MXPA01003405A - Metodos y composiciones para la seleccion de moduladores del canal activado por la liberacion de calcio (icrac). - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a composiciones y metodos dirigidos a la seleccion o caracterizacion de compuestos que modulan la actividad de canales de calcio en celulas, preferiblemente canales activados por la liberacion de calcio en celulas. Las composiciones y los metodos se pueden utilizar para producir inhibidores o activadores del canal, las cuales representan guias o modelos o farmacos terapeuticos, candidatos para tratar diversas condiciones patologicas. Mas especificamente, el metodo comprende a) poner en contacto un compuesto de prueba y un activador del canal de calcio, preferiblemente un activador del Icrac con una poblacion de celulas que expresan el canal de calcio, preferiblemente celulas que expresan el Icrac que contienen una construccion reportera que comprende un gen reportero bajo el control de un promotor inducible por el NFAT, y (b) determinar la actividad del compuesto de prueba en el canal activado por la liberacion de calcio al valorar la expresion del gen reportero en las celulas.

Description

METODOS Y COMPOSICIONES PARA LA SELECCION DE MODULADORES DEL CANAL ACTIVADO POR LA LIBERACION DE CALCIO (ICRAC) Campo de la Invención 5 La presente invención se refiere en general a composiciones y métodos para seleccionar los compuestos que modulan la entrada de calcio o la actividad mediada por el calcio dentro de las células. Más especificamente, esta 10 invención describe composiciones y métodos, inclusive ensayos en base a células, dirigidos a la selección o , caracterización de compuestos que modulan la actividad de los canales activados por la liberación de calcio en las células. Las composiciones y métodos se pueden utilizar para 15 producir inhibidores o activadores del canal, los cuales representan guias o modelos o fármacos terapéuticos, candidatos para tratar diversas condiciones patológicas .

/ Antecedentes de la Invención 20 La afluencia y la regulación del calcio juegan un papel critico en muchos procesos celulares en células de mamíferos tanto excitables como no excitables, que incluyen exocitósis, expresión de genes, diferenciación de células, 25 activación de células, contracción, etcétera. En las células REF: 128397 no excitables, tales como las células inmunes, la concentración y el flujo del calcio son regulados esencialmente por los canales de Ca++ independientes del f voltaje (algunas veces referidos como entrada de calcio capacitativa (CCE, por sus siglas en inglés)), designados canales operados por depósitos (SOC, por sus siglas en inglés) o canales operados por receptores (ROC, por sus siglas en inglés) . La actividad de estos canales es esencial en la regulación de la entrada de calcio y participa f. ^ 10 directamente en muchos procesos celulares, importantes tales v ? como la activación de células o la maduración por ejemplo. Un tipo particularmente importante del canal de calcio operado por depósitos es el canal activado por la liberación de calcio (Icrac), el cual se abre en respuesta a la depleción de depósitos de calcio intracelular y media diversas señales de transducción, intracelulares . Por ejemplo, el canal Icrac está involucrado en la . activación de células T después del enlace de un antigeno al Receptor de Células T (TCR, por sus siglas en inglés) . La activación completa de los linfocitos T es debido a la estimulación del complejo de TCR/CD3 y CD2, CD4 o CD28 (ver para revisión (1) ) . Con la estimulación antigénica de las células T, (2) el factor nuclear de las células T activadas (NFAT) se requirió para la producción de moléculas inmunorreguladoras tales como interleucinas, IFN-?, o TNF-a (3) . El NFAT es un complejo que incluye un componente citoplásmico, constitutivo expresado en las células inmunomoduladoras, latentes tales como las células T y B, /' las cuales son translocadas al núcleo, y un componente v .¦ 5 nuclear, inducible que consiste de di eros de proteínas de la familia fos- y jun-. La desfosforilación del componente citoplásmico del NFAT mediante la Ca++/serina dependiente de calmodulina/fosfatasa de treonina, calcineurina, induce su translocación al núcleo (4) . La elevación prolongada del 10 nivel de [Ca++]i, más allá del incremento transciente, inicial que resulta del vaciamiento o agotamiento de la acumulación intracelular de calcio, es requerida para mantener la fosf tasa de calcineurina en estado activo. Después de la estimulación de las células inmunomoduladoras 15 tal como las células T por los componentes externos, esta movilización del calcio es el resultado de la entrada de calcio capacitativa, un proceso originado por la depleción del almacenamiento o depósito de Ca++ y la afluencia del calcio extracelular a través del canal de Ca++ activado por 20 la liberación de Calcio, especifico (Icrac) (5, 6) . La entrada de Ca++ capacitativa es activada mediante la estimulación de diversos receptores tales como T-CR, B-CR, el receptor de IgE de alta afinidad (FceRI) y el receptor de IgG (Fcy RI) (por medio de PLCy, y la activación del receptor 25 de IP3), CD40 (3) o mediante el ionóforo de calcio (6, 7).

Los inhibidores de la bomba de Ca++/ATPasa del retículo endoplásmico (tapsigargina (TG) (Thastrup y colaboradores, PNAS 87 (1990) 2466, ref (9)} o ácido ciclopiazónico (CPA) (8)) agota directamente los depósitos de calcio intracelular y conducen a la activación del Icrac. También se ha mostrado que el Icrac es expresado por otras células sanguíneas tales como las células T. Debido a su papel en la producción de interleucina, el Icrac se ve como un objetivo muy interesante para los nuevos fármacos anti-inflamatorios e inmunosupresores o compuestos guía o modelo. Además, ha llegado a ser claro recientemente que una corriente similar al Icrac está presente también en las células endoteliales (Am. J. Physiol. 269 (1995) C733, ref (10)) y en las células epiteliales (J. Biol. Chem. 270 (1995) 169, ref (12)). Puesto que el daño radical se podría vincular a la afluencia de Ca++ en éstas células, se cree que los bloqueadores del Icrac tendrían un efecto positivo. Además, puesto que el bloqueo de la afluencia de Ca++ conduce al bloqueo de la síntesis de la IL2, los bloqueadores del Icrac son potencialmente útiles en enfermedades proliferativas o progresivas tales como tumores malignos . De esta manera, el Icrac representa un objetivo muy poderoso para la selección de los compuestos con alto potencial terapéutico. Sin embargo, el uso de este objetivo ha sido obstaculizado hasta ahora por el hecho que este canal no ha sido aislado o clonado en la técnica.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona composiciones y métodos que permiten una selección eficiente para los moduladores del Icrac. La invención describe ensayos en base a células que permiten una determinación selectiva y eficiente del efecto de cualquier compuesto de prueba sobre la actividad del Icrac. Los métodos de esta invención se pueden utilizar para seleccionar grandes cantidades de compuestos de prueba, inclusive colecciones de compuestos, en una base de alto rendimiento, al reducir el número de resultados positivos falsos, proporcionando una selectividad incrementada y un fácil monitoreo del efecto de cualquier compuesto. Los moduladores del Icrac representan guias o modelos o fármacos candidatos de alto potencial para el tratamiento o alivio de diversas condiciones patológicas, inclusive las enfermedades relacionadas con la inmunidad tales como enfermedades autoinmunes, inflamación, alergia, asma, cánceres u otros desórdenes proliferativos de células. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para seleccionar un compuesto que modula la actividad del canal de calcio, preferentemente la actividad del canal activado por la liberación de calcio (Icrac), que comprende: a. poner en contacto un compuesto de prueba y un activador selectivo del canal de calcio, preferentemente un activador del Icrac con una población de células que expresan el canal de calcio, preferentemente las células que expresan el Icrac, las células que contienen además una construcción reportera que comprende un gen reportero bajo el control de un promotor inducible por el NFAT, y b. determinar la actividad del compuesto de prueba en el canal activado por la liberación de calcio al valorar la expresión del gen reportero en las células.

En una modalidad particular, la determinación de la expresión del gen reportero comprende: (i) poner en contacto las células de a) con un substrato del producto de la expresión del gen reportero, y (ii) determinar la actividad del compuesto de prueba en el canal activado por la liberación de calcio al valorar la hidrólisis del substrato en las células.

La expresión del gen reportero (por ejemplo, la hidrólisis del substrato) se puede correlacionar directamente a la actividad del compuesto de prueba: los niveles de expresión elevados (por ejemplo los niveles elevados del producto de la hidrólisis) o un incremento en los niveles de expresión (del producto de la hidrólisis) comparado con una situación de control en la ausencia del compuesto de prueba indica que el compuesto estimula el Icrac; los niveles de expresión bajos (por ejemplo niveles bajos del producto de la hidrólisis) o una disminución en los niveles de expresión (del producto de la hidrólisis) comparado con una situación de control en la ausencia del compuesto de prueba indica que el compuesto inhibe el Icrac. Dentro de una modalidad preferida, las células se ponen en contacto con un activador selectivo del Icrac, que preferentemente no activa la Cinasa Proteinica C ("PKC") . Más preferentemente, el activador selectivo del Icrac no contiene acetato de miristato de éster de forbol (PMA) . De acuerdo con una modalidad preferida, el gen reportero es un gen de ß-lactamasa y el substrato es un substrato de ß-lactamasa. De acuerdo con otras modalidades preferidas, el substrato es un substrato de medición de relaciones o ratiométrico y/o la población de las células que expresan el Icrac comprende un cultivo de células sanguíneas, particularmente linfocitos o mastocitos. En una variante particular de la presente invención, el método además comprende la selección de los 5 compuestos de prueba activos detectados en el paso b) anterior para determinar cual de estos compuestos modula la actividad de la expresión del producto del gen reportero (por ejemplo, ß-lactamasa) de una manera no dependiente del NFAT.- Esta selección secundaria permite incrementar la 10 selectividad del método, al eliminar los diversos compuestos de prueba los cuales modularían la actividad de la p- lactamasa o, más generalmente, el metabolismo celular sin modular específicamente el Icrac (por ejemplo, compuestos citotóxicos, compuestos que alteran el ADN o la síntesis de proteínas en las células, etcétera) . ? fin de desechar tanto como sea posible los resultados no relacionados al Icrac, se puede realizar otro " ensayo secundario, además del ensayo secundario mencionado anteriormente. Este ensayo utiliza una línea de células estable donde una expresión del gen reportero impulsada por el NFAT es activada por la activación de un receptor acoplado a Gq tal como el receptor muscarínico 1 (MI). En este caso, la única diferencia en la vía de activación es la activación misma (Icrac o MI) pero el proceso de corriente abajo, completo permanece idéntico.

La presente invención se puede utilizar para seleccionar diversos compuestos de prueba, inclusive colecciones de compuestos (por ejemplo, colecciones combinatorias), ya sea secuencialmente o en paralelo, y para identificar los bloqueadores o estimuladores del Icrac. La invención también es aplicable para someter a un ensayo la actividad de los moduladores del Icrac. Otros aspectos de la presente invención residen en equipos para el uso en la realización de los métodos anteriores, cultivos de células, soportes y otros reactivos, asi como también el uso de los moduladores del Icrac para propósitos farmacéuticos. ' Descripción Detallada de la Invención Como se indicó anteriormente, la presente invención proporciona composiciones y métodos para analizar la actividad del canal Icrac y para seleccionar los compuestos que modulan la actividad. La presente invención describe composiciones y métodos que permiten la detección especifica de la activación del Icrac por medio de un sistema de genes reporteros. La presente invención es adecuada para la selección de alto rendimiento de grandes cantidades de compuestos, y permite la identificación de compuestos con selectividad más alta para los canales de calcio que fué posible con las estrategias anteriores. Como será discutido posteriormente, los presentes métodos y composiciones proporcionan ventajas significantes y un espectro amplio de aplicaciones. Los canales de calcio ayudan en el transporte del calcio a través de la membrana de plasma y regulan el flujo del calcio entre la célula y su ambiente. Los canales de calcio pueden ser caracterizados por su perfil cinético y su fisiología y patología del tipo de célula. La invención se basa más específicamente en el uso de un sistema reportero para medir la actividad del Icrac. Más particularmente, la invención utiliza un sistema reportero que monitorea la producción dependiente del NFAT, inducida por el Icrac de un producto del gen reportero dentro de las células. Como se indica anteriormente, el NFAT ("Factor nuclear de las células T activadas") se produce y se activa entro de las células T en respuesta a la estimulación del Icrac. El NFAT es un complejo molecular que incluye un componente citoplásmico, constitutivo expresado en las células T latentes y un componente nuclear, inducible que consiste de dímeros de proteínas de la familia fos- y jun-. Con la estimulación del Icrac y la afluencia del calcio mediada por el Icrac, el NFATC es translocado al núcleo, donde se enlaza específicamente a regiones particulares de ADN (regiones promotoras responsivas o inducibles del NFAT) y media la expresión del gen. El NFAT representa de esta manera un marcador interesante de la actividad del Icrac dentro de las células, en particular dentro de las células del sistema inmune. Sin embargo, la producción/tranlocación del NFAT también puede resultar de o ser influenciada por otras vías de señalización en las células, inclusive la vía de Cinasa Proteinica C (PKC) por ejemplo. En particular, es bien conocido que muchos componentes secundarios de la vía interactüan con la activación del promotor del NFAT y, como consecuencia, con la lectura del ensayo (ver Figura 1) . Entre estos, uno puede citar los activadores de AP-1 (por ejemplo, las vías PLCy / PKC) o la vía de desfosforilación del NFAT independiente de calcineurina (via CD28/P13Cinasa) . La invención ahora propone seleccionar la actividad del Icrac mediante el monitoreo de la producción especifica del NFAT inducida por el Icrac de las moléculas reporteras dentro de la célula. La invención proporciona más específicamente un nuevo ensayo reportero, celular que permite monitorear específicamente la actividad del Icrac de una manera confiable. Un primer objetivo de esta invención reside más específicamente en un método para seleccionar un compuesto que modula la actividad del canal de calcio, preferentemente la actividad del canal activado por la liberación de calcio (Icrac), que comprende: a. poner en contacto un compuesto de prueba y un activador selectivo del canal de calcio, preferentemente un activador del Icrac con una población de células que expresan el canal de calcio, preferentemente las células que expresan el Icrac, las células además contienen una construcción reportera que comprende un gen reportero bajo el control de un promotor inducible por el NFAT, y b. determinar la actividad del compuesto de prueba en el canal de calcio, preferentemente un canal activado por la liberación de calcio al medir la expresión del gen reportero. En una modalidad preferida, el activador del Icrac (directo o indirecto) en el paso a) es un activador selectivo del Icrac, por ejemplo, cualquier producto, tratamiento o condición que permite la depleción selectiva de los depósitos internos de calcio. Más preferentemente, el activador selectivo no contiene ningún co-estimulador de las vías de señalización, alternativas tal como PKC, para asegurar una selectividad más alta del método. En otra modalidad preferida, el método además comprende la selección de los compuestos que modulan la expresión del gen reportero de una manera no dependiente del NFAT o a través de una via de activación diferente. Cada paso y/o elemento del método ahora será descrito en más detalle. 5 La población celular La invención comprende poner en contacto diversos compuestos y reactivos con una población de células que 10 expresan el canal de calcio, preferentemente las células que r expresan el Icrac que contienen una construcción reportera, particular. La población de células a ser utilizada en la invención comprende preferentemente células que expresan el Icrac de mamífero, tal como células sanguíneas, células epiteliales o células endoteliales . Las poblaciones de células preferidas comprenden las células sanguíneas, tales '' " como linfocitos (en particular los linfocitos T y B) , mastocitos o células dendríticas, por ejemplo. Las células se establecen preferentemente como líneas de células, que pueden ser cultivadas y almacenadas. Las células pueden ser de origen de diversos mamíferos, inclusive de humano, roedor, bovino, porcino canino, etcétera. Las células preferidas son de origen de humano o roedor (por ejemplo, murino, rata) . Los ejemplos típicos de tales células incluyen la línea de células T Jurkat y la línea de células de mastocitos P815. Se debe entender que cualquier otra célula que expresa el Icrac se puede utilizar en esta invención. 5 En este respecto, un objetivo de esta invención reside en un cultivo de linfocitos (o células derivadas de linfocitos) así como mastocitos (o células derivadas de mastocitos) que contienen una construcción reportera como se describe posteriormente. Más específicamente, la invención 10 trata de cualquier línea de células derivadas de mastocitos, v"' tal como la línea de células P815, que comprenda una construcción reportera como se describe posteriormente. La invención también se refiere a cualquier población de células inmunes de roedor, en particular 15 cualquier población de células inmunes de murino o rata, que comprenda una construcción reportera como se describe posteriormente. La invención describe la producción de tales ( células, y demuestra que éstas se pueden utilizar para seleccionar la producción de ß-lactamasa dependiente del 20 NFAT, mediada por el Icrac con eficacia, sensibilidad y reproductividad. Para realizar la presente invención, no es necesario que sean utilizadas poblaciones de células puras. En particular, la población de células puede comprender 20% 25 de células que no expresan el Icrac o de células que no 1 contienen la construcción reportera. Sin embargo, se prefiere utilizar poblaciones de células que comprenden preferiblemente al menos 80% de células que expresan el ^ . canal Icrac y que contienen el sistema reportero a fin de incrementar la eficacia y la sensibilidad del método. Más preferentemente, las poblaciones de células comprenden al menos 85% de esas células y más preferido al menos 90%. La construcción reportera contenida en las células comprende un gen reportero bajo el control de un promotor 10 inducible por el NFAT. La construcción se puede incorporar en un plásmido, vector, virus, episoma, YAC, etcétera, es decir, en cualquier sistema genético, apropiado que permita el mantenimiento de la construcción dentro de las células. Las construcciones reporteras, típicas de esta invención comprenden un plásmido, tal como ADNpcIII, pUC, etcétera en el cual al menos una copia del gen reportero y el promotor han sido insertados. El plásmido puede comprender además un ( gen marcador, que permite la selección de las células recombinantes que contienen la construcción reportera.

Alternativamente, la construcción reportera puede ser integrada dentro del genoma de las células, mediante cualquier técnica convencional, inclusive la recombinación, transposones, integración viral, etcétera. En las modalidades preferidas, la construcción reportera es introducida de manera estable dentro de las células utilizando un vector extracromosómico. Más preferiblemente, la construcción es estable de modo que permanece presente en las células después de varias divisiones de las células (en forma preferente 100) bajo presión de selección. El gen reportero puede ser cualquier ácido nucleico que codifique un producto cuya presencia en una célula se pueda determinar. El gen reportero puede ser cualquier ADNc que codifique un polipéptido cuya presencia en una célula se pueda visualizar o determinar fácilmente. Los ejemplos de tales genes reporteros incluyen cualquier ácido nucleico que codifica un polipéptido tal como proteina fluorescente, verde (y variantes de) , ß-galactosidasa, fosfatasa alcalina, luciferasa, ß-lactamasa o derivados u homólogos de los mismos. En una modalidad preferida, el gen reportero es un gen de ß-lactamasa. El gel de ß-lactamasa puede ser cualquier molécula de ácido nucleico que codifique un polipéptido de ß-lactamasa, es decir, un polipéptido que pueda hidrolizar un anillo de ß-lactama. ün gen de ß-lactamasa preferido es el gen bacteriano descrito en Zlokarmik y colaboradores (13) . Se debe entender que cualquier variante, fragmento o análogo del mismo se puede utilizar sin desviarse de la presente invención.

El promotor inducible por el NFAT puede ser cualquier promotor transcripcional que comprenda una región responsiva al NFAT, es decir, un promotor que es activado en la presencia del NFAT y esencialmente inactivo en la ausencia del NFAT. £1 promotor puede ser cualquier promotor funcional en células de mamíferos, que comprenden una o varias copias de un dominio de enlace del NFAT. Más preferentemente, el promotor comprende una o varias copias (por ejemplo 2-8.) de la siguiente secuencia: GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT (SEC ID NO:l) o cualquier derivado o variante de la misma. Los derivados incluyen fragmentos, así como también secuencias mutadas, modificadas o suprimidas, los cuales pueden ser producidos por métodos convencionales conocidos para el artífice experto. La capacidad de las variantes/derivados para conferir la sensibilidad al NFAT a un promotor se puede verificar mediante una técnica de expresión convencional. Un promotor particular y preferido a ser utilizado en la construcción reportera comprende 3 repeticiones de la SEC ID NO:l. La secuencia de un promotor inducible por el NFAT, típico se describe en Mattila y colaboradores (19) . La construcción reportera (o cualquier vector que contenga la misma) se puede introducir en las células mediante técnicas convencionales, inclusive la electroporación, precipitación de calcio-fosfato, transfección mediada por lipidos, polímeros o liposomas catiónicos, infección mediada por virus, etcétera. Las células utilizadas en la invención pueden comprender una o varias copias de la construcción reportera, en forma preferente entre 1 y 10 copias. Las células se pueden mantener en cualquier medio de cultivo adecuado para las células de mamífero, inclusive RPMI, DMEM, generalmente alrededor de 37 CC (para las células de humano), complementado con aditivos convencionales (antibióticos, aminoácidos, suero, etcétera) . El medio preferido comprende una concentración elevada de calcio (por ejemplo, arriba de aproximadamente 1 mM) , tal como DMEM. Las células se pueden cultivar y/o almacenar en cualquier dispositivo apropiado (tubos, matraces, botellas, etcétera) . La viabilidad de las células y/o la ausencia de contaminación se pueden verificar antes de llevar a cabo los métodos de esta invención.

Los ensayos celulares Selección Primaria El método de esta invención comprende poner en contacto un compuesto de prueba con la población de células bajo condiciones particulares y medir la expresión del gen reportero en las células, como una indicación del efecto del compuesto de prueba. Típicamente, el efecto del compuesto de prueba se compara con el nivel de expresión medido en la ausencia de cualquier compuesto de prueba.

Contacto del compuesto de prueba y el activador con las V., 5 células que expresan el lera El paso a) del método de esta invención comprende más específicamente poner en contacto un compuesto de prueba y un activador del Icrac con una población de células que expresan el Icrac las cuales contienen una construcción 10 reportera, como se define anteriormente. En una modalidad típica, el método comprende poner en contacto diversos compuestos de prueba, en particular al menos dos compuestos de prueba, más preferiblemente al menos 10, aun más preferiblemente al menos 50 compuestos. Como será discutido 15 posteriormente, la invención es adecuada para la Selección de Alto Rendimiento de los compuestos y las colecciones combinatorias, completas se pueden someter a un ensayo, es ( x decir, hasta miles de compuestos.

El compuesto de prueba El compuesto de prueba puede ser cualquier producto en forma aislada o en mezcla con cualquier otro material (por ejemplo cualquier otro producto (s) ) . El compuesto puede ser definido en términos de estructura y/o composición, o éste puede ser indefinido. Por ejemplo, el compuesto puede ser un producto aislado y estructuralmente definido, un producto aislado de estructura desconocida, una mezcla de diversos productos conocidos y caracterizados o una composición indefinida que comprenda uno o varios productos. Los ejemplos de tales composiciones indefinidas incluyen por ejemplo muestras de tejido, fluidos biológicos, sobrenadantes de células, preparaciones vegetales, etcétera. El compuesto de prueba puede ser cualquier producto orgánico o inorgánico, que incluya un polipéptido (o una proteina o péptido) , un ácido nucleido, un lipido, un polisacárido, un producto químico, o cualquier mezcla o derivados de los mismos. Los compuestos pueden ser de origen natural, origen sintético, que incluyen colecciones de compuestos. Como será discutido adicionalmente más adelante, la presente invención está adaptada particularmente para la selección de grandes números de compuestos, tales como colecciones combinatorias de compuestos. En realidad, la presente invención proporciona composiciones y métodos que permiten la selección eficiente y simple de diversos compuestos en periodos de tiempo cortos. En particular, los presentes métodos pueden ser parcialmente automatizados, para permitir debido a eso la selección eficiente y simultánea de grandes conjuntos de compuestos. Generalmente, la actividad del (los) compuesto (s) de prueba es desconocida, y el método de esta invención se utiliza para identificar los compuestos que exhiben la propiedad seleccionada (por ejemplo, moduladores del Icrac) . Sin embargo, en ejemplos particulares donde la actividad (o el tipo de actividad) del (los) compuesto(s) de prueba es conocida o esperada, el método se puede utilizar para caracterizar adicionalmente la actividad (en términos de especificidad, eficacia, etcétera) y/o para optimizar la actividad, al someter a un ensayo los derivados de los compuestos de prueba. Preferentemente, el (los) compuesto (s) de prueba se pone(n) en contacto con las células en la presencia de un activador del Icrac. En realidad, el efecto modulador del (los) compuesto (s) de prueba se puede valorar preferentemente donde el canal Icrac está en estado activado. Para ese efecto, las células se ponen en contacto con un activador del Icrac, ya sea antes de ser puesto en contacto con el(los) compuesto (s) , o después o simultáneamente. En una modalidad típica, cada compuesto y activador se pone en contacto simultáneamente con las células.

Activador del Icrac Como se explica anteriormente, un aspecto ventajoso de esta invención reside en el monitoreo objetivo de la actividad del Icrac, más preferiblemente la activación mediada por el Icrac, selectiva del NFAT. Para ese efecto, es importante la naturaleza del activador del Icrac (o medio de activación o tratamiento) utilizado en el ensayo, y una > - característica preferida y ventajosa de los métodos de esta invención reside en el uso de activadores selectivos del Icrac, los cuales permiten una selección para los moduladores selectivos del Icrac (es decir, bloqueadores o estimuladores) . En este respecto, el activador del Icrac es ^ 10 preferiblemente un activador de liberación de calcio, es decir, un producto que promueve la depleción de depósitos de calcio intracelular. En realidad, la activación del Icrac depende de la depleción de los depósitos de calcio intracelular. En una modalidad preferida, el activador del Icrac es un producto o tratamiento o condición que reduce o agota selectivamente los depósitos de calcio intracelular. El activador del Icrac puede inducir directamente la ^ depleción de los depósitos de calcio intracelular (efecto directo sobre el Icrac) o a través de una o varias vías en la célula responsables de la activación del Icrac (efecto indirecto sobre el Icrac) . En una modalidad especifica, el activador del Icrac (o tratamiento o medio de activación) no induce ninguna co-estimulación de la Cinasa Proteinica C (PKC), en particular el activador no comprende ningún estimulador de la PKC tal como acetato de miristato de éster de forbol (PMA) . Los ejemplos específicos de los activadores del Icrac para el uso en la invención incluyen tapsigargina, 5 ácido ciclopiazónico, 2, 5-di- (ter-butil) -1, -hidroquinona (Masón, M.J. y colaboradores, J. Biol. Chem. 266, 20856- 20862, ref (17)), anticuerpos CD8 y fitohemaglutinina. Un activador del Icrac preferido para ser utilizado en esta invención es tapsigargina (Thastrup y colaboradores, 1990 ^ 10 supra) . Preferiblemente, la tapsigargina se utiliza en una concentración que varia entre 0.5 y 5 µ?, más preferiblemente abajo de 2 µ?. En una modalidad específica, las células se tratan en el paso a) con tapsigargina en la ausencia de alguna co- 15 estimulación de la PKC, tal como éster de forbol. Más preferiblemente, las células se tratan en el paso a) con tapsigargina sola. De acuerdo con esta modalidad, se utiliza ^ un estímulo específico del Icrac (es decir, tapsigargina) y la vía de la PKC no se activa. Esta estrategia de activación 20 particular permite la selección más selectivamente para la actividad del Icrac. La invención ha descubierto que se puede obtener una señal optimizada para la taza de ruido se puede obtener al incrementar la concentración de calcio en el medio. En 25 particular, cuando se utilizan las concentraciones de calcio arriba de 1 mM, preferiblemente entre 1 y 3 mM, la señal para la taza de ruido se eleva por arriba de 5 veces. Bajo estas condiciones, es posible seleccionar, en una base de f alto rendimiento, con resultados confiables y reproducibles, 5 bloqueadores del Icrac en la ausencia de la co-estimulación de la PKC. Las condiciones más preferidas comprenden la incubación de las células en un medio que comprende calcio entre 1 mM y 2 mM de y libre de éster de forbol. Estas condiciones representan una modalidad ,~ 10 preferida de esta invención. En este respecto, un objetivo \ , particular de la presente invención reside en un método para seleccionar bloqueadores del Icrac (o inhibidores) , que comprende : a} poner en contacto un compuesto de prueba y un 15 activador del Icrac con una población de células que expresan el Icrac, las células que contienen además una construcción reportera que comprende un gen reportero bajo el control de un promotor inducible por el NFAT, las células que se cultivan 20 en un medio que contiene al menos calcio 1 mM y que carece de éster de forbol, y b) determinar la actividad del compuesto de prueba sobre el canal activado por la liberación de calcio al medir la expresión del gen reportero en 25 las células.

En otra modalidad específica de esta invención, las células se ponen en contacto con el (los) compuesto (s) de prueba en la ausencia de algún activador del Icrac. Esta modalidad permite seleccionar los activadores del Icrac (o estimuladores) . El contacto se puede realizar en cualquier soporte o dispositivo apropiado, inclusive una placa, tubo, matraz y similares. Generalmente, el contacto se realiza en placas de múltiples pocilios, lo que permite que sean llevados a cabo múltiples ensayos en paralelo. Los soportes típicos incluyen v placas de microtítulo, especialmente los formatos de placas de microtítulo de 96 pocilios o 384 pocilios o de rendimiento más alto, los cuales son fáciles de manejar y fáciles de iluminar con excitación convencional. También se pueden utilizar otros formatos, inclusive placas de microtítulo más grandes o nanotecnologias. Dependiendo del soporte y el compuesto de prueba, V se pueden utilizar cantidades variantes de células en el ensayo. Típicamente, entre 103 y 106 células se ponen en 20 contacto con un compuesto, más preferiblemente entre 104 y 105 células. Como una ilustración, en una placa de microtítulo de 96 pocilios, se pueden incubar aproximadamente 105 células en cada pocilio y se pueden poner en contacto con un compuesto. En una placa de 25 microtítulo de 384 pocilios, generalmente menos de 105 células, típicamente entre 1-4 10* células se incuban en cada pocilio y se ponen en contacto con un compuesto (ver Figura 7) . La cantidad (o concentración) del compuesto de prueba se puede ajustar por el usuario, dependiendo del tipo de compuesto (su toxicidad, capacidad de penetración a la célula, etcétera) , el número de células, la longitud del período de incubación, etcétera. Si es necesario, el compuesto se puede poner en contacto en la presencia de un agente que facilita la penetración o contacto con las células . El contacto en el paso a) puede durar aproximadamente 2 a 6 horas, típicamente entre 3 y 5 horas. En realidad, las células y los diversos reactivos se incuban preferiblemente durante un período de tiempo suficiente para permitir la novo síntesis del producto de la expresión del gen reportero (por ejemplo, ß-lactamasa) . Dependiendo del tipo de células utilizadas, este período dura usualmente alrededor de 3-4 horas. En un experimento típico, las células y los reactivos anteriores se incuban durante aproximadamente 4 horas. El paso b) del método comprende medir la expresión del gen reportero, como una indicación de la actividad del compuesto de prueba.

La medición se puede realizar de acuerdo con diversas técnicas, dependiendo del tipo de gen reportero que es utilizado. Por ejemplo, la medición puede comprender la dosificación de la densidad óptica o la fluorescencia emitida, donde se utilizan ß-galactosidasa o luciferasa. En una modalidad preferida, la expresión del gen reportero se mide al valorar el nivel de hidrólisis de un substrato del producto de la expresión del gen reportero. Esta modalidad es adecuada para medir la expresión de la ß-lactamasa . Por consiguiente, en una modalidad preferida, el método comprende: a. poner en contacto un compuesto de prueba y un activador selectivo del Icrac con una población de células que expresan el Icrac, las células además contienen una construcción reportera que comprende un gen reportero bajo el control de un promotor inducible por el NFAT, b. poner' en contacto las células de a) con un substrato del producto de la expresión del gen reportero, y c. determinar la actividad del compuesto de prueba sobre el canal activado por la liberación de calcio al valorar la hidrólisis del substrato en las células. una modalidad más preferida, el gen reporte es ß-lactamasa y el paso b) del método actual comprende poner en contacto las células de a) con un substrato de ß- lactamasa . 5 este respecto, se pueden utilizar diversos substratos para monitorear la expresión de ß-lactamasa, por ejemplo, cualquier producto que contenga un anillo de ß- lactama y cuya hidrólisis se pueda monitorear. Los substratos preferidos son específicos para la ß-lactamasa / -,. 10 (es decir, son esencialmente no hidrolizados en células de mamíferos en la ausencia de la ß-lactamasa) , no tóxicos para las células de mamíferos, y/o su producto de la hidrólisis se puede monitorear fácilmente, por ejemplo por un método de detección de fluorescencia, radioactividad, enzimático o 15 cualquier otro. Los substratos más preferidos son los substratos ratiométricos, Los substratos ratiométricos son substratos cuya hidrólisis se puede relacionar directamente actividad del producto del gen reportero sin considerar el 20 número de células. Un substrato específico, no tóxico y ratiométrico, típico para el uso en la presente invención es CCF2-AM (13) . Este substrato es concebido como una cumarina unida a una molécula de fluoresceína por un anillo de ß- lactama. De acuerdo con el principio de la transformación de 25 energía de resonancia fluorescente (FRET) , la cumarina (el donador) emite una luz azul capaz de excitar la fluoresceina (aceptor) la cual, a su vez, produce una luz verde. Por consiguiente, el substrato no dividido emite una luz verde y ^ el producto después de la hidrólisis de la ß-lactamasa emite V 5 una luz azul. La relación de la fluorescencia azul a verde se relaciona directamente con la actividad de la lactamasa y no con el número de células. La concentración del substrato se puede ajustar por el artífice experto, dependiendo del número de células y las condiciones de activación del Icrac utilizadas, por ejemplo. Usualmente, el paso b) dura entre 15' y 3 horas, preferentemente menos de 2 horas. En una modalidad típica, las células se ponen en contacto con el substrato durante aproximadamente 60 minutos. Como una ilustración específica, cuando se utiliza el CCF2-AM, se podría detectar un incremento en la relación de azul/verde durante aproximadamente dos horas. Sin embargo, una señal ( significante (y suficiente) se podría detectar 1 horas después de cargar las células con el substrato. 20 El paso c) del método definido anteriormente comprende la determinación de la actividad del compuesto de prueba al valorar la hidrólisis del substrato en las células. Típicamente, el efecto del compuesto de prueba se compara al nivel de hidrólisis del substrato medido en la ausencia de algún compuesto de prueba o a un valor promedio de referencia determinado en la ausencia de algún compuesto de prueba . La medición de la hidrólisis comprende esencialmente una medida (o una determinación de la cantidad relativa) del producto de la hidrólisis contenido en cada muestra de reacción. La medición se puede realizar utilizando diversas técnicas conocidas en el oficio, inclusive la detección de fluorescencia, detección de radioactividad, detección colorimétrica, detección de la actividad enzimática, detección del complejo inmune de anticuerpo/antigeno, etcétera. En una modalidad preferida, el producto de la hidrólisis se detectó y se cuantificó utilizando la detección de fluorescencia. En este respecto, diversos fluoroeromos o sustancias fluorescentes se pueden utilizar y monitorear en las muestras de células. En un experimento típico, donde se utiliza el substrato CCF2-A , el paso c) comprende la excitación a aproximadamente 405 nm y la emisión a 460 (substrato dividido) y 535 nm (substrato no dividido) y se estima la relación 460/535, la cual se correlaciona directamente con la actividad de la hidrólisis con las células. Se debe entender que se puede emplear cualquier método de detección alternativo en el presente método. Como se indicó anteriormente, una de las ventajas de estos métodos es su capacidad para seleccionar grandes números de compuestos en periodos de tiempo relativamente cortos. Por ejemplo, en un experimento típico, aproximadamente 90 compuestos se someten a prueba en paralelo en una placa de 96 pocilios y su actividad se determina en aproximadamente 5 hora . El método se puede aumentar progresivamente a placas o dispositivo más grandes, permitiendo la selección de miles de compuestos cada día. Además, la distribución de células y todos los reactivos en el dispositivo de reacción puede ser automatizada, incrementando adicionalmente el rendimiento y la eficacia del método.

Selección secundaria En una variante particular de la presente invención, el método comprende una selección adicional de los compuestos que modulan la actividad de la ß-lactamasa de una manera no dependiente del NFAT. Esta selección secundaria permite incrementar la selectividad del método, al eliminar diversos compuestos de prueba los cuales modularían la actividad de la ß-lactamasa o, más generalmente, el metabolismo de las células, sin modular específicamente la actividad del Icrac (por ejemplo compuestos citotóxicos, compuestos que alteran el ADN o la síntesis de proteínas en las células, etcétera) . Por consiguiente, en una modalidad particular, el método de esta invención además comprende el paso d) la selección de los compuestos obtenidos en c) a fin de eliminar aquellos que modulan la actividad de la ß-lactamasa de una manera dependiente diferente del NFAT. Más preferiblemente, el paso d) comprende poner en contacto los compuestos seleccionados en c) con una población de células que comprenden una construcción reportera que comprende un gen de ß-lactamasa bajo el control de un promotor no inducible por el NFAT, más preferiblemente un promotor inducible por CRE. Esta selección secundaria se puede realizar utilizando diversas poblaciones de células, en particular células de mamíferos, tales como las células HEK por ejemplo, o las células CHO, Jurkat, o Vero, por ejemplo. La construcción reportera se puede preparar de la misma manera como se describe anteriormente, excepto por la región promotora. En una modalidad especifica, la región promotora comprende una o varias secuencias de CRE (1 a 8, preferiblemente 3) (CGTCA) , las cuales son responsivas a la concentración de AMP cíclica dentro de la células. Se pueden utilizar otras regiones promotoras en este ensayo secundario, tal como los promotores responsivos al VIP, o promotores que contienen elemento responsivo a NFKB o JNK, por ejemplo. Las selecciones secundarias, adicionales o alternativas se pueden realizar a fin de caracterizar o perfilar los compuestos seleccionados en base a la medición directa de los niveles de afluencia de calcio tal como los ensayos FLIPR®. - También, las selecciones secundarias adicionales o alternativas se pueden realizar a fin de caracterizar o perfilar adicionalmente los compuestos seleccionados, inclusive la captación de Ca, electrofisiologia del canal Icrac, etcétera. En este respecto, a fin de desechar tanto como sea 10 posible los resultados no relacionados con el Icrac, se puede realizar otro ensayo secundario, además de o en el reemplazo del ensayo secundario mencionado anteriormente. Este ensayo utiliza una linea de células estable donde una expresión del gen reportero impulsada por el FAT es 15 iniciada por la activación de un receptor acoplado con Gq tal como el receptor muscarínico 1 (MI) . En este caso, la única diferencia en la vía de activación es el iniciador mismo (Icrac o MI) pero el proceso de corriente abajo, total permanece idéntico. 20 La invención se puede utilizar para seleccionar los moduladores del Icrac, con diversas aplicaciones terapéuticas o de investigación. En este respecto, el modulador del Icrac se puede definir como cualquier compuesto que modula la actividad del 25 Icrac. Se entiende que el término modular significa inhibir, antagonizar o bloquear así como también estimular, incrementar, facilitar la actividad del Icrac. Un modulador puede ser un bloqueador o un estimulador, como se define ? -N posteriormente. La modulación de la actividad del Icrac puede resultar de diversos mecanismos de acción. En particular, los moduladores del Icrac pueden interactuar directamente con el Icrac y modular la afluencia de calcio mediada por el Icrac. Como un ejemplo, los moduladores pueden interactuar con el Icrac e impedir la entrada de ^N 10 calcio dentro de las células. Otro tipo de moduladores de conformidad con la presente invención es un compuesto que modula la activación del Icrac, por ejemplo un compuesto que impide o puede modular la activación corriente arriba del Icrac. Un tipo adicional de moduladores de acuerdo con la presente invención comprende los compuestos que modulan la transducción de señales mediada por el Icrac. Los moduladores preferidos de acuerdo con esta invención son los compuestos que modulan la activación del Icrac y/o que interactúan con el Icrac. 20 Los bloqueadores del Icrac designan más específicamente cualquier compuesto que bloquea (o inhibe, o antagoniza) la actividad de un canal Icrac. Más preferiblemente, un bloqueador del Icrac es un compuesto que inhibe al menos parcialmente la actividad del Icrac, típicamente, por al menos 20% comparado con la situación de control en la ausencia del compuesto. Los bloqueadores del Icrac más preferidos inhiben al menos 40% de la actividad del Icrac, medido por la hidrólisis dependiente de la ß-lactamasa mediada por el FAT de un substrato. Los estimuladores del Icrac diseñan más específicamente algún compuesto que estimula (o incrementa, o facilita) la actividad de un canal Icrac. Más preferiblemente, un estimulador del Icrac es un compuesto que causa un incremento de al menos 20% de la actividad del Icrac, comparado con la situación de control en la ausencia del compuesto. Los estimuladores del Icrac más preferidos causan un incremento de al menos 40% de la actividad del Icrac, medido por la hidrólisis dependiente de la ß-lactamasa mediada por el NFAT de un substrato. La invención fué validada utilizando diversas moléculas conocidas que interactúan con las vías de activación del NFAT tal como ciclosporina A (CsA) (14, 15), dentro de las células que expresan el Icrac similares a las células T (Jurkat) y mastocitos (16) . Puesto que el DMSO es un vehículo comúnmente utilizado para la solubilización del compuesto (así como también una molécula anti-inflamatoria) , su posible interacción con la activación impulsada por el NFAT también se verificó. Se muestra en la presente que este reactivo, no obstaculizó el ensayo en una concentración de aproximadamente 0.5%. Los resultados presentados en esta solicitud también ilustran la eficacia del método puesto que más de 3000 compuestos han sido seleccionados muy rápidamente, conduciendo a la identificación de 3 / moduladores eficientes del Icrac. Tales moduladores del 5 Icrac representan un fármaco candidato o guias o modelos que son utilizadas en el tratamiento de diversas condiciones patológicas, inclusive enfermedades inmunes (GVHD, enfermedades auto-inmunes, inflamación, alergias, asma, etcétera) y desórdenes proliferativos (cánceres, estenosis, etcétera) . Los compuestos se pueden utilizar para tratar, V prevenir, corregir, aliviar o reducir la condición patológica, ya sea solos o en combinación con otras moléculas farmacéuticamente activas. Otros aspectos y ventajas de la presente invención serán descritos en la siguiente sección experimental, la cual se debe considerar como ilustrativo y no limitante del alcance de la protección.

Abreviaciones utilizadas : 20 TG: tapsigargina; CsA: ciclosporina, CPA: ácido ciclopiazónico; PHA: fitohemagutinina; P A: acetato de miristato de forbol; CHX: cicloheximida; Jk-NFAT-blac: línea de células jurkat que expresa establemente la b-lactamasa 25 bajo el control del NFAT Jk-CMV-blac: línea de células jurkat que expresa constitutivamente la b-lactamasa; p815-NFAT-blac: linea de células p815 que expresa la b-lactamasa bajo el control del NFAT; HEK-CRE-blac: linea de células HEK que expresa la b-lactamasa bajo el control del CRE; NFAT: factor nuclear de células T activadas; CRE: Elemento Responsivo a AMPc; sulfóxido de dimetilo de DMSO.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1. Via de activación relacionada con el NFAT. Figura 2. A) Principio del ensayo en base a células con el gen reportero. La ß-lactamasa se expresa después de la activación del sistema del NFAT el cual se inicia por oscilaciones de [Ca++] debido a la depleción de la acumulación de calcio intracelular y la estimulación del Icrac. En este ejemplo se utiliza la hidrólisis del substrato de la ß-lactamasa para determinar el nivel de expresión de la ß-lactamasa. B) Efecto del [Ca++] extracelular sobre la síntesis del reportero-proteína (ß-lactamasa) medido por la hidrólisis de CCF2-AM. Las células Jurkat con NFAT-ß-lactamasa se estimularon durante 4 horas en el medio de RPMI ([Ca++] 0.4 mM) o el medio de DME ( [Ca++] 1.8 mM) en la presencia de TG 1 µ?.

C) Efecto de la concentración de TG sobre la síntesis de la ß-lactamasa . Las células Jurkat con NFAT-ß- lactamasa se estimularon durante 4 horas con diversas -- concentraciones de TG en el medio de DME. v , 5 Figura 3. Expresión del gen impulsada por el NFAT después de la estimulación con TG 1 µ? en células Jurkat y p815. Las células Jurkat con NFAT-p-lactamasa y p815 con NFAT-piac se incubaron con diversos moduladores durante 4 horas, antes de cargar el substrato. 1) control; 2) TG 1 µ? 10 + PMA 10 nM; 3) TG 1 µ?; 4) CsA 10 nM; 5) CsA 100 nM; 6) DMSO 0.5%; 7) DMSO 1%; 8) DMSO 2%. Figura . Efecto de diversos inhibidores sobre la síntesis de la p-lactamasa impulsada por TG. Las células Jurkat con NFAT-p-lactamasa se incubaron con diversos 15 inhibidores/moduladores junto con TG 1 µ? durante 4 horas, antes de la carga del substrato 1) control, 2) TG 1 µ?. La TG 1 µ se adicionó con 3) CsA 50 nM, 4) ácido okadaico, 5) caliculina, 6) Verapamil 10 µ?, 7) Diltiazem 10 µ?, 8) Nifedipina 10 µ?, 9) cicloheximida 10 µg ml, 10) DMSO 2%. Se 20 definió 100% como las células estimuladas con la TG 1 µ? sola . Figura 5. Efecto de la Ciclosporina sobre las células Jurkat con NFAT-p-lactamasa estimuladas por la TG. Las células Jurkat con NFAT-p-lactamasa se trataron con TG 1 µ? en presencia de diversas concentraciones de Ciclosporina. Se definió 100% como las células estimuladas sin CsA. Figura 6. Efecto del DMSO sobre diversos tipos de células y promotores. Se adicionó DMSO 3% a los pocilios que contenían células Jurcat con CMV-p-lactamasa O y células Jurcat con NFAT-p-lactamasa () estimuladas con TG 1 µ?, y células HEK CRE-p-lactamasa estimuladas con forskolin 10 µ? (). Los resultados se expresan como la relación de las actividades de cada línea de células sin o con DMSO. Figura 7. Estimulación de Jk-NFAT-piac en un formato de placa de 384 pocilios.

Tabla 1 Potencia relativa de diversos activadores de la síntesis de ß-lactamasa impulsada por TG en las células Jurcat con NFAT. Tabla 2 Efecto de DMSO sobre la capacidad de carga y las células Jurkat con NFAT-p-lactamasa.

Ejemplos 2. Matarxalma y Métodos Ensayo en base a las células Selección de la línea de células las lineas de células Jurkat (Jk-NFAT-piac) transíectadas establemente con un plásmido que contenia el gen reportero de 3xNFAT-p- lactamasa (para la secuencia promotora del NFAT ver (19)), y un plásmido que contenia CMV-p-lactamasa (Jk-CMV-piac) , ·· donde C V es un promotor constitutivamente activo asi como v ... 5 también las células HEK (HEK-CRE-piac) con 3xCRE-p-lactamasa (el promotor CRE contiene la secuencia del cuadro CRE de CGTCA (20)) se obtuvieron de Aurora Biosciences Corp (San Diego, CA) . La linea de células monoclonales de mastocitos 10 (p815-NFAT-piac) transfectada establemente con un plásmido que contenia 3xNFAT-p-lactamasa se obtuvo como sigue. Las células (1.107/ml) se electroporaron en una cubeta con abertura de 0.4 cm utilizando un BioRad Gene Pulser II a 960 µF y 300V, utilizando 20 µg del vector de expresión de 15 Zeomicina ADNpcIII 3xNFAT-p-lactamasa (de Aurora Biosciences Corp; San Diego, CA) en el medio de DME . Después de 48 horas, las células p815 electroporadas se seleccionaron durante 2 semanas utilizando 250 µg ml de Zeocina (InVitrogen, CA) . Una acumulación de células responsivas a 20 la TG primero se dividieron, utilizando FACS Vantage (Becton Dickinson, CA) , y una semana después, 200 células se monodividieron (una células por pocilio) de esta acumulación. Se cultivaron 15 clones y se sometieron a prueba como sigue. 25 Ensayo del gen reportero Las células Jurkat se cultivaron en un medio de RPMI 1640 complementado con suero bovino fetal 10%, L-glutamina 2 mM, NEAA 1 mM, Piruvato de Na 1 mM, v HEPES 25 mM, pH 7.4, gentamicina 100 µg ml. Las células HEK- 5 293 se cultivaron en glutamax de MEM, complementado con FBS 10%, gentamicina 10 µ?/p??, HEPES 20 mM. El medio para la propagación estable de células contuvo 250 µg ml de Zeocina (Jk-NFAT-piac) o 800 g ml de Geneticina {Jk-CMV-plac, HEK- CRE-piac) . En una placa de 96 pocilios, se utilizó 1 µ? de 10 Tapsigargina (TG) para estimular las células Jurkat con NFAT (10 por pocilio), durante 4 horas a 37°C, C02 5%, en FBS 10% ( [Ca++] 1.8 mM) de Dulbecco' s Modified Essential Médium, gentamicina 100 µg/ml. Las células luego se cargaron, durante 1 hora en la oscuridad a temperatura ambiente, con 15 12 uM de CCF2-AM (13) . La fluorescencia se monitoreó con un fluorómetro Fluostar (BMG, Alemania) . La excitación fué a 405 nm, y la emisión se registró a 460 nm y 535 nm. La relación (460 nm/535 nm) de unidad de fluorescencia (F.U., por sus siglas en inglés) se estimó después de la corrección 20 para la antecedencia (medio sin células) . La linea HEK-CRE- iac se estimuló utilizando Forskolin 10 µ? en el medio mencionado anteriormente (4xl04 células/pocilio) . Todos los reactivos se adicionaron con el agente estimulador (por ejemplo TG o forskolina), a menos que se notifique. 25 Medición óptica del [Ca**] Intracelular. La carga con 2 µ? de fura-2-?? se realizó con una suspensión de células 3x10* durante 30 minutos a 3 °C, en solución salina, amortiguadora de Hanks (HBSS, por sus siglas en inglés) . Las células se lavaron y se resuspendieron dos veces para minimizar el tinte extracelular . Las mediciones de fluorescencia con fura-2 se llevaron a cabo en una cubeta cubierta con agua (temperatura ambiente) con agitación continua, que contenia 1 mi de la suspensión de células. La fluorescencia se monitoreó con un espectrofluororómetro Shimadzu al colectar continuamente (intervalos de 1 segundo) las señales de excitación a 340 nm y 380 mi y la señal de emisión a 510 nm. Las fluorescencias máxima y mínima se obtuvieron al adicionar ionomicina 25 uM y EGTA (20 mM) respectivamente y secuencialmente al final del experimento. La relación de las señales de excitación a 340 nm y 380 nm se utilizó para calcular el [Ca*+] como se describe previamente (21) asumiendo un Kd de 155 nM.

Fármacos Tapsigargina, acetato de miristato de éster de forbol (???), fitohemaglutinina (PHA), ácido okadaico, caliculina, cicloheximida, DMSO seco, ácido ciclopiazónico, ciclosporina y Fura-2 se adquirieron de Sigma. El CCF2-AM fué de Aurora Biosciences. Todos los reactivos para el cultivo de células fueron de LifeTech (Gaithersburgh, MD) . Las células p815 fueron de ATCC (Manassas, VA. ATCC # TIB 64) . r 5 2. Activación dml NFAT en líneas da células Jtirkat.

Se emprendió un ensayo del gen reportero (ver Figura 2A para el principio esquemático) para estudiar la . 10 activación de las células T y la producción del gen impulsada por el NFAT relacionada con la activación y la regulación de flujo del Icrac. En esta prueba, se evitó la co-estimulación con los activadores de la PKC, puesto que el ensayo se hizo para identificar los bloqueadores o los inactivadores del Icrac pero no los inhibidores de la PKC. Sin embargo, mientras que la tapsigargina sola puede iniciar una producción del gen relacionada con el NFAT, la actividad { de la ß-lactamasa resultante llegó a ser débil en condiciones convencionales (condiciones convencionales que son [Ca++] 0.4 mM. (Figura 2B) . Para superar este problema y diseñar un ensayo de selección escogedora, se ha encontrado que cuando el [Ca++]o se incrementó a 1.8 mM (en lugar de aproximadamente 0.4 mM) , la señal para la taza de ruido llegó a ser 5-veces más alta y adecuada para un ensayo de HTS. Además, se muestra que la expresión del gen reportero (ß-lactamasa) estuvo relacionada con la concentración de TG de 0 a 1 µ ; las concentraciones más altas no incrementaron adicionalmente la síntesis de la ß-lactamasa (Figura 2C) , y aun se observó una disminución en las concentraciones de 5-10 µ? de TG. 3. Inhibidores y activadores dml sistema del ???? (validación de la selección) .

Los diversos activadores del Icrac conocidos tales como fitohemaglutinina (PHA), tapsigargina (TG), ácido ciclopiazónico (CPA) y el anticuerpo contra CD28, se sometieron a prueba, y se verificaron sus potencias relativas para estimular la expresión de la ß-lactamasa . Los resultados obtenidos (Tabla 1) muestran que la TG es el activador del Icrac activo, y como se describe previamente (22) la combinación de TG / PMA incrementa significantemente la señal. El ácido okadaico (OKA), un inhibidor de fosfatasa PP1A y PP2 bloqueó la síntesis de la ß-lactamasa, consistente con los resultados anteriores (23) tanto en las células Jurkat (Figura 4) como los mastocitos (no mostrado) . La caliculina, otro inhibidor de fosfatasa, bloqueó la activación del NFAT de una manera dependiente de la dosis (Figura 4 y (11)}. La ciclosporina (CsA) , un inhibidor de fosfatasa de calcineurina, suprimió la síntesis de la ß- latamasa con un CI5o en 17 nM (Figura 5), de acuerdo con el reporte anterior (18 nM, ver (22)). Se piensa que las células Jurkat carecen de canales de Ca++ dependientes del , ¦·¦ voltaje. De acuerdo con esta suposición, los inhibidores específicos de estos canales (Verapamil, Diltiazem y Nifedipina) no tuvieron ningún efecto sobre la síntesis de la ß-lactamasa (Figura 4) cuando se utilizaron a 10 µ?. Los efectos tóxicos se detectaron a 50 µ? (carga débil, datos no mostrados) . La Tazobactama, un inhibidor de la ß-lactamasa 10 (Ki = 0.7 µ?) se mostró que bloquea la ß-lactamasa tanto impulsada por el NFAT (Figura 4) como constitutiva (impulsada por CMV) con un CI50 a 2 µ?. 4. Efecto del DMSO 15 El DMSO es un vehículo muy común para los compuestos insolubles en agua así como también un compuesto anti-inflamatorio bien conocido. Se sometió a prueba el efecto de esta sustancia química sobre las diferentes líneas de células y diferentes promotores descritos en esta solicitud. Como se muestra en la Figura 6, el DMSO no tiene efecto sobre la síntesis de la ß-lactamasa (constitutiva) de las células Jk-CMV^lac. Sin embargo, éste no inhibió la producción de ß-lactamasa de las células Jk-NFAT^lac, p815- 25 NFAT^lac y HEK-CRE^lac, con un CI50 en 1%. Además, la Tabla II indica que la carga no se modificó después del tratamiento con DMSO. Para estudiar adicionalmente el mecanismo de inhibidión del DMSO, se adicionó DMSO, CsA y r CHX en diferente tiempo después de la adición de TG. El V. 5 curso del tiempo del DMSO y los efectos inhibitorios de la CsA son mucho muy parecidos, y ambos compuestos no bloquearon la síntesis de la ß-lactamasa si se adicionaron 3 horas después de la activación de la TG, mientras que el patrón del curso de tiempo de CHX se desvió fuertemente, exhibiendo un efecto inhibitorio cuando se adicionó tanto como 4 horas después de la estimulación de con TG, lo que sugiere que el compuesto actuó en el nivel de síntesis de proteínas . Este efecto inhibitorio del DMSO se detectó igualmente con la línea HEK-CRE-piac sugiriendo que el DMSO actuó después del incremento de [Ca++]i y antes de la síntesis de proteínas. Confirmando estos resultados, la determinación de [Ca++]i utilizando Fura-2 como sustancia de prueba, mostró que este compuesto no tenía efecto sobre el canal Icrac mismo. 20 5. Ensayo da Alto Rendimiento Se realizó una prueba en una sub-colección de 3000 compuestos en las siguientes condiciones: 25 Preparación, de placas y estimulación de las células Sembrar células a 105 células /180 µ? /pocilio en el medio de DMEM (GIBCO Cat #) 90%, FBS 10% en placas negras de fondo claro de 96 pocilios (COSTAR cat # 3603) . Adicionar 18 µ? de tapsigargina (11.1 µ?) + 2 µL del compuesto 1 mM en DMSO 50% (es decir DMSO final 0.5%). Incubar a 37°C, C02 5%, humedad 90% durante 4 horas.

Carga del tinte Se mezclaron vigorosamente 12 µ? de CCF2-AM 1 mM con 60 µ? de ácido plurónico y luego con 1 mi de una solución de PEG 400. Se adicionaron 40 µ? de la solución resultante a los posillos. Las placas luego se envolvieron en una hoja delgada de metal, se agitaron suavemente a temperatura ambiente durante 45 minutos a 2 horas.

Ensayo de fluorómetro La excitación se realizó a 405 nm y la emisión a 460 y 535 nm. Los siguientes controles se adicionaron en cada placa, i) Vacío, medio sin células; ii) control positivo (100%), JkNFAT -lac estimulada con tapsigargina; iii) control negativo (0%), JkNFATp-lac no estimulada.

El cálculo de la relación fué como sigue. El promedio de los valores vacíos se substrajo de las F.ü.s (tanto para la FU. 460 nm y F.U. 535 nm) y se estimó la relación de los valores resultantes (460/535) . Usualmente, los valores de control negativo fueron de aproximadamente 0.010 y del control positivo fueron aproximadamente 0.400-0.500.

Selección Secundaria Para determinar si los resultados seleccionados tienen un efecto ya sea corriente arriba o corriente debajo de la activación del factor nuclear, se verifica su inhibición potencial de la síntesis de la ß-lactamasa impulsada por el CRE utilizando las células HEK trans ormadas establemente con un vector de expresión de CRE3xpiactamasa . Las células se estimularon durante 6 horas con 10 uM de forskolina.

Resultados El ensayo mostró que la desviación normal intra- e inter-placa no fué mayor que 5% (datos no- mostrados) . Fuera de los 3000 compuestos de prueba, se seleccionaron 17 como bloqueadores del Icrac en el ensayo y se seleccionaron 3 después del ensayo secundario. Este ejemplo muestra que el método permite la selección eficiente, confiable y escogedora de los moduladores del Icrac. 6. Dimensión En esta solicitud, se describe un sistema de gen reportero/en base a células. Esto permite el análisis conveniente del proceso de activación del NFAT, puesto que la amplitud de la señal inducible y la reproductividad de este ensayo es compatible con el uso de placas de microtitulo de 96 pozos (los datos preliminares mostraron que la placa 384 se puede utilizar también con este ensayo, Figura 7) . Los diversos moduladores de la vía de activación del NFAT relacionada con el Icrac se sometieron a prueba y sus efectos se encontraron en concordancia con los reportes anteriores. Notable, la activación del gen impulsada por el NFAT es probable que sea un caso binario. Las células T permanecen inactivas hasta que el NFAT activado (desfosforilado) alcanza una concentración de umbral. Las células T luego se inician para entrar en un estado activado que es equivalente para todas las formas y la concentración de los estímulos (22,24). En este contexto, el CI50 refleja una disminución en el porcentaje en células respondedoras preferiblemente que en la intensidad de la respuesta en células individuales. Un aspecto importante de la prueba presentada en la presente, es el estimulo especifico para el Icrac utilizado (es decir TG) y el hecho que la vía de la PKC no se activó en la presente, cargando a un ensayo más especifico. Además, para separar los moduladores del Icrac genuinos de entre los compuestos no específicos, se ha emprendido otro ensayo del gen reportero que involucra un elemento de respuesta diferente (es decir un ensayo en base a HEK-CRE-piac) , permitiendo reducir dramáticamente el número de positivos falsos. Se puede desarrollar otro ensayo secundario de bajo rendimiento tal como la captación de 45Ca y la electrofisiologia del canal Icrac. La prueba es adecuada para HTS. En realidad, las células tienen que recibir una mezcla de TG y el compuesto, ser incubadas a 37eC durante 4 horas y ser cargadas con CCF2-AM durante 30 minutos. Otra ventaja de la técnica es el substrato de ß-lactamasa. El CCF2 es no tóxico, ratiométrico y permanece dentro de las células durante diversas horas. Luego, la ß-lactamasa parece ser la proteína más adecuada para el ensayo del gen reportero. En realidad, se puede monitorear en células vivas (distinto a la ß-galactosidasa o luciferasa) y, puesto que la ß-lactamasa es una enzima bacteriana, la actividad no endógena reacciona de modo cruzado en células de mamíferos (distinto a la fosfatasa alcalina) . Pero la característica más atractiva de la prueba es que permite la detección no únicamente de bloqueadores de la afluencia de s Ca++ genuinos, sino de las moléculas que actúan sobre el nivel de activación del Icrac. Puesto que se ha propuesto muy recientemente que esta activación es el resultado de un andamiaje de diversas proteínas (TRP, IP3 (26, 27) y SNAP25 (18)) cualquier bloqueador de las interacciones de proteína- proteína entre estos componentes es de facto un modulador de 10 la activación del Icrac. Esto podría conducir al descubrimiento de moléculas muy específicas, con efectos secundarios predecibles, bajos, y no solo a "tapones" del canal de Ca++ no específicos. Durante este estudio, se comprobó que el DMSO es 15 un bloqueador de la ß-lactamasa no especifico, potencial. Se mostró que el DMSO bloqueó la expresión de la ß-lactamasa impulsada por el NFAT tanto en mastocitos como en linfocitos así como también bloqueó la expresión de la ß-lactamasa impulsada por el CRE en células HEK con un CI50 alrededor de 20 1%. De manera interesante, se mostró que el efecto inhibitorio del DMSO surge entre la activación del NFAT y la traducción del ARN, pero no actuó como un bloqueador no específico de la síntesis de proteínas. Son necesarios estudios adicionales para manchar de manera precisa el 25 objetivo de DMSO intracelular. Sin embargo, se mostró que el DMSO 0.5% no obstaculizó el ensayo y se puede utilizar como concentración final. Notablemente, las herramientas farmacológicas utilizadas en este estudio no permitieron detectar las diferencias (si las hay) entre el canal Icrac de las células T y los mastocitos. Por consiguiente, el ensayo en base a células descrito en la presente facilita sustancialmente los procedimientos de selección y amplia el campo de investigación apuntando hacia la identificación de nuevos reactivos con potencial terapéutico en patologías relacionadas con la inflamación, proliferación de células (por ejemplo, cáncer), auto-inmune o alergias.

Referencias Robey, E. y Allison, J. P. (1995) Immunol . Today 16, 306- 310. Ghosh, P. y colaboradores (1996). J.Biol.Chem. 271, 7700- 7704. Rao, A., Luo, C, y Hogan, P. G. (1997), Annu.Rev. Immunol. 15, 707-747. Clipstone, N. A. y Crabtree, G. R. (1992) Nature 357, 695-697. Lewis, R. S. y Cahalan, M. D. (1990), Annu.Rev. Physiol. 52:415-30, 415-430. Berridge, M. J. (1995) Biochem. J. 312, 1-11. Fanger, C. M. y colaboradores (1999) J.Cell.Biol. 131, 655-667. Masón, M. J. y colaboradores (5-11-1991) J Biol Che 266, 20856-20862. Thastrup y colaboradores, PNAS 87 (1990) 2466 Am. J. Physiol. 269 (1995) C733 Li, . y Handschumacher (1996) Biochem. Biophys.Res.

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. Loh, C y colaboradores (3-5-1996) J.Biol.Chem. 271, 10884-10891. 16. Hoth, M. y Penner, R. (1992) Nature 355, 353-356. 17. Masón, M.J. y colaboradores, J.Biol.Chem. 266, 20856- 5 20862 18. Yao y colaboradores (20-8-1999) Cell 98, 475-485. 19. Mattila y colaboradores (1990) EMBO J. 9, 4425-4433. 20. Yamagami y colaboradores (1988) Aun N Y Acad Sci 527, 87-102. 10 21. Grynklewicz y colaboradores (1985) J.Biol.Chem. ? 260, 3440-3450. 22. Negulescu y colaboradores (1994) Proc. Nati.Acad. Sci. U.S.A. 91, 2873-2877. 23. Thevenin, C y colaboradores (25-5-1991) J.Biol.Chem. 15 266, 9363-9366. 24. Karttunen, J. y Shastri, N. (1991) Proc Nati Acad Sci USA 88, 3972-3976. r ^ 26. Boulay y colaboradores (2000) Proc. ati. Acad. Sei. USA 96, 14955-14960. 20 27. Putney, J. W. Jr. (2000) Proc. Nati.Acad. Sci. USA 96, 14672-14674.

Tabla 1 Activador del Xcrac Relación % total (460 m / 535 zun) (TG 1 JIM) TG 1 µ? 0.688 ± 0.035 100 PMA 10 nM 0.012 ± 0.008 2 TG 1 µ? + PMA 10 mM 1.648 ± 0.119 240 CPA 10 µ? 0.407 ± 0.041 59 CPA 10 µ? + PMA 10 nM 1.249 ± 0.032 182 PHA 1 µg/ml 0.280 ± 0.116 41 PHA 10 µ?/p?? 0.578 ± 0.040 84 mAbCD28 30 ng/ml + PMA 10 nM 0.020 ± 0.010 4 mAbCD28 100 ng/ml + PMA 10 nM 0.089 ± 0.023 13 mAbCD28 300 ng/ml + PMA 10 nM 0.254 ± 0.054 37 mAbCD28 1000 ng/ml + PMA 10 nM 0.275 ± 0.032 40 Tabla 2 F.ü. a 535 nm tratamiento Promedio SD % de Control Control 12043 173 100 DMSO 0.1% 11957 1131 99.2 DMSO 1% 11584 1379 96.1 DMSO 2% 11680 947 97 DMSO 4% 12980 899 107.7 DMSO 5% 13265 890 110.1 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. v....

V. ,

Claims (26)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para seleccionar un compuesto que modula la actividad del canal de calcio, preferiblemente la actividad del canal activado por la liberación de calcio (Icrac) , caracterizado porque comprende: a. poner en contacto un compuesto de prueba y un activador selectivo del canal de calcio, en forma preferente un activador del Icrac con una población de células que expresan el canal de calcio, preferiblemente células que expresan el Icrac, las células que además contienen una construcción reportera que comprende un gen reportero bajo el control de un promotor inducible por el NFAT, y b. determinar la actividad del compuesto de prueba en el canal de calcio, en forma preferente un canal activado por la liberación de calcio, al medir la expresión del gen reportero en las células.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en el paso a), las células se ponen en contacto con un activador del Icrac en la ausencia de un activador de la Cinasa Proteinica C.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el activador del Icrac es un producto o un tratamiento que reduce o agota selectivamente los depósitos de calcio intracelular, preferentemente tapsigargina.
4. 4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto un compuesto de prueba y un activador selectivo del Icrac, directo o indirecto con una población de células que expresan el Icrac, las células que además contienen una construcción reportera que comprende un gen reportero bajo el control de un promotor inducible por el NFAT. (b) poner en contacto las células de a) con un substrato del gen reportero, y (c) determinar la actividad del compuesto de prueba en el canal activado por la liberación de calcio al valorar la hidrólisis del substrato en las células.
5. 5. El método de conformidad con las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el gen reportero es un gen de ß-lactamasa.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque, en el paso b) , el substrato es un substrato ratiométrico.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el substrato es CCF2-AM.
8. 8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la población de células comprende un cultivo de células de la sangre, particularmente linfocitos, mastocitos, o células dendriticas.
9. 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el compuesto de prueba y el activador del Icrac se ponen en contacto simultáneamente con las células.
10. 10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque al menos dos compuestos de prueba se ponen en contacto en paralelo con la población de células.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el menos 10, preferiblemente al menos 50 compuestos se ponen en contacto en paralelo.
12. 12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el paso a) se realiza en una placa de múltiples pocilios.
13. 13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la población de células se incuba en un medio que comprende al menos 1 mM de calcio.
14. 14. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el método se utiliza para someter a un ensayo la actividad de un compuesto de prueba.
15. 15. Un método para seleccionar los bloqueadores del Icrac, caracterizado porque comprende: a) poner en contacto un compuesto de prueba y un activador del Icrac con una población de células que expresan el Icrac, las células que además contienen una construcción reportera que comprende un gen reportero bajo el control de un promotor inducible por el NFAT, las células que se incuban en un medio que contiene al menos 1 mM de calcio. b) poner en contacto las células de a) con un substrato del producto de la expresión del gen reportero, y, c) determinar la actividad del compuesto de prueba en el canal activado por la liberación de calcio al valorar la hidrólisis del substrato en las células.
16. 16. Un método para seleccionar los bloqueadores del Icrac, caracterizado porque comprende: a) poner en contacto un compuesto de prueba y un activador del Icrac con una población de células que expresan el Icrac, las células que además contienen una construcción reportera que comprende un gen de ß-lactamasa bajo el control de un promotor inducible por el NFAT, las células que se incuban en un medio que contiene al menos 1 itiM de calcio, b) poner en contacto las células de a) con un substrato ratiométrico de ß-lactamasa, y c) determinar la actividad del compuesto de prueba en el canal activado por la liberación de calcio al valorar la hidrólisis del substrato en las células.
17. 17. Un método para seleccionar estimuladores del Icrac, caracterizado porque comprende: a) poner en contacto un compuesto de prueba con una población de células que expresan el Icrac, las células que además contienen una construcción reportera que comprende un gen reportero bajo el control de un promotor inducible por el NFAT, las células que se incuban en un medio que contiene al menos 1 mM de calcio, b) poner en contacto las células de a) con un substrato del producto de la expresión del gen reportero, y c) determinar la actividad del compuesto de prueba en el canal activado por la liberación de calcio al valorar la hidrólisis del substrato en las células.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el gen reportero es un gen de ß-lactamasa
19. 19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque las células se incuban en un medio que carece de éster de forbol .
20. 20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque es para seleccionar un compuesto que module la afluencia de calcio mediada por el Icrac.
21. 21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende: d) seleccionar los compuestos obtenidos en c) a fin de eliminar aquellos que modulan la actividad de la ß-lactamasa de una manera no dependiente del NFAT al poner en contacto los compuestos seleccionados en c) con una población de células que comprenden una construcción reportera que comprende un gen de ß-lactamasa bajo el control de un promotor no inducible por el NFAT, en forma preferente seleccionado del promotor inducible por el CRE, el promotor responsivo al VIP, promotores que contienen un elemento responsivo a NF B O JNK, más preferiblemente un promotor inducible por el CRE.
22. 22. Un equipo para el uso en un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende una población de células como se define en la reivindicación 1, un soporte, y un substrato.
23. 23. Una célula de la sangre o una célula derivada de la sangre para el uso en un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque contiene una construcción reportera que comprende un gen reportero bajo el control de un promotor inducible por el NFAT.
24. 24. Un linfocito o una célula derivada de linfocitos o un mastocito o una célula derivada de mastocitos para el uso en un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque contiene una construcción reportera que comprende un gen reportero bajo el control de un promotor inducible por el NFAT.
25. 25. Una población de células inmunes de roedores, en particular células inmunes de murino o de rata o células inmunes de humano para el uso en un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque comprende una construcción reportera que comprende un gen reportero bajo el control de un promotor inducible por el NFAT.
26. 26. Una población de células de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque comprende al menos 80% de células que expresan el canal del Icrac.