MX2014007116A - Detergente o agente de limpieza liquido estable al almacenamiento que contiene proteasa y amilasa. - Google Patents

Abstract

La estabilidad al almacenamiento de un detergente o agente de limpieza líquido que contiene proteasa y amilasa ha de ser mejorada. Esto se logra a través del uso de una proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos .que es por lo menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID no. 1 en toda la longitud y, de acuerdo con SEQ ID no. 1, tiene la sustitución de aminoácidos R99E o R99D en combinación con por lo menos otras dos sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de S3T, V4I y V199I.

Description

DETERGENTE O AGENTE DE LIMPIEZA LÍQUIDO ESTABLE AL ALMACENAMIENTO QUE CONTIENE PROTEASA Y AMILASA Descripción de la invención La invención se refiere al campo de agentes de lavado y limpieza líquidos. La invención se refiere, en particular, a agentes de lavado y limpieza líquidos que contienen enzima, que contienen proteasas definidas en combinación con una amilasa, y además propone métodos en los que se usan esos agentes. La invención se refiere además a los usos de las proteasas definidas en agentes de lavado o limpieza líquidos que contienen una amilasa.

El uso de proteasas de tipo subtilisina es' preferido para agentes de lavado y limpieza. Las proteasas usadas en los agentes de lavado o limpieza conocidos de la técnica anterior, ya sea originalmente se originan a partir de microorganismos, por ejemplo de los géneros Bacillus , Streptomyces , Humicola o Pseudomonas, y/o son producidos por microorganismos adecuados usando métodos biotecnológicos conocidos per se, por ejemplo por hospederos de expresión transgénica de los géneros Bacillus o por hongos filamentosos .

Otras enzimas, en particular las amilasas, están cada vez más presente, en particular, en agentes de lavado líquidos modernos. Una amilasa es una enzima que cataliza la hidrólisis de enlaces glicosidicos , en particular en los polisacáridos tales como el almidón. Entre las amilasas, las a-amilasas, que hidrolizan los enlaces de a ( 1- ) -glicosidicos en amilosa se usan a menudo en agentes de lavado y limpieza. Dentro de la clasificación de enzimas de la CE, el sistema de clasificación numérico para las enzimas, las a-amilasas tienen el número de CE ("número de la Comisión de Enzimas") 3.2.1.1 y, por consiguiente pertenecen a la tercera de las seis clases principales de enzimas, las hidrolasas (EC 3.-.-·-), luego a las glicosilasas (EC 3.2.-.-) y, a su vez a las glicosidasas (EC 3.2.1.-), es decir, enzimas que hidrolizan compuestos de O- y/o S-glicosilo. El rompimiento del almidón por las a-amilasas da lugar a dextrinas y, de estas últimas, la maltosa, glucosa y oligosacáridos ramificados. En consecuencia, las amilasas en particular actúan contra los residuos que contienen almidón en lavandería y catalizan la hidrólisis de los mismos.

Las solicitudes de patente internacionales W095/23221 y WO92/21760 describen variantes de la proteasa alcalina de Bacillus lentvs OSM 5483 que son adecuadas para usarse en el agentes de lavado o limpieza, así como agentes de lavado y limpieza que contienen esas proteasas. La solicitud de patente internacional 02011 / 032988 describe, además, agentes de lavado y limpieza que también contienen variantes de la proteasa alcalina de Bacillus lentus OSM 5483. Las variantes de proteasa descritas en esos documentos se pueden modificar, además a otras posiciones, en las posiciones 3, 4, 99 y 199 en el sistema de numeración para la proteasa alcalina de Bacillus lentus OSM 5483 y tener, por ejemplo aminoácidos 3T, 41, 99D, 99E o 1991 en las posiciones indicadas. Se describe, además, que los agentes de lavado pueden contener otras enzimas, incluyendo también una amilasa. Los agentes de lavado pueden ser sólidos o líquidos. Dicho documento, sin embargo, no describe directamente y sin ambigüedad un agente de lavado líquido que contiene una amilasa en combinación con una proteasa que tiene combinaciones de estas modificaciones como se describen en lo sucesivo .

Un inconveniente de los agentes de lavado y limpieza líquidos que contienen proteasa y amilasa de la técnica anterior es que tienen estabilidad al almacenamiento inadecuada y en consecuencia pierden un grado considerable de actividad enzimática, en particular amilolítica y/o proteolítica, después de un corto tiempo. La presencia de la proteasa frecuentemente conduce a la pérdida de actividad amilolítica, ya que la proteasa inactiva la amilasa. El agente ' de lavado o limpieza entonces ya no presenta un rendimiento de limpieza óptimo.

Un objeto de la presente invención es superar el inconveniente señalado y proveer agentes de lavado o limpieza que contienen proteasa y amilasa que tienen estabilidad al almacenamiento adecuada o mejorada, en particular con respecto a su actividad enzimática y preferiblemente su actividad amilolitica y/o proteolitica.

Por consiguiente, la presente invención provee un agente de lavado o limpieza líquido que comprende (a) una proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos que, en toda la longitud de la misma, es por lo menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID no. 1 y, en la numeración de conformidad con SEQ ID no. 1, tiene la sustitución de aminoácidos R99E o R99D en combinación con por lo menos otras dos sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de S3T, V4I y V199I, y (b) una amilasa.

Sorprendentemente, se ha encontrado que un agente de lavado o limpieza líquido que contiene la combinación de una proteasa con una amilasa es venta osamente estable en almacenamiento. En particular, presenta un mejor rendimiento de limpieza, en particular rendimiento de limpieza amilolitica y/o proteolitica mejorado, después del almacenamiento en comparación con un agente de lavado o limpieza que difiere de un agente de conformidad con la invención sólo por la proteasa presente en el agente respectivo, en donde en el inicio del almacenamiento la proteasa está presente en los agentes para ser comparados en una concentración idéntica con respecto a la enzima activa. Una proteasa provista para el propósito de la presente invención, por lo tanto conduce a la inactivación reducida de la amilasa y la misma también presenta una pérdida reducida de rendimiento. La inactivación reducida de amilasa y/o proteasa por la proteasa provista para los propósitos de la presente invención es, sin embargo, no debida a un rendimiento y/o actividad inadecuados de la proteasa.

Un agente de conformidad con la invención preferiblemente presenta a este respecto el rendimiento de limpieza sobre suciedad sensible a la proteasa que sigue siendo buena, en particular ventajoso. Por consiguiente, un agente permite la remoción satisfactoria o mejorada de por lo menos uno, preferiblemente de una pluralidad de tipos de suciedades sensibles a la proteasa sobre los textiles y/o superficies duras, por ejemplo, platos. En desarrollos seleccionados de la invención, dicho rendimiento de limpieza con respecto a por lo menos un tipo de suciedad sensible a la proteasa, en particular, también se produce a temperaturas bajas, por ejemplo entre 10°C y 50°C, entre 10°C y 40°C o entre 20°C y 40°C.

Con respecto a las solicitudes de patente internacionales, W095/23221, O92/21760 y O2011/032988 mencionado en la introducción, la presente invención es por lo tanto una selección particularmente ventajosa que produce un agente de lavado liquido que está siendo obtenido que tiene un buen rendimiento y es estable al almacenamiento, en particular con respecto al rendimiento de limpieza proteolitica y/o amilolitica del agente después del almacenamiento y/o con respecto a la actividad proteolitica y/o amilolitica del agente después del almacenamiento.

Para los propósitos de la invención, se toma el rendimiento de limpieza en el sentido de la capacidad de agente de lavado o limpieza parcialmente o completamente para remover la suciedad que está presente al aplicar el agente. En el caso de suciedad de lavandería, éste es preferiblemente rendimiento de abrillantamiento con respecto a uno o más tipos de suciedad sobre textiles. Ejemplos de suciedad de lavandería son sangre-leche/tinta sobre algodón, huevo entero/pigmento sobre algodón, chocolate-leche/tinta sobre algodón, aceite de cacahuate-pigmento/tinta sobre poliéster/ algodón, pasto sobre algodón o cacao sobre algodón. En el caso de agentes de lavado de vajilla, el rendimiento de limpieza describe la capacidad del agente de lavado para remover la suciedad que está presente desde las superficies duras de los platos. Ejemplos de suciedad de vajilla son leche, carne picada, yema de huevo, avena y almidón. Para los propósitos de la invención, tanto el agente de lavado o limpieza que comprende la proteasa y la amilasa o la solución de lavado formada por este agente, y la proteasa o amilasa en si mismas presentan un rendimiento de limpieza respectivo. El rendimiento de la limpieza de las enzimas por lo tanto contribuye al rendimiento de limpieza del agente o de la solución de lavado formada por el agente. Rendimiento de limpieza amilolitica se refiere al rendimiento de limpieza sobre suciedad sensible a la amilasa. El rendimiento de limpieza proteolitica se refiere al rendimiento de limpieza sobre suciedad sensible a la proteasa. El rendimiento de limpieza se determina de manera convencional, preferiblemente como se indica más adelante.

La solución de lavado se entiende que es la solución de trabajo que contiene el agente de lavado o limpieza, dicha solución actúa sobre los textiles o telas o superficies duras y por lo tanto entra en contacto con la suciedad presente en los textiles, telas o superficies duras. La solución de lavado surge convencionalmente cuando el procese de lavado o de limpieza comienza y el agente de lavado o de limpieza es diluido con agua, por ejemplo en una máquina lavavaj illas , una lavadora o en otro recipiente adecuado .

La estabilidad al almacenamiento para los propósitos de la invención, en particular, se obtiene cuando un agente de lavado o limpieza de conformidad con la invención presenta un mayor rendimiento de limpieza después del almacenamiento en comparación con una composición de control que difiere del agente de lavado o limpieza de conformidad con. la invención únicamente por la proteasa presente en la composición de control. Al inicio del almacenamiento, los dos agentes que se han de comparar por lo tanto tienen la misma cantidad o concentración de amilasa y/o actividad amilolitica inicial. Además, al principio de almacenamiento, la proteasa está presente en ambos agentes en una. concentración idéntica, con respecto a la enzima activa, y los dos agentes son tratados en forma idéntica, en particular con respecto a las condiciones de almacenamiento y la determinación de la actividad enzimática. El almacenamiento dura cada vez más preferiblemente durante por lo menos 24 horas, 48 horas, 72 horas, 5 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas. El almacenamiento, además, procede preferiblemente a una temperatura de 20°C, 30°C o 40°C, muy preferiblemente a 40°C.

La actividad enzimática puede determinarse a este respecto, dependiendo del tipo de enzima particular, de una manera convencional. Los métodos para determinar la actividad son conocidos por un experto en la técnica en el campo de la tecnología de enzimas y son usados rutinariamente por esas personas. Los métodos para determinar la actividad de la proteasa se describen por ejemplo en Tenside [ Surfactants ] , volumen 7 (1970), páginas 125-132. La actividad proteolítica puede además ser determinada sobre la base de la liberación del cromóforo para-nitroanilina (pNA) del sustrato SUC-L-Ala -L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilida ( suc-AAPF-pNA) los proteasa escinde el sustrato y libera pNA. La liberación de la pNA provoca un aumento en la absorbancia a 410 nra, el perfil de tiempo del cual es una medida de la actividad enzimática (compárese con Del Mar et . al., 1979). La medición se lleva a cabo a una temperatura de 25 °C, a un pH de 8.6 y una longitud de onda de 410 nm. El tiempo de medición alcanza 5 minutos con un intervalo de medición de 20 s 60 s. La actividad de la proteasa se establece preferiblemente en PU (unidades de proteasa) .

La actividad de la amilasa se determina de manera convencional. La actividad de la amilasa se determina preferiblemente como se indica a continuación. Las amilasas convierten el almidón en glucosa. Bajo condiciones de reacción definidas (regulador de pH Tris-maleato de pH 6.5, 50°C, 15 min) , las muestras a investigar se incubaron con 0.67% de almidón (soluble, pretratado usando el método de Zulkowsky (tratado con glicerol a 190°C) ) . Mediante la adición de ácido dinitrosalicilico y calentando a 100°C, dicho ácido es reducido por la glucosa y otros azúcares reductores en condiciones alcalinas para formar un colorante de color naranja-rojo que se determina fotométricamente a 540 nm después de la finalización de la reacción. La cantidad de azúcar liberado correspondiente al color es aquí una medida de la actividad enzimática (compárese con Sumner et al., J. Biol. Chem., 1921,47 y 1924, 62).

La presencia de estabilización de enzimas para los propósitos de la presente invención se determina muy preferiblemente como se ha indicado anteriormente, usando un agente de lavado o limpieza liquido que contiene amilasa que se almacena durante cuatro semanas a una temperatura de 40°C, en donde la actividad proteolitica se determina a través de la liberación del cromóforo para-nitroanilina (pNA) del sustrato suc-AAPF-pNA, y la actividad amilolitica se determina como se ha indicado anteriormente.

La proteasa presente en un agente de lavado o de limpieza de conformidad con la invención comprende una secuencia de aminoácidos que, en toda la longitud de la misma, es por lo menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID no. 1 y, en la numeración de acuerdo con SEQ ID no. 1, tiene la sustitución de aminoácidos R99E o R99D en combinación con otros por lo menos dos sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de S3T, V4I y V199I.

En una modalidad adicional de la invención, la proteasa comprende una secuencia de aminoácidos que, en toda la longitud de la misma, es por lo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5% y 98.8% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID no. 1 y, en la numeración de acuerdo con SEQ ID no. 1, tiene la sustitución de aminoácido R99E en combinación con por lo menos dos sustituciones de aminoácidos adicionales seleccionadas del grupo gue consiste de S3T, V4I y V199I.

En una modalidad adicional de la invención, la proteasa comprende una secuencia de aminoácidos que, en toda la longitud de la misma, es por lo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5% y 98.8% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID no. 1 y, en la numeración de acuerdo con SEQ ID no. 1, tiene la sustitución de aminoácido R99D en combinación con por lo menos dos sustituciones de aminoácidos adicionales seleccionadas del grupo que consiste de S3T, V4I y V199I.

La SEQ ID no. 1 es la secuencia de la proteasa alcalina madura de Bacillus lentus DSM 5483, que se describe en la solicitud de patente internacional WO92/21760, y a la descripción de la cual se hace referencia expresamente.

Las proteasas que son más preferidas de conformidad con la invención son: una proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos que, en toda la longitud de la misma, es por lo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5% y 98.8% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID no. 1 y, en la numeración de acuerdo con SEQ ID no. 1, tiene la sustitución de aminoácido R99E en combinación con las sustituciones de aminoácidos S3T y V4I, en particular una proteasa de acuerdo con SEQ ID no. 1 con las sustituciones de aminoácidos S3T, V4I y R99E.

Una proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos que, en toda la longitud de la misma, es por lo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5% y 98.8% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID no. 1 y, en la numeración de acuerdo con SEQ ID no. 1, tiene la sustitución de aminoácido R99E en combinación con las sustituciones de aminoácidos S3T y V199I, en particular una proteasa de acuerdo con SEQ ID no. 1 con las sustituciones de aminoácidos S3T, R99E y V199I.

Una proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos que, en toda la longitud de la misma, es por lo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5% y 98.8% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID no. 1 y, en la numeración de acuerdo con SEQ ID no. 1, tiene la sustitución de aminoácido R99E en combinación con las sustituciones de aminoácidos V4I y V199I, en particular una proteasa de acuerdo con SEQ ID no. 1 con las sustituciones de aminoácidos V4I, R99E y V199I.

Una proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos que, en toda la longitud de la misma, es por lo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5% y 98.8% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID no. 1 y, en la numeración de acuerdo con SEQ ID no. 1, tiene la sustitución de aminoácido R99D ¦ en combinación con las sustituciones de aminoácidos S3T y V4I, en particular una proteasa de acuerdo con SEQ ID no. 1 con las sustituciones de aminoácidos S3T, V4I y R99D.

Una proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos que, en toda la longitud de la misma, es por lo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5% y 98.8% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID no. 1 y, en la numeración de acuerdo con SEQ ID no. 1, tiene la sustitución de aminoácido R99D en combinación con las sustituciones de aminoácidos S3T y V199I, en particular una proteasa de acuerdo con SEQ ID no. 1 con las sustituciones de aminoácidos S3T, R99D y V199I.

Una proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos que, en toda la longitud de la misma, es por lo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, '91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5% y 98.8% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID no. 1 y, en la numeración de acuerdo con SEQ ID no. 1, tiene la sustitución de aminoácido R99D en combinación con las sustituciones de aminoácidos V4I y V199I, en particular una proteasa de acuerdo con SEQ ID no. 1 con las sustituciones de aminoácidos V4I, R99D y V199I.

Modalidades más preferidas adicionales de proteasas de conformidad con la invención se distinguen en que tienen la sustitución de aminoácido R99E o R99D en combinación con las tres sustituciones de aminoácidos adicionales S3T, V4I y V199I. Las siguientes proteasas son particularmente preferidas a este respecto: Una proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos que, en toda la longitud de la misma, es por lo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98% y 98.5% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID no. 1 y, en la numeración de acuerdo con SEQ ID no. 1, tiene la sustitución de aminoácido R99E en combinación con las sustituciones de aminoácidos S3T, V4I y V199I, en particular una proteasa de acuerdo con SEQ ID no. 1 con las sustituciones de aminoácidos S3T, V4I, R99E y V199I. Dicha proteasa se establece en SEQ ID no. 2.

Una proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos que, en toda la longitud de la misma, es por lo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98% y 98.5% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID no. 1 y, en la numeración de acuerdo con SEQ ID no. 1, tiene la sustitución de aminoácido R99D en combinación con las sustituciones de aminoácidos S3T, V4I y V199I, en particular una proteasa de acuerdo con SEQ ID no. 1 con las sustituciones de aminoácidos S3T, V4I, R99D y V199I. Dicha proteasa se establece en SEQ ID no. 3.

Las proteasas más preferidas adicionales son las proteasas como se describió anteriormente que, además, tienen el aminoácido leucina (L) en la posición 211 en la numeración de acuerdo con SEQ ID no. 1.

Las posiciones de aminoácidos se definen para los propósitos de la presente invención por una alineación de la secuencia de aminoácidos de la proteasa para ser utilizadas con la secuencia de aminoácidos de la proteasa de Bacillus lentus, como se indica en SEQ ID no. 1. Puesto que la proteasa de Bacillus lentus en la técnica anterior constituye una importante molécula de referencia para la descripción de las proteasas y cambios de aminoácidos, es ventajoso referirse a la numeración de la proteasa de Bacillus lentus (SEQ ID no. 1) en la asignación de la posición de aminoácidos. La numeración se basa, además, en la proteina madura. Esta asignación, en particular, también se debe usar si la secuencia de aminoácidos de la proteasa que se ha de usar comprende un mayor número de residuos de aminoácidos que la proteasa de Bacillus lentus de conformidad con SEQ ID no. 1. Sobre la base de las posiciones indicadas en la secuencia de aminoácidos de la proteasa de . Bacillus lentus, las posiciones de aminoácidos en una proteasa que se han de usar de conformidad con la invención son aquellas que se asignan precisamente a estas posiciones en una alineación.

Además de la posición 99, las posiciones particularmente ventajosas en consecuencia deben ser asignadas a las posiciones 3, 4, 199 y 211, en una alineación con la SEQ ID no. 1 y por lo tanto en la numeración de acuerdo con SEQ ID no. 1. Las posiciones indicadas son ocupadas por los siguientes residuos de aminoácidos en la molécula de tipo salvaje de la proteasa de Bacillus lentus: S3, V4, V199 y L211. Dependiendo del número de desviaciones de secuencia de SEQ ID no. 1 que están presentes, surgen diferentes valores de identidad máximos, por lo tanto, que una proteasa que se ha de usar de conformidad con la invención en SEQ ID no. 1 puede presentar, incluso en caso de que coincida con la SEQ ID no. 1 con respecto a todos los otros aminoácidos. Este factor debe ser tomado en cuenta para cada posible combinación de las modificaciones de secuencia propuestas en cada caso individual y, además, también dependen de la longitud de la secuencia de aminoácidos de la proteasa. Por ejemplo, con uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve modificaciones de la secuencia, la identidad máxima alcanza 98.88%, 98.51%, 98.14%, 97.77%, 97.40%, 97.03% o 96.65%, respectivamente, para una secuencia de aminoácidos 269 aminoácidos de longitud, o 98.91%, 98.55%, 98.18%, 97.82%, 97.45%, 97.09% o 96.73%, respectivamente, para una secuencia de aminoácidos de 275 aminoácidos de longitud.

De conformidad con la invención, se ha encontrado que a través de la adición de dicha proteasa a un agente de lavado o limpieza liquido que contiene una amilasa, se obtiene un agente de lavado liquido particularmente estable al almacenamiento, en particular con respecto a su rendimiento de limpieza residual después del almacenamiento, en particular después de un período de almacenamiento de cada vez mayor preferiblemente 24 horas, 48 horas, 72 horas, 5 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas.

Una proteasa contenida en un agente de lavado o limpieza de conformidad con la invención presenta actividad proteolítica , es decir, es capaz de hidrolizar enlaces peptídicos de un polipéptido o proteína. Por lo tanto, es una enzima que cataliza la hidrólisis de enlaces peptídicos y es por lo tanto capaz de escindir los péptidos o proteínas. Es en particular una subtilasa y muy preferiblemente una subtilisina.

Una amilasa es una enzima como se describe en la introducción. Las amilasas pueden ser designadas por sinónimos, por ejemplo, 1 , -alfa-D-glucan glucanohidrolasa o glicogenasa. Las amilasas que se pueden formular de conformidad con la invención son preferiblemente a-amilasas. El que una enzima sea una a-amilasa para los propósitos de la invención se decide por su capacidad de hidrolizar enlaces de ( 1- ) -glicosídicos en la amilosa del almidón.

Ejemplos de amilasas formulables de conformidad con la invención son las a-amilasas de Bacillus licheniformis, de Bacillus amyloliquefaciens o de Bacillus stearothermophilus y, en particular, los desarrollos adicionales de los mismos mejorados para usarse en los agentes de lavado o limpieza. La enzima de Bacillus licheniformis es obtenible de Novozymes bajo el nombre de Termamyl® y de Danisco/Genencor bajo el nombre Purastar® ST . 'Productos desarrollados adicionales de esta a-amilasa se pueden obtener de Novozymes bajo el nombre comercial Duramyl® y Termamyl®ultra , de Danisco/Genencor bajo el nombre Purastar®OxAm y de Daiwa Seiko Inc., Tokio, Japón, como Keistase®. La a-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens es distribuida por Novozymes bajo el nombre BAN ®, y variantes derivadas de la a-amilasa de Bacillus stearothermophilus son distribuidas bajo los nombres BSG® y Novamyl®, del mismo modo por Novozymes. Una nota particular, además, se debe tomar para tal propósito de la a-amilasa de Bacillus sp. Una 7-7 (DSM 12368) y la ciclodextrina glucanotransferasa (CGTasa) de Bacillus agaradherens (DSM 9948). Productos de fusión de todas las moléculas indicadas igualmente se pueden usar. Por otra parte, los desarrollos adicionales de la a-amilasa de Aspergillus niger y A. oryzae obtenible bajo el nombre comercial Fungamyl® de Novozymes también son adecuados. Otros productos comerciales que pueden usarse ventajosamente son, por ejemplo, Amylase-LT® y Stainzyme® o Stainzyme ultra ® o Stainzyme Plus®, este último también de Novozymes. Variantes de estas enzimas que pueden obtenerse mediante mutaciones puntuales también se pueden usar de conformidad con la invención. Por lo tanto, amilasas más preferidas se describen en las solicitudes de patente publicadas internacionales WO00/60060, WO03/002711, WO03/054177 y WO07/079938, a la descripción de la cual por lo tanto se hace referencia explícita o el contenido de la descripción de las cuales se incluye explícitamente en la presente solicitud de patente.

Las variantes oc-amilasa de la oc-amilasa AA560 de acuerdo a SEQ ID no. 4 son particularmente adecuadas para usarse en agentes de conformidad con la invención. Las siguientes variantes son particularmente ventajosas: (a) variante de a-amilasa que, con relación a la a-amilasa AA560 de acuerdo con SEQ ID no. 4, tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las siguientes modificaciones de la secuencia de la numeración de la oc-amilasa AA560: R118K, D183* (deleción) , G184* (deleción) , N195F, R320K, R458K. La variante de a-amilasa tiene muy preferiblemente todas las seis de las modificaciones de secuencia indicadas. (b) una variante de a-amilasa que, en relación con la a-amilasa AA560 de acuerdo con SEQ ID no. 4, tiene las siguientes modificaciones de secuencia (en la numeración de la oc-amilasa AA560) : (1) M9L/M202I, (2) M9L/M202I/M323T, (3) M9L/M202I/M323T/M382Y, (4) 9L/ 202I/Y295F/A339S, (5) 9L/M202I/Y295F, (6) M9L/M202I/A339S, (7) M9L/M202I/Y295F/A339S, (8) M9L/M202I/Y295F/A339S/E345R, (9) M9L/G149A/ 202I/Y295F/A339S/E345R, (10) M9L/M202L, (11) M9L/M202L/M323T, (12) 9L/M202L/M323T/M382Y, (13) M9L/M202L/Y295F/A339S, (14) M9L/ 202L/Y295F, (15, M9L/M202L/A339S, (16) M9L/M202L/Y295F/A339S, (17 M9L/ 202L/Y295F/A339S, E345R, (18) M9L/G149A/M202L/Y295F/A339S/E345R, (191 9L/ 202T, (20 M9L/M202T/M323T, (21) M9L/M202T/M323T/M382Y, (22 M9L/ 202T/Y295F/A339S, (23) M9L/M202T/Y295F, (24 M9L/M202T/A339S, (25) M9L/M202T/Y295F/A339S, (26 M9L/M202T/Y295F/A339S/E345R, (27 M9L/G149A/M202T/Y295F/A339S/E345R, (28 M9L/G149A/M202I/V214T/Y295F/N299Y/M323T/A339S/E345R, (29) M9L/G149A/M202L/V214I/Y295F/M323T/A339S/E345R/M382Y, (30) M9L/G149A/G182T/G186A/M202I/V214I/Y295F/N299Y/M323T7 A339S, (31) M9L/G149A/G182T/G186A/ 202L/T257I/Y295F/N299Y/M323T/ A339S/ E345R, (32) M9L/G1 9A/M202L/V214T/Y295F/N299Y/M323T/A339S/E345R, (33) M9L/G1 9A/M202I/V214I/Y295F/M323T/A339S/E345R/M382Y, (34) M9L/G149A/G182T/G186A/M202L/V214I/Y295F/N299Y/M323T/ A339S, (35) M9L/G149A/G182T/G186A/M202I/T257I/Y295F/N299Y/M323T/ A339S/E345R, (36) M9L/G149A/M202I/V214T/Y295F/N299Y/M323T/A339S/E345R/ N471E, (37) M9L/G149A/ 202L/V21 I/Y295F/M323T/A339S/E345R/M382Y/ N471E, (38) M9L/G149A/G182T/G186A/M202I/V214I/Y295F/N299Y/M323T/ A339S/N471E, (39) M9L/G149A/G182T/G186A/M202L/T257I/Y295F/N299Y/M323T/ A339S/ E345R/N471E, (40) M202L/M105F/M208F, (41) G133E/M202L/Q361E, (42) G133E/M202L/R444E, (43) M202L/Y295F, (44) M202L/A339S, (45) M202L/M323T, (46) M202L/M323T/M309L, (47) M202L/M323T/M430I, (48) 202L/V214T/R444Y, (49) M202L/N283D/Q361E, (50) M202L/M382Y/K383R, (51) 202L/K446R/N484Q, (52) M202I/Y295F, (53) M202I/A339S, (54) M202I/M105F/M208F, (55) G133E/M202I/Q361E, (56) G133E/M202I/R444E, (57) M202I/M323T, (58) M202I/M323T/M309L, (59) 202I/M323T/M430I, (6.0) M202I/V214T/R444Y, (61) 202I/N283D/Q361E, (62) M202I/M382Y/K383R, (63) M202I/K446R/N484Q, (64) 202V/M105F/M208F, (65) G133E/M202V/Q361E, (66) G133E/M202V/R444E, (67) M202V/ 323T, (68) M202V/ 323T/ 309L, (69) 202V/ 323T/M430I, (70) M202V/M323T/M9L, (71) M202V/V214T/R444Y, (72) M202V/N283D/Q361E, (73) M202V/M382Y/K383R, (74) M202V/K446R/N484Q, (75) 202T/M105F/M208F, (76) G133E/M202T/Q361E, (77) G133E/M202T/R444E, (78) 202T/Y295F, (79) M202T/A339S, (80) M202T/M323T, (81) M202T/M323T/M309L, (82) M202T/M323T/M430I, (83) M202T/ 323T/M9L, (84) 202T/V214T/R444Y, (85) M202T/N283D/Q361E, (86) M202T/A339S, (87) M202T/Y295F (88) M202T/N299F, Y, (89) 202T/M382Y/K383R o (90) M202T/K446R/N484Q.

Entre éstas, las siguientes variantes de a-amilasas son particularmente preferidas: (10) M9L/M202L, (28) M9L/G149A/M202I/V214T/Y295F/N299Y/M323T/A339S/E345R, (3DM9L/G149A/G182T/G186A/M202L/T257I/Y295F/N299Y/ 323T/ A339S/E345R, (35) M9L/G149A/G182T/G186A/M202I/T257I/Y295F/N299Y/M323T7 (38) M9L/G149A/G182T/G186A/M202I/V214I/Y295F/N299Y/M323T / (39) M9L/G1 9A/G182T/G186A/M202L/T257I/Y295F/N299Y/M323T/ A339S/E345R/N471E, (45) M202L/M323T, (46) M202L/M323T/M309L, (62) M202I/M382Y/K383R, (68) M202V/M323T/ 309L, (73) M202V/M382Y/K383R (82) 202T/M323T/M430I o (84) M202T/V214T/R444Y. (c) una variante a-amilasa de acuerdo con (b) que, además, tiene todos las seis de las modificaciones de secuencia indicadas en (a) , en particular preferiblemente la variante 31 con las seis modificaciones de secuencia indicadas en (a) .

La variante de la -amilasa indicada en (a) y la variante de -amilasa 31 indicada en (c) con las seis modificaciones de secuencia indicadas en (a) son particularmente preferidas de conformidad con la invención.

La identidad de secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos se determina por una comparación de secuencias.

Dicha comparación procede por la asignación de secuencias similares entre si en las secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos. Esta comparación de secuencias se realiza preferiblemente sobre la base del algoritmo BLAST usado convencionalmente establecido en la técnica anterior Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. y Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool . " J. Mol. Biol. 215:403-410, y Altschul, Stephan F . , Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, y David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein datábase search programs"; Nucleic Acids Res., 25, p . 3389-3402) y, en principio procede por la asignación de secuencias similares de nucleótidos o aminoácidos en las secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos entre si. Una asignación de tabla de las posiciones en cuestión se conoce como una alineación. Un algoritmo más disponible en la técnica anterior es el algoritmo FASTA. Las comparaciones de secuencias (alineaciones), en particular, múltiples comparaciones de secuencias, se crean convencionalmente usando software. A menudo se usa, por ejemplo, la serie de Clustal (compárese con, por ejemplo, Chenna et al. (2003) : Múltiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31, 3497-3500), T-Coffee (compárese con, por ejemplo, Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for múltiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217) o los programas que se basan en estos programas o algoritmos.

Para los propósitos de las presentes secuencias invención, se realizan comparaciones y alineaciones preferiblemente con el software Vector NTI ® Suite de 10,3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, California, E.U.A.), usando los parámetros por defecto predefinidos.

Dicha comparación permite formular un enunciado sobre la similitud de las secuencias comparadas. Se indica convencionalmente en porcentaje de identidad, es decir, la proporción de los nucleótidos idénticos o residuos de aminoácidos en la misma o en una alineación de posiciones mutuamente correspondientes. El término más amplio "homología" también incluye la consideración de las sustituciones de aminoácidos conservados en las secuencias de aminoácidos, por lo tanto, aminoácidos con características similares, ya que generalmente tienen actividades o funciones similares dentro de la proteína. La similitud de las secuencias de comparación, por tanto, también se puede indicar en porcentaje de homología o porcentaje de similitud. Los enunciados en relación con la identidad y/o la homología se pueden hacer sobre polipéptidos o genes enteros o sólo sobre dominios individuales. Los dominios homólogos o idénticos de diferentes secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos se definen por lo tanto por coincidencias en las secuencias. A menudo tienen funciones idénticas o similares. Éstos pueden ser pequeños y comprender sólo unos pocos nucleótidos o aminoácidos. A menudo, este tipo de dominios pequeños ejercen funciones que son esenciales para la actividad global de la proteina. Por lo tanto, puede ser importante relacionar coincidencias de secuencias sólo con dominios individuales, opcionalmente pequeños. Si no se indica lo contrario, sin embargo, enunciados relacionados con la identidad u homología en la presente solicitud se refieren a la totalidad de la longitud de la secuencia de ácido nucleico o aminoácidos indicada en cada caso.

En una modalidad adicional de la invención, un agente de lavado o limpieza de conformidad con la invención se caracteriza además porque su rendimiento de limpieza por lo menos corresponde a la de un agente de lavado o limpieza que contiene una proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID no. 2 o SEQ ID no. 3, muy preferiblemente a la indicada en SEQ ID no. 2. El rendimiento de limpieza se determina en un sistema de lavado que contiene un agente de lavado que contiene amilasa a una velocidad de adición de entre 4.0 y 11.0 gramos por litro de licor de lavado y que contiene la proteasa, en donde las proteasas que han de ser comparadas se usan a una concentración idéntica (en relación con la proteina activa) y se determina el rendimiento de limpieza en relación con la suciedad de carne picada y/o yema de huevo de los platos mediante la determinación de los residuos restantes de la suciedad respectivos después del proceso de lavado, el proceso de lavado procede durante por lo menos 30 minutos, preferiblemente 60 minutos, a una temperatura de 50 °C y el agua tiene una dureza del agua de entre 15.5 y 16.5° dH (grados alemanes de dureza) .

El agente de lavado para el sistema de lavado es preferiblemente un agente de lavado de vajilla automático liquido bifásico que es de la siguiente composición (todos los valores indicados en por ciento en peso) : (a) Fase de enzima: Mejorador de detergencia 15.0-20.0 Alcohol de azúcar 8.0-12.0 Agente tensoactivo no iónico (etoxilato de alcohol graso de C8-Ci0 con 22 EO) 3.0-5.0 Compuesto de álcali (base) 3.0-4.0 Ácido bórico 2.5-3.5 Fosfonato (HEDP) 1.5-2.5 Amilasa 1.0-2.0 Proteasa véase texto Sal de Ca 0.8-1.2 Sal de Zn 0.15-0.25 Espesante 0.8-1.2 Colorante, perfume, conservador 0.25-0.5 Agua hasta 100 La amilasa es preferiblemente la preparación de una variante de -amilasa que, en relación con la a-amilasa AA560 de acuerdo con SEQ ID no. 4, tiene las modificaciones de secuencia siguientes en la numeración de -amilasa AA560: R118K, D183* (deleción) , G184* (deleción) , N195F, R320K, R458K (Novozymes) . (b) Fase alcalina: Mejorador de detergencia 7.5-12.5 Carbonato de sodio 7.5-12.5 Sulfopolímero 5.0-8.0 Compuesto de álcali (base) 3.0-5.0 Monoetañolamína 2.0-4.0 Fosfonato (HEDP) 2.0-5.0 Espesante 0.8-1.2 Colorante, perfume, conservador 0.25-0.5 Agua hasta 100 La proteasa está presente en el agente en una concentración de 0.01 a 1% en peso, preferiblemente de 0.1 a 0.5% en peso, en relación con la proteina activa. Las dos fases se reparten en proporciones idénticas (en cada caso 20 g por fase) para un ciclo de lavado en una máquina lavavaj illas . El lavado se lleva a cabo en un intervalo de valores de pH entre pH 9 y pH 10 en una máquina lavavajillas convencional, por ejemplo una máquina lavavajillas G698SC de Miele. Ni la actividad de la proteasa ni la actividad de la amilasa en la solución de lavado son iguales a cero al comienzo del lavado.

El rendimiento de limpieza se evalúa visualmente usando el método IKW estándar en una escala de 1 a 10, en el que un valor de 10 es la mejor calificación (ningún residuo perceptible) .

El rendimiento de limpieza se determina muy preferiblemente en una máquina lavavajillas con respecto a la suciedad de carne picada y yema de huevo de los platos usando un agente de lavado automático de vajilla liquido bifásico como se describió anteriormente.

En una modalidad adicional de la invención, un agente de lavado o limpieza de conformidad con la invención se caracteriza además porque su estabilidad al almacenamiento por lo menos corresponde a la de un agente de lavado p limpieza que contiene una proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID no. 2 o SEQ ID no. 3, muy preferiblemente a la indicada ' en SEQ ID no. 2. Dicha estabilidad al almacenamiento está presente si, después de un almacenamiento durante cuatro semanas a 50°C, el agente de lavado o limpieza de conformidad con la invención tiene un rendimiento de limpieza idéntico o mayor que el agente de lavado o limpieza que ha de ser usado a modo de comparación, en donde el agente de conformidad con la invención difiere del agente de lavado o limpieza que ha de ser utilizado a modo de comparación sólo por la proteasa contenida en el mismo .

El agente que ha de ser usado a modo de comparación comprende muy preferiblemente un agente de lavado automático de vajilla liquido bifásico como se ha indicado anteriormente, en donde el rendimiento de la limpieza se determina como se ha indicado anteriormente.

Al comienzo del almacenamiento, ambos agentes que se han de comparar tienen la actividad amilolitica inicial idéntica, contienen la proteasa en una concentración idéntica con respecto a la enzima activa, y ambos agentes son tratados de la misma manera. La actividad proteolitica en los agentes es en cada caso determinada a través de la liberación del cromóforo para-nitroanilina (pNA) del sustrato suc-AAPF-pNA, y la actividad amilolitica de la misma es en cada caso determinada como se ha indicado anteriormente. Las actividades iniciales para la proteasa y la amilasa en el agente respectivo no son iguales a cero.

El uso de la amilasa en actividad idéntica y las proteasas en concentración idéntica, en relación con la proteina activa, asegura que, incluso en el caso de cualquier divergencia en la relación de sustancia activa a proteina total (valores de actividad especifica) , es las propiedades enzimáticas realmente presente que se comparan.

A menos que se indique lo contrario, para los propósitos de la presente invención, en cada caso se hace referencia al peso del agente de lavado liquido, es decir, los valores se establecen en relación con el peso de la misma .

Numerosas proteasas y, en particular, subtilisinas se forman como "preproteinas" , es decir, acompañados de un propéptido y un péptido de señal, en donde la función del péptido de señal consiste convencionalmente en asegurar la exportación de la proteasa de la producción celular en el periplasma o el medio que rodea a la célula, y el propéptido es convencionalmente necesario para el correcto doblamiento de la proteasa. El péptido de señal y el propéptido son como regla general la parte N-terminal de la preproteina. El péptido de señal se escinde en condiciones naturales del resto de la proteasa por una peptidasa de señal. El doblamiento correcto, final, asistido por propéptido de la proteasa a continuación tiene lugar. La proteasa está entonces en su forma activa y en sí escinde el propéptido. Una vez que el propéptido se ha escindido, la proteasa entonces madura, en particular la subtilisina, ejerce su actividad catalítica sin los aminoácidos N-terminales originalmente presentes. Para aplicaciones industriales en general y en particular para los propósitos de la invención, las proteasas maduras, es decir, las enzimas procesadas después de la producción de las mismas, son las preferidas en las preproteíñas . Las proteasas pueden ser modificadas adicionalmente por las células que las producen después de la producción de la cadena del polipéptido, por ejemplo, por unión de moléculas de azúcar, formilación, aminación, etc. Dichas modificaciones son modificaciones posteriores a la traducción y pueden, pero no necesariamente, ejercer una influencia sobre la función de la proteasa.

La proteasa madura puede también, además, estar truncada en su extremo N-terminal y/o C-terminal, de tal manera que una proteasa truncada en relación con SEQ ID no. 1 o SEQ ID no. 2 o SEQ ID no. 3, es decir, un fragmento, está presente en el agente de lavado o limpieza de conformidad con • la invención. Todas las declaraciones de identidad se refieren en este caso a aquel dominio en el cual se asigna el fragmento respectivo en una alineación de SEQ ID no. 1. El fragmento respectivo, sin embargo, en cualquier caso, contiene aquellas posiciones que se asignan a las posiciones 3, 4, 99 y/o 199 en una alineación con SEC ID no. 1, y aquí comprende modificaciones correspondientes a las provistas de conformidad con la invención. Además, un fragmento de este tipo es proteoliticamente activo. Un fragmento que se prefiere, además, en este sentido comprende una secuencia de aminoácidos que, en una longitud de por lo menos 100 o por lo menos 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265 o 266 posiciones de aminoácidos contiguos, coincide con SEC ID no. 1 o SEQ ID no. 2 o SEQ ID no. 3, considerando los aminoácidos indicados anteriormente para la posición 99 y, además, para las posiciones 3 y/o 4 y/o 199 y/o 211. El rendimiento de limpieza y/o la estabilidad al almacenamiento de un agente de lavado o limpieza liquido de conformidad con la invención que comprende dicho fragmento corresponde (n) muy preferiblemente por lo menos al de un agente de lavado o limpieza que contiene una proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID no. 2 o SEQ ID no. 3, en cada caso determinada como se ha indicado.

Un agente de conformidad con la invención contiene la proteasa cada vez mayor preferiblemente en una cantidad de 1 x 10~8 a 5% en peso, de 0.0001 a 3% en peso, de 0.0005 a 1% en peso, de 0.001 a 0.75% en peso y muy preferiblemente de 0.005 a 0.5% en peso, en relación con la proteina activa. Un agente de conformidad con la invención contiene la amilasa cada vez mayor preferiblemente en una cantidad de 1 x 10"8 a 5% en peso, de 0.0001 a 3% en peso, de 0.0005 a 1% en peso, de 0.001 a 0.75% en peso y muy preferiblemente de 0.005 a 0.5% en peso, en relación con la proteina activa. La concentración de proteina se puede determinar con la ayuda de métodos conocidos, por ejemplo el método de BCA (ácido bicinconinico ; ácido 2 , 2 ' -biquinolil-4 , 4 ' -dicarboxilico ) o el método de biuret (AG Gornau, CS Bardawill y MM David, J. Biol. Chem., 177 (1948), pp 751-766). La concentración de proteina activa procede a este respecto a través de una titulación de los centros activos usando un inhibidor irreversible adecuado (para proteasas por ejemplo, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)) y determinación de la actividad residual (compárese con M. Bender et el., J. Am. Chem. Soc. 88, 24 (1966), pp 5890-5913).

La proteasa y/o amilasa, además, pueden ser adsorbidos sobre sustancias portadoras y/o estar incrustadas en sustancias encapsulantes con el fin de protegerlas contra inactivación prematura. En la solución de lavado, es decir, en condiciones de uso, la enzima es luego liberada y se puede llevar a cabo su acción catalítica.

En una modalidad adicional de la invención, el agente de lavado o de limpieza se caracteriza porque comprende además un componente que se selecciona de i. una sustancia aniónica y/o polianiónica, y/o ii. una sustancia catiónica y/o policatiónica, y/o iii. una sustancia que comprende grupo (s) hidroxilo y/o polihidroxilo .

Se ha encontrado que la adición de dichas sustancias mejora aún más el rendimiento de limpieza de agentes de lavado y limpieza, en particular de agentes de lavado y limpieza líquidos que contienen proteasas y amilasas, en particular aquellos descritos anteriormente, en particular a temperaturas comparativamente .bajas, en particular entre 10°C y 50°C, entre 10°C y 40°C, entre 10°C y 30°C y/o entre 20°C y 40°C. En particular, en combinación con una proteasa que se ha de usar de conformidad con la invención, se produce una acción sinérgica, sobre todo con respecto a la remoción de por lo menos un tipo de suciedad sensible a la proteasa, en particular, una como la que se mencionó anteriormente.

Las sustancias indicadas anteriormente en i. son sustancias aniónicas o polianiónicas , es decir, estas sustancias tienen por lo menos una y preferiblemente un número de cargas negativas. Las sustancias son preferiblemente un polímero con por lo menos un monómero cargado negativamente, de preferencia con una pluralidad de monómeros cargados negativamente. De conformidad con la invención, por lo tanto, este polímero es preferiblemente un polímero cargado negativamente. Se da preferencia, por ejemplo, a polímeros de ácidps orgánicos o las sales de los mismos, en particular, poliacrilatos y/o ácidos de polisacáridos y/o copolímeros de poliacrilato y/o copolímeros de polisacáridos. A este respecto, otros compuestos preferidos son sulfonatos o policarboxilatos poliacrílieos y las sales de los mismos, copolímeros o sales de los copolímeros .

Ejemplos de sustancias que muy preferiblemente se han de usar son Acusol 587D (sulfonato poliacrílico; Rohm & Haas/Dow Chemical), Acusol 445N (sal de sodio de policarboxilato; Rohm & Haas/Dow Chemical), Acusol 590 (copolímero de poliacrilato; Rohm & Haas/Dow Chemical) , Acusol 916N (sal de sodio de policarboxilato; Rohm & Haas/Dow Chemical), Sokalan CP42 (sal de sodio de policarboxilato modificado; BASF) , Sokalan PA 30CL (sal de sodio de policarboxilato; BAS F) , Dequest P 9000 (ácido polimaleico; ácido Thermphos) , algínico, ácido poli-2-acrilamido-2-metil-l'-propanosulfónico, sal de sodio de ácido poli-4- estirenosulfónico-co-ácido maleico, sal de sodio de ácido poli-acrilamido-co-ácido acrílico, sal de sodio de ácido metacrilico, sal de sodio de poli-metil-vinil éter-alt-ácido maleico o sal de sodio de ácido polivinilsulfónico .

Las sustancias indicadas anteriormente en ii. son sustancias catiónicos o policatiónicas , es decir, estas sustancias tienen por lo menos una y preferiblemente una pluralidad de cargas positivas. Las sustancias son preferiblemente un polímero con por lo menos un monómero cargado positivamente, preferiblemente con una pluralidad de monómeros cargados positivamente. De conformidad con la invención, por lo tanto, este polímero es preferiblemente un polímero cargado positivamente. Ejemplos de compuestos preferidos a este respecto son las sales de poliaminas, polietileniminas o los copolímeros de los mismos, sales de polialilaminas , sales de compuestos de polidialildimetil amonio o compuestos de poli ( acrilamida-co-dialil dimetil amonio) .

Las sustancias indicadas en el punto III. son sustancias que comprenden por lo menos un grupo hidroxilo y/o grupo polihidroxilo y preferiblemente una pluralidad de grupos hidroxilo y/o grupos polihidroxilo. A este respecto, se da preferencia por ejemplo a alcoholes polivinílieos , por ejemplo aquellos disponibles bajo el nombre comercial de Mowiol (Kremer Pigmente GmbH & Co. KG) .

Se señala expresamente en este punto que una sustancia especifica puede pertenecer a uno o más de los grupos mencionados anteriormente i. a iii. Por ejemplo, puede ser un polímero aniónico, que comprende uno o más grupos hidroxilo y/o grupo (s) polihidroxilo . Dicha sustancia entonces pertenece a los grupos i. y iii. Un polímero catiónico que comprende uno o más grupos hidroxilo y/o grupo (s) polihidroxilo asimismo pertenece a los grupos ii. y iii .

Es igualmente posible para los propósitos de la presente invención usar derivados de las sustancias mencionadas anteriormente como pertenecientes a i., ii. o III. Para los propósitos de la presente solicitud, por derivado se entiende una sustancia que está modificada químicamente sobre la base de una de las sustancias indicadas anteriormente, por ejemplo por la conversión de una cadena lateral o por la unión covalente de otro compuesto a la sustancia. Dicho compuesto puede ser, por ejemplo, compuestos de peso molecular bajo tales como lípidos o mono-, oligo- o polisacáridos o aminas o compuestos de amina. La sustancia además puede ser glicosilada, hidrolizada, oxidada, N-metilada, N-formilada, N-acetilada o contiene metilo, formilo, etilo, acetiló, t-butilo, anisilo, bencilo, trifluoroacetilo, N-hidroxisuccinimida, t-butiloxicarbonilo, benzoílo, 4-metilbencilo, tioanizilo, tiocresilo, bencilcximetilo, 4-nitrofenilo, benciloxicarbonilo, 2-nitrobenzoilo, 2-nitrofenilsulfenilo, 4-toluensulfonilo, pentafluorofenilo, difenilmetilo, 2-clorobenciloxicarbonilo, 2 , 4 , 5-triclorofenilo, 2-bromobenciloxicarbonilo, 9-fluorenilmetiloxicarbonilo, trifenilmetilo, 2,2,5,7,8-pentametilcromanilo-6-sulfonilo . Por derivado también se entiende la unión covalente o no covalente de la sustancia a un vehículo macromolecular , o igualmente también la inclusión no covalente en estructuras de jaula macromoleculares adecuadas. El acoplamiento de las reacciones con otros compuestos macromoleculares, como por ejemplo polietilenglicol , también puede llevarse a cabo. Modificaciones químicas preferidas adicionales son la modificación de uno o más de los grupos químicos -COOH, -OH, =NH, -NH2, -SH a -COOR, -OR, -NHR, -NR2, -NHR, -NR, -SR; en donde : R es -CH=CH-R2, -C=C- 2, -C(R2)=CH2, -C (R2) =C (R3 ) , -CH=NR2, -C(R2)=N-R3, un sistema de anillo de 4-7 C con o sin sustitución, un heterociclo de 4-7 nitrógenos con o sin sustitución, o una cadena de C2 a C8 con 1 a 5 enlaces dobles o triples con sustituciones seleccionadas entre Rl, R2 , o R3, en donde -Rl es H, -R, - O2, -CN, sustituyente halogenuro, -N3, -alquilo de Ci-8, - (CH2) nC02R2, alquenilo de C2-8-C02R2, -0 (CH2) nCo2R2, - C(0)NR2R3, -P(0) (OR2)2, tetrazol-5-il alquilo sustituido, - (CH2) ?? (CH2) n-arilo, -NR2R3, -(CH2)nOR2, -(CH2)nSR2, -N (R2) C (O) R3, -S(02)NR2R3, -N ( R2 ) S (02 ) R3 , - (CHR2 ) nNR2R3 , -C(0)R3, (CH2) nN (R3) C (O) R3, -N(R2)CR2R3, (CH2)n-cicloalquilo sustituido o no sustituido, (CH2) -fenilo sustituido o no sustituido, o -ciclo; en donde n es un número mayor que 1 ; -R2 es H, sustituyente halogenuro, alquilo, haloalquilo, - (CH2) n-fenilo, - (CH2) 1-3-bifenilo, -(CH2)i-4_Ph-N (S02-alquilo de Ci-2)2, -C0 (CHRl ) n-ORl , - (CHRl ) n-heterociclo, - (CHRl) n-NH-CO-Rl, - ( CHRl ) n-NH-S02Rl , - (CHRl ) n-Ph-N (S02-alquilo de Ci_2)2, - (CHRl)n-C (O) (CHRl) -NHR1, -( CHRl ) n-C ( S ) (CHRl ) -NHR1 , - (CH2) nO(CH2)nCH3, -CF3, acilo de C2_5, -(CHRl)nOH, - (CHRl)nC02Rl, - (CHRl) n-O-alquilo-, - (CHRl ) n-0- (CH2) n-O-alquilo, - (CHRl) n-S-alquilo, - (CHRl ) n-S (O) -alquilo, -(CHRl)n-S (02) -alquilo, - ( CHRl ) n-S ( 02 ) -NHR3 , -(CHR3)n-N3, - ( CHR3 ) nNHR4 , una cadena de alqueno de C2 a C8 con 1 a 5 dobles enlaces, una cadena de alquino de C2 a Cs con 1 a 5 triples enlaces, (CHR3 ) n-heterociclo sustituido o no sustituido, -(CHR3)n-cicloalquilo sustituido o no sustituido saturado o insaturado; en donde n es un número mayor que 1 y Rl y R3 pueden ser idénticos o diferentes; -R3 es H, -OH, -CN, alquilo sustituido, alquenilo de C2 a C8, cicloalquilo sustituido o no sustituido, -N(R1)R2, heterociclo o heterobiciclo de C5 a C7 saturado o insaturado de 4 a 7 átomos de C, -NR1, -NR2, -NR1R2 que consiste en un ¦heterociclo o un heterobiciclo saturado o insaturado de 4 a 7 átomos de C; -R4 es H, -(CH2)nOH, -C(0)0R5, -C(0)SR5, - (CH2 ) nC (0) R6R7 , -0-C (0) -0-R6 , un aminoácido o un péptido; en donde n es un número entre 0 y 4 ; -R5 es H, -R6 es -C (R7) - (CH2)n-0-C (O) -R8, - (CH2 ) n-C ( R7 ) -0-C(0)R8, - (CH2)n-C (R7) -0-C (0) -0-R8, o -C (R7 ) - ( CH2 ) n-0-C ( 0 ) -0-R8, en donde n es un número entre 0 y ; y -R7 y R8 son en cada caso H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, alquilarilo, alquilarilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, o 0?20?2 alquilo, en donde R7 y R8 pueden ser iguales o diferentes.

De conformidad con la invención, es posible, además, usar todas las combinaciones posibles de las sustancias antes mencionadas como pertenecientes a i., ii. o iii. y/o los derivados de las mismas.

Un agente de lavado o limpieza liquido de conformidad con la invención se puede usar como tal o después de diluirse con agua para limpiar textiles y/o superficies duras. Dicha solución diluida puede fácilmente ser producida mediante la dilución de una parte del agente en una cantidad adicional de agua en proporciones especificas en peso de agente:agua y, opcionalmente, esta dilución se agita para asegurar una distribución uniforme del agente en el agua. Posibles relaciones en peso o volumen de las diluciones son de 1:0 de agente:agua a 1:10,000 o 1:20,000 de agente:agua, preferiblemente de 1:10 a 1:2000 de agente:agua.

Todas las presentaciones liquidas o fluidas pueden servir aquí como agentes de lavado o de limpieza líquidos. "Fluido" para los propósitos de la presente solicitud significa agentes que se puede verter y puede presentar viscosidades de hasta varias decenas de miles de mPa*s. La viscosidad puede medirse con métodos estándares convencionales (por ejemplo, viscosímetro de Brookfield LVT-II a 20 rpm y 20°C, husillo 3) y está preferiblemente en el intervalo de 5 a 30.000 mPa*s. Los agentes preferidos tienen viscosidades de 10 a 15,000 mPa*s, en donde los valores de entre 120 y 8000 mPa*s son más preferidos. Un agente de lavado o limpieza líquido para los propósitos de la presente invención pueden, por lo tanto, también tomar la forma de un gel o una pasta, que puede estar presente como una solución o suspensión homogénea, y por ejemplo ser formulada como una presentación pulverizable u otra presentación convencional. Los agentes de lavado incluyen todos los tipos imaginables de agente de lavado, en particular los agentes de lavado para textiles, alfombras o fibras naturales. Éstos se podrán proveer para uso manual y/o también de máquina. Los agentes de lavado incluyen además auxiliares de lavado, que pueden añadirse al agente de lavado real para el lavado manual o a máquina de textiles, para lograr un efecto adicional. Los agentes de limpieza incluyen todos los agentes, ocurriendo lo mismo en todas las presentaciones indicadas, para la limpieza y/o desinfección de superficies duras, agentes para lavado manual y automático de vajillas, limpiadores de alfombras, agentes abrasivos, limpiadores de vidrio, bloques sanitarios C, etc. Por último, el agentes de pre- y post-tratamiento de textiles son, por una parte, aquellos agentes con los que un articulo de ropa se pone en contacto antes del lavado real, por ejemplo para disolver parcialmente suciedad persistente y, por otro lado, aquellos que en un paso corriente abajo del proceso de lavado real imparten al articulo lavado características deseables adicionales tales como tacto agradable, ausencia de pliegues o carga estática baja. Los últimos agentes incluyen, entre otras cosas, acondicionadores de enjuague. Los desinfectantes son por ejemplo los desinfectantes de manos, desinfectantes de superficies y desinfectantes de instrumentos, que pueden ocurrir asimismo en las presentaciones indicadas.

En una modalidad preferida adicional de la invención, el agente de lavado o limpieza se caracteriza porque comprende por lo menos un ingrediente adicional, en particular, un ingrediente que se selecciona del grupo que consiste de fosfonato, agente tensoactivo, mejorador de detergencia, solvente no acuoso, ácido, sal soluble en agua, espesante y combinaciones de los mismos.

Los fosfonatos son sales y compuestos orgánicos, en particular esteres, de ácido fosfónico. Los fosfonatos primarios (M'H2P03 o HP (0) (OH) (0 ' ) ) y secundarios (M'2HP03 o HP(0) (0M' ) 2) existen como sales, en donde M' representa un metal monovalente. Estos fosfonatos inorgánicos también se conocen como fosfitos primarios o secundarios. Los fosfonatos inorgánicos surgen, por ejemplo, por reacción de ácido fosfónico HP(0) (OH) 2, en particular la forma tautomérica estable de ácido fosforoso, con uno (primario) o dos (secundarios) equivalentes de base, por ejemplo, hidróxido de metal alcalino. Para los propósitos de la presente invención, son preferidos los fosfonatos P-sustituidos orgánicos que comprenden un enlace fósforo-carbono (compuestos organofosforados ) . Su estructura general es R1P(0) (OR2)2, con Rl y/o R2 = alquilo, arilo o H, en donde los residuos alquilo o arilo comprenden, sustituciones adicionales o pueden tener grupos más químicos. Los fosfonatos P-sustituidos orgánicos, surgen, por ejemplo, como resultado de la reacción de ichaelis-Arbusov . Muchos de estos fosfonatos son solubles en agua. Algunos fosfonatos industrialmente importantes llevan adicionalmente grupo (s) amino del tipo NR- (CH2) X-P0 (OH) 2 (R = alquilo, arilo o H) . Algunos de estos aminofosfonatos tienen similitudes estructurales con agentes formadores de complejo tales como EDTA, NTA o DTPA y tienen una función similar. Los fosfonatos más preferidos para los propósitos de la presente invención incluyen en particular organofosfonatos , tales como por ejemplo, ácido 1-hidroxietan-l , 1-difosfónico (HEDP) , ácido aminotri (metilenfosfónico ) (ATMP, también conocido como ácido aminotris (metilenfosfónico) o ácido nitrilotris (metilenfosfónico) (NTMP) ) , ácido dietilentriaminapenta (metilenfosfónico) (DTPMP o DETPMP o DTPNT) ) , ácido etilendiaminotetra (metilenfosfónico (EDTMP, también conocido como ácido etilendiaminotetra (metilenfosfónico) ) y ácido 2-fosfonobutano-1 , 2 , 4-tricarboxilico (PBS-AM, también conocido como ácido 2-fosfonobutano-1, 2 , 4-tricarboxilico o ácido 3-carboxi-3-fosfonoadipico) , que se usan por lo general en forma de las sales de amonio o sales de metal alcalino de los mismos. Es más preferido el ácido dietilentriaminapenta (metilenfosfónico) de sodio. Dicho fosfonato es obtenible por ejemplo bajo el nombre comercial de Dequest ® 2066 (Thermphos) .

El fosfonato está presente preferiblemente en el agente de lavado o limpieza en una cantidad de 0.01 a 2.5% en peso y cada vez más preferiblemente de 0.02 a 2% en peso, de 0.03 a 1.5% en peso y en particular de 0.05 a 1% en peso.

Los agentes tensoactivos aniónicos, no iónicos, zwitteriónicos y/o anfotéricos se pueden usar como agentes tensoactivo. Desde un punto de vista de aplicación, las mezclas de agentes tensoactivos aniónicos y no iónicos son preferidas. El contenido total de agente tensoactivo de agente de lavado o limpieza liquido es preferiblemente inferior a 60% en peso y muy preferiblemente por debajo de 45% en peso, en relación con el agente de lavado o limpieza liquido total.

Los agentes tensoactivos no iónicos adecuados incluyen alcoholes grasos alcoxilados, ásteres alquilicos de ácidos grasos alcoxilados, amidas de ácidos grasos, amidas de ácidos grasos alcoxilados, amidas de ácidos grasos polihidroxilicos , éteres poliglicólicos de alquilfenol, óxidos de amina, alquilpoliglucósidos y mezclas de los mismos .

Los alcoholes alcqxilados , ventajosamente etoxilados, en particular los alcoholes primarios preferiblemente con 8 a 18 átomos de C y en promedio 1 a 12 moles de óxido de etileno (EO) por mol de alcohol, en los que el residuo de alcohol puede ser lineal o preferiblemente metilo-ramificado en la posición 2, o puede contener residuos lineales o metilo-ramificados en la mezcla, como suelen estar presentes en los residuos oxo alcohol, se usan preferiblemente como agentes tensoactivos no iónicos. En particular, sin embargo, se prefieren etoxilatos de alcohol con residuos lineales preparados a partir de alcoholes de origen natural con 12 a 18 átomos de C, por ejemplo alcohol de coco, palmera, grasa de sebo u oleico, y en promedio 2 a 8 EO por mol de alcohol. Los alcoholes etoxilados preferidos incluyen, por ejemplo, alcoholes de C12-14 con 3 EO, 4 EO o 7 EO, alcohol de C9_n con 7 EO, alcoholes de C13-15 con 3 EO, 5 EO, 7 EO u 8 EO, alcoholes de C12-i8 con 3 EO, 5 EO o 7 EO y mezclas de éstos, tales como mezclas de alcohol C12-i4 con 3 EO y alcohol de C12-18 con 7 EO. Los títulos de etoxilación establecidos son promedios estadísticos que, para un producto específico, pueden ser un entero o un número fraccionario. Los etoxilatos de alcohol preferidos presentan una distribución homologa estrecha (etoxilatos de rango estrecho, NRE) . Además de estos agentes tensoactivos no iónicos, también se pueden usar alcoholes grasos con más de 12 EO. Ejemplos de éstos son el alcohol graso de sebo con 14 EO, 25 EO, 30 EO o 40 EO. Los agentes tensoactivos no iónicos' que contienen, grupos EO y PO juntos en una molécula también se pueden usar de conformidad con la invención. Además son adecuados también una mezcla de un alcohol graso etoxilado (relativamente altamente) ramificado y un alcohol graso etoxilado no ramificado, tal como por ejemplo una mezcla de un alcohol graso de Ci6_i8 con 7 EO y 2-propilheptanol con 7 EO. Muy preferiblemente, el agente de lavado, limpieza o post-tratamiento o auxiliar para el lavado contiene un alcohol graso de C12-18 con 7 EO o un oxo alcohol de C13-15 con 7 EO como agente tensoactivo no iónico.

El contenido de agentes tensoactivos no iónicos en el agente de lavado o limpieza alcanza preferiblemente 3 a 40% en peso, preferiblemente 5 a 30% en peso y en particular 7 a 20% en peso, en cada caso en relación con todo el agente de lavado o limpieza.

Además de los agentes tensoactivos no iónicos, el agente de lavado o de limpieza también puede contener tensoactivos aniónicos . Los sulfonatos, sulfatos, jabones, fosfatos de alquilo, agentes tensoactivos de silicón aniónicos y mezclas de los mismos se usan preferiblemente como el agente tensoactivo aniónico.

Los agentes tensoactivos de tipo sulfonato que aquí pueden considerarse preferiblemente son alquilo de Cg-^-bencen sulfonatos, olefinsulfonatos, es decir, mezclas de alquen- e hidroxialcan-sulfonatos y disulfonatos , como se obtienen, por ejemplo, a partir de monoolefinas de C12-18 con un doble enlace terminal o interno por sulfonación con trióxido de azufre gaseoso y posterior hidrólisis alcalina o ácida de los productos de sulfonación. Los alcansulfonatos de C12-18 y los ésteres de ácidos a-sulfograsos (éstersulfonatos ) , por ejemplo, los ésteres metílicos a-sulfonados de coco hidrogenado, semilla de palmera o ácidos grasos de sebo, también son adecuados.

Los alqu (en) ilsulfatos preferidos son las sales de metal alcalino y en particular de sodio de semi-ésteres de ácido sulfúrico de alcoholes grasos de Ci2-Ci8, por ejemplo, preparados a partir de alcohol graso de coco, alcohol graso de sebo, alcohol laurilico, miristilico, cetilico o estearilico u oxo alcoholes de Ci0-C2o y aquellos semi-ésteres de alcoholes secundarios de estas longitudes de cadena. Los alquilo de C12-Ci6-sulfatos y los alquilsulfatos de Ci2-Ci5 y alquilasulfatos de C14-C15 son preferidos debido a sus características de lavado. Los 2 , 3-alquilsulfatos también son agentes tensoactivos aniónicos adecuados.

Los monoésteres de ácido sulfúrico de alcoholes de C7-21 de cadena lineal o ramificados etoxilados con 1 a 6 moles de óxido de etileno son también adecuados, tales como alcoholes de Cg-n 2-metil-ramificados con en promedio 3.5 moles de óxido de etileno (EO) o alcoholes grasos de C12-18 con 1 a 4 EO.

Los jabones también son agentes tensoactivos aniónicos preferidos. Los jabones de ácidos grasos saturados e insaturados son en particular, adecuados, tales como las sales de ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido erúcico (hidrogenado) y ácido behénico y en particular mezclas de jabones derivadas de ácidos grasos naturales, por ejemplo, ácidos grasos de coco, de semilla de palmera, aceite de oliva o de sebo.

Los agentes tensoactivos aniónicos que incluyen jabones pueden estar presentes en la forma de sales de sodio, potasio, magnesio o amonio de los mismos. Los agentes tensoactivos aniónicos están presentes preferiblemente en forma de las sales de sodio de los mismos. Contraiones preferidos para los agentes tensoactivos aniónicos también son las formas protonadas de colina, trietilamina o metiletilamina .

El contenido de agente tensoactivo aniónico de un agente de lavado o limpieza puede alcanzar 1 al 40% en peso, preferiblemente de 5 a 30% en peso, y en particular preferiblemente 10 a 25% en peso, en cada caso en relación con todo el agente de lavado o limpieza.

Los posibles mejoradores de detergencia que pueden estar contenidos en el agente de lavado o limpieza son en particular silicatos, silicatos de aluminio (en particular zeolitas), carbonatos, sales de ácidos di- y policarboxilicos orgánicos y mezclas de estas sustancias.

Los mejoradores de detergencia orgánicos que pueden estar presentes en el agente de lavado o limpieza son, por ejemplo, ácidos policarboxilicos, que se pueden usar en forma de las sales de sodio de los mismos, en donde los ácidos policarboxilicos se toman para significar aquellos ácidos carboxilicos que portan más de una función ácido. Estos son, por ejemplo, ácido cítrico, ácido adípico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido maleico, ácido fumárico, ácidos sacáricos, ácidos aminocarboxilicos, ácido nitrilotriacético (NTA) , ácido metilglicindiacético (MGDA) y los derivados de los mismos y mezclas de éstos. Las sales preferidas son las sales de ácidos policarboxilicos tales como ácido cítrico, ácido adípico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido tartárico, ácidos sacáricos y mezclas de éstos.

Los policarboxilatos poliméricos son adecuados además como mejoradores de detergencia. Estos son por ejemplo las sales de metal alcalino de ácido poliacrílico o de ácido polimetacrí lico, por ejemplo aquellos con una masa molecular relativa de 600 a 750,000 g/mol.

Los polímeros adecuados son en particular los poliacrilatos que tienen preferiblemente una masa molecular de 1000 a 15,000 g/mol. Debido a su solubilidad superior, pueden a su vez ser preferidos los poliacrilatos de cadena corta de este grupo, éstos teniendo masas molares de 1000 a 10,000 g/mol, y muy preferiblemente de 1000 a 5000 g/mol.

También son adecuados los policarboxilatos copoliméricos , en particular los de ácido acrílico con ácido metacrílico y ácido acrílico o ácido metacrílico con ácido maleico. Con el fin de mejorar la solubilidad en agua, los polímeros pueden contener también ácidos alilsulfónicos, tales como el ácido aliloxibencensulfónico y ácido metalilsulfónico, como un monómero.

Preferiblemente, sin embargo, los mejoradores de detergencia solubles, tales como por ejemplo ácido cítrico, o polímeros acrílicos con masas molares de 1000 a 5000 g/mol se usan preferiblemente en los agentes de lavado o limpieza líquidos.

Las masas molares indicadas para policarboxilatos poliméricos comprenden para los propósitos de este documento masas molares promedio en peso Mw de la forma ácida respectiva, éstas en principio habiendo sido determinadas por medio de cromatografía de penetración en gel (GPC), en donde se usó un detector de UV. La medición se hizo aquí con respecto a un patrón de ácido poliacrílico externo, que provee valores realistas del peso molecular como consecuencia de su relación estructural con los polímeros investigados. Estos valores difieren marcadamente de los valores de peso molecular en los cuales los ácidos poliestirenosulfónicos se usan como el estándar. Las masas molares medidas en relación con los ácidos poliestirenosulfónicos son en general marcadamente más altas que las masas molares indicadas en el presente documento.

Dichas substancias mejoradoras de detergencia orgánicas, si se desea, pueden estar presentes en cantidades de hasta 40% en peso, en particular de hasta 25% en peso Y preferiblemente de 1% en peso a 8% en peso. Las cantidades próximas al límite superior indicado se usan preferiblemente, en particular, en agentes pastosos o líquidos que contienen agua.

Los agentes de lavado o limpieza de conformidad con la invención son líquidos y preferiblemente contienen agua como el solvente principal. Además, se pueden añadir solventes no acuosos al agente de lavado o limpieza. Los solventes no acuosos adecuados incluyen alcoholes mono- o polihídricos , alcanolaminas o éteres glicólicos, siempre que sean miscibles con agua en el intervalo de concentración indicado. Los solventes se seleccionan preferiblemente de etanol, n-propanol, i-propanol, butanoles, glicol, propanodiol, butanodiol, glicerol, diglicol, éter propílico de dietilenglicol, éter monobutílico de dietilenglicol, hexilenglicol , éter metílico de etilenglicol, éter etílico de etilenglicol, éter propílico de etilenglicol, éter n-butílico de etilenglicol, éter metílico de dietilenglicol, éter etílico de dietilenglicol, éter metílico de propilenglicol , éter etílico de propilenglicol, éter propílico de propilenglicol, éter monometílico de dipropilenglicol , éter monoetílico de dipropilenglicol, éter monometílico de diisopropilenglicol , éter monoetílico de diisopropilenglicol, metoxitriglicol, etoxitriglicol, butoxitriglicol, l-butoxietoxi-2- propanol, 3-metil-3-metoxibutanol , éter t-butílico de propilenglicol, éter di-n-octílico y mezclas de estos solventes. Sin embargo, es preferido que los agentes de lavado o de limpieza contengan un poliol como solvente no acuoso. El poliol puede comprender en particular glicerol, 1, 2-propanodiol, 1 , 3-propanodiol , etilenglicol, dietilenglicol y/o dipropilenglicol . Muy preferiblemente, el agente de lavado o limpieza contiene una mezcla de un poliol y un alcohol monohidrico. Se pueden usar solventes no acuosos en los agentes de lavado o limpieza en cantidades de entre 0.5 y 15% en peso, pero preferiblemente por abajo de 12% en peso.

A fin de establecer un valor de pH deseado que no se obtenga automáticamente mezclando los componentes restantes, los agentes pueden contener ácidos que sean compatibles con el sistema y que sean compatibles con el ambiente, en particular ácido cítrico, ácido acético, ácido tartárico, ácido málico, ácido láctico, ácido glicólico, ácido succinico, ácido glutárico y/o ácido adípico, así como ácidos minerales, en particular ácido sulfúrico, o bases, en particular, hidróxidos de amonio o de metal alcalino. Dichos reguladores del pH están presentes en los agentes en cantidades de preferiblemente no más de 20% en peso, en particular de 1.2% en peso a 17% en peso.

Un agente de conformidad con- la invención puede contener además una o más sales solubles en agua, que sirven por ejemplo para ajustar la viscosidad. Las sales pueden ser inorgánicas y/u orgánicas. Sales inorgánicas utilizables aquí se seleccionan preferiblemente del grupo que comprende halogenuros, sulfatos, sulfitos, carbonatos, bicarbonatos, nitratos, nitritos, fosfatos y/u óxidos de metales alcalinos, de metales alcalinotérreos , de aluminio y/o de transición metales, solubles en agua incoloros; además, se pueden usar sales de amonio. Los halogenuros y sulfatos de. metales alcalinos son más preferidos, por lo que la sal inorgánica se selecciona preferiblemente del grupo que comprende cloruro de sodio, cloruro d potasio, sulfato de sodio, sulfato de potasio y mezclas de los mismos. Ejemplos de sales orgánicas que se pueden usar son sales de metal alcalino, metal alcalinotérreo, amonio, aluminio y/o metales de transición de ácidos carboxilicos solubles en agua incoloros. Las sales se seleccionan preferiblemente del grupo que comprende formiato, acetato, propionato, citrato, malato, tartrato, succinato, malonato, oxalato, lactato y mezclas de los mismos.

Para propósitos de espesamiento, un agente de conformidad con la invención puede contener uno o más espesantes. El espesante se selecciona preferiblemente del grupo que comprende xantano, guar, carragenina, agar-agar, gelano, pectina, harina de semilla de algarrobo y mezclas de los mismos. Estos compuestos son espesantes eficaces incluso en presencia de sales inorgánicas. En una modalidad más preferida, el agente de lavado o limpieza contiene xantano como espesante, ya que de xantano espesa eficazmente incluso en presencia de concentraciones de sal elevadas y evita la separación macroscópica de la fase continua. Además, el espesante estabiliza la fase continua de agente tensoactivo bajo y evita la separación macroscópica de fases.

Como alternativa o además, los ( co )' polímeros de ácido (met ) acrí lico también se pueden usar como espesantes. Los (co) polímeros acrílicos y metacrílicos adecuados incluyen, por ejemplo, los homopolímeros de peso molecular alto, entrelazados con un poliéter polialquenílico, en particular, un éter alílico de sacarosa, pentaeritritol o propileno, de ácido acrílico (nombre de INCI de conformidad con el "International Dictionary of Cosmetic Ingredients" (Diccionario Internacional de Ingredientes para Cosméticos) de la "Asociación de Cosméticos, Productos de Tocador y Fragancias ( CTFA) " : Carbomer) , que también son conocidos como polímeros de carboxivinilo . Dichos ácidos poliacrí lieos se pueden obtener, entre otras cosas, con los nombres comerciales Polygel© y Carbopol®. Los siguientes copolimeros de ácido acrílico son más adecuados: (i) copolimeros de dos o más monómeros del grupo de ácido acrílico, ácido metacrílico y los ésteres simples de los mismos, formados preferiblemente con alcanoles de Ci_4 (copolímero de acrilatos de INCI), que se pueden obtener, por ejemplo, con los nombres comerciales Aculyn®, Acusol® o Tego®Polymer , (ii) copolimeros de ácido acrílico entrelazados de peso molecular alto, incluyendo por ejemplo los copolimeros de acrilatos de alquilo de C10-30 entrelazados con un éter alilico de sacarosa o de pentaeritritol con uno o más monómeros del grupo de ácido acrilico, ácido metacrilico y los ásteres simples de los mismos, formados preferiblemente con alcanoles de Ci_4 (Acrilatos/polimero entrelazado de acrilato de alquilo de Cio-30 de INCI) y se pueden obtener por ejemplo bajo el nombre comercial Carbopol®. Los polímeros más adecuados son ( co ) polímeros de ácido (met ) acrilico del tipo Sokalan®.

Puede ser preferible que el agente de lavado o limpieza de conformidad con la invención contenga un ácido (co) polímero (met ) acrilico en combinación con un espesante adicional, preferiblemente xantano. El agente de lavado o limpieza puede contener 0.05 a 1.5% en peso y preferiblemente de 0.1 a 1% en peso, en cada caso con respecto a todo el agente de lavado o limpieza, de espesante. La cantidad de espesante usado aquí depende del tipo de espesante y el grado de engrosamiento deseado.

Los productos líquidos o pasLosos de conformidad con la invención en forma de soluciones que contienen solventes convencionales son producidos generalmente por simple mezclado de los constituyentes, que pueden introducirse en un mezclador automático como un material no disuelto o como una solución.

Los agentes de lavado o limpieza de conformidad con la invención pueden contener únicamente una proteasa y una amilasa, como se describe. Alternativamente, también pueden contener otras enzimas hidroliticas u otras enzimas en una concentración conveniente para la eficacia del agente. Por lo tanto, la invención provee agentes que comprenden adicionalmente una o más enzimas adicionales, en donde en principio se pueden usar todas las enzimas establecidas para este propósito en la técnica anterior. Enzimas preferiblemente utilizables adicionales son las enzimas que pueden llevar a cabo una actividad catalítica en el agente de conformidad con la invención, en particular, una proteasa, amilasa, celulasa, hemicelulasa, mananasa, tanasa, xilanasa, xantanasa, xiloglucanasa, ß-glucosidasa, pectinasa, carragenina, perhidrolasa , oxidasa, oxidorreductasa o una lipasa, y las mezclas de las mismas. Enzimas adicionales están presentes ventajosamente en el agente en cada caso en una cantidad de 1 x 10"8 a 5 por ciento en peso en relación a la proteína activa. Cada enzima adicional preferiblemente está cada vez más presente en los agentes de conformidad con la invención en una cantidad de 1 x 10"'-3% en peso, de 0.00001 a 1.5% en peso, de 0.00005 a 1% en peso, de 0.0001 hasta 0.75% en peso y muy preferiblemente de 0.0005 a 0.5% en peso, en relación con la proteína activa. Muy preferiblemente, las enzimas presentan un rendimiento de limpieza sinérgico con respecto a su acción en relación con la suciedad o manchas específicas, es decir, las enzimas contenidas en la composición del agente ayudan al rendimiento de limpieza una de la otra. En particular, preferiblemente, una acción sinérgica de este tipo está presente entre la proteasa de conformidad con la invención y una enzima adicional de un agente de conformidad con la invención, incluyendo, en particular, entre la proteasa indicada y la amilasa y/o una lipasa y/o una mananasa y/o una celulasa y/o una pectinasa. Los efectos sinérgicos se pueden producir no sólo entre las diferentes enzimas, sino también entre una o más enzimas y otros ingredientes del agente de conformidad con la invención.

En una modalidad adicional de la invención, el agente de lavado o limpieza se caracteriza porque es un agente de lavado automático de vajilla. Como se define en la presente solicitud, los agentes de lavado automático de vajilla son composiciones que se pueden usar para la limpieza de platos sucios en un método de lavado automático de vajilla. Los agentes de lavado automático de vajilla de conformidad con la invención, por lo tanto difieren, por ejemplo, de auxiliares de enjuague automáticos, que siempre se usan en combinación con agentes de lavado automático de vajilla y por si mismas no llevan a cabo ninguna acción de limpieza. Requisitos más estrictos se aplican a menudo a lavado de vajilla en la lavadora que al lavado de vajilla a mano. Por ejemplo, después de la limpieza en la máquina, la vajilla no sólo debe estar completamente libre de residuos de alimentos, sino que, por ejemplo, tampoco debe mostrar manchas blanquecinas basadas en la dureza del agua u otras sales minerales que se originan de gotas de agua seca debido a la falta de agentes humectantes. Los agentes para lavado automático y vajilla modernos satisfacen estos requisitos mediante al incorporar sustancias activas de limpieza y/o acondicionamiento y/o ablandamiento del agua y/o enjuague y, por ejemplo, son conocidas por el consumidor como agentes de lavado de vajilla "2 en 1" o "3 en 1". Los agentes de lavado automático de vajilla contienen mejoradores de detergencia como un componente esencial para limpieza y enjuague con éxito. Por un lado, estos mejoradores de detergencia aumentan la alcalinidad de la solución de lavado, en sonde las grasas y aceites se emulsionan y se saponifican a medida que aumenta la alcalinidad y, por otro lado, reducen la dureza del agua de la solución de lavado por formación de complejos de iones de calcio presente en la solución acuosa. En un desarrollo posterior preferido, el agente de lavado automático de vajilla está encerrado en una película soluble en agua. La película comprende preferiblemente un alcohol polivinílico (PVA) o consiste de alcohol polivinílico (PVA) .

La invención además provee el uso de un agente de lavado o limpieza de conformidad con la invención para la remoción de suciedad, en particular suciedad sensible a proteasa y/o amilasa, de textiles o de superficies duras, es decir, para la limpieza de textiles o de superficies duras. Esto se debe a que los agentes de conformidad con la invención, en particular debido a la combinación de proteasa y amilasa contenida en los mismos, se pueden usar ventajosamente para remover la correspondiente suciedad de textiles o de superficies duras. Las modalidades de este aspecto de la invención incluyen, por ejemplo, el lavado de ropa a mano, la remoción manual de manchas de textiles o de superficies duras o el uso en conexión con un método de máquina. Todos los factores, aspectos y modalidades que se han descrito para agentes de lavado o limpieza de conformidad con la invención también son aplicables a este aspecto de la invención. Por lo tanto, se hace referencia expresa en este punto a la descripción en los puntos correspondientes, indicando que esta descripción se aplica también al uso anterior de conformidad con la invención.

La invención además provee un método para limpieza de textiles o superficies duras, en el que un agente de lavado o limpieza de conformidad con la invención se usa en por lo menos uno de los pasos del método. Éstos incluye métodos tanto manuales como de máquina, en donde se prefieren los métodos de máquina, debido a que son controlables con más precisión, por ejemplo, en términos de las cantidades usadas y periodos de exposición.

Los métodos para la limpieza de textiles en general se distinguen en que, en dos o más pasos del método, varias sustancias con una acción de limpieza se aplican sobre el material que ha de ser limpiado y, después del periodo de exposición, se lavan, o que el material que ha de ser limpiado es tratado de alguna otra manera con un agente de lavado o una solución o dilución de este agente. Lo mismo se aplica a los métodos para la limpieza de todos los materiales distintos a los textiles, en particular, superficies duras. Cualesquiera métodos de lavado o limpieza concebibles se pueden mejorar en por lo menos uno de los pasos del método de aplicación de un agente de lavado o limpieza de conformidad con la invención y a continuación, constituyen modalidades de la presente invención. Todos los factores, aspectos y modalidades que se han descrito para agentes de lavado o limpieza de conformidad con la invención también son aplicables a este aspecto de la invención. Por lo tanto, se hace referencia expresa en este punto a la descripción en los puntos correspondientes, indicando que esta descripción se aplica también a los métodos anteriores de conformidad con la invención.

En una modalidad preferida, el método se caracteriza porque la amilasa está presente en la solución de lavado en una concentración de 1 x 10"10-0.2% en peso, de 0.000001-0.12% en peso, de 0.000005 a 0.04% en peso, de 0.00001-0.03% en peso y muy preferiblemente de 0.00005 a 0.02% en peso, y/o porque la proteasa está presente en la solución de lavado en una concentración de lxl0"10-0.2% en peso, de 0.000001 a 0.12% en peso, de 0.000005-0.04% en peso, de 0.00001 a 0.03% en peso y muy preferiblemente de 0.00005 a 0.02% en peso, en donde los valores indicados se refieren a la' proteína activa en la solución de lavado. En una modalidad preferida adicional, el método se caracteriza porque se lleva a cabo a una temperatura de entre 10°C y 60°C, preferiblemente entre 20°C y 50°C y muy preferiblemente de entre 30°C y 50°C.

Las proteasas usadas en los agentes de conformidad con la invención se pueden usar ventajosamente, de conformidad con las explicaciones anteriores, en agentes de lavado y limpieza de conformidad con la invención, así como en los métodos, en particular, métodos de lavado y limpieza. Por lo tanto, se pueden usar ventajosamente para proveer una actividad proteolítica en los agentes correspondientes.

La presente invención provee además el uso de una proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos que, en toda la longitud de la misma, es por lo menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID no. 1 y, en la numeración de acuerdo con SEQ ID no. 1, tiene la sustitución de aminoácidos R99E o R99D en combinación con por lo menos otras dos sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de S3T, V4I y V199I, con el fin de proveer una actividad proteolitica en un agente de lavado o limpieza liquido que además comprende una amilasa.

Todos los factores, aspectos y modalidades que se han descrito para agentes de lavado o limpieza de conformidad con la invención son también aplicables a los usos indicados. Por lo tanto, se hace referencia expresa en este punto a la descripción en los puntos correspondientes, indicando que esta descripción se aplica también a los usos anteriores de conformidad con la invención.

Ejemplo: Determinación de la estabilidad al almacenamiento de un agente de lavado automático de vajilla liquido de conformidad con la invención La formulación de base era un agente de lavado automático de vajilla liquido bifásico que contiene amilasa, que tenia la siguiente composición (todos los valores indicados en por ciento en peso) : (a) Fase de enzima: Mejorador de detergencia 18.0 Alcohol de azúcar 12.0 Agente tensoactivo no iónico (etoxilato de alcohol graso de Cg-Cio con 22 EO) 5.0 Compuesto de álcali (base) 3.5 Ácido bórico 3.0 Fosfonato (HEDP) 1.5 Amilasa 1.2 Sal de Ca 1.2 Sal de Zn 0.2 Espesante 1.0 Colorante, perfume, conservador 0.3 Agua hasta La amilasa presente era una variante de a-amilasa que, en relación con la a-amilasa AA560 de acuerdo con SEQ ID no. 4, tiene las siguientes modificaciones de secuencia en la numeración de la a-amilasa AA560: R118K, D183* (deleción) , G184 * (deleción) ,. N195F, R320K, R458K (Novozymes). (b) Fase alcalina: Mejorador de detergencia 12.0 Carbonato de sodio 10.0 Sulfopolimero 7.0 Compuesto de álcali (base) 4.0 Monoetanolamina 3.5 Fosfonato (HEDP) 4.0 Espesante 1.0 Colorante, perfume,- conservador 0.3 Agua hasta 100 La fase de enzima de la formulación de base se combinó para los diversos lotes de prueba con, en cada caso, 3% en peso de las preparaciones de las siguientes proteasas (que resultan en cada caso en 0.5% en peso de proteina activa) : Lote 1: variante de rendimiento mejorado de la proteasa de Bacillus lentus de acuerdo con SEQ ID no. 2 de WO2011/032988 (de referencia); Lote 2: proteasa de acuerdo con SEQ ID no. 2 (SEQ ID no. 1 + S3T + V4I + R99E + V199I).

El rendimiento de limpieza se determinó mediante el prorrateo de las dos fases en proporciones idénticas (en cada caso, 20 g por fase) . El lavado se llevó a cabo en un intervalo de valores de pH entre pH 9 y pH 10 en una máquina lavavaj illas G698SC de Miele en un volumen de 4 litros durante un período de 60 minutos a una temperatura de 50°C.

Se usó vajilla con la siguiente suciedad: leche (A), carne picada (B) , yema de huevo (C) , avena (D) y almidón (E) .

El rendimiento de limpieza se evalúa visualmente usando el método de IKW estándar en una escala de 1 a 10, en el que un valor de 10 es la mejor calificación (ningún residuo perceptible) .

Los agentes de lavado de los lotes 1 y 2 se probaron con respecto a su rendimiento de limpieza antes y después del almacenamiento durante cuatro semanas a 40°C. Los resultados se muestran en la tabla 1 siguiente: Tabla 1: Después de un almacenamiento de cuatro semanas 40°C, es evidente que la composición de conformidad con la invención, gracias a la proteasa contenida en la misma, presenta claramente un rendimiento de limpieza mejorado, en particular, en los tipos sensibles a la proteasa de la suciedad B y C (rendimiento de la limpieza proteolitica) . En particular, el rendimiento de limpieza sobre los tipos sensibles a la amilasa de suciedad D y E también se ha mejorado (rendimiento de limpieza amilolítica) .

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un agente de lavado o limpieza líquido que comprende (a) una proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos que, en toda la longitud de la misma, es por lo menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID no. 1 y, en la numeración de acuerdo con SEQ ID no. 1, tiene la sustitución de aminoácidos R99E o R99D en combinación con por lo menos otras dos sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de S3T, V4I y V199I, y (b) una amilasa.

2. El agente de lavado o limpieza de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteasa comprende una secuencia de aminoácidos que, en toda la longitud de la misma, es por lo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98% y 98.5% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID no. 1 y, en la numeración de acuerdo con SEQ ID no. 1, tiene la sustitución de aminoácidos R99E en combinación con las sustituciones de aminoácidos S3T, V4I y V199I, en particular, una proteasa que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID no. 2.

3. El agente de lavado o limpieza de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteasa comprende una secuencia de aminoácidos que, en toda la longitud de la misma, es por lo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98% y 98.5% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID no. 1 y, en la numeración de acuerdo con SEQ ID no. 1, tiene la sustitución de aminoácido R99D en combinación con las sustituciones de aminoácidos S3T, V4I y V199I, en particular, una proteasa que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID no. 3.

4. El agente de lavado o limpieza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la amilasa es una variante de a-amilasa de la OÍ -amilasa 7??560 de acuerdo con SEQ ID no. 4 que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las siguientes modificaciones de la secuencia en la numeración de acuerdo con a-amilasa AA560: R118K, D183* (deleción) , G184* (deleción), N195F, R320 , R458K.

5. El agente de lavado o limpieza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones l a 4, caracterizado porque la amilasa está presente en una cantidad de 1 x 10"8 a 5 por ciento en peso, en relación con la. proteina activa, y/o —R porque la proteasa está presente en una cantidad de 1 x 10 a 5 por ciento en peso, en relación a la proteina activa.

6. El agente de lavado o limpieza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque comprende además un componente que se selecciona de i. una sustancia aniónica y/o polianiónica , y/o ii. una sustancia catiónica y/o policatiónica, y/o iii. una sustancia que comprende grupo (s) hidroxilo y/o polihidroxilo .

7. El agente de lavado o limpieza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque comprende por lo menos un ingrediente adicional, en particular, un ingrediente que se selecciona del grupo que consiste de fosfonato, agente tensoactivo, mejorador de detergencia, solvente no acuoso, ácido, sal soluble en agua, espesante y combinaciones de los mismos.

8. El agente de lavado o limpieza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque contiene por lo menos una enzima adicional, en particular, una proteasa, amilasa, celulasa, hemicelulasa, mananasa, tanasa, xilanasa, xantanasa, xiloglucanasa, ß-glucosidasa, pectinasa, carragenina, perhidrolasa, oxidasa, oxidorreductasa o una lipasa, y mezclas de las mismas.

9. El agente de lavado o limpieza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque es un agente de lavado automático de vajilla.

10. El uso de un agente de lavado o limpieza de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la remoción de suciedad sensible a la proteasa de textiles o superficies duras.

11. Un método para limpieza de textiles o limpieza superficies duras, caracterizado porque el agente de lavado o limpieza de conformidad con cualquiera de las rei indicaciones 1 a 9 se usa en por lo menos un paso del método .

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la amilasa está presente en la solución de lavado en una concentración de 1 x 10"10-0.2% en peso, y/o en porque la proteasa está presente en la solución de lavado en un concentración de 1 x 10~10-0.2% en peso.

13. El método de conformidad con la reivindicación 11 o la reivindicación 12, caracterizado porque se lleva a cabo a una temperatura de entre 10°C y 60°C, preferiblemente entre 20°C y 50°C y muy preferiblemente entre 30°C y 50°C.

14. El uso de una proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos que, en toda la longitud de la misma, es por lo menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID no. 1 y, en la numeración de acuerdo con SEQ ID no. 1, tiene la sustitución de aminoácidos R99E o R99D en combinación con por lo menos otras dos sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de S3T, V4I y V199I, con el fin de proveer una actividad proteolitica en un agente de lavado o limpieza liquido que comprende una amilasa. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La estabilidad al almacenamiento de un detergente o agente de limpieza liquido que contiene proteasa y amilása ha de ser mejorada. Esto se logra a través del uso de una proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos , que es por lo menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID no. 1 en toda la longitud y, de acuerdo con SEQ ID no. 1, tiene la sustitución de aminoácidos R99E o R99D en combinación con por lo menos otras dos sustituciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de S3T, V4I y V199I.