MX2014009797A - Metodos, composiciones y dispositivos para abastecer las necesidades de acidos grasos dieteticos. - Google Patents

Metodos, composiciones y dispositivos para abastecer las necesidades de acidos grasos dieteticos.

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Abstract

Se proveen formulas nutricionales que comprenden ácidos grasos poli insaturados de cadena larga (LC-PUFAs), conjuntamente con métodos y dispositivos para la preparación y/o administración de fórmulas nutricionales. En algunas modalidades, un porcentaje de los LC-PUFAs en la fórmula nutricional están en la forma de mono glicéridos y/o ácidos grasos libres. En algunas modalidades, las fórmulas nutricionales no comprenden lipasa adicionada. También se proveen métodos para proporcionar nutrición a un sujeto, métodos para mejorar la absorción de grasa, métodos para mejorar la capacidad cognitiva, métodos para prevenir enfermedad pulmonar crónica, y métodos para reducir la longitud del tiempo que requiere un paciente para una nutrición parenteral total.

Description

MÉTODOS, COMPOSICIONES Y DISPOSITIVOS PARA ABASTECER LAS NECESIDADES DE ÁCIDOS GRASOS DIETÉTICOS Campo de la Invención La presente invención se refiere, de manera particular, al campo de las fórmulas nutricionales y, de manera particular, se relaciona con formulaciones nutricionales que comprenden ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFAs).
Antecedentes de la Invención Referencia cruzada a solicitudes relacionadas La solicitud reivindica la prioridad bajo el 35 U.S.C. § 119 para la Solicitud Provisional Estadounidense Número 61/600,207, la cual se presentó el 17 de Febrero de 2012 y para la Solicitud Provisional Número 61/719,173, la cual se presentó el 26 de Octubre de 2012.
Los ácidos grasos de cadena larga son críticos para la salud y desarrollo humano. Los ácidos grasos de cadena larga que son consumidos en la dieta son principalmente en la forma de triglicéridos (TGs, por sus siglas en inglés), en los cuales tres ácidos grasos de cadena larga están unidos a una molécula de glicerol mediante enlaces éster. La absorción de triglicéridos de cadena larga requiere primero la acción enzimática de lipasas, (por ejemplo, lipasa pancreática), la cual digiere los triglicéridos a través de la hidrólisis, descomponiéndolos en monoglicéridos y además en ácidos grasos libres. Una vez disponible, estos monoglicéridos y ácidos grasos libres son absorbidos por células endoteliales en el intestino delgado, donde se someten a reesterificación, seguido por transporte al hígado y finalmente a tejidos en el cuerpo por varios propósitos fisiológicos. D. Kasper et al., Harrison’s Principies of Infernal Medicine 16 Ed. (2004). Mientras los triglicéridos de cadena media pueden ser absorbidos a través del lumen intestinal, los triglicéridos de cadena larga no, por lo tanto, la lipasa pancreática es esencial para la hidrólisis y absorción de ácido graso de cadena larga. C. Jensen et al., Am. J Clin. Nutr. 43:745-751 (1986). Sin embargo, algunas personas son incapaces de descomponer adecuadamente los triglicéridos de cadena larga, por ejemplo, pacientes que sufren de salidas pancreáticas comprometidas, insuficiencia pancreática o mala absorción, y como un resultado, pueden sufrir de absorción de ácidos grasos que son inadecuados para mantener la salud.
Los suplementos de lipasa comercialmente disponibles pueden ser agregados a la dieta para mejorar la hidrólisis de trigliceridos de cadena larga. Sin embargo, por un número de razones, los suplementos de lipasa no necesariamente resolverán el problema de escasa absorción de ácido graso en todas las personas que sufren de capacidad reducida para descomponer triglicéridos de cadena larga o de otro modo en necesidad de recibir ácidos grasos elementales. Por ejemplo, la mayoría de los suplementos comerciales de lipasa son elaborados de lipasa pancreática animal, lo cual se conoce por tener estabilidad significantemente reducida por debajo de pH 7. Véase, por ejemplo, documento US2010/0239559; D. Kasper et al., Harrison’s Principies of Infernal Medicine 16th Ed. (2004). Por el tiempo en que tales lipasas pasan a través del estómago, cantidades significantes es probable que hayan sido inactivadas. Además, no todas las lipasas funcionan al mismo grado para hidrólisis de un ácido graso de cadena larga dado, indicando que la especificidad de la lipasa es una consideración importante. R. Jensen et al., Lipids 18(3):239-252 (1983). Y en algunas poblaciones con insuficiencia pancreática, las fórmulas nutricionales son estrechamente reguladas, tal como en infantes de pre-término o en pacientes en unidades de cuidado intensivo. Para estas poblaciones controladas, puede no ser deseable o factible suplementar fórmulas ya aprobadas con ingredientes adicionales. Sin embargo, aunque muchas fórmulas suplementadas con ácidos grasos pueden contener triglicéridos de cadena media, existe un beneficio médico distinto para la absorción de ácidos grasos de cadena larga de la dieta. De este modo, existe una necesidad de métodos mejorados para mejorar la hidrólisis de triglicéridos de cadena larga.
La hidrólisis apropiada de triglicéridos poliinsaturados de cadena larga (TG-LCPUFA, por sus siglas en inglés) es particularmente importante por varias razones. Los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFAs, por sus siglas en inglés) son críticos para el desarrollo neuronal y retinal. Sin embargo, algunos son considerados “ácidos grasos esenciales”, significando que los humanos no pueden sintetizarlos y deben obtenerlos a partir de fuentes de dieta. La fuente de dieta principal para ácido docosahexaenoico (DHA, por sus siglas en inglés) de LC-PUFAS n-3 y ácido eicosapentaenoico (EPA, por sus siglas en inglés) es su precursor, ácido alfa-linolénico (ALA, por sus siglas en inglés), el cual es un ácido graso esencial. Las enzimas endógenas, sin embargo, son altamente ineficientes en convertir ALA a DHA y EPA. De conformidad con una declaración oficial por la Sociedad Internacional para el Estudio de Acidos Grasos y Lípidos (ISSFAL, por sus siglas en inglés), la conversión de ALA a DHA es aproximadamente 1% en infantes y considerablemente inferior en adultos. Brenna et al., Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 80(2-3):85-91 (2009). De este modo, aunque DHA y EPA no son esencialmente ácidos grasos per se, las fuentes de dieta de DHA y EPA son importantes. La fuente de dieta principal para el ácido araquidónico (ARA o AA) de LC-PUFA n-6 es ácido linoleico (LA), el cual es un ácido graso esencial.
Compendio de la Invención Modalidades de la invención resuelven estos varios problemas mediante (i) proporcionar lipasas que son sorprendentemente más eficientes que otras en la hidrolización de ciertos triglicéridos de cadena grasa y ésteres, tales como, por ejemplo, triglicéridos poliinsaturados de cadena larga y ésteres (ii) proporcionando una fórmula nutricional, tal como, por ejemplo, una fórmula nutricional médica o una fórmula infantil, que comprende componentes pre-hidrolizados (es decir, monoglicéridos y/o ácidos grasos libres) de triglicéridos de LC-PUFA, ésteres de ácido graso de LC-PUFA, y/u otros triglicéridos de cadena larga o ésteres de ácidos grasos de cadena larga, (iii) proporcionar métodos para producir tal fórmula nutricional, que incluye métodos en los cuales una fórmula que contiene triglicéridos de LC-PUFA, ésteres de ácido graso de LC-PUFA, y/u otros triglicéridos de cadena larga o ésteres de ácidos grasos de cadena larga es temporalmente expuesta a lipasa y (iv) proporcionar dispositivos diseñados para proporcionar fórmulas nutricionales que comprenden monoglicéridos y/o ácidos grasos libres, por ejemplo, triglicéridos de LC-PUFA y/o ésteres de ácido graso de LC-PUFA. En modalidades en las cuales la fórmula es temporalmente expuesta a la lipasa y la lipasa es removida o separada de la fórmula previo a la ingestión, la invención proporciona la ventaja de asegurar la descomposición de triglicéridos de LC-PUFA, ésteres de ácido graso de LC-PUFA, y/u otros triglicéridos de cadena larga o ésteres de ácidos grasos de cadena larga sin requerir ingestión de la lipasa exógena.
Por consiguiente, algunas modalidades de la invención proporcionan una fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional comprende LC-PUFAs. En algunas modalidades, más de 2% de los LC-PUFAs totales están en la forma de monogliceridos y ácidos grasos libres, es decir, menos de 98% de los LC-PUFAs totales están en la forma de triglicéridos o éster. En algunas modalidades, los monoglicéridos de LC-PUFA y ácidos grasos libres comprenden más de 2.5%, más de 3%, más de 4%, más de 5%, más de 6%, más de 7%, más de 8%, más de 10%, más de 12%, más de 15%, más de 20%, más de 25%, más de 30%, más de 40%, más de 50%, o más de 75% de los LC-PUFAs totales en una fórmula nutricional. En ciertas modalidades, la relación de monoglicéridos de LC-PUFA y ácidos grasos libres a triglicéridos y ésteres es al menos 0.08:1, al menos 0.09:1, al menos 0.1:1, al menos 0.25:1, al menos 0.5:1, al menos 1:1, al menos 2:1, al menos 3:1, al menos 4:1, al menos 5:1, al menos 8:1, al menos 10:1, o al menos 20:1.
En ciertas modalidades, la fórmula nutricional es formulada para administración a infantes prematuros. Otras fórmulas nutricionales abarcadas por la invención son formuladas para infantes, bebés pequeños, niños, o adultos quienes tienen una capacidad reducida para hidrolizar triglicéridos de LC-PUFA, ésteres de ácido graso de LC-PUFA, y/u otros triglicéridos de cadena larga o ésteres de ácidos grasos de cadena larga, o quienes necesitan simplemente LC-PUFAs y/u otros ácidos grasos de cadena larga de dieta elemental adicional. En algunas modalidades, una fórmula nutricional de la invención es para un sujeto quien es de menos de 1 año de edad. En algunas modalidades, el sujeto es de entre 1 y 4 años de edad. En algunas modalidades, el sujeto es entre 1 y 6 años de edad.
En ciertas modalidades, la fórmula nutricional de la invención es una fórmula nutricional médica, es decir, una fórmula que es formulada para ser consumida o administrada oralmente o entéricamente bajo supervisión médica, tal como aquellas distribuidas a través de hospitales o farmacias bajo una prescripción. Típicamente, una fórmula nutricional médica es formulada para manejo de dieta de un trastorno, enfermedad o condición anormal médica específica, para la cual existen requerimientos nutricionales distintivos. Una fórmula nutricional médica debe tener un estado “En general Reconocido como Seguro” y cumplir con las regulaciones de la FDA que pertenecen a etiquetado, reivindicaciones de producto, y manufacturación.
En algunas modalidades, la fórmula nutricional no contiene lipasa agregada. En otras modalidades, la fórmula nutricional contiene una lipasa. En algunas modalidades, la lipasa se selecciona a partir de lipasas de Chromobacterium viscosum, Pseudomonas fluorescens, Burcholderia cepacia, y Rhizopus oryzae.
En algunas modalidades, la fórmula nutricional comprende EPA, DHA, ARA, LA, y/o ALA.
Debido a que los ácidos grasos poliinsaturados libres son inestables y se degradan rápidamente, la invención también proporciona métodos convenientes y efectivos para preparar las fórmulas nutricionales de la invención prontamente antes de la ingestión por un sujeto. En ciertas modalidades, el método comprende exponer una composición nutricional líquida que comprende triglicéridos de LC-PUFA, ésteres de ácido graso de LC-PUFA, y/u otros triglicéridos de cadena larga y/o ésteres de ácidos grasos de cadena larga a una lipasa previo a la ingestión por una persona en necesidad de LC-PUFAs y/u otros ácidos grasos de cadena larga de dieta adicionales. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por al menos un minuto, al menos 2 minutos, al menos 3 minutos, al menos 5 minutos, al menos 8 minutos, al menos 10 minutos, al menos 15 minutos, al menos 30 minutos, al menos 45 minutos, o al menos 60 minutos previo a la ingestión. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de un minuto, no más de 2 minutos, no más de 3 minutos, no más de 5 minutos, no más de 8 minutos, no más de 10 minutos, no más de 15 minutos, no más de 30 minutos, no más de 45 minutos, o no más de 60 minutos previo a la ingestión. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 24 horas. En ciertas modalidades, la lipasa se selecciona a partir de lipasas de Chromobacterium viscosum, Pseudomonas fluorescens, Burcholderia cepacia, y Rhizopus oryzae. En ciertas modalidades, la lipasa puede ser removida de la fórmula nutricional previo a la ingestión. En otras modalidades, la composición nutricional líquida que comprende triglicéridos de LC-PUFA, ésteres de ácido graso de LC-PUFA, y/u otros triglicéridos de cadena larga y/o ésteres es expuesta a lipasa inmovilizada a un soporte sólido previo a la ingestión. En algunas modalidades, la lipasa es inmovilizada al soporte sólido por enlace covalente, enlace iónico, o reticulación. En ciertas modalidades, la lipasa inmovilizada es encapsulada dentro de o unida a una membrana permeable.
Otro aspecto de la invención es un método para proporcionar nutrición a un sujeto en necesidad de LC-PUFAS y/u otros ácidos grasos de cadena larga de dieta, tales como personas que sufren de una capacidad reducida para descomponer triglicéridos de cadena larga o esteres de ácidos grasos de cadena larga en el intestino, personas que sufren de insuficiencia pancreática, personas que sufren de desnutrición, y personas quienes han estado recibiendo nutrición parenteral total, administrando una fórmula de la invención. En algunas modalidades, el sujeto es un infante prematuro. En otras modalidades, el sujeto es un infante de término o un niño pequeño. En ciertas modalidades, el sujeto es mayor de 50, mayor de 60, o mayor de 70 años de edad. En algunas modalidades, el sujeto está sufriendo de insuficiencia pancreática. En otras modalidades, la fórmula se administra a través de una sonda de alimentación. En algunas modalidades, las fórmulas nutricionales de la invención son administradas para mejorar la capacidad cognitiva en una persona de cualquier edad, para prevenir las enfermedades crónicas pulmonares en un infante de pre-término, para mejorar el desarrollo neurológico de un infante de pre-término, o para tratar o prevenir un número de otras condiciones asociadas con el mejoramiento de absorción incrementada de ácidos grasos de cadena larga, tales como, por ejemplo, EPA, DHA, ARA, LA, y ALA. Tales condiciones incluyen pero no se limitan a enfermedad de Alzheimer, trastorno bipolar, depresión, sepsis, estrés respiratorio agudo, cicatrización de heridas, cáncer, enfermedad cardiovascular, apoplejía, enfermedad de Parkinson, esquizofrenia, diabetes, esclerosis múltiple, desnutrición, función GI deteriorada, y enfermedades inflamatorias crónicas tales como artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, y enfermedad inflamatoria del intestino.
Otra modalidad de la invención proporciona un método para reducir el tiempo que un paciente necesita para la nutrición parenteral total administrando una fórmula nutricional de la invención. Como un resultado, tales pacientes son expuestos a un riesgo reducido de atrofia intestinal y otras complicaciones asociadas con la nutrición parenteral total extendida (más de 24 horas). Tales métodos pueden ser usados para acortar el tiempo de recuperación de pacientes que sufren de función GI deteriorada, tales como, por ejemplo, mala absorción, síndrome de intestino delgado, IBD, insuficiencia pancreática, desnutrición antes o después de la cirugía, quimio- o radioterapia, u otras causas de desnutrición, cáncer, heridas y úlceras por presión. Tales pacientes pueden recibir la fórmula nutricional de la invención mediante sonda nasogástrica. Este método de alimentación puede ser ventajoso en situaciones donde el paciente sufre de movilidad intestinal alterada, secreción enzimática pancreática deteriorada, debido al Síndrome de Respuesta Inflamatoria Sistémica, u otras condiciones que resultan en el desdoblamiento y absorción deteriorada de triglicéridos de LC-PUFA, ésteres de ácido graso de LC-PUFA, y/u otros triglicéridos de cadena larga o ésteres de ácidos grasos de cadena larga. En una modalidad alterna, donde es ventajoso desviar el estómago, la fórmula nutricional de la invención puede ser administrada por sonda nasoycyunal. Otros tipos de aparatos de alimentación también pueden ser usados para suministrar formulas de la invención.
Puesto que los sujetos sanos pueden beneficiarse de la absorción incrementada de LC-PUFAs, por ejemplo, reduciendo el riesgo de enfermedad cardiovascular. Por consiguiente, en algunas modalidades, la invención proporciona métodos para mejorar la absorción de grasa en un sujeto sano, que comprende alimentar al sujeto una fórmula nutricional de la invención.
La invención además proporciona dispositivos para preparar las fórmulas nutricionales de la invención. En algunas modalidades, el dispositivo comprende una cámara que contiene al menos una lipasa, en donde la cámara es capaz de retener una composición nutricional líquida de manera que es expuesta a la lipasa. En algunas modalidades, la lipasa en el contenedor es inmovilizada a la superficie interior del contenedor. En otras modalidades, la lipasa es inmovilizada a un soporte dentro de la cámara. En algunas modalidades, el dispositivo comprende una cámara que consiste de una membrana permeable y que comprende lipasa inmovilizada dentro de la cámara, de manera que la composición nutricional líquida puede fluir a través de la membrana permeable y entrar en contacto con la lipasa, pero la lipasa no puede pasar a través de la membrana permeable. En algunas modalidades, la lipasa contenida dentro de la cámara de un dispositivo de la invención es una lipasa microbiana. En algunas modalidades, la lipasa se selecciona a partir de lipasas bacterianas. En algunas modalidades, la lipasa se selecciona a partir de la lipasa de Chromobacterium viscosum, lipasa de Pseudomonas fluorescens, lipasa de Burcholderia cepacia, y lipasa de Rhizopus oryzae. En algunas modalidades, la lipasa se selecciona a partir de lipasa de Chromobacterium viscosum, lipasa de Pseudomonas fluorescens, y lipasa de Rhizopus oryzae. En algunas modalidades, la lipasa es lipasa de Rhizopus oryzae.
Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 ilustra un dispositivo y método para proporcionar nutrición a un infante, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 2A ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 2B ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 2C ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 3A ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 3B ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 3C ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 4A ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 4B ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 5A ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 5B ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 6A es una fotografía de un vial de lipasa de Rhizopus oryzae inmovilizada en perlillas poliméricas.
La Figura 6B ilustra un dispositivo para tratar y administrar la fórmula nutricional de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 6C ilustra un dispositivo para tratar y administrar la fórmula nutricional de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 6D ilustra un acercamiento del dispositivo representado en la Figura 6C.
La Figura 7 representa la hidrólisis de triglicéridos de DHA por la lipasa de Rhizopus oryzae (RO).
La Figura 8 representa la hidrólisis de triglicéridos de ARA por la lipasa de Rhizopus oryzae.
La Figura 9A ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 9B ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 9C ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 10A ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 10B ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 10C ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 11A ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 1 IB ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 11C ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 12 ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 13A ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 13B ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 14 ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 15 ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 16 ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 17A ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 17B ilustra una vista en corte transversal parcial de un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 18 ilustra un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 19 ilustra una vista en corte transversal parcial de un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 20 ilustra una vista en corte transversal parcial de un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 21 ilustra una vista en corte transversal parcial de un dispositivo para tratar la fórmula, de conformidad con ciertas modalidades.
La Figura 22 A muestra el peso de las heces en cerdos EPI durante la semana de control (“semana de control”, durante el cual los cerdos fueron alimentados con fórmula infantil fortificada con TG-LCPUFA) contra la semana de tratamiento (“semana de tratamiento”, durante la cual los cerdos fueron alimentados con la misma fórmula fortificada ya sea no hidrolizada (“CONT”), pre-hidrolizada con lipasa de Chromobacterium viscosum (“CV”), o pre-hidrolizada con lipasa de Rhizopus oryzae (“RO”)).
La Figura 22B muestra el contenido de grasa fecal total durante los últimos 3 días de la semana de tratamiento en los mismos 3 grupos de cerdos, y la Figura 22C muestra el coeficiente de absorción de grasa (%CFA).
La Figura 23 muestra los niveles de ARA (23A), EPA (23B), y DHA (23C) en las heces de cerdos EPI alimentados con la fórmula no hidrolizada (“CONT”), fórmula pre-hidrolizada con lipasa CV (“CV”), o fórmula pre-hidrolizada con lipasa RO (“RO”). Los asteriscos indican p<0.001.
La Figura 24 muestra los niveles de ARA (24A) y DHA (24B) en el plasma de cerdos EPI después de 7 días de alimentación con la fórmula no hidrolizada (“CONT”), fórmula pre-hidrolizada con lipasa CV (“CV”), o fórmula pre-hidrolizada con lipasa RO (“RO”). Los asteriscos indican p<0.05.
La Figura 25 muestra los niveles de ARA y DHA en la retina (25A) y tejido adiposo (25B) de cerdos EPI después de 7 días de alimentación con la fórmula no hidrolizada (“CONT”), fórmula pre-hidrolizada con lipasa CV (“CV”), o fórmula pre-hidrolizada con lipasa RO (“RO”). Los asteriscos indican p<0.05.
La Figura 26 muestra los niveles de ARA y DHA en el corazón (26A) y tejido renal (26B) de cerdos EPI después de 7 días de alimentación con la fórmula no hidrolizada (“CONT”), fórmula pre-hidrolizada con lipasa CV (“CV”), o fórmula pre-hidrolizada con lipasa RO (“RO”). Los asteriscos indican p<0.05.
La Figura 27 muestra el porcentaje de hidrólisis de DHA y ARA en la fórmula Enfalac con 100 mg (27A), 500 mg (27B), 1000 mg (27C), o 2000 mg (27D) de lipasa RO inmovilizada.
La Figura 28 muestra el porcentaje de hidrólisis de DHA (28A) y ARA (28B) con lipasa RO o pancreatina.
La Figura 29 representa el diseño de estudio para el estudio de cerdo de 6 semanas descrito en el Ejemplo 10.
La Figura 30 muestra los niveles de ARA y DHA en eritrocitos recolectados de cerdos sanos alimentados con la fórmula infantil fortificada con TG-LCPUFA (“Sanos”), cerdos con insuficiencia pancreática exocrina inducidos quirúrgicamente alimentados con fórmula infantil fortificada con TG-LCPUFA (“EPI”), y cerdos con insuficiencia pancreática exocrina quirúrgicamente inducidos alimentados con fórmula infantil fortificada con TG-LCPUFA que se han pre-hidrolizado por lipasa RO inmovilizada (“EPI+iRO”).
Descripción Detallada de Modalidades Preferidas de la Invención Ácidos Grasos Poliinsaturados de Cadena Larga Los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFAs) son cadenas de hidrocarburos que contienen dos o más enlaces dobles. Dependiendo de la posición del primer enlace doble con relación al término metilo, un LC-PUFA puede ser clasificado como un ácido graso omega-3 (n-3) o omega-6 (n-6). ALA y LA son ácidos grasos precursores de las familias PUFA n-3 y n-6, respectivamente. Son considerados “ácidos grasos esenciales”, significando que los humanos no pueden sintetizarlos, sino preferiblemente, deben obtenerlos a través de dieta. Esto es debido a que los mamíferos carecen de la capacidad para introducir enlaces dobles en los ácidos grasos más allá del carbono 9 y 10. Blosover et al. Cell Biology: A Short Course, John Wilcy & Sons, Inc. at 39 (2011). Sin embargo, los humanos pueden hacer PUFAs de cadena larga adicionales partiendo con ALA y LA.
Tanto ALA como LA son metabolizados para generar otros PUFAs de cadena larga a través de una serie de etapas de desaturación y alargamiento. Por ejemplo, el ALA es metabolizado a EPA y finalmente a DHA. LA es metabolizado a ARA, un ácido graso n-6. La conversión de ALA a DHA y EPA y LA a ARA sin embargo, es relativamente ineficiente. L. Arterburn et al., Am. J Clin. Nutr. 83(suppl):1467S-1476S (2006). Los estudios han estimado que la conversión de ALA a DHA en humanos es de menos de 5%. B. Anderson and D. Ma, Lipids Health Dis. 8:33 (2009). El hígado contiene el tejido más activo para convertir ALA a DHA y LA a ARA, y por lo tanto juega un papel importante para proporcionar DHA y ARA a menos tejidos u órganos activos, tales como el cerebro. M. Martínez et al., J Pediatr. 120:S129-S138 (1992). Alternativamente, estos LC-PUFAs pueden ser consumidos directamente a partir de la dieta. El DHA y EPA se encuentran en pescado, nueces, y aceite de linaza, mientras el ARA está disponible de fuentes de grasa animal, aceite de maíz, aceite de soya y aceite de semilla de girasol. Ácidos grasos n-3 El DHA del ácido graso n-3 es crítico al desarrollo y función neural y retinal. Es el PUFA de cadena larga principal en la membrana neutral y es esencial para la función cerebral, construcción de circuitos cerebrales, y transmisión del impulso nervioso. Como un componente de la membrana integral, el DHA contribuye a la fluidez de la membrana lo cual es importante para mantener las estructuras sinápticas, neurotransmisión y plasticidad sináptica. G. Jicha et al., Clin. ínterv. Aging 5:45-61 (2010). El DHA también tiene influencia en los eventos de señalización esenciales para la diferenciación y supervivencia neuronal, y tiene efectos en los niveles y metabolismo de neurotransmisores y eicosanoides. La mayoría de la acumulación de DHA en el cerebro ocurre al comienzo del 3er. trimestre a través del segundo año de vida. Se ha demostrado que en roedores y primates, un suministro inadecuado de PUFA n-3 durante este periodo resulta en capacidad de aprendizaje y neurotransmisión deteriorada. M. Martínez et al., J Pediatr. 120:S129-S138 (1992). La suplementación de DHA en ratas que fueron previamente restringidas a una dieta deficiente en DHA, rescata el desempeño en las tareas de aprendizaje y memoria. W. Chung et al., J. Nutr. 138(6):1165-1171 (2008). Y en un estudio de varones adolescentes sanos, 8 semanas de suplementación de DHA incrementó significantemente la activación funcional en la corteza prefrontal dorsolateral durante el desempeño de una tarea de activación comparado con placebo. R. McNamara et al., Am. J Nutr. 91:1060-7 (2010). De este modo, el DHA es considerado importante no solamente en el desarrollo, sino también en el mantenimiento de la función neuronal.
El DHA es también altamente concentrado en la retina y tiene efectos importantes en la diferenciación del fotorreceptor y activación de la rodopsina del pigmento visual. H. Lauritzen et al., Prog. Lipid Res. 40:1-94 (2001); M. Clandinin et al., J. Pediatr. 125:S25-32 (1994). Un suministro inadecuado de DHA tempranamente en el desarrollo de primates y roedores resulta en fisiología retinal anormal y agudeza visual reducida. M. Reisbick et al., Dev. Psychol. 33:387-395 (1997); J. McCann et al., Am. J. Clin. Nutr. 82:281-295 (2005). De manera similar, en humanos, los infantes alimentados con la fórmula sin DHA por los primeros doce meses de vida han sido mostrados por tener baja agudeza visual que los infantes alimentados con la fórmula suplementada con DHA. E. Birch et al., Am. J. Clin. Nutr. 91(4):848-859 (2010). Las deficiencias de DHA también han sido asociadas con el síndrome de alcohol fetal, trastorno de hiperactividad por déficit de atención, fibrosis quística, fenilcetonuria, depresión unipolar, hostilidad agresiva, y adrenoleucodistrofia. A. Horrocks et al., Pharmacological Res. 40(3):211-225 (1999).
Los beneficios de la ingesta incrementada de DHA y otros ácidos grasos n-3 han sido descritos para varias enfermedades, que incluyen por ejemplo, enfermedad de Alzheimer (AD), trastorno bipolar (BP), depresión, que incluye trastorno depresivo mayor (MDD) y depresión post-parto, sepsis, estrés respiratorio agudo, cicatrización de heridas, cáncer, enfermedad cardiovascular, apoplejía, enfermedad de Parkinson, esquizofrenia, diabetes, esclerosis múltiple, y enfermedades inflamatorias crónicas tales como artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, y enfermedad inflamatoria del intestino.
Por ejemplo, los ensayos clínicos con pacientes con AD han demostrado que el DHA proporciona un beneficio terapéutico. Para una revisión de estudios que evalúan el efecto de DHA en AD, véase G. Jicha and W. Markesbery, Clin. Interv. Aging 5:45-61 (2010). Los datos a partir de ensayos in vitro, sistemas de cultivo celular, y modelos murinos de AD apoyan un papel directo para PUFAs n-3 en procesamiento amiloide en el cerebro. Y en modelos transgénicos de AD que producen amiloides, la suplementación con DHA resulta en niveles inferiores de ab. M. Oksman et al., Neurobiol. Dis. 23(3):563-572 (2006). Además de los datos de ensayo clínico positivo en pacientes con AD, un gran estudio en persona de edad avanzada sanas con problemas de memoria leves, mostró que sujetos administrados con DHA se desempeñan mejor en ensayos de memoria y aprendizaje después de seis meses comparado con aquellos que recibieron placebo. (Martek Press Release, Mayo 4, 2010). De este modo, el DHA puede también jugar un papel benéfico en la prevención de AD.
El uso terapéutico de DHA también ha sido investigado en pacientes con BP y MDD. Para una revisión en DHA en BP, véase V. Balencia-Martinez et al., Expert. Rev. Neurother. 11(7): 1029- 1047 (2011). Debido a las dificultades en la evaluación de los niveles de DHA en tejido cerebral a partir de pacientes humanos, la composición de ácido graso en membranas de eritrocitos a partir de muestras de sangre ha sido evaluada y se encontró que contiene significantemente menos DHA en pacientes con BP y MDD que en controles sanos. R. McNamara et al., J Mfect. Disord. 126(l-2):303-311 (2010). En un estudio post-mórtem, la composición de ácido graso de la corteza orbitofrontal tiene niveles significantemente inferiores de DHA en pacientes con BP comparado con controles normales. R. McNamara et al., Psychiatry Res. 160(3):285-299 (2008). Y en un estudio controlado con placebo, de doble ciego, de 4 meses, pacientes con BP que recibieron ácidos grasos n-3 tienen un periodo significantemente más largo de remisión que el grupo de placebo. A. Stoll et al., Arch. Gen. Psychiatry 56(5):407-412 (1999). Estos estudios implican que el DHA como terapéuticamente benéfico en BD y MDD, particularmente debido a sus efectos estabilizantes del ánimo.
El DHA también ha sido mostrado por beneficiar pacientes que sufren de otras formas de depresión. Para una revisión, véase A. Logan et al., Lipids Health Dis. 3:25-32 (2004). Un número de estudios han encontrado niveles de n-3 reducidos en la sangre de pacientes con depresión. De manera similar, un incremento en DHA del plasma se asocia con una reducción en síntomas que reportan mujeres de depresión post-parto. Algunos estudios controlados con placebo han encontrado que el tratamiento de n-3 mejora los sistemas depresivos. Para una revisión en la relación entre los niveles de n-3 y depresión, véase A. Logan et al., Lipids Health Dis. 3:25-32 (2004).
En sepsis, una dieta enriquecida entérica con EPA, ácido g-linolénico, y antioxidantes, mejora los resultados hospitalarios y reduce la mortalidad en pacientes con sepsis severa o choque séptico que requieren ventilación médica. A. Pontes-Arruda et al., Crit. Care Med. 34(9):2325-2333 (2006). Beneficios similares en días libres con ventilador, días libres de ICU, disfunciones de nuevos órganos reducidas, y una tasa de mortalidad disminuida se han reportado en pacientes con estrés respiratorio agudo alimentados con una dieta enriquecida con PUF As de cadena larga y antioxidantes. J. Gadek et al. Crit. Care Med. 27(8): 1409-1420 (1999).
Los ácidos grasos n-3 también son reportados por tener efectos benéficos en la cicatrización de heridas. A través de alterar el microambiente lípido, los ácidos grasos n-3 mejoran la reconstitución de células epiteliales y también puede ayudar a reducir la inflamación. D. Ruthig and K. Meckling-Gill, J Nutr. 129:1791-1798 (1999); J. McDaniel et al. Wound Repair Regen. 19(2): 189-200 (2011).
EPA y DHA han mostrado efectos protectores en cánceres, tales como cáncer de próstata y mama. Los efectos benéficos pueden ser debido a propiedades anti-inflamatorias, así como también mecanismos que disminuyen la proliferación y promueven la apoptosis, tales como a través de la regulación descendente de NF-kB. Para una discusión en ácidos grasos n-3 en cáncer, véase B. Anderson and D. Ma, Lipids Health Dis. 8:33 (2009).
Los ácidos grasos n-3 han sido asociados con los efectos benéficos en pacientes con enfermedad cardiovascular y en la reducción del riesgo de enfermedad cardiovascular en personas sanas. Efectos positivos similares se han reportado en la apoplejía. Por consiguiente, la Asociación Cardiaca Americana, así como también otras agencias de salud, han emitido recomendaciones para la ingesta incrementada de ácidos grasos n-3 en la dieta. P. Kris-Etherton et al. Circulation 106:2747-2757 (2002). Los mecanismos posibles para los efectos observados de ácidos grasos n-3 en la salud cardiovascular incluyen efectos hipotrigliceridémicos, efectos hipotensores, reducción en la agregación de plaquetas, y efectos estabilizantes en el miocardio mismo.
El beneficio de ácidos grasos n-3 en algunas condiciones puede ser atribuido a efectos anti-inflamatorios amplios. El EPA y DHA dan origen a resolvinas, las cuales son mediadores anti-inflamatorios con funciones inmunomoduladoras y que resuelven la inflamación. Por ejemplo, EPA y DHA presenten efectos inhibidores en la quimiotaxis del leucocito y alteran la producción de citocinas inflamatorias a través de la activación de reducción de NF-kB en células inmunes. P. Calder, Int. Rev. Immunol. 28:506-534 (2009). En general, los PUFAs n-3 están asociados con las respuestas de células T proinflamatorias. Cuando los ácidos grasos n-3 son incrementados en las dietas animales, la composición de microdominio de la membrana de células T en rafts lípidos se altera, resultando en activación de NF-kB disminuida, producción de IL-2, y proliferación celular. Específicamente, los PUFAs n-3 afectan la distribución y división de los mediadores de la señalización tempranos de la activación de células-T, tales como proteína cinasa C. Y. Fan et al., J. Immunol. 173:6151-6160 (2004). Los ácidos grasos n-3 también han sido mostrados por reducir la expresión de MHC clase II en células dendríticas, disminuyendo efectivamente la presentación del antígeno a células T, mientras los ácidos grasos n-6 están asociados con la actividad incrementada de la presentación del antígeno. Sanderson et al., J Leukoc. Biol. 62:771-777 (1997). En una línea de células de monocitos y en macrófagos intraperitoneales, el DHA y EPA tienen propiedades anti-inflamatorias mediadas a través del receptor 120 acoplado a la proteína G (GPR120). Como un resultado, estos ácidos grasos presentan efectos antidiabéticos in vivo mediante la supresión de la inflamación del tejido inducida por macrófagos. D. Oh et al., Cell 142(5):687-698 (2010). Las varias funciones inmunomoduladoras de PUFAs n-3 indican que pueden ser de influencia en muchas enfermedades humanas.
Acidos grasos n-6 Como los ácidos grasos n-3, los ácidos grasos n-6, tales como ARA, juegan un papel crucial en el desarrollo neuronal y función cerebral, con la acumulación de ARA que ocurre en el cerebro durante el desarrollo pre- y post-natal. B. Koletzo et al., J. Perinat. Med. 36(1):5-14 (2008). Los ácidos grasos n-6 son en general importantes para el desarrollo e inmunidad normal, y también estimulan el crecimiento del cabello y piel, mantienen la salud ósea, regulan el metabolismo, y mantienen el sistema reproductivo.
Suplementos de PUFA de Cadena Larga Por más de una década, las agencias de salud han recomendado el consumo de ácidos grasos n-3 en la dieta debido a sus beneficios de salud. El DHA y EPA son comercialmente disponibles como triglicéridos o en forma esterificada en suplementos nutricionales o productos de prescripción (por ejemplo, LOVAZA®, OMACOR®, y Vascepa™). Los suplementos de DHA pueden ser derivados de aceite de pescado, o de fuentes vegetarianas tales como aceite de linaza o algas. Los suplementos pueden ser bebidas líquidas, en polvo, o fórmulas de alimentación por sonda.
La fórmula infantil está sujeta a la Lcy Federal de Alimentos, Fármacos y Cosméticos, la cual define la fórmula infantil como “un alimento el cual pretende ser o está representado por el uso de dieta especial solamente como un alimento para infantes por razones de su simulación de la leche humana o su adecuabilidad como un sustituto completo o parcial para la leche humana”. La FDA define a los infantes como personas de no más de 12 meses de edad. 21 CFR 105.3(e). El ácido graso n-3 principal en la leche humana es DHA, promediando 7-8 mg/dL (variando desde 0.17% hasta 1.0% de los ácidos grasos totales). R. Yuhas et al., Lipids 41(9):851-858 (2006). La cantidad de DHA en la leche humana, es principalmente una reflexión de la ingestión de DHA materna.
Las fórmulas infantiles suplementadas con TG-LCPUFA comercialmente disponibles incluyen fórmulas de Enfamil, tales como Enfamil LIPIL® y Enfamil PREMIUM®, Baboo, Earth’s Best Organic, fórmulas de Nestle, tales como Nestle Gerber GOOD START® y Nestle NAN®, fórmulas Nutricia tales como NEOCATE® y APTAMIL®, Parent’s Choice Organic, Pfizer’s SMA GOLD®, fórmulas de Similac, tales como Similac ADVANCE®, Similac EARLY SHIELD®, y ISOMIL®, y Ultra Bright Beginnings. Otras fórmulas infantiles también pueden ser suplementadas con TG-LCPUFA. Las fórmulas suplementadas con TG-LCPUFA pueden ser a base de leche o a base de soya, y pueden ser orgánicas. En los Estados Unidos, la fórmula infantil suplementada con TG-LCPUFA representa aproximadamente 90% de las ventas del producto (Mead Johnson Nutrition).
El TG-LCPUFA también puede ser agregado a fórmulas y bebidas para dar seguimiento a niños pequeños, personas de edad avanzada, y otras personas que necesitan apoyo nutricional, o suplementación de dieta con ácidos grasos de cadena larga. Ejemplos de tal producto incluyen ENSURE®, PEDIASURE®, CARNATION®, BOOST®, CERELAC®, y SOUVENAID®. Además, fórmulas especializadas que son suplementadas con TG-LCPUFA o ésteres de LC-PUFAs pueden ser usadas en conjunto con los métodos y dispositivos de la invención en pacientes que requieren alimentación por sonda. Por ejemplo, las fórmulas entéricas son comúnmente usadas en infantes de pre-término, pacientes con insuficiencia renal, enfermedades gastrointestinales o condiciones que causan función GI deteriorada, resección intestinal, mala absorción de grasas, desnutrición, pancreatitis, hiperglicemia/diabetes, insuficiencia hepática, y enfermedad pulmonar aguda y crónica, o un estado inmunocomprometido. Para una revisión de fórmulas entéricas comercialmente disponibles, véase A. Malone, Pract. Gastr. 29(6):44-74 (2005). Las fórmulas nutricionales pueden ser estándares, elementales o especializadas con base en la condición o enfermedad del paciente. Las fórmulas estándares comúnmente usadas incluyen, por ejemplo, ISOCAL®, NUTREN 1.0®, NUTREN 1.5®, NUTREN 2.0®, OSOMLITE 1.0®, OSMOLITE 1.2®, FIBERSOURCE 1.2®, JEVITY 1.2®, JEVITY 1.5®, PROBALANCE®, ISOSOURCE 1.5®, DELIVER 2.0®, NOVOSOURCE 2.0®, y TWOCAL HN®. Las fórmulas elementales pueden contener fuentes de macronutrientes que incluyen fórmulas poliméricas e hidrolizadas y pueden ser enriquecidas en fibras. Las fórmulas específicas de la enfermedad incluyen, por ejemplo, fórmulas renales tales como MAGNACAL RENAL®, NEPRO®, NOVASOURCE RENAL®, SUPLENA®, y NUTRI-RENAL®.
Las fórmulas gastrointestinales (GI) pueden ser usadas para el manejo nutricional de pacientes con función GI deteriorada que incluye en pacientes con mala absorción de grasas o proteínas severa, resección intestinal extensiva, fibrosis quística, parálisis cerebral, síndrome de intestino delgado, IBD, pancreatitis, enfermedad de Crohn, diarrea, fístula GI, enfermedad Celiaca, síndromes de mala absorción, trauma/cirugía, enteritis por radiación, insuficiencia intestinal, quilotórax. Estas fórmulas también son usadas para alimentación post-operativa temprana, alimentación trófica, nutrición parenteral total (TPN) alternativa, y alimentación dual con TPN. Las fórmulas GI incluyen, por ejemplo, PEPTAMEN®, la cual es elaborada hasta de 70% de triglicéridos de cadena media para disminuir el potencial por mala absorción de grasas y 30% de triglicéridos de cadena larga, VIVONEX PLUS®, y VIVONEX PEDIATRIC®.
Desafortunadamente, para personas que sufren de capacidad deteriorada para hidrolizar triglicéridos de cadena larga o ésteres de ácidos grasos de cadena larga, tales como, por ejemplo, aquellos con salidas pancreáticas comprometidas o aquellos que sufren de insuficiencia pancreática, aún suplementar tales fórmulas con DHA, EPA, y otros ácidos grasos n-3 no puede ser suficiente para realizar los beneficios asociados con estos compuestos. Los triglicéridos de cadena larga o esteres de ácido graso deben ser metabolizados a monoglicéridos y/o ácidos grasos libres con el fin de ser apropiadamente absorbidos en el intestino. La invención proporciona métodos para utilizar suplementos de PUFA de cadena larga, comercialmente disponibles existentes o fórmulas recientemente diseñadas suplementadas con PUF As de cadena larga para proporcionar fórmulas listas para usar que contienen concentraciones significantemente superiores de monoglicéridos y/o ácidos grasos libres de cadena larga. En algunas modalidades, los métodos serán particularmente efectivos para proporcionar monoglicéridos y/o ácidos grasos libres de cadena larga producidos a partir de triglicéridos de DHA, EPA, y ARA o DHA, EPA, y ARA esterificados de manera que la fórmula proporcionará el máximo beneficio asociado con estos ácidos grasos críticos a personas quienes de otro modo no podrían ser capaces de hidrolizarlos y absorberlos.
Capacidad Reducida Para Hidrolizar Triglicéridos de Cadena Larga v Esteres de Acido Graso La insuficiencia pancreática es una de las condiciones que conduce a una capacidad reducida para hidrolizar triglicéridos de cadena larga. La insuficiencia pancreática es caracterizada por producción insuficiente de enzimas pancreáticas exocrinas, que incluyen lipasa pancreática. La insuficiencia pancreática puede ocurrir de manera natural durante varias etapas de la vida humana. Por ejemplo, la secreción de lipasa pancreática comienza a niveles bajos a aproximadamente 30 semanas de gestación y permanece baja durante el primer año de vida. Por lo tanto, infantes, y especialmente infantes de pre-término, pueden experimentar insuficiencia pancreática. Como un resultado, si no son alimentados con leche materna, estos infantes son susceptibles a escasa hidrólisis y absorción de ácido graso, y son desprovistos de los beneficios asociados con la ingestión de DHA, EPA, y otros LC-PUFAs.
En el otro extremo del espectro, personas de edad avanzada de otro modo sanas, pueden experimentar insuficiencia pancreática u otra capacidad reducida para hidrolizar triglicéridos de LC-PUFA o LC-PUFAs esterificados debido a cambios en el páncreas que ocurren como parte del proceso de envejecimiento natural. Estos cambios pueden incluir atrofia, fibrosis, esclerosis, o lipomatosis del páncreas. Como un resultado, las personas de edad avanzada pueden experimentar síntomas de mala digestión que incluyen desnutrición, esteatorrea, diarrea, dolor abdominal y pérdida de peso debido a la secreción de la enzima pancreática exocrina reducida. K. Herzig et al., BMC Geriatrics 11 :4-8 (2011).
La insuficiencia pancreática u otra capacidad reducida para hidrolizar triglicéridos de LC-PUFA o LC-PUFAs esterificados, también pueden resultar de la enfermedad o trauma. Por ejemplo, la pancreatitis es una condición de inflamación en el páncreas lo cual resulta en insuficiencia pancreática. La pancreatitis puede ser ya sea aguda o crónica, e incluye pancreatitis causada por alcoholismo, pancreatitis crónica idiopática, pancreatitis hereditaria, pancreatitis traumática, pancreatitis necronizante aguda, y pancreatitis autoinmune. La fibrosis quística es también una causa de insuficiencia pancreática, particularmente en niños y adolescentes. Los trastornos que resultan en una disminución en el pH intraduodenal, tal como gastrinoma (síndrome de Zollinger-Ellison), pueden inactivar la lipasa y causar insuficiencia pancreática. Las insuficiencias pancreáticas también pueden ser causadas por cirugías del tracto gastrointestinal en las cuales porciones del estómago o páncreas son removidas, cáncer pancreático, enfermedades gastrointestinales tales como úlceras estomacales, enfermedad celiaca, o enfermedad de Crohn, o en trastornos autoinmunes tales como lupus eritematoso sistémico (SLE) o enfermedad inflamatoria del intestino (IBD).
Otras causas de una capacidad reducida para digerir TG-LCPUFAs, LC-PUFAs esterificados, y/u otros triglicéridos de cadena larga y ésteres de ácido graso incluyen, por ejemplo, síndrome del intestino irritable, hipertrigliceridemia, desnutrición, que incluye desnutrición severa de proteína-calorías, neoplasmas pancreáticos y duodenales, radioterapia abdominal, hemocromatosis, colangitis esclerosante primaria, cirrosis biliar primaria, síndrome de Shwachman, deficiencia de tripsinógeno, deficiencia de enterocinasa, o una deficiencia aislada de lipasa. D. Kasper et al., Harrison’s Principies of Internal Medicine 16th Ed. (2004). Una capacidad reducida para digerir triglicéridos de cadena larga o PUF As de cadena larga esterificados también puede resultar de resección del intestino, fibrosis quística, parálisis cerebral, síndrome del intestino delgado, IBD, pancreatitis, enfermedad de Crohn, diarrea, fístula GI, enfermedad Celiaca, síndromes de mala absorción, trauma/cirugía, particularmente trauma o cirugía GI, enteritis por radiación, insuficiencia intestinal, quilotórax, cáncer, particularmente cáncer GI o pancreático, y/o cicatrización de heridas. Aunque la causa exacta es desconocida, niños con trastorno de hiperactividad por déficit de atención (ADHD) también tienen niveles reducidos de LC-PUFAs. Burgress et al., Am. J. Clin. Nutrí.71(suppl):327S-30S (2000).
Pacientes con fibrosis quística (CF), por ejemplo, han sido mostrados por tener niveles reducidos de LC-PUFAs. Peretti et al., Nutrition & Metabolism 2:11-28 (2005). Pacientes con CF que reciben terapia de reemplazo de la enzima pancreática frecuentemente continúan sufriendo de mala absorción de grasas. Kalivianakis, American 10urnal of Clinical Nutrition 69:127-134 (1999). En algunas modalidades, la invención proporciona fórmulas y métodos para mejorar la absorción de grasas, tales como, por ejemplo, LC-PUFAs, en pacientes con CF. En algunas modalidades, la invención proporciona fórmulas y métodos para inducir la ganancia de peso en pacientes con CF.
Mientras la caquexia y la pérdida de peso son comunes en etapas avanzadas de muchos cánceres debido al estado catabólico de tejidos, diversión de nutrientes, y mala absorción en etapas avanzadas, el cáncer pancreático (PC) es inusual en que la pérdida de peso y mala absorción están presentes en 80%-90% de pacientes al tiempo del diagnóstico. La mala absorción de la deficiencia exocrina ampliamente se considera para la pérdida de peso y es debido a la pérdida de parénquima pancreático, bloqueo del ducto pancreático que previenen a las enzimas de alcanzar el intestino, y procedimientos quirúrgicos. El resultado final común de todos estos mecanismos es la esteatorrea y pérdida de peso. Damería et al., J of Support Oncology 6:393-396 (2008). La estabilización de peso en PC está asociada con la supervivencia y calidad de vida mejorados. Davidson et al., Clinical Nutrition 23, 239-247 (2004). En algunas modalidades, la invención proporciona fórmulas y métodos para mejorar la absorción de grasas, tales como, por ejemplo, LC-PUFAs, en pacientes con PC. En algunas modalidades, la invención proporciona fórmulas y métodos para inducir la ganancia de peso en pacientes con PC.
Algunas modalidades de la invención mejoran sobre las opciones de tratamiento actual para insuficiencia pancreática y otras condiciones que reducen la capacidad para hidrolizar TG-LCPUFAs, LC-PUFAs esterificados, y/u otros triglicéridos de cadena larga y ásteres de ácido graso. En un paciente con capacidad reducida para hidrolizar TG- LCPUFAs, LC-PUFAs esterificados, y/u otros triglicéridos de cadena larga y ésteres de ácido graso, solamente incrementar el consumo de estos nutrientes sin mejorar la hidrólisis puede causar esteatorrea, dolor abdominal, calambres, diarrea y otras complicaciones gastrointestinales. La terapia de reemplazo de la enzima pancreática también puede conducir a complicaciones. Se ha observado que grandes cantidades de enzimas digestivas pancreáticas pueden dañar el intestino grueso resultando en colonopatía fibrosante. D. Bansi et al., Gut 46:283-285 (2000); D. Borowitz et al. J. Pediatr. 127:681-684 (1995). Otro peligro significante propuesto por los suplementos de lipasa es la reacción alérgica, ya que muchos suplementos comerciales de lipasa son derivados de fuentes animales. De este modo, modalidades de la invención que proporcionan triglicéridos de cadena larga prehidrolizados o ésteres de PUFA de cadena larga, con o sin lipasa agregada, proporcionarán métodos más seguros y mejores para tratar la insuficiencia pancreática u otra capacidad reducida para digerir triglicéridos de cadena larga o PUF As de cadena larga esterificados.
Mientras tanto ácidos grasos n-3 como n-6 son importantes durante el desarrollo, los ácidos grasos n-3 se creé, son más críticos que los ácidos grasos n-6 después en la vida. En algunos sujetos, particularmente algunos adultos, puede ser deseable incrementar la relación de (DHA y EPA):ARA. En particular, pacientes con fibrosis quística pueden beneficiarse de incrementar la relación de (DHA y EPA):ARA en su plasma. Desafortunadamente, fórmulas para adulto comercialmente disponibles en general tienen una baja relación de ácidos grasos n-3:n-6. Sin embargo, en sujetos con hidrólisis deteriorada de TG-LCPUFAs, simplemente incrementar el consumo de TG-LCPUFAs n-3 es poco probable para mejorar significantemente la relación (DHA y EPA):ARA en el sujeto, y el incremento resultante en TG-LCPUFAs no digeridos podría causar problemas gastrointestinales.
Por consiguiente, algunas modalidades de la invención proporcionan fórmulas y métodos para incrementar la relación de (DHA y EPA):ARA en un sujeto, particularmente en un sujeto adulto. Por ejemplo, algunas modalidades proporcionan métodos para preparar una fórmula para adultos en los cuales una fórmula que comprende triglicéridos y/o ésteres n-3 se expone a una lipasa que hidroliza triglicéridos y/o ésteres n-3. En algunas modalidades, la fórmula preparada comprende una relación superior de monoglicéridos y/o ácidos grasos libres n-3:n-6, por ejemplo, una relación superior de DHA y EPA libre a ARA libre, que en la formula correspondiente sin el tratamiento de lipasa. En algunas modalidades, la fórmula comprende más monoglicéridos y/o ácidos grasos libres n-3 que monoglicéridos y/o ácidos grasos libres n-6, por ejemplo, más DHA y EPA libre que ARA libre. En algunas modalidades, la fórmula es preparada exponiéndola a una lipasa que tiene actividad superior hacia triglicérídos y/o ésteres n-3 que triglicéridos y/o ásteres n-6. En algunas modalidades, la enzima es la enzima RO. La invención también proporciona una fórmula en la cual la relación de ácidos grasos libres y/o monoglicéridos n-3:n-6 es superior que la relación de ácidos grasos n-3:n-6 encontrada en el plasma del sujeto, por ejemplo, una fórmula en la cual la relación de DHA y EPA libre a ARA libre es superior que en el plasma del sujeto. La invención también proporciona métodos en los cuales tal fórmula es administrada a un sujeto adulto. En algunas modalidades, el sujeto tiene fibrosis quística.
Habilidad Reducida para Hidrolizar Acidos Grasos de Cadena Larga en Infantes de Pre-Término PUF As de cadena larga son críticos en infantes para el desarrollo normal retinal y del sistema nervioso y son altamente acumulados en las membranas celulares del cerebro y retina comenzando en las 30 semanas de gestación. C. Martin et al., J. Pediatr. 159(5):743-749 (2011); A. Lapillone et al., Leukotrines Ess. Fatty Acids 81:143-150 (2009); J. McCann et al., Am. J Clin. Nutr. 82:281-295 (2005); M. Martínez et al., J Pediatr. 120:S129-S138 (1992). Normalmente los ácidos grasos, que incluyen DHA, EPA, y ARA, así como también las lipasas necesitan descomponer estos ácidos grasos bajos a monoglicéridos y ácidos grasos libres que son proporcionados al feto a través de la placenta y después a infantes a través de la leche materna. Los infantes de pre-término están en un riesgo significantemente alto de un suministro inadecuado de ácidos grasos debido al tiempo de gestación acortado seguido por su dependencia en las fuentes externas para ácidos grasos después del nacimiento. C. Martin et al., J. Pediatr. 159(5):743-749 (2011). Adicionalmente, debido a que los infantes de pre-término no producen niveles suficientes de lipasa pancreática, consecuentemente tienen dificultad para hidrolizar algunos ácidos grasos de cadena larga que son proporcionados en su fórmula.
Se ha demostrado que los infantes prematuros tienen menos DHA y relaciones inferiores de DHA/ARA en tanto el cerebro como retina comparado con un infante de término completo. M. Martínez et al, J. Pediatr. 120:S129-S138 (1992). Adicionalmente, en un estudio de retrospectiva del perfil de ácido graso de infantes de pretérmino, los niveles inadecuados de PUF As de cadena larga se asociaron con un incremento de la enfermedad pulmonar crónica y sepsis, posiblemente debido a la respuesta inmune disregulada. C. Martin et al., J. Pediatr. 159(5):743-749 (2011). Estos estudios y otros sugieren que, aún con fórmulas suplementadas con DHA y otros triglicéridos de cadena larga o ásteres de ácidos grasos de cadena larga, asegurar niveles adecuados de PUF As de cadena larga en infantes de pre-término es una necesidad significante y potencialmente no cubierta. Las fórmulas, métodos, y dispositivos de la invención permitirán a los infantes de pre-término recibir suficientes cantidades de ácidos grasos de cadena larga para reconocer los beneficios médicos asociados.
Capacidad Reducida Para Hidrolizar Ácidos Grasos de Cadena Larga en Infantes Alimentados con la Fórmula Infantes alimentados con la fórmula que no han sido suplementados con ácidos grasos también pueden experimentar deficiencias en PUFAs de cadena larga. Los niveles de PUFAs de cadena larga se encontraron por declinar en infantes alimentados con fórmula no suplementada comparado con infantes alimentados con leche de materna. B. Koletzo et al., J. Perinat. Med. 36(1):5-14 (2008). Aún infantes alimentados con leche materna pueden experimentar deficiencias en ácidos grasos n-3 ya que la cantidad de DHA en la leche materna varía y está correlacionada con la ingesta de dieta materna. Se ha descrito una correlación positiva entre la cantidad de DHA en la leche materna y desarrollo visual y del lenguaje en infantes alimentados con leche materna. S. Innis, J. Pediatr. 143:S1-S8 (2003). De este modo, una dieta que contiene DHA es recomendada para mujeres que están amamantando. Para infantes alimentados con la fórmula, todos los fabricantes principales de la fórmula han introducido fórmulas infantiles premium o de primera calidad con grasas que contienen DHA y ARA. Sin embargo, reportes sobre los beneficios de estas fórmulas enriquecidas con DHA y ARA han sido mezclados. Algunos estudios han mostrado ventajas significantes en el desarrollo cognitivo cuando infantes han recibido fórmula que contiene PUFA de cadena larga, mientras otros no tienen. B. Koletzo et al., J. Perinat. Med. 36(1):5-14 (2008); E. Sarkadi-Nagy et al., J. Lipid Res. 45:71-80 (2004). Recientemente, infantes alimentados con Enfamil LIPIL® que contiene DHA y ARA durante el primer año de vida experimentaron resultados inmunes mejorados, que incluyen salud respiratoria mejorada, comparado con infantes alimentados con la misma fórmula sin lípidos. E. Birch et al., J. Pediatr. 156(6):902-906 (2010). En general, sin embargo, los datos pre-clínicos a la fecha no han mostrado beneficios consistentes de fórmulas actuales suplementadas con PUF As de cadena larga para el desarrollo de infantes.
Una explicación para los resultados inconsistentes en estos estudios es que algunos infantes no son capaces de absorber la cantidad necesaria de ácidos grasos críticos a través del intestino aún cuando de ingiere la fórmula suplementada con triglicéridos de cadena larga o ésteres de ácidos grasos de cadena larga. Esta incapacidad para absorber ácidos grasos puede ser debido a los bajos niveles de la lipasa pancreática endógena del infante. Debido a que las lipasas son típicamente transferidas a un infante a través de la leche materna, los infantes alimentados con la fórmula no pueden tener niveles suficientes de lipasa para descomponer los PUFAs de cadena larga o ésteres de PUF As a monoglicéridos y/o ácidos grasos libres, para absorción por el intestino. Como un resultado, los infantes alimentados con fórmula suplementada con LC-PUFA todavía tienen menos absorción de LC-PUFAs comparado con infantes alimentados con leche materna. Una vez nuevamente, existe una necesidad clara para no proporcionar simplemente suplementos de ácido graso, sino para permitir la hidrólisis y absorción de estos ácidos grasos.
Agregar lipasa a fórmulas infantiles reguladas por el gobierno (o por ejemplo, fórmulas nutricionales médicas) podría requerir trabajo de desarrollo significante para seleccionar, estabilizar y formular un suplemento de lipas adecuado. En fórmulas no reguladas, sin ensayos suficientes, los problemas que involucran estabilidad de lipasa, carencia de especificidad, pureza, y/o interferencia con otros materiales puede resultar en el uso de niveles en exceso o potencialmente nocivos de la enzima. Agregar cantidades copiosas de una nueva sustancia, más allá de los obstáculos reglamentarios, también introduce otra variable que podría afectar como también una persona con capacidad reducida para hidrolizar triglicéridos de cadena larga, particularmente un infante, toleraría una fórmula. Este problema persiste en fórmulas prescritas, por ejemplo, en la Patente Estadounidense 5,902,617 (Pabst) y Patente Estadounidense 4,944,944 (Tang).
Modalidades de la invención resuelven estos varios problemas proporcionando una fórmula nutricional que, como se alimenta, proporciona cantidades incrementadas de monoglicéridos y ácidos grasos libres esenciales que pueden ser fácilmente absorbidos a través del intestino de un infante. Como un resultado, los sujetos alimentados con la fórmula pueden proporcionados con los beneficios de DHA, EPA, y ARA. En algunas modalidades, la fórmula nutricional no introduce nuevos ingredientes excepto las grasas pre-hidrolizadas que están presentes en las fórmulas existentes. En ciertas modalidades, bebés alimentados con la fórmula son proporcionados con los beneficios del ácido graso obtenido por infantes alimentados con leche materna, sin exposición a suplementos de lipasa. En otras modalidades, la fórmula nutricional de la invención contiene una lipasa altamente específica que permite el uso de una cantidad mínima de lipasa agregada a la fórmula infantil para proporcionar cantidades incrementadas de monoglicéridos y ácidos grasos libres de cadena larga, particularmente DHA, EPA, y ARA.
En algunas modalidades, la fórmula nutricional conduce a la absorción mejorada de ácidos grasos. En algunas modalidades, un sujeto ingiere la fórmula nutricional por 3 días, 5 días, 7, días, 10 días, 14 días, 30 días, 60 días, o more. En algunas modalidades, tal ingestión de una fórmula nutricional de la invención reduce la grasa total en las heces, y específicamente puede reducir los niveles de DHA, ARA, y/o EPA en las heces. En algunas modalidades, esta reducción es medida con relación a la composición de las heces del sujeto previo a comenzar la ingesta de la fórmula nutricional. En algunas modalidades, esta reducción es medida con relación a la composición de las heces de un sujeto alimentado con una fórmula nutricional que no ha sido expuesta a lipasa previo a la ingestión, tal como una fórmula nutricional actualmente disponible. Los niveles de grasa total, DHA, ARA, y/o EPA en las heces pueden ser reducidos por al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, o más. En ciertas modalidades, los niveles de grasa total, DHA, ARA, y/o EPA en las heces son reducidos por entre 50 y 80%. En algunas modalidades, el nivel de grasa total en las heces se reduce por al menos 50%. En algunas modalidades, el nivel de al menos un LC-PUFA (tal como DHA, ARA, o EPA) en las heces se reduce por al menos 50%. En algunas modalidades, el nivel de al menos un LC-PUFA (tal como DHA, ARA, o EPA) en las heces se reduce por al menos 60%. En algunas modalidades, los niveles de DHA, ARA, y EPA en las heces son cada uno reducidos por al menos 50%. En algunas modalidades, los niveles de DHA, ARA, y EPA en las heces son cada uno reducidos por al menos 60%. En algunas modalidades, la ingestión de la fórmula nutricional mejora la acumulación en plasma, eritrocitos y tejido de niveles de grasas, que incluyen niveles de DHA y ARA. Los tejidos pueden incluir tejido de la retina, corazón, adiposo y renal. En algunas modalidades, la ingestión de la fórmula nutricional incrementa el nivel de DHA, ARA, o ambos en el plasma, eritrocitos, o ambos. En algunas modalidades, la ingestión de la fórmula nutricional incrementa el nivel de DHA, ARA, o ambos en la retina. En algunas modalidades, la ingestión de la fórmula nutricional incrementa el nivel de DHA, ARA, o ambos en el corazón. En algunas modalidades, la ingestión de la fórmula nutricional incrementa el nivel en plasma de triglicéridos, colesterol, HDL, y/o LDL. En algunas modalidades, la ingestión de la fórmula nutricional incrementa la relación de HDL a LDL en el plasma del sujeto.
En algunas modalidades, la ingestión de la fórmula nutricional incrementa el nivel en plasma de la vitamina A y/o vitamina E. Sin pretender ser ligado por teoría, se cree que este incremento es debido al hecho de que las vitaminas A y E son típicamente proporcionadas como ésteres, los cuales deben ser hidrolizados. La exposición a lipasa en varios métodos y composiciones de la invención se cree mejora la hidrólisis de estos ésteres de vitamina, conduciendo a mayor acumulación de vitaminas A y E en el plasma.
En algunas modalidades, la ingestión de la fórmula nutricional tiene efectos benéficos sin acumulación significantemente incrementada de grasa en el hígado. La enfermedad de hígado graso (FLD, por sus siglas en inglés) se caracteriza por acumulación incrementada de grasa, especialmente triglicéridos, en las células del hígado. La condición también está asociada con otras enfermedades que tienen influencia en el metabolismo de la grasa. Es normal para el hígado contener algo de grasa y por sí mismo, esto no causa síntomas. En algunos pacientes, el hígado graso puede estar acompañado por inflamación hepática y muerte de células hepáticas (esteatohepatitis). Existe también una asociación con el cáncer de hígado (carcinoma hepatocelular). La resistencia a la insulina, así como también consumo incrementado de carbohidratos y ácidos grasos saturados, y una baja ingesta de fibra y ácidos grasos omega-3, son todos positivamente asociados con la patogénesis de FLD.
Las causas de FLD incluyen dieta, medicamentos, enfermedades y condiciones médicas. El consumo de calorías en exceso puede causar FLD; la ingesta calórica en exceso abruma la capacidad del hígado para metabolizar la grasa en una forma normal, lo cual resulta en acumulación de grasa en el hígado. Un número de medicamentos, que incluyen tamoxifeno, inyección de amiodarona, amiodarona oral, y metotrexato están asociados con FLD. El hígado graso es también asociado con la diabetes tipo II, obesidad, y niveles de triglicéridos altos en la sangre, enfermedad celiaca, y enfermedad de Wilson (anormalidad del metabolismo del cobre), rápida pérdida de peso, y desnutrición.
Lipasa La insuficiencia pancreática y otras condiciones asociadas con la capacidad reducida para hidrolizar triglicéridos de cadena larga o ásteres de ácidos grasos de cadena larga son actualmente tratadas con enzimas digestivas suplementarias, que incluyen lipasa pancreática. Sin embargo, las enzimas pancreáticas, y particularmente lipasa pancreática presentes en estos suplementos, son a menudo sensibles a la degradación por ácido gástrico y pepsina de manera que solamente una pequeña fracción de las enzimas ingeridas alcanza el duodeno en forma activa. E. Ville et al., Digestión 65:73-81 (2001). Desafortunadamente muchos de los recubrimientos protectores de ácido tienen problemas de seguridad potencial para poblaciones de infantes o pacientes inmuno comprometidos, puesto que una porción significante del peso suministrado es el recubrimiento plástico. Sin embargo, aunque los recubrimientos protectores de ácido han ayudado, persiste algún grado de mala absorción, causando que los pacientes con insuficiencia pancreática requieran dosis incrementadas de suplementos enzimáticos. Esta persistencia de mala absorción de ácidos grasos de enzimas completamente recubiertas puede ser debido al hecho de que el duodeno y ycyuno superior en pacientes con insuficiencia pancreática son a menudo ambientes acídicos, de manera que la elevación esperada en pH no se logra y el recubrimiento protector no es apropiadamente disuelto para liberar la enzima. D. Graham, New England J. Med. 296(23):1314-1317 (1977). Ambos de estos problemas han sido atendidos incrementando la dosis de lipasa administrada. Desafortunadamente, como se indica previamente, altas dosis de suplemento de enzima pancreática se han encontrado por estar asociados con la colonopatía fíbrosante. De este modo, algunas modalidades de la invención proporcionan fórmulas nutricionales que comprenden porcentajes superiores de monoglicéridos y/o ácidos grasos libres de cadena larga sin contener lipasa agregada. Algunas modalidades proporcionan fórmulas nutricionales que comprenden una dosis optimizada de lipasa, como se describe en la presente.
Las lipasas se pueden obtener de animales, plantas, y muchos microorganismos naturales o diseñados genéticamente. Muchos, sino la mayoría, de los suplementos de lipasa de dieta comercialmente disponibles son derivados de animales y son particularmente susceptible a la degradación por las enzimas digestivas. Una alternativa menos frecuentemente usada es la lipasa microbiana, es decir, lipasa producida en bacterias u hongos, tales como, por ejemplo, levadura. Las lipasas microbianas retienen la actividad sobre un intervalo de pH más amplio que las lipasas animales o vegetales, de este modo eliminando la necesidad de tabletas recubiertas entéricas. Sin embargo, las enzimas microbianas tienden a ser degradadas por la tripsina en el intestino delgado, de este modo reduciendo su disponibilidad para descomponer los triglicéridos y ésteres en el intestino. En ciertas modalidades, las lipasas usadas en la fórmulas, métodos, o dispositivos de la invención son lipasas bacterianas, lipasas fúngicas, o ambas.
La especificidad y cinéticas de lipasas individuales pueden variar significantemente. La especificidad de las lipasas es controlada por las propiedades moleculares de la enzima, estructura del sustrato y factores que afectan la unión de la enzima al sustrato. Los tipos de especificidad incluyen especificidad del sustrato, es decir, una lipasa dada puede ser más activa en la descomposición de un tipo de ácido graso que otra lipasa, y especificidad posicional, la cual involucra hidrólisis preferencial de enlaces de éster en las posiciones 1 y/o 3 del esqueleto de glicerol de un triglicérido.
Se ha determinado ahora que la lipasa producida por Chromobacterium viscosum, Pseudomonas fluorescens, Burcholderia cepacia, y Rhizopus oryzae tiene mayor especificidad para DHA, EPA, y ARA que otras lipasas, tales como lipasas producidas por Candida rugosa, Rhizomucor miehei, Penicilium camemberti, Aspergillus niger, y Aspergilis oryzae. Como un resultado, los suplementos de lipasa o productos nutricionales suplementados con lipasa que comprenden Chromobacterium viscosum, Pseudomonas fluorescens, Burcholderia cepacia, y/o Rhizopus oryzae proporcionarán hidrólisis incrementada de TG-DHA, TG-EPA, y/o TG-ARA. Por consiguiente, un aspecto de la invención proporciona suplementos de lipasa o productos nutricionales suplementados con lipasa que comprenden lipasa de Chromobacterium viscosum, lipasa de Pseudomonas fluorescens, lipasa de Burcholderia cepacia, y/o lipasa de Rhizopus oryzae. En algunas modalidades, la lipasa es lipasa de Chromobacterium viscosum, lipasa de Pseudomonas flúor escens, o lipasa de Rhizopus oryzae. En ciertas modalidades, la lipasa es lipasa de Rhizopus oryzae.
La referencia a la lipasa de ciertas especies, tales como lipasa de Chromobacterium viscosum, lipasa de Pseudomonas fluorescens, lipasa de Burcholderia cepacia, y lipasa de Rhizopus oryzae, no significa necesariamente que la lipasa se preparó directamente a partir de las especies hospederas nativas. Por ejemplo, la misma lipasa podría ser producida recombinantemente en otra célula hospedera.
Otro aspecto de la invención es un método para incrementar la absorción de DHA, EPA, y/o ARA administrando una o más de las lipasas de Chromobacterium viscosum, Pseudomonas fluorescens, Burcholderia cepacia, y Rhizopus oryzae, como un suplemento de dieta, o pre-hidrolizando una fórmula que contiene DHA, EPA, y/o ARA con una o más de estas enzimas. En algunas modalidades, la lipasa es lipasa de Chromobacterium viscosum, lipasa de Pseudomonas fluorescens, o lipasa de Rhizopus oryzae. Un aspecto adicional de la invención proporciona lipasas con actividades específicas para DHA, EPA, y/o ARA que son comparables con las actividades específicas de una o más de Chromobacterium viscosum, Pseudomonas fluorescens, Burcholderia cepacia, y Rhizopus oryzae como se determina por cromatografía líquida de alto desempeño de fase inversa (RP-HPLC) y se describe en el Ejemplo 1. En algunas modalidades, la lipasa tiene actividades específicas para DHA, EPA, y/o ARA que son comparables con las actividades específicas de una o más de lipasa de Chromobacterium viscosum, lipasa de Pseudomonas fluorescens, o lipasa de Rhizopus oryzae. Una modalidad de la invención es una fórmula nutricional que contiene menos de 5,000 unidades de lipasa (con unidades evaluadas en un ensayo estándar de aceite de oliva, tal como se describe en Pharmaceutical Enzymes: Properties and Assay Methods, R. Ruyssen y A. Lauwers (Eds) Scientific Publising Company, Ghent, Gelgium (1978)). En otras modalidades, la fórmula nutricional contiene menos de 3,000 unidades de lipasa. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene menos de 1,000 unidades. En ciertas modalidades, la fórmula que contiene menos de 5,000, menos de 3,000, o menos de 1,000 unidades de lipasa es una fórmula infantil o una fórmula nutricional médica.
Lipasa inmovilizada Los procesos para inmovilizar enzimas y otras proteínas a soportes insolubles son bien conocidos y se describen en la literatura. La inmovilización de la lipasa puede mejorar la estabilizad de la enzima, proporcionarla reutilizable, y permitir a los productos ser fácilmente separados de la enzima sin contaminación por lipasa. En algunas modalidades, la lipasa está covalentemente unida a un soporte sólido, sin embargo, el enlace no covalente también puede ser usado. Los métodos adecuados de inmovilización de lipasa incluyen, por ejemplo, adsorpción, enlace iónico, enlace covalente, reticulación, encapsulación, y atrapamiento en matrices inorgánicas y poliméricas, hidrofóbicas o hidrofílicas. Véase Y. Ren et al., BMC Biotechnol. 11:63 (2011); V.R. Murty et al., Biotechnol. Bioprocess Eng. 7:57-66 (2002). La lipasa puede ser inmovilizada enlazándose directamente a un material de soporte o a través de un enlazador. Véase, por ejemplo, Stark and Holmberg, Biotechnol. and Bioeng. 34(7):942-950 (1989).
La inmovilización por adsorción es reversible y típicamente involucra fuerzas hidrofóbicas. Es simple y barato, pero tiene la desventaja de inmovilización incompleta o enzimas fugadas a partir del soporte insoluble. Ejemplos de lipasa inmovilizada usando este método se pueden encontrar en E. Lie et al., Chem. Technol. and Biotechnol. 50:549-553 (1991) (lipasa de Candida cylindracea, soporte de zeolita); M. Basri et al., J. Chem. Technol. and Biotechnol. 59:37-44 (1994) (lipasa de Candida rugosa; soporte de polímero); H. Gunnlaughsdottir et al., Enzyme and Microbiol. Tech. 22:360-367 (1998) (lipasa de Humicola lanuginose; soporte de perillas de vidrio). Soportes adecuados para inmovilización por adsorción incluyen, por ejemplo, perlillas de cerámica tales como Toyonita (Toyo Denka Kogyo Co., Ltd.).
El enlace iónico se basa en interacciones electrostáticas entre la lipasa y grupos iónicos cargados de manera diferente en matrices tales como por ejemplo, DEAE-celulosa o DEAE-Sephadex en un soporte sólido. El enlace iónico provoca cambio mínimo a la conformación de la lipasa y proporciona lipasa inmovilizada con alta actividad en la mayoría de los casos. Se debe tener en mente, sin embargo, que aunque las fuerzas de enlace entre la enzima y el soporte son más fuertes que cuando se usa la absorción, no es tan fuerte como el enlace covalente y de este modo, puede ocurrir la fuga de la lipasa a partir del soporte.
El enlace covalente se basa en enlaces covalentes entre un material de soporte y un grupo funcional en un aminoácido o en un aminoácido en la superficie de la lipasa. Los grupos funcionales que pueden tomar lugar en esta unión de enzima al soporte pueden ser grupos amino, carboxilo, sulfhidrilo, hidroxilo, imidazol, o fenólicos, los cuales no son esenciales para la actividad catalítica de la lipasa. Con el fin de proteger el sitio activo, la inmovilización se puede llevar a cabo en la presencia de sustrato o un inhibidor competitivo. Una ventaja significante para usar el enlace covalente de la lipasa a un material de soporte es la intensidad del enlace, es decir, la estabilidad de la inmovilización. Para un ejemplo de lipasa inmovilizada por enlace covalente, véase S. Emi et al., European Polymer 10urnal 30(5):589-595 (1994). Los soportes adecuados para el enlace covalente incluyen, por ejemplo, Immobead™ (ChiralVision).
La reticulación involucra unir la lipasa a la misma para formar una estructura tridimensional o unir la lipasa a una estructura sólida usando un agente de reticulación. Por ejemplo, la lipasa puede ser reticulada a perlillas de quitosán. Véase S.H. Chiou et al., Prep. Biochem. Biotechnol. 37(3):265-275 (2007). La inmovilización de la lipasa por encapsulación usualmente involucra la formación de un recubrimiento poroso o membrana semi-permeable alrededor de la lipasa de manera que la lipasa está contenida dentro del material poroso, pero los triglicéridos y ésteres pueden pasar libremente a través de esta. La inmovilización de la lipasa por atrapamiento involucra restringir el movimiento de la enzima atrapándola en una estructura reticular. Las perlillas de alginato pueden ser usadas para este tipo de inmovilización. I. Bushan et al., J. Bioactive and Compatible Polymers 23(6):552-562 (2008). Los polímeros naturales y sintéticos también pueden ser usados. Véase también, G. Femandez-Lorente et al., J. Am Oil Chem. Soc. (publicado en línea el 14 de Diciembre 2010) y G. Fernandez-Lorente et al., J. Am. Oil Chem. Soc. 88:1173-1178 (2011).
En ciertas modalidades, fórmulas, métodos, y dispositivos de la invención utilizarán lipasa que ha sido cristalizada y reticulada para estabilidad incrementada como se describe en la Patente Estadounidense 6,541,606 (Margolin), ya sea con o sin otra forma de inmovilización, tal como encapsulación.
En algunas modalidades, la lipasa es inmovilizada a nanopartículas magnéticas (MNP, por sus siglas en inglés). Estas MNPs pueden ser recubiertas por enlazadores o polímeros que contienen grupos funcionales amino o epoxi a los cuales las lipasas se hacen reaccionar. Un recubrimiento adecuado para MNPs es, por ejemplo, polidopamina. Véase, por ejemplo, Y. Ren et al., BMC Biotechnology 11:63 (2011). El uso de MNPs para inmovilización de lipasa tiene ventajas tales como biocompatibilidad, supermagnetismo, tamaño pequeño y baja toxicidad. Las propiedades magnéticas de las nanopartículas facilitan la remoción de la lipasa de la solución y también proporciona otros medios para unir la lipasa MNP a un soporte sólido.
En algunas modalidades, la lipasa inmovilizada es una lipasa microbiana. En algunas modalidades, la lipasa inmovilizada se selecciona a partir de lipasas bacterianas. En algunas modalidades, la lipasa inmovilizada es una o más lipasas seleccionadas a partir de Chromobacterium viscosum, Pseudomortas fluorescens, Burcholderia cepacia , y Rhizopus oryzae.
En ciertas modalidades, la lipasa (sea inmovilizada o no) se agrega a la fórmula por 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30 minutos o más. La hidrólisis de triglicéridos de LC-PUFA y ésteres es medida por RP-HPLC. En ciertas modalidades, el porcentaje de hidrólisis de triglicéridos de LC-PUFA y ésteres es 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100% por 30 minutos. En modalidades, el porcentaje de hidrólisis de triglicéridos de LC-PUFA y ésteres es 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100% por 20 minutos. En modalidades, el porcentaje de hidrólisis de triglicéridos de LC-PUFA y ésteres es 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100% por 10 minutos. En ciertas modalidades, la lipasa es lipasa de Rhizopus oryzae.
Dispositivos que Comprenden Lipasa Inmovilizada De conformidad con varias modalidades, la presente descripción proporciona dispositivos y métodos para preparar productos nutricionales. Los dispositivos y métodos pueden ser usados para exponer la fórmula infantil u otros productos nutricionales a lipasas previo al consumo. Las lipasas por consiguiente descompondrán grasas y aceites con liberación subsecuente de ácidos grasos libres y monoglicéridos. Los dispositivos y métodos permitirán los medios convenientes para preparar fórmula u otros productos nutricionales. En algunas modalidades, los dispositivos y métodos permitirán a los infantes u otros quienes consumen los productos, evitar consumir lipasa exógena. En algunas modalidades, los dispositivos y métodos permitirán la producción de fórmulas que contienen monoglicéridos y/o ácidos grasos libres pero que no contienen alguna cantidad significante de lipasa (como se determina por ELISA).
Las Figuras 1, 2A-2C, 3A-3C, 4A-4B, 5A-5B, 9A-9C, 10A-10C, 11A-11C, 12, 13A-13B, 14, 15, 16, 17A-17B, 18, 19, 20, y 21 ilustran dispositivos de conformidad con varias modalidades de la presente descripción. Como se muestra en la Figura 1, los dispositivos 100 de la presente descripción pueden incluir un contenedor 110 configurado para mantener la fórmula infantil 120 u otros productos nutricionales líquidos. Como se describe en detalle abajo, el contenedor 110 puede incluir lipasas que son inmovilizadas de manera que la fórmula 120 que es alimentada al infante a través de una sonda nasogástrica 114 u otros mecanismos de alimentación (por ejemplo, un biberón) no contienen lipasas en cualquier cantidad apreciable. Por ejemplo, las lipasas pueden ser inmovilizadas en o dentro de las estructuras 150 encontradas a lo largo de la pared o de otro modo dentro del contenedor de manera que las lipasas están en contacto fluido con la fórmula 120 dentro del contenedor. Además, como se discute con referencia a varias modalidades abajo, la fórmula puede ser agregada al contenedor 110, en varias formas para permitir el tratamiento enzimático de lipasas dentro del contenedor 110. Por ejemplo, el fluido puede ser alimentado a través de una sonda 112 o vertido en el contenedor, y puede ser subsecuentemente pasado a través de una sonda nasogástrica u otros dispositivos para alimentación.
A través de esta descripción, los dispositivos y métodos serán referidos para uso en el tratamiento o preparación de la fórmula nutricional, tal como, por ejemplo, fórmula infantil y fórmula nutricional médica. Se apreciará que los dispositivos y métodos pueden ser usados para tratar o preparar cualquier tipo de fórmula nutricional para lo cual puede ser benéfico proporcionar el tratamiento de lipasa previo al consumo. Tales productos pueden incluir cualquier fórmula nutricional para ser consumida por cualquiera con insuficiencia pancreática u otra capacidad reducida para hidrolizar triglicéridos de cadena larga o PUF As de cadena larga esterificados.
Las Figuras 2A-2C y 3A-3C ilustran dispositivos más detallados, de conformidad con varias modalidades. Como se muestra, los dispositivos 200-202, 300-302 pueden incluir un contenedor 210, 310 para retener la fórmula líquida. El contenedor 210, 310 puede incluir una variedad de diferentes tipos y configuraciones. Por ejemplo, el contenedor 210, 310 puede incluir una jarra o vial de vidrio o plástico, una bolsa (por ejemplo, silicona u otros materiales flexibles como una bolsa para salina IV), un contenedor cilindrico tal como un barril de jeringa, u otro contenedor que es dimensionado y conformado para mantener una cantidad deseada de fórmula u otro producto.
Como se indica, los dispositivos de la presente descripción pueden permitir a la fórmula estar expuesta a lipasas para obtener los efectos enzimáticos deseados, mientras permite a la fórmula entonces ser convenientemente consumida sin consumir lipasas. Por consiguiente, en varias modalidades, las lipasas son inmovilizadas dentro del contenedor 210, 310 de manera que, cuando la fórmula es removida (por ejemplo, a través de una sonda nasogástrica, chupón para un biberón, o transfiriendo la fórmula a otro contenedor), las lipasas permanecen en el contenedor 210, 310 o pueden ser removidas de la fórmula previo al consumo. En otras modalidades, las lipasas son inmovilizadas dentro del contenedor 210, 310, por ejemplo, en soportes sólidos removibles, de manera que las lipasas pueden ser fácilmente removidas del contenedor, mientras se deja la fórmula en el contenedor para consumo posterior.
Las Figuras 2A-2C muestran una configuración para el contenedor 210, junto con ciertas modalidades para inmovilizar lipasas dentro del contenedor 210. Como se indica, el contenedor 210 puede incluir una variedad de materiales, tamaños y formas diferentes. Además, el contenedor 210 puede incluir uno o más puertos de acceso 220, 230 para controlar el flujo de la fórmula 260 dentro y fuera del contenedor.
Las lipasas pueden ser inmovilizadas dentro del contenedor 210 en una variedad de formas. Por ejemplo, las lipasas pueden ser inmovilizadas o contenidas dentro de estructuras 250, 252 localizadas dentro del contenedor 210 (Figuras 2A y 2C). Adicionalmente, o alternativamente, las lipasas 251 pueden ser inmovilizadas en o contenidas dentro de la pared del contenedor 210 (Figura 2B). Por consiguiente, como la fórmula 260 es colocada dentro del contenedor, la fórmula 260 entra en contacto con las lipasas para producir los efectos enzimáticos deseados.
Como se indica, las lipasas pueden ser inmovilizadas dentro del contenedor uniendo las lipasas a estructuras 250, 252 dentro del contenedor y/o a las paredes 251 del contenedor. Las estructuras dentro del contenedor pueden tener una variedad de configuraciones. Por ejemplo, en ciertas modalidades, las estructuras pueden incluir perlillas, bolas, o cualquier otra estructura que puede la misma ser móvil dentro del contenedor de manera que las estructuras fluyen dentro de la fórmula. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 4A, las estructuras 250 pueden incluir perlillas o bolas que tienen una pared de superficie 256 a la cual las lipasas 257 pueden ser unidas. Además, se entenderá que las estructuras 250, 252 pueden tener una variedad de diferentes formas o configuraciones (por ejemplo, cuboide, ovoide, similar a varilla).
Las estructuras 250, 252 y/o configuración de la pared del contenedor 210 pueden ser configuradas para proporcionar un área de superficie deseada de manera que la fórmula es capaz de entrar en contacto con una cantidad suficiente de lipasa durante un periodo de tiempo aceptable. Por ejemplo, las estructuras 250, 252 pueden incluir perlillas numerosas 250 (Figura 2A) o estructuras similares a varillas 252 (la Figura 2C) para proporcionar una alta área de superficie para unir una cantidad suficiente de lipasa. Alternativamente, si se usan periodos de tiempo más largos están disponibles para incubar la fórmula con las lipasas antes del consumo y/o lipasas con alta actividad enzimática, cantidades más pequeñas de lipasa pueden ser adecuadas.
En varias modalidades, las estructuras 250, 252 y/o contenedores son construidos de manera que, como la fórmula 260 es removida del contenedor para consumo o almacenaje, la lipasa no se mantiene dentro de la fórmula 260. Por ejemplo, las perlillas 250 o estructuras similares a varillas pueden ser dimensionadas de manera que no pasarán a través de un puerto de acceso relativamente pequeño 230. Alternativamente, o adicionalmente, las estructuras pueden ser unidas a la pared del contenedor y/o el contenedor puede incluir una pantalla o filtro que es dimensionado para prevenir el movimiento de las estructuras con la fórmula 260. Además, las estructuras 250, 252 pueden tener otras propiedades que facilitan su separación de la fórmula. Por ejemplo, las estructuras 250 pueden ser formadas de perlillas magnéticas que pueden ser removidas por unión a un filtro magnético.
En algunas modalidades, en lugar de inmovilizar las lipasas por unión a estructuras dentro del contenedor 210 y/o pared del contenedor, las lipasas 257’ están contenidas dentro de las estructuras 250, 252 y/o la pared del contenedor 251. La Figura 4B ilustra una de tal modalidad. Como se muestra, las estructuras 250’ pueden incluir perlillas u otras formas que tienen una pared 256’. La pared puede ser formada de materiales semipermeables que permiten el ingreso y egreso de la fórmula 260 pero no las lipasas 257’. Tal encapsulación puede ser usada de manera similar para otras estructuras (por ejemplo, 252) y/o para la pared del contenedor de manera que la superficie de la pared tiene un material semi-permeable, dentro del cual las lipasas pueden estar contenidas.
El contenedor puede tener de manera similar configuraciones de superficie que proporcionan cantidades incrementadas de lipasa y/o contacto incrementado de lipasas con la fórmula 260. Por ejemplo, la pared del contenedor puede tener crestas u otras modificaciones de superficie para incrementar el área de superficie. Además, en lugar de incluir un espacio abierto único, el contenedor puede incluir variaciones en la trayectoria de flujo, por ejemplo, a lo largo de una trayectoria devanada para permitir la exposición prolongada o por más tiempo a las lipasas y/o una recolección de canales o sondas en los cuales las lipasas son inmovilizadas y a través de los cuales la fórmula puede fluir. Véase, por ejemplo, Figura 1, elemento 150 y Figura 21, elemento 2101.
En ciertas modalidades, el contenedor puede ser manufacturado y preenvasado con lipasas en cualquiera de las modalidades descritas en la presente. Durante el uso, el contenedor puede ser abierto, y la fórmula puede ser colocada dentro del contenedor para contactar las lipasas por un tiempo suficiente para producir los efectos enzimáticos deseados. En otras modalidades, estructuras tales como perlillas 250 o estructuras similares a varillas tienen lipasas inmovilizadas a sus superficies o contenidas/encapsuladas dentro pueden ser envasadas y distribuidas, y estas estructuras pueden ser colocadas en un contenedor separado que contiene la fórmula. En algunas modalidades, puede ser benéfico sacudir o agitar el contenedor que comprende lipasa inmovilizada y fórmula por un periodo de tiempo.
Como se indica, la fórmula 260 puede ser colocada en el contenedor 210 mediante varios puertos de acceso. Por ejemplo, el contenedor puede incluir un puerto de acceso superior y/o un puerto de acceso inferior 230. Los puertos 220, 230 pueden ser usados para ingreso y egreso de la fórmula respectivamente. Además, un puerto único puede ser usado, o puertos múltiples pueden ser usados. Los puertos pueden comprender una estructura configurada para acoplar otros dispositivos que pueden ser usados para la alimentación o transferencia de fluidos. Por ejemplo, los puertos pueden incluir un conector tal como una conexión de cierre luer, roscas, y/o un conducto o tubo que puede acoplarse a una sonda nasogástrica. Además, los puertos pueden ser configurados para acoplar un biberón, chupón de biberón, o cualquier otra estructura para facilitar la transferencia de fluido a otro contenedor o para ayudar en la alimentación. Además, uno o ambos puertos 220, 230 pueden incluir una válvula 140 (Figura 1), 240 (Figura 2A) u otro mecanismo de control de flujo del fluido.
Las Figuras 3A-3C ilustran dispositivos de la presente descripción, de conformidad con ciertas modalidades. Como se muestra, los dispositivos 300-302 incluyen un contenedor 310 para recibir la fórmula 260. Además, el contenedor 310 puede incluir una tapa 322 u otro dispositivo de cierre, tal como una rosca superior para una jarra o botella. Similar a las modalidades mostradas en las Figuras 2A-2C, los dispositivos pueden incluir estructuras 350, 351, 35G, y 353 que incluyen lipasas inmovilizadas a sus superficies y/o encapsuladas en estas.
Las modalidades de las Figuras 3A-3C pueden proporcionar separación más rápida de la fórmula a partir de las estructuras que contienen lipasas. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 3A, las estructuras similares a varilla 350 pueden contener lipasas, y después del tratamiento enzimático de la fórmula, la tapa 322 puede ser removida para remover simultáneamente las estructuras 350 y lipasas. Además, la tapa 322 puede ser reemplazada con otra capa, chupón de botella, u otra conexión de fluido. De manera similar, las estructuras que tienen otras configuraciones, como las bolas o perlillas 351, 35 G (Figura 3B), pueden ser dimensionadas para remoción fácil de la fórmula 260. Por ejemplo, como se muestra, las perlillas 351, 35 G son dimensionadas de manera que pueden ser fácilmente removidas de manera manual o por filtración. Además, el contenedor 310 puede proporcionar lipasas que son inmovilizadas a, o contenidas dentro de su superficie interior 353, y después del tratamiento enzimático, la fórmula 260 puede ser transferida a otro contenedor, o consumida reemplazando la tapa 322 con un chupón de botella u otra conexión a un sistema de alimentación.
Alternativamente, o adicionalmente, las estructuras 350, 351, 35 G pueden tener una pared exterior con componentes adicionales proporcionando lipasas inmovilizadas contenidas en esta. Por ejemplo, la estructura 35 G (Figura 3B), ilustra una modalidad en donde la estructura 35 G tiene una pared exterior permeable que encierra numerosas perlillas 250. La pared exterior puede incluir una malla u otra configuración que permite el movimiento fácil de la fórmula hacia dentro y hacia afuera de la estructura 351’ para proporcionar contacto con las perlillas 250. Además, las perlillas pueden proporcionar lipasas, las cuales pueden ser inmovilizadas a sus superficies o encapsuladas en estas, como se describe en varias modalidades anteriores.
Como se indica anteriormente, las estructuras que contienen las lipasas pueden ser manufacturadas y distribuidas como componentes preenvasados junto con el contenedor 310. Alternativamente, o adicionalmente, las estructuras pueden ser envasadas y distribuidas de manera separada a partir del contenedor. Por ejemplo, una tapa 322 que contiene estructuras similares a varillas 350 o perlillas 351, 35G, o de otro modo que tiene lipasa contenida en esta o inmovilizada a esta, puede ser manufacturada y distribuida. La tapa puede ser configurada para conexión con biberones estándares, botellas de agua, y otro contenedor o dispositivo que puede contener la fórmula.
En otras modalidades, las lipasas pueden ser proporcionadas de manera que las lipasas contactan la fórmula conforme la fórmula es colocada en un contenedor y/o durante la alimentación o remoción de un contenedor. Por ejemplo, la Figura 5A ilustra un dispositivo 500, de conformidad con modalidades ejemplares. El dispositivo 500 puede incluir un biberón estándar, y las lipasas pueden ser inmovilizadas a una superficie interior 510 de la orilla del chupón o chupón mismo. Como tal, la fórmula entrará en contacto con las lipasas durante el uso normal. De manera similar, las lipasas pueden estar contenidas dentro o sobre otras estructuras que pueden ser usadas para alimentación, tal como una sonda de fluido de un dispositivo de alimentación nasogástrico.
Alternativamente, las lipasas pueden ser proporcionadas en un elemento separado configurado para permitir el contacto de la fórmula con las lipasas durante el flujo del fluido normal. Por ejemplo, en una modalidad, las lipasas pueden estar contenidas dentro de un alojamiento 520 configurado para acoplamiento con un cierre de botella tal como un chupón (Figura 5A) o una tapa/parte superior de la botella (Figura 5B). El alojamiento 520 puede incluir paredes permeables que permiten a la fórmula fluir a través de su volumen y contactar las lipasas proporcionadas en este.
Las lipasas contenidas dentro del alojamiento 520 pueden ser proporcionadas en varias formas. Por ejemplo, en algunas modalidades, las lipasas son inmovilizadas en perlillas 550 dentro del alojamiento 520 por enlace o encapsulación, como se describe previamente. Además, el alojamiento 520 puede incluir una malla abierta u otra configuración que permite a la fórmula fluir a través de esta. Por ejemplo, con la configuración de botella mostrada en la Figura 5A, una malla abierta o trayectoria de flujo a través del alojamiento 520 permitirá a la fórmula contactar las lipasas conforme la fórmula sale de una botella durante la alimentación. Alternativamente, como se muestra en la Figura 5B, la fórmula puede ser vertida dentro o fuera de la parte superior 530 del alojamiento para permitir el contacto de la fórmula con las lipasas durante el llenado o vaciado del contenedor 310. La parte superior 530 y/o cualquier otra porción del alojamiento 520 pueden ser formadas de una variedad de materiales. Por ejemplo, el alojamiento 520 puede ser formado de una membrana que permite el flujo del fluido controlado. Además, la parte superior 530 puede ser formada de una membrana semi-permeable que permite el flujo del líquido (fórmula) a través de este, pero no permiten el pasaje de lipasas. Por consiguiente, la membrana que forma la parte superior 530 puede servir para inmovilizar las lipasas dentro del contenedor 310 sin de otro modo unir o inmovilizar las lipasas dentro del contenedor 310.
En varias modalidades, los dispositivos descritos anteriormente pueden incluir modificaciones para mejorar o de otro modo controlar la actividad de la lipasa. Por ejemplo, los contenedores 110, 210, 310 pueden incluir sistemas de agitación para permitir el movimiento continuo de la fórmula durante un periodo de incubación, de este modo permitiendo a las lipasas entrar en contacto con los ácidos grasos encontrados a través del volumen del fluido. Además, los dispositivos pueden incluir sistemas para controlar la temperatura para mejorar o controlar la actividad de la lipasa.
Ciertas modalidades de la invención proporcionan un contenedor que contiene la fórmula nutricional y una lipasa. En algunas modalidades, la lipasa está en contacto con la fórmula nutricional en el contenedor. En otras modalidades, la lipasa y la fórmula nutricional no están en contacto en el contenedor. En algunas modalidades, la fórmula nutricional y la lipasa están contenidas en compartimientos separados dentro del contenedor. En algunas modalidades, la fórmula nutricional está en forma seca. En algunas modalidades, la fórmula nutricional está en forma líquida. En algunas modalidades, la lipasa se lleva en contacto con la fórmula nutricional liberando la lipasa en el compartimiento que contiene la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la lipasa es llevada en contacto con la fórmula nutricional transfiriendo la lipasa y la fórmula nutricional en otro contenedor (por ejemplo, vaciando el compartimiento de la lipasa y el compartimiento de la fórmula nutricional en el otro contenedor). En algunas modalidades, el líquido se agrega al otro contenedor antes o después de transferir la lipasa y la fórmula nutricional en el otro contenedor.
Los dispositivos de conformidad con la presente descripción pueden tener un número de diferentes formas y/o configuraciones. Por ejemplo, las Figuras 9A-9C, 10A-10C, 11A-11C, 12, 13A-13B, 14, 15, 16, 17A-17B, 18, 19, 20, 21 ilustran varias formas y configuraciones adicionales. En cada una de las configuraciones descritas con respecto a estas figuras, las lipasas pueden ser inmovilizadas usando cualquiera de los métodos descritos anteriormente (por ejemplo, inmovilizando lipasas en estructuras tales como perlillas dentro de un dispositivo, y/o inmovilizando lipasas dentro de o en una pared u otra superficie de un dispositivo). Además, la configuración específica puede ser seleccionada para proporcionar una variedad de características diferentes, tales como área de superficie, volumen, cantidad de lipasas, y/o tiempo de exposición de materiales a enzimas.
Los dispositivos ilustrados en las Figuras 9A-9C, 10A-10C, 11A-11C, 12, 13A-13B, 14, 15, 16, 17A-17B, 18, 19, 20, 21 pueden ser configurados para permitir el contacto de lipasas en una variedad de formas. Por ejemplo, en varias modalidades, una porción de todo el dispositivo puede ser insertada dentro de un contenedor que incluye la fórmula con el fin de permitir el contacto entre la fórmula y las lipasas. En otras modalidades, el dispositivo está configurado para tratamiento en línea de la fórmula.
Las Figuras 9A-9C ilustran varias configuraciones para dispositivos que pueden ser colocados dentro de un contenedor para tratar la fórmula. Como se muestra, el dispositivo 900, 920 (Figuras 9A y 9C) puede tener una variedad de diferentes formas formadas de una pared exterior 901, 901” que encierra las lipasas. Como se indica anteriormente, las lipasas 902 pueden ser inmovilizadas en una variedad de formas diferentes, que incluyen mediante unión a perlillas. Además, los dispositivos 910 (Figura 9B) pueden incluir más de un bolsillo o abertura 903 formado en una o más paredes 90 G. La configuración específica, número de bolsillos o aberturas, así como también la cantidad de lipasa y/o volumen del dispositivo pueden ser variados dependiendo del uso propuesto y/o para controlar la velocidad de actividad de la lipasa.
En ciertas modalidades, el dispositivo puede ser configurado para permitir un cambio en su tamaño y forma. Por ejemplo, las Figuras 10A-10C ilustran un dispositivo 1000, el cual puede ser comprimido, por ejemplo, para almacenamiento en un contenedor 1001 antes del uso. Cuando se desea, el contenedor 1001 puede ser abierto, y la pared 1003 del dispositivo puede ser expandida para producir una relación deseada de volumen de lipasa 1002 al volumen del contenedor. En algunas modalidades, el dispositivo 1000 incluye una bobina o resorte 1004 para proporcionar soporte estructural y/o para ayudar al dispositivo a mantener una forma y/o volumen deseado.
En algunas modalidades, el dispositivo puede incluir una extensión similar a varilla para facilitar la colocación y remoción de la lipasa dentro de un volumen de la fórmula. Por ejemplo, las Figuras 11A-11C, 12, 13A-13B, 14, y 15 ilustran varias configuraciones ejemplares para dispositivos con una extensión similar a varilla. Como se muestra, el dispositivo 1100, 1100’, 1100”, 1200, 1300, 1400, 1500 puede incluir ya sea uno o múltiples bolsillos o aberturas 1101, 1201, 1301, 1401, 1501 posicionados en varias configuraciones cercanas a una región distal de la extensión similar a la varilla 1102, 1202, 1302, 1402, 1502. En algunas modalidades, como se muestra por ejemplo, en las Figuras 13A-13B, la orientación de los bolsillos o aberturas 1301 puede ser ajustable, por ejemplo, para permitir la inserción dentro de una abertura estrecha durante el uso y/o para minimizar el espacio de almacenamiento.
En varias modalidades, la lipasa puede ser unida a una porción de una tapa o cierre para una botella o jarra, de manera que cuando la tapa o cierre se colocan en la botella o jarra, la lipasa puede contactar los fluidos dentro de la botella o jarra. Por ejemplo, cualquiera de los dispositivos mostrados en la presente puede ser unido a una superficie de una tapa o cierre para permitir el contacto con el contenedor de la fórmula en una botella o jarra. Varias configuraciones de dispositivos 1600, 1700, 1800, 1900, 2000 que incluyen lipasa unida a una tapa o cierre 1602, 1702, 1802, 1902, 2002 se ilustran en las Figuras 16, 17A-17B, 18, 19, y 20. Como se muestra, las lipasas pueden ser contenidas dentro de bolsillos o aberturas 1601, 1705, 1805, 1901, 2001 que tienen una variedad de formas o configuraciones. Además, en algunas modalidades, la tapa o cierre 1902, 2002 puede incluir una abertura 1910, 2010 para insertar o remover fluido a partir de un contenedor, y tales aberturas 1910, 2010 pueden incluir un conector para una sonda de fluido, por ejemplo, un conector de tipo luer.
En algunas modalidades, puede ser deseable tratar la fórmula conforme la fórmula fluye a través de una sonda (por ejemplo, durante la alimentación, como se muestra en la Figura 1, o durante la transferencia de un contenedor a otro). La Figura 21 ilustra otro dispositivo 2100 para tratamiento en línea de lipasas. El dispositivo 2100 puede incluir un bolsillo o abertura 2101 que contiene lipasas, las cuales pueden ser inmovilizadas, como se discute anteriormente. Además, el bolsillo o abertura 2101 pueden tener trayectorias tortuosas o curvadas para permitir los tiempos de contacto más prolongados entre las lipasas y la fórmula. Además, el dispositivo 2100 puede incluir aberturas 2110 en ambos extremos para permitir la conexión a tubos o conductos para ingreso y egreso de la fórmula.
En varias modalidades, los dispositivos pueden incluir un material que actúa como una pantalla o malla para prevenir a las lipasas de entrar a la fórmula para ser ingeridas por un paciente. Por ejemplo, los dispositivos mostrados en las Figuras 19 y 21 pueden incluir una o más mallas o pantallas 1906, 2106 para prevenir las lipasas inmovilizadas en las perlillas u otras estructuras de moverse en la fórmula a ser ingerida.
En algunas modalidades, las lipasas pueden ser inmovilizadas dentro de o en un componente de un contenedor de manera que las lipasas no están en contacto con la fórmula hasta que se toman etapas adicionales. Por ejemplo, en una modalidad, las lipasas pueden estar contenidas dentro de o en una porción de una tapa o cierre, y la tapa o cierre puede incluir un mecanismo para liberar las lipasas inmovilizadas en el contenedor. Por ejemplo, las lipasas pueden ser contenidas en o dentro de las perlillas u otras estructuras (véase, por ejemplo, elemento 1805 en la Figura 18), que son además unidas a, o contenidas dentro de la tapa; y cuando se desea, las lipasas pueden ser goteadas en el contenedor (por ejemplo, torciendo la tapa o removiendo un mecanismo de barrera/unión). De manera similar, las lipasas pueden ser unidas a o contenidas con una pared del contenedor u otra estructura e inmovilizadas en perlillas u otros materiales, y las lipasas pueden ser permitidas para contactar la fórmula solamente cuando se desee (por ejemplo, liberando las lipasas en el contenedor o removiendo una barrera sobre las lipasas).
La Figura 6 A es una fotografía de un vial que contiene la lipasa Rhizopus oryzae inmovilizada en perlillas poliméricas. La lipasa inmovilizada está en forma granular la cual puede ser agregada al contenedor o cámara de un dispositivo de conformidad con la invención, tal como el dispositivo representado en las Figuras 6B-D. La lipasa inmovilizada puede ser atrapada en la cámara del dispositivo, mientras todavía permite el flujo de la fórmula a través de este y fuera de la cámara proporcionando simplemente un filtro en los extremos de egreso de la cámara que contiene poros suficientemente grandes para permitir a la fórmula pasar pero retiene la lipasa inmovilizada dentro de la cámara. Alternativamente, la lipasa puede ser inmovilizada mediante, por ejemplo, recubrir los canales o cámaras interiores del dispositivo de manera que la fórmula es expuesta a la lipasa conforme pasa a través de la cámara. La lipasa inmovilizada en tal dispositivo puede ser usada para alimentación continua por periodos prolongados debido a la estabilidad incrementada y reutilidad de la lipasa.
Fórmulas nutricionales Ciertas modalidades de la invención proporcionan fórmulas nutricionales. En algunas modalidades, la fórmula nutricional es una fórmula infantil. En algunas modalidades, la fórmula nutricional es una fórmula nutricional médica. En algunas modalidades, una fórmula nutricional es expuesta a lipasa previa a la ingestión. En algunas modalidades, esta exposición permite la pre-hidrólisis de al menos algunos lípidos en la fórmula nutricional. De este modo, en algunas modalidades, una fórmula nutricional es una fórmula “como alimentada”, es decir, la fórmula líquida como se compone solo previo a la ingestión por el sujeto, la cual difiere en composición de la fórmula como se vende por el fabricante. El término “fórmula nutricional” no abarca composiciones que existen dentro del cuerpo de un sujeto después de la ingestión.
En algunas modalidades, la fórmula nutricional comprende ácidos grasos de cadena larga. En algunas modalidades, la fórmula nutricional comprende uno o más LC-PUFAs, tales como DHA, ARA, y EPA. En algunas modalidades, la fórmula nutricional comprende DHA. En algunas modalidades, la fórmula nutricional comprende ARA. En algunas modalidades, la fórmula nutricional comprende DHA y ARA. En algunas modalidades, la fórmula nutricional comprende DHA, ARA, y EPA.
En algunas modalidades, más de 5% de los ácidos grasos de cadena larga totales en la fórmula nutricional están en la forma de monoglicéridos y/o ácidos grasos libres. En algunas modalidades, más de 5% del LC-PUFA total en la fórmula nutricional está en la forma de monoglicéridos y/o ácidos grasos libres. En algunas modalidades, más de 5% del DHA está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, más de 5% del ARA está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, más de 5% del EPA está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre.
En algunas modalidades, más de 10%, más de 15%, más de 20%, más de 30%, más de 40%, más de 50%, más de 60%, más de 70%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95%, o 100% de los ácidos grasos de cadena larga totales en la fórmula nutricional están en la forma de monoglicéridos y/o ácidos grasos libres. En algunas modalidades, más de 10%, más de 15%, más de 20%, más de 30%, más de 40%, más de 50%, más de 60%, más de 70%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95%, o 100% del LC-PUFA total en la fórmula nutricional está en la forma de monoglicéridos y/o ácidos grasos libres. En algunas modalidades, más de 10%, más de 15%, más de 20%, más de 30%, más de 40%, más de 50%, más de 60%, más de 70%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95%, o 100% del DHA está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, más de 10%, más de 15%, más de 20%, más de 30%, más de 40%, más de 50%, más de 60%, más de 70%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95%, o 100% del ARA está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, más de 10%, más de 15%, más de 20%, más de 30%, más de 40%, más de 50%, más de 60%, más de 70%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95%, o 100% del EPA está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, más de 10%, más de 15%, más de 20%, más de 30%, más de 40%, más de 50%, más de 60%, más de 70%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95%, o 100% de tanto el DHA como el ARA está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En una modalidad particular, más de 90% de tanto el DHA como el ARA está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En una modalidad particular, más de 95% de tanto el DHA como el ARA está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre.
En algunas modalidades, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o 100% de los ácidos grasos de cadena larga totales en la fórmula nutricional están en la forma de monoglicéridos y/o ácidos grasos libres. En algunas modalidades, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o 100% del LC-PUFA total en la fórmula nutricional está en la forma de monoglicéridos y/o ácidos grasos libres. En algunas modalidades, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o 100% del DHA está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o 100% del ARA está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o 100% del EPA está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o 100% de tanto el DHA como el ARA está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En una modalidad particular, al menos 90% de tanto el DHA como el ARA está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En una modalidad particular, al menos 95% de tanto el DHA como el ARA está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre.
En algunas modalidades de la invención, el tamaño de ración aproximada de una fórmula nutricional de la invención es aproximadamente 100-110 mL para la fórmula infantil para prematuros, 90-150 mL (por ejemplo, 148 mL) para la fórmula infantil de término, 230-500 mL (por ejemplo, 235-250 mL) para alimentos entéricos, y 230-250 mL para fórmulas para niños y fórmulas para adultos. En algunas modalidades, cara ración contiene aproximadamente 10-35 mg de ácidos grasos libres y monoglicéridos de ARA (como se podría obtener a partir de la hidrólisis completa de TG-ARA en las fórmulas infantiles de término y pretérmino actualmente disponibles) o aproximadamente 40-50 mg de ácidos grasos libres y monoglicéridos de ARA (como se podría obtener a partir de la hidrólisis completa de TG-ARA en una fórmula para adultos actualmente disponible). En algunas modalidades, cara ración contiene aproximadamente 7-20 mg de ácidos grasos libres y monoglicéridos de DHA (como se podría obtener a partir de la hidrólisis completa de TG-DHA en las fórmulas infantiles de término y pretérmino actualmente disponibles) o aproximadamente 10-40 mg de ácidos grasos libres y monoglicéridos de DHA (como se podría obtener a partir de la hidrólisis completa de TG-DHA en fórmulas para niños y adultos actualmente disponibles). En algunas modalidades, una ración para adultos de 230-250 mL contiene aproximadamente 1,100 mg de ácidos grasos libres y monoglicéridos de EPA y aproximadamente 240 mg de ácidos grasos libres y monoglicéridos de DHA (como se podría obtener a partir de la hidrólisis completa de TG-EPA y TG-DHA en alguna fórmula para adultos actualmente disponible, tal como ProSure®. En algunas modalidades de la invención, sin embargo, la capacidad para pre-hidrolizar TG-LCPUFAs antes de la ingestión permite a la fórmula ser elaborada con niveles superiores de LC-PUFAs que en las fórmulas actualmente disponibles. Por consiguiente, en algunas modalidades la cantidad de ácidos grasos libres y/o monoglicéridos de ARA y/o DHA excede las cantidades que se podrían obtener a partir de la hidrólisis completa de TG-LCPUFAs en las fórmulas actualmente disponibles. En algunas modalidades, una ración de una fórmula nutricional de la invención contiene 50-100 mg de ácidos grasos libres y/o monoglicéridos de LC-PUFA. En algunas modalidades, una ración de una fórmula nutricional de la invención contiene 100-200 mg de ácidos grasos libres y/o monoglicéridos de LC-PUFA. En algunas modalidades, una ración de una fórmula nutricional de la invención contiene 200-300 mg de ácidos grasos libres y/o monoglicéridos de LC-PUFA. En algunas modalidades, una ración de una fórmula nutricional de la invención contiene 250-500 mg de ácidos grasos libres y/o monoglicéridos de LC-PUFA. En algunas modalidades, una ración de una fórmula nutricional de la invención contiene 500-1000 mg de ácidos grasos libres y/o monoglicéridos de LC-PUFA. En algunas modalidades, una ración de una fórmula nutricional de la invención contiene 1-2 gramos de ácidos grasos libres y/o monoglicéridos de LC-PUFA. En algunas modalidades, una ración de una fórmula nutricional de la invención contiene 2-3 gramos de ácidos grasos libres y/o monoglicéridos de LC-PUFA.
En algunas modalidades, la fórmula nutricional comprende grasas, carbohidratos, y proteínas (o amino ácidos). En algunas modalidades, una fórmula infantil de la invención comprende uno, más de uno, o todos los siguientes: leche sin grasa, lactosa, aceite vegetal (por ejemplo, uno o más de aceites de oleína de palma, coco, soya y cártamo alto en oleico), concentrado de proteína de suero, azúcares, LC-PUFAs, vitaminas, y minerales. En algunas modalidades, la fórmula nutricional comprende grasas compuestas de ácidos grasos de cadena media y grasas compuestas de ácidos grasos de cadena larga. En algunas modalidades, la fórmula nutricional comprende grasas compuestas de ácidos grasos n-6 y grasas compuestas de ácidos grasos n-3. En algunas modalidades, la fórmula nutricional comprende LA y ALA.
En algunas modalidades, una fórmula nutricional de la invención no comprende lipasa agregada. En algunas modalidades, un dispositivo y/o un método de la presente invención se usa para exponer una fórmula nutricional a una lipasa, pero la fórmula nutricional se separa de la lipasa antes de la alimentación, de manera que la fórmula nutricional ya alimentada no comprende lipasa agregada. Una fórmula nutricional que no comprende lipasa agregada se refiere a una fórmula en la cual la lipasa no es detectable o está presente solamente a niveles muy bajos, debido, por ejemplo, a la lixiviación de la lipasa inmovilizada a partir de un soporte en la fórmula. En algunas modalidades, una fórmula nutricional comprende no más de 0.02% (p/p) de lipasa, no más de 0.01% (p/p) de lipasa, no más de 0.005% (p/p) de lipasa, no más de 0.002% (p/p) de lipasa, no más de 0.001% (p/p) de lipasa, no más de 0.0005% (p/p) de lipasa, no más de 0.0002% (p/p) de lipasa, o no más de 0.0001% (p/p) de lipasa. En algunas modalidades, una fórmula nutricional comprende menos de 0.02% (p/p) de lipasa, menos de 0.01% (p/p) de lipasa, menos de 0.005% (p/p) de lipasa, menos de 0.002% (p/p) de lipasa, menos de 0.001% (p/p) de lipasa, menos de 0.0005% (p/p) de lipasa, menos de 0.0002% (p/p) de lipasa, o menos de 0.0001% (p/p) de lipasa.
En algunas modalidades, la fórmula nutricional comprende una lipasa. En algunas modalidades, la lipasa se selecciona a partir de lipasa de Chromobacterium viscosum, lipasa de Pseudomonas fluorescens, lipasa de Burcholderia cepacia, y lipasa de Rhizopus oryzae. En algunas modalidades, la lipasa se selecciona a partir de lipasa de Chromobacterium viscosum, lipasa de Pseudomonas fluorescens, y lipasa de Rhizopus oryzae. En algunas modalidades, la lipasa es Chromobacterium viscosum. En algunas modalidades, la lipasa es Pseudomonas fluorescens. En algunas modalidades, la lipasa es Rhizopus oryzae.
En algunas modalidades, una ración de la fórmula nutricional contiene menos de 5,000 unidades de lipasa (con unidades evaluadas en un ensayo de oliva estándar, tal como se describe en Pharmaceutical Enzymes: Properties and Assay Methods, R.Ruyssen y A. Lauwers (Eds) Scientific Publishing Company, Ghent, Belgium (1978)). En otras modalidades, una ración de la fórmula nutricional contiene menos de 3,000 unidades de lipasa. En algunas modalidades, una ración de la fórmula nutricional contiene menos de 1,000 unidades. En ciertas modalidades, la fórmula que contiene menos de 5,000, menos de 3,000, o menos de 1,000 unidades de lipasa por ración es una fórmula infantil o una fórmula nutricional médica.
En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.01 mg hasta 1 gramo de lipasa por gramo de grasa total (ya sea en la forma de ácido graso libre, monoglicérido, éster, o triglicérido) en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.1 hasta 500 mg de lipasa por gramo de grasa total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.1 hasta 250 mg de lipasa por gramo de grasa total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.1 hasta 200 mg de lipasa por gramo de grasa total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.1 hasta 150 mg de lipasa por gramo de grasa total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.1 hasta 100 mg de lipasa por gramo de grasa total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.1 hasta 50 mg de lipasa por gramo de grasa total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 1 hasta 50 mg de lipasa por gramo de grasa total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 25 hasta 75 mg de lipasa por gramo de grasa total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 1 hasta 100 mg de lipasa por gramo de grasa total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene no más de 50 mg de lipasa por gramo de grasa total en la fórmula nutricional.
En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 10 mg de lipasa por miligramo de LC-PUFA total (ya sea en la forma de ácido graso libre, monoglicérido, éster, o triglicérido) en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 5 mg de lipasa por miligramo de LC-PUFA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 3 mg de lipasa por miligramo de LC-PUFA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 1 mg de lipasa por miligramo de LC-PUFA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 0.5 mg de lipasa por miligramo de LC-PUFA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 0.1 mg de lipasa por miligramo de LC-PUFA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 0.05 mg de lipasa por miligramo de LC-PUFA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.01 hasta 0.1 mg de lipasa por miligramo de LC-PUFA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.02 hasta 0.08 mg de lipasa por miligramo de LC-PUFA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.04 hasta 0.06 mg de lipasa por miligramo de LC-PUFA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene no más de 0.1 mg de lipasa por miligramo de LC-PUFA total en la fórmula nutricional.
En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 10 mg de lipasa por miligramo de total DHA (ya sea en la forma de ácido graso libre, monoglicérido, éster, o triglicérido) en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 5 mg de lipasa por miligramo de total DHA en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 3 mg de lipasa por miligramo de total DHA en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 1 mg de lipasa por miligramo de total DHA en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 0.5 mg de lipasa por miligramo de total DHA en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 0.1 mg de lipasa por miligramo de total DHA en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 0.05 mg de lipasa por miligramo de total DHA en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.01 hasta 0.1 mg de lipasa por miligramo de total DHA en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.02 hasta 0.08 mg de lipasa por miligramo de total DHA en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.04 hasta 0.06 mg de lipasa por miligramo de total DHA en la fórmula nutricional.
En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 10 mg de lipasa por miligramo de ARA total (ya sea en la forma de ácido graso libre, monoglicérido, éster, o triglicérido) en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 5 mg de lipasa por miligramo de ARA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 3 mg de lipasa por miligramo de ARA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 1 mg de lipasa por miligramo de ARA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 0.5 mg de lipasa por miligramo de ARA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 0.1 mg de lipasa por miligramo de ARA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 0.05 mg de lipasa por miligramo de ARA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.01 hasta 0.1 mg de lipasa por miligramo de ARA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.02 hasta 0.08 mg de lipasa por miligramo de ARA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.04 hasta 0.06 mg de lipasa por miligramo de ARA total en la fórmula nutricional.
En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 10 mg de lipasa por miligramo de total EPA (ya sea en la forma de ácido graso libre, monoglicérido, éster, o triglicérido) en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 5 mg de lipasa por miligramo de total EPA en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 3 mg de lipasa por miligramo de total EPA en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 1 mg de lipasa por miligramo de total EPA en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 0.5 mg de lipasa por miligramo de total EPA en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 0.1 mg de lipasa por miligramo de total EPA en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.001 hasta 0.05 mg de lipasa por miligramo de total EPA en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.01 hasta 0.1 mg de lipasa por miligramo de total EPA en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.02 hasta 0.08 mg de lipasa por miligramo de total EPA en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional contiene 0.04 hasta 0.06 mg de lipasa por miligramo de total EPA en la fórmula nutricional.
En algunas modalidades, una fórmula nutricional es preparada por un método descrito en la presente. En algunas modalidades, una fórmula nutricional es preparada usando un dispositivo descrito en la presente.
Metodos para Preparar una Fórmula Nutricional De conformidad con varias modalidades, la presente descripción también proporciona métodos para preparar fórmulas nutricionales. En algunas modalidades, la fórmula nutricional es una fórmula infantil. En algunas modalidades, la fórmula nutricional es una fórmula nutricional médica. En algunas modalidades, la fórmula nutricional es una bebida nutricional para adultos (tal como una bebida nutricional completa, por ejemplo, ENSURE, PEDI ASURE).
En algunas modalidades, un método para preparar una fórmula nutricional comprende exponer una composición nutricional líquida a una lipasa. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida comprende triglicéridos de LC-PUFA o ásteres de LC-PUFA. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida comprende triglicéridos o ésteres de uno o más LC-PUFAs seleccionados a partir del grupo que consiste de DHA, ARA, y EPA.
En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a una lipasa seleccionada a partir de lipasa de Chromobacterium viscosum, lipasa de Pseudomonas fluorescens, lipasa de Burcholderia cepacia, y lipasa de Rhizopus oryzae. En algunas modalidades, la lipasa se selecciona a partir de lipasa de Chromobacterium viscosum, lipasa de Pseudomonas fluorescens, y lipasa de Rhizopus oryzae. En algunas modalidades, la lipasa es Chromobacterium viscosum. En algunas modalidades, la lipasa es Pseudomonas fluorescens. En algunas modalidades, la lipasa es Rhizopus oryzae.
Componentes involucrados en estos métodos pueden ser mezclados en varios órdenes. En algunas modalidades, la lipasa se agrega a una composición nutricional líquida, de este modo exponiendo los lípidos en la composición nutricional líquida a la lipasa. En algunas modalidades, una composición nutricional líquida se prepara agregando un líquido potable a una forma sólida o en polvo de la composición nutricional. En algunas modalidades, la lipasa está presente en forma de polvo o sólido de la composición nutricional antes de la adición del líquido potable. En otras modalidades, la lipasa se agrega después que se prepara la composición nutricional líquida. En algunas modalidades, la lipasa y la forma en polvo o sólido de la composición nutricional se agregan a un líquido potable al mismo tiempo.
En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por al menos un minuto, al menos 2 minutos, al menos 3 minutos, al menos 5 minutos, al menos 8 minutos, al menos 10 minutos, al menos 15 minutos, al menos 30 minutos, al menos 45 minutos, o al menos 60 minutos previo a la ingestión. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 30 segundos, no más de 1 minuto, no más de 2 minutos, no más de 3 minutos, no más de 5 minutos, no más de 8 minutos, no más de 10 minutos, no más de 15 minutos, no más de 30 minutos, no más de 45 minutos, no más de 60 minutos, no más de 2 horas, no más de 4 horas, no más de 6 horas, no más de 12 horas, o no más de 24 horas.
En algunas modalidades, el método resulta en una fórmula nutricional en la cual al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o 100% del LC-PUFA total en la fórmula nutricional está en la forma de monoglicéridos y/o ácidos grasos libres. En algunas modalidades, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o 100% del DHA está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o 100% del ARA está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o 100% del EPA está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre.
Para los propósitos de esta solicitud, la exposición de una composición o fórmula nutricional a una lipasa se refiere al periodo de tiempo en el cual una composición nutricional líquida o fórmula líquida está en contacto con una lipasa, la cual puede estar en solución o inmovilizada. Para propósitos de esta solicitud, la exposición a una lipasa termina cuando la fórmula es ingerida por un sujeto o cuando la lipasa es removida separando la fórmula líquida a partir de un soporte sólido al cual la lipasa es inmovilizada. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 10 minutos, y al menos 20% del DHA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 10 minutos, y al menos 20% del ARA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 10 minutos, y al menos 20% del LC-PUFA total en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre.
En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 10 minutos, y al menos 40% del DHA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 10 minutos, y al menos 40% del ARA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida se expone a lipasa por no más de 10 minutos, y al menos 40% del LC-PUFA total en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre.
En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 10 minutos, y al menos 50% del DHA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 10 minutos, y al menos 50% del ARA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida se expone a lipasa por no más de 10 minutos, y al menos 50% del LC-PUFA total en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre.
En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 10 minutos, y al menos 60% del DHA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 10 minutos, y al menos 60% del ARA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida se expone a lipasa por no más de 10 minutos, y al menos 60% del LC-PUFA total en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre.
En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 10 minutos, y al menos 70% del DHA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 10 minutos, y al menos 70% del ARA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida se expone a lipasa por no más de 10 minutos, y al menos 70% del LC-PUFA total en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre.
En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 20 minutos, y al menos 20% del DHA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 20 minutos, y al menos 20% del ARA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida se expone a lipasa por no más de 20 minutos, y al menos 20% del LC-PUFA total en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre.
En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 20 minutos, y al menos 40% del DHA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 20 minutos, y al menos 40% del ARA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida se expone a lipasa por no más de 20 minutos, y al menos 40% del LC-PUFA total en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre.
En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 20 minutos, y al menos 50% del DHA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 20 minutos, y al menos 50% del ARA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida se expone a lipasa por no más de 20 minutos, y al menos 50% del LC-PUFA total en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre.
En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 20 minutos, y al menos 80% del DHA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 20 minutos, y al menos 80% del ARA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida se expone a lipasa por no más de 20 minutos, y al menos 80% del LC-PUFA total en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre.
En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 20 minutos, y al menos 90% del DHA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 20 minutos, y al menos 90% del ARA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida se expone a lipasa por no más de 20 minutos, y al menos 90% del LC-PUFA total en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre.
En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 30 minutos, y al menos 20% del DHA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 30 minutos, y al menos 20% del ARA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida se expone a lipasa por no más de 30 minutos, y al menos 20% del LC-PUFA total en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre.
En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 30 minutos, y al menos 40% del DHA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 30 minutos, y al menos 40% del ARA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida se expone a lipasa por no más de 30 minutos, y al menos 40% del LC-PUFA total en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre.
En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 30 minutos, y al menos 60% del DHA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 30 minutos, y al menos 60% del ARA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida se expone a lipasa por no más de 30 minutos, y al menos 60% del LC-PUFA total en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre.
En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 30 minutos, y al menos 70% del DHA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 30 minutos, y al menos 70% del ARA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida se expone a lipasa por no más de 30 minutos, y al menos 70% del LC-PUFA total en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre.
En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 30 minutos, y al menos 80% del DHA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por no más de 30 minutos, y al menos 80% del ARA en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida se expone a lipasa por no más de 30 minutos, y al menos 80% del LC-PUFA total en la fórmula nutricional resultante está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre.
En algunas modalidades, la lipasa permanece en la fórmula nutricional cuando es alimentada al sujeto. En otras modalidades, la lipasa es removida de la composición nutricional líquida antes de que sea alimentada al sujeto. En algunas modalidades, la lipasa es removida exponiendo la composición nutricional líquida que comprende la lipasa a un soporte sólido inmovilizado a una molécula que se une a la lipasa, de este modo uniendo la lipasa al soporte sólido, y separando la composición nutricional líquida a partir del soporte sólido. Puesto que la lipasa es inmovilizada al soporte sólido, separar la composición nutricional líquida a partir del soporte sólido tiene el efecto de remover la lipasa de la composición nutricional líquida. En algunas modalidades, la lipasa es inmovilizada a un soporte sólido antes de que se exponga a la composición nutricional líquida, y la lipasa es removida separando la composición nutricional líquida a partir del soporte sólido. En algunas modalidades, la lipasa es inmovilizada en al menos una porción de una cara interior de una cámara o a un soporte sólido contenido dentro de la cámara, y la composición nutricional líquida es temporalmente expuesta a la lipasa pasando a través de la cámara. En algunas modalidades, la cámara es una columna. En algunas modalidades, la composición nutricional líquida se expone a un contenedor que contiene lipasa inmovilizada a un soporte sólido, y al menos una porción de la superficie interior del contenedor consiste de un material que es permeable a triglicéridos y ésteres pero no es permeable al soporte sólido.
En algunas modalidades, el método produce una fórmula nutricional que no comprende lipasa agregada. En algunas modalidades, una fórmula nutricional es expuesta a una lipasa, sino la fórmula nutricional es separada de la lipasa antes de la alimentación, de manera que la fórmula nutricional ya alimentada no comprende lipasa agregada. Una fórmula nutricional que no comprende (o contiene) lipasa agregada se refiere a una fórmula en la cual la lipasa no es detectable o está presente solamente a niveles muy bajos, debido, por ejemplo, a lixiviación de lipasa inmovilizada a partir de un soporte sólido en la fórmula. En algunas modalidades, una fórmula nutricional comprende no más de 0.02% (p/p) de lipasa, no más de 0.01% (p/p) de lipasa, no más de 0.005% (p/p) de lipasa, no más de 0.002% (p/p) de lipasa, no más de 0.001% (p/p) de lipasa, no más de 0.0005% (p/p) de lipasa, no más de 0.0002% (p/p) de lipasa, o no más de 0.0001% (p/p) de lipasa. En algunas modalidades, una fórmula nutricional comprende menos de 0.02% (p/p) de lipasa, menos de 0.01% (p/p) de lipasa, menos de 0.005% (p/p) de lipasa, menos de 0.002% (p/p) de lipasa, menos de 0.001% (p/p) de lipasa, menos de 0.0005% (p/p) de lipasa, menos de 0.0002% (p/p) de lipasa, o menos de 0.0001% (p/p) de lipasa.
En algunas modalidades, el método comprende exponer la fórmula nutricional a menos de 5,000 unidades de lipasa por ración (con unidades evaluadas en un ensayo de oliva estándar, tal como se describe en Pharmaceutical Enzymes: Properties and Assay Methods, R. Ruyssen y A. Lauwers (Eds) Scientific Publising Company, Ghent, Gelgium (1978)). En otras modalidades, la fórmula nutricional se expone a menos de 3,000 unidades de lipasa por ración. En algunas modalidades, la fórmula nutricional se expone a menos de 1,000 unidades de lipasa por ración. En ciertas modalidades, la fórmula expuesta a menos de 5,000, menos de 3,000, o menos de 1,000 unidades de lipasa por ración es una fórmula infantil o una fórmula nutricional médica.
En algunas modalidades, un método de la invención expone la fórmula nutricional hasta 0.01 mg hasta 1 gramo de lipasa por gramo de grasa total (ya sea en la forma de ácido graso libre, monoglicérido, éster, o triglicérido) en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, un método de la invención expone la fórmula nutricional hasta 0.1 hasta 500 mg de lipasa por gramo de grasa total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, un método de la invención expone la fórmula nutricional hasta 0.1 hasta 250 mg de lipasa por gramo de grasa total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, un método de la invención expone la fórmula nutricional hasta 0.1 hasta 200 mg de lipasa por gramo de grasa total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, un método de la invención expone la fórmula nutricional hasta 0.1 hasta 150 mg de lipasa por gramo de grasa total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, un método de la invención expone la fórmula nutricional hasta 0.1 hasta 100 mg de lipasa por gramo de grasa total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, un método de la invención expone la fórmula nutricional hasta 0.1 hasta 50 mg de lipasa por gramo de grasa total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, un método de la invención expone la fórmula nutricional de 1 hasta 50 mg de lipasa por gramo de grasa total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, un método de la invención expone la fórmula nutricional de 25 hasta 75 mg de lipasa por gramo de grasa total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, un método de la invención expone la fórmula nutricional de 1 hasta 100 mg de lipasa por gramo de grasa total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, un método de la invención expone la fórmula nutricional a no más de 50 mg de lipasa por gramo de grasa total en la fórmula nutricional.
En algunas modalidades, el método expone la fórmula nutricional hasta 0.001 hasta 10 mg de lipasa por miligramo de LC-PUFA total (ya sea en la forma de ácido graso libre, monoglicérido, éster, o triglicérido) en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional se expone de 0.001 hasta 5 mg de lipasa por miligramo de LC-PUFA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional se expone de 0.001 hasta 3 mg de lipasa por miligramo de LC-PUFA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional se expone de 0.001 hasta 1 mg de lipasa por miligramo de LC-PUFA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional se expone de 0.001 hasta 0.5 mg de lipasa por miligramo de LC-PUFA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional se expone de 0.001 hasta 0.1 mg de lipasa por miligramo de LC-PUFA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional se expone de 0.001 hasta 0.05 mg de lipasa por miligramo de LC-PUFA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional se expone de 0.01 hasta 0.1 mg de lipasa por miligramo de LC-PUFA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional se expone de 0.02 hasta 0.08 mg de lipasa por miligramo de LC-PUFA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional se expone de 0.04 hasta 0.06 mg de lipasa por miligramo de LC-PUFA total en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional se expone a no más de 0.1 mg de lipasa por miligramo de LC-PUFA total en la fórmula nutricional.
En algunas modalidades, el método expone la fórmula nutricional de 0.001 hasta 10 mg de lipasa por miligramo de total DHA (ya sea en la forma de ácido graso libre, monoglicérido, éster, o triglicérido) en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional se expone de 0.001 hasta 5 mg de lipasa por miligramo de total DHA en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional se expone de 0.001 hasta 3 mg de lipasa por miligramo de total DHA en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional se expone de 0.001 hasta 1 mg de lipasa por miligramo de total DHA en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional se expone de 0.001 hasta 0.5 mg de lipasa por miligramo de total DHA en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional se expone de 0.001 hasta 0.1 mg de lipasa por miligramo de total DHA en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional se expone de 0.001 hasta 0.05 mg de lipasa por miligramo de total DHA en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional se expone de 0.01 hasta 0.1 mg de lipasa por miligramo de total DHA en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional se expone de 0.02 hasta 0.08 mg de lipasa por miligramo de total DHA en la fórmula nutricional. En algunas modalidades, la fórmula nutricional se expone de 0.04 hasta 0.06 mg de lipasa por miligramo de total DHA en la fórmula nutricional.
En algunas modalidades, un método para preparar una fórmula nutricional comprende exponer una composición nutricional líquida a un dispositivo cómo se describe en la presente.
Ejemplos Ejemplo 1: Actividades Específicas de Lipasa para DHA y ARA Para evaluar la actividad enzimática de varias lipasas en triglicéridos DHA y/o ARA, se realizaron experimentos en viales de vidrio de dos mL (con barras agitadoras magnéticas) que contienen amortiguador Tris 0.1M, pH 7.7 y el sustrato de triglicéridos DHA o ARA. La reacción se inició agregando soluciones de lipasa. Las lipasas se obtuvieron de fuentes comerciales como sigue: Rhizopus oryzae (Amano DF-15, Amano Enzymes Inc., Nagoya, Japón), Chromobacterium viscosum (EMD CalBiochem, EMD Biosciences, Billerica, MA), y Pseudomonas fluoresens (Amano AK, Amano Enzymes Inc., Nagoya, Japón). Otras lipasas también están disponibles de fuentes comerciales, tal como Candida rugosa (Amano AY 30 o Amano 30, Amano Enzymes Inc., Nagoya, Japón), Aspergillus niger (Amano DS, Amano Enzymes Inc., Nagoya, Japón), Penicillium camembertii (Amano 50, Amano Enzymes Inc., Nagoya, Japón), Rhizomucor miehei (L4277, Sigma-Aldrich), Asperigillus oryzae (62285, Sigma-Aldrich), y Burcholderia cepacia (534641, Sigma-Aldrich). Las soluciones de lipasa se prepararon a partir de estas lipasas comercialmente disponibles sin purificación adicional, excepto que la lipasa de B. cepacia se purificó a homogeneidad.
Los viales se transfirieron a un baño de agua de 37°C colocado en un agitador magnético. Se tomaron muestras de 50 ml a diferentes intervalos de tiempo 0, 15, 30, 45, 60, 90 y 120 min y se agregó a un vial HPLC que contiene 950 ml del amortiguador de corrida (30% de amortiguador de fosfato de amonio a 10 mM, pH 3.0 y 70% de acetonitrilo). Las muestras entonces se analizaron para ya sea ácido libre DHA o ácido libre ARA por cromatografía líquida de alto desempeño de fase inversa (RP-HPLC) usando una series Agilent HPLC1100 y una columna C8 RP y monitoreado a 215 y 220 nm. Los valores máximos de ácido libre se identificaron de conformidad a los tiempos de retención usando estándares comercialmente disponibles: triglicérido DHA (Nu-check Prep, Inc. Lot No. T-310-D7-V), triglicérido ARA (Nu-check Prep, Inc. Lot No. T-295-JY14-V), forma de ácido libre DHA (Nu-check Prep, Inc. Lot No. U-84A-AU20-U), y forma de ácido libre ARA (Nu-check Prep, Inc. Lot No. U-71A-N11-U). Las actividades específicas de un panel de lipasas en este ensayo para DHA y ARA se resumen en la Tabla 1. En las manos del inventor, Chromobacterium viscosum (CV), Burcholderia cepacia (BC), Pseudomonas fluorescens (PF), y Rhizopus oryzae (RO) tienen actividad específica sustancialmente mayor hacia DHA y/o ARA comparada con las otras lipasas probadas, que incluye Candida rugosa (CR).
TABLA 1: Actividades Específicas de lipasas para DHA y ARA Ejemplo 2: Actividad enzimática de lipasas de Chromobacterium viscosum y Rhizopus oryzae para DHA, ARA, y EPA en fórmula infantil Para evaluar la Actividad enzimática de lipasa CV y RO en DHA, ARA, y EPA cuando se suplementa a fórmula infantil, se preparó la fórmula infantil a base de leche disolviendo 10 g de polvo ENFAMIL® en 35 mL de agua. La fórmula infantil que contiene sustrato EPA, amortiguador Tris 0.1M, pH 7.7, y sustratos 2.7 mg de DHA (Nu-check Prep, Inc. Lot No. T-310-D7-V) y 5.4 mg de ARA (Nu-check Prep, Inc. Lot No. T-295) se agregaron a un vial de vidrio de un mi (con barra agitadora magnética). La reacción se inició agregando enzima (es decir, lipasa); se probaron cuatro concentraciones de cada enzima. Los viales se transfirieron a un baño de agua a 37°C colocado en un agitador magnético. 50 ml de cada muestra se tomaron a diferentes puntos de tiempo - 0, 10, 20, 30, 45, y 60 min y se agregó a un vial HPLC que contiene 950 ml de Amortiguador de corrida HPLC (30% amortiguador de fosfato de amonio 10 mM, pH 3.0 y 70% acetonitrilo). Las muestras entonces se analizaron para cada uno de ácido DHA, ácido ARA, o ácido EPA por RP-HPLC como anteriormente.
El porcentaje de triglicéridos totales disminuyó con el tiempo conforme la cantidad de ácido libre y monoglicérido se incrementó. Por ejemplo, cuando se hidrolizó con RO, la cantidad de ácido libre DHA se incrementó con el tiempo (Figura 7). De manera similar, cuando se hidrolizó con RO, la cantidad de ácido libre ARA se incrementó con el tiempo (Figura 8).
Las actividades específicas de cada una de las lipasas en este ensayo se calcularon en base a la cantidad de ácido DHA libre, Ácido ARA, o Ácido EPA liberado en la fórmula infantil y se muestran en la Tabla 2.
TABLA 2: Actividades específicas de lipasas en TG-DHA, TG-ARA, y TG-EPA en fórmula infantil Ejemplo 3: Hidrólisis de triglicérido DHA y triglicérido ARA aumentada Se evaluaron lipasas por su capacidad para hidrolizar TG-DHA y TG-ARA cuando aumenta a una cantidad que puede ser usada para suplementar la fórmula infantil. La fórmula infantil (leche) se preparó disolviendo 162 g de polvo de Enfamil en 648 mL de agua de grifo (agua caliente, la temperatura fue 37°C). Triglicérido DHA (442 mg, concentración final de DHA fue 0.54g, 1.2% de grasa total) y triglicérido ARA (885 mg, concentración final ARA 1.08 g, 2.4% de grasa total) se pesaron con exactitud desde la misma fuente como en el Ejemplo 2, y se mezclaron con la fórmula infantil en polvo antes de agregar agua. La reacción se llevó a cabo en un baño de agua con agitación constante. La hidrólisis de grasa se inició agregando ya sea lipasa CV o RO. Las muestras de la fórmula se retiraron a 0, 15, y 30 minutos y se analizaron por hidrólisis de DHA y ARA por RP-HPLC, como se describe anteriormente. Los resultados se muestran en la Tabla 3 abajo.
TABLA 3: Hidrólisis de TG-DHA y TG-ARA en fórmula infantil Ejemplo 4: Actividad enzimática de lipasa de Rhizopus oryzae inmovilizada en TG-DHA o TG-ARA en Fórmula infantil y Amortiguador Para evaluar la actividad enzimática de lipasa RO inmovilizada en TG-DHA o TG-ARA cuando se suplementa a fórmula infantil, fórmula infantil a base de leche se preparó disolviendo 10 g de polvo de ENFAMIL® en 35 mL de agua. La reacción se llevó a cabo como sigue. Se agregaron fórmula infantil, amortiguador Tris 0.1M, pH 7.7, y sustrato (TG-DHA o TG-ARA) a un vial de vidrio de un mi (con barra agitadora magnética). La reacción se inició agregando lipasa. Los viales se transfirieron a un baño de agua a 37°C colocada en agitador magnético. 50 ml de cada muestra se tomaron a diferentes puntos de tiempo - 0, 10, 20, y 30 min y se agregó a un vial HPLC que contiene 900 ml del Amortiguador de corrida HPLC (30% amortiguador de fosfato de amonio 10 mM, pH 3.0 y 70% de acetonitrilo). Las muestras entonces se analizaron para cada uno de ácido DHA o ácido ARA por RP-HPLC como se describe anteriormente.
Las actividades específicas de la lipasa por hidrólisis de TG-DHA y TG-ARA se calcularon en base a la cantidad de ácido DHA o ácido ARA libre liberado en la fórmula infantil y se muestran en la Tabla 4.
TABLA 4: Actividades específicas de lipasa RO inmovilizada en TG DHA o TG-ARA en fórmula infantil y Amortiguador Los valores en paréntesis son para el amortiguador solo.
Ejemplo 5: Procedimiento animal y quirúrgico 5.1 Animales Los experimentos se realizaron en 12 cerdos (9 + 3) de la University herd at Odarslóv; Swedish Agricultural University, Department de Agricultural Biosystems and Technology, pesando aproximadamente 10±2 kg cada uno. Los animales se mantuvieron en un ciclo día-noche de 12 horas, con luz de 06.00-18.00 (6am-6pm) y oscuridad de 18.00-06.00 (6pm-6am) horas. Los cerdos se alojaron individualmente en jaulas metabólicas o corrales individuales equipados con un comedero seco, una boquilla para beber y una lámpara para calentamiento constante (150 W). Se dejaron mover libremente dentro de su corral, y tienen contacto visual entre sí. 5.2 Alimentación Después de la cirugía y durante el periodo de pre-tratamiento, los cerdos se alimentaron con alimento para cerdo estándar (“53908 Váxtill 320 P BK”, Lantmánnen, Suecia) que contiene 17.5% de proteína cruda, 3.9% de fibra cruda, 3.5% de grasa cruda, y 5.2% de cenizas junto con 5000IE/kg de vitamina A, 500IE/kg de vitamina D, y 85 mg/kg de vitamina E. Los cerdos se alimentaron dos veces al día (2.0% de masa corporal por comida) a 09:00-10:00 hr (9am-10 am) y 17:00-18:00 hr (5pm-6pm). Por unos pocos días antes del inicio del experimento, es decir, antes del periodo de adaptación, los cerdos se entrenaron para consumir fórmula infantil (NAN Pro 1 Gold Infant Formula, Nestle). La fórmula se preparó como una dilución 1:4 en agua de grifo en lugar de 1:7 como es recomendado por el fabricante para permitir consumo apropiado, dado que a los cerdos no les gusta beber grandes cantidades de líquido. Los requerimientos nutrientes diarios son 400kJ/kg por peso corporal, que corresponde a 40g de fórmula en polvo/kg peso corporal. La alimentación diaria fue dividida en 4 porciones, iniciando con la primera comida a las 9 am y que, cada 3 h después con la última comida a las 6 pm. lOOg de fórmula NAN que contiene aproximadamente 27.7% de grasa, 9.6% de proteína, y 57.8% de carbohidratos. 5.3 Leche de fórmula infantil fortificada con triglicéridos DHA y ARA De conformidad con el fabricante, NAN Pro 1 Gold (Nestle) es una fórmula de suero de leche predominante inicial en la fórmula infantil que es completo nutricional y especialmente formulada para infantes saludables recién nacidos. También contiene aceite de pescado para ayudar a soportar el desarrollo del cerebro y visual. (http://www.nestlebaby.com/au/baby_nutrition/products/infant_f0rmula /) Ingredientes de NAN Pro 1 Gold: Sólidos de leche, aceites vegetales (contiene soya), minerales (citrato de calcio, citrato de potasio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, cloruro de sodio, sulfato de sodio, sulfato ferroso, sulfato de zinc, fosfato de calcio, sulfato de cobre, sulfato de manganeso, yoduro de potasio, selenato de sodio), omega LCPUFAs (DHA de aceite de pescado, AA), emulsificador (lecitina de soya), vitaminas [ascorbato de sodio (vit C), d-1 alfa tocoferil acetato (vit E), niacinamida (niacina), pantotenato de calcio, retinil acetato (vit A), mononitrato de tiamina (vit Bl), clorhidrato de piridoxina (vit B6), riboflavina (vit B2), ácido fólico, filoquinona (vit Kl), biotina, colecalciferol (vit D3)], cianocobalamina (B 12), L-histidina, taurina, inositol, nucleótidos (5'-monofosfato de citidina, 5'-monofosfato de uridina, 5'-monofosfato de adenosina, 5'-monofosfato de guanosina), L-camitina, cultivo (bifidus).
La Tabla 5 abajo resume la composición de lípido de leche humana y leche de fórmula infantil, junto con la fórmula infantil y leche de fórmula de cerdo para uso en estos experimentos.
TABLA 5: Leche de fórmula fortificada LCPUFA * Los datos de varias cohortes de mujeres en Australia, Europa, Estados Unidos y Canadá entre 1990 y 2005. Los datos de varias fórmulas de recién nacidos que incluyen Nutrilom (Nutricia, Holanda), Enfamil (Mead Johnson, Canadá), Similac (Abbott Ross, US), SMA (Wyeth, US). (JPGN 2010;51: 380-401)b ** Huang MC, 2007, $$MCT 9.6 *La concentración final puede ser medida después de terminado el experimento.
La concentración total de TG-DHA y TG-AA en fórmula NAN es 0.22%, la cual está por debajo de los niveles recomendados de 1%. Así, la fórmula NAN fue fortificada con TG-DHA y TG-AA de aceite de pescado (NuCheck (http://www.nu-chekprep.com, -40% TG-DHA y TG-ARA) para alcanzar una concentración final de 1% de TG-DHA y 2% de TG-DHA respectivamente. 5.4 Cirugía de ligación del conducto pancreático para inducción de insuficiencia pancreática por exocrina (EPI) Se realizó la cirugía EPI en 12+2 cerdos jóvenes de 6-8 semanas de edad. La EPI es típicamente de forma completa desarrollada de tres a custro semanas después de la cirugía. El desarrollo total de insuficiencia pancreática se confirmó deteniendo el crecimiento (incremento mínimo o nulo en peso corporal) y/o desarrollo de esteatorrea.
Ejemplo 6: Diseño Experimental, Procedimientos 6.1 Diseño del Estudio El estudio contiene tres periodos: adaptación, control y prueba. Durante el periodo de adaptación de 7 días, los cerdos se entrenaron para beber la fórmula infantil fortificada con TG-DHA y TG-ARA. Durante el periodo de control de 7 días, los cerdos continuaron siendo alimentados con la fórmula infantil fortificada con TG-DHA y TG-ARA. Durante el periodo de prueba de 7 días, los cerdos se alimentaron con la fórmula infantil fortificada con TG-DHA y TG-ARA, ya sea (a) no hidrolizada; (b) pre-hidrolizada con lipasa CV; o (c) pre-hidrolizada con lipasa RO. El consumo de la fórmula se midió diariamente, se recolectaron muestras de heces los últimos 3 días de cada periodo de estudio (72 h de recolección), y se recolectaron muestras de sangre en el día 7 de los periodos de control y prueba. 6.2 Dosificación de Lipasa Se determinaron las dosis de lipasa y el tiempo de pre-hidrólisis en base a resultados in vitro (Ejemplo 3) y los requerimientos nutricionales diarios de los cerdos. La fórmula NAN mezclada con lipasa RO o CV (-1300 U/g de grasa total) se incubó con agitación por 15 minutos a 37C.
Preparación de fórmula propuesta v mezcla de lipasa: - El peso corporal de los cerdos varía de 11-14 kg - Requerimiento de alimento: 40 g fórmula en polvo/kg peso corporal; - 4 comidas por día - 125 g de polvo/cerdo/comida Preparación de comida: 500 g de polvo + 1.51 de agua (dilución 1 :4) - Se agregó polvo seco original - Se agregó aceites de TG-PUFA (7.5 mi de DHA y 15 mi de ARA), bien mezclados, y se agregó agua de grifo del baño de agua a 37C y se mezcló bien.
- Para la fórmula tratada con lipasa, se mezcló en lipasa CV o RO - Se agregó agua al volumen final - Se mezcló todos por 15 min en baño de agua a 37C - Se dividió en 4 cubos y se alimentó a cada cerdo ~600 mi de la fórmula 6.2.1 Periodo de Adaptación (7-10 días) Aproximadamente 7-10 días antes del periodo de adaptación, 12 cerdos se colocaron en jaulas metabólicas y se entrenaron para beber la fórmula enriquecida con TG-PUFA. En la primera noche del periodo de adaptación, se registró el peso corporal antes de la comida de la mañana. 6.2.2 Periodo de Control (7 días) A todos los cerdos seleccionados se les proporcionó la fórmula infantil como la única fuente de alimento, 4 veces al día. Se midió el consumo de la fórmula diaria total durante el experimento completo. En la mañana del primer día del periodo de control, se registró el peso corporal antes de la comida de la mañana. Se recolectaron muestras de heces 3x24hr a partir del día 5 hasta el día 7. Las muestras de sangre se recolectaron en el último día de este periodo, 1 h antes de una comida y 1, 2 y 3 horas posteriores. 6.2.3 Periodo de Prueba (7 días) A todos los cerdos seleccionados se les proporcionó la fórmula infantil enriquecida con TG-PUFA como la única fuente de alimento, 4 veces por día. Se midió el consumo de leche diaria total durante el experimento completo. En la mañana del primer día del periodo de prueba se registró el peso corporal antes de la comida de la mañana. Se recolectaron muestras de heces 3x24hr a partir del día 5 hasta el día 7. Se recolectaron muestras de sangre en el último día de este periodo, lh antes de una comida y 1, 2 y 3 horas posteriores.
Antes de inicio de este periodo, los cerdos se aleatorizaron en tres grupos, en base al peso corporal y disposición de la fórmula para beber: 1) Un tercio de los cerdos EPI (n=4) se alimentaron con la fórmula pre-hidrolizada con lipasa RO; y 2) Un tercio de los cerdos EPI (n=4) se alimentaron con la fórmula pre-hidrolizada con lipasa CV; y 3) Un tercio de los cerdos EPI (n=4) son alimentados solamente con la fórmula.
La preparación de la mezcla de fórmula y lipasa se muestra anteriormente en el párrafo [00201]. 6.3 Criterio para una respuesta positiva Reducción significante en LCPUFA fecal, incremento en coeficiente de absorción de grasa (% de CFA), e incremento en concentración de LCPUFA de plasma cuando se compara a cerdos EPI alimentados solamente con la fórmula suplementada con 2% de TG-ARA y 1% de TG-AA. 6.4 Análisis de Datos - Se registraron datos individuales al momento que se generan. Se realizaron análisis estadísticos usando la prueba t de Student. Las diferencias son consideradas significantes si p<0.05.
Ejemplo 7: Lipasas RO y CV lipasas mejoran la absorción de ácido graso en cerdos EPI Se usaron con insuficiencia pancreática exocrina (EPI), un modelo quirúrgico bien establecido, como un modelo para bebes humanos no natos y recién nacidos mímico, en donde está comprometida la función pancreática exocrina. Se usó el modelo de cerdo quirúrgico EPI esencialmente como se describe en los Ejemplos 5 y 6 para evaluar el efecto en la absorción de ácido graso de la fórmula infantil pre-hidrolizada con lipasa CV o lipasa RO comparada a la fórmula infantil no hidrolizada. Los cerdos EPI son de 10 semanas de edad (+/- 2 semanas), lo cual corresponde a aproximadamente a 6 meses de edad para un bebe humano. Los cerdos se alimentaron con fórmula infantil de Nestle (NAN Pro 1 Gold) enriquecida con 2% de triglicéridos ARA (TG-ARA) y 1% de triglicéridos DHA (TG-DHA) de aceite de pescado (NuCheck (http:bwww.nu-chekprep.com, -40% TG-DHA y TG-ARA). La alimentación ocurre cada 3 horas, 4 veces por día. En el grupo de cerdos que recibieron la fórmula pre-hidrolizada, la fórmula se pre-hidrolizó 15 minutos antes de ser alimentados se mezcló con lipasa CV o lipasa RO a 37°C. La duración del experimento fue 1 semana, seguido por análisis de la concentración de LC-PUFA en las heces, absorción de LC-PUFA en plasma y acreción de LC-PUFA en tejidos (retina, corazón, hígado, riñón, eritrocitos, cerebro y grasa) Como se muestra en la Figura 22A, a los cerdos EPI se les proporciona la fórmula pre-hidrolizada con lipasa CV o lipasa RO teniendo peso de las heces significativamente reducidos (CV >60% reducción, p<0.001; RO: -30% reducción, p<0.05). La pre-hidrólisis de grasa con lipasa CV o lipasa RO también significativamente reduce el contenido de grasa total en las heces comparada a los cerdos EPI de control (Figura 22B) e incrementa significativamente el coeficiente de la absorción de grasa (% de CFA) comparado a los controles (Figura 22C), en donde el % de CFA = (ingestión de grasa (g/24 hr)- grasa en heces (g/24hr))/(ingestión de grasa (g/24hr)), n = 3/grupo, p = 0.002 para CV contra el control, y p = 0.003 para RO contra el control. Ya que se copara al control, la pre-hidrólisis con ya sea lipasa CV o lipasa RO provoca reducciones significantes en ARA fecal (36% y 65% en reducciones, respectivamente), EPA (78% de reducción con ya sea enzima) y DHA (68% y 60% de reducciones, respectivamente)(Figura 23). Estos datos muestran que la pre-hidrólisis de la fórmula con lipasa CV o RO reduce los niveles fecales de grasa total, ARA, DHA y EPA, indicando un mejoramiento en la absorción de omega-3, omega-6 y ácidos grasos totales Además, los cerdos alimentados con la fórmula pre-hidrolizada tienen un incremento significante en los niveles en plasma y tejido de ARA y DHA después de 7 días de alimentación comparado con cerdos de control. Para estos estudios, hubo 4 cerdos en los grupos de Control y lipasa CV y 3 cerdos en el grupo de lipasa RO. Las muestras en plasma pre-prandial se tomaron después del ayuno durante la noche después de 7 días de tratamiento. Los niveles en plasma de ARA y DHA fueron significantemente superiores (60% y 30%, respectivamente, p<0.05) en cerdos alimentados con la fórmula pre-hidrolizada con lipasa RO comparado con cerdos alimentados con la fórmula no hidrolizada (Figura 24). Los niveles en plasma de ARA fueron también significantemente superiores (40%, p<0.05) en cerdos alimentados con la fórmula pre-hidrolizada con lipasa CV comparado con cerdos alimentados con la fórmula no hidrolizada (Figura 24). Los niveles de ARA y DHA también se incrementaron significantemente (p<0.05) en la retina (Fig. 25A) y tejido adiposo (Fig. 25B) de cerdos alimentados con la fórmula pre-hidrolizada con la lipasa RO comparado con cerdos alimentados con la fórmula no hidrolizada. Los niveles en la retina de ARA también fueron significantemente superiores (p<0.05) en cerdos alimentados con la fórmula pre-hidrolizada con lipasa CV comparado con cerdos alimentados con la fórmula no hidrolizada (Figura 25A). En cerdos alimentados con la fórmula pre-hidrolizada con lipasa CV o RO, los niveles de ARA también se incrementaron significantemente (p<0.05) en el corazón (Fig. 26A: 60% y 20% de incremento, respectivamente) y riñón (Fig. 26B) de cerdos, comparado con cerdos alimentados con la fórmula no hidrolizada. Los niveles de DHA incrementaron significantemente (60%, p<0.05) en el corazón de cerdos alimentados con la fórmula pre-hidrolizada con lipasa CV comparado con cerdos alimentados con la fórmula no hidrolizada (Figura 26A). Hubo mínimo o ningún cambio en el hígado, eritrocitos, y cerebro, los cuales pueden ser explicados por la duración de tratamiento relativamente corta (7 días) en este estudio.
Ejemplo 8: Hidrólisis de TG-DHA y TG-ARA en la fórmula infantil por lipasa inmovilizada en una “bolsa de té” La lipasa de Rhizopus oryzae (RO) fue covalentemente unida a perlillas acrílicas y contenida en un dispositivo que se asemeja a una bolsa de té. La fórmula infantil Enfalac (25 g) se combinó con agua de grifo (88 mL) a 37°C. Las reacciones se llevaron a cabo en una botella de vidrio con 100 mL de fórmula infantil y una bolsa de té que contiene ya sea 100, 500, 1000, o 2000 mg de lipasa RO inmovilizada. Cada reacción se incubó a 37°C por 30 minutos con inversión. Las muestras se tomaron en los siguientes puntos de tiempo: 0,1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, y 30 minutos. Las muestras se analizaron por DHA y ARA por cromatografía líquida de alto desempeño de fase inversa (RP-HPLC).
En cada concentración de lipasa RO inmovilizada, el porcentaje de hidrólisis de DHA y ARA se incrementó como la cantidad de lipasa RO inmovilizada se incrementa (Figura 27). Estos datos demuestran la factibilidad del dispositivo de bolsa de té para pre-hidrolizar la fórmula con lipasa.
Ejemplo 9: Hidrólisis de TG-DHA y TG-ARA en la fórmula infantil por lipasa inmovilizada en un cartucho La lipasa de Rhizopus oryzae (RO) y lipasa de Chromobacterium viscosum (CV) se inmovilizaron sobre perlillas poliméricas acrílicas macroporosas (Immobeads™; ChiralVision). Aproximadamente 200 mg de lipasa RO se usaron por gramo de perlillas. Una muestra de perlillas recubiertas con lipasa CV se irradió (CVI) para determinar el efecto de la irradiación en la potencia de la lipasa inmovilizada. Aproximadamente 1.7 g de cada preparación de perlilla (RO, CV, y CVI) se envasaron en columnas con volúmenes de perlilla de aproximadamente 5 mL. La fórmula infantil que contiene triglicéridos de DHA y ARA se pasó sobre la columna a una velocidad de flujo de 75 mL/hr. Lo que eluyó de la columna se analizó por hidrólisis de DHA y ARA por HPLC. El porcentaje de hidrólisis de triglicéridos de DHA y ARA por lipasas CV, CVI, y RO se muestra en la Tabla 6.
TABLA 6: Hidrólisis de TG-DHA y TG-ARA usando un cartucho de lipasa inmovilizada La lipasa de Rhizopus oryzae (RO) presentó actividad bastante mayor hacia los triglicéridos DHA y ARA que la pancreatina porcina (Zenpep®), la cual contiene una mezcla de lipasas pancreáticas, proteasas, y amilasas. 1.4 mL de la fórmula infantil se mezcló con 100 uL de lipasa (ya sea pancreatina o lipasa RO) y 100 uL cada una de triglicéridos de DHA y ARA. Las reacciones se incubaron a 37°C por 15 minutos. Las muestras se tomaron en puntos de tiempo de 0, 1, 2, 4, 6, 8,10, y 15 minutos y se analizaron por RP-HPLC para DHA y ARA. Los triglicéridos de DHA (Figura 28A) y ARA (Figura 28B) se hidrolizaron por lipasa RO con el tiempo pero no se hidrolizaron por la pancreatina.
Ejemplo 11: estudio en cerdo de 6 semanas: alimentación a largo plazo de cerdos con la fórmula pre-hidrolizada por lipasa inmovilizada Seis cerdos sanos y veinte cerdos con insuficiencia pancreátrica exocrina (EPI) quirúrgicamente inducida (véase Ejemplo 5) se sometieron a un periodo de adaptación/control de dos semanas seguido por un periodo de ensayos de seis semanas (Figura 29). Durante el periodo de adaptación, todos los cerdos se alimentaron con la fórmula infantil NAN Pro 1 Gold (Nestle) (“IF”). Durante el periodo de prueba, los cerdos sanos (“Sanos”) y seis de los cerdos con EPI (“EPI”) se alimentaron con la fórmula infantil fortificada con TG-LCPUFA (véase Ejemplos 5 y 6); siete de los cerdos con EPI se alimentaron con fórmula infantil fortificada con TG-LCPUFA que ha sido pre-hidrolizada con enzima RO inmovilizada usando un dispositivo de “bolsa de té” (“EPI + iRO”). Los cerdos restantes se retiraron del estudio por varias razones, por ejemplo, falla para inducir quirúrgicamente EPI de competencia.
Para la pre-hidrólisis, 2 litros de fórmula infantil de NAN Pro 1 Gold (Nestle) se prepararon mezclando 1.5 litros de agua a 37°C con 500 g de fórmula fortificada en polvo con 50 mg/kg de TG-DHA y 100 mg/kg de TG-ARA (véase Ejemplo 5, Sección 5.3). Cinco dispositivos similares a bolsa de té que contienen lipasa RO inmovilizada en las perlillas (1 gramo de lipasa inmovilizada en cada “bolsa de té”) se agregaron a los 2 litros de la fórmula y se mezclaron a temperatura ambiente por 15 minutos usando un agitador magnético a velocidad de mezclado constante. Esto corresponde a 9,000 unidades (como se mide contra el aceite de oliva) de lipasa RO inmovilizada por 150 gramos de grasa total en la fórmula fortificada (60 U/g de grasa total). Antes de la hidrólisis, la fórmula fortificada contiene 17.4 mmol/litro de ácidos grasos no esterificados. Después de la hidrólisis, la fórmula contiene 107.6 mmol/litro de ácidos grasos no esterificados.
El consumo de alimento se midió diariamente. Las muestras de sangre y heces se recolectaron al final del periodo de adaptación (“basal”), y después de 1, 4, y 6 del periodo de tratamiento. Para la muestra basal, las heces se recolectaron por 48 horas (2x24h). Para la semana 1 , 4, y 6 de las muestras, las heces se recolectaron por 72 horas (3x24h). En la terminación del periodo de tratamiento, los órganos y tejidos se recolectaron para estudios de absorción y seguridad.
La fórmula pre-hidrolizada fue bien tolerada sin cambios relacionados al tratamiento en la ingesta de alimento, crecimiento, órganos (por exanimación macroscópica), o bienestar general. No hubo desarrollo de hígado graso con base en la examinación macroscópica del hígado cuando los cerdos se sacrificaron al final del estudio de 6 semanas.
Después de 6 semanas, hubo un incremento estadísticamente significante en los niveles de ARA (Figura 30A) y DHA (Figura 30B) en eritrocitos (20% y 36%, respectivamente) en cerdos EPI alimentados con la fórmula pre-hidrolizada (EPI+iRO), comparado con cerdos EPI alimentados con la fórmula fortificada de TG-LCPUFA sin la prehidrólisis (EPI). Los niveles de eritrocitos de ARA y DHA no difieren significantemente entre los cerdos sanos y los cerdos EPI alimentados con la fórmula pre-hidrolizada por 6 semanas.
Como se muestra en la Tabla 7, hubo un incremento estadísticamente significante en los niveles en plasma de triglicéridos, colesterol, HDL, y LDL en cerdos EPI alimentados con la fórmula pre-hidrolizada por seis semanas. Los niveles en plasma de triglicéridos, colesterol, HDL, y LDL no difieren significantemente entre los cerdos sanos y los cerdos EPI alimentados con la fórmula pre-hidrolizada por seis semanas.
Tabla 7 i diferencia entre EPI y EPI+iRO).
Como se muestra en la Tabla 8, los cerdos alimentados con la fórmula pre-hidrolizada por seis semanas tienen niveles en plasma incrementados de vitaminas A y E, pero no tienen diferencia significante para la vitamina D. Hubo una diferencia estadísticamente significante (p<0.05) en el nivel en plasma de la vitamina E entre los grupos EPI y EPI+iRO. Para la vitamina A, hubo una diferencia estadísticamente significante (p<0.05) entre los grupos de EPI y sanos pero no entre los grupos de EPI+iRO y sanos.
Tabla 8

Claims (89)

Reivindicaciones
1. Una fórmula nutricional caracterizada porque comprende ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFAs), en donde más de 5% de los LC-PUFAs están en la forma de monoglicéridos y/o ácidos grasos libres.
2. La fórmula nutricional de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los LC-PUFAs comprenden uno o más LC-PUFAs seleccionados a partir del grupo que consiste de DHA, ARA, y EPA.
3. La fórmula nutricional de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque los LC-PUFAs comprenden DHA.
4. La fórmula nutricional de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque los LC-PUFAs comprenden EPA.
5. La fórmula nutricional de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque los LC-PUFAs comprenden ARA.
6. La fórmula nutricional de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque los LC-PUFAs comprenden DHA y EPA.
7. La fórmula nutricional de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque los LC-PUFAs comprenden DHA y ARA.
8. La fórmula nutricional de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque los LC-PUFAs comprenden DHA, EPA, y ARA.
9. La fórmula nutricional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizada porque la fórmula nutricional es una fórmula infantil.
10. La fórmula nutricional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizada porque además comprende una lipasa seleccionada a partir de lipasa de Chromobacterium viscosum, lipasa de Pseudomonas fluorescens, y lipasa de Rhizopus oryzae.
11. La fórmula nutricional de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque comprende no más de 0.1 miligramo de lipasa por miligramo de LC-PUFA.
12. La fórmula nutricional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizada porque la fórmula nutricional no comprende lipasa agregada.
13. Una fórmula nutricional caracterizada porque comprende una lipasa seleccionada a partir de lipasa de Chromobacterium viscosum, lipasa de Pseudomonas fluorescens, y lipasa de Rhizopus oryzae.
14. La fórmula nutricional de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque además comprende DHA, en donde más de 5% del DHA está en la forma de un monoglicérido y/o un ácido graso libre.
15. La fórmula nutricional de conformidad con la reivindicación 13 o reivindicación 14, caracterizada porque además comprende ARA, en donde más de 5% del ARA está en la forma de un monoglicérido o un ácido graso libre.
16. La fórmula nutricional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, caracterizada porque además comprende EPA, en donde más de 5% del EPA está en la forma de un monoglicérido o un ácido graso libre.
17. La fórmula nutricional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-16, caracterizada porque comprende no más de 0.1 miligramo de lipasa por miligramo de LC-PUFA.
18. Un método para preparar una fórmula nutricional previo a la ingestión por un sujeto, caracterizado porque comprende exponer una composición nutricional líquida que comprende triglicéridos de LC-PUFA y/o ésteres de LC-PUFA a una lipasa.
19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la lipasa es una o más seleccionada a partir del grupo que consiste de lipasa de Chromobacterium viscosum, lipasa de Pseudomonas fluorescens, y lipasa de Rhizopus oryzae.
20. El método de conformidad con la reivindicación 18 o reivindicación 19, caracterizado porque la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa por al menos 1 minuto previo a la ingestión.
21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-20, caracterizado porque la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa no más de 60 minutos previo a la ingestión.
22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-21, caracterizado porque comprende preparar una composición líquida agregando un líquido potable a una composición en polvo o sólida que comprende triglicéridos de LC-PUFA y/o esteres de LC-PUFA y una lipasa, de este modo exponiendo una composición líquida que comprende triglicéridos de LC-PUFA y/o ésteres de LC-PUFA a la lipasa.
23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-21, caracterizado porque comprende (a) preparar una composición líquida agregando un líquido potable a una composición en polvo o sólida que comprende triglicéridos de LC-PUFA y/o ésteres de LC-PUFA, and (b) agregar una lipasa a la composición líquida, de este modo exponiendo los triglicéridos de LC-PUFA y/o ésteres de LC-PUFA a la lipasa.
24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-23, caracterizado porque además comprende remover la lipasa de la composición líquida después de exponer los triglicéridos de LC-PUFA y/o ésteres de LC-PUFA a la lipasa.
25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la lipasa es removed por un proceso que comprende las etapas de: (a) exponer la lipasa en la composición líquida a una molécula que se une a la lipasa, en donde la molécula es inmovilizada a un soporte sólido, de este modo uniendo la lipasa al soporte sólido; y (b) separar la composición líquida a partir del soporte sólido.
26. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque los triglicéridos de LC-PUFA y/o ésteres de LC-PUFA en la composición líquida son expuestos a una lipasa que es inmovilizada a un soporte sólido y la lipasa es removida separando la composición líquida a partir del soporte sólido.
27. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque los triglicéridos de LC-PUFA y/o ésteres de LC-PUFA en la composición líquida son expuestos a la lipasa y después separados de la lipasa pasando la composición líquida a través de una cámara, en donde la lipasa es inmovilizada en al menos una porción de una cara interior de la cámara.
28. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque los triglicéridos de LC-PUFA y/o ésteres de LC-PUFA en la composición líquida son expuestos a la lipasa y después separados de la lipasa por un proceso que comprende la etapa de pasar la composición líquida a través de una cámara, en donde la lipasa es inmovilizada a un sustrato sólido contenido dentro de la cámara.
29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la cámara es una columna.
30. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la composición líquida que comprende triglicéridos de LC-PUFA y/o ésteres de LC-PUFA es expuesta a la lipasa y después separada de la lipasa por un proceso que comprende la etapa de exponer la composición líquida que comprende triglicéridos de LC-PUFA y/o ésteres de LC-PUFA a un contenedor que contiene lipasa inmovilizada al soporte sólido, en donde al menos una porción de la superficie interior del contenedor consiste de un material que es permeable a triglicéridos de LC-PUFA y ésteres de LC-PUFA pero no es permeable al soporte sólido.
31. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-30, caracterizado porque más de 5% de los LC-PUFAs en la fórmula nutricional preparada están en la forma de monoglicéridos y/o ácidos grasos libres.
32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-31, caracterizado porque los LC-PUFAs comprenden uno o más seleccionados a partir del grupo que consiste de DHA, ARA, y EPA.
33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-20 y 22-32, caracterizado porque la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa no más de 60 minutos previo a la ingestión.
34. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-33, caracterizado porque la composición nutricional líquida es expuesta a no más de 0.1 miligramo de lipasa por miligramo de LC-PUFA en la composición nutricional líquida.
35. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-34, caracterizado porque la composición nutricional líquida es expuesta a lipasa no más de 30 minutos previo a la ingestión.
36. Una fórmula nutricional caracterizada porque es preparada por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-35.
37. Un método para proporcionar nutrición a un sujeto, caracterizado porque comprende alimentar al sujeto la fórmula nutricional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 y 36.
38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la fórmula nutricional es una fórmula infantil.
39. Un método para mejorar la absorción de grasa en un sujeto, caracterizado porque comprende alimentar al sujeto la fórmula nutricional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 y 36.
40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el método reduce el nivel de grasa total en las heces del sujeto por al menos 50%.
41. El método de conformidad con la reivindicación 39 o reivindicación 40, caracterizado porque el método reduce el nivel de al menos un LC-PUFA seleccionado a partir del grupo que consiste de DHA, ARA, y EPA en las heces del sujeto por al menos 50%.
42. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39-41, caracterizado porque el método incrementa el nivel de DHA, ARA, o ambos en el plasma del sujeto.
43. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39-42, caracterizado porque el método incrementa el nivel de DHA, ARA, o ambos en la retina del sujeto.
44. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39-43, caracterizado porque el método incrementa el nivel de DHA, ARA, o ambos en el corazón del sujeto.
45. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39-44, caracterizado porque el sujeto está sufriendo de insuficiencia pancreática, salida pancreática comprometida, una capacidad reducida para hidrolizar triglicéridos de LC-PUFA o ésteres de LC-PUFA, o una capacidad reducida para absorber triglicéridos de LC-PUFA o ésteres de LC-PUFA.
46. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39-45, caracterizado porque la fórmula nutricional es alimentada al sujeto a través de una sonda de alimentación.
47. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39-46, caracterizado porque el sujeto es un infante de pre-término.
48. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39-46, caracterizado porque el sujeto es al menos de 50 años de edad.
49. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39-46, caracterizado porque el sujeto es de 6 años de edad o más joven.
50. Un método para mejorar la capacidad cognitiva en un sujeto sobre la edad de 50, caracterizado porque comprende alimentar al sujeto con la fórmula nutricional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 y 36.
51. Un método para prevenir la enfermedad pulmonar crónica en un infante, caracterizado porque comprende alimentar al infante con la fórmula nutricional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 y 36.
52. Un contenedor que comprende al menos primero y segundo compartimientos, caracterizado porque el primer compartimiento contiene la fórmula nutricional y el segundo compartimiento contiene una lipasa.
53. El contenedor de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque la lipasa se selecciona a partir del grupo que consiste de lipasa de Chromobacterium viscosum, lipasa de Pseudomonas fluorescens, y lipasa de Rhizopus oryzae.
54. El contenedor de conformidad con la reivindicación 52 o reivindicación 53, caracterizado porque la fórmula nutricional está en forma de polvo.
55. El contenedor de conformidad con la reivindicación 52 o reivindicación 53, caracterizado porque la fórmula nutricional está en forma líquida.
56. El contenedor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 52-55, caracterizado porque el segundo compartimiento contiene no más de 0.1 miligramos de lipasa por miligramo de LC-PUFA en la fórmula nutricional contenida en el primer compartimiento.
57. Un dispositivo para preparar la fórmula, caracterizado porque comprende: un contenedor que comprende una pared de cuerpo para contener un fluido; y al menos una lipasa contenida dentro del contenedor.
58. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque al menos una lipasa es inmovilizada dentro del contenedor.
59. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque al menos una lipasa está unida a una estructura en comunicación fluida con el interior del contenedor.
60. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque al menos una lipasa está unida a una estructura por al menos uno de enlace covalente, enlace iónico, o reticulación dentro de la estructura.
61. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 59 o reivindicación 60, caracterizado porque la estructura comprende una superficie interior del contenedor.
62. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 59 o reivindicación 60, caracterizado porque la estructura comprende una tapa del contenedor.
63. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 59 o reivindicación 60, caracterizado porque la estructura comprende proyecciones de superficie dentro del contenedor.
64. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 59 o reivindicación 60, caracterizado porque la estructura comprende partículas dentro del contenedor.
65. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque las partículas comprenden bolas o perlillas
66. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61-65, caracterizado porque al menos una lipasa es encapsulada en un material que es permeable a ácidos grasos pero no es permeable a la lipasa.
67. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 57-66, caracterizado porque el contenedor además comprende al menos una abertura en el contenedor.
68. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque la abertura está configurada para conexión a una sonda de alimentación.
69. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 67 o reivindicación 68, caracterizado porque además comprende una válvula.
70. Un dispositivo para preparar una fórmula, que comprende una tapa para cierre de una botella, caracterizado porque la tapa comprende al menos una lipasa inmovilizada en o dentro de una superficie posicionada para contacto fluido con un interior de la botella.
71. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque al menos una lipasa es inmovilizada sobre o dentro de la superficie por al menos uno de enlace covalente, enlace iónico, o encapsulación dentro de la estructura.
72. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 70 o reivindicación 71, caracterizado porque la superficie comprende una superficie interior de la tapa.
73. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 70-72, caracterizado porque la superficie comprende proyecciones configuradas para extenderse en un contenedor.
74. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 70-73, caracterizado porque al menos una lipasa es encapsulada en un material que es permeable a ácidos grasos pero no es permeable a la lipasa.
75. Un dispositivo para hidrolizar triglicéridos y/o ésteres de ácido graso en una fórmula nutricional, caracterizado porque el dispositivo comprende lipasa unida a un soporte sólido.
76. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 57-75, caracterizado porque la lipasa se selecciona a partir del grupo que consiste de lipasa de Chromobacterium viscosum, lipasa de Pseudomonas fluorescens, y lipasa de Rhizopus oryzae.
77. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque comprende un contenedor, en donde la lipasa es inmovilizada en al menos una porción de una superficie interior del contenedor.
78. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque comprende un contenedor, en donde la lipasa es inmovilizada a un sustrato sólido contenido dentro del contenedor.
79. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 77 o reivindicación 78, caracterizado porque la lipasa es inmovilizada por enlace covalente o reticulación.
80. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 75-79, caracterizado porque además comprende una sonda de alimentación unida al contenedor.
81. Un método para reducir a longitud de tiempo que un paciente requiere para nutrición parental total, caracterizado porque comprende la etapa de administrar entéricamente la fórmula nutricional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 y 36.
82. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39-49, caracterizado porque el método incrementa el nivel de DHA, ARA, o ambos en los eritrocitos del sujeto.
83. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39-51, caracterizado porque el método incrementa el nivel de uno o más componentes del plasma seleccionados a partir del grupo que consiste de triglicéridos, colesterol, HDL, y LDL.
84. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39-51, caracterizado porque el método no incrementa significantemente la acumulación de grasa en el hígado.
85. La fórmula nutricional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o 10-17, caracterizada porque la fórmula es una fórmula nutricional para adultos.
86. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el sujeto es de menos de 1 año de edad.
87. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el sujeto es de entre 1 y 6 años de edad.
88. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39-49, caracterizado porque el método incrementa el nivel de vitamina A, vitamina E, o ambos en el plasma.
89. Un método para incrementar el nivel en plasma de al menos una vitamina seleccionada a partir del grupo que consiste de vitamina y vitamina E, caracterizado porque comprende alimentar al sujeto con la fórmula nutricional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 y 36.
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