresion en plantas para la expresion de polipeptidos inmunogenicos, incluyendo HbsAg. Los vectores de expresion en plantas pueden ser utilizados para producir polipeptidos inmunogenicos, que incluyen HbsAg, en tejidos de plantas comestibles. Los tejidos de plantas comestibles pueden ser utilizados para inducir una respuesta inmune en humanos y animales cuando se consumen los tejidos de la planta.

Description

EXPRESIÓN DE ANTIGENOS DE SUPERFICIE DE HEPATITIS B INMUNOGENICOS EN PLANTAS TRANSGENICAS Campo Técnico La presente invención se refiere a vacunas orales, particularmente aquéllas proporcionadas por plantas comestibles. La invención emplea técnicas de ingeniería genética para producir plantas transgénicas capaces de expresar polipéptidos inmunogénicos, incluyendo antígenos de la hepatitis B (HBsAg) en cantidades suficientes para provocar una respuesta inmune en un humano o animal que consume toda o una parte de la planta.

Antecedentes de la Invención Una vacuna para la hepatitis B fue la primera "nueva generación" de vacunas recombinantes autorizadas por la FDA para uso humano. La subunidad inmunogénica en esta formulación se produce por la expresión del gen que codifica a HBsAg en levaduras recombinantes; la proteína se purifica de la levadura diseñada genéticamente y se usa para el suministro parenteral. En el mundo desarrollado, la vacuna recombinante ha desplazado el uso de una vacuna REF: 131025 temprana derivada del plasma de individuos afectados. Ambas vacunas rHBsAg y derivadas del plasma, muestran ser razonablemente seguras y efectivas en poblaciones de adultos e infantes recién nacidos con alto riesgo. Sin embargo, el costo de la vacuna rHBsAg evita su extensiva disponibilidad en los países en vías de desarrollo. El envolvente del virus de la hepatitis B (HBV) contiene tres clases de tamaños de proteínas que comparten las secuencias carboxi-terminal . Estas proteínas llamadas antígenos de la superficie de la Hepatitis B (HBsAgs), incluyen clases de tamaños grandes (L; que contienen un dominio pre-S2), medio (M:, que contienen un dominio pre-Si), y pequeño (S, que contiene solamente el dominio S). Todas las tres proteínas se encuentran en viriones infecciosos (a menudo referidos como partículas Dañe), recuperadas como esferas de 42 mm a partir del suero de pacientes infectados. Las muestras del suero también contienen partículas esféricas vacías, promediando 22 nm, las cuales contienen principalmente las proteínas de la clase S. Las líneas celulares de mamíferos transfectadas exclusivamente con ADN que codifica a la proteína S, liberan esferas vacías de 20 nm similares a aquéllas de las células infectadas. Además, las células de levadura transformadas con el mismo gen a partir de esferas análogas, las cuales se encuentran que son igualmente inmunogénicas como las esferas de 22 nm a partir de células infectadas. El material derivado de la levadura forma los constituyentes activos de las vacunas comerciales actualmente disponibles ENGERIX (SKB) y RECOMBIVAX (Merck) . En células de mamíferos, las proteínas recientemente sintetizadas L, M o S, se insertan en la membrana del retículo endoplasmático (ER por sus siglas en inglés) . La proteína S consiste de 226 aminoácidos; su terminales N y C se piensa que están en el lado del lumen del ER y tiene cuatro hélices de transmembranas. Todas estas proteínas tienen un sitio de glicosilación en la posición 146 del dominio S. Las tres proteínas difieren en los sitios disponibles y la extensión de la glicosilación. La glicosilación impropia puede evitar la formación del virión, presumiblemente debido al pliegue desigual de las proteínas. También, los enlaces disulfuro múltiples entre las cisteínas en- las proteínas se conocen por ser importantes para la estructura del virión o partículas agrupadas y a la estructura de lazos antigénicos en la proteína. Las partículas incorrectamente agrupadas pueden interactuar con los acompañantes celulares debido al pliegue incorrecto para evitar la secreción. Los niveles superiores de presl y preS2 están presentes en HBV que en partículas de HBsAg de 17-25 nm por lo tanto, la inmunización con las partículas HBsAg no puede generar títulos de anticuerpos altos a las secuencias preS expresadas en HBV. Durante el curso de la infección por HBV en humanos, los niveles de las proteínas preS se incrementan durante la replicación activa, y los anticuerpos anti-preS y las células T se generan antes de las respuestas específicas a la proteína S. Una vez que aumentan los anticuerpos anti-HBsAg, disminuyen los anticuerpos anti-preS. El papel de presl y preS2 en la unión y neutralización de virus ha conducido al desarrollo de vacunas que contienen estas secuencias así como también la región total S . Las vacunas que incorporan secuencias preS incluyen HEPAGEN (Merck) y BIO-HEP-B (BGT) ; ambas se producen en líneas celulares de mamíferos. En la formulación de las partículas completas que contienen proteínas S y preS, es importante notar que las cantidades relativas de proteínas S, M, y L afectan la agrupación de HBsAg, por ejemplo, niveles superiores de la proteína L reducen la cantidad de formación y secreción de partículas HBsAg. El agrupamiento de las proteínas de la superficie S, M y L en partículas, ocurre durante la brotación del complejo en el ER, seguido por el transporte de las partículas a través del aparato de Golgi al exterior de las células. Las estructuras biológicas de la escala de nanómetro, tales como cápsidos virales, se juntan a través de la polimerización de las subunidades de la proteína plegada similarmente, usando un número pequeño de contactos de enlaces bien definidos. La fuerza de accionamiento para la polimerización es la formación de interacciones de enlaces favorables como las subunidades libres que están incorporadas en el polímero que crece. Para proteínas envueltas tales como HBsAg, los pasos esenciales en los procesos de polimerización son la integración apropiada del polipéptido en la membrana ER seguida por el establecimiento de contacto entre las subunidades de la proteína. El transporte celular normal y la distribución de proteínas en el sistema de la endomembrana pueden contribuir a este proceso. La Patente Estadounidense No. 4,710,463 por Murria, propone un método para producir un polipéptido que tiene la antigenicidad de un antígeno de la superficie o núcleo de la hepatitis B, el cual emplea un hospedero unicelular. La Patente Estadounidense No. 5,738,855 por Szu et al . , propone un inmunógeno de oligosacárido modificado, similar al antígeno Vi de Salmonell a typhi , el cual puede conjugarse a un portador, tal como el antígeno de la superficie en la hepatitis B. La Patente Estadounidense No. 4,847,080, EU 0154902 Bl, y documentos subsecuentes de Neurath et al., identifican epitopes peptídicas en las regiones presl y preS2 tanto para el enlace de hepatocito como neutralización, así como también péptidos que se pueden incluir en una vacuna. Los mamíferos infectados por un patógeno, aumentan la respuesta inmune cuando se supera al microorganismo invasor mediante la iniciación de al menos, una de las tres ramificaciones del sistema inmune: inmunidad mucosal, humoral o celular. La inmunidad mucosal ampliamente resulta de la producción de anticuerpos IgA secretorios en secreciones que empapan a las superficies mucosales en el tracto respiratorio, el tracto gastrointestinal, el tracto genitourinario y las glándulas secretorias. Estos anticuerpos mucosales actúan para limitar la colonización del patógeno en las superficies mucosales, así se establece una primer línea de defensa contra la invasión. La producción de anticuerpos mucosales puede iniciarse por la inmunización local de la glándula secretoria o tejido o mediante la presentación del antígeno a ya sea el tejido linfoide asociado con los intestinos (GALT por sus siglas en inglés); placas de Peyer o el tejido linfoide asociado con los bronquios (BALT por sus siglas en inglés) . La inmunización mucosal se puede alcanzar por la presentación oral de antígenos. Células epiteliales especializadas (células M) , que yacen sobre los tejidos linfoides mucosales excesivamente organizados junto al tracto intestinal, muestran los antígenos mediante la toma (por endocitosis) de los virus, bacterias infecciosas y macromoléculas. Estos pasan a los folículos subyacentes en donde las respuestas inmunes se inician y las células se dispersan tanto en los compartimentos inmunes mucosales como sistémicos. Las células epiteliales son también un componente integral de la red de citosina regulatoria, incluyendo aquéllas que son importantes en la diferenciación de las células B. La inmunización oral también produce fuertes respuestas inmunes humorales. La inmunidad humoral resulta de la producción de anticuerpos circulantes o de circulación en el suero (especialmente IgG y IgM) , precipitación de fagocitosis de patógenos invasores, neutralización de virus, o citotoxicidad mediada por el complemento contra el patógeno. Existe una relación bien documentada entre la protección HBV y la amplitud del anticuerpo sistémico y las respuestas de las células T a las proteínas HBsAg, y es probable que esta protección se logre' por inmunización oral. En contraste con la gran variedad de vacunas inyectables actualmente disponibles que proporcionan inmunidad sistémica, son raras las vacunas administradas no sistémicamente, que estimulan la inmunidad mucosal. Recientemente sin embargo, ha surgido un interés en el desarrollo de nuevas estrategias para el desarrollo de vacunas con suministro oral como la vía preferida de suministro. En el diseño de una vacuna oral exitosa, dos aspectos merecen la atención especial -el uso de un adyuvante apropiado y el desarrollo de un sistema de suministro de antígeno apropiado. La mayoría de los antígenos de proteínas estudiados para usarse como adyuvantes, cuando se administran oralmente en grandes dosis, fallan al provocar una respuesta anticuerpo mucosal, pero en su lugar, inducen un estado de insensibilidad o tolerancia oral. La toxina del cólera (CT por sus siglas en inglés) y la toxina inestable al calor de E . col i (LT por sus siglas en inglés) son excepciones. La alimentación de ya sea CT o LT, no induce tolerancia para la respuesta al anticuerpo y adicionalmente puede evitar la inducción de la tolerancia oral a los antígenos no relacionados que son administrados oralmente junto con la CT o LT (Elson, C. et al . , J. Im unol. 133:2892-2887 (1984)). Estos resultados sugieren que la CT/LT dirija el rendimiento total a favor de la sensibilidad en lugar de la tolerancia. En otros estudios, se ha encontrado que la CT no incrementa la respuesta inmune contra un antígeno que ha sido previamente alimentado sin CT (Xu-A ano, J. Exp. Med. 178:1309-1320 (1993)) . Esto es importante debido a que indica que no se monta una respuesta inmune contra los antígenos de dieta normal en la presencia de CT. De manera general, se toman dos diferentes procedimientos para la inducción de la tolerancia contra la inmunización después de la administración oral del antígeno: para la inducción de la tolerancia oral, el antígeno soluble o acuoso se administra solo; mientras que para los protocolos de vacunación, los antígenos son usualmente administrados en conjunto con los adyuvantes mucosales. Recientes avances en la ingeniería genética han proporcionado las herramientas necesarias para transformar plantas con costos relativamente bajos, candidatas para la expresión de proteínas inmunogénicas. Las plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas se han transformado establemente. Por ejemplo, el tabaco, una dicotiledónea, se ha transformado con un gen que codifica a la proteína S y las células se pueden romper para liberar esferas (o partículas similares a los virus; VLPs) (Masón et al . , PNAS, USA, 89:11745-11749 (1992)) . Cuando se inyectan en ratones, las partículas cuantitativamente imitan las propiedades inmunogénicas de la vacuna comercial (Thanavala et al . , PNAS USA, 92:3358-3361 (1995)) . Esto sugiere que el proceso de la síntesis de proteínas y el agrupamiento puedan ser similares en las células de plantas y de mamíferos. Desafortunadamente, las relaciones bajas de las síntesis de proteínas en las plantas transgénicas han imposibilitado estudios detallados de la formación del VLPs i n vi vo . La Patente Estadounidense No. 5,679,880 por Curtis, III propone una planta transgénica que expresa un determinante antígeno o antigénico de un microorganismo patogénico que puede provocar una respuesta inmune secretoria en un animal. Patentes Estadounidenses Nos. 5,484,719 y 5,612,487 por Lam e t al . , describen la obtención de partículas antigénicas a partir de tabaco transgénico transformado para expresar HBsAg. Actualmente, no existen métodos para predecir la eficiencia mediante la cual proteínas HBsAg recientemente sintetizadas se polimerizarán en estructuras antigénicas en las células de las plantas, puesto que el factor o factores que limitan la relación no se conocen. En consecuencia, estudios previos muestran que la formación de partículas en plantas transgénicas puede involucrar la inserción no específica de las proteínas recientemente sintetizadas en varias membranas celulares, las cuales podrían explicar el nivel bajo de la acumulación de partículas en las plantas transgénicas descritas a la fecha. Se sedea desarrollar una vacuna oral no costosa, segura, y altamente efectiva, que estimule la inmunidad sistémica y preferiblemente mucosal, para evitar la infección del virus de la hepatitis B. Tal vacuna deberá basarse sobre un antígeno de la hepatitis B o un epitope primario del mismo. Un procedimiento que podría incrementar la formación de las partículas similares al virus HBsAg, puede emplear las proteínas de fusión diseñadas para alterar las células objetivo de las subunidades de proteínas recientemente sintetizadas. Las proteínas de fusión pueden tener, por ejemplo, un péptido líder N-terminal conocido por entrar al sistema de la endomembrana o una extensión KDEL C-terminal (SEC ID NO:22) conocida por regular la retención microsomal. Un procedimiento- particularmente satisfactorio para la aplicación en los países en vías de desarrollo podría ser el desarrollo de plantas transgénicas que tienen partes comestibles que consistentemente establecen inmunidad oral contra el HBV cuando se consumen.

Breve Descripción de la Invención Es un objeto de la invención, proporcionar vectores de expresión de plantas que comprenden al menos, dos casetes de expresión que funcionan para reducir el silenciamiento transcripcional de la expresión de polinucleótidos. Es otro objeto de la invención, proporcionar nuevos vectores de expresión de plantas para la expresión de polipéptidos inmunogénicos, incluyendo HBsAg. Los vectores de expresión de plantas se pueden usar para producir polipéptidos inmunogénicos, incluyendo HBsAg, en tejidos de plantas comestibles. Es un objeto adicional de la invención, proporcionar tales polipéptidos inmunogénicos en tejidos de plantas comestibles para provocar una respuesta inmune en humanos y animales cuando los tejidos de las plantas son consumidos. Estos y otros objetos de la invención se proporcionan por una o más de las modalidades descritas abajo. Una modalidad de la invención proporciona un vector de expresión de la planta que comprende dos casetes de expresión. El primer cásete comprende un polinucleótido que codifica a un antígeno y el segundo cásete de expresión comprende un polinucleótido que codifica al mismo antígeno como el polinucleótido del primer cásete de expresión. El polinucleótido del segundo cásete de expresión no es idéntico al polinucleótido del primer cásete de expresión. El primer cásete puede opcionalmente comprender un polinucleótido que codifica a un antígeno de la superficie de la hepatitis B (HBsAg) y el segundo cásete de expresión puede comprender un polinucleótido no idéntico que codifica a un HBsAg. Opcionalmente, el primer cásete de expresión puede comprender un polinucleótido que codifica a un polipéptido HBsAg optimizado de planta, preferiblemente con al menos un codón optimizado de planta, y en donde el segundo cásete de expresión comprende un polinucleótido que codifica a un polipéptido HBsAg derivado de un virus nativo. Aún más preferiblemente, el polinucleótido del primer cásete de expresión comprende la SEC ID NO : 3 y el polinucleótido del segundo cásete de expresión comprende la SEC ID N0:1. Preferiblemente, el silenciamiento del gen, que incluye el silenciamiento del gen transcripcional mediado por el ARN, se reduce o elimina cuando ambos polinucleótidos se expresan en una célula. Opcionalmente, el vector de expresión de la planta puede tener un polinucleótido del primer cásete y un polinucleótido del segundo cásete en donde dicho polinucleótido comprende no más de 90 o no más de 60 nucleótidos contiguos idénticos. El vector de expresión de la planta puede comprender un primer cásete de expresión además de una región no traducida, transcrita al 5' , y un segundo cásete de expresión que comprende una región no traducida, transcrita al 5', no idéntica. El vector de expresión de la planta puede también además, comprender un primer cásete de expresión que además comprende una región no traducida transcrita al 3' y un segundo cásete de expresión que comprende una región no traducida, transcrita al 3', no idéntica. Adicionalmente, el vector de expresión de la planta puede comprender un primer cásete de expresión que además comprende una región no traducida, transcrita al 5' y una región no traducida, transcrita al 3' . El segundo cásete de expresión puede comprender una región no traducida, transcrita al 5' , no idéntica y una región no traducida, transcrita al 3' no idéntica, comparada con el primer cásete de expresión. El primer cásete de expresión puede comprender una región no traducida, transcrita al 5' TEV y una región no traducida, transcrita al 3' vspB, y un segundo cásete de expresión que comprende una región no traducida, transcrita al 5' TMV y una región no traducida, transcrita al 3' pí n2. El vector de expresión de la planta puede adicionalmente, comprender un primer cásete de expresión que comprende un polipéptido HBsAg optimizado por la planta, y un segundo cásete de expresión que comprende un polipéptido nativo HBsAg derivado del virus. En todavía otra modalidad de la invención, una célula E . col i es transformada con el vector de expresión de la planta descrito anteriormente. Las partículas similares a los virus se pueden agrupar en la célula.

En aún otra modalidaa de la invención, una célula de Agrobacteri um se transforma con el vector de expresión de la planta descrito anteriormente. Las partículas similares al virus se pueden agrupar en la célula. En otra modalidad de la invención, una célula de planta se transforma con el vector de expresión descrito anteriormente. Las partículas similares al virus, se pueden agrupar en la célula. Preferiblemente, la célula de la planta se selecciona del grupo que consiste de células de tomate, papa, plátano, y zanahorias. Aún más preferiblemente, el vector de expresión de la planta se integra en el genoma nuclear de la célula de la planta. En aún otra modalidad de la invención, se proporciona una semilla de planta que comprende el vector de expresión de la planta descrito anteriormente. En todavía otra modalidad de la invención, se proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica a un antígeno de la superficie de la hepatitis B (HBsAg) . El polinucleótido está operablemente ligado a un promotor funcional de la planta; una secuencia incrementadora de la traducción; y una secuencia de terminación. El polinucleótido carece de una región no transcrita entre la secuencia de incremento de la traducción y la secuencia de codificación HBsAg. La secuencia de ácido nucleico que codifica al HBsAg puede comprender al menos, un codón alterado, en donde el codón alterado es un codón preferido de planta. El promotor funcional de la planta, se puede seleccionar del grupo que consiste del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 35S, tomate E8, ubiquitina, sintasa anopina, patatina y promotores de la sintasa de almidón ligados al granulo (GBSS por sus siglas en inglés). Ei promotor puede incluir una región incrementadora dual. La secuencia incrementadora de la traducción se puede seleccionar del grupo que consiste de incrementadores de la traducción omega del virus del grabado del tabaco (TEV por sus siglas en inglés) y el virus del mosaico del tabaco (TMV por sus siglas en inglés) . La secuencia de terminación se puede seleccionar del grupo que consiste de una proteína de almacenaje vegetativo ( vsp) , una sintasa nopalina ( nos) , o una secuencia de terminación 2 (pin2 ) -inhibidora de la proteinasa . Además, el polinucleótido puede carecer de una región no transcrita entre la secuencia que codifica a HBsAg y la secuencia de terminación. El polinucleótido puede además, comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica a una señal de retención microsomal operablemente ligada al extremo 3' de la secuencia codificante HBsAg. La señal de retención microsomal puede ser Ser-Glu-Lys-Asp-Glu-Leu (SEC ID NO : 4 ) . El polinucléotido puede carecer de una región no transcrita entre la señal de retención microsomal y la secuencia de terminación. El polinucleótido puede además, comprender de una secuencia de ácido nucleico que codifica a un polipéptido señal operablemente ligado al extremo 5' de la secuencia codificante HBsAg. El péptido señal puede seleccionarse del grupo que consiste- de un péptido señal aS de la proteína de almacenaje vegetativo (VSP) y un péptido señal aL VSP. Adicionalmente, el polinucleótido puede comprender una secuencia que codifica a HBsAg además de comprender una región pre-S. Opcionalmente, el polinucleótido puede comprender una secuencia codificante HBsAg la cual comprende la secuencia de ácido nucleico optimizada para la expresión en las plantas mostrada en la SEC ID NO : 3. El polinucleótido se puede seleccionar del grupo de polinucleótidos que consisten de HB104, HB105, HB106, HB107, HB111, HB114, HB115, HB116, HB1117, HB118, HB119, HB120, HB121, HB122, HB123, HB131, HB140.3, HB145, y HB165. En aún otra modalidad de la invención, se proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido como se describe anteriormente. El vector de expresión puede comprender un marcador seleccionable, un origen de replicación de E . coli , y/o un origen de replicación de Agroba c teri um t urne fasci ens . En. otra modalidad de la invención, se proporciona una célula E . col i transformada con el vector de expresión descrito anteriormente. Una partícula similar al virus se puede agrupar en la célula. En aún otra modalidad de la invención, una célula de Agroba c teri um es transformada con el vector de expresión descrito anteriormente. Una partícula similar al virus se puede agrupar en la célula. La célula de Agroba cteri um puede además, comprender un plásmido auxiliar Ti. En todavía otra modalidad de la invención, se proporciona una célula de planta transgénica que comprende el polinucleótido como se describe anteriormente. Una partícula similar al virus se puede agrupar en la célula. La célula de la planta puede ser seleccionada a partir del grupo que consiste de células de tomate, papa, plátano, y zanahoria. El vector de expresión de la planta puede ser integrado en el genoma nuclear de la célula de la planta. En aún otra modalidad de la invención una semilla de planta comprende el vector de expresión de la planta como se describe anteriormente. En todavía otra modalidad de la invención, se proporciona una composición inmunogenética que comprende cualquiera de las células de la planta descritas anteriormente. La célula de la planta puede presentarse en el tejido de la planta seleccionado del grupo que consiste de una fruta, hoja, tubérculo, órgano de planta, protoplasto de semilla, y callos. La composición inmunogenética puede comprender jugo o extracto de la célula de la planta. La composición inmunogenética también puede comprende un adyuvante. El adyuvante puede ser expresado como una proteína de fusión con un antígeno de la composición inmunogenética. En aún otra modalidad de la invención se proporciona un método para estimular una respuesta inmune en un mamífero. El método comprende el paso de administrar la composición descrita anteriormente a un humano o animal. Se estimula una respuesta inmune. La composición puede ser administrada oralmente. La administración puede comprender el consumo de la célula de la planta transgénica. El polipéptido puede ser administrado por una técnica seleccionada del grupo que consiste de intramuscular, oral, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, e intranasal. Opcionalmente puede ser administrado un adyuvante. El adyuvante puede ser seleccionado del grupo que consiste de la toxina del cólera (CT) , toxina inestable al calor de E. coli (LT) , anticuerpo anti idiopático 2F10, factor de colonización, toxina similar a shiga, e intimina. La respuesta inmune estimulada, puede ser selecciona del grupo de respuestas inmunes que consisten de humoral; mucosal; celular; humoral y mucosal; humoral y celular; mucosal y celular; y humoral, mucosal y celular. En otra modalidad de la invención se proporciona un método de aislamiento de un polipéptido HBsAg recombinante expresado en un material de la planta. El método comprende el sometimiento del material de la planta a un detergente que tiene una concentración mayor que 0.1% y menor que 0.5%. Se proporciona aún en otra modalidad de la invención una planta o una célula de planta transgénica. Cuando la planta o célula de la planta transgénica se consume como un producto en cuatro o menos alimentaciones, se estimula una respuesta inmune que comprende un anticuerpo de suero anti-HBsAg mayor de 50 lU/mL en un mamífero. La respuesta inmune puede ser una respuesta inmune primaria. La célula de la planta transgénica puede comprender cualquier célula de la planta descrita anteriormente . Todavía en otra modalidad de la invención, se proporciona una planta o célula de la planta transgénica que, cuando se consume como un producto en cuatro o menos alimentaciones, estimula una respuesta inmune de refuerzo anti-HBsAg que incrementa los niveles de anticuerpo anti-HBsAg en suero en al menos cuatro veces o a niveles mayores de 500 mlU/mL en un mamífero. La planta o célula de la planta transgénica puede comprender cualquier célula de la planta descrita anteriormente. Como se usa aquí, un "antígeno" es una macromolécula capaz de estimular una respuesta inmune en un humano o en un animal . Un "epitope" es una porción de un antígeno que comprende la parte particular del antígeno al cual se enlaza el anticuerpo.

Una "colonización o antígeno virulento" es un antígeno de un microorganismo patogénico que se asocia con la habilidad del microorganismo para colonizar o invadir su hospedero. Un "polinucleótido", "ácido nucleico" y similares es un polinucleótido que codifica a un polipéptido. El polinucleótido o ácido nucleico puede incluir intrónes, genes marcadores, secuencias de señal, elementos regulatorios, tal como promotores, mcrementadores y secuencias de terminación, y similares. Un primer polinucleótido no es "idéntico" a un segundo polinucleótido donde al menos un nucleótido, y hasta incluyendo 85% de identidad total del primer polinucleótido es diferente de aquel segundo polinucleótido. Un "vector de expresión" es un plásmido, tal como pBR322, pUC, o ColEl; un virus tal como un adenovirus, virus Sindbis, virus 40 de simio, vectores alfavirus, y citomegalovirus y vectores retrovirales, tal como el virus del sarcoma murina, virus del tumor mamario del ratón, virus de leucemia murina Moloney, y virus del sarcoma Rous. Se pueden usar vectores Bacterianos, tal como Salmonella spp., Yersi ni a ent erocol i ti ca , Shigella spp., Vibri o ch ol erae, Mycobacterium de cepa BCG, y Li s teri a monocytogenes . Los minicromosomas tales como MC y MCI, bacteriófagos, partículas de virus, partículas similares al virus, cos idos (plásmido en el cual se han insertado los sitio cos lambda del fago) y replicones (elementos genéticos que son capaces de la replicación bajo su propio control en una célula) también pueden ser usados como vectores de expresión. Preferiblemente, un vector de expresión es capaz de transformar células eucarióticas, que incluyen, por ejemplo tejido de planta. Un "producto alimentario" o "material de la planta comestible" y similares, es cualquier material de la planta que puede ser ingerido directamente por animales o humanos como una fuente nutricional o complemento de dieta. Un material de planta comestible que incluye una planta o cualquier material de una planta, obtenido de una planta, el cual es adecuado para la ingestión por un mamífero u otros animales, incluyendo humanos. Este término tiene como objetivo incluir material de la planta crudo que puede ser directamente dado como alimento a animales o material de la planta procesado que es dado como alimento a animales, que incluyen humanos.

Una "respuesta inmune" comprende la respuesta de un hospedero a un antígeno. Una respuesta inmune humoral comprende la producción de anticuerpos en respuesta a un antígeno o antígenos. Una respuesta inmune celular incluye respuestas tales como una respuesta a las células T auxiliares (CD4~) y una respuesta del linfocito de las células T citotóxico (CD8*) . Una respuesta inmune mucosal (o respuesta inmune secretoria) que comprende la producción de anticuerpos (slgA) secretorios. Una respuesta puede comprender una o unas combinaciones de estas respuestas. Un "agente inmunogénico" o "polipéptido inmunogénico" es un antígeno o antígenos capaces de estimular una respuesta inmune Preferiblemente, la respuesta inmune es estimulada en humano o animal después de una ingestión oral de un antígeno expresado eucarióticamente . Una "composición inmunogénica" contiene uno o más agentes inmunogénicos, opcionalmente en combinación con un portador, un adyuvante o similares. Una "proteína de fusión" es una proteína que contiene al menos 2, 3, 4, 5, 10, o más de las mismas o diferentes secuencias de aminoácido ligadas en un polipéptido en donde las secuencias no se expresan nativamente como una proteína única. La proteína de fusión puede producirse por técnicas de ingeniería genética bien conocidas .

Descripción de la Figuras La figura ÍA muestra diagramas de casetes de expresión de la presente invención. Las abreviaciones: 35S = promotor 35S del virus de mosaico de la coliflor; GBSS = promotor de sintasa de almidón enlazado al granulo específico para la actividad en tubérculos; TEV = virus del grabado del tabaco, O = secuencia líder no traducida omega del virus de mosaico del tabaco; NOS = sintasa de nopalina; VSP = proteína de almacenaje vegetativo; PIN2 = inhibidor de proteinasa 2; TPSS = secuencia de péptido señal de tránsito para la sub-unidad pequeña de rubisco. Las VSP aS y aL son péptidos señal con aL que incluyen una señal objetivo vacuolar putativa. La Fig. IB muestra un mapa de pHB131 y pHB140.3 con sitios indicados de endonucleasa de restricción seleccionados . La Fig. 2A muestra un mapa de restricción del plásmido pHB103. La Fig. 2B describe un mapa de restricción del plásmido pHB114. La Fig. 2C describe un mapa de restricción del plásmido pHB117.

La Fig. 3 muestra respuestas anticuerpo anti-HBsAg estimuladas en ratones, seguido por una alimentación oral con papas transgénicas HBsAg (5 g/ratón) más 10 µg de CT en los días 0, 10, 20 y se sometieron a prueba con rHBsAg derivado de levadura (Merck, Sharpe & Domme) 0.5 µg i.p. en el día 60. Un grupo de control recibe papas de control (5 g/ratón) más el mismo adyuvante y se sometió a prueba de recombinante al día 60. Ambos grupos experimentales y de control de ratones, se mantuvieron sin alimento durante la noche previa a la alimentación con papas. Un ratón individual se monitoreó para verificar si consumió la dosis completa. Los resultados se expresaron como OD 492:660 nm. Las Figs. 4A-E muestran los resultados de varios protocolos de inmunización en ratones alimentados con rebanadas de papas transgénicas. Ratones Balb/c alimentados con 5 g de papas recombinantes cubiertas con 10 µg de toxina de cólera (CT) tres veces en intervalos semanales dio picos de títulos de anticuerpos de 70-110 mlU/mL, los cuales podrán reforzar a los títulos de 1700-3400 mlU/mL por una dosis i.p. sub inmunogénica única de HBsAg purificado de levadura recombinante (Merck) (los títulos reales se refieren a los niveles de expresión de HBsAg en papa) . Los niveles de respuesta se refieren a dosis con papas que suministran 1.1 µg de HBsAg por gramo de papa (Fig. 4A) dando una respuesta prolongada menor e inferior que las papas que suministran 8.3 µg/g (Fig. 4B) . El mismo régimen de alimentación (8.3 µg/g) se encontró reforzando una dosis s.c única de HBsAg purificada de levadura recombinante para dar picos de títulos de anticuerpos de 1000 mlU/mL (Fig. 4C) .

Los tubérculos hervidos (5 min, a 100°C) dan una respuesta inmune no detectable (Fig. 4D) pero se observa un refuerzo significativo en la administración subsecuente de una dosis i.p. única de HBsAg purificado de levadura recombinante (Fig. 4E) . La Fig. 5 muestra una secuencia codificante optimizada de planta para el péptido pre-S (pre S1/S2) y la secuencia de aminoácido correspondiente. Para obtener la secuencia descrita, se examina la secuencia codificante del tipo silvestre para la pre-S y se encuentra una secuencia de terminación II de la polimerasa de RNA así como también doce sitios de metilación potencial "CG". La secuencia optimizada de la planta no contiene señales crípticas ni secuencias CG. La Fig. 6 muestra un mapa de plásmido de pHB117. La Fig. 7 muestra un mapa de plásmido de pHB118. La Fig. 8 muestra un mapa de plásmido de pHB119. La Fig. 9 muestra un mapa de plásmido de pHB120.

La Fig. 10 muestra un mapa de plásmido de pHB121. La Fig. 11 muestra un mapa de plásmido de pHB122. La Fig. 12 muestra un mapa de plásmido de pHB123. La Fig. 13 muestra una gráfica que demuestra que los gradientes de sucrosa de tubérculos HB114-16 producen partículas similares al virus. La Fig. 14 muestra un manchado western de un extracto de tubérculo HB114-6. La Fig. 15 muestra un manchado northern del tubérculo HB114-16 y ARN de hoja. La Fig. 16 muestra un gel de ADN genómico del HV114-16 sometido a PCR, el cual verifica la presencia del transgen. La Fig. 17 muestra un manchado Southern de HB114-6 que demuestra al menos cuatro inserciones de HB114. La. Fig. 18 muestra una gráfica que demuestra la estabilidad de tubérculos transformados de HBsAg almacenados por 9 meses. La Fig. 19 muestra un análisis de manchado western de células NTl transgénicas que expresan 3 diferentes formas de HBsAg. A: franja 1, rHBsAg de levadura 50 ng; franja 2, rHBsAg de levadura inmunoprecipitada (IP) 50 ng; franja 3, IP-HB 117-9; franja 4, IP-HB118-3; franja 5, IP-HB121-11; franja 6, NTl no transgénica IP (control negativo); franja 7, anti-HB de cabra. Cada muestra desnaturalizada a 50°C por 5 minutos. Los números a la izquierda de las fotos indican el tamaño de los estándares en kDa. B: franja 1, rHBsAg de levadura 50 ng; franja 2, rHBsAg de levadura inmunoprecipitada (IP) 50 ng; franja 3, IP-HB117-9; franja 4 IP-HB118-3; franja 5, IP-HB121-11; franja 6 NTl no transgénica IP (control negativo); franja 7, anti-HB de cabra. Cada estra desnaturalizada a 100°C por 20 minutos. La proteína soluble total y HBsAg para estas muestras fue: Línea No. Proteina soluble total (ug/ul) HBsAg (Proteína ng/mg) HB117-9 3.256 130.59 HB118-3 3.655 356.06 HB121-11 3.304 195.28 La Fig. 20 muestra un análisis de manchado western de células NTl transgénicas que expresan 6 diferentes formas de HBsAg. A: cada muestra desnaturalizada a 50°C por 5 minutos. Franja 1, rHBsAg 50 ng; franja 2, HB117-9 inmunoprecipitada (IP); franja 3, IP-HB118-3; franja 4, IP-HB119-5; franja 5, IP-HB121-11; franja 6, IP-HB122-8; franja 7, IP-HB123-1; franja 8, IP-MS-NT1 (control negativo) . Los números a la izquierda de las fotos indican el tamaño de los estándares en kDa. B: cada muestra desnaturalizada a 100°C por 20 minutos. Franja 1, rHBsAg 50 ng; franja 2, HB117-9 inmunoprecipitada (IP); franja 3, IP-HB118-3; franja- 4, IP-HB119-5; franja 5, IP-HB121-11; franja 6, IP-HB122-8, franja 7, IP-HB123-1; franja 8, IP-MS-NT1 (Control negativo) . La proteína soluble total (TSP) y HBsAg para estas muestras es: Línea No. Proteína soluble total (ug/ul) HBsAg (Proteína ng/mg) HB117-9 4.780 133.98 HB118-3 4.289 521.33 HB119-5 3.887 244.31 Línea No. Proteína soluble total (ug/ul) HBsAg (Proteína ng/mg) HB121-11 3.403 234.76 HB122-8 4.806 266.46 HB123-1 4.461 310.60 La Fig. 21 muestra constructos de HBsAg sintéticos de la invención. La Fig. 22 muestra una secuencia de nucleótido HBsAg de tipo silvestre (SEC ID NO: 1) y una secuencia de nucleótido HBsAg optimizado de planta (SEC ID NO : 3 ) . La Fig. 23 muestra una secuencia de aminoácido HBsAg de tipo silvestre (SEC ID NO: 2) y una secuencia de aminoácido HBsAg optimizada de planta (SEC ID NO: 40) .

Descripción Detallada de la Invención Polipéptidos Inmunogénicos de la Invención La invención comprende antígenos parasíticos, virales y bacterianos, capaces de estimular una respuesta inmune en un animal tal como un ratón, conejo, cobayo, pollo, ganso, pato, chimpancé, macaco, babuino o humano. Preferiblemente, la respuesta inmune se estimula en un mamífero . Los antígenos virales pueden ser derivados de virus tales como Ortomixovirus, tales como el virus de la influenza (antígenos de hemaglutinina y nucleoproteína, por ejemplo) ; Retrovirus, tales como RSV y SIV, Herpes virus, tal como EBV, CMV, o virus del herpes simple (por ejemplo, el antígeno timidina cinasa) ; Lentivirus, tal como VIH (por ejemplo, antígenos Nef, p24, gpl20, gp41, Tat, Rev, y Pol); Rhabdovirus, tal como rabia; Picornovirus, tal como poliovirus; Poxvirus, tal como vaccinia; Rotavirus; Parvovirus y Hepadnavirus, tal como el virus de la hepatitis B (por ejemplo, HBsAg) . Los antígenos bacterianos se pueden derivar de, por ejemplo, Mycobacterium spp., Helicobacter pylori, Salmonella spp., Shigella spp. (tal como el antígeno de la forma 1 Shigella sonnci), E. coli (tal como el antígeno CFA/fimbrial I y la toxina inestable al calor), Rickettsia spp., Listeria spp., Legi onella pneumoniae, Pseudomonas spp., Vibrio spp. (tal como el antígeno O o la toxina del cólera) , Borelli a burgdorferi , Bordetella pertussí s (tal como pertactina y ciclasa-hemolisina de adenilato), y Cl ostridi um tetani (tal como la toxina del tétanos) . Los antígenos parasíticos se pueden derivar de, por ejemplo Plasmidiu spp. (por ejemplo, antígenos de circumsporocito, antígenos de la superficie de merozoitos), Tripanosoma spp., Giardia spp., Boophilus spp., Babesia spp., Entamoeba spp. (tal como la lectina específica de galactosa), Eimeria spp., Leishmania spp. (tal como gp63), Schistosoma spp. (tal como isomerasa de triosa-fosfato) , Brugia spp. (tal como paramiosina) , Fascida spp., Dirofilaria spp., Wuchereria spp., y Onchocerea spp. En una modalidad preferida de la invención un polipéptido inmunogénico comprende un antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) . La secuencia de ácido nucleico de un HBsAg se muestra en la SEC ID NO: 1 (Fig. 22) y la secuencia de aminoácido de un HBsAg se muestra en la SEC ID NO: 2 (fig. 23) . Los epitopes HBsAg están contenidos en tres polipéptidos envueltos codificados por HBV y en sus formas glicosiladas respectivas. Los dos polipéptidos más pequeños (24,000 y 27,000 daltons) representan un polipéptido de 226 aminoácidos y la forma glicosilada del mismo polipéptido. Estos polipéptidos se codifican por la región S de la estructura lectora abierta S de HBV. Otras dos proteínas son un polipéptido de 281 aminoácidos de 33,000 daltons, que comprende 55 aminoácidos codificados por la región pre-S2 de HBV y 226 aminoácidos codificados por la región S, y la forma glicosilada del mismo polipéptido (36,000 daltons). Otras dos proteínas son un polipéptido (389-400 aminoácidos) de 39,000 daltons, que comprenden aproximadamente 119 aminoácidos de la región pre-Sl de HBV y las secuencias codificadas por las regiones pre-S2 y S, y una forma glicosilada del mismo polipéptido. Todas estas proteínas se encuentran en viriones infecciosos (con frecuencia se refieren como partículas Dañe) recuperados como esferas de 42 nm a partir del suero de pacientes infectados. Las muestras de suero también contienen partículas esféricas vacías con un promedio de 22 nm, las cuales contienen proteínas de clase S principalmente. Las líneas de células de mamífero transfectadas exclusivamente con ADN que codifica a la proteína S, liberan esferas vacías de 20 nm similares a aquéllas de las células infectadas. Además, las células de levadura transformadas con el mismo gen a partir de esferas análogas, son inmunogénicas como las esferas de 22 nm a partir de células infectadas. Los polipéptidos inmunogénicos de la invención comprenden al menos un epitope que es reconocido por un anticuerpo. Los epitopes dentro de los polipéptidos pueden ser identificados por varios métodos. Por ejemplo, un polipéptido de la invención puede ser aislado por métodos tales como purificación de inmunoafinidad usando un anticuerpo monoclonal para el polipéptido. La secuencia de polipéptido aislado puede ser entonces seleccionada. Una serie de polipéptidos cortos, los cuales abarcan toda la secuencia del polipéptido completo, se pueden preparar por división proteolítica. Al empezar con, por ejemplo, fragmentos de polipéptidos de 50 mer, cada fragmento puede ser probado por la presencia de epitopes reconocidos en, por ejemplo, un ensayo inmunosorbente ligado a la enzima anti-HBsAg (ELISA por sus siglas en inglés) . Progresivamente los fragmentos traslapantes y más pequeños pueden entonces ser probados de 50-mer identificados para formar el mapa del epitope de interés. Un polipéptido HBsAg de esta invención puede comprender un polipétido S y puede además comprender un polipéptido pre-Sl. Un polipéptido HBsAg de la invención puede además comprender un polipéptido pre-S2. Un HBsAg puede comprender cualquier combinación de polipéptidos S, pre-Sl, y pre-S2. Opcionalmente, un polipéptido HBsAg puede comprender más de un polipéptido S, Pre-Sl, o pre-S2. Los polipéptidos S, Pre-Sl, y pre-S2 pueden derivarse a partir del mismo o diferentes asilamientos de HBV. También, los polipéptidos S, Pre-Sl, y pre-S2 pueden prepararse como una proteína de fusión o como polipéptidos separados. Algunos epitopes dentro de las regiones pre-Sl y pre-S2 son efectivos en enlaces de hepatocitos y pueden ser neutralizados. Neurath et al, U.S. Pat. No. 4,847,080 y EU-Bl-0154902. Los residuos que abarcan las secuencias Pre-Sl, 1-21, 12-32, 21-47, 27-49, 32-53, 94-117, y 120-153 se han identificado como inmunogénicos. (Neurath et al. 1986). Similarmente, los residuos 120-145 que abarcan la secuencia pre-S2 se identifican como inmunogénicos. Por lo tanto, estos residuos se usan como polipéptidos inmunogénicos de acuerdo con la invención. Otros péptidos que involucran inserciones, supresiones o substituciones de una secuencia antes mencionada se puede también esperar que muestren inmunogenicidad, y síntesis de dichos mutantes por mutagénesis dirigida al sitio, están dentro de la habilidad del practicante (Maniatis, T. (1988) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory) . Se deberá apreciar que para efectuar la inmunogenicidad puede ser necesario conjugar un epitope a un portador, tal como KLH o un liposoma. No se conoce precisamente cómo los epitopes antes mencionados señalan una respuesta inmune, sin embargo, se afirma que el receptor IgA, el receptor IL-6, el receptor asiloglicoproteina, y GAPD pueden estar involucrados. Un polipéptido preferido de la invención comprende un péptido de 15 aminoácidos, así como un péptido de 8 residuos inclusivo, el cual es homólogo parcialmente al determinante "a" del grupo específico de HBsAg. Este péptido, el cual tiene la secuencia AVYYCTRGYHGSSLY (SEC ID NO: 6), según se dice tiene propiedades antigénicas similares al determinante "a" del grupo específico, y puede duplicar las actividades estimuladoras de célula B y T de anticuerpos anti-idiotípicos 2F10 y HBsAg (ver, por ejemplo, las Patentes estadounidenses Nos. 5,744,153; 5,531,990; 5,668,253 por Thanavala, Y. et al.). En consecuencia, este péptido, y variantes del mismo, puede ser un polipéptido inmunogénico de HBsAg como se discute aquí, y un polinucleótido que codifica tal péptido se contempla dentro de la presente invención. El polipéptido puede servir como un mismo adyuvante, similarmente al anticuerpo 2F10, cuando se administra con otro HBsAg o un polipéptido inmunogénico de la invención. Algunos de los polipéptidos de la invención difieren de los polipéptidos obtenidos previamente en virtud de varias de las señales de retención y líderes, empleadas para seleccionar el tipo de proteína. Por ejemplo, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácido HBsAg covalentemente ligada a la secuencia Ser-Glu-Lys-Asp-Glu-Leu C-terminal (de la SEC ID NO: 4), con la última secuencia, que se cree señalar la proteína al ER. Los polipéptidos de la presente invención en algunos ejemplos, pueden también diferir de proteínas previas en virtud de que tienen diferentes modelos de glicosilación, los cuales pueden ser un resultado de su tiempo de retención en el ER o en las diferentes enzimas de glicosilación que pueden estar presentes en el ER. En consecuencia, los polipéptidos inmunogénicos obtenidos pueden variar en cierto modo en sus propiedades inmunogénicas de proteínas previas. Sin embargo, siempre y cuando tales inmunógenos compartan un número suficiente de epitopes, con aquéllos del polipéptido inmunogénico nativo, se puede montar una respuesta que es suficientemente reactivo cruzada con el antígeno.

Preferiblemente, un polipéptido HBsAg de la invención es capaz de formar partículas similares al virus (VLPs) . Aún más preferiblemente un polipéptido HBsAg de la invención es capaz de formar VLPs cuando se produce por una célula de planta. En una modalidad preferida de la invención un polipéptido HBsAg es capaz de formar monómeros de enlace cruzado vía puentes de disuifuro. El HBsAg altamente reticulado puede ser más estable y más inmunogénico. Véase ejemplo 12. Ocurren varias cepas y aislados de hepatitis y otros organismos que proporcionan los antígenos de la invención, y los polipéptidos de cualquiera de estas cepas y aislados pueden ser usados en la presente invención. Los polipéptidos inmunogénicos de la invención, tal como HBsAg, pueden ser ya sea polipéptidos de longitud completa, fragmentos de polipéptidos, o segmentos truncados de polipéptidos. Por ejemplo, los fragmentos de polipéptidos inmunogénicos pueden comprender al menos 6, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, o 350, 400, 500, 750, 1000, o 1500 aminoácidos o más de los polipéptidos inmunogénicos. La invención además comprende una mutación o mutaciones, es decir, substituciones de aminoácido, adiciones, supresiones, truncaciones, o combinaciones de las mismas, en un poiipéptido inmunogénico. Un polipéptido inmunogénico de la invención puede ser combinado o sintetizado con otro polipéptido inmunogénico truncado, un fragmento de otro polipéptido inmunogénico, o un polipéptido inmunogénico de longitud completa. Por ejemplo un fragmento de un polipéptido inmunogénico puede comprender al menos 6, 10, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 4000, 500 o 1000 aminoácidos de un polipéptido inmunogénico. Los dos polipéptidos inmunogénicos pueden ser de la misma o diferentes cepas. Además, se pueden combinar uno o más (es decir, 2, 3, 4, 5, 10, 25 o 50) polipéptidos inmunogénicos de la invención, de la misma o diferentes cepas. Preferiblemente, un polipéptido de la invención se produce recombinantemente. Un polinucleótido que codifica a un polipéptido de la invención puede introducirse en un vector de expresión el cual puede ser expresado en un sistema de expresión adecuado usando técnicas bien conocidas en el arte. Una variedad de sistemas de expresión bacterianos, de levaduras, plantas, mamíferos, y de insectos está disponible en la técnica y se puede usar cualquier sistema de expresión. Un polipéptido de la invención puede ser aislado y purificado de por ejemplo, una célula eucariótica, tal como una célula de la planta, por métodos bien conocidos en la técnica tal como purificación de inmunoafinidad. Opcionalmente, un polinucleótido que codifica a un polipéptido de la invención puede ser traducido en un sistema de traducción libre de célula. Si se desea, un polipéptido de la invención se puede producir como una proteína de fusión, la cual puede también contener otras secuencias de aminoácidos, tales como secuencias de señal o enlazadoras de aminoácidos, así como también ligandos usados en la purificación de proteínas, tales como transferasa-S-glutationa, residuos de histidina, y proteína A de estafilococos. Opcionalmente, uno o más antígenos tal como HBsAg, antígenos de colonización, antígenos virulentos, y epitopes del mismo, y otras composiciones usadas para la estimulación de una respuesta inmune en un animal o humano, se pueden presentar en una proteína de fusión. Más de un polipéptido inmunogénico, tal como HBsAg se pueden presentar en una proteína de fusión. Si se desea, varias combinaciones de, por ejemplo polipéptidos de HBsAg de diferentes cepas o asiladas de hepatitis, se puede incluir en una proteína de fusión.

Polinucleótidos que codifican Polipéptidos Inmunogénicos Los polinucleótidos de la invención contienen menos de un genoma bacteriano, viral, o protozoario completo y pueden ser ADN de hebra sencilla o doble. Preferiblemente, los polinucleótidos son purificados, libres de otros componentes, tales como proteínas. Los polinucleótidos codifican al polipéptido inmunogénico descrito anteriormente. Los polinucleótidos de la invención se pueden aislar de una biblioteca genómica derivada de secuencias de ácido nucleico presentes en, por ejemplo, cultivos celulares bacterianos, virus, o protozoarios. Preferiblemente, un polinucleótido se aisla de secuencias de ácido nucleico presentes en, por ejemplo, el plasma, suero, o hígado de un individuo infectado con HBV o un cultivo de células infectadas con HBV. Un método de amplificación tal como PCR puede ser usado para amplificar polinucleótidos a partir de cada ARN o ADNc genómico bacteriano, de virus o protozoario que codifica a un polipéptido inmunogénico. Los polinucleótidos pueden también ser sintetizados en el laboratorio, por ejemplo, usando un sintetizador automático. Si se desea, los polinucleótidos pueden ser clonados en un vector de expresión y transformados en, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, insecto, planta, o mamífero así N que los polipéptidos de la invención pueden ser expresados y aislados de cultivo celulares. Los polinucleótidos pueden comprender secuencias codificantes para polipéptidos inmunogénicos que se originan naturalmente o pueden codificar polipéptidos inmunogénicos alterados, los cuales no se originan naturalmente. Una mutación o mutaciones en un polinucleótido inmunogénico se puede hacer por mutagénesis dirigidas al sitio, usando técnicas convencionales. Una biblioteca de polinucleótidos mutantes que comprende mutaciones únicas, dobles o superiores, puede también prepararse usando técnicas de mutagénesis aleatorias. Las técnicas de mutagénesis se describen de manera general, por ejemplo, en Current Protocol s in Mol ecular Bi ol ogy, Ausubel, F. et al , eds., John Wiley (1988), y mutagénesis aleatoria (se refiere también como "ADN pesado") es el tema de las Patentes Estadounidenses Nos. 5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252, y 5,837,458 por Stemmer et al . Un polinucleótido que comprende mutaciones de un polipéptido inmunogénico se puede también sintetizar en un laboratorio. Preferiblemente, un polinucleótido inmunogénico de la invención es diseñado genéticamente, de manera tal que los codones bacterianos son reemplazados sistemáticamente por codones preferidos de plantas. Por ejemplo, la secuencia codificante de un HBsAg, o una porción de la misma, se puede analizar por el uso del codón. Este uso de codón puede entonces compararse con la frecuencia de uso del codón en proteínas abundantes encontradas en una planta particular. Véase, por ejemplo, WO 96/12801. Los codones de un polinucleótido, los cuales tienen frecuencia cero o baja de uso en una planta, se pueden modificar mediante, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o un polinucleótido puede ser sintetizado en el laboratorio. Las modificaciones de codón se hacen para conformar los codones de la planta usados en los genes para las proteínas de la planta expresadas abundantemente. Además, los segmentos de codones con posibles secuencias de señal poli-A pueden ser modificadas a otros codones para los mismos aminoácidos.

Además, las secuencias de señal críptica, sitios de unión de intrones, y sitios de metilación potencial se pueden modificar. Véase WO 96/12801; de la SEC ID NO: 3 (Fig.22) (que muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica a HBsAg que ha sido optimizado para la expresión en plantas) . El reemplazo o substitución de los codones preferidos de plantas para los codones virales, bacterianos, o preferidos de protozoarios correspondientes, puede incrementar la expresión de los polipéptidos inmunogénicos y puede facilitar la expresión del polipéptido o polipéptidos codificados en una parte particular, es decir, el fruto o tubérculo, de una planta. Se dice que una secuencia polinucleótida inmunogénica, tal como HBsAg, la cual tiene al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, o más codones modificados a los codones preferidos de la planta, está optimizada a la planta. Preferiblemente, la optimización a la planta además comprende modificaciones de codones que codifican posibles secuencias de señal, sitios de unión del intrón, y sitios de metilación. Preferiblemente, un polinucleótido de la invención que codifica a un polipéptido inmunogénico, tal como HBsAg, está operablemente ligado a un promotor funcional de la planta. Como se usa aquí "operablemente ligado" se refiere a la secuencia codificante para un polipéptido inmunogénico, siendo fusionada en estructura para un promotor, incrementador de la transcripción o traducción, secuencia de terminación, y similares, así que las secuencias codificantes respectivas se traducen o se transcriben exactamente. En consecuencia, las secuencias de nucleótido respectivas no necesitan ser fusionadas en forma contigua, es decir, covalentemente, a secuencias definidas adyacentes, pero se pueden proporcionar con adaptadores sintéticos, enlazadores y similares, para facilitar el agrupamiento del constructo y los vectores de expresión. Un promotor puede ser un promotor constitutivo, según el cual la expresión de un polipéptido inmunogénico continuamente ocurre dentro de la célula. Alternativamente, un promotor puede ser inducible según el cual un agente de inducción química o un agente específico del tejido activa al promotor, tal como después que la planta alcanza una etapa deseada de diferenciación. Los promotores inducibles pueden comprender cualquier promotor capaz de incrementar la cantidad del producto de polinucleótido producido por un polinucleótido dado en respuesta a la exposición de un inductor. Los promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a un promotor por choque térmico, un sistema glucocorticoide, heridas inducibles, esteroide inducible, deficiencia de fosfato inducible, y cualquier promotor químicamente inducible, que incluyen, pero no se limita a tetraciclina, etileno, cobre, ácido salicílico, y benz-1, 2, 3-tiadiazol . Véanse, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 5,942,662, 5,977,441, 5,684,239, y 5, 922,564.

Un promotor de la planta preferido es el CaMV 35S, que contiene una región incrementadora dual. Este promotor, es un promotor constitutivo y es efectivo en causar la expresión en hojas y tubérculos. Otros promotores preferidos, incluyen patatina, mas, tomate E8 (Giovanni et al , Plant Cell, 1:53-63 (1989)), ubiquitina (Quail et al . Patente Estadounidense No. 5,510,474), sintasa de manopina (Ellis et al . , Mol Gen. Genet. 195: 466-473 (1984)), sintasa de nopalina (Ebert et al . , PNAS, 84:5745-5749 (1987)), virus del mosaico en mosto de higo (FMV por sus siglas en inglés) (Rogers, Patente Estadounidense No. 5,378,619), sintasa de sacarosa (Yang et al . , PNAS, 87:4144-4148 (1990)), actina (Wang et al . , Mol Cell . Bi ol . , 12:3399-3406 (1992)), liasa de isocitrato (Harada et al. Patente Estadounidense No. 5,689,040), y promotores de la sintasa de almidón ligada al granulo (GBSS) . Preferiblemente, el promotor incluye un incrementador dual (o doble) . Véase Artzen, Patente Estadounidense No. 5,914,123; Lam, Patente Estadounidense 5,612,487; y Maiti, Patente Estadounidense No. 5,994,521. Algunos promotores funcionales de planta ejemplares, los cuales pueden ser usados para expresar un gen estructural de la presente invención, están entre los siguientes: Patente Estadounidense No. 5,352,605 y la Patente Estadounidense No. 5,530,196 - CaMV 35S y promotores 19S; la Patente Estadounidense NO. 5,436,393 - promotor de patatina; Patente Estadounidense No. 5,436,393 - secuencia del promotor B33 de un gen de patatina derivado de Sol anum tuberosum, y los cuales conducen a una expresión específica de tubérculo de la secuencia fusionada al promotor B33; WO 94/24298 - promotor E8 de tomate; Patente Estadounidense No. 5,556,653 - promotores de la fruta del. tomate; Patente Estadounidense No. 5,614,399 y 5,510,474 - sistema del promotor de ubiquitina en la planta; Patente Estadounidense No. 5,824,865 - elementos regulatorios 5' cis de la expresión del gen responsable del ácido abscísico; Patente Estadounidense No. 5,824,857 - promotor del badnavirus, virus baciliforme de tungro del arroz (RTBV por sus siglas en inglés); Patente Estadounidense No. 5,789,214 - fragmento de promotor inducible químicamente de la región 5' de flanqueo adyacente a la región codificante de un gen de tabaco PR-la; Patente Estadounidense NO. 5,783,394 promotor drul de frambuesa; WO 98/31812 genes y promotores de fresa; Patente Estadounidense No. 5,773,697 - promotor de napina, promotor de faseolina, y promotor DC3; Patente Estadounidense No. 5,723,765 - promotor LEA; Patente Estadounidense No. 5,723,757- región reguladora transcripcional al 5' de la expresión especifica del órgano sumergido; Patente Estadounidense No. 5,723,751 - porciones de secuencia relacionada con el cuadro G, específicamente con porciones de PA y Iwt, las cuales funcionan como cis-elementos de los promotores, para regular la expresión de genes heterólogos en plantas transgénicas; Patente Estadounidense No. 5,633,440 - promotores P 119 y su uso; Patente Estadounidense No. 5,608,144 - secuencias de promotores de la planta grupo 2 (Gp2); Patente Estadounidense No. 5,608,143 - fragmentos de promotores del ácido nucleico derivados de varios genes de maíz, petunia y tabaco; Patente estadounidense No. 5,391,725 - secuencias del promotor del gen nuclear para la sintetasa de glutamina GS2 de cloroplastos y de dos genes nucleares para la sintetasa de la glutamina citosólica GS3 en la planta del guisante o haba, Pi si um sa ti vum; Patente Estadounidense No. 5,378,619 - promotor de transcripción de longitud completa del virus de mosaico del mosto de higo (FMV); Patente Estadounidense No. 5,689,040 - promotor de liasa de isocitrato; Patente Estadounidense No. 5,633,438 - elemento regulador específico de la microespora; Patente Estadounidense No. 5,595,896 - expresión de genes heterólogos en células de plantas y plantas transgénicas usando promotores de la sintetasa asparagínica; Patente Estadounidense No. 4,771,002 - región promotora que acciona la expresión de un transcripto TR de 1450 bases en tumores de agallas de corona de tipo octopina; Patente Estadounidense No. 4,962,028 - secuencias promotoras del gen de la subunidad pequeña de carboxilasa de ribulosa-1, 5-bisfosfato; Patente Estadounidense No. 5,491,288 - promotor de histona H4 de Arabidopsi s; Patente Estadounidense No. 5,767,363 - promotor de la planta específico de la semilla; Patente Estadounidense No. 5,023,179 - elemento promotor 21 bp el cual es capaz de impartir la capacidad de expresión de la raíz a un promotor rbcS-3A, normalmente un promotor específico del tejido verde; Patente estadounidense No. 5,792,925 - promotores de la transcripción preferencial del tejido de secuencias de ADN asociadas en plantas, particularmente en la raíz; Patente Estadounidense No. 5,689,053 - promotor de poligalacturonasa en Brassi ca sp . ; Patente Estadounidense No. 5,824,863 - región promotora críptica especifica de la cubierta de la semilla; Patente estadounidense No. 5,689,044 - fragmento del promotor del ácido nucleico inducible químicamente aislado del gen de tabaco PR-la, inducible por la aplicación de un compuesto de ácido isonicotínico, benzo-1, 2, 3-tiadiazol, o un compuesto de ácido salicílico; Patente estadounidense No. 5,654,414 - fragmentos de promotores aislados de un gen quitinasa/lisozima de pepino que es inducible por aplicación de benzo-1, 2, 3-tiadiazol; Patente Estadounidense No. 5,824,872 - promotor constitutivo de tabaco que dirige la expresión en al menos, tejidos de ovario, flor, embrión inmaduro, embrión maduro, semilla, tallo, hoja y de la raíz; Patente Estadounidense No. 5,223,419 - alteración de la expresión del gen en la planta; Patente Estadounidense No. 5,290,924 - promotor reco binante para la expresión del gen en plantas monocotiledóneas; WO 95/21248- método para usar TMV para sobreproducir péptidos y proteínas; WO98/05199 -ácido nucleico que comprende promotor específico de meristemo del retoño y secuencias reguladas; EP-B-0122791 -promotor de faseolina y gen estructural; Patente Estadounidense No. 5,097,025 - promotores de la planta (sub dominio de CaMV 35S) ; W094/24294 - uso de promotores derivados de E8 del tomate para expresar genes heterólogos, por ejemplo, hidrolasa de 5-adenosilmetionina en fruta madura; Patente Estadounidense No. 5,801,027 - método para usar las proteínas de transactivación para controlar la expresión del gen en plantas transgénicas; Patente estadounidense No. 5,821,398 - moléculas de ADN que codifican promotores de planta inducibles y enzima Adh2 de tomate; WO 97/47756 - promotor del núcleo de la planta sintética y elemento regulatorio corriente arriba; Patente Estadounidense No. 5,684,239 - monocotiledónea que tiene un promotor inducible de lesiones de dicotiledóneas; Patente Estadounidense No. 5,110,732 - expresión del gen selectivo en planta; Patente Estadounidense No. 5,106,139 - promotor de sintasa manopina de CaMV 35S incrementado y método para usar el mismo; Patente Estadounidense No. 5,420,034 regulación de la transcripción específica de la semilla; Patente Estadounidense No. 5,623,067 - región promotora específica de la semilla; Patente Estadounidense No. 5,139,954 - fragmentos promotores de ADN de la planta del trigo; WO 95/14098 - regiones regulatorias quiméricas y cásete del gen para usarse en plantas; WO 90/13658 producción de los productos del gen a niveles altos; Patente Estadounidense No. 5,670,349 - sistema de expresión del promotor HMG y producción post-cosecha de productos del gen en plantas y cultivos de células de plantas; Patente estadounidense No. 5,712,112 - sistema de expresión del gen que comprende la región del promotor de los genes alfa amilasa en plantas.

Un polinucleótido preferido comprende una región no traducida (UTR por sus siglas en inglés) (omega) , transcrita al 5' del virus del mosaico del tabaco (TMV) (Gallie et al. Nucleic Acids Res 20: 4631-4638 (1992)) o una región no traducida, transcrita al 5' del virus del grabado del tabaco (TEV) (Carrington, et al., J. Virol. 64:1590-1597 (1990)) o fragmentos de las mismas, entre el promotor y una secuencia de polinucleótido que codifica a un polipéptido inmunogénico. Una UTR transcrita al 5' del TMV facilita la traducción de la secuencia codificada. Un polinucleótido puede además comprender una UTR transcrita al 3' del TMV o fragmentos de la misma, la cual puede además facilitar la traducción. Zeyenko et al., FEBS Lett. 354:271-273 (1994); Leathers et al . , Mol. Cell. Biol. 13:5331-5347 (1993); Gallie et al . , Nucí. Acids Res. 20:4631-4638 (1992)). Preferiblemente, un vector de expresión comprende uno o más incrementadores. Algunos incrementadores que pueden ser usados con la presente invención, están entre los siguientes: Patente Estadounidense No. 5,424,200 y la Patente Estadounidense No. 5,196,525 - secuencias incrementadoras CaMV 35S; Patente Estadounidense No. 5,359,142, Patente Estadounidense No. 5,322,938, Patente Estadounidense No .5, 164, 316, y la Patente Estadounidense No. 5,424,200 - incrementadores CaMV 35S duplicados uno tras otro; WO 87/07664 - región O' de TMV; WO 98/14604 - intrón 1 y/o intrón 2 del gen PATI; los intrónes HSP70 de la U.S. 5,593,874 que cuando se presentan en un líder no traducido de un gen quimérico, incrementan la expresión en plantas; Patente Estadounidense No. 5,710,267, Patente Estadounidense No. 5,573,932, y la Patente Estadounidense No. 5,837,849 -elemento incrementador de planta capaz de ser enlazado por un factor de transcripción OCS; Patente No. 5,290,924 - un intrón Adh 1 de maíz; la JP 8256777 - secuencia incrementadora de la traducción. Un polipéptido de la presente invención puede también incluir una secuencia de terminación de la transcripción funcional en una planta hospedera. Las secuencias de terminación ejemplares incluyen sintasa de nopalina ( nos) (Bevan, Nucleic Acids Res., 12:8711-8721 (1984)), proteína de almacenaje vegetativo (vsp) (Masón et al . , Plant Cell. 5:241-251 (1993)) y secuencias de 2 (pin2) terminación- inhibidoras de la proteinasa (An et al . Plant Cell. 1:115-122 (1989)). Estas secuencias se transcriben, pero no se traducen. Un polinucleótido de la invención puede también codificar una secuencia de señal de retención microsomal, tal como SEKDEL (Ser-Glu-Lys-Asp-Glu-Leu) (SEC ID. N0.4)o KDEL (SEC ID No. 22), para incrementar la retención del polipéptido expresado en la célula. Por ejemplo, la concentración del complejo de antígeno HBsAg se puede obtener al proporcionar al polipéptido naciente una señal de retención microsomal, ia cual señala que la proteína será reciclada en el retículo endoplasmático (ER) u otro organelo. La secuencia de señal de retención microsomal puede estar operablemente ligada al extremo 3' del polipéptido inmunogénico. Preferiblemente, el polipéptido carece de una región no traducida entre la señal de retención microsomal y la secuencia de terminación. La señal puede separarse del polipéptido inmunogénico mediante, por ejemplo, una región de pivoteo. Además, un polinucleótido de la invención puede comprender un polipéptido señal operablemente ligado al extremo 5' del polipéptido inmunogénico. Los polipéptidos de señal incluyen, por ejemplo, un péptido señal aS de la proteína de almacenaje vegetativo (VSP) o un péptido señal aL VSP. Masón et al . , Plant Mol. Biol. 11:845-856 (1988). Un péptido señal sirve para seleccionar un tipo de proteína a lo largo de una trayectoria predefinida tal como para el ER o las vesículas de almacenaje putativo en la célula. Así, un péptido señal permite de este modo la acumulación y/o procesamientos adicionales de un polipéptido a un sitio objetivo. Un péptido señal puede ser físicamente separado de un polipéptido inmunogénico que codifica a la secuencia por una región de pivoteo. En una modalidad preferida, un polinucleótido de la invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica a un polipéptido inmunogénico, tal como HBsAg operablemente ligado a un promotor funcional de la planta, una secuencia incrementadora de la traducción, y una secuencia de terminación. Aún más preferiblemente, un polinucleótido de la invención carece de una región no transcrita entre la secuencia de incremento de la traducción y la secuencia que codifica al polipéptido inmunogénico. Esto es, una polimerasa de ARN que transcribe la secuencia de incremento de la traducción no termina la transcripción, pero continúa para transcribir la secuencia que codifica al polipéptido inmunogénico. Aún más preferiblemente, el polinucleótido carece de una región no transcrita entre la secuencia del polipéptido inmunogénico y la secuencia de terminación . Preferiblemente, un polinucleótido de la invención comprende un virus nativo derivado de (o tipo silvestre) la secuencia de nucleótido que codifica al HBsAg mostrada en la SEC ID N0:1. La secuencia de aminoácido HBsAg correspondiente se muestra en la SEC ID NO: 2. Una secuencia que codifica al HBsAg se puede sintetizar directamente por el agrupamiento de oligoméricos sintéticos, o se puede derivar de una genoteca de ADNc, el plásmido que lleva la secuencia, u otro vector, tal como se discute aquí posteriormente . Alternativamente, un polinucleótido de la invención puede comprender una versión sintética de la secuencia que codifica al HBsAg, la cual incorpora una o más inserciones, supresiones, o mutaciones diseñadas para mejorar la eficiencia de transformación, transcripción, o traducción en un sistema de expresión eucariótico, por ejemplo, una célula de la planta. Una secuencia sintética que codifica a la proteína HBsAg se muestra en la SEC ID NO: 3 (Fig. 22); la secuencia de aminoácido correspondiente se muestra en la SEC ID NO: 40 (Fig. 23) Otra secuencia que se adapta para la expresión en plantas, la cual codifica al péptido pre-S, se muestra en la Fig. 5 (SEC ID NO: 5) . Las secuencias de nucleótidos que tienen un grado alto de homología para estas secuencias de HBsAg también se contemplan. Preferiblemente, la secuencia de aminoácido codificada permanece substancialmente o totalmente sin cambio. En particular, se contemplan las secuencias de al menos 80%, más preferiblemente 90%, homologas con un polinucleótido de HBsAg. En el cálculo del porcentaje de homología, se determina el porcentaje de pares de bases idénticos con referencia a un polinucleótido, tomando en cuenta cualquier ocurrencia de inserciones, supresiones o substituciones en la secuencia de ácido nucleico. Además, la invención contempla polinucleótidos que codifican epitopes de un polipéptido de HBsAg esencial para la generación de una respuesta inmune. En consecuencia, la C-terminal o N-terminal o cualquier otro fragmento de la proteína HBsAg que comprende un epitope se contempla dentro de la invención. Dichos fragmentos pueden ser codificados en un polinucleótido de la invención como una secuencia simple repetida. Los fragmentos pueden ser de al menos 12, 15, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 750, o 1000 ácidos nucleicos de longitud. Se prefieren particularmente los polinucleótidos de la invención que incluyen aquéllos designados aquí como HB103, HB104, HB105, HB106, HB107, HB111, HB114, HB115, HB116, HB117, HB118, HB119, HB120, HB121, HB122, HB123, HB145, y HB165, HB131 y HB140.3, los cuales contienen varias combinaciones de las características estructurales anteriormente mencionadas. Los casetes de expresión relevantes de estos plásmidos se muestran en las Figs, ÍA y IB. Más preferido es el constructo HB114 el cual usa un promotor 35S y un incrementador de la traducción TEV, así como también, una secuencia de terminación 2 (pin2) del inhibidor de la proteinasa. El gen de resistencia a la canamicina se usa como un marcador seleccionable en este plásmido. El vector se deriva de un vector binario en A. t umefaci ens, tal como pBINI9 (Bevan 1984) o (pGPTV-KAN) (Becker et al . Plant Mol. Biol. 20:1195-1197 (1992)). El promotor 35S es "constitutivo" y tiene un incrementador dual (Masón et aJ . 1992) . Preferiblemente, el polinucleótido de la invención comprende un cásete de expresión. Esto es, el polinucleótido está operablemente ligado a un promotor. Opcionalmente, una secuencia incrementadora de la traducción, y/o una secuencia del polinucleótido de terminación, pueden incluirse en un cásete de expresión. Otros poiinucleótidos pueden también estar presentes en un cásete de expresión, tal como una secuencia de señal. En un cásete de expresión preferido de la invención un polinucleótido que codifica a una planta optimizada o al polinucleótido inmunogénico de tipo silvestre tal como la HBsAg, está operablemente ligado a un promotor funcional de la planta, tal como CaMV 35S o tomate E8. Además, un cásete puede comprender un incrementador de la traducción Omega del virus del grabado del tabaco (TEV) o del virus del mosaico del tabaco (TMV), el cual es transcrito, pero no traducido. Un cásete puede también comprender una región no traducida, transcrita al 3', como la sintasa de no.palina ( nos) , una proteína de almacenaje vegetativo ( vsp) , o un inhibidor de proteinasa tal como pin2. Un cásete de expresión puede carecer de una región no traducida entre la secuencia de incremento de la traducción y la secuencia que codifica al polipéptido inmunogénico y/o entre la región no traducida, transcrita al 3'. (Masón, 1992). Los casetes de expresión de la invención pueden ser diseñados para comprender promotores que dirigen la expresión de polipéptidos en partes particulares de la planta. Por ejemplo, los casetes de expresión que incluyen el promotor CaVM 35S y un polinucleótido de la invención se pueden usar para transformar constitutivamente plantas, de manera que un polipéptido expresado por un polinucleótido de la invención se produce en las hojas de la planta. Esto permite el rápido análisis de la expresión del polinucleótido y la caracterización bioquímica de los productos de polinucleótidos. Los casetes de expresión que comprenden un promotor de albúmina 2S y un polinucleótido de la invención pueden ser usados para causar la expresión del polinucleótido específico de semilla para crear la producción de un polipéptido de la invención en tejidos de semillas, por ejemplo semillas de cañóla ( Brassi ca napus ) . Los casettes de expresión que comprenden un promotor de patatina o un promotor vspB de soya y un polinucleótido de la invención se pueden usar para causar una expresión de polinucleótido específico del tubérculo y una producción específica de tubérculo de un polipéptido en tejidos de tubérculos tal como papa (Solanum t uberosum) . Los casettes de expresión que comprenden promotores específicos de frutas maduras y polinucleótidos de la invención se pueden usar para transformar plantas que producen un polipéptido de la invención en frutas maduras, tal como el plátano (Musa acumina ta) .

Vectores de Expresión Si se desea, un polinucleótido o un casette de expresión que comprende polinucleótidos de la invención se pueden clonar en un vector de expresión y transformarse en, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, insecto, planta o de mamíferos de tal forma que los polipéptidos de la invención se puedan expresar y aislar de un cultivo de células. Los polinucleótidos pueden estar contenidos dentro de un plásmido, tal como pBR322, pUC, o ColEl, o un vector de adenovirus, tal como un vector de adenovirus Tipo 2 o un vector Tipo 5. Opcionalmente otros vectores se pueden usar, incluyendo pero no limitados al virus Sindbis, virus 40 de simio, vectores alfavirus y vectores retrovirales y citomegalovirus, tal como el virus de sarcoma murino, virus del tumor de mama de ratón, virus de leucemia murino Moloney y virus del sarcoma de Rous. Se pueden usar vectores bacterianos, tales como la Salmonella ssp., Yersinia enterocoli ti ca , Shigella spp., Vibri o chol erae, cepas de Micobacterias BCG, Li steria monocytogenes y Agrobacteri um spp. Se pueden usar también minicromosomas tales como MC y MCI, bacteriófagos, partículas de virus, partículas similares al virus, cósmidos (plásmidos en los cuales se han insertado sitios cos lambda de fagos) y replicones (elementos genéticos que son capaces de replicarse bajo su propio control en una célula) .

Preferiblemente, un vector de expresión comprende un marcador elegible en adición a un polinucleótido de la invención. Ejemplos de marcadores elegibles incluyen un gen de canamicina, un gen ß-glucuronidasa, un gen de transferasa de neomicina, un gen t-fdA, un gen Pat, un gen hyg, un gen DHFR resistente al metotrexato, un gen de deshalogenasa y un gen bar . Un vector de expresión puede comprender también un origen de replicación de E. coli , por ejemplo el origen de replicación ColEl o pBR322, para facilitar la replicación del vector en E. coli . Un vector de expresión de la invención puede comprender también un origen de replicación de A. tumefaci ens, para permitir la replicación del vector en este, tal como cuando A. t umefaci ens se usa para la transformación de plantas. El silenciamiento del gen puede afectar el nivel de expresión de un polinucleótido de la invención. Hay dos clases diferentes de silenciamiento del gen: silenciamiento del gen transcripcional (TGS por sus siglas en inglés) y silenciamiento del gen post-transcripcional (TPGS por sus siglas en inglés). Vaucheret et al . , Plant J. 16:651-9. Un tipo de TGS es la inactivación cis en la cual el locus o sitio de ADN que es metilado afecta el ADN conectado a este. En las plantas, la metilación puede extenderse de las secuencias adyacentes en los transgenes y causan el silenciamiento de gen. Proís y Meyer, Plant J. 2:463-75 (1992) . Una secuencia optimizada de planta tendrá un reducido número de sitios o sin sitios sobre los cuales puede ocurrir la metilación, de esta forma, este tipo de silenciamiento de gen se puede minimizar por el uso de una secuencia optimizada de planta para la proteína transgénica. Otro tipo de inactivación ci s ocurre con copias múltiples de la misma secuencia nucleótida integrada en un locus o sitio. De nuevo, el mecanismo de silenciamiento parece incluir la metilación (Ye y Signer, PNAS USA 93:10881-6 (1996). Una secuencia optimizada de planta sin sitios de metilación potencial puede evitar este tipo de silenciamiento. El silenciamiento del gen post-transcripcional puede ocurrir cuando el transgen ARN se produce a altos niveles. Si más de una copia de un transgen produce ARN, entonces el ARN puede acumularse a un nivel crítico que estimulará el silenciamiento del gen post-transcripcional (Vaucheret et al. Plant J. 16:651-9 (1998). Algunos estudios sugieren que una cantidad tan pequeña como 60 bp de la identidad de secuencia dentro de la región transcrita puede mediar este proceso. Depicker & Van Mantagu, Curr. Opin. Cell. Biol. 9:373-82 (1997). La combinación de copias no idénticas de una secuencia codificante en una planta transgénica puede por lo tanto incrementar los niveles de ARNm que codifica el mismo polipéptido sin estimulación del proceso de silenciamiento mediado por ARN. En una modalidad preferida, un vector de expresión comprende dos casettes de expresión. El primer casette de expresión puede comprender un polinucleótido que codifica a un polipéptido inmunogénico (o antígeno) . El segundo casette de expresión puede comprender un polinucleótido no idéntico que codifica al mismo polipéptido inmunogénico. Por ejemplo, el primer casette de expresión puede comprender un polinucleótido que codifica a HBsAg en donde el polinucleótido se ha optimizado de la planta. Véase, por ejemplo, SEC ID NO. 3 (Fig. 22) . El segundo casette de expresión puede comprender entonces un polinucleótido que codifica a un HBsAg (tipo silvestre) derivado de virus nativo. Un vector de expresión que comprende dos o más casettes de expresión que codifican el mismo polipéptido inmunogénico incrementará la producción del polipéptido inmunogénico por aumento del número de copias. Sin embargo, la duplicación de secuencia de múltiples copias o una secuencia idéntica puede conducir a un silenciamiento de gen post-transcripcional indeseable. Depicker & Van Montagu, Curr. Opin. Cell. Biol. 9:373-82 (199"?); Vaucheret et al. Plant. J. 16:651-9 (1998). Por lo tanto, es un objeto de la invención reducir o eliminar el silenciamiento del gen transcripcional, tal como el silenciamiento del gen post-transcripcional mediado por ARN, al suministrar dos o más casetes de expresión en un vector de expresión que comprende cada polinucleótido no idéntico que codifica el mismo polipéptido inmunogénico. Preferiblemente, los casetes comprenden además una identidad de secuencia mínima por el uso de promotores diferentes o no idénticos y regiones no traducidas, transcritas al 5' y 3' , tal como las secuencias que incrementan la traducción y las secuencias de terminación. Los casettes de expresión pueden comprender además polinucleótidos diferentes que codifican, por ejemplo, señales peptídicas o péptidos señales. Preferentemente, cada casette de expresión combinado en un vector de expresión de planta no comparte la longitud de identidad de secuencia con otro casette de expresión que es mayor de 90 pares de base y, más preferible sin la longitud de identidad de la secuencia con otro casette de expresión que es mayor de 60 pares de base y, más preferiblemente, sin la longitud de la identidad de secuencia con otro casette de expresión que es mayor de 30 pares de base. Esto es, no mayor de 90 pares de base (o 60 pares de base, o 30 pares de base) son idénticos dentro de cualquier longitud del casette de expresión, cuando cada componente de un casette de expresión (es decir, ácidos nucleicos que codifican un promotor, polipéptido inmunogénico, regiones no traducidas, transcritas al 5' y 3', y cualquier otro componente) se comparan con cada componente de un segundo casette de expresión. Una diferencia en el silenciamiento del gen transcripcional se puede medir por la construcción de un vector de expresión de planta que comprende por ejemplo, dos casettes de expresión idénticos cada uno comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido inmunogénico de interés. La cantidad de expresión de este polipéptido inmunogénico en una célula de planta se puede comparar con la cantidad de polipéptido inmunogénico cuando este es expresado por un vector de expresión de planta que comprende por ejemplo, dos casettes de expresión que codifican al polipéptido de interés. Una cantidad mayor de polipéptido inmunogénico expresada por un vector de expresión de planta que comprende dos casettes de expresión no idénticos que indican que el silenciamiento de gen post-transcripcional se ha reducido o no se ha activado en la célula de la planta.

Preferentemente, el silenciamiento de gen transcripcional se reduce al menos en 10, 25, 50, 75 ó 100%. Además, cada casette de expresión en un vector de expresión de planta puede comprender el mismo o diferentes promotores, secuencias de incremento de la traducción, y secuencias de terminación. Cada casette de expresión puede comprender también otra codificación de secuencias de polinucleótido, por ejemplo, una secuencia de señal. Preferiblemente, cuando dos o más casettes de expresión se usan en un vector de expresión de planta, cada casette de expresión comprende un polipéptido inmunogénico no idéntico, o una secuencia de incremento de la traducción diferente o no idéntica y una secuencia de terminación diferente o no idéntica . En otra modalidad preferida, los vectores de expresión no idénticos separados que cada uno contiene un casette de expresión para el mismo polipéptido (o antígeno) se pueden usar para transformar una planta secuencialmente. Además, dos plantas transgénicas que contienen casettes de expresión no idénticos para el mismo polipéptido (o antígeno) pueden ser cruzadas sexualmente para combinar los dos casettes de expresión dentro de los genomas de la progenie seleccionada. Similarmente, al engendrar diferentes líneas de progenie, cada una que contiene múltiples casettes de expresión no idénticos para el mismo polipéptido (o antígeno) , puede producir aún números mayores de casettes de expresión no idénticos dentro del genoma de la misma planta individual. Por lo tanto los casettes de expresión múltiple no necesitan estar presentes en el mismo vector de expresión, pero pueden introducirse separadamente por cada transformación secuencial o por el cruzamiento sexual . Preferiblemente, un vector de expresión de planta de la invención comprende al menos 2, 3, 4, 5, 10, o más casettes de expresión. Cada casette de expresión puede comprender los mismos o diferentes polinucleótidos.

Transformación y Regeneración de Plantas con Polinucleótidos y Vectores de Expresión Un aspecto adicional de la presente invención es una célula eucariótica o procariótica que comprende, por ejemplo, que se transforma con, un polinucleótido de la invención o un casette de expresión que comprende un polinucleótido de la invención. Preferiblemente, la célula es una célula de planta, pero otros tipos de células, tales como las células de insecto, un mamífero y bacterianas se contemplan. Tan pronto como una célula de planta es empleada, se prefiere que un polinucleótido se integre al genoma nuclear de la célula de planta para asegurar la estabilidad y paso en la línea germinal. Un polinucleótido de la invención puede también en algunos casos mantenerse fuera del cromosoma, tal como en la mitocondria, cloroplasto o citoplasma. Un modo preferido de transferencia de un polinucleótido a una célula de insecto es por vía de transporte viral, donde la replicación se puede mantener extracromosómicamente o por integración. Los métodos de transferencia de los polinucleótidos en las células de mamíferos y bacterianas se conocen también en la técnica. Una célula de planta transformada es preferiblemente una de una planta que se puede consumir como producto alimenticio o que expresa la proteína deseada o un polipéptido en una forma fácilmente aislable. Las plantas representativas incluyen tabaco, plátano, tomate, papa, zanahoria, soya, maíz, arroz, trigo y girasol. Particularmente se prefiere que el huésped de la papa incluya variedades "Desiree" y FL 1607 ("Frito Lay 1607"), las cuales se pueden obtener de Frito-Lay, Inc. Rhinelander, Wl . Una línea preferida de tomate, TA234, se puede obtener de Steven Tanksley, Dept. of Plant. Breeding, Cornell University, Ithaca, NY 14853. Una semilla de planta transgénica transformada con un polmucleótido de la invención, la cual se obtiene por propagación de la planta transgénica, es todavía un aspecto adicional de la invención. Entre los métodos principales para efectuar la transferencia de constructos de ácidos nucleicos foráneos en las plantas es la técnica de transformación de A. tumefaci ens . Este método se basa en el agente etiológico de agallas de la corona, el cual afecta una amplia variedad de dicotiledóneas y gimnospermas. Donde el huésped de la planta objetivo es susceptible de infección, el sistema A. t umefaci ens proporciona altos índices de transformación y patrones de integración de cromosomas predecibles. El Agrobacteri um, el cual infecta normalmente a una planta en sitios lesionados, lleva un gran elemento extracromosomal llamado plásmido Ti (inductor de tumor) . Los plásmidos Ti contienen dos regiones requeridas para la inducción del tumor. Una región es el ADN-T (ADN transferido) , la cual es una secuencia de ADN que es últimamente de manera estable transferida al ADN de la planta genómica. La otra región es la región vir (virulencia) , la cual se ha implicado en el mecanismo de transferencia. Aunque la región vir se requiere para una transformación estable, el ADN de la - región vir no se transfiere a la planta infectada. La transformación de células de plantas mediadas por la infección de Agrobacteri um y la transferencia subsecuente de ADN-T está bien documentada. Bevan et al. Int. Rev. Genet. 16:357 (1982). El sistema Agrobacteri um está bien desarrollado y permite la transformación de rutinas de ADN en el genoma de la planta de una variedad de tejidos de plantas. Por ejemplo, tabaco, tomate, girasol, algodón, semilla de colza, papa, álamo y soya se pueden transformar con el sistema de Agroba c t eri um . Preferiblemente, donde A. t umefaci ens media la transformación de plantas se usa con un polinucleótido de la invención, proporcionando el flanqueo de las regiones límites de ADN-T de A. t umefaci ens . Las regiones límites de ADN-T son repeticiones directas de 23-25 pares de base relacionados con la transferencia del ADN-T al genoma de la planta. Las regiones limites de ADN-T flanqueantes clasifican el ADN-T y señalan el polinucleótido que se va a transferir y a integrar en el genoma de la planta. Preferiblemente, un polinucleótido o un vector de expresión de la invención, comprenden al menos un límite de ADN-T, particularmente el límite derecho de ADN-T. Opcionalmente, un polinucleótido a ser liberado a un genoma de planta es intercalado entre los límites derecho e izquierdo de ADN-T. Los límites pueden ser obtenidos de cualquier plásmido Ti o Ri (véase abajo) y pueden estar unidos a un vector de expresión o polinucleótido por cualquier medio convencional. Típicamente, un vector que contiene el polinucleótido a ser transferido, primero se construye y se replica en E. coli . Este vector contiene al menos una región de límite derecho de ADN-T y preferiblemente una región de límite derecho e izquierdo que flanquea al polinucleótido deseado. Un marcador seleccionable (tal como un gen que codifica la resistencia a un antibiótico como canamicina) puede también estar presente para permitir la selección fácil de células transformadas. El vector E. coli es el siguiente transferido a Agrobacteri um, el cual se puede realizar vía un sistema de apareamiento de conjugación o por captación directa. Una vez adentro el Agrobacteri um, el vector que contiene el polinucleótido se puede someter a una recombinación homologa con un plásmido Ti de Agrobacteri um para incorporar el ADN-T en el plásmido Ti. Un plásmido Ti que contiene un conjunto de genes vir indicubles que efectúan la transferencia del ADN-T a las células de plantas . Alternativamente, el vector que comprende el polinucleótido puede ser sujeto ín trans a los genes vir de los plásmidos Ti. En un aspecto preferido, un plásmido Ti de una cepa dada es "desarmado", en donde los genes onc del ADN-T se eliminan o suprimen para evitar la formación de tumores en la planta transformada, pero los genes vir proporcionados in trans todavía efectúan la transferencia del ADN-T a la planta huésped. Véase, por ejemplo, Hood, Transgenic Res. 2:208-218 (1993); Simpson, Plant Mol. Biol. 6:403-415 (1986). Por ejemplo, en un sistema de vector binario, un vector de plásmido E. coli se construye, comprendiendo un polinucleótido de interés flanqueado por regiones límites de ADN-T y un marcador seleccionable. El vector plásmido se transforma en E. coli y el E. coli transformado es entonces apareado por conjugación a Agrobacteri um . El Agrobacteri um receptor contiene un segundo plásmido Ti (plásmido Ti auxiliar) que contiene genes vir, pero ha sido modificado mediante remoción de su fragmento de ADN-T. El plásmido Ti auxiliar proporcionará proteínas necesarias para la infección de células de plantas pero sólo el plásmido de ADN-T modificado de E. coli modificado será transferido a la célula de la planta. El sistema A. tumefaciens permite la transformación de rutina de una variedad de tejidos de plantas. Véase, por ejemplo, Chilton, Scientific American 248:50 (1983); Gelvin, Plant Physiol. 92:281-285 (1990); Hooykaas, Plant Mol Biol. 13:327-336 (1992); Rogers et al., Science 227:1229-1231 (1985). Las plantas representativas que se han transformado con este sistema y las referencias representativas se listan en la Tabla 1. Otras plantas que tienen partes comestibles o las cuales pueden procesarse para ofrecer una proteína aislada se pueden transformar por los mismos métodos o modificaciones de rutina de las mismas.

Tabla 1 Planta Referencia Tabaco Barton, K. et al. (1983) Cell 32, 1033 Tomate Fillati, J. et. al (1987) Bio/Technology 5, 726-730 PaPa Hoekema, A. et ai. , (1989) Bio/Technology 7:273-278 Berenjena Filipponee, E. et al. , (1989) Plant Cell Rep. 8:370-373 Pepino Atkinson, R. et al., Plant Cell Rep. 10:208-212 Camote Shafer, W. et al. , (1987) Nature 327 : 529-532 Soya Delzer, B, et al. , (1990) Crop Sci. 30: 320-322 Alubia Hobbs, S. et al. , (1989) Plant Cell Rep. 8:274-277 Remolacha azucarera Kallerhoff J. et al. , (1990) Plant Cell Rep. 9:224-22 8 Lechuga Michelmore, R., et al. , (1987) Plant Cell Rep. 6:439-442 Pimiento dulce Liu, W. et al. , (1990) Plant Cell Rep 9: 360-364 Apio Liu, C-N, et al. , (1992) Plant Mol. Biol. 1071-1087 Zanahoria Liu, C-N et al. , (1992) Plant Mol. Biol. 1071-1087 Espárragos Delbriel, B. et al. , (1993) Plant Cell Rep. 12:129-132 Cebolla Dommise, E. et al. , (1990) Plant Sci. 69:249-257 Vid Baribault, T., et al. , (1989) Plant. Cell Rep 8: 137-140 Melón amarillo Fang, G., et al. , (1990) Plant Cell Rep 9: 160-164 Fresa Nehra, N. et al. , (1990) Plant Cell Rep 9:10-13 Arroz Raineri, D. et al. , (1990) Bio/Technology. 8: 33-38 Girasol Schrammei j er , B. et al. , (1990) Plant CeJl Rep 9:55-60 Semilla de colza/canola Púa, E, et al. , (1987) Bio/Technology 5, 815 Trigo Mooney, P. et ai., (1991) Plant Cell Tiss. Organ. Cult. 25:209-218 Avena Donson, J. et al. , (1988) Virology, 162:248-250 Maíz Gould, J. et aJ . , Plant Physiol. 95: 26-434 Alfalfa Chabaud, M. et al. , (1988) Plant Cell Rep 7:512-516 Algodón Umbeck, P. et al. , (1987) Bio/Technology, 5:263-266 Nogal McGranahan, G. et al. , (1990) Plant Cell Rep. 8:512-516 Abeto/coniferas Ellis, D. et al. , (1989) Plant Cell Rep 8:16-20. Álamo Pythoud, F. et al. , (1987) Bio/Technology 5:1323 Manzana James, D. et al. , (1989) Plant Cell Rep 7:658-661 Otras cepas de Agrobacterium tales como A. rhizogenes se pueden usar como un vector para la transformación de la planta. A. rhizogenes, la cual incita la formación de los pelos radicales en muchas especies de plantas dicotiledóneas, lleva un elemento extra-cromosomal grande llamado plásmido Ri (incluyendo raíz), el cual funciona de una manera análoga al plásmido Ti de A. tumefaciens . La transformación usando A. rhizogenes se ha desarrollado análogamente a aquélla de A. tumefaciens y se ha usado exitosamente, por ejemplo, para transformar alfalfa y álamo. Sukhapinda et ai., Plant Mol. Biol. 8:209 (1987) . Los métodos de inoculación de estos tejidos de plantas pueden variar dependiendo de las especies de plantas y el sistema de suministro de Agrobacterium. Un procedimiento conveniente es ei procedimiento de disco de la hoja, el cual puede realizarse al explantar cualquier tejido que proporcione una buena fuente para la iniciación de la diferenciación de una planta completa. La adición de un tejido cultivado puede ser deseable bajo ciertas condiciones. Otros procedimientos tales como la transformación i n vi tro de protoplastos de regeneración con A . t umefa ci ens , puede seguir para obtener así también, las células de plantas transformadas. Los procedimientos de transferencia del gen, directos, se pueden usar para transformar plantas y tejidos de plantas sin el uso de plásmidos de Agrobacteri um . Potrykus, Bio/Technology, 8:535-542 (1990); Smith et a l . , Crop. Sci., 35:01-309 (1995) . La transformación directa involucra la captación del material genético exógeno en las células o protoplastos de las plantas. Tal captación puede incrementarse por el uso de agentes químicos o campos eléctricos. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención se puede transformar en protoplastos de una planta por el tratamiento del protoplasto con un pulso eléctrico en la presencia del protoplasto usando electroporación. Para la electroporación, los protoplastos son aislados y suspendidos en una solución de manitol. Se agrega el plásmido de ADN circular o superenrrollado, que comprende un polinucleótido de la invención. La solución se mezcla y se somete a un pulso de aproximadamente 400 V/cm a temperatura ambiente por aproximadamente 10 a 100 microsegundos. Un rompimiento físico reversible de la membrana ocurre de manera tal que el material genético extraño es transferido en los protoplastos. El material genético extraño puede entonces integrarse en el genoma nuclear. También se han transformado varios protoplastos de monocotiledóneas por este procedimiento incluyendo el arroz y maí z . La fusión del liposoma es también un método efectivo para la transformación de las células de plantas. En este método, los protoplastos se llevan junto con los liposomas que portan un polinucleótido de la invención. Como las membranas emergen, el gen extraño es transferido a los protoplastos. Dehayes et al . , EMBO J. 4:2731 (1985) . De manera similar, la transferencia directa del gen usando la transformación mediada por el polietilenglicol (PEG), se ha llevado a cabo en N. taba cum (una dicotiledónea) y Lol i um mul ti fl orum (una monocotiledónea) . La transferencia directa del gen se efectúa por la interacción sinergística entre Mg*¿, PEG, y posiblemente Ca*2. Negrutiu et al . , Pl an t Mol . Bi ol . 8:363 (1987) . Alternativamente, el ADN exógeno puede introducirse en las células o protoplastos por microinyección de una solución de ADN de plásmido que comprende un polinucleótido de la invención, directamente en la célula con una aguja de vidrio finamente estirada. La transferencia directa del gen puede también realizarse por el bombardeo de partículas (o aceleración de micropartículas), las cuales involucran el bombardeo de las células de las plantas por microproyectiles, llevando un polinucleótido de la invención. Klein et a l . , Nature 327:70 (1987); Sanford, Physiol. Plant. 79:206-209 (1990) . En este procedimiento, las partículas de metal químicamente inertes, tales como tungsteno u oro, son revestidas con un polinucleótido de la invención y aceleradas hacia las células de las plantas objetivo. Las partículas penetran en las células, llevando con ellas los polinucleótidos revestidos. La aceleración de micropartículas ha mostrado conducir tanto a la expresión temporal como a la expresión estable en las células suspendidas en cultivos, protoplastos y embriones inmaduros de la planta, incluyendo cebolla, maíz, soya, y tabaco: McCabe et al . , Bio/Tecnology : 6:923(1988) . Adicionalmente, el virus de ADN se puede usar como vectores en plantas. Por ejemplo, un virus del mosaico de la coliflor que lleva un gen de resistencia al metotrexato bacteriano modificado, se ha usado para infectar una planta. El gen extraño puede sistemáticamente esparcirse a través de toda la planta. Brisson e t al . , Nature 310:511 (1984) . Las ventajas de este sistema son la facilidad de la infección, la distribución sistémica dentro de la planta, y las copias múltiples del gen por célula. Una vez que las células de las plantas se han transformado, existe una variedad de métodos para la regeneración de las plantas. El método particular de regeneración dependerá del inicio del tejido de la planta y las especies de plantas particulares a ser regeneradas. Muchas plantas pueden regenerarse del tejido calloso derivadas de los explantes de las plantas, incluyendo, pero no limitando a maíz, arroz, cebada, trigo, centeno, girasol, soya, algodón, semilla de colza y tabaco. La regeneración de las plantas a partir del tejido transformado con A . t umefa ci en s se ha demostrado en plantas, incluyendo pero no limitando a girasol, tomate, clavo blanco, semilla de colza, algodón, tabaco, papa, maíz, arroz y numerosos cultivos vegetales. La regeneración de la planta a partir de los protoplastos es una técnica particularmente empleada y se ha demostrado en plantas incluyendo, pero no limitando a tabaco, papa, álamo, maíz y soya. Evans e t al . , Handbook of Plant Cell Culture 1, 124 (1983) . Estudios preliminares de los protocolos de transformación y similares, se pueden explorar a través del uso de un gen reportero para medir la eficiencia de la expresión proporcionada por un constructo dado. Los genes reporteros ejemplares codificados por ß-glucuronidasa (GUS), transferasa de acetil cloranfenicol, ß-galactosidasa, proteína fluorescente verde, y luciferasa. Las células de plantas transformadas con un gen reportero o polinucleótido de la presente invención, se pueden ensayar por niveles de expresión en un número de formas. Por ejemplo, el manchado Southern o Northern estándar, PCR, y técnicas de inmuno ensayo, se pueden realizar en los tejidos de plantas seleccionadas.

Plantas que Expresan a los Polipéptidos Inmunogénicos de la Invención La invención incluye plantas completas, células de plantas, órganos de plantas, tejidos de plantas, semillas de plantas, protoplastos, callos, cultivos celulares y cualquier grupo de células de plantas organizadas en unidades estructurales y/o funcionales capaces de expresar al menos, un polinucleótido de la invención. Preferiblemente, las plantas completas, células de plantas, órganos de plantas, tejidos de plantas, semillas de plantas, protoplastos, callos, cultivos celulares, y cualquier grupo de células de plantas producen al menos, 0.001, 0.01, 1.5, 10, 25, 50, 100, 500 o 1000 µg del polipéptido de la invención por gramo del material total soluble de la planta. Preferiblemente, una planta usada de conformidad con la invención, deberá contener al menos, 5 µg y preferiblemente de aproximadamente 7 µg hasta aproximadamente 15 µg de HBsAg por gramo del material de planta a ser ingerido. El animal, por ejemplo un humano, usualmente ingerirá material de planta suficiente para proporcionar de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 5 gramos del material de planta por kilogramo de peso corporal. La invención además comprende polipéptidos inmunogénicos de la invención, tal como HBsAg, aislado, purificado o parcialmente purificado de las células de las plantas, o tejidos de las plantas en las cuales se producen . Los extractos del tejido de la planta se pueden ensayar para la expresión de polipéptidos inmunogénicos mediante ELISA. Brevemente, un anticuerpo en amortiguador al polipéptido inmunogénico, se puede revestir, usando varias técnicas por ejemplo, placas de ELISA de poliestireno. Después de aproximadamente 1 hora de incubación a temperatura ambiente, el amortiguador es lavado completamente con por ejemplo, PBS, y los pozos son bloqueados por el enlace no específico con 5% de leche en PBS. Las muestras de extractos de plantas a ser ensayadas se cargan en los pozos. Para obtener una curva estándar para la cuantificación de las diluciones diferentes de polipéptidos inmunogénicos de polipéptidos inmunogénicos derivados bacterialmente, se pueden cargar en la misma placa. Las placas son lavadas con amortiguador después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente. El anti-suero, tal como antisuero de cabra o antisuero de conejo al polipéptido inmunogénico, se diluye en amortiguador y BSA y se incuba en el pozo por 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar 4 veces con amortiguador, los pozos se someten a sondas con, por ejemplo, antisuero de conejo contra IgG de cabra conjugado con fosfatasa alcalina diluida en amortiguador y BSA. Después de lavar con el amortiguador, los pozos son incubados con substrato de nitrofenilfosfato en amortiguador de dietanolamina. Después de la incubación por 10-30 minutos, la reacción se detiene por la adición de NaOH y la absorbencia se lee a 410 nm. El efecto tóxico de los polipéptidos de la invención en una planta en la cual los polipéptidos se producen, puede probarse por la comparación del crecimiento de las plantas que producen los polipéptidos de la invención con las plantas que no producen los polipéptidos. Preferiblemente, las plantas que producen los polipéptidos de la invención tienen la misma o similar velocidad de crecimiento como las plantas que no producen los polipéptidos.

Composiciones que Comprenden Polipéptidos Inmunogénicos de la Invención La invención proporciona composiciones de polipéptidos inmunogénicos, tales como HBsAg en las plantas completas, células de plantas, órganos de plantas, semillas de plantas, protoplastos, callos, cultivos celulares y cualquier grupo de células de plantas organizadas en unidades estructurales y/o funcionales capaces de expresar al menos, un polinucleótido de la invención. La composición de la planta, tales como las hojas, frutos y tubérculos, es preferiblemente administrada a un humano o animal oralmente. La invención además comprende polipéptidos inmunogénicos de la invención que se han aislado, procesado, purificado o parcialmente purificado de las células de las plantas, o tejidos de las plantas en las cuales se producen. Por ejemplo, el material de la planta se puede extraer, moler, pulverizar, disecar, homogenizar y similar, para producir un producto final en la forma de, por ejemplo, un extracto, jugo, líquido, polvo, tableta. Es particularmente ventajoso en ciertos protocolos de prevención de enfermedades para infantes humanos, producir una vacuna en un jugo para facilidad de administración tal como jugo de tomate, soya, y zanahoria, o leche. El material de la planta puede alternativamente, ser procesado en una forma que se de más sabrosa a través de la adición de componentes saborizantes. Puede también procesarse para concentrar o purificar los componentes antigénicos de la planta para incrementar el efecto inmunogénico de la composición. Aunque no es preferido de manera general que se haga así, los extractos del material de la planta se pueden obtener, esterilizar y reconstituir como un líquido inyectable, el cual se puede administrar parenteralmente si se desea. Preferiblemente, cualquier paso de procesamiento usado para concentrar o condicionar el material de la planta, evita la desnaturalización significativa de los polipéptidos inmunogénicos, por ejemplo, partículas HBsAg, así que las propiedades antigénicas no se pierden. Las propiedades inmunogénicas probablemente de la composición, se pueden probar ex vi vo mediante la selección con anticuerpos anti-HBsAg. La invención también proporciona composiciones que comprenden polinucleótidos de la invención. Las composiciones de la invención pueden comprender un portador farmacéuticamente aceptable. El mismo portador no deberá inducir la producción de anticuerpos peligrosos al hospedero. Los portadores farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por aquéllos en la técnica. Tales portadores incluyen, pero no se limitan a, macromoléculas lentamente metaboli zadas , grandes, tales como proteínas, polisacáridos tales como sefarosa funcionalizada con látex, agarosa, celulosa, perlillas de celulosa y similares, ácidos polilácticos , ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos tales como ácido poliglutámico, polilisina y similares, copolímeros de aminoácidos, peptoides, liptoides y partículas de virus inactivos. Las sales farmacéuticamente aceptables pueden también ser usadas en composiciones de la invención, por ejemplo, sales minerales tales como clorhidratos, bromhidratos , fosfatos o sulfatos, así también como sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos o benzoatos. Especialmente útiles los substratos de la proteína son albúminas de suero, hemocianina de lapa de punta, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovalbúmina, tétanos toxoide y otras proteínas bien conocidas por aquéllos de habilidades en la técnica. Las composiciones de la invención pueden también contener líquidos o excipientes, tales como agua, salina, glicerol, dextrosa, maltodextrina, etano, o similares, individualmente o en combinación, así como también substancias tales como agentes humectantes, agentes emulsificantes, o agentes amortiguadores del pH . Los liposomas también se pueden usar como un portador para una composición de la invención . Si se desea, las moléculas co-estimulatorias, las cuales mejoran la presentación del inmunógeno a los linfocitos, tales como B7-1 o B7-2, o citosinas tales como IL-2 y IL-12, se pueden incluir en una composición de la invención. Opcionalmente, los adyuvantes pueden también incluirse en una composición. Los adyuvantes los cuales pueden ser usados incluyen, pero no se limitan a MF59-0, hidróxido de aluminio, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637), referido como nor-MDP) , ADN de plásmido bacteriano de N-acet ilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- ( 1 ' ,2' -dipaImi toil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi ) -etilamina (CGP 19835A, referido como MTP-PE) , anticuerpo anti-HB, oligodesoxinucleótidos que contienen CpG inmunoestimulatorios, derivados lipofílicos del dipéptido de muramilo (MDP-Lys (L18)), fosfato de aluminio o sulfato de aluminio, proteína central de la hepatitis C, y RIBI, los cuales contienen tres componentes extraídos de la bacteria, lípido a monofosforilo, dimicolato de trehalosa y el esqueleto de la pared celular (MPL+TDM+CWS) en una emulsión de escualeno/Tween 80 al 9 & Los adyuvantes preferidos incluyen a la toxina del cólera (CT), enterotoxina estable al calor de E. coli (LT), anticuerpo 2F10 anti-idiotípico, factor de colonización, toxina similar a shiga, intimina, lípido a monofosforilo, OPTIVAX (Patente Estadounidense No. 5,622,649), proteína a de la superficie exterior (OspA), fluoruro de sodio, quitosan, subunidades de los mismos, y mutantes de los mismos. (Clements et al. , Vaccine. 6:269-277 (1988); de Haan et ai., Vaccine. 14:260-266 (1996); De Magistris, "Non-toxic derivatives of heat-labile toxins act as mucosal adjuvants", Mucosal Immunization : Genetic Approaches & Adjuvants . IBC Biomedical Library, Southborough, MA, pp . 1.8.1-1.8.12 (Basado en una presentación en la Conferencia IBC, Octubre 16-18, 1995, Rockville, MD) 1996; Dickinson et al., Infect. Immun. 63:1617-1623 (1995); Di Tommaso et al. , Infect. Immun. 64:974-979 (1996); Fontana et al. , Infecí. Immun. 63:2356-2360 (1995); Hol gren et al . , Vaccine, 11:1179-1184 (1993); Nedrud et al . , Reg. Im unol, 3:217-222 (1991); Pride et a l . , J. Exp. Med. 177:127-134 (1993); y Patentes Estadounidenses por Thanavala e t al . ) . Los adyuvantes pueden proporcionarse concurrentemente con, o por antes o después de la provisión de la composición inmunogénica. "'También, el adyuvante se puede proporcionar íntegramente con la composición inmunogénica, por ejemplo, como un producto coexpresado de la planta transgénica, o se puede proporcionar separadamente en una forma conveniente, por ejemplo, como un líquido, para ser tomado con el producto. Preferiblemente, el adyuvante es un adyuvante inmunológicamente aceptable, es decir, uno que promueve una respuesta inmune sin serios efectos dañinos. Las composiciones de la invención pueden comprender una formulación de liberación sostenida, formulaciones entéricas, tabletas, tabletas masticables, cápsulas, soluciones, soluciones parenterales, atomizadores intranasales o polvos, trociscos, supositorios, parches transdérmicos y suspensiones. En general, las composiciones contienen al menos, 0.01, 0.1, 1, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 u 80% de los polipéptidos o polinucleótidos de la invención en total, dependiendo de las dosis deseadas y el tipo de composición a ser usada.

Método para Estimular una Respuesta Inmune Los polipéptidos inmunogénicos de la invención se pueden usar para estimular una respuesta inmune en animales, tales como ganado vacuno, cerdos, ratones, cobayos, conejos, aves, tales como pollitos, patos y gansos, chimpancés, babuinos y macacos y en humanos. Preferiblemente, los polipéptidos inmunogénicos de la invención estimulan anticuerpos IgG y/o IgA (véase ejemplos 21 y 23) y/o una respuesta inmune mediada por la célula (véase ejemplo 24) . En un aspecto preferido, un polipéptido inmunogénico de la invención es un inmunógeno mucosal, tal como HBsAg. Para los propósitos de la invención, un inmunógeno mucosal es el que tiene la habilidad para cebar específicamente el sistema inmune mucosal. En aun una modalidad más preferida, un inmunógeno mucosal de la invención es el que ceba el sistema inmune mucosal y/o estimula la respuesta inmune humoral en una manera dependiente de la dosis, sin inducir la tolerancia sistémica y sin la necesidad de dosis excesivas del antígeno. La tolerancia sistémica está definida aquí como un fenómeno que ocurre con ciertos antígenos los cuales son repetidamente dados como alimento a un mamífero que resulta en una respuesta anti-antígeno subsecuente específicamente disminuida. Una respuesta mucosal a un inmunógeno de la invención se entiende, incluye cualquier respuesta inmune generada cuando el inmunógeno estimula el sistema inmune mucosal. Típicamente, el tejido linfoide asociado con el intestino (GALT por sus siglas en inglés), se activará por la alimentación del inmunógeno oralmente a un sujeto mamífero. Usando esta ruta de introducción del inmunógeno a las membranas mucosales, se proporciona acceso a las células M del intestino delgado, las cuales cubren las placas de Peyer y otros agrupamientos linfoides del GALT. Sin embargo, cualquier membrana mucosal accesible para el contacto con un inmunógeno de la invención, está específicamente incluida dentro de la definición de tales membranas (por ejemplo, membranas mucosales del paso del aire, accesibles por la inhalación, membranas mucosales de las porciones terminales del intestino grueso accesibles por supositorios, etc.).

La estimulación de anticuerpos por los polipéptidos inmunogénicos de la invención se puede usar, inter al i a , para proporcionar sistemas modelos para optimizar, por ejemplo, respuestas anticuerpo anti-HBsAg a HBV y proporcionar tratamiento profiláctico o terapéutico contra HBV, u otra bacteria, virus, o protozoarios. Por ejemplo, supresión y/o cuantificación de títulos de anticuerpos anti-HBsAg después del suministro de un polipéptido HBsAg se puede usar para identificar los epitopes HBsAg que no son particularmente efectivos al estimular títulos de anticuerpos anti-HBsAg. Los epitopes HBsAg responsables de una respuesta de anticuerpo HBsAg fuerte contra HBV pueden identificarse por la estimulación de anticuerpos HBsAg dirigidos contra los polipéptidos HBsAg de diferentes longitudes. Los anticuerpos anti-HBsAg estimulados por un epitope de polipéptido HBsAg particular, pueden entonces probarse usando un ensayo de ELISA anti-HBV para determinar cuáles polipéptidos contienen epitopes que son más efectivos en la generación de una respuesta fuerte. Los polipéptidos HBsAg o las proteínas de fusión las cuales contienen estos epitopes o polinucleótidos que codifican a los epitopes, entonces se pueden construir y usar para estimular una respuesta fuerte al anticuerpo HBsAg. Un polipéptido inmunogénico se puede administrar a un animal o humano para estimular una respuesta inmune í n vi vo . Se prefiere el suministro oral de un polipéptido inmunogénico. La administración de un polipéptido puede ser por cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo oral, intramuscular, intradérmico, intraperitoneal o inyección subcutánea, incluyendo inyección usando una pistola o disparo balístico biológico ("pistola o disparo del gen") . La administración puede también ser intranasal. Preferiblemente, un polipéptido inmunogénico está acompañado por una proteína portadora para la administración oral. Una combinación de los métodos de administración también se puede usar para estimular una respuesta inmune anti-HBsAg. Por ejemplo, una dosis de la composición inmunogénica puede ser administrada por una ruta, tal como oral, mientras otra dosis o refuerzo se puede administrar por ruta transdérmica, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intranasal o intrarectal. Una composición de la invención que comprende un polipéptido inmunogénico, o una combinación del mismo, es administrada de una manera compatible con la composición particular usada y en una cantidad la cual es efectiva para estimular una respuesta inmune .al polipéptido inmunogénico, por ejemplo, un título de anticuerpo anti-HBsAg como se detecta por ELISA. Las dosificaciones particulares de una composición antigénica de la invención dependerán de muchos factores, incluyendo pero no limitado a especies, edad y la condición general del humano o animal al cual se administra la composición, y el modo de administración de la composición. Una cantidad efectiva de la composición de la invención puede ser fácilmente determinada usando solamente experimentación de rutina. Los modelos i n vi tro e i n vi vo descritos aquí, pueden emplearse para identificar dosis apropiadas. De manera general, al menos 0.001, 0.001, 0.1, 1.0. 1.5, 2.0, 5 o 10 mg/kg de un antígeno se administrará a un mamífero grande, tal como un babuino, chimpancé o humano. Preferiblemente, se administran 10-100 µg/kg. Si se desea, las moléculas co-estimulatorias o adyuvantes, pueden también proporcionarse antes, después, o junto con las composiciones antigénicas. Los polipéptidos inmunogénicos de la invención, pueden ser administrados terapéuticamente o profilácticamente. De manera general, se desea que la cantidad de la planta o porción de la misma a ser consumida sea suficiente para proporcionar una cantidad de polipéptido inmunogénico, tal como HBsAg, que comprende al menos 0.1, 1, 2, 5, 10, 50, 100, 500 µg/g del alimento consumido por el animal o humano. Además, los extractos del material de la planta se pueden preparar y/o concentrar para incrementar la cantidad de polipéptido por gramo de material alimenticio preparado o concentrado, los cuales entonces se consumirán. Las respuestas inmune, incluyendo la estimulación de anticuerpos IgG y/o IgA y/o una respuesta inmune mediada por la célula, en un animal o humano generado por el suministro de una composición de la invención, se puede incrementar mediante la variación de la dosificación, ruta de administración, o regímenes de refuerzos. Las composiciones de la invención se pueden dar en un programa de dosis única, o preferiblemente en un programa de dosis única en las cuales, un curso primario de vacunación incluye 1-10 dosis separadas, seguidas por otras dosis dadas a intervalos de tiempo subsecuentes requeridos para mantener y/o reforzar una respuesta inmune, por ejemplo, 1-4 meses para una segunda dosis, y si se necesita, una dosis subsecuente o dosis después de varios meses. Preferiblemente, al menos una de estas administraciones se realiza oralmente para estimular una respuesta inmune mucosal así como también para aprovechar los costos y ventajas. La administración oral comprende el consumo de una planta o parte de una planta transgénica de la invención. Preferiblemente, una serie de ingestiones del material de la planta se garantiza, por ejemplo, una serie de tres, cuatro, cinco, diez o más, cada ingestión se separa por al menos tres, y preferiblemente, al menos aproximadamente siete a catorce días. La administración de polipéptidos inmunogénicos puede estimular un título de anticuerpo y/o una respuesta inmune celular en un animal o humano que dura por al menos 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 6 meses, 1 año o más tiempo. Opcionalmente, una respuesta inmune puede mantenerse en un animal o humano al proporcionar una o más inyecciones de refuerzo del polipéptido inmunogénico a 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 1 año o más después de la administración primaria. Opcionalmente, la administración de los polipéptidos de la invención como materia de la planta o alimentos se usa como un refuerzo después de una inyección primaria de una composición que estimula una respuesta inmune. Un régimen de inmunización deseado puede incluir la administración de una o más cantidades de refuerzo del presente complejo antigénico para incrementar la respuesta inmune del sujeto. En consecuencia, se contempla la administración de una planta transgénica presente come un inmunógeno primario, o como un "refuerzo" al mismo u otro inmunógeno. Por ejemplo, los resultados de administrar rebanadas de papas transgénicas con adyuvantes CT, seguidas por 7-16 semanas después con rHBsAg derivado de levadura (comercial) administrado intraperitonealmente o subcutáneamente, se muestran en las Figuras 4A-E . De manera similar, las papas transgénicas y CT se pueden administrar como un refuerzo en una inmunización inicial con rHBsAg, con los títulos de anticuerpos incrementados. Inicialmente, se demuestra una vacuna de refuerzo oral para usarse con individuos quienes han sido cebados por la administración parenteral de las vacunas actuales. Más preferido es una vacuna oral que puede ser usada sola en un régimen de vacunación para una protección efectiva. La frecuencia y cantidad del complejo consumido no deberá ser mayor en tanto provoque la tolerancia del antígeno y esta condición pueda ser determinada a través de la experimentación de rutina. Para determinar la inmunogenicidad de los polipéptidos derivados de las plantas de la invención cuando se administran oralmente, extractos o tejidos de las plantas que expresan los polipéptidos inmunogénicos de la invención, se pueden alimentar a animales, tales como ratones o humanos. Por ejemplo, un grupo de ratones se puede alimentar de un extracto de una planta o tejidos de plantas en donde la planta expresa un polipéptido de la invención. A otro grupo de ratones se le puede dar polipéptidos recombinantes purificados de E . col i que expresan el mismo antígeno a partir de un plásmido recombinante. Las respuestas de anticuerpos mucosales y del suero se pueden examinar por ELISA. Se sabe que los títulos de anticuerpos HBsAg de 10 mlU/mL son protectores en humanos. Se recomienda que los títulos de anticuerpos generen vacunas actuales de al menos 100 mlU/mL para permitir una declinación en los títulos con el tiempo. Preferiblemente, una respuesta inmune primaria estimulada por un polipéptido inmunogénico de la invención, alcanza un nivel anticuerpo de suero anti-HBsAg superior de .50 mlU/mL en cuatro o menos alimentaciones. En donde las composiciones de la invención sirven como un refuerzo, se prefiere que el nivel de anticuerpo del suero anti-HBsAg se incremente al menos cuatro veces o superior de 500 mlU/mL en cuatro o menos alimentaciones. En estudios de inmunización de HBsAg oral, la toxina del cólera (CT, 10 µg/dosis) o LT, se ha usado como un adyuvante. Por ejemplo, la CT es colocada en rebanadas de tubérculos de papa que expresan el HBsAg y se consumen por los animales en conjunto con el antígeno. La CT es efectiva para incrementar una respuesta inmune asociada con HBsAg. Los datos preliminares indican que la CT es un adyuvante oral más efectivo para HBsAg que el mutante LTR:92G de la toxina de E . col i inestable al calor desarrollado por John Clements de la Universidad de Tulane. Significantemente, los anticuerpos IgA secretorios se pueden seleccionar después de la alimentación de los tubérculos recombinantes; los cuales no están estimulados con la administración parenteral de HBsAg. Ilustrativo de la invención es la alimentación de ratones con 5 g de papa recombinante revestida con 10 µg CT tres veces a intervalos semanales. Este programa da picos de títulos de anticuerpos de 70-110 mlU/mL, los cuales pueden aumentar a títulos de 1700-3400 mlU/mL por una dosis intraperitonealmente sub-inmunogénica individual de HBsAg purificado a partir de levadura recombinante (Merck) . Los títulos reales medidos son correlacionados con los niveles de expresión HBsAg en papas. El nivel de respuesta a la dosis está relacionado con la dosis con papas suministrando 1.1 µg/g de HBsAg dando una respuesta menos prolongada e inferior que en las papas que suministran 8.3 µg/g. El mismo régimen de alimentación se encuentra para aumentar una dosis subcutánea única de HBsAg purificado de levaduras recombinantes para dar picos de títulos de anticuerpos de 1000 mlU/mL. Los tubérculos hervidos (5 min, 100°C) no dieron respuestas inmunes detectables, pero se observó un aumento significativo en la administración subsecuente de una dosis intraperitoneal única de HBsAg purificado a partir de levadura recombinante. Los siguientes ejemplos se proporcionan para propósitos solamente de ejemplificación y no pretenden limitar el ámbito de la invención descrito en términos amplios anteriormente. Todas las referencias citadas en esta descripción están incorporadas aquí como referencia.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Construcción de vectores HB101 y HB102 pHBl Ol : La región codificante HBsAg en el fragmento PSt I/Hi ndI I I a partir de pMT-SA ( cordialmente proporcionado por Li-he Guo, Chínese Academy of Sciences), se subclonó en pBluescript KS (Stratagene) para formar pKS-HBS. El gen HBsAg en pKS-HBS fue abierto a 116 pares de base (bp por sus siglas en inglés) al 3' al codón de terminación con BstBI y los extremos resultantes se truncaron por el llenado con la enzima Klenow y dCTP/dGTP. La región codificante completa entonces se escindió 16 bp corriente arriba del sitio Ps t I con BamHl . El pBH21 (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) , se digirió con Sa c I y los extremos se truncaron con nucleasa de judía mung (frijol de oro) . La región codificante GUS entonces se liberó con BamHl y el vector se aisló. El fragmento codificante HBsAg se ligó en pBII21 menos GUS para proporcionar pHBlOl, en donde la expresión es accionada por el promotor del virus del mosaico de la coliflor (CamV) derivado de pBII21. pHB1 02 (Fig. ÍA) : El promotor CaMV 35S con el incrementador duplicado ligado a la secuencia líder no traducida al 5' del virus del grabado del tabaco (TEV) , el cual actúa como un incrementador de la traducción (Carrington, et al . , J. Virol., 64:1590-1597 (1990), se escindió de pRTL2-GUS (Carrington et al . , Plant Cell 3:953-962 (1991)) como sigue. El pRTL2-GUS se digirió con Neo I y los extremos se truncaron con nucleasa de judía mung (frijol de oro) . El fragmento líder del promotor, entonces se .liberó por digestión con Hi ndI I I . El pHBlOl se digirió con Hi ndI I I y Sma I para liberar el fragmento promotor 35S y el vector se purificó. El fragmento líder del promotor entonces se ligó en el Hi ndI I I / Sma I , digerido con pHBlOl para proporcionar pHB102. La región codificante HBsAg se sitúa corriente arriba del terminador de la sintasa nopalina en ambos constructos. Los plásmidos contienen las regiones de límites izquierda y derecha, las cuales denotan los límites del ADN que se integran en el ADN genómico de la planta vía la transformación mediada por Agroba c t eri um t umefa ci ens , así como también el gen de fosfotransferasa de neomicina, los cuales permiten la selección con canamicina.

Ejemplo 2. Supresión de HB102 de las regiones nativas no traducidas 5' y 3' del ADNc de HBsAg pHB1 03 (Fig. 1A) : La construcción del plásmido HB102 se describe anteriormente y en Masón, H., et al . , (1992) . La supresión de las secuencias no traducidas virales seleccionadas se observó para mejorar la acumulación de la proteína recombinante en las plantas. Así, el constructo HB103 es idéntico a HB102 excepto por la supresión de las secuencias virales no codificantes, las cuales podrían disminuir la velocidad de transcripción o eficiencia de la traducción. La región codificante HBsAg del plásmido pKS-HBS (Masón et al . , 1992), se amplificó por PCR con los oligos HBNco (5' CATGCCATGGAGAACACAACATCA GG 3') (SEC ID NO : 7 ) y HBSac (5' GCC GGA GCT CA ATG TAT ACC CAÁ AGA CA 3 ' ) (SEC ID NO : 8 ) . Estos introducen un sitio Ncol al codón iniciador y un sitio Sacl al codón sin sentido de la región codificante. El fragmento PCR se clonó usando los sitios Ncol y Sacl en el vector intermediario designado pIBT210.1 (Haq et al . , Science 268:714-716 (1995)), lo cual dio origen al plásmido pIBT210. lHBsC#l 0. El fragmento Xhol a Sacl de pIBT210. lHBsC#l 0, se subclonó en pBluescript SK+ para crear el intermedio pBSSKHBsC#6. El fragmento Xhol a Seal no modificado, se subclonó en pIBT211.1 para formar el intermedio pIBT211. lHBsC#9. El vector pIBT211.1 se elaboró por la ligación del fragmento terminador Nos obtenido por digestión de pBHOl (Clontech; Jefferson e t al . , EMBO J. 13:3901-3907 (1987)) con Sacl y EcoRI en los mismos sitios de pIBT210.1, con eliminación del terminador VSP. El fragmento HindI I I /EcoRI de pIBT211.1HBSC#9 se subclonó en el vector de transformación de la planta pBIHOl para crear pHB103. Este plásmido contiene el promotor 35S con la región codificante HBsAg, TEV líder, incrementador duplicado, y el terminador Nos entre los sitios HindIII y EcoRI . El cásete de expresión y el mapa de restricción de HB103 se muestran en las Fig. ÍA y Fig. 2A, respectivamente .

Ejemplo 3. Modificaciones de HB103 Los siguientes constructos son todos modificaciones de HB103 en los cuales, un promotor 35S está operablemente ligado al ADNc de HBsAg (tipo silvestre) derivado del virus nativo. Los casetes relevantes se muestran en la Fig. ÍA.

Constructo 35S-TEV-HBsAg-SEKDEL-NOS El pHB1 05 (Fig. ÍA) contiene una supresión del codón C-terminal lie de la secuencia codificante HBsAg y una inserción que codifica la extensión SEKDEL C-terminal (SEC ID NOM) . Se construyó un clon intermedio por una ligación de tres fragmentos que consiste del fragmento Xhol a Accl a partir de pIBT210. lHBsC#10, el fragmento Accl a Sacl obtenido por la fijación por calor de dos oligonucleótidos: (aSEKDELs-F: 5?TACTCTGAGAAAGATGAGCTATGAGAGCT3' (SEC ID NO : 9 ) y un aSEKDELs-R: 5' CTCATAGCTCATCTTTCTCAGAGT 3' (SEC ID NO : 10 ) con un fragmento Xhol a Sacl de pBluescript SK+ . El plásmido resultante, pBSSKHBsCK#3 , se subclonó como se describe anteriormente para pHB103 por el fragmento Xhol/Sacl en pIBT211.1, y después el fragmento HindIII/EcoRI en pBHlOl para dar pHB105.

Constructo 35S-TEV-VSPaS-HBsAg-NOS El pHB1 06 (Fig. ÍA) contiene una inserción que codifica al péptido señal VSP "aS" de soya (Masón et al . , 1988), creando una extensión N-terminal de la secuencia codificante HBsAg con 21 aminoácidos codificados por: CCATGGCAATGAAGGTCCTTGTTTTCTTCGTTGCTACAATTTTGGTAGCATGGCAAT GCCATACC (SEC ID NO: 11). El pBSSKHBsC#6 se digirió con Ncol y se ligó con el fragmento Ncol de 67 bP de pVSP-alfa-Sig-GUS (DeWald, Ph.D. Thesis, Dept. of Biochemistry & Biophysics, Texas A&M University, College Station, TX . (1992)) . El plásmido resultante pSKHBsC-al faS#90, se subclonó como se describe anteriormente para pHB103 por el fragmento Xhol/Sacl en pIBT211.1, y después el fragmento HindIII/EcoRI en pBHOl para dar pHB106.

Constructo 35S-TEV-VSPaL-HBsAg-NOS El pHBl O l (Fig. ÍA) contiene una inserción que codifica al péptido señal VSP "aL" de soya (Masón et al . , 1988), creando una extensión N-terminal de la secuencia codificante HBsAg con 34 aminoácidos codificados por: CCATGGCAATGAAGGTCCTTGTTTTCTTCGTTGCTACAATTTTGGTAGCATGGCAAT GCCATGCGTA CGATATGTTCCCTCTCCGAATGAACACTGGCTATGGTGCC (SEC ID NO:12) . El pBSSKHBsC#6 se digirió con Ncol y se ligó con el fragmento Ncol de 106 bp de pVSP-al fa-Líder-GUS (DeWald, 1992) . El plásmido resultante pSKHBsC-alfaL#Ll , se subclonó como se describe anteriormente para pHB103 por el fragmento Xhol/Sacl en pIBT211.1, y después el fragmento HindIII/EcoRI en pBHOl para dar pHB107.

Constructo 35S-TEV-VSPaS-HBsAg-SEKDEL-NOS El pHB1 08 contiene una inserción en pHB105 que codifica al péptido señal VSP "aS" de soya (Masón et al . , 1988), creando una extensión N-terminal de la secuencia codificante HBsAg con 21 aminoácidos codificados por: CCATGGCAATGAAGGTCCTTGTTTTCTTCGTTGCTACAATTTTGGTAGCATGGCAAT GCCATACC (SEC ID NO: 13). El pBSSKHBsC#3 se digirió con Ncol y se ligó con el fragmento Ncol de 67 bp de pVSP-alfa-Sig-GUS (DeWald, 1992) . El plásmido resultante pSKHBsCKalfaS#23, se subclonó como se describe anteriormente para pHB103 por el fragmento Xhol/Sacl en pIBT211.1, y después el fragmento HindI 11 /EcoRI en pBHOl para dar pHB108.

Constructo 35S-TEV-VSPaL-HBsAg-SEKDEL-NOS El pHB1 09 contiene una inserción en pHB105 que codifica al péptido señal VSP "aL" de soya (Masón et al . , 1988), creando una extensión N-terminal de la secuencia codificante HBsAg con 34 aminoácidos codificados por: CCATGGCAATGAAGGTCCTTGTTTTCTTCGTTGCTACAATTTTGGTAGCATGGCAAT GCCATGCGTACGATATGTTCCCTCTCCGAATGAACACTGGCTATGGTGCC ( SEC ID N0:14) . El pBSSKHBsC#3 se digirió con Ncol y se ligó con el fragmento Ncol de 106 bp de pVSP-al fa-Líder-GUS (DeWald, 1992) . El plásmido resultante pSKHBsC-al faK#29, se subclonó como se describe anteriormente para pHB103 por el fragmento Xhol/Sacl en pIBT211.1, y después el fragmento HindI I I/EcoRI en pBHOl para dar pHB109.

Constructo 35S-TEV-TPSS-HBsAg-N0S El pHBH O (Fig. ÍA) contiene una inserción en pHB103 que codifica al péptido de tránsito y el péptido maduro parcial del N-término al rbcS de guisante o haba (Nawrath e t al . , "Plastid targeting of the enzymes required for the production of polihydroxybutyrate in higher plants". En " Bi odegradabl e Pl a s ti cs and Polymers , eds. Doi Y, Fukuda, K, Elsevier, Amsterdam, pp . 136-149 (1994)), creando una extensión N-terminal de la secuencia codificante HBsAg con 82 aminoácidos codificados por: CCATGGCTTCTATGATATCTTCTTCCGCTGTGACAACAGTCAGCCGTGCCTCTAGGG GGCAATCCGCCGCAATGGCTCCATTCGGCGGCCTCAAATCCATGACTGGATTCCCAG TGAAGAAGGTCAACACTTGACATTACTTCCATTACAAGCAATGGTGGAAGAGTAAAG TGCATGCAGGTGTGGCCTCCAATTGGAAAGAAGAAGTTTGAGACTCTTTCCTATTTG CCACCATTGACCAGAGATTCCATGG (SEC ID NO: 15) . El pUC-TPSS (Nawrath et al . , 1994) se sometió a PCR con los cebadores 5'TPSS (5'-GGATCCATGGCTTCTATGATATCTT-3' (SEC ID NO : 16 ) ) y 3'TPSS (5' -GGATCCATGGAATCTCTGGT CAATGGTGG-3' (SEC ID NO:17)) que se diseñaron para agregar sitios NBcoI a cada extremo de la secuencia rbcS . El pBSSKHBsC#6 se digirió con Ncol y se ligó con el producto de PCR digerido con Ncol que contiene la región codificante TPSS. El plásmido resultante pHB211.1TPSS#23 , se subclonó como se describe anteriormente para pHB103 por el fragmento Xhol/Sacl en pIBT211.1, y después el fragmento HindI I I/EcoRI en pGPTV-Kan (Becker et al . , 1992) para dar pHBHO.

Ejemplo 4. Secuencias de terminación alternativas, afectan la acumulación de proteína Los constructos discutidos en el Ejemplo 3 contienen el virus del grabado de tabaco (TEV) en el líder no traducido y el extremo nos 3' . Los vectores pHB104 (Fig. ÍA) y pHB114 (Fig. ÍA) , respectivamente, contienen los extremos terminales vsp y pi n2 al 3' en lugar del extremo nos al 3 ' . Estos vectores presentan un nivel superior de la acumulación de proteína por ARNm que HB103. El pHB104 se obtuvo por la subclonación del fragmento a partir de Sacl a EcoRI de pIBT210. lHBsC#l 0 en pHB103 para reemplazar el terminador Nos con el terminador VSP. Los casetes de expresión se muestran en la Fig. 1. El pHB11 4 contiene el terminador pin2 de papa de 400 bp (An et a l . , 1989). El pDP687 (Pioneer Hi-Bred International; Johnson City, IA) se digirió con BamHl y EcoRI y el terminador pi n2 de 400 bp se subclonó en pBluescriptKS . El pBlueKS-pin2 resultante, se digirió con Sacl y EcoRI para obtener el fragmento terminador pi n2, el cual se ligó con pHB103 digerido con Sacl y EcoRI para formar pHB114.

Ejemplo 5. Constructo con el líder TMV O El pHBl l l (Fig, ÍA) contiene el virus "O" UTR del mosaico del tabaco (Gallie et ai., 1992) en lugar del UTR TEV. Un fragmento EcoRV/Xhol del plásmido pBSG660 (Biosource Technologies, Inc., Vacaville, CA) contiene el extremo 3' del promotor 35S y el O-UTR se subclonó en los sitios EcoRV/Xhol de pIBT211.1HBSC#9 para crear el plásmido intermedio pHB21lO-5' . Para suprimir el líder TEV, el pHB21lO-5' se digirió con Xhol y Ncol, seguido por la nucleasa de judía mung para truncar los extremos y truncar la ligación. El plásmido resultante pHB211 se digirió con HindIII y EcoRI y el casette de expresión se clonó en pGPTV-KAN (Becker e t al . , 1992) para dar pHBlll.

Ejemplo 6. Secuencias promotoras alternativas El promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor es un promotor constitutivo fuerte que se expresa en casi todos los tejidos de las plantas. Otros promotores probados son el promotor para la patatina, el cual es la mayor proteína de almacenaje en papa, y el promotor de la sintasa de almidón enlazada al granulo (GBSS) . Ambos promotores accionan la expresión fuerte en el tubérculo. Estos constructos están identificados como HB145 (Fig. ÍA) y HB165 (Fig. ÍA) y se muestran en la Fig. 1. La formación de icrotubérculos podrán inducirse para probar los niveles de expresión debido a que el tejido de la hoja no puede analizarse con estos constructos .

A. Constructo Patatina-TEV-HBsAg-SEKDEL-NOS El pHB1 45 contiene el promotor del gen de patatina específico del tubérculo de papa, en lugar del promotor CaMV35S en pHB105. El pIBT240.1 se obtuvo por la subclonación del fragmento de patatina HindII I/BamHI de pPS20-GUS (Wenzler et al . , Plant Mol. Biol., 12:41-50 (1989) en los sitios HindIII/Xhol de pIBT210.1. El fragmento Ncol/Sacl de pBSSKHBsCK#3 se ligó a pIBT240.1 digerido con Ncol y Sacl, y el fragmento HindIII a EcoRI del plásmido resultante se subclonó en pBllOl para dar pHB145.

B. Constructo GBSS-TEV-HBsAg-SEKDEL-NOS El pHB1 65 contiene el promotor de la sintasa del almidón ligada al granulo específica del tubérculo (GBSS) (Visser et al . , Plant Mol. Biol., 17:691-699 (1991)) en lugar del promotor CaMV 35S en pHB105. El pPGBl (Visser et al . , 1991) se digirió con Salí y Sacl y se ligó con el fragmento Xhol al Sacl de pBSSKHBsCK#3 para formar pHB165.

C. Constructo Pin2-TMVO-HBsAg-pin2 El pHB131 contiene la secuencia codificante HBsAg nativa accionada por el promotor pi n2 de papa fusionado al virus del mosaico del tabaco (TMV) UTR 5'"O" (Gallie et al . , , 1992), y terminado por el elemento pi n2 al 3' de papa. El promotor pin2 es inducible a la lesión y puede permitir la expresión controlada de HBsAg en tubérculos. La construcción involucra una etapa intermedia para obtener el elemento pi n2 -3 ' en el fragmento SacI-EcoRI, en el cual el fragmento SacI-PstI de pRT38 se subclonó en pBluescriptKS para formar pKS-RT38. El promotor pi n2 (Palm et a l . , Proc . Na ti . Acad . Sci . USA 87:603-607 (1990)) se obtuvo de pRT24 (Robert Thornburg, Dept. of Biochemistry & Biophysics, Iowa State University, Ames, IA 50011) . El fragmento HindI I I-BamHI de pRT24 (1 kb) y los fragmentos pKS-OHB/BamHI-Sací (750 bp) se ligaron en pUC-V (que contiene el terminador vspB de soya) digerido con HindIII/Scal para obtener pHB231. El fragmento SacI-EcoRI de pKS-RT38 (Robert Thornburg, Dept. of Biochemistry & Biophysics, Iowa State University, Ames, IA 50011) que contiene el terminador pi n2 -3 ' entonces se obtuvo y se ligó con pHB231/HindI I I-Ncol que contiene el elemento líder promotor de pin2-TMVO, el fragmento pHB103/Ncol-Sacl que contiene la secuencia codificante HBsAg, y pGPTV-Kan/HindIII-EcoRI para dar pHB131.

D. Constructo Patatina-TMVO-HBsAg-vspB El pHB1 40 . 3 contiene la secuencia codificante HBsAG nativa accionada por el promotor del gen patatina específico del tubérculo de papa fusionado al virus del mosaico del tabaco (TMV) UTR 5'"O" (Gallie et al . , 1992), y terminado por el elemento vspB al 3' de soya. Un sitio Ba Hl se creó al extremo 5' del UTR O TMV usando el cebador mutagénico "Omega-Ma " (5' GATCGGATCCTTACAACAATTACCAAC-3' (SEC ID NO : 18 ) ) . Usando pHB211 como una fuente del UTR- O TMV al 5', la PCR se realizó usando el cebador "Omega-Bam" y un cebador corriente abajo, "NOS" ( 5' -CGGCAACAGGATTCAATC-3 ' (SEC ID NO: 19)), y un fragmento PCR de aproximadamente 800 bp se clonó en pBluescriptKS de extremo T para dar pKS-OHB. El fragmento pPS20/HindI I I-BamHI (promotor de patatina de 2.35 kb), se ligó con pKS-OHB/BamHI-Sací (750 bp) y pUC19/HindIII-Sacl (2.7 kb) para dar pPS-OHB. Finalmente, el fragmento pUC-V/SacI-EcoRl que contiene el terminador O vspB de soya, se ligó en pPS-OHB para dar pHB240.3, el cual contiene el promotor de patatina fusionado al UTR TMV "O" al 5' , y terminado por elemento vspB al 3 ' de soya. El cásete de expresión se obtuvo por la digestión de pHB240.3 con HindIII y EcoRI, y se ligó en pGPTV-Kan para dar pHB140.3.

Ejemplo 7. Codones optimizados de la planta para HBsAg La preferencia para el uso de codón varía entre las plantas y animales y muchas señales dentro de la secuencia de ADN no están conservadas (Ausubel, F. e t al . , eds. (1994) Current Protocol s i n Mol ecul ar Bi ol ogy, vol. 3, pp . A. 1C.3) . Por ejemplo, un incremento de 10-20 veces en la expresión de un gen sintético sobre la secuencia bacteriana nativa se ha expresado en las plantas . El análisis del gen HBsAg nativo, reveló que 9.7% de los codones no son favorables para las monocotiledóneas y 8.8% no son favorables para las dicotiledóneas (tales como papas) . En particular, existe una secuencia de terminación Pol II cerca del comienzo del gen, los trímeros 29 CnG y los dímeros 16 CG . Estas señales pueden afectar la elongación y estabilidad del transcripto, y por lo tanto, disminuyen la proteína HBsAg. Por lo tanto, los codones desfavorables y las secuencias de señales indeseables, los sitios de unión, y los sitios de metilación se pueden cambiar mientras se mantiene la misma o similar secuencia de aminoácido nativa. Para HBsAg, un total de 160 de 681 bases se cambiaron mientras se mantenía la secuencia de aminoácido nativa de la proteína. Véase la SEC ID NO : 3 (Fig. 22) y la SEC ID NO: 5 (Fig. 5). El contenido del AT resultante es 52.42% y la señal desfavorable se han alterado. Los vectores se proporcionan con la señal de terminación VSP 3' discutida anteriormente y un péptido señal aL se ha proporcionado en uno. Estos vectores se designan HB115-HB117 (Fig. ÍA y 21) .

A. Constructo 35S-TEV-sHBsAg-VSP El pHBl l d (Fig. ÍA y 21) contiene una secuencia optimizada de planta sintética que codifica a la proteína HBsAg. La secuencia nativa HBsAg se exploró para el uso del codón y para las secuencias problemas potenciales, incluyendo señales de procesamiento de ARNm espurio, tales como las señales de poliadenilación, sitios de unión, y señales de terminación de la transcripción, secuencias desestabilizantes de ARNm tales como "ATTTA" (Ohme-Takagi et al . , Proc . Na ti . Acad . Sci . USA 90:11811-11815 (1993)) y secuencias "DST" (Newman et al . , Plant Cell 5:701-714 (1993)), y la porción de metilación de citosina "CCGG".

Se diseñó un gen optimizado de planta que usa codones preferidos de plantas y carece de las secuencias problema potenciales. El gen diseñado entonces se agrupó a partir de los oligonucleótidos traslapantes usando el método descrito por Stemmer et al . , 1992. El producto final se digirió con Ncol y Sacl y se clonó en pGem5Zf+. Los clones #7 y #3 tienen un solo error cada uno, así el 5' del #7 se combinó con el 3' de #3. Un fragmento HincII/SacI se aisló de #7 y un fragmento Ncol/Bbsl se aisló de #3. Estos fragmentos se cortaron con Bfal y ligaron juntos con el vector pGEM5Zf+ cortado con Ncol y Sacl. El clon resultante, #8 se secuenció, nombrado psHB312, y se subclonó en pIBT210.1 a los sitios Ncol y Sacl (mini #18), entonces se subclonaron en pGPTV-Kan a los sitios HindIII y EcoRI para elaborar el pHB115. Este clon se encontró subsecuentemente que contenía un error de nucleótido (nt 595 es "G" en lugar de "T", el cual causa una substitución de aminoácido única Gly por Trp) en la región codificante HB la cual conduce a la creación de una versión corregida, pHB117 (véase abajo) . El pHBl l l (Fig. 6 y 21) es el mismo como pHB115 con la corrección del nucleótido en el gen HBsAg. El nucleótido incorrecto en psHB312 (posición 595 "G") se corrigió a "T" por mutagénesis dirigida al sitio (Axis Genetics pie, Cambridge, England), y se nombró pHBVIO. El fragmento Ncol y Sacl se subclonó en pIBT210.1 para crear pIBT210.1HBV entonces el fragmento HindI I I /EcoRI se subclonó en pGPTV-Kan para dar pHB117.

B. Constructo 35S-TEV-VSPaL-sHBsAg-VSP El pHBl l ß (Fig. ÍA y 21) contiene la secuencia "aL" VSP de soya al 5' del gen HBsAg sintético contenido en pHB115. El fragmento Ncol de pSKHBsC-al faL#29 se ligó al fragmento Ncol a Sacl de psHB312 y el vector pIBT210.1 digerido con Ncol y Sacl (mini #4 alfaL), después se subclonó en pGPTV-Kan (Becker, D., et al . , 1992) a los sitios HindIII y EcoRI .

C. Constructo 35S-TEV-aS-sHB5Ag-VSP El pHB1 1 8 (Fig. 7 y 21) contiene la secuencia "aS" VSP de soya al 5' del HBsAg sintético de pHB117. El fragmento Ncol que contiene el "aS" de pIBT210. lHBsCKaS (pHB308) se ligó al psHB317 para hacer psHB318. El fragmento HindIII a EcoRI entonces se ligó en pGPTV-Kan para elaborar pHB118.

D. Constructo 35S-TEV-aL-sHBsAg-VSP El pHB1 1 9 (Fig. 8 y 21) contiene la secuencia "aL" de soya al 5' del HBsAg sintético de pHB117. El fragmento Ncol que contiene el "aL" de pIBT210. lHBsCKaL (pHB309) se ligó al psHB317 para hacer psHB319. El fragmento HindIII a EcoRI entonces se ligó en pGPTV-Kan para elaborar pHB119.

E. Constructo E8-sHBsAg-pin2 El pHB120 (Fig. 9 y 21) contiene el promotor E8 ligado al sHBsAg con el extremo pin2 3'- El fragmento Ncol a Sacl que contiene el gen sHBsAg de psHBVIO se ligó al promotor EcoRI a Ncol E8 y pBluescript I ISK+ digerido con EcoRI y Sacl para elaborar psHB520. El fragmento HmdlII a Sacl de psHB520 se ligó a HindIII y Sacl digerido con HB131 que contiene el terminador pin2 resultante en pHB120.

F. 35S-TEV-sHBsAg-SEKDEL-pin2 El pHB121 (Fig. 10 y 21) contiene la señal de retención endoplásmica insertada al 3' del gen sHBsAg.

Los oligos 5' ATCTCTGAGAAGGATGAGCTTTAA 3' (SEC ID NO : 20 ) y 3' GACTCTTC CTACTCGAAATTTAGA 5' (SEC ID NO : 21 ) se hibridizaron y ligaron a psHBVIO digerido con Bbsl resultante en psHB521. El fragmento Ncol a Sacl de psHB521 se ligó al fragmento HindIII a Sacl de HB131 incluyendo el vector pGPTV Kan con el terminador pin2 y se ligó al fragmento HindIII a Ncol de pIBT210.1 que contiene el romotor 35S para crear pHB121.

G. 35S-TEV-aS-sHBsAg-SEKDEL-pin2 El pHB122 (Fig. 11 y 21) combina la señal aS con la señal KDEL (SEC ID NO:22) en el sHBsAg. El fragmento BstXI de pHB121 contiene el extremo 3' del sHBsAg con SEKDEL (SEC ID NO : ) y el terminador pin2 se ligó en pHB118 reemplazando el extremo 3' del gen sHBsAg y el terminador vsp para elaborar pHB122.

H. 35S-TEV-aL-sHBsAg-SEKDEL-pin2 El pHB123 (Fig. 12 y 21) combina la señal aL con la señal KDEL (SEC ID NO:22) en el sHBsAg. El fragmento BstXI de pHB121 que contiene el extremo 3' del sHBsAg con SEKDEL (SEC ID NO : 4 ) y el terminador pin2 se ligó en pHB119 reemplazando el extremo 3' del gen sHBsAg y el terminador vsp para elaborar ?HB123.

Ejemplo 8. Transformación de las plantas de papa La transformación estable de papa ( Sol an um t uberos um "Frito-Lay 1607") se alcanzó por la co-cultivación del disco de la hoja axénica. Haq T. et al . (1 995) ; Wenzler, H. et al . (1 989) . Los pasos se resumieron como sigue: Los explantes de tejidos se cortaron y se colocaron abaxiaies con la cara hacia arriba en las placas LCI por 3-4 días. Los explantes se colocaron en dilución agro por 10 minutos (agitación manual), después se tiñeron en papel secante estéril. Después del manchado, los explantes se colocaron abaxiaies con la cara hacia arriba nuevamente en placas LCI por 3-4 días. Después de la co-cultivación, los explantes se colocaron en placas LC1CK que contienen canamicina y carbenicilina por 5-7 días hasta que se desarrolló el callo. Los explantes con callos bien desarrollados se colocaron en cajas LC2CK por 2 semanas; después de 2 semanas, los explantes se colocaron en medios LC2CK frescos y se desarrollaron los brotes. Cuando los brotes son de aproximadamente 1.5 cm de longitud, se transfirieron a medios cm para la formación de la raíz. Se agregó carbenicilina a los medios cm para prevenir el crecimiento bacteriano en exceso. Crecimiento de Agroba c t eri um- solución madre LB : Se cultivó una colonia durante la noche en presencia de canamicina; solución madre YM : una colonia se cultivó durante un periodo de 36-48 horas en la presencia de canamicina . Debido a alguna variación en la expresión entre los eventos de transformación independientes, se espera que debido al sitio aleatorio de inserción, se seleccionen las líneas transgénicas independientes por el manchado Northern usando sondas específicas de la región codificante. Cuando se usa un promotor 35S, el ARN total de las hojas se selecciona. Cuando se usa el promotor de patatina, se obtiene el ARN a partir de microtubérculos desarrollados en cultivos axénicos. Los constructos promotores de patatina se seleccionan de microtubérculos generados por el subcultivo de los cortes de nudos de tallos a partir de brotes transformados nacientes en un medio alto en sucrosa. Las líneas transformadas más prometedoras son propagadas por el cultivo axénico de cortes de nudos; y las plántulas enraizadas son transplantadas al suelo y se hacen crecer en invernaderos. Para obtener tubérculos, las plantas se hacen crecer en un protocolo de dos etapas: (1) para los primeros 1.5-2 meses, o hasta el desarrollo suficiente del crecimiento vegetativo, usando iluminación de días largos (16 h) con iluminación suplemental en invierno, y (2) por 1.5-2 meses adicionales bajo condiciones de días cortos (12 h) . Los tubérculos son típicamente recuperados en rendimientos de 600-800 g por recipientes de 3 galones después de este régimen de 3-4 meses. Los tubérculos cosechados del primer cultivo se pueden usar para iniciar nuevas plantas después de un periodo de latencia de 1 mes .

Ejemplo 9. Incremento de la acumulación de HBsAg en las células de las plantas El nivel de la expresión de HBsAg en las células de plantas se puede incrementar mediante la incorporación de mejoramientos en el vector de expresión de las plantas que incrementan la transcripción/traducción del gen extraño. La transcripción, procesamiento de ARNm y acumulación, traducción, procesamiento post- traduccional y la acumulación se pueden afectar por los componentes del vector de expresión. Los estudios preliminares han demostrado una concentración del umbral celular crítico al cual el agrupamiento de VLPs que consiste de subunidades HBsAg se acelera, y que los VLPs son más estables que las subunidades no agrupadas. El ARNm de HBsAg (medido por densitometría de la señal de manchado Northern) es lineal cuando se traza contra la proteína rHBsAg (medido por ELISA) para los constructos HB103 y HB107. Una explicación posible de este resultado es que el HBsAg es más estable/resistente a las proteasas citoplásmicas de plantas si son dirigidos efectivamente al ER.

Ejemplo 10 Las plantas de papa transformadas crecieron en macetas en un invernadero o se hicieron crecer. Las plantas transgénicas que expresan HBsAg mostraron un hábito de crecimiento alterado a pesar de que se produjeron los tubérculos, los cuales podrían limitar los niveles absolutos de la expresión del antígeno en las plantas. Los resultados de los ensayos de la proteína HBsAg en el tejido de la hoja y el tejido del tubérculo de papas transformadas con los varios constructos mostrados en la Fig. 1, se dan en la Tabla 2. El nivel de HBsAg se muestra como % de proteína soluble total para los transformantes individuales que se expresan más alto para cada constructo. Hay una variación considerable en los niveles de expresión de HBsAg entre las líneas transformadas con pHB114, que varían de 0.2 a 16 µg por g de tubérculo. La proteína HBsAg forma partículas i n pl an ta y se pueden glicosilar. Ocurren tres secuencias potenciales de N-glicosilación en el antígeno, junto con numerosas ubicaciones posibles para la glicosilación 0-ligada. Se cree que solamente uno de los sitios N-ligados está glicosilado en los sistemas de mamíferos y solamente en un 40-50%. Los datos de estudios anteriores en tabaco transgénico muestran que las plantas pueden agrupar HBsAg en partículas parecidas a los virus (VLPs por sus siglas en inglés) similares en tamaño a los VLPs derivados de levadura recombinante y de suero de individuos infectados (aunque la distribución del tamaño difiere) . La localización precisa del antígeno dentro de un tubérculo no se conoce, aunque los niveles de la proteína se piensa son superiores en la capa justo por debajo de la piel.

Cantidades de HBsAg purificado/extraído se pueden incrementar por la adición de ß-mercaptoetanol al amortiguador de extracción.

Tabla 2 Expresión de HBsAg en mejores individuos Constructo ARNm Tejido de la Tejido deJ declinado hoja (%) tubérculo contra la (µg/g) proteína HB102 0.001 0.016 0.18 HB103 0.001 0.023 0.33 HB105 0.004 0.048 1.25 HB106 0.004 0.035 0.8 HB107 0.005 0.11 2.4 HB110 ND 0 ND HB104 0.004 0.19 6.5 HB114 0.005 0.22 16 HB145 ND 0.063 1.1 HB165 ND 0.021 -- HB111 ND 0.041 0.33 HB115 ND 0.13 2 HB116 ND 0.176 2 Ejemplo 11. Caracterización de tubérculos de la línea HB114-16 de papas transgénicas Este ejemplo describe experimentos diseñados para caracterizar el HBsAg recombinante producido en tubérculos de la línea HB114-16 de "FL1607" de tubérculos de papa, los cuales se transformaron con pHB114. Estos datos indican que el HBsAg que se produce en estos tubérculos tiene la estructura esperada para una proteína de vacuna inmunogénica, comparable con el HBsAg recombinante de levadura, usado para la vacuna comercial. Específicamente, la forma de partícula similar al virus agrupado (VLP por sus siglas en inglés) de HBsAg es más estable e inmunogénica que las subunidades no agrupadas, y así se considera una característica crucial del antígeno de la vacuna .

Contenido de VLP por el gradiente de sucrosa. Examinamos extractos a partir de tubérculos HB114-16 y tubérculos no transgénicos de control mediante la sedimentación del gradiente de sucrosa para determinar si el HBsAg agregado como VLPs describe la expresión del tabaco (Masón et al. 1992) . Un extracto crudo de un tubérculo se obtuvo por la pulverización de un tubérculo en nitrógeno líquido en una licuadora, después la adición de dos volúmenes en peso de PBS IX (pH 7.2), 0.1% de Tritón X-100, 10 mM de EDTA. El amortiguador congelado después del mezclado con el polvo congelado y se dejó que se descongelara lentamente en hielo. El extracto resuspendido se centrifugó a 14,000xg por 5 minutos a 4°C, y 0.5 ml del sobrenadante se formó en capas por arriba de un gradiente de sucrosa lineal al 30% en 10 mM de fosfato de sodio a pH 7.0 , 0.15 M de NaCl. Los gradientes que contienen 2 µg de partículas de HBsAg recombinante derivado de levadura purificado (rHBsAg) en 0.5 ml de PBS IX (pH 7.2), Tritón 0.1% X-100, 10 mM EDTA, ya sea con o sin extracto de tubérculo FL607, se corrieron al mismo tiempo para comparación. Los gradientes se centrifugaron en un rotor Beckman SW41 a 33,000 rpm por 5 horas a 4°C. ELISA por HBsAg (Auszyme monoclonal, Abbott Laboratories) se realizó en fracciones de gradientes, y el % de sucrosa se trazó contra ELISA OD . La Fig. 13 muestra que todas las muestras de HBsAg sedimentadas en un pico amplio preferentemente entre aproximadamente 8% y 22% de sucrosa. El perfil para el material de tubérculo se cambió ligeramente hacia la densidad superior pero en todas las muestras la proporción superior de los sedimentos de HBsAg entre 10 y 15% de sucrosa. El rHBsAg de levadura agregado a un extracto de tubérculos FL1607 no transgénicos mostró un perfil similar al rHBsAg de la levadura purificada, pero las señales de ELISA fueron un tanto inferiores. Los tubérculos FL1607 no transgénicos no mostraron señales de ELISA en el gradiente. Estos datos muestran que los co-sedimentos de HBsAg derivados de tubérculos con HBsAg derivados de levadura, y sugieren que el HBsAg derivado del tubérculo se agrupa como VLPs. Manchado Western. Se realizó un manchado Western para observar polipéptidos HBsAg en tubérculos HB114-16 que reaccionan con anticuerpos. Las muestras se desnaturalizaron en amortiguador de muestras de SDS-PAGE de reducción (100 M DTT, SDS al 2%) por la ebullición de 5 minutos, se sometieron a electroforesis, se mancharon por la membrana PVDF y se sometieron a sondas con antisuero de conejo policlonal contra HBsAg. La Fig. 14 muestra el manchado Western y una corrida en gel duplicada al mismo tiempo teñida con Coomassie. El gel teñido indica que las cantidades similares de la proteína total de tubérculo se cargaron para muestras tanto de HB114-16 (franja HB) como de FL1607 no transgénico (franja-) . En el manchado Western, 10 ng de rHBsAg derivado de la levadura (franja+) proporcionó un monómero de aproximadamente 25 kDa como se espera y un dímero a M, aproximadamente 40 kDa (bandas marcadas "Y" a la izquierda) . El material derivado de tubérculo (franja HB) contiene un monómero de aproximadamente 28 kDa y bandas grandes que pueden representar dímeros (bandas marcadas "P" a la izquierda) . El monómero derivado del tubérculo es probablemente glicosilado y por lo tanto de un tamaño más grande que el monómero derivado de la levadura. En tubérculos no transgénicos (franja-) se mostraron varias bandas no específicas tenues, pero no reaccionaron adversas en la región del monómero y dímero. De manera interesante, la proporción relativa de los dímeros a monómeros en el material de tubérculo es mucho mayor que aquélla de rHBsAg de levadura. Aunque este análisis se realizó bajo condiciones de reducción, la proporción substancial de los dímeros en el material de tubérculo indica que es más altamente y establemente reticulado al disulfuro, y así potencialmente más resistentes a la degradación, especialmente cuando se suministran oralmente. Se realizó un manchado Northern en el ARN total preparado de tubérculos de la línea HB114-16 de papa como se describe (Masón et al., 1996) . Como un control negativo, se examinó el ARN de tubérculos de líneas FL1607 de papas no transgénicas. Cinco µg de cada muestra se desnaturalizaron con formaldehído en amortiguador MOPS/acetato/EDTA a 65°C por 15 minutos, se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1%, y se transfirieron a la membrana ZetaProbe (BioRad) por manchado capilar. La membrana se fijó por irradiación UV en Stratalinker (Stratagene) y después se tiñó con azul de metileno para verificar la integridad del ARN y la densidad de carga. Se preparó una sonda usando etiquetación cebada aleatoria de un fragmento de ADN de 700 bp (que comprende la secuencia codificante HBsAg) obtenida por la digestión de pHB114 con Ncol y Sacl. El manchado se hibridizó con la sonda a 65°C en fosfato de sodio 0.25 M. PH 7.2; SDS al 7%; 1 mM de EDTA por 16 horas. La membrana se lavó con amortiguador 1 de lavado (40 mM de fosfato de sodio, pH 7.2; 1 mM de EDTA; SDS al 5%) 2 veces por 30 minutos cada uno a 65°C. La membrana se cubrió con plástico y formó imagen cuantitativamente con Phosphorlmager (Molecular Dynamics) . La Fig. 15 muestra los resultados obtenidos. Las franjas duplicadas se corrieron conteniendo la misma cantidad de cada muestra de ARN; una serie de franjas fueron tenidas de azul de metileno después del manchado. La fotografía a la derecha muestra el manchado del teñido de azul de metileno de la mitad del gel, lo cual indica que más del total de ARN de las muestras de hojas se cargaron que de la muestras de tubérculos. La calidad del ARN es buena como se juzga por la integridad de las bandas de ARN ribosómicas. La fotografía a la izquierda muestra el patrón de hibridación obtenido. El ARN de HB114-16 tiene una banda mayor a aproximadamente 1 kb en tanto las muestras de tubérculo como de hoja, representando el transcripto HBsAg de longitud completa. La mancha por debajo de la banda de 1 kb representa el ARN degradado. La banda tenue a aproximadamente 3 kb en la muestra de ARN de la hoja puede representar la transcripción a través de la lectura de la unidad de HBsAg debido a un nuevo sitio de inserción. Ni el tubérculo FL1607 no transgénico ni el ARNs de la hoja mostraron señales de hibridación. El análisis de PCR se realizó en el ADN genómico aislado de hojas HB114-16. La Fig. 16 muestra una banda mayor única que se obtuvo usando cebadores TEV (5' GCATTCTACTTCTATTGCAGC) (SEC ID NO: 23) y PIN2 que flanquea al gen HBsAg a los extremos 5' y 3' respectivamente. Esta banda fue del mismo tamaño como aquélla amplificada del plásmido pHB114 y no fue visible en el ADN genómico de FL1607 de control. El fragmento de PCR se escindió del gel y se secuenció para verificar que no hubiera mutaciones de la secuencia pHB114. Las secuencias fueron idénticas. Esto mostró que no hubo mutación o cambio en el gen HBsAg después de la transformación de la línea HB114-16.

Se realizó un Manchado Southern en las mismas muestras de ADN genómicas usadas para el análisis de PCR. Quince µg de cada muestra de ADN, y 10 ng del plásmido pHB114 se digirieron con varias enzimas de restricción o se quedaron sin digerir antes del f accionamiento en gel de agarosa al 0.8%, despurinación por el tratamiento con HCl, neutralización y transferencia a la membrana ZetaProbe (BioRad) mediante manchado capilar. La membrana se fijó por irradiación UV en un Stratalinker (Stratagene) . Se preparó una sonda usando etiquetación cebada aleatoria de un fragmento de ADN de 2 kb (que comprende el promotor 35S, TEV 5-UTR y la secuencia codificante HBsAg) obtenida por la digestión de pHB203 con HindIII y Sacl. El manchado se hibridizó con la sonda a 65°C en 0.25 M de fosfato de sodio, pH 7.2; SDS al 7%; 1 mM de EDTA por 16 horas. La membrana se lavó con amortiguador de lavado (40 mM de fosfato de sodio, pH 7.2; 1 mM de EDTA; SDS al 5%) 2 veces por 30 minutos cada uno a 65°C. La membrana se cubrió en plástico y se formaron imágenes cuantitativamente con un Phosphorlmager (Molecular Dynamics) . La Fig. 17 muestra el patrón resultante de hibridación, el teñido de bromuro de etidio del gel antes de transferir a Zetaprobe, un mapa del cásete de ADN-T, y la parte del ADN usado como la sonda. Las digestiones de Ncol y HincII resultaron en un fragmento interno al cásete de ADN-T que hibridiza a la sonda (INT) así como también otro fragmento que se extiende en el sitio de inserción del ADN-T. En las franjas HB114-16 digeridas con Ncol o HincII, al menos cuatro bandas diferentes de la banda interna se pueden contar (véase números a la derecha de la franja "Neo" y a la izquierda de la franja "HincII") . La explicación más probable de estos datos es que hay al menos 4 copias del ADN-T que contienen el cásete de expresión HBsAg integrado a sitios diferentes en el ADN genómico nuclear de HB114-16 (véase números en las bandas) . Las franjas que contienen el ADN FL1607 no hibridizan a la sonda. El EcoRV digerido, proporciona resultados inesperados, quizás debido a la digestión parcial o actividad inicial, y así se ignora .

Estabilidad del HBsAg en tubérculos almacenados 9 meses. Varios recipientes de tubérculos HB114-16 se colectaron en Mayo de 1998. Los tubérculos se almacenaron a 4°C en bolsas de papel separadas para cada recipiente.

Un tubérculo de cada uno de los 11 recipientes, se ensayó mediante ELISA para HBsAg (Auszyme monoclonal, Abbott Laboratories) dentro de dos semanas de la cosecha. Nueve meses después, dos tubérculos de los mismos 11 recipientes se ensayaron. La gráfica de barras en la Fig. 18, muestra la cantidad de HBsAg medida en Mayo de 1998 con barras negras y la cantidad medida en Febrero de 1999 con barras blancas. Los tubérculos tuvieron significantemente más HBsAg después del envejecimiento por nueve meses, basados en el peso de los tubérculos frescos. Esto puede explicarse por la deshidratación parcial de los tubérculos, de manera que el peso de un tubérculo es más bajo después del almacenaje que cuando es cosechado. Otra explicación puede ser que un poco de HBsAg está presente en la cosecha como subunidades de monómeros inapropiadamente plegadas, y que durante el almacenaje estas subunidades se pliegan correctamente y se agrupan para formar VLPs, así se permite que más del HBsAg se detecte. Finalmente, es posible que la síntesis adicional de los monómeros ocurra durante el almacenaje y que estas se agrupen en formas detectables por ELISA. (Se sabe que las células de tubérculos de papa son fisiológicamente activas durante el almacenaje a 4°C, como se evidencia por los cambios en el contenido de almidón y azúcar, y finalmente el brote de los botones y crecimiento de los retoños). Estos datos muestran que el HBsAg producido en tubérculos transgénicos, es estable por al menos nueve meses después del almacenaje a 4°C.

Ejemplo 12. Expresión de versiones modificadas de HBsAg en células de tabaco y análisis de reticulaciones de disulfuro Este ejemplo describe la expresión estable en células de tabaco transgénicas NTl del gen HBsAg optimizado de la planta, sintético, modificado en formas diferentes para los objetivos subcelulares. Estos estudios muestran que ciertas modificaciones causan un grado significantemente superior de reticulaciones de monómeros vía puentes de disulfuro. Puesto que más HBsAg altamente reticulados son potencialmente más estables y más inmunogénicos, un incremento de la reticulación se espera proporcione un mejor antígeno de vacuna. Además, puesto que el HBsAg recombinante derivado de la levadura (rHBsAg) no está altamente reticulado a menos que se extraiga y se trate con químicos que accionan la formación de puentes de disulfuro (Wampler, D., Lehman, E., Boger, J., McAleer, W. & Scolnick, E. Múltiple chemical forms of the hepatitis B surface antigen produced m yeast. Proc . Na ti . Acad. De Sci . USA 1985; 82, 6830-6834), el HBsAg derivado de planta representa un material potencialmente más inmunogénico cuando se suministra oralmente sin la purificación y/o tratamiento químico. Creamos líneas celulares de tabaco transgénico NTl por ADN mediado por Agroba c t eri um, suministrado con plásmidos pHB117, pHB118, pH119, pHB121, pHB122 y pH123. Estos constructos se describen más completamente en el Ejemplo 7, pero son brevemente descritas sus modificaciones en la Tabla 3 abajo. Todos contienen el gen HBsAg optimizado de planta sintético descrito en el Ejemplo 7, el cual se ha modificado aquí por ya sea una extensión N o C-terminal o ambas. Nuestra razón principal sugiere que el péptido señal N-terminal de la planta puede más efectivamente señalar el polipéptido HBsAg naciente al ER y permitir el plegado más eficiente de monómeros y agrupamiento de partículas como el virus reticuladas (VLPs) . El péptido señal aS contiene 21 aminoácidos, mientras el péptido señal aL comprende 14 residuos adicionales del mismo gen vspA de soya que contiene una señal de localización vacuolar potencial (Masón et al. 1988) . Además, una señal "SEKDEL" (SEC ID NO : 4 ) de retención ER C-terminal, puede concentrar las subunidades en el ER por el salvamento de los compartimentos de la endomembrana corriente abajo, y con ello, dirige la asociación más efectiva y la reticulación de monómeros.

Tabla 3. Plásmidos usados en este Ejemplo Nombre extensión N-termmal extensión C-terminal pHB117 ninguna ninguna pHB118 péptido señal vspA aS ninguna pHB119 péptido señal vspA aL ninguna pHB121 ninguna SEKDEL pHB122 péptido señal vspA aS SEKDEL pHB123 péptido señal vspA aL SEKDEL Usamos estos plásmidos para transformar células NTl de tabaco esencialmente como se describe (Newman TC, Ohme-Takagi M, Taylor CB, Green PJ. Las secuencias DST, altamente conservadas entre los genes SAUR de plantas, transcriptores reporteros objetivos para la rápida pudrición en el tabaco. Plant Cell 1993; 5:701-714). Las colonias de células callosas seleccionadas para crecer en 300 mg/L de canamicina, se ensayaron para la expresión de HBsAg. Las células se extrajeron con 2 ml por g de células en amortiguador (PBS, 7.2; 50 mM de ascorbato de sodio, 10 mM' de EDTA, 0.2 M de PMFS, TritonX-100 al 0.1%). Los extractos se clarificaron por centrifugación a 16,000xg por 3 minutos a 4°C, y los sobrenadantes se probaron por la proteína soluble total (TSP por sus siglas en inglés) mediante el ensayo Bradford (BioRad) y por HBsAg por ELISA monoclonal de Auszyme (Abbott Laboratories). La expresión varía grandemente entre las líneas, pero las líneas que expresan los niveles más altos para cada constructo se propagaron y usaron para estudios posteriores. La tabla 4 abajo, muestra los datos de expresión de un experimento representativo en el cual se ensayó una línea seleccionada de cada constructo. Todas las líneas expresaron niveles similares de TSP. Todas las formas modificadas se expresaron en niveles superiores de HBsAg que en la forma no modificada en la líneaa HB117-9, con la línea HB118-3 dando el nivel más alto. Debemos interpretar los datos con cautela, puesto que no se cuantifican los niveles de ARNm, los cuales podrían haber explicado algunas diferencias. Sin embargo, estas líneas se seleccionaron como las mejores líneas de 20 eventos aleatorios para cada experimento de transformación, y así es probable que las formas modificadas se realicen al menos así como también el HBsAg no modificado.

Tabla 4. HBsAg y proteína total en líneas celulares transgénicas NTl TPS HBsAg Línea (mg/ml) (TPS ng/ml) HB117-9 4.78 67 HB118-3 4.28 261 HB119-5 3.88 121 HB121-11 3.40 118 HB122-8 4.80 133 HB123-1 4.46 155 Control NTl 3.12 0 Inmunoprecipitación y análisis de reticulación Examinamos los extractos de células NTl para formas multiméricas de HBsAg por el manchado Western después del fraccionamiento de inmunoprecipitados bajo condiciones de reducción parciales. Las células se extrajeron y ensayaron como anteriormente para TSP y HBsAg. Las muestras que contienen 1 mg de TSP se diluyeron 10 veces con PBS que contiene Triton-x-100 al 1%, desoxicolato de sodio al 0.5%, y SDS al 0.1%, después se mezclaron con 1 µg de anti-HBsAg de cabra (Fitzgerald Industries, Concord, MA) . La reacción se incubó por 1 hora a 23°C, y después se mezcló con 15 µl de Proteína G más Agarosa (Calbiochem) y se incubó en un mezclador de rotación a 4°C por 16 horas. La matriz de agarosa se formó en perlillas y se lavó de conformidad con las instrucciones del proveedor antes de suspenderlas en 25 µl de amortiguador de muestra SDS-PAGE al 1.5X que contiene 80 mM de DTT. Las muestras de rHBsAg de levadura se inmunoprecipitaron en la misma forma. En el experimento 1, se examinaron las muestras de las líneas HB117-9, HB118-3, y HB121-11. Las muestras inmunoprecipitadas (IP) en el amortiguador de muestra SDS-PAGE se calentaron a 50°C por 5 minutos (condición de reducción parcial), se centrifugaron 16,000xg por 2 minutos, y 10 µl del sobrenadante cargado en un gradiente de minigel al 4-20% (BioRad) . El material restante se resuspendió y se calentó a 100°C por 20 minutos (condiciones de reducción rigurosas), se centrifugó 16,000xg por 2 minutos, y se cargaron 10 µl del sobrenadante en un segundo gel. Las muestras se sometieron a electroforesis, se electromancharon por membranas de PVDF y se probaron con el mismo suero anti-HBsAg de cabra usado para IP. La Figura 19 muestra los manchados de Western obtenidos. El panel A presenta muestras que se sometieron a condiciones de reducción parciales (50°C por 5 minutos) y el panel B presenta muestras con condiciones rigurosas dadas (100°C por 20 minutos) . El rHBsAg de levadura (50 ng) en las franjas 1, mostró una escala de multímeros bajo reducción parcial, lo cual es mucho menos pronunciado bajo reducción rigurosa. Los patrones similares se observaron para el rHBsAg de levadura purificada por IP (franjas 2), aunque el rendimiento de recuperación fue menor que el esperado. Observe que todas las franjas contienen una señal de aproximadamente 50 kDa que representa la cadena pesada del IgG de cabra que se usó tanto como para el gancho IP como para la sonda del manchado Western, y se incluyen en las franjas 7 como control. Las señales del dímero y trímero de HBsAg clasifican esta señal y están bien resueltas de dicha señal. El monómero HBsAg en la muestra HB117-9 (HBsAg no modificado) co-emigra con el monómero rHBsAg de levadura, y está presente con el dímero y las señales multímeras débiles bajo reducción parcial. Esto indica que el HBsAg fácilmente se retícula para formar multímeros cuando se expresan en las células de plantas. Aún bajo reducción rigurosa, una señal de dímero fuerte es evidente en la muestra HB117-9. Una par de señales M inferiores, débiles, se observa en la muestra HB117-9 que no está presente en el material derivado por la levadura, sugiriendo un caso de escisión único que proporciona 2 fragmentos HBsAg. Un estudio adicional es necesario para determinar si la escisión ocurre en las células vivas o como un resultado de la extracción. La muestra de células NTl no transgénicas (franjas 6), presenta una señal débil no específica que pasa entre el monómero HBsAg y el dímero y dicha señal está bien resuelta de ambos. Las franjas 4 contienen la muestra de células NTl HB118-3 con el HBsAg modificado con la extensión del péptido señal N-terminal de planta "aS2. La señal del monómero en esta muestra pasa a Mr ligeramente superior, lo cual sugiere que el péptido señal de planta no se desdoble en estas células NTl. Más interesantemente, la señal del dímero en muestras de HB118-3 parcialmente reducidas, es más intensa que el monómero, y los multímeros hasta un pentámero, se pueden distinguir con una mancha ascendente indicando substancialmente que los multímeros de orden superior están presentes. Aún con condiciones de reducción rigurosas, las señales del trímero y tetrámeros son fácilmente distinguidas, mostrando que las reticulaciones de disulfuro entre los monómeros son muy estables y resistentes a la reducción en las células HB118-3. Al igual que las señales M inferiores débiles 2, la muestra HB117-9, sugieren un desdoblamiento proteolítico parcial. Las franjas 5 en el Experimento 1 contienen muestras de la línea celular HB121-11 de NTl con el HBsAg modificado por la extensión C-terminal "SEKDEL" (SEC ID NO : 4 ) . La muestra parcialmente reducida muestra un monómero que pasa a Mr ligeramente superior, el cual es compatible con la extensión C-terminal. Además, los multímeros hasta los tetrámeros, son fácilmente observados mostrando un grado substancialmente superior de reticulación que en las células HB117-3. La reducción rigurosa convierte muchos multímeros a monómeros, pero está presente todavía, una señal fuerte de dímero. Como las líneas HB117 y HB118, las señales inferiores Mr débiles 2, sugieren un desdoblamiento proteolítico parcial en la muestra HB121.

En el experimento 2, las muestras de todas las 6 líneas transgénicas se examinaron. En este caso, las reacciones IP separadas se realizaron para la reducción parcial (50°C x 5 min) y la reducción rigurosa (100°C X 20 minutos), para obtener un resultado más cuantitativo. La figura 20 muestra los resultados; nuevamente las muestras del Panel A se redujeron parcialmente y las muestras del Panel B se redujeron rigurosamente. Las muestras HB117-9, HB118-3, y HB121-11 muestran los resultados compatibles con el Experimento 1, aunque la resolución de los multímeros de orden superior está menos definida bajo reducción parcial. La muestra HB118-3 en el Panel B (reducción rigurosa) nuevamente muestra reticulaciones altamente resistentes con los tetrámeros evidentes y los multímeros de orden superior probablemente en la mancha al Mr superior. Las franjas 4 en el Experimento 2 contienen la muestra HB118-3 de las células NTl con el HBsAg modificado con la extensión del péptido señal N-terminal de planta "aL" . En el Panel A, el monómero procesado del péptido señal A es aparente en aproximadamente la relación equimolar con una señal superior que probablemente represente la forma no procesada. Los multímeros también están presentes, los cuales son ampliamente cambiados a monómeros y dímeros en la condición de reducción rigurosa. Las franjas 6 y 7 contienen muestras HB122-8 y HB123-1, respectivamente, en las cuales el HBsAg se extiende en ambos N y C-términos. En estas muestras (Panel B) , los tetrámeros serán evidentes aún bajo condiciones de reducción rigurosas. La línea HB123-1, la cual porta la extensión peptídica de señal de planta "aL" y la extensión SEKDEL C-terminal (SEC ID NO: 4), muestran procesamiento parcial aparente del péptido señal, similar a la línea HB119-5 que porta el péptido señal de planta "aL" sola, Además, es aparente que el péptido señal "aL" más largo sea más eficientemente procesado que el péptido señal "aS" más corto en estas células NTl. En conclusión, el HBsAg expresado en células cultivadas NTl de tabaco, fácilmente forma multímeros de disulfuro reticulados. La reticulación está ampliamente incrementada cuando ya sea las formas "aS" o "aL" del péptido señal vspA de soya están fusionadas al N-término del gen HBsAg optimizado de planta. Estos datos indican que el HBsAg producido en la planta, especialmente cuando se fusiona a un péptido señal de planta, es un antígeno de vacuna superior para usarse en el suministro oral de un material hospedero no procesado o crudo.

Ejemplo 13. Expresión del adyuvante oral en papas La subunidad B LT de E . col i s e puede expresar en tubérculos de papa en una forma que es inmunogénica cuando se alimenta directamente a ratones sin que la preparación sea distinta a las rebanadas, con la expresión incrementada de la secuencia de aminoácido SEKDEL (SEC ID NO : 4 ) (Haq, T. et al . , 1995) . Como se mencionó aquí, la proteína LT-B se puede usar como un portador de vacuna. La expresión de la proteína LT-B se puede incrementar en gran emida todavía más por el empleo de codones optimizados de planta de la secuencia codificante de la proteína. Los niveles de expresión diferenciales se muestran en la Tabla 5. Tabla 5 Región codificante Modificación (s) LTB, proteína (plasmido) soluble total ng/mg LT-B nativo Sitio de inicio de 70 (pLTBHO) la traducción optimizado LTB-SEKDEL Extensión SEKDEL 190 (pLTKHO) C-terminal LT-B (pTHllO)* Codones 4640 sintético optimizados de la planta, poliadenilación espuria y señales de unión * La construcción de pTHllO se describe en Masón, H., et al . , (1998), Vaccine , 16:1336-1343.

Ejemplo 14. Plantas de papas transgénicas que coexpresan HBsAg y adyuvante mucosal del mutante LT de E . coli en tubérculos Para evitar los problemas logísticos involucrados en las preparaciones de mezclado y estabilización que contienen el antígeno de vacuna y el adyuvante, es conveniente proporcionar un material comestible que tenga ambos componentes sin necesitarlos para la preparación. A este extremo, se pueden producir las plantas de papa transgénicas, las cuales coexpresan y acumulan HBsAg y el mutante LT de E. col i en sus tubérculos. Se han construido los vectores de plásmidos que permiten la co-expresión en las plantas de las subunidades A y B de la enteroxotina inestable al calor de E . col i (LT) y los mutantes de los mismos. Estos también son el tema de la solicitud co-pendiente Estadounidense Serie No. 60/113,507. Para coexpresar el HBsAg con LT en plantas de papa, una planta de papa se transforma con un plásmido usado como un hospedero para la transformación con un vector binario que contiene un cásete de expresión HBsAg y confiere resistencia al antibiótico. Un ejemplo del plásmido formador es el pSLT102, el cual expresa LT-K63 agrupado (mutación S62 a K63 en LT-A) y lleva el gen NPT-II de resistencia a la canamicina. Los ejemplos de plásmidos adecuados para la preparación de un vector que tiene resistencia al antibiótico son pGPTV-HYG (higromicina) y pGPTV-BAR (fosfinotricina) (Becker, D., et al . , 1992). El plásmido deseado se construye por digestión de pHB17 con HindIII y EcoRI para obtener el cásete HBsAg, y la ligación con pGPTV-HYG o pGPTV-BAR digerido del mismo modo. El vector binario resultante es entonces usado para transformar el hospedero de la línea de papa que expresa LT-K63 usando selección en los medios que contienen 20 mg/L de higromicina a 1 mg/L de fosfinotricina. Ejemplo 15. Inmunización oral de ratones con HBsAg expresado en tubérculos de papa Ratones BALB/c se alimentan con rebanadas de papa (5 g papa/alimento/animal) que expresan HBsAg. Como se muestra en las Figuras 3 y 4A-E, los ratones desarrollaron respuestas IgM y IgG del suero que son específicas a HBsAg. Un grupo de animales de control alimentados con papas no transformadas, no generó anticuerpos. La toxina del cólera (Sigma, St . Louis, MO) se usó como un adyuvante oral en estos estudios. Diez µg de adyuvante se colocaron en las rebanadas de papas y se consumieron por los animales junto con el antígeno. Este experimento se repitió dos veces con un total de 10 ratones en tanto los grupos experimentales como de control. Los tubérculos de papas en estos experimentos expresaron solamente 1.1 µg de HBsAg/gm de papa. Por lo tanto, cada animal recibió solamente 5.5 µg de HBsAg por alimento. Esto probablemente refleja directamente la respuesta primaria modesta estimulada. Aún así, cuando ambos grupos de ratones se pusieron a prueba con una dosis sub-inmunogénica de rHBsAg derivada de levadura al día 60, solamente aquéllos alimentados con papas transgénicas elaboraron una respuesta anti-HBsAg secundaria, confirmando que se ha establecido una respuesta celular de memoria. Cuando la respuesta inmune se analizó en términos de las clases y subclases de inmunoglobulinas, una respuesta IgM seguida por una respuesta IgG se observó en todas las subclases. No se podrá medir una respuesta IgA del suero.

Ejemplo 16. Transformación de plantas de tomate Las plantas de tomate se pueden transformar de conformidad con el protocolo de Frary/Fillati et al . (1987) Bi o t echnol ogy 5:726-730), como se modifica aquí: Se esterilizaron semillas (100 semillas-380 mgs) (Tanksley TA234TM2R) y se sumergieron en blanqueador CHLOROX al 20% por 20 minutos. Las semillas se enjuagaron bien con agua mili-Q estéril (2 o más veces) y se siembran en cajas de Magenta que contienen MSO (aproximadamente 30 semillas/caja) . El día previo al corte de los cotiledones, 2 mL de cultivos de suspensión NT-1 de una semana de edad, se pipetearon en una placa de medio KCMS . (Las células NT-1 se subcultivaron semanalmente (2:48) en un medio de líquido KCMS) . La suspensión se cubrió con un filtro Whatman estéril y se cultivó en la oscuridad, durante la noche. Los cotiledones se cortaron 8 días después del sembrado. Las plántulas se colocaron en un papel secante estéril humedecido con agua estéril. Los cotiledones se excisaron en el peciolo y las puntas se cortaron. Se cortaron a la mitad nuevamente si el tamaño del cotiledón es superior a 1 cm. Los explantes se colocaron en placas alimentadoras adaxiales con la cara hacia abajo y se cultivaron a 25°C, por un fotoperiodo de 16 horas, durante la noche. Para la transformación, el Agroba c t eri um se sometió a estriado en una placa de medio selectivo LB aproximadamente 1 semana antes de la transformación y se incubó a 30°C. El medio selectivo líquido se inoculó con Agroba c teri um mediante la selección de una colonia única de la placa de estriado, e inoculación de 3mL de medio YM con 150 µ de sulfato de canamicina. El cultivo es vigorosamente sacudido a 30°C por 48 horas. Un mL del cultivo se inocula en 49 L de medio YM con 2.5 mg de sulfato de canamicina y se cultiva en un matraz de 250 mL sacudido vigorosamente a 30°C por 24 horas. La densidad óptica se mide a 600 nm. La O.D óptima se considera como 0.5 a 0.6. El cultivo de Agroba c t eri um es centrifugado a 8,000 rpm (Sorvall centrifuge, rotor ss34 por 10 minutos. El YM es vertido completamente y la pelotilla resuspendida en MS-O, al 2%. La O.D final deberá estar entre 0.5 y 0.6. Veinticinco mL de cultivo de Agroba c t eri um se pipetea en una caja Magenta estéril. Los explantes se transfieren de 2 a 3 placas en el inoculo en la caja de magenta y se incuban por 5 minutos, con sacudimiento ocasional. Los explantes son removidos a un papel secante estéril. Los explantes se regresan a las placas alimentadoras, adaxiales con la cara hacia abajo y las placas se sellan con película Nesco. Los explantes se co-cultivan por un fotoperiodo de 16 horas a 25°C por aproximadamente 24 horas. Los explantes se transfieren a los medios de selección (2Z) adaxial con la cara hacia arriba. Las placas se sellan con cinta microporo y se regresan a 25°C, por un fotoperiodo de 16 horas. Los explantes se transfieren a nuevas placas de medio de selección IZ cada 3 semanas. Cuando los brotes aparecen se transfieren a cajas de magenta IZ.

Ejemplo 17. Regeneración de tomates transgénicos. Dentro de 4 a 6 semanas iniciales deberán aparecer los brotes. Los brotes son escindidos de los explantes cuando los brotes son de al menos 2 cm e incluyen al menos 1 nudo. Se colocan en cajas de magenta (4/caja) que contiene un Medio Enraizante de Tomate con agentes selectivos. Las raíces deberán aparecer en aproximadamente 2 semanas. Se emplean las condiciones de crecimiento en Invernaderos estándares: día de 16 horas; temperatura promedio: 24.5°C; fertilizada cada vez en abundante agua: 100 ppm. EXCELL (15-5-15) con calcio y magnesio extras; las papas crecieron en METRO-MIX 360; los tomates crecieron en Mezcla Cornell + OSMO; los controles biológicos se usaron tan pronto como fue posible para mejorar la calidad total de la planta.

Ejemplo 18. Ensayo ELISA para la Medición de los Anticuerpos Específicos Anti-HBsAg del Suero El suero de ratón se evaluó para los anticuerpos específicos anti-HBsAg usando un equipo de diagnóstico de inmunoensayo de enzima (EIA) AUSAB comercialmente disponible (Abbott Diagnostics, Chicago, IL) , usando los métodos descritos en otra parte (Pride, M. et al . , 1998). El uso del panel de cuantificación AUSAB, permite la conversión de los valores de absorbencia a mlU/mL.

Ejemplo 19. Distribución Isotipo de la Respuesta Anti-HBsAg La distribución de isotipo de la respuesta anti- HBsAg se determinó usando el equipo de sub-isotipeado de tipificador de Ratón (Bio-Rad; Richmond, CA) . Los extractos de suero, saliva y fecales, se incubaron en perlillas revestidas con HBsAg (del equipo EIA de Abbott) y el anticuerpo enlazado se detectó usando antisuero de conejo específico de la subclase anti-ratón (Bio-Rad, del panel de inmunoensayo de enzima (EIA) de grado Tipificador de Ratón) .

Ejemplo 20. Detección de la Producción de Anticuerpos Específicos CT(LT) por ELISA. Este ensayo se incluye para que sirva como un control positivo. Las respuestas anticuerpo sistémicas obtenidas siguiendo la administración oral de CT/LT, están bien documentadas, y por lo tanto, permiten la evaluación si las respuestas son comparables. El CT-B se ensaya como se describe por Masón et al . , 1992. 1998) .

Ejemplo 21. Medición de las Respuestas Anticuerpo en Secreciones Mucosales Para medir los niveles de anticuerpos en las secreciones mucosales, se colectaron muestras de defecación y saliva como sigue: Defecaci ones : Se colectaron pelotillas fecales recientemente evacuadas a partir de animales individuales y se almacenaron en tubos Eppendorf a -70°C. Antes del ensayo, las pelotillas se resuspendieron en PBS (50 µl por pelotilla), y los tubos se dejaron permanecer a temperatura ambiente por 15 minutos, después se sometieron a vórtices vigorosamente y se incubaron a 20°C por 15 minutos. Las muestras se sometieron a vórtices nuevamente y se centrifugaron a 1,000 xg por 5 minutos. El sobrenadante se colectó y se usó inmediatamente en el ensayo de ELISA. Este método es esencialmente como se describe por de Vos & Dick. J. Immunol. Methods, 141:285-288 (1991) . Sal i va : Se colectó la saliva en tubos capilares después de la inyección i.p. de ratones con 0.1 mL de 1 mg/mL de solución de pilocarpino. Se tomó cuidado para colectar el primer flujo de saliva en todos los casos. Las muestras se transfirieron a tubos Eppendorf y se almacenaron a -70°C hasta que se ensayó.

Ejemplo 22. Preparación de suspensiones celulares individuales Se obtuvieron suspensiones celulares individuales de los bazos por el desmenuzamiento paulatino del tejido a través de una pantalla de acero inoxidable estéril. Las células linfoides de Placas de Peyer (PP por sus siglas en inglés) se aislaron por la escisión de PP a partir de la pared del intestino delgado. Las células se disociaron en medio modificado Joklik (GIBCO, Grand Island, NY) , que contiene 1.5 mg de la enzima proteasa neutral Dispasa (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianápolis, IN) por mL o 0.5 mg/mL de colagenasa, como se describe previamente (Kiyono, H. et al . PNAS USA 79:596-600 (1982)).

Ejemplo 23. MANCHADO ELI (ELISPOT) de las células B Este ensayo se realizó usando células aisladas como se describe anteriormente a partir del bazo y las Placas de Peyer, permitiendo la comparación de las respuestas vistas en la inducción sistémica (bazo) y mucosal (Placas de Peyer) . Las células que forman manchas IgM, IgA e IgG específicas al antígeno y totales (SFC por sus siglas en inglés), se enumeraron en suspensiones celulares mediante el MANCHADO ELI específico al antígeno como se describe en alguna parte (por ejemplo., Current Protocols in Immunology) .

Ejemplo 24. Análisis de células Thl y Th2 en tejidos asociados al intestino y sistémicos de murina, después de la ingestión oral de las papas transgénicas Se puede examinar la naturaleza y cinética de las respuestas de las células T generadas como una consecuencia de ratones alimentados con plantas transgénicas que expresan HBsAg o cualquier polipéptido inmunogénico. Usando las células T enriquecidas del bazo o las placas de Peyer de ratones inmunizados oralmente con un péptido microencapsulado sintético, estimula las respuestas proliferativas de las células T específicas del antígeno. Estudios similares se pueden realizar en ratones alimentados con papas transgénicas. También se puede analizar la frecuencia de las células tipo Thl y Th2 en ambos tejidos asociados a la mucosa y sistémicos de ratones alimentados con plantas que expresan HBsAg transgénicas. La frecuencia de las células Thl o Th2 en los tejidos mucosales tales como Placas de Peyer influencian la respuesta específica del isotipo que ocurre. Se pueden tomar tres procedimientos: (i) los ensayos celulares individuales específicos de la citosina para cuantificar el número de células específicas del antígeno que secretan una citosina particular, (ii) medición de citosinas secretadas usando ensayos ELISA específico, y (iii) análisis de PCR específico de la citosina. Los primeros dos procedimientos permiten determinar el nivel de síntesis y secreción de las varias citosinas, mientras el tercer procedimiento determinará si estos son cambios concomitantes en la producción de ARNm. La combinación de estos procedimientos permitirá la determinación si un incremento en la citosina particular es una consecuencia directa de incremento en la expresión del ARNm de la citosina. Proliferaci ón In vi tro de Cél ul as T de Pl a cas de Peyer y de l os Ba zos . Una semana después de la tercera alimentación, los animales se sacrificaron, se colectaron los bazos y las células se purificaron como se describe previamente (Pride, M. et al . , 1993) . Las placas de Peyer se colectaron y las células se disociaron como se describe anteriormente. Las células T enriquecidas (2.5 x 10D células por pozo) se colocaron en placas de fondo liso de 96 pozos junto con células de bazos singenéicos irradiados 5 x 10° como una fuente de las células que presentan antígenos. Después de la adición del antígeno, las células se cultivaron por 120 horas como se describe. La proliferación, medida por la incorporación de [3H] timidina, se determinó por espectroscopia de escintilación líquida. Los resultados se expresan como la media cpm de [3H]-TdR incorporada de los pozos triplicados . Enumeración de las Células T que producen Cítosina . La enumeración de las células que producen citosina dentro de los cultivos de las células T específicos del antígeno re-estimuladas in vitro, se determinó por MANCHADO ELI usando anticuerpos monoclonales anti-citosina de pares igualados. Ensayo de ELISA específico de la Citosina . La cantidad de citosinas producidas en los sobrenadantes de cultivos de células de bazos y células T de placas de Peyer, se ensayó por ELISA (Current Protocols in Immunology) , usando el mismo anti-citosina mAbs en el ensayo ELISPOT o MANCHADO ELI.

Análisis de PCR específico de la citosina . Para la detección de ARNm específico de IFN-?, IL-2, IL-4, IL-5 e IL-6 en células T CD+4 (células de bazos y Placas de Peyer), se empleó un protocolo de amplificación PCR-RT estándar y se modificó como se describe previamente (Kiyono, H. et al. , 1982) . Para el aislamiento del ARN, se usa el método del procedimiento de extracción de cloroformo fenol tiocianato de guanidio ácido (Chomczynski & Sacchi, Anal. Biochem. 162:156 (1987)) . El ARN se extrajo y después se sometió a PCR-RT específico de la citosina usando 2.5 U/µL de Transcriptasa Inversa Superscript II (Life Technologies) . Los productos de PCR separados por electroforesis en geles de agarosa al 2% se tiñeron con bromuro de etidio (0.5 µg/mL) y se visualizaron bajo luz UV . Para la cuantificación de ARNm específico de INF-? e IL-4, se ha adoptado una PCR-RT usando ARNm recombinantes (ARNrc) como estándar interno. Un ARNrc conectado para IFN-?, IL-4, y ß-actina, se ha construido como se describe en otra parte (Wang e t al . , PNAS USA 86:9717-9721 (1989)). La reacción de la PCR realizó en 50 µL de amortiguador PCR, 3 mM de MgCl2, 0.2 M de cada dNTPs, 30 pmol de cebadores delanteros e inversos de ARNm para IFN-?, IL-4 y ß-actina, 200 ng de ADN genómico (gen separador) y 2.5 unidades de polimerasa Ta q (Perkin-Elmer Cetus, Foster City, CA) a 85°C. Se listan los cebadores adecuados en la Tabla 6. Después del calentamiento a 94°C por 3 minutos, las muestras se sometieron a ciclos 30 veces con un paso desnaturalizante de 30-s (94°C), un segundo proceso de calentamiento (59°C) y un paso de extensión de 45-s (72°C) en un ciclador térmico (Perkin-Elmer Cetus) . Un paso de extensión de 5 minutos (72°C) se realiza al final del procedimiento. Los productos PCR se purifican con el Sistema de Purificación de ADN Preps de PCR Wizard (Promega Corp., Madison, Wl). Después de la construcción de este gen sintético que contiene IFN-?, IL-4 y ß-actina, el producto PCR se insertó en un vector pGEM-T que contiene el promotor de la polimerasa T7 (Promega). La transformación se realiza mediante el uso de Eschl eri chi a col i JM109. Para obtener ARNrc, un gen sintético purificado es linealizado por Spel (Promega),. Para obtener el ARNrc purificado, los transcriptos son tratados con RQIDNasa (Promega) y después purificados además usando partículas de látex Oligotex-dT (equipos de ARNm de Oligotex-dT, QUiagen, Chatsworth, CA) . Tabla 6. Lista de cebadores para la citosina por PCR específica ß-Actina(349bp):5'Cebador5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAA?C- ' (SEQ ID NO:24) 3'Cebador 5'- TAAAACGCAGCTCAGTA?CAGTCCG-3' (í$8§ í? N&2á} IFN-? (460bp): 5'Cebador 5'-TGA ACG CTA CAC ACT GCA TCT TGG-3 $18 ?? ):¥¿ 3'Cebador5' -CGA CTC CTT TTC CGC TTC CTG AG-3' (SEC ID NO:27) IL-2(502bp) : 5'Cebador 5' -?TG TAC AGC ATG CAG CTC GCA TC-3' (SEC ID NO:28) 3'Cebador5' -GGC TGG TTG AGA TGA TGC TTT GAC A-3' (SEC ID NO:29) IL^) (399bp) : 5 'Cebador 5' -ATG GGT CTC AAC CCC C?G GAA GTC-3' (SEC ID NO:30) 3 'Cebador 5' -GCT CTT TAG GCT TTC CAG GAA GTC-3' (SEC IDNO:31) IL-5 (243bp) : 5 'Cebador 5' --ATG ACT GTG CCT CTG TGC CTG GAG C-3' (SEC ID NO:32) .3'Cebador5' -CTG TTT TTC CTG GAG TAA ACT GGG G-3' (SEC ID NO:33) IL-6(155bp): 5 'Cebador 5' -CTG TTT TTC CTG GAG TAA ACT GGG G-3' (SEC ID NO:34) 3 'Cebador 5' -5' -TCT G?C CAC AGT GAG GAA TGT CCA C-3' (SEC ID NO:35) IL-10(237bp) : 5 'cebador 5' -ACC TGG TAG AAG TGA TGC CCC AGG C-3' (SEC ID NO:36) 3' cebador 5' -CTA TGC ?GT TGA AGA TGT CA? A-3' (SEC ID N0.37) TNF-a(354bp) :5'cebador5'-TTCTGTCTACTGAACTTCGGGGTGATCGGTCC-3' (SEC IDNO:38) 3 'cebador 5'-GTATGAGATAGCAAATCGGCTGACGGTGTGCC-3' (SEC IDNO:39) Para la PCR-RT competitiva, el ARN total se corre con ARNrc específico de la citosina como un patrón competitivo.' Las alícuotas de ARN total (8-630 ng para IFN-?, 11-900 ng para IL-4, y 0.19-15 pg para ß-actina) se perforaron con una serie de estándares internos de ARNm diluido. Una PCR-RT estándar entonces se realizó (Véase Tabla 7) . La cuantificación se alcanza por la adición de 5 µCi de [32P]dCTP (Amersham, Arlington Heights, IL) a la mezcla de reacción PCR. Duchmnann et al., ADN and Cell Biol. 12:217. 1993. Finalmente, los productos de PCR son sometidos a electrofóresis como se describe anteriormente. El contenido de [J¿P]dCTP de las bandas específicas de INF-?, IL-4, y ß-actina se determina por el conteo de escintilación líquida.

Tabla 7 Condición RT Condición PCR 42°C 15 minutos 95°C 2 minutos 1 ciclo 99°C 5 minutos 95°C 1 min 60°C 35 ciclos 1 minuto 5°C 5 minutos 60°C 7 minutos 1 ciclo. 4°C remojo Ejemplo 25. Efecto de la Concentración de Detergente en la Extracción de HBsAg a partir de Plantas Una cepa DX del virus X de la papa (PVX) basado en el vector del virus de la planta, se usó para expresar el antígeno en la superficie de la hepatitis B en plantas (HBsAg) . El gen HBsAg sintético, optimizado para la expresión in planta, se amplificó por la reacción en cadena de la polimerasa, a partir del plásmido psHB312 descrito en el Ejemplo 7 bajo pHB115, usando cebadores de oligonucleótidos en los cuales se han introducido los sitios para las enzimas de restricción CLAI y Xhol . El producto de amplificación se digirió con estas enzimas y el producto de digestión que contiene el gen HBsAg se ligó al fragmento de nueve pares de kilobase del plásmido pDXlOa digerido con las mismas enzimas. El plásmido pDXlOa es un derivado de pUC19 que tiene sitios de restricción CLAI/Xh ol que rompen la secuencia codificante de la proteína cubierta del genoma PVX . Este produce un plásmido, pDX10a-HBV6 que contiene un clon de ADNc infeccioso de longitud completa de la cepa DX de PVX, bajo el control de un promotor T7, en el cual, un gen de proteína revestida de PVX se reemplaza con el gen para HBsAg. El constructo se diseñó de manera que la expresión de HBsAg se podrá accionar a través de la producción del ARNm que codifica al HBsAg a partir del promotor subgenómico que dirige de manera natural, la producción del ARNm subgenómico para la proteína revestida PVX. El ADN de pDX10a-HBV6 se linealizó con la enzima de restricción Spel y el ADN linealizado se transcribió i n ví tro con la polimerasa T7 usando un equipo de mMáquina mMensaje Ambion T7 de conformidad con las instrucciones del fabricante. Los productos de transcripción se inocularon manualmente en plantas de Ni coti ana ben thami ana que expresan transgénicamente a la proteína revestida PVX. La forma modificada de las infecciones sistémicas producidas por el virus en las plantas, cuando se complementan transgénicamente para el gen viral suprimido, la proteína revestida. El análisis de SDS-PAGE y manchado Western de extractos a partir de plantas infectadas, demostró la expresión de dos proteínas que fueron inmunoreactivas con el antisuero específico de HBsAg: estas se presume, representan las formas glicosiladas y no glicosiladas de la proteína HBsAg viralmente expresada. La purificación de la proteína HBsAg expresada viralmente i n pl an ta , se probó usando una forma modificada del procedimiento descrito por Masón et al . , (1992) para permitir su caracterización. El tejido de la hoja sistémicamente infectado se homogeneizó en cuatro volúmenes de amortiguador de extracción usando un triturador y un mortero. Lo homogeneizado se centrifugó a 1000 x g por 5 minutos, y el sobrenadante se centrifugó a 27,000 x g por 15 minutos. El sobrenadante 27,000 x g se centrifugó a 100,000 x g por 1 hora. Las alícuotas del homogeneizado crudo y los sobrenadantes de cada una de las etapas de centrifugación se tomaron para SDS-PAGE y el análisis del manchado Wester con antisuero específico HBsAg. La inspección visual del manchado western mostró que no hubo formación significativa de pelotillas del HBsAg durante la primera centrifugación a baja velocidad, pero hubo significante pérdida de la proteína expresada durante la segunda etapa de centrifugación y que la mayoría del HBsAg soluble residual se formó en pelotillas durante la tercera centrifugación a alta velocidad. La observación de que cantidades substanciales de HBsAg se perdieron durante la centrifugación de velocidad intermedia, sugiere que la proteína fue ineficientemente extraída con el amortiguador usado, posiblemente debido a sus características conocidas de asociación de la membrana. Por lo tanto, para probar si la extracción de la proteína podría incrementarse, su extracción se ensayó con amortiguadores que contienen diferentes niveles de detergentes . El tejido de la hoja sistémicamente infectado se homogeneizó en dos volúmenes de amortiguador que contiene 0.01M de fosfato de sodio (pH 7.0) y 0. ÍM de ascorbato de sodio usando un triturador y un mortero. Alícuotas de 5 mL del homogenizado crudo se tomaron y se homogenizaron por unos 2 minutos adicionales en el triturador y el mortero con un volumen igual de amortiguador suplementado con ya sea 0.2%, 1%, 2%, 5% o 10% de Tritón X-100, como un detergente no iónico representativo. Los homogenizados se incubaron en hielo por 1 hora y después se sometieron a centrifugación a 27.000 x g por 15 minutos. Cantidades iguales del homogenizado crudo y el sobrenadante de cada uno de los cinco procedimientos de extracción, se tomaron para SDS-PAGE y análisis del manchado western con antisuero específico HBsAg. La inspección visual del manchado western mostró que en la ausencia de detergente HBsAg se recuperó con eficiencia muy baja en el sobrenadante después de la centrifugación, pero la extracción con una concentración final de II o superior de Tritón X-100 resultó en la recuperación eficiente. Así, se incrementa el nivel del detergente hasta 1% que resulta en una extracción más eficiente de la proteína deseada. Sin embargo, la eficacia de HBsAg como un inmunógeno depende de su estado de agregación, la forma particulada siendo más inmunogénica que la proteína libre. Por lo tanto. El HBsAg extraído con una concentración final de 0.1%, 0.5% y 1.0%, Tritón X-100 fue además analizado por la relación centrifugación zonal discontinua, 32 mL de gradientes de sucrosa se hicieron en 10 mM de fosfato de sodio (pH 7.0) y 0.15M de cloruro de sodio (8 mL cada uno de 5%, 13.3%, 21-6% y 30% de sucrosa), y se dejaron difuminar durante la noche a 4°C. 2 mL del sobrenadante de 27,000 x g se cargaron en gradientes y se centrifugaron en un rotor Sorvall AH629 y las alícuotas se analizaron por SDS-PAGE y manchado Western. La inspección del manchado Western de las fracciones del gradiente cargadas con el material extraído con 1% de Tritón X-100, mostraron que virtualmente toda la proteína relacionada con HBsAg está presente en las cuatro fracciones de la parte superior del gradiente, indicando que los complejos de lipoproteínas HBsAg se han solubilizado completamente con este nivel de detergente. En contraste, el manchado Western de las fracciones del gradiente cargado con el material, extraído con 0.1% de Tritón X-100, mostró un pico amplio en las fracciones de la mitad del gradiente, indicando que el extracto de HBsAg estuvo en la forma particulada deseada. La inspección del manchado western de las fracciones a partir del tercer gradiente de sucrosa, mostraron que la mayoría del HBsAg se ha solubilizado completamente mediante la extracción con este nivel de detergente, como con el 1% de Tritón X-100.

Por lo tanto, aunque el nivel de la extracción de HBsAg se puede mejorar por el incremento del nivel de detergente arriba del 0.1% usado por Masón et al . , el uso de 0.5% o concentraciones superiores de Tritón X-100 resulta en la disolución de la forma particulada de HBsAg que puede ser más eficaz para usarse como una vacuna. Así, los niveles de detergente menores de 0.5% deberán usarse para la purificación del antígeno a menos que se pretenda reconstituir partículas o se deseen proteínas completamente solubilizadas. En conclusión, los niveles mayores que o iguales a 0.1%, pero menores de 0.5% de Tritón X-100, parecen óptimos para la extracción de la forma particulada de HBsAg expresado en planta.

Ejemplo 26 Se puede obtener una respuesta inmune al antígeno de la superficie de la hepatitis B (HBsAg) , cuando el antígeno es expresado en una planta y el material de la planta se alimenta al animal cuando el animal es inmunoreceptivo a HBsAg. Un animal puede hacerse inmunoreceptivo a HBsAg mediante la administración del material de planta que contiene HBsAg en conjunto con un adyuvante adecuado. El animal puede también ser inmunoreceptivo debido a una inmunización previa, por ejemplo, primaria, en tal caso, una respuesta inmune a HBsAg se puede reforzar en el animal mediante la alimentación al animal del material de planta que contiene el HBsAg. Las líneas de papas que expresan HBsAg seleccionadas para usarse de conformidad con los ejemplos 27 a 30, son líneas transformadas de S. t uberos um L c . v. Frito Lay 1607 HB-7. Las líneas transformadas se designan FL-1607 HB-7 y HB114-16. Para obtener estas líneas, el gen HBsAg de un clon pMT-SA de un adr Chino aislado de HBV, se insertó en los vectores del plásmido de transformación (pHB-7 y pHB114) que se movilizaron en Agroba c t eri um t umefa ci ens (LBA4404) que entonces se usó para transformar Sol anum t uberos um L c . v. "Frito Lay 1607". Los vectores de plásmidos usados para construir las líneas de papas pHB-7 y pHB114-16 usados en estos ejemplos, ambos contienen el gen para la fosfotransferasa de neomicina (NPTII, también conocido como APH(3')II) . Este gen también llega a integrarse en el genoma de papa y es expresado en las células de papa. El NPTII derivado de E . col i ha mostrado ser bioquímicamente equivalente al NPTII expresado en la planta. El NPTII derivado de E . col i se degrada rápidamente bajo condiciones de digestión de mamífero simulada y no han mostrado causar efectos dañinos cuando la proteína purificada se alimenta a ratones hasta de 5 g/kg de peso corporal. El FL-0607 transformado se curó de A . t umefaci ens y se propagó clonalmente y las líneas FL-1607 HB-7 y HB114-16 se seleccionaron para su nivel superior de -la expresión de HBsAg. Los extractos de las líneas transformadas FL-1607 se probaron por la concentración de HBsAg mediante las técnicas de ELISA. El HB-7 promedió 1100 ng de HBsAg por gramo de peso de tubérculo y el HB114-16 promedió 8500 ng + 2100 ng de HBsAg por gramo de peso de tubérculo. El HBsAg extraído espontáneamente forma partículas similares al virus (VLPs) que sedimentan a la misma densidad como la levadura derivada de HBsAg VLPs. Los análisis de movilidad electroforética y el manchado western indican que el antígeno expresado en el tubérculo es indistinguible del antígeno derivado de la levadura. Las líneas se propagaron clonalmente para multiplicar el número de plantas y sembrarlas en el suelo para producir los tubérculos usados en los ejemplos. Las líneas transformadas se mantienen por propagación clonal in vi tro . La línea de papa original no transformada FL-1607 se mantiene por propagación clonal y se planta para producir tubérculos que se usan como el control de placebo. El tejido de estos tubérculos no expresa alguna proteína que sea reactiva con los reactivos para detectar HBsAg.

Ejemplo 27 Ratones BALB/c se alimentaron ya sea con rebanadas de papa HB-7 peladas o papas no transformadas de control . A cada grupo de ratones se les dio 3 alimentaciones de 5 mg de papa en los días 0, 7 y 14. La subunidad B de la toxina del cólera (CT) (Sigma), se usó como un adyuvante oral. Diez µg del adyuvante se colocaron en rebanadas de papas (ambos experimental y control) y se consumieron por los animales en conjunto con el antígeno. Los animales se alimentaron con HB-7 y por lo tanto, recibieron un promedio de 5.5 µg de HBsAg por alimentación, o un promedio total hecho de 16.5 µg de HBsAg sobre los 3 alimentos proporcionados. Ratones alimentados con HB-7 desarrollaron respuestas IgM y IgG del suero que fueron específicas a HBsAg, mientras el grupo de animales alimentados con papas no transformadas de control fallaron al hacer algunos anticuerpos. Después del tercer alimento, se observó una respuesta inmune que fue máxima a aproximadamente 70 mlU/ml . Después de una sola inoculación i.p de 0.5 µg del HBsAg recombinante derivado de la levadura (rHBsAg) en alumbre (una dosis normalmente subinmunogénica) se observó una respuesta secundaria fuerte que fue máxima a aproximadamente 1700 mlU/ml . Esta respuesta fue predominantemente IgG. No se observaron respuestas primarias o secundarias en los ratones de control alimentados con papas no transgénicas y CT. Sin el adyuvante oral no hubo una respuesta significante a HBsAg.

Ejemplo 28 En la línea de Frito Lay 1607 HB114-16 la expresión se accionó del promotor 35S y la expresión promedio del tubérculo en el lote usada para estos experimentos fue de 8.37 µg de HBsAg/gm en peso húmedo del tubérculo. Los grupos de ratones BALB/c (5/grupo), se alimentaron con ya sea HB114-16 o con una papa no transgénica de control. En ambos casos, se agregaron 10 µg de CT a la papa. La alimentación se repite una o dos semanas después. La dosis promedio total a cada ratón de HBsAg en la papa transgénica fue de 125.55 µg durante el periodo de 3 semanas. Después, al final de los 70 días después de la primera alimentación o a las 3 o 6 semanas después que la respuesta inmune inicial ha regresado a los niveles de la línea de base, los ratones se inmunizaron con una dosis sub-inmunogénica (0.5 µg) de rHBsAg (Merck) suministrada en adyuvante de aluminio por inyección subcutánea (s.c) . A estos niveles de dosis, se observó una respuesta inmune inicial inmediatamente después de la segunda alimentación. Esta respuesta inmune continuó hasta alcanzar un máximo a aproximadamente 6 semanas a 100 mlU/ml. Un título de solamente 10 mlU/ml en un humano después de unas tres dosis de una vacuna de la hepatitis B inyectable actualmente autorizada, se considera refleja la inmunización exitosa. La respuesta regresó a la línea de base a las 13 semanas y a las 16 semanas a los animales se les dio dosis de refuerzo de rHBsAg. Esto conduce a una elevación inmediata en el título inmune a >3000 mlU/ml, lo cual permanece sobre 1000 mlU/ml para el resto del experimento (40 semanas) . Esto establece que la inmunización primaria genera células de memoria inmune específicas del antígeno, que son rápidamente y fuertemente rellamadas después del refuerzo secundario. A los animales de control para este experimento que se les dio papas no transgénicas + CT, no desarrollaron una respuesta inmune significante a HBsAg y en la prueba secundaria con la dosis subinmunogénica, como se describe anteriormente, no se observó respuesta secundaria, estableciendo la especificidad de los resultados de HBsAg. Los controles que dan papas transgénicas sin CT, solamente desarrollaron un nivel bajo, es decir, 10 mlU/ml del título para una respuesta primaria que regresa a la línea de base en solamente una semana. La prueba además con la dosis subinmunogénica como se describe anteriormente solamente dio una respuesta secundaria de 50 mlU/ml y regresó a solamente 10 mlU/ml en solamente dos semanas.

Ejemplo 29 Las papas transgénicas también se han usado para reforzar una dosis subinmunogénica pre-existente de rHBsAg en ratones. En estos grupos de experimentos de ratones BALB/c (5/grupos), se inmunizaron con una dosis sub-inmunogénica de rHBsAg (Merck) suministrada s.c. en alumbre. 5 semanas después a cada ratón se alimentó ya sea con HB114-16 o con papas no transgénicas de control. En ambos casos, 10 µg de CT se agregaron a la papa. La alimentación se repitió una y dos semanas después. La dosis promedio total a cada ratón fue de 125.55 µg durante el periodo de 3 semanas. Una respuesta secundaria desarrollada ha comenzado a aparecer al tiempo del tercer alimento y la cual alcanza aproximadamente 1000 mlU/ml 11 semanas después de la inmunización de cebación inicial antes de la declinación. En un grupo de control, no se desarrolló respuesta inmune en el grupo alimentado con la papa no transgénica .

Ejemplo 30 Se sometieron a prueba cuarenta y dos sujetos humanos libres de VIH y previamente inmunizados con una vacuna HB comercial y después de un tiempo prolongado con títulos anti-HBsAg por debajo de 115 mlU/ml, se alimentaron con papas que contienen HBsAg o un control de papa libre de HBsAg en un estudio de doble anonimato aleatorizado. Cuando se rompió el programa, se determinó que el Grupo I fue un grupo de control que recibió tres dosis de 100 gramos de papas no transgénicas FL-1607. El grupo 2 recibió dos dosis de 100 gramos cada uno de papas transgénicas FL-1607 HB114-16 y una dosis de papas FL-1607 no transgénicas. El grupo 3 recibió tres dosis de 100 gramos cada uno de papas transgénicas FL-1607 HB114-16. Los datos pre-clínicos disponibles indican que (1) sobre la base del peso, los ratones libremente consumen hasta 25% de su peso corporal en papas sin evidencia de toxicidad y (2) una dosis de 50 µg de HBsAg en 5 mg de papa es inmunogénica como una serie primaria con un adyuvante oral. Los datos clínicos disponibles con otras vacunas de papas indican (1) el consumo de 100 gm de papa cruda es generalmente bien tolerado y (2) en una base en peso, 100 gm consumidos por una persona de 70 kg podrían representar 0.14% del peso corporal. Esta cantidad es aproximadamente 178 veces menor que la que se ha consumido en peso en ratones experimentales preclínicos .

Así, en el ejemplo para humanos, 100 a 110 gm de papas se ingieren por voluntarios por dosis. El lote clínico programado para usarse en este estudio contiene 8.5 + 2.1 µg de HBsAg por gm de papa. Los sujetos quienes recibieron dos dosis de 100 gm de papas transgénicas, recibieron una dosis total de 1,280 a 2,120 µg de HBsAg y los sujetos que recibieron tres dosis recibieron un total de 1,920 a 3,180 µg de HBsAg durante el curso de 28 días. En cada día de dosificación (días 0, 14 y 28) el número apropiado de papas para cada grupo (placebo y control) se removieron separadamente y se procesaron en dosis de 100 a 110 gm individuales por personal de farmacia usando técnicas de limpieza. Brevemente, las papas seleccionadas se lavaron, se pelaron, se cortaron y se colocaron en un baño de agua enfriado con hielo. La peladura de las papas se hace para remover la piel que contiene la solanina alcaloide. Este alcaloide puede causar molestia abdominal o náuseas y puede causar sabor amargo. Después de la peladura y el cortado, 100 a 110 gm de dosis de papa se pesaron completamente para cada sujeto de estudio de acuerdo al grupo asignado y Número de Identificación del Sujeto (SID por sus siglas en inglés). Las peladuras y cualquier porción sin usar de las papas se colectaron y se procesaron para su destrucción. Alícuotas de papa para cada sujeto de estudio se mantuvieron bajo agua para prevenir el quemado por oxidación entre el tiempo que la papa se corta hasta que la consume el sujeto de estudio. Una muestra apropiada de la papa procesada a partir de cada grupo a cada alimento se retuvo y congeló para su procesamiento adicional para verificar el contenido del antígeno. Los sujetos se sometieron a prueba para el título anti-HBsAg en los días mostrados en las Tablas 8, 9, y 10. Los resultados claramente muestran una respuesta incrementada a la administración del antígeno HBsAg como un resultado de la ingestión de las papas transformadas genéticamente. Sobre el 60 por ciento de los sujetos que recibieron tres dosis de papas que contenían HBsAg mostraron un incremento significante en la respuesta inmune. Las tablas claramente indican que, en muchos casos, la ingestión del material de planta que contiene HBsAg expresado genéticamente puede actuar como un reforzador efectivo para la vacunación primaria HB . Ninguno de los sujetos de control que reciben tres dosis de papa de control no transgénicas tienen algún cambio en el título de anticuerpo sobre el curso completo de la observación .

TABLA 8 Grupo 1 (3 dosis recibidas del tubérculo de papa no transgénica) Título (lm/ml) Voluntarios Día 0 Día 7 Día Día Día Día Día Día 14 21 28 35 42 56 72 64 73 74 78 78 63 57 17 14 12 12 2 5 10 * 63 51 56 67 69 74 88 89 66 78 52 62 54 74 67 69 5 0 0 0 1 0 0 7 6 12 9 12 1 8 1 8 1 6 17 19 7 34 28 24 32 33 29 34 33 8 9 11 12 11 8 7 9 9 9 104 99 83 110 120 100 99 92 * No muestra esquema TABLA 9 Grupo 2 (2 dosis recibidas del tubérculo de papa Transgénica & 1 dosis del tubérculo de papa no transgénica) Título (mlU/ml) Voluntarios Día 0 Día 7 Día Día Día Día Día Día 14 21 28 35 42 56 1 2 9 2 9 29 29 29 29 47 93 2 8 15 27 49 41 40 73 79 3 170 161 158 144 130 144 * 132 4 32 32 31 34 33 23 * 42 5 13 15 15 14 11 11 17 17 6 43 37 46 77 69 85 85 78 67 37 47 57 89 77 73 1 1 1 14 1 14 136 17 6 1 91 200 9 104 126 262 269 318 313 357 390 10, 33 26 22 21 21 25 25 29 11 107 92 96 89 93 83 95 90 12 21 22 55 112 120 219 395 458 13 65 68 66 63 89 103 137 258 14 20 24 15 12 12 15 20 15 0 0 0 0 0 0 0 0 16 97 93 112 109 128 294 454 432 17 26 34 197 330 353 360 707 863 No muestra esquema TABLA 10 Grupo 3 (3 dosis recibidas del tubérculo de papa Transgénica) Título (mlU/ml) Voluntarios Día 0 Día 7 Día Día Día Día Día Día 14 21 28 35 42 56 1 17 20 70 140 269 428 401 463 2 94 87 100 99 88 79 87 88 3 33 34 32 33 27 34 31 32 4 0 0 0 0 0 0 0 0 5 9 9 53 74 74 85 65 61 6 20 41 57 84 452 475 897 652 7 85 76 496 1212 3058 3572 4152 4526 8 13 19 19 15 28 14 20 21 9 120 236 282 390 605 667 1583 1717 10 9 11 14 13 13 18 11 15 11 0 0 0 0 0 0 0 0 12 72 77 137 270 349 523 1098 1226 13 85 76 84 74 111 215 175 163 14 40 35 39 71 119 122 330 430 15 56 51 59 85 252 407 520 745 16 115 213 511 1054 1964 3069 2966 3449 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

LISTADO DE SECUENCIA <110> Boyce Thompson Inst. for Plant Res. at Cornell <120> Expresión de Antígenos Inmunogénicos de la Superficie en la Hepatitis B en plantas transgénicas <130> 4868/85428 <140> PCT/US99/31020 <141> 1999-12-23 <160> 41 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 681 <212> ADN <213> Virus de la Hepatitis B <400> 1 atggagaaca caacatcagg attcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggtttttc 60 ttgttgacaa gaatcctcac aataccacag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat 120 tctctagggg gagcacccac gtgtcttggc caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac 180 tcaccaacct cttgtcctcc aatttgtcct ggttatcgtt ggatgtgtct gcggcgtttt 240 atcatattcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct tctggactac 300 caaggtatgt tgcccgtttg tcctctactt ccaagaacat caacaaccag cacgggacca 360 tgcaagacct gcacgattcc tgctcaagga aactctatgt ttccctcttg ttgctgtaca 420 aaaccttcgg acggaaactg cacttgtatt cccatcccat catcttgggc tttcgcaaga 480 ttcctatggg agtgggcctc agtccgtttc tcttggctca gtttactagt gccatttgtt 540 cagtggctcg tagggctttc ccccactgtt tggctttcag ttatatggat gatgtggtat 600 tgggggccaa gtctgtacaa catcttgagt ccctttttac ctctattacc aattttcttt 660 tgtctttggg tatacatttg a 681 <210> 2 <211> 226 <212> PRT <213> Virus de la Hepatitis B <400> 2 Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg He Leu Thr He Pro Gln Ser Leu 20 25 30 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys 35 40 45 Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser 50 55 60 Cys Pro Pro lie Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 lie lie Phe Leu Phe lie Leu Leu Leu Cys Leu lie Phe Leu Leu Val 85 90 95 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Arg 100 105 110 Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr lie Pro Ala 115 120 125 Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp 130 135 140 Gly Asn Cys Thr Cys lie Pro lie Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg 145 150 155 l€O Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 165 170 175 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 Ser Val lie Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn lie 195 200 205 Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro lie Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 Tyr lie 225 <210> 3 <211> 699 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Atificial: Secuencia HBsAg optimatizada de la planta. <400> 3 cgaccatgga gaacacaaca tcagga?tct tgggacccct cttggtgctc caagctggat 60 -tcttcttgtt gacaagaatc ctcacaatcc cacaatcttt ggactcttgg tggacttctc 120 tcaacttctt gggaggagca cccacttgtc ttggccaaaa tagccaatcc ccaacctcca 180 accactcacc aacctcttgt cctccaattt gtcctggtta taggtggatg tgtttgagga 240 ggttcatcat ctccctcttc atcctcctct tgtgcctcat cttcttgttg gttcttttgg 300 actaccaagg tatgttgcca gtttgtcctc tccttccaag aacatcaact actagcactg 360 gaccatgcaa gacttgcacc acccctgctc aaggaaactc tatgttcccc tcttgttgtt 420 gtacaaagcc ttctgatgga aattgcactt gtatccccat cccatcatct tgggcttttg 4ß0 caagattctt gtgggagtgg gcctcagtga ggttctcttg gttgagcctc ttggtgccat 540 ttgttcaatg gtttgtggga ctttccccca ctgtttggct ttcagttatt tggatgatgt 600 ggtattgggg accaagcctc tacaacatct tgagcccctt cctccctctc cccccaatct 660 tcttttgtct ttgggtgtac atctagtctt cgagctccc 699 <210> 4 <2ll> 6 <212> PRT < 13> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia peptidica de la señal de retención Microsomal <400> 4 Ser Glu Lys Asp Glu Leu 1 5 <210> 5 <211> 492 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia pre s1/s2 . Optimatizada de la planta <400> 5 atgggacaaa atctttcaac cagcaatcct ttgggattct ttccagacca ccaacttgat 60 ccagccttca gagcaaacac tgcaaatcca gattgggact tcaatcccaa caaggacacc 120 tggccagatg ccaacaaggt gggagctgga gcatttggat tgggtttcac cccaccacat 180 ggtggccttt tgggatggag ccctcaagct caaggcatct tgcaaacttt gccagcaaat 240 ccacctcctg cctcaaccaa tagacaatca ggaaggcaac ctaccccatt gtctccacct 300 ttgagaaaca ctcatcctca agccatgcaa tggaactcaa caaccttcca ccaaactttg 360 caagatccca gagtgagagg cttgtatttc cctgctggtg gctcaagctc aggaacagtg 420 aaccctgttt tgactactgc ctctcccttg tcctcaatct tcagcagaat cggagaccct 480 gctttgaaca tg 492 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Determinante "a" de HBsAg. <400> 6 Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Tyr His Gly Ser Ser Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 1 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para la amplificación de la región codificante HBsAg <400> 7 catgccatgg agaacacaac atcagg 26 <210> 8 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para la amplificación de la región codoficante HBsAg <400> 8 gccggagctc aaatgtatac ccaaagaca 29 <210> 9 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para la creación del constructo pBSSKHBsCK#3. <400> 9 atactctgag aaagatgagc tatgagagct 30 <210> 10 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para la creación del constructo pBSSKHBsCK#3. <400> 10 ctcatagctc 'atctttctca gagt 24 <210> 11 <211> 65 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para la extensión N-terminal de la secuencia codificante HBsAg. <400> 11 ccatggcaat gaaggtcctt gttttcttcg ttgctacaat tttggtagca tggcaatgcc 60 atacc 65 <210> 12 <211> 107 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para la extensión N-terminal de la secuencia codificante HBsAg. <400> 12 ccatggcaat gaaggtcctt gttttcttcg ttgctacaat tttggtagca tggcaatgcc 60 atgcgtacga tatgttccct ctccgaatga acactggcta tggtgcc 107 <210> 13 <211> 65 <212s ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> DescripCi6n ¿e ?a secuencia Artificial: Cebador para la extensión N-terp nal de la secuencia codificante HBsAg. <400> 13 ccatggcaat gaaggtcctt gttttcttcg ttgctacaat tttggtagca tggcaatgcc 60 atacc 65 <210> 14 <211> 107 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador Para la extensión N-terminal de la secuencia codificante HBsAg. <400> 14 ccatggcaat gaaggtcctt gttttcttcg ttgctacaat tttggtagca tggcaatgcc 60 atgcgtacga tatgttccct ctccgaatga acactggcta tggtgcc 107 <210> 15 <211> 253 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para la extensión N-terminal de la secuencia codificante HBsAg. <400> 15 ccatggcttc tatgatatct tcttccgctg tgacaacagt cagccgtgcc tctagggggc 60 aatccgccgc aatggctcca ttcggcggcc tcaaatccat gactggattc ccagtgaaga 120 aggtcaacac ttgacattac ttccattaca agcaatggtg gaagagtaaa gtgcatgcag 180 gtgtggcctc caattggaaa gaagaagttt gagactcttt cctatttgcc accattgacc 240 agagattcca tgg 253 <210> 16 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para agregar al sitio Ncol al extremo de la secuencia rbcS. <400> 16 ggatccatgg cttctatgat atctt 25 <210> 17 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para agregar al sitio Ncol al extremo de la secuencia rbcS. <400> 17 ggatccatgg aatctctggt caatggtgg 29 <210> 18 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para el sitio BamHi al extremo 5' de omega TMV ÜTR. <400> 18 gatcggatcc ttacaacaat taccaac 27 <210> 19 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador para el sitio BamHl al extremo 5' de omega TMV UTR. <400> 19 cggcaacagg attcaatc 18 <210> 20 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido para la creación de psHB521. <400> 20 atctctgaga aggatgagct ttaa 24 <210> 21 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido para la creación de psHB521. <400> 21 gactcttcct actcgaaatt taga 24 <210> 22 <211> 2 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia de péptido señal de retención Microsomal <400> 22 kd 2 <210> 23 <211> 21 <212> ADN <213>Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: TEV Cebador flanqueante al extremo 5' de la secuencia HBsAg. <400> 23 gcattctact tctattgcag c 21 <210> 24 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador Beta-actina. <400> 24 tggaatcctg tggcatccat gaaac 25 <210> 25 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador Beta-actina. <400> 25 taaaacgcag ctcagtaaca gtccg 25 <210> 26 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Description de la Secuencia Artificial : Cebador lnterferona-gamma . <400> 26 tgaacgctac acactgcatc ttgg 24 <210> 27 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador lnterferona-gamma. <400> 27 cgactccttt tccgcttcct gag 23 <210> 28 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador lnterleucina-2. <400> 28 atgtacagca tgcagctcgc ate 23 <210> 29 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador lnterleucina-2. <400> 29 ggctggttga gatgatgctt tgaca 25 <210> 30 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador lnterleucina-4. <400> 30 atgggtctca acccccagga agtc 24 8 <210> 31 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador lnterleucina-4. <400> 31 gctctttagg ctttccagga agtc 24 <210> 32 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador lnterleucina-5. <400> 32 atgactgtgc ctctgtgcct ggagc 25 <210> 33 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador lnterleucina-5. <400> 33 ctgtttttcc tggagtaaac tgggg 25 <210> 34 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador Interleucina-6. <400> 34 ctgtttttcc tggagtaaac tgggg 25 <210> 35 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador Interleucina-6. <400> 35 tctgaccaca gtgaggaatg tccac 25 <210> 36 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador Interleucina-10. <400> 36 acctggtaga agtgatgccc caggc 25 <210> 37 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador Interleucina-10. <400> 37 ctatgcagtt gaagatgtca aa 22 <210> 38 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador del Factor Alpha de Necrosis del Tumor <400> 38 ttctgtctac tgaacttcgg ggtgatcggt ce 32 <210> 39 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador del Factor Alpha de Necrosis del Tumor <400> 39 gtatgagata gcaaatcggc tgacggtgtg ce 32 <210> 40 <211> 226 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Planta optimizada HBsAg. <400> 40 Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg lie Leu Thr lie Pro Gln Ser Leu 20 25 30 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys 35 40 45 Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser 50 55 60 Cys Pro Pro lie Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 lie lie Phe Leu Phe lie Leu Leu Leu Cys Leu lie Phe Leu Leu Val 85 90 95 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Arg 100 105 110 Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr lie Pro Ala 115 120 125 Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp 130 135 140 Gly Asn Cys Thr Cys lie Pro lie Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg 145 150 155 160 Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 165 170 175 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 Ser Val lie Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn lie 195 200 205 Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro lie Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 Tyr lie 225 <210> 41 <211> 164 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223>Descripción de la Secuencia Atificial' pre-optimizada de la planta s1/s2. <400> 41 Met Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp 1 5 10 15 His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Asp Trp 20 25 30 sp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val Gly 35 40 45 Ala Gly Ala Phe Gly Leu Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu 50 55 60 Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly He Leu Gln Thr Leu Pro Ala Asn 65 70 75 80 Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro 85 90 95 Leu Ser Pro Pro Leu Arg Asn Thr Hie Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn 100 105 110 Ser Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu 115 120 125 Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Leu 130 135 140 Thr Thr Ala Ser Pro Leu Ser Ser He Phe Ser Arg He Gly Asp Pro 145 150 155 160 Ala Leu Asn Met

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un vector de expresión de una planta, caracterizado porque comprende dos casetes de expresión, en donde el primer cásete comprende un polinucleótido que codifica a un antígeno y donde el segundo cásete de expresión comprende un polinucleótido que codifica el mismo antígeno como el polinucleótido del primer cásete de expresión, en donde el polinucleótido del segundo cásete de expresión no es idéntico al polinucleótido del primer cásete de expresión.

2. El vector de expresión de una planta de la reivindicación 1, caracterizado porque el primer cásete de expresión comprende un polinucleótido que codifica a un antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y en donde el segundo cásete de expresión comprende un polinucleótido no idéntico que codifica a un HBsAg.

3. El vector de expresión de una planta de la reivindicación 1, caracterizado porque el silenciamiento del gen se reduce o se elimina cuando ambos polinucleótidos son expresados en una célula.

4. El vector de expresión de una planta de la reivindicación 3, caracterizado porque el silenciamiento del gen es el silenciamiento del gen transcripcional mediado por el ARN.

5. El vector de expresión de una planta de la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido del primer cásete de expresión y el polinucleótido del segundo cásete de expresión comprenden no más que 90 nucleótidos idénticos contiguos.

6. El vector de expresión de la planta de la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido del primer cásete de expresión y el polinucleótido del segundo cásete de expresión comprenden no más que 60 nucleótidos idénticos contiguos.

7. El vector de expresión de la planta de la reivindicación 2, caracterizado porque el primer cásete de expresión comprende un polinucleótido que codifica a un polipéptido HBsAg optimizado de una planta y en donde el segundo cásete de expresión comprende un polinucleótido que codifica a un polipéptido HBsAg derivado del virus nativo .

8. El vector de expresión de la planta de la reivindicación 1 , caracterizado porque el polinucleótido del primer cásete de expresión comprende al menos un codón optimizado de una planta.

9. El vector de expresión de la planta de la reivindicación 7, caracterizado porque el polinucleótido del primer cásete de expresión comprende la SEC ID NO: 3 y en donde el polinucleótido del segundo cásete de expresión comprende la SEC ID NO: 1.

10. El vector de expresión de una planta de la reivindicación 1, caracterizado porque el primer cásete de expresión además comprende una región no traducida, transcrita al 5' , y en donde el segundo cásete de expresión comprende una región no traducida, transcrita al 5' no idéntica.

11. El vector de expresión de la planta de la reivindicación 1, caracterizado porque el primer cásete de expresión además comprende una región no traducida, transcrita al 3', y en donde el segundo cásete de expresión comprende una región no traducida, transcrita al 3' no idéntica.

12. El vector de expresión de la planta de la reivindicación 1, caracterizado porque el primer cásete de expresión además comprende una región no traducida, transcrita al 5' y una región no traducida, transcrita al 3' y en donde el segundo cásete de expresión comprende una región no traducida, transcrita al 5' no idéntica y una región no traducida, transcrita al 3' no idéntica comparada con el primer cásete de expresión.

13. El vector de expresión de la reivindicación 12, caracterizado porque el primer cásete de expresión comprende una región no traducida, transcrita al TEV 5' y una región no traducida, transcrita al vspB3', y en donde el segundo cásete de expresión comprende una región no traducida, transcrita al TMV5' y una región no traducida, transcrita al pi n2 3' .

14. El vector de expresión de una planta de la reivindicación 13, caracterizado porque el primer cásete de expresión comprende un polipéptido HBsAg optimizado de una planta y en donde el segundo cásete de expresión comprende un polipéptido HBsAg derivado del virus nativo.

15. Una célula de E. coli , caracterizada porque se transforma con el vector de expresión de la planta de la reivindicación 1.

16. La célula de E. coli de la reivindicación 15, caracterizada porque las partículas similares al virus se agrupan en la célula.

17. Una célula de Agrobac t eri um, caracterizada porque se transforma con un vector de expresión de la planta de la reivindicación 1.

18. La célula de Agrobacterium de la reivindicación 17, caracterizada porque las partículas similares al virus se agrupan en la célula.

19. Una célula de una planta, caracterizada porque se transforma con el vector de expresión de la planta de la reivindicación 1.

20. La célula de planta de la reivindicación 19, caracterizada porque las partículas similares al virus se agrupan en la célula.

21. La célula de la planta de la reivindicación 19, caracterizada porque la célula de la planta se selecciona del grupo que consiste de células de tomate, papa, plátano, y de zanahorias.

22. La célula de la planta de la reivindicación 19, caracterizada porque el vector de expresión de la planta se integra en el genoma nuclear de la célula de la planta .

23. Una semilla de planta, caracterizada porque comprende el vector de expresión de la planta de la reivindicación 1.

24. Un polinucleótido, caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica a un antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) ligado operablemente a: (i) un promotor funcional de la planta; (ii) una secuencia que incrementa la traducción; y (iii) una secuencia de terminación en donde, el polinucleótido carece de una región no transcrita entre la secuencia de incremento de la traducción y la secuencia que codifica al HBsAg.

25. El polinucleótido de la reivindicación 24, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico que codifica al HBsAg comprende al menos un codón alterado, en donde' el codón alterado es un codón preferido de una planta .

26. El polinucleótido de la reivindicación 24, caracterizado porque dicho promotor funcional de una planta se selecciona del grupo que consiste del virus del mosaico de coliflor (CaMV) 35S, tomate E8, ubiquitina, sintasa manopina, patatina, y promotores de la sintasa de almidón ligada al granulo (GBSS) .

27. El polinucleótido de la reivindicación 24, caracterizado porque el promotor incluye una región incrementadora dual.

28. El polinucleótido de la reivindicación 24, caracterizado porque dicha secuencia de incremento de la traducción se selecciona del grupo que consiste de incrementadores de la traducción omega del virus del grabado del tabaco (TEV) y del virus del mosaico del tabaco (TMV) .

29. El polinucleótido de la reivindicación 24, caracterizado porque dicha secuencia de terminación se selecciona del grupo que consiste de una sintasa de nopalina ( nos ) , una proteína de almacenaje vegetativo ( vsp) , o un inhibidor de la proteinasa- una secuencia de terminación 2 (pin 2) .

30. El polinucleótido de la reivindicación 24, caracterizado porque el polinucleótido carece de una región no transcrita entre la secuencia que codifica al HBsAg y la secuencia de terminación.

31. El polinucleótido de la reivindicación 24, caracterizado porque además comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal de retención microsomal operablemente ligada al extremo 3' de la secuencia que codifica al HBsAg.

32. El polinucleótido de la reivindicación 31, caracterizado porque la señal de retención microsómica es Ser-Glu-Lys-Asp-Glu-Leu (de la SEC ID NO: 4) .

33. El polinucleótido de la reivindicación 31, caracterizado porque el polinucleótido. carece de una región no transcrita entre la señal de retención microsómica y la secuencia de terminación.

34. El polinucleótido de la reivindicación 24, caracterizado porque además comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido señal operablemente ligada al extremo 5' de la secuencia que codifica al HBsAg.

35. El polipéptido de la reivindicación 34, caracterizado porque el péptido señal se selecciona del grupo que consiste de un péptido señal aS de la proteína de almacenaje vegetativo (VSP) y un péptido señal aL VSP.

36. El polinucleótido de la reivindicación 24, caracterizado porque la secuencia que codifica al HBsAg además comprende una región pre-S.

37. El polinucleótido de la reivindicación 24, caracterizado porque la secuencia que codifica al HBsAg que comprende la secuencia de ácido nucleico optimizada para la expresión en plantas se muestra en la SEC ID NO: 3.

38. El polinucleótido de la reivindicación 24, caracterizado porque el polinucleótido se selecciona del grupo de polinucleótidos que consiste de HB104, HB105, HB106, HB107, HB111, HB114, HB115, HB116, HB117, HB118, HB119, HB120, HB121, HB122, HB123, HB131, HB140.3, HB145 y HB165.

39. Un vector de expresión caracterizado porque comprende el polinucleótido de la reivindicación 24.

40. El vector de expresión de la reivindicación 39, caracterizado porque además comprende un marcador seleccionable .

41. El vector de expresión de la reivindicación 39, caracterizado porque además comprende un origen de replicación de E . col i .

42. El vector de expresión de la reivindicación 39, caracterizado porque además comprende un origen de replicación de Agroba cteri um t umefa ci ens .

43. Una célula de E. coli , caracterizada porque se transforma con el vector de expresión de la reivindicación 39.

44. La célula de E. coli de la reivindicación 43, caracterizada porque una partícula similar al virus es agrupada en la célula.

45. Una célula de Agrobac teri um, caracterizada porque se transforma con el vector de expresión de la reivindicación 39.

46. La célula de Agroba ct eri um de la reivindicación 45, caracterizada porque una partícula similar al virus se agrupa en la célula.

47. La célula de Agrobacteri um de la reivindicación 45, caracterizada porque además comprende un plásmido Ti auxiliar.

48. Una célula de la planta transgénica, caracterizada porque comprende el polinucleótido de la reivindicación 24.

49. La célula de la planta transgénica de la reivindicación 48, caracterizada porque una partícula similar al virus se ensambla en la célula.

50. La célula de la planta de la reivindicación 48, caracterizada porque la célula de la planta se selecciona del grupo que consiste de células de tomate, papa, plátano, y de zanahoria.

51. La célula de la planta de la reivindicación 48, caracterizada porque el vector de expresión de la planta se integra en el genoma nuclear de la célula de la planta .

52. Una semilla de la planta, caracterizada porque comprende el vector de expresión de la planta de la reivindicación 48.

53. Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende la célula de la planta de la reivindicación 19 o 48.

54. La composición inmunogénica de la reivindicación 53, caracterizada porque la célula de la planta se presenta en el tejido de la planta seleccionado del grupo que consiste de una fruta, hoja, tubérculo, órgano de la planta, protoplasto de semilla, y tejido calloso .

55. La composición inmunogénica de la reivindicación 53, caracterizada porque comprende jugo o extracto de la célula de la planta.

56. La composición inmunogénica de la reivindicación 53, caracterizada porque además comprende un adyuvante.

57. La composición inmunogénica de la reivindicación 56, caracterizada porque el adyuvante se expresa como una proteína de fusión con un antígeno de la composición inmunogénica.

58. Un método para estimular una respuesta inmune en mamífero, caracterizado porque comprende el paso de administrar la composición de la reivindicación 53 a un mamífero, en donde una respuesta inmune es estimulada.

59. El método de la reivindicación 58, caracterizado porque la composición se administra oralmente .

60. El método de la reivindicación 58, caracterizado porque la administración comprende consumir la célula de planta transgénica.

61. El método de la reivindicación 58, caracterizado porque el polipéptido se administra por una técnica seleccionada del grupo que consiste de intramuscular, oral, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, e intranasal.

62. El método de la reivindicación 58, caracterizado porque además comprende el paso de administrar un adyuvante.

63. El método de la reivindicación 62, caracterizado porque el adyuvante se selecciona del grupo que consiste de toxina del cólera (CT), toxina estable al calor de E . coli (LT), anticuerpo anti-idiopático 2F10, factor de colonización, toxina similar al shiga, e intimina .

64. El método de la reivindicación 58, caracterizado porque la respuesta inmune estimulada se selecciona del grupo de respuestas inmunes que consisten de composiciones inmunogénicas humoral; mucosal; celular; humoral y mucosal; humoral y celular; mucosal y celular; y humoral, mucosal y celular.

65. Un método para aislar un polipéptido HBsAg recombinante que se expresa en un material de planta caracterizado porque comprende el paso de someter el material de la planta a un detergente que tiene una concentración mayor de 0.1% y menor de 0.5%, con ello un HBsAg recombinante se aisla.

66. Una planta transgénica o una célula de planta, caracterizada porque se consume como un producto alimenticio en cuatro o menos alimentos, estimulando una respuesta inmune que comprende un anticuerpo del suero anti-HBsAg mayor de 50 mlU/mL en un mamífero.

67. La planta transgénica o la célula de la planta de la reivindicación 66, caracterizada porque la respuesta inmune es una respuesta inmune primaria.

68. La célula de planta transgénica de la reivindicación 66, caracterizada porque la célula de la planta comprende la célula de planta de la reivindicación 18 o 47.

69. Una planta o célula de la planta transgénica, caracterizada porque cuando se consume como un producto alimenticio en cuatro o menos alimentos, se estimula una respuesta inmune que refuerza el anti-HBsAg que incrementa los niveles de anticuerpo anti-HBsAg del suero en al menos cuatro veces o a niveles mayores de 500 mlU/mL en un mamífero .

70. La planta o célula de planta transgénica de la reivindicación 69, caracterizada porque la célula de la planta comprende la célula de la planta de la reivindicación 18 o 47.