MX2014007183A - Vacunación por medio de levadura recombinante al producir una inmune respuesta humoral protectora contra los antígenos definidos. - Google Patents

Vacunación por medio de levadura recombinante al producir una inmune respuesta humoral protectora contra los antígenos definidos.

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Abstract

La invención se relaciona con las levaduras recombinantes de la especie Kluyveromyces lactis para la producción de una inmunorespuesta humoral contra los antígenos definidos, con la producción de dichas levaduras, y con el uso de las mismas para la vacunación protectora contra los patógenos y las células malignas que contienen dichos antígenos.

Description

VACUNACIÓN POR MEDIO DE LEVADURA RECOMBINANTE AL PRODUCIR UNA INMUNE RESPUESTA HUMORAL PROTECTORA CONTRA LOS ANTÍGENOS DEFINIDOS Campo de la Invención La presente invención se refiere a levaduras recombinantes para la creación de una respuesta inmune humoral contra antígenos definidos, con la producción de estas levaduras y con el uso de las mismas para la vacunación protectora contra los patógenos y las células malignas que contienen estos antígenos.
Antecedentes de la Invención Las vacunas son utilizadas para prevenir enfermedades (vacunas preventivas) o para tratar enfermedades establecidas (vacunas inmunoterapéuticas). En los últimos 100 años, las vacunas preventivas han contribuido significativamente a la reducción de enfermedades infecciosas. Las vacunas inmunoterapéuticas han sido desarrolladas y utilizadas únicamente durante aproximadamente 20 años, por ejemplo contra infecciones persistentes con virus, bacterias o parásitos, o contra enfermedades carcinogénicas. El propósito de la vacunación es inducir una respuesta inmune celular (es decir, transmitida esencialmente por la célula T y NK) y/o humoral (es decir, transmitida esencialmente por célula B/anticuerpo), y una memoria inmunológica hacia los componentes antigénicos de los patógenos o las células malignas (tumorigénicas).
Las vacunas clásicas contienen el patógeno completo en forma atenuada (desactivada) o aniquilada, incluyendo su material genético, ácidos nucleicos en la forma de ADN o ARN. Para su producción, estas vacunas clásicas en su mayoría requieren precauciones de seguridad especial y/o el uso de animales experimentales y/o el uso de cultivos celulares; además, con frecuencia necesitan ser almacenadas y transportadas en forma costosa, con el uso de cadenas frías. Además, implica el riesgo de que las sustancias procedentes de su producción (por ejemplo, del animal experimental o del cultivo celular) ocasionen efectos secundarios en el individuo vacunado, o el surgimiento de reactivaciones no deseadas del patógeno. También existen problemas en el diagnóstico: por lo tanto, por ejemplo, en el caso de la vacunación de ganado, los animales vacunados no pueden ser diferenciadas de los animales infectados naturalmente, de modo que puede fallar el sistema de alerta temprano, el cual está basado en la detección de infecciones recientes. Por lo tanto, se desarrollaron las vacunas denominadas "de subunidad" las cuales únicamente contienen partes del patógeno. Un requisito previo para esto es que se conozcan los "antígenos principales del patógeno particular". Los antígenos principales son casi en tu totalidad componentes de la superficie del patógeno que pueden ser reconocidos por el sistema inmune, por ejemplo, proteínas de la envoltura viral o del cápside del virus. Incluso en la ausencia de una partícula de virus completa, éstos pueden inducir una respuesta inmune humoral y/o celular, y una memoria inmunológica contra el virus, en el huésped. Ya que en la "vacunación de subunidad" faltan los componentes típicos del patógeno, los individuos vacunados pueden ser diferenciados de los naturalmente infectados a través de un diagnóstico diferencial, por lo tanto también se hace referencia a un "vacuna de marcador de subunidad". Las desventajas de muchas vacunas de subunidad con frecuencia son la producción costosa y la inmunogenicidad no adecuada. Aunque los patógenos por si mismos pueden ser cultivados eficientemente (con las limitaciones antes descritas), su antígeno principal debe ser producido mediante diseño genético a través de procesos de alto costo y en su mayoría ineficientes, los cuales además son purificados en forma laboriosa. Por consiguiente, las vacunas de subunidad común con frecuencia son sensibles, tienen que ser almacenadas en refrigeración y tienen baja estabilidad. Por estas razones, una proporción de las vacunas producidas en masa aún están basadas en el principio clásico con patógenos completos. Por ejemplo, la mayoría de las vacunas dirigidas contra la enfermedad en aves a nivel mundial, bursitis infecciosa (IBD), en su mayoría actualmente están basadas en los virus atenuados (debilitados) o inactivos del virus de bursitis infecciosa activado por (IBDV).
Se han hecho intentos para compensar el problema de la inmunogenicidad más débil con vacunas de subunidad a través del uso adicional de adyuvantes. Los adyuvantes son sustancias que se ha descubierto empíricamente que son estimulantes. Refuerzan la respuesta inmune no específica, y con frecuencia en una forma poco comprendida. Por lo tanto, únicamente se aprueban pocos adyuvantes para el uso humano. Los únicos aditivos que son aprobados, por ejemplo, en los Estados Unidos de América, para el uso en personas, son sales de aluminio, hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio. Sin embargo, las formulaciones de sal de aluminio originan problemas adicionales en el almacenamiento de la vacuna correspondiente. Además, estos adyuvantes no exhiben una eficacia adecuada con todos los antígenos.
La producción de ingeniería genética de las proteínas extrañas, que incluyen la mayor parte de las vacunas de subunidad, puede llevarse a cabo en varias células huésped. Así como la bacteria intestinal Escherichia coli, las células de mamíferos que pueden ser proliferadas en cultivos celulares, células de planta y diversos hongos son establecidas como sistemas huésped. Los sistemas microbianos, tales como bacterias y hongos, pueden ser crecidos a gran escala particularmente en forma barata. Las células de levadura de los géneros de levadura, Saccharomyces, Pichia y Kluyvero-myces ya han sido utilizadas rutinariamente durante décadas para la expresión de proteínas extrañas. En comparación con las bacterias, las células de levadura tienen la ventaja de que son eucariotos, es decir, son en muchas formas similares a las células animales, y proteínas eucarióticas, es decir, proteínas que se forman y/o han sido funcionales en células animales, pueden ser producidas en forma barata en levaduras en forma natural o casi natural (Bathurst, 1994; Gellissen & Hollenberg, 1997). Las levaduras fueron las que se utilizaron primero para la producción de las proteínas extrañas, y las proteínas fueron purificadas a partir de células de levadura y utilizadas como vacunas de subunidad. Únicamente en la actualidad, se han hecho intentos de administrar levaduras tal como están, o las fracciones celulares de las levaduras, en forma de vacunas.
Durante aproximadamente los últimos 5 años, se han realizado intentos para utilizar Saccharomyces cerevisiae ("levadura de Baker", S. cerevisiae) tal como está para vacunación: por lo tanto, de esta forma se ha mostrado que las células dendríticas pueden ser activadas y se pueden crear respuestas inmune de células T específicas de antígeno, especialmente respuestas inmune de células T citotóxicas contra ciertos antígenos, mediante la administración subcutáneas de células que expresan antígenos de S. cerevisiae. Esta respuesta inmune celular se encontró como protectora contra la administración en ciertas células de tumor, es decir, después de la vacunación aparecieron menos tumores en los animales vacunados que en los animales de control. Este método actualmente también está siendo probado en aplicaciones inmunoterapéuticas en enfermedades de tumor (Stubbs et al., 2001; Lu et al., 2004).
Las fuentes de la técnica anterior, las cuales se encuentran a continuación y en las cuales se describe una vacunación a base de levadura, son bien conocidas por los expertos en la técnica.
Por ejemplo las Patente Norteamericana Nos. 20090304741, 5830463 y 10738646 y 20070166323 describen el uso de S. cerevisiae que contienen menos un antígeno recombinante en inmunoterapia. Se mostró que estas levaduras son efectivas para estimular una reacción inmune en particular, la reacción inmune trasmitida por la célula. La Publicación Internacional WO/2006/044923 describe una levadura (S. cerevisiae) la cual expresa en forma recombinante varias proteínas del virus de hepatitis C (VHC), y que puede disparar una reacción inmune, principalmente una respuesta de célula T, contra estas proteínas VHC y se pretenden utilizarla como una vacuna contra hepatitis C crónica.
La Publicación Internacional WO/2007/092792 describe el posible uso de S. cerevisiae recombinante contra infecciones de virus de influenza, en donde se utiliza una combinación de diversas cepas de levadura, cuya administración da como resultado la inducción de célula T, es decir, una respuesta inmune celular.
La Publicación Internacional No. WO/2011 /032119 se refiere a un método para mejorar los pacientes la eficacia de una inmunoterapia a base de levadura. El método comprende un agente basado en levadura que modula la producción o la supervivencia de células CD4+ TH17.
En ninguna de las patentes disponibles, se puede demostrar en forma contundente el uso de levadura para la inducción de una respuesta inmune humoral protectora contra enfermedades infecciosas o tumores (el asunto o materia de la presente solicitud). Además, cualquiera de las levaduras S. cerevisiae o Pichia pastoris, son utilizadas, pero no se utiliza Kluyveromyces lactis (el asunto o materia de la presente solicitud).
Igual que S. cerevisiae, la "levadura de leche" Kluyveromyces lactis (K. lactis) también tiene un estado GRAS (GRAS: generalmente considerada como segura), es decir, es adecuada para utilizarse en animales u hombres (van Ooyen et al., 2006). Aunque morfológicamente es muy similar a la levadura para hornear S. cerevisiae, las líneas de evolución de los dos géneros se han desarrollado en diferentes direcciones de un ancestro común, hace más de 100 millones de años. Por lo tanto K. lactis difiere fundamentalmente de S. cerevisiae en muchas propiedades. Algunas de estas diferencias son la mayor importancia para poderse utilizar en aplicaciones biotecnológicas. La evolución de S. cerevisiae, comprendió la especialización del metabolismo en fermentación alcohólica, y por lo tanto, pérdida de muchos genes ancestrales. Sin embargo, la fermentación alcohólica no es típica para la mayor parte de las levaduras. Tiene lugar en S. cerevisiae con altas concentraciones de glucosa, incluso cuando está presente el oxígeno, condiciones en donde la respiración mitocondrial podría realmente permitir una producción de energía mucho más eficiente a partir de la conversión de azúcar: la función de la mitocondria, las "casas de energía" de la célula, se ve en gran parte suprimida por la "represión de glucosa". K. lactis difiere considerablemente de S. cerevisiae en la regulación de la función de la mitocondria (Chen y Clark-Walker, 1995, Clark-Walker, 2007). En contraste con S. cerevisiae, K. lactis pertenece a las levaduras denominadas "negativas de Crabtree". Dichas levaduras, como una regla, no forman etanol bajo condiciones estrictamente aeróbicas, sino más bien a través de la actividad mitocondrial degradan la glucosa completamente a C02 con la formación de ATP. Esta propiedad fisiológica es de importancia fundamental, ya que conduce a un incremento marcado en la producción de biomasa en fermentaciones a gran escala, lo cual da como resultado una marcada disminución en costo en la utilización de estas levaduras como productoras de proteínas recombinantes. Además, los estudios con respecto a K. lactis han mostrado que las mutaciones en la trayectoria de señalización de glucosa transmitida por hexosa quinasa, pueden mejorar la expresión de genes heterólogos (Donnini et al., 2004). La represión de glucosa reducida, especialmente de genes respiratorios, es una característica de las levaduras de "negativa de Crabtree" y pueden ser relacionadas con la mejor expresión de gen extraño observada en forma empírica en dichas levaduras.
K. lactis y 5. cerevisiae también exhiben considerables diferencias en la composición de los glucanos de la pared celular (Backhaus et al., 2011); presumiblemente estas diferencias están basadas en las transferasas de glucosilo diferentes en el aparato de Golgi, que están implicadas en la maduración de glucoproteínas: por lo tanto a las glucoproteínas en S, cerevisiae contienen múltiples fosfatos de mañosa, y las glucoproteínas en K. lactis, principalmente N-acetil-glucosaminas terminales (Raschke y Ballou, 1972). Se asume que estas diferencias entre S. cerevisiae y K. lactis en la glucosilación y secreción de proteínas y en la síntesis de pared celular, tienen una influencia considerable en la ubicación, doblez y estabilidad intracelular, y por lo tanto también en la inmunogenecidad de las proteínas extrañas expresadas en forma heteróloga (Uccelletti et al., 2004).
La Publicación Internacional de WO/2010/054649 describe la producción de un sistema recombinante de K. lactis. En los ejemplos proporcionados en la solicitud, las cepas recombinantes que fueron derivadas de la cepa VAK367-D4 fueron utilizadas para vacunación mucosa u oral contra varios antígenos. Sin embargo, una desventaja de la vacunación oral/mucosa es que las vacunas deben ser utilizadas en grandes cantidades, con el objeto de lograr una inmunización protectora .
Breve Descripción de las Figuras La figura 1, es una representación esquemática de la producción de la cepa de vacuna VAK887, que contiene el gen extraño IBDV VP2, mediante recombinación homologa en la cepa de partida VAK367-D4. Mediante la transformación del plásmido Klp3-MCS (SEQ ID No. 10) el cual contiene el gen VP2 de la cepa IBDV D78, se insertó el gen extraño VP2 mediante recombinación homologa en el locus del gen LAC4 cromosomal, que habia sido destruido mediante inserción del gen URA3. Durante la recombinación en el genoma huésped, el gen URA3 fue reemplazado por el gen VP2 y se restauró el gen LAC4; las cepas de levadura recombinante pueden ser obtenidas mediante selección en un medio de lactosa sin uracilo. Posteriormente, la expresión de LAC4 (ß-galactosidasa) se controla mediante el promotor KIGAL80, y la expresión del gen VP2 a través del promotor LAC4.
La figura 2A muestra la expresión del IBDV VP2 mediante la cepa VAK887 en comparación con la cepa original (VAK367), y en comparación con células de pollo infectadas con IBDV a través de análisis de manchado por Western con un anticuerpo específico de VP2. La figura 2B, muestra el análisis de expresión del IBDV VP2 recombinante y IBDV VP2-T2S mutado en diversas variantes K. lactis que expresan VP2. La variante original K. lactis VP2 (VAK887) expresó únicamente cantidades moderadas de proteína viral. La expresión VP2 puede ser incrementada en la cepa K. lactis VP2-T2S (VAK888) mediante el reemplazo de treonina en la posición de aminoácido 2 de la proteína VP2 con serina. Se podría lograr un incremento adicional incrementando la dosis del gen KIGAL4 (VP2-T2S_GAL4 = VAK890) o a través del uso de un gen sintético VP2 optimizado por codón de levadura (OVP2-T2S = VAK910).
La figura 3, muestra que la desactivación térmica de las levaduras de acuerdo con la presente invención a una temperatura de 90°C durante 2 horas, no conduce a una pérdida de la proteína VP2-T2S recombinante (figura 3A). Las cantidades iguales de proteína de levadura no desactivada, levadura desactivada y levadura de un pelet de alimentación, cada una fueron separadas en un SDS PAGE y se probó en un manchado Western con un anticuerpo anti-VP2 en comparación con los Usados celulares de células de aves que fueron o no infectadas con IBDV. La figura 3 muestra además que la cantidad de VP2-T2S en VAK890 variante es de aproximadamente 0.7 fg de proteína heteróloga por célula de levadura (figura 3B). Aquí, las cantidades definidas de 10 VP2- T2S purificado en comparación con VP2 de un conteo de célula definida de K. lactis (cepa VAK890) crecidas en el fermentador, fueron manchadas en el manchado Western y el resultado se evaluó mediante densitometría.
La figura 4, ilustra la vacunación en ratones con células de levadura completas, inactivadas en forma térmica, administradas en forma subcutánea de la variante K. lactis VAK890 en comparación con la vacunación oral con células de levadura completas de la variante K. VAK890 La figura 4A muestra el esquema de inmunización: la inmunización subcutánea se llevó a cabo tres veces, con una pausa de dos semanas entre ellas; en comparación, se llevó a cabo la alimentación dos veces durante dos semanas. Dos semanas (flecha) después de la última administración de levadura, se probaron las muestras de suero de los ratones tratados con respecto a la presencia de anticuerpos anti-VP2 en un ensayo ELISA específico IBDV (figura 4B) y en un ensayo de neutralización IBDV (figura 4C). La figura 4D resume el hecho de que los ratones que fueron tratados con K. lactis que expresa VP2 (cepa Kl VP2-T2S_GAL4 (VAK890)) exhiben mayores tituladores de los anticuerpos/anticuerpos neutralizantes que los ratones que fueron tratados con K. lactis tipo silvestre (cepa VAK367). Además, se mostró que los ratones que fueron administrados en forma subcutánea con K. lactis (cepa VAK890) exhibieron niveles marcadamente superiores de anticuerpos/anticuerpos neutralizantes que los ratones que fueron alimentados con K. lactis (cepa VAK890). Sin embargo, los ratones que fueron oralmente inmunizados con K. lactis (cepa 890) también mostraron un titulador elevado de anticuerpos/anticuerpos neutralizantes en comparación con ratones que fueron tratados con K. lactis tipo silvestre (cepa VAK367).
La figura 5, muestra la vacunación oral y subcutánea en pollos con células de levadura completas, inactivadas en forma térmica de la variante K. lactis VP2-T2S_GAL4 (VAK890). Para la vacunación oral, se utilizó ya sea un esquema corto 1/1/1/1 (1 semana de alimentación, 1 semana de pausa, 1 semana de alimentación, etc.) o se utilizó un esquema 2/2/2 más largo (figura SA). Después de 1 semana o 2 semanas de pausa respectivamente después de la vacunación, todos los animales tratados fueron infectados con IBDV (cepa Edgar) en una concentración de 100 EID50 por animal (estimulo de virus: barras negras). Después de la vacunación oral, particularmente después del uso del esquema de tratamiento extendido, se pudieron detectar en varios animales tituladores incrementados de los anticuerpos que neutralizan el virus. En contraste con esto, la vacunación subcutánea con K. lactis recombinante creo tituladores de alto nivel de anticuerpos que neutralizan el virus en todos los animales tratados (figuras 5B & C; ensayo de ELISA especifico de IBDV, ensayo de neutralización IBDV).
Ningunos de los animales tratados con la levadura K. lactis recombinante murió después de la infección con IBDV, sin importar que esquema de tratamiento fue utilizado. En contraste con esto, el rango de mortalidad fue del 10 al 35% en el grupo de control (figura SC). El análisis de las lesiones en la bursa de los animales tratados mostraron aproximadamente el 10% de los animales tratados en forma oral después del uso del esquema de tratamiento prolongado, no mostró signo de infección viral después de la inoculación con IBDV: para esto, se utilizó una calificación denominada de "lesiones" - las calificaciones 1 y 2 indican bursas no dañadas en absoluto o solo un poco, las calificaciones 3 y 4 indican bursas dañadas y severamente dañadas. Tal como se muestra, todos los animales en los cuales se administró en forma subcutánea la cepa de K. lactis recombinante VAK890, exhibieron protección completa contra infección de IBDV (figura 5C).
La figura 6, es una representación esquemática de la estructura del vector Klp3-MCS (SEQ ID No. 10).
Descripción Detallada de la Invención La posibilidad de utilizar levaduras recombinantes para la vacunación subcutánea, es conocida por los expertos en la técnica a partir de la técnica anterior: Stubbs et al., (2001) Nat. Med. 7: 625-629; Stubbs y Wilson (2002) Curr. Opin. Mol. Ther. 4: 35-40; Wansley et al., (2008) Clin. Cáncer Res. 14: 4316-4325; Patente Norteamericana No. 5,830,463, Publicaciones Internacionales WO/2006/044923; WO/2007/092792 y WO/2011 /032119. Sin embargo, en los ejemplos prácticos de estas publicaciones, se llevó a cabo el trabajo exclusivamente con la levadura Saecharomyees cerevisiae. La "levadura" es un término colectivo para microorganismos eucarióticos que crecen como células individuales, algunos con propiedades muy diferentes debido a la evolución divergente durante cientos de millones de años (aproximadamente 100 millones de años para S. cerevisiae y K. lactis). Por lo tanto en el uso de S. cerevisiae y K. lactis para propósitos de vacunación en eucariotos mayores, tal como animales u hombres, se asume que una respuesta inmune activada por S. cerevisiae, será marcadamente diferente a una respuesta inmune activada por K. lactis. Esto aplica tanto para la respuesta inmune a antígenos extraños expresados en la levadura, como para la respuesta inmune contra antígenos de levadura endógenos. En el caso de inmunizaciones subcutáneas con células S. cerevisiae completas, se creó la inducción de célula T es decir, una respuesta inmune celular. No se ha confirmado previamente en la técnica anterior, una respuesta inmune humoral, protectora contra un antígeno con S. cerevisiae recombinante en formas simples (por ejemplo, mediante administración directa de una cepa que expresa un solo antígeno).
A partir de los antecedentes presentados anteriormente, el problema fue por lo tanto proporcionar un método con el cual se pueda crear una respuesta humoral, protectora contra antígenos definidos. Un problema adicional, comprendió la producción de una vacuna de marcador de subunidad con la cual sea posible distinguir individuos vacunados, de los que están infectados naturalmente. Un problema adicional, comprendió producir una vacuna de marcador de subunidad que exhiba simultáneamente fuertes propiedades de adyuvante y que por lo tanto sea fuertemente inmunogénica.
Estos problemas fueron resueltos mediante la provisión de un sistema de expresión a base de levadura que permite la integración dirigida de los genes extraños en el genoma de levadura. Las levaduras recombinantes que expresan genes extraños pueden ser producidas rápidamente (es decir, en pocas semanas) con este sistema. Las levaduras pueden ser proliferadas en forma barata en el fermentador en grandes cantidades (por ejemplo, en el rango de kilogramos (kg). Mediante la expresión y fermentación regulada en un proceso de alimentación por lotes, los antígenos citotóxicos también son expresados en este sistema de levadura. Después de la expresión del gen extraño, la levadura es inactivada en forma térmica y posteriormente puede ser almacenada y transportada sin refrigeración en la forma de un polvo. El polvo de levadura puede ser utilizado directamente como una vacuna de marcador de subunidad, es decir, sin fraccionado adicional, ya sea en la forma de una emulsión o como pelet (ver ejemplos prácticos).
La formulación de antígeno y el efecto adyuvante necesario para que sea una inmunización efectiva, es decir protectora, son asegurados por dos factores: (i) por la posibilidad de la modificación genética dirigida de la proteína extraña expresada y (ii) a través de la expresión de la proteína extraña de la levadura y el uso directo de la levadura en forma oral o subcutánea, la propia levadura tiene un fuerte efecto adyuvante. Se prefiere la administración subcutánea. Se produjo una cepa de levadura recombinante ; esto expresa un antígeno viral específico y puede ser utilizado para vacunación subcutánea en el método de acuerdo con la presente invención. Se logró la protección preventiva completa contra una infección por parte del virus. En este proceso, únicamente se utilizaron cantidades muy pequeñas de levadura (por ejemplo, dentro del rango de miligramos (mg) en el caso de uso subcutáneo en aves de corral). Únicamente fueron necesarias de 2 a 3 aplicaciones con el objeto de lograr esta protección.
El método de acuerdo con la presente invención es adecuado para uso tanto en a medicina humana como en el campo de medicina veterinaria. Se prefiere el uso del método de acuerdo con la presente invención, en el campo de la medicina veterinaria.
El método de acuerdo con la presente invención, se lleva a cabo con levaduras. Las levaduras adecuadas son por ejemplo levaduras del género Saccharomyces spec, Pichia spec y Kluyvero-myces spec. En una modalidad preferida, el método de acuerdo con la presente invención se lleva a cabo con levaduras del género Saccharomyces spec. y Kluyveromyces spec. Aquí es particularmente preferido el uso de Saccharomyces cerevisiae y Kluyveromyces lactis.
En la modalidad más preferida, el método de acuerdo con la presente invención se lleva a cabo con la levadura Kluyveromyces lactis.
La levadura K. lactis pertenece a las levaduras denominadas de "grado de alimentación", que tienen un estado GRAS (GRAS: generalmente consideradas como seguras). Igual que las levaduras para hornear, que han sido intentadas y probadas como aditivos para alimentos durante milenios, la levadura K. lactis con frecuencia presente en productos lácteos, también es considerada como inofensiva para la industria alimenticia.
Así como la posibilidad de fermentación explicada bajo la sección de "técnica anterior", la levadura K. lactis tiene numerosas ventajas en comparación con S. cerevisiae con respecto a la expresión de genes heterólogos. K. lactis pertenece a las levaduras denominadas de "negativas pequeñas", esto es, la pérdida de ADN mitocondrial es letal (debido al colapso de la membrana mitocondrial) (Chen et al., 1995; Clark-Walker, 2007). La función mitocondrial se acopla cercanamente a la transmisión de señal dependiente de Ca2+, a la producción de los compuestos de oxígeno reactivos, a la respuesta de tensión de la célula, a la glucosilación de proteína y a la integridad de la pared celular. Como resultado, la función mitocondrial tiene una infuencia decisiva en la producción de las glucoproteínas recombinantes y la composición de la pared celular.
En levaduras y mamíferos, los primeros pasos de la N-glucosilación de proteínas, que tiene lugar en el retículo endoplásmico, son los mismos. Sin embargo, los pasos que tienen lugar en el aparato de Golgi, difieren entre sí. Las transferasas de glucosilo presentes en el aparato de Golgi son diferentes en las diferentes especies de levaduras. Esto da como resultado diferencias en la composición de las glucoproteínas en la pared celular. En K. lactis, las glucoproteínas tienen N-acetilglucosaminas terminales, en contraste con fosfato de mañosa en S. cerevisiae (Raschke y Ballou, 1972). En vacunaciones, esto podría tener efectos considerables en la estimulación del sistema inmune a través de las especies de levadura respectivas.
La secreción incrementada de proteínas recombinantes en mutantes K. lactis con transferasa de a-1 ,6-manosil modificada (KTOCH 1 ) muestra claramente la relación entre la glucosilación/secreción de proteína y la biosíntesis de pared celular (Uccelletti et al., 2004). Además, los cambios en la glucosilación de proteína influencian la localización celular de las proteínas recombinantes que se detienen en la trayectoria de secreción, debido a dobleces incorrectos.
K. lactis es una de las pocas especies de levadura que pueden utilizar lactosa como una fuente de carbono y energía. La lactosa es un azúcar barato que surge en grandes cantidades como un componente de suero (por ejemplo, como un subproducto en la industria de lácteos). K. lactis puede lograr rangos de crecimiento similares con lactosa, como con glucosa. La regulación de los genes implicados en el metabolismo de lactosa ha sido intensamente estudiado. El promotor de (3-galactosidasa fuerte (LAC4), puede ser utilizado para regulación de la expresión de genes heterólogos y la producción de proteínas recombinantes (van Ooyen et al., 2006, Breunig et al., 2000). Debido a la represión de glucosa disminuida, la expresión heteróloga de genes en cultivos K. lactis que son cultivados en medios que contienen glucosa, puede ser inducida en forma rápida y eficiente a través de la adición de lactosa.
De acuerdo con la presente invención, se generó una cepa K. lactis, preferentemente VAK367-D4 y las variantes de esta cepa, que permiten la integración dirigida de los genes extraños en el locus LAC4 del genoma de levadura, a través de métodos de ingeniería genética (figura 1). Esta integración requiere únicamente un paso a través de un plásmido construido en forma adecuada; la selección de cepas recombinantes es posible sin el uso de genes de resistencia a antibióticos, y la expresión de gen extraño en la cepa recombinante puede ser inducida a través del promotor LAC4 mediante la adición de lactosa al medio. Se puede generar K. lactis con genes extraños integrados, y caracterizarse en pocas semanas a través de este método. Ambos aspectos de este sistema son de gran importancia: primero, es posible el crecimiento reproducible de las células de levadura, las cuales en cada caso, contienen cantidades definidas de una proteína extraña (figuras 2 y 3). En segundo lugar, en el caso de uso para vacunación contra antígenos fácilmente variables (tal como por ejemplo el antígeno de influenza, hemaglutinina), se pueden generar nuevas cepas de levadura en poco tiempo, por ejemplo en el surgimiento de nuevas cepas de virus de influenza potencialmente pandémico. Además, existe una alta probabilidad de que las cepas K. lactis recombinantes recientemente generadas, tengan propiedades similares a las cepas probadas (por ejemplo, con respecto a su comportamiento de crecimiento en el fermentador).
Además, a través de la integración adicional de los genes del transactivador K1Ga14 en el genoma de levadura, se puede incrementar significativamente el rango de expresión del gen extraño (Kuger et al., 1990). En una modalidad adicional, el método de acuerdo con la presente invención se lleva a cabo con una cepa de K. lactis, especial VAK367-D4 y los derivados de los mismos. Se generó una serie de (VAK) variantes recombinantes con base en la cepa K. lactis VAK367-D4. En general, estas variantes expresan en forma inducible cantidades significativas de una proteína extraña, o los dominios de esta proteína extraña, o los dominios de esta proteína extraña fusionada con dominios de proteína extraña para las especies. Los dominios de proteína extraña utilizados, sirven para estimulación específica de la respuesta inmune (adyuvante) o la compartimentación específica de la proteína expresada en la célula de levadura. Junto con los efectos adyuvantes, la compartimentación de la proteína extraña expresada es importante para la optimización de expresión y la formulación del producto de expresión.
En una modalidad adicional, el método de acuerdo con la presente invención se lleva a cabo con VAK367-D4 y los derivados de la misma en la aplicación como una vacuna de marcador de subunidad. El uso de K. lactis recombinante, que expresa únicamente antígenos de proteína definidos (proteínas extrañas) como una vacuna en un diagnóstico diferencial, permite la diferenciación de individuos vacunados, de los que están infectados naturalmente. Una de estas cepas K. lactis recombinantes (ver ejemplos prácticos) fue utilizada con éxito para vacunación oral y subcutánea. Con la administración subcutánea, se obtuvo la protección completa de los individuos vacunados.
En el sentido de la presente invención, las "proteínas extrañas" significan todas las proteínas, polipéptidos y proteínas que sean adecuadas para crear una respuesta inmune protectora, preferentemente una respuesta inmune humoral protectora en hombres o en animales contra un patógeno o células degeneradas en forma carcinogénica. Las proteínas extrañas pueden derivarse de patógenos o tumores de cualquier clase para la cual se hayan caracterizado los antígenos, los cuales tienen la capacidad solos, de inducir una respuesta inmune protectora, preferentemente una respuesta inmune humoral protectora.
En una modalidad preferida, las proteínas extrañas se derivan de patógenos (virus, bacterias o parásitos) para los cuales se han caracterizado antígenos, los cuales tienen la capacidad, solos, de inducir una respuesta inmune protectora, preferentemente una respuesta inmune humoral protectora: Estas son por ejemplo: Proteínas extrañas que se derivan de parásitos Necator americanus, Ancilostoma duodenale: proteína ASP, proteasas de degradación de hemoglobina Leishmania: gp63, antígeno promastigote 46 kD, LACK Plasmodium: proteína CSP, CSA-1, CSA-3, EXP 1 , SSP2, STARP, SALSA, MSP1, MSP2, MSP3, AMA-1 , GLURP, Pfs25, Pfs 28, Pvs25, Pvs 28, Pfs 48/45, Pfs 230 Schistosoma: TP1, Sm23, ShGSTs 26 y 28, paramiosina, miosina de parásito, Sm14.
Proteínas extrañas que se derivan de bacterias Mycobacterium tuberculosis: Ag85A, Hsp65, R8307, 19 kD, 45 kD, 10.4 Heliobacter pilori: VacA, LagA, NAP, hsp, ureasa, catalasa Grupo A Strepptococcus: M, peptidasa de SCPA, exotoxinas SPEA y SPEC, proteína de enlace de fibronectina Streptococcus pneumoniae: PspA, Psa A, BHV 3, BHV 4 Salmonella typhimurium: antígeno Vi Shigella: LPS Vibrio choleras: CTB Escherichia coli ETEC: LT, LT-ST, CTB Yersinia pestis: F1, V Proteínas extrañas que se derivan de células de tumor/tumores (antí enos asociados con tumor, TAA) CEA 5T4 MUG1 MARTI HER-2 Las proteínas extrañas que se derivan de virus son las particularmente preferidas Calciviridae (Norwalk, HEV): NV 60 kD, HEV ORF2 Reoviridae (Rota): VP7, VP4 Retroviridae (HIV): Gag, Pol, Nef, Env, gp160, gp120, gp140, gp41 Flaviviridae (género Flavivirus: WNV, dengue, YF, TBE, JEV): pre -Env, NS3, NS4, NS5 Flaviviridae (género Pestivirus BVDV, CSFV, BDV. género Hepacivirus VHC): E1, E2, EARN (Pesti), C, NS3, NS4, NS5 Hepadnaviridae (HBV): antígeno HBS Paramyxoviridae (Paramyxovirinae: PIV-1, PIV-2, paperas, Sendai, PIV-2, PIV-4, morbilli): , HN, N, F Paramyxoviridae (Pneumovirinae: RSV): F, G, SH, M Rhabdoviridae (rabia): G Herpesviridae (EBV, HSV2): gp350/220 (EBV), gB2, gD2 (HSV) Coronavíridae (SARS): CoV, N , M, S Orthomyxoviridae (influenza A, B): HA, NA, M1, M2, MP Papillomaviridae: L2, E6, E7.
En la modalidad más preferida de la presente invención, las proteínas extrañas se derivan de miembros de la familia Birnaviridae, tal como por ejemplo los virus IBD, y tienen la capacidad de inducir una respuesta inmune protectora, preferentemente una respuesta inmune humoral protectora. En una modalidad preferida de la presente invención, se creó una variante K. lactis VAK367-D4 VP2 (VAK887) en la forma de una proteína extraña que expresa el antígeno VP2 que forma cápside del virus de bursitis infecciosa (IBDV cepa D78) (SEQ ID Nos.: 1 y 2). Particularmente preferida es una variante K. lactis VAK367-D4 VP2-T2S (VAK888) en donde la proteína VP2 ha sido mutada en la posición de aminoácido 2 (reemplazo de treonina por serina; Jagadish et al. 25 (1991)) y que tiene la secuencia de nucleótido y aminoácido de acuerdo con SEQ ID No.3 y 4 respectivamente.
En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, se creó una variante K. lactis VAK367-D4 optimizada, VP2T2S_GAL4, en donde la proteína VP2 fue mutada en la posición de aminoácido (SEQ ID No. 3 y 4) y contenía adicionalmente al menos dos genes KIGAL4 (VAK890). Particularmente preferida es una variante K. lactis VAK367-D4, OVP2-T2S, en donde el antígeno VP2 mutado es codificado por la secuencia de ácido de nucleótido optimizado por codón de levadura con la SEQ ID No. 5 y tiene la secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID No. 6 en el antígeno VP2 expresado en forma recombinante. La variante K. lactis oVP2-T2S_GAL4 optimizada (VAK911) tiene la siguiente ventaja: - la proteína extraña es adicionalmente estabilizada a través de la mutación - se puede lograr un incremento marcando una expresión de VP2 a través de la sobreexpresión del transactivador y/o mediante optimización de codón de la secuencia (figura 2). - la integración de los genes KIGAL4 adicionales también se correlaciona con un mayor rango de crecimiento de esta variante K. lactis. - esta variante K. lactis exhibe una capacidad de reproducción particularmente alta en fermentación de alta densidad celular y en la cantidad de proteína VP2 expresada (figura 3).
La variante K. lactis VP2-T2S_GAL4 creada de acuerdo con la presente invención, la cual como proteína extraña expresa recombinantemente el antígeno VP2 mutado de IBDV y contiene copias adicionales del gen transactivador KIGAL4, (VAK890) fue depositada el 29 de noviembre de 2011 en la Germán Collection de Microorganisms and Cell Cultures (Recolección de Microorganismos y Cultivos Celulares de Alemania), GmbH, DSMZ, Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig, Alemania, de acuerdo con el Tratado de Budapest bajo el número DSM 25405.
La variante K. lactis OVP2T2S creada de acuerdo con la presente invención, la cual, como proteína extraña expresa recombinantemente el antígeno VP2 mutado y optimizado por codón de IBDV (VAK910), fue depositada el 29 de noviembre del 2011 en the Germán Collection de Microorganisms y Cell Cultures (Recolección de Microorganismos y Cultivos Celulares de Alemania) GmbH, DSMZ, Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig, Alemania de acuerdo con el Tratado de Budapest bajo el número DSM 25406.
La variante K. lactis OVP2-T2S, creada de acuerdo con la presente invención, la cual, como proteína extraña expresa recombinantemente el antígeno VP2 mutado y optimizado por codón de IBDV y que contiene copias adicionales del gen transactivador KIGAL4 (VAK911), se depositó el 29 de noviembre del 2011 en the Germán Collection de Micro-organisms y Cell Cultures (Recolección de Microorganismos y Cultivos Celulares de Alemania) GmbH, DSMZ, Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig, Alemania, de acuerdo con el Tratado de Budapest bajo el número DSM 25407.
Una modalidad adicional se refiere al uso de levaduras recombinantes de acuerdo con la presente invención, en un método para la creación de una inmunización protectora, en particular una inmunización humoral protectora.
Dicho método comprende los siguientes pasos: a) crecimiento y proliferación de las levaduras recombinantes de acuerdo a la presente invención, b) recolección y desactivación de las levaduras, c) administración de las levaduras recombinantes de acuerdo con un esquema de inmunización que será especificado, d) determinación del titulador de los anticuerpos formados y/o e) detección de la inmunización.
El crecimiento y proliferación de las levaduras recombinantes de acuerdo con la presente invención, se puede llevar a cabo con cualquier método convencionalmente disponible. En la presente invención, los métodos particularmente preferidos, son los que en forma barata, dan como resultado altos rendimientos celulares. Éstos incluyen métodos de fermentación, en particular métodos de fermentación de alta densidad celular. Se ha descubierto como particularmente conveniente, llevar a cabo la fermentación utilizando un protocolo de fermentación de alimentación por lotes.
En una modalidad preferida, la inmunización humoral, protectora se logra administrando la levadura recombinante en forma oral/mucosa o subcutánea. En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, las levaduras recombinantes se administran en forma subcutánea. Particularmente preferido en el método de acuerdo con la presente invención, es el uso de K. lactis, especialmente las variantes genéticamente modificadas VAK367-D4 y la variante VAK890 derivada de las mismas, y las variantes de las mismas para administración subcutánea.
Las células de levadura recombinante deben ser utilizadas en el método de acuerdo con la presente invención desactivadas/aniquiladas. Para esto, después del crecimiento y la expresión de los genes extraños, las levaduras se secan y posteriormente se desactivan. La desactivación puede llevarse a cabo con cualquier método con vencionalmente disponible. Particularmente adecuado para el uso en el método de acuerdo con la presente invención, es desactivación térmica (por ejemplo, desactivación térmica durante 2 horas a una temperatura de 90°C).
Para la vacunación oral/mucosa, por ejemplo, se puede utilizar un esquema de inmunización 1/1/1/1 corta (1 semana de alimentación, 1 semana de pausa, 1 semana de alimentación, etc.) o un esquema más largo 2/2/2 (2 semanas de alimentación, 2 semanas de pausa, 2 semanas de alimentación, etc.)- Para la vacunación subcutánea, se puede utilizar por ejemplo una administración doble o triple en intervalos de dos semanas cada una (figuras 4 y 5).
Para la detección de la inmunización realizada, están disponibles todos los métodos convencionales. En una modalidad de la presente invención, para la detección de la inmunización, se prueba el títulador de los anticuerpos que neutralizan el virus. Para esto, por ejemplo, se pueden llevar a cabo pruebas ELISA o ensayos de neutralización específicos. En el ensayo de neutralización, se trata un número definido de IBD con un volumen definido de suero de un animal inmunizado o un animal de control. Posteriormente, se prueba la inhibición de la infección (neutralización) a través de los virus tratados de esta forma en el cultivo celular. También es posible revisar si una inmunización fue exitosa en un experimento de "estímulo", por ejemplo en un experimento de "estímulo de virus". Para esto, se administra a los animales tratados una dosis de un microorganismo patogénico o virus que normalmente podría conducir a la enfermedad en animales no inmunizados. Si los animales no se enferman después de dicho estímulo, queda demostrada la inmunización exitosa (figura 5). Finalmente, la inmunización también puede ser detectada mediante inmunohistoquímica. Para esto, después del estímulo, se verifican los órganos objetivo del patógeno con respecto a infección o lesión (figura 5).
De acuerdo con la presente invención, se mostró que las variantes K. lactis recombinantes, las cuales cada una se derivaron de VAK367-D4, pueden ser utilizadas con éxito para vacunación mediante administración subcutánea. La variante de la cepa VAK890, descrita en los ejemplos prácticos, expresa el antlgeno VP2 del virus de bursitis infeccioso (IBDV: cepa D78). El IBDV VP2 es una proteína que forma cápside. Se sabe a partir de VP2, que la activación de una respuesta inmune humoral para este antígeno, es suficiente para proteger en forma preventiva un organismo infectado contra una infección subsecuente a través del virus en cuestión (IBDV). La generación de una respuesta inmune humoral efectiva, por una parte, puede ser indexada por la cuantificación de los anticuerpos que neutralizan el virus. Por otra parte, se llevó a cabo la detección de una respuesta inmune protectora a través de un "experimento del estímulo del virus" e inmunohistoquímica después del estímulo del virus. Por lo tanto fue posible, de acuerdo con la presente invención, establecer el K. lactis recombinante, o K. lactis recombinante con base en la cepa VAK367-D4, en aplicaciones subcutáneas como una vacuna de acción efectiva, es decir protectora del 90 al 100% (del 90 al 100% corresponde a "estándar de oro" en vacunación) (figuras 4 y 5). La K. lactis recombinante, o K. lactis recombinante con base en la cepa VAK367-D4, fue establecida de esta forma como una vacuna de marcador de subunidad contra patógenos tales como por ejemplo virus. Esto significa que una subunidad de proteína inmunogénica, individual de un virus, fue utilizada como el antígeno. El uso como vacuna de marcador de "subunidad" implica que su uso permite la diferenciación de organismos vacunados y los infectados, no vacunados. Esto es posible por ejemplo, a través de un método de diagnóstico diferencial que detecta anticuerpos contra el antígeno utilizado para la vacunación, así como anticuerpos contra un antígeno adicional del patógeno infeccioso. A través de la inmunización con la cepa K. lactis recombinante AK890 (DSM 25405), comenzando a partir de la cepa VAK367-D4, fue posible crear tituladores de anticuerpo de alto nivel contra el antígeno viral correspondiente. Para estos anticuerpos, se puede mostrar que son neutralizantes de virus. Puede deducirse empíricamente a partir de esta propiedad y el titulador de alto nivel medido, que está respuesta inmune humoral es suficiente para proteger a un organismo contra infección subsecuente con el virus en cuestión, se puede obtener una prueba final para IBDV. En el modelo de pollo, el titulador de alto nivel de los anticuerpos que neutralizan el virus creado, se correlacionó con protección total de los animales vacunados contra una infección de virus subsecuente (figura 5).
El uso de K. lactis, especialmente de una variante genéticamente modificada, VAK361 -D4 y los derivados de la misma, tal como por ejemplo K. lactis VP2-T2S_GAL4 (VAK890) tienen las siguientes ventajas significativas en comparación con los métodos convencionales: 1. Para utilizarse para la expresión del gen extraño, K. lactis tiene ventajas significativas, fundamentales en comparación con S. cerevisiae, que se basan en la fisiología de la separación de K. lactis de S. cerevisiae durante millones de años. 2. La expresión del gen extraño no ocurre a través de vectores de plásmido si no después de la integración dirigida y estable del gen extraño en un locus de gen definido del genoma K. lactis. Esto permite una alta capacidad de producción de la expresión de proteína bajo condiciones no selectivas. Este aspecto es esencial para la creación reproducible de la vacuna, mediante el cultivo de la cepa de levadura en el fermentador. El principio de la cepa VAK367-D4 y los derivados de la misma, ya ha sido descrito para una vacunación oral (WO 20101054649 A2). En la presente invención, se mostró que la cepa VAK367-D4 y los derivados de la misma, en particular K. lactis VP2- T2S_GAL4 (VAK890) y oVP2-T2S_GAL4 (VAK911) en vacunación subcutánea con el uso de cantidades considerablemente menores de levadura, da como resultado una protección efectiva en infecciones de virus. 3. La expresión de gen es inducible y puede ser incrementada en forma adicional incrementando la concentración del activador de transcripción Ga14 y/o mediante optimización de codón de la secuencia de nucleotido del gen extraño para que corresponda con el receptor de levadura. El establecimiento de un protocolo de fermentación de alimentación por lotes, permite producción eficiente, incluso de los antígenos citotóxicos. 4. La integración del gen extraño en VAK367-D y los derivados de la misma 4, es un "procedimiento de un paso".
Esto significa que aproximadamente en 3 semanas se puedan crear y caracterizar nuevas cepas recombinantes; esto es particularmente importante para el desarrollo rápido de vacunas eficientes contra variantes de virus modificadas. 5. A través de administración subcutánea de la levadura recombinante del tipo K. lactis, especialmente la levadura recombinante de la cepa VAK367-D4 y los derivados de la misma, se puede crear una respuesta inmune protectora tanto en ratón como en pollo. El procedimiento es extremadamente simple: se inyecta una cantidad definida de células de levadura desactivadas (aniquiladas con calor) en el animal vacunado bajo la piel en un procedimiento de dos a tres veces. Dos semanas después de la última aplicación, se prueba el suero del animal vacunado con respecto a la presencia y funcionalidad de los anticuerpos específicos del antígeno. A través de las pruebas de neutralización del virus, se puede mostrar que esta respuesta inmune estuvo basada predominantemente, si no es que en forma exclusiva, en la creación de anticuerpos de neutralización (respuesta inmune humoral protectora). Por lo tanto, la respuesta inmune inducible por K. lactis en aplicación subcutánea, difiere fundamentalmente de la respuesta inmune inducible por S. cerevisiae, la cual principalmente induce una respuesta de célula T. Por lo tanto, las posibilidades para el uso subcutáneo de K. lactis son fundamentalmente diferentes a las posibilidades para el uso subcutáneo de S. cerevisiae : aunque K. lactis se puede utilizar como una variedad de vacuna de subunidad en el caso de antígenos que puede crear una respuesta inmune humoral protectora (por ejemplo, antígenos virales tal como el antígeno VP2 de virus de bursitis infeccioso, IBDV, o el antígeno de hemaglutinina HA del virus de influenza), entonces se puede utilizar S. cerevisiae como una vacuna de subunidad en el caso de antígenos que pueden crear una respuesta inmune celular protectora (tal como por ejemplo, con la proteína NS3 del virus de hepatitis C o antígenos de tumor, tales como Her-2). Estas diferencias en la forma de la respuesta inmune inducida, son atribuibles presuntamente a las propiedades muy diferentes de las células S. cerevisiae y K. lactis las cuales se describieron anteriormente.
En síntesis, la presente invención hace una extensa contribución a la técnica, y proporciona muchas modalidades convenientes, en comparación con la técnica anterior: • los inventores tuvieron éxito en producir vacunas de marcador de subunidad con las cuales es posible distinguir individuos vacunados de los que están infectados naturalmente. · además, las vacunas de marcador de subunidad pueden ser producidas de modo que tengan simultáneamente propiedades adyuvantes de alto nivel, y por lo tanto sean fuertemente inmunogénicas. • las vacunas de marcador de subunidad de acuerdo con la presente invención se pueden aplicar en forma repetida. • las vacunas de marcador de subunidad de acuerdo a la presente invención crean una respuesta inmune protectora sistémica y memoria inmunológica en el animal vacunado. • con la presente invención también es posible producir vacunas contra antígenos citotóxicos. • el método de acuerdo con la presente invención, permite la creación más rápida posible, de nuevas variantes de vacuna. • los métodos de vacunación son, en particular, muy baratos. · para la producción de las vacunas de acuerdo con la presente invención, no son necesarios animales experimentales ni el uso de células animales o humanas en el cultivo. • las vacunas de acuerdo con la presente invención no son sensibles a la temperatura, se pueden transportar y almacenar sin refrigeración. • en el método de acuerdo con la presente invención, no se utilizan células u organismos recombinantes vivos. • con el método de acuerdo con la presente invención, es posible restringir tanto las cantidades de vacuna utilizadas, como el número de las aplicaciones que son necesarias para lograr la inmunización protectora a un nivel mínimo.
Ejemplos Prácticos 1. Creación de la cepa K. lactis VAK367-D4 (metA ura3-5 lac4::ScURA3).
La cepa de partida VAK367 para la expresión heteróloga de proteínas extrañas tienen las siguientes propiedades: permite cultivo en alta densidad, sin que las proteínas intracelulares sean liberadas en el proceso en forma detectable. A este respecto, esta cepa difiere de muchas cepas K. lactis relacionadas en forma cercana. La cepa VAK367 fue derivada de la cepa CBS 2359 (Centraalbureau voor Schimmelcultures http://www.fungalbiodiversitycentre. com) a través de dos vueltas de mutagénesis y es auxotrófica para la metionina de aminoácido y el uracilo de nucleobase. La cepa VAK367-D4 (depositada el 18.11.2009 en el Germán Collection de Microorganisms and Cell Cultures (Recolección de Microorganismos y Cultivos Celulares de Alemania) GmbH, (DSMZ) en Braunschweig bajo el número de depósito DSM 23097) fue derivada de la cepa VAK367 mediante métodos de ingeniería genética, reemplazando la secuencia +358 a +1181 del gen LAC4, por el gen ScURA3 por medio del plásmido pD4-2. La cepa VAK367-D4 ahora permite la integración de los genes extraños en el locus LAC4 sin marcadores adicionales, ya que se seleccionó para el crecimiento de lactosa. Al mismo tiempo, con el uso de un vector de integración adecuado, tal como por ejemplo Klp3-MCS (figura 6), el cartucho de interrupción es reemplazado por recombinación homologa, de modo que se reconstituye un gen LAC4 intacto con la pérdida del marcador ScURA3 (figura 1). 2. Creación de un vector de integración que permite la expresión inducible de genes extraños.
Vector: Klp3-MCS (SEQ ID No.10).
El vector Klp3-MCS (SEQ ID No. 10) (figura 6) es un vector E. coli basado en YRp7 que no puede replicarse en forma autónoma en levaduras, ya que se ha eliminado la secuencia ARS1. Klp3- CS (SEQ ID No. 10) contiene el promotor K. lactis LAC4 y las secuencias que permiten la integración en el locus LAC4 mediante recombinación homologa.
Entre el promotor LAC4 y el inicio de transcripción, se insertó un segmento de ADN que contiene el terminador TEF1 y el promotor KIGAL80. Como resultado, el cuadro de lectura LAC4 después de la reconstitución mediante recombinación homologa puede ser expresado bajo el control del promotor KIGAL80. El promotor KIGAL80 se regula junto con el promotor LAC4a través del factor de transcripción, KIGal4 (Zenke et al., 1993). Está construcción hace posible monitorear la inducción de la expresión del gen extraño a través de la medida de la ß-galactosidasa codificada por LAC4. Klp3-MCS (SEQ ID No. 10) permite la inserción del gen extraño entre el promotor LAC4 y el terminador TEF1 a través de uno de los sitios de disociación únicos en el sitio de clonación múltiple (MCS) (figura 6). Para la integración, el plásmido resultante fue digerido con enzimas de restricción adecuadas, de modo que el cartucho de expresión se separa de las secuencias de vector E. coli. Después de la transformación en K. lactis VAK367-D4, el cartucho de expresión se integra en forma cromosomal; las cepas resultantes no contienen secuencias bacterianas. 3. Variante K. lactis que expresa el antígeno VP2 del virus de bursitis infecciosa (IBDV variante D78).
Producción de la cepa de levadura recombinante El cADN que codifica para el IBDV D78 VP2 fue amplificado del pD78A del plásmido (Icard et al., 2008) por medio de los siguientes oligonucleótidos: IBDV_Ascl_fwd (5'-GGCGCGCCGATGACAAACCTGCAAGATC-3') (SEQ ID No.7), que contiene un sitio de restricción AscI, y VP2_Notl_rev. (5'-ATAAGAATGCGGCCGCTCACACAGCTATCCTCCTTATG-3') (SEQ ID No.8), que contiene un sitio de restricción Notl.
Para la generación de VP2-T2S, se utilizó el siguiente oligo-nucleótido: IBDV_S: T_Ascl_f wd (5'- GGCGCGCCGATGTCTAACCTGCAAGATCAAA CCCA-3') (SEQ ID No. 9) y VP2_Notl_rev (ver anteriormente).
Después de verificar y confirmar las secuencias de nucleótido, se clonaron los fragmentos de ADN amplificados de esta forma en el vector Klp3-MCS (SEQ ID No.10) (figura 6) a través de los sitios de disociación AscI y Notl. Después de esto, se efectúa la integración en el genoma (figura 1). Con detalle, el plásmido de integración fue digerido con la enzima de restricción EcoRI y los fragmentos digeridos fueron transformados en células VAK367-D4 competentes. Las células transformadas se revistieron en el medio YEPD y se incubaron durante la noche a una temperatura de 30°C. Para la detección de colonias positivas, la placa de transformación se duplicó en el medio SM que contiene lactosa como la fuente de carbono, y se incubó durante 2 días a una temperatura de 30°C. Los clones positivos identificados a través de este método fueron investigados en forma adicional. La integración genómica de las copias del gen KIGAL4 adicional, se llevó a cabo a través de un método convencional (Kuger et al. (1990)). La optimización de codón estuvo seguida de un algoritmo de Saccharomyces cerevisiae (mr.gene.com, Raab et al., 2010). Los fragmentos de ADN optimizados por codón fueron sintetizados directamente. En la síntesis, los sitios de restricción 5' AscI y 3' Notl ya estaban incorporados (mr.gene.com, Regensburg, Alemania). Posteriormente se llevó a cabo la clonación en el vector Klp3-MCS (SEQ ID No.10). xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx X Análisis de manchado Western Se resuspendieron los pelets celulares en el amortiguador B60 (50 mM HEPES-KOH pH 7.3; 60 mM acetato de potasio, 5 mM acetato de magnesio, 0.1% Tritón X100, 10% glicerol, 1 mM fluoruro de sodio, 20 mM fosfato de glicerol, 10 mM MgCI2, 1 mM DTT, inhibidor completo de proteasa (Roche)) y se Usaron mediante mezclado vigoroso con gránulos de vidrio. El extracto fue centrifugado (14,000 rpm, 20 mins en 4°C) y se determinó la concentración de proteína. Se separaron en un gel al 12%, 40 pg del extracto de proteína mediante SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron posteriormente en una membrana. Se llevaron a cabo análisis de manchado Western con un antisuero a-IBDV de conejos (1:15,000, Granzow et al., 1997) y un anticuerpo acoplado con HRP de cabra-anticonejo (1:3,0-00, Santa Cruz Biotechnology Inc.) utilizando métodos convencionales.
Análisis de manchado Northern Para la extracción total del ARN, se enfriaron sobre hielo 5 mi de un cultivo de levadura. El análisis celular se llevó a cabo con agitación vigorosa con gránulos de vidrio, en amortiguador de Proteinasa K (100 mM Tris/HCI pH 7.9, 150 mM NaCI, 25 mM EDTA, 1% SDS) y 50 mg de proteinasa K (Fermentas). Las muestras se incubaron durante 1 hora a una temperatura de 35°C y el ARN extraído se precipitó con etanol y se resuspendió en agua DEPC. Se llevó a cabo el análisis Northern como se describe en la Publicación de Engler-Blum et al., 1993, pero con algunas diferencias. Se separaron 5 pg del ARN total en formaldeh ído-gel de agarosa al 1% y se transfirieron en una membrana de nylon (Amersham HybondTM-N + , GE Healthcare). La membrana se incubó a una temperatura 68°C con una sonda de ARN marcada con DIG que se produjo a través de transcripción in vitro de los fragmentos PCR en la presencia de DIG (Digoxigenin)-NTPs (Roche). El manchado se trató con una solución de bloqueo y se incubó con un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina anti-DIG (Roche). La determinación de la actividad de fosfatasa alcalina se determinó a través de medios convencionales.
Cuantificación de VP2 expresada en forma heteróloga Se utilizó un protocolo modificado de acuerdo con la Publicaciónde Saugar et al., 2005. Se cultivaron durante la noche 2,000 ODU de un cultivo de levadura que había sido transformado con un plásmido VP2 episomal (pADHI-P_VP2-T2S) en un medio selectivo (0.67% YNB, 2% de glucosa y las siguientes adiciones: 11 mg/1 Ade, 14 mg/1 Tyr, 38 mg/1 cada uno de His, Trp, Arg y Met, 48 mg/1 Phe, y 58 mg/1 cada uno de Leu; lie, Lys, Val y Thr). Después de la recolección y lavado con agua destilada, las células se desintegraron con gránulos de vidrio en amortiguador de lisis (10 mM Tris (pH 8.0), 150 mM NaCI, 20 mM Cal2, 1 mM EDTA, inhibidor completo de proteasa (Roche), pH 8.0). El extracto de proteína resultante se centrifugó (10,000 g durante 1 hora a una temperatura de 4°C) y la fracción soluble se colocó en capas en un colchón de sucrosa al 20% (p/v) en amortiguador de sucrosa (10 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCI, 20 mM CaCI2, que contiene inhibidor completo de proteasa (Roche)). Después de la centrifugación en 170,000 g durante 3 horas a una temperatura de 4°C, el pellet se disolvió en 200 µ? de amortiguador de sucrosa y se centrifugó durante 17 horas adicionales en 114,000 g en un gradiente de sucrosa del 20 al 53% en amortiguador de sucrosa. El gradiente se recolectó en fracciones de 700 µ? y se analizó mediante SDS-PAGE y manchado Western. Los complejos de proteína oligoméricos de VP2 expresados en forma heteróloga, pueden ser concentrados y purificados de esta forma. La proteína puede ser detectada y la cantidad de proteína determinada mediante SDS PAGE y manchado Coomassie en comparación con una proteína estándar (no mostrada). El VP2 purificado de esta forma se utilizó posteriormente como estándar en el manchado Western comparativo con anticuerpos anti-VP2. Se comparó el contenido VP2 de un número definido en células de levadura de diferentes fermentaciones (figura 3). Fermentación de levadura y desactivación térmica Todas las fermentaciones experimentales se llevaron a cabo en un sistema de bioreactor paralelo DasGip (DasGip AG, Jülich, Alemania) con cuatro fermentadores de 2L completamente equipados. Las fermentaciones en la escala de producción se llevaron a cabo mediante Organobalance GmbH (Berlín, Alemania) o en nuestro laboratorio en un bioreactor Biostat ED (B. Braun Biotech, Melsungen, Alemania) con un volumen de operación de 10L. Todos los procesos de producción se llevaron a cabo a través del método de alimentación por lotes. Se utilizó un medio de cultivo complejo que contiene 2% de extracto de levadura y 1% de peptona y 20% de solución de alimentación de lactosa. La temperatura del cultivo de levadura se mantuvo a una temperatura de 30°C y se controló el p02 en una saturación al 30%. El pH se mantuvo en 5.0 durante la fermentación mediante la adición de 2 NaOH o 2M H3P04.
Para los experimentos, in vivo en ratones y pollos, las levaduras fueron secadas por congelación y posteriormente desactivadas en forma térmica durante 2 horas a una temperatura de 90°C. A través del uso de este proceso, fueron viables menos de 10 células por gramo de peso seco de célula. 4. Administración subcutánea en ratones Para la administración subcutánea en ratones de una variante K. lactis que expresa el antígeno VP2 del virus de bursitis infecciosa (IBDV variante D78) (VAK890), se mezcló la levadura seca y pulverizada con adyuvante Freund completo (CFA) para la primera aplicación, y en las aplicaciones adicionales se mezcló la levadura con adyuvante Freund incompleto adyuvante (IFA) (100 pg de material de levadura por 200 µ? de CFA o IFA). Se inyectaron 200 µ? de las emulsiones (con 100 pg contenido de levadura) por individuo o por inmunización/refuerzos. Por lo tanto la cantidad de VP2 administrada por administración subcutánea a un ratón individual, correspondió aproximadamente a 18 ng (figura 3). Después de la inyección inicial (día 0), esto se "reforzó" dos veces en intervalos de dos semanas (el día 14 y el 28, figura 4). Después de dos semanas adicionales, los animales fueron alquilados mediante narcosis para obtener el suero de sangre. 5. Administración subcutánea en pollos Para la administración subcutánea en pollos, se disolvieron 5 mg de la variante K. lactis seca y pulverizada que expresa el antígeno VP2 del virus de bursitis infecciosa (variante IBDV D78) (VAK890) en 750 µ? de amortiguador/solución salina de fosfato (PBS) y 500 µ? de agua destilada y una emulsión con 1.25 mi de IFA preparada. Se inyectaron 500 µ? de esta emulsión (con 1 mg de contenido de levadura) el día 0, 14 y el día 28 (figura 5). Por lo tanto, la cantidad de VP2 administrada por inmunización subcutánea de un solo pollo, corresponde aproximadamente a 180 ng (figuras 3 y 4). 6. Estímulo del virus Después de la vacunación (figura 5), los pollos vacunados se infectaron el día 42 a través de ruta oral con 100 EID5o de la cepa IBDV "Edgar", y el rango de mortalidad se determinó después de seis días. Posteriormente los animales se aniquilaron bajo narcosis, después de lo cual los sueros fueron obtenidos y se eliminaron las bursas de los animales. Éstos se fijaron primero durante 24 horas en 10% de formalina amortiguada neutral y posteriormente se incrustaron en cera de parafina. 7. Ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzimas (ELISA) Los tituladores del anticuerpo específicos de IBDV en los sueros de animales vacunados, se determinaron con una prueba ELISA comercial, equipo ELISA IDEXX FlockChek® IBD ELISA (IDEXX Laboratories, Inc.). En el caso de los sueros de los ratones vacunados, se utilizó un anticuerpo secundario de un fabricante diferente (Sigma Aldrich). 8. Ensayo de neutralización Se llevó a cabo el ensayo de neutralización para la determinación de la concentración de los anticuerpos que neutralizan el virus, de acuerdo con el protocolo de Schróder et al., 2000. 9. Inmunohistoquímica Se prepararon secciones de órganos con grosor de 4 micrometros a partir de las bursas incrustadas en ceras. Después de la eliminación de la cera, éstas se mancharon con hematoxilina y eosina a través de procedimientos estándar. Las muestras se revisaron microscópicamente, y se determinó la denominada "calificación de lesiones" en una escala del 1 al 4 (1 = normal para el 10% de atrofia folicular, 2 = del 10 al 30% de atrofia folicular, 3 = del 30 al 70% de atrofia folicular y 4 = > 70% de atrofia).
Resultados Producción y cuantificación de la cepa K. lactis que expresa IBDV VP2 Se prepararon diferentes variantes K. lactis con el gen IBDV VP2 integrado. Para los experimentos de vacunación, se utilizó una variante optimizada en donde la proteína VP2 fue mutada en la posición de aminoácido 2 (reemplazo de treonina por serina; Jagadish et al. (1991)), y que contenía una integración tándem adicional de al menos dos genes KIGAL4 (variante VP2-T2S_GAL4; cepa VAK890). La proteína extraña se estabilizó adicionalmente a través de la mutación; a través de la sobreexpresión del transactívador, se puede lograr un incremento marcado en la expresión VP2 (figura 2). La integración de los genes KIGAL4 adicionales también se correlacionó con un mayor rango de crecimiento de esta variante K. lactis. Las condiciones de crecimiento para la expresión VP2 de la cepa K. lactis VAK890 en particular, se optimizaron de modo que la levadura pudiera ser fermentada en altas densidades y con una cantidad reproducible de VP2 expresado. Después de la producción, la levadura se secó por congelación y se desactivó durante 2 horas a una temperatura de 90°C. La desactivación fue confirmada: permanecieron menos de 10 células de levadura viva por g de material de levadura desactivado. Se determinó la cantidad de VP2 por célula de levadura: con la cepa VAK890 fue de aproximadamente 0.7 fg de la proteína VP2 heteróloga por célula de levadura (figura 3).
Administración subcutánea en ratones y pollos Se llevaron a cabo inmunizaciones tal como se describió anteriormente; dos semanas después de la última administración, se probaron los sueros de los animales vacunados tratados con respecto a la presencia de anticuerpos neutralizantes. Para esto se utilizó un ensayo ELISA específico de IBDV y se llevó a cabo un ensayo de neutralización IBDV (figuras 4 y 5). Además, con los pollos vacunados se llevó a cabo un experimento denominado "estímulo del virus". Para esto a los animales se les proporcionó una dosis viral de 100 EID50 por animal de la cepa IBDV fuertemente virulenta "Edgar", cuya concentración en aves de corral no vacunadas da como resultado bursitis significativa con un rango de mortalidad aproximadamente del 10 al 35% en aves de corral no vacunadas (figura 5D). Después del experimento de "estímulo de virus", se verificaron las bursas de los animales vacunados mediante inmunohistoquímica con respecto a signos de infección y lesiones en las bursas, y se caracterizaron a través de la denominada "calificación de lesiones" (figura 5).
Tanto los experimentos con ratones, así como los experimentos con pollos mostraron que a través de la administración subcutánea de la cepa K. lactis VAK890, se pueden crear tituladores de alto nivel de los anticuerpos que neutralizan el virus, prácticamente en todos los animales tratados (figuras 4B y 4C y figuras 5B y 5C). De igual manera, se puede demostrar que prácticamente todos los pollos de prueba vacunados fueron protegidos contra el estímulo de virus, y prácticamente no mostraron signos de infección viral en sus bursas (figura 5). Por lo tanto todos los animales vacunados con la cepa K. lactis VAK890 mostraron una respuesta inmune humoral significativa contra VP2. Esta respuesta inmune ya se puede observar después de un solo refuerzo, a partir de lo cual, se puede concluir que dos inyecciones, las cuales además se llevaron a cabo con adyuvante incompleto de (inmunización y un refuerzo), ya son suficientes para producir la protección.
Además, todos los pollos de prueba que fueron vacunados con la cepa K. lactis VA K890 , fue ron p roteg i dos contra u na i nfecció n de vi ru s s u bsecu ente (fig u ra 5) .
A b rev iatu ras ARS1 secuencia de réplica autónoma: secuencia de nucleótido en el ADN en el cual se inicia la réplica Ase I endonucleasa de restricción Ase I CFA adyuvante completo de Freund ADN ácido desoxirribonucleico DEPC pirocarbonato de dietilo DIG-NTP trifosfato de nucleótido de digoxigenina DSMZ recolección de Microorganismos y Cultivos Celulares de Alemania GmbH DTT ditiotreitol E. coli Escheríchia coli EcoR\ endonucleasa de restricción Eco Rl EDTA ácido etilendiaminotetraacético EID50 dosis infecciosa de huevo o embrión - número de virus infectados que son necesarios para disparar una infección en el 50% de los huevos infectados ELISA ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzimas GAL4 activador de transcripción específico de levadura GRAS generalmente considerado como seguro HEPES ácido 2-(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil)-etanosulfonato Hpa I endonucleasa de restricción Hpa I HRP peroxidasa de rábano iBDV virus de bursitis infecciosa IFA adyuvante incompleto de Freund K. lactis Kluyveromyces lactis KIGAL4 gen K. lactis que codifica para la proteína KIGal4/Lac9 KIGAL80 gen K. lactis que codifica para la proteína KIGal80 LAC4 gen K. lactis que codifica para una enzima de ß-galactosidasa Nati endonucleasa de restricción Not I ODU unidad de densidad óptica PBS amortiguador/solución salina de fosfato PCR reacción de cadena de polimerasa RNA ácido ribonucleico S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Salí endonucleasa de restricción SAI I SDS dodecilsulfato de sodio SDS-PAGE electroforesis de gel de poliacrilamida utilizando SDS TEF1 gen Arxula adeninivorans que codifica para el factor de traducción EF-1 alfa VP2 proteína viral que forma cápside de IBDV VP2-T2S VP2 con reemplazo de aminoácido de treonina por serina en la posición 2 VAK cepa de vacuna YEPD dextrosa de peptona de extracto de levadura YRp7 vector de traslado de S. cerevisiae-E.coli, acceso Genbank U03501 (Botstein et al., 1979) Listado de Referencias Backhaus, K. et al. Milk and sugar: Regulation of cell wall synthesis in the milk yeast Kluyveromyces lactis (Leche y azúcar: regulación de síntesis de pared celular en la levadura de leche Kluyveromyces lactis). European Journal of Cell Biology 90, 745-750 (2011).
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Claims (56)

REIVINDICACIONES
1. Una levadura recombinante de la especie Kluyveromyces lactis, que contiene un gen extraño y que permite la expresión de proteínas extrañas, caracterizada porque la levadura recombinante de la especie Kluyveromyces lactis, se utiliza para la creación de una respuesta inmune humoral protectora.
2. La levadura recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque la levadura recombinante se utiliza como una vacuna de marcador de subunidad.
3. La levadura recombinante de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque las vacunas de marcador de subunidad se utilizan para distinguir individuos vacunados, de individuos infectados naturalmente.
4. La levadura recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, caracterizada porque las vacunas de marcador de subunidad exhiben, al mismo tiempo, fuertes propiedades adyuvantes.
5. La levadura recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 2 a la 4, caracterizada porque las vacunas de marcador de subunidad son fuertemente inmunogénicas.
6. La levadura recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la integración del gen extraño se llevó a cabo con secuencias de vector o marcadores de selección adicionales.
7. La levadura recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la expresión del gen extraño tiene lugar en forma constitutiva.
8. La levadura recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la expresión del gen extraño es inducible.
9. La levadura recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la expresión del gen extraño puede ser cuantificada indirectamente a través de la expresión de un gen reportero endógeno.
10. La levadura recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el gen extraño permite la expresión de proteínas extrañas con propiedades antigénicas.
11. La levadura recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la levadura recombinante expresa en forma inducible o constitutiva cantidades significativas de una proteína extraña o dominios de esta proteína extraña, o dominios de esta proteína extraña fusionados con dominios de proteína extraños para la especie.
12. La levadura recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la cepa Kluyveromyces lactis es Kluyveromyces lactis VAK367-D4 (DSM 23097) o una variante de la misma.
13. La levadura recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la proteína extraña se deriva de un patógeno o un tumor.
14. La levadura recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la proteína extraña es un antígeno asociado con tumor seleccionado de CEA, 5T4, MUC1, ART1 y HER-2.
15. La levadura recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 13, caracterizada porque la proteína extraña se deriva de un virus, una bacteria o un parásito.
16. La levadura recombinante de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizada porque la proteína extraña se deriva de un parásito.
17. La levadura recombinante de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizada porque la proteína extraña se deriva de Necator americanus, Ancylostoma duodenale, Leishmania spec, Plasmodium spec. o Schistosoma spec.
18. La levadura recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 o 17, caracterizada porque la proteína extraña se selecciona del grupo que comprende: Necator americanus o Ancylostoma duodenale: proteína ASP y proteasas de degradación de hemoglobina; Leishmania spec: gp63, antígeno de promastigote 46 kD, LACK; Plasmodium spec: proteína CSP, CSA-1, CSA-3, EXP1, SSP2, STARP, SALSA, MSP1, MSP2, MSP3, AMA-1, GLURP, Pfs25, Pfs 28, Pvs25, Pvs 28, Pfs 48/45, Pfs 230; Schistosoma spec: TP1, Sm23, ShGSTs 26 y 28, paramiosina, miosina de parásito, Sm14.
19. La levadura recombinante de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizada porque la proteína extraña se deriva de una bacteria.
20. La levadura recombinante de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizada porque la proteína extraña se deriva de Mycobacterium tuberculosis, Heliobacter pylori, grupo A Strepptococcus spec., Streptococcus pneumonía, Salmonella typhimurium , Shigella spec, Vibrio cholera, Escherichia coli o Yersinia pestis.
21. La levadura recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 o 20, caracterizada porque la proteína extraña se selecciona del grupo que comprende: Mycobacterium tuberculosis: Ag85A, Hsp65, R8307, 19 kD, 45 kD, 10.4; Heliobacter pylori: VacA, LagA, NAP, hsp, ureasa, catalasa; Grupo A Strepptococcus spec: M, Peptidasa SCPA, exotoxinas SPEA y SPEC, proteína de enlace de fibronectina; Strepptococcus pneumoniae: PspA, Psa A, BHV 3, BHV 4; Salmonella typhimurium: antígeno Vi; Shigella spec: LPS; Vibrio cholerae CTB; Escherichia coli: ETEC: LT, LT-ST, CTB; y Yersinia pestis: F1 y V.
22. La levadura recombinante de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizada porque la proteína extraña se deriva de un virus.
23. La levadura recombinante de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizada porque el gen extraño permite la expresión de proteínas virales con propiedades antigénicas.
24. La levadura recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 22 o 23, caracterizada porque el gen extraño permite la expresión de proteínas estructurales virales.
25. La levadura recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones de la 22 a la 24, caracterizada porque la proteína extraña se derivada de Birnaviridae, Caliciviridae, Reoviridae, Retroviridae, Flaviviridae, Hepadnaviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Herpesviridae, Coronaviridae, Orthomyxoviridae o Papillomaviridae.
26. La levadura recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones de la 22 a la 25, caracterizada porque la proteína extraña se selecciona del grupo que comprende: Birnaviridae: VP2 Caliciviridae (Norwalk, HEV): NV 60 kD¡ HEV ORF2; Reoviridae (Rota): VP7, VP4; Retroviridae (HIV): Gag, Pol, Nef, Env, gp160, gp120, gp140, gp41 ; Flaviviridae (género Flavivirus: WNV, dengue, YF, TBE, JEV): preM-Env, NS3, NS4, NS5; Flaviviridae (género Pestivirus BVDV, CSFV, BDV. género Hepacivirus HCV): E1, E2, ERNA (pesti), C, NS3, NS4, NS5; Hepadnaviridae (HBV): antígeno HBS; Paramyxoviridae (Paramyxovirinae PIV-1, PIV-2, paperas, Sendai, PIV-2, PIV-4, morbilli): M, HN, N, F; Paramyxoviridae (Pneumovirinae: RSV): F, G, SH, M; Rhabdoviridae (rabies): G; Herpesviridae (EBV, HSV2): gp350/220 (EBV), gB2, gD2 (HSV); Coronaviridae (SARS): CoV, N, M, S; Orthomyxoviridae (influenza A, B): HA, NA, M1, M2, NP; y Papillomaviridae: L2, E6, E7.
27. La levadura recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones de la 22 a la 26, caracterizada porque la proteína extraña se deriva de un miembro de la familia Birnaviridae.
28. La levadura recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones de la 22 a la 27, caracterizada porque la proteína extraña es el antígeno VP2 del virus de bursitis infecciosa (IBDV).
29. La levadura recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones de la 22 a la 28, caracterizada porque el antígeno VP2 se deriva de la cepa del virus de bursitis infecciosa (IBDV) D78.
30. La levadura recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones de la 22 a la 29, caracterizada porque el antígeno VP2 del virus de bursitis infecciosa (IBDV) se codifica a través de una secuencia de nucleótido seleccionada de la SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 y SEQ ID No. 5.
31. La levadura recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones de la 22 a la 30, caracterizada porque el antígeno VP2 del virus de bursitis infecciosa (IBDV) tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4 y SEQ ID No. 6.
32. La levadura recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la cepa Kluyveromyces lactis se selecciona de: Kluyveromyces lactis VAK367-D4890 DSM 25405, Kluyveromyces lactis VAK367-D4910 DSM 25406, y Kluyveromyces lactis VAK367-D4911 DSM 25407.
33. La levadura recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones de la 22 a la 31, caracterizada porque la proteína extraña es un antígeno VP2 mutado del virus de bursitis infecciosa (IBDV).
34. La levadura recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones de la 22 a la 32, caracterizada porque la proteína extraña es un antígeno VP2 optimizado por codón de virus de bursitis infecciosa (IBDV).
35. La levadura recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la cepa Kluyveromyces lactis se selecciona de Kluyveromyces lactis VAK890, VAK910 y VAK911.
36. El uso de una levadura recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones de la 1 a la 35, en un método para vacunación subcutánea.
37. Un método para vacunación subcutánea por medio de levaduras recombinantes, caracterizado porque el método comprende los siguientes pasos: a) crecimiento y proliferación de las levaduras recombinantes, b) recolección y desactivación de las levaduras, c) administración de las levaduras recombinantes de acuerdo con un esquema de inmunización que será especificado, d) determinación del titulador de los anticuerpos formados y/o e) detección de la inmunización.
38. Un método para la vacunación subcutánea por medio de levaduras recombinantes, caracterizado porque en el método se utiliza una levadura recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones de la 31 a la 35.
39. El método de acuerdo con las reivindicaciones 37 o 38, caracterizado porque la administración subcutánea de las células de levadura completa de una levadura recombinante, de acuerdo con una o más de las reivindicaciones de la 1 a la 35, se obtiene una inmunización específica contra la proteína extraña expresada.
40. El método de acuerdo con la reivindicación 39, caracterizada porque se obtiene una inmunización específica contra una proteína extraña de un patógeno o un tumor.
41. El método de acuerdo con la reivindicación 39, caracterizado porque la proteína extraña se deriva de un parásito, una bacteria o un virus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 3 a la 31.
42. El método de acuerdo con la reivindicación 39, caracterizado porque se obtiene una inmunidad específica contra un antígeno citotóxico.
43. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 37 a la 42, caracterizado porque mediante administración subcutánea de las células de levadura completas de una levadura recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones de la 1 a la 35, se obtiene una inmunización humoral contra la proteína extraña expresada.
44. El método de acuerdo con una o más de las reivindicaciones de la 37 a la 43, caracterizado porque mediante administración subcutánea de las células de levadura completa de una levadura recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones de la 1 a la 35, se obtiene una inmunización humoral protectora contra proteína extraña expresada.
45. Un método ELISA específico para la detección y cuantificación de una respuesta inmune de acuerdo con una o más de las reivindicaciones anteriores.
46. El método ELISA de acuerdo con la reivindicación 45 para la detección y cuantificación de un agonista inmune contra la proteína IBDV VP2 y/o la proteína IBDV VP2T2S mutada.
47. Un método para la detección de anticuerpos neutralizantes procedentes de sueros de individuos que fueron inmunizados de acuerdo con cualquiera reivindicaciones de la 37 a la 44.
48. Un método para la detección de anticuerpos neutralizantes contra la proteína IBDV VP2 y/o la proteína IBDV OVP2-T2S mutada y/o la proteína OVP2-T2S optimizada por codón procedente de sueros de individuos que fueron inmunizados de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 37 a la 44.
49. Un método para la detección de la inmunización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 37 a la 44 a través del estímulo con un antígeno.
50. Un método para la detección de la inmunización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 37 a la 44 a través del estímulo con un antígeno viral o estímulo con un virus.
51. Un método para detección de la inmunización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 37 a la 44 a través del estímulo con IBDV VP2 y/o IBDV VP2-T2S mutado y/o proteína OVP2-T2S optimizada por codón.
52. Un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótido tal como se reclama en la SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8 o SEQ ID No. 9.
53. Un vector de expresión que contiene un gen extraño, caracterizado porque el gen extraño tiene la secuencia de nucleótidos tal como se reclama en la SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5.
54. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 53, caracterizado porque el gen extraño contiene la secuencia de nucleótidos natural u optimizada con codón, que codifica para la proteína IBDV VP2 o para la proteína IBDV VP2-T2S.
55. El vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 53 o 54, caracterizado porque el gen extraño codifica para la proteína IBDV VP2 con la secuencia de aminoácido tal como se reclama en la SEQ ID No. 2, o la proteína IBDV VP2-T2S con la secuencia de aminoácido tal como se reclama en la SEQ ID No. 4.
56. El vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 53 a 55, caracterizado porque el vector de expresión es el vector Klp3 o Klp3-MCS (SEQ ID No. 10). R E S U M E N La invención se relaciona con las levaduras recombinantes de la especie Kluyveromyces lactis para la producción de una inmunorespuesta humoral contra los antígenos definidos, con la producción de dichas levaduras, y con el uso de las mismas para la vacunación protectora contra los patógenos y las células malignas que contienen dichos antígenos.
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