MX2014004527A - Combinacion terapeutica para el tratamiento de cancer. - Google Patents

Abstract

Esta invención se relaciona a combinaciones terapéuticas que comprenden un agente antineoplástico a base de platino, como cisplatino y un extracto de especies del género Nerium oleander, así como también métodos de uso de las combinaciones para tratar sujetos, incluyendo humanos, que sufren de ciertos cánceres, como cáncer de próstata, melanoma, cáncer pancreático, cáncer pulmonar, cáncer de mama o cáncer colorrectal.

Description

COMBINACION TERAPEUTICA PARA EL TRATAMIENTO DE CANCER CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se relaciona a combinaciones terapéuticas que comprenden un agente antineoplástico a base de platino y un extracto de especies del género Nerium, asi como también métodos para usar las combinaciones para tratar pacientes que sufren de ciertos tipos de cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Debido a la necesidad continua para formas más efectivas para tratar cáncer, continúan siendo ejercidos grandes esfuerzos para desarrollar nuevos fármacos que son menos tóxicos para que sea tratado el paciente. Sin embargo, otro procedimiento es tratar de disminuir la toxicidad de fármacos anticáncer existentes por combinarlos con otros fármacos.

Los fármacos anticáncer a base de platino, como cisplatino, encuentran uso en quimioterapia de varios tipos de cáncer, pero su toxicidad permanece como problema serio. Adicionalmente, el surgimiento de resistencia a cisplatino en algunos tumores vicia su utilidad en dosis limitada a toxicidad. Para mitigar estas limitaciones, se usa comúnmente cisplatino en combinación con otros fármacos, como 5-fluorouracil , que ejerce sus efectos tóxicos en diferentes órganos que aquellos afectados por cisplatino.

Extractos de Nerium oleander comprenden varios Ref.:247955 polisacáridos y proteínas así como también dos glicósidos cardiacos tóxicos, oleandrina y oleandrigenina, que son conocidos para exhibir actividad anticáncer.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Una modalidad de la invención es una combinación terapéutica que comprende (I) un agente antineoplástico que comprende platino y (II) un extracto de especies del género Nerium.

Otra modalidad de la invención es la combinación terapéutica anterior, en donde (I) está presente en una cantidad que, en la ausencia de (II) , es efectiva para producir un incremento en actividad antineoplástica.

Otra modalidad de la invención es la combinación terapéutica anterior, en donde (I) está presente en una cantidad, en la ausencia de (II) , que es ineficaz para producir un incremento en actividad anti-neoplástica .

Otra modalidad de la invención es la combinación terapéutica anterior, en donde (I) es seleccionada del grupo que consiste de cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, satraplatino, picoplatino, nedaplatino, triplatino y fosfaplatinos .

Otra modalidad de la invención es la combinación terapéutica anterior, en donde (I) es cisplatino.

Otra modalidad de la invención es la combinación terapéutica anterior, en donde (II) es un extracto de especies seleccionadas del grupo que consiste de Nerium indicum, Nerium oleander y iVerium odorum.

Otra modalidad de la invención es la combinación terapéutica anterior, en donde (II) es un extracto de la especie Nerium oleander.

Otra modalidad de la invención es la combinación terapéutica anterior, en donde (II) es un extracto a base de agua.

Otra modalidad de la invención es la combinación terapéutica anterior, en donde (II) es un extracto a base de aloe.

Otra modalidad de la invención es la combinación terapéutica anterior, en donde (I) es cisplatino y (II) es un extracto de la especie Nerium oleander.

Otra modalidad de la invención es la combinación terapéutica anterior, en donde (I) y (II) están presentes como formulaciones separadas.

Aún otra modalidad de la invención es un método para tratar cáncer que comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una combinación terapéutica que comprende (I) un agente antineoplástico que comprende platino y (II) un extracto de una especie del género Nerium.

Otra modalidad de la invención es el método anterior, en donde (I) está presente en una cantidad que, en la ausencia de (II) , es ineficaz para producir un incremento en actividad anti-neoplástica .

Otra modalidad de la invención es el método anterior, en donde (I) es seleccionado del grupo que consiste de cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, satraplatino, picoplatino, nedaplatino, triplatino y fosfaplatinos .

Otra modalidad de la invención es el método anterior, en donde (I) es cisplatino.

Otra modalidad de la invención es el método anterior, en donde (II) es un extracto de una especie seleccionada del grupo que consiste de Nerium indicum, Nerium oleander y Nerium odorum.

Otra modalidad de la invención es el método anterior, en donde (II) es un extracto de la especie Nerium oleander.

Otra modalidad de la invención es el método anterior, en donde (II) es un extracto a base de agua.

Otra modalidad de la invención es el método anterior, en donde (II) es un extracto a base de aloe.

Otra modalidad de la invención es el método anterior, en donde (I) es cisplatino y (II) es un extracto de la especie Nerium oleander.

Otra modalidad de la invención es el método anterior, en donde (I) y (II) de la combinación terapéutica son administrados al paciente simultánea, separada o secuencialmente.

Otra modalidad de la invención es el método anterior, en donde (II) es administrado al paciente intramuscular, sublingual o intramuscular y sublingüalmente .

Otra modalidad de la invención es el método anterior, en donde (II) es administrado al paciente sublingüalmente en dos o más dosis.

Otra modalidad de la invención es el método anterior, en donde el cáncer tratado es cáncer de próstata, melanoma, cáncer pancreático, cáncer pulmonar, cáncer de mama o cáncer colorrectal .

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 representa una gráfica de la reducción relativa en células de la línea celular de cáncer de próstata LNCaP en la presencia de Anvirzel™, cisplatino y combinación de dos .

La Figura 2 representa una gráfica de la reducción relativa en células de la línea celular de cáncer de melanoma A375 en la presencia de Anvirzel™, cisplatino y una combinación de los dos.

La Figura 3 representa una gráfica de la reducción relativa en células de la línea celular de cáncer pancreático PA C-1 en la presencia de Anvirzel™ y una combinación de los dos .

La Figura 4 representa una gráfica de la reducción relativa en células de línea celular de cáncer pulmonar COL0699N en la presencia de Anvirzel™, cisplatino y una combinación de los dos.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Se ha encontrado sorpresivamente que combinaciones de un agente antineoplástico que comprende platino y un extracto de una especie del género Nerium exhiben sinergísticamente actividad antineoplástica incrementada. Como resultado, dosis de otra forma ineficaces pero bien toleradas de los agentes antineoplásticos a base de platino cuando se combinan con dosis del extracto que carece de eficacia por si mismo, ejercen eficacia antineoplástica clínicamente útil.

Las combinaciones terapéuticas de esta invención comprenden un agente antineoplástico que comprende platino y un extracto de una especie del género Nerium.

El agente antineoplástico usado en las combinaciones terapéuticas de esta invención puede ser cualquier agente anticáncer o antitumoral conocido o fármaco que contiene platino. Ejemplos no limitantes incluyen cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, satraplatino, picoplatino, nedaplatino, triplatino y fosfaplatinos , como aquellos descritos en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica NO. 8,034,964 y la cual se incorpora en la presente para referencia. Estos compuestos pueden ser preparados por métodos conocidos en la técnica. Preferentemente, el agente antineoplástico es cisplatino. El cisplatino es un complejo que contiene platino, soluble en agua, inorgánico divalente usado ampliamente para tratar cánceres testiculares , de vejiga y ovario.

Los agentes antineoplásticos en base a platino usados en las combinaciones terapéuticas de esta invención pueden ser combinados con cualquier excipiente, portador, adyuvante o diluyente conocido en la técnica aceptable farmacéuticamente.

El extracto usado en las combinaciones terapéuticas de esta invención puede ser derivado de cualesquiera especies del género Nerium. Ejemplos no limitantes incluyen extractos de las especies Nerium indicum, Nerium oleander y Nerium odorum. Preferentemente, el extracto es derivado de Nerium oleander .

Extractos de Nerium oleander pueden ser preparados por métodos conocidos en la técnica. Los métodos incluyen extracción con agua caliente (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 6,565,897 y 5,135,745), agua a temperatura ambiente y alcohol acuoso, particularmente metanol acuoso y etanol (Solicitud de patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 2007/0154573 Al) , bióxido de carbono supercrítico (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 7,402,325) y aloe (Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 2007/0154573 Al) . Estos métodos de extracción mencionados anteriormente descritos en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica No. 6,565,897, 5,135,745 y 7,402,325 y Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 2007/0154573 Al y 2010/0092585 Al son incorporados en la presente para referencia. Anvirzel™ es un extracto de agua caliente de Nerium oleander que contiene oleandrina y oleandrigenina como sus constituyentes principales.

Los extractos usados en las combinaciones de la invención pueden contener cualquier excipiente, portador, adjunto, o diluyente aceptable farmacéuticamente conocido en la técnica. Ejemplos incluyen manitol, ácido ascórbico, ascorbato de sodio, metilparabeno, propilparabeno, y mezclas de los mismos.

Preferentemente, la combinación terapéutica de la invención comprende cisplatino y un extracto de la especie Neriu oleander.

El agente antineoplástico que comprende platino y el extracto a partir de una especie del género Nerium puede estar presente en las combinaciones terapéuticas de la invención como ya sea formulaciones separadas o combinadas.

El método de esta invención para tratar cáncer comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una combinación terapéutica que comprende un agente antineoplástico que comprende platino y un extracto de una especie del género Nerium. Como se usa en la presente, el término "paciente" se refiere a un mamífero afligido con cáncer. El paciente preferido es un humano.

El agente antineoplástico que comprende platino puede estar presente en las combinaciones terapéuticas de la invención y usadas en el método de esta invención en una cantidad que, en la ausencia del extracto de una especie del género Nerium es ya sea efectivo o ineficaz para producir un incremento en actividad antineoplástica. Una cantidad o dosis que es "efectiva" es aquella la cual produce un efecto inhibidor de proliferación o crecimiento celular cancerígeno particular, efecto inhibidor de crecimiento tumoral, efecto inhibidor de incremento de volumen tumoral, o efecto de tratamiento de cáncer en una célula cancerosa o tumor.

El agente antineoplástico que comprende platino puede ser administrado al paciente por medio de cualquier modo conocido en la técnica, como intravenosamente en el caso de cisplatino, carboplatino y oxalplatino y oralmente en el caso de satraplatino . Una dosis típica de cisplatino para un adulto es 70-100 mg/m2 un día por tres días, seguido por dos semanas, que constituyen un ciclo. Los pacientes pueden recibir un máximo de seis ciclos de terapia, pero debido a problemas de toxicidad la mayoría de los pacientes puede solamente soportar cuatro ciclos de la terapia. Un adulto típico (170 cm de alto y que pesa 70 kg) , tiene 1.83 m2 (The Journal of pediatrics 1978 93:1:62-66, Gehan EA, George SL) , que corresponde a una dosis de aproximadamente 125-185 mg.

El extracto usado en este método puede ser administrado intramuscular, sublingüal o intramuscular y sublingüalmente, ya sea en una dosis sencilla o en múltiples dosis. La dosis normal para Anvirzel™ es 0.5 a 1.0 mi intramuscularmente , 1.0 a 2.0 mi sublingüalmente, o una combinación de administración intramuscular y sublingüal de tal forma que la cantidad total en un periodo de 24 horas no es mayor a 2 mi. Anvirzel™ administrado sublingüalmente solamente es dividido en una serie de subdosis más pequeñas, típicamente dos a cuatro dosis de 0.5 mi ó menos por 24 horas.

Como es común con agentes farmacéuticos, las dosis terapéuticas respectivas de los componentes de las combinaciones terapéuticas de la invención pueden variar con la condición de el paciente y la ruta por la cual se administra el fármaco. La dosis y quizás la frecuencia de dosis, variará también de acuerdo a la edad, peso corporal, y respuesta del paciente individual. Puede ser necesario usar dosis fuera de estos intervalos en algunos casos, como será aparente para aquellos expertos en la técnica. Además, se indica que el médico o médico que trata conocerá cómo y cuándo interrumpir, ajustar, o terminar terapia junto con respuesta de paciente individual . Los términos "cantidad terapéutica" y "cantidad efectiva terapéuticamente" son comprendidos por las cantidades de dosis descritas anteriormente y programas de frecuencia de dosis.

Las combinaciones terapéuticas de la invención pueden ser administradas al paciente simultánea, separada o secuencialmente .

Las combinaciones terapéuticas de la invención pueden ser usadas de acuerdo a este método para tratar cualquier tipo de cáncer. Ejemplos incluyen cáncer de próstata, melanoma, cáncer pancreático, cáncer pulmonar, cáncer de mama, y cáncer colorrectal .

Los siguientes ejemplos no limitantes demuestran el efecto citostático sinergístico de coadministración de un extracto de Nerium oleander con cisplatino.

Mientras que estos ejemplos muestran ciertas modalidades específicas de la invención, será manifestado para aquellos expertos en la técnica que varias modificaciones y redisposiciones de las partes pueden ser hechas sin alejarse del espíritu y alcance del concepto inventivo subyacente y que el mismo no es limitado a las formas particulares mostradas en la presente y descritas.

Ejemplos Ensayos De Viabilidad Se eligen tres diferentes ensayos de viabilidad para complementar entre si y producen resultados dependientes de la concentración y línea celular: el ensayo de tinte de metil tetrazolio, el ensayo de tinte fluorescente Sulforodamina B y el ensayo de tinte de cristal violeta.

El ensayo de tinte metil-tetrazolio mide la actividad de enzimas en mitocondria. El precursor de tinte es tomado por células, donde sufre reducción al púrpura formazan. Mide solamente la actividad mitocondrial y, de esta forma, no es siempre una indicación confiable de si las células por si mismas están vivas o muertas, ya que incluso una célula muerta recientemente tiene menor actividad enzimática en mitocondria. La concentración de glucosa intracelular , pH y ensayo antes de tiempo todos afectan las mediciones.

Los ensayos de sulforodamina B y cristal violeta proporcionan información acerca de la proteína y son usados para complementar el ensayo de tinte metil-tetrazolio . El ensayo de sulforodamina B es más sensible para la detección de número pequeño de células y muestra una relación lineal entre el número celular y su intensidad de tinción. Se usa para la cuantificación de proteínas celulares de células cultivadas. El ensayo que usa cristal violeta, un tinte que enlaza electrostáticamente a proteínas y tiñe ADN, proporciona un ensayo confiable, simple para medir viabilidad de células.

Los ensayos de metil-tetrazolio, sulforodamina B y cristal violeta son usados para evaluar viabilidades celulares. Los tiempos de incubación son 24 horas, 48 horas y 72 horas. El extracto de Werium oleander Anvirzel™ (un extracto en agua caliente de oleander obtenida de Salud Integral, Honduras) es probada en concentraciones en el intervalo de 0.01 ng/ml a 10 ng/ml. Se prueba el cisplatino (Sigma, P4394) en concentraciones en el intervalo de 0.1 µg/ml a 100 |jg/ml.

Las células se desunen por tripsinización (tripsina-0.25% de EDTA, invitrogen, 25200-072) durante la fase logarítmica de crecimiento de cultivo y colocan en placa en placas de 96 pozos (18,000 células/pozo) (Corning, Costar 359) en un volumen final de 200 µ? de medio por pozo. Después de 70 a 80% de confluencia del cultivo, el medio es removido y el Anvirzel™ diluido en agua y cisplatino diluido en N,N-dimetilformamida (Fluka 40255) son agregados a las células en densidades graduadas. La absorbancia es medida después de 24 horas, 48 horas, y 72 horas de incubación.

Para el ensayo de sulforodamina B, se fijan 96 placas de pozo por 10% de ácido tricloroacético (Fluka 91228) y se incuban en 4°C por 1 hora. Después de esto, se enjuagan las placas con agua y se tiñen las células con 0.4% de sulforodamina B (sigma 341738) , disuelto en 1% de ácido acético (Cario Ebra, 401422) por 15 minutos en temperatura ambiente (RT, por sus siglas en inglés) . La tinción no enlazada es lavada dos veces con 1% de ácido acético. Finalmente, se agrega 10 mM de amortiguador Tris pH 10.5 (Sigma, T6791) para disolver el tinte.

Para el ensayo de cristal violeta, el medio es removido de placas de 96 pozos, las placas son enjuagadas con PBS (sigma, P3813) y entonces se enjuagan las células por la adición de 10% de formalina (MERCK, 1.04003.2500) por 20 minutos en RT (siglas en inglés para temperatura ambiente) . Se remueve la formalina y 0.25% de cristal violeta acuosa (Sigma, HT901) , disuelto en agua, se agrega por 10 minutos en RT. Se enjuaga cristal violeta no enlazado por lavar con agua y finalmente 33% de ácido acético es agregado para disolver el tinte.

Para el ensayo de metil-tetrazolio, el tinte (Sigma, M2128; 5 mg/ml, diluido en solución salina amortiguada con fosfato) es agregado a cada pozo y se incuban las placas por 3 horas en 37°C. Después del final del periodo de incubación, se desecha el medio y se enjuagan las células con solución salina amortiguada con fosfato. Finalmente, se disuelven los cristales formazan en dimetilsulfóxido (Sigma, D4540) .

La densidad óptica de cada placa es medida en un espectrofotómetro µ?) y los datos son analizados con software Gen5 ^Quant Biomolecular Spectrophotometer MQX200 y Gen5™ Microplate Data Collection & Análisis software, BioTeck® Instruments. Inc, Abril de 2008). Se mide la absorbancia en 570 nm para todos los ensayos y se mide una segunda longitud de onda con el fin de substraer el ruido. Para el ensayo de metil-tetrazolio esta segunda longitud de onda es 630 nm y para el ensayo de sulforodamina B y cristal violeta es 690 nm.

Líneas Celulares Se obtienen las líneas celulares de carcinoma humano por European Collection of Cell Cultures from Health Protective Agency, UK e incluyen líneas derivadas de cáncer de próstata humano (PC3, LNCaP y 22Rvl) , cáncer de mamá humano (MDA-MB 231, T47D, MCF-7) , carcinoma pulmonar de célula no pequeña (CALU-1, COL0699N, COR-L-105), cáncer colorrectal (HCT-116, HT55, HCT-15) , melanoma (A375) y cáncer pancreático (PANC-1) .

Las células cultivadas en frascos de 75 cm2 (Orange Scientific, 5520200, Bélgica) en el medio indicado para cada línea con la cantidad apropiada de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS, Invitrogen, 10106-169, California) y 2 mM de L-glutamina (Sigma, G5792, Alemania) para cada línea celular e incubada en 37°C en un 5% de atmósfera de G¾ .

Análisis Estadístico Todos los tratamientos para cada línea celular son realizados por triplicado. La significancia estadística de todos los efectos es evaluada por "diferencia del medio" prueba (p<0.05) .

Las concentraciones de Anvirzel™ están en el intervalo de 0.01 ng/ml a 10 ng/ml, mientras que aquellas para cisplatino están en el intervalo de 0.1 µg/ml a 100 µg/ml. Sorpresivamente, concentraciones menores de tanto el Anvirzel™ (0.01 a 0.1 ng/ml) y el cisplatino (0.1 µg/ml) da mejores resultados que concentraciones superiores, lo cual produce resultados no confiables y no reproducibles . Los resultados son también dependientes a tiempo, como se observa después de 48 y 72 horas de incubación.

Ejemplo 1: Línea Celular LNCaP La tabla 1 posterior muestra resultados para células LNCaP, una línea celular derivada de cáncer prostático, con densidades de población celular, estimadas de datos de absorbancia óptica.

Por ensayo de cristal violeta, después de 48 horas de incubación, células no estimuladas muestran una absorbancia aparente de 1.307 (una cantidad menos dimensional) , con esencialmente el mismo volumen (1.249) obtenido en la presencia de 0.01 ng/ml de Anvirzel™. La presencia de 0.1 Ug/ml de cisplatino reduce la absorbancia aparente a 0 . 408 , pero la presencia de 0 . 01 de ng/ml de Anvirzel™ y 0 . 1 ?/t?? de cisplatino además reduce el valor a 0.178 (p=0.00008 < 0.05) . Una disminución similar en absorbancia aparente es encontrada después de 72 horas de incubación también .

Por ensayo de Sul f orodamina B , después de 48 horas de incubación, células no estimuladas muestran una absorbancia aparente de 2 . 616 con esencialmente el mismo valor ( 2 . 667 ) obtenido en la presencia de 0 . 01 ng/ml de Anvirzel™. La presencia de 0 . 1 g/ml de cisplatino reduce la absorbancia aparente a 1.681, pero la presencia de 0.01 ng/ml de anvirzel™ y 0. 1 fig/ml de cisplatino además reduce el valor a 1.033 (p=0.007<0.05) . Una disminución similar en absorbancia aparente es encontrada después de 72 horas de incubación también.

Por ensayo de metil-tetrazolio, después de 48 horas de incubación, las células no estimuladas muestran una absorbancia aparente de 0.429, con algo de valor menor (0.292) obtenido en la presencia de 0.01 ng/ml de Anvirzel™. La presencia de 0.1 |ig/ml de cisplatino reduce la absorbancia aparente a 0.161, pero la presencia de 0.01 ng/ml de anvirzel™ y 0. 1 |ig/ml de cisplatino además reduce el valor a 0.033 (p=0.005<0.05) . Una disminución similar en aparente absorbancia es encontrada después de 72 horas de incubación también .

Tabla 1. Evaluación estadística de absorbancia en línea lar de cáncer de próstata LNCaP.

Estos resultados en la Tabla 1 son representados gráficamente en la Figura 1.

Ejemplo 2; Línea Celular A375 La Tabla 2 posterior muestra resultados para células A375, una línea celular derivada de melanoma, con densidades de población celular estimadas de datos de absorbancia óptica .

Por ensayo de cristal violeta, después de 48 horas de incubación, células no estimuladas muestran una absorbancia aparente de 2.791, con esencialmente el mismo valor (2.71) obtenido en la presencia de 0.01 ng/ml de Anvirzel™. La presencia de 0.1 µg/ml de cisplatino reduce la absorbancia aparente a 1.304, pero la presencia de 0.01 ng/ml de Anvirzel™ y 0.1 µg/ml de cisplatino reduce el valor a 0.178 (p=0.00008<0.05) . Una disminución similar en absorbancia aparente es encontrada después de 72 horas de incubación también.

Por ensayo de sulforodamina B, después de 48 horas de incubación, células no estimuladas muestran una absorbancia aparente de 2.836, con esencialmente el mismo valor (2.854) obtenido en la presencia de 0.01 ng/ml de Anvirzel™. La presencia de 0.1 9/p?1 de cisplatino reduce la absorbancia aparente a 2.421, pero la presencia de 0.01 ng/ml de Anvirzel™ de y 0.1 µg/ml de cisplatino además reduce el valor a 1.89 (p=0.01<0.05 ) . una disminución similar en absorbancia aparente es encontrada después de 72 horas de incubación también.

Por ensayo de metil-tetrazolio, después de 48 horas de incubación, células no estimuladas muestran una absorbancia aparente de 0.45, con esencialmente el mismo valor (0.49) obtenido en la presencia de 0.01 ng/ml de Anvirzel™. La presencia de 0.1 g/ml de cisplatino reduce la absorbancia aparente a 0.332, pero la presencia de 0.01 ng/ml de Anvirzel™ y 0.1 µg/ml de cisplatino reduce el valor a 0.072 (p=0.002<0.05) . Una disminución similar en absorbancia aparente es encontrada después de 72 horas de incubación también.

Tabla 2. Evaluación estadística de absorbancia en línea celular de cáncer de melanoma A375.

Estos resultados en la Tabla 2 son representados gráficamente en la Figura 2.

Ejemplo 3; Línea Celular PANC-1 La tabla 3 posterior muestra resultados para células PANC-1, una línea celular derivada de cáncer pancreático, con densidades de población celular estimadas de los datos de absorbancia óptica.

Por ensayo de cristal violeta, después de 48 horas de incubación, las células no estimuladas muestran una absorbancia aparente de 0.964, con esencialmente el mismo valor (1.04) obtenido en la presencia de 0.01 ng/ml de Anvirzel™. La presencia de 0.1 µg/ml de cisplatino reduce la absorbancia aparente a 0.753, pero la presencia de 0.01 ng/ral de Anvirzel™ y 0.1 g/ml de cisplatino reduce el valor a 0.283 (p=0.01<0.05) . Una disminución similar en absorbancia aparente es encontrada después de 72 horas de incubación también.

Por ensayo de sulforodamina B, después de 48 horas de incubación, células no estimuladas muestran una absorbancia aparente de 2.332, con esencialmente el mismo valor (2.328) obtenida en la presencia de 0.01 ng/ml de Anvirzel™. La presencia de 0.1 g/ml de cisplatino reduce la absorbancia aparente a 1.861, pero la presencia de 0.01 ng/ml de Anvirzel™ y 0.1 g/ml de cisplatino además reduce el valor a 1.25 (p=0.002<0.05 ) . Una disminución similar en absorbancia aparente es encontrada después de 72 horas de incubación también.

Por ensayo de metil-tetrazolio, después de 48 horas de incubación, células no estimuladas muestran una absorbancia aparente de 0.546, con un valor similar (0.518) obtenido en la presencia de 0.01 ng/ml de Anvirzel™. La presencia de 0.1 µg/ml de cisplatino reduce la absorbancia aparente a 0.286, pero la presencia de 0.01 ng/ml de Anvirzel™ y 0.1 µg/ml de cisplatino reduce el valor a 0.143 (p=0.0007<0.05 ) . Una disminución similar en absorbancia aparente es encontrada después de 72 horas de incubación también.

Tabla 3 Evaluación estadística de absorbancia en línea lar de cáncer pancreático PANC-1.

Estos resultados en la tabla 3 son representados gráficamente en la Figura 3 Ejemplo 4: Línea Celular COL0699N La tabla 4 posterior muestra resultados para células COL0699N, una línea celular derivada de cáncer pulmonar, con densidades de población estimadas de datos de absorbancia óptica .

Por ensayo de cristal violeta, después de 48 horas de incubación, células no estimuladas muestran una absorbancia aparente de 0.918, con un valor similar (0.826) obtenido en la presencia de 0.01 ng/ml de Anvirzel™. La presencia de 0.1 µ9/p?1 de cisplatino reduce la absorbancia aparente ligeramente a 0.801, pero la presencia de 0.01 ng/ml de Anvirzel™ y 0.1 µg/ml de cisplatino reduce el valor a 0.361 (pOO.01 z0.05) . Una disminución similar en absorbancia aparente es encontrada después de 72 horas de incubación también.

Por ensayo de sulforodamina B, después de 48 horas de incubación, células no estimuladas muestran una absorbancia aparente de 2.636, con esencialmente el mismo valor (2.633) obtenido en la presencia de 0.01 ng/ml de Anvirzel™. La presencia de 0.1 µg/ml de cisplatino reduce la absorbancia aparente a 1.975, pero la presencia de 0.01 ng/ml de Anvirzel™ y 0.1 g/ml de cisplatino reduce además el valor a 1.046 (p=0.00001 <0.05) . Una disminución similar en absorbancia aparente es encontrada después de 72 horas de incubación también.

Por ensayo de metil-tetrazolio, después de 48 horas de incubación, células no estimuladas muestran una absorbancia aparente de 0.82, con algo de valor superior (0.953) obtenido en la presencia de 0.01 ng/ml de Anvirzel™. La presencia de 0.1 µg/ml de cisplatino reduce la absorbancia aparente a 0.636, pero la presencia de 0.01 ng/ml de Anvirzel™ y 0.1 µg/ml de cisplatino reduce el valor a 0.058 (p=0.001<0.05) . Una disminución similar en absorbancia aparente es encontrada después de 72 horas de incubación también.

Tabla 4. Evaluación Estadística de absorbancia en línea celular de cáncer pulmonar COL0699N Estos resultados en la Tabla 4 son representados gráficamente en la Figura 4.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama la propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una combinación terapéutica caracterizada porque comprende (I) un agente antineoplástico que comprende platino y (II) un extracto de una especie del género Nerium.

2. La combinación terapéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque (I) está presente en una cantidad que, en la ausencia de (II), es efectivo para producir un incremento en actividad antineoplástica.

3. La combinación terapéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque (I) está presente en una cantidad que, en la ausencia de (II), es ineficaz para producir un incremento en actividad antineoplástica.

4. La combinación terapéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque (I) es seleccionado del grupo que consiste de cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, satraplatino, picoplatino, nedaplatino, triplatino y fosfaplatinos .

5. La combinación terapéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque (I) es cisplatino.

6. La combinación terapéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque (II) es un extracto de una especie seleccionada del grupo que consiste de Nerium indicum, Nerium oleander y Nerium odorum.

7. La combinación terapéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque (II) es un extracto de la especie Nerium oleander.

8. La combinación terapéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque (II) es un extracto a base de agua.

9. La combinación terapéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque (II) es un extracto a base de aloe.

10. La combinación terapéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque (I) es cisplatino y (II) es un extracto de la especie Nerium oleander.

11. La combinación terapéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque (I) y (II) están presentes como formulaciones separadas.

12. Una combinación terapéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para usarse en el tratamiento de cáncer.

13. La combinación terapéutica para usarse de conformidad con la reivindicación 12, en donde (I) y (II) de la combinación terapéutica son administrados al paciente simultánea, separada o secuencialmente .

14. La combinación terapéutica para usarse de conformidad con la reivindicación 12, en donde: a) (II) es administrado al paciente intramuscular, sublingual, o intramuscular o sublingüalmente; o b) (II) es administrado al paciente sublingüalmente en dos o más dosis.

15. La combinación terapéutica para usarse de conformidad con la reivindicación 12, en donde el cáncer tratado es cáncer de próstata, melanoma, cáncer pancreático, cáncer pulmonar, cáncer de mama o cáncer colorrectal .