MXPA00011708A

MXPA00011708A - Vacuna contra el virus de la encefalitis equina venezolana recombinante.

Info

Publication number: MXPA00011708A
Application number: MXPA00011708A
Authority: MX
Inventors: Alice Marie Bennett
Original assignee: Secr Defence
Priority date: 1998-05-29
Filing date: 1999-05-05
Publication date: 2005-10-13
Also published as: GB9811433D0; WO1999063098A1; DE69920011D1; US6936257B1; CA2329133C; EP1084261B1; PT1084261E; AR020080A1; AU3834999A; DK1084261T3; GB2337755A; DE69920011T2; CA2329133A1; BR9910814A; ATE275631T1; GB2337755B; EP1084261A1; ES2224655T3; USRE41745E1; EP1084261B8

Abstract

Se describe una vacuna profilactica o terapeutica para su uso para proteger mamiferos tales como seres humanos o animales contra el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE).Particularmente, la vacuna comprende un virus recombinanate como, por ejemplo, un virus de vaccinila recombinante que puede expresar los genes estructurales de VEE en forma atenuada, que ha sido modificado para incrementar el efecto protector de la vacuna . Esto se logra modificando la secuencia de la cepa de VEE atenuada y/o colocando dicha cepa bajo el control de promotor modificado lo que incrementa la expresion a partir del vector. Se describen tambien formulaciones de la vacuna asi como metodos de tratamiento con el empleo de la vacuna.

Description

VACUNA CONTRA EL VIRUS DE LA ENCEFALITIS EQUINA VENEZOLANA RECOMBIN NTE La presente invención se refiere a una vacuna de virus, específicamente una vacuna para el virus de la encefalomielitis equina venezolana (VEE) , a su preparación y formulaciones farmacéuticamente aceptables así como métodos de tratamiento profiláctico y terapéutico empleando dicha vacuna . El virus de VEE es un alfavirus portado por moscos que es una causa importante de enfermedad epidémica en seres humanos y de epizootias en caballos, asnos y muías en ciertas partes del mundo, particularmente en América Latina. La vacuna contra VEE existente, TC-83, fue producida inicialmente mediante la atenuación de la cepa de VEE de asno Trinidad (TRD) mediante un pasaje secuencial en cultivos de células de corazón de conejillos de Indias. Sin embargo, esta vacuna se considera, generalmente, inadecuada para la vacunación de seres humanos. Esto se debe principalmente a la alta incidencia de efectos colaterales en las personas vacunadas y la gran proporción de personas vacunadas que no desarrollan anticuerpos neutralizantes (Monath et al., 1992, Vaccune Research, 1, 55-68) . Se ha elaborado una vacuna basada en vaccinia contra VEE (Kinney et al. J. Gen. Virol. 1988, 69, 3005-3013) . En este recombinante genes estructurales que codifican 26S ARN de VEE fueron insertados en la cepa NYCBH de vaccinia. El virus recombinante proporcionó protección contra reto subcutáneo pero tenia una eficacia limitada contra reto en aerosol con VEE. La cepa de asno trinidad virulenta de VEE y la cepa atenuada TC-83 han sido clonadas y secuenciadas (R. . inney et al. Virology (1989) 170, 19-30) y el sistema de numeración de aminoácidos y nucleótidos empleado en esta referencia se empleará a continuación. Este trabajo reveló que existen varios cambios de aminoácidos entre TRD y TC-83. La mayoría (cinco) de estos cambios ocurre dentro del gen que codifica la glicoproteina E2. Los cambios se presentan a continuación de manera resumida Tabla 1 Nucleótido aminoácido Posición TRD TC-83 TRD TC-83 22, región de unión A G no codificador 1053, E2-7 G U Lys Asn 1285, E2-85 C U His Tyr 1391, E2-120 C U Thr Arg 1607, E2-192 U A Val Asp 1866, E2-278 U C ninguno 1919, E2-296 c U Thr lie 2947, Ei-161 u A Leu lie 3099, Ei-211 A U ninguno 3874, 3 '-región UU U no codificadora no codificadora Se ha encontrado también que los primeros 25 aminoácidos de la glicoproteina E2 representa un epitopo protector. Esta región incluye un cambio único de aminoácido (lys ^ asp) en el aminoácido 7 en el constructo de TC-83 en comparación con la cepa TRD. Un péptido sintético de 25 pares de bases basado en la secuencia de TRD VE2pep01 (TRD) , protegía más a los ratones contra reto con virus de TRD que un péptido basado en TC-83 correspondiente (A.R. Hunt et al., Virology, 1990, 179, 701-711) . Un mapeo más preciso de este epitopo se ha efectuado (A. R Hunt et al., Vaccine 1995, 13, 3, 281-288). Los solicitantes han encontrado formas de incrementar la capacidad de protección de una vacuna y particularmente una vacuna basada en vaccinia. Particularmente, los solicitantes han encontrado que la capacidad de protección de la vacuna puede ser incrementada ya sea (a) mediante la restauración del residuo de lisina en el aminoácido 7 de la proteína E2 y/o (b) mediante la modificación del promotor para incrementar la expresión del constructo protector. Así, en un primer aspecto, la presente invención ofrece una vacuna para la inmunización terapéutica o profiláctica contra el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) , dicha vacuna comprende un vector que incluye una secuencia que codifica una forma atenuada de dicho virus que es capaz de producir una respuesta inmune protectora, donde dicha secuencia es tal que el aminoácido en la posición 7 en la proteina E2 de VEE es lisina. De manera adecuada, la forma atenuada del virus de VEE comprende un derivado o variante del constructo TC-83 o un fragmento inmunogénico del mismo. Otras formas atenuadas pueden ser producidas por el experto en la materia, por ejemplo, empleando técnicas conocidas tales como pasaje en serie a través de otro organismo, o bien mediante tecnología de ADN recombinante, por ejemplo, mediante la desactivación de genes asociados con la replicación o virulencia del virus. El gen estructural que codifica la glicoproteína E2 o un fragmento que codifica por lo menos los 19 aminoácidos de terminal N debe conservarse para conservar la inmunogenicidad del constructo. Fragmentos adecuados del constructo son fragmentos que incluyen solamente algunos de los genes estructurales del péptido de VEE o que codifican solamente una parte de las proteínas codificadas por dichos genes, a condición que el constructo codifique suficientes determinantes antigénicos para asegurar que puede producir una respuesta inmune protectora en un mamífero al cual se administra el constructo . Como se emplea aquí, el término "variante" significa que el constructo es diferente de la cepa original pero que codifica proteínas y/o péptidos que son iguales o similares a los de VEE de tipo silvestre o fragmentos inmunogénicos del mismo. Así, los cambios en la secuencia de nucleótidos pueden ser silenciosos en la medida en que no producen cambios de aminoácidos en comparación con la cepa original, o bien pueden producir cambios de aminoácidos a condición que estos no alteren la función del constructo en términos de su capacidad para producir una respuesta inmune protectora contra VEE. Por ejemplo, el constructo puede codificar péptidos o proteínas que presentan una homología del 60% con la proteína o péptidos de tipo silvestre, adecuadamente más de 80% de homología y de preferencia más que el 90% de homología con la secuencia de proteína nativa, y a condición que produzcan anticuerpos que reaccionen de manera cruzada con VEE de tipo silvestre, se pueden conservar los efectos protectores del constructo. Los "derivados" pueden tener estructuras generalmente similares pero son derivados mediante la manipulación de los constructos originales empleando tecnología de ADN recombinante o bien modificación química, en caso apropiado. El vector puede contener las funciones habituales de control de expresión tales como promotores, realzadores y secuencias de señales, así como marcador de selección con el objeto de permitir la detección de transformantes exitosos. La selección de estos dependerá de la naturaleza precisa del vector seleccionado y un experto en la materia podrá efectuar esta selección o bien podrá determinarla fácilmente. De manera adecuada, el vector es un vector viral/ por ejemplo, un vector derivado de vaccinia, adenovirus, o bien virus de herpes simples (HSV) BCG o BCC. Es adecuadamente atenuado en si, para minimizar cualquier efecto dañino asociado con el virus sobre el huésped. De preferencia, el vector se deriva de virus de vaccinia, puesto que tiene muchas propiedades que hacen de él un vector adecuado para vacunación, incluyendo su capacidad para estimular de manera eficiente las respuestas inmunes humorales así como mediadas por células. Vaccinia ha comprobado ser útil como vehículo para vacuna, después de los programas de erradicación de la viruela. Proporciona el potencial para la construcción de vacuna multivalente y para administración oral. Existen muchas cepas atenuadas actualmente disponibles. Un marcador de selección adecuado para su inclusión en un vector de vaccinia es el gen marcador gpt. Una vacuna contra VEE fue construida empleando una cepa WR en ese trabajo. De preferencia, se emplea una cepa más altamente atenuada de vaccinia que podría ser más aceptable para su uso en seres humanos. Tales cepas incluyen Lister, que fue empleada para vacunación a gran escala contra la viruela, NYVAC (Tartaglia et al, (1992) . AIDS Research and Human Retroviruses 8, 1445-1447) que contiene remociones especificas de genoma, o bien VA (Mayr et al, (1975) Infection 3, 6-14) que presenta también una fuerte atenuación. Vacunas basadas en vectores virales se formulan de manera adecuada para administración parenteral como se describió arriba. Sin embargo, es posible formular tales vacunas para administración oral, por ejemplo, mediante la incorporación del vector en un microorganismo que coloniza los intestinos como por ejemplo Salmonella y particularmente S. typhimurium. pTC-5A es un plásmido clon de ADNc que codifica los genes estructurales de la cepa TC-83 de virus de VEE (Kinney et al. J. Gen. Virol. (1988) 69, 3005-30130). El ADNc de VEE se encuentra corriente abajo del promotor de 7.5 K de vaccinia que impulsa la expresión de las proteínas estructurales de VEE cuando el plásmido se emplea para construir virus de vaccinia recombinantes . Promotores de vaccinia de 7.5 K modificados han sido previamente preparados (Davison & Moss, J. Mol. Biol. 210, (1989) 749-769). Se ha encontrado que ciertas mutaciones por sustitución incrementan la fuerza del promotor. Mediante el uso de promotores sintéticos que incluyen mutaciones por sustitución, se incrementó la cantidad de proteínas de VEE producidas a partir del virus recombinante .

Asi, en un aspecto adicional de la invención, se proporciona una vacuna para la inmunización terapéutica o profiláctica contra virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) dicha vacuna comprende un vector de virus de vaccinia que codifica una forma atenuada del virus de VEE o una variante o fragmento del mismo que es capaz de producir una respuesta inmune protectora contra virus de VEE, la expresión de dicho virus VEE atenuado se encuentra bajo el control de un promotor de vaccinia de 7.5 K sintético que ha sido sometido a mutación lo que incrementa el nivel de producción de proteina de virus de VEE en comparación con el promotor de 7.5 K de tipo silvestre. Particularmente se ha encontrado que las mutaciones por sustitución dentro del promotor de 7.5 Kd pueden ser efectivas. Se pueden ilustrar a través de la siguiente tabla: Promotor de 7.5 K de tipo silvestre: TAAAAGTAGAAAATATATTCTAAT TATTGCAC (SEQ ID No 1) Mutaciones por sustitución (en negritas) TAAAAA.TTGAAAATAGATTCTAATTTATTGCAC (SEQ ID No 2) AAAAA GAAAATATA CTAATT A TGCAC (SEQ ID No 3) La inclusión de un promotor de vaccinia de 7.5 sintético en WR 103 incrementa la expresión del ADNc de VEE corriente abajo provocando un incremento de 3.59 veces en cuanto a la producción de proteina. La vacuna puede comprender el vector mismo pero se formula adecuadamente como composición farmacéutica en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones forman un aspecto adicional de la invención. La composición puede estar en una forma adecuada para aplicación oral o parenteral. Vehículos adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen diluyentes sólidos y líquidos, por ejemplo, agua, solución salina o bien etanol acuoso. El vehículo líquido es adecuadamente estéril y exento de pirógenos. Las composiciones pueden tener la forma de líquidos adecuados para infusión o inyección, o bien jarabes, suspensiones o soluciones, así como formas sólidas tales como cápsulas, tabletas o polvos reconstituibles . Constructos para su uso en las vacunas de la presente invención pueden prepararse a través de varios medios conocidos en la técnica que van desde la modificación de los constructos disponibles tales como el virus de tipo silvestre empleando tecnología de ADN recombinante hasta medios sintéticos. Las técnicas de ADN recombinantes incluyen mutagenesis dirigida por sitio, involucrando opcionalmente amplificación por reacción en cadena de polimerasa de conformidad con lo ilustrado a continuación. Como se ilustra a continuación, se construyó un virus de vaccinia recombinante que expresó los genes estructurales de VEE producidos por una forma modificada de TC-83. La capacidad del virus recombinante para provocar respuestas inmunes protectoras contra la enfermedad de VEE virulenta fue investigada. En otra modalidad, la vacuna comprende además una citosina o un fragmento activo o variante de la misma. La citosina puede per se incorporarse en la formulación de vacuna, o bien de manera más adecuada el vector puede incluir una secuencia de codificación lo que significa que la citosina es coexpresada por el vector. Ejemplos de citosinas adecuadas incluyen interleucina 2 (IL-2) e interleucina 6 (IL-6) . Una citosina particularmente adecuada es la interleucina 2 (IL-2) , que puede expresarse por ejemplo a partir de un virus de vaccinia recombinante. Se sabe que IL-2 es responsable de la expansión clonal de células T activadas por antigeno (Smith, (1984) Reviews in Immunology 2, 319-333) . Alternativamente, niveles de anticuerpo pueden ser realzados empleando otras citosinas. Por ejemplo, la expresión de IL-6 por vectores de vaccinia induce un alto nivel de IgGi (Ruby et al, 1992 Vaccine Research 1, (4), 347-356), e IL-5 e IL-6 indujeron respuestas de IgA mucosales contra la influenza HA coexpresada (Ramsay et al, (1994) Reproduction, Fertility and Development 6, 389-392) . La vacuna de la presente invención puede emplearse para tratar seres humanos o animales. Particularmente puede administrarse a caballos, como vacuna veterinaria, para evitar infecciones, o bien como vacuna profiláctica o terapéutica para los seres humanos. La vacuna de la presente invención puede incorporarse en una vacuna multivalente con el objeto de incrementar la relación beneficio-riesgo de la vacunación. La dosificación de las vacunas de esta invención dependerá de la naturaleza del mamífero inmunizado así como de la naturaleza y forma precisas de la vacuna. Esto lo determinará el médico responsable. Sin embargo, en general, cuando se emplea un vector de virus como por ejemplo vectores de virus de vaccinia, las dosificaciones del vector pueden encontrarse dentro del rango de 104 a 1012 pfu (pfu = unidades formadoras de partículas) . Las vacunas de la invención producirán una respuesta inmune en los animales de prueba incluyendo la producción de anticuerpos. Estos anticuerpos pueden ser útiles para programas de vacunación pasiva o bien para el diagnóstico de enfermedades provocadas por virus de VEE. Para propósitos de diagnóstico, los anticuerpos pueden formar parte de un kit como es convencional en la técnica. La invención se ilustrará a continuación, a título de ejemplo, con referencia a los dibujos anexos en los cuales la figura 1 muestra la construcción de plásmidos quiméricos empleados para la generación de virus de vaccinia recombinantes; la figura 2 muestra los resultados . de un ensayo- de inmunofluorescencia empleando antisuero, policlonal para TC-80; la figura 3 es una gráfica que muestra los resultados de un experimento para cuantificar por ELISA la cantidad de proteína de VEE expresada por cepas; y la figura 4 es una gráfica que muestra los resultados de un experimento para encontrar el nivel de IgG anti-VEE en animales vacunados con varias cepas de la invención. En los ejemplos, se calcularon niveles relativos de proteína a partir de los datos de ELISA empleando análisis de regresión efectuado por la programática de análisis estadístico (Minitab Inc., State College, PA, Estados Unidos de América) . Los niveles de anticuerpo séricos fueron comparados por la prueba t de dos muestras. Tablas de contingencias fueron analizadas por la prueba exacta de Fisher. Se tomaron valores P menores 0.05 como significativos . Ejemplo 1 Alteración de la secuencia de proteina E2 pTC-5A, un plásmido clon de ADNc que codifica los genes estructurales del virus de la encefalitis equina venezolana, cepa TC-83 se obtuvo del Dr. R. Kinney (Kinney et al, 1988, Journal of General Virology 69, 3005-3103) . Se removió un fragmento Eco RI que contenía ADNc de VEE a partir de pT C-5A y dicho fragmento fue insertado en plll3 (Carroll, 1993, tesis de doctorado, facultad de medicina, universidad de anchester; figura la) que es un vector reversible empleado para la inserción de genes en el locus de timidinquinasa de vaccinia con selección dominante de virus recombinantes con base en la resistencia al ácido micofenólico (Falkner & Moss, 1988, Journal of Virology 62, 1849-1854) . El plásmido resultante pABlOO fue mezclado con Lipofectin® (Life Technologies) y empleado para transfectar células CV-1 infectadas con virus de vaccinia, cepa WR. Se diseñaron virus recombinantes WR100 los cuales fueron sometidos a tres rondas de purificación en placas antes de la preparación de las soluciones madres de conformidad con lo descrito antes (Mackett et al, 1985 DNA cloning (volumen II) : a practical approach) . La secuencia de E2 de VEE, cepa TC-83, situada en pTC-5A fue alterada por una sustitución de nucleótido de T a G en la posición 1053 en comparación con TRD de VEE de tipo silvestre (Jonson et al. J. Gen. Virol. 1986, 67, 1951-1960). Esto resultó en un cambio de aminoácido de asparagina a lisina en la proteina E2 cuando se expresó a partir del virus de vaccinia . Con el objeto de efectuar este cambio particular de aminoácido, se realizaron las siguientes manipulaciones. Un sitio de disociación para enzima de restricción Nsi I ocurre cerca del sitio de la sustitución requerida de nucleótido. Un segundo sitio Nsi I se encuentra aproximadamente 500 pares de bases corriente arriba.

Iniciadores de oligonucleótidos fueron empleados para amplificar la secuencia de ADN entre los sitios Nsi I empleando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) . El iniciador corriente arriba contenia una falta de correspondencia de nucleótido que correspondía a la secuencia TRD en este punto. Las secuencias de iniciadores aparecen a continuación. Los sitios de disociación de Nsi I y la posición del nucleótido sustituido se subrayan. Iniciador 1 designado "Nsi 1" 5' GCC GAT GCA TGT GGA AGG C 3' iniciador 2 designado "Nsi 2" 5' ATC TGA TGC ATC TGG CCA TGT AAG GGC GCG TTA GCT TAT ACT CCT TAA ACA GC 3' El producto de reacción en cadena de polimerasa fue digerido con Nsi I y empleado para remplazar el fragmento Nsi I correspondiente en pTC-5A, generando el plásmido pABlOl. La secuencia de nucleótidos de la región relevante en pABlOl fue obtenida para verificar la alteración de secuencia. pABlOl fue después digerido con Eco Rl para remover la secuencia de codificación de ARN 26S VEE que fue transferida al plásmido plll3 de vector reversible de vaccinia. P1113 contiene el marcador selecciónatele gpt que permite la selección de virus de vaccinia recombinantes . El plásmido construido mediante la adición de secuencia de VEE a plll3 fue designado pAB102. Ejemplo 2 Sustitución del promotor de 7.5 K por un promotor sintético en pAB102 Se diseñó un promotor de vaccinia de 7.5 K sintético con base en el trabajo efectuado por Davison y Moss (supra) . Oligonucleótidos complementarios fueron diseñados con extremos 5'Bam HI y 3 'Eco RI . Los oligonucleótidos fueron fusionados y ligados en el plásmido pT7Blue (disponible en AMS Biotechnology (UK) Ltd) . El plásmido clon fue digerido con Bam HI y Eco RI y el fragmento de ADN que contenia el promotor sintético fue aislado y clonado en el plásmido pAB102 que había sido cortado con las mismas enzimas. Esto resultó en la generación de plásmido pAB103 (figura 1) que contiene el promotor sintético corriente arriba de la secuencia de codificación de ARN 26S VEE. La cepa de vaccinia WR fue transformada con PAB103 para producir el virus de vaccinia recombinante R103. La secuencia de los oligonucleótidos empleados aparece a continuación. Sustituciones en la secuencia de promotor de 7.5 K aparecen en negritas. Las inserciones se subrayan. Las "colas" de oligonucleótidos que contienen sitios de disociación de enzimas de restricción se presentan en cursivas . Oligo 1 designado "7.5 KF2" 5' ACG CGG ATC CAA AAA TTG ??? AAC TAG CTT AAA AAT TGA AAA ACT ATT CTA ATT TAT TGC ACG AAT TCC G 3' Oligo 2 designado "7.5 KR2" Es el complemento reverso de 7.5 KF2. La cantidad de proteínas de VEE producida por el virus recombinante WR103 se midió empleando un ensayo de inmunoabsorción enlazado con enzimas (ELISA) . Ejemplo 3 Análisis de expresión de proteína Proteínas virales de VEE fueron visualizadas por inmunofluorescencia indirecta de células CV-1 infectadas. Monocapas de CV-1 (25cm2) fueron infectadas con virus a una multiplicidad de 2 pfu por célula. 24 horas después de la infección, las células fueron raspadas en el medio de crecimiento y lavadas una vez con una solución salina regulada con fosfato (PBS) que contenía 0.1% de albúmina sérica bovina. Las células fueron colocadas en platinas, secadas al aire y fijadas en acetona. La unión del antisuero policlonal de ratón cultivado contra la cepa TC-80 de VEE (proporcionado por el Dr. A.D.T. Barrett, Universidad de Texas) fue detectada con IgG de antiratón de cabra conjugado con isotiocianato de fluoresceína (Amersham International pie) . El examen de las células infectadas por WR100 o R103 mostró que las células infectadas por WR103 presentaban una fluorescencia más brillante que las células infectadas por WE100 (figura 2) . La cuantificación de la expresión de proteina viral de VEE se efectuó empleando un ensayo inmunoabsorbente enlazado con enzima (ELISA) . Monocapas de CV-1 (150 cm2) fueron infectadas con virus en una cantidad de 10 p.f.u. por célula y cosechadas a las 24 horas después de la infección mediante raspado en el medio de crecimiento. Las células fueron lavadas una vez en PBS y resuspendidas en amortiguador T9 (10 m Tris. HC1: 1 mM EDTA; pH 9.0). Las muestras fueron congeladas, descongeladas y sonicadas durante 1 minuto en un baño de sonicación. Los residuos de células fueron formados en nodulos durante 5 minutos a 1800 g y el sobrenadante fue centrifugado durante 30 minutos a 10,000 x g. El sobrenadante fue removido y almacenado a una temperatura de -70° C. La preparación de lisado celular fue diluida 1/30 en amortiguador de bicarbonato (Sigma) , volúmenes de 100 µ? fueron agregados a pozos de una placa de microtitulación y se permitió que el antigeno se enlazara a una temperatura de 37° C durante 1 hora. Los lisados fueron remplazados con 200 µ?/???? de solución salina que contenia 10% de formaldehido . Las placas fueron incubadas a temperatura ambiente durante 20 minutos, y después lavadas 6 veces con pBS que contenia 0.1% Tween (PBST) . Se diluyó en serie anti-TC80 policlonal de ratón en solución de bloqueo (0.5% leche seca/PBST) , se agregó a los pozos, y las placas fueron incubadas durante 1 hora a una temperatura de 37° C. Las placas fueron lavadas 3 veces en PBST antes de la adición de anticuerpo especifico de ratón conjugado con peroxidasa de rábano agrio (diluido 1:1000 en solución de bloqueo) e incubadas durante 1 hora a una temperatura de 37° C . Las placas fueron lavadas 3 veces antes de la adición de ABTS e incubación a temperatura ambiente durante 1 hora. El desarrollo del color fue medido a A41 . Este proceso de cuantificación mostró que las células infectadas con R103 contenia 3.59 veces más proteínas VEE que las células infectadas con R100 (figura 100) . La cuantificación de la proteína de vaccinia en estas muestras demostró cantidades equivalentes en cada una (datos no ilustrados), de tal manera que debe considerarse que la diferencia en cuanto al contenido de proteína de VEE se debe a niveles de expresión diferentes del ADNc de VEE codificado. Ejemplo 4 Efecto protector de recombinantes de vaccinia Grupos (10) de ratones Balb/c de 6 a 8 semanas de edad, hembras, fueron inoculados con PBS o bien con 108 p.f.u. de virus de vaccinia por inyección intramuscular, o bien con 105 p.f.u. de TC-83 por inyección subcutánea. Se tomó suero para medición de las inmunoglobulinas contra proteínas de VEE. Los ratones vacunados fueron retados con dos dosis diferentes de cepa TRD de VEE virulenta 35 días después de la inmunización. Las tasas de sobrevivencia después de 14 días aparecen en la tabla 2. Tabla 2 Cepa 10 pfu TRD 100 pfu TRD WR 0/10 0/10 WR100 1/10 2/10 WR103 6/10 6/10 Ningún tratamiento 0/10 0/10 WR100: vaccinia/VEE recombinante WR103: vaccinia/VEE recombinante producido en el ejemplo 2 arriba. Estos resultados muestran que la manipulación genética del virus recombinante ha mejorado la protección ofrecida por el constructo. Una mejora significativa de la protección de ratones después de reto subcutáneo con TrD se observó cuando se empleó WR103 para vacunación, en comparación con WR 100 (P<0.05, tabla 2). WR100 ofreció una protección hasta 20% de los ratones mientras que WR103 ofreció una protección de 60% de los ratones. No se observó ninguna diferencia significativa entre los números de ratones protegidos cuando dosis de reto de 10 pfu o bien 100 pfu de TrD se emplearon.

La dosis de reto había sido previamente titulada para mostrar que 1 pfu de TrD es aproximadamente 2-3 dosis LD50 (datos no mostrados) . Ejemplo 5 Inmunoensayos Inmunoglobulina específica para virus de VEE en suero se midió mediante un inmunoensayo enlazado con enzima de la siguiente manera. Pozos de una placa de microtitulación fueron revestidos con TC-83 purificado a una temperatura de 37° C durante 1 hora. El suero fue diluido en serie en solución de bloqueo y se permitió la unión con pozos revestidos con antígeno durante la noche a una temperatura de 4o C. las placas fueron lavadas 3 veces e incubadas con inmunoglobulina de antiratón conjugada con peroxidasa de rábano agrio a una temperatura de 37° C durante 1 hora. Se lavaron e incubaron placas con sustrato de TMB durante 20 minutos antes de la medición del desarrollo del color a A45o. Todos los ratones inoculados con vaccinia respondieron a la vacunación mediante la detección de inmunoglobulina para virus de vaccinia en suero (datos no mostrados) . Un inmunoensayo para medir el anticuerpo de TC-83 no detectó IgG anti-VEE en las muestras de WR100. Muestras de WR103 contenían un nivel detectable de anticuerpo anti-VEE aun cuando este nivel fue sustancialmente menor que la cantidad encontrada en suero de ratones vacunados con TC-83 (figura 4) . Anticuerpo neutralizante fue medido por una prueba de reducción de placa. Se incubó suero (10 µ?) con TC-83 (50 µ?) y medio de mantenimiento (140 µ?) durante 1 hora a temperatura ambiente. El medio de mantenimiento (800 µ?) fue agregado y la suspensión fue empleada para infectar monocapas confluentes de células BHK-21 cultivadas en placas de 6 pozos. Las placas fueron incubadas a una temperatura de 37° C durante 3 días. Una reducción del 50% en cuanto al número de placas por pozo, en comparación con los pozos de control, fue una indicación de la presencia de anticuerpo neutralizante . Un anticuerpo neutralizante para TC-83 fue encontrado en suero de ratones vacunados con TC-83 pero no fue detectado en suero de ratones vacunados con WR100 o WR103 (datos no ilustrados) . Aun cuando un anticuerpo neutralizante se encuentra habitualmente en ratones que están protegidos contra reto con VEE, se ha reportado protección previamente en ausencia de anticuerpo neutralizante detectable (Kinney et al, 1988a, Journal of Virology 62, 4697-4702) .

Claims

REIVINDICACIONES Una vacuna para la inmunización terapéutica o profiláctica contra el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) , dicha vacuna comprende un vector que incluye una secuencia que codifica una forma atenuada de dicho virus que puede producir una respuesta inmune protectora, donde dicha secuencia es tal que el aminoácido en la posición 7 en la proteina E2 de VEE es lisina . Una vacuna de conformidad con la reivindicación 1 donde la forma atenuada de dicho virus comprende un derivado del constructo de TC-83. Una vacuna de conformidad con la reivindicación 2 donde el vector comprende un vector viral. Una vacuna de conformidad con la reivindicación 3 donde el virus se selecciona a partir de un virus atenuado. Una vacuna de conformidad con la reivindicación 3 o de conformidad con la reivindicación 4 donde el virus se selecciona entre vaccinia, adenovirus, HSV, BCG o BCC. Una vacuna de conformidad con la reivindicación 5 que comprende un virus de vaccinia atenuado . Una vacuna de conformidad con la reivindicación 6 donde la expresión de dicho virus de VEE atenuado se encuentra bajo el control de promotor de vaccinia 7.5 K sintético que ha sido sometido a mutación que incrementa el nivel de producción de proteina de virus de VEE en comparación con el promotor 7.5 K de tipo silvestre . 8. Una vacuna de conformidad con la reivindicación 7 donde dicho promotor de 7.5 K comprende una secuencia seleccionada entre TAAAAATTGAAAATACATTC AATTTATTGCAC (SEQ ID No 2) o bien TAAAAATTGAAAATATATTCTAATTTAT GCAC (SEQ ID No 3) 9. Una vacuna de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende un vector que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido inmunogénico adicional, y puede expresar dicha secuencia cuando se administra a un mamífero. 10. Una vacuna de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende además una citosina o un fragmento activo o una variante de la misma, o un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una citosina o un fragmento activo o variante de la misma. 11. Una vacuna de conformidad con la reivindicación 10 que comprende un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una citosina o un fragmento activo o variante de la misma. 12. Una vacuna de conformidad con la reivindicación 10 o de conformidad con la reivindicación 11 donde la citosina es una interleucina. Una vacuna de conformidad con la reivindicación 10 donde la interleucina se selecciona entre IL-2 humana o IL-6 humana. Una vacuna para la inmunización terapéutica o profiláctica contra el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) , dicha vacuna comprende un vector de virus de vaccinia que codifica una forma atenuada de virus de VEE o una variante o fragmento del mismo que puede producir una respuesta inmune protectora contra el virus de VEE, la expresión de dicho virus de VEE atenuado se encuentra bajo el control de un promotor de vaccinia de 7.5 K sintético ' que ha sido sometido a mutación que incrementa el nivel de producción de proteína de virus de VEE en comparación con el promotor de 7.5 K de tipo silvestre. Una composición farmacéutica que comprende una vacuna de conformidad con lo definido en cualesquiera de las reivindicaciones anteriores y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Un método para producir una respuesta inmune protectora contra virus de VEE en un mamífero, dicho método comprende la administración a dicho mamífero de una vacuna de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 14. 17. Un método de conformidad con la reivindicación 16 donde el mamífero es ya sea un ser humano o un caballo. 18. Una vacuna multivalente que comprende una vacuna de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y una vacuna adicional.