MXPA00009168A - Metodo para el aislamiento de s-fenilcisteina n-protegida - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a:Proporciona un método para el aislamiento de S-fenilcisteína N- protegida de la fórmula (1) de alta pureza, de manera expedita, eficiente y con alto rendimiento, el cual comprende hacer que la S-fenilcisteína N-protegida se salifique en forma de una sal básica, en presencia de agua. (1) en donde R1 representa un grupo amino-protector;R2 representa unátomo de hidrógeno o, ya sea independientemente de R1 o tomado en conjunto con R1, representa un grupo amino-protector.

Description

MÉTODO DE AISLAMIENTO DE S-FENILCISTEINA N-PROTEGIDA CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a un método para aislar una S-fenilcisteina N-protegida de la siguiente fórmula (1) [de aqui en adelante referida a veces como la S-fenilcisteina N-protegida de la fórmula (1) ] . Las S-fenilcisteinas N-protegidas, tales como la N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina, son compuestos de importancia como intermediarios sintéticos de inhibidores de la proteasa de VIH (Virus de la Inmunodeficiencia Humana) , tal como se describe en la Publicación Internacional WO 96/23756 y en la Patente Europea EP 604185A1. en donde R1 representa un grupo amino-protector; R2 representa un átomo de hidrógeno o, ya sea independientemente de R1 o tomado en conjunto con R1, representa un grupo amino-protector. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La S-fenilcisteina N-protegida de la fórmula (1) se puede sintetizar, por ejemplo^ mediante el tratamiento REF: 123141 de un compuesto de la fórmula (2) (en donde R1 y R2 son como los anteriormente definidos; X representa un grupo saliente) con tiofenol en condiciones básicas, tal como se describe en la Solicitud de Patente Japonesa Hei-10-264397. A manera de ilustración, la N-benciloxicarbonil-S-fenilcisteina se puede sintetizar mediante el tratamiento de la N-benciloxicarbonil-ß-cloroalanina con tiofenol, en una solución alcalina acuosa. La S-fenilcisteina N-protegida de la fórmula (1) sintetizada de esta manera, se puede recuperar tipicamente mediante la adición de un ácido a la solución acuosa básica, para precipitar la S-fenilcisteina N-protegida en forma de ácido libre. Como una versión de esta tecnología, la Publicación Japonesa de Kikai Hei-10-29973 describe un proceso en el cual se agrega ácido clorhídrico a una solución acuosa de hidróxido de sodio que contiene una N-benciloxicarbonil-S-fenilcisteina, para causar que la N-benciloxicarbonil-S-fenilcisteina se cristalice en forma de ácido libre. En este proceso, la sal básica de la N-benciloxicarbonil-S-fenilcisteina (en este caso, la sal sódica de N-benciloxicarbonil-S-fenilcisteina) , que es fácilmente soluble en agua, se transforma en la N-benciloxicarbonil-S-fenilcisteina libre, difícilmente soluble, mediante la acidificación. Sin embargo, el proceso no está libre de la desventaja de que, como se señaló en la misma literatura científica anteriormente citada, la N-benciloxicarbonil-S-fenilcisteina libre tiende a sufrir una gelificación en el transcurso de la cristalización, lo cual causa que no se cristalice de buena manera. Además de los problemas anteriores, el proceso también tiene el problema de que los componentes contaminantes estructuralmente relacionados no se pueden remover con facilidad. Asi pues, los métodos hasta la fecha conocidos para cristalizar S-fenilcisteina N-protegida de la fórmula (1) en forma de ácido libre, no necesariamente son un procedimiento de aislamiento efectivo. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En estas circunstancias, la presente invención tiene como objetivo proporcionar un método para aislar una S-fenilcisteina N-protegida de la fórmula (1) de alta pureza, de manera expedita, eficiente y con un buen rendimiento. Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para el aislamiento de S-fenilcisteina N-protegida de la fórmula (1) que comprende hacer que dicha S-fenilcisteina N-protegida forme una sal básica en presencia de agua. Los presentes inventores descubrieron por primera vez que la sal básica hidrosoluble de la S-fenilcisteina N-protegida de la fórmula (1) se podia obtener fácilmente en presencia de agua, con una buena eficiencia y un buen rendimiento, y con una alta pureza. La presente invención a continuación se describirá en detalle. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En la presente descripción, el término "sal básica" tal como se utiliza con referencia a la S-fenilcisteina N-protegida, significa un compuesto en el cual un catión tal como un ion metálico y un ion amonio han sustituido al hidrógeno del grupo carboxilo de la S-fenilcisteina N-protegida. Además, el término "libre" o "ácido libre" tal como se utiliza con referencia a la S-fenilcisteina N-protegida de la presente invención, significa que la S-fenilcisteina N-protegida no ha formado ninguna sal con ninguna sustancia básica; dicho de otra manera, significa que un ion hidrógeno ha sido sustituido por el catión, e.g. el ion metálico o el ion amonio, de una sal básica de S-fenilcisteina N-protegida o el compuesto en ^^i tales condiciones. El término "salificar" tal como se utiliza con referencia a la sal básica de la S-fenilcisteina N-protegida de la presente invención, significa que la sal básica de la S-fenilcisteina N-protegida se separa de una solución acuosa que contiene la sal, haciendo que otra sustancia (principalmente una sal inorgánica) esté presente en dicha solución acuosa. En la fórmula (1) anterior, R1 representa un grupo amino-protector. R~ representa un átomo de hidrógeno o, ya sea independientemente de R1 o tomado en conjunto con RA representa un grupo amino-protector. En el método de la presente invención, es esencial que esté presente un grupo amino-protector en la S-fenilcisteina. El grupo amino-protector anteriormente mencionado no está particularmente restringido, pero por ejemplo podria ser un grupo que se selecciona de entre los grupos protectores mencionados en Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd Ed., John Wiley & Sons (1991) asi como un grupo alquilo, aralquilo o arilo. Cuando se contempla una derivación adicional de la S-fenilcisteina N-protegida de la fórmula (1), de preferencia se utiliza un grupo protector de tipo uretano o de tipo acilo capaz de enmascarar la basicidad del grupo amino. Entre los ejemplos específicos de tales grupos protectores, se pueden mencionar los grupos benciloxicarbonilo, etoxicarbonilo, metoxicarbonilo, tert-butoxicarbonilo, acetilo, tosilo, benzoilo y ftaloilo, entre otros. Además, también se pueden emplear selectivamente grupos (3S) -tetrahidrofuraniloxicarbonilo y 3-hidroxi-2-metilbenzoilo cuyo grupo hidroxilo puede estar opcionalmente protegido. Particularmente, los grupos protectores de tipo uretano son preferidos y los grupos aralquiloxicarbonilo y alcoxicarbonilo inferior son todavia más preferidos. Más particularmente, los grupos benciloxicarbonilo, tert-butoxicarbonilo, metoxicarbonilo y etoxicarbonilo son los preferidos y entre ellos el benciloxicarbonilo todavia es más preferido. Cuando el grupo amino-protector es un grupo benciloxicarbonilo, la S-fenilcisteina N-protegida de la fórmula (1) es un compuesto de gran importancia como intermediario sintético de los inhibidores de la proteasa de VIH, tal como se describe en la Publicación Internacional WO 96/23756 y en la Patente Europea EP 604185A1, por ejemplo. La S-fenilcisteina N-protegida de la fórmula (1), puede ser un compuesto ópticamente activo. Aun cuando tal compuesto ópticamente activo se utiliza en la presente invención, la salificación se puede llevar a cabo sin importar la pureza óptica.

La sal básica de la S-fenilcisteina N-protegida de la fórmula (1) no está particularmente restringida, pero incluye, entre otras, sales de metales tales como sales de metales alcalinos, por ejemplo sal de litio, sal de sodio, sal de potasio, etcétera; sales de metales alcalinotérreos y sales de amonio de la S-fenilcisteina N-protegida de la fórmula (1) . Entre ellas, se prefieren las sales de metales, siendo particularmente preferidas las sales de metales alcalinos y siendo la sal sódica la más preferida. La base para transformar la S-fenilcisteina N-protegida de la fórmula (1) en su sal básica no está particularmente restringida, sino que incluye hidróxidos de metales alcalinos, carbonatos de metales alcalinos, carbonatos ácidos de metales alcalinos, hidróxidos de metales alcalinotérreos, carbonatos de metales alcalinotérreos y amoniaco, entre otros. Se prefieren los hidróxidos de metales alcalinos, carbonatos de metales alcalinos y carbonatos ácidos de metales alcalinos. Más particularmente, se pueden mencionar el hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de litio, carbonato de sodio, carbonato de potasio, carbonato de litio, carbonato ácido de sodio y carbonato ácido de potasio. El más preferido es el hidróxido de sodio. El método preferido para la transformación de la S-fenilcisteina N-protegida de la fórmula (1) en una sal básica, comprende hacer reaccionar la S-fenilcisteina N-protegida de la fórmula (1) con dicha base bajo condiciones de neutras a básicas. En términos de pH, el sistema se debe mantener a pH no menor de 7, de preferencia no menor de 8, más preferiblemente un pH no menor de 9, con el fin de retener la estabilidad del grupo amino-protector. Hablando en términos generales, la reacción se puede llevar a cabo con ventaja a un pH de 9 a 11. El uso de un pH menor de 7 es objetable debido a que tal nivel de pH induce la transformación de la sal básica de la S-fenilcisteina N-protegida en S-fenilcisteina N-protegida libre. Además, cuando el grupo amino-protector es un grupo protector que no es tan estable bajo condiciones básicas, tal como trifluoroacetilo, es aconsejable evitar condiciones fuertemente básicas, por ejemplo un pH de 12 ó mayor. En la presente invención, la salificación se lleva a cabo en presencia de agua. Generalmente, se lleva a cabo en una solución acuosa de S-fenilcisteina N-protegida de la fórmula (1) . Debido a que la S-fenilcisteina N-protegida de la fórmula (1) se presenta en forma de su sal con una base, este procedimiento de preferencia se lleva a cabo bajo condiciones básicas. Dentro del rango no interferente con el procedimiento, la solución acuosa podria contener un disolvente orgánico o similares. Este disolvente orgánico no está particularmente restringido, pero incluye, entre otros, esteres de ácido acético, tales como acetato de etilo, acetato de isopropilo, etcétera; hidrocarburos aromáticos representados por tolueno; hidrocarburos alifáticos tales como hexano, heptano, etcétera; éteres tales como metil-tert-butil éter, di-n-butil éter, tetrahidrofurano, etcétera; alcoholes tales como metanol; y cetonas tales como acetona, 2-butanona y asi sucesivamente. Al causar que el disolvente orgánico esté presente en el sistema, la disolución y la remoción de las impurezas liposolubles (lipofilicas) coexistentes con dicha sal se facilita. Se puede hacer que el disolvente orgánico esté presente desde el principio de la salificación o se puede agregar cuando la salificación ha progresado hasta un grado suficiente. Con el fin de que la sal básica de la S-fenilcisteina N-protegida pueda ser salificada, se debe hacer que otra sal esté presente en el sistema. Esta sal de preferencia es una sal inorgánica. La sal inorgánica no está particularmente restringida, sino que incluye sales de metales alcalinos tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, etcétera; sulfato de amonio, cloruro de amonio y cloruro de calcio, entre otras. Desde el punto de vista de facilidad de uso, se prefieren las sales de metales alcalinos y las más preferidas son el cloruro de sodio y el sulfato de sodio. De todas ellas, el cloruro de sodio es el más preferido por su bajo costo, facilidad de manejo, facilidad de desecho, eficiencia en la salificación de la sal básica de la S-fenilcisteina N-protegida y las propiedades de la sal obtenida, entre otros factores. La sal anteriormente mencionada se puede agregar al sistema o, aprovechando la reacción de neutralización entre un ácido y una base, se puede hacer que se forme en el sistema. El catión de la sal a ser utilizada para la salificación, de preferencia es de la misma especie que el catión de la sal básica de la S-fenilcisteina N-protegida. Por ejemplo, la N-benciloxicarbonil-S-fenilcisteina de preferencia se salifica en forma de sal sódica. En este caso, la sal a ser utilizada para la salificación de preferencia es una sal sódica, tal como cloruro de sodio, sulfato de sodio y similares, siendo la más preferida el cloruro de sodio. La cantidad de sal a ser utilizada para este procedimiento de salificación, depende de la especie de sal y la especie y cantidad de la sal básica de la S-fenilcisteina N-protegida, entre otras variables, y no se puede definir en términos generales. Sin embargo, se prefiere utilizar una cantidad suficiente de una sal para lograr el objetivo de salificar hasta un buen rendimiento.

Más particularmente, de preferencia se hace que la sal inorgánica esté presente en una cantidad de aproximadamente 5% en peso o mayor, en términos de la concentración en agua. El limite superior generalmente es el punto de saturación. Tomando como ejemplo el cloruro de sodio, la salificación se puede llevar a cabo aprovechando una concentración entre aproximadamente 5% en peso y el punto de saturación. La concentración de la sal básica de la S-fenilcisteina N-protegida de la fórmula (1) para la salificación, no está particularmente restringida, pero generalmente no es mayor de aproximadamente 30% en peso, de preferencia dentro del rango de 5 a 20% en peso, con base en el agua en el sistema. Con el fin de que la sal básica de la S-fenilcisteina N-protegida pueda ser salificada con facilidad y eficiencia, se prefiere asegurar que el sistema contenga tanto la sal básica de la S-fenilcisteina N-protegida, como una sal utilizada para la salificación en cantidades efectivas (cantidades suficientes necesarias para la salificación) . Asi pues, se prefiere que la salificación se lleve a cabo; i) incrementando la cantidad de la sal básica de la S-fenilcisteina N-protegida, manteniendo constante la cantidad de sal inorgánica, ii) incrementando la cantidad de la sal inorgánica, manteniendo constante la cantidad de la sal básica de la S-fenilcisteina N-protegida, o iii) incrementando la cantidad de la sal básica de la S-fenilcisteina N-protegida, incrementando simultáneamente la cantidad de la sal inorgánica. La temperatura de la salificación no está particularmente restringida, pero por ejemplo puede estar entre la temperatura de solidificación del sistema y aproximadamente 100°C, de preferencia de aproximadamente 0 a aproximadamente 60°C. Particularmente, el procedimiento se puede llevar a cabo dentro de un rango de aproximadamente 10 a aproximadamente 50°C. Si la sal básica de la S-fenilcisteina N-protegida de la fórmula (1) no se salifica con facilidad, se pueden agregar cristales de siembra al sistema. Como se mencionó anteriormente, la Publicación Japonesa de Kokai Hei-10-29973 describe una tecnología en la cual una solución acuosa básica (pH de 10 a 11) conteniendo una sal básica (sal sódica) de N-benciloxicarbonil-S-fenilcisteina, se acidifica con ácido clorhídrico para cristalizar la N-benciloxicarbonil-S-fenilcisteina en forma de ácido libre. Sin embargo, la concentración de cloruro de sodio en la solución acuosa básica es tan baja como menos de 3% en peso, lo cual no es suficiente para efectuar la salificación. Además, en la acidificación, la sal básica (sal sódica) de N-benciloxicarbonil-S-fenilcisteina se transforma en un ácido libre antes de que la cantidad de la sal inorgánica (cloruro de sodio) se incremente por la reacción de neutralización, de tal manera que la sal básica de la N-benciloxicarbonil-S-fenilcisteina no se salifica. El método de conformidad con la presente invención se puede utilizar para los propósitos de purificar una S-fenilcisteina N-protegida libre o una sal básica de S-fenilcisteina N-protegida, o para los propósitos de separar una S-fenilcisteina N-protegida en forma de sal básica, de una mezcla de reacción. Cuando para tales propósitos se utiliza un medio acuoso conteniendo una cantidad suficiente de una sal inorgánica para llevar a cabo la salificación en condiciones básicas, por ejemplo, la formación de la sal básica de la S-fenilcisteina N-protegida y la salificación de la sal básica formada de esta manera de S-fenilcisteina N-protegida, se pueden lograr de manera concurrente. En este caso también se puede acelerar la formación de la sal básica de la S-fenilcisteina N-protegida y, al mismo tiempo, la salificación de la misma, sembrando cristales en el sistema. Además, es posible sintetizar una S-fenilcisteina N-protegida llevando a cabo la reacción sintética bajo condiciones básicas y, al mismo tiempo, haciendo que la S-fenilcisteina N-protegida resultante se salifique de la mezcla de reacción en forma de una sal básica. Este procedimiento contribuye a mejorar el rendimiento y/o la calidad de la S-fenilcisteina N-protegida, debido a que la descomposición y racemización de la S-fenilcisteina N-protegida que no necesariamente es estable bajo condiciones básicas, se pueden evitar. Además, la sal básica de la S-fenilcisteina N-protegida se puede salificar selectivamente de una mezcla de reacción que contiene análogos estructurales y otras impurezas capaces de formar sales con la base utilizada, obteniéndose como resultado que el producto se puede purificar al remover dichas impurezas en una fase acuosa con alta eficiencia. Más particularmente, en un medio acuoso en el cual está presente la sal inorgánica en una cantidad suficiente para efectuar la salificación en condiciones básicas, un compuesto de la fórmula (2) : (2¡ (en donde R y R son como los anteriormente definidos; X representa un grupo saliente) es tratado con tiofenol para obtener una S-fenilcisteina N-protegida y, al mismo tiempo, la S-fenilcisteina N-protegida se salifica en forma de una sal básica en la mezcla de reacción (es decir, la S-fenilcisteina N-protegida es removida del sistema de reacción en forma de sal básica) . De esta manera, la S-fenilcisteina N-protegida que no es necesariamente lo suficientemente estable en condiciones básicas, se protege contra la descomposición y racemización, dando como resultado la obtención de S-fenilcisteina N-protegida de alta pureza, con un alto rendimiento. Por supuesto, la base, las condiciones básicas, la sal inorgánica, etcétera a ser utilizadas en este proceso, son las mismas que las anteriormente mencionadas. El grupo saliente representado por X no está particularmente restringido, pero incluye grupos halógeno, e.g. cloro, alquilsulfoniloxi de 1 a 10 átomos de carbono, e.g. mesiloxi; grupos arilsulfoniloxi de 6 a 10 átomos de carbono, e.g. tosiloxi; grupos aralquilsulfoniloxi de 7 a 10 átomos de carbono; acetiloxi, trihaloacetiloxi y fosforilo, entre otros. Al llevar a cabo la salificación para los propósitos de mejorar la calidad del producto, los contaminantes liposolubles (lipofilicos) se pueden disolver y remover suplementando el sistema con un disolvente orgánico (un éster de ácido acético, e.g. acetato de etilo, acetato de isopropilo, etcétera; un hidrocarburo aromático, e.g. tolueno; un hidrocarburo alifático, e.g. hexano, heptano, etcétera; un éter, e.g. metil-tert-butil éter, di-n-butil éter, tetrahidrofurano, etcétera; un alcohol, e.g. metanol; o una cetona, e.g. acetona, 2-butanona, etcétera; entre otros) . Esta práctica es particularmente efectiva para salificar de una mezcla de reacción tal como una cristalización reactiva, por ejemplo. El disolvente orgánico puede estar presente desde el principio de la salificación o se puede agregar después de que la salificación ha progresado lo suficiente. La sal básica de la S-fenilcisteina N-protegida tal como es salificada por el método de la presente invención, se puede recuperar mediante un procedimiento de separación tal como filtración. La sal básica recuperada de S-fenilcisteina N-protegida se puede lavar con agua [se prefiere, e.g. agua fria o agua conteniendo la sal utilizada para la salificación (e.g. una solución acuosa de cloruro de sodio) ] o el disolvente orgánico y, cuando fuera necesario, el disolvente tal como agua, se pueden remover a presión atmosférica o a presión reducida. El rendimiento de la salificación normalmente no es menor del 80%, de preferencia no menor del 90% y más preferiblemente de ¿.^A^.»J».. aproximadamente 100%. La sal básica resultante de S-fenilcisteina N-protegida, se puede neutralizar con un ácido tal como ácido clorhídrico y ácido sulfúrico para obtener la S-fenilcisteina N-protegida en forma libre. Al mezclar esta S-fenilcisteina N-protegida libre con un disolvente orgánico, se puede obtener la mezcla de un disolvente orgánico y la S-fenilcisteina N-protegida libre. El disolvente orgánico mencionado no está particularmente restringido, pero incluye esteres de ácido acético tales como acetato de etilo, acetato de isopropilo, etcétera; hidrocarburos aromáticos tales como tolueno, etcétera; y éteres tales como metil-tert-butil éter, di-n-butil éter, tetrahidrofurano, etcétera, entre otros disolventes. No es necesario mencionar que la neutralización con el ácido se pueda llevar a cabo en presencia del disolvente orgánico. La mezcla preparada de esta manera de un disolvente orgánico con una S-fenilcisteina N-protegida libre (e.g. una mezcla de tolueno y S-fenilcisteina N-protegida libre) se puede utilizar para mayor derivación (e.g. esterificación con un alcohol) . BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es un espectro de absorción infrarroja (disco de KBr) de la sal sódica de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina obtenida.

La Figura 2 es un espectro de absorción infrarroja (disco de KBr) de la N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina libre. La Figura 3 es una gráfica que muestra el porcentaje de sal sódica de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina remanente, a 40°C, con respecto al tiempo. La Figura 4 es una gráfica que muestra la solubilidad de la sal sódica de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina contra la concentración de cloruro de sodio. MEJOR MODO DE LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN Los siguientes ejemplos, ejemplos comparativos y ejemplos de referencia tienen el propósito de ilustrar la presente invención con mayor detalle y no se debe interpretar que definen los alcances de la invención. Los análisis cuantitativos que se le realizaron a los derivados de S-fenilcisteina en los siguientes ejemplos, invariablemente fueron llevados a cabo utilizando HPLC equipado con un detector UV. EJEMPLO 1 A 137.8 g de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina se le agregaron 56.4 g de una solución al 30% en peso de hidróxido de sodio (1.0 moles por mol de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina) en 300 ml de agua, y la mezcla de reacción se ajustó a pH 10.2 y se agitó calentando a aproximadamente 40°C durante 1 hora, para preparar una solución clara. Después, se agregaron 73.5 g de cloruro de sodio (22% en peso con base en el agua) y la agitación se continuó durante 1 hora, tiempo durante el cual los cristales se separaron. Se cosecharon los cristales mediante filtración por succión, para obtener 312.2 g de cristales húmedos de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina. El análisis por HPLC demostró que el rendimiento de la cristalización fue del 100%. EJEMPLO DE REFERENCIA 1 Los cristales húmedos de la sal sódica de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina obtenida en el Ejemplo 1 (310.0 g) se disolvieron en 700 ml de agua y el agua se evaporó a presión reducida a una temperatura de aproximadamente 50°C, para concentrarse hasta 619.5 g, causando de esta manera que los cristales se precipitaran. Se cosecharon los cristales mediante filtración por succión y se enjuagaron con 100 ml de agua, para obtener 208 g de cristales húmedos. Toda la cantidad de cristales húmedos obtenidos de esta manera, se disolvió en 600 ml de agua y el agua se evaporó después a presión reducida a una temperatura de aproximadamente 50°C, para obtener 209.5 g de concentrado. Este concentrado oleoso se cristalizó agregando 1000 ml de acetona. La cosecha de cristales ,se recuperó mediante filtración por succión y se lavó con 200 ml de acetona, para obtener 88.8 g de cristales húmedos. Estos cristales se disolvieron en 400 ml de agua y después se recristalizaron agregando 2800 ml de acetona. Los cristales resultantes se recuperaron mediante filtración por succión, se lavaron con 1300 ml de acetona y finalmente se secaron al vacio (de 1 a 30 mmHg, de 20 a 40°C, 20 horas) para obtener 44.5 g de cristales. Este producto cristalino contenia 43.8 g de sal sódica de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina y su pureza era del 98.4% en peso (ensayada por HPLC para N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina y calculada como sal sódica) . El espectro de resonancia magnética nuclear de 400 MHz de esta sal sódica de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina [D20, 3- (trimetilsilil) -propanosulfonato de sodio como estándar interno] fue: d (ppm): 3.19 (ÍH, dd, J=8.1, 13.9 Hz) , 3.51 (ÍH, dd, J=3.4, 13.9 Hz), 4.15 (ÍH, dd, J=3.4, 8.1 Hz) , 4.89-5.01 (2H, AB1, J=12.4 Hz) , 7.2-7.4 (10H, m) . El espectro de absorción infrarroja (disco de KBr) de la sal sódica de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina anterior, se presenta en la Figura 1. Como referencia se presenta un espectro de absorción infrarroja (disco de KBr) de la N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina libre, en la Figura 2. ''"tr ' '' ••""" ' ' -f- -— y>, . .^.n?.rt«á*»M**»<. . .*,. . . *. ,tfc..-.^.

EJEMPLO 2 Utilizando 3 g de cristales de la sal sódica de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina preparada en el Ejemplo de referencia 1, se prepararon (A) una solución de los mismos en 30 ml de agua y (B) una suspensión de los mismos en una solución acuosa al 20% en peso de cloruro de sodio. La solución y suspensión se ajustaron respectivamente a un pH 9.7 con una solución acuosa al 3% en peso de hidróxido de sodio y la mezcla se agitó a 40°C. Cada solución se muestreó serialmente y se analizó por HPLC para determinar la concentración de la sal sódica de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina en la muestra, para monitorear el porcentaje de sal sódica de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina remanente . La Figura 3 muestra el porcentaje de sal sódica de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina remanente, con respecto al tiempo, a 40°C. Los resultados anteriores indican que la sal sódica de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina, que es inestable en condiciones básicas, se puede estabilizar mediante el procedimiento de salificación. EJEMPLO 3 A 86.19 g de una solución acuosa que contenia 7.47 g de ß-cloroalanina, se le agregaron 11.35 g de cloruro de benciloxicarbonilo (1.1 moles por mol de ß-cloroalanina) por goteo, en un periodo de 1 hora, bajo una agitación constante a aproximadamente 5°C, en donde el sistema de reacción se mantuvo a pH 9.7 con una solución acuosa al 30% de hidróxido de sodio. La reacción se dejó continuar durante 3 horas, al final de las cuales la mezcla de reacción se lavó con 50 ml de tolueno. Esta mezcla de reacción lavada, 89.53 g, contenían 15.52 g (rendimiento del 100%) de N-benciloxicarbonil-ß-cloroalanina. A 88.27 g de la mezcla de reacción anterior (que contenia 15.30 g de N-benciloxicarbonil-ß-cloroalanina) se le agregaron 13.95 g de cloruro de sodio (al 25% en peso con base en el agua) y, posteriormente, se añadieron 9.82 g de tiofenilo (1.5 moles por mol de N-benciloxicarbonil-ß-cloroalanina) por goteo en un periodo de 1 hora, con agitación constante bajo una atmósfera de nitrógeno a aproximadamente 40°C, manteniendo el sistema de reacción a pH de aproximadamente 10 con una solución acuosa al 30% de hidróxido de sodio. A medida que progresaba la reacción, el producto de la reacción N-benciloxicabonil-S-fenil-L-cisteina se cristalizaba en forma de sal sódica y la mezcla de reacción se tornó similar a una lechada. La lechada obtenida después de 20 horas de reacción, 148.97 g, contenia 19.21 g (rendimiento de la reacción, 98%) de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina. EJEMPLO 4 A 5.0 g de N-benciloxicarbonil-ß-cloroalanina purificada se le agregaron 32 g de agua, seguido por la adición de cloruro de sodio [A: 0.0 g (sin adición) o B: 8.0 g (concentración al 25% en peso con base en el agua)]. A esta solución se le agregaron por goteo 3.2 g de tiofenol (1.5 moles por mol de N-benciloxicarbonil-ß-cloroalanina) en un periodo de 1 hora en agitación constante bajo una atmósfera de nitrógeno, aproximadamente a 40°C, manteniendo el sistema de reacción a un pH de aproximadamente 10 con una solución acuosa al 30% de hidróxido de sodio. La reacción se dejó continuar durante 20 horas y se determinó el contenido de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina en la mezcla de reacción. Después se calculó el rendimiento. Las concentraciones de cloruro de sodio en agua y los correspondientes rendimientos de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina, se resumen en la Tabla 1.

TABLA 1 En ausencia de cloruro de sodio (A) , el sistema de reacción no formó una lechada. En contraste, se formó una lechada en presencia de cloruro de sodio (B) . A partir de los resultados anteriores, puede observarse que la adición de cloruro de sodio promueve la salificación de la sal sódica de N-benciloxicarbonil-S- fenil-L-cisteina formada, purgándola del campo de reacción y protegiendo el producto efectivamente contra la descomposición . EJEMPLO COMPARATIVO 1 A 141.22 g de una lechada de producto de reacción obtenida de la misma manera que en el Ejemplo 3 (la cual contenia 18.41 g de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L- cisteina) , se le agregaron 17.44 g (3.0 moles por mol de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina) de ácido clorhídrico concentrado, por goteo en un periodo de 5 horas, bajo una atmósfera de nitrógeno a aproximadamente 25°C, con agitación constante para ajustar el pH de la lechada a 3. La mezcla se agitó a esta misma temperatura durante 3 horas para efectuar una cristalización completa. Los cristales se cosecharon mediante filtración por succión y se enjuagaron con agua para obtener 26.11 g de cristales húmedos. Esta cosecha de cristales contenia 18.19 g de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina (rendimiento de la cristalización, 99%) y su pureza aparente por HPLC fue de 74.8 área %. EJEMPLO 5 A 145.34 g de la lechada de reacción obtenida en el Ejemplo 3 (que contenia 18.73 g de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina) , se le agregaron 65 ml de tolueno y la mezcla se agitó a aproximadamente 40°C bajo una atmósfera de nitrógeno durante 1 hora. Los cristales resultantes se cosecharon mediante filtración por succión y los cristales húmedos obtenidos de esta manera se lavaron serialmente con tolueno y una solución acuosa saturada de cloruro de sodio y se secaron al vacio (de 1 a 30 mmHg, 20 a 40°C, durante 20 horas), para obtener 21.96 g de cristales. Esta cosecha de cristales contenia 19.67 g de sal sódica de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina (rendimiento de la cristalización, 99%) y su pureza aparente por HPLC fue de 99.0 área %. En comparación con el caso en el cual la N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina fue cristalizada en forma de ácido libre (Ejemplo Comparativo 1), la cantidad de impurezas detectadas por HPLC fue extremadamente pequeña, lo cual indica que se pudo obtener una N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina de alta calidad, en forma de una sal básica. EJEMPLO 6 Bajo una adición constante de cloruro de sodio hasta 190.89 g de una solución acuosa (pH 10.8) preparada con 20.04 g de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina y 8.04 g (1.0 moles por mol de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina) de hidróxido de sodio, la solución fue muestreada serialmente y se determinó la concentración en por ciento en peso (solubilidad) de la sal sódica de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina en el filtrado remanente después de remover los cristales. La solubilidad de la sal sódica de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina se gráfico contra la concentración de cloruro de sodio, lo cual se muestra en la Figura 4.

EJEMPLO 7 En 20 ml de agua se disolvieron 2.05 g de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina y 0.26 g (1.0 moles por mol de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina) de hidróxido de litio monohidratado. A esta solución se le agregaron 7.08 g (35% en peso con base en el agua) de cloruro de litio y la mezcla se agitó durante 10 minutos. Como resultado, los cristales se precipitaron. EJEMPLO 8 En 20 ml de agua se suspendieron 2.02 g de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina y se agregó amoniaco acuoso al 28% en peso hasta que ocurriera la disolución completa, obteniéndose 21.93 g de una solución acuosa a OH 9.2. A esta solución se le agregaron 1.01 g (al 5% en peso con base en el agua) de cloruro de amonio y la mezcla se agitó durante 10 minutos. Como resultado, los cristales se precipitaron. EJEMPLO 9 A 45.52 g de una solución acuosa (pH 10.8) conteniendo 5.04 g de N-bencil-S-fenilcisteina y 2.38 g de hidróxido de sodio 81.0 moles por mol de N-bencil-S-fenilcisteina), se le agregaron 9.71 g (al 24% en peso/H20) de cloruro de sodio y la mezcla se agitó durante 1 hora.

Como resultado, se preciataron los cristales. A EJEMPLO COMPARATIVO 2 A 46.85 g de una solución acuosa (pH 10.8) conteniendo 5.12 g de S-fenil-L-cisteina y 3.55 g de hidróxido de sodio (1.0 mol por mol de S-fenil-L-cisteina) , se le agregaron 12.29 g (al 30% en peso/H20) de cloruro de sodio. Como resultado, no ocurrió ninguna salificación de la sal sódica de S-fenil-L-cisteina, ni se indujo ningún cambio en el estado de la solución. El resultado anterior indica que, en la presente invención, la presencia de un grupo protector en el grupo amino, es indispensable. EJEMPLO COMPARATIVO 3 A 62.31 g de una solución acuosa conteniendo 4.55 g de S-fenil-L-cisteina y mantenida a pH 11 con una solución acuosa al 30% de hidróxido de sodio, en agitación constante a aproximadamente 25°C, se le agregaron 3.94 g de cloruro de benciloxicarbonilo (1.0 mol por mol de S-fenil-L-cisteina) por goteo en un periodo de 1 hora. La mezcla se dejó reaccionando durante otras 12 horas. La mezcla de reacción resultante pesó 67.19 g, tuvo un pH de 10.9 y contenia 7.12 g de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina (concentración 10.6% en peso; rendimiento, 93%). La A^AÉÉ^ concentración de cloruro de sodio en la mezcla de reacción fue de 2.7% en peso (basándose en el agua). Esta mezcla de reacción no mostró salificación de la sal sódica de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina. EJEMPLO 10 A 14.98 g de los cristales de la sal sódica de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina obtenida en el Ejemplo 5 (pureza, 13.42 g) se le agregaron 50 ml de agua y 260 ml de tolueno, y la mezcla de reacción se ajustó a pH 1.8 con ácido clorhídrico concentrado, aproximadamente a 40°C con agitación. La fase acuosa se desechó después de separarla y la fase de tolueno, que pesaba 236.65 g, se recuperó. Esta solución de tolueno contenia 2.54 g (Índice de recuperación, 100%) de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina. A 235.14 g de esta solución de tolueno (que contenia 12.46 g de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina) , se le añadieron 0.66 g de ácido p-toluensulfónico monohidratado y utilizando un total de 25.99 g de metanol, la reacción se llevó a cabo a reflujo durante 20 horas, en donde el agua del subproducto se destiló azeotrópicamente. Esta mezcla de reacción se enfrió a aproximadamente 30°C para obtener 91.99 g de una mezcla de reacción. Esta mezcla de reacción contenia 12.50 g de metiléster de N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina. El rendimiento fue del 96%. EJEMPLO 11 En 160 ml de agua se disolvieron 15.7 g (98.1 mmol) de clorhidrato de ß-cloro-L-alanina. Después de enfriar hasta una temperatura interna de 0 a 5°C, la solución se ajustó a pH 10 agregando aproximadamente 36 g de una solución acuosa al 30% de hidróxido de sodio por goteo, con agitación vigorosa. Posteriormente, manteniendo la temperatura interna entre 0 y 5°C, en agitación vigorosa, . se añadieron 20.5 g (120.0 mmol) de cloroformiato de bencilo por goteo en un periodo de 1 hora y la mezcla se agitó durante 4 horas más. Durante la reacción, la mezcla de reacción se mantuvo a un pH entre 9.5 y 10.5 agregando aproximadamente 16 g de una solución acuosa al 30% en peso de hidróxido de sodio, por goteo. El ensayo de HPLC mostró que esta mezcla de reacción contenia 25.1 g (97.5 mmol) de N-carbobenciloxi-ß-cloro-L-alanina. A la mezcla de reacción anterior se le agregaron 22.0 g (200.0 mmol) de tiofenol por goteo bajo una atmósfera de nitrógeno, con agitación intensa. Durante este procedimiento, la mezcla de reacción se mantuvo a un pH entre 9.7 y 10.3 agregando aproximadamente 26 g de una solución acuosa al 30% en peso de hidróxido de sodio, por goteo. La temperatura interna posteriormente se incrementó a 50°C y la reacción se llevó a cabo bajo una atmósfera de nitrógeno durante 3.5 horas. Durante la reacción, la mezcla de reacción se mantuvo a un pH entre 9.7 y 10.3 agregando aproximadamente 1 g de una solución acuosa al 30% en peso de hidróxido de sodio, por goteo. Durante esta reacción, el producto N-carbobenciloxi-S-fenil-L-cisteina (N-benciloxicarbonil-S-fenil-L-cisteina) se salificó en forma de sal sódica, de manera que el sistema de reacción se tornó similar a una lechada. A esta lechada se le agregaron aproximadamente 20 g de ácido clorhídrico concentrado, gradualmente en un periodo de 3 horas, con agitación vigorosa bajo una atmósfera de nitrógeno, hasta que el sistema tuviera un pH de 3. Los cristales de N-carbobenciloxi-S-fenil-L-cisteina se recuperaron mediante filtración por succión, se enjuagaron con 100 ml de agua dos veces y se drenaron para obtener los cristales húmedos de N-carbobenciloxi-S-fenil-L-cisteina [29.8 g (89.9 mmol) de N-carbobenciloxi-S-fenil-L-cisteina pura] . La pureza óptica de la N-carbobenciloxi-S-fenil-L-cisteina obtenida, fue del 99.9% e.e.

APLICABILIDAD INDUSTRIAL De conformidad con la presente invención, constituida de la manera anteriormente expuesta, se puede aislar una S-fenilcisteina N-protegida de alta calidad, de manera expedita y eficiente, con un buen rendimiento. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. - * *' < • r - - - l .. . ?.

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecedente, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un método para el aislamiento de una S-fenilcisteina N-protegida representada por la siguiente fórmula (1) : en donde R1 representa un grupo amino-protector; R2 representa un átomo de hidrógeno o, ya sea independientemente de R1 o tomado en conjunto con R1, representa un grupo amino-protector, caracterizado porque comprende hacer que la S-fenilcisteina N-protegida se salifique en forma de una sal básica, en presencia de agua.
2. 2. El método de aislamiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la salificación se lleva a cabo en condiciones básicas.
3. 3. El método de aislamiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 6 2, caracterizado porque la sal utilizada para la salificación es una sal inorgánica.
4. 4. El método de aislamiento de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la sal inorgánica es una sal de metal alcalino.
5. 5. El método de aislamiento de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la sal inorgánica es cloruro de sodio o sulfato de sodio.
6. 6. El método de aislamiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5 caracterizado porque el catión de la sal a ser utilizada para la salificación, es de la misma especie que el catión de la sal básica de S-fenilcisteina N-protegida a ser salificada.
7. 7. El método de aislamiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 5 ó 6, caracterizado porque la sal inorgánica se utiliza en una cantidad suficiente para realizar la salificación.
8. 8. El método de aislamiento de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la sal inorgánica se utiliza en una concentración no menor del 5% en peso con base en el agua.
9. 9. El método de aislamiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 5, 6, 7 u 8, caracterizado porque la salificación de la sal básica de S-fenilcisteina N-protegida en presencia de la sal inorgánica, se efectúa: i) incrementando la cantidad de la sal básica de S-fenilcisteina N-protegida, manteniendo constante la cantidad de sal inorgánica, ii) incrementando la cantidad de sal inorgánica, manteniendo constante la cantidad de la sal básica de S-fenilcisteina N-protegida, o iii) incrementado la cantidad de la sal básica de S-fenilcisteina N-protegida, incrementando simultáneamente la cantidad de sal inorgánica.
10. 10. El método de aislamiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7, 8 ó 9, caracterizado porque se hace que se forme una sal básica de S-fenilcisteina N-protegida en un medio acuoso conteniendo la sal inorgánica en una cantidad suficiente para efectuar la salificación en condiciones básicas y, al mismo tiempo, la S-fenilcisteina N-protegida formada de esta manera se salifica.
11. 11. El método de aislamiento de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque un compuesto de la fórmula (2) : en donde R1 representa un grupo amino-protector, R: representa un átomo de hidrógeno o, ya sea independientemente de R1 o tomado en conjunto con R1, representa un grupo amino-protector; X representa un grupo saliente, se trata con tiofenol en un medio acuoso que contiene la sal inorgánica en una cantidad suficiente para efectuar la salificación en condiciones básicas para obtener una S-fenilcisteina N-protegida y, al mismo tiempo, causar que la sal básica de S-fenilcisteina N-protegida formada se salifique de la mezcla de reacción.
12. 12. El método de aislamiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11, caracterizado porque la salificación se lleva a cabo en presencia de cristales sembrados.
13. 13. El método de aislamiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11, caracterizado porque el disolvente está presente durante o después de la salificación para disolver y remover contaminantes liposolubles .
14. 14. Un método para preparar una mezcla de un disolvente orgánico y una S-fenilcisteina N-protegida libre, caracterizado porque comprende neutralizar con un ácido la sal básica de S-fenilcisteina N-protegida obtenida por el método de aislamiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ó 13, para obtener la S-fenilcisteina N-protegida libre y después se mezcla la S-fenilcisteina N-protegida libre con un disolvente orgánico.
15. 15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 14, caracterizado porque la sal básica de S-fenilcisteina N-protegida es una sal metálica de S-fenilcisteina N-protegida.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la sal metálica de S-fenilcisteina N-protegida es una sal de metal alcalino de S-fenilcisteina N-protegida.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la sal de metal alcalino de S-fenilcisteina N-protegida es una sal sódica de S-fenilcisteina N-protegida.
18. 18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ó 17, caracterizado porque el grupo amino-protector es un grupo protector de tipo uretano.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el grupo amino-protector es un grupo aralquiloxicarbonilo o un grupo alcoxicarbonilo inferior.
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, . caracterizado porque el grupo amino-protector es un grupo benciloxicarbonilo, tert-butoxicarbonilo, metoxicarbonilo o etoxicarbonilo.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el grupo amino-protector es un grupo benciloxicarbonilo.