MX2015002390A - Metodos para la produccion de polipeptidos procesados proteoliticamente. - Google Patents

Metodos para la produccion de polipeptidos procesados proteoliticamente.

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Abstract

La presente invención se refiere a nuevos polipéptidos activos proteolíticamente y varios usos de los polipéptidos (y otros) en métodos de selección y producción.

Description

MÉTODOS PARA LA PRODUCCIÓN DE POLIPÉPTIDOS PROCESADOS PROTEOLÍTICAMENTE CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a polipéptidos activos proteolíticamente y a varios usos de los polipéptidos en métodos de detección y producción.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Clostridium botulinum y Clostridium tetani producen neurotoxinas muy potentes, es decir, neurotoxinas botulínicas (BoNTs) y la neurotoxina del tétanos (TeNT), respectivamente. Estas neurotoxinas clostridiales (CNTs) se enlazan específicamente a las células neuronales y afectan la liberación de neurotransmisores. La bacteria Clostridium botulinum secreta siete serotipos de la neurotoxina botulinica (BoNT), distintos antigénicamente, designados con las letras A a G. Todos los serotipos junto con la neurotoxina del tétanos (TeNT) relacionada, secretada por la bacteria Clostridium tétano, son Zn2+-endoproteasas que bloquean la exocitosis sináptica al escindir las proteínas involucradas en la formación del complejo SNARE que controla la fusión de la membrana celular. Las CNTs provocan la parálisis muscular flácida observada en el botulismo y el tétanos. Además, se ha demostrado que la actividad de las CNT afecta la secreción granular. Estos efectos fisiológicos de las CNTs sobre la actividad muscular y glandular se han usado cada vez más en varias aplicaciones terapéuticas y cosméticas. La neurotoxina botulinica del serotipo A (BoNT/A) fue aprobada para uso humano en los Estados Unidos en 1989 para el tratamiento del estrabismo, blefaroespasmo, y otros trastornos. Esta toxina se encuentra disponible comercialmente como la preparación de proteina de neurotoxina botulinica A, por ejemplo, con el nombre comercial B0T0X (Allergan Inc.) y con el nombre comercial DYSPORT (Ipsen Ltd). Para su aplicación terapéutica, un compuesto que comprende la neurotoxina y proteínas bacterianas adicionales se inyecta directamente en el músculo a ser tratado. A pH fisiológico, la toxina se libera del complejo de proteína (Eisele et al. 2011, Toxicon 57(4):555-65) y el efecto farmacológico deseado tiene lugar. Una preparación mejorada de BoNT/A que está libre de proteínas complejantes está disponible con los nombres comerciales XEOMIN o Bocouture (Merz Phamaceuticals GmbH, Frankfurt/Alemania). El efecto de la BoNT solo es temporal, la cual es la razón por la que normalmente se requiere la administración repetida se la BoNT para mantener el efecto terapéutico.
Cada CNT se sintetiza inicialmente como un polipéptido inactivo de cadena individual. En el caso de la BoNT, el polipéptido de la neurotoxina tiene un peso molecular de aproximadamente 150 kDa. El procesamiento post-traduccional de este polipéptido de cadena individual involucra la proteólisis limitada en una región expuesta llamada horquilla (véase la tabla I) y la formación de puentes de disulfuro cercanos. La neurotoxina activa de cadena doble consiste de dos productos de escisión que resultan de la hidrólisis proteolitica del polipéptido precursor de cadena individual: una cadena ligera de la N-terminal de aproximadamente 50 kDa y una cadena pesada de aproximadamente 100 kDa enlazadas por un enlace de disulfuro. Las CNTs consisten esencialmente de tres dominios, es decir, la cadena ligera catalítica, la cadena pesada que abarca el dominio de traslocación (mitad N-terminal) y el dominio de enlace al receptor (mitad C-terminal) (cf. Krieglstein 1990, Eur J Biochem 188: 39; Krieglstein 1991, Eur J Biochem 202: 41; Krieglstein 1994, J Protein Chem 13: 49; Lacy et al., 1998, Nat. Struct. Biol. 5 (10):898-902).
Dependiendo del número de sitios de escisión presentes en la cadena individual entre los residuos de aminoácidos que forman el dominio catalítico y los residuos de aminoácidos que forman el dominio de traslocación, la actividad de la endopeptidasa puede dar lugar a dos productos de escisión grandes, es decir, la cadena ligera y la cadena pesada, y además, péptidos cortos característicos que representan la región de horquilla anterior, formándose un puente en la cadena individual de la neurotoxina que se convierte en las cadenas ligera y pesada (cf. Tabla 1, a continuación).
La purificación de las CNTs a partir de la solución de fermentación es un desafio particular, ya que las neurotoxinas están contenidas en la misma como una mezcla de polipéptidos no procesados, procesados parcialmente y procesados completamente, todos los cuales tienen propiedades bioquímicas y físicas muy similares. Típicamente se generan neurotoxinas procesadas parcialmente, si la actividad endoproteolítica ha hidrolizado el enlace peptídico entre la cadena ligera y el horquilla, en tanto que el enlace peptídico entre el horquilla y la N-terminal de la cadena pesada está aún intacto. Además, la neurotoxina procesada parcialmente también puede ser producida si la actividad endoproteolítica ha liberado el péptido de horquilla de la cadena pesada, en tanto que el enlace peptídico del péptido de horquilla y la C-terminal de la cadena ligera aún no ha sido hidrolizado. Dependiendo de las condiciones de la fermentación y el tipo de la neurotoxina, el polipéptido procesado completamente el cual carece del péptido de horquilla puede estar contaminado significativamente, con entre 5% a 90% de polipéptido procesado parcialmente o no procesado. Un en algunos casos, la neurotoxina está principalmente sin procesar, y antes del uso terapéutico, necesita ser tratada con una endopeptidasa con el fin de volverse biológicamente activa.
La téenica previa describe varios intentos para tratar las neurotoxinas clostridiales con proteasas heterólogas con el fin de reducir la proteina precursora no procesada o procesada parcialmente. La proteasa usada más ampliamente para la activación de las neurotoxinas clostridiales, la Tripsina, aunque es útil para activar las neurotoxinas clostridiales de los serotipos B (BoNT/B) y E (BoNT/E) (DasGupta y Sugiyama 1972, Biochem. Biophys. Res. Commun. 48: 108-112; Kozaki et al., 1974, Infect. Immun. 10: 750-756) parece producir productos secundarios, presumiblemente mediante la acción proteolitica cerca de la C-terminal de la subunidad pesada de la BoNT/A) y, por lo tanto, parece destruir la toxina que se enlaza a si receptor celular (Shone et al., 1985, Eur. J. Bioch. 151: 75-82). Los productos de escisión más específicos se esperan teóricamente de las proteasas endógenas, aisladas de anfitriones nativos, tales como C botulinum que producen BoNT/A. Por consiguiente, se han hecho varios intentos para aislar de las células hospederas nativas, la proteasa endógena involucrada en la activación proteolitica de las neurotoxinas clostridiales. Dekleva y DasGupta (Dekleva & DasGupta, 1989, Biochem. Biophys. Res. Commun. 162: 767-772) purificaron a partir de cultivos de C. botulinum que producen la BoNT/A una fracción capaz de escindir proteoliticamente la BoNT/A en una subunidad pesada y una ligera. Los estudios posteriores de los mismos autores caracterizaron además la proteasa endógena aislada de C. botulinum (Dekleva y DasGupta, 1990, J. Bact. 172: 2498-2503) y revelaron una proteina de 62 kDa, compuesta de un polipéptido de 15.5 kDa y un polipéptido de 48 kDa. Sin embargo, la observación de fragmentación considerable de las CNTs después de la exposición limitada a la proteina de 62 kDa de Dekleva y DasGupta sugiere que la proteasa aislada puede no ser la enzima proteolitica responsable de la activación de las CNTs en cultivos de células clostridiales y durante la infección. De hecho, otros autores han sugerido recientemente que la clostripaina, llamada también clostridiopeptidasa B (Mitchel y Harrington, 1968, JBC 243: 4683-4692), podría estar involucrada en la activación específica de las CNTs (Sebaihia et al., 2007, Genome Res. 17(7): 1082-1092; W02009/014854). Resulta interesante que, la estructura y la especificidad del substrato de esta enzima son reminiscentes de aquellos de la alfa clostripaina secretada de Clostridium histolyticum (Dargatz et al., 1993), un homólogo (74% de identidad de aminoácidos) del cual está presente en C. botulinum (CBO1920). La alfa-clostripaina de C. histolyticum es una cisteína endopeptidasa con especificidad estricta por el enlace de arginilo. Esta se sintetiza como una preproenzima inactiva que experimenta una escisión autocatalítica para generar polipéptidos de 15.4 y 43 kDa, los cuales se asocian para formar una enzima heterodimérica activa (Dargatz et al., 1993). Tanto la alfaclostripaina de C. histolyticum y la proteasa de 62 kDa de C. botulinum requieren un agente reductor y calcio para la actividad completa y son susceptibles a los mismos inhibidores de proteasa. Los datos sugieren fuertemente que el ortólogo de C. botulinum de la alfa-clostripaina (CBO1920) es la proteasa endógena responsable del corte de la neurotoxina de C. botulinum. Un gen que codifica la clostripaina (CPE0846) también está presente en C. perfrigens, y se ha descubierto que está regulado positivamente por el sistema de dos componentes VirR/VirS (Shimizu et al., 2002b).
Hasta el día de hoy, sin embargo, hace falta evidencia experimental concluyente adicional y una proteasa capaz de convertir eficientemente las CNTs precursoras de cadena individual en productos de escisión maduros auténticos, es decir, la neurotoxina de cadena doble, no está disponible aun en la téenica. La presente invención resuelve uno o más de los problemas descritos anteriormente.
Los medios y los métodos para reducir la cantidad de los polipéptidos de neurotoxina no procesados y/o procesados parcialmente y mejorar por ello la calidad de las preparaciones de neurotoxina son muy deseables pero no están disponibles todavía. Por lo tanto, el problema técnico subyacente de la presente invención puede ser observado como el suministro de los medios y los métodos para mejorar la producción de los polipéptidos de neurotoxinas al cumplir con las necesidades antes mencionadas. El problema técnico se resuelve por las modalidades caracterizadas en las reivindicaciones y que se detallan a continuación.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Por consiguiente, la presente invención se refiere, en un aspecto, a un polipéptidos activo proteoliticamente el cual comprende una secuencia de polipéptido que tiene al menos 50% de identidad de la secuencia con la secuencia de la SEC ID NO: 1. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido activo proteoliticamente que consiste de una secuencia de polipéptido que tiene al menos 50% de identidad de la secuencia con la secuencia de la SEC ID NO: 1. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido activo proteoliticamente que consiste de una secuencia de polipéptido como se muestra en la SEC ID NO: 1.
El término "polipéptido activo proteoliticamente" como se usa en este documento, se refiere a la función catalítica del polipéptido de la presente invención, y significa que el polipéptido de la presente invención es capaz de hidrolizar un enlace peptídico. En un aspecto, "polipéptido activo proteoliticamente" se refiere a un polipéptido que es capaz de hidrolizar un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las SEC ID NOs: 4 a 25. El término "polipéptido activo proteoliticamente", como se usa en este documento se refiere a la función catalítica del polipéptido de la presente invención y significa que el polipéptido de la presente invención es incapaz de hidrolizar un enlace peptidico.
Las personas experimentadas pueden determinar si un polipéptido de acuerdo con la definición de la secuencia mencionada en este documento es un polipéptido de acuerdo con la presente invención, al evaluar la actividad proteolitica de dicho polipéptido. Un sistema de ensayo o prueba para determinar la actividad proteolitica comprende poner en contacto un polipéptido, el cual comprende una secuencia de polipéptido que tiene al menos 50% de identidad de la secuencia con la secuencia de la SEC ID NO: 1 con un substrato de prueba. El substrato de prueba es típicamente un polipéptido el cual se sabe que puede ser escindido por el polipéptido de la presente invención. Preferiblemente, el substrato de prueba es una CNT tal como BoNT o un fragmento de la misma. El substrato de prueba puede ser por ejemplo, BoNT no escindida/ no procesada, designada en este documento como "scBoNT" y puede ser, por ejemplo, del serotipo A, B, Cl, D, E, F o G (por ejemplo, "scBoNT/A", "scBoNT/B", etc.) o el substrato de prueba puede ser la neurotoxina del tétanos. Alternativamente, el substrato de prueba puede ser un fragmento de una neurotoxina clostridial, dicho fragmento que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las SEC ID NOs: 4 a 25. El fragmento puede ser un polipéptido de 50 o más residuos de asmas o un polipéptido de hasta 49 residuos de aminoácidos. Como se usa en toda la presente especificación, el término "polipéptido" se refiere a moléculas con 50 o más residuos de aminoácidos, en tanto que el término "péptido" se refiere a moléculas con 2 a 49 residuos de aminoácidos. En un aspecto, el substrato de prueba es un fragmento soluble de neurotoxina llamado LHN que comprende el polipéptido de cadena ligera, la región del péptido de horquilla expuesta y la mitad de la N-terminal del polipéptido de cadena pesada, el dominio de traslocación HN. En otro aspecto, el sustrato de prueba es o comprende un péptido seleccionado de cualquiera de las SEC ID NO: 4 a 25 (cf. tabla 1). En aun otro aspecto, el sustrato de prueba es una neurotoxina quimérica que comprende residuos de aminoácidos derivados de dos o más serotipos.
Un ensayo para determinar la actividad proteolitica comprendería típicamente una etapa para determinar el grado de conversión del sustrato de prueba en sus productos de escisión. La observación de uno o más productos de escisión generados después de poner en contacto el polipéptido con el sustrato de prueba o la observación del aumento en la cantidad de los productos de escisión es indicativo de la actividad proteolitica del polipéptido. Dicha etapa de determinación puede involucrar la comparación del sustrato y de los productos de escisión. Dicha comparación puede involucrar la determinación de la cantidad del sustrato y/o la cantidad de uno o más productos de escisión y también puede involucrar el cálculo de la proporción del sustrato y los productos de escisión. Además, el ensayo para determinar la actividad proteolitica puede comprender una etapa para comparar una muestra de prueba con una muestra de referencia, en donde la muestra de referencia típicamente comprende (a) un polipéptido el cual comprende una secuencia de polipéptido que tiene al menos 50% de identidad de la secuencia con la secuencia de la SEC ID NO: 1 y el cual se sabe que es activo proteolíticamente y (b) un sustrato de prueba que se sable puede ser escindido por el polipéptido de (a). En un aspecto, el ensayo para determinar la actividad proteolitica comprende separar el sustrato y los productos de escisión mediante electroforesis o mediante cromatografía en columna, y opcionalmente, un análisis espectrométrico. Puede ser conveniente etiquetar el sustrato con una o más etiquetas con el fin de detectar más fácilmente la reducción del sustrato de prueba y/o el aumento de los productos. El término "etiqueta", como se usa en este documento significa un marcador detectadle e incluye, por ejemplo, etiquetas radioactivas, anticuerpos, etiquetas fluorescentes. La cantidad del sustrato de prueba y/o de los productos de escisión puede ser determinada por ejemplo mediante métodos de autorradiografía o espectrometría, incluyendo los métodos basados en la transferencia de resonancia de energía entre al menos dos etiquetas. Alternativamente, los métodos inmunológicos tales como la transferencia western o ELISA pueden ser usados para la detección. Un ensayo preferido para determinar la actividad proteolitica del polipéptido de la presente invención se describe a continuación en este documento, en los Ejemplos que ilustran la invención. En una modalidad preferida particularmente de la presente invención, un polipéptido más activo proteoliticamente si más del 20%, preferiblemente más del 95% del sustrato de prueba se convierte en los productos de escisión, como por ejemplo la cadena ligera y la cadena pesada en 120 min a 37°C, usando un amortiguador seleccionado de entre Tris-HCl 100 mM, pH 8 o PBS (Na2HP0450 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4). Las mismas condiciones se aplican si el sustrato de prueba no es una neurotoxina de longitud completa sino más bien, por ejemplo, un fragmento de la neurotoxina de longitud completa o un derivado de la neurotoxina. Es aparente que los productos de escisión diferirán en este caso. Sin embargo, las personas experimentadas pueden cuantificar los productos de escisión correspondientes. En otro aspecto, típicamente, 100 ng del polipéptido activo proteoliticamente y una proporción molar de 1:100 con relación al sustrato se usan en el ensayo. En aun otro aspecto, se puede tomar una muestra a intervalos con el fin de seguir la actividad catalítica con el tiempo. El ensayo puede ser modificado, por ejemplo, usando múltiples cantidades del polipéptido activo proteoliticamente.
La SEC ID NO: 2 muestra la secuencia del polipéptido de un polipéptido activo proteolíticamente, derivado de la cepa ATCC 3502 de Clostridium botulinum, Número de acceso al GenBank: "CAL82988.1", que tiene una longitud de aminoácidos de 581 residuos. La SEC ID NO: 1 muestra un derivado activo proteolíticamente de la SEC ID NO: 2, que carece de los residuos de aminoácidos 1 a 248 de la SEC ID NO: 2.
El término "polipéptido el cual comprende una secuencia de polipéptido que tiene al menos 50% de identidad de la secuencia con la secuencia de la SEC ID NO: 1" se refiere a un polipéptido el cual tiene al menos 50% de identidad de la secuencia con la secuencia de la SEC ID NO: 1. Además, el término se refiere a un polipéptido el cual comprende una secuencia de polipéptido que tiene al menos 50% de identidad de la secuencia con la secuencia de la SEC ID NO: 1. Dicho polipéptido puede tener aminoácidos adicionales, por ejemplo, en una posición interna de la N- o la C-terminal para la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 1 o en una posición interna o la N- o la C-terminal para la secuencia de aminoácidos la cual es al menos 50% idéntica con la secuencia de la SEC ID NO: 1, en donde, una metionina puede estar presente en la N-terminal del polipéptido. Además, el término se refiere a un polipéptido que carece de uno o más residuos de aminoácidos, por ejemplo, en una posición interna de la N- o la C-terminal de la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 1 o en una posición interna de la N- o la C-terminal de una secuencia la cual es al menos 50% idéntica en la secuencia con la SEC ID NO: 1.
El término "identidad de la secuencia" como se usa en este documento, se refiere a la determinación de la identidad entre la secuencia de aminoácidos de referencia y una secuencia problema en donde las secuencias se alinean de modo tal que se obtenga la correspondencia del orden más alta, y la cual puede ser calculada usando las téenicas o los métodos publicados codificados en programas de computadora tales como, por ejemplo, BLASTP, BLASTN, FASTA (Altschul 1990, J Mol Biol 215: 403). Los valores de identidad porcentual en un aspecto se calculan sobre la secuencia de aminoácidos completa. En otro aspecto, la identidad de la secuencia se calcula sobre una longitud de la secuencia de hasta 50 residuos de aa, hasta 100 residuos de aa, hasta 150 residuos de aa, hasta 250 residuos de aa, 300 residuos de aa, 350 residuos de aa, 400 residuos de aa, 450 residuos de aa, 500 residuos de aa, o 550 residuos de aa. En notro aspecto, la identidad de la secuencia se calcula sobre al menos 50 residuos de aa, al menos 100 residuos de aa, al menos 150 residuos de aa o al menos 250 residuos de aa. En modalidades preferidas, la identidad de la secuencia se determina sobre la longitud completa de la SEC ID NO: 1 o 2, es decir, sobre una longitud de 333 aa o 581 aa, respectivamente. Una serie de programas basados· en una variedad de algoritmos está disponible para los operarios experimentados, para comparar diferentes secuencias. En este contexto, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith y Waterman proporcionan resultados particularmente confiables. Para llevar a cabo las alineaciones de las secuencias y calcular los valores de identidad de las secuencias mencionados en este documento, el programa disponible comercialmente Lasergene MegAlign Versión 7.1.0 de DNASTAR, basado en el algoritmo de Clustal W, se usó sobre la región de la secuencia completa con los siguientes ajustes: Parámetros de Alineación en Pares: Penalización por Hueco: 10.00, Penalización por Longitud del Hueco: 0.10, Matriz de peso de proteina Gonnet 250, los cuales, a menos que se especifique de otra manera, se usaran siempre como los ajustes estándar para las alineaciones de las secuencias.
El término "al menos 50% de identidad de la secuencia" como se usa en este documento significa al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o 100%.
El polipéptido activo proteolíticamente de la presente invención puede tener el mismo número de aminoácidos que la secuencia de polipéptido de referencia como se muestra en la SEC ID NO: 1. También están comprendidos por la presente invención los polipéptidos que tienen residuos de aminoácidos adicionales o menos residuos de aminoácidos. En un aspecto, el polipéptido activo proteolíticamente de la presente invención es o comprende mutantes de truncamiento de la SEC ID NO: 1 o 2 o de un polipéptido que tiene al menos 50% de identidad de la secuencia con la secuencia de la SEC ID NO: 1 o 2. Los mutantes de truncamiento de la SEC ID NO: 2 pueden carecer por ejemplo de uno o más residuos de aminoácidos de las N-terminal para la posición del aminoácido 24 9. Los mutantes de truncamiento pueden ser mutantes de truncamiento de la N- o la C-terminal y/o mutantes de truncamiento internos que son activos proteoliticamente. En un aspecto, dichos mutantes de truncamiento de la SEC ID NO: 2 carecen de las posiciones de aminoácidos 1 a 248 de la SEC ID NO: 2. En otro aspecto, el mutante de truncamiento de la SEC ID NO: 2 es un mutante de truncamiento de la C-terminal. En un aspecto, el mutante de truncamiento carece de hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 50, 100, 150, o hasta 170 residuos de aminoácidos consecutivos. En otro aspecto, el polipéptido activo proteoliticamente de la presente invención tiene una longitud de aminoácidos de al menos 200 residuos de aa, de al menos 250 residuos de aa, de al menos 300 residuos de aa o de al menos 333 residuos de aa. En otro aspecto, el polipéptido activo proteoliticamente de la presente invención tiene hasta 333 residuos de aa, hasta 350 residuos de aa, hasta 573 residuos de aa, hasta 581 residuos de aa, hasta 592 residuos de aa, hasta 600 residuos de aa o hasta 617 residuos de aa.
En otro aspecto, el polipéptido activo proteoliticamente de la presente invención abarca un polipéptido que comprende residuos de aminoácidos adicionales en la N- o la C-terminal y/o en una posición interna de la cadena del polipéptido de la SEC ID NO: 1 o de una secuencia de polipéptido que tenga al menos 50% de identidad de la secuencia con la secuencia de la SEC ID NO: 1. Estos residuos de aminoácidos adicionales pueden comprender hasta 5, hasta 10 o aun hasta 200, 300, o hasta 400 residuos de aminoácidos consecutivos. En un aspecto, los residuos de aminoácidos adicionales funcionan como un inhibidor de la actividad proteolitica. En otro aspecto, los residuos de aminoácidos adicionales pueden ser removidos por una proteasa. En otro aspecto, los residuos adicionales que inhiben la actividad proteolitica del péptido de la presente invención se excluyen. Los residuos de aminoácidos pueden estar flanqueados por uno o más sitios de escisión de proteasa. En otro aspecto, la secuencia de aminoácidos adicional funciona como una etiqueta detectadle y/o permite el enlace a un soporte sólido.
En otro aspecto, la cadena de polipéptido de la SEC ID NO: 1 o de una secuencia de polipéptido que tiene al menos 50% de identidad de la secuencia con la secuencia de la SEC ID NO: 1 se modifica al intercambiar uno o más residuos de aminoácidos. El término "intercambiar", como se usa en este documento, significa reemplazar un aminoácido con un aminoácido diferente. Por ejemplo, hasta un laa, 2aa, 3aa, 4aa, 5aa, 6aa, 7aa, 8aa, 9aa, lOaa, 15aa, 20aa o hasta 50aa pueden ser remplazados dentro de la secuencia de polipéptido. Los intercambios pueden involucrar cambios de aminoácidos conservativos o no conservativos, teniendo como objetivo, por ejemplo, aumentar o reducir el enlazamiento del sustrato o la actividad proteolitica del polipéptido de la presente invención.
En un aspecto, el polipéptido activo proteoliticamente de la presente invención abarca un polipéptido que es capaz de hidrolizar un sustrato en dos o más productos de escisión nativos. En otro aspecto, el polipéptido de la presente invención hidroliza el sustrato en dos o más productos de escisión los cuales difieren de los productos de escisión nativos. El término "productos de escisión nativos" o "productos nativos" como se usa en este documento se refiere a los productos, los cuales son idénticos en la secuencia de aminoácidos cuando se comparan con los productos generados a partir del mismo sustrato en cultivos de células de tipo silvestre, de los cuales se origina el sustrato. En un aspecto, el producto de escisión es la neurotoxina de cadena doble de una neurotoxina botulinica o de la neurotoxina del tétanos, en otro aspecto, la neurotoxina de cadena doble, es una neurotoxina aislada de C. botulinum del serotipo A, B, Cl, D, E, F o G. En aun otro aspecto, dicha neurotoxina de cadena doble es una neurotoxina nativa de cadena doble.
La Tabla 1 muestra los precursores, la neurotoxina nativa de cadena doble de la TeNT y de la BoNT/A-G e identifica la horquilla expuesta que comprende la secuencia de aminoácidos escindida por el polipéptido de la presente invención.
Se debe entender que las definiciones y las explicaciones de los términos, realizadas anteriormente y a continuación, se aplican mutatis mutandis para todos los aspectos descritos en esta especificación, a menos que se indique de otra manera.
El polipéptido activo proteolíticamente de la presente invención es adecuado para varias aplicaciones. Una aplicación relevante comercialmente es su uso en la producción de neurotoxinas terapéuticas, tales como aquellas aisladas de C. botulinum. Actualmente, los cultivos de células de C. botulinum usadas para la preparación de preparaciones disponibles comercialmente de la neurotoxina botulinica están contaminadas con cantidades significativas de la neurotoxina procesada parcialmente y/o no procesada, ambas de las cuales afectan negativamente, es decir, reducen la actividad de estas composiciones farmacéuticas. Usando el polipéptido activo o activado proteolíticamente de la presente invención por ejemplo después de la lisis de C. botulinum, será posible ahora tratar las composiciones que comprenden neurotoxinas no procesadas y/o procesadas parcialmente y por lo tanto, convertir estos contaminantes en neurotoxinas procesadas completamente. En consecuencia, se pueden proporcionar productos comerciales con una actividad específica aumentada de la neurotoxina, en donde la cantidad total de proteínas bacteriana puede ser reducida, reduciéndose además el riesgo para los pacientes de formación de anticuerpos.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la presente invención, y opcionalmente, elementos reguladores. El término "elementos reguladores" como se usa en este documento, se refiere a elementos reguladores de la expresión genética, incluyendo la transcripción y la traducción e incluye elementos tales como la caja tata, promotores, mejoradores, sitio de enlace a ribosomas, secuencias de Shine-Dalgarno, Regiones de IRES, señales de poliadenilación, estructuras de encapuchamiento de terminales, y los similares. Dichos elementos reguladores pueden comprender uno o más elementos reguladores heterólogos o uno o más elementos reguladores homólogos. Un "elemento regulador homólogo" es un elemento regulador de células de tipo silvestre, de las cuales se derivan las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, el cual está involucrado en la regulación de la expresión genética de las moléculas de ácido nucleico o los polipéptidos en dichas células de tipo silvestre. La presente invención también abarca moléculas de ácido nucleico que comprenden elementos reguladores heterólogos. El término "elemento regulador heterólogo" es un elemento el cual no está involucrado en la regulación de la expresión genética de las moléculas de ácido nucleico o el polipéptido en dichas células de tipo silvestre. También están abarcados los elementos reguladores para la expresión inducible, tales como los promotores inducibles. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser por ejemplo, hnARN, mARN, ARN, ADN, ANP, LNA, y/o moléculas de ácido nucleico modificadas. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser circulares, lineales, integradas en un genoma o episoma. También estas abarcados los concatémeros que codifican las proteínas de fusión que comprenden tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o diez polipéptidos de la presente invención. Además, las moléculas de ácido nucleico pueden contener secuencias que codifican secuencias de señalización para el transporte intracelular, tales como señales para el transporte hacia el compartimiento intracelular o para el transporte a través de la membrana celular.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico de acuerdo con las moléculas de ácido nucleico de la presente invención. Los vectores pueden ser adecuados para la expresión in vitro y/o in vivo del polipéptido de la presente invención. Los vectores pueden ser vectores para la expresión genética transitoria y/o estable. En una modalidad, los vectores comprenden además elementos reguladores y/o marcadores de selección. Dichos vectores, en una modalidad, son de origen viral, en otra modalidad de origen fágico, en aun otra modalidad, de origen bacteriano.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a células que comprenden las moléculas de ácido nucleico o los vectores de la presente invención. El término "célula(s)" como se usa en este documento, abarca las células procariotas y/o eucariotas adecuadas para expresar las moléculas de ácido nucleico o dichos vectores y en particular los polipéptidos de la invención. Dichas células pueden ser células hospederas que no expresan los polipéptidos de la presente invención y homólogos de los mismos. El término "homólogo" como se usa en este documento se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptido que tiene al menos 50% de identidad de la secuencia con la secuencia de la SEC ID NO: 1. Sin embargo, también están abarcadas por la presente invención las células, en particular células de tipo silvestre, que expresan los polipéptidos de la presente invención y homólogos de los mismos. En un aspecto particular, las células de la presente invención se seleccionan de C. botulinum, C. bufyricum, C. baratii y C. tetani. En un aspecto preferido, las células son C. botulinum del serotipo A, B o F. En otro aspecto, dichas células son la cepa de Hall (ATCC 3502) de C. botulinum. En otro aspecto, dichas células son la cepa ATCC 19397 que produce la BoNT/A conocida también como NCTC 4587 y NCTC 7272 de C. botulinum. En otro aspecto, dichas células son de la cepa NCTC 2916 de C. botulinum que produce la BoNT/A. En otro aspecto, dichas células son las cepas Kyoto-F y Mauritius/NCTC 9837 de C. botulinum que producen la BoNT/A2. En otro aspecto, dichas células son la cepa A254 Loch Maree/NCTC 2012 de C. botulinum que producen la BoNT/A3. En otro aspecto dichas células son la cepa CDC657 de C. botulinum que producen la BoNT/A4 y B. En otro aspecto, dichas células son la cepa H044Q2 065 de C. botulinum que produce la BoNT/A5 y B3'. En otro aspecto, dichas células son la cepa Okra/NCTC 7273 de C. botulinum que produce la BoNT/Bl. En otro aspecto, dichas células son la cepa CDC4013/NCTC 12265 de C. botulinum que produce la BoNT/B y F. En otro aspecto, dichas células son la cepa Langeland/NCTC 10281 de C. botulinum que produce la BoNT/Fl. En otro aspecto, dichas células son células de Clostridium sporogenes, Clostridium perfiingens, Clostridium acetobufylicum, B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoidis, B. thermoproteolyticus, B. anthracis, B. megaterium, B. subtilis, E. coli, o de una levadura. En un aspecto, los polipéptidos de la presente invención se modifican dentro de las células (es decir, se someten a glicosilación, fosforilación, se procesan mediante proteasas, etc.). La modificación también incluye la adición de cofactores no proteinicos incluyendo iones metálicos. Las células que comprenden los polipéptidos inactivos proteoliticamente descritos anteriormente, cualquier producto polipéptido intermedio, asi como los polipéptidos finales activos proteoliticamente descritos en este documento, están abracados por esta invención. También están abarcadas por la presente invención las células que comprenden inductores de la expresión de los polipéptidos de la presente invención. Tales inductores de la expresión pueden ser moléculas de ácido nucleico o polipéptidos o entidades químicas, incluyendo entidades químicas pequeñas, que tienen el efecto de aumentar la cantidad de la actividad de los polipéptidos activos proteolíticamente de la presente invención en cultivos celulares o lisados de los mismos. Los inductores de la expresión pueden, por ejemplo, aumentar la transcripción o la traducción de las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de la presente invención. Alternativamente, los inductores de la expresión pueden ser compuestos capaces de activar el polipéptido inactivo proteolíticamente SEC ID NO: 2, o los polipéptidos que comprenden una secuencia de polipéptido que tenga al menos 50% de identidad de la secuencia con la secuencia de la SEC ID NO: 2. En un aspecto, dichas células comprenden inductores que son polipéptidos activos proteolíticamente capaces de remover los residuos de aminoácidos inhibidores de la N-terminal de dichos polipéptidos. Los inductores pueden ser, por ejemplo, expresados por medios recombinantes conocidos por las personas experimentadas en la téenica. Alternativamente, los inductores pueden ser aislados de células, por ejemplo, células clostridiales .
La presente invención también se refiere al uso de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención para la producción de polipéptidos activos proteolíticamente de la presente invención.
En un aspecto relacionado, la presente invención se refiere a un método para la producción de polipéptidos activos proteolíticamente, que comprende las etapas de: (a) sintetizar químicamente o traducir de una secuencia de nucleótidos, un polipéptido, que comprende una secuencia de polipéptido que tiene al menos 50% de identidad de la secuencia con la secuencia de la SEC ID NO: 1; y (b) purificar el polipéptido de la etapa (a).
El término "sintetizar químicamente" significa sintetizar los polipéptidos por medios químicos. Tales métodos se reseñan por ejemplo en Nilsson et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2005. 34:91-118. El término "purificar el polipéptido" significa eliminar de una mezcla que comprende el polipéptido de la presente invención, los compuestos distintos a dicho polipéptido. El término también significa extraer el polipéptido de la presente invención de una mezcla que comprende compuestos distintos a dicho polipéptido. En un aspecto particular, el término significa separar el polipéptido activo proteolíticamente de su precursor inactivo proteolíticamente.
Los ácidos nucleicos pueden ser traducidos en células o en un sistema sin células. Varios sistemas para la traducción sin células están disponibles para aquellas personas experimentadas. La presente invención abarca por ejemplo, la traducción en un sistema de traducción de proteínas sin células, que comprende lisado de reticulocitos de conejo, lisado de germen de trigo, U sado de E. coli, y otros U sados celulares, por ejemplo, lisados generados a partir de C. botulinum y los similares. También está abarcada la traducción del polipéptido de la presente invención a partir la secuencia de nucleótidos de la presente invención o los vectores de la presente invención. La transcripción puede ser regulada o controlada por uno o más elementos reguladores heterólogos o por elementos reguladores homólogos. También está abarcada por este aspecto de la presente invención la traducción en células de tipo silvestre, es decir, células aisladas de la naturaleza, tales como cualquier aislado de C. botulinum, C. butyricum, C. baratii, y C. tetani. En un aspecto partículas, dichas células son la cepa de Hall de C. botulinum (ATCC 3502). Varios medios y métodos estándar están disponibles para las personas experimentadas para introducir moléculas de ácido nucleico o vectores en las células y para expresar los polipéptidos de la presente invención como proteínas recombinantes en las células. Además, las personas experimentadas conocen muchas téenicas estándar para aislar los polipéptidos de las células o los lisados celulares o de los sistemas de expresión sin células (por ejemplo, Recombinant DNA Principies and Methodologies, J. Green, Marcel Dekker Inc., 1998; The Condensed Protocols: From Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al, Coid Spring Harbor Laboratory, 2006; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Coid Spring Harbor Laboratory, 2000). Cualquiera de estos medios y métodos puede ser usado en los métodos de la presente invención.
El primer polipéptido de la presente invención puede ser traducido a partir de moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido activo proteoliticamente. La SEC ID NO: 26 es un ejemplo de tales moléculas de ácido nucleico. Alternativamente, dichas moléculas de ácido nucleico pueden codificar un polipéptido precursor el cual es inactivo proteoliticamente pero el cual puede ser convertido en el polipéptido activo proteoliticamente de la presente invención. La SEC ID NO: 27 es un ejemplo de tales moléculas de ácido nucleico. El precursor inactivo proteoliticamente también se conoce como "BoNTHidrolasa inactiva", abreviado iBH. Este polipéptido inactivo proteoliticamente puede ser activado, por ejemplo, durante o después de la tradición o poniendo en contacto por ejemplo, dicho polipéptido inactivo proteoliticamente con una proteasa capaz de remover los residuos de aminoácidos desactivadores en la N-terminal del polipéptido inactivo proteoliticamente. Un ejemplo de un polipéptido inactivo proteoliticamente es el polipéptido presentado por la SEC ID NO: 2. Otro ejemplo es un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptido que tiene al menos 50% de identidad de la secuencia con la secuencia de la SEC ID NO: 2. El término "residuos de aminoácidos desactivadores en la N-terminal", en un aspecto, se refiere a los primeros 248 residuos de aa de dicho polipéptido. En otro aspecto, este término se refiere a un fragmento de hasta 10 residuos de aa, 50 residuos de aa, 100 residuos de aa, 150 residuos de aa, 200 residuos de aa, 250 residuos de aa de dicho polipéptido. Cualquiera de estos polipéptidos es útil en el método de la presente invención para la producción de polipéptidos activos proteoliticamente. En un aspecto, la proteasa capaz de remover los residuos de aminoácidos desactivadores de la N-terminal de estos polipéptidos se aísla, por ejemplo, de Clostridium botulinum, Clostridium butyricum, Clostridium baratii, y Clostridium tetani. En otro aspecto, la proteasa capaz de remover dichos residuos de aminoácidos desactivadores se proporciona al proporcionar un lisado fraccionado o no fraccionado de dichas células. Los residuos de aminoácidos desactivadores pueden ser removidos al poner en contacto el polipéptido inactivo proteoliticamente con dicho lisado e incubando hasta que el polipéptido inactivo proteoliticamente se transforme en el polipéptido activo proteoliticamente.
En otro aspecto del método de la presente invención, el polipéptido se traduce en células. Las células pueden ser células procariotas o eucariotas. En un aspecto, las células se seleccionan de E. coli, B. subtilis o levaduras. También está abarcada por la presente invención la traducción del polipéptido de la presente invención en células de tipo silvestre, es decir, células aisladas de la naturaleza, tales como cualquier aislado conocido de Clostridium botulinu , Clostridiu butyricum, Clostridium baratii, y Clostridium tetani. En un aspecto particular, dichas células son la cepa Hall de C. botulinum (ATCC 3502). En otro aspecto particular, dichas células son las células de la presente invención descritas anteriormente en este documento.
Los productos de la traducción obtenidos por el método de la presente invención pueden ser purificados por varios medios, todos los cuales son conocidos por las personas experimentadas en la téenica (por ejemplo, Recombinant DNA Principies and Methodologies, J. Green, Marcel Dekker Inc., 1998; The Condensed Protocols: de Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al, Cold Spring Harbor Laboratory, 2006; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 2000). Los métodos típicos para purificar los polipéptidos de la presente invención pueden involucrar, centrifugado del lisado de células, precipitación de las proteínas por sulfato de amonio, resuspensión de las proteínas, centrifugación de las proteínas resuspendidas, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de interacción hidrofóbica, y los similares. Varias combinaciones de tales etapas, en distinto orden, pueden ser útiles para purificar los polipéptidos de la presente invención. Un método preferido para purificar los polipéptidos de la presente invención se describe en los Ejemplos los cuales ilustran la invención.
En un aspecto, la etapa de purificación comprende enlazar los polipéptidos de la presente invención a un soporte sólido. El término "soporte sólido" se refiere a una matriz que abarca, por ejemplo, sílice, dextrano reticulado, poliacrilamida reticulada, o agarosa reticulada y las similares. También se incluyen en particular, polipéptidos, vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, polipropilenglicol (PEG), dextrano, nylon, amilasas, y celulosas modificadas, poliacrilamidas, gabros, y magnetita. Un soporte sólido es, en un aspecto de la invención, una matriz de polisacárido seleccionado del grupo que consiste de: sefarosa, sefadex, agarosa, sefacel, nitrocelulosa, y perlas de alginato. En otro aspecto, dicho soporte sólido puede consistir de perlas de vidrio, y/o matrices de polipéptido.
En un aspecto, el soporte sólido se enlaza al anticuerpo de la presente invención. El término "enlaza" significa, en un aspecto, enlazado de forma estable o asociado de forma estable. En otro aspecto, enlazado incluye interacciones tales como enlaces indirectos o directos, no reversibles o reversibles, físicos y químicos, electrostáticos, y/o covalentes. En un aspecto, el anticuerpo se enlaza al soporte sólido de forma covalente, ya sea directamente o a través de moléculas enlazadoras. El anticuerpo puede ser enlazado a dicho soporte sólido a través de un enlazador, que incluye moléculas enlazadoras de compuestos de moléculas pequeñas y péptidos (o polipéptidos). El soporte sólido puede tener virtualmente cualquier configuración estructural o arreglo posible siempre y cuando el anticuerpo acoplado pueda enlazarse con su antigeno. Por lo tanto, la matroz o el soporte sólido puede ser esférico, como en las perlas, o cilindrico, como en la superficie interior de los tubos de ensayo, o la superficie externa de una varilla. Alternativamente, la superficie puede ser irregular o plana, como por ejemplo una lámina o una tira de pruebas.
Dicho anticuerpo enlazado al soporte sólido puede ser usado, por ejemplo, en el método de producción de la presente invención o en un método de diagnóstico. En un aspecto, dicho método de producción puede comprender una etapa de cromatografía de afinidad, en donde dicha cromatografía de afinidad se basa en un anticuerpo enlazado a un soporte sólido. En una modalidad, dicho anticuerpo es un anticuerpo que se enlaza específicamente al polipéptido activo proteolíticamente de la presente invención. En otra modalidad, dicho anticuerpo es un anticuerpo que se enlaza específicamente al polipéptido inactivo proteolíticamente de la presente invención.
En otro aspecto, el método para producir el polipéptido activo proteolíticamente de la presente invención, comprende purificar el polipéptido de la presente invención a partir de una mezcla que contiene componentes adicionales. La purificación se puede basar en, por ejemplo, la polaridad, la carga eléctrica y el tamaño. Por lo tanto, el método puede, en un aspecto, comprender una o más etapas de separación seleccionadas del grupo que consiste de: HPLC en fase normal, HPLC en fase invertida, cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC), cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), cromatografía de intercambio iónico (IEC) incluyendo cromatografía de intercambio de aniones y cromatografía de intercambio de cationes, cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), cromatografía de permeación de gel (GPC).
En otro aspecto, dicha purificación comprende las etapas de: (a) separación mediante cromatografía de intercambio aniónico; (b) separación por cromatografía de exclusión de tamaño; (c) separación por cromatografía de interacción hidrofóbica; y (d) separación por cromatografía de exclusión de tamaño.
Una o más fracciones recolectadas de la columna de cromatografía pueden ser concentradas, por ejemplo, mediante precipitación o ultrafiltración.
En un aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende el polipéptido activo proteolíticamente de la presente invención. Usando el método descrito en este documento, es posible producir los polipéptidos activos proteoliticamente de la presente invención, los cuales están sustancialmente libres de polipéptidos inactivos proteoliticamente. En otras palabras, el método de la presente invención proporciona polipéptidos activos proteoliticamente y composiciones que no comprenden contaminación sustancial con la proteina precursora inactiva de los polipéptidos de la presente invención. Se considera que las composiciones no contienen contaminación sustancial o están sustancialmente libres de los polipéptidos precursores inactivos proteoliticamente si, al usar un método de detección basado en la transferencia western, se puede detectar menos de 5% del precursor inactivo proteoliticamente, en donde icho 5% se refiere a la cantidad del precursor inactivo proteoliticamente con relación a la suma de los polipéptidos activo e inactivo proteoliticamente. En otro aspecto, dicha composición está sustancialmente pura y comprende al menos 50% del polipéptido activo proteoliticamente de la presente invención, en donde dicho 50% se refiere a la cantidad del precursor activo proteoliticamente con relación a la cantidad total de la proteina contenida en la composición. En otro aspecto, dicha composición sustancialmente pura comprende al menos 75%, 80%, 90% o al menos 98% de polipéptidos proteoliticamente activos.
En otro aspecto, la presente invención también se refiere a polipéptidos los cuales pueden ser obtenidos a partir del método para producción de polipéptidos activos proteoliticamente como se describe anteriormente en este documento y como se ilustra en los Ejemplos. Dichos polipéptidos proteoliticamente activos, en un aspecto, son polipéptidos activos proteoliticamente, con la secuencia de polipéptido de la SEC ID NO: 1. En otro aspecto, los polipéptidos activos proteoliticamente son polipéptidos que tienen al menos 50% de identidad de la secuencia con la SEC ID NO: 1. En aun otro aspecto, los polipéptidos activos proteoliticamente, son polipéptidos los cuales comprenden una secuencia de polipéptido que tiene al menos 50% de identidad de la secuencia con la secuencia de la SEC ID NO: 1. El término "polipéptidos los cuales pueden ser obtenido" como se usa en este documento se refiere, en un aspecto, a los polipéptidos que se traducen de los ácidos nucleicos de la presente invención. Los polipéptidos pueden experimentar posteriormente modificaciones postraduccionales tales como acilación, alquilación, amidación, adición de aminoácidos, eliminación de aminoácidos, glicosilación, oxidación, S-glutationilación, fosforilación, sulfatación, procesamiento proteolitico y los similares. Además, los polipéptidos se pueden enlazar a iones metálicos tales como Li+, Na+, K+, Ag+, Cs+, Mg2+, Ca2, Co2+, Ni2+, Mn2+, Cu2+ o Zn2+. Preferiblemente, dichos iones metálicos son Zn2+, Mn2+ o Co2+.
La presente invención también se refiere, en un aspecto, a anticuerpos que se enlazan específicamente a los polipéptidos de la presente invención. El término "anticuerpo(s) " como se usa en este documento abarca anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos de cadena individual, anticuerpos humanos, humanizados, primatizados, o quimerizados, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos sintéticos, derivados modificados químicamente o enzimáticamente, fragmentos de cualquiera de dichos anticuerpos o aptámeros que consisten de ácidos nucleicos de origen natural y/o modificados químicamente. Los fragmentos de dichos anticuerpos incluyen los fragmentos F(ab')2, F(ab), Fv o scFv o los derivados modificados químicamente o enzimáticamente de cualquiera de estos fragmentos.
En un aspecto, los anticuerpos de la presente invención se enlazarán específicamente a los polipéptidos activos proteolíticamente de la presente invención o a sus precursores inactivos proteolíticamente. En y aspecto, los anticuerpos los cuales son específicos para los polipéptidos activos proteolíticamente de la presente invención reaccionan de forma cruzada con los polipéptidos inactivos proteolíticamente descritos en este documento. En otro aspecto, los anticuerpos son capaces de discriminar entre los polipéptidos activos proteolíticamente de la presente invención y sus precursores inactivos. En otro aspecto, el epitope para el cual son específicos dichos anticuerpos se ubica en un una región de los aminoácidos que está presente en los polipéptidos inactivos proteolíticamente pero no en los polipéptidos activos proteolíticamente. Por ejemplo, dicho epitope puede ser un epitope de una región de los polipéptidos que consiste de los residuos de aminoácidos 1 a 248 de los polipéptidos que comprenden la secuencia de polipéptido que tienen al menos 50% de identidad de la secuencia con la secuencia de la SEC ID NO: 2.
En otro aspecto, el epitope se forma por los residuos de aminoácidos ubicados en la N-terminal al residuo de aminoácido 249 de los polipéptidos que comprenden la secuencia de polipéptido que tiene al menos 50% de identidad de la secuencia con la secuencia de la SEC ID NO: 2. En otro aspecto, dicho epitope se elimina de los polipéptidos inactivos proteolíticamente descritos en este documento, mediante procesamiento proteolítico.
En otro aspecto, el epitope para el cual son específicos los anticuerpos de la presente invención es un epitope ubicado en la N-terminal de los polipéptidos que comprenden la secuencia de polipéptido que tiene al menos 50% de identidad de la secuencia con la secuencia de la SEC ID NO: 1. El término "N-terminal", como se usa en este aspecto de la invención, se refiere a una región de los polipéptidos que comprende los 50 residuos de aminoácidos de la N-terminal de dicha secuencia de polipéptido, preferiblemente los 25 residuos de aminoácidos de la N-terminal de dicha secuencia de polipéptidos. En un aspecto particular, el término se refiere a 14 residuos de aminoácidos de la N-terminal. El término "epítope" como se usa en este documento, se refiere al determinante antigénico el cual es reconocido por los anticuerpos de la presente invención. En un aspecto, el epitope es un epitope lineal, en otro aspecto, el epitope es un epitope conformacional. En un aspecto particular, el determinante antigénico consiste de un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la N-terminal de los polipéptidos activos proteoliticamente de la presente invención, en donde dicho péptido puede tener una longitud de aminoácidos de 7 a 14, preferiblemente de 8, 9, 10, 11, 12, 13, o 14 residuos de aminoácidos.
El término "se enlaza(n) especificamente" o "que se enlaza (n) específicamente a" en un aspecto, significa que los anticuerpos de la presente invención no reaccionan de forma cruzada a un grado significativo con otros epítopes ya sea sobre los polipéptidos de la presente invención o sobre otros polipéptidos en general. La especificidad del epítope es una característica importante de los anticuerpos de la presente invención. La especificidad de los anticuerpos con respecto a los polipéptidos aaccttiivvooss proteoliticamente versus los polipéptidos inactivos proteoliticamente será, en un aspecto, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%. El enlazamiento especifico puede ser evaluado mediante varias téenicas bien conocidas incluyendo, por ejemplo, estudios de competición. Otra característica importante, es la sensibilidad de los anticuerpos. La sensibilidad será, en un aspecto de la invención, tal que se enlace al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% del epítope comprendido por una muestra. La sensibilidad puede ser evaluada mediante las técnicas bien conocidas. Aquellas personas experimentadas en la técnica serán capaces de determinar las condiciones operativas y óptimas del ensayo para cada determinación, empleando la experimentación de rutina. Las técnicas convencionales para los estudios de enlazamiento incluyen radioinmunoensayos, ELISA, diálisis de equilibrio, microcalorimetría isotérmica, ensayos BIACORE® (resonancia de plasmón superficial, SPR) y otros métodos de adsorción superficial. El sistema SPR de BIACORE® mide la interacción anticuerpo-antígeno. La respuesta del SPR refleja un cambio en la concentración de masa en la superficie del detector cuando los analitos se enlazan o se disocian. Con base en SPR, las mediciones en tiempo real de BIACORE® monitorean las interacciones directamente cuando estas ocurren, véase BIAapplications Handbook, versión AB (reimpreso en 1998), código de BIACORE® No: BR-1001-86; BIAtechnology Handbook, versión AB (reimpreso en 1998), código de BIACORE® No: BR-1001-84. Las propiedades de enlace tales como la sensibilidad de los anticuerpos de la presente invención puede, en principio, ser determinadas mediante estudios de enlazamiento usando un antigeno inmovilizado (el ligando) presentado sobre una superficie detectora. Los anticuerpos a ser evaluados (el analito) serán proporcionados en la fase móvil, es decir, en una solución. En algunos casos, el antigeno se enlaza indirectamente a la superficie a través de enlazamiento con otras moléculas inmovilizadas las cuales se conocen como moléculas de captura. Cuando los anticuerpos se inyectan en pulsos discretos a través de la superficie con los antigenos inmovilizados, se pueden subdividir esencialmente tres fases: (i) Asociación de los anticuerpos con el antigeno durante la inyección única; (ii) Equilibrio o estado permanente durante la inyección de la muestra, donde la velocidad de enlazamiento de los anticuerpos se balancea por la disociación del complejo anticuerpo-antígeno; (iii) Disociación de los anticuerpos de la superficie durante el flujo del amortiguador. Se entenderá que tal ensayo puede ser llevado a cabo alternativamente con anticuerpos inmovilizados a ser investigados y una solución que contiene el antigeno como la fase móvil. Las fases de asociación y disociación proporciona información sobre la cinética de la interacción analito-ligando (ka y kd, las velocidades de formación y disociación del complejo, kd/ka=KD). La fase de equilibrio proporciona información sobre la afinidad de la interacción analito-ligando (KD). En un aspecto de la invención, los anticuerpos de la presente invención tienen una KD menor a 0.5 mM, en otro aspecto, menor a 0.05 mM, en otro aspecto menor a 0.02 mM.
Los anticuerpos a los que se hace referencia en la presente invención pueden ser producidos usando los métodos que se describen, por ejemplo, en Harlow y Lañe, 1988 (Harlow y Lañe, "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Coid Spring Harbor, 1988). Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados mediante las téenicas descritas originalmente en Kohler y Milstein, 1975 (Kohler y Milstein 1975, Nature 256: 495) y Galfie y Milstein, 1981 (Galfle y Milstein 1981, Meth Enzymol 73: 3). Dichas técnicas comprenden la fusión de células de mieloma de ratón a células de bazo derivadas de mamíferos inmunizados. Los anticuerpos pueden ser mejoradores adicionalmente mediante las técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, resonancia de plasmón superficial, como se emplea en el sistema BIACORE®, puede ser usada para aumentar la eficiencia de los anticuerpos de fagos los cuales se enlazan al epítope mencionado anteriormente dentro de los polipéptidos de la presente invención (cf. Schier et al., 1996, Human Antibodies Hybridomas 7:97; Malmborg et al., 1995, J. Immunol Methods 183: 7).
En un aspecto de la invención, los anticuerpos se producen usando péptidos que comprenden o que consisten del epitope mencionado anteriormente. Los péptidos pueden ser producidos, por ejemplo, sintéticamente o mediante expresión recombinante. Alternativamente, los anticuerpos de la invención pueden ser producidos aplicando los polipéptidos activos o inactivos proteoliticamente de origen natural de la presente invención. En este último caso, se debe entender que los anticuerpos resultantes serán evaluados posteriormente por su especificidad con respecto a los polipéptidos de la presente invención. En un aspecto adicional de la invención, los anticuerpos monoclonales de la invención se producen usando los polipéptidos de la presente invención, los cuales pueden ser tratados con detergentes con el fin de volver disponible inmunológicamente al epitope. Sin embargo, se entenderá que en el caso donde los anticuerpos serán dirigidos contra un epitope conformacional no se llevará a cabo tal tratamiento con detergentes. En un aspecto adicional, los agentes de inmunoestimulación tales como hemocianina de lapa californiana (KLH) también pueden ser aplicados en tal proceso, especialmente cuando se usan péptidos sintéticos.
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser usados, por ejemplo, para cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación, e inmunolocalización de los polipéptidos de la presente invención así como para el monitoreo de la presencia de dichos polipéptidos en muestras o en organismos recombinantes. Además, los anticuerpos de la presente invención pueden ser usados en un método de detección o en un método de diagnóstico. En un aspecto particular, los anticuerpos de la presente invención se usan en la Transferencia Western o ELISA. Además, los anticuerpos de la presente invención pueden ser usados en aplicaciones terapéuticas. En particular, los anticuerpos pueden ser usados para inhibir la actividad de los polipéptidos activos proteoliticamente de la presente invención. Por lo tanto, los anticuerpos de la presente invención también tienen varias aplicaciones terapéuticas descritas a continuación en este documento.
La presente invención también se refiere al uso de los polipéptidos activos proteoliticamente de la presente invención en un método para procesar proteoliticamente los polipéptidos. En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para la producción de polipéptidos procesados proteoliticamente, que comprende la etapa de poner en contacto (a) un primer polipéptido, dicho primer polipéptido que es el polipéptido de la presente invención, con (b) un segundo polipéptido, dicho segundo polipéptido que es susceptible de proteólisis por dicho primer polipéptido, en donde, dicho contacto resulta en el procesamiento proteolitico de dicho segundo polipéptido en al menos dos productos de escisión.
La presente invención también se refiere al uso de Lys-N y/o Lys-C y/o arginilo endopeptidasa (endoproteinasa Arg-C, LeR) de Lysobacter enzymogenes (ATCC 29487) (Wright DS, Graham LD, Jennings PA. Biochim Biophys Acta. 1998 Dic 22; 1443(3):369-74). Además, también está abracado el uso de plasmina y/o omptina (OmpT), una serina proteasa de enlace a la membrana que se escinde en los motif (Arg/Lys-(Arg/Lys) (K. Sugimura y T. Nishihara. J. Bacteriol. 170 (1988), pp.5625-5632) en un método para procesar proteoliticamente las CNT tal como BoNT/A. En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para la producción de polipéptidos procesados proteoliticamente, que comprende la etapa de poner en contacto: (a) un primer polipéptido, dicho primer polipéptido que es Lys-C o Lys-N, con (b) un segundo polipéptido, dicho segundo polipéptido que es susceptible de proteólisis por dicho primer polipéptido, en donde, dicho contacto resulta en el procesamiento proteolitico de dicho segundo polipéptido en al menos dos productos de escisión, y en donde, el segundo polipéptido es la cadena individual de BoNT/A. El término "Lys-C" se refiere a la serina endoproteinasa de 33 kDa Lys-C de Lysobacter enzymogenes (Lisilo endopeptidasa, LeK, Genbank acc. Q7M135) que escinde específicamente los enlaces péptidos en la C-terminal a U sina o un homólogo de la misma que tiene al menos 60% de identidad de la secuencia. El término "Lys-N" se refiere a la metaloendopeptidasa Lys-N aislada de Grifóla frondosa y Pleurotus ostreatus (Nonaka T et al., 1997, J Biol Chem. 272: 30032-30039; Nonaka T et al., 1998, J Biochem.1998 124:157-162; Hori T et al·., 2001, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 57: 361-368). También están abarcados por el % término los homólogos de dicha proteasa que tienen al menos 60% de identidad de la secuencia.
Este método puede ser usado, por ejemplo, para producir neurotoxinas (CNT) procesadas proteolíticamente o neurotoxina botulinica (BoNT). El término "BoNT", como se usa a través de esta invención significa neurotoxina botulinica y se refiere a la neurotoxina que puede ser obtenida de C. botulinum, tal como BoNT de serotipo A, B, Cl, D, D, F o G. También están abarcadas por los términos "CNT" y "BoNT" las neurotoxinas recombinantes y modificadas que comprenden una o más modificaciones que incluyen modificaciones químicas o modificaciones genéticas. El término "modificación genética" significa eliminación, sustitución, o adición de uno o más residuos de aminoácidos. Usando el método de la presente invención, es posible ahora obtener composiciones de neurotoxina con significativamente menos contaminación de neurotoxinas no procesadas o procesadas parcialmente, ya que esos contaminantes se procesan eficientemente en neurotoxinas de cadena doble. En un aspecto, las neurotoxinas de cadena doble son neurotoxinas de cadena doble nativas, en donde la C-terminal de la cadena ligera y la N-terminal de la cadena pesada son idénticas a la neurotoxina de cadena doble correspondiente procesada completamente, aisladas de clostridial de tipo silvestre.
El término "poner el contacto" como se usa en este documento se refiere a poner en cercanía física al menos dos diferentes compuestos para permitir la interacción física y/o química de dichos compuestos. De acuerdo con el método de esta invención, los dichos dos diferentes compuestos son, en un aspecto, el primero y el segundo polipéptidos los cuales están comprendidos por la solución. El contacto se lleva a cabo bajo las condiciones y durante el tiempo suficiente para permitir la interacción del primero y el segundo polipéptidos. El término "polipéptido procesado proteolíticamente" como se usa en este documento, se refiere en un aspecto a un polipéptido, la cadena de polipéptido del cual ha sido hidrolizada o escindida en uno o más enlaces peptídicos. En otro aspecto, el término se refiere a un polipéptido que ha sido escindido proteolíticamente por una endoproteinasa o endopeptidasa. En otro aspecto, el término se refiere a un polipéptido el cual ha sido escindido a un grado de al menos 50%. En otro aspecto, dicho polipéptido procesado proteolíticamente es el segundo polipéptido. En otro aspecto, al menos 60%, 70%, 80%, 90% o 95% esta proteolíticamente procesado.
El término "primer polipéptido", como se usa en este documento, se refiere al polipéptido de la presente invención, es decir, el polipéptido activo o activado proteoliticamente, designado también como "BoNTHidrolasa activa". Ya que la BoNTHidrolasa puede ser obtenida del sobrenadante de C. botulinum, esta se llamó inicialmente BoNTHidrolasa nativa, abreviado "nBH". Sin embargo, el término "primer polipéptido" y "nBH" también se refiere a las BoNTHidrolasas que se pueden obtener de otras fuentes. El término "segundo polipéptido", como se usa en este documento, se refiere al sustrato de dicho primer polipéptido. El término "que es susceptible a la proteólisis" se refiere a una característica o requerimiento del segundo polipéptido y se usa aquí para dar a entender que el segundo polipéptido puede ser escindido proteoliticamente por dicho primer polipéptido. En otras palabras, el término "que es susceptible a la proteólisis" significa que el segundo polipéptido comprende un sitio de reconocimiento de escisión por la proteasa que le permite funcionar como un sustrato del primer polipéptido. El "segundo polipéptido" es un sustrato del primer polipéptido y es procesado proteoliticamente en dos o más productos de escisión. Usando el ensayo descrito anteriormente en este documento, las personas experimentadas pueden evaluar si un polipéptido dado es un sustrato del primer polipéptido y, por lo tanto, un "segundo polipéptido", de acuerdo con la definición de la presente invención. El término "al menos dos productos de escisión" incluye, por ejemplo, hasta dos, tres, cuatro, cinco, y hasta seis productos de escisión.
Este método puede ser usado, por ejemplo, para preparar composiciones farmacéuticas que comprenden neurotoxinas clostridiales o para generar fragmentos de polipéptidos usados en un método de espectrometría de masas. El primer polipéptido y el segundo polipéptido pueden ser puestos en contacto en varias etapas en el proceso de producción de los polipéptidos procesados proteolíticamente. En un aspecto, la etapa de poner en contacto el primer polipéptido y el segundo polipéptido se lleva a cabo dentro de células. En un aspecto particular de esta modalidad, el primero y el segundo polipéptidos se expresan en dichas células.
En otro aspecto, dicha etapa de contacto se lleva a cabo en un U sado celular o en un U sado de células purificado. Este aspecto comprende agregar el primer polipéptido al lisado o al lisado purificado. El primer polipéptido puede ser agregado en varias etapas durante la purificación del segundo polo del lisado de células. Por ejemplo, el primer polipéptido puede ser agregado antes o después: precipitación de proteínas, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica y/o cromatografía de exclusión de tamaño. Además, también esta abarcada la adición del primer polipéptido a una composición farmacéutica. En este aspecto, el polipéptido de la presente invención se usa, por ejemplo, para escindir proteolíticamente el segundo polipéptido, por ejemplo, para la activación de un segundo polipéptido el cual es un agente terapéutico contenido en la composición farmacéutica. También se contempla la administración del primer polipéptido a un sujeto, con el fin de procesar proteoliticamente un segundo polipéptido en el sujeto. La administración también incluye la coadministración del primero y el segundo polipéptidos. También está abarcada por este método una etapa de incubación a las condiciones y por un tiempo suficiente para escindir el segundo polipéptido. En un aspecto, las condiciones pueden comprender agregar un amortiguador seleccionado del grupo que consiste de Tris-HCl 100 mM, pH 8.0, o PBS (Na2HP0450 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4). Las condiciones preferidas del amortiguador incluyen Tris-HCl 100 mM, pH 8.0. El "tiempo suficiente para la escisión" puede ser determinado usando el ensayo descrito anteriormente en este documento. En un aspecto, dicho "tiempo suficiente para la escisión" depende del grado de escisión que deba tener el polipéptido procesado proteoliticamente o una composición que lo comprende. En un aspecto, el método comprende una etapa de incubación del primero y el segundo polipéptidos durante al menos 30 min, 60 min, 120 min, o al menos 240 min. En otro aspecto, el primero y el segundo polipéptidos se incuban hasta por 30 min, 60 min, 120 min, 240 min, 480 min o hasta 600 min. En otro aspecto, el método comprende una etapa de incubación del primero y el segundo polipéptidos a 4°C o a 37°C. En otro aspecto, el método comprende una etapa de incubación hasta por 1 h, hasta 2 h, 4h, 6h, lOh o hasta 16h.
En un aspecto, la cadena de polipéptido de dicho segundo polipéptido comprende una secuencia seleccionada de cualquiera de las SEC ID NOs: 4 a 25. En un aspecto más particular, la cadena de polipéptido de dicho segundo polipéptido comprende una secuencia seleccionada de cualquiera de las SEC ID NOs: 4 a 25 y en donde el segundo polipéptido se escinde en la C-terminal a un residuo de amino ácido básico dentro de dicha secuencia de cualquiera de las SEC ID NOs: 4 a 25. Dichas secuencias representan las secuencias de aminoácidos de sustratos conocidos de los polipéptidos activos proteoliticamente de la presente invención. Como se muestra en este documento, dichos sustratos se escinden en la C-terminal a un residuo de aminoácido básico contenido en la secuencia, examinar la Tabla 1, columna Lc y HN. En un aspecto preferido, dicho segundo polipéptido comprende una secuencia seleccionada de las SEC ID NO: 4 a 10. En otro aspecto preferido, dicho segundo polo es BoNT/A o un derivado de la misma, incluyendo, por ejemplo, el polipéptido de la SEC ID NO: 3 y los derivados del mismo. El término "derivado" como se usa con respecto a este y otros aspectos de la invención, comprende las mutaciones de aminoácidos tales como adiciones, sustituciones, eliminaciones o truncamientos de uno o más residuos de aminoácidos .
En un aspecto, el segundo polipéptido comprende un derivado de cualquiera de las SEC ID NOs: 4 a 25, o de la SEC ID NO: 3, en donde, dicho derivado tiene una o más mutaciones de punto y/o uno o más residuos de aminoácidos adicionales. En otro aspecto, dicho derivado tiene hasta 1, hasta 2, hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta 6, hasta 7, hasta 8, hasta 9, hasta 10, hasta 15 mutaciones de punto. Al usar el ensayo de actividad para determinar la actividad de la proteasa, como se describe en este documento, las personas experimentadas pueden determinar si un derivado dado se procesa por los polipéptidos activos proteoliticamente de la presente invención. En otro aspecto, el derivado contiene una mutación de punto que cambia un residuo de aminoácido básico en un residuo de aminoácido no básico. En otro aspecto, el derivado tiene al menos 50% de identidad de la secuencia con cualquiera de las SEC ID NOs: 4 a 25. En otro aspecto, dicho derivado o un polipéptido que comprende el derivado es un sustrato del primer polipéptido y puede ser escindido proteoliticamente por el primer polipéptido. Un ejemplo típico es un derivado de la SEC ID NO: 3 que comprende, por ejemplo, una o más mutaciones de punto en la cadena ligera o pesada.
En otro aspecto, dicho segundo polipéptido comprende (a) una secuencia de polipéptido que tiene al menos 30% de identidad de la secuencia con la secuencia de la SEC ID NO: 3 [(BoNT/A de ATCC 3402, Genbank acc. AAA23262)]; o (b) una secuencia de polipéptido seleccionada del grupo que consiste de neurotoxina del Tétanos, la proteina del Factor X de la cascada de coagulación o Protrombina (Factor II), enzimas digestivas del páncreas, como la tripsina, quimotripsina, pepsina, papaina. Al menos 30% significa al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 85%. En un aspecto articular, la identidad de la secuencia de dicha segunda secuencia de polipéptido que tiene al menos 50% de identidad de la secuencia con la secuencia de la SEC ID NO: 3 se determina con base en las posiciones de los aminoácidos 420 a 466 de la SEC ID NO: 3, en otro aspecto, dicha identidad de la secuencia se determina con base en cualquiera de las SEC ID NOs: 4 a 25. En otras palabras, dicho aspecto se refiere a un segundo polipéptido el cual comprende una secuencia de polipéptido la cual tiene, por ejemplo, al menos 30% de identidad de la secuencia con la secuencia de polipéptido encontrada entre las posiciones de los aminoácidos 420 a 466 de la SEC ID NO: 3 o al menos 30% de identidad de la secuencia con la secuencia de polipéptido de cualquiera de las SEC ID NOs: 4 a 25. Un polipéptido de acuerdo con esta definición puede ser obtenido, por ejemplo, de C. botulinum, C. tetani o C. sporogenes. Dicho segundo polipéptido puede ser, por ejemplo, una neurotoxina de origen natural tal como BoNT/A, B, Cl, D, E, F o G o un derivado de las mismas que comprende una o más mutaciones de aminoácidos, tales como adiciones, sustituciones, eliminaciones o truncamientos de uno o más residuos de aminoácidos. Están abarcados, por ejemplo, los derivados que carecen, por ejemplo, del dominio Hc de la neurotoxina o partes de los mismos o derivados con otros residuos de aminoácidos reemplazando el dominio Hc de la neurotoxina asi como derivados con una cadena ligera adicional y otras moléculas de carga proteinica fusionadas en la N-terminal a la cadena ligera de BoNT.
En otro aspecto el segundo polipéptido puede contener residuos de aminoácidos adicionales en la N- o la C-terminal o en una posición interna. Los residuos de aminoácidos adicionales pueden estar flanqueados por uno o más sitios de escisión de proteasa. En otro aspecto, la secuencia de aminoácidos funciona como una etiqueta detectable y/o permite el enlace a un soporte sólido. Un ejemplo es una etiqueta his o una etiqueta GST. Otro ejemplo es la secuencia de aminoácidos VPPTPGSAWSHPQFEK que contiene la Steptag, agregada preferiblemente a la C-terminal.
En un aspecto particular, dicho segundo polipéptido es un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptido como se muestra en GenBank No: CBZ04958.1, YP_002805603.1, ZP_02994746.1, YP_001788403.1, YP_001782718.1, ZP_02616437.1, ZP__02614241.1, YP_001392361.1, YP_001255575.1 o un homólogo de los mismos que tenga al menos 50% de identidad de la secuencia.
En otro aspecto, la actividad biológica de dicho segundo polipéptido se modula por la escisión proteolitica. Es bien sabido por las personas experimentadas en la téenica, que la función de muchos polipéptidos puede ser modulada por el procesamiento proteolitico. "Modulado" como se usa en este documento significa aumentado o reducido, activado o desactivado. Por ejemplo, la actividad biológica de muchas neurotoxinas clostridiales se incrementa o se activa al procesar proteoliticamente una neurotoxina de cadena individual en una neurotoxina de cadena doble, en donde, la neurotoxina de cadena doble se compone de un polipéptido de cadena ligera y de cadena pesada, las cuales se enlazan covalentemente a través de un puente de disulfuro. La actividad biológica de la neurotoxina abarca al menos tres actividades separadas: la primera actividad es una "actividad proteolitica" que reside en la cadena ligera de la neurotoxina y es responsable de hidrolizar el enlace peptidico de uno o más polipéptidos involucrados en la regulación de la fusión a la membrana celular. Una segunda actividad es una "actividad de traslocación", que reside en el extremo de la N-terminal de la cadena pesada de la neurotoxina procesadas y está involucrada en el transporte de la cadena ligera a través de la membrana lisosomica y hacia el citoplasma. Una tercera actividad es una "actividad de enlace al receptor", que resine en el extremo de la C-terminal de la cadena pesada de la neurotoxina procesada e involucrada en el enlace y la asimilación de la neurotoxina en las células objetico. En un aspecto preferido, el término actividad biológica como se usa en este documento, significa actividad proteolitica. En un aspecto más preferido, el término significa actividad proteolitica aumentada.
La actividad biológica de las neurotoxinas clostridiales puede ser medida mediante varias pruebas, todas las cuales son conocidas por las personas experimentadas en la téenica. Estas pruebas permiten determinar una o más de las actividades mencionadas anteriormente. Por ejemplo, el ensayo de LD50 de ratón o el ensayo de hemidiafragma del nervio frénico de ratón ex vivo (MPN) como se describe en Pearce et al., 1994 (Pearce LB, Borodic GE, First ER, MacCallum RD (1994), Toxicol Appl Pharmacol 128: 69-77) y Habermann et al., 1980 (Habermann E, Drcyer F, Bigalke H. (1980), Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 311:33-40) permiten determinar el efecto tóxico de una preparación dada de neurotoxina sobre un organismo vivo o una preparación neuromuscular aislada. Para establecer el efecto tóxico en un ensayo de LD50, la neurotoxina debe ser activa biológicamente en cada una de las tres actividades mencionadas anteriormente. Además, están disponibles varios otros ensayos, que permiten, por ejemplo, determinar si una neurotoxina o la cadena ligera de la neurotoxina es activa proteoliticamente . Tales ensayos se basan, por ejemplo, en poner en contacto la BoNT/A con SNAP-25. Alternativamente, puede ser usado un péptido que representa el sitio de escisión de SNAP-25, en donde el péptido puede ser etiquetado por facilidad de detección. En un aspecto preferido, la actividad biológica se determina usando el ensayo MPN descrito anteriormente en este documento.
En otro aspecto, dicho primer polipéptido se activa procesando proteoliticamente un polipéptido precursor inactivo, dicho polipéptido precursor inactivo que comprende una secuencia de polipéptido que tiene al menos 60% de identidad de la secuencia con la secuencia de la SEC ID NO: 2. Este aspecto se basa en la observación de que un polipéptido que tiene la secuencia de polipéptido de la SEC ID NO: 2 es inactivo proteoliticamente, mientras que los truncamientos de la N-terminal del mismo son activos proteoliticamente. También se contempla por la presente invención usar los polipéptidos inactivos proteoliticamente en los métodos descritos en este documento. Los polipéptidos inactivos proteoliticamente descritos en este documento pueden ser activados, por ejemplo, eliminando un fragmento de la N-terminal o la N-terminal completa que comprende los residuos de aminoácidos 1 a 248 de la SEC ID NO: 2. En un aspecto, la N-terminal se elimina mediante una proteasa, en otro aspecto, la N-terminal se remueve por autoproteólisis de la SEC ID NO: 2. 60% de identidad de la secuencia se refiere a una alineación de la secuencia con NT02CB1447 de longitud completa.
En otro aspecto, el método de la presente invención para la producción de polipéptidos procesados proteoliticamente comprende la etapa de purificar el segundo polipéptido procesado proteoliticamente o al menos uno o dos productos de escisión del mismo. La purificación de la BoNT/A expresada por C. botulinum se puede realizar, por ejemplo, como se describe esencialmente en la téenica previa (DasGupta 1984, Toxicon 22, 415; Sathyamoorthy 1985, J Biol Chemistry 260, 10461). En particular, la purificación de la neurotoxina puede contener una o más etapas de precipitación y extracción, una o más etapas de concentración, y además distintas etapas cromatográficas. La BoNT/A de cadena individual recombinante y su purificación se describen en la técnica previa (Rum el et al., 2004, Mol Microbiol.51:631-43).
En una modalidad preferida, la cepa de clostridium es C. botulinum, por ejemplo, que produce la BoNT/A, o un derivado de la misma. Para la fermentación, puede ser usado el proceso descrito por DasGupta B. R. et al., en Toxicon, vol.22, No. 3, p. 414 a 424, 1984. Por lo tanto, extracto de levadura al 0.5% y pasta de levadura al 0.6% esterilizada en autoclave se agrega a 2% de medio de N-Z-amina de tipo A, y se ajustará a un pH de 7.2 con la ayuda de NaOH 4N, y el medio preparado de tal manera se esterilizara después en el autoclave. A este medio calentado en el autoclave por separado se puede agregar glucosa (20% en peso por volumen), para llegar a una concentración final de glucosa de 0.5% en el medio. La incubación puede ocurrir por ejemplo a 37°C sin agitación, en donde la fermentación se detiene, por ejemplo, después de 96 horas. Está dentro del ámbito de la presente invención que además de la fermentación en lotes descrita anteriormente, también se puede llevar a cabo la fermentación semicontinua, fermentación repetida por lotes o fermentación continua.
Después de la fermentación actual y la separación del medio de fermentación de las células el medio de fermentación puede experimentar una primera precipitación con el objetico de remover las proteínas grandes. La precipitación es preferiblemente una precipitación ácida. Las condiciones de reacción para tal precipitación ácida son conocidas por aquellas personas experimentadas en la téenica. Típicamente se puede usar H2SO41.5 M, para acidificar el sobrenadante a pH de 3.5. La centrifugación ocurre normalmente durante 20 minutos a 2400 x g a 4°C. El comprimido recibido a través de la centrifugación puede ser lavado con agua, preferiblemente varias veces, el comprimido puede ser extraído con amortiguador de ácido cítrico-citrato de trisodio 0.1 M, pH 5.5, por ejemplo durante una hora. Posteriormente, puede ser llevada a cabo una etapa de centrifugación adicional, por ejemplo a 9800 x g durante 20 minutos a 4°C. El comprimido así obtenido puede ser extraído otra vez opcionalmente como se describe anteriormente. El sobrenadante de la extracción, y ambos sobrenadantes en el caso de la repetición de la extracción, pueden ser sometidos entonces a precipitación con sulfato de protamina. La precipitación puede continuar durante toda la noche, por ejemplo a 8°C. Posteriormente, el precipitado puede ser centrifugado, por ejemplo, durante 20 minutos a 4°C y a 12,000 x g., 1 sobrenadante de la centrifugación puede ser sometido a precipitación, tal como una precipitación con sulfato de amonio, por lo cual se pueden remover otras proteínas más grandes. Después de la etapa de precipitación con sulfato de amonio se puede agregar otra etapa de centrifugación y posteriormente el comprimido así obtenido puede ser disuelto otra vez y, opcionalmente, ser sometido a diálisis. El extracto el cual se somete preferiblemente a diálisis y centrifugado otra vez, puede ser sometido a una sucesión de etapas de cromatografía con el objetivo de purificar la neurotoxina. Cada una de las etapas de cromatografía sirve para remover los contaminantes tales como el sulfato de protamina, el ADN restante, parte de las proteínas más pequeñas y las proteínas de tamaño medio así como las hemaglutininas del complejo de proteína de la neurotoxina botulínica. Con este propósito, en una modalidad preferida se pueden usar una o más etapas de cromatografía. Opcionalmente, el eluato de, por ejemplo, la última etapa de cromatografía puede ser filtrado con el fin de reducir los gérmenes. Opcionalmente, el eluato puede ser diluido antes de la filtración y se pueden agregar los auxiliares adecuados. Durante las etapas posteriores se puede llevar a cabo otra filtración estéril después de la adición de los auxiliares. En un aspecto, la filtración se lleva a cabo en recipientes de reacción los cuales pueden ser sometidos entonces a una etapa de liofilización.
La presente invención también se refiere a una composición que puede ser obtenida por el método de la presente invención para producción de polipéptidos procesados proteoliticamente. En un aspecto, dicha composición comprende una mezcla del segundo polipéptido procesado y no procesado, en donde dicha mezcla puede contener menor de 5%, 4%, 3%, 2%, o menos del 1% del segundo polipéptido no procesado. En un aspecto de dicha composición, dicho segundo polipéptido es BoNT o un derivado de la misma. La BoNT puede ser seleccionada, por ejemplo, del grupo que consiste de BoNT del serotipo A, B, C, D, E, F y G, incluyendo un derivado de la misma. La composición puede ser por ejemplo, una composición liquida o sólida y puede contener uno o más portadores, auxiliares, y/o excipientes.
En otro aspecto, la presente invención también se refiere a un método para la producción de un medicamento, es decir, una composición farmacéutica, que comprende las etapas del método mencionado anteriormente, y la etapa adicional de formular la neurotoxina de cadena doble purificada como un medicamento. En un aspecto, dicho medicamento comprende una mezcla del segundo polipéptido procesado y no procesado, en donde dicha mezcla contiene menos de 5% del segundo polipéptido no procesado. En modalidades preferidas, la mezcla contiene menor de 4%, 3%, 2% o menos de 1% del segundo polipéptido no procesado.
La presente invención también se refiere a varios usos médicos de los compuestos descritos en este documento: En un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos activos proteoliticamente de acuerdo con la presente invención, para ser usados como medicamentos o en composiciones farmacéuticas. En otro aspecto, la presente invención se refiere a composiciones de acuerdo con la presente invención para ser usadas como medicamentos o en composiciones farmacéuticas. En aun otro aspecto, la presente invención se refiere a anticuerpos de acuerdo con la presente invención para ser usados como medicamentos o en composiciones farmacéuticas. En aun otro aspecto, la presente invención se refiere a inhibidores de acuerdo con la presente invención para ser usados como medicamentos o en composiciones farmacéuticas. En particular, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos de la presente invención, los anticuerpos de la presente invención, las composiciones de la presente invención o los inhibidores de la presente invención.
El término "composición" como se usa en este documento, se refiere a cualquier composición formulada en forma sólida, liquida, aerosol (o gaseosa) y las similares. Dichas composiciones comprenden, por ejemplo, un compuesto de la invención activo terapéuticamente junto con compuestos auxiliares adecuados, tales como diluyentes o portadores u otros ingredientes. En un aspecto, el compuesto activo terapéuticamente es el polipéptido activo proteoliticamente de la presente invención. En otro aspecto, el compuesto terapéutico es el segundo polipéptido procesado proteoliticamente, como se describe anteriormente en este documento, tal como la neurotoxina de cadena doble. En otro aspecto, el compuesto activo terapéuticamente es el anticuerpo de la presente invención. En otro aspecto, el compuesto activo terapéuticamente es el inhibidor del polipéptido activo proteoliticamente de la presente invención.
En este contexto, se distingue para la presente invención entre los compuestos auxiliares, es decir, los compuestos los cuales no contribuyen a los efectos producidos por el compuesto de la presente invención, tras la aplicación de la composición para su propósito pretendido, y otros ingredientes, es decir, compuestos los cuales contribuyen a un efecto adicional o modulan el efecto del compuesto de la presente invención. Los diluyentes y/o portadores apropiados dependen del propósito para el cual se debe usar la composición y de los otros ingredientes. Las personas experimentadas en la téenica pueden determinar tales diluyentes y/o portadores adecuados sin ningún otro procedimiento.
El o los portadores deben ser aceptables en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no ser nocivos para el receptor de los mismos. El portador farmacéutico empleado puede incluir un sólido, un gel, o un liquido. Los ejemplos de portadores sólidos son lactosa, caolín, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, acacia, estearato de magnesio, ácido esteárico y los similares. Los ejemplos de portadores líquidos son solución salina amortiguada con fosfato, jarabes, aceites, agua, emulsiones, varios tipos de agentes humectantes, y los similares. De forma similar, el portador o el diluyente puede incluir materiales de retardo bien conocidos en la técnica, tales como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo individualmente o con una cera. Dichos portadores adecuados comprenden aquellos mencionados anteriormente y otros bien conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Re ington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.
El o los diluyentes se selecciona(n) para no afectar la actividad biológica de la combinación. Los ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, solución salida fisiológica, soluciones de Ringer, solución de dextrosa, y solución de Hank, además, la composición o la formulación farmacéutica puede incluir también otros portadores, auxiliares, o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos, y los similares.
En un aspecto, una composición farmacéutica como se usa en este documento comprende la neurotoxina activa biológicamente obtenida mediante el método de la presente invención, opcionalmente, uno o más portadores acatables farmacéuticamente. La neurotoxina activa puede estar presente en forma liquida o liofilizada. En un aspecto, dicho compuesto puede estar presente junto con glicerol, estabilizadores de proteínas (por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA)) o estabilizadores no proteinicos tales como polivinilpirrolidona o ácido hialurónico. La composición farmacéutica, en un aspecto, de administra tópicamente. Convencionalmente la forma de administración del fármaco usada convencionalmente es la administración intramuscular, subcutánea (cerca de las glándulas). Sin embargo, dependiendo de la naturaleza y el modo de acción del compuesto la composición farmacéutica puede ser administrada por otras rutas también. El polipéptido de neurotoxina de cadena doble es el ingrediente activo de la composición, y en un aspecto, se administra en formas de codificación convencionales preparadas al combinar el fármaco con los portadores farmacéuticos estándar de acuerdo con los procedimientos convencionales. Estos procedimientos pueden involucrar, mezclado, granulado, y comprensión, o disolución de los ingredientes según sea apropiado para la preparación deseada. Se apreciará que la forma y el carácter del portador o el diluyente aceptable farmacéuticamente están dictados por la cantidad el ingrediente activo con el cual se deben combinar, la ruta de administración y otras variables bien conocidas.
Una dosis efectiva terapéuticamente se refiere a una cantidad del compuesto, la neurotoxina, a ser usada en una composición farmacéutica de la presente invención, la cual evita, alivia o trata los síntomas que acompañan a una enfermedad o condición a la que se hace referencia en esta especificación. La eficacia terapéutica y la toxicidad del compuesto pueden ser determinadas mediante los procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, ED50 (por ejemplo, la dosis efectiva terapéuticamente en 50% de la población) y LD5o (la dosis letal para el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos terapéutico y toxico es el índice terapéutico y puede ser expresado como la relación, LD50/ED50.
El régimen de dosificación será determinado por el médico encargado y otros factores clínicos. Como es bien sabido en las artes médicas, las dosis de cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo la talla del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto particular a ser administrado, el sexo, el tiempo y la ruta de administración, la salid general, y otros fármacos que se administran concurrentemente. El progreso puede ser monitoreado mediante la evaluación periódica. Las composiciones y las formulaciones farmacéuticas a las que se hace referencia en este documento se administran al menos una vez con el fin de tratar o aliviar o prevenir una enfermedad o condición mencionada en esta especificación. Sin embargo, dichas composiciones farmacéuticas pueden ser administradas más de una vez.
En un aspecto adicional de la invención, la composición mencionada anteriormente es un medicamento o una composición cosmética. En un aspecto, el dicho medicamento que comprende la neurotoxina activa biológicamente puede ser usado para la prevención y/o el tratamiento de al menos una de las siguientes enfermedades y trastornos: fortaleza muscular voluntaria, distonia focal, incluyendo distonia cervical, craneal y blefaroespasmo esencial benigno, espasmos hemifaciales y espasticidad focal, trastornos gastrointestinales, hiperhidrosis, y corrección cosmética de arrugas, en un aspecto adicional, también blefaroespasmos, distonia oromandibular, del tipo de apertura de la mandíbula, del tipo de cierre de la mandíbula, bruxismo, síndrome de Meige, distonia lingual, apraxia del parpado, distonia cervical de apertura, antecolis, retrocolis, laterocolis, torticolis, distonia faríngea, distonia laríngea, disfonía espasmódica aductora, disponía espasmódica abductora, disnea espasmódica, distonia límbica, distonia de brazos, distonia específica de la tarea, calambres de escritor, calambres del músico, calambres del jugador de golf, distonia de piernas, aducción del muslo, flexión de la rodilla por aducción del muslo, extensión de la rodilla, flexión del tobillo, extensión del tobillo, equinovaro, distonia por deformidad del pie, dedo estriatal, flexión del dedo gordo del pie, extensión del dedo gordo del pie, distonia axial, síndrome de pisa, distonia de la bailarina del vientre, distonia segmentada, hemidistonia, distonia generalizada, distonia por enfermedad de Lubag, distonia por degeneración corticobasal, distonia por enfermedad de Lubag, distonia tardía, distonia por ataxia espinocerebelar, distonia por enfermedad de Parkinson, distonia por enfermedad de Huntington, distonia por enfermedad de Hallervorden Spatz, disquinesias dopa inducidas/ distonia dopa inducida, disquinesias tardías/distonia tardía, disquinesias/distonia paroxismales, mioclono palatal inducido por la acción quinesiogénica, no quinesiogénica, mioquimia por mioclono, rigidez, calambres musculares benignos, temblor hereditario de la barbilla, actividad paradójica de los músculos de la mandíbula, espasmos hemimasticatorios, miopatía branquial hipertrófica, hipertrofia masetérica, hipertrofia del músculo tibial anterior, nistagmo, oscilopsia, parálisis visual supranuclear, epilepsia parecial continua, planeación de la operación de torticolis espasmódica, parálisis de las cuerdas vocales abductoiras, disforia mutacional recalcitante, disfunción del esfínter esofágico superior, granuloma del pliegue vocal, tartamudeo por síndrome de Gilíes de la Tourette, mioclono del oído medio, cierre protector de la laringe, post laringectomía, falla de la voz, ptosis protectora, entropión, disfunción del esfínter de Oddi, pseudoacalasia, nonacalasia, trastornos del movimiento esofágico, vaginismos, temblor por inmovilización postoperatoria, disfunción de la vejiga, disinergia del esfínter detrusor, espasmo del esfínter de la vejiga, espasmo hemifacial, disquinesias de reinervación, patas de gallo por el uso de cosméticos, asimetrías faciales del ceño, mentalis dimples (hoyuelos mentonianos), síndrome de la persona rígida, hiperplasia de la próstata por tétanos, adipositas, estrabismo por parálisis cerebral infantil en tratamiento, parálisis mixta concomitante, después de la cirugía retinal, después de la cirugía por cataratas, estrabismo en la afaquia miosítica, estrabismo miopático, desviación vertical disociada como un adjunto a la cirugía por estrabismo, esotropía, exotropía, acalasia, fisuras anales, hiperactividad de las glándulas exocrinas, síndrome de Frcy, síndrome de Lágrimas de Cocodrilo, hiperhidrosis, rinorrea axilar-plantar-palmar, hipersalivación relativa en la apoplejía, en la enfermedad de Parkinson, condiciones espásticas en la esclerosis lateral amiotrófica, procesos autoinmunes en la encefalitis y la esclerosis múltiple, mielitis transversal, síndrome de Devic, infecciones virales, infecciones bacterianas, infecciones parasitarias, infecciones fúngicas, infarto hemisférico en el síndrome postapoplético con paraparesia espástica hereditaria, infarto del tronco cerebral, infarto de la medula espinal, migraña, trauma al sistema nervioso central, lesiones hemisféricas, lesiones del tronco cerebral, hemorragia del sistema nervioso central, hemorragia intracereberal, hemorragia subaraenoidea, hemorragia subdural, hemorragia intrapersonal, en neoplasias, tumores hemisféricos, tumores del tronco cerebral, tumores de la médula espinal, ronquido (WO 2000/033863). En cuanto a los detalles y los síntomas, véase, por ejemplo, Jost 2007, Drugs 67(5), 669 o Dressler 2000 en Botulinum Toxin Therapy, Thieme Verlag, Stuttgart, Nueva York.
En otro aspecto de la invención, la composición es una composición cosmética la cual puede ser formulada como se describe anteriormente para las composiciones farmacéuticas. Para una composición cosmética, igualmente, se contempla que el compuesto de la presente invención este se use, en un aspecto, en forma sustancialmente pura. Las composiciones cosméticas, en un aspecto, deben ser aplicadas de forma intramuscular. En otro aspecto adicional de la invención, las composiciones cosméticas que comprenden la neurotoxina pueden ser formuladas como una solución antiarrugas.
En otro aspecto, la composición farmacéutica comprende el anticuerpo o el inhibidor de la presente invención. Ya el polipéptido de la presente invención es responsable de activar las neurotoxinas clostridiales, el anticuerpo será útil para reducir el efecto tóxico observado durante la infección con las clostridial. Por lo tanto, los anticuerpos de la presente invención pueden, en un aspecto, ser usados para tratar las infecciones por Clostridia, incluyendo Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium baratii, Clostridium butyricum, Clostridium sporogenes, Clostridium acetobutylicum, Clostridium haemolyticum, Clostridium novyi y Clostridium oedematiens. Además, los anticuerpos de la presente invención pueden, en otro aspecto, ser usados para el tratamiento de los síntomas asociados con dicha infección. Además, dichos anticuerpos pueden ser usados en el tratamiento de las condiciones o los síntomas asociados con las condiciones, en donde, las condiciones se seleccionan de Botulismo, Tétanos, Colitis pseudomembranosa, Envenenamiento por alimentos y los similares.
En otro aspecto, la composición farmacéutica comprende los polipéptidos activos proteolíticamente de la presente invención. Dicha composición farmacéutica puede ser usada, en un aspecto, para escindir proteoliticamente los polipéptidos involucrados en la conglutinación, en particular, para tratar a los pacientes con hipocoaglutinación. En otro aspecto, la composición farmacéutica puede ser usada como fibrinolitico, en particular para tratar a los pacientes con infarto al miocardio, embolismo pulmonar, tromboembolismo venoso profundo, es decir, para remover los coágulos sanguíneos. También, se contempla el uso de la composición farmacéutica en el tratamiento de la apoplejía. Además, en otros aspectos, la composición farmacéutica puede ser usada en el tratamiento de la insuficiencia pancreática exocrina para reemplazar ya sea la tripsina, la quimotripsina, o la pepsina. Además, en otros aspectos, la composición farmacéutica puede ser usada en el tratamiento de pacientes afectados por reacciones inflamatorias, en el tratamiento de los pacientes de cáncer, en particular para escindir proteoliticamente los antígenos de tumores expuestos a la superficie. Además, en otro aspecto, la composición farmacéutica puede ser usada en el tratamiento del papiloma .
La presente invención también se refiere a un método para detectar un inhibidor, que comprende la etapa de (a) poner en contacto el polipéptido activo proteoliticamente de la presente invención con un sustrato conocido, y opcionalmente con un inhibidor putativo; y (b) determinar el efecto del inhibidor putativo sobre la conversión del sustrato en los productos de escisión, en donde una reducción en la cantidad de productos de escisión es indicativa del efecto inhibidor del inhibidor putativo. En un aspecto, el inhibidor putativo es un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las SEC ID NOs: 4 a 25, en donde, al menos un aminoácido básico de dicha secuencia de aminoácidos se reemplaza con un aminoácido no básico. En un aspecto adicional, dicho péptido comprende una o más modificaciones químicas. En otro aspecto, el inhibidor es un peptidomimético de dicho péptido. En otro aspecto, el inhibidor putativo es parte de un microarreglo de compuestos químicos, es decir, una colección de compuestos químicos orgánicos. En aun otro aspecto, el inhibidor es el anticuerpo de la presente invención. Este método es útil para identificar compuestos capaces de inhibir los polipéptidos activos proteolíticamente de la presente invención. La detección inicial se puede basar en, por ejemplo, un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las SEC ID NOs: 4 a 25. Los péptidos capaces de inhibir los polipéptidos de la presente invención pueden ser modificados con el fin de aumentar la inhibición. Las modificaciones incluyen sustituciones de aminoácidos o modificaciones químicas. Típicamente, este método se lleva a cabo poniendo en contacto los polipéptidos de la presente invención con un sustrato conocido, en presencia y ausencia del inhibidor putativo (etapa (a) del método) y al comparar el efecto del inhibidor putativo sobre la conversión del sustrato en los productos de escisión. Una reducción de la velocidad de conversión en presencia del inhibidor putativo es indicativa de un efecto inhibidor.
La presente invención también se refiere a un inhibidor de los polipéptidos activos proteoliticamente de la presente invención, en donde dicho inhibidor es (a) un inhibidor que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de las SEC ID NOs: 4 a 25, en donde un aminoácido básico contenido en la misma se reemplaza con un aminoácido no básico; o (b) el anticuerpo de la presente invención.
Todas las referencias citadas en esta especificación se incorporan como referencia en la misma con respecto al contenido completo de su descripción y el contenido de la descripción mencionado específicamente en esta especificación.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Prueba de actividad de las fracciones recolectadas de HiPrep 16/10 Q FF Fracciones de 5 ml recolectadas de la corrida de HiPrep 16/10 Q FF se analizaron en cuanto a su actividad enzimática incubando 2 mg de scBoNTA (carril 2) durante 1 h a 37°C y posteriormente SDS-PAGE al 10%. Carril 1: marcador de bajo peso molecular (LMW): 116 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 35 kDa.
Figura 2: Análisis de las fracciones recolectadas de SEC (HiLoad 16/10 Superdex 75) con relación al contenido de nBH con un peso molecular de ~37.3 kDa mediante SDS-FAGE al 12.5%.
Las fracciones 9 a 11 contenían la mayoría de la nBH (Carril 1: LMW: 116 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 35 kDa, 18.4 kDa, 14.4 KDa) Figura 3: Análisis con SDS-PAGE al 12.5% para la determinación de la pureza y concentración de proteína de tres lotes de purificación de nBH.
Carril 1, LMW (116 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 35 kDa, 25 kDa, 18.4 kDa, 14.4 kDa); carril 2, lote TE311206 de nBH (192 ng/ml de NT02CB1446/CBO1444 madurados, aminoácidos 254-594 de Genbank acc. CAL82987.1, PM: 38.6 kDa); carril 3, Liste TIK301009 de nBH (130 ng/ml de NT02CB1447/CBO1445 madurado, SEC ID NO: 1, aminoácidos 249-581 de Genbank acc. CAL82988.1, PM: 37.3 kDa); carril 4, Lote TIK280509 de nBH (114 ng/m? de NT02CB1447/CBO1445 madurado, SEC ID NO: 1, aminoácidos 249-581 del Genbank acc. CAL82988.1, PM: 37.3 kDa).
Figura 4: Reporte del análisis del espectro de ESI-MSIM La banda de proteína de 38.6 kDa del lote de nBH TE311206 fue identificada como NT02CB1446/CBO1444 con un puntaje de Mascot de 725 una cobertura de la secuencia MS/MS del péptido de 29.6% sobre el marco de lectura abierto (ORF) completo. No se identificó el péptido (recuadros grises, péptido MS identificado; Recuadros rojos, aminoácidos y-/iones b del péptido identificados después del decaimiento de MS/MS) fue identificado derivado de los 253 aminoácidos de la N-terminal. El análisis de MS/MS del lote TE311206 muestra una cobertura de la secuencia de 52% de acuerdo con los aminoácidos 254-594 de la C-terminal que forman la nBH.
Figura 5: Reporte del análisis del espectro de ESI-MS/MS.
La banda de proteína de 37.3 kDa del lote de nBH TIK301009 se identificó como NT02CB1447/CB01444 un puntaje de Mascot de 555 y una cobertura de la secuencia de MS/MS del péptido de 28.4% sobre el marco de lectura abierto (ORF) completo. Excepto uno todos los péptidos (recuadros grises; péptido de MS identificado; recuadros rojos: Recuadros rojos, aminoácidos y-/iones b del péptido identificados después del decaimiento de MS/MS) identificados se derivan de los 333 aminoácidos de la C-terminal. El análisis de MS/MS del lote TIK301009 mostró una cobertura de la secuencia de 49.5% de acuerdo con los aminoácidos 249-581 de la C-terminal que forman la nBH.
Figuras 6A-6B: Comparación de la actividad proteolítica dependiente de la concentración de nBH derivada de tres lotes de purificación. 6A Una SDS-PAGE al 12.5% de la prueba de actividad que analiza la nBH derivada de los lotes TIK301009, TIK280509 y TE311206 usando las siguientes diluciones de nBH concentrada: 1:10, 1:30, 1:100, 1:300, 1:1000. El ensayo se llevó a cabo incubando 1 mg de scBoNT/A y 2 ml de dH2O y 1 ml de la nBH diluida correspondientemente durante 60 min a 37°C. Para el análisis de SDS-PAGE, 3 m? de un amortiguador de reducción de 4 x SDS Laemmli se agregaron a un volumen final de 10 m?.150 kDa de scBoNT/A se escindieron en una cadena pesada de 100 kDa y la cadena ligera de 50 kDa. 6B La densidad óptica de las bandas de proteína de la cadena pesada, la cadena ligera y scBoNT/A se cuantificaron y la suma de las bandas de los productos de cadena ligera y pesada se dividió entre la suma de las bandas de proteína de LC, HC y scBoNT/A. la mayor dilución del primer polipéptido aumenta la velocidad de escisión. La actividad proteolítica específica de tres diferentes lotes es casi idéntica.
Figuras 7A-7C: Escisión dependiente del tipo de la scBoNTA/A de tipo silvestre y mutantes que contienen una horquilla modificada por nBH. 7A Modificación de la secuencia de horquilla. En las scBoNTAS Throm todos los residuos de lisina se removieron y la secuencia de reconocimiento de trombina LVPRGS se insertó en tanto que en scBoNT Res la horquilla carece de todos los aminoácidos básicos. El acortamiento de la horquilla a ocho residuos pequeños de cinco aminoácidos con cadenas laterales voluminosas da scBoNTAS (GGSG)2 y scBoNTAS FQWYI, respectivamente. En scBoNTAS CGS-C la horquilla completa se elimina y el puente disulfuro que forma las cisteínas se remplaza con glicina y serina. 7B Análisis de SDS-PAGE de la escisión dependiente del tiempo de scBoNT/A de tipo silvestre y mutantes. 7C scBoNTAS de tipo silvestre se activa por nBH en una manera dependiente del tiempo, en una cadena ligera y la cadena pesada dentro de 120 min. La carencia de lisinas y la inserción de un solo residuo de arginina prolonga la escisión de la horquilla (scBoNTAS Throm). Una horquilla que carece de cualquier residuo básico puede ser escindida aun (scBoNTAS Res). El acortamiento de la horquilla al péptido de 8mer, introducir cinco aminoácidos con cadenas laterales voluminosas o eliminar la horquilla completa da una scBoNT/A escindible.
Figuras 8A-8B: Análisis de MS/MS de los productos de escisión de 50 kDa y 100 kDa tras la digestión de scBoNT/A con nBH. 8A Análisis del producto de escisión de 50 kDa el cual se identificó como la cadena ligera de BoNT/A con un puntaje de Mascot de 1460. El péptido más atribuible a la C-terminal cubre los aminoácidos G433 a K438 los cuales corresponden a la C-terminal observada fisiológicamente de BoNT/A LC. 8B Análisis del producto de escisión de 100 kDa el cual se identificó como la cadena pesada de BoNT/A con un puntaje de Mascot de 96. El péptido más atribuible a la N-terminal cubre los aminoácidos A449 a K456 los cuales corresponden a la N-terminal observada fisiológicamente de BoNT/A HC.
Figuras 9A el contenido de proteína (mg/ml) del anti-nBH- IgY de tres acerbos posteriores se analizaron mediante SDS- PAGE al 12.5%. 9B ELISA: Placas de microtitulación Nunc Maxisorp F96 se revistieron con nBH de varios lotes (500 ng/ml) en PBS, durante toda la noche a 4°C y entonces se bloquearon durante 1 hora con amortiguador de bloqueo de PBS contendiendo 0.1% de Tween-20 y 2% de leche descremada sin grasa. Después del lavado, la dilución de cada acerbo (10 mg/ml en amortiguador de bloqueo) se agregó durante 1 h y se detectó usando IgY anti-pollo, de burro, etiquetado con biotina, streptavidina-peroxidasa de rábano (ambas de Dianova, Hamburgo, Alemania) y 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (Sigma).
Figuras 10A-10B: 10A Expresión recombinante y aislamiento de la BH 1-581 inactiva (63 kDa) mediante Talón IMAC. El análisis de SDS-PAGE al 10% de las fracciones de Talón IMAC (LMW: 116 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 35 kDa, 25 kDa; SS34, lisado transparente; TD, flujo; W, fracción de lavado; E1-E7, fracciones eluídas con imidazol 1 a 7). 10B No se observó la endoproteolisis de la scBoNT/A en LC (50 kDa) y HC (100 kDa) con iBH recombinante (SEC ID NO: 2; "E"; 63 kDa), a 37°C después de 1 h (carril 6) (LMW: 116 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 35 kDa, 25 kDa).
Figuras 11A-11C: Uso de la BoNTHidrolasa (nBH) activa, purificada para obtener los polipéptidos procesados proteolíticamente 11A 200 mg de la scBoNT/A purificada, recombinante se incubaron con 350 ng de la BoNTHidrolasa activa purificada durante 12 min a 37°C. Para detener la reacción se extrajo la nBH mediante SEC (columna Superdex 200 10/300 GL, amortiguador: NaP 50 mM, pH 7.5, NaCl 150 mM, volumen de la muestra = 0.3 mi, velocidad de flujo = 0.25 ml/min) y la cantidad de escisión se abalizó mediante SDS-PAGE al 10%.11B La fracción 1 (1800 ml) que contenía -40% de BoNT/A procesada se incubo con 350 ng de BoNTHidrolasa activa purificada, durante 15 min y se concentró a 300 ml mediante ultrafiltración. Para detener finalmente la reacción, la nBH se extrajo mediante SEC (columna Superdex 200 10/300 GL, amortiguador: NaP 50 mM, pH 7.5, NaCl 150 mM, volumen de la muestra = 0.3, velocidad de flujo = 0.25 ml/min) y la cantidad de la escisión se analizó mediante SDS-PAGE al 10%.11C Las fracciones 1 y 2 (1800 m?) que contenía - 80 de BoNT/A procesada se combinaron y se incubaron con 120 ng de BoNTHidrolasa activa purificada a 37°C y se concentraron a 300 m? mediante ultraf iltración. Para detener finalmente la reacción la nBH se extrajo mediante SEC (columna Superdex 20 10/300 GL, amortiguador, NaP 50 mM pH 7.5, NaCl 150 mM, volumen de la muestra = 0.3 mi, velocidad de flujo 0.25 ml/min) y la cantidad de escisión se analizó mediante SDS-PAGE al 10%. A se obtuvo > 95% de BoNT/A (SEC ID NO: 3) procesada.
LISTADO DE SECUENCIAS SEC ID NO: 1: polipéptido activo proteolíticamente derivado de la cepa ATCC 3502 de Clostridium botulinum, número de acceso al GenBank: "CAL82988.1", que carece de los 248 residuos de aminoácidos de la N-terminal SEC ID NO: 2: polipéptido inactivo proteoliticamente derivado de la cepa ATCC 3502 de Clostridium botulinum, Número de acceso al GenBank: CAL82988.1 SEC ID NO: 3: BoNT/A de ATCC 3502 Genbank acc.
"AAA23262" SEC ID NO: 4: Horquilla de BoNT/Al SEC ID NO: 5: Horquilla de BoNT/A2/A6 SEC ID NO: 6: Horquilla de BoNT/A3 SEC ID NO: 7: Horquilla de BoNT/A3 SEC ID NO: 8: Horquilla de BoNT/A4 SEC ID NO: 9: Horquilla de BoNT/A5 SEC ID NO: 10: Horquilla de BoNT/A7 SEC ID NO: 11: Horquilla de BoNT/Bl/B4bv/B6 SEC ID NO: 12: Horquilla de BoNT/B2/B3 SEC ID NO: 13: Horquilla de BoNT/B5np SEC ID NO: 14: Horquilla de BoNT/C/CD SEC ID NO: 15: Horquilla de BoNT/D SEC ID NO: 16: Horquilla de BoNT/DC SEC ID NO: 17: Horquilla de BoNT/El-E5 SEC ID NO: 18: Horquilla de B0NT/E6 SEC ID NO: 19: Horquilla de B0NT/FI/F6 SEC ID NO: 20: Horquilla de BoNT/F2/F3 SEC ID NO: 21: Horquilla de BoNT/F4 SEC ID NO: 22: Horquilla de BoNT/F5 SEC ID NO: 23: Horquilla de BoNT/F7 SEC ID NO: 24: Horquilla de BoNT/G SEC ID NO: 25: Horquilla de TeNT SEC ID NO: 26: secuencia de ácido nucleico que codifica la SEC ID NO: 1 SEC ID NO: 27: secuencia de ácido nucleico que codifica la SEC ID NO: 2 Los siguientes Ejemplos ilustran la invención, y en absoluto, deben ser considerados como limitantes de su ámbito.
EJEMPLOS Ejemplo 1: Purificación y caracterización de la BoNTHidrolasa (nBH) nativa, la cual escinde específicamente la BoNT/A de cadena individual en su forma activa de cadena doble (1) Prueba de sistema/actividad de lectura: Para detectar y purificar específicamente la actividad enzimática que hidroliza la neurotoxina botulínica A (BoNT/A) en la cadena ligera (LC) de 50 kDa y la cadena pesada (HC) de 100 kDa en los sobrenadantes de cultivo de C. botulinum y entre las etapas de cromatografía se expresó la BoNT/A de 50 kDa como el polipéptido de cadena individual (se) en E. coli. La incubación de la scBoNT/A recombinante con la actividad enzimática apropiada (nBH) debe usar una LC de 50 kDa y una HC de 10 kDa visualizada por SDS-PAGE de 10-13%. (2) Expresión de la proteasa clostridial: A una colonia individual de la cepa ATCC 3502 de C. botulinum se inoculó en 100 mi de medio de infusión de cerebro corazón (BHI) y el cultivo se incubó durante toda la noche a 37°C bajo condiciones anaeróbicas.10 mi del cultivo de O/N se inoculó en 11 de medio de BHI y se incubó de forma anaeróbica durante 48-72 h. (3) Precipitación con sulfato de amonio: El sobrenadante de cultivo de 11 se cosechó mediante centrifugación (4°C, 6500xg, 25 min). Se agregó sulfato de amonio a una concentración final de 85% (aquí 575 g), la suspensión se agitó durante 6 horas a 4°C y posteriormente se sometió a centrifugación (4°C, 6500xg, 30 min). El precipitado de sulfato de amonio comprimido se disolvió en un volumen pequeño (aquí 5 mi) de NaP 5 mM pH 7.5 y se sometió a diálisis contra NaP 50 mM, NaCl 150 mM pH 7.5. Finalmente, el dializado se sometió a centrifugación (4°C, 40000xg, 60 min) y el sobrenadante se usó para la IEC. (4) Cromatografía de intercambio iónico (IEC, columna HiPrep 16/10 Q FF): El sobrenadante de (3)(Figura 1, carril 3) se aplicó a la columna de intercambio de aniones HiPrep 16/10 Q FF equilibrada y se corrió con un amortiguador que contenía NaP 50 mM pH 7.5, NaCl 150 mM. La corrida se llevó a cabo a una velocidad de flujo de 1 mi/min. Se llevó a cabo una prueba de actividad al incubar 5 ml de cada fracción con 2 mg de scBoNTA durante 1 h a 37°C y el análisis posterior en SDS-PAGE (Figura 1). Las fracciones 6-24 se combinaron y su volumen se concentró a 3.5 mi usando ultrafiltración (Amicon-Ultra MWCO 10,000). (5) Cromatografía de exclusión de tamaño (SEC, HiLoad 16/60 Superdex 200): Posteriormente, la solución de proteína concentrada de (a) se cargó en una columna HiLoad 16/60 Superdex 200, se equilibró con NaP 50 mM pH 7.5, NaCl 150 mM. La separación se llevó a cabo a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Las fracciones con un volumen de retención entre 80 mi y 100 mi se analizaron usando la prueba de actividad (1) y las fracciones apropiadas que contenían la actividad enzimática (nBH) se combinaron (~10 mi) y se concentraron a 3 mi mediante ultrafiltración. Posteriormente se agregó sulfato de amonio a una concentración final de 12.5%= 500 mM (+0.2g). (6) Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC, HiTrap Fenil Sefarosa): La nBH se enlazó a la Fenil Sefarosa en amortiguador A (NaP 50 mM pH 7.5, sulfato de amonio 500 M). La nBH enlazada se eluyó al reducir la cantidad de sulfato de amonio debido a un gradiente de aumento lineal con amortiguador B (NaP 50 mM pH 7.5) a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Todas las fracciones que contenían proteína se analizaron usando la prueba de actividad (1) y las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron mediante ultrafiltración a 3.5 mi. El amortiguador de la solución se ajustó a NaP 50 mM pH 7.5; NaCl 150 mM. (7) SEC (HiLoad 16/60 Superdex 75): Finalmente, la nBH se purificó mediante SEC usando la columna HiLoad 16/60 superdex 75 a NaP 50 mM pH 7.5, NaCl 150 mM y una velocidad de flujo de 1 ml/min. Las fracciones con un volumen de retención entre 70 mi y 80 mi se analizaron mediante SDS-PAGE al 12.5% (Figura 2) y las fracciones 8-12 que contenían la nBH la cual migra a ~37.3 kDa se combinaron (~10 mi) y se concentraron a 1 mi mediante ultrafiltración. (8) la proteína prominente que migra a aproximadamente 37.3 kDa (nBH) se analizó mediante secuenciamiento del péptido de la N-terminal de acuerdo con el protocolo de degradación de Edman. La secuencia del péptido identificado es V Q G Q S V K G V G y corresponde a los primeros diez residuos de la SEC ID NO: 1. (9) Dos lotes de nBH (NT02CB1447, 37.3 kDa, Figura 3, carril 3: TIK301009, carril 4: TIK280509) se aislaron de forma reproducible de acuerdo con el procedimiento como se describe anteriormente. Siguiendo las modificaciones del procedimiento de aislamiento da la isoforma NT02CB1446 de la nBH (38.6 kDa, Figura 3, carril 2, lote TE311206): (i) cultivo de crecimiento de C. botulinum: 18 h en lugar de 48 a 72 h; (ii) variación de las etapas cromatográficas: IEC -> SEC Superdex 75 -> HIC Fenil Sefarosa en lugar de IEC -> SEC Superdex 200 -> HIC Fenil Sefarosa -> SEC Superdex 75.
Ejemplo 2: Identificación de la secuencia de nBH de C. botulinum mediante espectrometría de masas (MS) (1) Digestión tríptica: Las bandas de proteína que migran a aproximadamente 30 kDa (nBH) en SDS-PAGE se cortaron para la digestión triptica y se destiñeron al agitarlas suavemente en NH4HCO3, acetonitrilo al 50% durante 30 min a 37°C. El desteñido se repitió Hasta que las manchas de gel estuvieron claras. El acetonitrilo (100%) se agregó y se removió después de 3 min. Posteriormente, las manchas se secaron en un sistema Speed Vac (Eppendorf, Alemania). Se agregó tripsina (10 ng/ml) en NH4HCO350 mM y se incubó en hielo por 1 h. Entonces, la solución remanente de tripsina se removió, se agregó un volumen pequeño de NH4HCO350 mM y la digestión se llevó a cabo a 37°C durante toda la noche. El sobrenadante se recolectó y los fragmentos del gel se extrajeron usando TFA al 5%, acetonitrilo al 10% dos veces. Todos los fluidos se combinaron en un Speed Vac y los péptidos extraídos se almacenaron a 4°C. (2) MS de desorción/ionización mediante láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF/TOF): Las muestras se analizaron en un espectrómetro de masas MALDI-TOF/TOF (Ultraflexl Bruker Daltonik GmbH) en el modo lineal con un voltaje de aceleración de 25 kV. Las masas se detectaron desde 700 m/z a 4,500 m/z. Las muestras (2 ml) se cocristalizaron con 2 m? de solución de ácido sinapínico que contenía 50% de acetonitrilo y 0.2% de ácido acético trifluórico (TFA) directamente sobre una placa objetivo de MALDI de acero inoxidable. Se recolectaron 500 disparos de láser para cada muestra. (3) Separación del peptido mediante cromatografía en fase invertida: La separación del péptido se realizó mediante cromatografía en fase invertida usando un sistema nano-HPLC (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania) que consiste de un muestreador automático y una bomba de gradiente. Las muestras se disolvieron en amortiguador A (5% de acetonitrilo, 0.1% de ácido fórmico) y una alícuota de hasta 10 ml se inyectó en una columna C18 (Zorbax SB-C18, 5 mm, 300 A, diámetro interno de 0.5 mm, longitud 15 cm) a una velocidad de flujo de 5 ml/min. Después de la carga, la columna se lavó durante 15 min con amortiguador a y los péptidos se eluyeron usando un gradiente de eluyente A y eluyente B (70% (v/v) de acetonitrilo en ácido fórmico al 0.1% (v/v)) desde 0% a 100% de eluyente B en 75 min . (4) Interfaz de ionización por electroaspersión (ESI) y espectrometría de masas con trampa de iones: La salida de HPLC se conectó directamente a la fuente de nanoESI de un espectrómetro de masas con trampa de iones y se usó el aspersor de líquido auxiliar coaxial (Agilent Technologies). El capilar de descarga se sujetó mediante una aguja de acero circundante y se observó 0.1 a 0.2 mM fuera de esta. La aspersión se estabilizó mediante N2 como el gas nebulizador (5 1/min). El voltaje de la ionización se ajustó a 4,500 V y se aplicó gas seco a 5 psi y 250°C. Los espectros se recolectaron con un espectrómetro de masas con trampa de iones Esquire3000+ (Bruker Daltonik) a una velocidad de barrido de 13,000 m/z por segundo. Usando la ESI en el modo positivo, se adquirieron los espectros de masas de 50 a 1600 m/z en el modo de barrido y los datos dependientes de la conmutación entre los análisis Ms y MS/MS. Para aumentar la calidad de los espectros de MS/MS solo se seleccionaron dos iones precursores de un espectro para el análisis de MS/MS y la exclusión activa se ajustó a 2 min para excluir los iones precursores que ya habían sido medidos. (4) Procesamiento de datos: El procesamiento de datos se llevó a cabo con los paquetes informáticos Data Analysis (versión 3.0) y BioTools (versión 3.0) (Bruker Daltonik). La identificación de las proteínas se realizó usando el programa MASCOT (versión 2.1) y la base de datos MSDB (Matriz Science, Londres UK). (5) Resultados: Tabla 2: nBH identificada mediante MS La banda de proteína del carril 2 (lote de nBH TE311206) se identificó como NT02CB1446/CBO1444 con un puntaje de Mascot de 725 y una cobertura de las secuencia de MS/MS del péptido de 29.6% sobre el marco de lectura abierto (ORF) completo. No se identificó el péptido derivado de los 253 aminoácidos de la N-terminal (Figura 4). El análisis de MS/MS del lote TE311206 desplegó una cobertura de la secuencia de 52% de acuerdo con los aminoácidos 254-594 de la C-terminal que forman la nBH.
Las bandas de proteína de 37.3 kDa del carril 3 (lote TIK301009 de nBH) y el carril 4 (lote TIK280509 de nBH) se identificaron como NT02CB1447/CBO1445 con un puntaje de Mascot de 555 y 609, respectivamente. Excepto uno, todos los péptidos identificados se derivan de los 333 aminoácidos de la C-terminal (Figura 5). El análisis de MS/MS del lote TIK301009 despliega una cobertura de la secuencia de 49.5% de acuerdo con los aminoácidos 249-581 de la C-terminal que forma la nBH.
Ejemplo 3: Caracterización de la especificidad enzimática de la nBH (1) Se comparó la actividad proteolítica dependiente de la concentración de la nBH derivada de tres lotes de purificación (Figura 6A y 6B). Una prueba de actividad que analiza la nBH derivada de los lotes TIK301009, TIK280509 y TE311206 usando varias diluciones de nBH demuestra que las diluciones más altas reducen la velocidad de escisión. La actividad proteolítica de los tres diferentes lotes es casi idéntica indicando que la isoforma madurada NT02CB1446 (TE311206) despliega una actividad específica similar que la NT02CB1447 madurada (SEC ID NO: 1). (2) La escisión dependiente del tiempo de la scBoNT/A de tipo silvestre y mutantes por nBH se analizó empleando la prueba de actividad (Figura 7). Las scBoNTAS de tipo silvestre se activan por la nBH en una manera dependiente del tiempo, en la cadena ligera y la cadena pesada, en 120 min, en más de 95%. La secuencia de la horquilla se modificó para caracterizar el sitio de escisión. En las scBoNTAS Throm todos los residuos de lisina se remueven y se inserta la secuencia de reconocimiento de trombina LVPRGS la cual prolonga la velocidad de escisión. En la scBoNT Res la horquilla carece de todos los aminoácidos básicos lo cual retarda drásticamente la hidrólisis completa indicando una preferencia de reconocimiento fuerte de la nBH para los residuos básicos como la lisina y la arginina en el sitio de escisión. Además, la accesibilidad de la nBH a la horquilla se deteriora al acortar la horquilla a ocho residuos de aminoácidos o cinco residuos de aminoácidos con cadenas laterales voluminosas (scBoNTAS(GGSG)2 y scBoNTAS FQWYI). (3) El análisis de MS/MS del producto de escisión de 50 kDa tras la digestión de la scBoNT/A con nBH exhibe que el péptido más atribuible a la C-terminal cubre los aminoácidos G433 a K438 los cuales corresponden a la C-terminal de BoNT/A LC observada fisiológicamente (Figura 8A). El análisis de los productos de escisión de 100 kDa el cual se identificó como la cadena pesada de la BoNT/A demuestra que el péptido más atribuible a la N-terminal cubre los aminoácidos A449 a K456 los cuales corresponden a la N-terminal de la BoNT/A HC (Figura 8B) observada fisiológicamente. Por lo tanto, la nBH aislada proporciona la BoNT/A procesada fisiológicamente de hidroliza preferiblemente la C-terminal de los enlaces peptidicos a residuos de lisina y arginina.
Ejemplo 4: Conservación evolutiva de la BoNTHidrolasa y sus isoformas El análisis de la secuencia de proteínas de la SEC ID NO: 2 (Genbank acc. CAL82988.1/YP_001253958.1)revela tres dominios conservados. Los residuos 16-573 corresponden a una metaloproteasa de zinc (elastasa) o LasB involucrada en el transporte y el metabolismo de aminoácidos con puntaje Blast de 738. Los residuos 148-212 corresponden a un propeptido de peptidasa y el dominio YPEB o PepSY (puntaje de Blast 97. Los residuos 336-573 son parte de la familia de la peptidasa M4 que incluye termolisina, protealisina, aureolisina y las proteasas naturales (puntaje de Blast 803). El secuenciamiento del genoma de C. botulinum ATCC 3502 ha revelado la existencia de seis ORFs que codifican las isoformas de iBH (Sebaihia et al., 2007, Genome Res. 17(7):1082-1092). Otros datos del genoma están disponibles para 10 cepas de C. botulinum del grupo I, así como C. sporogenes que no secreta BoNT, todas las cuales contienen entre cinco a siete ORFs que codifican la iBH. La nBH (SEC ID NO: 1) comparte un mínimo de 64% de identidad de la secuencia con las otras 63 isoformas.
Ejemplo 5: Generación de los anticuerpos específicos para la BoNTHidrolasa (1) Generación de IgY: Gallinas de dieciséis semanas de edad [ISA Brown y Lohmann Selected Leghorn (LSL), Spreenhagener Vermehrungsbetrieb fur Legehennen GmbH, Bestensee, Alemania] se mantuvieron en jaulas individuales, construidas exclusivamente para el mantenimiento de pollos (Ebeco, Castrop-Rauxel, Alemania). El alimento (ssniff Legehühner-Zucht 1 y 2; ssniff Spezialitaten GmbH, Soest, Alemania) y el agua estuvieron disponibles ad libitum, y las gallinas comenzaron a poner huevos entre las 23 y 25 semanas de edad. Los huevos se recolectaron diariamente, se etiquetaron, y se almacenaron a 4°C hasta que estos fueron procesados adicionalmente. Todo el mantenimiento animal y los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directivas de las autoridades locales. Berlín (No. H0069/03). Las gallinas se inmunizaron y se les aplicaron refuerzos a través de la ruta i.m. (músculo pectoral, lados izquierdo y derecho) un total de 10 veces durante un periodo de 1 año, con intervalos entre las semanas 4 y 8. El intervalo usado se basó en trabajos previos que no demostraron células de memoria demostrables hasta al menos 3 semanas después de la inmunización (Pei y Collisson, 2005). La concentración de antígeno usada fue aproximadamente de 20 mg por inyección (nBH). No más de 500 ml de solución de antígeno se inyectaron por inmunización. Se usó adyuvante completo de Freund para la primera inmunización, y se usó FIA para las inyecciones de refuerzo posteriores. El método para la purificación de IgY se adaptó de Polson et al., (1980). En concreto, la yema de los huevos se diluyó 1:2 con PBS estéril (pH 7.4, Roche, Mannheim, Alemania). Para la eliminación de los lipidos y la lipoproteina, se agregó polietilenglicol (PEG) 6000 al 3.5% (p/V) (Roth, Karlsmhe, Alemania). Después de la agitación suave seguida por centrifugación (10,000xg durante 20 min a 4°C), el sobrenadante se decantó y se agregó PEG 6000 sólido a una concentración final de 12% (p/v). Esta mezcla se sometió entonces a centrifugación como se menciona anteriormente. El precipitado se disolvió en 10 mi de PBS, se agregó PEG al 12% (p/vol), y la solución se sometió a centrifugación. Finalmente, el precipitado se disolvió en 1.2 mi de PBS, se transfirió a un dispositivo de microdiálisis (QuixSep, Roth, Alemania) y se sometió a diálisis contra PBS a 4°C. El contenido de proteina se analizó mediante SDS-PAGE al 12.5% (Figura 9A) y se midió fotometricamente a 280 nm y se calculó de acuerdo con la lcy de Lambert-Beer con un coeficiente de extinción de 1.33 para el IgY. (2) ELISA: Placas de microtitulación Nunc Maxisorp F96 (VWR International GmbH, Darmstadt, Alemania) se revistieron con nBH de varios lotes (500 ng/mL) en PBS durante toda la noche, a 4°C y después se bloquearon durante 1 h con amortiguador de bloqueo de PBS que contenia 0.1% de Tween-20 y 2% de leche descremada sin grasa (Merck, Darmstadt, Alemania). Después del lavado, una dilución de IgY (10 mg/ml en amortiguador de bloqueo) se agregó durante lh y se detectó usando IgY anti pollo, de burro, etiquetado con biotina, estreptavidina-peroxidasa de rábano (ambos de Dianova, Hamburgo, Alemania) y 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (Sigma). La nBH detectada se ilustra en la Figura 9B. (3) Transferencia Western: La nBH se separó mediante SDS- PAGE al 12.5%, y se transfirió sobre una membrana de fluoruro de polivinileno (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania) usando las téenicas estándar de inumotransferencia. La membrana se bloqueó durante toda la noche a 4°C, y se incubó con IgY (1:5,000 en amortiguador de bloqueo) por 1 h. Después del lavado, la membrana se sondeó con IgY anti-pollo, de burro, etiquetado con biotina, durante 30 min y se desarrolló usando fosfatasa alcalina y CDP-Star (Perkin Elmer, Waltham, MA).
Ejemplo 6: Expresión Recombinante de BoNTHidrolasa (1) Construcciones de plásmidos: Las porciones genéticas que codifican la BH nativa (SEC ID NO: 1) y este propeptido (SEC ID NO: 2) se amplificaron mediante PCR usando los oligonucleótidos adecuados y ADN genómico de C. botulinum ATCC 3502, fusionado con un oligonucleótido que codifica la His6Tag e insertado en pQE3 (Qiagen) que proporciona el plásmido de expresión pQ-BHl445H6-249-581 y pQ-BH1445H6-1-581 respectivamente. Las secuencias de nucleótidos se verificaron mediante secuenciamiento de ADN. (2) Purificación de las proteínas recombinantes: nBH e iBH, fusionadas a una HisTag6 de carboxilo-terminal, se produjeron utilizando la cepa M15pRep4 de E. coli (Qiagen) durante diez horas de incubación a la temperatura ambiente, y se purificaron sobre perlas de Talon-sefarosa (Clontech Inc.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las fracciones que contenían las proteínas deseadas se combinaron, se congelaron en nitrógeno líquido, y se mantuvieron a -70°C. La iBH se aisló como la proteína recombinante con un PM de 63 kDa (Figura 10A). La inactividad de la iBH se demostró usando la prueba de actividad: después de Ih a 37°C no se hidrolizo la scBoNT/A wt en LC y HC (Figura 10B).
Ejemplo 7: Inhibición de la BoNTHidrolasa (1) Identificación de los inhibidores del péptido de BH: los péptidos basados en las SEC ID NOs: 4 a 25 serán sintetizados careciendo de uno o más residuos básicos. Cada péptido se agregará a la mezcla de acurdo con la prueba de actividad. Un péptido que es capaz de reducir la cantidad de la scBoNT/A procesada prolonga la duración requerida para procesar completamente la scBoNT/A o bloquea el procesamiento de la scBoNT/A se considera como un inhibidor de la nBH. (2) Detección de los inhibidores con base en anticuerpos.
Los anticuerpos generados contra los epítopes derivados de nBH como IgY del Ejemplo 5 se incuban con nBH y posteriormente se someten a la prueba de actividad. Un anticuerpo que es capaz de reducir la cantidad de scBoNT/A procesada, prolonga la duración requerida para procesar completamente la scBoNT/A o bloquea el procesamiento de la scBoNT/A se considera como un inhibidor de la nBH.
Ejemplo 8: Uso de la BoNTHidrolasa (nBH) activa, purificada para obtener polipeptidos procesados proteoliticamente (1) 200 mg de scBoNT/A recombinante, purificada se incuban con 350 ng de BoNTHidrolasa activa, purificada, durante 12 min a 37°C. Para detener la reacción la nBH se extrae mediante SEC (columna Superdex 200 10/300 GL, amortiguador: NaP 50 mM pH 7.5, NaCl 150 mM, volumen de la muestra = 0.3 mi, velocidad de flujo = 0.25 ml/min) y la cantidad de escisión se analiza mediante SDS-PAGE al 10% (Figura 11A). (2) La fracción 1 (800 ml) que contiene ~40% de BoNT/A procesada se incuba con 350 ng de BoNTHidrolasa activa, purificada, durante 15 min a 37°C y se concentra a 300 ml mediante ultrafiltración. Para detener finalmente la reacción la nBH se extrae mediante SEC (columna Superdex 20010/300 GL, amortiguador: NaP 50 mM pH 7.5, NaCl 150 mM, volumen de la muestra = 0.3 mi, velocidad de flujo = 0.25 ml/min) y la cantidad de escisión se analiza mediante SDS-PAGE al 10% (Figura 11B). (2) Las fracciones 1 y 2 (1800 ml) que contienen ~80% de BoNT/A procesada se combinan y se incuban con 120 ng de BoNTHidrolasa activa, purificada, durante 25 min a 37°C y se concentran a 300 ml mediante ultrafiltración. Para detener finalmente la reacción, la nBH se extrae mediante SEC (columna Superdex 200 10/300 GL, amortiguador: NaP 50 mM pH 7.4, NaCl 150 mM, volumen de la muestra = 0.3 mi, velocidad de flujo = 0.25 ml/min), y la cantidad de escisión de analiza mediante SDS-PAGE al 10% (Figura 11C). Se obtiene una BoNT/A procesada >95% (SEC ID NO: 3). El segundo polipéptido idéntico procesado completamente (BoNT/A procesada >95%) se obtiene si el segundo polipéptido se procesa en una etapa durante 50 min a 37°C (200 mg de scBoNT/A incubados con 350 ng de nBH). Después del tiempo de incubación de lh a 37°C, se procesa más de 97% de la BoNT/A.

Claims (32)

REIVINDICACIONES
1. El uso de un polipéptido activo proteolíticamente en la producción de un polipéptido procesado proteolíticamente, caracterizado porque, el polipéptido activo proteolíticamente es Lys-C o un homólogo del mismo que tiene al menos 60% de identidad de la secuencia con el mismo; en donde, el polipéptido procesado proteolíticamente es un serotipo A de la neurotoxina botulínica (BoNT/A) de cadena doble y en donde, dicho polipéptido activo proteolíticamente hidroliza el serotipo A de la neurotoxina botulínica (BoNT/A) de cadena individual para producir el serotipo A de la neurotoxina botulínica (BoNT/A) de cadena doble.
2. El uso de acuerdo con la Reivindicación 1, caracterizado porque, el serotipo A de la neurotoxina botulínica (BoNT/A) de cadena individual es una neurotoxina de origen natural, una neurotoxina recombinante, o una neurotoxina modificada, tal como una neurotoxina que carece del dominio Hc nativo o partes o derivados de las mismas con otros residuos de aminoácidos que reemplazan el dominio Hc de la neurotoxina.
3. El uso de acuerdo con la Reivindicación 2, caracterizado porque, el serotipo A de la neurotoxina botulínica (BoNT/A) de cadena individual comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50% de identidad de la secuencia con una secuencia de polipéptido seleccionada de cualquiera de las SEC ID Nos: 3 a 10; preferiblemente en donde, el polipéptido activo proteoliticamente hidroliza el serotipo A de la neurotoxina botulinica (BoNT/A) de cadena individual, en una posición inmediatamente después de la C-terminal a un residuo de aminoácido dentro de dicha secuencia de cualquiera de las SEC ID NOs: 3 a 10.
4. El método para la producción de polipéptidos procesados proteoliticamente, caracterizado porque, comprende la etapa de poner en contacto: (a) un primer polipéptido, dicho primer polipéptido que es Lys-C o un homólogo del mismo que tiene al menos 60% de identidad de la secuencia con el mismo; con (b) un segundo polipéptido, dicho segundo polipéptido que es susceptible a la proteólisis por dicho primer polipéptido; en donde, dicho contacto resulta en el procesamiento proteolitico de dicho segundo polipéptido en al menos dos productos de escisión; en donde el segundo polipéptido es el serotipo A de la neurotoxina botulinica (BoNT/A) de cadena individual, y en donde dicho primer polipéptido hidroliza el serotipo A de la neurotoxina botulinica (BoNT/A) de cadena individual para producir el serotipo A de la neurotoxina botulinica (BoNT/A) de cadena doble.
5. El método de acuerdo con la Reivindicación 4, caracterizado porque, dicho serotipo A de la neurotoxina botulinica (BoNT/A) de cadena individual es una neurotoxina de origen natural, una neurotoxina recombinante, o una neurotoxina modificada, tal como una neurotoxina que carece del dominio Hc nativo o partes o derivados de las mismas con otros residuos de aminoácidos reemplazando el dominio Hc de la neurotoxina.
6. El método de acuerdo con la Reivindicación 5, caracterizado porque, el segundo polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50% de identidad de la secuencia con una secuencia de polipéptido seleccionada de cualquiera de las SEC ID NOs: 3 a 10; preferiblemente, en donde, el primer polipéptido escinde proteoliticamente el segundo polipéptido en una posición inmediatamente posterior a la C-terminal a un residuo de aminoácido dentro de dicha secuencia de cualquiera de las SEC ID NOs: 3 a 10.
7. El uso de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-3 o el método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 4-6, caracterizado porque, la C-terminal de la cadena L y la N-terminal de la cadena H del serotipo A de la neurotoxina botulinica (BoNT/A) de cadena doble son idénticas a la serotipo A de la neurotoxina botulinica (BoNT/A) de cadena doble aislado de las clostridias de tipo silvestre.
8. El uso de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-3 o 7 o el método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 4-7, caracterizado porque, el serotipo A de la neurotoxina botulinica (BoNT/A) clostridial de cadena doble tiene una secuencia de aminoácidos idéntica cuando compara con el polipéptido del serotipo A de cadena doble de la neurotoxina botulinica (BoNT/A) correspondiente, generado del mismo polipéptido del serotipo A de la neurotoxina botulinica (BoNT/A) de cadena individual en clostridias de tipo silvestre.
9. El método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 4-8, caracterizado porque, dicho contacto ocurre dentro de una célula, en un U sado de células, en un lisado de células purificado, o en un sujeto.
10. El uso del método de cualquiera de las Reivindicaciones 4-9, para determinar la calidad del producto o en la producción de un medicamento.
11. Una composición que se puede obtener mediante el método de cualquiera de las Reivindicaciones 4-9; preferiblemente, caracterizado porque, la composición es una composición farmacéutica que comprende un polipéptido procesado que puede ser obtenido mediante el método de cualquiera de las Reivindicaciones 4-9 y un portador aceptable farmacéuticamente.
12. Una composición de acuerdo con la Reivindicación 11, caracterizado porque, dicha composición comprende una mezcla del segundo polipéptido no procesado, dicha mezcla que contiene menos de 5% del segundo polipéptido no procesado.
13. Una composición de acuerdo con la Reivindicación 11 o la Reivindicación 12, caracterizada porque, dicha composición se formula en forma olida liquida o en aerosol (gaseosa).
14. Una composición de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 11-13, caracterizada porque, dicha composición es un medicamento o una composición cosmética.
15. Una composición de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 11-14, para ser usada en el tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado de fortaleza muscular voluntaria, distonia focal, incluyendo distonia cervical, craneal y blefaroespasmo esencial benigno, espasmos hemifaciales y espasticidad focal, trastornos gastrointestinales, hiperhidrosis, y corrección cosmética de arrugas, en un aspecto adicional, también blefaroespasmos, distonia oromandibular, del tipo de apertura de la mandíbula, del tipo de cierre de la mandíbula, bruxismo, síndrome de Meige, distonia lingual, apraxia del parpado, distonia cervical de apertura, antecolis, retrocolis, laterocolis, tortícolis, distonia faríngea, distonia laríngea, disfonía espasmódica aductora, distonia espasmódica abductora, disnea espasmódica, distonia límbica, distonia de brazos, distonia específica de la tarea, calambres de escritor, calambres del músico, calambres del jugador de golf, distonia de piernas, aducción del muslo, flexión de la rodilla por aducción del muslo, extensión de la rodilla, flexión del tobillo, extensión del tobillo, equinovaro, distonia por deformidad del pie, dedo estriatal, flexión del dedo gordo del pie, extensión del dedo gordo del pie, distonia axial, síndrome de pisa, distonia de la bailarina del vientre, distonia segmentada, hemidistonia, distonia generalizada, distonia por enfermedad de Lubag, distonia por degeneración corticobasal, distonia por enfermedad de Lubag, distonia tardía, distonia por ataxia espinocerebelar, distonia por enfermedad de Parkinson, distonia por enfermedad de Huntington, distonia por enfermedad de Hallervorden Spatz, disquinesias dopa inducidas/ distonia dopa inducida, disquinesias tardías/distonia tardía, disquinesias/distonia paroxismales, mioclono palatal inducido por la acción quinesiogénica, no quinesiogénica, mioquimia por mioclono, rigidez, calambres musculares benignos, temblor hereditario de la barbilla, actividad paradójica de los músculos de la mandíbula, espasmos hemimasticatorios, miopatía branquial hipertrófica, hipertrofia masetérica, hipertrofia del músculo tibial anterior, nistagmo, oscilopsia, parálisis visual supranuclear, epilepsia parecial continua, planeación de la operación de torticolis espasmódica, parálisis de las cuerdas vocales abductoiras, disforia mutacional recalcitante, disfunción del esfínter esofágico superior, granuloma del pliegue vocal, tartamudeo por síndrome de Gilíes de la Tourette, mioclono del oído medio, cierre protector de la laringe, post laringectomía, falla de la voz, ptosis protectora, entropión, disfunción del esfínter de Oddi, pseudoacalasia, nonacalasia, trastornos del movimiento esofágico, vaginismos, temblor por inmovilización postoperatoria, disfunción de la vejiga, disinergia del esfínter detrusor, espasmo del esfínter de la vejiga, espasmo hemifacial, disquinesias de reinervación, patas de gallo por el uso de cosméticos, asimetrías faciales del ceño, mentalis dimples (hoyuelos mentonianos), síndrome de la persona rígida, hiperplasia de la próstata por tétanos, adipositas, estrabismo por parálisis cerebral infantil en tratamiento, parálisis mixta concomitante, después de la cirugía retinal, después de la cirugía por cataratas, estrabismo en la afaquia miosítica, estrabismo miopático, desviación vertical disociada como un adjunto a la cirugía por estrabismo, esotropía, exotropía, acalasia, fisuras anales, hiperactividad de las glándulas exocrinas, síndrome de Frcy, síndrome de Lágrimas de Cocodrilo, hiperhidrosis, rinorrea axilar-plantar-palmar, hipersalivación relativa en la apoplejía, en la enfermedad de Parkinson, condiciones espásticas en la esclerosis lateral amiotrófica, procesos autoinmunes en la encefalitis y la esclerosis múltiple, mielitis transversal, síndrome de Devic, infecciones virales, infecciones bacterianas, infecciones parasitarias, infecciones fúngicas, infarto hemisférico en el síndrome postapoplético con paraparesia espástica hereditaria, infarto del tronco cerebral, infarto de la medula espinal, migraña, trauma al sistema nervioso central, lesiones hemisféricas, lesiones del tronco cerebral, hemorragia del sistema nervioso central, hemorragia intracereberal, hemorragia subaraenoidea, hemorragia subdural, hemorragia intrapersonal, en neoplasias, tumores hemisféricos, tumores del tronco cerebral, tumores de la médula espinal, ronquido.
16. El uso de un polipéptido activo proteolíticamente para generar fragmentos de polipéptidos para uso en un método de espectrometría de masas, caracterizado porque, el polipéptido activo proteolíticamente es Lys-C o un homólogo del mismo que tiene al menos 60% de identidad de la secuencia con el mismo; en donde dicho polipéptido activo proteolíticamente hidroliza un polipéptido para generar los fragmentos del polipéptido .
17. El método para generar fragmentos de polipéptidos para ser usados en un método de espectrometría de masas, caracterizado porque, comprende la etapa de poner en contacto: (a) un primer polipéptido, dicho primer polipéptido que es Lys-C o un homólogo del mismo que tiene al menos 60% de identidad de la secuencia con el mismo; con (b) un segundo polipéptido, dicho segundo polipéptido que es susceptible a la proteólisis por dicho primer polipéptido; en donde dicho contacto resulta en el procesamiento proteolitico de dicho segundo polipéptido en al menos dos fragmentos de polipéptido.
18. Un truncamiento activo proteoliticamente de un polipéptido precursor, caracterizado porque, dicho polipéptido precursor consiste de un polipéptido que tiene al menos 90% de identidad de la secuencia con la SEC ID NO: 2, en donde dicho truncamiento activo proteoliticamente carece de uno o más residuos de aminoácidos N-terminales a la posición del aminoácido 249 de la SEC ID NO: 2, y en donde, dicho truncamiento activo proteoliticamente es capaz de hidrolizar la neurotoxina botulinica o del tétanos para producir la neurotoxina botulinica de cadena doble o del tétanos de cadena doble.
19. Un truncamiento activo proteoliticamente de acuerdo con la Reivindicación 18, caracterizado porque, dicho polipéptido precursor consiste de un polipéptido que tiene al menos 95% de identidad de la secuencia con la SEC ID NO: 2.
20. Un truncamiento activo proteoliticamente de acuerdo con la Reivindicación 18 o la Reivindicación 19, caracterizado porque, dicho truncamiento activo proteoliticamente comprende la SEC ID NO: 1.
21. Moléculas de ácido nucleico, caracterizadas porque, comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica el truncamiento activo proteoliticamente de cualquiera de las Reivindicaciones 18-20 y, opcionalmente, elementos reguladores.
22. Un vector, caracterizado porque, comprende las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la Reivindicación 21.
23. Células, caracterizadas porque, comprenden las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la Reivindicación 21 o el vector de acuerdo con la Reivindicación 22.
24. El método para la producción de un truncamiento activo proteoliticamente de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 18-20, caracterizado porque, comprende las etapas de: (a.) sintetizar o traducir químicamente de una secuencia de nucleótidos un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 18-20; y (b.) purificar el polipéptido de la etapa (a.).
25. El uso de un anticuerpo que se enlaza específicamente al truncamiento activo fisiológicamente de cualquiera de las Reivindicaciones 18-20, para cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación, inmunolocalización o para monitorear la presencia de un truncamiento activo proteoliticamente de cualquiera de las Reivindicaciones 18-20.
26. El método para la producción de un polipéptido procesado proteoliticamente, caracterizado porque, comprende la etapa de poner en contacto: (a) un primer polipéptido, dicho primer polipéptido que comprende el truncamiento activo proteoliticamente de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones 18-20, con (b) un segundo polipéptido, dicho segundo polipéptido que es susceptible a la proteólisis por dicho primer polipéptido; en donde, dicho contacto resulta en el procesamiento proteolitico de dicho segundo polipéptido en al menos dos productos de escisión.
27. El método de acuerdo con la Reivindicación 26, caracterizado porque, el segundo polipéptido tiene al menos 50% de identidad de la secuencia con una secuencia de polipéptido seleccionada de cualquiera de las SEC ID NOs: 3 a 25 y en donde el segundo polipéptido se escinde de la C-terminal a un residuo de aminoácido básico dentro de dicha secuencia de cualquiera de las SEC ID NOs: 3 a 25.
28. El método de acuerdo con la Reivindicación 26 o la Reivindicación 27, caracterizado porque, sirve para determinar la calidad del producto o en la producción de un medicamento.
29. Un método para identificad un inhibidor del truncamiento activo proteoliticamente de cualquiera de las Reivindicaciones 18-20, caracterizado porque, comprende las etapas de : (a) poner el contacto el truncamiento activo proteoliticamente de cualquiera de las Reivindicaciones 18-20 con un sustrato conocido y, opcionalmente, con un inhibidor putativo; y (b) determinar el efecto del inhibidor putativo sobre la conversión del sustrato en el producto de escisión, en donde, una reducción en la cantidad del producto de escisión es indicativa del efecto inhibidor del inhibidor putativo.
30. El método de acuerdo con la Reivindicación 29, caracterizado porque, el inhibidor es un anticuerpo que se enlaza específicamente al truncamiento activo proteoliticamente de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 18-20.
31. El uso del truncamiento activo proteoliticamente de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 18-20 en la producción de neurotoxinas terapéuticas.
32. Una composición, caracterizada porque, comprende un truncamiento activo proteoliticamente de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 18-20, y un portador farmacéutico. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a nuevos polipéptidos activos proteoliticamente y varios usos de los polipéptidos (y otros) en métodos de selección y producción.
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