BR112014019927B1 - fórmula nutricional, seu método de preparação, seu uso, dispositivos e composição - Google Patents

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Abstract

FÓRMULA NUTRICIONAL, SEU MÉTODO DE PREPARAÇÃO, SEU USO, DISPOSITIVOS E COMPOSIÇÃO. São fornecidas fórmulas nutricionais, compreendendo ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa (LC-PUFAs), juntamente com métodos e dispositivos para preparação e/ou administração das fórmulas nutricionais. Em algumas modalidades, uma porcentagem dos LC-PUFAs na fórmula nutricional está sob a forma de monoglicerídeos e/ou ácidos graxos livres. Em algumas modalidades, as fórmulas nutricionais não compreendem lipase adicional. São também fornecidos métodos para fornecer nutrição para um sujeito, métodos para melhorar a absorção de gordura, métodos para melhorar a capacidade cognitiva, métodos para a prevenção de doença pulmonar crônica, e métodos para reduzir a duração do tempo que um paciente requer nutrição parenteral total.

Description

[001] O pedido reivindica prioridade sob 35 U.S.C. § 119 ao PedidoProvisório dos Estados Unidos número 61/600.207, que foi depositado em 17 de fevereiro 2012 e Pedido Provisório número 61/719.173, que foi depositado em 26 de outubro de 2012.
[002] Ácidos graxos de cadeia longa são cruciais a saúde e desenvolvimento humano. Ácidos graxos de cadeia longa que são consumidos na dieta estão primeiramente na forma de triglicerídeos (TGs), em que três ácidos graxos de cadeia longa são vinculados a uma molécula de glicerol por meio de ligações de éster. Absorção de triglicerídeos de cadeia longa primeiramente requer a ação enzimáti- ca de lipases, (por exemplo, lipase pancreática), que digere triglicerí- deos através de hidrólise, quebrando-os em monoglicerídeos e ainda em ácidos graxos livres. Uma vez disponíveis, estes monoglicerídeos e ácidos graxos livres são absorvidos por células endoteliais no intestino delgado, onde eles se submetem a reesterificação, seguida por transporte ao fígado e enfim aos tecidos no corpo para vários propósitosfisiológicos. D. Kasper et al., Harrison's Principles of Internal Medicine 16aEd. (2004). Enquanto triglicerídeos de cadeia média podem ser absorvidos através do lúmen intestinal, triglicerídeos de cadeia longa não podem, portanto, lipase pancreática é essencial para hidrólise e absorção de ácidos graxos de cadeia longa apropriadas. C. Jensen et al., Am.J.Clin.Nutr. 43:745-751 (1986). Entretanto, algumas pessoas são incapazes de quebrar adequadamente triglicerí- deos de cadeia longa, por exemplo, pacientes sofrendo de saída pancreática comprometida, má absorção ou insuficiência pancreática, e como resultado, podem sofrer de absorção de ácidos graxos que é inadequada para manter a saúde.
[0003] Suplementos de lipase disponíveis comercialmente podem ser adicionados à dieta para melhorar a hidrólise de triglicerídeos de cadeia longa. Entretanto, por um número de razões, suplementos de lipase não resolverão necessariamente o problema de pobre absorção de ácido graxo em todas as pessoas sofrendo de capacidade reduzida de quebrar triglicerídeos de cadeia longa ou, de outro modo, que precisem receber ácidos graxos elementares. Por exemplo, suplementos de lipase mais comerciais são feitos de lipase pancreática animal, que é conhecida por ter estabilidade significantemente reduzida abaixo de pH 7. Vide, por exemplo, US2010/0239559; D. Kasper et al., Harrison's Principles of Internal Medicine16aEd. (2004). Pelo tempo que tais lipases passam através do estômago, quantias significantes são passí-veis de terem sido inativas. Ainda, nem todas as lipases funcionam ao mesmo grau para hidrólise de um dado ácido graxo de cadeia longa, indicando especificidade de lipase em uma consideração importante. R. Jensen et al., Lipids 18 (3):239-252 (1983). E em algumas populações com insuficiência pancreática, fórmulas nutricionais são rigidamente reguladas, tais como, em crianças prematuras ou em pacientes em unidade de terapia intensiva. Para estas populações controladas, pode não ser desejável ou viável suplementar fórmulas já aprovadas com ingredientes adicionais. Além do mais, embora muitas fórmulas suplementadas com ácidos graxos possam conter triglicerídeos de cadeiamédia, há um benefício médico distinto para ingestão alimentar de ácidos graxos de cadeia longa. Deste modo, há uma necessidade de métodos melhorados para intensificar a hidrólise de triglicerídeos de cadeia longa.
[0004] Hidrólise apropriada de triglicerídeos poli-insaturados de cadeia longa (TG-LCPUFA) é particularmente importante por diversas razões. Ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa (LC-PUFAs) são cruciais para o desenvolvimento neural e da retina. Além do mais, alguns são considerados "ácidos graxos essenciais", significando que humanos não podem sintetizá-los e devem obtê-los de fontes alimentares. A principal fonte alimentar para LC-PUFAs n-3 de ácido docosa- hexaenóico (DHA) e ácido eicosapentaenóico (EPA) é seu precursor, ácido alfa-linolênico (ALA), que é um ácido graxo essencial. Enzimas endógenas, entretanto, são altamente ineficientes em converter ALA para DHA e EPA. De acordo com uma declaração oficial pela International Society for the Study of Fatty Acids and Lipids (ISSFAL), a conversão de ALA para DHA é cerca de 1% em crianças e consideravelmente menor em adultos. Brenna et al., Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 80(2-3):85-91 (2009). Deste modo, embora DHA e EPA não sejam necessariamente ácidos graxos por si só, fontes alimentares de DHA e EPA são importantes. A principal fonte alimentar para o LC-PUFA n-6 de ácido araquidônico (ARA ou AA) é ácido linoleico (LA), que é um ácido graxo essencial.
[0005] Modalidades da invenção resolvem estes e vários problemas (i) fornecendo lipases que são surpreendentemente mais eficientes do que outras em hidrolisar certos triglicerídeos de cadeia longa e ésteres, tais como, por exemplo, triglicerídeos poli-insaturados de cadeia longa e ésteres, (ii) fornecendo uma fórmula nutricional, tais como, por exemplo, uma fórmula nutricional médica ou uma fórmula infantil, compreendendo componentes pré-hidrolisados (por exemplo, monoglicerídeos e/ou ácidos graxos livres) de triglicerídeos de LC- PUFA, ésteres de ácido graxo de LC-PUFA e/ou outros triglicerídeos de cadeia longa ou ésteres de ácido graxo de cadeia longa, (iii) fornecendométodos para produzir tal fórmula nutricional, incluindo métodos em que a fórmula contendo triglicerídeos de LC-PUFA, ésteres de ácido graxo de LC-PUFA e/ou outros triglicerídeos de cadeia longa ou ésteres de ácido graxo de cadeia longa é temporariamente exposta a lipase e (iv) fornecendo dispositivos projetados para fornecer fórmulas nutricionais compreendendo monoglicerídeos e/ou ácidos graxos livres, por exemplo, triglicerídeos de LC-PUFA e/ou ésteres de ácido graxo de LC-PUFA. Em modalidades em que a fórmula é temporariamente exposta à lipase e a lipase é removida ou separada da fórmula antes da ingestão, a invenção fornece a vantagem de garantir quebra de triglicerídeos de LC-PUFA, ésteres de ácido graxo de LC-PUFA e/ou outros triglicerídeos de cadeia longa ou ésteres de ácidos graxos de cadeia longa sem requerer ingestão de lipase exógena.
[0006] Por conseguinte, algumas modalidades da invenção fornecem uma fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional compreende LC-PUFAs. Em algumas modalidades, mais do que 2% dos LC-PUFAs totais estão na forma de monoglicerídeos e ácidos graxos livres, por exemplo, menos do que 98% dos LC-PUFAs totais estão na forma de triglicerídeo ou éster. Em algumas modalidades, os monoglicerídeos de LC-PUFA e ácidos graxos livres compreendem mais do que 2,5%, mais do que 3%, mais do que 4%, mais do que 5%, mais do que 6%, mais do que 7%, mais do que 8%, mais do que 10%, mais do que 12%, mais do que 15%, mais do que 20%, mais do que 25%, mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50% ou mais do que 75% dos LC-PUFAs totais em uma fórmula nutricional. Em certas modalidades, a razão de monoglicerídeos de LC-PUFA e ácidos graxos livres para triglicerídeos e ésteres é de pelo menos 0,08:1, pelo menos 0,09:1, pelo menos 0,1:1, pelo menos 0,25:1, pelo menos 0,5:1, pelo menos 1;1, pelo menos 2:1, pelo menos 3:1, pelo menos 4:1, pelo menos 5:1, pelo menos 8:1, pelo menos 10:1 ou pelo menos 20:1.
[0007] Em certas modalidades, a fórmula nutricional é formulada para administração para crianças prematuras. Outras fórmulas nutricionais englobadas pela invenção são formuladas para crianças nos primeiros anos de vida, crianças entre um e três anos, crianças ou adultos que têm uma capacidade reduzida para hidrolisar triglicerídeos de LC-PUFA, ésteres de ácido graxo de LC-PUFA e/ou outros triglice- rídeos de cadeia longa ou ésteres de ácido graxo de cadeia longa, ou que simplesmente precisem de LC-PUFA alimentares elementares adicionais e/ou outros ácidos graxos de cadeia longa. Em algumas modalidades uma fórmula nutricional da invenção é para um sujeito que tem menos de 1 ano de idade. Em algumas modalidades, o sujeito tem entre 1 e 4 anos de idade. Em algumas modalidades, o sujeito tem entre 1 e 6 anos de idade.
[0008] Em certas modalidades, a fórmula nutricional da invenção é uma fórmula nutricional médica, por exemplo, uma fórmula que é formulada para ser consumida ou administrada oralmente ou de forma enteral sob supervisão médica, tais como aquelas distribuídas através de hospitais e farmácias sob uma prescrição. Normalmente, uma fórmula nutricional médica é formulada para administração alimentar de uma desordem médica específica, doença ou condição anormal, para a qual há requisitos nutricionais distintos. Uma fórmula nutricional médica dever ter estado "Geralmente Reconhecido como Seguro" e cumprir com regulamentos FDA que pertencem a rotulagem, reivindicações do produto e fabricação.
[0009] Em algumas modalidades, a fórmula nutricional não contém lipase adicional. Em outras modalidades, a fórmula nutricional contém uma lipase. Em algumas modalidades, a lipase é selecionada a partir de lipases de Chromobacterium viscosum, Pseudomonas fluorescens, Burcholderia cepacia e Rhizopus oryzae.
[0010] Em algumas modalidades, a fórmula nutricional compreende EPA, DHA, ARA, LA e/ou ALA.
[0011] Em função dos ácidos graxos poli-insaturados livres serem instáveis e degradarem rapidamente, a invenção também fornece métodos convenientes e eficientes de preparação de fórmulas nutricionais da invenção pouco antes da ingestão por um sujeito. Em certas modalidades, o método compreende a exposição de uma composição nutricionallíquida compreendendo triglicerídeos de LC-PUFA, ésteres de ácido graxo de LC-PUFA e/ou triglicerídeos de cadeia longa e/ou ésteres de cadeia longa a uma lipase antes da ingestão por uma pessoa que precisa de LC-PUFA alimentar adicional e/ou outros ácidos graxos de cadeia longa. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por pelo menos um minuto, pelo menos 2 minutos, pelo menos 3 minutos, pelo menos 5 minutos, pelo menos 8 minutos, pelo menos 10 minutos, pelo menos 15 minutos, pelo menos 30 minutos, pelo menos 45 minutos ou pelo menos 60 minutos antes da ingestão. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquidaé exposta a lipase por não mais do que um minuto, não mais do que 2 minutos, não mais do que 3 minutos, não mais do que 5 minutos,não mais do que 8 minutos, não mais do que 10 minutos, não mais do que 15 minutos, não mais do que 30 minutos, não mais do que 45 minutos ou não mais do que 60 minutos antes da ingestão. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 24 horas. Em certas modalidades, a lipase é selecionada a partir de lipases de Chromobacterium viscosum, Pseudomonas fluorescens, Burcholderia cepacia e Rhizopus oryzae. Em certas modalidades a lipase pode ser removida da fórmula nutricional antes da ingestão. Em outras modalidades, a composição nutricionallíquida compreendendo triglicerídeos de LC-PUFA, ésteres de ácido graxo de LC-PUFA e/ou outros triglicerídeos de cadeia longa e/ou ésteres é exposta a lipase imobilizada a um suporte sólido antes da ingestão. Em algumas modalidades, a lipase é imobilizada ao suportesólido por ligação covalente, ligação iônica ou reticulação. Em certas modalidades, a lipase imobilizada é encapsulada dentro ou anexada a uma membrana permeável.
[0012] Outro aspecto da invenção é um método para fornecer nutrição a um sujeito que precise de LC-PUFA alimentar e/ou outros ácidos graxos de cadeia longa, tais como, pessoas sofrendo de uma capacidade reduzida de quebrar triglicerídeos de cadeia longa ou ésteres de ácido graxo de cadeia longa no intestino, pessoas sofrendo de insuficiência pancreática, pessoas sofrendo de má nutrição e pessoas que vem recebendo nutrição parenteral total, administrando uma fórmula da invenção. Em algumas modalidades, o sujeito é uma criança prematura. Em outras modalidades, o sujeito é uma criança que completou o período de gestação ou uma criança entre um e três anos. Em certas modalidades, o sujeito tem mais de 50 anos, mais de 60 anos ou mais de 70 anos. Em algumas modalidades, o sujeito está sofrendo de insuficiência pancreática. Em outras modalidades, a fórmula é administradaatravés de um tubo de alimentação. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional da invenção é administrada para melhorar a capacidade cognitiva em uma pessoa de qualquer idade, para prevenir doença de pulmão crônica em uma criança prematura, para intensificar o desenvolvimento reurológico de uma criança prematura ou para tratar ou prevenir um número de outras condições associadas com a melhoria da ingestão aumentada de ácidos graxos de cadeia longa, tais como, por exemplo, EPA, DHA, ARA, LA e ALA. Tais condições incluem, mas não se limitam a doença de Alzheimer, transtorno bipolar, depressão, sepse, estresse respiratório agudo, cicatrização de feridas, câncer, doença cardiovascular, derrame cerebral, doença de Parkin-son, esquizofrenia, diabetes, esclerose múltipla, má nutrição, função GI prejudicada e doença inflamatória crônica, tais como, artrite reuma- toide, lúpus eritematoso sistêmico e doença inflamatória intestinal.
[0013] Outra modalidade da invenção fornece um método para reduzir o tempo que um paciente precisa de nutrição parenteral total administrando uma fórmula nutricional da invenção. Como resultado, tais pacientes são expostos a um risco reduzido de atrofia intestinal e outras complicações associadas nutrição parenteral total estendida (mais do que 24 horas). Tais métodos podem ser usados para encurtar o tempo de recuperação de pacientes sofrendo de função GI prejudicada, tais como, por exemplo, má absorção, síndrome do intestino curto, IBD, insuficiência pancreática, má nutrição antes ou após cirurgia, quimioterapia ou radioterapia ou outras causas de má nutrição, câncer, feridas e úlceras de pressão. Tais pacientes podem receber a fórmula nutricional da invenção por meio de tubo nasogástrico. Este método de alimentação pode ser vantajoso em situações onde o paciente sofre de motilidade intestinal alterada, secreção de enzima pancreática prejudicada devido Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica ou outras condições que resultem em clivagem e absorção de triglicerídeos de LC-PUFA, ésteres de ácido graxo de LC-PUFA e/ou outros triglicerí- deos de cadeia longa ou ésteres de ácidos graxos de cadeia longa. Em uma modalidade alternativa, onde é vantajoso ignorar o estômago, a fórmula nutricional da invenção pode ser administrada por tubo naso- jejunal. Outros tipos de aparatos de alimentação também podem ser usados para entregar as fórmulas da invenção.
[0014] Uma vez que sujeitos saudáveis também podem se beneficiar da absorção aumentada de LC-PUFA, por exemplo, reduzindo o risco de doença cardiovascular. Por conseguinte, em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para melhorar a absorção de gordura em um sujeito saudável, compreendendo alimentação para o sujeito com uma fórmula nutricional da invenção.
[0015] A invenção fornece ainda dispositivos para preparação das fórmulas nutricionais da invenção. Em algumas modalidades, o dispositivo compreende uma câmara contendo pelo menos uma lipase, em que a câmara é capaz de reter uma composição nutricional líquida de modo que seja exposta à lipase. Em algumas modalidades, a lipase no recipiente é imobilizada á superfície interna do recipiente. Em outras modalidades, a lipase é imobilizada a um suporte dentro da câmara. Em algumas modalidades, o dispositivo compreende uma câmara constituída de uma membrana permeável e compreendendo lipase imobilizada dentro da câmara, de tal modo que a composição nutricionallíquida possa fluir através da membrana permeável e entrar em contato com a lipase, mas a lipase não pode passar através da membranapermeável. Em algumas modalidades, a lipase contida dentro da câmara de um dispositivo da invenção é uma lipase microbiana. Em algumas modalidades, a lipase selecionada a partir de lipase bacteria- na. Em algumas modalidades, a lipase é selecionada a partir de lipase de Chromobacterium viscosum, lipase de Pseudomonas fluorescens, lipase de Burcholderia cepacia e lipase de Rhizopus oryzae. Em algumas modalidades, a lipase e selecionada a partir de lipase de Chromobacterium viscosum, lipase de Pseudomonas fluorescens e lipase de Rhizopus oryzae. Em algumas modalidades, a lipase é lipase de Rhizopus oryzae.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0016] A Figura 1 ilustra um dispositivo e método para fornecer nutrição a uma criança de acordo com certas modalidades.
[0017] A Figura 2A ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0018] A Figura 2B ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0019] A Figura 2C ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0020] A Figura 3A ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0021] A Figura 3B ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0022] A Figura 3C ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0023] A Figura 4A ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0024] A figura 4B ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula, de acordo com certas modalidades.
[0025] A Figura 5A ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0026] A Figura 5B ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0027] A Figura 6A é uma fotografia de uma ampola de lipase de Rhyzopus oryzae imobilizada sobre grânulos de polímero.
[0028] A Figura 6B ilustra um dispositivo para tratamento e administração de fórmula nutricional de acordo com certas modalidades.
[0029] A Figura 6C ilustra um dispositivo para tratamento e administração de fórmula nutricional de acordo com certas modalidades.
[0030] A Figura 6D ilustra um dispositivo representado na Figura 6C visto de perto.
[0031] A Figura 7 representa a hidrólise de triglicerídeo de DHA por lipase de Rhyzopus oryzae (RO).
[0032] A Figura 8 representa a hidrólise de triglicerídeos de ARA por lipase de Rhyzopus oryzae.
[0033] A Figura 9A ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0034] A Figura 9B ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0035] A Figura 9C ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0036] A Figura 10A ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0037] A Figura 10B ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0038] A Figura 10C ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0039] A Figura 11A ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0040] A Figura 11B ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0041] A Figura 11C ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0042] A Figura 12 ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0043] A Figura 13A ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0044] A Figura 13B ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0045] A Figura 14 ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0046] A Figura 15 ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0047] A Figura 16 ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0048] A Figura 17A ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0049] A Figura 17B ilustra uma vista em corte parcial de um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0050] A Figura 18 ilustra um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0051] A Figura 19 ilustra uma vista em corte parcial de um dispo- sitivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0052] A Figura 20 ilustra uma vista em corte parcial de um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0053] A Figura 21 ilustra uma vista em corte parcial de um dispositivo para tratamento de fórmula de acordo com certas modalidades.
[0054] A Figura 22A mostra o peso de fezes em porcos com EPI durante a semana de controle ("Semana Cont", durante a qual os porcos foram alimentados com fórmula infantil fortificada com TG- LCPUFA) versus a semana de tratamento ("Semana Trat", durante a qual os porcos foram alimentados com a mesma fórmula ou não hidro- lisada ("CONT"), pré-hidrolisada com lipase de Chromobasterium vis-cosum ("CV") ou pré-hidrolisada com lipase de Rhyzopus oryzae(RO)). A Figura 22B mostra o teor de gordura fecal total ao longo dos últimos 3 dias da semana de tratamento nos mesmo 3 grupos de porcos e a Figura 22C mostra o coeficiente de absorção de gordura (%CFA).
[0055] A Figura 23 mostra os níveis de ARA (A), EPA (B) e DHA (C) nas fezes dos porcos com EPI alimentados com fórmula não hidro- lisada ("CONT"), fórmula pré-hidrolisada com lipase de CV ("CV") ou fórmula pré-hidrolisada com lipase de RO ("RO"). Asteriscos indicam p<0,001.
[0056] A Figura 24 mostra níveis de ARA (A) e DHA (B) no plasma de porcos com EPI seguindo 7 dias de alimentação com fórmula não hidrolisada ("CONT"), fórmula pré-hidrolisada com lipase de CV ("CV") ou fórmula pré-hidrolisada com lipase de RO ("RO"). Asteriscos indicam p<0,05.
[0057] A Figura 25 mostra níveis de ARA e DHA na retina (A) e tecido adiposo (B) de porcos com EPI seguindo 7 dias de alimentação com fórmula não hidrolisada ("CONT"), fórmula pré-hidrolisada com lipase de CV ("CV") ou fórmula pré-hidrolisada com lipase de ("RO"). Asteriscos indicam p<0,05.
[0058] A Figura 26 mostra níveis de ARA e DHA no coração (A) e tecido de rim (B) de porcos com EPI seguindo 7 dias de alimentação com fórmula não hidrolisada ("CONT"), fórmula pré-hidrolisada com lipase de CV ("CV") ou fórmula pré-hidrolisada com lipase de RO ("RO"). Asteriscos indicam p<0,05.
[0059] A Figura 27 mostra o percentual de hidrólise de DHA e ARA na fórmula Enfalac com 100 mg (A), 500 mg (B), 1000 mg (C) ou 2000 mg (D) de lipase de RO imobilizada.
[0060] A Figura 28 mostra o percentual de hidrólise de DHA (A) e ARA (B) com lipase de RO ou pancreatina.
[0061] A Figura 29 representa o projeto de estudo para o estudo de porcos de 6 semanas descrito no Exemplo 10.
[0062] A Figura 30 mostra níveis de ARA e DHA em eritrócitos coletados de porcos saudáveis alimentados com fórmula infantil fortificada com TG-LCPUFA ("Saudável"), porcos com insuficiência pancreáti- ca exócrina induzida cirurgicamente alimentados com fórmula infantil fortificada com TG-LCPUFA ("EPI") e porcos com insuficiência pan- creática exócrina induzida cirurgicamente alimentados com fórmula infantil fortificada com TG-LCPUFA que foram pré-hidrolisadas por lipase de RO imobilizada ("EPI+RO").
Ácidos Graxos Poli-Insaturados De Cadeia Longa
[0063] Ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa (LC-PUFAs) são cadeias de hidrocarboneto contendo duas ou mais ligações duplas. Dependendo da posição da primeira ligação dupla em relação a terminal metil, um LC-PUFA pode ser classificado como um ácido gra- xo ômega-3 (n-3) ou ômega-6 (n-6). ALA e LA são ácidos graxos precursores das famílias PUFA n-3 e n-6, respectivamente. Eles são considerados"ácidos graxos essenciais", significando que humanos não podem sintetizá-los, mas em vez disso, devem obtê-los através da dieta. Isto é em função de mamíferos carecerem da capacidade de in- troduzir ligações duplas em ácidos graxos além do carbono 9 e 10. Blosover et al. Cell Biology: A Short Course, Jhon Wiley & Sons, Inc. em 39 (2011). Entretanto, humanos podem fazer PUFAs de cadeia longa adicionais começando com ALA e LA.
[0064] Tanto ALA quanto LA são metabolizados para gerar outros PUFAs de cadeia longa através de uma série de etapas de dessatura- ção e alongamento. Por exemplo, ALA é metabolizado para EPA e enfim DHA. LA é metabolizado para ARA, um ácido graxo n-6. Conversão de ALA para DHA e LA para ARA, entretanto, é relativamente ineficiente. L. Arterburn et al., AM J. Clin. Nutr. 83 (suppl): 1467S-1476S (2006). Estudos estimaram a conversão de ALA para DHA em humanos em menos do que 5%. B. Anderson e D. Ma, Lipids Health Dis. 8:33 (2009). O fígado contém tecido mais ativo para converter ALA para DHA e LA para ARA, e portanto, desempenhar um papel fundamental em fornecer DHA e ARA a tecidos ou órgãos menos ativos, tal como, o cérebro. M. Martinez et al., J. Pediatr. 120:S129-S138 (1992). Alternativamente, estes LC-PUFAs podem ser consumidos diretamente a partir da dieta. DHA e EPA são encontrados em peixes, nozes e óleo de linhaça, ao passo que ARA está disponível a partir de fontes de gordura animal, óleo de milho, óleo de soja e óleo de semente de girassol.
ÁCIDOS GRAXOS N-3
[0065] O ácido graxo de DHA n-3 é crucial para desenvolvimento e funcionamento neural e da retina. É o principal PUFA de cadeia longa na membrana neural e é essencial para o funcionamento cerebral, ligação de circuitos cerebrais e transmissão de impulso nervosa. Como um componente de membrana integral, DHA contribui para a fluidez da membrana que é importante para manter as estruturas sinápticas, neu- rotransmissão e plasticidade sináptica. G. Jicha et al., Clin. Interv Aging 5:46-61 (2010). DHA também influencia sinalização de eventos essenciais a diferenciação e sobrevivência de neurônios e tem efeitos sobre os níveis e metabolismo de neurotransmissores e eicosanóides. A maioria do acúmulo de DHA no cérebro ocorre no início do 3° trimestre ao longo de todo o segundo ano de vida. Isso demonstrou que em roedores e primatas, um suprimento inadequado de PUFA n-3 durante este período resulta em capacidade de aprendizado e neurotransmis- são prejudicadas. M. Martinez et al., J. Pediatr. 120:S129-S138 (1992). Suplementação de DHA em ratos que foram anteriormente restritos a uma dieta deficiente em DHA salva o desempenho em tarefas de memóriae aprendizado. W. Chung et al., J. Nutr. 138(6):1165-1171 (2008). E em um estudo de garotos adolescentes saudáveis, 8 semanas de suplementação de DHA significantemente aumentou a ativação funcional no córtex pré-frontal dorsolateral durante desempenho de uma tarefa de ativação comparado ao placebo. R. McNamara et al., Am. J. Nutr. 91:1060-7 (2010). Deste modo, DHA é considerado importantenão apenas no desenvolvimento, mas na manutenção do funcionamento neuronal.
[0066] DHA também é altamente concentrado na retina e tem efeitos importantes sobre diferenciação e ativação de fotorreceptores da rodopsina do pigmento visual. H Lauritzen et al., Prog. Lipid Res. 40:194 (2001); M. Clandinin et al., J. Pediatr. 125:S25-32 (1994). Um suprimento inadequado de DHA no início do desenvolvimento de primatas e roedores resulta em fisiologia de retina anormal e acuidade visual reduzida. M. Reisbick et al., Dev. Psychol. 33:387-395 (1997); J. McCann et al., Am. J. Clin. Nutr. 82:281-295 (2005). Similarmente, em humanos e crianças alimentados com a fórmula sem DHA pelos primeiros doze meses de vida, mostraram ter menor acuidade visual do que crianças alimentadas com fórmula suplementada com DHA. E. Birch et al., Am. J. Clin. Nutr. 91(4):848-859 (2010). Deficiências de DHA também foram associadas com síndrome alcoólica fetal, transtor- no de déficit de atenção e hiperatividade, fibrose cística, fenilcetonúria, depressão unipolar, hostilidade agressiva e adrenoleucodistrofia. A. Horrocks et al., Pharmacological Res. 40(3):211-225 (1999).
[0067] Os benefícios da ingestão aumentada de DHA e outros ácidos graxos n-3 foram descritos para várias doenças, incluindo por exemplo, doença de Alzheimer (AD), transtorno bipolar (BP), depressão, incluindo transtorno depressivo maior (MDD) e depressão pós- parto, sepse, estresse respiratório agudo, cicatrização de feridas, câncer,doença cardiovascular, derrame cerebral, doença de Parkinson, esquizofrenia, diabetes, esclerose múltipla e doença inflamatória crônica, tais como, artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico e doença inflamatória intestinal.
[0068] Por exemplo, ensaios clínicos com pacientes AD demonstrou que DHA fornece um benefício terapêutico. Para uma revisão de estudos avaliando o efeito de DHA em AD, vide G. Jicha e W. Mar- kesbery, Clin. Interv. Aging 5:45-61 (2010). Dados de análises in vitro, sistemas de cultura celular e modelos murinos de AD suportam um papel direto para PUFAs n-3 em processamento amilóide no cérebro. E em modelos transgênicos de produção amilóide de AD, suplementa- ção com DHA resulta em níveis menores de □□. M. Oksman et al., Neurobiol. Dis. 23(3):563-572 (2006). Além destes dados de ensaios clínicos positivos em pacientes com AD, um grande estudo em pesso-as idosas saudáveis com queixas de memória leves mostrou que sujeitos administrados com DHA desempenharam melhor no aprendizado e testes de memória após seis meses comparados àqueles recebendo placebo. (Martek Press Release, 4 de maior de 2010). Deste modo, DHA também pode desempenhar um papel benéfico em prevenir AD.
[0069] Uso terapêutico de DHA também foi investigado em pacientes com BP e MDD. Para uma revisão sobre DHA em BP, vide V. Ba- lencia-Martinez et al., Expert. Ver. Neurother. 11(7):1029-1047 (2011). Devido a dificuldades em estimar níveis de DHA no tecido cerebral de pacientes humanos, a composição de ácido graxo em membranas eri- trocítica de amostras de sangue foi avaliada e descobriu-se conter sig- nificantemente menos DHA em pacientes com BP e MDD do que em controles saudáveis. R. McNamara et al., J. Affect. Disord. 126(1- 2):303-311 (2011). Em um estudo post-mortem, a composição de ácido graxo do córtex orbitofrontal teve níveis significantemente menores de DHA em pacientes com BP comparados a controles normais. R. McNamara et al., Psychiatry Res. 160(3):285-299 (2008). E em um estudo controlado de 4 meses, duplo-cego, com placebo, pacientes com BP recebendo ácidos graxos n-3 tiveram períodos significantemente mais longos de remissão do que o grupo placebo. A. Stoll et al., Arch. Gen. Psychiatry 56(5):407-412 (1999). Estes estudos implicam DHA como terapeuticamente benéfico em BD e MDD, particularmente devido a seus efeitos estabilizantes de humor.
[0070] DHA também se mostrou benéfico a pacientes sofrendo de outras formas de depressão. Para uma revisão, vide A. Logan et al., Lipids Health Dis. 3:25-35 (2004). Um número de estudos descobriu diminuição dos níveis n-3 no sangue de pacientes com depressão. Similarmente, um aumento no DHA no plasma foi associado a uma redução em mulheres relatando sintomas de depressão pós-parto. Alguns estudos controlados com placebo descobriram que tratamento com n-3 melhora sistemas depressivos. Para uma revisão sobre a relação entre níveis de n-3 e depressão, vide A. Logan et al., Lipids Health Dis. 3:25-32 (2004).
[0071] Em sepse, uma dieta enteral enriquecida com EPA, ácido Y- linolênico e antioxidantes melhorou resultados hospitalares e mortalidade reduzida em pacientes com sepse severa ou choque séptico requerendoventilação mecânica. A. Pontes-Arruda et al., Crit. Care Med. 34(9):2325-2333 (2006). Benefícios similares em dias livres de ventila- dor, dias livres de ICU, disfunções de órgão novo reduzidas e uma diminuição na taxa de mortalidade foram relatados em pacientes com estresse respiratório agudo alimentados com uma dieta enriquecida com PUFAs de cadeia longa e antioxidantes. J. Gadek et al., Crit. Care Med. 27(8):1409-1420 (1999).
[0072] Ácidos graxos n-3 também são relatados por terem efeitos benéficos em cicatrização de feridas. Através da alteração do micro- ambiente lipídico, ácidos graxos n-3 intensificam a reconstituição de células epiteliais e também podem ajudar a reduzir inflamação. D. Ru- thig e K. Meckling-Gill, J. Nutr. 129:1791-1798 (1999); J. McDaniel et al., Wound Repair Regen. 19(2):189-200 (2011).
[0073] EPA e DHA mostraram efeitos protetores em cânceres, tais como, câncer de próstata e de mama. Os efeitos benéficos podem ser devido a propriedades anti-inflamatórias, assim como mecanismos que diminuem a proliferação e promovem apoptose, tal como, através de diminuição na regulação de NF-KB. Para uma discussão sobre ácidos graxos n-3 em câncer, vide B. Anderson e D. Ma, Lipids Health Dis. 8:33 (2009).
[0074] Ácidos graxos n-3 foram associados a efeitos benéficos em pacientes com doença cardiovascular e na redução do risco de doença cardiovascular em pessoas saudáveis. Efeitos positivos similares foram relatados para derrame cerebral. Por conseguinte, a American Heart Association, assim como outras agências de saúde emitiram recomendações para aumento de ingestão de ácidos graxos n-3 na dieta. P. Kris-Etherton et al. Circulation 106:2747-2757 (2002). Mecanismospossíveis pelos efeitos observados de ácidos graxos n-3 sobre a saúde cardiovascular incluem efeitos hipotrigliceridêmicos, efeitos hipotensores, redução na agregação de plaquetas e efeitos estabili- zantes sobre o próprio miocárdio.
[0075] O benefício de ácidos graxos n-3 em algumas condições pode ser atribuído a efeitos anti-inflamatórios gerais. EPA e DHA dão origem a resolvins, que são mediadores anti-inflamatórios com funções de resolução de inflamação e imunomoduladoras. Por exemplo, EPA e DHA exibem efeitos inibidores sobre a quimiotaxia dos leucócitos e alteram a produção de citosinas inflamatórias através da redução da ativação de NF-KB em células imunes. P. Calder, Int. Rev. Immunol. 28:506-534 (2009). Em geral, PUFAs n-3 são associados à redução nas respostas da célula T pró-inflamatória. Quando ácidos graxos n-3 são aumentados em dietas animais, a composição de micro domínio de membrana de células T em jangadas lipídicas é alterado, resultando em redução de ativação de NF-KB, produção de IL-2 e proliferação celular. Especificamente, PUFAs n-3 afetam a distribuição e partição dos primeiros mediadores de sinalização de ativação de célula T, tal como, proteína quinase C. Y. Fan et al., J. Immunol. 173:6151-6160 (2004). Ácidos graxos n-3 se mostraram a reduzir a expressão de MHC classe II sobre células dentríticas, diminuindo efetivamente a apresentação de antígeno para células T, ao passo que ácidos graxos n-6 são associados a o aumento da atividade de apresentação de an- tígenos. Sanderson et al., J. Leukoc. Biol. 62:771-777 (1997). Em um monócito de linha celular e em macrófagos intraperitoneais, DHA e EPA têm propriedades anti-inflamatórias mediadas através de um receptor 120 de proteína G acoplado (GPR120). Como resultado, estes ácidos graxos exibem efeitos antidiabéticos in vivo por meio da supressão de inflamação de tecido induzida por macrófagos. D. Oh et al., Cell 142(5):687-698 (2010). As várias funções imunomoduladoras de PUFAs n-3 indicam que eles podem ser influenciáveis em muitas doenças humanas.
ÁCIDOS GRAXOS N-6
[0076] Assim como os ácidos graxos n-3, ácidos graxos n-6, tal como, ARA, desempenham um papel crucial no desenvolvimento neu- ral e funcionamento cerebral, com acúmulo de ARA ocorrendo no cérebro durante o desenvolvimento pré e pós-natal. B. Koletzo et al., J. Perinat. Med. 36(1):5-14 (2008). Ácidos graxos n-6 são de forma geral importantes para o desenvolvimento normal e imunidade e também estimulam o crescimento de pele e cabelo, mantêm a saúde óssea, regulam o metabolismo e mantêm o sistema reprodutivo.
Suplementos de PUFA de cadeia longa
[0077] Por mais de uma década, agências de saúde recomendaram o consumo de ácidos graxos n-3 na dieta devido aos seus benefícios à saúde. DHA e EPA são disponíveis comercialmente como trigli- cerídeos ou na forma esterificada em suplementos nutricionais ou produtos de prescrição (por exemplo, LOVAZA®, OMACOR® e Vasce- pa™). Suplementos de DHA podem ser derivados a partir de óleo de peixe ou a partir de fontes vegetarianas, tais como, óleo de linhaça ou algas. Suplementos podem ser pó, líquido, bebida ou fórmulas para alimentação por tubo.
[0078] A fórmula infantil é sujeita ao Federal Food, Drug, and Cosmetic Act, que define fórmula infantil como "um alimento que tenha em vista ser ou é representado para uso unicamente dietético especial como um alimento para crianças por razões de sua simulação de leite humano ou sua adequabilidade como um substituto completo ou parcial ao leite humano". O FDA define crianças como pessoas com não mais do que 12 meses de idade. 21 CFR 105,3(e). O principal ácido graxo n-3 no leite humano é DHA, sendo o ponto médio 7 a 8 mg/dl (variando de 0,17% a 1,0% dos ácidos graxos totais). R. Yuhas et al. Lipids 41(9):851-858 (2006). A quantia de DHA no leite humano é principalmente um reflexo da ingestão de DHA maternal.
[0079] Fórmulas infantis suplementadas com TG-LCPUFA disponíveis comercialmente incluem fórmulas Enfamil, tais como, Enfamil LIPIL® e Enfamil PREMIUM®, Baboo, Earth's Best Organic, fórmulas Nestlé, tais como, Nestle Gerber GOOD START® e Nestle NAN®, fórmulas Nuticia, tais como, NEOCATE® e APTAMIL®, Parent's Choice Organic, Pfizer's SMA GOLD®, fórmulas Similac, tais como, Similac ADVANCE®, Similac EARLY SHIELD® e ISOMIL®, e Ultra Bright Beginnings. Outras fórmulas infantis também podem ser suplementadas com TG-LCPUFA. Fórmulas suplementadas com TG-LCPUFA podem ser à base de leite ou à base de soja, e podem ser orgânicas. Nos Estados Unidos, fórmulas infantis suplementadas com TG-LCPUFA são responsáveis por aproximadamente 90% das vendas de produtos (Mead Johnson Nutrition).
[0080] TG-LCPUFA também pode ser adicionado a fórmulas de alimentação de transição e bebidas para crianças entre um e três anos, idosos e outras pessoas precisando de suporte nutricional ou suplementação alimentar com ácidos graxos de cadeia longa. Exemplos de tal produto incluem ENSURE®, PEDIASURE®, CARNATION®, BOSST®, CERELAC® e SOUVENAID®. Além disto, fórmulas especializadas que são suplementadas com TG-LCPUFA ou ésteres de LC-PUFAs podem ser usadas em ligação com os métodos e dispo-sitivos da invenção em pacientes que requerem alimentação por tubo. Por exemplo, fórmulas enterais são comumente usadas em crianças prematuras, pacientes com insuficiência renal, doenças gastrointestinais ou condições causando funcionamento GI prejudicado, ressecção intestinal, má absorção de gordura, má nutrição, pancreatites, hipergli- cemia/diabetes, insuficiência hepática, doenças pulmonares crônicas e agudas ou um estado imunocomprometido. Para uma revisão de fórmulas enterais disponíveis comercialmente, vide A. Malone, Pract. Gastr. 29(6):44-74 (2005). Fórmulas nutricionais podem ser padrão, elementar ou especializada com base em uma doença ou condição de paciente. Fórmulas padrão comumente usadas incluem, por exemplo, ISOCAL®, NUTREN 1.0®, NUTREN 1.5®, NUTREN 2.0®, OSMOLITE 1.0®, OSMOLITE 1.2®, FIBERSOURCE 1.2®, JEVITY 1.2®, JEVITY 1.5®, PROBALANCE®, ISOSOURCE 1.5®, DELIVER 2.0®, NOVO- SOURCE 2.0® e TWOCAL HN®. Fórmulas elementares podem conter fontes de macro nutrientes incluindo fórmulas poliméricas e hidrolisa- das e podem ser intensificadas com fibras. Fórmulas específicas para doenças incluem, por exemplo, fórmulas renais, tais como, MAGNA- CAL RENAL®, NEPRO®, NOVASOURCE RENAL®, SUPLENA® e NUTRI-RENAL®.
[0081] Fórmulas gastrointestinais (GI) podem ser usadas para a administração nutricional de pacientes com funcionamento GI prejudicado inclusive em pacientes com má absorção severa de proteínas ou gorduras, ressecção intestinal extensa, fibrose cística, paralisia cerebral, síndrome do intestino curto, IBD, pancreatites, doença de Crohn, diarreia, Fístula GI, doença Celíaca, síndromes de má absorção, trau- ma/cirurgia, enterite por radiação, falência intestinal, quilotórax. Estas fórmulas também são usadas para alimentação pós-operatória imediata,alimentação trófica, nutrição parenteral total (TPN) alternativa e alimentação dupla com TPN. Fórmulas GI incluem, por exemplo, PEP- TAMEN®, que é feito de 70% de triglicerídeos de cadeia média para diminuir o potencial de má absorção de gordura e 30% de triglicerí- deos de cadeia longa, VIVONEX PLUS® e VIVONEX PEDIATRIC®.
[0082] Infelizmente, para pessoas sofrendo de capacidade prejudicada para hidrolisar triglicerídeos de cadeia longa ou ésteres de ácidos graxos de cadeia longa, tal como, por exemplo, aquelas com saída pancreática comprometida ou aquelas sofrendo de insuficiência pan- creática, mesmo suplementando tais fórmulas com DHA, EPA e outros ácidos graxos n-3 podem não ser suficientes para perceber os benefícios associados a estes compostos. Triglicerídeos de cadeia longa ou ésteres de ácido graxo devem ser metabolizados para monoglicerí- deos e/ou ácidos graxos livres a fim de serem propriamente absorvi- dos nos intestinos. A invenção fornece métodos para utilizar suplementos de PUFA de cadeia longa disponíveis comercialmente ou fórmulasrecém-projetadas suplementadas com PUFAs de cadeia longa para fornecer fórmulas prontas para uso contendo concentrações sig- nificantemente maiores de monoglicerídeos de cadeia longa e/ou ácidos graxos livres. Em algumas modalidades, os métodos serão particularmente efetivos em fornecer monoglicerídeos de cadeia longa e/ou ácidos graxos livres produzidos a partir de triglicerídeos de DHA, EPA e ARA ou DHA, EPA e ARA esterificados de modo que a fórmula fornecerá o benefício máximo associado a estes ácidos graxos críticos a pessoas que, de outro modo, não seriam capazes de hidrolisá-los e absorvê-los.
Capacidade reduzida para Hidrolisar Triglicerídeos de Cadeia Longa e Ésteres de Ácido Graxo
[0083] Insuficiência pancreática é uma das condições que leva a uma capacidade reduzida para hidrolisar triglicerídeos de cadeia longa. Insuficiência pancreática é caracterizada por produção insuficiente de enzimas pancreáticas exócrinas, incluindo lipase pancreática. Insuficiência pancreática pode ocorrer naturalmente durante vários estágios da vida humana. Por exemplo, a secreção de lipase pancreática inicia em níveis baixos em torno de 30 semanas de gestação e permanece baixo durante o primeiro ano de vida. Entretanto, crianças, e especialmente crianças prematuras, podem experimentar insuficiência pancreática. Como resultado, se elas não são amamentadas, estas crianças são suscetíveis a pobre hidrólise e absorção de ácido graxo e são privadas dos benefícios associados à ingestão de DHA, EPA e outros LC-PUFAs.
[0084] Na outra extremidade do espectro, de outro modo, idosos saudáveis também podem experimentar insuficiência pancreática ou outra capacidade reduzida para hidrolisar triglicerídeos de LC-PUFA ou LC-PUFAs esterificados devido a mudanças no pâncreas que ocorrem como parte do processo natural de envelhecimento. Estas mudanças podem incluir atrofia, fibrose, esclerose ou lipomatose do pâncreas. Como resultado, os idosos podem experimentar sintomas de má digestão incluindo má nutrição, esteatorreia, diarreia, dor abdominal e perda de peso em função da secreção de enzima pancreática exócrina reduzida. K. Herzig et al., BMC Geriatrics 11:4-8 (2011).
[0085] Insuficiência pancreática ou outra capacidade reduzida para hidrolisar triglicerídeos de LC-PUFA ou LC-PUFAs esterificados também podem resultar de doença ou trauma. Por exemplo, pancreatite é uma condição de inflamação no pâncreas que resulta em insuficiência pancreática. Pancreatite pode ser aguda ou crônica, e inclui pancreatite causada por alcoolismo, pancreatite crônica idiopática, pancreatite hereditária, pancreatite traumática, pancreatite necrosante aguda e pancreatite autoimune. Fibrose cística também é uma causa de insuficiência pancreática, particularmente em crianças e adolescentes. Distúrbios que resultam em uma diminuição no pH intraduodenal, tal como, gastrinoma (síndrome de Zollinger-Ellison), pode neutralizar lipase e causar insuficiência pancreática. Insuficiências pancreáticas também podem ser causadas por cirurgias do trato gastrointestinal em que partes do estômago ou pâncreas são removidas, câncer pancreático, doenças gastrointestinais, tais como, úlceras estomacais, doença celíaca ou doença de Chron, ou em distúrbios autoimunes, tais como, lúpus eritematoso sistêmico (SLE) ou doença inflamatória intestinal (IBD).
[0086] Outras causas de uma capacidade reduzida para digerir TG-LCPUFAs, LC-PUFAs esterificados e/ou outros triglicerídeos de cadeia longa e ésteres de ácido graxo incluem, por exemplo, síndrome do intestino irritável, hipertrigliceridimia, má nutrição, incluindo má nutrição proteico-calórica grave, neoplasias pancreáticas e duodenais, radioterapia abdominal, hemocromatose, colangite esclerosante primá- ria, cirrose biliar primária, síndrome de Shwachman, deficiência de tripsonogênio, deficiência de enteroquinase ou uma deficiência de lipase isolada. D. Kasper et al., Harrison's Principles of Internal Medicine16aEd. (2004). Uma capacidade reduzida para digerir triglicerí- deos de cadeia longa ou PUFAs de cadeia longa esterificados pode resultar de ressecção intestinal, fibrose cística, paralisia cerebral, sín- drome do intestino curto, IBD, pancreatite, doença de Chron, diarreia, fístula GI, doença celíaca, síndrome de má absorção, trauma/cirurgia, particularmente trauma ou cirurgia GI, enterite por radiação, falência intestinal, quilotórax, câncer, particularmente pancreático ou câncer GI e/ou cicatrização de feridas. Embora a causa exata seja desconhecida, crianças com transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (ADHD) também têm níveis reduzidos de LC-PUFAs. Burgress et al., Am. J. Clin. Nutri. 71 (suppl) 327S-30S (2000).
[0087] Pacientes com fibrose cística (CF), por exemplo, se mostraram a ter níveis reduzidos de LC-PUFAs. Peretti et al., Nutrition &Metabolism 2:11-28 (2005). Pacientes com CF recebendo terapia de reposição de enzima pancreática frequentemente continuam a sofrer de má absorção de gordura. Kalivianakis, American Journal of Clinical Nutrition 69:127-134 (1999). Em algumas modalidades, a invenção fornece fórmulas e métodos para melhorar a absorção de gorduras, tal como, por exemplo, LC-PUFAs, em pacientes com CF. Em algumas modalidades, a invenção fornece fórmulas e métodos para induzir ganho de peso em pacientes com CF.
[0088] Enquanto caquexia e perda de peso são comuns em estágios avançados de muitos cânceres devido ao estado catabólico de tecidos, desvio de nutrientes e má absorção em estágios avançados, câncer pancreático (PC) é incomum pelo fato de que a perda de peso e a má absorção estão presentes em 80%-90% dos pacientes no momento do diagnóstico. Má absorção a partir de deficiência exócrina em grande parte é responsável por perda de peso e é devido à perda de parênquima pancreático, bloqueio do duto pancreático impedindo que enzimas alcancem o intestino e procedimentos médicos. O resultado final comum de todos estes mecanismos é esteatorreia e perda de peso. Damerla et al., J. of Support Oncology 6:393-396 (2008). Estabilização de peso em PC é associada com sobrevivência e qualidade de vida melhoradas. Davidson et al., Clinical Nutrition 23, 239-247 (2004). Em algumas modalidades, a invenção fornece fórmulas e métodos para melhorar absorção de gorduras, tal como, por exemplo, LC-PUFAs, em pacientes com PC. Em algumas modalidades, a invenção fornece fórmulas e métodos para induzir ganho de peso em pacientes com PC.
[0089] Algumas modalidades da invenção melhoram à medida que as opções de tratamento atuais para insuficiência pancreática e outras condições que reduzem a capacidade para hidrolisar TG-LCPUFAs, LC-PUFAs esterificados e/ou triglicerídeos de cadeia longa e ésteres de ácido graxo. Em um paciente com capacidade reduzida para hidro- lisar TG-LCPUFAs, LC-PUFAs esterificados e/ou outros triglicerídeos de cadeia longa e ésteres de ácido graxo. Em um paciente com capacidade reduzida para hidrolisar TG-LCPUFAs, LC-PUFAs esterificados e/ou triglicerídeos de cadeia longa e ésteres de ácido graxo, meramente aumentando o consumo destes nutrientes sem melhorar a hidrólise pode causar esteatorreia, dor abdominal, cãibra, diarreia e outras complicações gastrointestinais. Terapia de reposição de enzima pan- creática também pode levar a complicações. Observou-se que grandes quantias de enzimas pancreáticas digestivas podem prejudicar o intestino grosso resultando em colonopatia fibrosante. D. Bansi et al., Gut 46:283-285 (2000); D. Borowitz et al., J. Pediatr. 127:681-684 (1995). Outro perigo significante representado por suplementos de lipase é reação alérgica, como muitos suplementos de lipase comercias são derivados a partir de fontes animais. Deste modo, modalidades da invenção que fornecem triglicerídeos de cadeia longa pré-hidrolisados ou ésteres de cadeia longa de PUFA, com ou sem lipase adicional, fornecerão métodos melhores e mais seguros para tratamento de insuficiência pancreática ou outras capacidades reduzidas para digerir tri- glicerídeos de cadeia longa ou PUFAs de cadeia longa esterificados.
[0090] Enquanto tanto ácidos graxos n-3 quanto n-6 são importantes durante o desenvolvimento, acredita-se que ácidos graxos n-3 são mais crucias do que ácidos graxos n-6 mais tarde na vida. Em alguns sujeitos, particularmente alguns adultos, pode ser desejável aumentar a razão de (DHA e EPA):ARA. Em particular, pacientes com fibrose cística podem se beneficiar do aumento da razão de (DHA e EPA): ARA no seu plasma. Infelizmente, fórmulas adultas atualmente disponíveis geralmente têm uma razão baixa de ácidos graxos n-3:n-6. Além do mais, em sujeitos com hidrólise de TG-LCPUFAs prejudicada, simplesmente aumentando o consumo de TG-LCPUFAs n-3 é improvável que melhorem significantemente a razão de (DHA e EPA):ARA no sujeito e o aumento resultante em TG-LCPUFAs não digeridos poderia causar problemas gastrointestinais.
[0091] Por conseguinte, algumas modalidades da invenção fornecemfórmulas e métodos para aumentar a razão de (DHA e EPA):ARA em um sujeito, particularmente em um sujeito adulto. Por exemplo, algumas modalidades fornecem métodos de preparação de uma fórmula adulta em que a fórmula compreendendo triglicerídeos n-3 e/ou ésteresé exposta a uma lipase que hidrolisa triglicerídeos n-3 e/ou ésteres. Em algumas modalidades, a fórmula preparada compreende uma razão maior de monoglicerídeos n-3:n-6 e/ou ácidos graxos livres, por exemplo, uma razão maior de DHA e EPA livre do que ARA, do que na fórmula correspondente sem tratamento de lipase. Em algumas modalidades, a fórmula compreende mais monoglicerídeos n-3 e/ou ácidos graxos livres do que monoglicerídeos n-6 e/ou ácidos graxos livres, por exemplo, mais DHA e EPA livres do que ARA livre. Em algumas modalidades, a fórmula é preparada expondo-a a uma lipase que tem uma atividade maior em relação a triglicerídeos n-3 e/ou ésteres do que tri- glicerídeos n-6 e/ou ésteres. Em algumas modalidades, a enzima é enzima RO. A invenção também fornece uma fórmula em que a razão de ácidos graxos livres n-3:n-6 e/ou monoglicerídeos é maior do que a razão de ácidos graxos n-3:n-6 encontrados no plasma do sujeito, por exemplo, uma fórmula em que a razão de DHA e EPA livres em relação a ARA livre é maior do que no plasma do sujeito. A invenção também fornece métodos em que tal fórmula é administrada a um sujeito adulto. Em algumas modalidades, o sujeito tem fibrose cística.
Capacidade reduzida para hidrolisar ácidos graxos de cadeia longa em crianças prematuras
[0092] PUFAs de cadeia longa são cruciais em crianças para o desenvolvimento normal do sistema nervoso e de retina e são altamente acumulados nas membranas celulares do cérebro e da retina começado em 30 semanas de gestação. C. Martin et al., J. Pediatr. 159(5):743-749 (2011); A. Lapillone et al., Leukotrines Ess. Fatty Acids 81:143-150 (2009); J. McCann et al., Am. J. Clin. Nutr. 82:281-295 (2005); M.Martinez et al., J. Pediatr. 120:S129-S138 (1992). Normalmenteácidos graxos, incluindo DHA, EPA e ARA, assim como as lipases necessárias para quebrar estes ácidos graxos para monoglicerí- deos e ácidos graxos livres são fornecidos ao feto através da placenta e então as crianças através do leite materno. Crianças prematuras estão em um risco significantemente maior por um suprimento inadequado de ácidos graxos devido ao tempo de gestação mais curto seguido por sua dependência de fontes externas de ácidos graxos após o nascimento. C.Martin et al., J. Pediatr. 159(5):743-749 (2011). Adicionalmente, em função de crianças prematuras não produzirem níveis suficientes de lipase pancreática, eles consequentemente têm dificuldade hidrolisando quaisquer ácidos graxos de cadeia longa que são fornecidos em sua fórmula.
[0093] Foi demonstrado que crianças prematuras têm menos DHA e maiores razões de DHA/ARA tanto no cérebro quanto na retina comparados a uma criança que completou o período de gestação. M. Martinez et al., J. Pediatr. 120:S129-S138 (1992). Adicionalmente, em um estudo retrospectivo do perfil de ácido graxo de crianças prematuras, níveis inadequados de PUFAs de cadeia longa foram associados a uma doença pulmonar crônica e sepse, possivelmente devido à resposta imune desregulada. C. Martin et al., J. Pediatr. 159(5):743-749 (2011). Estes estudos e outros sugerem que mesmo com fórmulas suplementadas com DHA e outros triglicerídeos de cadeia longa ou ésteres de ácido graxo de cadeia longa, garantindo níveis adequados de PUFAs de cadeia longa em crianças prematuras é uma necessidade significante e potencialmente não atendida. As fórmulas, métodos e dispositivos da invenção permitirão que crianças prematuras recebam quantias suficientes de ácidos graxos de cadeia longa para reconhecer os benefícios medicinais associados.
Capacidade reduzida para hidrolisar ácidos graxos de cadeia longa em crianças alimentadas com fórmula
[0094] Crianças alimentadas com fórmula que não foram suplementadas com ácidos graxos também podem experimentar déficits em PUFAs de cadeia longa. Descobriu-se que os níveis de PUFAs de cadeia longa declinam em crianças alimentadas com fórmula não suplementada comparadas a crianças alimentadas com leite materno. B. Koletzo et al., J. Perinat. Med. 36(1):5-14 (2008). Mesmo crianças alimentadas com leite materno podem experimentar déficits em ácidos graxos n-3 como a quantia de DHA no leito materno varia e é correlacionado com ingestão alimentar maternal. Uma correlação positiva entre a quantia de DHA no leite materno e o desenvolvimento visual e de linguagem em crianças alimentadas com leite materno foi descrito. S. Innis, J. Pediatr. 143:S1-S8 (2003). Deste modo, uma dieta contendo DHA é recomendada para mulheres que estão amamentando. Para crianças alimentadas com fórmula, todos os grandes fabricantes de fórmula introduziram fórmulas infantis de alta qualidade com gorduras contendo DHA e ARA. Entretanto, relatórios sobre os benefícios dessas fórmulas enriquecidas com DHA e ARA foram mistos. Alguns estudos mostraram vantagens significantes no desenvolvimento cognitivo quando crianças receberam fórmula contendo PUFA de cadeia longa, enquanto outros não receberam. B. Koletzo et al., J. Perinat. Med. 36(1):5-14 (2008); E. Sarkadi-Nagy et al., J. Lipid Res. 45:71-80 (2004). Recentemente, crianças alimentadas com Enfamil LIPIL® contendo DHA e ARA durante o primeiro ano de vida experimentaram resultadosimunológicos melhorados, incluindo saúde respiratória melhorada, comparados a crianças alimentadas com a mesma fórmula sem lipídeos. E. Birch et al., J. Pediatr. 156(6):902-906 (2010). Além de tudo, entretanto, os dados pré-clínicos para datar não mostraram benefícios consistentes de fórmulas suplementadas com PUFAs de cadeia longa atuais para desenvolvimento infantil.
[0095] Uma explicação para os resultados inconsistentes nestes estudos é que algumas crianças não são capazes de absorver a quantianecessária de ácidos graxos cruciais através do intestino, mesmo quando ingerindo fórmula suplementada com triglicerídeos de cadeia longa ou ésteres de ácido graxo de cadeia longa. Esta incapacidade para absorver ácidos graxos pode ser devido aos baixos níveis de lipase pancreática endógena da criança. Em função das lipases serem normalmente transferidas a uma criança através do leite materno, crianças alimentadas com fórmula podem não ter níveis suficientes de lipase para quebrar os PUFAs de cadeia longa ou ésteres de PUFA para monoglicerídeos e/ou ácidos graxos livres, para absorção pelo intestino. Como resultado, crianças alimentadas com fórmula suplementada com LC-PUFA ainda têm menos absorção de LC-PUFAs comparados a crianças alimentadas com leite materno. Mais uma vez, há uma clara necessidade para não fornecer simplesmente suplementos de ácido graxo, mas possibilitar hidrólise e absorção destes ácidos graxos.
[0096] Adicionando lipase a fórmulas infantis reguladas pelo governo (ou, por exemplo, fórmulas nutricionais médicas) poderia requerer desenvolvimento significante funciona para abrigar, estabilizar e formular um suplemento de lipase adequado. Em fórmulas não reguladas, sem teste suficiente, questões envolvendo estabilidade de lipase, carência de especificidade, pureza e/ou interferência com outros materiais podem resultar no uso de excesso ou níveis potencialmente prejudiciais de enzima. Adicionando quantias copiosas de uma substância nova, além de obstáculos reguladores, também introduz outra variável que poderia afetar quão bem uma pessoa com capacidade reduzida para hidrolisar triglicerídeos de cadeia longa, particularmente uma criança, irá tolerar a fórmula. Este problema persiste em fórmulas descritas, por exemplo, na Patente U.S. 5.902.617 (Pabst) e Patente U.S. 4.944.944 (Tang).
[0097] Modalidades da invenção resolvem estes vários problemas fornecendo uma fórmula nutricional que, como alimentada, fornece quantias aumentadas de monoglicerídeos essenciais e ácidos graxos livres que podem ser prontamente absorvidos através do intestino de uma criança. Como resultado, sujeitos alimentados com fórmula podem ser fornecidos com os benefícios de DHA, EPA e ARA. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional não introduz nenhum ingrediente novo exceto gorduras pré-hidrolisadas que estão presentes em fórmulas existentes. Em certas modalidades, bebês alimentados com fórmula são fornecidos os benefícios de ácido graxo obtido por crian- ças amamentadas, sem exposição a suplementos de lipase. Em outras modalidades, fórmula nutricional da invenção contém uma lipase alta-menteespecífica que permite o uso de uma quantia mínima de lipase adicional à fórmula infantil para fornecer quantias aumentadas de mo- noglicerídeos de cadeia longa e ácidos graxos livres, particularmente DHA, EPA e ARA.
[0098] Em algumas modalidades, a fórmula nutricional leva a absorção melhorada de ácidos graxos. Em algumas modalidades, um sujeito ingere a fórmula nutricional por 3 dias, 5 dias, 7 dias, 10 dias, 14 dias, 30 dias, 60 dias ou mais. Em algumas modalidades, tal ingestão de uma fórmula nutricional da invenção reduz a gordura total nas fezes, e especificamente pode reduzir os níveis de DHA, ARA e/ou EPA nas fezes. Em algumas modalidades, esta redução é medida com relação a composição das fezes do sujeito antes do iniciar a ingerir a fórmula nutricional. Em algumas modalidades, esta redução é medida com relação a composição das fezes de um sujeito alimentado com uma fórmula nutricional que não foi exposta a lipase antes da ingestão, tal como, uma fórmula nutricional disponível atualmente. Os níveis de gordura total, DHA, ARA e/ou EPA nas fezes podem ser reduzidos por pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou mais. Em certas modalidades, os níveis de gordura total, DHA, ARA e/ou EPA nas fezes são reduzidos entre 50% e 80%. Em algumas modalidades, o nível de pelo menos um LC- PUFA (tais como, DHA, ARA ou EPA) nas fezes é reduzido por pelo menos 50%. Em algumas modalidades, o nível de pelo menos um LC- PUFA (tais como, DHA, ARA ou EPA) nas fezes é reduzido por pelo menos 60%. Em algumas modalidades, os níveis de DHA, ARA ou EPA nas fezes são, cada um, reduzidos por pelo menos 50%. Em algumas modalidades, os níveis de DHA, ARA e EPA nas fezes são re- duzidos, cada um, por pelo menos 60%. Em algumas modalidades, ingestão da fórmula nutricional melhora os níveis de plasma, eritrócitos e deposição de tecido, incluindo níveis de DHA e ARA. Tecidos podem incluir tecido de retina, do coração, adiposo e do rim. Em algumas modalidades, a ingestão da fórmula nutricional aumenta o nível de DHA, ARA ou ambos no plasma, eritrócitos ou ambos. Em algumas modalidades, a ingestão da fórmula nutricional aumenta o nível de DHA, ARA ou ambos na retina. Em algumas modalidades, ingestão da fórmula nutricional aumenta o nível de DHA, ARA, ou ambos no coração. Em algumas modalidades, ingestão da fórmula nutricional aumenta o nível de plasma de triglicerídeos, colesterol, HDL e/ou LDL. Em algumas modalidades, ingestão da fórmula nutricional aumenta a razão de HDL para LDL no plasma do sujeito.
[0099] Em algumas modalidades, a ingestão da fórmula nutricional aumenta o nível de plasma de vitamina A e/ou vitamina E. Sem a intenção de estar ligado a teoria, acredita-se que este aumento é devido ao fato de as vitaminas A e E serem normalmente fornecidas como ésteres que devem ser hidrolisados. Acredita-se que a exposição a lipase em vários métodos e composições da invenção melhore a hidrólise destes ésteres de vitamina, levando a maior acumulação de vitaminas A e E no plasma.
[00100] Em algumas modalidades, ingestão da fórmula nutricional tem efeitos benéficos sem acumulação significantemente aumentada de gordura no fígado. Doença do fígado gorduroso (FLD) é caracterizada por acúmulo aumentado de gordura, especialmente triglicerídeos, nas células do fígado. A condição também é associada com outras doenças que influenciam o metabolismo de gordura. É normal para o fígado conter alguma gordura, e por si só, isto não causa nenhum sintoma. Em alguns pacientes, fígado gorduroso pode ser acompanhado por inflamação hepática e morte celular do fígado (esteatohepatite). Há também uma associação com câncer de fígado (carcinoma hepatoce- lular). Resistência à insulina, assim como consumo aumentado de carboidratos e ácidos graxos saturados e uma baixa ingestão de fibra e ácidos graxos ômega-3, são todas positivamente associadas com pa- togênese de FLD.
[00101] Causas de FLD incluem dieta, medicações, doenças e condições médicas. Consumo de calorias excessivas pode causar FLD; a ingestão excessiva de calorias subjuga a capacidade do fígado para metabolizar gordura de maneira natural, que resulta em acúmulo de gordura no fígado. Um número de medicações, incluindo tamoxifeno, injeção de amiodarona, amiodarona via oral e metrotexato são associadosà FLD. Fígado gorduroso também é associado à diabetes tipo II, obesidade e altos níveis de triglicerídeos no sangue, doença celíaca e doença de Wilson (anormalidade de metabolismo de cobre), rápida perda de peso e má nutrição.
Lipase
[00102] Insuficiência pancreática e outras condições associadas com capacidade reduzida para hidrolisar triglicerídeos de cadeia longa ou ésteres de ácido graxo de cadeia longa são tratadas atualmente com enzimas digestivas suplementares, incluindo lipase pancreática. Entretanto, enzimas pancreáticas, e particularmente lipase pancreática presente nestes suplementos são frequentemente sensíveis a degradação por ácido gástrico e pepsina, de modo que apenas uma pequenafração das enzimas ingeridas atinjam o duodeno em forma ativa. E. Ville et al., Digestion 65:73-81 (2001). Infelizmente, muitos dos revestimentos protetores de ácido têm segurança potencial no que diz respeito a populações infantis ou pacientes imunocomprometidos, uma vez que uma parte significante do peso entregue é o revestimento plástico. Além do mais, embora revestimentos protetores de ácido tenham ajudado, algum grau de má absorção persiste, fazendo que pa- cientes com insuficiência pancreática requeiram aumento de doses de suplementos de enzimas. Esta persistência da má absorção de ácido graxo de enzimas inteiramente revestidas pode ser devido ao fato de que o duodeno e jejuno superior em pacientes com insuficiência pan- creática são frequentemente ambientes ácidos, de modo que o aumento esperado em pH não é alcançado e o revestimento protetor não é propriamente dissolvido para liberar a enzima. D. Graham, New England J. Med. 296(23):1314-1317 (1977). Estes dois problemas foram tratados aumentando a dose de lipase administrada. Infelizmente, como anteriormente mencionado, descobriu-se que altas doses de suplemento de enzima pancreática estão associadas à colonopatia fibro- sante. Deste modo, algumas modalidades da invenção fornecem fórmulas nutricionais que compreendem maiores porcentagens de mono- glicerídeos de cadeia longa e/ou ácidos graxos livres sem conterem lipase adicional. Algumas modalidades fornecem fórmulas nutricionais que compreendem uma dose otimizada de lipase, como descrito neste documento.
[00103] Lipases podem ser obtidas a partir de animal, vegetal e muitos micro-organismos naturais ou modificados geneticamente. Muitos, se não a maioria, suplementos de lipase alimentar disponíveis comercialmente são derivados a partir de animais e são particularmentesuscetíveis a degradação por enzimas digestivas. Uma alternativa frequentemente menos usada é lipase microbiana, por exemplo, lipase produzida em bactérias ou fungos, tal como, por exemplo, levedura. Lipases microbianas retêm atividade ao longo de uma gama de pH mais ampla do que lipases animal ou vegetal, deste modo, eliminando a necessidade de comprimidos revestidos entericamente. Entretanto, enzimas microbianas tendem a ser degradadas por tripsina no intestino delgado reduzindo, desse modo, sua disponibilidade para quebrar triglicerídeos e ésteres no intestino. Em certas modalidades, a lipase usada nas fórmulas, métodos ou dispositivos da invenção são lipases bacterianas, lipases fúngicas ou ambas.
[00104] A especificidade e cinética de lipases individuais podem variar significantemente. Especificidade de lipases é controlada pelas propriedades moleculares da enzima, estrutura do substrato e fatores afetando a ligação da enzima do substrato. Tipos de especificidade incluem especificidade de substrato, por exemplo, uma dada lipase pode ser mais ativa em quebrar um tipo de ácido graxo do que outra lipase, e especificidade posicional, que envolve hidrólise preferencial de ligações de éster em posições 1 e/ou 3 da espinha dorsal de glice- rol de um triglicerídeo.
[00105] Foi determinado agora que lipase produzida por de Chromobacterium viscosum, Pseudomonas fluorescens, Burcholderia cepacia e Rhizopus oryzaetêm maior especificidade para DHA, EPA e ARA do que outras lipases, tal como, lipase produzida por Candida rugosa, Rhizomucor miehei, Penicilium camemberti, Aspergillus niger e Aspergilis oryzae. Como resultado, suplementos de lipase ou produtos nutricionais suplementados com lipase compreendendo de Chromobacterium viscosum, Pseudomonas fluorescens, Burcholderia cepacia e Rhizopus oryzaefornecerão hidrólise de TG-DHA, TG-EPA e /ou TG-ARA aumentada. Por conseguinte, um aspecto da invenção fornece suplementos de lipase ou produtos nutricionais suplementados com lipase compreendendo lipase de Chromobacterium viscosum, lipase de Pseudomonas fluorescens, lipase de Burcholderia cepacia e/ou lipase de Rhizopus oryzae. Em algumas modalidades, a lipase é lipase de Chromobacterium viscosum, lipase de Pseudomonas fluorescens e lipase de Rhizopus oryzae. E certas modalidades, a lipase é lipase de Rhizopus oryzae.
[00106] Referência à lipase de certas espécies, tal como, lipase de Chromobacterium viscosum, lipase de Pseudomonas fluorescens, li pase de Burcholderia cepacia e/ou lipase de Rhizopus oryzaenão significa necessariamente que a lipase foi preparada diretamente a partir da espécie hospedeira nativa. Por exemplo, a mesma lipase poderia ser produzida de forma recombinante em outra célula hospedeira.
[00107] Outro aspecto da invenção é um método para aumentar a absorção de DHA, EPA e/ou ARA administrando um ou mais dentre lipases de Chromobacterium viscosum, Pseudomonas fluorescens, Burcholderia cepacia e Rhizopus oryzae, como um suplemento alimentar ou por pré-hidrolisar uma fórmula contendo DHA, EPA e/ou ARA com uma ou mais destas enzimas. Em algumas modalidades, a lipase é lipase de Chromobacterium viscosum, lipase de Pseudomonas fluo- rescens ou lipase de Rhizopus oryzae. Um aspecto adicional da invenção fornece lipases com atividades específicas para DHA, EPA e/ou ARA que são comparáveis às atividades específicas de um ou mais dentre Chromobacterium viscosum, Pseudomonas fluorescens, Bur- cholderia cepacia e Rhizopus oryzae. Um aspecto adicional da invenção fornece lipases com atividades específicas para DHA, EPA e/ou ARA que são comparáveis às atividades específicas de um ou mais dentre Chromobacterium viscosum, Pseudomonas fluorescens, Bur- cholderia cepacia e Rhizopus oryzae, como determinado por cromato- grafia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC) e descrito no Exemplo 1. Em algumas modalidades, a lipase tem atividades específicas para DHA, EPA e/ou ARA que são comparáveis as atividadesespecíficas de uma ou mais lipase de Chromobacterium viscosum, lipase de Pseudomonas fluorescens ou lipase de Rhizopus oryzae. Uma modalidade da invenção é uma fórmula nutricional que contém menos do que 5.000 unidades de lipase (com unidades estimadas em uma análise de azeite de oliva padrão, tal como, descrito em Pharmaceutical Enzymes: Properties and Assay Methods, R. Ruyssen e A. Lauwers (Eds) Scientific Publising Company, Ghent, Bélgica (1978)). Em outras modalidades, a fórmula nutricional contém menos do que 3.000 unidades de lipase. Em algumas modalidades, a fórmula nutricionalcontém menos do que 1.000 unidades de lipase. Em certas modalidades, a fórmula contendo menos do que 5.000, menos do que 3.000 ou menos do que 1.000 unidades de lipase está em uma fórmula infantil ou uma fórmula nutricional médica.
Lipase Imobilizada
[00108] Processos para imobilizar enzimas e outras proteínas para transportes insolúveis são bem conhecidos e descritos na literatura. Imobilização de lipase pode melhorar a estabilidade da enzima, torná- la reutilizável e permitir que os produtos sejam prontamente separados da enzima sem contaminação por lipase. Em algumas modalidades, a lipase é covalentemente ligada a um suporte sólido, entretanto, ligação não covalente também pode ser usada. Métodos adequados para imobilização de lipase incluem, por exemplo, adsorção, ligação iônica, ligação covalente, reticulação, encapsulação e aprisionamento sobre matrizes poliméricas hidrofóbicas ou hidrofílicas e inorgânicas. Vide Y. Ren et al., BMC Biotechnol. 11:63 (2011); V.R. Murty et al., Biotechnol. Bioprocess Eng. 7:57-66 (2002). Lipase pode ser imobilizada por ligação diretamente a um material de suporte através de um ligante. Vide, por exemplo, Stark e Holmberg, Biotechnol. and Bioeng. 34(7):942-950 (1989).
[00109] Imobilização por adsorção é reversível e normalmente envolve forças hidrofóbicas. É simples e barato, mas tem a desvantagem de imobilização incompleta ou vazamento de enzima do suporte insolúvel. Exemplos de lipase imobilizada usando este método podem ser encontrados em E. Lie et al., Chem. Technol. and Biotechnol.50:549553 (1991) (lipase de Candida cylindracea, suporte de zeólita); M. Bas- ri et al., J. Chem. Technol. and Biotechnol. 59:37-44 (1994) (lípase de Candida rugosa; suporte de polímero); H. Gunnlaughsdottir et al., Enzyme and Microbiol. Tech. 22:360-367 (1998) (lípase de Humicola lanuginose; suporte de grânulos de vidro). Suportes adequados para imobilização por adsorção incluem, por exemplo, grânulos de cerâmica, tal como, Toyonite (Toyo Dekna Kogyo Co., Ltd.).
[00110] Ligação iônica é baseada em interações eletrostáticas entre a lipase e grupos iônicos carregados diferentemente sobre matrizes, tais como, por exemplo, celulose-DEAE ou Sephadex-DEAE sobre um suporte sólido. Ligação iônica causa mudança mínima para a conformação da lipase e rende lipase imobilizada com alta atividade na maioria dos casos. Deveria ser mantido em mente, entretanto, que embora a força de ligação entre a enzima e o suporte é mais forte do que quando usando adsorção, não é tão forte quanto a ligação covalente, e deste modo, vazamento de lipase do suporte pode ocorrer.
[00111] Ligação covalente é baseada em ligações covalentes entre um material de suporte e um grupo funcional sobre um aminoácido sobre uma superfície da lipase. Os grupos funcionais que podem ter lugar nesta ligação de enzima para suportar podem ser amino, carboxila, sulfídrico, hidroxila, imidazole ou grupos fenólicos que não são essenciais para a atividade catalítica da lipase. A fim de proteger o local ativo,imobilização pode ser realizada na presença de substrato ou um inibidor competitivo. Uma vantagem significante para o uso de ligação covalente de lipase para um material de suporte é a força da ligação, por exemplo, a estabilidade da imobilização. Para um exemplo de lipase imobilizada por ligação covalente, vide S. Emi et al., European Polymer Journal 30(5):589-595 (1994). Suportes adequados para ligação covalente incluem, por exemplo, Immobead™ (ChiralVision).
[00112] Reticulação envolve juntar a lipase a ela mesma para formar uma estrutura tridimensional ou juntar a lipase a uma estrutura sólida usando um agente de reticulação. Por exemplo, lipase pode ser reticulada para grânulos de quitosana. Vide S.H. Chiou et al., Prep. Biochem. Biotechnol. 37(3):265-275 (2007). Imobilização de lipase por encapsulação geralmente envolve a formação de um revestimento poroso ou membrana semipermeável em torno da lipase de modo que a lipase é contida dentro de um material poroso, mas triglicerídeos e ésteres podem atravessar livremente. Imobilização de lipase por aprisionamento envolve restringir o movimento da enzima aprisionando-a em uma estrutura de treliça. Grânulos de alginato podem ser usados para este tipo de imobilização. I. Bushan et al., J. Bioactive and Compatible Polymers 23(6):552-562 (2008). Polímeros sintéticos e naturais também podem ser usados. Vide também, G. Fernandez-Lorente et al., J. Am. Oil Chem. Soc. (publicado online em 14 de dezembro de 2010) e G. Fernandez-Lorente et al., J. Am. Oil Chem. Soc. 88:1173-1178 (2011).
[00113] Em certas modalidades, as fórmulas, métodos e dispositivos da invenção utilizarão lipase que foi cristalizada e reticulada para estabilidade aumentada, como descrito na Patente U.S. 6.541.606 (Margolin), com ou sem outra forma de imobilização, tal como, encap- sulação.
[00114] Em algumas modalidades, lipase é imobilizada a nano partículas magnéticas (MNPs). Estas MNPs podem ser revestidas por vinculadores ou polímeros contendo grupos amino ou epóxi funcionais aos quais as lipases são reagidas. Um revestimento adequado para MNPs é, por exemplo, polidopamina. Vide, por exemplo, Y. Ren et al., BMC Biotechnology 11:63 (2011). O uso de MNPs para imobilização de lipase tem vantagens, tais como biocompatibilidade, super magnetismo, tamanho pequeno e baixa toxidade. As propriedades magnéticas das nano partículas facilitam a remoção da lipase a partir da solução e também fornecem outro meio para anexar a lípase-MNP a um suporte sólido.
[00115] Em algumas modalidades, a lipase imobilizada é uma li pase microbiana. Em algumas modalidades, a lipase imobilizada é selecionada a partir de lipases bacterianas. Em algumas modalidades, a lipase imobilizada é uma ou mais lipases selecionadas a partir de Chromobacterium viscosum, Pseudomonas fluorescens, Burcholderia cepacia e Rhizopus oryzae.
[00116] Em certas modalidades, a lipase (se imobilizada ou não) é adicionada a fórmula por 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30 minutos ou mais. A hidrólise de triglicerídeos e ésteres de LC-PUFA é medida por RH- HPLC. Em certas modalidades, o percentual de hidrólise de triglicerí- deos ou ésteres de LC-PUFA é 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% por 30 minutos. Em modalidades, o percentual de hidrólise de triglicerídeos e ésteres de LC-PUFA é 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% por 20 minutos. Em modalidades, o percentual de hidrólise de triglicerídeos e ésteres de LC-PUFA é 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% por 10 minutos. Em certas modalidades, a lipase é lipase de Rhyzopus oryzae.
Dispositivo Compreendendo lipase Imobilizada
[00117] De acordo com várias modalidades, a presente divulgação fornece dispositivos e métodos para preparação de produtos nutricionais. Os dispositivos e métodos podem ser usados para expor fórmula infantil ou outros produtos nutricionais a lipase antes do consumo. As lipases quebrarão, por conseguinte, gorduras e óleos com liberação subsequente de ácidos graxos livres e monoglicerídeos. Os dispositivos e métodos permitirão meios convenientes para preparação de fórmula ou outros produtos nutricionais. Em algumas modalidades, os dispositivos e métodos permitem que crianças ou outros que consumam os produtos evitem consumir lipase exógena. Em algumas modalidades, os dispositivos e métodos permitem a produção de fórmulas que contenham monoglicerídeos e/ou ácidos graxos livres, mas não contenham qualquer quantia significante de lipase (como determinado por ELISA).
[00118] As Figuras 1, 2A a 2C, 3A a 3C, 4A e 4B, 5A e 5B, 9A a 9C, 10A a 10C, 11A a 11C, 12, 13A e 13B, 14, 15, 16, 17A e 17B, 18, 19, 20 e 21 ilustram dispositivos de acordo com várias modalidades da presente divulgação. Como mostrado na Figura 1, dispositivos 100 da presente divulgação podem incluir um recipiente 110 configurado para reter uma fórmula infantil 120 ou outros produtos nutricionais líquidos. Como descrito em detalhes abaixo, o recipiente 110 pode incluir lipases que são imobilizadas, de tal modo que a fórmula 120 é alimentada a criança através de um tubo nasogástrico 114 ou outro mecanismo de alimentação (por exemplo, uma mamadeira) que não contém lipases em qualquer quantia apreciável. Por exemplo, as lipases podem ser imobilizadas sobre ou em estruturas 150 encontradas ao longo da parede ou, de outro modo, dentro do recipiente, de tal modo que as lipases estão em contato fluído com a fórmula 120 dentro do recipiente. Ainda, como é discutido com referência a várias modalidades abaixo, a fórmula pode ser adicionada ao recipiente 110 de várias maneiras para permitir tratamento enzimático de lipases dentro do recipiente 110. Por exemplo, fluído pode ser alimentado através de um tubo 112 ou despejado no recipiente e pode ser subsequentemente passado através de um tubo nasogástrico ou outro dispositivo para alimentação.
[00119] Por toda esta divulgação, os dispositivos e métodos serão referidos ao uso em tratamento ou preparação de fórmula nutricional, tais como, por exemplo, fórmula infantil e fórmula nutricional médica. Será apreciado que os dispositivos e métodos podem ser usados para tratar ou preparar qualquer tipo de fórmula nutricional para que possa ser benéfica para fornecer tratamento de lipase antes do consumo. Tais produtos podem incluir qualquer fórmula nutricional para ser consumida por alguém com insuficiência pancreática ou outra capacidade reduzida para hidrolisar triglicerídeos de cadeia longa ou PUFAs de cadeia longa esterificados.
[00120] As Figuras 2A a 2C e 3A e 3C ilustram mais dispositivos detalhados, de acordo com várias modalidades. Como mostrado, os dispositivos 200 a 202, 300 a 302 podem incluir um recipiente 210 e 310 para reter fórmula líquida. O recipiente 210 e 310 podem incluir um pote ou ampola de vidro ou plástica, uma bolsa (por exemplo, silicone ou outro material flexível como uma bolsa salina IV), um recipientecilíndrico, tal como, um tambor de seringa ou outro recipiente que é dimensionado e formatado para reter uma quantia desejada ou outro produto.
[00121] Como mencionado, os dispositivos da presente divulgação podem permitir que a fórmula seja exposta a lipases para obter os efeitosenzimáticos desejados, enquanto permitem que a fórmula então seja convenientemente consumida sem consumir lipases. Por conseguinte, em várias modalidades, lipases são imobilizadas dentro de um recipiente 210 e 310, de tal modo que, quando a fórmula é removida (por exemplo, através de um tubo nasogástrico, bico para uma mamadeira ou transferindo a fórmula para outro recipiente), as lipases permanecem no recipiente 210 e 310 ou podem ser removidas a partir da fórmula antes do consumo. Em outras modalidades, lipases são imobi-lizadas dentro do recipiente 210 e 310, por exemplo, sobre suportes sólidos removíveis, de tal modo que as lipases podem ser facilmente removidas do recipiente enquanto deixam a fórmula no recipiente para consumo subsequente.
[00122] As Figuras 2A a 2C mostram uma configuração para o recipiente 210, juntamente com certas modalidades para imobilizar lipases dentro do recipiente 210. Como mencionado, o recipiente 210 pode incluir uma variedade de materiais, tamanhos e formatos diferentes. Além disto, o recipiente 210 pode incluir uma ou mais portas de aces- so 220 e 230 para controlar fluxo de fórmula 260 no ou fora do recipiente.
[00123] Lipases podem ser imobilizadas dentro do recipiente 210 em uma variedade de maneiras. Por exemplo, lipases podem ser imobilizadas ou contidas dentro de estruturas 250 e 252 localizadas dentro do recipiente 210 (Figuras 2A e 2C). Adicionalmente ou alternativamente, lipases 251 podem ser imobilizadas sobre ou contidas dentro da parede do recipiente 210 (Figura 2B). Por conseguinte, como a fórmula 260 é colocada dentro do recipiente, a fórmula 260 entra em contato com as lipases para produzir os efeitos enzimáticos desejados.
[00124] Como mencionado, lipases podem ser imobilizadas dentro do recipiente ligando as lipases a estruturas 250 e 252 dentro do recipiente e /ou paredes 251 do recipiente. As estruturas dentro do recipiente podem ter uma variedade de configurações. Por exemplo, em certas modalidades, as estruturas podem incluir grânulos, bolas ou qualquer outra estrutura que podem por si só serem móveis dentro do recipiente, de tal modo que as estruturas fluam dentro da fórmula. Por exemplo, como mostrado na Figura 4A, as estruturas 250 podem incluirgrânulos ou bolas tendo uma parede de superfície 256 a qual lipases 257 podem ser ligadas. Ainda, será entendido que as estruturas 250 e 252 podem ter uma variedade de formatos ou configurações diferentes (por exemplo, cuboide, ovoide e bastonete).
[00125] As estruturas 250 e 252 e/ou configuração da parede do recipiente 210 podem ser configuradas para fornecer uma área de superfície desejada, de tal modo que a fórmula é capaz de entrar em contato com uma quantia suficiente de lipase durante um período de tempo aceitável. Por exemplo, as estruturas 250 e 252 podem incluir grânulos numerosos 250 (Figura 2A) ou estruturas em forma de basto- nete 252 (Figura 2C) para fornecer uma alta área de superfície para ligar uma quantia suficiente de lipase. Alternativamente, se períodos de tempo mais longos são disponíveis para incubar a fórmula com as lipases antes do consumo e/ou lipases com alta atividade enzimática são usadas, menores quantias de lipase podem ser adequadas.
[00126] Em várias modalidades, as estruturas 250 e 252 e/ou recipientesão construídos, de tal modo que, conforme a fórmula 260 é removida do recipiente para consumo ou armazenamento, a lipase não é mantida dentro da fórmula 260. Por exemplo, os grânulos 250 ou estruturas na forma de bastonete podem ser dimensionados, de tal modo que não passarão através de uma porta de acesso relativamente pequena 230. Alternativamente ou adicionalmente, as estruturas podem ser anexadas à parede do recipiente e/ou o recipiente pode incluir uma tela ou filtro que é dimensionado para prevenir movimento das estruturas com a fórmula 260. Ainda, as estruturas 250 e 252 podem ter outras propriedades que facilitam sua separação da fórmula. Por exemplo, as estruturas 250 podem ser formadas de grânulos magnéticos que podem ser removidos por ligação a um filtro magnético.
[00127] Em algumas modalidades, ao invés de imobilizar lipases pela anexação as estruturas dentro do recipiente 210 e/ou parede de recipiente, as lipases 257'são contidas dentro das estruturas 250 e 252 e/ou parede de recipiente 251. A Figura 4B ilustra uma tal modalidade. Como mostrado, as estruturas 250' podem incluir grânulos ou outros formatos tendo uma parede 256'. A parede pode ser formada de materiais semipermeáveis que permitem ingresso e egresso de fórmula 260, mas não lipases 257'. Tal encapsulamento pode similarmente ser usado para outras estruturas (por exemplo, 252) e/ou para a parede de recipiente, de tal modo que a superfície da parede tem um material semipermeável, dentro do qual lipases podem ser contidas.
[00128] O recipiente pode similarmente ter configurações de superfície que fornecem quantias aumentadas de lipase e/ou contato aumentado de lipases com a fórmula 260. Por exemplo, a parede do re- cipiente pode ter pontes ou outras modificações de superfície para aumentar a área de superfície. Ainda, ao invés de incluir um único espaço aberto, o recipiente pode incluir variações no caminho de fluxo, por exemplo, um longo caminho sinuoso para permitir exposição prolongada ou maior a lipases e/ou coleção de canais ou tubos aos quais lipases são imobilizadas e através dos quais a fórmula possa fluir. Vide, por exemplo, Figura 1, elemento 150 e Figura 21, elemento 2101.
[00129] Em certas modalidades, o recipiente pode ser fabricado e pré-embalado com lipases em quaisquer das modalidades descritas neste documento. Durante o uso, o recipiente pode ser aberto e fórmula pode ser colocada no recipiente para tocar as lipases por tempo su-ficiente para produzir efeitos enzimáticos desejados. Em outras modalidades, estruturas, tais como, grânulos 250 ou estruturas na forma de bastonete, têm lipases imobilizadas as suas superfícies ou conti- das/encapsuladas dentro, podem ser embaladas e distribuídas, e essas estruturas podem ser colocadas em um recipiente separado contendofórmula. Em algumas modalidades, pode ser benéfico sacudir ou agitar o recipiente compreendendo lipase imobilizada e fórmula por um período de tempo.
[00130] Como mencionado, a fórmula 260 pode ser colocada no recipiente 210 por meio de várias portas de acesso. Por exemplo, o recipiente pode ser incluído em uma porta de acesso de topo 220 e/ou uma porta de acesso de fundo 230. As portas 220 e 230 podem ser usadas para ingresso e egresso de fórmula respectivamente. Além disto, uma porta única pode ser usada, ou múltiplas portas podem ser usadas. As portas podem compreender uma estrutura configurada para ativar outros dispositivos que podem ser usados para alimentação ou transferência de fluídos. Por exemplo, as portas podem incluir um conector, tais como uma conexão luer-lock, roscas e/ou um conduíte ou tubo que pode prender um tubo nasogástrico. Além disto, as portas podem ser configuradas para prender uma mamadeira, um bico de mamadeira ou qualquer outra estrutura para facilitar transferência de fluído para outro recipiente ou auxiliar na alimentação. Ainda, uma ou ambas as portas 220 e 230 podem incluir uma válvula 140 (Figura 1), 240 (Figura 2A) ou outro mecanismo de controle de fluxo de fluído.
[00131] As Figuras 3A a 3C ilustram dispositivos da presente divulgação, de acordo com certas modalidades. Como mostrado, os dispositivos 300 e 302 incluem um recipiente 310 para receber fórmula 260. Além disto, o recipiente 310 pode incluir uma tampa 322 ou outro dispositivo de fechamento, tal como um topo roscado para uma jarra ou garrafa. Similar às modalidades mostradas nas Figuras 2A a 2C, os dispositivos podem incluir estruturas 350, 351, 351' e 353 que incluem lipases imobilizadas as suas superfícies e/ou encapsuladas as mesmas.
[00132] As modalidades das Figuras 3A a 3C podem fornecer separação mais rápida de fórmula das estruturas contendo lipases. Por exemplo, como mostrado na Figura 3A, as estruturas em forma de bastonete 350 podem conter lipases, e após tratamento enzimático de fórmula, a tampa 322 pode ser removida para remover simultaneamente as estruturas 350 e lipases. Ainda, a tampa 322 pode ser substituída por outra tampa, bico de mamadeira ou outro fluído de conexão. Similarmente, estruturas tendo outras configurações, como as bolas ou grânulos 351 e 351' (Figura 3B), podem ser dimensionados para fácil remoção da fórmula 260. Por exemplo, como mostrado, os grânulos 351 e 351'são dimensionados, de tal modo que podem ser facilmente removidos manualmente ou por filtração. Ainda, o recipiente 310 pode fornecer lipases que são imobilizadas a ou contidas dentro de sua superfície interna 353, e após tratamento enzimático, a fórmula 260 pode ser transferida a outro recipiente ou consumida substituindo a tampa 322 por um bico de mamadeira ou outra conexão a um sistema de ali- mentação.
[00133] Alternativamente ou adicionalmente, as estruturas 350, 351 e 351' podem ter uma parede externa permeável com componentes adicionais fornecendo lipases imobilizadas contidas nas mesmas. Por exemplo, estruturas 351' (Figura 3B) ilustram uma modalidade em que as estruturas 351'têm uma parede externa permeável cercando grânulos numerosos 250. A parede externa pode incluir uma malha ou outra configuração que permita fácil movimento de fórmula na ou fora da estrutura 351' para fornecer contato com os grânulos 250. Ainda, os grânulos podem fornecer lipases que podem ser imobilizadas as suas superfícies ou encapsuladas as mesmas, como descrito em várias modalidades acima.
[00134] Como mencionado acima, as estruturas contendo lipases podem ser fabricadas e distribuídas como componentes pré-embala- dos juntamente com o recipiente 310. Alternativamente ou adicionalmente, as estruturas podem ser embaladas e distribuídas separadas do recipiente. Por exemplo, uma tampa 322 contendo estruturas em forma de bastonete 350 ou grânulos 351 e 351' ou, de outro modo, tendo lipase contida nas mesmas ou imobilizada a ela, podem ser fabricadas e distribuídas. A tampa pode ser configurada para conexão para conexão com mamadeiras padrão, garrafas de água ou outro recipiente ou dispositivo que pode conter fórmula.
[00135] Em outras modalidades, lipases podem ser fornecidas, de tal modo que as lipases tocam a fórmula conforme a fórmula é colocada em um recipiente e/ou durante a alimentação ou remoção de um recipiente. Por exemplo, a Figura 5A ilustra um dispositivo 500, de acordo com modalidades exemplares. O dispositivo 500 pode incluir um bico de mamadeira padrão e lipases podem ser imobilizadas a uma superfície interna 510 de um aro de bico ou o próprio bico. Como tal, a fórmula entrará em contato com as lipases durante uso normal. Similarmente, lipases podem ser contidas em ou sobre outras estruturas que podem ser usadas para alimentação, tal como, um tubo de fluído de um dispositivo de alimentação nasogástrico.
[00136] Alternativamente, as lipases podem ser fornecidas em um elemento separado configurado para permitir o contato da fórmula com as lipases durante fluxo normal de fluído. Por exemplo, em uma modalidade, as lipases podem ser contidas dentro de um alojamento 520 configurado para o prendimento com um fechamento de garrafa, tais como, um bico (Figura 5A) ou uma tampa de garrafa/topo (Figura 5B). O alojamento 520 pode incluir uma parede permeável que permite que a fórmula flua através de seu volume e toque as lipases fornecidas àquela.
[00137] As lipases contidas dentro do alojamento 520 podem ser fornecidas em várias formas. Por exemplo, em algumas modalidades, as lipases são imobilizadas sobre grânulos 550 dentro do alojamento 520 por ligação ou encapsulamento, como descrito anteriormente. Ainda, o alojamento 520 pode incluir uma malha aberta ou outra configuração que permite que a fórmula flua através dela. Por exemplo, com a configuração de garrafa mostrada na Figura 5A, uma malha aberta ou caminho de fluxo através do alojamento 520 permitirá que a fórmula toque lipases conforme a fórmula sai de uma garrafa durante a alimentação. Alternativamente, como mostrado na Figura 5B, a fórmula pode ser despejada no ou fora do topo 530 do alojamento para permitir contato de fórmula com lipases durante preenchimento ou esvaziamento do recipiente 310. O topo 530 e/ou qualquer outra parte do alojamento 520 pode ser formado de uma variedade de materiais. Por exemplo, o alojamento 520 pode ser formado de uma membrana que permite fluxo de fluído controlado. Ainda, o topo 530 pode ser formado de uma membrana semipermeável que permite fluxo de um líquido (fórmula) através da mesma, mas não permite a passagem de lipases. Por conseguinte, a membrana formando o topo 530 pode servir para imobilizar as lipases dentro do recipiente 310 sem, de outro modo, ligar ou imobilizar as lipases dentro do recipiente 310.
[00138] Em várias modalidades, os dispositivos descritos acima podem incluir modificações para melhorar ou, de outro modo, controlar atividade de lipase. Por exemplo, os recipientes 110, 210 e 310 podem incluir sistemas de agitação para permitir movimento contínuo de fórmula durante um período de incubação permitindo, desse modo, que as lipases entrem em contato com ácidos graxos encontrados por todo o volume de fluído. Ainda, os dispositivos podem incluir sistemas para controlar a temperatura e melhorar ou controlar atividade de lipase.
[00139] Certas modalidades da invenção fornecem um recipiente contendo fórmula nutricional e uma lipase. Em algumas modalidades, a lipase está em contato com a fórmula nutricional no recipiente. Em outras modalidades, a lipase e a fórmula nutricional não estão em contato com o recipiente. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional e a lipase estão contidas em compartimentos separados dentro do recipiente. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional está na forma seca. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional está na forma líquida. Em algumas modalidades, a lipase e levada ao contato com a fórmula nutricional liberando a lipase no compartimento contendo a fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a lipase é levada ao contato com a fórmula nutricional transferindo a lipase e a fórmula nutricional em outro recipiente (por exemplo, esvaziando o compartimento de lipase e o compartimento de fórmula nutricional no outro recipiente). Em algumas modalidades, líquido é adicionado ao outro recipiente antes ou após transferir a lipase e a fórmula nutricional no outro recipiente.
[00140] Os dispositivos, de acordo com a presente divulgação podem ter um número de formatos e/ou configurações diferentes. Por exemplo, as Figuras 9A a 9C, 10A a 10C, 11A a 11C, 12, 13A e 13B, 14, 15, 16, 17A e 17B, 18, 19, 20 e 21 ilustram vários formatos e configurações adicionais. Em cada uma das configurações descritas com relação a essas figuras, lipases podem ser imobilizadas usando quaisquer dos métodos descritos acima (por exemplo, imobilizando lipases sobre estruturas, tais como, grânulos dentro de um dispositivo e/ou imobilizando lipases dentro de ou sobre uma parede ou outra superfície de um dispositivo). Ainda, a configuração específica pode ser selecionada para fornecer uma variedade de características diferentes, tais como, área de superfície, volume, quantia de lipase e/ou tempo de exposição de materiais a enzimas.
[00141] Os dispositivos ilustrados nas Figuras 9A a 9C, 10A a 10C, 11A a 11C, 12, 13A e 13B, 14, 15, 16, 17A e 17B, 18, 19, 20 e 21 podem ser configurados para permitir contato de lipase em uma variedade de maneiras. Por exemplo, em várias modalidades, uma parte ou todas do dispositivo podem ser inseridas dentro de um recipiente que inclui fórmula a fim de permitir contato entre a fórmula e lipases. Em outras modalidades, o dispositivo é configurado para tratamento de fórmula em linha.
[00142] As Figuras 9A a 9C ilustram várias configurações para dispositivos que podem ser colocados dentro de um recipiente para tratar a fórmula. Como mostrado, o dispositivo 900 e 920 (Figuras 9A e 9C) pode ter uma variedade de formatos diferentes formados de uma parede externa 901 e 901'' que cerca lipases. Como indicado acima, as lipases 902 podem ser imobilizadas em uma variedade de maneiras diferentes, incluindo por anexação aos grânulos. Além do mais, os dispositivos 910 (Figura 9B) podem incluir mais do que um bolso ou abertura 903 formados em uma ou mais paredes 901'. A configuração es-pecífica, número de bolsos ou aberturas, assim como quantia de lipase e/ou volume do dispositivo pode ser variado dependendo do uso inten- cionado e/ou para controlar a taxa de atividade de lipase.
[00143] Em certas modalidades, o dispositivo pode ser configurado para permitir uma mudança em seu tamanho e ou formato. Por exemplo, as Figuras 10A a 10C ilustram um dispositivo 1000, que pode ser comprimido, por exemplo, para armazenamento em um recipiente 1001 antes do uso. Quando desejado, o recipiente 1001 pode ser aberto e a parede 1003 do dispositivo pode ser expandida para produzir uma razão de volume de lipase desejada 1002 para volume de recipiente. Em algumas modalidades, o dispositivo 1000 inclui uma bobina ou mola 1004 para fornecer suporte estrutural e/ou ajudar o dispositivo a manter um formato e/ou volume desejados.
[00144] Em algumas modalidades, o dispositivo pode incluir uma extensão na forma de bastonete para facilitar a colocação e remoção de lipase dentro de um volume de fórmula. Por exemplo, as Figuras 11A a 11C, 12, 13A e 13B, 14 e 15 ilustram várias configurações exemplares para dispositivos com uma extensão em forma de basto- nete. Como mostrado, o dispositivo 1100, 1100', 1100'', 1200, 1300, 1400 e 1500 podem incluir tanto um ou múltiplos bolsos ou aberturas 1101, 1201, 1301, 1401 e 1501 posicionadas em várias configurações perto de uma região distal da extensão do bastonete 1102, 1202, 1302, 1402 e 1502. Em algumas modalidades, como mostrado, por exemplo, nas Figuras 13A e 13B, a orientação dos bolsos ou aberturas 1301 podem ser ajustáveis, por exemplo, para permitir inserção dentro de uma abertura estreita durante o uso e/ou para minimizar espaço de armazenamento.
[00145] Em várias modalidades, lipase pode ser anexada a uma parte de uma tampa ou fechamento para uma garrafa ou pote, de tal modo que quando a tampa ou fechamento é colocado sobre a garrafa ou pote, a lipase pode tocar fluído contido dentro da garrafa ou pote. Por exemplo, quaisquer dos dispositivos mostrados neste documento podem ser anexados a uma superfície de uma tampa ou fechamento para permitir contato com o recipiente de fórmula em uma garrafa ou pote. Várias configurações de dispositivos 1600, 1700, 1800, 1900 e 2000 incluindo lipase anexada a uma tampa ou fechamento 1602, 1702, 1802, 1902 e 2002 são ilustradas nas Figuras 16, 17A e 17B, 18, 19 e 20. Como mostrado, as lipases podem ser contidas dentro de bolsos ou aberturas 1601, 1705, 1805, 1901 e 2001 tendo uma variedade de formatos ou configurações. Ainda, em algumas modalidades, a tampa ou fechamento 1902 e 2002 podem ser incluir uma abertura 1910 e 2010 para inserir ou remover fluído a partir de um recipiente, e tais aberturas 1910 e 2010 podem incluir um conector para um tubo de fluído, por exemplo, um conector de tipo luer.
[00146] Em algumas modalidades, pode ser desejável tratar a fórmula conforme a fórmula flui através de um tubo (por exemplo, durante a alimentação, como mostrado na Figura 1 ou durante a transferência de um recipiente para outro). A Figura 21 ilustra outro dispositivo 2100 para tratamento de lipases em linha. O dispositivo 2100 pode incluir um bolso ou abertura 2101 contendo lipases que podem ser imobilizadas, como discutido acima. Ainda, o bolso e abertura 2101 pode ter um caminho tortuoso ou curvado para permitir tempos de contato maiores entre as lipases e a fórmula. Além disto, o dispositivo 2100 pode incluir aberturas 2110 em ambas as extremidades para permitir conexão aos tubos ou conduítes para ingresso ou egresso de fórmula.
[00147] Em várias modalidades, os dispositivos podem incluir um material que atua como uma tela ou malha para prevenir que lipases entrem na fórmula a ser ingerida por um paciente. Por exemplo, os dispositivos mostrados nas Figuras 19 e 21 podem incluir uma ou mais malhas ou telas 1906 e 2106 para prevenir que lipases imobilizadas sobre grânulos ou outras estruturas se movam na fórmula a ser ingerida.
[00148] Em algumas modalidades, lipases podem ser imobilizadas dentro de ou sobre um componente de um recipiente, de tal modo que as lipases não estão em contato com a fórmula até que etapas adicionais sejam tomadas. Por exemplo, em uma modalidade, lipases podem ser contidas dentro de ou sobre uma parte de uma tampa ou fechamento, e a tampa ou fechamento pode incluir um mecanismo para liberar lipases imobilizadas no recipiente. Por exemplo, lipases podem estar contidas sobre ou dentro de grânulos ou outras estruturas (vide, por exemplo, elemento 1805 na Figura 18), que são adicionalmente anexadas a ou estão contidas dentro da tampa; e, quando desejado, as lipases podem ser pingadas no recipiente (por exemplo, torcendo a tampa ou removendo uma barreira/mecanismo anexo). Similarmente, lipases podem ser anexadas a ou contidas em uma parede do recipiente ou outra estrutura e imobilizadas sobre grânulos ou outros materiais e pode-se permitir que as lipases toquem a fórmula apenas quando desejado (por exemplo, liberando lipases no recipiente ou removendo uma barreia acima das lipases).
[00149] A Figura 6A é uma fotografia de uma ampola contendo lipase de Rhyzopus oryzae imobilizada sobre grânulos de polímero. A lipase imobilizada está em forma granular seca que pode ser adicionada ao recipiente ou câmara de um dispositivo de acordo com a invenção, tal como, o dispositivo representado nas Figuras 6B a 6D. A lipase imobilizada pode ser aprisionada na câmara do dispositivo, enquanto ainda permite o fluxo de fórmula através de e fora da câmara fornecendo simplesmente um filtro na extremidade de egresso da câmara que contém poros suficientemente grandes para permitir que a fórmula passe, mas retém a lipase imobilizada dentro da câmara. Al-ternativamente, lipase pode ser imobilizada, por exemplo, revestindo os canais internos ou câmara do dispositivo, de modo que a fórmula está exposta à lipase conforme ela passa através da câmara. A lipase imobilizada em tal dispositivo pode ser usada para alimentação contínua por períodos estendidos em função da estabilidade aumentada e da reutilização da lipase.
Fórmulas Nutricionais
[00150] Certas modalidades da invenção fornecem fórmulas nutricionais. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é uma fórmula infantil. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é uma fórmula nutricional médica. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é exposta a lipase antes da ingestão. Em algumas modalidades, esta exposição permite pré-hidrólise de pelo menos alguns lipídios na fórmula nutricional. Deste modo, em algumas modalidades, a fórmula nutricional é uma fórmula "conforme alimentada", por exemplo, a fórmula líquida conforme composta logo antes da ingestão pelo sujeito, que se difere em composição da fórmula como vendida pelo fabricante. O termo "fórmula nutricional" não engloba composições existentes dentro do corpo de um sujeito após a ingestão.
[00151] Em algumas modalidades, a fórmula nutricional compreende ácidos graxos de cadeia longa. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional compreende um ou mais LC-PUFAs, tais como, DHA, ARA e EPA. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional compreende DHA. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional compreende ARA. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional compreende DHA e ARA. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional compreende DHA, ARA e EPA.
[00152] Em algumas modalidades, mais do que 5% dos ácidos gra- xos de cadeia longa totais na fórmula nutricional estão na forma de monoglicerídeos e/ou ácidos graxos livres. Em algumas modalidades, mais do que 5% do LC-PUFA total na fórmula nutricional está na forma de monoglicerídeos e/ou ácidos graxos livres. Em algumas modalidades, mais do que 5% do DHA está na forma de um monoglicerídeo e/ou ácido graxo livre. Em algumas modalidades, mais do que 5% do ARA está na forma de um monoglicerídeo e/ou ácido graxo livre Em algumas modalidades, mais do que 5% do EPA está na forma de um monoglicerídeo e/ou ácido graxo livre.
[00153] Em algumas modalidades, mais do que 10%, mais do que 15%, mais do que 20%, mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 85%, mais do que 90%, mais do que 95% ou 100% dos ácidos graxos de cadeia longa totais na fórmula nutricional estão na forma de monoglicerídeos e/ou ácidos graxos livres. Em algumas modalidades, mais do que 10%, mais do que 15%, mais do que 20%, mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 85%, mais do que 90%, mais do que 95% ou 100% do LC-PUFA total na fórmula nutricional está na forma de monoglicerídeos e/ou ácidos graxos livres. Em algumas mo-dalidades, mais do que 10%, mais do que 15%, mais do que 20%, mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 85%, mais do que 90%, mais do que 95% ou 100% do DHA está na forma de um monoglicerídeo e/ou ácido graxo livre. Em algumas modalidades, mais do que 10%, mais do que 15%, mais do que 20%, mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 85%, mais do que 90%, mais do que 95% ou 100% do ARA está na forma de um monoglicerídeo e/ou ácido graxo livre. Em algumas modalidades, mais do que 10%, mais do que 15%, mais do que 20%, mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 85%, mais do que 90%, mais do que 95% ou 100% do EPA está na forma de um monoglicerídeo e/ou ácido graxo livre. Em algumas modalidades, mais do que 10%, mais do que 15%, mais do que 20%, mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 85%, mais do que 90%, mais do que 95% ou 100% tanto de DHA quanto de ARA estão na forma de um monoglicerídeo e/ou ácido graxo livre. Em uma modalidade particular, mais do que 90% tanto de DHA quanto de ARA está na forma de um monoglicerídeo e/ou ácido graxo livre. Em uma modalidade particular, mais do que 95% tanto de DHA quanto de ARA está na forma de um monoglicerídeo e/ou ácido graxo livre.
[00154] Em algumas modalidades, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% dos ácidos graxos de cadeia longa totais na fórmula nutricional estão na forma de monoglicerídeos e/ou ácidos graxos livres. Em algumas modalidades, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% do LC-PUFA total na fórmula nutricional está na forma de monoglicerídeos e/ou ácidos graxos livres. Em algumas modalidades, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% do DHA está na forma de um monoglicerí- deo e/ou ácido graxo livre. Em algumas modalidades, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% do ARA está na forma de um monoglicerídeo e/ou ácido graxo livre. Em algumas modalidades, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% do EPA está na forma de um monoglicerídeo e/ou ácido graxo livre. Em algumas modalidades, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% tanto de DHA quanto de ARA estão na forma de um monoglicerídeo e/ou ácido graxo livre. Em uma modalidade particular, pelo menos 90% tanto de DHA quanto de ARA está na forma de um monoglicerídeo e/ou ácido graxo livre. Em uma modalidade particular, pelo menos 95% tanto de DHA quanto de ARA estão na forma de um monoglicerídeo e/ou ácido graxo livre.
[00155] Em algumas modalidades da invenção, o tamanho de porção aproximado de uma fórmula nutricional da invenção é cerca de 100 a 110 ml para fórmula infantil prematura, 90 a 150 ml (por exemplo, 148 ml) para fórmula infantil para gestação completa, 230 a 500 ml (por exemplo, 235 a 250 ml) para alimentações entéricas e 230 a 250 ml para fórmulas para criança e fórmulas para adulto. Em algumas modalidades, cada porção contém cerca de 10 a 35 mg de ácidos gra- xos livres ARA e monoglicerídeos (como seriam obtidos a partir de hidrólisecompleta de TG-ARA nas fórmulas infantis prematura e para gestação completa disponíveis atualmente) ou cerca de 40 a 50 mg de ácidos graxos livres ARA e monoglicerídeos (como seriam obtidos a partir de hidrólise completa de TG-ARA em uma fórmula para adulto disponível atualmente). Em algumas modalidades, cada porção contém cerca de 7 a 20 mg de ácidos graxos livres DHA e monoglicerí- deos (como seriam obtidos a partir de hidrólise completa de TG-DHA nas fórmulas infantis prematura e para gestação completa disponíveis atualmente) ou cerca de 10 a 40 mg de ácidos graxos livres DHA e monoglicerídeos (como seriam obtidos a partir de hidrólise completa de TG-DHA em fórmulas para crianças e adultos disponíveis atualmente). Em algumas modalidades, uma porção adulta de 230 a 250 ml contém cerca de 1.100 mg de ácidos graxos livres EPA e monoglicerí- deos e cerca de 240 mg de ácidos graxos livres DHA e monoglicerí- deos (como seriam obtidos a partir de hidrólise completa de TG-EPA e TG-DHA em algumas fórmulas para adulto, tal como, ProSure®). Em algumas modalidades da invenção, entretanto, a capacidade para pré- hidrolisar TG-LCPUFAs antes da ingestão permite que a fórmula seja feita com níveis maiores de LC-PUFAs do que em fórmulas disponíveis atualmente. Por conseguinte, em algumas modalidades a quantia de ácidos graxos livres e/ou monoglicerídeos de ARA e/ou DHA exce-de as quantias que poderiam ser obtidas a partir da hidrólise completa de TG-LCPUFAs em fórmulas disponíveis atualmente. Em algumas modalidades, uma porção de uma fórmula nutricional contém 50 a 100 mg de ácidos graxos livres LC-PUFA e/ou monoglicerídeos. Em algumas modalidades, uma porção de uma fórmula nutricional da invenção contém de 100 a 200 mg de ácidos graxos livres LC-PUFA e/ou mo- noglicerídeos. Em algumas modalidades, uma porção de uma fórmula da invenção contém de 200 a 300 mg de ácidos graxos livres LC- PUFA e/ou monoglicerídeos. Em algumas modalidades, uma porção de uma fórmula nutricional da invenção contém de 250 a 500 mg de ácidos graxos livres LC-PUFA e/ou monoglicerídeos. Em algumas mo-dalidades, uma porção de uma fórmula nutricional da invenção contém de 500 a 1000 mg de ácidos graxos livres LC-PUFA e/ou monoglicerí- deos. Em algumas modalidades, uma porção de uma fórmula nutricional da invenção contém de 1 a 2 gramas de ácidos graxos livres LC- PUFA e/ou monoglicerídeos. Em algumas modalidades, uma porção de uma fórmula nutricional da invenção contém de 2 a 3 gramas de ácidos graxos livres LC-PUFA e/ou monoglicerídeos.
[00156] Em algumas modalidades, a fórmula nutricional compreende gorduras, carboidratos e proteínas (ou aminoácidos). Em algumas modalidades, uma fórmula infantil da invenção compreende um, mais do que um ou todos os seguintes: leite desnatado, lactose, óleo vegetal (por exemplo, uma ou mais dentre oleína de palma, coco, soja e óleos de girassol oleicos elevados), proteína de soro de leite concentrada,açúcares, vitaminas de LC-PUFAs e minerais. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional compreende gorduras compostas de ácidos graxos de cadeia média e gorduras compostas de ácidos gra- xos de cadeia longa. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional compreende gorduras compostas de ácidos graxos n-6 e gorduras compostas de ácidos graxos n-3. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional compreende LA e ALA.
[00157] Em algumas modalidades, uma fórmula nutricional da invenção não compreende lipase adicional. Em algumas modalidades, um dispositivo e/ou um método da presente invenção é usado para expor uma fórmula nutricional a uma lipase, mas a fórmula nutricional é separada da lipase antes da alimentação, de tal modo que a fórmula nutricional conforme alimentada não compreende lipase adicional. Uma fórmula nutricional que não compreenda lipase adicional se refere a uma fórmula em que lipase não é detectável ou está presente apenas em níveis muito baixos, por exemplo, devido a lixiviação de lipase imobilizada a partir de um suporte sólido na fórmula. Em algumas modalidades, uma fórmula nutricional compreende não mais do que 0,02% (w/w) de lipase, não mais do que 0,01% (w/w) de lipase, não mais do que 0,005% (w/w) de lipase, não mais do que 0,002% (w/w) de lipase, não mais do que 0,001% (w/w) de lipase, não mais do que 0,0005% (w/w) de lipase, não mais do que 0,0002% (w/w) de lipase ou não mais do que 0,0001% (w/w) de lipase. Em algumas modalidades, uma fórmula nutricional compreende menos do que 0,02% (w/w) de lipase, menos do que 0,01% (w/w) de lipase, de lipase, menos do que 0,005% (w/w) de lipase, menos do que 0,002% (w/w) de lipase, menos do que 0,001% (w/w) de lipase, menos do que 0,0005% (w/w) de lipase, menos do que 0,0002% (w/w) de lipase ou menos do que 0,0001% (w/w) de lipase.
[00158] Em algumas modalidades, a fórmula nutricional compreende uma lipase. Em algumas modalidades, a lipase é selecionada a partir de lipase de Chromobacterium viscosum, lipase de Pseudomonas fluorescens, lipase de Burcholderia cepacia e lipase de Rhizopus oryzae. Em algumas modalidades, a lipase é selecionada a partir de lipase de Chromobacterium viscosum, lipase de Pseudomonas fluo- rescens e lipase de Rhizopus oryzae. Em algumas modalidades a lipase é lipase de Chromobacterium viscosum. Em algumas modalidades, a lipase é lipase de Pseudomonas fluorescens. Em algumas mo-dalidades, a lipase é lipase de Rhizopus oryzae.
[00159] Em algumas modalidades, uma porção da fórmula nutricionalcontém menos do que 5.000 unidades de lipase (com unidades estimadas em uma análise de azeite de oliva padrão, tal como descrito em Pharmaceutical Enzymes: Properties and Assay Methods, R. Ru- yssen e A. Lauwers (Eds) Scientific Publishing Company, Ghent, Bélgica (1978)). Em outras modalidades, uma porção da fórmula nutricionalcontém menos do que 3.000 unidades de lipase. Em outras modalidades, uma porção da fórmula nutricional contém menos do que 1.000 unidades. Em certas modalidades, uma porção da fórmula contém menos do que 5.000, menos do que 3.000 ou menos do que 1.000 unidades de lipase por porção é uma fórmula infantil ou uma fórmula nutricional médica.
[00160] Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,01 mg a 1 grama de lipase por grama de gordura total (se na forma de ácido graxo livre, monoglicerídeo, éster ou triglicerídeo) na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,1 a 500 mg de lipase por grama de gordura total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,1 a 250 mg de lipase por grama de gordura total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,1 a 200 mg de lipase por grama de gordura total da fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,1 a 150 mg de lipase por grama de gordura total da fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,1 a 100 mg de lipase por grama de gordura total da fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,1 a 50 mg de lipase por grama de gordura total da fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 1 a 50 mg de lipase por grama de gordura total da fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 25 a 75 mg de lipase por grama de gordura total da fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 1 a 100 mg de lipase por grama de gordura total da fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém não mais do que 50 mg de lipase por grama de gordura total da fórmula nutricional.
[00161] Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 10 mg de lipase por miligrama de LC-PUFA total (se na forma de ácido graxo livre, monoglicerídeo, éster ou triglicerídeo) na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 5 mg de lipase por miligrama de LC-PUFA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 3 mg de lipase por miligrama de LC-PUFA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 1 mg de lipase por miligrama de LC-PUFA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 0,5 mg de lipase por miligrama de LC-PUFA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 0,1 mg de lipase por miligrama de LC-PUFA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 0,05 mg de lipase por miligrama de LC-PUFA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,01 a 0,1 mg de lipase por miligrama de LC-PUFA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,02 a 0,08 mg de lipase por miligrama de LC-PUFA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,04 a 0,06 mg de lipase por miligrama de LC-PUFA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém não mais do que 0,1 mg de lipase por miligrama de LC-PUFA total na fórmula nutricional.
[00162] Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 10 mg de lipase por miligrama de DHA total (se na forma de ácido graxo livre, monoglicerídeo, éster ou triglicerídeo) na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 5 mg de lipase por miligrama de DHA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 3 mg de lipase por miligrama de DHA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 1 mg de lipase por miligrama de DHA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 0,5 mg de lipase por miligrama de DHA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 0,1 mg de lipase por miligrama de DHA total na fórmula nutricional. Em algumas moda-lidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 0,05 mg de lipase por miligrama de DHA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,01 a 0,1 mg de lipase por mili- grama de DHA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,02 a 0,08 mg de lipase por miligrama de DHA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,04 a 0,06 mg de lipase por miligrama de DHA total na fórmula nutricional.
[00163] Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 10 mg de lipase por miligrama de ARA total (se na forma de ácido graxo livre, monoglicerídeo, éster ou triglicerídeo) na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 5 mg de lipase por miligrama de ARA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 3 mg de lipase por miligrama de ARA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 1 mg de lipase por miligrama de ARA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 0,5 mg de lipase por miligrama de ARA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 0,1 mg de lipase por miligrama de ARA total na fórmula nutricional. Em algumas moda-lidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 0,05 mg de lipase por miligrama de ARA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,01 a 0,1 mg de lipase por miligrama de ARA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,02 a 0,08 mg de lipase por miligrama de ARA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,04 a 0,06 mg de lipase por miligrama de ARA total na fórmula nutricional.
[00164] Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 10 mg de lipase por miligrama de EPA total (se na forma de ácido graxo livre, monoglicerídeo, éster ou triglicerídeo) na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 5 mg de lipase por miligrama de EPA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 3 mg de lipase por miligrama de EPA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 1 mg de lipase por miligrama de EPA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 0,5 mg de lipase por miligrama de EPA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 0,1 mg de lipase por miligrama de EPA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,001 a 0,05 mg de lipase por miligrama de EPA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,01 a 0,1 mg de lipase por mili-grama de EPA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,02 a 0,08 mg de lipase por miligrama de EPA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional contém de 0,04 a 0,06 mg de lipase por miligrama de EPA total na fórmula nutricional.
[00165] Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é preparada por um método divulgado neste documento. Em algumas modalidades, uma fórmula nutricional é preparada usando um dispositivo divulgado neste documento.
Métodos de preparação de uma Fórmula Nutricional
[00166] De acordo com várias modalidades, a presente divulgação também fornece métodos de preparação de fórmulas nutricionais. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é uma fórmula nutricional infantil. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é uma fórmula nutricional médica. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é uma bebida nutricional para adultos (tal como, uma bebida nutricional completa, por exemplo, ENSURE e PEDIASURE).
[00167] Em algumas modalidades, um método de preparação de uma fórmula nutricional compreende exposição de uma composição nutricional líquida a uma lipase. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida compreende triglicerídeos de LC-PUFA ou ésteres de LC-PUFA. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida compreende triglicerídeos ou ésteres de um ou mais LC- PPUFAs selecionados a partir dos grupos constituído de DHA, ARA e EPA.
[00168] Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a uma lipase selecionada a partir de lipase de Chromobacterium viscosum, lipase de Pseudomonas fluorescens, lipase de Burcho- lderia cepacia e lipase de Rhizopus oryzae. Em algumas modalidades, a lipase é selecionada a partir de lipase de Chromobacterium viscosum, lipase de Pseudomonas fluorescens e lipase de Rhizopus ory- zae. Em algumas modalidades a lipase é lipase de Chromobacterium viscosum. Em algumas modalidades, a lipase é lipase de Pseudomonas fluorescens. Em algumas modalidades, a lipase é lipase de Rhizo- pus oryzae.
[00169] Componentes envolvidos nestes métodos podem ser misturados em várias ordens. Em algumas modalidades, lipase é adicionada a uma composição nutricional líquida expondo, desse modo, lipídios na composição nutricional líquida à lipase. Em algumas modalidades, uma composição nutricional líquida é preparada adicionando um líquido potável a uma forma sólida ou em pó da composição nutricional. Em algumas modalidades, lipase está presente na forma sólida ou em pó da composição nutricional antes da adição de líquido potável. Em algumas modalidades, lipase é adicionada após a composição nutricional líquida ser preparada. Em algumas modalidades, a lipase e a forma sólida ou em pó da composição nutricional são adicionados a um líquido potável ao mesmo tempo.
[00170] Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por pelo menos um minuto, pelo menos 2 minutos, pelo menos 3 minutos, pelo menos 5 minutos, pelo menos 8 minutos, pelo menos 10 minutos, pelo menos 15 minutos, pelo menos 30 minutos, pelo menos 45 minutos ou pelo menos 60 minutos antes da ingestão. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta por não mais do que 30 segundos, não mais do que 1 minuto, não mais do que 2 minutos, não mais do que 3 minutos, não mais do que 5 minutos, não mais do que 8 minutos, não mais do que 10 minutos,não mais do que 15 minutos, não mais do que 30 minutos, não mais do que 45 minutos, não mais do que 60 minutos, não mais do que 2 horas, não mais do que 4 horas, não mais do que 6 horas, não mais do que 12 horas ou não mais do que 24 horas.
[00171] Em algumas modalidades, o método resulta em uma fórmula nutricional em que pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% do LC-PUFA total na fórmula nutricional está na forma de monoglicerídeos e/ou ácidos graxos livres. Em algumas modalidades, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% do DHA está na forma de um monoglicerídeo e/ou ácido graxo livre. Em algumas modalidades, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% do ARA está na forma de um monoglicerídeo e/ou ácido graxo livre. Em algumas modalidades, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo me- nos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% do EPA está na forma de um monoglicerídeo e/ou ácido graxo livre
[00172] Para os propósitos deste pedido, exposição de uma composição nutricional ou fórmula a uma lipase se refere ao período de tempo em que uma composição nutricional líquida ou fórmula líquida está em contato com uma lipase, que pode ser em solução ou imobilizada. Para os propósitos deste pedido, exposição a uma lipase termina quando a fórmula é ingerida pelo sujeito ou quando a lipase é removida separando a fórmula líquida a partir de um suporte sólido ao qual a lipase é imobilizada. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 10 minutos e pelo menos 20% do DHA na fórmula nutricional resultante está na forma de um monoglicerídeo e/ou ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 10 minutos e pelo menos 20% do ARA na fórmula nutricional resultante está na forma de um monoglicerídeo e/ou ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 10 minutos e pelo menos 20% do LC-PUFA total na fórmula nutricional resultante está na forma de um monoglicerídeo e/ou ácido graxo livre.
[00173] Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 10 minutos e pelo menos 40% do DHA na fórmula nutricional resultante está na forma de um mono- glicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 10 minutos e pelo menos 40% do ARA na fórmula nutricional resultanteestá na forma de um monoglicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 10 minutos e pelo menos 40% do LC- PUFA total na fórmula nutricional resultante está na forma de um mo- noglicerídeo e/ou um ácido graxo livre.
[00174] Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 10 minutos e pelo menos 50% do DHA na fórmula nutricional resultante está na forma de um mono- glicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 10 minutos e pelo menos 50% do ARA na fórmula nutricional resultanteestá na forma de um monoglicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 10 minutos e pelo menos 50% do LC- PUFA total na fórmula nutricional resultante está na forma de um mo- noglicerídeo e/ou um ácido graxo livre.
[00175] Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 10 minutos e pelo menos 60% do DHA na fórmula nutricional resultante está na forma de um mono- glicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 10 minutos e pelo menos 60% do ARA na fórmula nutricional resultanteestá na forma de um monoglicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 10 minutos e pelo menos 60% do LC- PUFA total na fórmula nutricional resultante está na forma de um mo- noglicerídeo e/ou um ácido graxo livre.
[00176] Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 10 minutos e pelo menos 70% do DHA na fórmula nutricional resultante está na forma de um mono- glicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 10 minutos e pelo menos 70% do ARA na fórmula nutricional resultan- te está na forma de um monoglicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 10 minutos e pelo menos 70% do LC- PUFA total na fórmula nutricional resultante está na forma de um mo- noglicerídeo e/ou um ácido graxo livre.
[00177] Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 20 minutos e pelo menos 20% do DHA na fórmula nutricional resultante está na forma de um mono- glicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 20 minutos e pelo menos 20% do ARA na fórmula nutricional resultanteestá na forma de um monoglicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 20 minutos e pelo menos 20% do LC- PUFA total na fórmula nutricional resultante está na forma de um mo- noglicerídeo e/ou um ácido graxo livre.
[00178] Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 20 minutos e pelo menos 40% do DHA na fórmula nutricional resultante está na forma de um mono- glicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 20 minutos e pelo menos 40% do ARA na fórmula nutricional resultanteestá na forma de um monoglicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 20 minutos e pelo menos 40% do LC- PUFA total na fórmula nutricional resultante está na forma de um mo- noglicerídeo e/ou um ácido graxo livre.
[00179] Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 20 minutos e pelo menos 50% do DHA na fórmula nutricional resultante está na forma de um mono- glicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 20 minutos e pelo menos 50% do ARA na fórmula nutricional resultanteestá na forma de um monoglicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 20 minutos e pelo menos 50% do LC- PUFA total na fórmula nutricional resultante está na forma de um mo- noglicerídeo e/ou um ácido graxo livre.
[00180] Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 20 minutos e pelo menos 80% do DHA na fórmula nutricional resultante está na forma de um mono- glicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 20 minutos e pelo menos 80% do ARA na fórmula nutricional resultanteestá na forma de um monoglicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 20 minutos e pelo menos 80% do LC- PUFA total na fórmula nutricional resultante está na forma de um mo- noglicerídeo e/ou um ácido graxo livre.
[00181] Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 20 minutos e pelo menos 90% do DHA na fórmula nutricional resultante está na forma de um mono- glicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 20 minutos e pelo menos 90% do ARA na fórmula nutricional resultanteestá na forma de um monoglicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 20 minutos e pelo menos 90% do LC- PUFA total na fórmula nutricional resultante está na forma de um mo- noglicerídeo e/ou um ácido graxo livre.
[00182] Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 30 minutos e pelo menos 20% do DHA na fórmula nutricional resultante está na forma de um mono- glicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 30 minutos e pelo menos 20% do ARA na fórmula nutricional resultanteestá na forma de um monoglicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 30 minutos e pelo menos 20% do LC- PUFA total na fórmula nutricional resultante está na forma de um mo- noglicerídeo e/ou um ácido graxo livre.
[00183] Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 30 minutos e pelo menos 40% do DHA na fórmula nutricional resultante está na forma de um mono- glicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 30 minutos e pelo menos 40% do ARA na fórmula nutricional resultanteestá na forma de um monoglicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 30 minutos e pelo menos 40% do LC- PUFA total na fórmula nutricional resultante está na forma de um mo- noglicerídeo e/ou um ácido graxo livre.
[00184] Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 30 minutos e pelo menos 60% do DHA na fórmula nutricional resultante está na forma de um mono- glicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 30 minutos e pelo menos 60% do ARA na fórmula nutricional resultanteestá na forma de um monoglicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 30 minutos e pelo menos 60% do LC- PUFA total na fórmula nutricional resultante está na forma de um mo- noglicerídeo e/ou um ácido graxo livre.
[00185] Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 30 minutos e pelo menos 70% do DHA na fórmula nutricional resultante está na forma de um mono- glicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 30 minutos e pelo menos 70% do ARA na fórmula nutricional resultanteestá na forma de um monoglicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 30 minutos e pelo menos 70% do LC- PUFA total na fórmula nutricional resultante está na forma de um mo- noglicerídeo e/ou um ácido graxo livre.
[00186] Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 30 minutos e pelo menos 80% do DHA na fórmula nutricional resultante está na forma de um mono- glicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 30 minutos e pelo menos 80% do ARA na fórmula nutricional resultanteestá na forma de um monoglicerídeo e/ou um ácido graxo livre. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a lipase por não mais do que 30 minutos e pelo menos 80% do LC- PUFA total na fórmula nutricional resultante está na forma de um mo- noglicerídeo e/ou um ácido graxo livre.
[00187] Em algumas modalidades, a lipase permanece na fórmula nutricional quando é alimentada ao sujeito. Em outras modalidades, a lipase é removida da composição nutricional liquida antes de ser alimentada ao sujeito. Em algumas modalidades, a lipase é removida expondo a composição nutricional líquida, compreendendo a lipase, a um suporte sólido imobilizado a uma molécula que se liga a lipase, desse modo, ligando a lipase ao suporte sólido e separando a composição nutricional líquida do suporte sólido. Uma vez que a lipase é imobilizada ao suporte sólido, separando a composição nutricional líquida do suporte sólido tem o efeito de remover a lipase da composição nutricional líquida. Em algumas modalidades, a lipase é imobilizada a um suporte sólido antes de ser exposta à composição nutricional líquida e a lipase é removida separando a composição nutricional líquida do suporte sólido. Em algumas modalidades, a lipase é imobilizada a pelo menos uma parte de uma face interior de uma câmara ou a um suporte sólido contido dentro da câmara, e a composição nutricionallíquida é temporariamente exposta à lipase passando através da câmara. Em algumas modalidades, a câmara é uma coluna. Em algumas modalidades, a composição nutricional líquida é exposta a um recipiente contendo lipase imobilizada a um suporte sólido, e pelo menos uma parte da superfície interna do recipiente constituído de um material que é permeável a triglicerídeos e ésteres, mas não é permeável ao suporte sólido.
[00188] Em algumas modalidades, o método produz uma fórmula nutricional que não compreende lipase adicional. Em algumas modalidades, uma fórmula nutricional é exposta a uma lipase, mas a fórmula nutricional é separada da lipase antes da alimentação, de tal modo que a fórmula nutricional conforme alimentada não compreende lipase adicional. Uma fórmula nutricional que não compreende (ou contém) lipase adicional se refere a uma fórmula em que lipase não é detectá- vel ou está presente apenas em níveis muito baixos, por exemplo, devido lixiviação de lipase imobilizada a partir de um suporte sólido na fórmula. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional compreende não mais do que 0,02% (w/w) de lipase, não mais do que 0,01% (w/w) de lipase, não mais do que 0,005% (w/w) de lipase, não mais do que 0,002% (w/w) de lipase, não mais do que 0,001% (w/w) de lipase, não mais do que 0,0005% (w/w) de lipase, não mais do que 0,0002% (w/w) de lipase ou não mais do que 0,0001% (w/w) de lipase. Em algumas modalidades, uma fórmula nutricional compreende menos do que 0,02% (w/w) de lipase, menos do que 0,01% (w/w) de lipase, de lipase, menos do que 0,005% (w/w) de lipase, menos do que 0,002% (w/w) de lipase, menos do que 0,001% (w/w) de lipase, menos do que 0,0005% (w/w) de lipase, menos do que 0,0002% (w/w) de lipase ou menos do que 0,0001% (w/w) de lipase.
[00189] Em algumas modalidades, o método compreende exposição da fórmula nutricional a menos do que 5.000 unidades de lipase por porção (com unidades avaliadas em uma análise de azeite de oliva padrão, tal como descrito em Pharmaceutical Enzymes: Properties and Assay Methods, R. Ruyssen e A. Lauwers (Eds) Scientific Publising Company, Ghent, Bélgica (1978)). Em outras modalidades, a fórmula nutricional é exposta a menos do que 3.000 unidades de lipase por porção. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é exposta a menos do que 1.000 unidades de lipase por porção. Em algumas modalidades, a fórmula exposta a menos do que 5.000, menos do que 3.000 ou menos do que 1.000 unidades de lipase por porção é uma fórmula infantil ou uma fórmula nutricional médica.
[00190] Em algumas modalidades, um método da invenção expõe a fórmula nutricional a 0,01 mg para 1 grama de lipase por grama de gordura total (se na forma de ácido graxo livre, monoglicerídeo, éster ou triglicerídeo) na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, um método da invenção expõe a fórmula nutricional a 0,1 para 500 mg de lipase por grama de gordura total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, um método da invenção expõe a fórmula nutricional a 0,1 para 250 mg de lipase por grama de gordura total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, um método da invenção expõe a fórmula nutricional a 0,1 para 200 mg de lipase por grama de gordura total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, um método da invenção expõe a fórmula nutricional a 0,1 para 150 mg de lipase por grama de gordura total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, um método da invenção expõe a fórmula nutricional a 0,1 para 100 mg de lipase por grama de gordura total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, um método da invenção expõe a fórmula nutricional a 0,1 para 50 mg de lipase por grama de gordura total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, um método da invenção expõe a fórmula nutricional a 1 para 50 mg de lipase por grama de gordura total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, um método da invenção expõe a fórmula nutricional a 25 para 75 mg de lipase por grama de gordura total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, um método da invenção expõe a fórmula nutricional a 1 para 100 mg de lipase por grama de gordura total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, um método da invenção expõe a fórmula nutricional a não mais do que 50 mg de lipase por grama de gordura total na fórmula nutricional
[00191] Em algumas modalidades, o método expõe a fórmula nutricional a 0,001 para 10 mg de lipase por miligrama de LC-PUFA total (se na forma de ácido graxo livre, monoglicerídeo, éster ou triglicerí- deo) na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricionalé exposta a 0,001 para 5 mg de lipase por miligrama de LC- PUFA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é exposta a 0,001 para 3 mg de lipase por miligrama de LC- PUFA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é exposta a 0,001 para 1 mg de lipase por miligrama de LC- PUFA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é exposta a 0,001 para 0,5 mg de lipase por miligrama de LC-PUFA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é exposta a 0,001 para 0,1 mg de lipase por miligrama de LC-PUFA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é exposta a 0,001 para 0,05 mg de lipase por miligrama de LC-PUFA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é exposta a 0,01 para 0,1 mg de lipase por miligrama de LC-PUFA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é exposta a 0,02 para 0,08 mg de lipase por miligrama de LC-PUFA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é exposta a 0,04 para 0,06 mg de lipase por miligrama de LC-PUFA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é exposta a não mais do que 0,1 mg de lipase por miligrama de LC-PUFA total na fórmula nutricional.
[00192] Em algumas modalidades, o método expõe a fórmula nutricional a 0,001 para 10 mg de lipase por miligrama de DHA total (se na forma de ácido graxo livre, monoglicerídeo, éster ou triglicerídeo) na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é exposta a 0,001 para 5 mg de lipase por miligrama de DHA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é exposta a 0,001 para 3 mg de lipase por miligrama de DHA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é exposta a 0,001 para 1 mg de lipase por miligrama de DHA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é exposta a 0,001 para 0,5 mg de lipase por miligrama de DHA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é exposta a 0,001 para 0,1 mg de lipase por miligrama de DHA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é exposta a 0,001 para 0,05 mg de lipase por miligrama de DHA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é exposta a 0,01 para 0,1 mg de lipase por miligrama de DHA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é exposta a 0,02 para 0,08 mg de lipase por miligrama de DHA total na fórmula nutricional. Em algumas modalidades, a fórmula nutricional é exposta a 0,04 para 0,06 mg de lipase por miligrama de DHA total na fórmula nutricional.
[00193] Em algumas modalidades, um método de preparação de uma fórmula nutricional compreende expor uma composição nutricionallíquida a um dispositivo descrito neste documento.
EXEMPLO 1: ATIVIDADES ESPECÍFICAS DE LIPASES PARA DHA E ARA
[00194] Para avaliar a atividade enzimática de várias lipases sobre triglicerídeos de DHA e/ou ARA, experimentos foram executados em uma ampola de vidro de dois ml (com barra de agitação magnética) contendo tampão Tris 0,1M, pH 7,7 e o substrato de triglicerídeos DHA e ARA. A reação foi iniciada adicionando soluções de lipase. Lipases foram obtidas a partir das seguintes fontes comerciais: Rhyzopus ory- zare (Amano DF-15, Amano Enzymes Inc., Nagoya Japão), Chromobacterium viscosum (EMD CalBiochem, EMD Biosciences, Billerica, MA) Pseudomonas fluoresens (Amano AK, Amano Enzymes Inc., Nagoya, Japão). Outras lipases também estão disponíveis a partir de fontes comerciais, tais como, Candida rugosa (Amano AY 30 ou Amano 30, Amano Enzymes Inc., Nagoya, Japão), Aspergillus niger (Amano DS, Amano Enzymes Inc., Nagoya, Japão), Penicillium camembertii (Amano 50, Amano Enzymes Inc., Nagoya, Japão), Rhyzomucor mi- ehei (L4277, Siga-Aldrich), Asperigillus oryzae (62285, Sigma-Aldrich) e Burcholderia cepacia (534641, Sigma-Aldrich). Soluções de lipase foram preparadas a partir destas lipases disponíveis comercialmente sem purificação adicional, exceto que lipase de B. cepacia foi purificada a homogeneidade.
[00195] As ampolas foram transferidas para um banho de água à 37 °C colocadas sobre um agitador magnético. 50 μl de amostras foram tomadas em intervalos de tempo diferentes - 0, 15, 30, 45, 60, 90 e 120 minutos e adicionadas a uma ampola HPLC contendo 950 μl de tampão de corrida (30% de tampão de fosfato de amônia 10mM, pH 3,0 e 70% de acetonitrila). As amostras foram então analisadas para ou ácido livre DHA ou ácido livre ARA por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC) usando um Agilent série HPLC1100 e uma coluna C8 RP e monitorando em 215 e 220 nm. Os picos de ácidos livres foram identificados de acordo com os tempos de retenção usando padrões disponíveis comercialmente: triglicerídeo de DHA (Nu-check Prep, Inc. Lote N° T-310-D7-V), triglicerídeo de ARA (Nu-check Prep, Inc. Lote N° T-295-JY14-V), forma de ácido livre DHA (Nu-check Prep, Inc Lote N° U-84A-AU20-U) e forma de ácido livre ARA (Nu-check Prep, Inc. Lote N° U-71A-N11-U). As atividades específicas de um painel de lipases nesta análise para DHA e ARA são resumidas na Tabela 1. Nas mãos dos inventores, Chromobacterium viscosum (CV), Burcholderia cepacia (BC), Pseudomonas Fluoresens (PF) e Rhyzopus oryzae (RO) tiveram atividades específicas substancialmente maiores em direção a DHA e/ou ARA comparado as outras lipases testadas, incluindo Candida rugosa (CR). TABELA 1: Atividades específicas de lipases para DHA e ARA
Figure img0001
EXEMPLO 2: ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE LIPASES DE Chromobac- terium viscosum E Rhyzopus oryzae PARA DHA, ARA E EPA EM FÓRMULA INFANTIL
[00196] Para avaliar a atividade enzimática de lipases de CV e RO sobre DHA, ARA e EPA quando suplementadas a fórmula infantil, fórmula infantil a base de leite foi preparada dissolvendo 10 g de pó de ENFAMIL® em 35 ml de água. A fórmula infantil contendo substrato de EPA, tampão Tris 0,1M, pH 7,7, e 2,7 mg de DHA (Nu-check Prep, Inc. Lote N° T-310-D7-V) e 5,4 mg de ARA (Nu-check Prep, Inc. Lote N° T- 295) substratos foram adicionados a uma ampola de vidro de um ml de (com barra de agitação magnética). A reação foi iniciada adicionando enzima (por exemplo, lípase); quatro concentrações de cada enzima foram testadas. As ampolas foram transferidas para um banho de água à 37 °C colocado sobre um agitador magnético. 50 μl de cada amostra foram tomados em diferentes momentos - 0, 10, 20, 30, 45 e 60 minutos e adicionados a uma ampola HPLC contendo 950μl de tampão de corrida HPLC (30% de tampão de fosfato de amônia 10mM, pH 3,0 e 70 % de acetonitrila). As amostras foram então analisadas para ácido DHA, ácido ARA ou ácido EPA por RP-HPLC como acima.
[00197] O percentual de triglicerídeos totais diminuiu ao longo do tempo, conforme a quantia de ácido livre e monoglicerídeo aumentou. Por exemplo, quando hidrolisado com RO, a quantia de ácido livre DHA aumentou com o tempo (Figura 7). Similarmente, quando hidroli- sado com RO, a quantia de ácido livre ARA aumentou com o tempo (Figura 8).
[00198] As atividades específicas de cada uma das lipases nesta análise foram calculadas com base nas quantias de ácido DHA, ácido ARA ou ácido EPA livres liberadas na fórmula infantil e são mostradas na Tabela 2. TABELA 2: Atividades específicas de lipases sobre TG-DHA, TG-ARA e TG-EPA em fórmula infantil
Figure img0002
EXEMPLO 3: HIDRÓLISE DE EXPANSÃO DE TRIGLICERÍDEO DE DHA E TRIGLICERÍDEO DE ARA
[00199] Lipases foram avaliadas por suas capacidades de hidrolisa- rem TG-DHA e TG-ARA quando expandidas a uma quantia que pode ser usada para suplementação de fórmula infantil. A fórmula infantil (leite) foi preparada dissolvendo 162 g de pó de Enfamil em 648 ml de água da torneira (água quente, a temperatura era 37 °C). Triglicerídeo DHA (442 mg, concentração final de DHA foi 0,54 g, 1,2% de gordura total) e triglicerídeo ARA (885 mg, concentração final de ARA 1,08 g, 2,4% de gordura total) foram precisamente pesados a partir da mesma fonte como no Exemplo 2 e foram misturados com o pó de fórmula infantil antes de adicionar água. A reação foi realizada em um banho de água com agitação constante. Hidrólise de gordura foi iniciada adicionando ou lipase de CV ou de RO. Amostras de fórmula foram retiradas em 0, 15 e 30 minutos e foram analisadas para hidrólise de DHA e ARA por RP-HPLC, como descrito acima. Os resultados são mostrados na Tabela 3 abaixo. TABELA 3: Hidrólise de TG-DHA e TG-ARA em fórmula infantil
Figure img0003
EXEMPLO 4: ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE LIPASE DE Rhyzopus oryzae IMOBILIZADA SOBRE TG-DHA OU TG-ARA EM FÓRMULA INFANTIL E TAMPÃO
[00200] Para avaliar a atividade enzimática de lipase de RO imobilizada sobre TG-DHA ou TG-ARA quando suplementada a fórmula, fórmula infantil a base de leite foi preparada dissolvendo 10g de pó de ENFAMIL® em 35 ml de água. A reação foi realizada como a seguir. Fórmula infantil, tampão Tris 0,1M, pH 7,7 e substrato (TG-DHA ou TG-ARA) foram adicionados a uma ampola de vidro de um ml (com barra de agitação magnética). A reação foi iniciada por lipase adicional. As ampolas foram transferidas para um banho de água à 37 °C colocado sobre um agitador magnético. 50 μl de cada amostra foram tomados em diferentes momentos - 0, 10, 20 e 30 minutos e adicionadas a uma ampola HPLC contendo 900 μl de tampão de corrida HPLC (30% de tampão de fosfato de amônia 10mM, pH 3,0 e 70% de aceto- nitrila). As amostras foram então analisadas para ácido DHA ou ácido ARA por RP-HPLC como descrito acima.
[00201] As atividades específicas da lipase para hidrólise de TG- DHA e TG-ARA foram calculadas com base na quantia de ácido DHA e ácido ARA livres liberada na fórmula infantil e são mostradas na Tabela 4. TABELA 4: Atividades específicas de lipase de RO imobilizada sobre TG-DHA ou TG-ARA em fórmula infantil e tampão.
Figure img0004
[00202] Os valores em parênteses são para o tampão sozinho.
EXEMPLO 5: ANIMAIS E PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS 5.1 Animais
[00203] Os experimentos foram executados em 12 porcos (9+3) da University herd at Odarslov, Swedish Agricultural University, Department of Agricultural Biosystems and Technology, pesando aproxi- madamente 10±2 kg cada. Os animais foram mantidos em um ciclo de 12 horas dia-noite, com luz das 6:00-18:00 (6am-6pm) e escuro das 18:00-6:00 horas (6pm-6am). Os porcos foram alojados individualmente em gaiolas metabólicas ou baias individuais equipadas com uma manjedoura seca, um bico para beber e uma lâmpada de aquecimento constante (150 W). Permitiu-se que eles se movam livremente dentro de suas baias e tenham contato visual uns com os outros.
5.2 Alimentação
[00204] Após a cirurgia e durante o período de pré-tratamento, os porcos foram alimentados com uma dieta suína padrão ("53908 Vaxtill 320 P BK", Lantmannen, Suécia) contendo 17,5% de proteína bruta, 3,9% de fibra bruta, 3,5% de gordura bruta e 5,2% de cinzas junto com 5000 IE/kg de vitamina A, 500 IE/kg de vitamina D e 85 mg/kg de vitamina E. Porcos foram alimentados duas vezes diariamente (2,0% de massa corporal por refeição) às 9:00-10:00 horas (9am-10am) e 17:0018:00 horas (5pm-6pm). Por alguns dias antes do início do experimento, por exemplo, antes do período de adaptação, os porcos foram treinados para consumir fórmula infantil (NAN Pro 1 Gold Infant Formula, Nestlé). A fórmula foi preparada conforme uma diluição de 1:4 em água da torneira ao invés de 1:7 como recomendado pelo fabricante para permitir consumo apropriado, uma vez que os porcos não gostam de beber grandes volumes de líquido. Os requisitos nutricionais diários são de 400 kJ/kg de peso corporal, correspondendo a 40 g de pó de fórmula/kg de peso corporal. Alimentação diária foi dividida em 4 partes, começando com a primeira refeição às 9 am e então, a cada 3 horas após com a última refeição do dia às 6 pm. 100 g de fórmula NAN contêm cerca de 27,7% de gordura, 9,6% de proteína e 57,8% carboidratos.
5.3 Fórmula infantil fortificada com leite com triglicerídeos de DHA e ARA
[00205] De acordo com o fabricante, NAN Pro 1 Gold (Nestlé) é uma fórmula infantil de partida proteína de soro de leite predominante de alta qualidade que é nutricionalmente completa e especialmente formulada para crianças saudáveis a partir do nascimento. Também contém óleo de peixe para ajudar a apoiar o desenvolvimento cerebral e visual. (http://nestlebaby.com/au/baby_nutrition/products/infant_formula/) NAN Pro 1 Gold Ingredientes:
[00206] Sólidos de leite, óleos vegetais (contém soja), minerais (citrato de cálcio, citrato de potássio, cloreto de potássio, cloreto de magnésio, cloreto de sódio, sulfato de sódio, sulfato ferroso, sulfato de zinco, fosfato de cálcio, sulfato de cobre, sulfato de manganês, iodeto de potássio, selenato de sódio), LCPUFAs ômega (DHA de óleo de peixe, AA), emulsificante (lecitina de soja), vitaminas [ascorbato de sódio (vit C), alfa d-l acetato de tocoferol (vit E), niacinamida (niacina), pantote- nato de cálcio, acetato de retinol (vit A), mononitrato de tiamina (vit B1), cloridrato de piridoxina (vit B6), riboflavina (vit B2), ácido fólico, filoquinona (vit K1), biotina, colecalciferol (vit D3)],cianocobalamina (B 12), L-histidina, taurina, inositol, nucleótidos (5'-monofosfato de citidi- na, 5'-monofosfato de uridina, 5'-monofosfato de adenosina, 5'- monofosfato de guanosina), L-carnitina, cultura (bifidus).
[00207] A Tabela 5 abaixo resume a composição de lipídio de leite humano e leite* de fórmula infantil, junto com a fórmula infantil e o leite de fórmula infantil suína para uso nestes experimentos. TABELA 5:Leite de fórmula infantil fortificado com LCPUFA
Figure img0005
* Dados a partir de vários grupos de mulheres na Austrália, Europa, Estados Unidos e Canadá entre 1990 e 2005. Dados a partir de várias fórmulas infantis incluindo Nutrilom (Nutricia, Holanda), Enfamil (Mead Jhonson, Canadá), Similac (Abbott Ross, US), SMA (Wyeth, US). (JPGN 2010;51:380-401)// ** Huang MC, 2007, $$MCT 9,6 * Concentração final será medida após experimento ser terminado
[00208] A concentração total de TG-DHA e TG-AA na fórmula NAN é 0,22%, que está abaixo dos níveis recomendados de 1%. Deste modo, a fórmula NAN foi fortificada com TG-DHA e TG-AA a partir de óleo de peixe (Nucheck (http://www.nu-check.com, ~40% TG-DHA e TGARA) para atingir uma concentração final de 1% de TG-DHA e 2% de TG-DHA, respectivamente.
5.4 Cirurgia de ligação de duto pancreático para indução de insuficiência pancreática exócrina (EPI)
[00209] Cirurgia EPI foi executada em 12+2 porcos jovens de 6 a 8 semanas de idade. EPI é normalmente completamente desenvolvida três a quatro semanas após a cirurgia. Desenvolvimento de insuficiência pancreática foi confirmado por interrupção de crescimento (mínimo ou nenhum aumento no peso corporal) e/ou desenvolvimento de este- atorreia.
EXEMPLO 6: PROJETO EXPERIMENTAL E PROCEDIMENTOS 6.1 Projeto de estudo
[00210] O estudo conteve três períodos: adaptação, controle e teste. Durante o período de adaptação de 7 dias, porcos foram treinados para beber a fórmula infantil fortificada com TG-DHA e TG-ARA. Durante o período de controle de 7 dias, os porcos continuaram a ser alimentados com a fórmula infantil fortificada com TG-DHA e TG-ARA. Durante o período de teste de 7 dias, os porcos foram alimentados com fórmula infantil fortificada com TG-DHA e TG-ARA, ou (a) não hi- drolisada; (b) pré-hidrolisada com lipase de CV; ou (c) pré-hidrolisada com lipase de RO. O consumo de fórmula foi medido diariamente, amostras de fezes foram coletadas nos últimos 3 dias de cada período de estudo (coleta de 72 horas), e amostras de sangue foram coletadas no dia 7 dos períodos de controle e teste.
6.2 Dosagem de lipase
[00211] Dose de lipase e tempo de pré-hidrólise foram determinados com base em resultados in vitro (Exemplo 3) e requisitos nutricionaisdiários dos porcos. A fórmula NAN misturada com lipase de RO ou de CV (~1300 U/g de gordura total) foi incubada com agitação por 15 minutos a 37 °C. Preparação de fórmula proposta e mistura de lipase: - Peso corporal dos porcos variou de 11 a 14 kg; - Requisitos de alimentação: 40 g de pó de fórmula/kg de peso corporal; - Necessidade diária de 500 g de pó/porco; - 4 refeições por dia; - 125 g de pó/porco/refeição Preparação de refeição: 500 g de pó + 1,5 L de água (diluição 1:4) - Adicionar pó seco primeiro; - Adicionar óleos de TG-PUFA (7,7 ml de DHA e 15 ml de ARA), misturar bem e adicionar água da torneira a partir de banho de água a 37 °C, misturar bem; Para fórmula tratada por lipase, misturar em lipase de CV Adicionar água ao volume final; Misturar por todos os 15 minutos em banho de água a 37 Dividir em 4 baldes e alimentar cada porco com ~600 ml de fórmula
6.2.1 Período de adaptação (7 a 10 dias)
[00212] Aproximadamente 7 a 10 dias antes do período de Adaptação, 12 porcos foram colocados em gaiolas metabólicas e treinados para beberem a fórmula enriquecida com TG-PUFA. Na primeira manhã do período de adaptação, o peso corporal foi registrado antes da refeição matinal.
6.2.2 Período de controle (7 dias)
[00213] Para todos os porcos selecionadas foi dada fórmula infantil como a única fonte de alimento, 4 vezes por dia. O consumo diário de fórmula total foi medido durante todo o experimento. Na manhã do primeiro dia do período de Controle, o peso corporal foi registrado an- tes da refeição matinal. Amostras de fezes foram coletada 3 vezes em 24 horas a partir do dia 5 até o dia 7. Amostras de sangue foram coletadas no último dia deste período, 1 hora antes de uma refeição e 1, 2 e 3 horas depois.
6.2.3 Período de teste (7 dias)
[00214] Para todos os porcos selecionados foi dada fórmula infantil enriquecida com TG-PUFA como única fonte de alimento, 4 vezes por dia. O consumo diário de leite total foi medido durante todo o período de experimento. Na manhã do primeiro dia do período de Teste o peso corporal foi registrado antes da refeição matinal. Amostras de fezes foram coletadas 3 vezes em 24 horas a partir do dia 5 até o dia 7. Amostras de sangue foram coletadas no último dia deste período, 1 horas antes de uma refeição e 1, 2 e 3 horas depois.
[00215] Antes do início deste período, porcos foram colocados em três grupos aleatórios, com base no peso corporal e disposição para beber a fórmula: 1) Um terço dos porcos com EPI (n=4) foram alimentados com fórmula pré-hidrolisada com lipase de RO; 2) Um terço dos porcos com EPI (n=4) foram alimentados com fórmula pré-hidrolisada com lipase de CV; e 3) Um terço dos porcos com EPI (n=4) foram alimentados apenas com fórmula. Preparação da fórmula e a mistura de lipase são mostradas acima no parágrafo [00201].
6.3 Critérios para uma resposta positiva
[00216] Redução significante em LCPUFA fecal, aumento no coeficiente de absorção de gordura total (% de CFA) e aumento na concentração de LCPUFA no plasma, quando comparado a porcos com EPI alimentados apenas com fórmula suplementada com 2% de TG-ARA e 1% de TG-AA. 6.4 Análise de dados Dados individuais foram registrados ao mesmo tempo em que foram gerados. Análises estatísticas foram executadas usando o teste t de Student. Diferenças foram consideradas significantes se p<0,05.
EXEMPLO 7: lipases DE RO E DE CV MELHORAM A ABSOSRÇÃO DE ÁCIDO GRAXO EM PORCOSCOM EPI
[00217] Porcos com insuficiência pancreática exócrina (EPI), um modelo cirúrgico bem estabelecido, foram usados como um modelo para imitar bebês humanos prematuros ou que completaram o período de gestação, onde a função pancreática exócrina é comprometida. O modelo suíno cirúrgico EPI foi usado essencialmente como descrito nos Exemplos 5 e 6 para avaliar o efeito sobre a absorção de ácido graxo de fórmula infantil pré-hidrolisada com lipase de CV ou lipase de RO como comparado à fórmula infantil não hidrolisada. Porcoscom EPI tinham 10 semanas de idade (+/- 2 semanas), o que corresponde a cerca de 6 meses de idade para uma criança humana. Os poros foram alimentados com fórmula infantil Nestlé (NAN Pro 1 Gold) enriquecida com 2% de tri- glicerídeos de ARA (TG-ARA) e 1% de triglicerídeos de DHA (TG-DHA) a partir de óleo de peixe (NuCheck (http://www.nu-checkprep.com, ~40% de TG-DHA e TG-ARA). A alimentação ocorreu a cada 3 horas, 4 vezes por dia. No grupo de porcos recebendo fórmula pré-hidrolisada, a fórmula foi pré-hidrolisada 15 minutos antes misturando com lipase de CV ou lipase de RO a 37 °C. A duração do experimento foi 1 semana, seguido por análise de concentração de LC-PUFA nas fezes, absorção de LC-PUFA no plasma e acréscimo de LC-PUFA nos tecidos (retina, coração, fígado, rim, eritrócitos, cérebro e gordura).
[00218] Como mostrado na Figura 22A, porcos com EPI submetidos à fórmula pré-hidrolisada com lipase de CV ou lipase de RO tiveram significante redução no peso das fezes (CV: redução de >60%, p<0,001; RO: redução de ~30%, p<0,05). Pré-hidrolise de gordura com lipase de CV ou lipase de RO também reduziu significantemente o teor de gordura total nas fezes comparado aos porcos com EPI de controle (Figura 22B) e significantemente aumentou o coeficiente de absorção de gordura (% CFA) comparado a controles (Figura 22C), onde %CFA = (ingestão de gordura (g/24 hr) - gordura nas fezes (g/24 hr)), n=3/arm, p=0,002 para CV versus controle, e p=0,003 para RO versus controle. Como comparado ao controle, pré-hidrólise com lipase de CV ou lipase de RO causou reduções significantes em ARA fecal, (reduções de 36% e 65%, respectivamente), EPA (redução de 78% com qualquer enzima) e DHA (reduções de 68% e 60%, respectivamente) (Figura 23). Estes dados mostram que a pré-hidrólise da fórmula com lipase de CV ou de RO reduzem os níveis de gordura total fecal, ARA, DHA e EPA, indicando uma melhora na absorção de ômega-3, ômega- 6 e ácidos graxos totais.
[00219] Além disto, porcos alimentados com fórmula pré-hidrolisada tiveram um aumento significativo nos níveis de ARA e DHA no plasma e tecido após 7 dias de alimentação comparados aos porcos de controle. Para estes estudos, houve 4 porcos nos grupos de Controle e lipase de CV e 3 porcos no grupo de lipase de RO. Amostras de plasma pré-prandial foram tomadas após jejum durante a noite seguindo 7 dias de tratamento. Níveis de ARA e DHA no plasma foram significan- temente maiores (60% e 30%, respectivamente, p<0,05) em porcos alimentados com fórmula pré-hidrolisada com lipase de RO comprado a porcos alimentados com fórmula não hidrolisada (Figura 24). Níveis de ARA no plasma também foram significantemente maiores (40%, p<0,05) em porcos alimentados com fórmula pré-hidrolisada com lipase de CV comparado a porcos alimentados com fórmula não hidroli- sada (Figura 24). Níveis de ARA e DHA também aumentaram signifi- cantemente (p<0,05) na retina (Figura 25A) e tecido adiposo (Figura 25B) de porcos alimentados com fórmula pré-hidrolisada com lipase de RO comparado a porcos alimentados com fórmula não hidrolisada. Níveis de ARA na retina também foram significantemente maiores (p<0,05) em porcos alimentados com fórmula pré-hidrolisada com lipase de CV comparado a porcos alimentados com fórmula não hidroli- sada (Figura 25A). Em porcos alimentados com fórmula pré- hidrolisada com lipase de CV ou de RO, níveis de ARA também aumentaram significantemente (p<0,05) no coração (Figura 26A: aumento de 60% e 20%, respectivamente) e rim (Figura 26B) de porcos, comparado a porcos alimentados com fórmula não hidrolisada. Níveis de DHA aumentaram significantemente (60%, p<0,05) no coração de porcos alimentados com fórmula pré-hidrolisada com lipase de CV comparado a porcos alimentados com fórmula não hidrolisada (Figura 26A). Houve mínima ou nenhuma mudança no fígado, eritrócitos e cérebro, o que pode ser explicado pela duração relativamente curta do tratamento (7 dias) neste estudo.
EXEMPLO 8: HIDRÓLISE DE TG-DHA E TG-ARA EM FÓRMULA INFANTIL POR LIPASE IMOBILIZADA EM UM "SACO DE CHÁ"
[00220] Lípase de Rhyzopus oryzae (RO) foi covalentemente ligada a grânulos acrílicos e contida em um dispositivo parecido com um saco de chá. A fórmula infantil Enfalac (25 g) foi combinada com água da torneira (88 ml) a 37 °C. Reações foram realizadas em uma garrafa de vidro com 100 ml de fórmula infantil e um saco de chá contendo 100, 500, 1000, ou 2000 mg de lipase de RO imobilizada. Cada reação foi incubada a 37 °C por 30 minutos com inversão. Amostras foram tomadas nos seguintes momentos: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 e 30 minutos. Amostras foram analisadas para DHA e ARA por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC).
[00221] Em cada concentração de lipase de RO imobilizada, o percentual de hidrólise de DHA e ARA aumentou como a quantia de lipase de RO imobilizada aumentou (Figura 27) Estes dados demons- tram a viabilidade do dispositivo de saco de chá para pré-hidrolisar a fórmula com lipase.
EXEMPLO 9: HIDRÓLISE DE TG-DHA E TG-ARA EM FÓRMULA INFANTIL POR LIPASE IMOBILIZADA EM UM CARTUCHO
[00222] Lipase de Rhyzopus oryzae (RO) e lipase de Chromobacterium viscosum (CV) foram imobilizados sobre grânulos de polímero acrílico macroporosos (Immobeads™, ChiralVision). Aproximadamente 200 mg de lipase de RO foram usados por grama de grânulos. Uma amostra de lipase de CV revestida com grânulos foi irradiada (CVI) para determinar o efeito de irradiação sobre a potência de lipase imobilizada. Aproximadamente 1,7 g de cada preparação de grânulo (RO, CV e CVI) foram embalados em colunas com volumes de leito de aproximadamente 5 ml. Fórmula infantil contendo triglicerídeos DHA e ARA foi passada sobre a coluna em uma taxa de fluxo de 75 ml/hr. O eluído da coluna foi analisado para hidrólise de DHA e ARA por HPLC. O percentual de hidrólise de triglicerídeos de DHA e ARA por lipases de CV, de CVI e de RO é mostrado na Tabela 6. TABELA 6: Hidrólise de TG-DHA e TG-ARA usando cartucho de lipase imobilizada
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EXEMPLO 10: LIPASE DE RO VERSUS PANCREATINA
[00223] Lípase de Rhyzopus oryzae (RO) exibiu atividade muito maior em direção aos triglicerídeos de DHA e ARA do que pancreatina suína (Zenpep®), que contém uma mistura de lipases pancreáticas, proteases e amilases. 1,4 ml de fórmula infantil foram misturados com 100 ul (ou pancreatina ou lipase de RO) e 100 ul de cada um dos trigli- cerídeos de DHA e ARA. Reações foram incubadas a 37 °C por 15 mi- nutos. Amostras foram tomadas nos momentos 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 15 minutos e analisadas por RP-HPLC para DHA e ARA. Triglicerídeos de DHA (Figura 28A) e ARA (Figura 28B) foram hidrolisados por lipase de RO ao longo do tempo, mas não foram hidrolisadas por pancreatina.
EXEMPLO 11: ESTUDO DE PORCO DE 6 SEMANAS: ALIMENTAÇÃO A LONGO PRAZO DE PORCOS COM FÓRMULA PRÉ- HIDROLISADA POR LIPASE IMOBILIZADA
[00224] Seis porcos saudáveis e vinte porcos com insuficiência pancreática exócrina (EPI) cirurgicamente induzida (vide Exemplo 5) foram sujeitados a um período de adaptação/controle de duas semanas seguido por um período de teste de seis semanas (Figura 29). Durante o período de adaptação, todos os porcos foram alimentados com fórmula infantil NAN Pro 1 Gold (Nestlé) ("IF"). Durante o período de teste, porcos saudáveis ("Saudável") e seis dos porcos com EPI ("EPI") foram alimentados com fórmula fortificada com TG-LCPUFA (vide Exemplos 5 e 6); sete dos porcos com EPI foram alimentados com fórmula infantil fortificada com TG-LCPUFA que tinha sido pré- hidrolisada com enzima de RO imobilizada usando um dispositivo de "saco de chá" ("EPI+iRO"). Os porcos remanescentes foram retirados do estudo por várias razões, por exemplo, falha para induzir cirurgicamente EPI completa.
[00225] Para pré-hidrólise, 2 litros de fórmula infantil NAN Pro 1 Gold (Nestlé) foram preparados misturando 1,5 litros de água a 37 °C com 500 g de fórmula em pó fortificada com 50 mg/kg de TG-DHA e 10 mg/kg de TG-ARA (vide Exemplo 5, Seção 5.3). Cinco dispositivos com a forma de saco de chá contendo lipase de RO imobilizada sobre grânulos (1 grama de lipase imobilizada em cada "saco de chá") foram adicionados aos 2 litros de fórmula e misturados em temperatura ambiente por 15 minutos usando um agitador magnético em velocidade de mistura constante. Isto corresponde a 9.000 unidades (como medi- do contra azeite de oliva) de lipase de RO imobilizada por 150 gramas de gordura total na fórmula fortificada (60 U/g de gordura total). Antes da hidrólise, a fórmula fortificada continha 17,4 mmol/litro de ácidos graxos esterificados. Após a hidrólise, a fórmula continha 107,6 mmol/litro de ácidos graxos não esterificados.
[00226] O consumo de alimento foi medido diariamente. Amostras de sangue e fezes foram coletadas no final do período de adaptação ("basal") e após 1, 4, e 6 semanas do período de tratamento. Para as amostras basais, fezes foram coletadas por 48 horas (2x24h). Para as amostras das semanas 1, 4 e 6, fezes foram coletadas por 72 horas (3x24h). Na conclusão do período de tratamento, órgãos e tecidos foram coletados para estudos de absorção e segurança.
[00227] A fórmula pré-hidrolisada foi em tolerada sem nenhuma mudança relacionada ao tratamento na ingestão de alimento, crescimento,órgãos (por exame macroscópico) ou bem estar geral. Não houve nenhum desenvolvimento de fígado gorduroso com base no exame macroscópico do fígado quando os porcos foram sacrificados no final do estudo de 6 semanas.
[00228] Após seis semanas, houve um aumento estatisticamente significante nos níveis de ARA (Figura 30A) e DHA (Figura 30B) em eritrócitos (20% e 36%, respectivamente) em porcos com EPI alimentados com fórmula pré-hidrolisada (EPI+iRO), como comparado a porcos com EPI alimentados com a fórmula fortificada com TG-LCPUFA sem pré-hidrólise (EPI) Níveis de ARA e DHA em eritrócitos não se diferiram significantemente entre porcos saudáveis e porcos com EPI alimentados com fórmula pré-hidrolisada por seis semanas.
[00229] Como mostrado na Tabela 7, houve um aumento estatisticamente significante nos níveis de triglicerídeos no plasma, colesterol, HDL e LDL em porcos com EPI alimentados com fórmula pré- hidrolisada por seis semanas. Níveis de triglicerídeos, colesterol, HDL e LDL no plasma não se diferiram significantemente entre porcos saudáveis e porcos com EPI alimentados com fórmula hidrolisada por seis semanas. Tabela 7
Figure img0007
(Todos os valores em mmol/L. Asteriscos indicam p<0,05 para a diferença entre EPI e EPI+iRO.)
[00230] Como mostrado na Tabela 8, porcos alimentados com fórmula pré-hidrolisada por seis semanas tiveram níveis aumentados de vitaminas A e E no plasma, mas nenhuma diferença significante para vitamina D. Houve uma diferença estatisticamente significante (p<0,05) no nível de vitamina E no plasma entre grupos EPI e EPI+iRO. Para vitamina A, houve uma diferença estatisticamente significante (p<0,05) entre os grupos EPI e saudáveis, mas não entre os grupos EPI+iRO e saudáveis. Tabela 8
Figure img0008

Claims (34)

1. Dispositivo para proporcionar uma fórmula nutricional compreendendo monoglicerídeos e ácidos graxos livres pela exposição temporária de uma composição nutricional compreendendo triglicerí- deos de ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa (LC-PUFA) e/ou ésteres de LC-PUFA à lipase antes da ingestão, o dispositivo caracte-rizado pelo fato de compreender: um recipiente definindo um interior para receber a compo-sição nutricional; uma estrutura em comunicação fluida com o interior do recipiente; e pelo menos uma lipase imobilizada de modo que a compo-sição nutricional é exposta a pelo menos uma lipase quando a composição nutricional é recebida dentro do recipiente.
2. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma abertura no recipiente para permitir que a composição nutricional entre no recipiente.
3. Dispositivo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o recipiente compreende ainda uma segunda abertura no recipiente para permitir que a fórmula nutricional saia do recipiente.
4. Dispositivo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a primeira abertura e a segunda abertura são cada configuradas para ligação a um tubo de alimentação.
5. Dispositivo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um tubo de alimentação anexado ao recipiente.
6. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dispositivo é um mecanismo de alimentação ou uma garrafa.
7. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a estrutura compreende partículas dentro do recipiente, preferencialmente em que as partículas compreendem bolas ou grânulos ou em que as partículas são magnéticas.
8. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a estrutura compreende uma superfície interna do recipiente, e/ou em que a estrutura compreende uma parede do recipiente e pelo menos uma lipase está imobilizada na ou contida dentro da parede do recipiente, e/ou em que a estrutura está incluída como parte de um compartimento separado dentro do recipiente.
9. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o recipiente inclui uma abertura, em que a estrutura compreende uma tampa removível do recipiente, em que a tampa é configurada para fechar a abertura quando fixada ao recipiente, e em que a tampa compreende pelo menos uma lipase imobilizada sobre ou dentro da superfície posicionada para contato fluido com o interior quando a tampa fecha a abertura, preferencialmente em que a estrutura compreende uma projeção que se estende de uma superfície da tampa que fica em frente ao interior do recipiente quando a tampa fecha a abertura.
10. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a estrutura compreende projeções dentro do recipiente.
11. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma lipase é encapsulada em um material que é permeável aos ácidos graxos, mas não é permeável à lipase.
12. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma válvula e/ou compreende ainda caminho de fluxo sinuoso configurado para prolongar a exposição da lipase à fórmula contida dentro do caminho de fluxo.
13. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a lipase é selecionada do grupo consistindo em lipase de Chromobacterium viscosum, lipase de Pseudomonas fluorescens, e lipase de Rhizopus oryzae.
14. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a lipase é imobilizada dentro do recipiente de modo que quando a fórmula nutricional sai do recipiente, a lipase permanece no recipiente, preferencialmente em que o dispositivo compreende ainda um material que age como uma tela ou filtro para prevenir a pelo menos uma lipase de sair do dispositivo com a fórmula nutricional.
15. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o recipiente tem paredes que são permeáveis para a composição nutricional porém não são permeáveis para a lipase, ou em que o recipiente tem uma parede interior que define um compartimento no interior e uma parede exterior que define o recipiente, em que a parede interior é permeável para a composição nutricional porém não é permeável para a lipase, e/ou em que o recipiente é compressível.
16. Método para a preparação de uma fórmula nutricional compreendendo LC-PUFAs na forma de monoglicerídeos e ácidos graxos livres antes da ingestão por um sujeito, o método caracterizado pelo fato de que compreende expor uma composição nutricional líquida compreendendo triglicerídeos de LC-PUFA e/ou ésteres de LC-PUFA a uma lipase imobilizada, e, opcionalmente, remover a lipase da composição nutricional líquida após a exposição dos triglicerídeos de LC-PUFA e/ou ésteres de LC-PUFA à lipase, em que a fórmula nutricional está pronta para ingestão por um indivíduo uma vez que a composição líquida nutricional é exposta à lipase e opcionalmente a lipase é removida da composição líquida nutricional.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a lipase é uma ou mais selecionadas do grupo consistindo em lipase de Chromobacterium viscosum, lipase de Pseudomonas fluorescens, e lipase de Rhizopus oryzae.
18. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que os triglicerídeos de LC-PUFA e/ou ésteres LC-PUFA na composição nutricional líquida são expostos à lipase que está imobilizada a uma estrutura sólida e a lipase é removida pela separação da composição nutricional líquida a partir da estrutura sólida.
19. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que expor a composição nutricional líquida compreende passar a composição nutricional líquida através de um recipiente contendo uma lipase imobilizada por ligação covalente a uma estrutura sólida, ou em que expor a composição nutricional líquida compreende passar a composição nutricional líquida através de um dispositivo de alimentação enteral no qual a lipase imobilizada está covalentemente ligada a uma estrutura sólida.
20. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que compreende passar a composição nutricional líquida através de um recipiente, em que a lipase está imobilizada por ligação covalente às partículas contidas dentro do recipiente.
21. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de passar a composição nutricional líquida através de um recipiente compreendendo lipase imobilizada a uma estrutura sólida, em que a fórmula nutricional sai do recipiente passando através de um material que é permeável para a fórmula nutricional, mas não é permeável para a estrutura sólida, e em que, opcionalmente, a fórmula nutricional sai do recipiente através de um tubo de alimentação.
22. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a composição nutricional líquida é exposta à lipase e então separada da lipase por um processo compreendendo a etapa de exposição da composição nutricional líquida a um recipiente contendo lipase imobilizada a uma estrutura sólida, em que pelo menos uma porção da superfície interior do recipiente compreende um material que não é permeável para a estrutura sólida.
23. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a fórmula nutricional preparada é subsequentemente administrada para um sujeito através de um tubo de alimentação, preferencialmente em que o sujeito é uma criança.
24. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a fórmula nutricional compreende mais ácidos graxos livres do que monoglicerídeos após a exposição da composição nutricional líquida à lipase.
25. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a composição nutricional líquida é exposta à lipase por pelo menos 1 minuto antes da ingestão, ou em que a composição nutricional líquida é exposta à lipase por não mais que 30 segundos antes da ingestão, ou em que a composição nutricional líquida é exposta à lipase por não mais que 60 minutos antes da ingestão.
26. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que os LC-PUFAs compreendem um ou mais selecionados do grupo consistindo em DHA, ARA, e EPA.
27. Fórmula nutricional, caracterizada pelo fato de que com-preende LC-PUFAs na forma de monoglicerídeos e ácidos graxos livres preparados pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 16 a 26.
28. Fórmula nutricional de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que os LC-PUFAs compreendem um ou mais LC-PUFAs selecionados do grupo consistindo em DHA, ARA, e EPA.
29. Fórmula nutricional de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a fórmula nutricional compreende não mais do que 0,1 miligrama de lipase por miligrama de LC-PUFA.
30. Fórmula nutricional de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizada pelo fato de que a fórmula nutricional não compreende lipase adicional.
31. Fórmula nutricional de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a fórmula nutricional é uma fórmula infantil.
32. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende a fórmula nutricional como definida na reivindicação 27, para uso em: (a) fornecer nutrição para um sujeito; (b) melhorar a absorção de gordura em um sujeito; (c) reduzir o nível de pelo menos um LC-PUFA selecionado do grupo constituído de DHA, ARA, e EPA nas fezes do sujeito em pelo menos 50%; (d) aumentar o nível de DHA, ARA ou ambos no plasma do sujeito, retina, coração, e/ou eritrócitos; (e) prevenir doença pulmonar crônica em uma criança; (f) melhorar a capacidade cognitiva em um sujeito; (g) aumentar o nível de um ou mais componentes de plasma selecionados do grupo constituído de triglicerídeos, colesterol, HDL e/ou LDL; e/ou (h) aumentar o nível plasmático de pelo menos uma vitamina selecionada do grupo constituído por vitamina A e vitamina E em um sujeito.
33. Composição de acordo com a reivindicação 32, caracteri-zada pelo fato de que o sujeito está sofrendo de insuficiência pancre- ática, saída do pâncreas comprometida, uma redução da capacidade de hidrolisar os triglicerídeos de LC-PUFA ou ésteres de LC-PUFA, ou uma redução da capacidade para absorver os triglicerídeos de LC-PUFA ou ésteres de LC-PUFA.
34. Uso de uma fórmula nutricional como definida na reivindicação 27, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição para: (a) fornecer nutrição para um sujeito; (b) melhorar a absorção de gordura em um sujeito; (c) reduzir o nível de pelo menos um LC-PUFA selecionado do grupo constituído de DHA, ARA, e EPA nas fezes do sujeito em pelo menos 50%; (d) aumentar o nível de DHA, ARA ou ambos no plasma do sujeito, retina, coração, e/ou eritrócitos; (e) prevenir doença pulmonar crônica em uma criança; (f) melhorar a capacidade cognitiva em um sujeito; (g) aumentar o nível de um ou mais componentes de plasma selecionados do grupo constituído de triglicerídeos, colesterol, HDL e/ou LDL; e/ou (h) aumentar o nível plasmático de pelo menos uma vitamina selecionada do grupo constituído por vitamina A e vitamina E em um sujeito.
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