MX2014004658A - Ácidos nucleícos que unen glucagón. - Google Patents

Ácidos nucleícos que unen glucagón.

Info

Publication number
MX2014004658A
MX2014004658A MX2014004658A MX2014004658A MX2014004658A MX 2014004658 A MX2014004658 A MX 2014004658A MX 2014004658 A MX2014004658 A MX 2014004658A MX 2014004658 A MX2014004658 A MX 2014004658A MX 2014004658 A MX2014004658 A MX 2014004658A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
nucleic acid
seq
absent
acid molecule
nucleotides
Prior art date
Application number
MX2014004658A
Other languages
English (en)
Inventor
Werner Purschke
Simone Sell
Axel Vater
Klaus Buchner
Christian Maasch
Sven Klussmann
Original Assignee
Noxxon Pharma Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/EP2012/000089 external-priority patent/WO2012095303A1/en
Application filed by Noxxon Pharma Ag filed Critical Noxxon Pharma Ag
Publication of MX2014004658A publication Critical patent/MX2014004658A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

La presente invención se relaciona a una molécula de ácido nucleico capaz de unirse a glucagón, en donde la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que comprende una molécula de ácido nucleico de tipo A, una molécula de ácido nucleico de tipo B y una molécula de ácido nucleico de tipo C.

Description

ÁCIDOS NUCLEICOS QUE UNEN GLUCAGÓN La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de unirse un glucagón, el uso del mismo para la fabricación de un medicamento, un agente de diagnóstico, y un agente de detección, respectivamente, una composición que comprende tal molécula de ácido nucleico, un complejo que comprende tal molécula de ácido nucleico, un método para el cribado de un antagonista de una actividad mediada por glucagón usando tal molécula de ácido nucleico nucleico, y un método para la detección de tal molécula de ácido nucleico.
La Diabetes mellitus (en forma abreviada DM) muestra un aumento alarmante de la prevalencia en todo el mundo (especialmente en Asia), que es impulsado principalmente por Diabetes mellitus tipo 2 (en forma abreviada DM2). Los datos para los EE.UU. muestran que en 2001 el 7,9% de las personas mayores de 18 años fueron diagnosticados con Diabetes en comparación con el 4,9% en 1990. La incidencia está vinculada a la edad y al indice de masa corporal. Los modelos matemáticos predicen que para un hombre nacido en el 2000 en los EE.UU. la posibilidad de desarrollar Diabetes es del 33%, para una mujer es incluso superior a los 39%. El mismo modelo predice una pérdida de 9 años de la vida de estos hombres, y de 12 años para las mujeres. Los principales factores de riesgo como la obesidad, la falta de actividad física son bien conocidos, pero se han encontrado para ser extremadamente difícil de influenciar. Las alarmantes tendencias han hecho que la búsqueda de nuevos agentes terapéuticos adecuados para el tratamiento de la DM2 sea aún más urgente. Los agentes ideales no sólo deben reducir el azúcar en la sangre, sino también por lo menos neutral con respecto al peso corporal y también disminuir los triglicéridos.
Aunque varios agentes anti-hiperglucémicos están actualmente disponibles, existe una necesidad urgente de nuevos agentes con diferentes mecanismos de acción. Los agentes existentes son a menudo ineficaces o se vuelven menos efectivos con el tiempo y/o están asociados con efectos secundarios considerables. Dos tipos de eventos adversos son particularmente comunes, inquietante y potencialmente perjudiciales: el aumento de peso y la hipoglucemia. Las excepciones son los agentes metformina y acarbosa. Ellos son, sin embargo, normalmente usados sólo en las formas tempranas o menos graves de la DM2, tienen una eficacia limitada, y con frecuencia ejercen efectos secundarios gastrointestinales. Además, el tratamiento dela metformina para la Diabetes se asocia con el riesgo de amenazar la vida por la acidosis láctica, especialmente en pacientes mayores con insuficiencia renal crónica y cardiaca.
Además de los agentes clásicos, los nuevos medicamentos que han entrado en el mercado en la última década. Sin embargo, la mayoría de estos están limitados por la modesta eficacia o efectos secundarios que son de especial preocupación en la población objetivo. El péptido similar al glucagón (en forma abreviada GLP-1) análogos (también referido como incretinas) o los inhibidores de la enzima degradante dipeptidil-peptidasa-4 (en forma abreviada DPPIV), sólo se aprobaron para los casos en los que otros agentes han demostrado ser ineficaces y sólo han mostrado una eficacia modesta en términos de acción anti-hiperglucémica. Las formas inyectables de incretinas, sin embargo, al menos, tienen la ventaja de un perfil de cambio de peso favorable (Amori, Lau et al. 2007). La terapia con estos agentes por lo general requiere la inyección de insulina de larga duración, para evitar la hiperglucemia en ayunas. Otra clase relativamente nueva de sustancias, las tiazolidinedionas que actúan como agonistas de PPAR, ha sido recientemente objeto de debate de preocupación en cuanto a sus efectos secundarios cardiovasculares, lo que ha llevado a una suspensión de la autorización de comercialización en Europa (EMD 2010) y reglas de prescripción más controladas en los EE.UU. (FDA 2011) para la rosiglitazona. Esto fue provocado por yna asociación de rosiglitazona con insuficiencia cardiaca, infarto de miocardio y muerte por insuficiencia cardiaca (Nissen y Wolski 2007). Otro miembro de la clase, troglitazona, se había retirado del mercado debido a la lesión hepática inducida por fármacos. La venta de la tercera tiazolidinedionas, la pioglitazona, se ha suspendido en Francia después de un estudio que sugirió que el (nombre comercial Actos®) el fármaco elevó el riesgo de cáncer de vejiga (el comunicado de prensa de Takeda, 11 de julio del 2011).
Mientras que la mayoría de los fármacos utilizados actualmente se centran en la falta relativa de la insulina en sí o la actividad de la insulina, una gran cantidad de investigación apoya el concepto de que la DM2 es, al menos, un trastorno bi-hormonal caracterizado por inadecuados niveles altos de glucagón en combinación con la deficiencia de insulina o resistencia a la insulina (Jiang y Zhang 2003).
El glucagón es una hormona que, como la insulina, se produce en el páncreas, pero tiene efectos opuestos de la insulina en el tejido periférico y en particular en el hígado. Aquí se induce principalmente la gluconeogénesis y la glucogenólisis con el fin de estabilizar los niveles de glucosa en la sangre entre comidas.
En la mayoría de los pacientes diabéticos se ha reportado un aumento paradójico de los niveles circulantes de glucagón después de una comida mixta o la ingestión de carbohidratos (Ohneda, Watanabe et al.1978). Esto es visto como un importante contribuyente al aumento de los niveles de glucosa en la sangre postprandial que desempeñan un papel importante en la fisiopatología de las complicaciones micro y macrovasculares en DM (Gin y Rigalleau 2000).
Por lo tanto, el bloqueo de la acción del glucagón por diferentes accesos ha sido ampliamente estudiado. E han reportado una gran cantidad de antagonistas de los receptores de glucagón una pequeña molécula peptídica y no peptídica (Jiang y Zhang 2003). Algunos de estos antagonistas de molécula pequeña, que generalmente tienen afinidades más bajas para el receptor de glucagón, se ha demostrado para reducir la glucosa en la sangre en ayunas o para bloquear la elevación estimulada por un glucagón exógeno de glucosa en la sangre en los modelos animales. Un antagonista del receptor de glucagón de molécula pequeña no peptidica se mostró para bloquear la elevación inducida por glucagón de la producción de glucosa hepática y la glucosa en la sangre en los humanos en una manera dependiente de la dosis (Petersen y Sullivan 2001). Más recientemente, la reducción de la expresión del receptor de glucagón en ratones db/db por oligonucleótidos antisentido condujo a la reducción de la glucosa en sangre, ácidos grasos libres y los triglicéridos sin desarrollo de hipoglucemia (Liang, Osborne et al. 2004). Estos efectos serian ideales para los pacientes con DM2.
Más allá de eso, se encontró que los receptores de glucagón de los ratones knockout son viables y muestran señales de sólo hipoglucemia leve, mejora la tolerancia a la glucosa y los niveles de glucagón elevados. También son resistentes a la obesidad inducida por la dieta (Conarello, Jiang et al. 2007), y tienen una mayor sensibilidad a la insulina, que puede ser beneficioso en la preservación de la s?1h?3b (Sorensen, Winzell et al.2006).Por otra parte, los receptores de glucagón en los ratones knockout eran resistentes al "fenotipo de Diabetes tipo 1 " inducida por estreptozotocina, es decir, que mostraron la normoglucemia en ayunas y después de las pruebas de tolerancia de glucosa oral e intraperitoneal (Lee, Wang et al.2011).
La neutralización de glucagón en si por los anticuerpos monoclonales también condujo a una reducción aguda y sostenida de la glucosa en la sangre, triglicéridos, HbAlc, y la producción de glucosa hepática (Brand, Rolin et al. 1994; Sorensen, Brand et al.2006). Sin embargo, debido a su potencial de inmunogenicidad, estos y otros anticuerpos pueden no ser una opción viable para el tratamiento a largo plazo de la DM.
En esencia, los intentos de intervención terapéutica a través de la reducción de los niveles/actividad de glucagón han producido una gran cantidad de resultados que apoyan el concepto de antagonismo glucagón, pero no han dado lugar a compuestos con suficiente potencia o a compuestos con toxicidad hepática inaceptable.
El péptido inhibidor de la hormona gástrica (en forma abreviada GIP) [, un péptido largo de 42 aminoácidos con una secuencia similar a glucagón, se libera de las células K predominantemente localizadas en el duodeno y el ycyuno proximal. Es secretada tras la ingestión de nutrientes, especialmente la glucosa o de grasa, con la grasa que es el estimulador más potente de la secreción de GIP en los seres humanos.
El receptor de GIP es un receptor acoplado a la proteína G normal con siete hélices transmembrana. El gen del receptor de GIP se encontró que se expresa en el páncreas, el estómago, intestino delgado, tejido adiposo, corteza suprarrenal, pituitaria, corazón, testículo, células endoteliales, células óseas, tráqueas, bazo, timo, pulmón, riñón, tiroides y en varias regiones del cerebro.
La GIP no sólo induce la liberación de insulina como su nombre lo sugiere, pero también puede desempeñar un papel en la homeostasis de los lípidos y puede ser necesaria para el desarrollo de la obesidad como se muestra por varios estudios en animales (Asmar 2011): La administración diaria del antagonista del receptor de GIP-Pro3-GIP durante 50 días produjo una reducción del peso corporal, disminución de la acumulación de tejido adiposo, y mejoras notables en los niveles de glucosa, hemoglobina glicosilada y de insulina pancreática en los ratones diabéticos de mayor edad alimentados con mucha grasa, junto con la reducción de los niveles de triglicéridos en el músculo y el hígado. No se observó ningún cambio en la ingesta de dieta rica en grasas (McClean, Irwin et al. 2007). Apuntando en la misma dirección, se encontró que los ratones knockout receptores de GIP son más resistentes al desarrollo de la obesidad, mientras que los ratones de tipo salvaje alimentados con la misma dieta alta en grasas exhibieron tanto hipersecreción de GIP y la extrema acumulación de grasa visceral y subcutánea con resistencia a la insulina ( Miyawaki, Yamada et al.2002). Sin embargo, la respuesta temprana de insulina después de una carga oral de glucosa se vio afectada, lo que conduce a niveles de glucosa en sangre más altos (Miyawaki, Yamada et al. 1999). Una descripción detallada de-la contribución de GIP a la obesidad también se puede encontrar en una revisión reciente por Irwin y Flatt (Irwin y Flatt 2009).
Otros péptidos que están relacionados con la secuencia de glucagón y que se transcriben a partir del mismo gen son • glicentina • Polipéptido relacionado con la glicentina • Oxintomodulina • GLP-1 y sus formas activas GLP-1 (7-36) y GLP-1 (7-37) · GLP-2 Además existe el polipéptido relacionado • Péptido intestinal vasoactivo prepro (81-122) (prepro- VIP/péptido intestinal PHV-42) Un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de estos péptidos se muestra en la figura 21 El problema subyacente de la presente invención es proporcionar un medio que interactúa específicamente con el glucagón y/o GIP, mediante el cual el medio es adecuado para la prevención y/o tratamiento de la Diabetes, complicaciones diabéticas, condición diabética y/o hiperglucagonemia.
Estos y otros problemas que subyacen a la presente invención se resuelven por la materia de las reivindicaciones independientes adjuntas. Las modalidades preferidas se pueden tomar de las reivindicaciones dependientes.
El problema subyacente de la presente invención se resuelve en un primer aspecto que es también la primera modalidad del primer aspecto por una molécula de ácido nucleico capaz de unirse a glucagón, en el que la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que comprende una molécula de ácido nucleico de tipo A, una molécula de ácido nucleico de tipo B y una molécula de ácido nucleico de tipo C.
En una segunda modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico de tipo A, en el que la molécula de ácido nucleico de tipo A comprende un tramo central de nucleótidos, en el que el tramo central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' BniAAATGn2GAn3n4GCTAKGn5GGn6n7GGAATCTRRR 3' [SEQ ID NO: 173], en donde n1 es G o rG, n2 es G o rG, n3 es G o rG, n4 es G o rG, n5 es Y o rT, n¾ es A o rA, n7 es A o rA, y en donde cualquiera de G, A, T, C, B, K, Y y R es un 2' desoxirribonuclótido, y cualquiera de rG, rA y rT es un ribonucleótido.
En una tercera modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la segunda modalidad del primer aspecto, el tramo central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' BniAAATGn2GAn3n4GCTAGGn5GGn6n7GGAATCTGAR 3' [SEQ ID NO: 174], en donde h es G o rG, n2 es G o rG, n3 es G o rG, n4 es G o rG, n5 es T o rT, n¾ es A o rA, n7 es A o rA, y en donde cualquiera de G, A, T, C, B, y R es un 2'-desoxirribonucleótido, y cualquiera de rG, rA y rT es un ribonucleótido.
En una cuarta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la segunda y la tercera modalidad del primer aspecto, el tramo central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de 5' TniAAATGn2GAn3n4GCTAGGn5GGn6n7GGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 175] , 5' TniAAATGn2GAn3n4GCTAGGn5GGn6n7GGAATCTGAA 3' [SEQ ID NO: 176] , 5' Cn1AAATGn2GAn3n4GCTAGGn5GGn6n7GGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 177], y 5' GniAAATGn2GAn3n4GCTAGGn5GGn6n7GGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 178] , en donde nies G o rG, n2 es G o rG, n3 es G o rG, n4 es G o rG, ns es T o rT, he es A o rA, n7 es A o rA, y en donde cualquiera de G, A, T y C es un 2'desoxirribonuclótido, y cualquiera de rG, rA y rT es un ribonucleótido.
En una quinta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la segunda, tercera y cuarta modalidad del primer aspecto, el tramo central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' GniAAATGn2GAn3n4GCTAGGn5GGn6n7GGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 178] , En donde nies G o rG, n2 es G o rG, n3 es G o rG, n4 es G o rG, n5 es T o rT, n6 es A o rA, n7 es A o rA, y en donde cualquiera de G, A, T y C, es un 2' desoxirribonucleótidos, y cualquiera de rG, rA y rT es un ribonucleótido.
En una sexta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la segunda, tercera y cuarta modalidad del primer aspecto, el tramo central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CniAAATGn2GAn3n4GCTAGGn5GGn6n7GGAATCTGAG 3'[SEQ ID NO: 177], En donde n es G o rG, n2 es G o rG, n3 es G o rG, n4 es G o rG, n5 es T o rT, n¾ es A o rA, n7 es A o rA, y G, A, T y C, son 2' desoxirribonucleótidos, y rG, rA y rT son ribonucleótidos.
En una séptima modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la segunda, tercera, cuarta, quinta y sexta modalidad del primer aspecto, el tramo central de nucleótidos consiste de 2 1-desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos.
En una octava modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta y séptima modalidad del primer aspecto, el tramo central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de 5' GrGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 179], 5' GGAAATGrGGAGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 180], 5' GGAAATGGGArGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 181], 5' GGAAATGGGAGrGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 182], 5' GGAAATGGGAGGGCTAGGTGGrAAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 183], 5' GGAAATGGGAGGGCTAGGTGGArAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 184]; 5' GGAAATGrGGAGGGCTAGGTGGrAAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 185] 5' GGAAATGGGAGGGCTAGGTGGrArAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 186] 5' GGAAATGrGGAGGGCTAGGTGGrArAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 187], 5' GGAAATGGGArGGGCTAGGTGGrArAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 188], 5' GrGAAATGrGGArGGGCTAGGTGGrArAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 189], 5' GrGAAATGrGGArGrGGCTAGGTGGrArAGGAATCTGAG 3'[SEQ ID NO: 190] Y 5' GrGAAATGrGGArGrGGCTAGGrTGGrArAGGAATCTGAG 3'[SEQ ID NO: 191] en donde cualquiera de G, A, T y C es un 2'-desoxirribonucleótido, y cualquiera de rG, rA y rT es un ribonucleótido.
En una novena modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la segunda, tercera, cuarta, quinta y sexta modalidad del primer aspecto, el tramo central de nucleótidos consiste de 2'-desoxirribonucleótidos.
En una décima modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava y novena modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende en la dirección 5'-> 3' un primer tramo terminal de nucleótidos, el tramo central de nucleótidos y un segundo tramo terminal de nucleótidos, en donde el primer tramo terminal de nucleótidos comprende de uno a siete neuclótidos , y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende de uno a siete nucleótidos.
En una décimo primera modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava y novena modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende en una dirección 5'-> 3' un segundo tramo terminal del nucleótidos, el tramo central de nucleótidos y un primer tramo terminal de nucleótidos, en donde el primer tramo terminal de nucleótidos comprende de uno a siete nucleótidos, y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende de uno a siete nucleótidos.
En una décimo segunda modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la décima y la décimo primera modalidad del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'Z1Z2Z3Z4Z5Z6V 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de neucleótidos de 5' BZ7Z8Z9Z10 ZiiZc23', En donde Zi es G o ausente, Z2 es S o ausente, Z3 es V o ausente, Z4 es B o ausente, Z5 es B o ausente, Zs es V o ausente, Z7 es B o ausente, Zs es V o ausente, Z9 es V o ausente, Zco es B o ausente, Zn es S o ausente, y zi2 es C o ausente.
En una décimo tercera modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la décima, décimo primera y décimo segunda modalidad del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'ZiZ2Z3Z4Z5Z6V 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'BZ7Z8Z9Z10 Z Zi23', en donde a) Z es G, Z es S , Z3 es V, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es b) Z está ausente, Z2 es S , Z3 es V, Z4 es B, Z5 es B, Zz es V, Z7 es B, Z es V, Z9 es V, Z es B, Zn es S, y Zc2 es C, o c) Z es G, Z2 es S, Z3 es V, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es V, Z7 es B, Z8 es V, Z9 es V, Z10 es B, Zn es S , y Zi2 está ausente, preferiblemente a) Zc es G, Z2 es C, Z3 es R, Z4 es B, Z5 es Y, Z6 es R, Z7 es Y, Z es R, Z9 es V, Z es Y, Zn es G, y Z12 es , o b) Z está ausente, Z2 es C, Z3 es R, Z4 es B, Z5 es Y, Z6 es R, Z7 es Y, Z8 es R, Z9 es V, Zc0 es Y, Zn es G, y Zc2 es C, o c) Zx es G, Z2 es C, Z3 es R, Z4 es B, Z5 es Y, z6 es R, Z7 es Y, Z8 es R, Z9 es V, Zi0 es Y, Zn es G y Zc2 está ausente .
En una décimo cuarta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la décimo tercera modalidad del primer aspecto, a) el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'GCACTGG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'GCAGTGC 3', o b) el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'GCACTGA 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'GCAGTGC 3', o c) el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'GCAGTGG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'TCACTGC 3', o d) el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'GCACTGG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'CTACTGC 3', o e) el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'GCGCTGG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 51GCAGTGC 3', o f) el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'GCGCCAG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'TCGGCGC 3'.
En una décimo quinta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la décima, décimo primera y décimo segunda modalidad del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'Z1Z2Z3Z4Z5Z6V 3'y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5 ' BZ7Z8Z Z oZuZ 3 ' , en donde a) Zc está ausente, Z2 es S , Z3 es V, Z4 es B,_ Z5 es B, Z6 es V, Z7 es B, Z8 es V, Z9 es V, Z 0 es B, Zn es S, y Zi2 está ausente, o b) Zi está ausente, Z2 es S, Z3 es V, Z4 es B, Z5 es B, Z¾ es V, Z h es B, Z8 es V, Z9 es C, Z4o es B, Zn está ausente, y X42 está ausente, o c) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 es V, Z4 es B, Z5 es B, Z¾ es V, Z7 es B, Z8 es V, Z9 es C, Z40 es B, Zn es S, y Z12 está ausente, preferiblemente el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'ZiZ2Z3Z4Z5Z6G 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'OZZ89Zi0ZhZi23', en donde a) Zc está ausente, Z2 es S , Z es V, Z4 es G, Z5 es Y, Z es S , Z7 es B, Z8 es R, Z9 es C, es B, Zn es S, y Z42 está ausente, o b) Z está ausente, Z2 es S , Z3 es V, Z4 es G, Z5 es Y, Zx es S , Z7 es B, Z8 es R, Z9 es C, Z70 es B, Zn está ausente, y Z12 está ausente , o c) Z está ausente , Z2 está ausente , Z3 es V, Z4 es G, Z5 es Y, Z6 es S , Z7 es B, Z8 es R, Z9 es C, Zco es B, Zn es S, y Z12 está ausente.
En una décimo sexta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la décimo quinta modalidad del primer aspecto, a) el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'GCGCGG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos 5'CTGCGC 3', o b) el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'GCGCGG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'CCGCGC 3', o c) el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'GGGCCG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'CGGCCC 3', o d) el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'GCGCCG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'CGGCGC 3', o e) el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'GAGCGG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'CCGCTC 3', o f) el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'GCGTGG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'CCACGC 3', o g) el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'GCGTCG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'CGACGC 3'.
En una décimo séptima modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la décima, décimo primera y décimo segunda modalidad del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'Z1Z23Z4Z5Z6V 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' BZ7Z8Z9Z1011Z123', en donde a) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 es V, Z4 es B, Z5 es B, Ze es V, Z7 es B, Z8 es V, Zg es V, Z10 es B, Zn está ausente, y Z12 está ausente, o b) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 es V, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es V, Z7 es B, Z8 es V, Z9 es V, Z0 está ausente, Z está ausente, y Zi2 está ausente, o c) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 es B, Z5 es B, Ze es V, Z7 es B, Zg es V, Zg es V, Z10 es B, Zn está ausente, y Z12 está ausente, preferiblemente el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'ZxZ23Z4Z5Z6G 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'CZ7Z8ZgZioZiiZi23', en donde a) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 es V, Z4 es G, Z5 es Y, Zg es G, Z7 es Y, Zg es R, Zg es C, Z10 es B, Zn está ausente, y Z12 está ausente, o b) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 es V, Z4 es G, Z5 es Y, Z6 es G, Z7 es Y, Zg es R, Zg es C, Z10 está ausente, Zn está ausente, y Z12 está ausente, o c) Zc está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 es G, Z5 es Y, Z¾ es G, Z7 es Y, Zg es R, Zg es C, Z10 es B, Zn está ausente, y Z12 está ausente.
En una décimo octava modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la décimo séptima modalidad del primer aspecto, a) el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 51GGCGG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'CCGCC 3', o b) el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'CGCGG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'CCGCG 3'.
En una décimo novena modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la décima, décimo primera y décimo segunda modalidad del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 51Z1Z2Z3Z4Z5Z6V 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'BZ7Z8Z9Z10Z11Z123', en donde a) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 es B, Z5 es B, Zz es V, Z7 es B, Z8 es V, Z9 es V, Z10 está ausente, Z está ausente, y Zi2 está ausente, o b) Z4 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 es B, Z5 es B, Z es V, Z7 es B, Z8 es V, Z9 está ausente, Z10 está ausente, Z está ausente, y Z12 está ausente, o c) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es V, Z7 es B, Z8 es V, Z9 es V, Zio está ausente, Zu está ausente, y Z42 está ausente, preferiblemente el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'ZiZ23Z4Z5Z6G 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'CZ7Z8Z9ZioZuZi23', en donde a) Zc está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 es G, Z5 es Y, Z6 es G, Z7 es Y, Z8 es R, Z9 es C, Z10 está ausente, Zu está ausente, y Zi2 está ausente, o b) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 es G, Z5 es Y, Z6 es G, Z7 es Y, Z8 es R, Zg está ausente, Z40 está ausente, ZX1 está ausente, y Z42 está ausente, o c) Zc está ausente Z2 está ausente Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 es Y, Ze es G, Z7es Y, Z8 es R, Z9 es C, Zco está ausente, Zu está ausente, y Z42 está ausente.
En una vigésima modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la décimo novena modalidad del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'GCGG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'CCGC 3'.
En una vigésimo primera modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la décima, décimo primera y décimo segunda modalidad del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'ZiZ2Z3Z4Z5Z5n 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'BZ-ZgZgZioZnZn 3', en donde a) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 es B, Z¾ es V, Z7 es B, Zg es V, Z9 está ausente, Z40 está ausente, Zn está ausente, y Z42 está ausente, o b) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 es B, Z<¿ es V, Z7 es B, Zg está ausente, Zg está ausente, Zco está ausente, Z está ausente, y Z12 está ausente, o c) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, Zb es V, Z7 es B, Zg es V, Z9 está ausente, Zi0 está ausente, Zn está ausente, y Z12 está ausente, preferiblemente el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'ZiZ2Z3Z4Z5Z6G 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CZ7Z8Z9Zi0 ZUZ12 3', en donde a) i está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 es S, Zz es S, Z7 es S, Zg es S, Zg está ausente, Zc0 está ausente, Zn está ausente, y Z12 está ausente, o b) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 es S, Z6 es S, Z7 es S Z8 está ausente, Zg está ausente, Z70 está ausente, Zn está ausente, y Zi2 está ausente, o c) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, Z<¡ es S, Z7 es S, Zg es S, Zg está ausente, Z10 está ausente, Zn está ausente, y Zi2 está ausente.
En una vigésimo segunda modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la vigésimo primera modalidad del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'GCG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'CGC 3'.
En una vigésimo tercera modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la décima, décimo primera y décimo segunda modalidad del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'Z1Z2Z3Z4Z5Z6V 3'y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' BZ7Z8Z9ZioZiiZ?23', en donde a) Z está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, Z¾ es V, Z7 es B, Z8 está ausente, está ausente Zg, Z10 está ausente, Zn está ausente, y Zi2 está ausente, b) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, Z¾ es V, Z7 está ausente, Z8 está ausente, Zg está ausente, Z10 está ausente, Z está ausente, y Z12 está ausente, c) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, Z6 está ausente, Z7 es B, Z8 está ausente, Zg está ausente, Z10 está ausente,Zn está ausente, y Z42 está ausente, d) Zc está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, Z está ausente, Z7 está ausente, Z8 está ausente, Zg está ausente, Z40 está ausente, Zn está ausente, y Zi2 está ausente, preferiblemente el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'Z1Z23Z4Z5Z6G 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'CZ7Z8Z9Zio ZuZi2 3', en donde a) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, Z6 es G, Z7 es C, Z8 está ausente, Z9 está ausente, Z10 está ausente, Zn está ausente, y Z42 está ausente, o b) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, Z6 está ausente, Z7 está ausente, Z8 está ausente, Zg está ausente, Z10 está ausente, Zn está ausente, y z42 está ausente.
En una vigésimo cuarta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la segunda, tercera, cuarta quinta, sexta, novena décima décimo primera décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, y vigésima tercera modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, o la molécula de ácido nucleico tiene una identidad de al menos el 85% a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, o la molécula de ácido nucleico es homologa a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, en donde la homología es de al menos el 85%.
En una vigésimo quinta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, ocho, décimo, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 23, SEC ID NO: 43, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 158 y SEQ ID NO: 159, o la molécula de ácido nucleico tiene una identidad de al menos el 85% a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 23 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 158 y SEQ ID NO: 159, o la molécula de ácido nucleico es homologa a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 158 y SEQ ID NO: 159, en el que la homología es de al menos el 85%.
En una vigésima sexta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico de tipo B, en el que la molécula de ácido nucleico de tipo B comprende un tramo central de 29 a 32 nucleótidos, en el que el tramo central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de 5'-AKGARniKGTTGSYAWAn2RTTCGn3TTGGAn4TCn5-'3 [SEQ ID NO: 197], 5'-AGAAGGTTGGTAAGTTTCGGTTGGATCTG-'3 [SEQ ID NO: 198], 5'-AGAAGGTCGGTAAGTTTCGGTAGGATCTG-'3 [SEQ ID NO: 199], 5'-AGGAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCA-'3 [SEQ ID NO: 200], 5'-AGGAAAGGTTGGTAAGGTTCGGTTGGATTCA-'3 [SEQ ID NO: 201] y 5'-AGGAAGGTTGGTAAGGTTCGGTTGGATTCA-'3 [SEQ ID NO: 202], en donde ni es A o rA, n2 es G o rG, n3 es G o rG, n4 es T o rU, ns es A o rA y en donde cualquiera de G, A, T, C, K, Y, S, W y R es un 2'-desoxirribonucleótido, y cualquiera de rG , RA y rU es un ribonucleótido.
En una vigésimo séptima modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la vigésimo sexta modalidad del primer aspecto, el tramo central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' AGGAAniGGTTGGTAAAn2GTTCGn3TTGGAn4TCn53' [SEQ ID NO: 203], En donde n es A o rA, n2 es G o rG, n3 es G o rG, n4 es T o rU, n5 es A o rA, y en donde cualquiera de G, A, T, y C es un 2'-desoxirribonucleótidos, y cualquiera de rG, rA y rU es ribonucleótido.
En una vigésimo octava modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la vigésimo sexta y vigésimo séptima modalidad del primer aspecto, el tramo central de nucleótidos consiste de 2 '-desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos.
En una vigésimo novena modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la vigésimo sexta, vigésimo séptima y vigésima octava modalidad del primer aspecto, el tramo central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo de 5' AGGAArAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCA 3' [SEQ ID NO: 204], 5' AGGAAAGGTTGGTAAArGGTTCGGTTGGATTCA 3' [SEQ ID NO: 205], 5' AGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGArUTCA 3' [SEQ ID NO: 206], 5' AGGAArAGGTTGGTAAArGGTTCGGTTGGATTCA 3' [SEQ ID NO: 207], 5' AGGAArAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGArUTCG 3' [SEQ ID NO: 208], 5' AGGAArAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGArUTCA 3' [SEQ ID NO: 209], 5' AGGAArAGGTTGGTAAArGGTTCGGTTGGArUTCA 3' [SEQ ID NO: 210] y 5' AGGAArAGGTTGGTAAArGGTTCGrGTTGGArUTCrA 3'[SEQ ID NO: 211], en donde cualquiera de G, A, T, y C es un 2'-desoxirribonucleótido, y cualquiera de rG , RA y r es un ribonucleótido.
En una trigésima modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la vigésima sexta y vigésima séptima modalidad del primer aspecto, el tramo central de nucleótidos consiste de 2'-desoxirribonucleótidos.
En una trigésima primera modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena y trigésima modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende en una dirección 5'-> 3' de un primer tramo terminal de nucleótidos, el tramo central de nucleótidos y un segundo tramo terminal de nucleótidos, en donde el primer tramo terminal de nucleótidos comprende de tres a nueve nucleótidos, y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende de tres a diez nucleótidos.
En una trigésimo segunda modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la vigésimo sexta, vigésimo séptima, vigésimo octava, vigésimo novena y trigésima modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende en una dirección 5'-> 3' de un segundo tramo terminal de nucleótidos, el tramo central de nucleótidos y un primer tramo terminal de nucleótidos, en donde el primer tramo terminal de nucleótidos comprende de tres a nueve nucleótidos, y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende de tres a diez nucleótidos.
En una trigésima tercera modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la trigésima primera y trigésima segunda modalidad del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' Z1Z2Z3Z4Z5Z6SAK 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CKVZ7Z8Z9Z10Z11Z123', en donde Zi es C o ausente, Z2 es G o ausente, Z3 es R o ausente, Z4 es B o ausente, Z5 es B o ausente, Z6 es S o ausente, Z7 es S o ausente, Z8 es V o ausente, Zg es V o ausente, Z10 es K o ausente, Zn es M o ausente, y Zi2 es S o ausente.
En una trigésimo cuarta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la trigésimo primera, trigésimo segunda y trigésimo tercera modalidad del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' ZI2Z3Z4Z5Z6SAK 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CKVZ-ZgZgZioZnZn 3', en donde a)Zi es C, Z2 es G, Z3 es R, Z4 es B, Z5 es B, Z¾ es S, Z7 es S, Zs es V, Zg es N, Z10 es K, Z es M, y Zi2 es S, o b) Zi está ausente, Z2 es G, Z3 es R, Z4 es B, Z5 es B, Z¾ es S, Z7 es S, Z8 es V, Zg es N, Z10 es K, Zn es M, y Zi2 es S, o c) Z es C, Z2 es G, Z3 es R, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es S, Z7 es S, Z8 es V, Z es N, Z o es K, Zu es M, y Zi2 está ausente, preferiblemente el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' ZIZ2Z3Z4Z5Z6GAG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CTCZ7Z8Z9 ZioZnZ12 3', en donde a) Z es C, Z2 es G, Z3 es R, Z4 es C , Z5 es T, Z6 es C, Z es G, Z8 es A, Z9 es G, Z 0 es T, ZX1 es C, y Zi2 es G, o b) Z está ausente, Z2 es G, Z es R, Z4 es C, Z5 es T, Zz es C, Z7 es G, Z8 es A, Z9 es G, Zi0 es T, Z es C, y Z42 es G, o c) Z es C, Z2 es G, Z3 es R, Z4 es C, Z5 es T, Z6 es C, Z7 es G, Z8 es A, Z9 es G, Zi0 es T , Zn es C, y Zi2 eestá ausente En una trigésimo quinta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la trigésimo cuarta modalidad del primer aspecto a) el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CGACTCGAG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CTCGAGTCG 3', o b) el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CGGCTCGAG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CTCGAGTCG 3'.
En una trigésimo sexta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la trigésima primera, trigésima segunda y trigésima tercera modalidad del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' Zi^ ZsZíZsZgSAK 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CKVZ7Z8Z9Z10Z11Zi23', en donde a) Z está ausente, Z2 es G, Z3 es R, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es S, Z7 es S, Z8 es V, Z9 es N, Zc0 es K, Zn es M, y Zi2 está ausente, o b) Z está ausente, Z2 es G, Z3 es R, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es S, Z7 es S, Z8 es V, Z9 es N, Zc0 es K, Zn está ausente, y Z12 está ausente, o c) c está ausente, Z2 está ausente, Z3 es R, Z4 es B, Z5 es B, Z6es S, Z7es S, Z8 es V, Z9 es N, Z10 es K, Zcc es M, y Z12está ausente.
En una trigésima séptima modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la trigésima primera, trigésima segunda y trigésima tercera modalidad del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' Z1Z2Z3Z4Z5Z6SAK 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CKVZ7Z8Z9ZioZiiZi23', en donde a) Zc está ausente, Z2 está ausente , Z3 es R, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es S , Z7 es S , Z8 es V, Z9 es N, Zc0 es K, Zcc está ausente , y Z42 está ausente , o b) Zc está ausente, Z2 está ausente , Z3 es R, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es S , Z7 es S , Z8 es V, Z9 es N, Z10 está ausente, Zcc está ausente, y Z42 está ausente, o c) Zc está ausente, Z2 está ausente , Z3 está ausente , Z4 es B, Z5 es B, Z6 es S , Z7 es S , Z8 es V, Z9 es N, Z o es K Zn está ausente, y Zi2está ausente, preferiblemente el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' ZiZ2Z3Z4Z5Z6GAG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CTCZ7Z8Z9ZionZi2 en donde a) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 es A, Z4 es C, Z5 es T, Z6 es C, Z7 es G, Z8 es A, Z9 es G, Z0 es T, Zü está ausente, y Zi2 está ausente, o b) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 es A, Z4 es C, Z5 es T, Z6 es C, Z7 es G, Z8 es A, Z9 es G, Z10 está ausente, Zn está ausente, y Zi2 está ausente, o c)Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 es C, Z5 es T, Z6 es C, Z7 es G, Z8 es A, Z9 es G, Zc0 es T Z está ausente, y Z72 está ausente, preferiblemente Zc está ausente, Z2 está ausente, Z3 es A, Z4 es C, Z5 es T, Z6 es C, Z7 es G, Z8 es A, Z9 es G, Zc0 es T, Z está ausente, y Z22 está ausente.
En una trigésima octava modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la trigésima primera, trigésima segunda y trigésima tercera modalidad del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' ZIZ2Z3Z4Z5Z6SAK 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CKVZ7Z8Z9ZioZnZ123', en donde a) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es S, Z7 es S, Z8 es V, Z9 es N, Z0 está ausente, Z está ausente, y Z2 está ausente, o b) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 es B, ¾ es S, Z7 es S, Z8 es V, Z9 es N, Z10 está ausente, Zn está ausente, y Zi2 está ausente, o c)Z está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 es B, Z5 es B, Z6es S, Z7es S, Z8 es V, Z9 está ausente, Z40 está ausente, Zn está ausente, y Z32está ausente, preferiblemente el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' ZiZ2Z3Z4Z5Z6SAG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CTSZ7ZgZ9ZioZiiZi2 en donde a) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es S, Z7 es S, Z8 es S, Z9 es V, Z0 está ausente, Z está ausente, y Z12 está ausente, o b) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 es B, Z6 es S, Z7 es S, Z8 es S, Zg es V, Z10 está ausente, n está ausente, y Z42 está ausente, o c) Zc está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es S, Z7 es S, Z8 es S, Z9 está ausente, Z10 está ausente, Zn está ausente, y Z12 está ausente.
En una trigésima novena modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la trigésima octava modalidad del primer aspecto, a) el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' GTCGAG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CTCGAC 3', o b) el primer tramo terminal del nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' TGCGAG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CTCGCA 3', o * c) el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' GGCCAG y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CTGGCC 3' , o d) el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' GCCGAG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CTCGGC 3' , o e) el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CTCGAG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CTCGAG 3' .
En una cuadragésima modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la trigésima primera, trigésima segunda y trigésima tercera modalidad del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' Z1Z2Z3Z4Z5Z6SAK 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CKVZ7Z8Z9ZioZiiZi23', en donde a) Zc está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 es B, Ze es S, Z7 es S, Zg es V, Z9 está ausente, Zi0 está ausente, Zn está ausente, y Zi2 está ausente, o b) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 es B, Ze es S, Z7 es S, Zs está ausente, Z9 está ausente, Z40 está ausente, Zn está ausente, y Z42 está ausente, o c) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, Z6es S, Z7es S, Z8 es V, Z9 está ausente, Z10 está ausente, Zn v, y Z12 está ausente, en donde preferiblemente el primer tramo terminal de la nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' ZiZ2Z3Z4Z5Z6GAG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' OTOZ7Z8Z9ZioZhZi2 3 en donde a) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 es T, Z6 es C, Z7 es G, Z8 es A, Zg está ausente, Zi0 está ausente, Zn está ausente, y Z12 está ausente, o b) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 es T, Z6 es C, Z7 es G, Z8 está ausente, Zg está ausente, Z10 está ausente, Zn está ausente, y Zi2 está ausente, o c) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, Z6 es C, Z7 es G, Z8 es A, Zg está ausente, Z10 está ausente, Zn está ausente, y Z42 está ausente.
En una cuadragésima primera modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la trigésima primera, trigésima segunda y trigésima tercera modalidad del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' ZiZ2Z3Z4Z5Z6SAK 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'CKVZ7Z8ZgZioZnZi23', en donde a) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, es S, Z7 es S, Zg está ausente, Zg está ausente, Zc0 está ausente, Zn está ausente, y Z12 está ausente, o b) Zc está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, Z¾ está ausente, Z7 es S, Z3 está ausente, Zg está ausente, Z10 está ausente, Z está ausente, y Zc2 está ausente, o c) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, Z e es S, Z7 está ausente, Ze está ausente, Z9 está ausente, Z10 está ausente, Zn está ausente, y Zi2está ausente.
En una cuadragésima segunda modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la trigésimas primera, trigésima segunda y trigésima tercera modalidad del primer aspecto, el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' ZxZ2Z3Z4Z5Z6SAK 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CKVZ7Z89Z10Z11ZX23', En donde Zc está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, Z6 está ausente, Z7 está ausente, Zg está ausente, Zg está ausente, Zco está ausente, Zn está ausente, y Zc2 está ausente, o en donde el primer tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' ZIZ2Z3Z4Z5Z6GAG y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5'CTCZ7Z8Z9Z10Z11Z123', en donde Zc está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, Z¾ está ausente, Z7 está ausente, Zg está ausente, Zg está ausente, Zco está ausente, Zn está ausente, y Z12 está ausente.
En una cuadragésima tercera modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera y cuadragésima segunda modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 155, o la molécula de ácido nucleico tiene una identidad de al menos el 85% a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 155, o la molécula de ácido nucleico es homologa a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 155, en donde la homología es de al menos el 85%.
En una cuadragésima cuarta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera y cuadragésima segunda modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 156 y SEQ ID NO: 157, o la molécula de ácido nucleico tiene una identidad de al menos el 85% a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 156 y SEQ ID NO: 157, o la molécula de ácido nucleico es homologa a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo de la SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 156 y SEQ ID NO: 157, en donde la homología es de al menos 85 %.
En una cuadragésima quinta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico de tipo C, en donde la molécula de ácido nucleico de tipo C comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo de la SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 97 y SEQ ID NO: 102 o en donde la molécula de ácido nucleico tiene una identidad de al menos el 85% a la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 97 y SEQ ID NO: 102, o en donde la molécula de ácido nucleico es homologa a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 97 y SEQ ID NO: 102 en donde la homología es de al menos el 85%.
En una cuadragésima sexta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta modalidad del primer aspecto, los nucleótidos de o los nucleótidos que forman la molécula de ácido nucleico son nucleótidos-L.
En una cuadragésima séptima modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido L-nucleico.
En una cuadragésima octava modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, cuadragésima sexta y cuadragésima séptima modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende al menos una fracción de unión que es capaz de unir glucagón, en donde tales fracciones de unión se componen de nucleótidos-L.
En una cuadragésima novena modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, cuadragésima sexta, cuadragésima séptima y cuadragésima octava modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico es un antagonista de una actividad mediada por glucagón.
En una quincuagésima modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, cuadragésima sexta y cuadragésima séptima, cuadragésima octava y cuadragésima novena modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico es capaz de unirse a GIP.
En una quincuagésimo primera modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, cuadragésima sexta y cuadragésima séptima, cuadragésima octava, cuadragésima novena y quincuagésima modalidad del primer aspecto, el ácido nucleico es un antagonista de una actividad mediada por GIP.
En una modalidad quincuagésimo segunda del primer aspecto que es también una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, décima primera, décima segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, cuadragésima sexta y cuadragésima séptima, cuadragésima octava, cuadragésima novena, quincuagésima y quincuagésima primera modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende un grupo de modificación, en donde la tasa de excreción de la molécula de ácido nucleico que comprende el grupo de modificación de un organismo se reduce en comparación con un ácido nucleico que no comprende el grupo de modificación.
En una quincuagésima tercera modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, cuadragésima sexta y cuadragésima séptima, cuadragésima octava, cuadragésima novena, quincuagésima y quincuagésima primera modalidad del primer aspecto, la molécula de ácido nucleico comprende un grupo de modificación, en el que la molécula de ácido nucleico que comprende el grupo de modificación tiene un mayor tiempo de retención en un organismo en comparación con una molécula de ácido nucleico que no comprende el grupo de modificación.
En una quincuagésima cuarta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la quincuagésima segunda y quincuagésima tercera modalidad del primer aspecto, el grupo de modificación se selecciona de entre el grupo que comprende modificaciones biodegradables y no biodegradables, preferiblemente el grupo de modificación se selecciona del grupo que comprende polietilenglicol, polietilenglicol lineal, polietilenglicol ramificado, almidón hidroxietilico, un péptido, un proteína, un polisacárido, un esterol, polioxipropileno, polioxidomidato y poli (2-hidroxietil)-L-glutamina.
En una quincuagésima quinta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la quincuagésima quinta modalidad del primer aspecto, el grupo de modificación es un polietilenglicol que consiste de un polietilenglicol lineal o polietilenglicol ramificado, en donde el peso molecular del polietilenglicol es preferiblemente de aproximadamente 20,000 a aproximadamente 120,000 Da, más preferiblemente de aproximadamente 30,000 a aproximadamente 80,000 Da y más preferiblemente de aproximadamente 40,000 Da.
En una quincuagésima sexta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la quincuagésima cuarta modalidad del primer aspecto, el grupo de modificación es el almidón de hidroxietilico, en donde el peso molecular del almidón hidroxietilico es de aproximadamente 50 kDa a aproximadamente 1000 kDa, más preferiblemente de aproximadamente 100 kDa a aproximadamente 700 kDa y más preferiblemente de 300 kDa a 500 kDa.
En una modalidad quincuagésima séptima del primer aspecto que es también una modalidad de la quincuagésima segunda, quincuagésima tercera, quincuagésima cuarta, quincuagésima quinta y quincuagésima sexta modalidad del primer aspecto, el grupo de modificación está acoplado a la molécula de ácido nucleico a través de un enlazador, preferiblemente en el que el enlazador es un enlazador biodegradable.
En una modalidad quincuagésima octava del primer aspecto que es también una modalidad de la quincuagésima segunda, quincuagésima tercera, quincuagésima cuarta, quincuagésima quinta y quincuagésima sexta modalidad del primer aspecto, el grupo de modificación se acopla al nucleótido terminal-5' y o el nucleótido-terminal-3 de la molécula de ácido nucleico y/o a un nucleótido de la molécula de ácido nucleico entre el nucleótidos terminal-5' de la molécula de ácido nucleico y el nucleótido terminal-3' de la molécula de ácido nucleico.
En una modalidad quincuagésima novena del primer aspecto que es también una modalidad de la quincuagésima segunda, quincuagésima tercera, quincuagésima cuarta, quincuagésima quinta, quincuagésima sexta, quincuagésima séptima y quincuagésima octava modalidad del primer aspecto, el organismo es un animal o un cuerpo humano, preferentemente un cuerpo humano.
El problema subyacente de la presente invención se resuelve en un segundo aspecto que es también la primera modalidad del segundo aspecto por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena , décima, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, cuadragésima sexta y cuadragésima séptima, cuadragésima octava, cuadragésima novena, quincuagésima, quincuagésima primera, quincuagésima segunda, quincuagésima tercera, quincuagésima cuarta, quincuagésima quinta, quincuagésima sexta, quincuagésima séptima, quincuagésima octava y quincuagésima novena modalidad del primer aspecto, para su uso en un método para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o trastorno o hiperglucagonemia.
En una segunda modalidad del segundo aspecto que es también una modalidad de la primera modalidad del segundo aspecto, la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que comprende la Diabetes, complicaciones diabéticas y la condición diabética.
En una tercera modalidad del segundo aspecto que es también una modalidad de la segunda modalidad del segundo aspecto, la Diabetes se selecciona entre el grupo que comprende la Diabetes de tipo 1, Diabetes tipo 2 y Diabetes gestacional.
En una cuarta modalidad del segundo aspecto que es también una modalidad de la tercera modalidad del segundo aspecto, la complicación diabética o condición diabética es una complicación diabética o una condición diabética seleccionada de entre el grupo de la aterosclerosis, enfermedad de la arteria coronaria, enfermedad del pie diabético , retinopatia diabética, retinopatia diabética proliferativa, edema macular diabético, vitreorretinopatia diabética, vitreorretinopatia proliferativa diabética, nefropatia diabética, neuropatía diabética, la intolerancia a la glucosa, enfermedad del corazón, presión arterial alta, colesterol alto, alteración a la tolerancia a la glucosa, la impotencia, la resistencia a la insulina, insuficiencia renal, síndrome metabólico, enfermedad del hígado graso no alcohólico, esteatohepatitis no alcohólica, con o sin fibrosis, enfermedad vascular periférica, disminución de la sensibilidad a la glucosa, disminución de la sensibilidad a la insulina, obesidad, esteatosis hepática, la hiperglucemia, la inflamación vascular asociada con la diabetes, cetoacidosis diabética, coma hiperglucémico hiperosmolar no cetósico, pérdida de peso por eritema necrolítico migratorio, la anemia, la trombosis venosa en el presente de la función de coagulación normal y las manifestaciones neuropsiquiátricas.
El problema subyacente de la presente invención se resuelve en un tercer aspecto que es también la primera modalidad del tercer aspecto mediante una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima , octava, novena, décima, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, cuadragésima sexta y cuadragésima séptima, cuadragésima octava, cuadragésima novena, quincuagésima, quincuagésima primera, quincuagésima segunda, quincuagésima tercera, quincuagésima cuarta, quincuagésima quinta, quincuagésima sexta, quincuagésima séptima, quincuagésima octava y quincuagésima novena modalidad del primer aspecto y, opcionalmente, un componente adicional, en el que el más constituyente se selecciona del grupo que comprende excipientes farmacéuticamente aceptables, vehículos farmacéuticamente aceptables y agentes farmacéuticamente activos.
En una segunda modalidad del tercer aspecto que es también una modalidad de la primera modalidad de la tercer aspecto, la composición farmacéutica comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava , noveno, décimo, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, cuadragésima sexta y cuadragésima séptima, cuadragésima octava, cuadragésima novena, quincuagésima, quincuagésima primera, quincuagésima segunda, quincuagésima tercera, quincuagésima cuarta, quincuagésima quinta, quincuagésima sexta, quincuagésima séptima, quincuagésima octava y quincuagésima novena modalidad del primer aspecto y un portador farmacéuticamente aceptable.
El problema subyacente de la presente invención se resuelve en un cuarto aspecto que es también la primera modalidad del cuarto aspecto por el uso de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, cuadragésima sexta y cuadragésima séptima, cuadragésima octava, cuadragésima novena, quincuagésima, quincuagésima primera, quincuagésima segunda, quincuagésima tercera, quincuagésima cuarta, quincuagésima quinta, quincuagésima sexta, quincuagésima séptima, quincuagésima octava y quincuagésima novena modalidad del primer aspecto para la fabricación de un medicamento.
En una segunda modalidad del cuarto aspecto que es también una modalidad de la primera modalidad del cuarto aspecto, el medicamento es para uso en medicina humana o para el uso en la medicina veterinaria.
El problema subyacente de la presente invención se resuelve en el quinto aspecto que es también la primera modalidad del quinto aspecto por el uso de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, cuadragésima sexta y cuadragésima séptima, cuadragésima octava, cuadragésima novena, quincuagésima, quincuagésima primera, quincuagésima segunda, quincuagésima tercera, quincuagésima cuarta, quincuagésima quinta, quincuagésima sexta, quincuagésima séptima, quincuagésima octava y quincuagésima novena modalidad del primer aspecto para la fabricación de un medio de diagnóstico.
En una tercera modalidad del cuarto aspecto que es también una modalidad de la primera modalidad del cuarto aspecto, el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o trastorno o hiperglucagonemia, en el que la enfermedad o trastorno se selecciona de entre el grupo diabetes, complicaciones diabéticas, y la condición diabética.
En una cuarta modalidad del cuarto aspecto que es también una modalidad de la tercera modalidad del cuarto aspecto, la diabetes se selecciona del grupo de la diabetes tipo 1, diabetes tipo 2 y diabetes gestacional.
En una quinta modalidad del cuarto aspecto que es también una modalidad de la tercera modalidad del cuarto aspecto, la complicación diabética o condición diabética es una complicación diabética o una condición diabética seleccionada de entre el grupo de la aterosclerosis, enfermedad de la arteria coronaria, enfermedad del pie diabético , retinopatia diabética, retinopatía diabética proliferativa, edema macular diabético, vitreorretinopatia diabética, vitreorretinopatia proliferativa diabética, nefropatia diabética, neuropatía diabética, la intolerancia a la glucosa, enfermedad del corazón, presión arterial alta, colesterol alto, alteración a la tolerancia a la glucosa, la impotencia, la resistencia a la insulina, insuficiencia renal, síndrome metabólico, enfermedad del hígado graso no alcohólico, esteatohepatitis no alcohólica, con o sin fibrosis, enfermedad vascular periférica, disminución de la sensibilidad a la glucosa, disminución de la sensibilidad a la insulina, obesidad, esteatosis hepática, la hiperglucemia, la inflamación vascular asociada con la diabetes, cetoacidosis diabética, coma hiperglucémico hiperosmolar no cetósico, pérdida de peso por eritema necrolítico migratorio, la anemia, la trombosis venosa en el presente de la función de coagulación normal y las manifestaciones neuropsiquiátricas.
El problema subyacente de la presente invención se resuelve en un sexto aspecto que es también la primera modalidad del sexto aspecto por un complejo que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 59 y glucagón y/o GIP, en donde preferiblemente el complejo es un complejo cristalino.
El problema subyacente de la presente invención se resuelve en un séptimo aspecto que es también la primera modalidad del séptimo aspecto por el uso de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima , octava, novena, décima, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, cuadragésima sexta y cuadragésima séptima, cuadragésima octava, cuadragésima novena, quincuagésima, quincuagésima primera, quincuagésima segunda, quincuagésima tercera, quincuagésima cuarta, quincuagésima quinta, quincuagésima sexta, quincuagésima séptima, quincuagésima octava y quincuagésima novena modalidad del primer aspecto para la detección de glucagón y/o de GIP.
El problema subyacente de la presente invención se resuelve en un octavo aspecto que es también la primera modalidad del octavo aspecto por un método para el cribado de un antagonista de una actividad mediada por glucagón y/o GIP que comprende las siguientes etapas: -proporcionar un antagonista candidato de la actividad mediada por glucagón y/o GIP, -proporcionando una molécula de ácido nucleico como se define en una cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, cuadragésima sexta y cuadragésima séptima, cuadragésima octava, cuadragésima novena, quincuagésima, quincuagésima primera, quincuagésima segunda, quincuagésima tercera, quincuagésima cuarta, quincuagésima quinta, quincuagésima sexta, quincuagésima séptima, quincuagésima octava y quincuagésima novena modalidad del primer aspecto, proporcionando un sistema de prueba que proporciona una señal en presencia de un antagonista de la actividad mediada por glucagón y/o de GIP, y determinar si el antagonista candidato de la actividad mediada por glucagón y/o de GIP es un antagonista de la actividad mediada por glucagón y/o de GIP.
El problema subyacente de la presente invención se resuelve en un noveno aspecto que es también la primera modalidad del noveno aspecto, por un equipo para la detección de glucagón que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima octava, novena, décima, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, cuadragésima sexta y cuadragésima séptima, cuadragésima octava, cuadragésima novena, quincuagésima, quincuagésima primera, quincuagésima segunda, quincuagésima tercera, quincuagésima cuarta, quincuagésima quinta, quincuagésima sexta, quincuagésima séptima, quincuagésima octava y quincuagésima novena modalidad del primer aspecto.
El problema subyacente de la presente invención se resuelve en un décimo aspecto que es también la primera modalidad del décimo aspecto, por un método para la detección de un ácido nucleico como se define en cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima octava, novena, décima, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, cuadragésima sexta y cuadragésima séptima, cuadragésima octava, cuadragésima novena, quincuagésima, quincuagésima primera, quincuagésima segunda, quincuagésima tercera, quincuagésima cuarta, quincuagésima quinta, quincuagésima sexta, quincuagésima séptima, quincuagésima octava y quincuagésima novena modalidad del primer aspecto en una muestra, en el que el método comprende las etapas de: a) proporcionar una sonda de captura, en donde la sonda de captura es, al menos parcialmente complementaria a una primera parte de la molécula de ácido nucleico como se define en cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, cuadragésima sexta y cuadragésima séptima, cuadragésima octava, cuadragésima novena, quincuagésima, quincuagésima primera, quincuagésima segunda, quincuagésima tercera, quincuagésima cuarta, quincuagésima quinta, quincuagésima sexta, quincuagésima séptima, quincuagésima octava y quincuagésima novena modalidad del primer aspecto, y una sonda de detección, en el que la sonda de detección es al menos parcialmente complementaria a una segunda parte de la molécula de ácido nucleico como se define en cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, cuadragésima sexta y cuadragésima séptima, cuadragésima octava, cuadragésima novena, quincuagésima, quincuagésima primera, quincuagésima segunda, quincuagésima tercera, quincuagésima cuarta, quincuagésima quinta, quincuagésima sexta, quincuagésima séptima, quincuagésima octava y quincuagésima novena modalidad del primer aspecto, o, alternativamente, la sonda de captura es, al menos parcialmente complementaria a una segunda parte de la molécula de ácido nucleico como se define en cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima , octava, novena, décima, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, cuadragésima sexta y cuadragésima séptima, cuadragésima octava, cuadragésima novena, quincuagésima, quincuagésima primera, quincuagésima segunda, quincuagésima tercera, quincuagésima cuarta, quincuagésima quinta, quincuagésima sexta, quincuagésima séptima, quincuagésima octava y quincuagésima novena de modalidad del primer aspecto y la sonda de detección es al menos parcialmente complementaria a la primera parte de la molécula de ácido nucleico como se define en cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, cuadragésima sexta y cuadragésima séptima, cuadragésima octava, cuadragésima novena, quincuagésima, quincuagésima primera, quincuagésima segunda, quincuagésima tercera, quincuagésima cuarta, quincuagésima quinta, quincuagésima sexta, quincuagésima séptima, quincuagésima octava y quincuagésima novena de modalidad del primer aspecto; b)la adición de la sonda de captura y la sonda de detección por separado o combinado a una muestra que contiene la molécula de ácido nucleico como se define en cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, cuadragésima sexta y cuadragésima séptima, cuadragésima octava cuadragésima novena, quincuagésima, quincuagésima primera, quincuagésima segunda, quincuagésima tercera, quincuagésima cuarta, quincuagésima quinta, quincuagésima sexta, quincuagésima séptima, quincuagésima octava y quincuagésima novena modalidad del primer aspecto o presume que contiene la molécula de ácido nucleico como se define en una cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, cuadragésima sexta y cuadragésima séptima, cuadragésima octava, cuadragésima novena, quincuagésima, quincuagésima primera, quincuagésima segunda, quincuagésima tercera, quincuagésima cuarta, quincuagésima quinta, quincuagésima sexta, quincuagésima séptima, quincuagésima octava y quincuagésima novena modalidad del primer aspecto; c)permitiendo que la sonda de captura y la sonda de detección para reaccionar, ya sea simultáneamente o cualquier orden secuencialmente con la molécula de ácido nucleico como se define en cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, cuadragésima sexta y cuadragésima séptima, cuadragésima octava, cuadragésima novena, quincuagésima, quincuagésima primera, quincuagésima segunda, quincuagésima tercera, quincuagésima cuarta, quincuagésima quinta, quincuagésima sexta, quincuagésima séptima, quincuagésima octava y quincuagésima novena modalidad del primer aspecto o parte del mismo; opcionalmente detectar si la sonda de captura o no se hibridiza con la molécula de ácido nucleico como se define en cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, cuadragésima sexta y cuadragésima séptima, cuadragésima octava, cuadragésima novena, quincuagésima, quincuagésima primera, quincuagésima segunda, quincuagésima tercera, quincuagésima cuarta, quincuagésima quinta, quincuagésima sexta, quincuagésima séptima, quincuagésima octava y quincuagésima novena modalidad del primer aspecto proporcionado en la etapa a); y e)detectar el complejo formado en la etapa c) que consiste en la molécula de ácido nucleico como se define en cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, cuadragésima sexta y cuadragésima séptima, cuadragésima octava, cuadragésima novena, quincuagésima, quincuagésima primera, quincuagésima segunda, quincuagésima tercera, quincuagésima cuarta, quincuagésima quinta, quincuagésima sexta, quincuagésima séptima, quincuagésima octava y quincuagésima novena modalidad del primer aspecto y la sonda de captura y la sonda de detección.
En una segunda modalidad de la décimo aspecto que es también una modalidad de la primera modalidad del décimo aspecto, la sonda de detección comprende un medio de detección, y/o en el que la sonda de captura se inmoviliza a un soporte, preferiblemente un soporte sólido.
En una tercera modalidad del décimo aspecto que es también una modalidad de la primera y la segunda modalidad del décimo aspecto, cualquier sonda de detección que no es parte del complejo formado en la etapa c) se elimina de la reacción de modo que en la etapa e) sólo una sonda de detección que forma parte del complejo, es detectada.
En una cuarta modalidad del décimo aspecto que es también una modalidad de la primera, segunda y tercera modalidad del décimo aspecto, la etapa e) comprende la etapa de comparar la señal generada por los medios de detección cuando la sonda de captura y la sonda de detección son hibridizado en presencia de la molécula de ácido nucleico como se define en una cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, décimo primera, décimo segunda, décimo tercera, décimo cuarta, décimo quinta, décimo sexta, décimo séptima, décimo octava, décimo novena, vigésima, vigésima primera, vigésima segunda, vigésima tercera, vigésima cuarta, vigésima quinta, vigésima sexta, vigésima séptima, vigésima octava, vigésima novena, trigésima, trigésima primera, trigésima segunda, trigésima tercera, trigésima cuarta, trigésima quinta, trigésima sexta, trigésima séptima, trigésima octava, trigésima novena, cuadragésima, cuadragésima primera, cuadragésima segunda, cuadragésima tercera, cuadragésima cuarta, cuadragésima quinta, cuadragésima sexta y cuadragésima séptima, cuadragésima octava, cuadragésima novena, quincuagésima, quincuagésima primera, quincuagésima segunda, quincuagésima tercera, quincuagésima cuarta, quincuagésima quinta, quincuagésima sexta, quincuagésima séptima, quincuagésima octava y quincuagésima novena modalidad del primer aspecto o parte del mismo, y en ausencia de dicha molécula de ácido nucleico o parte del mismo.
Aunque no se desea ligar por ninguna teoría, los presentes inventores han encontrado que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se une específicamente y con alta afinidad a glucagón, inhibiendo de este modo la unión de glucagón a su receptor de glucagón y/o es por lo tanto, ya sea directamente o indirectamente, útil en y utilizado para el tratamiento de la diabetes, complicaciones ddiiaabbééttiiccaass, ccoonnddiicciióónn diabética y/o hiperglucagonemia. Además, los presentes inventores han encontrado que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es adecuada para bloquear la interacción de glucagón con el receptor de glucagón. En la medida, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención también puede ser visto como un antagonista del receptor de glucagón y, respectivamente, como un antagonista de los efectos de glucagón, en particular, los efectos de glucagón en su receptor.
Un antagonista de glucagón es una molécula que se une a glucagón, tales como las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, e inhibe la función de glucagón, preferentemente en un ensayo in vitro o en un modelo in vivo como se describe en los Ejemplos.
En cuanto a las diferentes enfermedades, condiciones y trastornos que pueden tratarse o prevenirse mediante el uso de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención o composiciones, preferentemente composiciones farmacéuticas que comprenden la misma, tiene que ser reconocido que este tipo de enfermedades, condiciones y trastornos son aquellos que se describen en este documento, incluyendo y en particular los que se describen y se establece en la parte introductoria de la presente solicitud. En la medida, los respectivos pasajes de la especificación y la parte introductoria de la forma de especificación forman parte integral de la presente divulgación enseñando la idoneidad de la molécula de ácido nucleico de la presente invención para la prevención y el tratamiento, respectivamente, de dichas enfermedades, condiciones, y trastornos.
Además, se prefiere una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención si el efecto fisiológico de glucagón, eje receptor de glucagón está relacionada con los niveles plasmáticos elevados de glucagón.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término glucagón se refiere a cualquier glucagón, incluyendo, pero no limitado a, el glucagón de mamífero. Preferiblemente, el glucagón de mamífero se selecciona entre el grupo que comprende humano, rata, ratón, mono, cerdo, conejo, hámster, perro, oveja, gallina y el glucagón bovino (ver la alineación de especies de glucagón en la Figura. 22). Más preferiblemente, el glucagón es glucagón humano. La secuencia de aminoácidos de los diversos glucagónes son conocidos por la persona experta en la téenica y, entre otros, representado en la Figura.22.
Un antagonista a glucagón es una molécula que se une a glucagón tales como la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención e inhibe la función de glucagón, preferentemente en un ensayo in vitro o en un modelo in vivo como se describe en los Ejemplos.
Por otra parte, los presentes inventores han encontrado que la molécula de ácido nucleico de Tipo B de acuerdo con la presente invención inhibe la unión de glucagón a su receptor de glucagón y la unión de GIP a su receptor. Además, la molécula de ácido nucleico de Tipo B de acuerdo con la presente invención es adecuada para bloquear la interacción de glucagón con el receptor de glucagón y de GIP con el receptor de GIP. En la medida, la molécula de ácido nucleico de Tipo B de acuerdo con la presente invención también puede ser vista como un antagonista del receptor de glucagón y como antagonistas del receptor de GIP.
Un antagonista de GIP es una molécula que se une a GIP tal como la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención e inhibe la función de GIP, preferiblemente en un ensayo in vitro o en un modelo in vivo como se describe en los Ejemplos.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término GIP se refiere a cualquier GIP incluyendo, pero no limitada a, mamíferos GIP. Más preferiblemente, el GIP es un GIP humano. La secuencia de aminoácidos de GIP es conocido por la persona experta en la téenica y, entre otros, representada por la SEQ ID NO: 168 divulgada en el presente documento.
Está dentro de la presente invención que el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es una molécula de ácido nucleico. En la medida los términos ácido nucleico y molécula de ácido nucleico se usan en el presente documento de manera sinónima si no se indica lo contrario. Además, dicho ácido(s) nucleico es/son preferiblemente también referidos como en el presente documento como la molécula de ácido(s) nucleico de acuerdo con la presente invención, el ácido(s) nucleico de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de la invención o la molécula(s) de ácido nucleico de la invención.
Las características del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención como se describe en el presente documento se pueden realizar en cualquier aspecto de la presente invención en la que se utiliza el ácido nucleico, ya sea solos o en cualquier combinación.
Como se describe en más detalle en este documento, los presentes inventores han identificado un número de diferentes moléculas de ácido nucleico que unen glucagón, mediante el cual las moléculas de ácido nucleico pueden ser caracterizadas en términos de tramos de nucleótidos que se hace referencia también en el presente documento como se divulga (véase el Ejemplo 1). Como se muestra experimentalmente en el ejemplo 8 los inventores podrían demostrar sorprendentemente en varios sistemas que las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención son adecuadas para el tratamiento de la Diabetes.
Cada uno de los diferentes tipos de moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de la invención que se unen al glucagón y/o GIP comprende tres tramos diferentes de nucleótidos: un primer tramo terminal de nucleótidos, un tramo central de nucleótidos y un segundo tramo terminal de nucleótidos. En general, las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de la presente invención comprenden en su extremo 5'y el extremo 3' de cada uno de los tramos terminales de nucleótidos, es decir, el primer tramo terminal de nucleótidos o el segundo tramo terminal de nucleótidos (también referido como tramo terminal 5' de nucleótidos y tramo terminal 3' de nucleótidos). El primer tramo terminal de nucleótidos y el segundo tramo terminal de nucleótidos pueden, en principio debido a su complementariedad de bases, se hibridizarse entre si, por lo que tras la hibridación se forma una estructura de doble cadena. Sin embargo, dicha hibridación no se realiza necesariamente en la molécula bajo condiciones fisiológicas y/o no fisiológicas. Los tres tramos de nucleótidos de moléculas de ácido nucleico que unen glucagón, el primer tramo terminal de nucleótidos, el tramo central de nucleótidos y segundo tramo terminal de nucleótidos, están dispuestos entre si en la dirección 5'-> 3': el primer tramo terminal de los nucleótidos el tramo central de nucleótidos el segundo tramo terminal de nucleótidos. Alternativamente, el segundo tramo terminal de nucleótidos, el tramo central de nucleótidos y el primer tramo terminal de nucleótidos están dispuestos el uno al otro en la dirección 5'->3'.
Las diferencias en las secuencias de los tramos definidos entre las diferentes moléculas de ácido nucleico que unen glucagón pueden influir en la afinidad de unión al glucagón y/o de GIF. Basado en el análisis de unión de los diferentes moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de la presente invención, el tramo central y los nucleótidos que forman el mismo, son de forma individual y más preferiblemente en su totalidad esencial para la unión al glucagón y/o de GIP.
Los términos 'tramos' y 'tramo de nucleótidos "se usan aquí de manera sinónima si no se indica lo contrario.
En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es una molécula de ácido nucleico única. En una modalidad adicional, la molécula de ácido nucleico única está presente como una multitud de la molécula de ácido nucleico única o como una multitud de las especies de molécula de ácido nucleico únicas.
Será reconocido por los expertos en la téenica que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención consiste preferiblemente de nucleótidos que están unidos covalentemente entre si, preferiblemente a través de enlaces fosfodiéster o enlaces.
Está dentro de la presente invención que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención comprende dos o más tramos o parte(s) de los mismos que pueden, en principio, hibridar entre si. Tras dicha hibridación se forma una estructura de doble cadena.
Será reconocido por los expertos en la materia que puede o no producirse tal hibridación, particularmente bajo in vitro y/o en condiciones in vivo.También, en el caso de hibridación, tal hibridación no se produce necesariamente en toda la longitud de los dos tramos en los que, al menos basado en las reglas para el apareamiento de bases, tal hibridación y por lo tanto la formación de una estructura de doble cadena puede, en principio, producirse. Tal como se utiliza en el presente documento preferiblemente, una estructura de doble cadena es una parte de una molécula de ácido nucleico o una estructura formada por dos o más cadenas separadas o dos tramos separados espacialmente de una sola cadena de una molécula de ácido nucleico, en donde al menos uno, preferiblemente dos o más de pares base existen, que son el apareamiento de bases, preferiblemente de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases de Watson-Crick. También será reconocido por los expertos en la téenica que otros apareamiento de bases tales como el apareamiento de bases de Hoogsten puede existir en o puede formar tal estructura de doble cadena. También es necesario reconocer que la característica de que dos tramos hibriden preferiblemente indica que tal hibridación se supone que sucede debido a la complementariedad de bases de los dos tramos independientemente de si tal hibridación en realidad se produce in vivo y/o in vitro.
En una modalidad preferida el término dispuesto como en el presente documento, significa el orden o secuencia de características o elementos estructurales o funcionales descritos en este documento en relación con la molécula(s) de ácidos nucleico divulgada en el presente documento.
Se reconocerá por la persona experta en la téenica que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es capaz de unirse a glucagón y/o de GIP. Sin desear estar ligado por ninguna teoría, los presentes inventores asumen que la unión de glucagón y/o de unión de GIP resulta de una combinación de rasgos o elementos estructurales tridimensional de la molécula de ácido nucleico de la presente invención, que son causadas por la orientación y el patrón de plegado de la secuencia primaria de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de la formación de tales rasgos o elementos, por lo que preferiblemente tales rasgos o elementos son el primer tramo terminal de nucleótidos, el tramo central de nucleótidos y/o el segundo tramo terminal de la invención nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de la presente invención. Es evidente qué el rasgo o elemento individual se pueden formar por diferentes secuencias individuales el grado de variación de las cuales pueden variar dependiendo de la estructura tridimensional tal elemento o rasgo se tiene que formar para mediar la unión de la molécula de ácido nucleico de la invención a glucagón y/o GIP. La característica de unión general del ácido nucleico de la presente invención resulta de la interacción de los diversos elementos y rasgos, respectivamente, que finalmente resulta en la interacción de la molécula de ácido nucleico de la presente invención con su objetivo, es decir, glucagón y GIP, respectivamente. De nuevo sin desear estar ligado por ninguna teoría, el tramo central de nucleótidos que es característico para el ácido nucleico de la presente invención es importante para mediar en la unión de la molécula de ácido nucleico de la invención con el glucagón y/o de GIP. Por consiguiente, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es capaz de interactuar con el glucagón. Además, se reconoció por la persona experta en la téenica que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es un antagonista de glucagón y/o de GIP. Debido a esto la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es adecuada para el tratamiento y prevención, respectivamente, de cualquier enfermedad o condición que están asociadas con o causadas por el glucagón y/o de GIP. Tales enfermedades y condiciones pueden ser tomadas de la téenica anterior que establece que el glucagón y/o GIP está implicada o asociada con dichas enfermedades y condiciones, respectivamente, y que se incorpora en el presente documento por referencia para proporcionar el fundamento científico para el uso terapéutico de la molécula de ácido nucleico de la presente invención.
La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención comprenderá también una molécula de ácido nucleico que es esencialmente homologa a las secuencias de nucleótidos particulares descritas en el presente documento. El término sustancialmente homólogo se entenderá como la homología es de al menos 75%, preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90% y más preferiblemente más que al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99%.
El porcentaje real de nucleótidos homólogos presentes en una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención dependerá del número total de nucleótidos presentes en el ácido nucleico. El porcentaje de la modificación se puede calcular basándose en el número total de nucleótidos presentes en la molécula de ácido nucleico.
La homología entre dos moléculas de ácido nucleico se puede determinar como es conocido por la persona experta en la téenica. Más específicamente, un algoritmo de comparación de secuencia se puede utilizar para calcular el porcentaje de homología de secuencia para una secuencia(s) de prueba con relación a una secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa designados. La secuencia de prueba es, preferiblemente, la secuencia o molécula de ácido nucleico que se dice que es homologa o por probar si es homologa, y si es así, en qué medida, a una molécula de ácido nucleico diferente, por lo que tal molécula de ácido nucleico diferente se conoce como la secuencia de referencia. En una modalidad, la secuencia de referencia es una molécula de ácido nucleico como se describe en el presente documento, preferiblemente una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54 o SEQ ID NO: 59. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede llevarse a cabo, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Smith y Waterman, 1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970), por la búsqueda de método de similitud de Pearson y Lipman (Pearson y Lipman, 1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) , o por inspección visual.
Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia es el algoritmo usado en la herramienta de búsqueda de alineación local básica (en lo sucesivo como "BLAST"), ver, por ejemplo, Altschul et al (Altschul et al.1990 y Altschul et al, 1997). El software para realizar el análisis BLAST está públicamente disponible a través del Centro Nacional de Información Bioteenológica (en lo sucesivo como "NCBI"). Los parámetros por defecto utilizados en la determinación de identidad de secuencia utilizando el software disponible de NCBI, por ejemplo, BLASTN (para secuencias de nucleótidos) y BLASTP (para secuencias de aminoácidos) se describen en McGinnis et al (McGinnis et al, 2004).
La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención comprenderá también una molécula de ácido nucleico que tiene un cierto grado de identidad en relación con el ácido(s) nucleico de la presente invención descrita en este documento y definido por su/sus secuencia de nucleótidos. Más preferiblemente, la presente invención también comprende aquellas moléculas de ácido nucleico que tienen una identidad de al menos el 75%, preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90% y lo más preferiblemente más de al menos 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% con respecto a la molécula de ácido nucleico de la presente invención definida por su secuencia de nucleótidos o una parte del mismo.
El término ácido nucleico de la invención o molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención comprenderán también una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico descrita en el presente documento o parte del mismo, tales como, por ejemplo, un metabolito o un derivado del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención , preferiblemente en la medida en que la molécula de ácido nucleico o dichas partes están involucrados en la o capaz de unirse a glucagón. Tal molécula de ácido nucleico puede ser derivado de los descritos en este documento, por ejemplo, por truncamiento. El truncamiento se puede relacionar con uno o ambos de los extremos de una molécula de ácido nucleico de la presente invención como se describe en el presente documento. También, el truncamiento puede estar relacionado con la secuencia interna de nucleótidos, es decir, puede estar relacionada con una o varias de las secuencias de nucleótidos entre el nucleótido terminal 5' y el nucleótido terminal 3', respectivamente. Por otra parte, el truncamiento comprenderá la supresión de tan poco como un solo nucleótido de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de la presente invención descrita en el presente documento. El truncamiento también puede estar relacionado con más de un tramo de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de la presente invención, mediante el cual el tramo de nucleótidos puede ser tan poco como un nucleótido de largo. La unión de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se puede determinar por los expertos en la téenica usando experimentos de rutina o mediante el uso de o la adopción de un método como se describe en el presente documento, preferiblemente como se describe en el presente documento en la parte de ejemplo.
La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede ser una molécula de ácido D-nucleico o una molécula de ácido L-nucleico. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es una molécula de ácido L-nucleico.
También está dentro de la presente invención que, en una modalidad, cada una y cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento en su totalidad, en términos de su secuencia(s) de ácido nucleico se limitan a la secuencia(s) de nucleótidos indicada en particular. En otras palabras, los términos "que comprende" o "comprende" se interpretarán de tal modalidad, en el sentido de que contengan o de que consistan.
También está dentro de la presente invención que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es parte de un ácido nucleico más largo por el que este ácido nucleico comprende ya varias partes mediante el cual al menos una de tal parte es una molécula de ácido nucleico de la presente invención, o una parte de la misma. La otra parte de dicho ácido nucleico más largo puede ser uno o varios ácido(s) D-nucleico o ácido(s) L-nucleico. Cualquier combinación puede utilizarse en relación con la presente invención. Esta otra parte del ácido nucleico más largo puede exhibir una función que es diferente de la unión, preferiblemente de la unión a glucagón y/o de GIP. Una función posible es permitir la interacción con otras moléculas, por lo que tales otras moléculas de preferencia son diferentes de glucagón tales como, por ejemplo, para la inmovilización, enlaces cruzados, la detección o amplificación. En una modalidad adicional de la presente invención, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención comprende, como fracciones individuales o combinadas, varias de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención. Tal ácido nucleico que comprende varias de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención también es abarcado por el término ácido nucleico más largo.
Un ácido L-nucleico tal como se usa en el presente documento es un ácido nucleico o molécula de ácido nucleico que consiste en nucleótidos-L, preferiblemente que consiste completamente de nucleótidos-L.
Un ácido D-nucleico tal como se utiliza en el presente documento es el ácido nucleico o molécula de ácido nucleico que consiste de d-nucleótidos, preferiblemente que consiste completamente de d-nucleótidos.
Los términos ácido nucleico y molécula de ácido nucleico se utilizan en el presente documento de manera intercambiable si no se indica explícitamente lo contrario.
Además, si no se indica lo contrario, cualquier secuencia de nucleótidos que se expone en el presente documento en la dirección 5'3'.
Como preferiblemente se utiliza en el presente documento cualquier posición de un nucleótido se determina o se hace referencia en relación con el extremo 5'de una secuencia, un tramo o un subtramo que contiene tales nucleótidos. De acuerdo con ello, un sequndo nucleótido es el segundo nucleótido contado a partir del extremo 5' de la secuencia, tramo y subtramo, respectivamente. Además, en virtud de los mismos, un penúltimo nucleótido es el segundo nucleótido contado a partir del extremo 3' de una secuencia, tramo y subtramo, respectivamente.
Independientemente de si la molécula de ácido nucléico de la invención consiste en d-nucleótidos, nucleótidos-L o una combinación de ambos con la combinación de ser por ejemplo una combinación aleatoria o una secuencia definida de tramos que consisten en al menos un nucleótido-L y al menos un ácido D-nucleico, el ácido nucleico puede consistir en desoxirribonucleótido(s), ribonucleótido (s) o combinaciones de los mismos.
También está dentro de la presente invención que la molécula de ácido nucleico consiste de ambos ribonucleótidos y 2' desoxirribonucleótidos. Los 2' desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos se muestran en la Figura.29 y 30A-B. Con el fin de distinguir entre los ribonucleótidos y 2' desoxirribonucleótidos en las secuencias de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el siguiente código de referencia se usa en el presente documento.
La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se compone principalmente de 2' desoxirribonucleótidos, en el gue preferiblemente G es 2'desoxi-guanosina-5'-monofosfato, C es 2' desoxi-citidina-5'monofosfato, A es 2'desoxi-adenosina-5'-monofosfato, T es 2'desoxi-timidina-5'-monofosfato, rG es guanosina-5'-monofosfato, rC es citidina 5'-monofosfato rA es adenosina-5'-monofosfato, rU es uridina-5'-monofosfato, rT es timidina-5 '-monofosfato-.
La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se compone principalmente de ribonucleótidos, en donde preferiblemente G es guanosina-5'-monofosfato, C es citidina 5'-monofosfato, A es adenosina-5'-monofosfato, U es uridina-5'monofosfato, dG es 2'desoxi-guanosina-5'-monofosfato, dC es 2'desoxi-citidina-5'monofosfato, dA es 2'desoxi-adenosina-5'-monofosfato, dT es 2'desoxi-timidina-5'-monofosfato.
Diseñando la molécula de ácido nucleico de la invención tal como una molécula de ácido L-nucleico es ventajoso por varias razones. Las moléculas de ácido L-nucleico son enantiómeros de ácidos nucleicos naturales. Las moléculas de ácido D-nucleico sin embargo, no son muy estables en soluciones acuosas y en particular en los sistemas biológicos o muestras biológicas debido a la presencia expandida de nucleasas. Las nucleasas presentes en la naturaleza, en particular las nucleasas de las células animales no son capaces de degradar los ácidos L-nucleicos. Debido a esto, la vida media biológica de una molécula de ácido L-nucleico se incrementa significativamente en un sistema de este tipo, incluyendo el cuerpo animal y humano. Debido a la falta de degradabilidad de moléculas de ácido L-nucleico no se generan productos de degradación de nucleasa y por lo tanto no hay efectos secundarios derivados de los mismos observados en un sistema de este tipo, incluyendo el cuerpo animal y humano. Este aspecto distingue moléculas de ácido L-nucleico de objetivamente todos los demás compuestos gue se utilizan en la terapia de enfermedades y/o trastornos que implican la presencia de glucagón. Una molécula de ácido L-nucleico que se une específicamente a una molécula objetivo a través de un mecanismo diferente del apareamiento de bases de Watson Crick, o un aptámero que consiste parcial o completamente de L-nucleótidos, particularmente con aquellas partes del aptámero que está implicando en la unión del aptámero para la molécula objetivo, también es llamado un spiegelmer. Los aptámeros y los spiegelmer como tales son conocidos para un experto en la téenica y son, entre otros, descritos en "El manual de aptámero 1(eds.Klussmann, 2006).
También está dentro de la presente invención que la molécula de ácido nucleico de la invención, independientemente si están presentes como un ácido D-nucleico, ácido L-nucleico o ácido D,L-nucleico o si se trata de ADN o de ARN, puede ser presente como una molécula de ácido nucleico de cadena sencilla o de cadena doble. Normalmente, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico de cadena única que presenta una estructura secundaria definida debido a su secuencia primaria y pueden también por lo tanto formar una estructura terciaria. La molécula de ácido nucleico, sin embargo, también puede ser de doble cadena en el sentido de que dos cadenas que son complementarias o parcialmente complementarias entre si se hibridizan entre si.
La molécula de ácido nucleico de la invención puede ser modificada. Tal modificación puede estar relacionada con la única de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico y es bien conocido en la téenica. Los ejemplos de tales modificaciones se describen por, entre otros, Venkatesan et al. (Venkatesan, Kim et al.2003) y Kusser (Kusser 2000). Tal modificación puede ser un átomo de H, un átomo de F o grupo 0-CH3 o grupo NH2- en la posición 2' de uno, varios de todos los nucleótidos individuales de los cuales la molécula de ácido nucleico consiste. Además, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede comprender al menos un LNA nucleótido. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención consta de LNA nucleótidos.
En una modalidad, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede ser una molécula de ácido nucleico multipartito. Una molécula de ácido nucleico multipartito como se usa en el presente documento es una molécula de ácido nucleico que se compone de al menos dos cadenas de ácido nucleico separadas. Estas dos cadenas de ácidos nucleicos forman una unidad funcional con lo cual la unidad funcional es un ligando para una molécula objetivo y, preferiblemente un antagonista de la molécula objetivo, en el caso de glucagón y/o de GIP. Las dos cadenas de ácido nucleico se pueden derivar de cualquier molécula de ácido nucleico de la invención por escindir una molécula de ácido nucleico de la invención para generar al menos dos cadenas o por sintetizar una molécula de ácido nucleico correspondiente a una primera parte de la completa longitud de la molécula de ácido nucleico de la invención y otra molécula de ácido nucleico correspondiente a otra parte de la molécula de ácido nucleico de la completa longitud de la invención. Dependiendo del número de partes que forman la completa longitud de las moléculas de ácido nucleico el número correspondiente de las partes que tienen la secuencia de nucleótidos requerida se sintetizará. Es preciso reconocer que tanto el enfoque de escisión y el enfoque de síntesis se pueden aplicar para generar una molécula de ácido nucleico ultipartita donde hay más de dos cadenas como se ejemplifica más arriba. En otras palabras, las dos cadenas de ácido nucleico separadas son normalmente diferentes a partir de dos cadenas siendo complementarias y se hibridizan entre sí a pesar de un cierto grado de complementariedad que puede existir entre dichas dos cadenas de ácido nucleico separadas y por lo cual tal complementariedad puede resultar en la hibridación de dichas cadenas separadas.
Finalmente, también está dentro de la presente invención que una completamente cerrada, es decir, una estructura circular para la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se realiza, es decir, que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención están cerrados en una modalidad, preferentemente a través de un enlace covalente, por el cual más preferiblemente tal vinculación covalente se hace entre el 5 extremo y el 3' extremo de la secuencia de la molécula de ácido nucleico de la invención como se divulga en el presente documento o cualquier derivado de la misma.
Una posibilidad para determinar las constantes de unión de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es el uso de los métodos como se describe en los ejemplos 3 y 4 que confirman el hallazgo anterior de que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención exhiben un rango de valores de KD favorables. Una medida apropiada con el fin de expresar la intensidad de la unión entre la molécula de ácido nucleico individual y el objetivo es que en el presente caso el glucagón es el tan llamado valor de KD que, como tal, así como el método para su determinación que es conocido para los expertos en la téenica.
Preferiblemente, el valor de KD mostrado por el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención está por debajo de 1 mM. Un valor de KD de aproximadamente 1 mM se dice que es característico para una unión no específica de un ácido nucleico a un objetivo. Como será reconocido por los expertos en la técnica, el valor KD de un grupo de compuestos tales como diversas modalidades de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención está dentro de un cierto rango. La KD antes mencionada de alrededor de 1 mM es un limite superior preferido para el valor de KD. El limite inferior para la KD del objetivo que una los ácidos nucleicos tales como la de la molécula de ácido nucleico de la invención puede ser tan poco como aproximadamente 10 picomolar o puede ser mayor. Está dentro de la presente invención que los valores de KD de los ácidos nucleicos individuales que unen al glucagón es preferentemente dentro de este rango. Los rangos preferidos de los valores de KD pueden ser definidos por la elección de cualquier primer número dentro de este rango y cualquier segundo número dentro de este rango. Los valores de KD superiores preferidos son 250 nM y 100 nM, los valores inferiores preferidos de KD son 50 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM y 10 pM. El valor superior más preferido de KD es 10 nM, el valor inferior preferido de KD es 100 pM.
Además de las propiedades de unión de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención inhibe la función de la molécula objetivo respectiva que está en el presente caso de glucagón y/o de GIP. La inhibición de la función de glucagón y/o GIP por ejemplo, la estimulación de los receptores respectivos como se describe anteriormente se consigue por la unión de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención a glucagón y/o de GIP y la formación de un complejo de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y el glucagón y/o de GIP. Tal complejo de una molécula de ácido nucleico de la presente invención y el glucagón y/o GIP no puede estimular los receptores que normalmente son estimuladas por el glucagón y/o GIP, es decir, glucagón y/o GIP que no está presente en un complejo con una molécula de ácido nucleico de la invención. Por consiguiente, la inhibición de la función del receptor por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es independiente del respectivo receptor que puede ser estimulado por el glucagón y/o GIP, en lugar de tal inhibición que resulta de la prevención de la estimulación del receptor por el glucagón y/o GIP por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención.
Una posibilidad para determinar la constante de inhibición de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es el uso de los métodos como se describe en el ejemplo 5 que confirma el hallazgo anterior de que el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención exhibe una constante de inhibición favorable que permite el uso de dicha molécula de ácido nucleico en un esquema de tratamiento terapéutico. Una medida apropiada para la expresión de la intensidad del efecto inhibidor de la molécula de ácido nucleico individual en la interacción del objetivo el cual está en el glucagón del caso presente, y el receptor respectivo, es llamado la concentración inhibitoria máxima media (en forma abreviada CI50) que, como tal, asi como el método para su determinación son conocidos por los expertos en la téenica.
Preferiblemente, el valor de CI50 se muestra por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención está por debajo de 1 mM. Un valor de IC50 de aproximadamente 1 mM se dice que es característico para una inhibición no específica de funciones objetivo, preferiblemente la inhibición de la activación del receptor objetivo por el objetivo, por una molécula de ácido nucleico. Como será reconocido por los expertos en la técnica, el valor CI50 de un grupo de compuestos tales como de diversas modalidades de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención está dentro de un cierto rango. El CI50 anteriormente mencionado de aproximadamente 1 mM es un límite superior preferido para el valor de CI50. El limite inferior para el CI50 de una molécula de unión al objetivo del ácido nucleico de la invención puede ser tan poco como aproximadamente 10 picomolares o puede ser mayor. Está dentro de la presente invención que los valores de CI50 de los ácidos nucleicos individuales de la unión a glucagón es preferiblemente dentro de este rango. Los rangos preferidos pueden ser definidos por la elección de cualquier primer número dentro de este rango y cualquier segundo número dentro de este rango. Los valores de CI50 superiores preferidos son 250 nM y 100 nM, los valores de CI50 inferiores preferidos son 50 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM y 10 pM. El valor CI50 superior más preferido es de 5 nM, el valor CI50 inferior más preferido es 1 nM .
La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede tener cualquier longitud, mientras sea capaz de unirse a la molécula objetivo que es en el presente caso de glucagón y/o de GIP. Se reconoce en la téenica que hay longitudes preferidas de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con las presentes invenciones. Normalmente, la longitud es de entre 15 y 120 nucleótidos. Será reconocido por los expertos en la técnica que cualquier número entero entre 15 y 120 es una longitud posible para una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Los rangos más preferidos para la longitud de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención son longitudes de aproximadamente 20 a 100 nucleótidos, aproximadamente 20 a 80 nucleótidos, aproximadamente 20 a 60 nucleótidos, aproximadamente 20 a 54 nucleótidos y aproximadamente 39 a 44 nucleótidos.
Está dentro de la presente invención que la molécula de ácido nucleico de la presente invención comprende una fracción que prefe iblemente es una fracción de alto peso molecular y/o que preferiblemente permite modificar las características de la molécula de ácido nucleico en términos de, entre otros, tiempo de residencia en el cuerpo del animal, preferiblemente el cuerpo humano. Una modalidad particularmente preferida de dicha modificación es la PEGilación y HESilación de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. En el presente documento PEG representa poli (etilenglicol) y HES para el hidroxietil almidón. La PEGilación como preferiblemente se usa en el presente documento es la modificación de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención en la que dicha modificación consiste en una fracción de PEG que está unido a una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. La HESylación como preferiblemente se usa en el presente documento es la modificación de una molécula de ácido nucleico de acuerdo a la presente invención en la que dicha modificación consiste en una fracción de HES la cual se une a una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Estas modificaciones, asi como el proceso de modificación de una molécula de ácido nucleico usando tales modificaciones, se describen en la solicitud de patente Europea EP 1306382, cuya divulgación se incorpora en el presente documento en su totalidad por referencia.
En el caso de PEG siendo tal fracción de peso molecular alto, el peso molecular es preferiblemente de aproximadamente 20,000 a aproximadamente 120,000 Da, más preferiblemente de aproximadamente 30,000 a aproximadamente 80,000 Da y más preferiblemente de aproximadamente 40,000 Da.
En el caso de HES siendo tal fracción de peso molecular alto, el peso molecular es preferiblemente de aproximadamente 50 kDa a aproximadamente 1,000 kDa, más preferiblemente de aproximadamente 100 kDa a aproximadamente 700 kDa y más preferiblemente de 200 kDa a 500 kDa. HES exhibe una sustitución molar de 0.1 a 1.5, más preferiblemente de 1 a 1.5 y exhibe un grado de sustitución expresado como el radio C2/C6 de aproximadamente 0.1 a 15, preferiblemente de aproximadamente 3 a 10. El proceso de modificación de HES es, por ejemplo, descrito en la solicitud de patente alemana DE 1 2004 006 249.8 cuya divulgación es incorpora en este acto en su totalidad por referencia.
La modificación puede, en principio, hacerse a la molécula de ácido nucleico de la presente invención en cualquier posición de la misma. Preferiblemente, tal modificación se realiza ya sea a la 5'- nucleótido terminal, el 3'-nucleótido terminal y/o cualquier nucleótido entre el 5' nucleótido y el 3' nucleótido de la molécula de ácido nucleico.
La modificación y preferiblemente la fracción de PEG y/o de HES se pueden adjuntar a la molécula de ácido nucleico de la presente invención, ya sea directamente o indirectamente, de preferencia indirectamente a través de un enlazador. También está dentro de la presente invención que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención comprende una o más modificaciones, preferiblemente uno o más fracciones de PEG y/o de HES. En una modalidad, la molécula de enlace individual une más de una fracción de PEG o de HES a una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. El enlazador utilizado con relación a la presente invención puede ser en si mismo, ya sea lineal o ramificado. Este tipo de enlazadores son conocidos para los expertos en la téenica y se describen adicionalmente en las solicitudes de patente internacional WO2005/074993 y W02003/035665.
En una modalidad preferida, el enlazador es un enlazador biodegradable. El enlazador biodegradable permite modificar las características de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención en términos de, entre otros, tiempo de residencia en un cuerpo animal, preferiblemente en un cuerpo humano, debido a la liberación de la modificación de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. El uso de un enlazador biodegradable puede permitir un mejor control del tiempo de residencia de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Una modalidad preferida de dicho enlazador biodegradable es un enlazador biodegradable como se describe en, pero no limitado a, las solicitudes de patente internacional W02006/052790, W02008/034122, W02004/092191 y W02005/099768.
Está dentro de la presente invención que la modificación o grupo de modificación es una modificación biodegradable, por lo que la modificación biodegradable puede estar unida a la molécula de ácido nucleico de la presente invención, ya sea directa o indirectamente, preferentemente a través de un enlazador. La modificación biodegradable permite modificar las características de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención en términos de, entre otros, tiempo de residencia en un cuerpo animal, preferiblemente en un cuerpo humano, debido a la liberación o a la degradación de la modificación de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. El uso de una modificación biodegradable puede permitir un mejor control del tiempo de residencia de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Una modalidad preferida de dicha modificación biodegradable es biodegradable como se describe en, pero no restringido a, las solicitudes de patente internacional W02002/065963, 02003/070823, W02004 /113394 y W02000/41647, preferiblemente en W02000/41647, página 18, línea 4 a 24.
Además de las modificaciones tal como se describe anteriormente, otras modificaciones pueden ser utilizadas para modificar las características de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, por lo que tales otras modificaciones se pueden seleccionar del grupo de proteínas, lípidos tales como colesterol y cadenas de azúcar tales como amilasa, dextrano, etc.
Sin desear estar ligado por ninguna teoría, mediante la modificación de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención con una fracción de peso molecular alto tal como un polímero y más particularmente uno o varios de los polímeros descritos en el presente documento, que son preferiblemente fisiológicamente aceptables, la cinética de la excreción de la así molécula de ácido nucleico modificada de la invención se cambió. Más particularmente, debido al aumento del peso molecular de la así molécula de ácido nucleico modificada de la invención y debido a la molécula de ácido nucleico de la invención no está sujeta al metabolismo en particular cuando en la forma L, es decir, ser una molécula de ácido L-nucleico, la excreción de un cuerpo animal, preferiblemente de un cuerpo de un mamífero y más preferiblemente de un cuerpo humano se reduce. Como la excreción normalmente ocurre por medio de los riñones, los presentes inventores suponen que la tasa de filtración glomerular de la así molécula de ácido nucleico modificada es reducida significativamente en comparación con una molécula de ácido nucleico que no tiene este tipo de modificación de peso molecular alto que da como resultado un aumento en el tiempo de residencia de la molécula de ácido nucleico modificada en el cuerpo animal. En conexión con eso, es particularmente digno de mención que, a pesar de tal modificación de peso molecular alto de la especificidad de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención no se ve afectado de manera perjudicial. En la medida, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención tiene entre otros, la característica sorprendente - la cual normalmente no se puede esperar de un compuesto farmacéuticamente activo - que una fórmula farmacéutica que proporciona para una liberación sostenida no es necesariamente requerido para proporcionar una liberación sostenida de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Más bien, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención en su forma modificada que comprende una fracción del peso molecular alto, puede, como tal, ya ser utilizada como una fórmula de liberación sostenida, ya que actúa, debido a su modificación, ya como si fuera liberado de una fórmula de liberación sostenida. En la medida, la modificación(es) de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención como se divulga en el presente documento y la así molécula de ácido nucleico modificada de acuerdo con la presente invención y cualquier composición que comprende el mismo puede proporcionar para una distinta, preferiblemente farmacocinética, controlada y la biodistribución de la misma. Esto también incluye el tiempo de residencia en la circulación del animal y el cuerpo humano y la distribución de los tejidos de tal animal y humano. Tales modificaciones se describen adicionalmente en la solicitud de patente W02003/035665.
Sin embargo, también está dentro de la presente invención que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención no comprende ninguna modificación y, en particular ninguna modificación de peso molecular alto, tal como PEG o HES. Tal modalidad se prefiere particularmente cuando la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención muestra la distribución preferencial a cualquier órgano o tejido objetivo en el cuerpo o cuando se desea un rápido aclaramiento de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención desde el cuerpo después de la administración. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención como se divulga en el presente documento con un perfil de distribución preferencial a cualquier órgano o tejido objetivo en el cuerpo permitirla el establecimiento de concentraciones locales eficaces en el tejido objetivo, mientras se mantiene la concentración sistémica de la molécula de ácido nucleico baja. Esto permitiría el uso de dosis bajas que no sólo es beneficioso desde un punto de vista económico, sino que también reduce la exposición innecesaria de otros tejidos a la molécula de ácido nucleico, reduciendo asi el riesgo potencial de efectos secundarios. El rápido aclaramiento de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención desde el cuerpo después de la administración podría ser deseable, entre otros, en caso de formación de imágenes in vivo o requisitos de dosificación terapéutica específicos utilizando la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención o medicamentos que comprenden la misma.
La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, y/o el antagonista de acuerdo con la presente invención pueden utilizarse para la generación o fabricación de un medicamento. Tal medicamento o una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención contiene al menos una especie de una molécula de ácido nucleico de la invención capaces de unirse a glucagón y/o GIP opcionalmente junto con más compuestos activos farmacéuticamente, por lo que la molécula de ácido nucleico de la invención preferiblemente actúa en sí como un compuesto activo farmacéuticamente.Tales medicamentos comprenden en modalidades preferidas, al menos un portador farmacéuticamente aceptable. Tal portador puede ser, por ejemplo, agua, tampón, PBS, solución de glucosa, preferiblemente un 5% de glucosa, solución de sal equilibrada, citrato, almidón, azúcar, gelatina o cualquier otra sustancia portadora aceptable. Tales portadores son generalmente conocidos por los expertos en la téenica. Será reconocido por la persona experta en la técnica que cualquiera de las modalidades, el uso y aspectos de o relacionados con el medicamento de la presente invención es también aplicable a la composición farmacéutica de la presente invención y viceversa.
La indicación, enfermedades y trastornos para el tratamiento y/o prevención de las cuales la molécula de ácido nucleico, las composiciones farmacéuticas y medicamentos de acuerdo con o preparadas de acuerdo con la presente invención resultan de la participación, ya sea directa o indirecta, de glucagón en el mecanismo patogenético respectivo.
Basado sobre la participación de glucagón en las vías pertinentes para o implicados en la diabetes, es evidente que la molécula de ácido nucleico de la presente invención, las composiciones farmacéuticas que contienen uno o varias especies de la molécula de ácido nucleico de la presente invención y los medicamentos que contienen uno o varios de las mismas se pueden utilizar en el tratamiento y/o prevención de dicha enfermedad, trastornos y condiciones de enfermedad. Por consiguiente, tales enfermedades y/o trastornos y/o condiciones de enfermedad incluyen, pero no se limitan a, diabetes tipo 1, la diabetes tipo 2 (incluyendo diabetes gestacional) complicaciones de la diabetes, condiciones diabéticas y/o secuelas de la diabetes mellitus y la hiperglucagonemia y el Síndrome de Alstrom debido a otras causas, por lo que las complicaciones resultantes se seleccionan del grupo que comprende aterosclerosis, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad del pie diabético, retinopatía diabética, la retinopatía diabética proliferativa, edema macular diabético, vitreorretinopatía diabética, vitreorretinopatía diabética proliferativa, nefropatía diabética, neuropatía diabética , diabetes mellitus gestacional, intolerancia a la glucosa, enfermedad del corazón, presión alta, colesterol alto, la tolerancia a la glucosa disminuida, la impotencia, la resistencia a la insulina, insuficiencia renal, síndrome metabólico, enfermedad del hígado graso no alcohólico, esteatohepatitis no alcohólica· con o sin fibrosis, enfermedad vascular periférica, sensibilidad a la glucosa reducida, sensibilidad a la insulina reducida, la obesidad, esteatosis hepática, la hiperglucemia, la cetoacidosis diabética, y el coma no cetósico hiperosmolar hipoglucémico, pérdida de peso por eritema necrolitico migratorio (NME), la anemia, la trombosis venosa en el presente de la función de coagulación normal, manifestaciones neuropsiquiátricas (depresión, demencia, insomnio, ataxia).
Por supuesto, porque la molécula de ácido nucleico que une glucagón de acuerdo con la presente invención interactúa con o se une a glucagón y/o GIP, un experto en la téenica generalmente entenderá que la molécula de ácido nucleico que une glucagón de acuerdo con la presente invención se puede utilizar fácilmente para la el tratamiento, la prevención y/o el diagnóstico de cualquier enfermedad como se describe en el presente documento de humanos y animales. En relación con la misma, es preciso reconocer que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se puede utilizar para el tratamiento y prevención de cualquiera de las enfermedades, trastorno o condición descrita en el presente documento, independientemente del modo de acción que subyace a tal enfermedad, trastorno y condición.
En la siguiente la racional para el uso de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención con relación a las diversas enfermedades, trastornos y condiciones se proporciona, así presentando la aplicabilidad terapéutica, preventiva y de diagnóstico reivindicada de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención plausible. Con el fin de evitar toda repetición innecesaria, hay que reconocer que, debido a la participación de glucagón/el eje del receptor de glucagón y/o de GIP/eje del receptor de GIP como se indica en relación con el mismo dicho eje puede ser dirigido por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención de tal manera que se consigue el efecto terapéutico, preventivo y de diagnóstico reivindicado. Además, debe reconocerse que las particularidades de las enfermedades, trastornos y condiciones, de los pacientes y cualquier detalle del régimen del tratamiento se describe con relación en la misma, podrán ser objeto de las modalidades preferidas de la presente solicitud.
En la mayoría de los pacientes diabéticos se ha reportado un aumento paradójico de los niveles circulantes de glucagón después de una comida mixta o la ingestión de carbohidratos (Ohneda, Watanabe et al.1978) Esto es visto como un importante contribuyente al aumento de los niveles de glucosa en la sangre postprandial que desempeñan un papel importante en la patofisiología de las complicaciones micro y macrovasculares en DM (Gin y Rigalleau 2000).
Se ha reportado una abundancia de antagonistas de los receptores de glucagón de molécula pequeña peptidilica y no peptidilica (Jiang y Zhang 2003). Algunos de estos antagonistas de molécula pequeña, que generalmente tienen afinidades más bajas para el receptor de glucagón, se ha demostrado que reduce la glucosa en la sangre en ayunas o para bloquear la elevación de glucagón estimulada exógena de glucosa en la sangre en modelos animales. Un antagonista del receptor de glucagón de molécula pequeña no peptidilica se mostró para bloquear la elevación inducida por glucagón de la producción de glucosa hepática y la glucosa en la sangre en humanos en una manera dependiente de la dosis (Petersen y Sullivan 2001). Más recientemente, la reducción de la expresión del receptor de glucagón en ratones db/db por oligonucleótidos antisentido dio lugar a reducciones de la glucosa en la sangre, ácidos grasos libres y triglicéridos sin el desarrollo de hipoglucemia (Liang, Osborne et al. 2004). Estos efectos serian ideales para los pacientes con DM2.
Más allá de eso, los ratones knockout receptores de glucagón se encontró que eran viables y dió señales de sólo una hipoglucemia leve, la tolerancia a la glucosa mejorada y los niveles de glucagón elevados. También son resistentes a la obesidad inducidg por la dieta (Conarello, Jiang et al. 2007), y tienen una mayor sensibilidad a la insulina, que puede ser beneficioso en la preservación de la b-célula (Sorensen, Winzell et al.2006). Por otra parte, los ratones knockout receptores de glucagón eran resistentes a la estreptozotocin que induce "fenotipo de diabetes tipo 1", es decir, que mostraron la normoglucemia en ayunas y después en las pruebas de tolerancia a la glucosa oral e intraperitoneal (Lee, Wang et al.2011) La neutralización de glucagón en si por los anticuerpos monoclonales también condujo a una reducción aguda y sostenida de la glucosa en sangre, triglicéridos, HbAlc, y la producción de glucosa hepática (Brand, Rolin et al. 1994; Sorense, Brand et al.2006). Sin embargo, debido a su potencial de inmunogenicidad, estos y otros anticuerpos pueden no ser una opción viable para el tratamiento a largo plazo de la DM.
Esencialmente, los intentos de intervención terapéutica a través de la reducción de los niveles/actividad de glucagón han cosechado una gran cantidad de resultados que apoyan el concepto de antagonismo glucagón. Sin embargo, estos intentos tienen o conducen a los compuestos no tienen suficiente potencia o de compuestos con toxicidad hepática inaceptable.
La diabetes mellitus tipo 1 (DM1) se caracteriza por una deficiencia de insulina que está en contraste con la DM2 no una deficiencia funcional debido a la resistencia a la insulina, pero una deficiencia absoluta debido a la pérdida de la b-célula pancreática. La DM1 se refiere a menudo como la Diabetes juvenil, ya que se desarrolla sobre todo en niños y adultos jóvenes. En un estudio recientemente publicado los ratones knockout receptores de glucagón fueron resistentes a la estreptozotocina que induce el "fenotipo de la diabetes tipo 1 ", es decir, que mostraron la normoglucemia en ayunas y después de las pruebas de tolerancia a la glucosa oral e intraperitoneal (Lee, Wang et al.2001).
En los pacientes con DM1 la falta de la supresión postpandrial dependiente de la insulina de glucagón deteriora la tolerancia a la glucosa. Una complicación potencialmente mortal aguda de DM y una consecuencia directa del desequilibrio de insulina de glucagón es la cetoacidosis diabética (en forma abreviada DKA), después de una producción excesiva de cuerpos cetónicos y de complicaciones diabéticas, como el coma no cetósico hiperosmolar hiperglucémico (en forma abreviada HHNK). En HHNK los efectos osmóticos de glucosuria resultan en insuficiencia renal la reabsorción de NaCl y agua conduce a la hipernatremia (Wahid, Naveed et al. 2007). El DKA y HHNK también se pueden observar en los casos dependientes de la insulina de la DM2.
Los tumores neuroendocrinos son tumores poco frecuentes que pueden llevar a la sobreexpresión de la hormona respectiva que generalmente se produce por las células que se originan de ahi. Por lo tanto la hiperglucagonemia es causada por la hiperplasia o neoplasia de las células productoras de glucagón (glucagonoma), por ejemplo, neoplasias derivadas de a-células. Del mismo modo una neoplasia de células de Langerhans intestinales, en los que la glicentina, oxintomodulina y GLP-1 se produce a partir de la transcripción de genes glucagón, que puede conducir a la sobreexpresión de estos péptidos o la sobreexpresión de glucagón si el procesamiento es sesgada.
La hiperglucagonemia puede llevar a complicaciones, como la Diabetes mellitus, cetoacidosis y pérdida de peso por eritema migratorio necrolitico (en forma abreviada NME), la anemia, la trombosis venosa en la presencia de la función de coagulación normal, manifestaciones neuropsiquiátricas (depresión, la demencia, el insomnio, ataxia) y otros síntomas (Griffing, Odeke et al.2011) El GIP no sólo induce la liberación de insulina como su nombre sugiere, pero también puede desempeñar un papel en la homeostasis de los lípidos y puede ser necesario para el desarrollo de la obesidad como se muestra por varios estudios en animales (Asmar 2011): La administración diaria del antagonista del receptor de GIP Pro3-GIP durante 50 días produjo una reducción del peso corporal, disminución de la acumulación de tejido adiposo, y marcó mejoras notables en los niveles de glucosa, hemoglobina glicosilada y de insulina pancreática en ratones de edad avanzada diabéticos alimentados con un alto contenido de grasa, junto con la reducción de los niveles de triglicéridos en el músculo y el hígado. No se observó ningún cambio en la ingesta de dieta rica en grasas (McClean, Irwin et al.2007). Apuntando en la misma dirección, se encontró que los ratones knockout receptores de GIP se entrontraron resistentes al desarrollo de la obesidad, mientras que los ratones de tipo salvaje alimentados con la misma dieta alta en grasas exhibió tanto hipersecreción de GIP y la extrema acumulación de grasa visceral y subcutánea con resistencia a la insulina (Miyawaki, Yamada et al.2002). Sin embargo, la respuesta temprana de insulina después de una carga oral de glucosa se vio afectada, lo que conduce a niveles de glucosa en la sangre más altos (Miyawaki, Yamada et al.1999).
En una modalidad adicional, el medicamento comprende un agente farmacéuticamente activo adicional. Tal compuesto farmacéuticamente activo adicional es, entre otros, pero no limitada a la misma, un compuesto para el tratamiento y/o prevención de la diabetes, preferiblemente DM2, y de complicaciones diabéticas, por lo que el compuesto se selecciona del grupo que comprende, fármacos sulfonilureas, biguanidas, inhibidores de alfa-glucosidasa, tiazolidinedionas, inhibidores de DPP4, meglitinidas, análogos de péptidos similares al glucagón, análogos de péptido inhibidores gástricos, análogos de amilina, , miméticos de incretina, la insulina y otros terapéuticos utilizados en el tratamiento de la resistencia a la insulina y/o la DM2 o utilizados en la prevención de la resistencia a la insulina y/o la DM2, y similares. Se entenderá por el experto en la téenica que, dadas las diversas indicaciones que se pueden dirigir de acuerdo con la presente invención por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, dicho agente farmacéuticamente activo adicional puede ser cualquiera que en principio es adecuado para el tratamiento y/o prevención de tales enfermedades. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, particularmente si se presenta o se utiliza como un medicamento, se combina preferiblemente con fármacos sulfonilureas, biguanidas, inhibidores de la alfa-glucosidasa, tiazolidinediuna, meglitinidas, análogos de péptidos similares al glucagón, análogos de péptido inhibidor gástrico, análogos de amilina, miméticos de incretina, inhibidores de DPP4, la insulina y otros terapéuticos utilizados en el tratamiento de la DM1, la resistencia a la insulina y/o la DM2 o utilizado en la prevención de la resistencia a la insulina y/o la DM2, y similares.
Está dentro de la presente invención que el medicamento se utiliza alternativamente o adicionalmente, en principio, para la prevención de cualquiera de las enfermedades descritas con relación en el uso del medicamento para el tratamiento de dichas enfermedades. Los marcadores respectivos, por lo tanto, es decir, para las enfermedades respectivas son conocidos por los expertos en la téenica. Preferiblemente, el marcador respectivo es hiperglucagonemia. Alternativamente y/o adicionalmente, el marcador respectivo se selecciona entre el grupo que comprende oxintomodulina, glicentina, y GIP (para una molécula de ácido nucleico que une GIP). Todavía un grupo adicional de marcadores se selecciona del grupo que comprende una sed fuerte, un alto volumen de bebida, orinar frecuentemente, una sensación de hambre extrema, el valor de HbAlc, nivel de insulina en plasma, nivel de glucosa en plasma después de OGT, un nivel de glucosa en plasma de la alimentación en ayunas, un nivel de glucosa en plasma en ayunas, nivel de glucosa en la orina, el peso corporal, la presión sanguínea, lasitud, cansancio, pérdida de peso en ausencia de una dieta, aumento de peso, infecciones bacterianas o micóticas frecuentes, mala cicatrización de las heridas, entumecimiento en las manos y los pies y visión afectada.
En una modalidad del medicamento de la presente invención, dicho medicamento es para uso en combinación con otros tratamientos para cualquiera de las enfermedades descritas en este documento, particularmente para aquellos los que el medicamento de la presente invención es para ser utilizado.
"Terapia de combinación" (o "coterapia") incluye la administración de un medicamento de la invención y al menos un segundo o más agentes como parte de un régimen de tratamiento especifico destinado a proporcionar por lo menos el efecto beneficioso de la acción conjunta de estos agentes terapéuticos, es decir, el medicamento de la presente invención y dicho segundo o más agentes. El efecto beneficioso de la combinación incluye, pero no se limita a, la co-reacción de farmacocinética o farmacodinámica resultante de la combinación de los agentes terapéuticamente eficaces. La administración de estos agentes terapéuticamente eficaces en combinación se lleva a cabo normalmente durante un periodo de tiempo definido (normalmente minutos, horas, dias o semanas dependiendo de la combinación seleccionada).
La "Terapia de combinación" puede ser, pero generalmente no es, con la intención de abarcar la administración de dos o más de estos agentes terapéuticamente eficaces como parte de regímenes de monoterapia separados. La "Terapia de combinación" tiene la intención de abarcar la administración de estos agentes terapéuticamente eficaces de una manera secuencial, eso es, en el que cada agente terapéuticamente efectivo se administra en un momento diferente, así como la administración de estos agentes terapéuticamente eficaces, o al menos dos de los agentes terapéuticamente eficaces, en una manera sustancialmente simultánea. La administración sustancialmente simultánea se puede lograr, por ejemplo, mediante la administración a un sujeto una única cápsula que tiene una indice fijo de cada uno de los agentes terapéuticamente efectivos o en múltiples cápsulas individuales, para cada uno de los agentes terapéuticamente eficaces.
La administración secuencial o sustancialmente simultánea de cada agente terapéuticamente eficaz puede efectuarse por cualquier vía apropiada incluyendo, pero no limitado a, vías tópicas, vías orales, vías intravenosas, vías intramusculares y absorción directa a través de tejidos de las membranas mucosas. Los agentes terapéuticos pueden administrarse por la misma vía o por vías diferentes. Por ejemplo, un primer agente terapéuticamente efectivo de la combinación seleccionada se puede administrar mediante inyección, mientras que el otro agente terapéuticamente efectivo de la combinación se puede administrar por vía tópica.
Alternativamente, por ejemplo, todos los agentes terapéuticamente eficaces se pueden administrar por vía tópica o todos los agentes terapéuticamente eficaces pueden ser administrados por inyección. La secuencia en la que se administran los agentes terapéuticamente eficaces no es estrechamente critica a menos que se indique lo contrario. La "Terapia de combinación" también puede abarcar la administración de los agentes terapéuticamente eficaces como se describió anteriormente en una combinación adicional con otros ingredientes biológicamente activos. Cuando la terapia de combinación comprende además un tratamiento no farmacológico, el tratamiento no farmacológico puede realizarse en cualquier momento adecuado, siempre y cuando un efecto beneficioso de la acción conjunta de la combinación de los agentes terapéuticamente eficaces y tratamiento no farmacológico se consigua. Por ejemplo, en los casos apropiados, el efecto beneficioso se consigue aún cuando el tratamiento no farmacológico se retira temporalmente de la administración de los agentes terapéuticamente eficaces, tal vez por dias o incluso semanas.
Como se indica en términos generales anteriores, el medicamento de acuerdo con la presente invención se puede administrar, en principio, en cualquier forma conocida para los expertos en la téenica. Una vía de administración preferida es la administración sistémica, más preferiblemente por administración parenteral, preferiblemente por inyección.
Alternativamente, el medicamento se puede administrarse localmente. Otras vías de administración comprenden intramuscular, intraperitoneal, y subcutánea, por orum, intranasal, intratraqueal o pulmonar con preferencia dada a la vía de administración que sea la menos invasiva, mientras se garantice la eficacia.
La administración parenteral se utiliza generalmente para la administración subcutánea, intramuscular o inyecciones e infusiones intravenosas. Además, un enfoque para la administración parenteral utiliza la implantación de sistemas de liberación lenta o sistemas de liberación sostenida, que asegura que se mantiene un nivel constante de dosificación, que son bien conocidos para el experto en la téenica.
Además, los medicamentos preferidos de la presente invención se pueden administrar en forma intranasal mediante el uso tópico de portadores intranasales adecuados, inhalantes, o por medio de vías transdérmicas, usando las formas de parches cutáneos transdérmicos bien conocidos por los expertos en la técnica. Para ser administrada en la forma de un sistema de suministro transdérmico, la administración de la dosificación será, por supuesto, continua en lugar de intermitente durante todo el régimen de dosificación. Otras preparaciones tópicas preferidas incluyen cremas, ungüentos, lociones, aerosoles y geles.
Los sujetos que respondan favorablemente al método, la molécula de ácido nucleico, composición farmacéutica y el medicamento de la invención incluyen sujetos médicos y veterinarios en general, que incluyen los seres humanos y los pacientes humanos. Entre otros, tales sujetos seleccionados preferiblemente del grupo que comprende gatos, perros, animales grandes, aves tales como pollos, y similares.
El medicamento de la presente invención generalmente comprenderá una cantidad eficaz del componente activo de la terapia, incluyendo, pero no limitado a, una molécula de ácido nucleico de la presente invención, disuelta o dispersa en un medio farmacéuticamente aceptable. Los medios o portadores farmacéuticamente aceptables incluyen cualquier y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardantes de la absorción e isotónicos y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la téenica. Los ingredientes activos suplementarios también se pueden incorporar en el medicamento de la presente invención.
En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con una composición farmacéutica. Tal composición farmacéutica que comprende al menos una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y preferiblemente un excipiente farmacéuticamente aceptable. Tal aglutinante puede ser cualquier excipiente utilizado y/o conocido en la téenica. Más particularmente, tal excipiente es cualquier excipiente como se expone en relación con la fabricación del medicamento descrito en el presente documento. En una modalidad adicional, la composición farmacéutica comprende un agente farmacéuticamente activo adicional.
La preparación de un medicamento y una composición farmacéutica de la invención serán conocidos por los expertos en la técnica teniendo en cuanta la presente divulgación. Normalmente, tal composición se puede preparar como un inyectable, ya sea como una solución o suspensión líquida; una forma sólida adecuada para la solución en, o suspensión en, líquido antes de la inyección; como una tableta o cualquier otra sólida para la administración oral; en forma de cápsulas de acción prolongada; o en cualquier otra forma usada actualmente, incluyendo gotas para los ojos, una crema, una loción, un ungüento, un inhalante y similares. El uso de una fórmula estéril, tal como un lavado a base de solución salina, por cirujanos, médicos o trabajadores de la salud para el tratamiento de un área en particular en el campo de operación puede también ser particularmente útil. Las composiciones también pueden administrarse mediante microdispositivos, microparticulas o una esponja.
Tras la fórmula, un medicamento se puede administrar en una forma compatible con la fórmula de dosificación, y en tal cantidad que es farmacológicamente eficaz. Las fórmulas se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero las cápsulas de liberación de fármaco y similares también se pueden emplear.
El medicamento de la invención también se puede administrar en formas de dosificación oral como la liberación gradual tabletas de liberación sostenida o cápsulas, pildoras, polvos, gránulos, elixires, tinturas, suspensiones, jarabes y emulsiones. Los supositorios se preparan ventajosamente a partir de emulsiones o suspensiones grasas.
La composición farmacéutica o medicamento pueden esterilizarse y/o contener adyuvantes, tales como agentes conservantes, estabilizantes, humectantes o emulsionantes, promotores de la solución, sales para regular la presión osmótica y/o tampones. Además, también pueden contener otras sustancias terapéuticamente valiosas. Las composiciones se preparan de acuerdo con téenicas convencionales, incluyendo mezclado, granulación, o procedimientos de recubrimiento, y típicamente contienen alrededor de 0.1% a 75%, preferiblemente de aproximadamente 1% a 50%, del ingrediente activo.
Las composiciones líquidas, especialmente inyectables pueden, por ejemplo, prepararse por disolución, dispersión, etc El compuesto activo se disuelve en o se mezcla con un disolvente farmacéuticamente puro tal como, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerol, etanol, y similares, para formar así la solución o suspensión inyectable. Adicionalmente, las formas sólidas adecuadas para la disolución en un líquido antes de la inyección se pueden formular.
Los medicamentos y la molécula de ácido nucleico, respectivamente, de la presente invención también se pueden administrar en forma de sistemas de suministro de liposomas tales como pequeñas vesículas unilamelares, grandes vesículas unilamelares y vesículas multilamelares. Los liposomas pueden formarse a partir de una variedad de fosfolípidos, que contienen colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas. En algunas modalidades, una película de componentes lipidíeos se hidrata con una solución acuosa de fármaco para formar una capa de lípidos que encapsula el fármaco, que es bien conocido para el experto en la téenica. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico de la invención divulgado en el presente documento se puede proporcionar como un complejo con un compuesto lipófilico o compuesto no inmunogénico, un compuesto de alto peso molecular construido usando métodos conocidos en la técnica. Además, los liposomas pueden llevar una molécula de ácido nucleico de la invención en su superficie para ortientar y llevar a agentes citotóxicos internamente para mediar en la muerte celular. Un ejemplo de los complejos asociados con ácido nucleico se proporciona en la Patente de EE.UU. No.6,011,020.
Los medicamentos y la molécula de ácido nucleico, respectivamente, de la presente invención también pueden acoplarse con polímeros solubles como portadores de fármacos dirigibles. Tales polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, copolímero del pirano polihidroxipropil-metacrilamida-fenol, polihidroxietilaspanamidefenol, o polietilenoxidopolilisina sustituido con residuos de palmitoyl. Además, los medicamentos y la molécula de ácido nucleico, respectivamente, de la presente invención pueden acoplarse a una clase de polímeros biodegradables útiles para conseguir la liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, ácido poliláctico, poliepsilon capro lactona, ácido butírico polihidroxi, poliortoésteres, poliacetales , polidihidropiranos, policianoacrilatos y enlace cruzado o copolímeros de bloques antipáticos de hidrogeles.
Si se desea, la composición farmacéutica y medicamento, respectivamente, de la invención que se va administrar también pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH, y otras sustancias tales como, por ejemplo, acetato de sodio, y oleato de trietanolamina.
El régimen de dosificación que utilizan las moléculas de ácido nucleico y medicamentos, respectivamente, de la presente invención se selecciona de acuerdo con una variedad de factores incluyendo el tipo, especie, edad, peso, sexo y estado médico del paciente; la gravedad de la afección a tratar; la vía de administración; la función renal y hepática del paciente; y el ácido nucleico particular de la invención o sal del mismo empleado. Un médico o veterinario experto puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad eficaz del fármaco requerida para prevenir, contrarrestar o detener el progreso de la afección.
Los niveles plasmáticos eficaces del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención preferiblemente un rango de 500 fM a 200 mM, más preferiblemente de 1 nM a 20 mM, más preferiblemente de 5 nM a 20 mM, más preferiblemente 50 nM a 20 mM en el tratamiento de cualquiera de las enfermedades divulgadas en el presente documento.
La molécula de ácido nucleico y el medicamento, respectivamente, de la presente invención se pueden administrar preferiblemente en una dosis diaria única, cada segundo o tercer día, semanalmente, cada segunda semana, en una dosis única mensual o cada tercer mes.
Está dentro de la presente invención que el medicamento como se describe en el presente documento constituye la composición farmacéutica divulgada en el presente documento.
En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con un método para el tratamiento de un sujeto que se encuentra en necesidad de dicho tratamiento, mediante el cual el método comprende la administración de una cantidad farmacéuticamente activa de al menos una especie de la molécula de ácido nucleico de la presente invención. En una modalidad, el sujeto sufre de una enfermedad o está en riesgo de desarrollar tal enfermedad, en donde la enfermedad es cualquiera de las descritas en el presente documento, particularmente cualquiera de las enfermedades descritas con relación en el uso de cualquiera de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención para la fabricación de un medicamento.
Es de entenderse que el ácido nucleico, así como los antagonistas de acuerdo con la presente invención se pueden usar no sólo como un medicamento o para la fabricación de un medicamento, sino también para fines cosméticos, en particular con respecto a la implicación de glucagón en lesiones de la piel regionales inflamadas.
Tal como se utiliza en el presente documento preferiblemente un diagnóstico o un agente de diagnóstico o medios de diagnóstico con todos los tres términos siendo utilizados de forma intercambiable si no se indica lo contrario es adecuado para detectar, ya sea directa o indirectamente, glucagón, preferentemente glucagón como se describe en el presente documento y más preferiblemente glucagón como se describe en el presente documento en relación con los diversos trastornos y enfermedades descritas en el presente documento. El diagnóstico es adecuado para la detección y/o seguimiento de cualquiera de los trastornos y enfermedades, respectivamente, que se describen en el presente documento. Tal detección es posible a través de la unión de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención al glucagón. Tal unión puede ser directa o indirectamente detectada.
Los respectivos métodos y medios son conocidos por los expertos en la materia. Entre otros, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede comprender una etiqueta que permite la detección de la molécula de ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, preferiblemente el ácido nucleico unido al glucagón. Tal marcador se selecciona preferiblemente del grupo que comprende marcadores radiactivos, enzimáticos y fluorescentes. En principio, todos los ensayos conocidos desarrollados para los anticuerpos pueden ser adoptados para la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención mientras que el anticuerpo de unión a objetivo está sustituido con un ácido nucleico de unión a objetivo. En ensayos de anticuerpos utilizando anticuerpos unión al objetivo sin marcar la detección se hace preferiblemente mediante un anticuerpo secundario que está modificado con marcadores radiactivos, enzimáticos y fluorescentes y se unen al anticuerpo de unión al objetivo en su Fc-fragmento. En el caso de una molécula de ácido nucleico, preferiblemente una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, la molécula de ácido nucleico es modificada con una etiqueta de este tipo, lo que preferiblemente dicha etiqueta se selecciona de entre el grupo que comprende biotina, Cy-3 y Cy- 5, y dicha etiqueta se detecta por un anticuerpo dirigido contra dicha etiqueta, por ejemplo, un anticuerpo anti-biotina, un anticuerpo anti-Cy3 o un anticuerpo anti-Cy5, o - en el caso de que la etiqueta es biotina - la etiqueta se detecta por la estreptavidina o avidina que se une naturalmente a la biotina. Tal anticuerpo, estreptavidina o avidina a su vez es modificado preferiblemente con una etiqueta respectiva, por ejemplo, un marcador radiactivo, enzimático o fluorescente (como un anticuerpo secundario).
En una modalidad adicional se detecta la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención o analizada por un segundo medio de detección, en el que dichos medios de detección es una baliza molecular. La metodología de la baliza molecular es conocida por las personas expertas en la téenica y revisados por Mairal et al. (Mairal et al., 2008).
Será reconocido que la detección de glucagón usando una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención será particularmente permitir la detección de glucagón como se define en el presente documento.
En relación con la detección de glucagón un método preferido comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar una muestra que se va a probar para la presencia de glucagón, (b) proporcionar una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, (c) hacer reaccionar la muestra con la molécula de ácido nucleico, preferiblemente en un recipiente de reacción mediante el cual la etapa (a) puede llevarse a cabo antes de la etapa (b), o la etapa (b) puede ser preformada antes de la etapa (a).
En una modalidad preferida se proporciona un paso adicional d), el cual consiste en la detección de la reacción de la muestra con la molécula de ácido nucleico. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico de la etapa b) se inmoviliza a una superficie. La superficie puede ser la superficie de un recipiente de reacción tal como un tubo de reacción, un pocilio de una placa, o la superficie de un dispositivo contenido en dicho recipiente de reacción tal como, por ejemplo, una perla. La inmovilización de la molécula de ácido nucleico a la superficie se puede hacer por cualquier medio conocido por los expertos en la téenica, incluyendo, pero no limitado a, enlaces covalentes o no covalentes. Preferiblemente, el enlace se establece a través de un enlace químico covalente entre la superficie y la molécula de ácido nucleico. Sin embargo, también está dentro de la presente invención que la molécula de ácido nucleico se inmoviliza indirectamente a una superficie, por lo que tal inmovilización indirecta implica el uso de un componente adicional o un par de parejas de interacción. Tal componente adicional es preferiblemente un compuesto que interactúa específicamente con la molécula de ácido nucleico que se ha inmovilizado que también se conoce como pareja de interacción, y por lo tanto media la unión de la molécula de ácido nucleico a la superficie. La pareja de interacción se selecciona preferiblemente del grupo que comprende ácidos nucleicos, polipéptidos, proteínas y anticuerpos. Preferiblemente, la pareja de interacción es un anticuerpo, más preferiblemente un anticuerpo monoclonal. Alternativamente, la pareja de interacción es una molécula de ácido nucleico, preferiblemente una molécula de ácido nucleico funcional. Más preferiblemente tal molécula de ácido nucleico funcional se selecciona del grupo que comprende un aptámero, un Spiegelmer, y la molécula de ácido nucleico que es al menos parcialmente complementaria a la molécula de ácido nucleico. En una modalidad alternativa adicional, la unión de la molécula de ácido nucleico a la superficie está mediada por una pareja de interacción multipartita. Tal pareja de interacción multipartita es preferiblemente un par de pareja de interacción o una pareja de interacción que consiste en un primer miembro y un segundo miembro, por lo que el primer miembro está compuesto por, o unido a la molécula de ácido nucleico y el segundo miembro está unido a o integrado por la superficie. La pareja de interacción multipartita se selecciona preferiblemente del grupo de pares de parejas de interacción que comprenden biotina y avidina, biotina y estreptavidina, y biotina y neutravidina. Preferiblemente, el primer miembro del par de parejas de interacción es la biotina.
Un resultado preferido de tal método es la formación de un complejo inmovilizado de glucagón y la molécula de ácido nucleico, por lo que más preferiblemente se detecta dicho complejo. Está dentro de una modalidad que desde el complejo de glucagón es detectado.
Una detección respectiva significa que está en el cumplimiento de este requisito es, por ejemplo, cualquier medio de detección que es especifico para esa/esas parte(s) del glucagón. Una detección particularmente preferida significa es un medio de detección que se selecciona entre el grupo que comprende una molécula de ácido nucleico, un polipéptido, una proteina y un anticuerpo, la generación que es conocida por los expertos en la téenica.
El método para la detección de glucagón comprende también que la muestra se retira del recipiente de reacción que se ha utilizado preferentemente para llevar a cabo la etapa c).
El método comprende en una modalidad adicional también la etapa de inmovilizar una pareja de interacción de glucagón en una superficie, preferentemente una superficie como se define anteriormente, por lo que la pareja de interacción se define como en el presente documento y preferiblemente como anteriormente en conexión con el método respectivo y más preferiblemente comprende una molécula de ácido nucleico, un polipéptido, una proteina y un anticuerpo en sus diversas modalidades. En esta modalidad, un medio de detección particularmente preferido es una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, mediante el cual tales moléculas de ácido nucleico preferiblemente pueden estar marcadas o no marcadas. En tal caso la molécula de ácido nucleico está marcada puede ser detectada directa o indirectamente. Dicha detección también puede implicar el uso de un segundo medio de detección que es, preferiblemente, también seleccionado de entre el grupo que comprende una molécula de ácido nucleico, un polipéptido y una proteina descrita en el presente documento. Tales medios de detección son preferiblemente específicos para la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. En una modalidad más preferida, el segundo medio de detección es una baliza molecular. O bien la molécula de ácido nucleico o el segundo medio de detección o ambos pueden comprender en una modalidad preferida de una etiqueta de detección. La etiqueta de detección se selecciona preferiblemente del grupo que comprende biotina, una etiqueta de bromo-desoxiuridina, una etiqueta digoxigenina, una etiqueta de fluorescencia, una etiqueta UV, una etiqueta de radio, y una molécula de quelante. Alternativamente, el segundo medio de detección interactúa con la etiqueta de detección que está contenida preferiblemente por, compuesta por, o unida al ácido nucleico. Las combinaciones particularmente preferidas son las siguientes: La etiqueta de detección es biotina y el segundo medio de detección es un anticuerpo dirigido contra la biotina, o en donde la etiqueta de detección es biotina y el segundo medio de detección es un avidina o una molécula que transporta avidina, o en donde la etiqueta de detección es biotina y el segundo medio de detección es una estreptavidina o una molécula que transporta estretavidina, o en donde la etiqueta de detección es biotina y el segundo medio de detección es una neutravidina o una molécula que transporta neutravidina, o en donde el marcador de detección es un bromodesoxiuridina y el segundo medio de detección es un anticuerpo dirigido contra la bromodesoxiuridina, o en donde la etiqueta de detección es un digoxigenina y el segundo medio de detección es un anticuerpo dirigido contra la digoxigenina, o en donde la etiqueta de detección es un quelante y el segundo medio de detección es un radionúclido, por lo que se prefiere que dicho marcador de detección se una a la molécula de ácido nucleico. Es preciso reconocer que este tipo de combinación es también aplicable a la modalidad en la que la molécula de ácido nucleico está unida a la superficie. En tal modalidad, se prefiere que el marcador de detección se una a la pareja de interacción.
Finalmente, también está dentro de la presente invención que el segundo medio de detección se detecta usando significa un tercer medio de detección, preferentemente el tercer medio de detección es una enzima, más preferentemente mostrando una reacción enzimática después de la detección del segundo medio de detección, o el tercer medio de detección es un medio para detectar la radiación, más preferiblemente radiación emitida por un radionúclido. Preferiblemente, el tercer medio de detección está detectando y/o interactuando específicamente con el segundo medios de detección.
También en la modalidad con un pareja de interacción de glucagón siendo inmovilizada sobre una superficie y la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se añade preferiblemente al complejo formado entre la pareja de interacción y el glucagón, la muestra se puede retirar de la reacción, más preferiblemente desde el recipiente de reacción donde el paso c) y/o d) son preformadas.
En una modalidad, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención comprende una fracción de fluorescencia y por el cual la fluorescencia de la fracción de la fluorescencia es diferente a la formación del complejo entre la molécula de ácido nucleico y el glucagón y glucagón libre.
En una modalidad adicional, la molécula de ácido nucleico es un derivado de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, mediante el cual el derivado de la molécula de ácido nucleico comprende al menos un derivado fluorescente de adenosina sustituyendo adenosina. En una modalidad preferida, el derivado fluorescente de adenosina es etenoadenosina.
En una modalidad adicional el complejo que consta de la derivada de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención y el glucagón se detecta usando fluorescencia.
En una modalidad del método se crea una señal en la etapa (c) o la etapa (d) y, preferentemente, la señal se correlaciona con la concentración de glucagón en la muestra.
En una modalidad preferida, los ensayos pueden realizarse en placas de 96 pocilios, donde los componentes se inmovilizan en los recipientes de reacción como se describe anteriormente y los pocilios actúan como recipientes de reacción.
La molécula de ácido nucleico de la invención puede utilizarse además como material de aprtida para el descubrimiento de fármacos. Básicamente, hay dos enfoques posibles. Un enfoque es el cribado de bibliotecas de compuestos mientras tales bibliotecas de compuestos son preferiblemente bibliotecas de compuestos de peso molecular bajo. En una modalidad de la misma, el cribado es un cribado de alto rendimiento. Preferiblemente, el cribado de alto rendimiento es, la evaluación del ensayo-y-error rápida, eficaz de compuestos en un ensayo basado en un objetivo. En el mejor caso, el análisis se realizó mediante una medición colorimétrica. Las bibliotecas tal como se utiliza en relación con los mismos son conocidas por los expertos en la téenica.
En el caso del cribado de bibliotecas de compuestos, tales como mediante el uso de un ensayo competitivo que son conocidos por los expertos en la técnica, se pueden encontrar análogos de glucagón, agonistas de glucagón o antagonistas de glucagón adecuados.
Tales ensayos competitivos se pueden establecer de la siguiente manera. Una molécula de ácido nucleico de la invención, preferiblemente un Spiegelmer, es decir, un ácido L-nucleico de la invención, está acoplado a una fase sólida. Con el fin de identificar los análogos de glucagón marcados se puede añadir al ensayo glucagón. Un análogo de potencial podría competir con las moléculas de unión de glucagón a la molécula de ácido nucleico de la invención el cual puede ir junto con una disminución en la señal obtenida por el marcador respectivo. El cribado de los agonistas o antagonistas puede implicar el uso de un ensayo de cultivo celular como se conoce por los expertos en la técnica.
El equipo de acuerdo con la presente invención puede comprender al menos una o varias de las especies de la molécula de ácido nucleico de la invención, preferiblemente para la detección de un glucagón, más preferiblemente para la detección de glucagón. Además, el equipo puede comprender al menos uno o varios controles positivos o negativos. Un control positivo puede ser, por ejemplo, glucagón, particularmente el que contra el cual se selecciona la molécula de ácido nucleico de la invención o al que se une, preferiblemente, en forma liquida. Un control negativo puede, por ejemplo, ser un péptido que se define en términos de propiedades biofísicas similares a glucagón, pero que no es reconocido por la molécula de ácido nucleico de la invención. Además, dicho equipo puede comprender uno o varios tampones. Los diversos ingredientes pueden estar contenidos en el equipo en forma seca o liofilizada o disueltos en un líquido. El equipo puede comprender uno o varios contenedores que a su vez pueden contener uno o varios ingredientes del equipo. En una modalidad adicional, el equipo comprende una instrucción o folleto de instrucciones que proporciona al usuario información sobre cómo utilizar el equipo y sus diversos ingredientes.
La determinación farmacéutica y bioanalitica del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es importante para la evaluación de su perfil farmacocinético y biodinámico en varios humores, tejidos y órganos del cuerpo humano y no humano. Para tal propósito, cualquiera de los métodos de detección descritos en este documento o conocidos por una persona experta en la téenica puede ser utilizado. En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un ensayo de hibridación intercalado para la detección de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Dentro del ensayo de detección se utilizan una sonda de captura y una sonda de detección. La sonda de captura es complementaria a la primera parte y la sonda de detección a la segunda parte de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. La sonda de captura se inmoviliza a una superficie o matriz. La sonda de detección lleva preferiblemente una molécula marcadora o la etiqueta que puede ser detectada como se describe anteriormente en el presente documento.
La detección de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede llevarse a cabo de la siguiente manera: La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención hibridiza con uno de sus extremos a la sonda de captura y con el otro extremo a la sonda de detección. Después, la sonda de detección no unida se elimina mediante, por ejemplo, uno o varios pasos de lavado. La cantidad de sondas de detección unidas las cuales llevan preferiblemente una etiqueta o molécula marcadora se puede medir posteriormente como, por ejemplo, se describe en más detalle en WO/2008/052774 que se incorpora en el presente documento por referencia.
Como preferiblemente se utiliza en el presente documento, el término tratamiento comprende en una modalidad preferida adicional o alternativamente, la prevención y/o el seguimiento.
Como preferiblemente se utiliza en el presente documento, los términos enfermedad y trastorno se utilizan de manera intercambiable, si no se indica lo contrario.
Como se usa en el presente documento, el término comprende preferentemente no tiene la intención para limitar la materia seguida o descrita por dicho término. Sin embargo, en una modalidad alternativa el término comprende será entendido en el sentido de que contiene y por lo tanto como limitativos de la materia seguida o descrito por dicho término.
Las diversas SEQ ID NOs:, la naturaleza química de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, la secuencia real del mismo y el número de referencia interna se resume en la siguíente tabla.
Tabla1 - - - - - - - - - - - - - - · - - - - - - - - - - - - - - - - - - | | | [ La presente invención se ilustra adicionalmente mediante las figuras, los ejemplos y la lista de secuencias en las que podrán adoptarse nuevas características, modalidades y ventajas, en donde La Figura 1 muestra un alineamiento de secuencias de moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de "tipo A"; Las Figuras 2A-B muestran los derivados de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 257-E1-001, una molécula de ácido nucleico que une glucagón de "tipo A"; Las Figuras 3A-C muestran los derivados de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 257-E1-6XR-001, una molécula de ácido nucleico que une glucagón de "tipo A"; La Figura 4 muestra un alineamiento de secuencias de moléculas de ácido nucleico que une glucagón de la invención de "tipo B"; La Figura 5 muestra derivados de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-001, una molécula de ácido nucleico que une glucagón de "tipo B"; Las Figuras 6A-C muestran los derivados de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-002, una molécula de ácido nucleico que une glucagón de "tipo B"; La Figura 7 muestra un alineamiento de secuencias de las moléculas de ácido nucleico que une glucagón de la invención de "tipo C"; La Figura 8 muestra una alineación de secuencias de la molécula de ácido nucleico adicional que une glucagón de la invención de "tipo C"; La Figura 9 muestra los resultados de ensayos pull-down competitivos de Spiegelmers 257-E1-001 y sus derivados 257-E1-R15 (también referidos como 257-E1-R15-001), 257-E1-R29 (también conocida como 257-E1-R29-001), y 257-El-6xR-001 a glucagón biotinilado, mediante el cual Spiegelmer 257-E1-001 o 257-El-6xR-001 fue marcado (L molécula de referencia1^ y la unión de la molécula de referencia al glucagón biotinilado en 37°C se compitió con 0.032 - 5000 nM no marcado de Spiegelmers; La Figura 10 muestra la evaluación cinética mediante la medición Biacore de la unión de glucagón Spiegelmers 259-H6-002-R13, 259-H6-002-R24 y 259-H6-002-R36 contra Spiegelmer 259-H6-002 a un glucagón humano biotinilado inmovilizado, mediante el cual se muestran los datos para la inyección 500 nM de Spiegelmers; La Figura 11 muestra la evaluación cinética mediante la medición de Biacore de la unión de glucagón Spiegelmer NOX-G13 para inmovilizar el glucagón humano biotinilado, por el que los datos para 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.3, 15.6, 7.8, 3.9, y 1.95-0 nM de Spiegelmer N0X-G13 se muestran; La Figura 12 muestra la evaluación cinética mediante la medición Biacore de la unión de glucagón Spiegelmers 259-H6-002-R13, 259-H6-002-R24, 259-H6-002-R36, 259-H6-002-R13-R24, 259-H6-002-R13-R36, 259-H6-002-R24-R36 y 259-H6-002-R13-R24-R36 contra Spiegelmer 259-H6-002 para inmovilizar el glucagón humano biotinilado, por el que se muestran los datos para la inyección 500 nM de Spiegelmers; La Figura 13 muestra la evaluación cinética mediante la medición Biacore de la unión de glucagón Spiegelmer NOX-G14 para inmovilizar el glucagón humano biotinilado, con el que los datos para 125, 62.5, 31.3, 15.6, 7.8, 3,9, 1.95 y 0 nM de Spiegelmer NOX-G14 se muestran; La Figura 14 muestra la evaluación cinética mediante la medición Biacore de la unión de glucagón Spiegelmer N0X-G15 para inmovilizar el glucagón humano biotinilado, por el que se muestran los datos para 125, 62.5, 31.3, 15.6, 7.8, 3.9, 1.95 y 0 nM de Spiegelmer N0X-G15; La Figura 15 muestra la evaluación cinética mediante la medición Biacore de la unión de glucagón Spiegelmer N0X-G16 para inmovilizar el gl-ucagón humano biotinilado, por el que se muestran los datos para 125, 62.5, 31.3, 15.6, 7.8, 3.9, 1.95 y 0 nM de Spiegelmer N0X-G16; La Figura 16 muestra la inhibición de la producción inducida por glucagón-de cAMP por Spiegelmer 259-H6-002 y sus derivados 259-H6-002-R13 y 259 - H6-002-R13-R24-R36 (también conocida como 259-H6-002-R13/24/36), por el que a) las cantidades generadas de cAMP por pocilio se normalizaron al valor más grande de cada conjunto de datos y representadas como actividad por ciento contra la concentración Spiegelmer; La Figura 17 muestra la inhibición de la producción inducida por glucagón de cAMP por Spiegelmers NOX- G15 y NOX-G16, en el que a) las cantidades generadas de cAMP por pocilio se normalizaron al valor más grande de cada conjunto de datos y representados como la actividad por ciento contra la concentración Spiegelmer, b) las concentraciones Spiegelmer en el que la producción de cAMP se inhibe en un 50% (CI50) se calcularon mediante regresión no lineal (ajuste de cuatro parámetros) con el software de Prism5, c) los valores de IC50 para NOX-G15 (5 experimentos independientes) y NOX-G16 (3 experimentos independientes) determinadas fueron 3.44 nM y 2.43 nM, respectivamente; La Figura.18 muestra la inhibición de la producción inducida por el GIP de cAMP por Spiegelmers 259-H6-002, 259-H6-002-R13-PEG (también denominado NOX-G13) y 257-El-OOl, por el que a) las cantidades generadas de cAMP por pocilio se normalizaron al valor más grande de los datos de cada conjunto de datos y representado como la actividad por ciento frente a la concentración de Spiegelmer, b) las concentraciones Spiegelmer en el que la producción de cAMP se inhibe en un 50% (IC50) se calcularon usando la regresión no lineal (ajuste de cuatro parámetros) con el software de Prism5, y c) Spiegelmers 259-H6-002 y 259-H6-002-R13-PEG mostraron una inhibición dependiente de dosis de la generación de cAMP inducida por GIP y Spiegelmer 257-El-OOl no mostró actividad inhibidora contra GIP; La Figura.19 muestra los datos de ensayos competitivos de selectividad Biacore con Spiegelmers NOX-G13, NOX-G14, NOX-G15 y NOX-G16 y el competidor péptidos glucagón, polipéptido insulotrópico dependiente de glucagón (en forma abreviada GIP), péptido-1 semejante al glucagón (en forma abreviada GLP-1) (7-37), péptido-2 semejante al glucagón (en forma abreviada GLP-2) (1-33), oxintomodulina (en forma abreviada OXM y el péptido intestinal Vasoactivo (en forma abreviada VIP); los medios de control "no péptido competidor"; los datos se normalizaron con el control (100%); La Figura.20A-B muestran los datos sobre a la unión de Spiegelmers 257-El-6xR-001, 257-El-7xR-037, 257-El-6xR- 030-5'-PEG (también referido como NOX-G15), 257-El-7xR-037- 5'-PEG (también referido como N0X-G16), 259-H6-002-RL3-5'-PEG (también referido como N0X-G13) y 259-H6-014-R12/23/35-5'-PEG (también referido como NOX-G14) a glucagón, GIP, el GLP-1, OXM, y VIP, asi como la competencia de GIP, el GLP-1, OXM, y VIP con dicho efecto de Spiegelmers sobre el glucagón que induce la generación de cAMP in vitro, ; La Figura 21 muestra las secuencias de aminoácidos de glicentina, polipéptido relacionado con glicentina (nombre corto=GRPP), Oxintomodulina (nombre cortó=OXY, nombre corto=OXM), glucagón, péptido 1 semejante al glucagón 1 (nombre corto=GLP-l), péptido 1 similar a glucagón (7-37) (nombre corto = GLP-1 (7-37)), péptido similar al glucagón 1 (7-36) (nombre corto = GLP-1 (7-36)) y péptido 2 similar al glucagón (nombre corto = GLP-2); La Figura 22 muestra las secuencias de aminoácidos de glucagón de las diferentes especies; La Figura.23A-B muestran los resultados de una prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal en un modelo de ratón con Diabetes mellitus tipo 1 con: La Figura 23A indica la glucosa en la sangre conforme avanza el tiempo (media y SEM); y La Figura 23B, que indica el Área bajo la curva (AUC) de determinación; los datos fueron analizados utilizando One Way ANOVA y Tukey posttest; los niveles de significantes en comparación con el grupo de portadores: *significa p <00.5, **significa p <0.01; La Figura 24A-B muestran la prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal en el modelo de ratón de la Diabetes mellitus tipo 2: (A): indica la glucosa en sangre conforme avanza el tiempo; y (B): El Área de indicación bajo la curva (AUC) de determinación; los datos fueron analizados utilizando One Way ANOVA y Tukey posttest; los niveles significantes en comparación con el grupo de portadores: * p<0.05, **p<0.01; Las Figuras.25A-B muestra derivados de molécula de ácido nucleico que une glucagón de NOX-Gllstabi, una molécula de ácido nucleico que une glucagón de la invención de "tipo C"; La Figura 26 muestra la evaluación cinética mediante la medición Biacore de la unión de glucagón Spiegelmers N0X-Gllstabi2, NOX-G11-D07, N0X-G11-D16, N0X-G11-D19, NOX-G11-D21 y NOX-G11-D22 para inmovilizar el glucagón humano biotinilado; La Figura 27 muestra la prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal en el modelo de ratón de la Diabetes mellitus tipo 1, (A): en el día 1 después de una sola dosis de NOX-G16; (B) en el día 5 después de cinco dosis (qld) de NOX-G16 y (C) en el día 7 después de siete dosis (qld) de NOX-G16: Panel superior: la glucosa en sangre conforme el paso del tiempo (media y SEM); Panel inferior: Área bajo la curva (AUC) de determinación; los datos fueron analizados utilizando One Way ANOVA y Tukey posttest; los niveles significantes en comparación con el grupo de portadores: *p<00.5; La Figura 28 muestra los niveles plasmáticos FGF-21 en el día 9 después de nueve dosis de N0X-G16 (qld). Los datos fueron analizados utilizando One Way ANOVA y Tukey posttest; los niveles significantes en comparación con el grupo de portadores: *p<00.5, **p<0.01; La Figura 29 muestra los 2'desoxiribonucleótidos que las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención consisten en; y La Figura 30A-B muestra los ribonucleótidos que las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención consisten en.
Ejemplo 1: Las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón Varias moléculas de ácido nucleico que une glucagón y derivados de los mismos se identificaron: las secuencias de nucleótidos de las cuales están representadas en las Figuras 1 a 8. Las moléculas de ácido nucleico que une glucagón fueron caracterizadas como a) aptámeros, es decir, como moléculas de ácido D-nucleico utilizando un ensayo directo pull-down (Ejemplo 3) y/o un ensayo comparativo de competencia pull-down (Ejemplo 3); b) spiegelmers, es decir ácido L-nucleico usando un ensayo comparativo de competencia pull-down (Ejemplo 3), mediante la medición de resonancia plasmódica de superficie (Ejemplo 4), y por un ensayo in vitro con el receptor de glucagón humano (Ejemplo 5). Por otra parte los spiegelmers se probaron in vivo (Ejemplo 8).
Los spiegelmers y aptámeros se sintetizaron como se describe en el Ejemplo 2.
Las moléculas de ácido nucleico, por consiguiente generaron exhibieron secuencias ligeramente diferentes, con el que tres tipos principales se identificaron y se definieron como moléculas de unión de ácido nucleico que une glucagón: molécula de ácido nucleico que une glucagón de Tipo A (Figuras 1 a 3), moléculas de ácido nucleico que une glucagón Tipo B (las figuras 4 a 6) y las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de Tipo C (Figuras 7 y 8).
Para la definición de 2'-desoxinucleótidos motivos de secuencia, se utilizan las abreviaturas de la IUPAC para los nucleótidos ambiguos: S fuerte G o C; W débil A o T; R purina G o A; Y pirimidina C o T; K ceto G o T; M imino A o C; B no A C o T o G; D no C A oG oT; H no G A oC oT; V no T A oC oG; N todo A o G o C o T Si no se indica lo contrario, cualquier secuencia de ácido nucleico o secuencia de tramos, respectivamente, se indica en la dirección 3'->5'. 1.1 Las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de Tipo A Como se representa en las Figura 1 a la Figura 3 las oléculas de ácido nucleico que unen glucagón de Tipo A comprenden un tramo central de nucleótidos que definen un motivo potencial de unión de glucagón.
En general, las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de Tipo A glucagón comprenden en el extremo 5' y los tramos terminales 3' de nucleótidos: el primer tramo terminal de nucleótidos y el segundo tramo terminal de nucleótidos. El primer tramo terminal de nucleótidos y el segundo tramo terminal de nucleótidos pueden hibridizar entre sí, por lo que tras la hibridación se forma una estructura de doble cadena. Sin embargo, dicha hibridación no necesariamente se da en la molécula.
Los tres tramos de nucleótidos de las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de Tipo A - un primer tramo terminal de nucleótidos, un tramo central de nucleótidos y un segundo tramo terminal de nucleótidos - están dispuestos en la dirección 5'—>31 de la siguiente manera: el primer tramo terminal de nucleótidos - el tramo central de nucleótidos -el segundo tramo terminal de nucleótidos. Alternativamente, sin embargo, el primer tramo terminal de nucleótidos, el tramo central de nucleótidos y el segundo tramo terminal de nucleótidos están dispuestos el uno al otro en la dirección 5'->3' de la siguiente manera: el segundo tramo terminal de nucleótidos - el tramo central de nucleótidos - el primer tramo terminal de nucleótidos.
Las secuencias de los tramos definidos pueden ser diferentes entre las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de Tipo A, que influye en la afinidad de unión al glucagón. Basado en el análisis de las diferentes moléculas de ácido nucleico que une glucagón de Tipo A el tramo central de nucleótidos y sus secuencias de nucleótidos como se describe en el siguiente son individualmente y más preferiblemente en su totalidad esencial para la unión al glucagón humano.
Las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón Tipo A de acuerdo con la presente invención se muestran en las Figuras.1 a 3. Todos ellos se probaron como aptámeros y/o spiegelmers para su capacidad para unirse a glucagón. La primera molécula de ácido nucleico que une glucagón de tipo A que fue caracterizada por su afinidad de unión al glucagón fue la molécula de ácido nucleico 257-E1-001, que consiste en 2'-desoxirribonucleótidos. El equilibrio de unión constante KD de la molécula de ácido nucleico 257-E 1-001 se determinó como un aptámero y como spiegelmer por ensayos directos de Union pulí- down (Kp _ aptámero 137 nM, KQ _ spiegelmer 179 nM Fig . 1 ) .
Las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón 257-A1-001, 257-D4-001, 257-F4-001, 257-B3-001, 257-D3-001, 257-E4-001, 257-C4-001, 257-C1-001 y 257-H2-001 - todos ellos consiste en 2'-desoxirribonucleótidos - se probaron como aptámeros en ensayos pull-down de competencia comparativa frente al ácido nucleico que une glucagón 257-E 1-001. Las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón 257-E4-001 mostró una afinidad de unión similar a la 257-E1-001. Las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón 257-A1-001, 257-F4-001, 257-C1-001 y 257-H2-001 mostraron afinidad de unión más débil en comparación con la molécula de ácido nucleico que une glucagón 257-E1-001. Las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón 257-D4-001, 257-B3-001, 257-D3-001 y 257-C4-001 mostraron una afinidad de unión mucho más débil en comparación con la molécula de ácido nucleico que unen glucagón 257-E1-001 (Figura.1).
Los derivados 257-E1-002, 257-E1-003, 257-E1-004 y 257-E1-005 de molécula de ácido nucleico que une glucagón 257- El-001 comprenden un primero y un segundo tramo terminal de nucleótidos de cada uno con seis, cinco o cuatro nucleótidos mediante el cual la molécula de ácido nucleico que une glucagón 257-E1-001 comprende un primer y segundo tramo terminal de cada uno de los nucleótidos con siete nucleótidos, respectivamente. Los derivados 257-E1-002, 257- El-003, 257-E1-004 y 257-E1-005 de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 257-E1-001 mostraron una afinidad de unión reducida en un ensayo pull-down de competencia comparativo en comparación con la molécula de ácido nucleico que unen glucagón 257-E 1-001 (Fig.2A). En consecuencia, el truncamiento del primer y el segundo tramo terminal de los nucleótidos de la molécula de áciso nucleico que une glucagón 257-E1-001 llevado a la reducción de la afinidad de unión al glucagón.
Las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón 257-A1-001, 257-D4-001, 257-F4-001, 257-B3-001, 257-D3-001, 257-E4-001, 257-C4-001, 257-C1 -001, 257-H2-001, 257-E1-001 y sus derivados 257-E1-002, 257-E1-003, 257-E1-004 y 257-E1-005 comparten la secuencia 5' BGAAATGGGAGGGCTAKGYGGAAGGAATCTRRR 3' [SEQ ID NO: 192] para el tramo central de nucleótidos, mediante el cual G, A, T, C, B, Y, K, y R son 2'-desoxirribonucleótidos, en donde a) en una modalidad preferida, el tramo central de nucleótidos comprende la secuencia 5' TGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 193], en donde G, A, T y C son 2'-desoxirribonucleótidos; b) en una modalidad preferida, el tramo central de nucleótidos comprende la secuencia 5' TGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAA 3' [SEQ ID NO: 194], en donde G, A, T y C son 21-desoxirribonucleótidos; c) en una modalidad preferida, el tramo central de nucleótidos comprende la secuencia 5' CGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 195], en donde G, A, T y C son 2'-desoxirribonucleótidos; d) en una modalidad preferida, el tramo central de nucleótidos comprende la secuencia 5' GGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 196], en donde G, A, T y C son 2'-desoxirribonucleótidos.
Las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón 257-E4-001 y 257-E1-001 mostró la mejor afinidad de unión al glucagón y comprenden las siguientes secuencias para el tramo central de: a) 257-E4-001: 5' CGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 195] b) 257-E1-001 y sus derivados: 5 1GGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 196], en donde G, A, T, C son 2'-desoxirribonucleótidos.
Los inventores mostraron sorprendentemente en un ensayo pull-down spiegelmer de competencia comparativa que la afinidad de unión de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 257-El-001 se mejoró mediante la sustitución de 2'-desoxirribonucleótidos por ribonucleótidos dentro de la secuencia del tramo central de nucleótidos. Los 2'-desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos se muestran en la Figura 29 y 30A-B, en donde el Ejemplo 1.1 y en las figuras correspondientes se utilizaron las siguientes abreviaturas: G es 2'desoxi-guanosina (5'monofosfato), C es 2'desoxi-citidina (5' monofosfato), A es 2 'desoxi-adenosina (5' monofosfato), T es 2'desoxi-timidina (5 'monofosfato), rG es guanosina (5' monofosfato), rT es timidina (5’monofosfato) y rA es de adenosina (5' monofosfato). En particular la sustitución de hasta siete 2'-desoxirribonucleótidos por ribonucleótidos en la molécula de ácido nucleico que une glucagón 257-E1-001 dio lugar a la mejora de la afinidad de unión al glucagón por un factor de hasta más de cuarenta años. En más detalle, los inventores han encontrado sorprendentemente que a) la sustitución de un 2'-desoxirribonucleótido por un ribonucleótido en la posición 2, 8, 11, 12, 22 ó 23 en el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 257-E1-001 resultó en la mejora de la afinidad de unión al glucagón biotinilado en comparación con la afinidad de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 257-E1-001 (véase la Figura2B y 9; spiegelmers 257-E1-R09-001, 257-El-Rl5-001, 257-E1-R18-001, 257-E1-R19-001, 257-E1-R29-001, 257-E1-R30-001); b) la sustitución de dos 2'-desoxirribonucleótidos por dos ribonucleótidos en las posiciones 8 y 22 ó 22 y 23 en el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 257-E1-001 dio lugar a la mejora de la afinidad de unión al glucagón biotinilado en comparación con la afinidad de unión de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 257-E1-001 (véase la Figura 2B; spiegelmer 257-E1-R15/29-001, 257-E1-R29/30-001); c) la sustitución de tres 2'-desoxirribonucleótidos por tres ribonucleótidos en las posiciones 8, 22 y 23 ó 11, 22 y 23 en el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 257-E 1-001 dió lugar a la mejora de la afinidad de unión al glucagón biotinilado en comparación con la afinidad de unión de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 257-E1-001 (ver Figura 2B; spiegelmer 257-E1-R15/29/30-001, 257-E1-R18/29/30-001); d) la sustitución de cuatro 2'-desoxirribonucleótidos por cuatro ribonucleótidos en las posiciones 8, 11, 22 y 23 en el tramo central de nucleótidos de glucagón de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 257-E1-001 dió lugar a la mejora de la afinidad de unión al glucagón biotinilado en comparación con la afinidad de unión a la molécula de ácido nucleico que une glucagón 257-E1-001 (ver la Figura 2B; Spiegelmer 257-E1-R15/18/29/30-001); e) la sustitución de seis 2'-desoxirribonucleótidos por seis ribonucleótidos en las posiciones 2, 8, 11, 12, 22 y 23 en el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 257-E1-001 resultó en la mejora de la afinidad de unión al glucagón biotinilado en comparación con la afinidad de unión de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 257-E1-001 (véanse las Figuras 2B y 9; Spiegelmer 257-El-6xR-001); y f) la sustitución de siete 2'- desoxirribonucleótidos por siete ribonucleótidos en las b posiciones 2, 8, 11, 12, 19, 22 y 23 en el tramo central de nucleótidos de glucagón de la molécula de ácido nucleico que une a glucagón 257-E1-001 resultó en una afinidad mejorada de unión al glucagón biotinilado en comparación con la afinidad de unión de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 0 257-E1-001 (ver la Figura 3C; spiegelmers 257-El-7xR-023 y 257-El-7xR-037).
Basado sobre los datos mostrados que reemplazan 2'- desoxirribonucleótidos por ribonucleótidos en varias 5 posiciones del tramo central de nucleótidos de moléculas de ácido nucleico que une glucagón de Tipo A llevó a la mejora de la unión a glucagón, el tramo central de todas las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón probadas de Tipo A se pueden resumir en la siguiente fórmula genérica 0 5' BniAAATGn2GAn3n4GCTAKGX5GGn6n7GGAATCTRRR 3' [ SEQ ID NO: 173 ] , en donde ni es G o rG, n2 es G o rG, n3 es G o rG, n4 es G o rG, n5 es Y o rT, n6 es A o rA, n7 es A o rA, y en donde G, A, T, C, B, K, Y y R son 2'-desoxiribonucleótidos, y rG, rA y rT son ribonucleótidos.
Las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón 257-A1-001, 257-F4-001, 257-E4-001, 257-C1-001, 257-H2-001, 257-E1-001 y los derivados de la 257-E1-001 que comprenden ribonucleótidos en lugar de 2 '-desoxirribonucleótidos en varias posiciones del tramo central de nucleótidos mostraron mejor afinidad de unión a glucagón que otras moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de Tipo A y compartir las siguientes secuencias para el tramo central: 5' BniAAATGn2GAn3n4GCTAGGn5GGn6n7GGAATCTGAR 3' [SEQ ID NO: 174], en dodne nies G o rG, n2 es G o rG, n3 es G o rG, n4 es G o rG, n5 es T o rT, he es A o rA, hh es A o rA, y en donde G, A, T, C, B, y R son 2 ' -desoxirribonucleótidos, y rG, rA y rT son ribonucleótidos, en donde a) a) en una modalidad preferida, el tramo central de nucleótidos comprende la secuencia 5' TniAAATGn2GAn3n4GCTAGGn5GGn6n7GGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 175], en donde nies G o rG, n2 es G o rG, n3 es G o rG, n4 es G o rG, n5 es T o rT, h¾ es A o rA, n7 es A o rA, y en donde G, A, T y C son 2'-desoxirribonucleótidos, y rG, rA y rT son ribonucleótidos; b) en una modalidad preferida, el tramo central de nucleótidos comprende la secuencia 5' TniAAATGn2GAn3n4GCTAGGn5GGnsn7GGAATCTGAA 3' [SEQ ID NO: 176], en donde nies G o rG, n2 es G o rG, n3 es G o rG, n4 es G o rG, n5 es T o rT, n6 es A o rA, n7 es A o rA, y en donde G, A, T y C son 2'-desoxirribonucleótidos, y rG, rA y rT son ribonucleótidos; c) en una modalidad preferida, el tramo central de nucleótidos comprende la secuencia 5' CniAAATGn2GAn3n4GCTAGGn5GGn6n7GGAATCTGAG 3'[SEQ ID NO: 177], en donde nies G o rG, n2 es G o rG, n3 es G o rG, n4 es G o rG, n5 es T o rT, Pb es A o rA, n7 es A o rA, y en donde G, A, T y C son 2'-desoxirribonucleótidos, y rG, rA y rT son ribonucleótidos; d) en una modalidad preferida, el tramo central de nucleótidos comprende la secuencia 5' GniAAATGn2GAn3n4GCTAGGn5GGn6n7GGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 178], en donde nies G o rG, n2 es G o rG, n3 es G o rG, n4 es G o rG, n5 es T o rT, n¾ es A o rA, n7 es A o rA, y en donde G, A, T y C son 2'-desoxirribonucleótidos, y rG, rA y rT son ribonucleótidos; en donde en una modalidad más preferida, el tramo central de nucleótidos comprende la secuencia 5' GniAAATGn2GAn3n4GCTAGGn5GGn6n7GGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 178], en donde nies G o rG, n2 es G o rG, n3 es G o rG, P4 es G o rG, n5 es T o rT, n6 es A o rA, n7 es A o rA, y en donde G, A, T y C son 2'-desoxirribonucleótidos, y rG, rA y rT son ribonucleotides; o la secuencia 5^ CnA TGn2Gn3n4GCTGGn5GGngn7GG TCTGG 3^ [SEQ ID NO: 177], en donde nies G o rG, n2 es G o rG, n3 es G o rG, n4 es G o rG, n5 es T o rT, n6 es A o rA, n7 es A o rA, y en donde G, A, T y C son 2'-desoxirribonucleótidos, y rG, rA y rT son ribonucleótidos.
Las moléculas de ácido nulceico que unen glucagón 257-E1-R09-001, 257-E1-R15-001, 257-E1-R18-001, 257-El-R 19-001, 257-E1-R29-001, 257-E1- R30-001, 257-E1-R15/29-001, 257- E1-R29/30-001, 257-E1-R15/29/30, 257-E1-R18/29/30-001, 257- El- R15/18/29/30-001, 257-El-7xR-023, 257-E1-6XR-001 y derivados truncados de las mismas (257-E1-6XR-003...257-E1-6XR-020 y 257 - E1-6XR-029 257-E1-6XR-033; 257-E1-7XR-037, véase las Figuras 3A, 3B y 3C) mostraron la mejor afinidad de unión al glucagón y comprenden las siguientes secuencias para el tramo central de nucleótidos: a) 257-E1-R09-001: 5' GrGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 179], en donde G, A, T y C son 2'-desoxirribonucleótidos, y rG es un ribonucleótido; b) 257-E1-R15-001: 5' GGAAATGrGGAGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 180], en donde G, A, T y C son 2'-desoxirribonucleótidos, y rG es un ribonucleótido; c) 257-E1-R18-001: 5' GGAAATGGGArGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 181], en donde G, A, T y C son 2'-desoxirribonucleótidos, y rG es un ribonucleótido; d) 257-E1-R19-001: 5' GGAAATGGGAGrGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 182], en donde G, A, T y C son 21-desoxirribonucleótidos, y rG es un ribonucleótido; e) 257-E1-R29-001: 5' GGAAATGGGAGGGCTAGGTGGrAAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 183], en donde G, A, T y C son 2'-desoxirribonucleótidos, y Ra es un ribonucleótido; f) 257-E1-R30-001: 5' GGAAATGGGAGGGCTAGGTGGArAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 184], en donde G, A, T y C son 2'-desoxirribonucleótidos, y Ra es un ribonucleótido; g) 257-E1-R15/29-001: 5' GGAAATGrGGAGGGCTAGGTGGrAAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 185], en donde G, A, T y C son 2'-desoxirribonucleótidos y rG y rA son ribonucleótidos; h) 257-E1-R29/30-001: 5' GGAAATGGGAGGGCTAGGTGGrArAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 186], en donde G, A, T y C son 2 '-desoxirribonucleótidos, y Ra es un ribonucleótido; i) 257-E1-R15/29/30-001: 5' GGAAATGrGGAGGGCTAGGTGGrArAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 187], en donde G, A, T y C son 2 '-desoxirribonucleótidos y rG y rA son ribonucleótidos; j) 257-E1-R18/29/30-001: 5' GGAAATGGGArGGGCTAGGTGGrArAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 188], en donde Cces G, X2 es G, X3 es rG, X4 es G, X5 es T, rA, X7 es rA, y en donde G, A, T y C son 2'- desoxirribonucleótidos, y rG y rA son ribonucleótidos; k) 257-E1-R15/18/29/30-001: 5' GGAAATGrGGArGGGCTAGGTGGrArAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 189], en donde G, A, T y C son 2 '-desoxirribonucleótidos y rG y rA son ribonucleótidos; l) 257-E1-6XR-001: 5' GrGAAATGrGGArGrGGCTAGGTGGrArAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 190], en donde G, A, T y C son 2 '-desoxirribonucleótidos y rG y rA son ribonucleótidos; m) 257-El-7xR-023: 5' GrGAAATGrGGArGrGGCTAGGrTGGrArAGGAATCTGAG 3', en donde G, A, T y C son 2'-desoxirribonucleótidos y rG, RA y RT son ribonucleótidos.
Como se muestra arriba, el ácido nucleico que une el glucagón 257-E1-001 consiste de 21-desoxirribonucleótidos y deleción de los nucleótidos del primer y segundo tramo terminal de nucleótidos de 257-E1-001 lleva a la afinidad de unión reducida (véase la Figura 2A, 257-E1-002, 257-E1-003, 257-E1-004, 257-E1-004 y 257-E1-005).
Sorprendentemente, para el ácido nucleico que une glucagón 257-E1-6XR-001 que comprende un tramo central de nucleótidos con seis ribonucleótidos en lugar de 2'-desoxirribonucleótidos los inventores pudieron demostrar que el truncamiento del primer y el segundo tramo terminal de nucleótidos de siete nucleótidos (ver 257-E1-6XR-001, Figura, 3A) a seis nucleótidos (ver 257-El-6xR-008/-010/-011/-012/-013/-016/-018 /, Figuras 3A y 3B) y cinco nucleótidos (ver 257-EL-6xR-020, Figura 3C) no dio lugar a una reducción de la afinidad de unión. Los derivados del ácido nucleico que une glucagón 257-El-6xR-001 que comprende los tramos terminales se extiende con menos de cinco nucleótidos demostraron una reducción de la afinidad de unión al glucagón: 257-El-6xR-029 con un primer y un segundo tramo terminal de nucleótidos cada uno con cuatro nucleótidos; 257-E1-6XR-030 y 257-E1-6XR-031 con un primer y un segundo tramo terminal de nucleótidos cada uno con tres nucleótidos; 257-E1-6XR-032 con un primer y un segundo tramo terminal de nucleótidos cada uno con dos nucleótidos; y 257-E1-6XR-033 con un primer y un segundo tramo terminal cada uno de los nucleótidos con un nucleótido (ver la Figura 3C).
Con el fin de truncar la molécula de ácido nucleico que une glucagón 257-E1-6XR-010 mientras se mantiene la afinidad de unión al glucagón la 2'-desoxirribonucleótido en la posición 19 del tramo central de nucleótidos se ha sustituido por un ribonucleótido que conduce al ácido nucleico que une glucagón 257-E1-7XR-023. Ambas moléculas, la molécula de ácido nucleico que une glucagón 257-E1-6XR-010 y la molécula de ácido nucleico que une glucagón 257-E1-7XR-023 mostraron afinidades de unión similares al glucagón (Figuras 3A y 3C). Sorprendentemente, los inventores pudieron demostrar que una molécula que comprende el tramo central de los nucleótidos idénticos y un primero y un segundo tramo terminal de nucleótidos de cada uno con tres nucleótidos (ver molécula de ácido nucleico que une glucagón 257-E1-7XR-037), tiene casi la misma la afinidad de unión al glucagón como de una molécula de ácido nucleico que une glucagón 257-E1-7XR-023 con un primer y un segundo tramo terminal de seis nucleótidos, respectivamente (véase la Figura 3C).
El primer y el segundo tramo terminal de las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de tipo A comprende una (véase 257-E1-6XR-033), dos (ver 257-E1-6XR-032), tres (por ejemplo, 257-E1-6XR-030 ó 257-E1-7XR-037), cuatro (véase 257-E1-6XR-029), cinco (por ejemplo 257-E1-6XR-020), seis (por ejemplo, 257-E1-6XR-010) o siete (por ejemplo, 257-E1-RXR-001 ó 257-E1-E1-001) nucleótidos (Figura 1 a Figura 3), por lo que los tramos opcionalmente se hibridizan entre si, por lo que tras la hibridización se forma una estructura de doble cadena. Esta estructura de doble cadena puede constar de uno a siete pares de bases. Sin embargo, dicha hibridización no está necesariamente dada en la molécula.
La combinación de los primeros tramos terminales de nucleótidos y los segundos tramos terminales de nucleótidos de todas las moléculas probadas de ácido nucleico que unen glucagón de tipo A de la fórmula genérica para el primer tramo terminal de nucleótidos es 5' Z1Z2Z3Z4Z5Z 6V 3' y la fórmula genérica para el segundo tramo terminal de nucleótidos es 5' BZ7Z8Z9Z10Z11Z12 3', en donde Zi es G o ausente, Z2 es S o ausente, Z3 es V o ausente, Z4 es B o ausente, Z5 es B o ausente, Z6 es R o ausente, Z7 es B o ausente, Z8 es V o ausente, Z9 es V o ausente, Zi0 es B o ausente, Z es S o ausente, y Z12 es C o ausente, por el que en una primera modalidad preferida d)Zi es G, Z2 es S, Z3 es V, Z4 es B, Z5 es B, Z es V, Z7 es B, Z8 es V, Z9 es V, Z10 es B, Z es S, y Z es C, o e) Zx está ausente , Z2 es S, Z es V, Z4 es B, Z es B, Z6 es V, Z7 es B, Z8 es V, Z9 es V, Z10 es B, Zn es S , y Z es C, o f ) Z es G, Z2 es S, Z3 es V, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es V, Z7 es B, Z es V, Z9 es V, Z10 es B, Zn es S , y Z está ausente, y en una segunda modalidad preferida a) Z está ausente, Z2 es S , Z3 es V, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es V, Z7 es B, Z8 es V, Z es V, Z10 es B, Zn es S , y Z12 está ausente, o b)Zi está ausente, Z2 es S, Z3 es V, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es V, Z7 es B, Z8 es V, Z9 es C, Z10 es B, Z está ausente, y Z12 está ausente, o c)Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 es V, Z4 es B, Z es B, Z6 es V, Z7 es B, Z8 es V, Zg es C, Z10 es 3, Zn es S, y Z12 está ausente, y en una tercera modalidad preferida d) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 es V, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es V, Z7 es B, Z8 es V, Z9 es V, Z10 es i 3, Zn está ausente, y Z42 está ausente, o e) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 es V, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es V, Z7 es B, Z8 es V, Z9 es V, Z10 está ausente, Zu está ausente, y Z42 está ausente, o f) Zi es ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 es B, Z5 es B, Zs es V, Z7 es B, Z8 es V, Z9 es V, es B, Z está ausente, y Z42 está ausente, y En una cuarta modalidad preferida d)Z4 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es V, Z7 es B, Z8 es V, Z9 es V, Zc está ausente, Zu está ausente, y Zi2 está ausente, o e)Zc está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 es B, Z5 es B, å5 es V, Z7 es B Z8 es V, Z9 está ausente, Zco está ausente, Zn está ausente, y Zi2 está ausente, o f)Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 es B, Z6 es V, Z7 es B, Z8 es V, Z9 es V, Z10 está ausente, Z está ausente, y Z12 está ausente, y En una quinta modalidad preferida d) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 es B, Z¾ es V, Z7 es B, Z8 es V, Z9 está ausente, Z40 está ausente, Zn está ausente, y Z12 está ausente, o e) Z. está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 es B, Z¾ es V, Z7 es B, Z8 está ausente, Z9 está ausente, Zco está ausente, Zn está ausente, y Zi2 está ausente, o f)Zc está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, Zg es V, Z7 es B, Zg es V, Z9 está ausente, Zc0 está ausente, Zn está ausente, y Zi2 está ausente, y en la sexta modalidad preferida e)Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, Z¾ es V, Z7 es B, Z8 está ausente, Z9 está ausente, Z10 está ausente, Z está ausente, y Zi2 está ausente, f)Z está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, Z6 es V, Z7 está ausente, Z8 está ausente, Z9 está ausente, Z10 está ausente, Zn está ausente, y Z72 está ausente, g)Zc está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, está ausente, Z7 es B, Z8 está ausente, Z9 está ausente, Zi0 está ausente, Zn está ausente, y Z12 está ausente, h)Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, está ausente, Z7 está ausente, Z8 está ausente, Z9 está ausente, Z10 está ausente, Zn está ausente, y Zi2 está ausente La combinación de los primeros tramos terminales de nucleótidos y los segundos tramos terminales de nucleótidos de las moléculas de áciso nucleico que unen glucagón 257-A1-001, 257-D4-001, 257-F4-001, 257-B3-001, 257-D3-001, 257-E4-001, 257-C4-001, 257-C1-001, 257-H2-001, 257-E1-001, 257-El-R9-001, 257-E1-R15-001, 257-E1- R18-001, 257-E1-R19-001, 257-E1-R29-001, 257-E1-R30-001, 257-E1-R15/29-001, 257-E1-R29/30- 001 , 257-E1-R15/29/30-001 , 257-E1-R18/29/30-001 , 257-E1- R15/18/29/30-001 y 257-E1-6XR-001 la fórmula generica para el primer tramo terminal de nucleótidos es 5' Z1Z2Z3Z4Z5Z6V 3' y la fórmula genérica para el segundo tramo terminal de nucleótidos es 5' BZ7Z8 Z9ZIOZIIZI2 , en donde d) Z es G, Z2 es C, Z3 es R, Z4 es B, Z5 es Y, Z6 es R, Z7 es Y, Z8 es R, Z9 es V, Z 0 es Y, Z es G, y Z12 es C, o e) Z está ausente, Z2 es C, Z3 es R, Z4 es B, Z5 es Y, Z6 es R, Z7 es Y, Z8 es R, Z9 es V, Z40 es Y, Zn es G, y Z12 es C, o f) Z4 es G, Z2 es C, Z3 es R, Z4 es B, Z5 es Y, Z6 es R, Z7 es Y, Z8 es R, Z9 es V, Zw es Y, Zü es G, y Zi2 está ausente, en donde las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón con la mejor afinidad de unión al glucagón comprenden las siguientes combinaciones del primer tramo terminal y el segundo tramo terminal de nucleótidos: g) 257-D1-001: 5'GCACTGG3' (primer tramo terminal de nucleótidos) y 5'GCAGTGC3' (segundo tramo terminal de nucleótidos), o h) 257-F4-001: 5'GCACTGA3' (primer tramo terminal de nucleótidos) y 5'GCAGTGC3' (segundo tramo terminal de nucleótidos), o i) 257-E4-001: 5'GCAGTGG3' (primer tramo terminal de nucleótidos) 5'TCACTGC3' (segundo tramo terminal de nucleótidos), o j) 257-E 1-001: 5'GCAGTGG3' (primer tramo terminal de nucleótidos) 5'CTACTGC3' (segundo tramo terminal de nucleótidos), o k) 257-C 1-001: 5'GCGCTGG3' (primer tramo terminal de nucleótidos) 5'GCAGTGC3' (segundo tramo terminal de nucleótidos), o l) 257-H2-001: 5'GCGCCAG3' (primer tramo terminal de nucleótidos) 5'TCGGCGC3' (segundo tramo terminal de nucleótidos).
La combinación de los primeros tramos terminales de nucleótidos y los segundos tramos terminales de nucleótidos de moléculas de ácido nucleico que unen glucagón 257-E1-002, 257-E1-003, 257-E1-6XR-003, 257-E1-6XR-005, 257-E1-6XR-006, 257-E1-6XR-007, 257-E1-6XR-008, 257-E1-6XR-009, 257-E1-6XR-010, 257-E1-6XR-011, 257-E1-6XR-012, 257-E1-6XR-013, 257-E1- 6XR-014, 257-E1-6XR-015, 257-E1-6XR-016, 257-E1-6XR-017, 257-E1-6XR-018 y 257-E1-7XR-023 la fórmula genérica para el primer tramo de la terminal de nucleótidos es 5' Z1Z2Z3Z4Z5Z6G 3' y la fórmula genérica para el segundo tramo terminal de nucleótidos es 5' CZ7Z8Z9ZioZnZi2 3 en donde d)Zi está ausente, Z2 es S, Z3 es V, Z4 es G, Z5 es Y, Z6 es S, Z7 es B, Z8 es R, Z9 es C, Z10 es B, Z es S, y Z12 está ausente, o e)Zc está ausente, Z2 es S, Z3 es V, Z4 es G, Z5 es Y, Z6 es S, Z7 es B, Z8 es R, Z9 es C, Z30 es B, n está ausente, y Z12 está ausente, o f)Zc está ausente, Z2 está ausente, Z3 es V, Z4 es G, Z5 es Y, Z6 es S, Z7 es B, Z8 es R, Z9 es C, Z40 es B, Zn es S, y Z12 está ausente en donde las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón con la mejor afinidad de unión al glucagón comprenden las siguientes combinaciones del primer tramo terminal y el segundo tramo terminal de nucleótidos: h) 257-E1-6XR-008: 5'GCGCGG3' (primer tramo terminal de nucleótidos) y 5'CTGCGC3' (segundo tramo terminal de nucleótidos), o i) 257-E1-6XR-010: 5'GCGCGG3' (primer tramo terminal de nucleótidos) y 5'CCGCGC3' (segundo tramo terminal de nucleótidos), o j) 257-E1-6XR-011: 5'GGGCCG3' (primer tramo terminal del nucleótidos) y 5'CGGCCC3' (segundo tramo terminal de nucleótidos), o k) 257-E1-6XR-012: 5'GCGCCG3' (primer tramo terminal del nucleótidos) y 5'CGGCGC3' (segundo tramo terminal de nucleótidos), o l) 257-E1-6XR-013: 5'GAGCGG3' (primer tramo terminal del nucleótidos) y 5'CCGCTC3’ (segundo tramo terminal de nucleótidos), o m) 257-E1-6XR-016: 5'GCGTGG3' (primer tramo terminal del nucleótidos) y 5'CCACGC3' (segundo tramo terminal de nucleótidos), o n) 257-E1-6XR-018: 5'GCGTCG3' (primer tramo terminal de nucleótidos) y 5'CGACGC3' (segundo tramo terminal de nucleótidos).
La combinación de los primeros tramos terminales de nucleótidos y los segundos tramos terminales de nucleótidos de moléculas de ácido nulceico que une glucagón 257-E1-6XR-004, 257-E1-6XR-019 y 257-E1-6XR-020 la fórmula genérica para el primer tramo terminal de nucleótidos es 5 ' Z1Z2Z3Z4Z5Z6G3' y la fórmula genérica para el segundo tramo terminal de nucleótidos es de 5'CZvZaZgZioZuZ^S', en donde d) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 es V, Z4 es G, Z5 es Y, Z6 es G, Z7 es Y, Z8 es R, Z9 es C, Z10 es B, Zn está ausente, y Z42 está ausente, o e) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 es V, Z4 es G, Z5 es Y, Z6 es G, Z7 es Y, Z8 es R, Z9 es C, Z10 está ausente, Zn está ausente, y Zi2 está ausente, o f) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 es G, Z5 es Y, Z6 es G, Z7 es Y, Z8 es R, Z9 es C, Z10 es B, Z está ausente, y Z42 está ausente, en donde los ácidos nucleicos que unen glucagón con la mejor afinidad de unión al glucagón comprenden las siguientes combinaciones del primer tramo terminal y el segundo tramo terminal de nucleótidos: c) 257-E1-6XR-019: 5'GGCGG3' (primer tramo terminal de nucleótidos) y 5'CCGCC3' (segundo tramo terminal del nucleótidos), o d) 257-E1-6XR-020: 5'CGCGG3' (primer tramo terminal de nucleótidos) y 5'CCGCG3' (segundo tramo terminal de nucleótidos).
La combinación de los primeros tramos terminales de nucleótidos y los segundos tramos terminales de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 257-E1-6XR 029 y 257-E1-005 la fórmula genérica para el primer tramo terminal de nucleótidos es 5'Z1Z2Z3Z4Z5Z6G3' y la fórmula genérica para el segundo tramo terminal de nucleótidos es 5'CZ7Z89ZioZiiZi23', en donde d) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z 4 es G, S5 es Y, Z¾ es G, Z7 es Y, åg es R, å9 es C, Z10 esta ausente, Zn está ausente, y Z12 está ausente, o e) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 es G, Z5 es Y, Z6 es G, Z7 es Y, Z3 es R, Z9está ausente, Zco está ausente, Zn está ausente, y Zi2 está ausente, o f)Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 es Y, Zg es G, Z7 es Y, Zg es R, Z9 es C, Z10 está ausente, Zn está ausente, y Zi2 está ausente, en donde la molécula de ácido nucleico que une glucagón con la mejor afinidad de unión al glucagón comprende las siguientes combinaciones del primer tramo terminal y el segundo tramo terminal de nucleótidos: 257-El-6xR-029: 5'GCGG3' (primer tramo terminal del nucleótidos) y 5'CCGC3' (segundo tramo terminal de nucleótidos).
Combinando de los primeros tramos terminales de nucleótidos y los segundos tramos terminales de nucleótidos de las moléculas de ácido nucleico que une glucagón 257-E1-6xR-030, 257-El-6xR-031 y 257-El-7xR-037 de la fórmula genérica para el primer tramo terminal de nucleótidos es de 5'Z1Z2Z3Z4Z5Z6G3' y la fórmula genérica para el segundo tramo terminal de nucleótidos es 5'CZ7Z8Z9ZioZnZi23', en donde d) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 es S, Z6 es S, Z es S, Z3 es S, Z9 está ausente, Z10 está ausente, Zn está ausente, y Z42 está ausente, o e) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 es S, es S, Z7 es S Z8 está ausente, Z9 está ausente, Z10 está ausente, Zn está ausente, y Z42 está ausente, o f) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, es S, Z7 es S, Z3 es S, Z9 está ausente, Zc0 está ausente, Zn está ausente, y Z42 está ausente, en donde la molécula de ácido nucleico que une glucagón con la mejor afinidad de unión al glucagón comprenden las siguientes combinaciones del primer tramo terminal y el segundo tramo terminal de nucleótidos: 257-E1-6XR-030: 5'GCG3' (primer tramo terminal de nucleótidos) y 5'CGC3' (segundo tramo terminal de nucleótidos).
Combinando los primeros tramos terminales de los nucleótidos y los segundos tramos terminales de nucleótidos de glucagón de las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón 257-E1-6XR-032 y 257-E1-6XR-033 de la fórmula genérica para el primer tramo terminal de nucleótidos es 5'Z1Z2Z3Z4Z5Z6G3' y la fórmula genérica para el segundo tramo terminal de nucleótidos es 5'OZ7Z8Z9ZioiiZi23', en donde c)Zc está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, å6 es G, Z7 es C, Z8 está ausente, Z9 está ausente, Zio está ausente, Zn está ausente, y Zi2 está ausente (ver 257-El-6xR-032), o d)Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, Z¾ está ausente, Z7 está ausente, Z8 está ausente, Zg está ausente, Z10 está ausente, Zn está ausente, y Z12 está ausente (ver 257- El-6xR-033).
Con el fin de probar la funcionalidad de las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón 257-E1-6XR-001, 257-E1-6XR-030 y 257-E1-7XR-037 fueron sintetizadas como spiegelmers. Para la PEGilación de Spiegelmers 257-E1-6XR-030 y 257-E1-7XR-037 se sintetizaron con un grupo amino en su extremo 5'. Para los spiegelmers que modifica los amino 257-E1-6XR-030-5'amino [SEQ ID NO: 158] y 257-E1-7XR-037-5'amino [SEQ ID NO: 159] una fracción de PEG 40 kDa fue acoplado llevando a unos spiegelmers que unen glucagón 257-El-6xR-030-5'-PEG (también referido como NOX-G15) [SEC ID N n: 91] y 257-E1-7XR-037-5'-PEG (también denominado como NOX-G16) [SEQ ID NO: 92]. La síntesis y PEGilación de spiegeler se describe en el Ejemplo 2.
Los spiegelmers que unen glucagón 257-El-6xR-001, 257-El-7xR-037, N0X-G15 y NOX-G16 fueron capaces de inhibir/antagonizar in vitro la función de glucagón a su receptor con una IC50 de 2-3 nM (Figura 17: N0X-G15 y N0X-G16; Figura 20 A: 257-El-6xR-001, 257-El-7xR-0037, NOX-G15 y NOX-G16; para el protocolo del ensayo in vi tro véase el Ejemplo 5).
Como se muestra en el Ejemplo 8, el spiegelmer que une glucagón NOX-G15 fue efectivo en una prueba de tolerancia a la glucosa en un DM tipo 1 y DM tipo 2 en un experimento con animales (Figuras.23 y 24).
Además, como se muestra en el ejemplo 6 la selectividad de unión de los spiegelmer 257-El-6xR-001, 257- El-7xR-0037, N0X-G15 y N0X-G16 se determinó (Figuras 19 y 20). 1.2 las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de Tipo B Como se representa en las Figuras 4 a la Figura 6 las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón Tipo B comprenden un tramo central de nucleótidos que definen un motivo de unión del potencial de glucagón En general, las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de Tipo B comprenden en el extremo 5' y 3' los tramos terminales de nucleótidos: el primer tramo terminal de nucleótidos y el segundo tramo terminal de nucleótidos. El primer tramo terminal de nucleótidos y el segundo tramo terminal de nucleótidos pueden hibridizarse entre si, por lo que tras la hibridación se forma una estructura de doble cadena. Sin embargo, dicha hibridización no está necesariamente dada en la molécula.
Los tres tramos de nucleótidos de las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de Tipo B un primer tramo terminal de nucleótidos, un tramo central de nucleótidos y un segundo tramo terminal de nucleótidos están dispuestos en la dirección 5'->3' de la siguiente manera: el primer tramo terminal de nucleótidos - el tramo central de nucleótidos -el segundo tramo a terminal de nucleótidos. Alternativamente, sin embargo, el primer tramo terminal de nucleótidos, el tramo central de nucleótidos y el segundo tramo terminal de nucleótidos están dispuestos el uno al otro en la dirección 5'->3' de la siguiente manera: el segundo tramo terminal de nucleótidos, el tramo central de nucleótidos, el primer tramo terminal del nucleótidos.
Las secuencias de los tramos definidos pueden ser diferentes entre las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de Tipo B, que influye en la afinidad de unión al glucagón. Basado en el análisis de unión de las diferentes moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de tipo B el tramo central de nucleótidos y sus secuencias de nucleótidos como se describe más adelante son individuales y más preferiblemente en su totalidad esencial para la unión a un glucagón humano.
Las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de Tipo B de acuerdo con la presente invención se muestra en las Figuras 4 a 6. Todos ellos se probaron como aptámeros y/o spiegelmers para su capacidad para unirse glucagón. La primera molécula de ácido nucleico que une glucagón de tipo B que fue caracterizada por su afinidad de unión a la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-001 que consta de desoxirribonucleótidos.
El equilibrio de unión constante KD de la molécula de ácido nucleico 259-H6-001 se determinó como aptámero mediante ensayos de unión pull-down directo (KDaptámero= 33 nM, Figura 4) Las moléculas de ácido nucleico que unen glucanón 259-D5-001, 259-B7-001, 259-B8-001, 259 - A5-001, 259-C8-001, 259-E5-001, 259-E7-001 y 259-F5-001 también consiste en 2'-desoxirribonucleótidos - que fueron probados como aptámeros en ensayos pull-down de competencia comparativa contra un ácido nucleico que une glucagón 259-H6-001. La molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-C8-001 mostraron afinidad de unión similar a la 259-H6-001, por el que ambas moléculas comprenden un tramo central de 32 nucleótidos con la secuencia de 5'- AGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCA-'3 [SEQ ID NO: 212]. Las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón 259-D5-001 y 259-B7-001 tienen cambios menores en la secuencia del tramo central de nucleótidos y mostró afinidad de unión más débil en comparación con la unión molécula de ácido nucleico 259-H6-001. Además, las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón 259-B8-001, 259-A5-001, y 259-E5- 001 tiene cambios menores en la secuencia del tramo central de nucleótidos y mostró afinidad de unión mucho más débil en comparación con la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-001. Los ácidos nucleicos que unen glucagón 259-F5-001 y 259-E7-001 comprenden cada uno un tramo central de 29 nucleótidos que está relacionada con el tramo central de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-001 y mostraron una afinidad de unión débil y mucho más débil en comparación a la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-001 (Figura 4). Los tramos centrales de 259-F5-0015'-AGAAGGTTGGTAAGTTTCGGTTGGATCTG-'3) [SEQ ID NO: 198] y 259-E7- 001 (5'-AGAAGGTCGGTAAGTTTCGGTAGGATCTG-'3) [SEQ ID NO: 199] comprende dos subtramos que están relacionados con los subtramos en el tramo central de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-001 (primer subtramo: 5'- AAGGTTGGTA-'3 [SEQ ID NO: 213], segundo subtramo: 5'- AGGTTCGGTTGGAT- '3 [SEQ ID NO : 214 ] ) : 259-F5-001 : primer subtramo: 5'-AAGGTTGGTA-'3 [SEQ ID NO: 213], segundo subtramo: 5'-AGTTTCGGTTGGAT-'3 [SEQ ID NO: 215];259-E7-001: primer subtramo: 5'- AAGGTCGGTA-'3 [SEQ ID NO: 216], segundo subtramo: 5'-AGTTTCGGTAGGAT-'3 [SEQ ID NO: 217].
Los derivados 259-H6-002, 259-H6-005, 259-H6-003 y 259-H6-004 de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-001 consisten en 2 '-desoxirribonucleótidos y comprenden los primeros y segundos tramos terminales de nucleótidos con siete, seis, cinco o tres nucleótidos, por el que la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-001 comprende un primer y segundo tramo terminal de nucleótidos de cada uno con nueve nucleótidos. Los derivados 259-H6-002 y 259-H6-005 de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-001 mostraron una afinidad de unión similar en un ensayo pull-dow de competencia comparativo como la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-001. Los derivados 259-H6-003 y 259-H6-004 de la molécula de ácido nucleico que une glucagón la 259-H6-001 demostraron una reducción de la afinidad de unión en un ensayo pull-down de competencia comparativa comparado con la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-001 (Figura 5). En consecuencia, la deleción de más de tres nucleótidos del primer y del segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-001 lleva a la reducción de la afinidad de unión al glucagón.
Como se muestra por las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón 259-E7-001 y 259-F5-001 una molécula de ácido nucleico que une glucagón con un tramo central de 29 nucleótidos se puede unir a glucagón.
Las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón 259-H6-006, 259-H6-007 y 259- H 6-008 son derivados de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-002 (que tiene un tramo central de 32 nucleótidos) y todos comprenden el mismo primer y segund tramos terminales de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-002 y tramos centrales de nucleótidos que son casi idéntico al tramo central de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-002. Debido a la deleción de uno o dos nucleótidos dentro del tramo central tal como se describe para la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-002 el tramo central consiste de 31 ó 30 nucleótidos: 259-H6-006: tramo central de nucleótidos: 5'-AGGA- AGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCA-'3 [SEQ ID NO: 218], 259-H6-007: tramo central de nucleótidos: 5 ' -AGGAAAGGTTGGTA- AGGTTCGGTTGGATTCA-'3 [SEQ ID NO: 219], 259-H6-008: tramo central de nucleótidos: 5'-AGGA-AGGTTGGTA- AGGTTCGGTTGGATTCA-'3 [SEQ ID NO: 220].
En un ensayo pull-down de competencia comparativa contra la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-002 se demostró que la deleción de uno (ver 259-H6-006 y 259- H6-007) o dos (ver 259-H6-008) nucleótidos del tramo central de nucleótidos de 259-H6-002 condujeron a una reducción de la afinidad de unión (Figura 5) Sin embargo, la combinación de los tramos centrales de nucleótidos de las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón 259-D5-001, 259-H6-001, 259-B7-001, 259-B8-001, 259-A5-001, 259-C8-001, 259-E5-001, 259-E7-001, 259-F5-001, 259- H6-002, 259-H6-005, 259-H6-003, 259-H6-004, 259-H6-006, 259 -H6-007 y 259-H6-008 estas moléculas de ácido nucleico que unen glucagón comprenden un tramo central de nucleótidos que consta de 29, 30, 31 ó 32 nucleótidos seleccionados del grupo que consiste de 5'-AKGARAKGTTGSYAWAGRTTCGGTTGGATTCA-'3 (259-D5-001, 259-H6- 001, 259-B7-001, 259-B8-001, 259-A5-001, 259-C8-001, 259-E5-001) [SEQ ID NO: 221], 5'-AGAAGGTTGGTAAGTTTCGGTTGGATCTG-'3 (259-F5-001) [SEQ ID NO: 198], 5'-AGAAGGTCGGTAAGTTTCGGTAGGATCTG-'3 (259-E7-001) [SEQ ID NO: 199], 5'-AGGAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCA-'3 (259-H6-006) [SEQ ID NO: 218], 5' -AGGAAAGGTTGGTAAGGTTCGGTTGGATTCA-'3 (259-H6-007) [SEQ ID NO: 219], 5'-AGGAAGGTTGGTAAGGTTCGGTTGGATTCA-'3 (259-H6-008) [SEQ ID NO: 220].
Las moléculas de ácido nucleico que unen glucaqón 259-H6-001 y 259-C8-001 mostraron la mejor afinidad de unión al glucagón y comprenden las siguientes secuencias para el tramo central: 5' - AGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCA-'3 [SEQ ID NO: 212].
Los inventores mostraron sorprendentemente en ensayos pull-down de competencia comparativos o por análisis de resonancia de plasmón de superficie que la afinidad de unión deuna molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-002 se mejoró mediante la sustitución de 2'-desoxirribonucleótidos por ribonucleótidos dentro de la secuencia del tramo central de nucleótidos. Los 2'-desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos se muestran en la Figura 29 y 30A-B, en el que en el ejemplo 1.2 y en las figuras correspondientes se utilizaron las siguientes abreviaturas: G es 21desoxi-guanosina (5'monofosfato), C es 2'desoxi-citidina (5'monofsfato), A es 2'desoxi-adenosina (5' monofosfato), T es 2 'desoxi-timidina (5' monofosfato), rG es guanosina (5'monofosfato), rU es uridina (5' monofosfato) y rA es adenosina (5'monofosfato). En particular la sustitución de hasta cinco 2'-desoxirribonucleótidos por ribonucleótidos en el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-002 resultó en la mejora de la afinidad de unión al glucagón por un factor de hasta más de 22. En más detalle, los inventores han encontrado sorprendentemente que a) la sustitución de un 2'-desoxirribonucleótido por un ribonucleótido en la posición 6, 17 ó 29 en el tramo central de nucleótidos de glucagón de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-002 dio lugar a la afinidad de unión mejorada al glucagón en comparación con la afinidad de unión de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-002 (véase la Figura 6D, 6B y 6C; 259-H6-002-R13, 259-H6-002-R24, 259-H6-002-R36, 259-H6-005-R12, 259-H6-009-R12, 259-H6-010-R12, 259 - H6-01 1-R12, 259-H6-012-R12, 259-H6- 013-R12, 259-H6-014-R12, 259-H6-015-R12, 259-H6-016-R12); b) la sustitución de dos 2'-desoxirribonucleótidos por dos ribonucleótidos en las posiciones 6 y 17, ó 6 y 29, ó 17 y 29 en el tramo central de nucleótidos la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-002 produjo una mejora de la afinidad de unión al glucagón en comparación con la afinidad de unión de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-002 (véase la Figura 6A; 259-H6-002-R13/24, 259-H6-002-R13/36, 259-H6-002-R24/36); c) la sustitución de tres 21-desoxirribonucleótidos por tres ribonucleótidos en las posiciones 6, 17 y 29 en el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-002 dió lugar a la mejora de la afinidad de unión al glucagón en comparación con la afinidad de unión de las moléculas de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-002 (ver Figura 6A y 6C; 259-H6-002-R13/24/36 y 259- H6-014-R12/23/35); y d) la sustitución de cinco 2'-desoxirribonucleótidos por cinco ribonucleótidos en las posiciones 6, 17, 23, 29 y 32 en el tramo central de nucleótidos de glucagón de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-002 produjo una mejora de la afinidad de unión al glucagón en comparación con la afinidad de unión de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-002 (ver la Figura 6C; 259-H6-014-R12/23/29/35/38).
Basado en los dato que mostraron que la sustitución de 2'-desoxirribonucleótidos por ribonucleótidos en varias posiciones del tramo central de nucleótidos de las moléculas de ácido nucleico que une glucagón de Tipo B llevó a mejorar la unión a glucagón el tramo central de las moléculas de ácido nucleico que une glucagón 259-D5-001, 259-H6-001, 259-B7-001, 259-B8-001, 259-A5-001, 259-C8-001, 259-E5-001 se puede resumir en la siguiente fórmula genérica 5'-AKGAR n1KGTTGSYA An2RTTCGn3TTGGAn4TCn5-'3 [SEQ ID NO: 197], en donde ni es A o rA, n2 es G o rG, n3 es G o rG, n4 es T o rU, n5 es A o rA,y en donde G, A, T, C, K, Y, S, W y R son 2 ' -desoxirribonucleótidos, y rG, rA y rU son ribonucleótidos.
La unión de moléculas de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-001, 259-C8-001, 259-H6-002-R13, 259-H6-002-R24, 259-H6-002-R36, 259-H6-005-R12, 259-H6-009-R12, 259-H6- 010-R12, 259-H6-011-R12, 259-H6-012-R12, 259-H6-013-R12, 259-H6-014-R12, 259 - H6-015-R12, 259-H6-016-R12, 259-H6-002- R13/24, 259-H6-002-R13/36, 259-H6-002-R24/36, 259-H6-002 - R13/24/36, 259-H6-014-R 23/12/35 y 259-H6-014-R12/23/35/38 mostró afinidad de unión al glucagón mejor que otras moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de tipo B y la comparten las siguietes secuencias para el tramo central: 5' AGGAAniGGTTGGTAAAn2GTTCGn3TTGGAn4TCn53' [SEQ ID NO: 203], en donde nies A o rA, n2 es G o rG, n3 es G o rG, n4 es T o rU, n5 es A o rA, y en donde G, A, T, y C son 2'-desoxirribonucleótiaos, y rG, rA y rU son ribonucleótidos.
Las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón 259-H6-002-R13, 259-H6-002-R24, 259-H6-002-R36, 259-H6-002-R13/24, 259-H6-002-R13/36, 259-H6-002-R13/24/36, 259-H6-014- R12/23/35, 259-H6-014-R 12/23/29/35/38 mostraron la mejor afinidad de unión al glucagón y comprenden las siguientes secuencias para el tramo central de nucleótidos: a) 259-H6-002-R13: 5'AGGAArAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCA 3' [SEQ ID NO: 204], en donde G, A, T, y C son 2'-desoxirribonucleótidos, y Ra es un ribonucleótido; b) 259-H6-002-R24: 5'AGGAAAGGTTGGTAAArGGTTCGGTTGGATTCA 3' [SEQ ID NO: 205], en donde G, A, T, y C son 2'-desoxirribonucleótidos, y rG es ribonucleótido; c) 259-H6-002-R36: 5 'AGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGArUTCA 3' [SEQ ID NO: 206], en donde G, A, T, y C son 2'-desoxirribonucleótidos, y r es un ribonucleótido; d) 259-H6-002-R13/24: 5'AGGAArAGGTTGGTAAArGGTTCGGTTGGATTCA 3' [SEQ ID NO: 207], en donde G, A, T y C son 2'-desoxirribonucleótidos y rG y rA son ribohucleótidos; e) 259-H6-002-R13/36: 5'AGGAArAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGArUTCG 3' [SEQ ID NO: 208], en donde G, A, T, C y son 2'-desoxirribonucleótidos y rA y r son ribonucleótidos; f) 259-H6-002-R24/36: 5'AGGAArAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGArUTCA 3' [SEQ ID NO: 209], en donde G, A, T, y C son 2'-desoxirribonucleótidos, y rG y r son ribonucleótidos; g) 259-H6-002-R13/24/36 y 259-H6-014-R12/23/35: 5'AGGAArAGGTTGGTAAArGGTTCGGTTGGArUTCA 3' [SEQ ID NO: 210], y en donde G, A, T, y C son 2'-desoxirribonucleótidos, y la RG, RA y r son ribonucleótidos; h) 259-H6-014-R12/23/29/35/38: 5'AGGAArAGGTTGGTAAArGGTTCGrGTTGGArUTCrA 3' [SEQ ID NO: 211], y en donde G, A, T, y C son 2'-desoxirribonucleótidos, y la RG, RA y r son ribonucleótidos.
El primer y el segundo tramo terminal de las moléculas de ácido nucleico que une glucagón de tipo B comprenden tres (véase 259-H6-004), cinco (véase 259-H6-003), seis (por ejemplo, 259-H6-005, 259 - H6-005-R12, 259-H6-009-R12, 259-H6-010-R12, 259-H6-011-R12, 259-H6-012-R12), siete (por ejemplo, 59-H6-002 y los derivados, del mismo tales como 259-H6-002-R13, 259-H6-002-R13/24/36) o nueve (por ejemplo, 259-H6-001) nucleótidos (Figuras 4 a 6), por el que los tramos opcionalmente se hibridizan entre si, por lo que tras la hibridización se forma una estructura de doble cadena. Esta estructura de cadena doble puede consistir en uno a nueve pares de bases. Sin embargo, dicha hibridización no está necesariamente dada en la molécula.
La combinación de los primeros tramos terminales de nucleótidos y los segundos tramos terminales de nucleótidos de todas las moléculas de ácido nucleico que une glucagón probadas de Tipo B de la fórmula genérica para el primer tramo terminal de nucleótidos es 5' Z1Z2Z3Z4Z5Z6SAK 3' y la fórmula genérica para el segundo tramo terminal de de nucleótidos es 5' CKVZ7Z8Z9Z10Z11Z123', en donde Zi es C o ausente, Z2 es G o ausente, Z3 es R o ausente, Z4 es B o ausente, Z5 es B o ausente, Z6 es S o ausente, Z7 es S o ausente t, Zg es V o ausente, Z9 es N o ausente, Z10 es K o ausente, Z es M o ausente, y Zi2 es S o ausente, en donde en una primera modalidad preferida d) Z es C, Z2 es G, Z es R, Z4 es B, Z es B, Z6 es S, Z7 es S , Z8 es V, Z9 es N, Z40 es K, Zn es M, y Zi2 es S , b o e) Zc está ausente, Z2 es G, Z es R, Z4 es B, Z5 es B, Zb es S , Z7 es S , Z8 es N, Z9 es V, Z4o es K, Z41 es M, y Zi2 es S, o f) Z4 es C, Z2 es G, Z3 es R, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es S, Z7 es 0 S, Za es V, Z9 es N, Z40 es K, Zn es M, y Z42 está ausente, y en una segunda modalidad preferida 5 d) Z4 está ausente, Z2 es G, Z3 es R, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es S, Z7 es S , Z8 es V, Z9 es N, Z40 es K, Z14 es M, Y z42 está ausente, o e ) Z4 está ausente, Z2 es G, Z3 es R, Z4 es B, Z5 es B, Z 8 es S , Z7 es S, Z8 es V, Z9 es N, Z40 es K, Zn está 0 ausente, y Z42 está ausente , o f ) Z está ausente, Z2 está ausente , Z3 es R, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es S, Z7 es S, Z8 es V, Z9 es N, Z40 es K, Zn es M, y Z42 está ausente , y en una tercera modalidad preferida d)Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 es R, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es S, Z7 es S, Z8 es V, Z9 es N, Z10 es K, Zn está ausente, y Z12 está ausente, o e) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 es R, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es S, Z7 es S, Z8 es V, Z9 es N, Z40 está ausente, Zu está ausente, y Z42 está ausente, o f)Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 es B, Z5 es B, Z6es S, Z7es S, Z8 es V, Z9 es N, Z40 es K, Zn está ausente, y Z42está ausente, y en una cuarta modalidad preferida d) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 es B, Z5 es B, Ze es S, Z7 es S, Z8 es S, Z9 es N, Z10 está ausente, Zn está ausente, y Z42 está ausente, o e) Z4 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 es B, Z7 es S, Z8 es S, Z9 es N, Z10 está ausente, Zn está ausente, y Z42 está ausente, o f) Z4 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es S, Z7 es S, Z8 es S, Z9 está ausente Zio está ausente, Zn está ausente, y Z42 está ausente, y En una quinta modalidad preferida d)Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 es B, Z6 es S, Z7 es S, Zg es V, está ausente, Z10 está ausente, Zn está ausente, y Zi2 está ausente, o e) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 es B, Z6 es S, Z7 es S, Z8 está ausente, Z9 está ausente, Zi0 está ausente, Zn está ausente, y Zi2 está ausente, o f)Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, Z6es S, Z7es S, Z8 es V, Z9 está ausente, Z10 está ausente, Zn está ausente, Zi2 está ausente, y Z43 está ausente, y En una sexta modalidad preferida d) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, está ausente, Zz es S, Z7 es S, Zg está ausente, está ausente, Z10 está ausente, está ausente, y Z42 está ausente, o e) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, Z6 está ausente, Z7 es S Zg está ausente, Zg está ausente, Zio está ausente, Z está ausente, y Z12 está ausente, o f) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, Z¾es S, Z7 está ausente, Zg está ausente, Z9 está ausente, Zo está ausente, Zn está ausente, Z12está ausente, y Zi3 está ausente, y En una séptima modalidad preferida Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, Z6 está ausente, Z7 está ausente, Zg está ausente, Zg está ausente, Zn está ausente, Zn está ausente, y Zi2 está ausente.
El primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-F5-001 y 59-E7 comprende una secuencia de nucleótidos de 5' ZIZ2Z3Z4Z5Z6GAT 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-F5-001 comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CGA gZgZgZioZnZn 3', en donde Zi es C, Z2 es G, Z3 es A, Z4 es G, Z5 es T, Z6 es C, Z7 es C, Z8 es G, Z9 es A, Z10 es G, Zn es A, y Z12 es C. Por otra parte en el extremo 3'del segundo tramo terminal de nucleótidos hay un adicional 'G'.
Combinando los primeros tramos terminales de nucleótidos y los segundos tramos terminales de nucleótidos de las moléculas de ácido nucleico que une glucagón 259-D5-001, 259-H6-001, 259-B7-001, 259-B8-001, 259-A5-001, 259-C8-001 y 259-E5-001 de la fórmula genérica para el primer tramo terminal de nucleótidos es 5' ZiZ2Z3Z4Z5Z6GAG 3' y la fórmula genérica para el segundo tramo terminal de nucleótidos es 5' CTCZ7Z8Z9Z10Z11Z123', en donde d) Zi es C, Z2 es G, Z3 es R, Z4 es C, Z es T, Z es C, Z7 es G, Zs es A, Z9 es G, Z10 es T, Zn es C, y Z es G, o e) Zi está ausente, Z2 es G, Z3 es R, Z es C, Z5 es T, Z6 es C, Z7 es G, Zs es A, Z9 es G, Z10 es T, Z es C, y Z42 es G, o f)Zi es C, Z2 es G, Z3 es R, Z4 es C, Z5 es T, Z6 es C, Z es G, Z8 es A, Z9 es G, ZiC es T, Zn es C, y Z 2 está ausente, en donde los ácidos nucleicos que unen glucagón con la mejor afinidad de unión al glucagón comprenden las siguientes combinaciones del primer tramo terminal y el segundo tramo terminal de nucleótidos: 259-H6-001: 5 'CGACTCGAG 3' (primer tramo terminal de nucleótidos) y 5'CTCGAGTCG 3' (segundo tramo terminal de nucleótidos) ; 259-C8-001 5'CGGCTCGAG 3' (primer tramo terminal de nucleótidos) y 5 ' CTCGAGTCG 3' (segundo tramo terminal de nucleótidos) .
Las moleculad de ácido nucleico que unen 259-H6-002, 259-H6-006, 259-H6-007, 259-H6-008, 259-H6-002-R13 , 259-H6-002-R24, 259-H6-002 -R36, 259-H6-002-R13/24 , 259-H6-002- R13/36, 259-H6-002-R24/36 y 259-H6-002-R13/24/36 comprenden un primer tramo terminal de nucleótidos con una secuencia de 5' Z1Z2Z3Z4Z5Z6GAG 3' y un segundo tramo terminal de nucleótidos con una secuencia de 5' CTCZ7ZBZ9ZIOZI1Z12 3', en donde a) Z está ausente, Z2 está ausente, Z3 es A, Z4 es C, Z5 es T, es C, Z7 es G, Z8 es A, Zg es G, Z10 es T, Zcc está ausente, y Z12 está ausente, o b) Zc está ausente, Z2 está ausente, Z3 es A, Z4 es C, Z5 es T, Z6 es C, Z7 es G, Z8 es A, Z9 es G, Zc0 está ausente, Zn está ausente, y Z12 está ausente, o c) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 es C, Z5 es T, Zz es C, Z7 es G, Z8 es A, Z9 es G, Zc0 es T, Zn está ausente, y Zi2 está ausente.
Combinando los primeros tramos terminales de nucleótidos y los segundos tramos terminales de nucleótidos de nucleico que une glucagón 259-H6-005, 259-H6-005-R12, 259-H6-009-R12, 259-H6-010-R12, 259 - H6-011-R12, 259-H6-012-R12, 259-H6-013-R12, 259-H6-014-R12, 259-H6-015-R12, 259-H6-016-R12, 259-H6- 014-R12/23/35 y 259-H6-014-R12/23/29/35/38, la fórmula genérica para el primer tramo terminal de nucleótidos es 5' ZXZ2Z3Z4Z5Z6SAG 3' y la fórmula genérica para el segundo tramo terminal de nucleótidos es 5' CTSZ7Z8Z9Z10Z11Z123', en donde a) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es S, Z7 es S, Z8 es S, Z9 es V, Z10 está ausente, Zn está ausente, y Z12 está ausente, o b) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 es B, Z es S, Z7 es S, Z8 es S, Z9 es V, Zco está ausente, Zn está ausente, y Z12 está ausente, o c)Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 es B, Z5 es B, Z6 es S, Z7 es S, Z8 es S, Z9 está ausente, Z10 está ausente, Zn está ausente, y Z12 está ausente, en donde los ácidos nucleicos que unen glucagón con la mejor afinidad de unión al glucagón comprenden las siguientes combinaciones del primer tramo terminal y el segundo tramo terminal de nucleótidos: c) 259-H6-005-R12: 51GTCGAG (primer tramo terminal de nucleótidos) y 5’CTCGAC (segundo tramo terminal de nucleótidos), o d) 259-H6-010-R12: 5'TGCGAG 3' (primer tramo terminal de nucleótidos) 5'CTCGCA 3' (segundo tramo terminal de nucleótidos), o e) 259-H6-012-R12 5'GGCCAG 3' (primer tramo terminal de nucleótidos) 5'CTGGCC 3' (segundo tramo terminal de nucleótidos), o f) 259-H6-014-R12: 5'GCCGAG 3' (primer tramo terminal de nucleótidos) y 5'CTCGGC 3' (segundo tramo terminal de nucleótidos), o g) 259-H6-015-R12: 5'CTCGAG 3' (primer tramo terminal de nucleótidos) y 5'CTCGAG 3' (segundo tramo terminal de nucleótidos).
El primer tramo terminal de nucleótidos dela molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-003 comprende una secuencia de nucleótidos de 5' Z1Z2Z3Z4Z5Z6GAG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleioc que une glucagón 259-H6-003 comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CTCZ7Z8Z9 Z1011Z123', en donde a) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 es T, Z6 es C, Z7 es G, Zg es A, Zg está ausente, Zc0 está ausente, Zn está ausente, y Zi2 está ausente, o b) Zi está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 es T, Z6 es C, Z7 es G, Z8 está ausente, Z9 está ausente, Zco está ausente, Zn está ausente, y Zc2 está ausente, o c) Zc está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Zs está ausente, Z es C, Z7 es G, Zg es A, Zg está ausente, Z10 está ausente, Zcc está ausente, y Z12 está ausente, preferiblemente el primer tramo terminal de nucleótidos es 5'-TCGAG-'3 y el segundo tramo terminal de nucleótidos es 5'-CTCGA-'3.
El primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-004 comprende una secuencia de nucleótidos de 5' ZxZ2Z3ZZ5Z6GAG 3' y el segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que une glucagón 259-H6-004 comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CTCZ7Z8Z9 Z10ZnZi23', en donde Zc está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 está ausente, Z6 está ausente, Z7 está ausente, Z8 está ausente, Zg está ausente, Zio está ausente, Zn está ausente, y Z12 está ausente.
Con el fin de determinar la afinidad de unión por una medición de resonancia plasmódica de superficie y/o para probar la funcionalidad de las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de Tipo B, las moléculas 259-H6-002, 259- H6-002-R13, 259-H6-002- R24, 259-H6-002-R36, 259-H6-002- R13/24, 259-H6-002-R13/36, 259-H6-002-R13/24/36, 259-H6-002-R24 / 36, 259H6-014-R12, 259-H6-014-R12/23/35 y 259-H6-014- R12/23/29/35/38 fueron sintetizados como spiegelmers, por el que los spiegelmers 259-H6-002, 259 - H6-002-R13 y 259-H6- 014-R12/23/35 fueron sintetizados con un grupo amino en el extremo 5'. Para los spiegelmers que modificaron el amino 259-259-H6-002-5'-Amino [SEq ID NO: 155], H6-002-R13-5'-amino [SEQ ID NO: 156] y 259-H6-014- R12/23/35-5'-amino [SEQ ID NO: 157] una fracción de PEG de 40 kDa se acopló llevando a la unión de los spiegelmers que unen glucagón 259-H6-002-5'-PEG (también referido como NOX-G12) [SEQ ID NO: 88], 259-H6-002-R13-5'-PEG (también referido como NOX-G13) [SEQ ID NO: 89], y 259-H6-014-R12/23/35-5'-PEG (también referido como N0X-G14) [SEQ ID NO: 90],.Síntesis y PEGilación de los spiegelmer se describe en el Ejemplo 2.
El equilibrio de unión constante KD de spiegelmers que unen glucagón 259-H6-002, 259-H6-002-R13, 259-H6-002-R24, 259-H6-002-R36, 259-H6-002-R13/24, 259 -H6-002-R13/36, 259- H6-002-R13/24/36, 259-H6-002-R24/36, 259-H6-014-R12, 259-H6-014-R12/23/35 , N0X-G13 y N0X-G14 se determinaron por la medición de resonancia plasmódica de superficie (Figuras 6C, 259-H6-014-R12/23/29/35/38, 10, 11, 12, 13, protocolo véase el Ejemplo 4).
Los spiegelmers que unen glucagón NOX-G13 y NOX-G14 fueron capaces de inhibir/antagonizar in vi tro la función de glucagón a su receptor con un IC50 de 4.7 a 6.0 nM (Figura 20 A; para el protocolo del ensayo funcional in vi tro véase el Ejemplo 5).
Los datos de la medición de resonancia plasmódica de superficie como se muestra en la Figura 10 confirman que la sustitución de un 2'deoxyribonucleotide por un ribonucleótido en el tramo central de nucleótidos de la molécula que une glucagón 259-H6-002 condujo a una afinidad de unión mejorada (que se muestra para 259-H6-002-R13, 259- H6-002-R24 , 259-H6-002-R36). Los datos de la medición de resonancia plasmódica de superficie como se muestra en la Figura 12 revelan que la sustitución adicional de uno o dos 2'desoxirribonucleótidos por uno o dos ribonucleótidos en el tramo central de la molécula que une glucagón 259-H6-002R13 lleva a una afinidad de unión mejorada adicional al glucagón (que se muestra para el 259-H6-002-R13, 259 - H6-002-R13 R24, 259-H6-002-R13 _R36 y 259-H6-002-R13_R24_R36). Este efecto también se mostró por spiegelmers 259-H6-002, 259-H6-002-R13 y 259-H6-002-R13-R24-R36 en un ensayo funcional in vitro (Figura 16, para el protocolo véase el Ejemplo 5).
Además, como se muestra en el ejemplo 6 de la selectividad de unión de los spiegelmers que unen glucagón de NOX-G13 y N0X-G14 se determinó (Figuras 19 y 20). 1 .3 Las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de Tipo C Además, otros cinco ácidos nucleicos que unen glucagón que no comparten los motivos de unión de 'Tipo A' y 'Tipo B' se identificaron y se denomina en el presente documento como "tipo C". Se analizaron como aptámeros utilizando el ensayo de unión pulldown directo y o el ensayo de unión pulldown de competencia comparativa (Figuras 7 y 8).
Los inventores mostraron sorprendentemente mediante la medición de resonancia plasmódica que la afinidad de unión de la molécula de ácido nucleico que une glucagón NOX-Gllstabi2 se mejoró mediante la sustitución de un ribonucleótido por medio de 2'-desoxirribonucleótido en la secuencia de N0X-GL1 lstabi2. Los 2'-desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos se muestran en la Figura.29 y 30A-B, en donde en el Ejemplo 1.3 y en las figuras correspondientes se usaron las siguientes abreviaturas: G es guanosina(5'monofosfato), C es la citidina 5’monofosfato, A es adenosina (5'monofosfato), U es uridina (5'monofosfto), dG es 2'desoxi-guanosina (5'monofosfato), dC es 2'desoxi-citidina(5'monophosphate), dA es 2'desoxi-adenosina(5'monofosfato), dT es 2'desoxi-timidina(5'monofosfato). En particular, la sustitución de un ribonucleótido por 2'-desoxirribonucleótido en la posición 5, 7, 15, 16, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 46 ó 48 en la molécula de ácido nucleico que une glucagón N0X-Gllstabi2 condujo a una unión mejorada al glucagón (Figuras 25A y 25B). En la Figura 26 se muestran las curvas de unión de NOX-Gllstabi2, NOX-G11-D07, NOX-G1 1-D16, N0X-G11-D19, NOX-G11- D21 y NOX-G11-D22 como se determinó por la medición de resonancia plasmódica.
Es de entenderse que cualquiera de las secuencias mostradas en las Figuras 1 a 8 son moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, incluyendo las formas truncadas de los mismos, pero incluyendo también aquellas formas extendidas de los mismos en virtud de la condición, sin embargo, que la truncada y extendida, respectivamente, las moléculas de ácido nucleico son todavía capaces de unirse al objetivo.
Ejemplo 2: Síntesis y derivatización de aptámeros y Spiegelmers SÍNTESIS DE PEQUEÑA ESCALA Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se produjeron como aptámeros (ácidos D_ARN nucleicos o D-ADN modificado ácidos D-ARN nucleicos) y Spiegelmers (ácidos L-ARN nucleicos o L-ADN modificado ácidos L-ARN nucleicos), respectivamente , mediante una síntesis en fase sólida con un sintetizador ABI 394 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) utilizando 2'TBDMS ARN y la química de la fosforamidita ADN con grupos protectores de aminas exocielico estándar (Damha y Ogilvie, 1993). Se usaron para la parte de ARN del oligonucleótido rA(N-Bz)-, rC(N-Ac) rG(N-ibu) -, y rU-fosforamiditas en el D-y L-configuración, mientras que se aplicaron para la parte ADN dA(N-Bz)-, dC(N-Ac) -, dG (N-ibu)-, y dT en el D-y L-Configuración. Todas las fosforamiditas se adquirieron de ChemGenes, Wilmington, MA. Después de la síntesis y desprotección de aptámeros y spiegelmers se purificaron mediante electroforesis en gel.
SÍNTESIS A GRAN ESCALA MÁS MODIFICACIÓN Los spiegelmers fueron producidos por síntesis en fase sólida con un sintetizador AktaPilotlOO (GE Healthcare, Freiburg) utilizando 2'TBDMS ARN y la química de la fosforamidita ADN con grupos protectores de aminas exocielico estándar (Damha y Ogilvie, 1993). L-rA(N-Bz)-, L-rC(N-Ac)-, L-rG(N-ibu)-, L-rU-, L-dA(N-Bz)-, L-dC(N-Ac)-, L-dG(N-ibu) y L-dT-fosforamiditas fueron adquiridos de ChemGenes, Wilmington, MA. El 5'-amino-modificador se adquirió de American International Chemicals Inc. (Framingham, MA, EE.UU.). La síntesis de la no modificada o una 5'-amino-modificada spiegelmer se inició con L-riboA, L-riboC, L-riboG, L-RiboU, L-2'desoxiA, L-2'desoxiC, L-2'desoxiG, o L-2'desoxiT modificado CPG tamaño de poro 1000 Á (Link Technology, Glasgow, Reino Unido. Para el acoplamiento de las fosforamiditas de ARN y ADN (15 min por ciclo), 0.3 M benciltiotetrazol (CMS-Chemicals, Abingdon, Reino Unido) en acetonitrilo, y se utilizaron 2 equivalentes de la respectiva 0.2 M de solución de fosforamidita en acetonitrilo. Se utilizó un ciclo de nivelación de oxidación. Otros disolventes y reactivos estándar para la síntesis de oligonucleótidos fueron adquiridos de Biosolve (Valkenswaard, NL). El Spiegelmer se sintetizó DMT-ON; después de la desprotección, que se purificó mediante RP-HPLC preparativa (Wincott et al., 1995) utilizando un medio Sourcel5RPC (Amersham). El grupo-5'DMT se eliminó con ácido acético al 80% (30 min a RT). En el caso de Spiegelmers 5'aminomodificado el grupo-5'MMT se eliminó con ácido acético al 80% (90 min a RT). Posteriormente, se añadió una solución acuosa 2 M NaOAc y el Spiegelmer se desaló por filtración de flujo tangencial utilizando una membrana de celulosa regenerada 5 K (Millipore, Bedford, MA).
La PEGilación de Spiegelmers Con el fin de prolongar el tiempo de residencia en plasma de Spiegelmer in vivo, una fracción de 40 kDa polietilenglicol (PEG) se acopló covalentemente al extremo 5'de los Spiegelmers.
Para la PEGilación (para los detalles téenicos del método para la PEGilación ver la solicitud de patente europea EP 1306 382), el purificado 5'-amino modificado Spiegelmer se disolvió en una mezcla de H2O (2.5 mi), DMF (5 mi), y un tampón A (5 mi; preparado mediante la mezcla de ácido cítrico. H20 [7 g], ácido bórico [3.54 g], ácido fosfórico [2.26 mi], y 1 M de NaOH [343 mi] y añadiendo agua hasta un volumen final de 11; H = 8.4 se ajustó con 1 M HCl).
El pH de la solución Spiegelmer fue llevado a 8.4 con 1 M NaOH. Después, se añadieron 40 kDa PEG-NHS éster (Jenkem Teenología, Alien, TX, EE.UU.) a 37°C se alcanzó cada 30 min en seis porciones de 0.25 equivalentes hasta un rendimiento máximo de 75 a 85%. El pH de la mezcla de reacción se mantuvo a 8 a 8.5 con 1 M NaOH durante la adición del éster de PEG-NHS.
La mezcla de reacción se mezcló con 4 mi de solución de urea (8 M), y 4 mi de tampón B (0.1 M de acetato de trietilamonio en H20) y se calentó a 95°C durante 15 min. A continuación, el PEGilado Spiegelmer se purificó por RP-HPLC con Fuente 15RPC medio (Amersham), usando un gradiente de acetonitrilo (tampón B; tampón C: 0.1 M de acetato de trietilamonio en acetonitrilo). El exceso de PEG eluyó a 5% de tampón C, el PEGilado Spiegelmer a 10-15% de tampón C. Las fracciones de producto con una pureza de >95% (según la evaluación por HPLC) se combinaron y se mezclaron con 40 mi de 3 M NaOAc. El PEGilado Spiegelmer se desaló por filtración de flujo tangencial (5 K membrana de celulosa regenerada, Millipore, Bedford MA).
Ejemplo 3: Determinación de la afinidad de unión al glucagón (Ensayo pull-down) Para el análisis de unión a glucagón las moléculas de ácido nucleico que une glucagón se sintetizaron como aptámeros que consiste en D-nucleótidos o como spiegelmers que consiste en L-nucleótidos. El análisis de unión de aptámeros se hizo con biotinilado humano D-glucagón que consiste en D-aminoácidos. El análisis de unión de spieglmers se hizo con biotinilado humano L-glucagón que consiste en L-aminoácidos.
Ensayo pulldown directo Los aptámeros eran 5'-fosfato marcado por la T4 polinucleótido quinasa (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) usando [g-32R]-marcado ATP (Hartmann Analytic, Braunschweig, Alemania). Dos adenosina residuos adicionales en la configuración D en el extremo 5' de Spiegelmer permitieron también el marcado radioactivo de spiegelmers por T4 polinucleótido quinasa. La radioactividad especifica de ácidos nucleicos marcados fue de 200,000 - 800,000 cpm/pmol. Después de- y renaturalización (1' 94°C, hielo/H20) ácidos nucleicos marcados se incubaron a 100-700 pM de concentración de 37°C en tampón de selección (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4; NaCl 137 mM; 5 mM KC1; 1 mM de MgCl2,' 1 mM de CaCl2; 0,1% [w/vol] de Tween-20; 0,1% [w/vol] de CHAPS) junto con cantidades variables de biotinilado D-o L-glucagón humano, respectivamente, por 2-6 horas con el fin de alcanzar el equilibrio a bajas concentraciones. El tampón de selección se suplemento con 100 mg/ml albúmina de suero humano (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania), y 10 pg/ml de ARN de levadura (Ambion, Austin, EE.UU.) con el fin de prevenir una inespecifica absorción de parejas de unión a las superficies de material de plástico utilizado o a la matriz de inmovilización. El rango de concentración de biotina D-glucagón para la unión de un aptámero se estableció a partir de 0.64 nM a 10 mM mientras que el intervalo de concentración de glucagón L-biotinilado para la unión de Spiegelmer se estableció a partir de 0.32 nM a 5mM; volumen total de reacción fue de 50 ml. El glucagón biotinilado y complejos de ácidos nucleicos y glucagón biotinilado se inmovilizaron sobre 4 ml partículas de alta capacidad de Neutravidina agarosa (Thermo Scientific, Rockford, USA) que había sido previamente equilibrada con un tampón de selección. Las partículas se mantienen en suspensión durante 20 min a la temperatura respectiva en un termomezdador. La radioactividad inmovilizada se cuantificó en un contador de centelleo después de la eliminación del sobrenadante y el lavado apropiado. El porcentaje de unión se representó frente a la concentración de glucagón biotinilado y de las constantes de disociación se obtuvieron mediante el uso de algoritmos de software (GRAFIT; Erithacus Software; Surrcy UK) suponiendo una 1:1 estequiometría.
El ensayo pulldown de competencia para la clasificación de los ácido nucleicos que unen glucagón Con el fin de comparar la unión de diferentes aptámeros o Spiegelmers a glucagón se realizó un ensayo de clasificación competitiva. Para este propósito, ya sea el Spiegelmer aptámero más afín disponible se marcó radioactivamente (véase más arriba) y sirvió como referencia para los aptámeros o spiegelmers que unen glucagón, respectivamente. Después de la de- y renaturalización los ácidos nucleicos marcados fueron incubados a 37°C con glucagón biotinilado en 50 ó 100 ml de tampón de selección en condiciones que resultaron en alrededor de 5 - 10% de unión al glucagón biotinilado después de la inmovilización en 1.5 ml partículas de Gran capacidad de Neutravidina agarosa (Thermo Scientific, Rockford, EE.UU.) y el lavado sin competencia. Se añadió un exceso de variantes aptámeras no etiquetadas de-y renaturalizadas a diferentes concentraciones (por ejemplo, 50, 500 y 5000 nM), junto con el aptámero de referencia marcado na reacciones de unión paralelas. Los derivados Spiegelmer de- y renaturalizadas no marcadas se aplican a concentraciones de 1, 10, y 100 nM junto con el Spiegelmer de referencia en reacciones de unión paralelas. Los ácidos nucleicos que se van a probar compitieron con el ácido nucleico de referencia para la unión objetivo, disminuyendo de este modo la señal de unión en dependencia de sus características de unión. El aptámero o Spiegelmer, respectivamente, que se encuentra con más activos en este ensayo a continuación podrían servir como una nueva referencia para el análisis comparativo de otras moléculas de ácido nucleico que unen glucagón. La unión del Spiegelmer marcado de cada curva de unión se normalizó el establecimiento de la unión sin la competencia a 100%.
Ensayo pulldown de competencia para la determinación de la afinidad y selectividad Además de los experimentos de clasificación comparativos también se realizó el ensayo pulldown de competencia para determinar las constantes de afinidad de los ácidos nucleicos que unen glucagón. Para este propósito, ya sea un aptámero de unión a D-glucagón o un Spiegelmer de unión L-glucagón se marcaron radioactivamente y sirvieron como referencia tal como se describe más arriba. Después se incubaron de-y renaturalización del ácido nucleico de referencia marcado y un conjunto de 5 diluciones que van por ejemplo, 0.128 a 2000 nM de moléculas de competencia con una cantidad constante de glucagón biotinilado en 0.1 ó 0.2 mi de tampón de selección en 37°C durante 2-4 horas. La concentración de proteina elegido debe causar la unión final de aproximadamente 5 - 10% de la molécula de referencia marcada radioactivamente en la concentración de competencia más baja. Con el fin de medir las constantes de unión del ácido nucleico derivado de secuencias de un exceso del aptámero de-y renaturalizada no marcado apropiadamente o las variantes de Spiegelmer sirvió como competidores, mientras que para los Spiegelmers no modificados asi como las formas de PEGilación fueron probadas. En otro ensayo la aproximación al glucagón no biotinilado a distintas concentraciones compitió contra el glucagón biotinilado para aptámero o Spiegelmer de unión. Además, la selectividad de los Spiegelmer que unen glucagón fue investigado por el péptido-1 similar al glucagón humano (GLP-1) y la polipéptida insulinotrópica dependiente de la glucosa (GIP), que se utiliza para competir contra el glucagón biotinilado. Después de la inmovilización de glucagón biotina y los ácidos nucleicos que unen en 1.5 ml de la matriz de agarosa neutravidina de gran capacidad, lavado y recuento de centelleo (véase más arriba), el porcentaje normalizado de Spiegelmer radiomarcado unido se representó frente a la concentración correspondiente de moléculas de competencia. La constante de disociación resultante se calcula empleando el Software GraFit.
Ejemplo 4: Medición Biacore de spiegelmers que unen glucagón Configuración de ensayo Biacore L-Glucagón biotinilado humano (glucagónI-29-AEEAc-AEEAc-biotina, síntesis a medida por Bachem, Suiza) se inmovilizó sobre un carboximetilado (en forma abreviada CM) chip sensor recubierto con dextrano que había sido preparado por inmovilización covalente de neutravidina soluble (Sigma Aldrich, Alemania) utilizando una mezcla 1:1 de 0.4M de EDC (l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida en H2O; GE , BR-1000-50) y 0.1 M NHS (N-hidroxisuccinimida en H20; GE, BR-1000-1050). La célula de flujo de referencia en el mismo chip de sensor fue bloqueada con biotina.
Evaluación general cinética Los spiegelmers que unen glucayón se disuelve en agua a una concentración de reserva de 100 mM (cuantificación por medición UV), se calienta a 95°C durante 30 segundos en un baño de agua o el mezclador termo y se enfrió rápidamente en hielo para asegurar una solución disuelta homogénea. Los parámetros cinéticos y constantes de disociación fueron evaluados por una serie de inyecciones Spiegelmer a concentraciones de 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63, 7.8, 3.9, 1.95, 0.98 y 0 nM diluida en tampón de ejecución. En todos los experimentos, el análisis se realizó a 37°C utilizando el comando Kinject definiendo un tiempo de asociación de 240 hasta 360 y un tiempo de disociación de 240 hasta 360 segundos a un flujo de 30 ml/min. El ensayo fue doblemente, mientras que FC1 sirvió como (bloqueado) de control de superficie (mayor contribución de cada concentración Spiegelmer) y una serie de inyecciones de tampón sin analito determina el volumen el tampón por si solo. Los datos del análisis y el cálculo de constantes de disociación (KD) se realizó con el software BIAevaluation 3.1.1 (Biacore AB, Uppsala, Suecia) usando una de Langmuir modificada 1:1 algoritmo de ajuste estequiométrica.
Los datos de análisis y el cálculo de constantes de disociación (KD) se realizó con el software BIAevaluation 3.1.1 (Biacore AB, Uppsala, Suecia) usando una de Langmuir modificada 1:1 algoritmo de ajuste estequiométrica, con una constante de RI y la evaluación de transferencia de masa con un transporte de masa coeficiente kt de 1 x 107 [RU/M*s]. Los resultados se representan como ka [1/M*s] frente kd [1/s].
Ensayo de competencia Biacore para determinar la selectividad de spiegelmersque unen glucagón La inmovilización se realizó de glucagón humano biotinilado en la forma descrita anteriormente. El Spiegelmer a analizar se inyectó a una concentración fija (aquí 125 nM) junto con una serie de concentraciones (2000-1000-500-250-0 nM) de diversos péptidos libres relacionados con glucagón (específicamente, glucagón, oxytomodulin, el GLP-1 (7-37), GLP-2 (1-33), GIP y prepro-VIP (81-122) como competidor o ningún competidor como control. La unión de spiegelmer para inmovilizar L-glucagón sin competidor (control) se normalizó a 100%. Cuando el Spiegelmer es co-inyectado con glucagón o péptidos relacionados (péptidos competidores), los Spiegelmer asociados al glucagón inmovilizado se reduce si la unión al competidor soluble se produce (respuestas mostradas sólo para 2000 nM de péptidos competidores). Las unidades de respuesta [RU] se determinaron después de 360 segundos de la inyección, normalizado para el control (=100%) y se representaron.
Ejemplo 5: Inhibición de la producción de cAMP inducida por glucagón por Spiegelmers que unen glucagón Una linea celular establemente transfectada que expresan el receptor humano para glucagón fue generado por clonación de la secuencia de codificación para el receptor de glucagón humano (NCBI adhesión NM_000160) en el vector pCR3.1 (Invitrogen). Las células CHO adaptadas al crecimiento en un medio libre de suero (UltraCHO, Lonza) fueron transíectadas con el plásmido de receptor de glucagón y las células transfectadas de manera estable se seleccionaron por tratamiento con geneticina.
Para un experimento de inhibición de células CHO que expresan el receptor de glucagón se sembraron en una placa de 96 pocilios (de cultivo celular tratado, de fondo plano) a una densidad de 4 - 6 x lOVpocillo y se cultivaron durante la noche a 37°C 5% de CO2 en un medio de UltraCHO que contiene 100 unidades/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina y 0.5 mg/ml de geneticina.20 min antes de la estimulación una solución de 3 - isobutil-L-metilxantina (IB MX) se añadió a una concentración final de 1 mM.
Las soluciones de estimulación (diversas concentraciones de Spiegelmers + glucagón) se prepararon en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) + 1 mg/ml de BSA y se incubaron durante 30 min a 37°C. Poco antes de la adición a las células, IBMX se añadió a una concentración final de 1 mM. Para la estimulación, se retiró el medio de las células y se añadieron las soluciones de estimulación (glucagón + Spiegelmer). Después de la incubación durante 30 min a 37°C las soluciones se retiraron y las células se Usaron en un tampón de lisis que es un componente del cAMP-Screen™ un equipo System (Aplicado a biosistemas). Este equipo se utiliza para la determinación del contenido de cAMP siguiendo las instrucciones del proveedor.
Ejemplo 6: La inhibición de GIP inducida por la producción de cAMP por los spiegelmers que unen glucagón Para investigar si los spiegelmers jque unen glucagón también pueden bloquear la acción del polipéptido insulinotrópico dependiente de glucagón (GIP), RTN-M5f células insuloma de rata (ATCC; CRL-11605) se sembraron en una placa de 96 pocilios (de cultivo celular tratada, de fondo plano) a una densidad de 1 x 105/pocillo y se cultivaron durante la noche a 37°C 5% de CO2 en RPMI1640 un medio que contiene suero bovino fetal al 10%, 100 unidades/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina.20 min antes de la estimulación se añadió una solución de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) hasta una concentración final de 1 mM.
Las soluciones de estimulación (GIP + varias concentraciones de Spiegelmers) se prepararon en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) + 1 mg/ml de BSA y se incubaron durante 30 min a 37°C. Poco antes de la adición a las células, IBMX se añadió a una concentración final de 1 mM. Para la estimulación, se retiró el medio de las células y se añadieron las soluciones de estimulación (GIP + Spiegelmer). Después de la incubación durante 30 min a 37°C las soluciones se retiraron y las células se lisaron en un tampón de lisis que es un componente del equipo de cAMP Screen™ System (Aplicado a biosistemas). Este equipo se utiliza para la determinación del contenido de cAM-P siguiendo las instrucciones del proveedor.
Ejemplo 7: La determinación de la selectividad de spiegelmer que une glucagón El precursor de glucagón se escinde en 8 cadenas, principalmente, glicentina, polipéptido relacionado con la glicentina, (GRPP), oxintomodulina (OXY/OXM), glucagón, péptido similar al glucagón 1 (GLP-1), péptido similar al glucagón 1 (GLP-1 [7-37]), el péptido 1 similar al glucagón 1 (GLP-1 [7-36]) y el péptido 2 similar al glucagón (GLP-2) (ver Figura 21).Una búsqueda BLAST también identificó el péptido insulintrópico dependiente de la glucosa (GIP) y el péptido intestinal PHV-42 (péptido intestinal vasoactivo prepro/ prepro-VIP [81 - 122]) como péptidos relacionados con la secuencia de glucagón. La selectividad de las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de tipo A- como Spiegelmers 257-E1-6XR-001, 257-E1-7XR-037, 257-E1-6XR-030-5'-PEG (también referido como N0X-G15) y 257-E1-7XR-037-5'-PEG (también referido como N0X-G16) y de Tipo B - tales como 259- H6-002-R13-5'-PEG (también referido como NOX-G13 ) y 259-H6- 014-R12/23/35-5'-PEG (también referido como NOX-G14) - se determinaron en un formato de ensayo de unión competitiva con libre de glucagón, oxintomodulina, el GLP-1 [7-37], el GLP-2 [1-33], GIP y prepro-VIP [81 - 122] por ensayos pulldown (véase el Ejemplo 3) y/o medición de Biacore (véase el Ejemplo 4). Los ensayos basados en células (Ejemplo 5 y 6) fueron utilizados para confirmar la unión de las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de Tipo A a glucagón, la oxintomodulina, el GLP-1 y GIP.
En los ensayos pulldown (véase el Ejemplo 3) y/o mediciones de Biacore de las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de Tipo A y Tipo B mostró una unión a glucagón y oxintomodulina e inhibió el glucagón-inducido, asi como la formación de ensayos basados en células oxintomodulina-inducida cAMP. Estos datos indican que el C-terminal de glucagón no es esencial para la unión de glucagón de las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de Tipo A y Tipo B. Los péptidos relacionados con la secuencia de glucagón GLP-1 [7-37], GLP-2 [1-33] y prepro-VIP [81 -122] no fueron reconocidos por las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de tipo A y tipo B. Sorprendentemente las moléculas de ácido nucleico que unen glucagón de tipo B 259-H6-002-R13-5'-PEG glucagón (también referido como NOX-G13) y 259-H6-014-R12/23/35-5'-PEG (también referido como N0X-G14) mostraron unión a GIP y el GIP inhibido que induce la formación de cAMP en ensayos basados en células (Figuras 18, 19, 20).
Ejemplo 8: El efecto de spiegelmers que unen glucagón en la tolerancia a la glucosa en un experimento en animales con diabetes mellitus tipo 1 y tipo 2 8.1 Efecto del spiegelmer NOX-G15 que une glucagón en un experimento con animales de diabetes mellitus tipo 1 y tipo 2 Métodos Los ratones macho BALB/c se obtuvieron a 20-24 g y se alojaron en condiciones estándar durante una semana antes de comenzar el experimento.
Según datos publicados recientemente (Lee, Wang et al. 2011), Diabetes mellitus tipo 1 (en forma abreviada DM1) fue inducida por una primera inyección de estreptozotocina (en forma abreviada STZ) (100 mg/kg de peso corporal) tres semanas antes del día de la prueba y una segunda inyección (80 mg/kg de peso corporal) dos semanas antes del experimento. Para verificar los niveles de glucosa que alcanza el fenotipo de la diabetes tipo 1 y el peso corporal se midieron un día antes de la prueba a la tolerancia a la glucosa intraperitoneal (en forma abreviada ipGTT). Los animales con pérdida de peso >25% comparado con el peso inicial de los animales con los niveles de glucosa en la sangre en ayunas debajo de 200mg/dL o arriba de 500mg/dL fueron excluidos En el dia experimental, se realizaron los siguientes procedimientos: Los ratones se mantuvieron en ayunas durante 2.5 horas antes del comienzo (tiempo: -95 minutos) del experimento.
Hora:_ Acción -95 Min: determinación de glucosa plasmática basal -90 Min: i.p.inyección de NOX-G15 (1 mg/kg y 10 mg/kg) o el antagonista del receptor de glucagón des-His1-Glu9glucagón (2 mg/kg y 4 mg/kg) o portador (H2O para inyección). 5 min: determinación de glucosa en sangre O min: i.p.inyección de glucosa (2 g/kg) 20 min: determinación de glucosa en la sangre 40 min: determinación de glucosa en la sangre 70 min: determinación de glucosa en la sangre 100 min determinación de glucosa en sangre Resultados Los ratones tratados con STZ presentados con un fuerte nivel de glucosa basal elevado entre 300 y 400 mg/dL después del intervalo de 2.5 horas de ayuno. 20 minutos después de i.p. inyección de glucosa los niveles de glucosa alcanzaron su punto máximo más alto en el grupo tratado con portador. El antagonista del receptor peptidico que se utilizó como control positivo (Dallas-Yang, Shen et al., 2004) mostró una calda en la concentración de glucosa en el grupo de dosis alta antes de la exposición a la glucosa. Ambos grupos alcanzaron su punto máximo más bajo que el grupo de portador. Ambos grupos de dosis Spiegelmer también tenían una concentración de glucosa en el pico más bajo que el portador. Los efectos descritos anteriormente también resultaron en un área significativamente menor bajo la curva para la glucosa en sangre con el paso del tiempo en los grupos tratados con Spiegelmer (en forma abreviada AUC) (Figura 23). 8.2 El efecto de spiegelmer NOX-G15 que une glucagón en la tolerancia de la glucosa en un experimento con animales de diabetes mellitus tipo 2 Para imitar la fase tardía de Diabetes mellitus tipo 2 (en forma abreviada DM2) los síntomas observados en los humanos, los ratones obesos inducidos por la dieta pueden ser tratados con dosis bajas de estreptozotocina (Luo, Quan et al.1998; Strowski, Li et al.2004).
Métodos Los ratones macho BALB/c se obtuvieron a 20-24 g. La resistencia a la insulina inducida de 10 semanas de dieta rica en grasas (en forma abreviada HFD) de alimentación. Además después de 8 semanas de HFD una dosis de STZ (100 mg/kg de peso corporal) se administró para inducir el fracaso parcial de la b-célula que imita la fisiología DM2 en etapa tardía (Baribault 2010). La Diabetes fue confirmada por la medición de los niveles de glucosa en sangre en ayunas y el peso corporal. Se excluyeron los ratones con la glucosa en sangre por debajo de 200 mg/dL o superiores a 300 mg/dL. Así mismo, se excluyeron los ratones que no tienen un perfil de peso estable antes y 1 semana después de la inyección de estreptozotocina a pesar de la DFH.
En el día experimental, se realizaron los siguientes procedimientos: Los ratones se mantuvieron en ayunas durante 2.5 horas antes del comienzo (tiempo: -120 min) del experimento.
Hora: Acción - 120 min: determinación de la glucemia basal -90 Min i.p. inyección de NOX-G15 (1 mg/kg y 10 mg/kg) 0 el antagonista del receptor de glucagón des-His'-Gh al glucagón (4 mg / kg) o portador (H2O para inyección). - 5 min: determinación de glucosa en sangre 0 min: i.p. inyección de glucosa (2 g/kg) 20 min: determinación de glucosa en la sangre 40 min: determinación de glucosa en la sangre 70 min: determinación de glucosa en la sangre 100 min: determinación de glucosa en sangre 120 min: determinación de glucosa en sangre Resultados Los ratones DM2 presentados con un elevado nivel de glucosa basal de 170 mg/dL después del intervalo de 2.5 horas de ayuno.40 minutos después de la i.p. inyección de glucossa los niveles de glucosa alcanzaron su punto máximo más alto en el grupo tratado con portador. El antagonista del receptor peptidico utilizado como control positivo (Dallas-Yang, Shen et al.2004) mostró una concentración de glucosa ligeramente inferior y mostró una normalización más rápida. Ambos grupos de dosis Spiegelmer tenían una concentración de glucosa de pico inferior y una normalización más rápido gue el portador y el antagonista del receptor de glucagón.
Los efectos descritos anteriormente también resultaron en un área significativamente menor bajo la curva (en forma abreviada AUC) para la glucosa en la sangre con el paso del tiempo en los grupos tratados con Spiegelmer (ver Figura 24). 8.3 El efecto de spiegelmer NOX-G16 en la tolerancia a la glucosa en un experimento con animales de diabetes mellitus tipo 1 Métodos Los ratones macho BALB/c se obtuvieron a 20-24 g y se alojaron en condiciones estándar durante una semana antes de comenzar el experimento.
Según datos publicados recientemente (Lee, Wang et al. 201 1), la Diabetes mellitus tipo 1 (en forma abreviada DM1) fue inducida por una primera inyección de estreptozotocina (en forma abreviada STZ) (100 mg/kg de peso corporal) tres semanas antes del dia de la prueba y una segunda inyección (80 mg/kg de peso corporal) dos semanas antes del experimento. Con el fin de verificar los niveles de glucosa en ayunas alcanzados por el fenotipo de la diabetes tipo 1 y el peso corporal se midieron un dia antes de la prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (en forma abreviada ipGTT). Se excluyeron los animales con una pérdida de peso >25% en comparación con el peso corporal inicial y los animales con los niveles de glucosa en sangre en ayunas por debajo de 200 mg/dL o superiores a 500 mg/dl.
Había 20 ratones por grupo de tratamiento.
En el día del experimento, se realizaron los siguientes procedimientos: Hora: Acción 480 min. la eliminación de alimentos -125 Min: determinación de la glucemia basal -120 Min: i.p. inyección de NOX-G16 (0.1 mg/kg y 1 mg/kg) o portador (0.9% de solución salina) - 5 min: determinación de glucosa en sangre (efecto de sólo Spiegelmer) 0 min: i.p. inyección de glucosa (2 g/kg) 15 min: determinación de glucosa en la sangre 30 min: determinación de glucosa en la sangre 45 min: determinación de glucosa en la sangre 60 min: determinación de glucosa en la sangre 90 min: determinación de glucosa en la sangre El tratamiento se realiza una vez al día durante nueve dias a las 9 am ipGTT se hizo en los dias 1, 3 y 7 Resultados Los ratones tratados con STZ presentados con un nivel de la glucosa basal elevado fuertemente entre 300 y 400 mg/dL después del intervalo de ayuno de 2 horas.20 minutos después de los niveles de glucosa en la i.p. inyección de glucosa alcanzó su punto máximo más alto en el grupo tratado con portador. Ambos grupos de dosis Spiegelmer tenían una concentración de glucosa en el pico más bajo que el portador. Los efectos descritos anteriormente también resultaron en un área significativamente menor bajo la curva para la glucosa en la sangre con el tiempo en los grupos tratados con 1 mg/kg de Spiegelmer (en forma abreviada AUC) (Figura 27). Esto muestra que el efecto antidiabético de las dosis repetidas de NOX-G16 se puede mantener durante siete dias, mostrando que ningún negado efecto de Spiegelmer por arriba o bajo regulación de hormonas endocrinas u otras sustancias de señalización y sus receptores tiene lugar.
El dia 9 se administró NOX-G16 después de 4 h de ayuno. Después de 2 horas adicionales se extrajo sangre. Factor de crecimiento de fibroblastos de21 niveles (FGF-21) (los cuales se incrementan en la diabetes) se redujeron significativamente en ambos grupos de dosis Spiegelmer, proporcionando así evidencia de que la administración repetida de N0X-G16 puede tener un efecto beneficioso sobre el resultado a largo plazo de la enfermedad.
Referencias Los datos bibliográficos completos de los documentos citados en el presente documento son, si no se indica lo contrario, de la siguiente manera, por lo que la divulgación de dichas referencias que se incorporan en el presente documento por referencia.
Altschul S.F., Gish W., et al. (1990) Basic local alignment search tool. J Mol Biol.215(3):403-10.
Altschul S.F., Madden T.L., et al. (1997) Gapped BLAST y PSI- BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res.25(17):3389-402.
Amori, R. E., J. Lau, et al. (2007). "Efficacy y safety of incretin therapy in type 2 dia-betes: systematic review y meta-analysis. " JAMA 298(2): 194-206.
Asmar, M. (2011). "New physiological effects of the incretin hormones GLP-1 y GIP." Dan Med Bull 58(2): B4248. Baribault, H. (2010). "Mouse models of type II diabetes mellitus in drug discovery." Methods Mol Biol 602: 135- 55.
Brand, C. L., B. Rolin, et al. (1994). "Immunoneutralization of endogenous glucagon with monoclonal glucagon antibody normalizes hyperglycaemia in moderately streptozotocin- diabetic rats." Diabetologia 37(10): 985-93.
Conarello, S. L., G. Jiang, et al. (2007). "Glucagon receptor knockout mice are re-sistant to diet-induced obesity and streptozotocin-mediated beta cell loss and hyperglycaemia. " Diabetologia 50(1): 142-50.
Dallas-Yang, Q., X. Shen, et al. (2004). "Hepatic glucagon receptor binding y glucose-lowering in vivo by peptidyl and non-peptidyl glucagon receptor antagonists. " Eur J Pharmacol 501(1-3): 225-34.
Damha M.J. y Ogilvie K.K. (1993). "Oligoribonucleotide synthesis. The silyl-phosphoramidite method." Methods Mol Biol 20:81-114 EMA (2010) "European Medicines Agency recommends suspensión of Avandia, Avandamet and Avaglim; Anti-diabetes medication to be taken off the market." Press Release Volumen, 2 DOI: FDA (2011) "FDA Drug Safety Communication: Updated Risk Evaluation y Mitiga-tion Strategy (REMS) to Restrict Access to Rosiglitazone-containing Medicines including Avandia, Avandamet, y Avandary." Safety Announcement Volume, DOI: Gin, H. y V. Rigalleau (2000). "Post-prandial hyperglycemia. post-prandial hyperglycemia y diabetes." Diabetes Metab 26(4): 265-72.
Griffing, G.T., Odeke, S., et al. "Hyperglucagonemia" http://emedicine.medscape.com/article/121575-overview Irwin, N. y P. R. Flatt (2009). "Evidence for beneficial effects of compromised gastric inhibitory polypeptide action in obesity-related diabetes y possible therapeutic implications. " Diabetologia 52(9): 1724-31.
Jiang, G. y B. B. Zhang (2003). "Glucagon y regulation of glucose metabolism." Am J Physiol Endocrinol Metab 284(4): E671-8.
Klussmann S. (2006). The Aptamer Handbook - Functional Oligonucleotides y their Applications. Edited by S. Klussmann. WILEY-VCH, Weinheim, Germany, ISBN 3-527- 31059-2 Kusser W. (2000) Chemically modified nucleic acid aptamers for in vitro selections: evolving evolution. J Biotechnol 74(1): 27-38.
Lee, Y., M. Y. Wang, et al. (2011). "Glucagon receptor knockout prevents insulin-deficient type 1 diabetes in mice. " Diabetes 60(2): 391-7.
Liang, Y., M. C. Osborne, et al. (2004). "Reduction in glucagon receptor expression by an antisense oligonucleotide ameliorates diabetic syndrome in db/db ice." Diabetes 53(2): 410-7.
Luo, J. J. Quan, et al. (1998). "Nongenetic mouse odels of non-insulin-dependent diabetes mellitus." Metabolism 47(6): 663-8.
Mairal T., Ozalp V.C., Lozano Sánchez P., et al. (2008) Aptamers: molecular tools for analytical applications.
Anal Bioanal Chem.390(4):989-1007 McClean, P. L., N. Irwin, et al. (2007). "GIP receptor antagonism reverses obesity, in-sulin resistance, y associated metabolic disturbances induced in mice by prolonged consumption of high-fat diet." Am J Physiol Endocrinol Metab 293(6): E1746-55.
McGinnis S., Madden T.L. et al. (2004) BLAST: at the core of a powerful y diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res.32(Web Server issue):W20-5.
Miyawaki, K., Y. Yamada, et al. (1999). "Glucose intolerance caused by a defect in the entero-insular axis: a study in gastric inhibitory polypeptide receptor knockout mice." Proc Nati Acad Sci EE.UU.96(26): 14843-7.
Miyawaki, K., Y. Yamada, et al. (2002). "Inhibition of gastric inhibitory polypeptide sig-naling prevents obesity." Nat Med 8(7): 738-42.
Needleman y Wunsch (1970) A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J Mol Biol.48(3):443-53.
Nissen, S. E. y K. Wolski (2007). "Effect of rosiglitazone on the risk of myocardial infarction y death from cardiovascular causes." N Engl J Med 356(24): 2457-71.
Ohneda, A., K. Watanabe, et al. (1978). "Abnormal response of pancreatic glucagon to glycemic changes in diabetes mellitus." J Clin Endocrinol Metab 46(3): 504-10.
Pearson y Lipman (1988) Improved tools for biological sequence comparison. Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 85: 2444 Petersen, K. F. y J. T. Sullivan (2001). "Effects of a novel glucagon receptor antag-onist (Bay 27-9955) on glucagon- stimulated glucose production in humans. " Diabetologia 44(11): 2018-24.
Smith y Waterman (1981), Adv. Appl. Math.2: 482 Sorensen, H., C. L. Brand, et al. (2006).
"Immunoneutralization of endogenous gluca-gon reduces hepatic glucose output y improves long-term glycemic control in diabetic ob/ob mice." Diabetes 55(10): 2843- 8.
Sorensen, H., M. S. Winzell, et al. (2006). "Glucagon receptor knockout mice display increased insulin sensitivity y impaired beta-cell function." Diabetes 55(12): 3463-9.
Strowski, M. Z., Z. Li, et al. (2004). "Small-molecule insulin mimetic reduces hypergly-cemia y obesity in a nongenetic mouse model of type 2 diabetes." Endocri- nology 145(11): 5259-68.
Venkatesan N., Kim S.J., et al. (2003) Novel phosphoramidite building blocks in synthesis y applications toward modified oligonucleotides. Curr Med Chem 10(19): 1973- 91.
Wahid M., Naveed, A.K., et al. (2007) "Hyperglucagonemia - a potent threat which can worsen the diabetes mellitus" Annals of Ring Edward Medical University Lahore Pakistán 13(4): 247-251.
Wincott F., DiRenzo A., et al. (1995) "Synthesis, deprotection, analysis y purification of RNA y ribozymes." Nucleic Acids Res.23(14):2677-84.
Las características de la presente invención divulgadas en la especificación, las reivindicaciones y/o los dibujos pueden ser separados y en una combinación de los mismos puede ser material para realizar la invención en diversas fomas del mismo.

Claims (28)

Reivindicaciones
1. Una molécula de ácido L-nucleico capaz de unirse a un glucagón, en donde la molécula de ácido L-nucleico es seleccionada del grupo que comprende una molécula de ádico L-nucleico de tipo A una molécula de ácido L-nucleico de tipo B y una molécula de ácido L-nucleico de tipo C, en donde:1a molécla de ácido L-nucleico de tipo A comprende un tramo central de nucleótidos, en donde el trao central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos de 5' BniAAATGn2GAn3n4GCTAKGn5GGn6n7GGAATCTRRR 3 [SEQ ID NO: 173], en donde ni es G o rG, n2 es G o rG, n3 es G o rG, n4 es G o rG, ns es Y o rT, n¾ es A o rA, n7 es A o rA, y en donde cualquiera de G, A, T, C, B, K, Y y R es un 2'-desoxirribonucleótidos, y cualquiera de rG, rA y rT es un ribonucleótido. Y La molécula de ácido L-nucleico de tipo B comprende un tramo central de 29 a 32 nucleótidos, en donde el tramo central de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos seleccionados de un grupo de 5'-AKGARniKGTTGSYAWAn2RTTCGn3TTGGAn4TCn5-'3 [SEQ ID NO: 197], 5'-AGAAGGTTGGTAAGTTTCGGTTGGATCTG-'3 [SEQ ID NO: 198], 5'-AGAAGGTCGGTAAGTTTCGGTAGGATCTG-'3 [SEQ ID NO: 199], 5'-AGGAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCA-'3 [SEQ ID NO: 200], 5'-AGGAAAGGTTGGTAAGGTTCGGTTGGATTCA-'3 [SEQ ID NO: 201] y 5'-AGGAAGGTTGGTAAGGTTCGGTTGGATTCA-'3 [SEQ ID NO: 202], en donde n es A o rA, n2 es G o rG, n3 es G o rG, n4 es T o rü, ns es A o rA, y en donde cualquiera de G, A, T, C, K, Y, S, W y R es un 2'-desoxirribonucleótido , y cualquiera de rG, rA y rU es un ribonucleótido y la molécula de ácido L-nucleico de tipo comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 97 y SEQ ID NO: 102 , o en donde la molécula de ácido L-nucleico de tipo C tiene una identidad de al menos 85% a una molécula de ácido L-nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos del grupo de SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 97 y SEQ ID NO: 102, o en donde la molécula de ácido L-nucleico de tipo C es homologa a una molécula de ácido L-nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionados de un grupo de SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 97 y SEQ ID NO: 102 en donde la homología es de al menos 85%.
2. La molécula de ácido L-nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido L-nucleótido de tipo A consiste de 2'desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos.
3. La molécula de ácido L-nucleico de conformidad con la reivindicación 1 a 2, caracterizado porque el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido L-nucleico de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos del grupo de 5 GrGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 179], 5' GGAAATGrGGAGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 180], 5' GGAAATGGGArGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 181], 5' GGAAATGGGAGrGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 182], 5' GGAAATGGGAGGGCTAGGTGGrAAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 183], 5' GGAAATGGGAGGGCTAGGTGGArAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO: 184]; 5' GGAAATGrGGAGGGCTAGGTGGrAAGGAATCTGAG 2 ' [SEQ ID NO: 185], 5' GGAAATGGGAGGGCTAGGTGGrArAGGAATCTGAG 2 ' [SEQ ID NO: 186], 5' GGAAATGrGGAGGGCTAGGTGGrArAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO 187], 5 GGAAATGGGArGGGCTAGGTGGrArAGGAATCTGAG 3' [SEQ ID NO 188] 5' GrGAAATGrGGArGGGCTAGGTGGrArAGGAATCTGAG 3 ' [SEQ ID NO : 189] , 5' GrGAAATGrGGArGrGGCTAGGTGGrArAGGAATCTGAG 3'[SEQ ID NO: 190] y 5' GrGAAATGrGGArGrGGCTAGGrTGGrArAGGAATCTGAG 3'[SEQ ID NO: 191], en donde cualquiera de G, A, T y C es un 2 ' -desoxirribonucleótido , y cualquiera de rG, rA y rT es un ribonucleótido .
4. La molécula de ácido L-nucleico de conformidad con la reivindicación 1 a 3, caracterizado porque el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido L-nucleico tipo A consiste de 2 ' -desoxirribonucleótidos.
5. La molécula de ácido L-nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la molécula de ácido L-nucleico de tipo A comprende en la dirección 5'->3' a) un primer tramo terminal de nucleótidos, el tramo central de nucleótidos y un segundo tramo terminal de nucleótidos o b) Un segundo tramo teerminal de nucleótidos, el tramo central de nucleótidos y un primer tramo terminal de nucleótidos, en donde el primer tramo terminal de nucleótidos comprende de uno a siete nucleótidos, y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende de uno a siete nucleótidos.
6. La molécula de ácido L-nucleico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido L-nucleico de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos de 5' ZiZ2Z3Z4Z5Z6V 3' y un segundo tramo terminal nucleótidos de la molécula de ácido L-nucleico de tipo A comprende una secuencia de 5' BZ7Z8Z9Z10Z11Z12 3' , En donde Zi es G o ausente, Z2 es S o ausente, Z3 es V o ausente, Z4 es B o ausente, Z5 es B o ausente, Z6 es V o ausente, Z7 es B o ausente, Z8 es V o ausente, Zg es V o ausente, Zi0 es B o ausente, Zn es S o ausente, y Zi2 es C o ausente.
7. La molécula de ácido L-nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4 a 6, caracterizado porque la molécula de ácido L-nucleico de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, o en donde la molécula de ácido L-nucleico de tipo A tiene una identidad de al menos 85% a una molécula de ácido L-nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, o en donde la molécula de ácido L-nucleico de tipo A es homologa a una molécula de ácido L-nucleico que comprende una secuencia seleccionada del grupo SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, en donde la homología es de al menos 85%.
8. La molécula de ácido L-nucleico de tipo A de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 5 a 6, caracterizado porque la molécula de ácido L-nucleico de tipo A comprende una secuencia de nucleótidos seleccionado del grupo de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 158 y SEQ ID NO: 159, o en donde la molécula de ácido L-nucleico de tipo A tiene una identidad de al menos 85% a una molécula de ácido L-nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 158 y SEQ ID NO: 159, o en donde la molécula de ácido L-nucleico de tipo A es homologa a una molécula de ácido L-nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 158 y SEQ ID NO: 159, en donde la homología es de la menos 85%.
9. La molécula de ácido L-nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido L-nucleico de tipo B consiste de 2'-desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos.
10. La molécula de ácido L-nucleico de conformidad con las reivindicaciones 1 y 9, caracterizado porque el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido L-nucleico de tipo B comprende una secuencia seleccionada del grupo de 5' AGGAArAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCA 3' [SEQ ID NO: 204], 5' AGGAAAGGTTGGTAAArGGTTCGGTTGGATTCA 3' [SEQ ID NO: 205], 5' AGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGArUTCA 3' [SEQ ID NO: 206], 5' AGGAArAGGTTGGTAAArGGTTCGGTTGGATTCA 3' [SEQ ID NO: 207], 5' AGGAArAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGArUTCG 3' [SEQ ID NO: 208], 5' AGGAArAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGArUTCA 3' [SEQ ID NO: 209], 5' AGGAArAGGTTGGTAAArGGTTCGGTTGGArUTCA 3' [SEQ ID NO: 210] y 5' AGGAArAGGTTGGTAAArGGTTCGrGTTGGArUTCrA 3'[SEQ ID NO: 211], en donde cualquiera de G, A, T, y C es un 2'-desoxirribonucleótido , y cualquiera de rG, rA y rU es un ribonucleótido .
11. La molécula de ácido L-nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tramo central de nucleótidos de la molécula de ácido L-nucleico de tipo B consiste de 2'-desoxirribonucleótidos.
12. La molécula de ácido L-nucleico de conformidad con las reivindicaciones 1 y 9 a 11, caracterizado porque la molécula de ácido L-nucleico de tipo B comprende en la dirección 5'->3' a) un primer tramo tereminal de nucleótidos, el tramo central de nucleótidos y un segundo tramo terminal de nucleótidos o b) un segundo tramo terminal de nucleótidos, el tramo central de nucleótidos y un primer tramo terminal de nucleótidos, en donde el primer tramo terminal de nucleótidos comprende de tres a nueve nucleótidos, y el segundo tramo terminal de nucleótidos comprende de tres a diez nucleótidos.
13. La molécula de ácido L-nucleico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el primer tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido L-nucleico de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5' Z1Z2Z3Z4Z5Z6SAK 3' y un segundo tramo terminal de nucleótidos de la molécula de ácido L-nucleico de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos de 5' CKVZ7Z8Z9Z10H 123', en donde Zi es C o ausente, Z2 es G o ausente, Z3 es R o ausente, Z4 es B o ausente, Z5 es B o ausente, Zb es S o ausente, Z7 es S o ausente, Zs es V o ausente, Zg es V o ausente, Zi0 es K o ausente, Zn es M o ausente, y Zi2es S o ausente.
14. La molécula de ácido L-nucleico de conformidad con las reivindicaciones 1,9,10,12 y 13, caracterizado porque la molécula de ácido L-nucleico de tipo B comprende una secuencia de nucleótidos seleccionados del grupo de SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 155, o en donde la molécula de ácido L-nucleico de tipo B tienen una identidad de al menos 85% a una molécula de ácido L-nucleico comprende una secuencia de nulceótidos seleccionados del grupo de SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 155, o en donde la molécula de ácido L-nucleico de tipo B es homologa a una molécula de ácido L-nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 155, en donde la homología es de al menos
15. La molécula de ácido L-nucleico de conformidad con las reivindicaciones 1, 11 a 13, caracterizado porque la molécula de ácido L-nucleico de tipo B comprende una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 156 y SEQ ID NO: 157, o en donde la molécula de ácido L-nucleico tipo B tienen una identidad de al menos 85% a una molécula de ácido L-nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 156 y SEQ ID NO: 157, o en donde la molécula de ácido L-nucleico tipo B es homologa a una molécula de ácido L-nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 156 y SEQ ID NO: 157, en donde la homología es de al menos 85%.
16. La molécula de ácido L-nucleico de conformidad con las reivindicacionesl a 15, caracterizado porque la molécula de ácido L-nucleico es un antagonista de una actividad mediada por glucagón.
17. La molécula de ácido L-nucleico de conformidad con las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque La molécula de ácido L-nucleico comprende un grupo de modificación, en donde el índice de excreción de la molécula de ácido L-nucleico que comprende un grupo de modificación de un animal o un cuerpo humano disminuye comparado a una molécula de ácido L-nucleico que no comprende el grupo de modificación.
18. La molécula de ácido L-nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque la molécula de ácido L-nucleico comprende un grupo de modificación que tiene un aumento en la retención de tiempo en un animal o cuerpo humano en comparación con unna molécula de ácido L-nucleico que no comprende un grupo de modificación.
19. La molécula de ácido L-nucleico de conformidad con las reivindicaciones 17 y 18, caracterizado porque el grupo de modificación es seleccionado del grupo que comprende modificaciones biodegradables y no biodegradables, preferiblemente el grupo de modificación es seleccionado del grupo que comprende glicol polietileno, glicol polietileno lineal, glicol polietileno ramificado, hidroxietil almidón, un péptido, una proteina, un polisacárido, un esterol, un polioxipropileno, polioxiamidato y poli(2-hidroxietil)-L-glutamina.
20. La molécula de ácido L-nucleico de conformidad con las reivindicaciones 1 a 19 para el uso en un método para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad o transtorno de la hiperglucemia,caracterizado porque preferiblemente la enfermedad o transtorno es seleccionado del grupo que comprende diabetes, complicaciones diabéticas y la condición diabética.
21. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido L-nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 y opcionalmente un constituyente adicional, en donde el constituyente adicional es seleccionado del grupo que comprende excipientes aceptados farmacéuticamente, portadores aceptados farmacéuticamente y egentes activos aceptados farmacéuticamente.
22. El uso de la molécula de ácido L-nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 para la fabricación de un medicamento, caracterizado porque preferiblemente el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o transtorno o hiper glucemia, en donde la enfermedad o transtorno es seleccionado del grupo que comprende diabetes, complicaciones diabéticas y condición diábetica.
23. El uso de la molécula de ácido L-nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 para la fabricación de un medio de diagnóstico.
24. Un complejo que comprende una molécula de ácido L-nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 y glucagón y/o GIP, caracterizado porque preferiblemente el complejo es un complejo cristalino
25. el uso de una molécula de ácido L-nucleico de conformidad con cualquieraq de las reivindicaciones 1 a 19 para la detección de glucagón y/o GIP.
26. un método para el cribado de un antagonista de una actividad mediada por glucagón y/o GIP que comprende los siguientes etapas: proveer un candidato antagonista de la actividad mediada por glucagón y/o GIP, proveer una molécula de ácido L-nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, proveer un sistema de prueba el cual provee una señal enn la presencia de un antagonista de una actividad mediada por glucagón y/o GIP, y determinar si el candidato antagonista de la actividad mediada por glucagón y/o GIP es un antagonista de la actividad mediada por glucagón y/o GIP
27. Un equipo para la detección de glucagón que comprende una molécula de ácido L-nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
28. Un método para la detección de un ácido nucleico en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 en una muestra, caracterizado porque el método comprende las etapas de: a) Proveer una sonda de captura, en donde la sonda de captura es al menos parcialmente complementaria a la primera parte de la molécula de ácido L-nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, y una sonda de detección, en donde la sonda de detección es al menos parcialmente complementaria a una segunda parte de la molécula de ácido L-nucleico com se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, o alternativamente la sonda de captura es al menos parcialmente complementaria a la segunda parte de la molécula de ácido L-nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 y la sonda de detección es al menos parcialmente complementaria a la primera parte de la molécula de ácido L-nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19. b) añadiendo la sonda de captura y la sonda de detección por separado o combinado a una muestra que contenga la molécula de ácido L-nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 o presumen contener la molécula de ácido L-nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19; c) permitiendo que la sonda de captura y la sonda de detección reaccione ya sea simultáneamente o en cualquier orden secuencial con la molécula de ácido L-nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 o una parte de las mismas; d) opcionalmente detectando ya sea que la sonda de captura o no sea hibridizada a la molécula de ácido L-nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 proporcionadas en la etapa a); y e) detectar el complejo formado en la etapa c) que consiste de la moléculad e ácido L-nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 y la sonda de captura y la sonda de detección.
MX2014004658A 2011-10-21 2012-10-22 Ácidos nucleícos que unen glucagón. MX2014004658A (es)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11008473 2011-10-21
EP11008467 2011-10-21
PCT/EP2012/000089 WO2012095303A1 (en) 2011-01-10 2012-01-10 Nucleic acid molecule having binding affinity to a target molecule and a method for generating the same
EP12000107 2012-01-10
PCT/EP2012/004421 WO2013056852A1 (en) 2011-10-21 2012-10-22 Glucagon binding nucleic acids

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MX2014004658A true MX2014004658A (es) 2015-08-13

Family

ID=48140366

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2014004658A MX2014004658A (es) 2011-10-21 2012-10-22 Ácidos nucleícos que unen glucagón.

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20150232852A1 (es)
EP (1) EP2768960A1 (es)
JP (1) JP2014533098A (es)
KR (1) KR20140083039A (es)
CN (1) CN103958682A (es)
AU (1) AU2012325233A1 (es)
BR (1) BR112014009104A2 (es)
CA (1) CA2852802A1 (es)
IL (1) IL231980A0 (es)
MX (1) MX2014004658A (es)
SG (1) SG11201401362TA (es)
WO (1) WO2013056852A1 (es)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102034203B1 (ko) 2012-01-10 2019-10-18 아프타리온 바이오테크 아게 새로운 C5a 결합 핵산
CN103343126B (zh) * 2013-07-19 2015-12-02 暨南大学 莱克多巴胺适配体与检测莱克多巴胺的适配体电化学生物传感器
EP3102243A1 (en) * 2014-02-03 2016-12-14 Noxxon Pharma AG Methods for the preparation of a polyalkoxylated nucleic acid molecule
ES2607639B1 (es) * 2015-09-30 2018-02-28 Urquima, S.A Sal de ácido maleico de un intermedio de silodosina
WO2017062693A1 (en) * 2015-10-07 2017-04-13 Remd Biotherapeutics, Inc. Methods for treating rare genetic disorders using glucagon receptor antagonistic antibodies
DE17829597T1 (de) 2016-11-30 2019-12-05 Noxxon Pharma Ag Verfahren zur polyalkoxylierung von nukleinsäuren zur rückgewinnung und wiederverwendung einer überschüssigen polyalkoxylierungsreagenz
JP7418788B2 (ja) * 2019-10-16 2024-01-22 国立研究開発法人産業技術総合研究所 グルカゴン認識ペプチド並びにグルカゴン検出法

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6011020A (en) 1990-06-11 2000-01-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US6395029B1 (en) 1999-01-19 2002-05-28 The Children's Hospital Of Philadelphia Sustained delivery of polyionic bioactive agents
US6677136B2 (en) * 2000-05-03 2004-01-13 Amgen Inc. Glucagon antagonists
US6652886B2 (en) 2001-02-16 2003-11-25 Expression Genetics Biodegradable cationic copolymers of poly (alkylenimine) and poly (ethylene glycol) for the delivery of bioactive agents
DK1438321T5 (da) 2001-10-26 2011-02-21 Noxxon Pharma Ag Modificeret L-nukleinsyre
EP1306382A1 (de) 2001-10-26 2003-05-02 Noxxon Pharma AG Modifizierte L-Nukleinsäure
AU2003219796A1 (en) 2002-02-20 2003-09-09 Beth Israel Deaconess Medical Center Conjugates comprising a biodegradable polymer and uses therefor
RU2394041C2 (ru) 2003-04-13 2010-07-10 Энзон Фармасьютикалз, Инк. Полимерные олигонуклеотидные пролекарства
GB0314472D0 (en) 2003-06-20 2003-07-23 Warwick Effect Polymers Ltd Polymer
EP1713509A2 (de) 2004-02-09 2006-10-25 Noxxon Pharma AG Verfahren zur herstellung von konjugaten aus polysacchariden und polynukleotiden
CA2786794C (en) 2004-03-23 2017-09-12 Complex Biosystems Gmbh Aromatic polymeric cascade prodrug linker reagent
CA2585664C (en) 2004-11-05 2014-05-20 The Children's Hospital Of Philadelphia Biodegradable linkers for molecular therapies
CA2607185A1 (en) * 2005-05-04 2006-11-09 Noxxon Pharma Ag Intracellular active agents
JP4706019B2 (ja) * 2005-07-08 2011-06-22 国立大学法人東京農工大学 アプタマーの同定方法
AU2007296054B2 (en) 2006-09-15 2013-03-28 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Hindered ester-based biodegradable linkers for oligonucleotide delivery
US20100062436A1 (en) 2006-10-31 2010-03-11 Noxxon Pharma Ag Methods for Detection of a Single- or Double-Stranded Nucleic Acid Molecule
JP2014504865A (ja) * 2011-01-10 2014-02-27 ノクソン ファーマ エージー 標的分子との結合親和性を有する核酸分子およびその生成方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20150232852A1 (en) 2015-08-20
WO2013056852A1 (en) 2013-04-25
AU2012325233A1 (en) 2014-04-24
AU2012325233A2 (en) 2014-04-24
CA2852802A1 (en) 2013-04-25
IL231980A0 (en) 2014-05-28
SG11201401362TA (en) 2014-05-29
EP2768960A1 (en) 2014-08-27
KR20140083039A (ko) 2014-07-03
JP2014533098A (ja) 2014-12-11
BR112014009104A2 (pt) 2017-04-18
CN103958682A (zh) 2014-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5308813B2 (ja) グレリン結合核酸
MX2014004658A (es) Ácidos nucleícos que unen glucagón.
JP4823067B2 (ja) 生物活性グレリンに特異的に結合する核酸
US20160257958A1 (en) Hepcidin Binding Nucleic Acids
US9163243B2 (en) Nucleic acids specifically binding CGRP
EP2663640A1 (en) Nucleic acid molecule having binding affinity to a target molecule and a method for generating the same
HK1117567A (en) Ghrelin binding nucleic acids
AU2012216540A1 (en) Ghrelin binding nucleic acids
HK1168126B (en) Hepcidin binding nucleic acids