MX2014003405A - Formulaciones mejoradas de lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a formulaciones mejoradas de lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante (rhBSSL), incluyendo las que son adecuadas para formar una formulación liofilizada de rhBSSL, formulaciones liofilizadas de rhBSSL per se, formas de dosis unitarias de rhBSSL y formulaciones reconstituidas de rhBSSL. Las formulaciones de la presente invención comprenden rhBSSL, un agente volumétrico cristalino y un estabilizador amorfo que es una entidad química diferente al agente volumétrico cristalino. Las formulaciones de la presente invención tienen una o más propiedades deseadas, incluyendo las que se relacionan con la estabilidad, la disminución de la agregación y/o la formación de agregados insolubles en solución. Las formulaciones liofilizadas de la presente invención tienen utilidad farmacéutica, en particular para la administración de rhBSSL a los lactantes humanos.

Description

FORMULACIONES MEJORADAS DE LIPASA ESTIMULADA POR SALES BILIARES HUMANA RECOMBINANTE CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a formulaciones mejoradas de lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante (rhBSSL, por sus siglas en inglés) , incluyendo aquellas adecuadas para la formación de una formulación liofilizada de rhBSSL, formulaciones liofilizadas de rhBSSL per se, formas de dosis única de rhBSSL y formulaciones reconstituidas de rhBSSL. Las formulaciones de la presente invención tienen una o más propiedades deseadas, incluyendo aquellas que se refieren a estabilidad, agregación reducida y/o formación de agregados insolubles en solución. Las formulaciones liofilizadas de la presente invención tienen utilidad farmacéutica, particularmente para la administración de rhBSSL a bebés humanos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION En adultos, la lipasa pancreática dependiente de colipasa (PTL, por sus siglas en inglés) es la principal enzima responsable de la digestión de triglicéridos dietarios (TG) . En el bebé recién nacido, y particularmente en el bebé prematuro, las funciones pancreáticas exocrinas no están completamente desarrolladas (Manson & Weaver, 1997; Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed, 76:206-211). En consecuencia, en el REF . : 247362 bebé, la expresión de lipasas pancreáticas es baja en comparación con el páncreas de adultos (Lombardo, 2001; Biochim Biophys Acta, 1533: 1-28; Li et al 1007; Pediatr Res, 62:537-541), la actividad PTL intraluminal durante la digestión de grasa establecida es mucho más baja en comparación con adultos (Fredrikzon et al, 1978; Paediatr Res, 12:138-140) y la mala absorción de grasa no es poco común (Carnielli et al., 1998; Am J Clin Nutr 67:97-103; Chappell et al., 1986; J Pediatr, 108:439-443). Lindquist y Hernell (1990; Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 13:314-320) han revisado el tema de la digestión y absorción de lípidos en los primeros años de vida.

En el nacimiento el feto humano cambia de un suministro de energía dominado por glucosa a uno dominado por lípidos toda vez que la grasa, o más específicamente TG, que constituye la mitad de la energía total en la leche humana y en la mayoría de las fórmulas para bebés, sirve como el substrato de energía dominante para bebés recién nacidos. Por lo tanto, la digestión y absorción eficientes de TG dietario es crucial para el crecimiento y desarrollo del bebé. En el bebé amamantado, baja actividad PTL es compensada por una lipasa de amplia especificidad, lipasa estimulada por sales biliares (BSSL, por sus siglas en inglés) (EC 3.1.1.13), la cual es secretada tanto de la glándula mamaria lactante en la leche como del páncreas exocrino. En bebés prematuros, la leche materna parece proporcionar la mayor parte de PSSL en contenido duodenal durante una comida de leche materna (Fredrikzon et al, 1978), y los bebés amamantados digieren y absorben grasa, e importantemente ácidos grasos poliinsaturado de cadena larga (LCPUFAs) , más eficientemente que los bebés alimentados con fórmula (Bernbáck et al, 1990; J Clin Invest, 85:1221-1226; Carnielli et al, 1998) .

La superioridad de la leche humana como una fuente nutricional para bebés no prematuros así como prematuros se ha manifestado en muchos estudios y recomendaciones de grupos de expertos. En consecuencia, el método de alimentación recomendado a nivel mundial es amamantar. Sin embargo, ni el amamantar ni alimentar la propia leche de la madre siempre es posible o recomendado por razones médicas, y el amamantar podría no llevarse a la práctica por un número de otras razones. En casos en los que el bebé no es amamantado, se usa comúnmente fórmula para bebés o leche materna pasteurizada y/o congelada de banco o no de banco. Todos son, sin embargo, en algunos aspectos, sub-óptimos nutricionalmente para bebés recién nacidos.

Debido a riesgos de infección viral (virus de la inmunodeficiencia humana [VIH] , citomegalovirus [CMV] , hepatitis) y en un menor grado a la transmisión de bacterias patógenas, la leche donante usada en los llamados bancos de leche generalmente es pasteurizada antes de ser usada. Sin embargo, BSSL es inactivada durante la pasteurización de leche humana (Bjórksten et al, 1980; Br Med J, 201:267-272); tampoco está presente en ninguna de las muchas fórmulas diferentes que existen para la nutrición de recién nacidos no prematuros o prematuros. Se ha demostrado que la absorción de grasa, aumento de peso y crecimiento lineal son más altos en bebés alimentados con leche materna fresca en lugar de leche pasteurizada (Andersson et al. 2007; Williams et al., 1978; Arch Dis Child 43:555-563). Esta es una de las razones por las que se ha tomado especial atención en que los bebés recién nacidos, particularmente bebés prematuros, que no puedan ser alimentados por la leche de sus propias madres deban ser alimentados con leche no pasteurizada de otras madres (Bjórksten et al, 1980) .

La BSSL de leche nativa humana (hBSSL-MAM) ha sido purificada hasta homogeneidad, según se reporta por Bláckberg and Hernell (1981; Eur J Biochem, 116:221-225) y Wang & Johnson (1983) , y la secuencia de ADNc de BSSL humana se identificó por Nilsson (1990; Eur J Biochem, 192:543-550) y se describe en WO 91/15234 y W091/18923. Estudios de caracterización y secuencia a partir de varios laboratorios concluyeron que las proteínas hBSSL-MAM y el éster carboxílico hidrolasa (CEH) de páncreas (conocida también como BSSL pancreática) son ambos productos del mismo gen (por ejemplo, Baba et al, 1991; Biochem, 30:500-510 Hui et al., 1990; FEBS Lett, 276:131-134; Reue et al, 1991; J Lipid Res, 32:267-276). Después del aislamiento de la secuencia de ADNc, rhBSSL, así como variantes de la misma, ha sido producida incluyendo en borregos transgénicos (rhBSSL-OVI) ; tal como se describe en US 5716817, O94/20610 y W099/54443.

Andersson et al, 2007 (Acta Paediatr 96:1445-1449) reportaron un estudio aleatorizado que demostró que la pasteurización de la propia leche materna redujo la absorción de grasa y el crecimiento en bebés prematuros, y propusieron que estos efectos se debían a la inactivación de BSSL a base de leche por pasteurización. Recientemente, dos pruebas clínicas aleatorizadas y controladas han reportado que la adición de rhBSSL a leche materna pasteurizada o a fórmula para bebés y su administración a bebés prematuros demostró una mejora estadísticamente significativa en velocidad de crecimiento de estos bebés. Por ejemplo, como se presenta por Maggio et al en "The Power or Programming conference 2010: International conference on developmental origins of health and disease" , Munich, mayo 6-8 2010, y como se presenta por Carnielli et al en "The 3rd congress of the European Society of Paediatric Societies" , Copenhagen, octubre 24, 2010). Esta última presentación también reportó un pequeño incremento pero no estadísticamente significativo en el coeficiente total de absorción de grasa (CFA, por sus siglas en inglés) y una tendencia hacia absorción intestinal mejorada de ácido docosahexanoico (DHA) y ácido araquidónico (AA) - dos ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LCPUFAs, por sus siglas en inglés) importantes desde el punto de vista médico y de desarrollo - cuando rhBSSL se añadió a fórmula para bebés en comparación con fórmula para bebés con placebo.

Como se describió arriba, BSSL de leche materna es la misma lipasa que CEH producida por el páncreas humano maduro que es importante para la digestión de TG en adultos. En consecuencia, rhBSSL también ha sido explorada como una terapia para insuficiencia pancreática exocrina (PI) debido a pancreatitis crónica o fibrosis quística (CF) en adultos humanos (por ejemplo, Strandvik et al, 2004; 18th North American Cystic Fibrosis Conference, St Louis MI; abstract published in Pediatr Pulmonol, S27:333). Más recientemente, se ha anunciado que una prueba fase II adicional con una suspensión oral de rhBSSL (descrita ahí como "bucelipasa alfa"), dosificada a 170 mg 3 veces al día durante 5-6 días, para evaluar el efecto en la absorción de grasa en pacientes adultos con CF y PI ha sido completado (clinicaltrials.gov identifier NCT00743 -483 ) , y los resultados presentados en la 34th European Cystic Fibrosis Society Conference, Hamburg, Alemania, 8 a 11 de junio del 2011.

Con evidencia cada vez más alta de utilidad terapéutica para rhBSSL, sería deseable proporcionar formulaciones de rhBSSL para usos farmacéuticos que tengan propiedades particulares, y/o sean útiles para su administración a adultos o a bebés, en particular a bebés prematuros. Por ejemplo, sería deseable proporcionar formulaciones de rhBSSL que muestren estabilidad mejorada o prolongada, tal como en términos de formación reducida de agregados de alto peso molecular; tengan condiciones de almacenamiento prácticas o convenientes; tengan propiedades de reconstitución más confiables y uniformes; muestren una mayor vida útil; tengan características adecuadas para fabricación o envasado; y/o posean otras propiedades deseables .

Las proteínas terapéuticas se proporcionan comúnmente como una formulación liofilizada, que comprende una cantidad de proteína de interés junto con uno o más excipientes farmacéuticos tales como un agente de volumen, agente estabilizador y/o sales. La liofilización (también llamada secado por congelación) se refiere a un proceso que usa baja temperatura y presión para eliminar un solvente, típicamente agua, de una formulación líquida por el proceso de sublimación (es decir, un cambio en fase de sólido a vapor sin pasar a través de una fase líquida) . La liofilización comprende típicamente tres etapas generales: (1) congelación; (2) secado primario y (2) secado secundario.

Se cree generalmente que el secado por congelación interrumpe la actividad biológica de biomoléculas tales como proteínas. La magnitud de daño varía considerablemente con diferentes biomoléculas y diferentes condiciones, y varios investigadores han estudiado sistemas diferentes. La congelación de soluciones acuosas puede crear un incremento inicial en las concentraciones de solutos o pH que puede ser más dañino para proteínas lábiles que la propia congelación. Agentes de volumen pueden ser usados para buscar incrementar la formación y capacidad de secado de la torta sólida, o para mejorar su elegancia farmacéutica. Pueden usarse agentes estabilizadores para buscar estabilizar la actividad de la biomolécula, pero tienen grados de éxito limitados y variables, dependiendo del sistema. Crowe, et al (1987; Biochem J; 242: 1-10) describe la estabilización de bicapas de fosfolípidos secas y proteínas por azúcares, y también revisa el entendimiento de los mecanismos de estabilización de trehalosa de células en "The trehalose myth revisited: Introduction to a symposium on stabilization of cells in the dry state" Cryobiology 43, 89-105 (2001) .

Varios investigadores han reportado sobre el uso de diferentes excipientes y combinaciones de excipientes para proteger varias biomoléculas, incluyendo los siguientes ej emplos .

WO 03/009817 describe el uso de manitol o glicina como agentes de volumen para formar formulaciones liofilizadas estables de anticuerpos IGG.

WO 2006/075072 describe formulaciones liofilizadas de varias enzimas, incluyendo de una lipasa, para usarse en un biosensor. Glicina y manitol se usan ahí como agentes de volumen cristalinos, aunque la proteína está generalmente en un estado amorfo.

En EP 1 932 519, se describen formulaciones liofilizadas de proteínas morfogénicas de hueso, particularmente de Factor de Crecimiento y Diferenciación humano recombinante (rhGDF) , incluyendo aquellas que comprenden manitol, y una formulación separada de rhGDF que comprende glicina a un pH de aproximadamente 4.

WO 2006/023665 describe formulaciones antagonistas de IL-1, incluyendo una formulación de pre-liofilización que comprende 5-50 mg/mL de proteína y 0.25-3.0% de glicina como un lioprotector .

Chang et al (1996; Pharm Res, 13:243-249) describe el desarrollo de una formulación liofilizada estable de Antagonista del Receptor de Interleucina- 1 humana recombinante (rhlL-lra) , incluyendo la prueba de manitol o glicina como un agente de volumen usado en combinación con un estabilizador de proteínas amorfo, especialmente sacarosa.

Hirakura et al (2004; Int J Pharm; 386:53-67 investigaron los impactos de los cambios de temperatura durante los procesos de congelación en una formulación liofilizada que contenía fosfato de sodio (10 mM, pH 7.0) y glicina (300 mM) de interleucina-11 humana recombinante (rhIL-11; 5 mg/mL) .

Leuckel et al (1998; Pharm dev and Tech 3 : 325-336) investigaron glicina, lisina-HCl o manitol como agentes de volumen cristalizantes en combinación con los agentes estabilizadores amorfos sacarosa o trehalosa en las propiedades del concentrado congelado y el liofilizado. En la ausencia de cualquier proteína, dependiendo de la combinación particular de excipientes y su relación de concentración, uno u otro de los excipientes fue capaz de formar cristales.

Meyer et al (2009; Eur J Pharm Sci, 38:29-38) estudiaron el impacto de agentes de volumen en la estabilidad de una IgG monoclonal de murino anti-TNF liofilizada. Combinaciones de sacarosa como agente estabilizador con los agentes de volumen manitol o glicina se evaluaron para sus efectos en la estabilidad de anticuerpos.

Tian et al (2007; Int J Pharmac, 335:20-31) evaluaron la estabilización de anticuerpos monoclonales humanizados en formulaciones de aminoácidos. Los efectos protectores de histidina, arginina, glicina o ácido aspártico en anticuerpos anti-CDlla y anti-IgE fueron probados.

WO 99/27983 describe una jeringa de una dosis que contiene una formulación liofilizada de hormona de crecimiento human que sufre menos "soplado" cuando es usada. Cada dosis única contenía menos de 1.4 mg de proteína, y varias relaciones de otros excipientes incluyendo alrededor de 0.2 mg de glicina y 1.1 mg de manitol por mg de proteína, e incluyendo además fosfato de sodio y disódico.

O 2006/081320 describe una formulación líquida adecuada para liofilización que comprende al menos 20 mg/mL de proteína, un agente de volumen cristalino y soluto amorfo a una relación peso:peso de menos de 1. Manitol y glicina se describen ahí como siendo "agentes de volumen cristalino" convencionales, pero también que se pueden usar como un agente estabilizador, siempre y cuando permanezcan en estado amorfo después del proceso de liofilización . Un ejemplo incluyó al menos 2.0% p/v del agente estabilizador en la formulación líquida.

US 2006/0275306 describe varias formulaciones de anticuerpos anti-IgG o anti-HER2 liofilizadas obtenidas de formulaciones líquidas, incluyendo aquellas que comprenden 21 mg/mL de anticuerpo con manitol/glicina a 250/25 mM o 55/276 mM, respectivamente.

Pyne et al (2003; J Pharm Sci 92:2172-2283) estudiaron la cristalización de solutos en sistemas de manitol/glicina y sus implicaciones en la estabilización de proteínas en formulaciones liofilizadas. La formación de cristales de manitol y/o glicina en el material congelado fue afectada por varios factores incluyendo la velocidad de congelación, las concentraciones relativas del manitol y glicina en la formulación pre- liofilizada líquida y la presencia/concentración de regulador de pH de fosfato.

WO 2007/112757 describe procesos para la concentración de polipéptidos incluyendo porfobilinógeno desaminasa humana recombinante (rhPBGD) para formar formulaciones liofilizadas de esta proteína a partir de varias formulaciones líquidas incluyendo una solución global que comprende 3.67 mM de Na2HP04, 27 mM de glicina, 250 mM de manitol a pH 7.9 (intervalo de pH 7.5 a 8.5) .

Estos investigadores reportan grados variables de éxito usando varios excipientes diferentes o combinaciones de los mismos, según se mide por varios mé3todos en varias biomoléculas o proteínas. Ninguno de estos investigadores ha reportado sobre formulaciones de rhBSSL.

EP 0 317 355 describe genéricamente una composición dietaria que comprende una base nutricional a partir de una primera fuente, la base contiene grasas y es deficiente en lipasa estimulada por sales biliares; y una cantidad efectiva de lipasa estimulada por sales biliares a partir de una segunda fuente .

WO 91/18923 describe genéricamente una composición farmacéutica que comprende lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante , WO 94/20610 reclama genéricamente una composición farmacéutica que comprende variantes de lipasa estimulada por sales biliares humanas, y W099/54443 describe genéricamente una composición farmacéutica que comprende lipasa estimulada por sales biliares humanas producida a partir de un animal transgénico. En cada caso, se describe que estas composiciones farmacéuticas pueden usarse para la mejora de la utilización de lípidos dietarios en bebés nacidos prematuramente o para el tratamiento de condiciones patológicas relacionadas con insuficiencia pancreática, por ejemplo en fibrosis quística.

WO 2012/052059 y WO 2012/052060 co-pendientes (cuyos contenidos se incorporan en la presente por referencia en su totalidad) describen la preparación y uso de una composición farmacéutica de lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante para incrementar la velocidad de crecimiento y/o incrementar la absorción de ciertos LCPUFDAs en bebés humanos prematuros. La dosis única descrita ahí era una solución oral congelada que comprendía 15 mg/mL de lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante disuelta en 1.3 mL de agua para inyección. La dosis única se preparo a partir de alícuotas de una solución hecha a partir de lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante global liofilizada disuelta en agua para inyección. Brevemente, lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante global liofilizada se obtuvo mediante la producción de la proteína usando células CHO recombinantes , purificación de la proteína recombinante a partir de las células usando una variedad de etapas incluyendo cromatografía de intercambio aniónico, diafiltración, concentración y finalmente liofilización . La formulación liofilizada y dosis única terminada comprendían además fosfato diácido de sodio y cloruro de sodio como sustancia farmacéutica de rhBSSL que fue liofilizada a partir de una solución global regulada en pH con fosfato/cloruro de sodio de rhBSSL.

Así, existe evidencia conflictiva sobre lo que es una combinación óptima de excipientes para lograr lioprotección de biomoléculas tales como proteínas, y no hay una orientación específica en cuanto a aquellos para usar en o para formar formulaciones liofilizadas que comprendan rhBSSL. No hay ninguna combinación de excipientes que sea óptima para todas las proteínas, sino más bien un grado significativo de experimentación se requiere para obtener los resultados deseados para la proteína bajo investigación. Continúa habiendo la necesidad de uno o más, o de una combinación de, excipientes farmacéuticamente aceptables y adecuados para rhBSSL, incluyendo aquellos que protejan a la proteína durante liofilización, almacenamiento y/o uso, o que proporcionen otras propiedades deseables incluyendo vida útil, características de fabricación y/o reconstitución, o una o más de otras propiedades como las descritas en la presente .

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La solución a uno de los anteriores problemas técnicos es provista por los diferentes aspectos o modalidades de la presente invención definidos o de otra manera divulgados en la presente y/o en las reivindicaciones. Generalmente, y a manera de breve descripción, los principales aspectos de la presente invención pueden describirse como sigue: En un aspecto, la invención se refiere a una formulación adecuada para liofilización que comprende lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante (rhBSSL) ; un agente de volumen cristalino; y un estabilizador amorfo que es una entidad química diferente al agente de volumen cristalino .

En otro aspecto, la invención se refiere a una formulación liofilizada que puede obtenerse por liofilización de una formulación líquida de la presente invención, en donde la formulación liofilizada comprende rhBSSL, un agente de volumen cristalino y un estabilizador amorfo. En un aspecto relacionado, la invención se refiere también a una dosis única de la formulación liofilizada. En otros aspectos relacionados, la presente invención se refiere además a un método para producir la formulación liofilizada, y también a una formulación liofilizada que pueda obtenerse mediante tal método .

En otro aspecto más, la invención se refiere a un método para producir una formulación reconstituida de rhBSSL, el método comprende las etapas de: proporcionar una formulación liofilizada o una dosis única de la presente invención; y reconstituir la formulación liofilizada o dosis única en un líquido. En un aspecto relacionado, la invención se refiere a una formulación reconstituida de rhBSSL, que comprende: (i) la rhBSSL presente en una cantidad absoluta de entre aproximadamente 10 mg y alrededor de 20 mg; (ii) manitol presente en una cantidad absoluta de entre alrededor de 27 mg y aproximadamente 62 mg; y (iii) glicina presente en una cantidad absoluta de entre aproximadamente 2 mg y alrededor de 6 mg; y en donde la formulación es reconstituida en un alimento para bebés líquido y la formulación reconstituida tiene un pH de entre aproximadamente 6.4 y alrededor de 7.4.

En un aspecto más, la invención se refiere a un uso de glicina para estabilizar rhBSSL, presente en una formulación liofilizada que comprende además un agente de volumen cristalino que no es glicina, en donde: la glicina está presente en la formulación liofilizada sustancialmente en forma no cristalina; y/o la glicina se incluye en la formulación liofilizada en una cantidad relativa de entre aproximadamente 0.2 mg y alrededor de 0.3 mg por mg de la rhBSSL.

En un aspecto más, la invención se refiere a un método para reducir y/o minimizar la formación de agregados insolubles de rhBSSL presentes en un alimento para bebés líquido, el método comprende las etapas de: proporcionar una formulación liofilizada o una dosis única de la presente invención; y reconstituir la formulación liofilizada o dosis única en un alimento para bebés líquido.

En un aspecto particular, la invención se refiere también a un método para determinar una reducción en la agregación de rhBSSL, el método comprende las etapas de: (i) proporcionar una formulación liofilizada o una dosis única, de la presente invención; (ii) almacenar la formulación liofilizada o dosis única; y (iii) determinar, en uno o más puntos de tiempo, los niveles porcentuales de alto peso molecular (%HMW, por sus siglas en inglés) de la rhBSSL en la formulación liofilizada o la dosis única, determinando de esta manera el nivel de agregación de la rhBSSL.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las figuras 1A y IB muestran la inestabilidad de monómeros de rhBSSL (cuantificada por el pico principal integrado detectado por SE-HPLC) durante almacenamiento a +5°C entre 0 y 18 meses para las formulaciones liofilizadas del experimento AH7507: la figura 1A muestra la reducción en el porcentaje absoluto de picos principales integrados; y la figura IB muestra la reducción en el porcentaje de reducción relativo (pico principal a 0 meses establecido como 100% para cada formulación) de picos principales integrados. Las clases generales de concentración de glicina presentes en cada pre-formulación se indican por el sombreado de los símbolos graficados, con símbolos sólidos representando una "alta" concentración de glicina de 77 mM, los símbolos abiertos representando una "baja" concentración de glicina de 0 mM y los símbolos con rayas representando concentraciones de glicina "medias" de 27 mM (para N6 y N7) y 33 mM (para N4) .

Las figuras 2A y 2B muestran la inestabilidad de monómeros de rhBSSL (cuantificada por el pico principal integrado detectado por SE-HPLC) durante almacenamiento a +25°C entre 0 y 18 meses para las formulaciones liofilizadas del experimento AH750 : la figura 2A muestra la reducción en el % absoluto de picos principales integrados; y la figura 2B muestra la reducción en el porcentaje de reducción relativo (pico principal a 0 meses establecido como 100% para cada formulación) de picos principales integrados. La concentración de glicina presente en cada pre- formulación se indica usando el mismo sombreado que el descrito arriba.

Las figuras 3A y 3B muestran la inestabilidad de monómeros de rhBSSL (cuantificada por el pico principal integrado detectado por SE-HPLC) durante almacenamiento a +40°C entre 0 y 9 meses para las formulaciones liofilizadas del experimento AH7507: la figura 3A muestra la reducción en el porcentaje absoluto de picos principales integrados; y la figura 3B muestra la reducción en el % de reducción relativo (pico principal a 0 meses establecido como 100% para cada formulación) de picos principales integrados. La concentración de glicina presente en cada pre- formulación se indica usando el mismo sombreado que el descrito arriba.

Las figuras 4A y 4B muestran la velocidad de agregación de rhBSSL (cuantificada por la suma de todos los picos de alto peso molecular (HMW) integrados detectados por SE-HPLC) durante almacenamiento a +5°C entre 0 y 18 meses para las formulaciones liofilizadas del experimento AH7507: la figura 4A muestra la velocidad usando el % absoluto de picos HMW integrados totales; y la figura 4B muestra la velocidad usando el incremento % relativo (picos HMW totales a 0 meses establecido como 100% para cada formulación) de los picos HMW integrados totales. La concentración de glicina presente en cada pre-formulación se indica usando el mismo sombreado que el descrito arriba.

Las figuras 5A y 5B muestran la velocidad de agregación de rhBSSL (cuantificada por la suma de todos los picos de alto peso molecular (HMW integrados detectados por SE-HPLC) durante almacenamiento a +25°C entre 0 y 18 meses para las formulaciones liofilizadas del experimento AH7507: la figura 5A muestra la velocidad absoluta de picos HMW integrados totales; y la figura 5B muestra la velocidad usando el incremento porcentual relativo (picos HMW totales a 0 meses establecido como 100% para cada formulación) de picos HMW integrados totales. La concentración de glicina presente en cada pre-formulación se indica usando el mismo sombreado que el descrito arriba.

Las figuras 6A y 6B muestran la velocidad de agregación de rhBSSL (cuantificada por la suma de todos los picos de alto peso molecular (HMW integrados detectados por SE-HPLC) durante almacenamiento a +40°C entre 0 y 9 meses para las formulaciones liofilizadas del experimento AH7507: la figura 6A muestra la velocidad absoluta de picos HMW integrados totales; y la figura 6B muestra la velocidad usando el incremento porcentual relativo (picos HMW totales a 0 meses establecido como 100% para cada formulación) de picos HMW integrados totales. La concentración de glicina presente en cada pre-formulación se indica usando el mismo sombreado que el descrito arriba.

La figura 7 muestra una superposición de patrones PXRD obtenidos a partir de N4 , N5 , N6 y N7 para las formulaciones liofilizadas del experimento AH7507. Las flechas marcan los picos que corresponden a beta-glicina cristalina que se encuentra presente en la formulación N5 únicamente.

La figura 8 muestra una gráfica de dispersión que representa la relación entre agregación de rhBSSL cuantificada por la suma de todos los picos de alto peso molecular (HMW) integrados detectados por SE-HPLC) contra la concentración de glicina en la formulación pre-liofilizada para formulaciones del experimento AH7507 después de almacenamiento a -40°C durante 9 meses. La concentración de manitol presente en cada pre-formulación se indica por el sombreado de los símbolos graficados, con cuadrados sólidos representando una "alta" concentración de manitol de 307 mM, los cuadrados abiertos representando una "baja" concentración de manitol de 132 mM y los cuadrados con rayas representando una concentración de manitol "media" de 220 mM.

La figura 9 muestra una gráfica de coeficiente del pico principal integrado detectado por SE-HPLC para el modelo MLR con base en datos de las formulaciones del experimento AH7507 después de almacenamiento a +5°C y +25°C durante 18 meses .

La figura 10 muestra una superficie de contorno a partir del modelo MLR usado para analizar el pico principal integrado detectado por SE-HPLC (monómeros de rhBSSL) a partir de las formulaciones del experimento AH7507 después de almacenamiento a +5°C durante 18 meses.

La figura 11 muestra una gráfica de coeficientes de la suma de todos los picos de alto peso molecular (HMW) integrados detectados pro SE-HPLC (agregados de rhBSSL) para el modelo MLR con base en datos de las formulaciones del experimento AH7507 después de almacenamiento a +5°C y +25°C durante 18 meses.

La figura 12 muestra una superficie de contorno del modelo MLR usada para analizar la suma de todos los picos de alto peso molecular (HMW) integrados detectados por SE-HPLC (agregados de rhBSSL) a partir de las formulaciones del experimento AH7507 después de almacenamiento a +5°C durante 18 meses.

Las figuras 13A y 13B muestran la inestabilidad de monómeros rhBSSL - cuantificada por el pico principal integrado detectado por SE-HPLC - para las formulaciones liofilizadas de los experimentos AH7513 y AH7517 después de almacenamiento a +5°C después de almacenamiento durante 0 a 12 meses: la figura 13A muestra la reducción en el % del pico principal integrado; y la figura 13B muestra el porcentaje de reducción relativa (pico principal a 0 meses establecido como 100% para cada formulación) de pico principal integrado. Nótese que para el experimento AH7517, los datos fueron recabados a 0, 6, 9 y 12 meses únicamente. Las clases generales de concentración de glicina presente en cada formulación se indica por el sombreado de los símbolos graficados, con símbolos sólidos representando una "alta" concentración de glicina de 56 mM, los símbolos abiertos representando una "baja" concentración de glicina de 0 mM y los símbolos con rayas representando concentraciones de glicina "medias" de 44 mM (para G2) y 50 mM (para G3) .

Las figuras 14A y 14B muestran la inestabilidad de monómeros de rhBSSL - cuantificada por el pico principal integrado detectado por SE-HPLC - para las formulaciones liofilizadas de los experimentos AH7513 y AH7517 después de almacenamiento a +25°C durante 0 a 12 meses: la figura 14A muestra la reducción en el porcentaje de pico principal integrado; y la figura 14B muestra el porcentaje de reducción relativa (pico principal a 0 meses establecido como 100% para cada formulación) de pico principal integrado. Los puntos de tiempo recolectados y la concentración de glicina presente en cada pre- formulación se indican usando el mismo sombreado que el descrito arriba.

Las figuras 15A y 15B muestran la inestabilidad de monómeros de rhBSSL - cuantificada por el pico principal integrado detectado por SE-HPLC - para las formulaciones liofilizadas de los experimentos AH7513 y AH7517 después de almacenamiento a +40°C: la figura 15A muestra la reducción en % de pico principal integrado después de almacenamiento durante 0 a 12 meses. Nótese que para el experimento AH7517, los datos fueron recolectados a 0, 3 y 6 meses únicamente; y la figura 15B muestra el porcentaje de reducción relativo (pico principal a 0 meses establecido como 100% para cada formulación) de pico principal integrado después de almacenamiento durante 0 a 6 meses. La concentración de glicina presente en cada formulación se indica usando el mismo sombreado que el descrito arriba.

Las figuras 16A y 16B muestran la velocidad de agregación de rhBSSL - cuantificada por la suma de todos los picos de alto peso molecular (HMW) integrados detectados por SE-HPLC - para las formulaciones liofilizadas de los experimentos AH7513 y AH7517 después de almacenamiento a +5°C durante 0 a 12 meses: la figura 16A muestra el incremento de picos de HMW integrados totales; y la figura 16B muestra el % de incremento relativo (picos de HMW totales a 0 meses establecido como 100% para cada formulación) de picos HMW integrados totales. Nótese que para el experimento AH7517, los datos fueron recolectados a 0, 6, 9 y 12 meses únicamente, y la concentración de glicina presente en cada pre- formulación se indica usando el mismo sombreado que el descrito arriba.

Las figuras 17A y 17B muestran la velocidad de agregación de rhBSSL - cuantificada por la suma de todos los picos de alto peso molecular integrados (HMW) detectados por SE-HPLC - para las formulaciones liofilizadas de los experimentos AH7513 y AH7517 después de almacenamiento a +25°C durante 0 a 12 meses: la figura 17A muestra el incremento de picos de HMW integrados totales; y la figura 17B muestra el % de incremento relativo (picos de HMW totales a 0 meses establecido como 100% para cada formulación) de picos HMW integrados totales. Los puntos de tiempo recolectados y la concentración de glicina presente en cada pre-formulación se indican usando el mismo sombreado que el descrito arriba.

Las figuras 18A y 18B muestran la velocidad de agregación de rhBSSL - cuantificada por la suma de todos los picos de alto peso molecular integrados (HMW) detectados por SE-HPLC - para las formulaciones liofilizadas de los experimentos AH7513 y AH7517 después de almacenamiento a +40°C: la figura 18A muestra el incremento de picos de HMW integrados totales después de almacenamiento durante 0 a 12 meses. Nótese que para el experimento AH7517, los datos fueron recolectados a 0, 3 y 6 meses únicamente, y la figura 18B muestra el % de incremento relativo (picos de HMW totales a 0 meses establecido como 100% para cada formulación) de picos HMW integrados totales después de almacenamiento durante 0 a 6 meses. La concentración de glicina presente en cada pre-formulación se indica usando el mismo sombreado que el descrito arriba.

Las figuras 19A y 19B muestran patrones de PXRD: obtenidos de: figura 19A la formulación liofilizada de rhBSSL Fl del experimento AH7513. Las flechas marcan los picos que corresponden a beta-glicina cristalina presente en esta formulación; y la figura 19B muestra la formulación liofilizada de rhBSSL G3 del experimento AH7517. Las flechas marcan la ubicación esperada de picos (ausentes en esta formulación) que de otra manera indicarían la presencia de beta-glicina cristalina.

Las figuras 20A y 20B muestran resultados de SDS-PAGE para formulaciones liofilizadas de rhBSSL almacenadas durante 12 meses a varias temperaturas, y su grado respectivo de agregados de alto peso molecular (HMW) para: figura 20A formulaciones Fl y F2 del experimento AH7513; y figura 20B formulaciones G2 y G3 del experimento AH7517.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención, y aspectos no limitativos y/o modalidades particulares de la misma, se puede describir generalmente en más detalle como sigue: En un aspecto, la presente invención se refiere a una formulación adecuada para liofilización que comprende: (i) lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante (rhBSSL) ; (ii) un agente de volumen cristalino; y (iii) un estabilizador amorfo que es una entidad química diferente al agente de volumen cristalino.

Términos como los establecidos en adelante en la presente generalmente se deben entender por su significado común a menos que se indique lo contrario.

Cuando el término "que comprende" o "comprende" se use en la presente descripción y reivindicaciones, no excluye otros elementos. Para los efectos de la presente invención, el término "consiste en" se considera como una modalidad preferida del término "que comprende" . Si en adelante un grupo se define para comprender al menos cierto número de modalidades, también se entiende que esto describe un grupo que consiste preferiblemente en todos o sólo algunas de estas modalidades .

En el contexto de la presente invención, los términos "aproximadamente" y "alrededor de" indican un intervalo de precisión que la persona experta en la técnica entenderá para aún asegurar el efecto técnico de la característica en cuestión. El término indica típicamente desviación del valor numérico indicado por +20%, ±15%, ±10%, y de preferencia ±5%. Como se apreciará por la persona de capacidad ordinaria, esta desviación específica para un valor numérico para un efecto técnico dado dependerá de la naturaleza del efecto técnico. Por ejemplo, un efecto técnico natural o biológico generalmente puede tener una mayor de estas desviaciones que uno para un efecto técnico sintético o de ingeniería.

Cuando se use un artículo indefinido o definido al hacer referencia a un sustantivo singular, por ejemplo, "uno", "una", "el" y "la", esto incluye un plural de ese sustantivo a menos que algo más se indique específicamente. I. Liofilizacion en general La liofilizacion (también llamada secado por congelación) se refiere a un proceso que usa baja temperatura y presión para remover un solvente, típicamente agua, de una formulación líquida por el proceso de sublimación (es decir, un cambio en fase de sólido a vapor sin pasar a través de una fase líquida) . La liofilizacion ayuda a estabilizar formulaciones farmacéuticas al reducir uno o más componentes solventes a niveles que ya no soportan reacciones químicas o crecimiento biológico.

Los procesos de secado por congelación son conocidos. En algunos casos, el secado por congelación se lleva a cabo en un proceso "múltiple" en el cual matraces, ampolletas o viales se unen individualmente a los puertos de un múltiple o cámara de secado. En otros casos, el secado por congelación se lleva a cabo como un proceso "intermitente" en el cual uno o más recipientes de tamaño similar que contienen productos iguales se ponen juntos en un secador de bandeja, en un proceso "a granel" el producto es vertido en un recipiente a granel y secado como una sola unidad. El producto se retira de la cámara de liofilizacion antes de cerrar y luego se envasa en recipientes herméticos al aire. La invención descrita en la presente puede usarse en combinación con cualquiera de estos procesos.

Generalmente, la liofilización tiene lugar en al menos tres etapas: congelación; secado primario y secado secundario. En algunos casos, puede ser deseable incluir una etapa de templado entre las etapas de congelación y secado primario.

En la primera etapa de un proceso de secado por congelación típico, una muestra de solución de proteínas acuosas se enfría hasta debajo de la temperatura de colapso del producto hasta que la solución se congele. Durante la segunda etapa de secado primario, se aplica un vacío al material congelado y en algunos casos se transfiere calor a la masa congelada dando como resultado sublimación. Generalmente, el secado por congelación se usa para eliminar agua de una solución o formulación. Al presentarse la sublimación, el vapor de agua pasa de la masa congelada a una cámara de secado por congelación. Al incrementarse la temperatura, existe una presión de vapor saturada más alta lo cual se traduce en una velocidad de secado incrementada. Esto da como resultado un ciclo de liofilización acortado. Un límite superior en la temperatura de secado durante esta etapa asegura que la temperatura del producto se mantenga debajo de la temperatura de colapso del producto.

El "colapso" de un producto durante la liofilización está asociado con un área superficial reducida de formulación seca, reducción en volumen y también puede estar asociado con incremento del tiempo de reconstitución subsecuente. En caso de que el material liofilizado se colapse, solvente que no haya sido eliminado puede ser atrapado. Esto puede reducir desagradablemente la estabilidad del producto final y tener un impacto adverso en su desempeño. La temperatura de colapso es la temperatura a la cual el material se ablanda hasta el punto de ya no poder soportar su propia estructura. En general, al reducirse el nivel de solvente por medio de sublimación, se incrementa la temperatura de colapso. En la mayoría de los sistemas que contienen una proteína, el inicio de esta temperatura no está bien definido y puede presentarse sobre una gama de temperaturas. Un material que conserve esta estabilidad estructural más alta a una temperatura más alta puede por lo tanto permitir un procesamiento más rápido. Los componentes de la mezcla pueden, por lo tanto, impartir estabilidad durante el proceso de liofilización además de estabilizar la proteína durante almacenamiento subsecuente.

Además del hielo libre que es sublimado durante el secado primario, sigue habiendo una cantidad sustancial de moléculas de agua que son unidas al producto. En la tercera etapa de secado secundario, ésta es el agua que es eliminada (desorbida) . Ya que todo el hielo libre ha sido eliminado en secado primario, la temperatura del producto puede ahora incrementarse considerablemente sin miedo a colapsar. El secado secundario (desorción) realmente inicia durante la fase primaria, pero a temperaturas elevadas (típicamente en la escala de 30°C a 50°C) , la desorción procede mucho más rápidamente. Las velocidades de secado secundario dependen de la temperatura del producto. El vaciado del sistema puede continuarse al mismo nivel que el usado durante el secado primario, o puede ser variado. El secado secundario se continúa hasta que el producto tenga contenido de humedad aceptable para almacenamiento a largo plazo. Dependiendo de la aplicación, el contenido de humedad en productos completamente secos es típicamente de entre 0.5% y 35.

Una vez que se completa la deshidratación por liofilización, la proteína se deja como un polvo o "torta". La liofilización ayuda a estabilizar las formulaciones farmacéuticas al reducir uno o más componentes solventes (típicamente agua) en la torta hasta niveles que ya no soporten velocidades significativas de degradación química o física. La estructura de la torta es importante para permitir que el material (por ejemplo, la proteína terapéutica y cualquier otro excipiente) sea reconstituida. Si la torta tiene poros pequeños, la remoción de agua durante el proceso de liofilización puede ser impedida. Como resultado, el proceso de secado es incompleto y la torta tiene un alto contenido de humedad. Si la torta se forma con grandes poros, el proceso de secado es más eficiente y la torta tiene un bajo contenido de humedad.

II. Formulaciones Como se describió arriba, la liofilización es un proceso en el cual una formulación líquida adecuada para liofilización es sometida a un proceso de secado por congelación para obtener una formulación liofilizada (secada por congelación) . Los contenidos de una formulación secada por congelación pueden variar dependiendo del agente activo y de la ruta de administración deseada. La formulación líquida generalmente incluye un solvente y soluto. El soluto incluye típicamente un agente activo y, opcionalmente , uno o más excipientes. La formulación liofilizada resultante incluye una matriz sólida amorfa y una cantidad menor de solvente no congelado residual. La matriz sólida amorfa incluye el agente activo y, opcionalmente, uno o más excipientes.

En general, cualquier componente en la formulación que no sea el solvente o el agente activo se denomina un "excipiente" . Los "excipientes" están incluidos en una formulación por muchas razones, aunque la función principal de muchos excipientes es proporcionar un ambiente líquido estable para el ingrediente activo o proteger al agente activo durante el proceso de congelación o secado. Algunos excipientes pueden usarse para lograr varios efectos en una formulación. Por ejemplo, un disacárido tal como sacarosa puede actuar como un crioprotector, lioprotector, agente volumétrico y modificador de tonicidad. El comportamiento de un excipiente puede cambiar cuando está en presencia de otros excipientes. Algunas combinaciones tienen un efecto sinérgico positivo, otras tienen un efecto sinérgico negativo. La energía positiva se presenta cuando la suma de los efectos de excipientes que actúan juntos es mayor que los efectos aditivos de los excipientes individuales. Una sinergia negativa se presenta cuando la suma de efectos de la combinación de excipientes es menor que aquella de los excipientes individuales. Ejemplos de agentes activos, solventes y excipientes se proporcionan abajo.

Agente activo y lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante Según se usa en la presente, el término "formulación farmacéutica" se refiere a ambas formulaciones que incluyen al menos un agente activo, el cual es, o uno de los cuales es, lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante (rhBSSL) .

La lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante (rhBSSL) como un componente en los diferentes aspectos de la invención es la proteína descrita, definida o referida en la presente. Por ejemplo, incluye polipéptidos reconocibles por una persona de capacidad ordinaria en la técnica como siendo lipasa estimulada por sales biliares humana, en donde la lipasa humana ha sido producida por o aislada a partir de una fuente no humana, tal como un organismo no humano, adaptado o modificado (por ejemplo por tecnología genética recombinante) para producir este polipéptido .

La lipasa estimulada por sales biliares humanas (BSSL, por sus siglas en inglés) es una enzima conocida por varios identificadores o aliasas; por ejemplo, "lipasa de éster carboxílico (CEL)", "lipasa activada por sales biliares (BAL)", "lipasa dependiente de sales biliares (BSDL) " , "carboxilesterasa" , "éster hidrolasa carboxílica" (CEH) , y un número de otros alias y descripciones que serán fácilmente disponibles para la persona de capacidad ordinaria en la técnica a partir de fuentes de información tales como "GeneCards" (www.genecards.org) . Un número de secuencias de aminoácidos naturales e isoformas de BSSL humana han sido identificadas a partir de leche humana (y páncreas) , y un número de diferentes secuencias de aminoácidos (típicamente, predichas a partir de una secuencia de ADNc o genómica) han sido descritas; todas las cuales se abarcan en la presente dentro del término "lipasa estimulada por sales biliares humanas". Por ejemplo, la lipasa estimulada por sales biliares humana se produce naturalmente primero como una secuencia precursora que incluye una secuencia de señal de 20 a 26 aminoácidos, y la forma de longitud completa madura de la proteína descrita como teniendo 722 a 733 aminoácidos (por ejemplo véase, Nilsson et al, 1990; WO 91/15234, WO 91/18923; el polipéptido predicho a partir de la secuencia de ADNc de GenBank ID de presentación: X54457; GenBank ID: CAA38325.1; GeneCards entry for "CEL/BSSL"; GenBank ID de presentación: X54457; GenBank ID: CAA38325.1; GeneCards entrada para "CEL/BSSL"; GenBank DI: AAH42510.1; Ref Seq ID: NP_001798.2 ; Swiss-Prot ID: P19835) . En ejemplos adicionales, otras isoformas más cortas de lipasa estimulada por sales biliares humana se describe en Venter et al (2001; Science, 291:1304-1351); GenBank ID: AAC71012.1; Pasqualini et al (1998; J Biol Chem, 273:28208-28218); GenBank ID: EAW88031.1; WO94/20610 y Bláckberg et al (1995; Eur J Biochem, 228: 817-821).

En modalidades particulares, la lipasa estimulada por sales biliares humana comprende una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende, o como la mostrada por SEQ ID NO : 2. En otras modalidades particulares, la lipasa estimulada por sales biliares humana (recombinante) tiene una secuencia de aminoácidos ya sea de las formas madura o precursora de BSSL seleccionada de aquellas descritas en Nilsson et al, 1990; WO 91/15234, WO 91/18923; Ref Seq ID: NP_001798.2; GenBank ID: AAH42510.1; GenBank ID: CAA38325.1; GeneCards entrada para "CEL/BSSL"; Swiss-Prot ID: P19835. En modalidades adicionales de este tipo, la lipasa estimulada por sales biliares humana (recombinante) comprende una proteína con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 720 aminoácidos consecutivos de cualquiera de las secuencias descritas en las referencias anteriores o de SEQ ID NO: 2. En otras modalidades, la lipasa estimulada por sales biliares humana (recombinante) comprende una proteína que tiene al menos la secuencia de aminoácidos de la posición 1 a 101 de aquella descrita en SEQ ID NO: 2 o WO 91/15234, o al menos la secuencia de aminoácidos de la posición 1 a 535 de aquella descrita en SEQ ID NO: 2, tal como "variante A" descrita en Hansson et al, 1993; J Biol Chem, 35:26692-26698, en donde esta proteína tiene actividad de lipasa dependiente de sales biliares y/o de unión a sales biliares, como por ejemplo se puede determinar por los métodos descritos en Bl ckberg et al (1995; Eur J Biochem 228:817-821).

Será por lo tanto ahora aparente para la persona de capacidad ordinaria en la técnica que en ciertas modalidades de la presente invención una o más de estas formas descritas de lipasa estimulada por sales biliares humana (recombinante) se puede usar en los diferentes aspectos de la invención. Además, será aparente para esta persona que otras proteínas (recombinantes) que tengan actividad lipolítica dependiente de sales biliares (por ejemplo, como se puede determinar por los métodos descritos en Bláckberg et al; 1995) y que sean similares en secuencia de aminoácidos a aquellas secuencias de polipéptidos descritas, definidas o mencionadas en la presente también pueden tener utilidad en la presente invención, y por consiguiente también se abarcan por el término "lipasa estimulada por sales biliares humana" . En ciertas modalidades de éstas, una proteína que muestra más de 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5% de identidad de secuencia sobre al menos aproximadamente 30, 50, 100, 250, 500, 600, 700, 711, 720, 722, 733 ó 750 aminoácidos con una secuencia descrita, definida o mencionada en la presente. En otras modalidades, una o más sustituciones de aminoácido pueden hacerse a una de las secuencias de polipéptidos BSSL descritas, definidas o referidas en la presente. Por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco o hasta 10 sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos pueden hacerse a la secuencia descrita en SEQ ID NO: 2. Estos cambios de aminoácido pueden ser cambios neutros (tales como sustituciones de aminoácido neutras) , y/o pueden afectar la glicosilación, unión, actividad catalítica u otras propiedades de la proteína de cierta manera (deseada) . Proteínas con estas sustituciones, siempre y cuando tengan actividad lipolítica dependiente de sales biliares, también serán reconocidas por la persona de capacidad ordinaria en la técnica como siendo "lipasa estimulada por sales biliares humana" en el sentido de la presente invención.

En otras modalidades, la lipasa estimulada por sales biliares humana puede expresarse a partir de o codificarse de otra manera por un ácido nucleico que tenga una secuencia de ácido nucleico adecuada. A manera de ejemplo no limitado, la lipasa se puede expresar a partir de o codificarse de otra manera por un ácido nucleico que comprenda la secuencia entre las posiciones 151 y 2316 de SEQ ID NO: 1, o aquella descrita en O 94/20610 o Nilsson et al (1990) . Como también se apreciará por la persona de capacidad ordinaria, una "secuencia de ácido nucleico adecuada" también abarcará variantes de las secuencias de ácido nucleico anteriores. Por ejemplo, cambios en una o más bases de nucleótidos que no cambien el aminoácido codificado por un codón de triplete (tal como en la tercera posición de codón) también serán "adecuadas". Sub- fragmentos de estas secuencias de ácido nucleico también serán "adecuados" si codifican para una isoforma (corta) de lipasa estimulada por sales biliares humana como la descrita en la presente. Además, secuencias de ácido nucleico que codifiquen para una proteína que tenga una variante de la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO: 2, tales como aquellas descritas arriba, también serán "adecuadas" . En consecuencia, la presente invención contempla modalidades en las cuales la lipasa estimulada por sales biliares humana (recombinante) es una proteína que se puede expresar o codificar de otra manera por un ácido nucleico que híbrida a un ácido nucleico que comprende la secuencia entre las posiciones 151 y 2316 de SEQ ID NO: l o a una que comprende la secuencia entre las posiciones 151 y 755, y en donde la proteína tiene actividad lipolítica dependiente de sales biliares. En ciertas modalidades de este tipo, la hibridación se lleva a cabo bajo condiciones severas, tal como se conocerá por la persona de capacidad ordinaria, y se describe en libros de texto generales por ejemplo "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", por Joe Sambrook y David Russell (CSHL Press) .

En una modalidad particular, la lipasa estimulada por sales biliares humana (recombinante) se produce por expresión a partir de un ácido nucleico descrito, definido o referido en la presente.

Una lipasa estimulada por sales biliares humana descrita, definida o referida en la presente, en el contexto de la presente invención, es una lipasa estimulada por sales biliares recombinante (rhBSSL) ; es decir, en donde la lipasa humana ha sido producida por o aislada a partir de una fuente no humana, tal como un organismo no humano, adaptada o modificada (por ejemplo por tecnología genética recombinante) para producir tal lipasa. En modalidades particulares, la rhBSSL se produce usando técnicas de transcripción-traducción libres de células y/o in vitro a partir de una molécula de ácido nucleico aislada descrita, definida o referida en la presente. Como alternativa, un organismo no humano recombinado es usado, en donde el organismo no humano incluye al menos una copia de tal ácido nucleico, y en donde el ácido nucleico es expresable por el organismo no humano para producir la proteína: rhBSSL deseada. Por ejemplo, se pueden usar células bacterianas, de algas, levadura u otras eucarióticas recombinantes , y la rhBSSL es, en ciertas modalidades, producida a partir del cultivo de tales células recombinantes. En otras modalidades, la rhBSSL puede producirse por cultivo extracorporal de células humanas modificadas o seleccionadas específicamente, por ejemplo por su cultivo in vitro. En otras modalidades más, rhBSSL puede producirse por su aislamiento a partir de la leche de animales transgénicos ; tales como ganado, borregos, cabras o conejos transgénicos. La persona de capacidad ordinaria en la técnica estará consiente de las numerosas tecnologías disponibles para producir lipasa estimulada por sales biliares humana usando tecnología recombinante.

La lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante ha mostrado ser producible a partir de cultivo de células recombinantes incluyendo el cultivo de células de E coli, ratón y hámster (Hansson et al, 1993), y P. pastoris (Trimple et al, 2004; Glycobiol, 14:265-274). La lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante también ha mostrado ser producible y aislable a partir de la leche de ratones transgénicos (Strómqvist et al, 1996; Transgen Res, 5:475-485) y de la leche de borregos transgénicos (WO 99/55443) . En ciertas modalidades de la presente invención, la lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante es aislada del cultivo de tales células recombinantes o de la leche de tales animales transgénicos. En una modalidad alternativa, la lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante no es una aislada de la leche de un borrego transgénico o un ratón transgénico.

En una modalidad particular de la presente invención, la lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante es aislada a partir de un producto de expresión de una línea de células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) recombinante, se produce por una línea de células CHO recombinante, o es expresable por, o aislable de, o una línea de células CHO recombinante. El uso de un sistema de expresión de línea de células de CHO recombinante para producir esta lipasa puede producir rhBSSL que exhiba características estructurales, de actividad u otras particulares, tales como una o más de aquellas descritas en las solicitudes co-pendientes WO 2012/052059 y WO 2012/052060, cuyos contenidos se incorporan en la presente por referencia. A manera de ejemplo no limitativo, la rhBSSL útil en la presente invención puede ser aislada usando un proceso y/o exhibir características análogas a, o sustancialmente como las descritas en, los ejemplos de la presente, o como se describe en las solicitudes co-pendientes WO 2012/052059 y WO 2012/052069.

En ciertas modalidades de la presente invención, la lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante se identifica por el Nombre No Privado Internacional (INN) "bucelipasa" (véase WHO Drug Information, 21:62, 2007), por ejemplo debido a que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada ahí. La lipasa estimulada por sales humanas biliares recombinante, cuando se usa en la presente invención puede, con referencia a SEQ ID NO: 2, tener uno o más puentes de disulfuro en las ubicaciones Cys64-Cys80 y Cys246 -Cys257 , y/o es glicosilada en uno o más de los posibles sitios de glicosilación en Asn-187, Thr-538, Thr-549, Thr-559, Thr-576, Thr-587, Thr-598, Thr-609, Thr-620, Thr-631 y Thr-642 (en una de estas modalidades, representada esquemáticamente en la figura 1.1) . En ciertas de éstas modalidades, la rhBSSL está en una glicoforma, y puede por ejemplo tener el INN de "bucelipasa alfa" .

En otras modalidades particulares de la presente invención, la lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante tiene propiedades estructurales, de composición y/u otras que son diferentes a aquellas de la lipasa estimulada por sales biliares humana nativa (BSSL-MAM) y/o diferentes de aquellas de la lipasa estimulada por sales biliares recombinante que ha sido producida por aislamiento de la leche de borregos transgénicos (rhBSSL-OVI) , tal como se describe en WO 99/54443. Ciertas de estas diferencias estructurales y/o de composición, u otras propiedades que son diferentes, se describen en solicitudes co-pendientes WO 2012/052059 y WO 2012/052060. A manera de ejemplo no limitativo, en ciertas de estas modalidades, la lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante útil para la presente invención está (sustancialmente) libre de otras proteínas de leche o componentes de leche. Como será aparente a partir de la descripción de la presente invención, en ciertas modalidades la rhBSSL se añade a un alimento para bebés a base de leche antes de su administración al bebé humano. En consecuencia, en tales modalidades, los "libre de otras proteínas de leche o componentes de leche" aplicará a aquella forma, composición o formulación de la lipasa estimulada por sales biliares recombinante que exista justo antes (tal como inmediatamente antes) de la adición de dicha lipasa al alimento para bebés a base de leche. Por ejemplo, en tales modalidades las composiciones farmacéuticas o componentes de kits de la invención que contienen rhBSSL, o aquella cantidad de rhBSSL que es provista lista para su adición a cualquier fórmula para bebés y/o leche materna pasteurizada, están libres de estos contaminantes a base de leche. En ciertas de estas modalidades, la rhBSSL está libre de caseína de leche y proteínas de suero, tales como lactoferrina, o libre de otros contaminantes nativos para la leche, en particular en donde estas proteínas derivadas de leche u otros contaminantes se derivan de la leche de humanos, borregos o ratones. En estas modalidades la frase "libre de" cualquiera particular de estas proteínas o contaminante significa que ninguna cantidad material de esta proteína u otro contaminante puede detectarse por metodologías de detección de rutina. Como alternativa, cualesquiera de estas impurezas particulares puede estar presente a un nivel de menos de aproximadamente 5%, tal como menos de aproximadamente 2%, 1%, 0.5% o 0.1%, o está esencialmente o efectivamente ausente, o el total de todas estas proteínas derivadas de leche u otros contaminantes están presentes a un nivel de menos de aproximadamente 5%, tal como menos de aproximadamente 2%, 1%, 0.5% o 0.1%, o están esencialmente o efectivamente ausentes. Como se entenderá por la persona de capacidad ordinaria en la técnica, la lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante producida y aislada del cultivo de células, tal como de células CHO recombinantes será considerada "libre de" estos contaminantes a base de leche.

En otras de estas modalidades de la presente invención, la lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante tiene una pureza de más de aproximadamente 70%, tal como una pureza de más de aproximadamente 80%, 90% o 95%.

En modalidades de este tipo particulares, tal pureza porcentual es una pureza porcentual de proteína total. Como se describió arriba, en las modalidades aplicables esta medida de pureza es aquella de la composición que comprende la lipasa antes de su adición a cualquier alimento para bebés u otro medio de administración. Estos valores de pureza pueden ser determinados por técnicas de RP-HPLC, SE-HPLC o SDS-PAGE (con SyproRuby o tinción con plata) .

En otras modalidades de la invención, particularmente si la lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante se produce usando (es expresada a partir de) células CHO recombinantes , la rhBSSL cuando se usa en la presente invención puede ser caracterizada por una o más propiedades estructurales, de actividad u otras tales como aquellas descritas en lo siguiente. Los métodos para determinar estas propiedades estructurales, de actividad u otras se conocerán por la persona de capacidad ordinaria en la técnica después de la descripción de la presente invención y, por ejemplo, incluyen aquellas descritas en solicitudes co-pendientes WO 2012/052059 y WO 2012/052060.

En modalidades de la invención de este tipo adicionales, la lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante tiene un nivel (total/general) de glicosilación que es menor que aquél de la lipasa estimulada por sales biliares humana nativa (BSSL-MAM) y/o tiene un nivel (general/total) de glicosilación que es mayor que aquél de lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante aislada de la leche de borregos transgénicos (rhBSSL-OVI) . Los niveles de glicosilación, tales como el nivel de contenido de monosacáridos y/o ácido siálico de BSSL (o muestra de la misma pueden medirse usando cromatografía de intercambio aniónico de alto pH con detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD) . En modalidades particulares de la presente invención, el contenido total de monosacáridos de la lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante (mol de monosacárido por mol de rhBSSL) es de entre aproximadamente 20 y 100, entre alrededor de 25 y 65 o entre aproximadamente 25 y 55, tal como entre aproximadamente 40 a 45 mol/mol de rhBSSL) . En ciertas modalidades de la invención el contenido total de ácido siálico de la rhBSSL (mol de ácido siálico por mol de rhBSSL) es de entre aproximadamente 20 y 35, tal como entre aproximadamente 25 y 30 mol /mol de rhBSSL) .

En otras de estas modalidades adicionales de la presente invención, la lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante tiene un patrón de glicosilación, por ejemplo de 0-glicanos, que es diferente a aquél de BSSL-MAM y/o diferente a aquél de rhBSSL-OVI. Tales diferencias pueden detectarse usando electroforesis capilar con detección por fluorescencia inducida con láser (CE-LIF) y/o HPAEC-PAD.

En modalidades particulares de la invención, la rhBSSL puede tener entre aproximadamente 20 y 50 mol de ácido N-acetilneuramínico (NANA = Neu5Ac) por mol de rhBSSL [mol/ (mol de rhBSSL)], tal como entre aproximadamente 25 y 40 mol/ (mol de rhBSSL) . La rhBSSL usada en la invención puede tener menos de aproximadamente 5 mol de ácido N-glicosilneuramínico (NGNA = Neu5Gc) por mol de rhBSSL, tal como menos de aproximadamente 2 mol/ (mol de rhBSSL) , o en donde NGNA es esencialmente indetectable . La rhBSSL usada en la invención puede tener menos de aproximadamente 20 mol de fucosa por mol de rhBSSL, tal como menos de aproximadamente 10, menos de alrededor de 5, menos de o aproximadamente 2 mol (mol de rhBSSL) , y en ciertas modalidades la fucosa es esencialmente indetectable. La rhBSSL usada en la invención puede tener entre aproximadamente 5 y 25 mol de galactosamina por mol de rhBSSL, tal como entre aproximadamente 10 y 20 o entre alrededor de 15 y 18 mol/ (mol de rhBSSL) . La rhBSSL usada en la invención puede tener menos de aproximadamente 10 mol de glucosamina por mol de rhBSSL, tal como menos de aproximadamente 5, menos de aproximadamente 3 o alrededor de 2 mol/ (mol de rhBSSL) . La rhBSSL usada en la invención puede tener entre aproximadamente 5 y 25 mol de galactosa por mol de rhBSSL, tal como entre aproximadamente 10 y 20 o entre alrededor de 15 y 18 mol /(mol de rhBSSL). La rhBSSL usada en la invención puede tener menos de aproximadamente 5 mol de glucosa por mol de rhBSSL, tal como menos de aproximadamente 2 mol /mol de rhBSSL) , o en donde glucosa es esencialmente indetectable . La rhBSSL usada en la invención puede tener entre aproximadamente 2 y 8 mol de mañosa por mol de rhBSSL, tal como entre aproximadamente 4 y 6 mol / (mol de rhBSSL) . En modalidades particulares de la invención, la rhBSSL puede tener un perfil de contenido de monosacárido y/o ácido siálico aproximadamente aquél como, o sustancialmente como, como el representado en la tabla 1.1 de las solicitudes co-pendientes WO 2012/052059 y WO 2012/052060.

En otras modalidades de la invención, la lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante útil para la presente invención es diferente de BSSL-MA y de rhBSSL-OVI en el perfil o cantidad de unión de lectina o pruebas de unión a antígeno de Lewis, tales como aquellos ensayos y perfiles descritos en Bláckberg et al (1995) y Landberg et al (1997) respectivamente. Estas pruebas de unión a lectina o de unión a antígeno de Lewis pueden indicar diferencias en patrón de glicosilación entre éstas diferentes formas de BSSL. Se pueden usar otras técnicas para identificar y/o caracterizar lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante útil para la presente invención. Por ejemplo, rhBSSL puede caracterizarse (y/o diferenciarse a partir de BSSL-MAM o de rhBSSL-OVI) por digestión con endoproteasa Lys- C seguida por análisis de los péptidos resultantes con HPLC de fase inversa con detección UV cuantitativa (a 214 nbm) , y grabación/inspección del cromatograma resultante. Las diferencias en el cromatograma resultante pueden deberse a -y por consiguiente reflejan más - características únicas de glicosilación de péptidos específicos que comprendan la rhBSSL que tengan diferencias específicas en tiempo de retención .

En otras modalidades adicionales de la presente invención, la lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante tiene una masa molecular de entre 90 kDa y 75 kDa. En modalidades de este tipo particulares la masa molecular de la lipasa es de entre aproximadamente 84 y 86 kDa, tal como aproximadamente 85 kDa. La masa molecular puede determinarse por técnicas de rutina incluyendo MALDI-MS . A manera de comparación, usando las mismas técnicas de detección la masa molecular de BSSL-MAM se mide como siendo sustancialmente mayor (por ejemplo, alrededor de 100 kDa) y aquella de rhBSSL-OVI se mide como siendo sustancialmente menor (por ejemplo, alrededor de 78 kDa) .

En otras de estas modalidades adicionales de la presente invención, la lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante puede comprender una población de moléculas de lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante que tengan secuencias de diferentes longitudes de aminoácidos. En ciertas de estas modalidades, la cantidad de moléculas de lipasa que estén presentes en una forma que es más corta en el extremo C-terminal por uno, dos, tres, cuatro, cinco o hasta diez aminoácidos, en comparación con la forma de longitud completa más larga (o predicha (tal como aquella mostrada por SEQ ID NO: 2) es mayor que 50% de la cantidad de moléculas de lipasa presentes en tal forma de longitud completa más larga o (predicha) . En ciertas de estas modalidades, entre alrededor de 100% y 500% de la cantidad de la molécula de lipasa más larga (o de longitud completa predicha) es la cantidad presente como una molécula de lipasa más corta, tal como por uno o dos aminoácidos a partir del extremo C-terminal. En modalidades de este tipo particulares entre alrededor de 200% y 400%, por ejemplo aproximadamente 3005, de la cantidad de la molécula más larga (o longitud completa predicha) (por ejemplo, aquella mostrada por SEQ ID NO: 2), es la cantidad presente como una molécula de lipasa más corta tal como por uno o dos aminoácidos a partir del extremo C-terminal. En modalidades particulares o la anterior, menos de 1% de la cantidad de las moléculas de lipasa más largas (o longitud completa predicha) está presente como una molécula de lipasa más corta por dos aminoácidos. En otras modalidades, entre dos a cinco veces, tal como aproximadamente tres veces, el número de las moléculas de lipasa más largas (o predichas) están presentes en una forma que son más cortas que tal molécula más larga (o predicha) a partir del extremo C-terminal por uno, dos, tres, cuatro, cinco o hasta diez aminoácidos.

En otras de estas modalidades adicionales de la presente invención, la lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante puede tener una actividad específica que sea mayor que BSSL aislada de leche humana y/o rhBSSL-OVI. Por ejemplo, la actividad específica de la rhBSSL puede ser de entre aproximadamente 15% y 35% más alta, tal como alrededor de 20% o 25% más alta que la actividad específica de aquella de BSSL-MAM y/o rhBSSL-OVI (con base en masa) . Las técnicas para medir actividad específica de BSSL humana se conocerán por la persona de capacidad ordinaria e incluyen el uso del ensayo de éster 4 -nitrofenílico de ácido butírico (PNPB) como el descrito generalmente en los ejemplos de la presente. Otros ensayos in vitro para BSSL se conocen, por ejemplo mediante el uso de trioleoilglicerol emulsionado en goma arábiga como el sustrato para BSSL y colato de sodio (10 mM) como sal biliar activadora (por ejemplo, como se describe por Bl ckberg y Hernell, 1981; Eur J Biochem, 116:221-225). En modalidades particulares, antes de medir la actividad específica, la BSSL puede purificarse hasta una alta pureza, tal como mediante el uso de las técnicas de cromatografía de afinidad a heparina y cromatografía de exclusión de tamaño.

Como se entenderá por la persona de capacidad ordinaria, la lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante usada en la presente invención puede caracterizarse por más de una de las características distintivas descritas o definidas en la presente, tales como aquellas arriba. Por ejemplo, una combinación de dos o más (tal como tres, cuatro, cinco o más) de estas características pueden caracterizar juntas una modalidad particular de la lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante para usarse en la presente invención.

En cierta modalidad de este aspecto de la invención, la rhBSSL está presente a una concentración de entre aproximadamente 1 mg/mL y alrededor de 35 mg/mL; de preferencia en donde la concentración es de entre aproximadamente 10 mg/mL y alrededor de 15 mg/mL; muy preferiblemente, en donde la concentración se selecciona del grupo que consiste en aproximadamente: 11 mg/mL; 12 mg/mL; 13 mg/mL; y 14 mg/mL. En modalidades alternativas, tales como aquellas en donde una cantidad efectiva más baja de la rhBSSL se desee, la rhBSSL está presente a una concentración de aproximadamente entre alrededor de 1 y aproximadamente 5 mg/mL; de preferencia alrededor de 2 , 3 ó 4 mg/mL: Como estará ahora dentro de la capacidad de la persona de la capacidad ordinaria, la capacidad/concentración de rhBSSL presente en una formulación o composición puede ser expresada en cantidad absoluta (por ejemplo, masa o cantidades molares) y/o en términos del número de unidades activas. La actividad de rhBSSL puede determinarse fácilmente usando el ensayo PNPB como el descrito en la presente, con referencia a una molécula de BSSL estándar activa. Las masas adecuadas de rhBSSL activa están dentro de los intervalos de masas dados arriba. Ya que puede variar la masa molecular de una proteína compleja tal como rhBSSL, por ejemplo debido a diferencias en glicosilación, la cantidad de dicha lipasa puede .definirse de maneras que no sean en términos de masa, tal como en términos de cantidades molares (activas) . La persona experta será fácilmente capaz de hacer otras conversiones a partir de cantidades en mg específicas a la cantidad en micromol correspondiente. Como alternativa, la cantidad de lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante puede expresarse en términos de la actividad de la lipasa en unidades de enzima (U) , tal como se define como la cantidad de la lipasa que cataliza la formación de 1 micromol de producto por minuto bajo las condiciones del ensayo, por ejemplo se determina en un ensayo in vi tro para actividad BSSL tal como uno descrito en la presente.

Solvente Como se describió previamente, la liofilización es un proceso mediante el cual se elimina solvente de una formulación líquida. Según se usa en la presente, el término "solvente" se refiere al componente líquido de una formulación que es capaz de disolver o suspender uno o más solutos. El término "solvente" puede referirse a un solo solvente o a una mezcla de solventes . Un solvente usado comúnmente para formulaciones farmacéuticas es agua para inyección (WFI, por sus siglas en inglés) . Dependiendo de la formulación o del proceso de liofilización, puede ser deseable incluir uno o más solventes orgánicos en la formulación líquida. Por ejemplo, puede ser deseable incluir un solvente orgánico en la formulación para mejorar la solubilidad de uno o más ingredientes activos. Ejemplos de solventes orgánicos adecuados incluyen, pero no están limitados a, acetonitrilo, metanol, etanol, propanol, alcohol ter-butílico, acetona, ciclohexano y sulfóxido de dimetilo (DMSO) .

Agente volumétrico El propósito del agente volumétrico es proporcionar volumen a la formulación e incrementar la formación de torta. Según se usa en la presente, el término "agente volumétrico" incluye agentes volumétricos tanto "cristalinos" como "no cristalinos" . El término agentes volumétricos "cristalinos" se refiere a agentes volumétricos que son capaces de formar una estructura de cristal bajo condiciones de liofilización típicas .

En general, un agente volumétrico cristalino se refiere a un agente volumétrico que es capaz de cristalizarse durante la congelación (por ejemplo, entre una temperatura de aproximadamente 0°C y alrededor de -50°C) . Un agente volumétrico cristalino puede requerir una etapa de templado y tratamiento térmico u otro componente para proporcionar cristalización durante el proceso de congelación. Por ejemplo, un agente volumétrico puede o no cristalizarse durante la liofilización, dependiendo de las condiciones del proceso de liofilización y/o los demás excipientes presentes en la formulación. Típicamente, cuando una cantidad suficiente de agente volumétrico cristalino se incluye en una formulación líquida (por ejemplo, cuando la relación de agente volumétrico cristalino a soluto/componente amorfo (por ejemplo, rhBSSL u otros excipientes) es de al menos aproximadamente 1.0, alrededor de 1.25 o aproximadamente 1.5) y se deja cristalizar durante el proceso de liofilización, el agente volumétrico cristalino puede formar una matriz de soporte estructural para los componentes amorfos de la formulación (por ejemplo, rhBSSL) . Según se usa en la presente, el término "matriz de soporte estructural" se refiere al soporte que la estructura cristalina proporciona a la formulación (análogo a un "andamiaje"), de tal manera que la macroestructura de la torta sea ampliamente no afectada por ningún "micro-colapso" del soluto amorfo que resida dentro de los intersticios de la matriz de soporte estructural durante el secado primario. Esta matriz de soporte estructural cristalina puede permitir secado primario con una temperatura de producto por arriba de la temperatura de transición vitrea de los componentes amorfos del producto.

En ciertas modalidades de este aspecto, la concentración de masa relativa de agente volumétrico cristalino a rhBSSL es mayor que aproximadamente 1 a 1, tal como mayor de aproximadamente 1.25 a 1, mayor que alrededor de 1.5 a 1 , mayor que aproximadamente 2.0 a 1 o mayor que alrededor de 2.5 a 1, tal como entre aproximadamente 2.0 a 1 y 5.0 a 1.

En modalidades particulares de todos los aspectos de la invención, el agente volumétrico cristalino no es un aminoácido, tal como un poliol, por ejemplo, en donde el agente volumétrico cristalino es manitol.

Como se evidencia por el ejemplo 3, los inventores encontraron sorprendentemente que la adición de un agente volumétrico cristalino, tal como manitol, mejora significativamente la estabilidad de una formulación liofilizada de rhBSSL en comparación con una formulación líquida que no incluye un agente volumétrico cristalino.

En modalidades particulares de la formulación adecuada para liofilización de la presente invención, el agente volumétrico cristalino es manitol, presenta una concentración de entre alrededor de 50 mM y aproximadamente 500 mM; de preferencia en donde la concentración es de aproximadamente entre 100 m y 400 mM, o entre 150 mM y 300 mM. En modalidades de éstas preferidas, la concentración de manitol es de alrededor de entre aproximadamente 175 mM y aproximadamente 250 mM, y muy preferiblemente, en donde el manitol está presente a una concentración de entre aproximadamente 180 mM y alrededor de 210 mM; tal como en donde la concentración de manitol se selecciona del grupo que consiste en aproximadamente: 185 mM; 190 mM; 195 mM; 200 mM; y 205 mM: Agentes de estabilización Los agentes de estabilización pueden comprender las formulaciones y/o composiciones de la presente invención. En modalidades particulares las formulaciones y/o composiciones de la invención pueden comprender además un agente estabilizador, tal como un estabilizador amorfo, que sea una entidad química diferente al agente volumétrico cristalino.

El término estabilizador "amorfo" se refiere a agentes estabilizadores que son capaces de adoptar una forma amorfa bajo condiciones de liofilización típicas. El término "amorfo" se entiende comúnmente por la persona de capacidad ordinaria, e incluye el significado para describir un sólido que carece - hasta un grado detectable - de la característica del orden de largo rango de un cristal.

En ciertas modalidades de las formulaciones y/o composiciones de la presente invención, el estabilizador amorfo no es sacarosa; de preferencia el estabilizador amorfo no es un sacárido; muy preferiblemente el estabilizador amorfo es un aminoácido. En modalidades particulares de este tipo, el estabilizador amorfo se selecciona del grupo que consiste en: L-arginina; L-histidina; L-prolina; L-alanina; y glicina; muy preferiblemente en donde el estabilizador amorfo es glicina.

Según se evidencia por los ejemplos de la presente, los inventores encontraron sorprendentemente que la adición de un agente estabilizador amorfo, tal como glicina, tiene un efecto adicional y sinérgico en la estabilidad de rhBSSL presente en la formulación liofilizada. Estos efectos adecuados se muestran, en particular, cuando la glicina está presente en la formulación dentro de ciertos intervalos de concentraciones/cantidades .

En consecuencia, en modalidades particulares de la formulación adecuada para liofilización de la presente invención, el estabilizador amorfo es glicina, presente en tal formulación a una concentración de entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 100 mM; de preferencia en donde la concentración de glicina es de entre alrededor de 20 mM y alrededor de 70 mM; muy preferiblemente en donde la concentración es de aproximadamente entre 30 mM y 55 mM; más preferiblemente la glicina está presente en la formulación a una concentración de alrededor de entre 35 mM y 50 mM, tal como a una concentración de glicina seleccionada del grupo que consiste en aproximadamente: 36 mM; 38 mM; 40 mM; 42 mM; 44 MM; 46 mM; y 48 mM. pH o agentes reguladores de pH Reguladores de pH se incluyen típicamente en formulaciones farmacéuticas para mantener el pH de la formulación a un pH fisiológicamente aceptable. El pH deseable para una formulación también puede ser afectado por el agente activo. Por ejemplo, la mayoría de los agentes activos biofarmacéuticos tienen una actividad más alta dentro de un intervalo de pH específico. Generalmente, el pH de la formulación se mantiene entre aproximadamente 4.0 y aproximadamente 8.0, entre alrededor de 5.5 y alrededor de 7.5, o entre aproximadamente 6.0 y aproximadamente 7.2. Típicamente el regulador de pH se incluye en la formulación líquida a una concentración de entre aproximadamente 2 mM a alrededor de 50 mM, o entre aproximadamente 10 mM y 25 mM.

Ejemplos de reguladores de pH adecuados incluyen reguladores de pH derivados de un ácido tal como fosfato, ácido aconítico, cítrico, glutárico, málico, succínico y carbónico. Típicamente, el regulador de pH se emplea como una sal alcalina o alcalinotérrea de uno de estos ácidos. Frecuentemente el regulador de pH es fosfato o citrato, comúnmente citrato, por ejemplo citrato de sodio o ácido cítrico. Otros reguladores de pH adecuados incluyen reguladores de pH de acetato, tris e histidina.

En modalidades particulares de la formulación adecuada para liofilización, la formulación tiene un valor de pH de entre aproximadamente 6.3 y alrededor de 7.5; de preferencia el valor de pH es de entre alrededor de 6.6 y aproximadamente 7.2; más preferiblemente en donde el valor de pH se selecciona del grupo que consiste en alrededor de: 6.7; 6.8; 6.9; 7.0 y 7.1.

En ciertas modalidades, la formulación adecuada para liofilización puede comprender además un regulador de pH de fosfato de sodio. En modalidades de éstas particulares, la formulación adecuada para liofilización comprende fosfato de sodio, presente a una concentración de fosfato de entre aproximadamente 2 mM y alrededor de 20 mM; de preferencia en donde la concentración de fosfato es de entre alrededor de 5 mM y aproximadamente 15 mM; muy preferiblemente en donde la concentración de fosfato se selecciona del grupo que consiste en alrededor de: 6 mM; 8 mM; 10 mM; 12 mM y 14 mM.

Se entenderá por una persona de capacidad ordinaria que una concentración de fosfato abarcará cualquiera o las tres formas de formas de fosfato (H3P0 , (H2P04) ; (HP04)2~ o (P04)3") a concentraciones relativas aplicables, dependiendo del pH, las cuales a intervalos de pH biológicos comprenderán típicamente iones de (H2P04 , (HP04)2" como la forma de fosfato predominante. En consecuencia, a pHs fisiológicos, un regulador de pH de fosfato de sodio se proporciona típicamente por un equilibrio entre fosfato ácido disódico y fosfato diácido de sodio.

Otros excipientes Se pueden añadir otros excipientes a cualquiera de las formulaciones/composiciones de la presente invención. Otros excipientes pueden incluir agentes isotónicos tales como sales y/o conservadores, edulcorantes, colorantes, cargas, etc.

En modalidades particulares, las formulaciones/composiciones de la presente invención pueden comprender además cloruro de sodio. Por ejemplo, la formulación adecuada para liofilización puede comprender cloruro de sodio, presente a una concentración de cloruro de alrededor de entre 10 mM y 30 mM; de preferencia en donde la concentración de cloruro es de alrededor de 15 mM y 25 mM; muy preferiblemente en donde la concentración de cloruro se selecciona del grupo que consiste en alrededor de: 18 mM; 20 mM; 22 mM y 24 mM.

III. Formulaciones específicas y otros aspectos de la presente invención Los inventores describen en la presente una formulación particular que incluye rhBSSL que es adecuada para liofilización que tiene una combinación específica de excipientes dentro de un intervalo de concentración específico. Como se evidencia en los ejemplos, esta formulación tiene utilidad particular para formar una formulación liofilizada de rhBSSL que muestra mejoras en una o más características como las descritas en la presente. En consecuencia, en una modalidad particular, una formulación adecuada para liofilización de la presente invención comprende : • rhBSSL presente a una concentración de aproximadamente entre 10 mg/mL y 15 mg/mL; • manitol presente a una concentración de aproximadamente entre 180 mM y 210 mM; • glicina presente a una concentración de alrededor de entre 35 mM y 50 mM; • fosfato de sodio presente a una concentración de fosfato de alrededor de entre 2 mM y 20 mM, de preferencia a alrededor de entre 5 mM y 15 mM; y • cloruro de sodio presente a una concentración de cloruro de alrededor de entre 5 mM y 50 mM, de preferencia a aproximadamente entre 15 mM y 25 mM, • en donde la formulación tiene un valor de pH de alrededor de entre 6.3 y 7.2.

Después de la liofilización de esta formulación (líquida) , tal como mediante un método como el descrito en la presente, se forma una formulación liofilizada de rhBSSL que muestra mejoras en una o más características como las descritas en la presente.

En consecuencia, otro aspecto de la presente invención se refiere a una formulación liofilizada que puede obtenerse mediante, tal como la que se obtiene de, liofilización de una formulación adecuada para liofilización, como la descrita en la presente.

En ciertos de estos aspectos, la rhBSSL en la formulación liofilizada está presente sustancialmente en forma no cristalina. Por ejemplo, menos de aproximadamente 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5% o 0.1% de la rhBSSL puede estar en forma cristalina, o ninguna forma cristalina de rhBSSL puede ser detectable, por ejemplo, por análisis de difracción de rayos X en polvo. En modalidades preferidas de este tipo, la rhBSSL está presente en forma amorfa.

En modalidades particulares de la formulación liofilizada, el agente volumétrico cristalino es manitol . En ciertas de estas modalidades, el manitol está presente sustancialmente en forma cristalina; y/o el manitol se incluye a una cantidad relativa de entre aproximadamente 1 mg y alrededor de 10 mg por mg de la rhBSSL. De preferencia, manitol se incluye a una cantidad relativa de entre alrededor de 2 mg y aproximadamente 5 mg, muy preferiblemente entre alrededor de 2.7 mg y aproximadamente 3.1 mg, por mg de rhBSSL. Por "presente sustancialmente" con referencia a un componente significa que entre alrededor de 5% y aproximadamente 50%, tal como entre aproximadamente 10% y alrededor de 50% o entre alrededor de 25% y aproximadamente 50% del componente está en la forma determinada. En modalidades preferidas, el manitol está presente predominantemente en forma cristalina. Por "presente predominantemente" con referencia a un componente significa que más de alrededor del 50%, tal como más de aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90% o 95% del componente está en la forma determinada .

Los inventores demuestran que a diferencia del agente volumétrico cristalino, sorprendentemente ninguna otra forma cristalina fue detectada en ciertas de las formulaciones liofilizadas de la presente invención. En particular, y con referencia a la formulación descrita en el ejemplo 4, no hubo evidencia de glicina cristalina, fosfato de sodio cristalino e incluso ninguna evidencia de cloruro de sodio cristalino.

En consecuencia, en modalidades preferidas de la formulación liofilizada, el manitol es el único componente de la formulación que está presente sustancialmente en forma cristalina. Por ejemplo, manitol es el único componente dentro de la formulación liofilizada para la cual cristales pueden detectarse; tal como por detección usando análisis de difracción de rayos X en polvo. En modalidades alternativas de la formulación liofilizada, el manitol es el único excipiente que está presente sustancialmente en forma cristalina; o en donde el manitol es el único agente volumétrico presente en la formulación; y/o es el único agente volumétrico presente en forma cristalina, tal como presente sustancialmente en forma cristalina.

La formulación liofilizada de la presente invención comprende un estabilizador amorfo que es una entidad química diferente al agente volumétrico cristalino. En modalidades de este tipo preferidas de la formulación liofilizada de la presente invención, el estabilizador amorfo es glicina, y: la glicina está presente sustancialmente en forma no cristalina; y/o la glicina se incluye a una cantidad relativa de entre aproximadamente 0.1 mg y alrededor de 0.5 mg por mg de la rhBSSL. De preferencia, glicina se incluye a una cantidad relativa de entre alrededor de 0.1 mg y aproximadamente 0.4 mg, muy preferiblemente entre alrededor de 0.2 mg y aproximadamente 0.3 mg, por mg de rhBSSL. En modalidades más preferidas, la formulación liofilizada de la presente invención comprende, como el estabilizador amorfo, glicina, en donde la glicina está presente en forma amorfa. Por ejemplo, no se puede detectar glicina en forma cristalina por análisis de difracción de rayos X en polvo, tal como particularmente por la ausencia de picos detectables característicos de glicina cristalina por ejemplo la ausencia de picos de difracción de rayos X en polvo detectables a valores D 17.906, 23.693 y/o 28.429 2?.

En particulares de estas formas preferidas de la formulación liofilizada, la glicina es el único estabilizador presente en la formulación, y/o es el único estabilizador presente en forma sustancialmente no cristalina, y en formas aún más preferidas glicina es el único estabilizador presente en forma amorfa.

En modalidades adicionales, la formulación liofilizada de la presente invención comprende fosfato de sodio, de preferencia en donde el fosfato de sodio está presente sustancialmente en forma no cristalina; y/o el fosfato de sodio se incluye a una cantidad relativa de entre alrededor de 0.15 mg y aproximadamente 0.25 mg por mg de la rhBSSL. En tales modalidades, el fosfato de sodio puede comprender fosfato ácido disódico y fosfato diácido de sodio.

Los inventores demuestran el sorprendente descubrimiento de que a pesar de la presencia de glicina en ciertas de las formulaciones de la invención (un excipiente que se sabe promueve la cristalización de fosfato de sodio) , fosfato de sodio cristalino no es detectable. En consecuencia, en ciertas modalidades, la formulación liofilizada de la presente invención comprende fosfato de sodio presente en forma amorfa.

En otras modalidades más, la formulación liofilizada de la presente invención comprende cloruro de sodio; de preferencia en donde el cloruro de sodio está presente sustancialmente en forma no cristalina; y/o el cloruro de sodio se incluye a una cantidad relativa de entre aproximadamente 0.02 mg y alrededor de 0.3 mg por mg de la rhBSSL.

Los inventores demuestran el sorprendente descubrimiento de que a pesar de que cloruro de sodio normalmente forma cristales fácilmente, fosfato de sodio cristalino no es detectable. En consecuencia, en ciertas modalidades, la formulación liofilizada de la presente invención comprende cloruro de sodio presente en forma amorfa .

Los inventores describen aquí una formulación liofilizada particular que incluye rhBSSL que tiene una combinación específica de excipientes dentro de un intervalo específico de cantidades relativas. Según se evidencia en los ejemplos, esta formulación liofilizada muestra mejorías en una o más características como las descritas aquí. En consecuencia, en una modalidad particular, una formulación liofilizada de la presente invención comprende por mg de la rhBSSL: • manitol, presente a una cantidad relativa de entre alrededor de entre aproximadamente 2 mg y alrededor de 5 mg, de preferencia entre aproximadamente 2.7 mg y aproximadamente 3.1 mg; • glicina, presente a una cantidad relativa de entre aproximadamente 0.1 mg y alrededor de 0.4 mg, de preferencia entre aproximadamente 0.2 mg y alrededor de 0.3 mg; · fosfato de sodio, presente a una cantidad relativa de entre aproximadamente 0.05 mg y alrededor de 0.15 mg; y • cloruro de sodio, presente a una cantidad relativa de entre alrededor de 0.06 mg y aproximadamente 0.18 mg.

En modalidades preferidas de esta formulación liofilizada particular de la invención: manitol está presente sustancialmente en forma cristalina, de preferencia el manitol está presente predominantemente en forma cristalina; glicina está presente en forma amorfa; fosfato de sodio está presente en forma amorfa; y/o cloruro de sodio está presente en forma amorfa.

Como será aparente ahora para la persona de capacidad ordinaria, las formulaciones liofilizadas de la presente invención pueden prepararse en cantidades absolutas variables, tal como en grandes lotes de fabricación preparando, por e emplo alrededor de: 100 g, 1 Kg, 10 Kg, 100 Kg, 250 Kg o 500 Kg de tal formulación liofilizada. Para administración a individuos tales como pacientes que lo requieran, sin embargo, cantidades más pequeñas serán deseadas en cantidades que puedan ser administradas, en cantidades singulares o múltiples de este tipo, al individuo en cualquier administración o curso de administraciones determinado .

En consecuencia, en otro aspecto la invención se refiere a tal cantidad deseada de una formulación liofilizada de la presente invención, que es una dosis única de una formulación liofilizada como la descrita en la presente en donde la rhBSSL está presente en tal dosis única en una cantidad absoluta de entre aproximadamente 1 mg y alrededor de 500 mg. En una modalidad preferida de esta dosis única, la rhBSSL está presente en una cantidad absoluta de entre aproximadamente 5 mg y alrededor de 25 mg, y muy preferiblemente en donde la cantidad se selecciona del grupo que consiste en aproximadamente: 8 mg; 10 mg; 12 mg; 14 mg; y 16 mg. A manera de ejemplos no limitativos de aplicaciones para estas dosis únicas, aquellas dosis únicas que comprendan entre alrededor de 25 mg y aproximadamente 50 mg pueden tener utilidad para tratar fibrosis quística en adultos y/o pacientes con insuficiencia pancreática; y aquellas dosis únicas que comprendan entre alrededor de 10 mg y aproximadamente 20 mg pueden tener utilidad para tratar bebés tales como bebés prematuros. En ciertas modalidades, tal como donde una "dosis media" pueda requerirse para complementar una dosis única entera, por ejemplo cuando una dosis precisa para peso corporal se requiera tal como para administración a bebés prematuros y/o pequeños, una dosis única de la presente invención puede comprender rhBSSL presente en una cantidad absoluta de entre aproximadamente 2 mg y 10 mg, tal como una cantidad de rhBSSL seleccionada de aproximadamente: 4 mg; 16 mg y 8 mg. Como se describe en la presente, la persona de capacidad ordinaria ahora será fácilmente capaz de representar la cantidad de rhBSSL en cualquier formulación liofilizada en dosis única de la presente invención en términos de una cantidad de rhBSSL activa tal como por un número de unidades de enzima (U) al, por ejemplo, usar un ensayo de actividad como el descrito aquí .

En ciertas modalidades, una dosis única de la presente invención es útil para, y/o está específicamente adaptada para, administración o bebés prematuros. Por ejemplo, dicha administración puede incluir administración de un alimento líquido para bebés por medio del tracto gastrointestinal, en donde la dosis única de la formulación liofilizada haya sido reconstituida en el alimento para bebés antes de dicha administración. En ciertas modalidades, el alimento líquido para bebés es un alimento líquido para bebés a base de leche o a base de grasa (tal como a base de grasa de leche o vegetal) . En modalidades particulares, el alimento líquido para bebés es leche materna pasteurizada, y en modalidades alternativas es una fórmula para bebés tal como una descrita en solicitudes co-pendientes WO 2012/052059 y WO 2012/052060. La administración por medio del tracto gastrointestinal puede llevarse a cabo convenientemente por alimentación, tal como por mamila. Como alternativa, la administración puede efectuarse por otros medios, por ejemplo, mediante el uso de un gotero, jeringa, cuchara o un trapo empapado, tal como se pueda requerir si el bebé tiene una deformidad de la boca. En ciertas modalidades, tal como con bebés prematuros o débiles de peso extremadamente bajo, la administración se puede hacer directamente al tracto gastrointestinal por medio de un tubo gástrico, gastrostomía o duodenal .

Los bebés prematuros están particularmente en riesgo, y en consecuencia requieren alimentación y administración cuidadosas de agentes terapéuticos. En consecuencia, existe una gran necesidad por agentes terapéuticos para su administración a bebés que sean estables, y por consiguiente conserven su efecto terapéutico durante largos periodos de tiempo. Cambios significativos o sustanciales a la estabilidad de agentes terapéuticos para su administración a tales bebés pueden llevar a una dosificación incompleta, excesiva o variable para estos bebés durante un curso de terapia; potencialmente con resultados mortales.

En consecuencia, en ciertas modalidades la presente invención incluye la formulación liofilizada como la descrita en la presente, o la dosis única como la descrita aquí, en donde la rhBSSL comprende rhBSSL estable. Por "estable" se intenta decir que la actividad o potencial terapéutico de la rhBSSL, y/o la formulación completa, se mantiene durante el periodo de tiempo deseado después de almacenamiento a una dosis recomendada. A manera de ejemplo no limitativo, este periodo de tiempo deseado puede ser durante al menos aproximadamente: 3 meses, 6 meses, 12 meses, 12 meses, 18 meses, 24 meses o más largo, tal como 72 meses: y esta temperatura de almacenamiento recomendada puede ser de alrededor de -18°C, +4°C, +18°C o aproximadamente +22°C.

En ciertas modalidades de la invención, la formulación liofilizada o la dosis única que comprende rhBSSL estable no forma fácilmente agregados, tal como durante almacenamiento durante estos periodos de tiempo. En ciertas de estas modalidades, los agregados son agregados insolubles. La presencia de agregados insolubles de rhBSSL en una formulación terapéutica, incluso una dada oralmente y particularmente una dada a bebés prematuros, puede tener efectos significativos en la dosificación y en consecuencia eficacia y/o seguridad de la terapia. Una reducción en la cantidad de agregados insolubles de rhBSSL sería por lo tanto deseada toda vez que puede contribuir a menos variación en eficacia y usos terapéuticos más seguros de rhBSSL. A manera de ejemplo no limitativo, "no forma fácilmente" agregados incluye que después de almacenamiento +25°C durante 6 meses, menos de aproximadamente 5%, tal como menos de aproximadamente 3%, 2.5% o 2% de agregados de rhBSSL están presentes. La cantidad de agregados de rhBSSL puede ser cuantificada, por ejemplo, por SE-HPLC como se describe en la presente. Como alternativa, la velocidad de formación de agregados puede ser menor que aquella mostrada para la formulación NI descrita aquí.

En ciertas modalidades, la formación de agregados en la formulación liofilizada o dosis única es el resultado de almacenamiento de la formulación liofilizada a una temperatura de entre aproximadamente 0°C y alrededor de +40°C; de preferencia en donde la temperatura de almacenamiento se selecciona del grupo que consiste en aproximadamente: +5°C; +10°C; +15°C; +20°C y +25°C. En otras modalidades, esta formación de agregación puede ser el resultado de interacciones superficiales, luz (UV) , radiación, modificación química, presencia de tensioactivos .

En ciertas modalidades, la vida útil de la formulación liofilizada o la dosis única es prolongada, por ejemplo hasta aproximadamente 18 meses, 25 meses o 72 meses, después de almacenamiento a +4°C, +18°C o aproximadamente +22°C.

En otro aspecto más, la invención se refiere a un método para producir una formulación liofilizada de rhBSSL, el método comprende las etapas de: proporcionar una formulación adecuada para liofilización como la descrita, definida o reclamada en la presente; y liofilizar la formulación. El método puede comprender las etapas de: congelar la formulación adecuada para liofilización; secado primario de la formulación congelada; y secado secundario de la formulación secada primaria.

En modalidades preferidas de este método, cada una de las etapas de este método puede llevarse a cabo usando parámetros como los descritos o definidos para esa etapa en la presente. Por ejemplo, y como se muestra en más detalle en el ejemplo 4 en la presente, la etapa de congelación puede llevarse a cabo al enfriar la formulación adecuada para liofilización hasta aproximadamente -50°C a una velocidad a alrededor de 0.8°C/hora, y además de estas modalidades la formulación congelada puede ser equilibrada al mantener a -50°C durante 5 horas. Con respecto a secado primario, esta etapa puede llevarse a cabo al aplicar un vacío de alrededor de 0.2 mbares con una temperatura de anaquel de 0°C, y continuarse durante alrededor de 13 horas y/o hasta que la temperatura déla muestra alcance aquella del anaquel indicando que la sublimación de los cristales de hielo se completó. Secado secundario puede ser iniciado al reducir la presión de la cámara hasta aproximadamente 0.02 mbares y elevar la temperatura de los anaqueles a alrededor de +25°C a una velocidad de aproximadamente l°C/hora, y secado secundario puede continuarse durante alrededor de 10 horas hasta que el producto tenga un contenido de humedad de entre aproximadamente 0.8% y 0.2%. La liofilización de la formulación líquida puede llevarse a cabo con viales de vidrio puestos en una cámara de liofilización; viales que luego son, cuando la liofilización se completa, sellados al vacío con tapones de caucho.

En un aspecto relacionado, la presente invención se refiere también a una formulación liofilizada de rhBSSL que se puede obtener mediante, tal como se obtiene de, el método descrito arriba.

Para administrar la rhBSSL a un individuo, las formulaciones liofilizadas de la presente invención son típicamente reconstituidas; es decir disueltas en un solvente (normalmente de base acuosa) para formar una solución de rhBSSL que puede ser más fácilmente biodisponible para dicho individuo. En consecuencia, en un aspecto más la presente invención se refiere a un método para producir una formulación reconstituida de rhBSSL, el método comprende las etapas de: proporcionar ya sea una formulación liofilizada como la descrita, definida o reclamada en la presente, o una dosis única como la descrita, definida o reclamada en la presente; y reconstituir la formulación liofilizada o dosis única en un líquido, por ejemplo en un solvente tal como un solvente de base acuosa.

En métodos de este tipo particulares, la formulación reconstituida resultante tiene un pH de aproximadamente entre 5.9 y 7.9; de preferencia en donde el pH es de aproximadamente entre 6.4 y 7.4; muy preferiblemente en donde el pH se selecciona del grupo que consiste en alrededor de: 6.5; 6.6; 6.7; 6.8; 6.9; 7.0; 7.1; 7.2 y 7.3.

En métodos de este tipo adicionales, la formulación reconstituida resultante comprende la rhBSSL en una cantidad de entre aproximadamente 2.5 mg y alrededor de 50 mg; de preferencia en donde la cantidad es de entre aproximadamente 5 mg y alrededor de 25 mg; muy preferiblemente en donde la cantidad se selecciona del grupo que consiste en aproximadamente: 7.5; 10; 12.5; 15, 17.5 y 20 mg.

Cierta aplicación de la presente invención se refiere a la provisión de formulaciones de rhBSSL adecuadas para su administración a bebés humanos. En consecuencia, en ciertas modalidades de este método, la formulación liofilizada o dosis única es reconstituida en un alimento para bebés líquido, y en consecuencia la formulación constituida es reconstituida en un alimento líquido para bebés .

En ciertas modalidades de la presente invención, el alimento líquido para bebés es leche materna no fresca en la cual la formulación liofilizada o dosis única se reconstituye como leche materna pasteurizada . En otras modalidades la leche materna ha sido congelada, tal como después de pasteurización. En modalidades particulares, la leche materna usada en la presente invención proviene de un banco de leche materna. Los bancos de leche materna pueden incluir el Banco Nacional de Leche (NMB, por sus siglas en inglés) , una organización nacional que recolecta leche humana donada, asegura la seguridad y calidad de la leche y la pone a disposición para bebés que lo requieran, o la Asociación de Bancos de Leche Humana de Norteamérica (HMBANA, por sus siglas en inglés) , una asociación no lucrativa de bancos de leche humana donantes establecida en 1985 para establecer estándares para y para facilitar el establecimiento y operación de bancos de leche en Norteamérica.

En una modalidad alternativa, la formulación liofilizada o dosis única es reconstituida en una fórmula para bebés. La persona experta estará consiente de las muchas fórmulas para bebés que están disponibles comercialmente, las cuales incluyen: Enfamil™, Pregestimil™, Nutramigen™ y Nutramigen AA™ (todas comercializadas o fabricadas por Mead Johnson) ; Similac™, Isomil™, Alimentum™ y EleCare™ (todas comercializadas o fabricadas por Abbott Laboratories, división Ross) ; Nestlé: el más grande productor de fórmula en el mundo, hace GoodStart™ (comercializada o fabricada por Nestle/Gerber Products Company) ; Farexl™ y Farex2™) (comercializada o elaborada por Wockhardt Nutrition) . Para bebés prematuros, otras fórmulas para bebés tales como Similac Neosure, Entramil Premature, Similac Special Care, Cow & Gate Nutriprem 2 y Entramil Enfacare también están disponibles. Algo común para todas las fórmulas para bebés es que contienen una fuente de lípidos que son los substratos para lipasas tales como rhBSSL. En una modalidad particular, la fórmula para bebés tiene la composición (antes de la adición de rhBSSL) generalmente de conformidad con, o sustancialmente como las especificaciones mostradas en el Anexo A de las solicitudes co-pendientes O 2012/052059 y WO 2012/052060, o como una recomendada por el ESPGHAN Coordinated International Expert Group (Koletzko et al, 2005; J Ped Gastro Nutr 41:584-599) . En ciertas modalidades, la fórmula para bebés contiene uno o más de los ingredientes, y a aproximadamente los niveles mostrados en el anexo B. En modalidades particularmente adecuadas, la fórmula para bebés contiene al menos 0.5% (de grasa total) que es ácido docosahexaenoico (DHA) y/o ácido araquidónico (AA) , y en modalidades de este tipo adicionales en donde la concentración de AA debe alcanzar al menos la concentración de DHA, y/o si ácido eicosapentaenoico (C20:5 n-3) se añade su concentración no excede el contenido de DHA.

Este alimento líquido para bebés que comprende rhBSSL reconstituida a partir de la formulación liofilizada o dosis única de la presente invención almacenada, por ejemplo, durante 9 minutos a +25°C, se espera que tenga niveles más bajos de agregados insolubles que un alimento líquido para bebés hecho a partir de formulaciones de rhBSSL de la técnica anterior (una solución acuosa de rhBSSL) , o hechas a partir de rhBSSL liofilizada sin ningún agente volumétrico o estabilizador, en cada caso almacenada similarmente durante 9 meses a +25°C.

En un aspecto particular, la presente invención se refiere a una formulación reconstituida de rhBSSL que comprende : (i) la rhBSSL presente en una cantidad absoluta de entre 10 mg y 20 mg; (ii) manitol presente en una cantidad absoluta de entre 27 mg y 62 mg; (iii) glicina presente en una cantidad absoluta de entre 2 mg y 6 mg; y en donde la formulación es reconstituida en un alimento líquido para bebés; y la formulación reconstituida tiene un pH de entre 6.4 y 7.4.

Los inventores demuestran además aquí, que el uso de glicina en formulaciones liofilizadas de rhBSSL proporciona propiedades sorprendentes y adecuadas adicionales a tal formulación de esta proteína específica. En consecuencia, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un uso de glicina para estabilizar rhBSSL, presente en una formulación liofilizada, en donde: • la glicina está presente en la formulación liofilizada sustancialmente en forma no cristalina; y/o « la glicina se incluye en la formulación liofilizada a una cantidad relativa de entre aproximadamente 0.1 mg y alrededor de 0.4 mg, de preferencia entre alrededor de 0.2 mg y aproximadamente 0.3 mg por mg de la rhBSSL.

La formulación liofilizada mencionada comprende además un agente volumétrico cristalino que no es glicina, tal como un agente volumétrico cristalino que es manitol . En modalidades preferidas de este aspecto, la glicina presente en la formulación liofilizada está presente en forma amorfa.

En modalidades de este tipo que más se prefieren de tal uso, la formulación liofilizada comprende además, por mg de la rhBSSL: • manitol, incluido en la formulación liofilizada como el agente volumétrico cristalino, a una cantidad relativa de entre aproximadamente 2 mg y alrededor de 5 mg, de preferencia entre alrededor de 2.7 mg y aproximadamente 3.1 mg; • fosfato de sodio incluido en la formulación liofilizada a una cantidad relativa de entre alrededor de 0.05 mg y aproximadamente 0.15 mg; y · cloruro de sodio se incluye en la formulación liofilizada a una cantidad relativa de entre aproximadamente 0.06 mg y alrededor de 0.18 mg.

En otra modalidad preferida de estas modalidades de este uso, en tal formulación liofilizada: « el manitol está presente sustancialmente en forma cristalina ; • la glicina está presente en forma amorfa; • el fosfato de sodio está presente en forma amorfa ; y « el cloruro de sodio está presente en forma amorfa .

Estos usos de glicina proporcionan, en ciertas modalidades, formulaciones de rhBSSL que tienen estabilidad incrementada. En consecuencia, en modalidades particulares la estabilización de la rhBSSL se caracteriza por la velocidad de formación de agregados de la rhBSSL. Por ejemplo, la formación de agregados es el resultado de almacenamiento de la formulación liofilizada a una temperatura de entre aproximadamente 0°C y +40°C; de preferencia en donde la temperatura de almacenamiento se selecciona del grupo que consiste en alrededor de: +5°C; +10°C; +15°C; 20°C y +25°C.

En consecuencia, en un aspecto relacionado la presente invención se refiere a un método para reducir y/o minimizar la formación de agregados insolubles de rhBSSL presente en un alimento líquido para bebés, el método comprende las etapas de: proporcionar: una formulación liofilizada o una dosis única como la descrita, definida o reclamada en la presente; y reconstituir la formulación liofilizada o dosis única en un alimento líquido para bebés.

En ciertas modalidades de este método, la formulación o dosis única se añade directamente al alimento líquido para bebés y se disuelve en el mismo. En modalidades alternativas, la formulación liofilizada o dosis única se disuelve primero en un primer líquido (tal como agua) , el cual es luego añadido al alimento líquido para bebés.

En otras modalidades de este método, el método se practica: para incrementar la cantidad de rhBSSL activa presente en solución en el alimento líquido para bebés con relación a la cantidad de agregados insolubles; y/o para reducir variabilidad en potencia de la rhBSSL entre diferentes alimentos líquidos para bebés.

Un método importante en la caracterización de las formulaciones y/o composiciones de la presente invención es la determinación del grado de agregaciones de rhBSSL. En consecuencia, un aspecto más de la presente invención se refiere a un método para determinar una reducción en agregación de rhBSSL, el método comprende las etapas de: proporcionar una formulación liofilizada o una dosis única como la descrita, definida o reclamada en la presente; almacenar la formulación liofilizada o dosis única; y determinar, en uno o más puntos de tiempo, el porcentaje de niveles de alto peso molecular (% HMW) de la rhBSSL en la formulación liofilizada o la dosis única, determinando de esta manera el nivel de agregación de la rhBSSL. El grado y/o nivel de agregación de rhBSSL puede determinarse y/o cuantificarse por cualquier método adecuado, tal como por SE-HPLC para detectar niveles porcentuales de HMW de rhBSSL, tal como por ejemplo se describe en los ejemplos de la presente.

En métodos de este tipo preferidos, el método comprende la etapa de determinar si la formulación liofilizada comprende menos de aproximadamente 3.5%, 3.0%, 2.5%, 2.25%, 2.0%, 1.75% o 1.5% especies HMW de la rhBSSL, según se determina por SE-HPLC, después de almacenamiento a +5°C durante 18 meses.

Se debe entender que la aplicación de las enseñanzas de la presente invención a un problema o ambiente específico estará dentro de las capacidades de alguien que tenga capacidad ordinaria en la técnica en vista de las enseñanzas contenidas aquí. Todas las referencias, patentes y publicaciones citadas en la presente se incorporan en la presente a manera de referencia en su totalidad. Ejemplos de las formulaciones y composiciones de la presente invención y métodos representativos, usos o procesos para su preparación o uso aparecen a continuación.

E emplos La siguiente ej emplificación, incluyendo los experimentos llevados a cabo y los resultados logrados, también ilustra varias modalidades actualmente particulares de la presente invención, y se proporcionan para efectos ilustrativos únicamente y no se deben considerar como limitativos de la presente invención.

Ejemplo 1 Experimento AH7507 Configuración del experimento: El efecto de un agente volumétrico de cristalización, y opcionalmente un agente de estabilización amorfo, en las propiedades de una formulación liofilizada de rhBSSL se estudió usando un diseño nivel 2 factorial completo (22) con 2 puntos centrales. Se usaron excipientes en varias combinaciones y cantidades para producir 7 formulaciones liofilizadas que tenían las composiciones representadas en la tabla 1. La temperatura se añadió como un tercer factor (almacenamiento durante 18 meses a +5°C y +25°C) al diseño factorial para muestras a ser almacenadas durante 18 meses, y para un periodo más corto de 9 meses las muestras también se almacenaron a +40°C. En periodos regulares durante el almacenamiento, se tomaron muestras de las diferentes formulaciones liofilizadas, y se estudiaron usando cromatografía de líquidos de alto rendimiento y exclusión de tamaño (SE-HPLC, por sus siglas en inglés) , difracción de rayos X en polvo (PXRD, por sus siglas en inglés) y otras técnicas.

Tabla 1 Cantidad de rhBSSL y excipientes en polvo liofilizado de las formulaciones liofilizadas de AH7507 * Cantidad de fosfato de sodio calculada a partir de pesos moleculares promedio ponderados y masa de material de los dos componentes de fosfato de sodio.

Resultados (i) monomerización y agregación de rhBSSL estudiada por SE-HPLC: Durante almacenamiento a largo plazo, rhBSSL en forma monomérica se detectó como pico principal y la formación de agregados de rhBSSL detectados como picos de peso molecular más alto se estudió usando cromatografía de líquido de alto rendimiento y exclusión de tamaño (SE-HPLC) . Las dos respuestas se conectan como agregación o rhBSSL podría, en consecuencia, reducir la cantidad restante de monómero de rhBSSL. Las figuras 1A y IB muestran la cantidad de monómero de rhBSSL (cuantificada por el pico principal de SE-HPLC) presente en las diferentes formulaciones liofilizadas después de almacenamiento a +5°C durante varios periodos de tiempo, las figuras 2A y 2B muestran lo mismo después de almacenamiento a +25°C, y las figuras 3A y 3B muestran lo mismo después de almacenamiento a +40°C.

Sorprendentemente, no sólo es el porcentaje de monómeros de rhBSSL más alto para todas las formulaciones probadas que contienen un agente volumétrico de cristalización (en este ejemplo manitol) que otra formulación de rhBSSL (véase ejemplo 3) : rhBSSL liofilizada a granel sin ningún agente volumétrico o estabilizador, y/o una solución acuosa de rhBSSL, sino que la inspección de los resultados representados aquí demuestra que en particular las formulaciones liofilizadas N , N6 y N7, que comprenden una cantidad de glicina mayor que 0 mg/vial pero menor que 7.21 mg/vial, tienen una velocidad reducida de pérdida de monómero de rhBSSL en comparación con las demás formulaciones que comprenden ya sea ninguna glicina o 7.21 mg de glicina por vial. Este efecto se observa más claramente después de alrededor de 12 meses de almacenamiento a +25°C, pero también se observa evidencia después de la misma duración de almacenamiento a +5°C, y entre alrededor de 3 y 6 meses de almacenamiento a las condiciones más extremas de +40°C.

En las figuras 1A, IB , 2A , 2B , 3A , 3B , 4A , 4B , 5A , 5B , 6A y 6b, las clases generales de concentración de glicina que estuvieron presentes en cada formulación líquida antes de la liofilización se indican también por el sombreado de los símbolos graficados, con símbolos sólidos representando una "alta" concentración de glicina de 77 mM, los símbolos vacíos representando una "baja" concentración de glicina de 0 mM y los símbolos con rayas representando concentraciones de glicina "medias" de 27 mM (para N6 y N7) y 33 mM (para N4) . Esta codificación, particularmente a la temperatura de +40°C, ayuda a la interpretación de estas gráficas con respecto a la mayor estabilidad de las formulaciones que se obtuvieron a partir de las concentraciones de glicina "medias" .

Este efecto estabilizador sorprendentemente adicional de glicina, especialmente dentro de un intervalo de cantidades particular, se encuentra además soportado a partir de una velocidad más baja de formación de agregados de rhBSSL para formulaciones N4 , N6 y N7 en comparación con las demás formulaciones, después de almacenamiento a las tres temperaturas estudiadas. Las figuras 4A y 4B muestran la cantidad de agregados de rhBSSL (cuantificada por los picos principales de alto peso molecular de SE-HPLC) presentes en las diferentes formulaciones liofilizadas después de almacenamiento a +5°C durante varios periodos de tiempo. Las figuras 5A y 5B muestran lo mismo después de almacenamiento a +25°C y las figuras 6A y 6B muestran lo mismo después de almacenamiento a +40°C. El efecto se ve claramente a las temperaturas de almacenamiento más altas de +25°C y +40°C.

Resultados (ii) agregados insolubles de rhBSSL: Se encuentra que ese significado que los agregados de rhBSSL no son fácilmente solubilizados , por ejemplo después de agitación en un regulador de pH que contiene 0.1% de SDS .

Resultados (iii) cristalización de componentes de la formulación estudiada por PXRD: Se usó difracción de rayos X en polvo (PXRD) para determinar la forma cristalina de los componentes de cada formulación del experimento AH7507 en varios puntos de tiempo durante el experimento, a partir del tiempo cero hasta el muestreo de almacenamiento final. Todos los puntos de tiempo muestreados para una formulación determinada dieron resultados similares, que PXRD mostró que la matriz cristalina en las muestras liofilizadas NI a N7 aparecían principalmente delta-manitol , con cierta cantidad pequeña de beta manitol aparecida detectada en la formulación N4. No se detectó evidencia de rhBSSL cristalina por PXRD.

Sorprendentemente, a pesar de la enseñanza de la técnica anterior de que la glicina fácilmente se cristaliza durante la liofilización, ninguna glicina cristalina podría detectarse en formulaciones N4, N6 o N7 ; aquellas formulaciones que a partir de los estudios SE-HPLC anteriores parecieron mostrar estabilidad mejorada en términos de pérdida reducida de monómeros de rhBSSL y formación reducida de agregados de rhBSSL (insoluble) . En la formulación N5, sin embargo, la formulación que tenía la cantidad más alta de glicina presente (7.21 mg/vial) , beta-glicina cristalina pudo ser detectada. En la figura 7, el patrón de PXRD para las formulaciones N4 , N5, N6 y N7 ha sido superpuesto para comparación. Los picos que indican la presencia de beta-glicina en formulación N5, pero sorprendentemente no en cualquier otra de las formulaciones que contienen glicina, han sido marcados con flechas.

De manera sorprendentemente adicional, ninguna evidencia de cloruro de sodio o fosfato de sodio cristalino se detectó en ninguna de las formulaciones N4 a N7 , a pesar de que se cree que ambas sales generalmente forman fácilmente cristales durante la liofilizació .

Resultados (iv) análisis de regresión lineal múltiple (MLR, por sus siglas en inglés) : Datos obtenidos de las formulaciones muestreadas en los últimos puntos de tiempo de almacenamiento fueron evaluados por análisis MLR en Modde 9.0 (Umetrics AB) . El análisis se llevó a cabo en el punto de tiempo de 9 mes almacenado a +40°C y el punto de tiempo de mes 18 para las muestras almacenadas a +5°C y +25°C. Muestras de almacenamiento a +40°C durante 9 horas fueron evaluadas con base en actividad de enzima específica, pico principal de SE-HPLC (monómeros de rhBSSL) y picos HM (agregados de rhBSSL) . Muestras almacenadas a +5°C y +25 °C durante 18 meses fueron evaluadas por MLR, con temperatura añadida a un modelo en el cual las muestras de ambas temepraturas fueron evaluadas en el mismo modelo.

Para el modelo MLR aplicado a datos de muestras almacenadas a +40°C, en una evaluación de monómero de rhBSSL (pico principal de SEC-HPLC) , se observó un pequeño efecto de manitol: el efecto cuadrado de manitol mostró un efecto negativo al pico principal de SE-HPLC (es decir, un incremento en el cuadrado de la cantidad de manitol está débilmente asociado con una reducción en la cantidad de monómeros de rhBSSL) . Este efecto negativo fue bajo y sólo separado del intervalo de confianza de 95%. Ninguno de los factores investigados mostró ningún efecto significativo en la actividad de enzima específica.

Para el modelo MLR aplicado a datos de las muestras almacenadas a +40°C, en una evaluación de agregados de rhBSSL (picos de SEC-HPLC HMW) , se observó un efecto significativo de glicina: la presencia y cantidad de glicina compensó una gran porción de la varianza (R2 0.991) en SE-HPLC HMW. Aunque Q2 (R2 validada cruzada) fue relativamente baja a -10.032, a partir de este análisis de un solo punto de tiempo, este resultado es soportado por la tendencia observada en las figuras 6A y 6b, con glicina pareciendo tener el efecto estabilizador más efectivo en una cantidad intermedia entre cero y 7.21 mg/vial. Esto se ve más claramente en la figura 8, la cual muestra que las formulaciones menos ventajosas son aquellas con ausencia completa de glicina (NI, N2 y N3 -"categoría 1") toda vez que éstas son las formulaciones con el porcentaje más alto de SE-HPLC HMW. Un porcentaje casi tan alto de SE-HPLC HMW se ve en la muestra N5 (categoría 1) indicando una formulación desfavorable en esta muestra también. En las formulaciones con una cantidad intermedia de glicina (N4, N6 y N7 - "categoría 2") , el porcentaje de SE-HPLC HMW es significativamente más bajo. Estas muestras de categoría 2 son aquellas que comprenden glicina, pero no mostraron evidencia en PXRD de la presencia de beta-glicina cristalina. Estos datos indican que la presencia de glicina, en particular la presencia de glicina sin cantidades particulares y/o en forma no cristalina, tiene un efecto de inhibir la formación/reducción de la cantidad de agregados en las muestras liofilizadas . La interpretación de estos datos presentados usando el porcentaje de incremento relativo en picos de HMW totales, sugiere que no sólo es una concentración de glicina intermedia adecuada para reducir la formación de agregados de rhBSSL, sino que (en comparación con N6/N7 a N4) la presencia de cierto manitol tiene un efecto sinérgico adicional al reducir la cantidad de agregados de rhBSSL (insolubles) después de almacenamiento a +40°C durante 9 meses.

El modelo MLR aplicado a muestras almacenadas a +40°C se usó para diseñar una composición de una formulación favorable con respecto a las cantidades más bajas de SE-HPLC HMW, lo cual se determinó por el modelo para consistir de 4 mg de glicina por vial y alrededor de 50 mg de manitol por vial (con las mismas cantidades/relaciones de sales y rhBSSL) .

Para el modelo MLR aplicado a datos de muestras almacenadas a +5°C y +25°C, la figura 9 muestra que el efecto de los factores en el pico principal de SE-HPLC (monómeros de rhBSSL) mostró que la temperatura de almacenamiento tuvo, como se esperaba, un efecto negativo (es decir, que un incremento en la temperatura de almacenamiento está asociado con una reducción en monómeros de rhBSSL) , sino que también el cuadrado del factor de glicina contribuyó negativamente, indicando una curvatura en el modelo y sugiriendo la existencia de una concentración de glicina óptima. La glicina como un factor lineal no tuvo efecto significativo en sí misma en la respuesta a pico principal de SE-HPLC. El modelo fue descrito por una R2 de 0.865 y una Q2 de 0.733, indicando tanto alta proporción de varianza compensada por los factores, como buena previsibilidad .

El modelo MLR aplicado a datos de muestras almacenadas a +5°C se usó para diseñar otra formulación favorable en relación a la cantidad de glicina con respecto a un máximo en el pico principal de SE-HPLC (monómeros de rhBSSL) usando una gráfica de contorno, la cual determinó que glicina puede variar entre 2.1 y 4.9 mg/vial y aún dar como resultado un pico principal de SE-HPLC de >95.9% después de 18 meses a +5°C. La gráfica de contorno se presenta en la figura 10 en donde el óptimo de glicina puede ser visto. Se hizo una determinación similar para los resultados del almacenamiento a +25°C, produciendo aproximadamente el mismo óptimo de glicina pero afectó ligeramente de manera negativa el porcentaje del pico principal de SE-HPLC a esta temperatura de almacenamiento.

Para el modelo MLR aplicado a datos de muestras almacenadas a +5°C y +25°C con SE-HPLC HMW (cantidad de agregados de rhBSSL) como la variable de respuesta, el efecto de los factores estuvo cerca del opuesto completo a aquél observado para el pico principal de SE-HPLC (monómeros de rhBSSL) . Esto está relacionado con el hecho de que el SE-HPLC HMW y el pico principal son respuestas del mismo método analítico y hasta cierto punto relacionadas: un incremento en agregados de rhBSSL se traducirá en cierta reducción en monómeros de rhBSSL. En consecuencia, en este modelo con SE-HPLC HMW (cantidad de agregados de rhBSSL) como la variable de respuesta, la temperatura de almacenamiento y el cuadrado de la cantidad de glicina se vio que tenía un efecto significativo en la SE-HPLC HMW (agregados de rhBSSL) como se ve en la figura 11, con más agregación formándose a almacenamiento a temperaturas más altas y una curvatura en el modelo con respecto a la cantidad de glicina. Este modelo que describe la formación de agregados de rhBSSL después de almacenamiento a +5°C o +25°C durante 18 meses compensó una gran proporción de varianza total (R2 igual a 0.914) y una alta previsibilidad (Q2 de 0.853).

El modelo MLR aplicado a datos de muestras almacenadas a +5°C se usó para diseñar una formulación favorable adicional con respecto a la cantidad de glicina en relación a un mínimo en picos de SE-HPLC HMW (agregados de rhBSSL) usando una gráfica de contorno, la cual determinó que glicina puede variar entre 2.3 y 4.5 mg/vial y aún dar como resultado menos de 2.0% de agregados de rhBSSL (SE-HPLC HMW) después de 18 meses a +5°C. La gráfica de contorno se presenta en la figura 12, el donde el óptimo de glicina puede ser visto. Se hizo una determinación similar para almacenamiento a +25°C que dio como resultado aproximadamente el mismo óptimo de glicina pero ligeras modificaciones en el porcentaje de pico de SH-HPLC HMW a esta temperatura de almacenamiento .

Liofilización: Un número de viales suficiente para cada condición de almacenamiento y tiempo de muestreo se preparó para cada formulación NI a N7 por liofilización de una formulación líquida adecuada que comprendía rhBSSL y los excipientes respectivos en cantidades y concentraciones adecuadas. Los viales de las diferentes formulaciones líquidas fueron liofilizados , y se prepararon formas de dosis única (viales) de cada formulación liofilizada NI a N7, como se describió generalmente como sigue: una pre-formulación líquida preparada como abajo se hace alícuotas en viales de vidrio de 6 mL (6R) blancos transparentes de estándar ISO (Mglas) , que cada uno contienen 1.25 mL de formulación líquida, y lotes de los viales hechos alícuotas se ponen en un liofilizador (LyoStar II, sistemas FTS) . Las muestras se enfrían a -50°C a una velocidad de aproximadamente 0.8°C/hora y se dejan equilibrar a -50°C durante 5 horas, y el secado primario se lleva a cabo al aplicar un vacío de 0.3 mbares que se mantiene durante 62 horas con una temperatura de anaquel de 0°C. Durante este tiempo la temperatura de una muestra se seca a la temperatura del anaquel, indicando que la sublimación de cristales de hielo es completa. Secado secundario se inicia al reducir la presión de la cámara a 0.02 mbares y elevar la temperatura de las repisas a +10°C a una velocidad de aproximadamente 0.3°C/hora. Se continúa el secado secundario durante aproximadamente 20 horas hasta que el producto tenga un contenido de humedad de entre aproximadamente 1% y 0.2%, después de lo cual los viales son sellados al vacío con tapones de caucho (West Pharmaceutical Services) .

Formulación líquida adecuada para liofilización: Un lote de cada formulación líquida usado para preparar cada una de las formulaciones liofilizadas NI a N7 se preparó análogamente y se hizo alícuotas en un número adecuado de viales antes de la liofilización, como se describe generalmente en la sección adecuada del ejemplo 4, excepto que la composición final de las diferentes formulaciones líquidas antes de la liofilización fue como se describe en la tabla 2 y que cada vial fue llenado con 1.25 mL. El pH de cada formulación líquida se encontró típicamente que era de entre 6.6 y 7.2.

Tabla 2 Composición de formulación líquida de rhBSSL adecuada para formar formulaciones liofilizadas NI a N7 * Concentraciones molares de fosfato de sodio calculadas a partir de pesos moleculares promedio ponderados y masa de material de los dos componentes d fosfato de sodio.

Condiciones de almacenamiento: Los viales de cada formulación liofilizada se aleatorizaron entre almacenamiento a las 3 temperaturas de almacenamiento +5°C, +25°C y +40°C, con el número de viales usado para temperatura suficiente para el muestreo que se llevará a cabo durante el tiempo. Para cada condición de almacenamiento los viales se almacenaron en un recipiente exterior a prueba de luz o gabinete que sólo fue abierto cuando el vial iba a ser retirado para análisis en un punto de tiempo dado. La temperatura deseada se mantuvo dentro de los siguientes intervalos: para +5°C entre +2°C y +8°C; para 25°C entre +23°C y +27°C; y para +0°C entre +38°C y +42°C.

Análisis (i) PXRD: Una muestra de cada formulación liofilizada NI a N7 se sometió a análisis de difracción de rayos X en polvo (PXRD) para investigar el estado cristalino de los diferentes componentes. Brevemente, se llevó a cabo un análisis de difracción en polvo de rayos X en un difractómetro T/2T (geometría de Bragg-Brentano de paraenfogue) con capacidad de centrifugación de muestra (X' pert PRO, Philips Analytical, Holanda) usando una radiación Cu KOI (1.5406 Á) . Las muestras se investigaron de 5o a 50° 2T a un tamaño de etapa de 0.013°. La alineación del difractómetro se probó contra materiales de referencia estándares de NIST. Preparación de muestra: el material liofilizado se puso en un soporte de muestras de acero que contenían una oblea de silicio de fondo cero y luego se cubrió con un papel Kaptone . Los datos de difracción fueron evaluados (indexación y refinamientos de Rietveld) con software cristalográfico estándar usando FULLPROF (Rodríguez-Carvajal, 2001 Comission on Powder Diffraction (IUCr) Newsletter 26; 12-19), DICVOL06, TREOR90, X' Pert HighScorre Plus and MDI JADE 8.

Análisis (ii) SE-HPLC: Después de retirar un vial de almacenamiento, la formulación liofilizada que contenía se reconstituyó rápidamente en 1.0 mL de agua desionizada por agitación durante aproximadamente 5 minutos y se sometió a cromatografía líquida de alto rendimiento de intercambio de tamaño para detectar cualquier cambio en la cantidad de monómeros de rhBSSL (pico principal) o agregados de rhBSSL (picos de alto peso molecular) . Brevemente, se llevó a cabo cromatografía de exclusión de tamaño en un TSK-gel Super SW3000 30x4.6 mm (Tosoh Bioscience) . La columna se equilibró y se corrió en 10 mM de fosfato de sodio, cloruro de sodio 0.4 M, pH 7, a una velocidad de flujo de 0.15 mL/min usando un HPLC Agilent 1100 serie equipado con un detector de disposición de diodos. La muestra se comparó con un estándar de referencia de rhBSSL puro. La carga de muestra fue 1 µg y proteína se detectó al monitorear la absorción UV a 214 nm. Los datos se evaluaron con el software Chemstation Plus y Chemstore (Agilent Technologies) .

Ejemplo 2 Experimentos AH7513 y AH7517 Configuración del experimento: El efecto de glicina como un agente estabilizador amorfo en las propiedades de una formulación liofilizada de rhBSSL se estudió más en dos experimentos adicionales AH7513 y AH7517. Excipientes en varias combinaciones y cantidades se usaron para producir 4 formulaciones liofilizadas adicionales que tenían las composiciones presentadas en la tabla 3. Las muestras se almacenaron durante varias veces a +5°C, +25°C y +40°C. En periodos regulares durante almacenamiento, se tomaron muestras de las diferentes formulaciones liofilizadas, y se estudiaron usando cromatografía de líquidos de alto rendimiento por exclusión de tamaño (SE-HPLC) , difracción de rayos X en polvo (PXRD) y otras técnicas.

Tabla 3 Cantidad de rhBSSL y excipientes en polvo liofilizado de las formulaciones liofilizadas de AH7513 y AH7517 * Cantidad de fosfato de sodio calculada a partir de pesos moleculares promedio ponderados y masa de material de los dos componentes de fosfato de sodio.

Resultados (i) monomerización y agregación de rhBSSL estudiada por SE-HPLC: Durante almacenamiento a largo plazo, rhBSSL en forma monomérica se detectó como pico principal y la formación de agregados de rhBSSL detectada como picos de alto peso molecular se estudió usando SE-HPLC como se describe en el ejemplo 1. Las figuras 13a-13b muestran la cantidad de monómero de rhBSSL (cuantificada por el pico principal de SE-HPLC) presente en las diferentes formulaciones liofilizadas después de almacenamiento a +5°C durante varios periodos de tiempo, las figuras 14a-14b muestran lo mismo después de almacenamiento a +25°C, y las figuras 15a- 15b muestran lo mismo después de almacenamiento a +40°C.

En todas las figuras (figuras 13a, 13b, 14a, 14b, 15a, 15b, 16a, 16b, 17a, 17b, 18A y 18) , las clases generales de concentración de glicina que estuvieron presentes en cada formulación líquida antes de la liofilización también se indican por el sombreado de los símbolos graficados, con símbolos continuos representando una "alta" concentración de glicina de 56 m , los símbolos abiertos representando una "baja" concentración de glicina de 0 mM y los símbolos con rayas representando concentraciones de glicina "medias" de 44 mM (para G2) y 50 mM (para G3 ) . Esta codificación ayuda a la interpretación de estas gráficas con respecto a la mayor estabilidad de las formulaciones que se obtuvieron a partir de las concentraciones de glicina (medias) .

Las figuras 16A y 16b, figuras 17A y 17B y figuras 18A y 18B muestran acumulación reducida de agregados de rhBSSL de formulaciones G2 y G3. Este efecto es más marcado a las temperaturas de almacenamiento más altas.

Resultados (ii) cristalización de componentes de la formulación estudiada por PXRD: Se usó difracción de rayos X en polvo (PXRD) para determinar la forma cristalina de los componentes de cada formulación de experimentos AH7513 y AH7517 en varios puntos de tiempo durante el experimento, del tiempo cero hasta el muestreo de almacenamiento final como se describe generalmente en el ejemplo 1.

Sorprendentemente, y como se puede ver a partir de las figuras 19a-19b, la glicina presente en la formulación Fl pareció estar presente en forma cristalina, mientras que en las formulaciones G2 o G3 (datos no mostrados) ninguna forma cristalina de glicina pudo detectarse por PXRD, y la glicina en tales formulaciones parece estar en forma amorfa. La presencia de glicina amorfa en las formulaciones G2 y G3 se correlaciona con, y confirma las propiedades adecuadas detectadas primero en el ejemplo 1, pérdida reducida de monómeros de rhBSSL (figuras 13a, 15b, 14a, 14b, 15 y 15b) y acumulación reducida de agregados de rhBSSL (insolubles) (figuras 16a, 16b, 17a, 17b, 18A y 18b) .

Resultados (iii) electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida : Se usa electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) para revelar visualmente la agregación de rhBSSL. Como se muestra en las figuras 20A y 20b, la cantidad de agregados de HMW en las formulaciones G2 y G3 después de 12 meses a +25°C parece ser similar a aquella revelada en la formulación Fl en el punto de tiempo cero o Fl o F2 después de almacenamiento a +5°C durante 12 meses.

Liofilización: Un número de viales suficiente para cada una de todas las condiciones de almacenamiento y tiempos de muestreo se prepararon para cada formulación Fl, F2, Gl y G2 por liofilización de una formulación líquida adecuada que comprendía rhBSSL y los excipientes respectivos en cantidades y concentraciones adecuadas. Los viales de las formulaciones líquidas diferentes fueron liofilizados , y se prepararon formas de dosis única (viales) de cada formulación liofilizada Fl, F2 , Gl y G2 , como se describe generalmente en la sección adecuada del ejemplo 1 pero usando un volumen de relleno por vial de 1.20 mL.

Formulación líquida adecuada para liofilización: Un lote de cada formulación líquida usado para preparar cada una de las formulaciones liofilizadas Fl , F2 , Gl y G2 se preparó de manera análoga y se hizo alícuota en un número adecuado de viales antes de la liofilización, como se describe generalmente en la sección adecuada del ejemplo 4, excepto que la composición final de las diferentes formulaciones líquidas antes de la liofilización fue como la descrita en la tabla 4 y que cada vial se llenó con 1.20 mL. El pH de cada formulación líquida se encontró típicamente de entre 6.6 y 7.2.

Tabla 4 Composición de formulación líquida de rhBSSL adecuada para formar formulaciones liofilizadas Fl, F2, Gl y G2 * Concentraciones molares de fosfato de sodio calculadas usando pesos moleculares promedio ponderados y masa de material de los dos componentes de fosfato de sodio.

Análisis : Muestras de las formulaciones liofilizadas Fl, F2 , Gl y G2 se analizaron usando cromatografía de líquidos (SE-HPLC) , difracción de rayos X en polvo (PXRD) como se describió generalmente en el ejemplo 1. SDS-PAGE Se llevó a cabo usando procedimientos estándares dentro de un gel de gradiente PA de 4-12%. La muestra se disolvió en regulador de pH de sulfato de litio dodecilo (LDS) a una concentración de LDS de 1% o aproximadamente 40 ug/ug de proteína (0.25 µg de proteína/mL en la muestra) .

Ejemplo 3 Comparación con una formulación líquida de rhBSSL A manera de evidencia adicional de la superioridad de las formulaciones liofilizadas de la presente invención, la formulación líquida de rhBSSL (la sustancia farmacéutica (DS) producida como se describió en el ejemplo 4 abajo) se sometió a estudios de estabilidad análoga por almacenamiento durante 3 meses a +25°C. Después de 3 meses de almacenamiento a +25°C, la SE-HPLC de la DS mostró 93.3% de pico principal (monómeros de rhBSSL) y 3.6% de picos HMW integrados totales (que representaban agregados de rhBSSL) . Esto es sorprendentemente menos estable que cualquiera de las formulaciones liofilizadas de la presente invención. Por ejemplo, incluso la formulación NI del experimento AH7505 (que no contenía glicina sino una "baja" cantidad de manitol) no perdió tanto % de pico principal o generó tantos picos de % de HMW, incluso después de 18 meses de almacenamiento a la misma temperatura (véanse figuras 2A y 2B y figuras 5A y 5B , respectivamente) . Además, las formulaciones liofilizadas optimizadas G2 y G3 , a pesar de almacenamiento a +40°C durante 6 meses, aún conservaron alrededor de 95% de pico principal y no más de aproximadamente 2.6% de picos HM totales .

Ejemplo 4 Una formulación liofilizada optimizada para rhBSSL y una dosis única de la misma Con base en los resultados de experimentos tales como arriba, una formulación liofilizada optimizada de rhBSSL se prepara como se describe abajo, con todas las etapas llevadas a cabo bajo condiciones GMP.

Producción de sustancia farmacéutica: La sustancia farmacéutica, lipasa estimulada con sales biliares humanas, que tenía una secuencia de aminoácidos predicha como la mostrada en SEQ ID NO: 2, se produce, por ejemplo, por expresión de células de ovario de hámster chino (CHO) recombinantes que contenían un sistema de expresión de ácido nucleico que comprendía la secuencia de nucleótidos que codifica para BSSL humana de acuerdo con procedimientos estándares .

A manera de breve descripción de este proceso, la secuencia de ADNc de 2.3 Kb que codificaba para hBSSL de longitud completa que incluía la secuencia líder (como la descrita por Nilsson et al, 1990; Eur J Biochem, 192:543-550) se obtiene de pS146 (Hansson et al, 1993; J Biol Chem, 268: 26692-26698) y se clona en el vector de expresión pAD-CMVl (Boehringer Ingelheim) - un plásmido a base de pBR que incluye promotor CMV/señal SV40 poliA para expresión génica y el gen dhfr para selección/amplificación - para formar pAD-CMV-BSSL. pAD-CMV-BSSL se usa después para la transfección de células CHOss DHFR-negativas (Boehringer Ingelheim) junto con co-transfección del plásmido pBR3127SV/NeopA que codifica para resistencia a neomicina para seleccionar la resistencia a geneticina (G418) - para generar células CHO productoras de BSSL DHFR-positiva . Las células CHO resultantes se cultivan bajo condiciones y se escalan para expresar cantidades más grandes de rhBSSL. Por ejemplo, células del banco de células maestro (MCB) son descongeladas, expandidas en matraces agitadores usando medio ExCell 302 sin glutamina y glucosa (SAFC) posteriormente suplementadas con glutamina y glucosa, seguidas por crecimiento en biorreactores de 15 y 100 L, antes de inocular el biorreactor de producción de 700 L en donde BSSL se expresa constitutivamente y se produce en un proceso de lotes de alimentación. El cultivo se cosecha como un solo lote y el polipéptido rhBSSL maduro (es decir, sin la secuencia líder) se purifica a partir de células, restos celulares y otros contaminantes por medio de un número de etapas descendentes, incluyendo una etapa de cromatografía de intercambio aniónico. Virus contaminantes pueden ser inactivados por tratamiento a bajo pH y una etapa de tratamiento con calor seco. El grueso de la sustancia farmacéutica (DS) rhBSSL es diafiltrado y concentrado hasta aproximadamente 20-25 mg/mL.

La actividad específica de las DS a granel se determina usando ácido butírico y éster 4 -nitrofenílico (PNPB) como un substrato para BSSL, y la detección de la liberación de 4-nitrofenol . Brevemente, una serie de diluciones de rhBSSL (por ejemplo, de 20 a 160 ng de actividad/mL) se prepara en PBS con 0.1% de BSA. Se añaden 200 µ? de estas soluciones de rhBSSL a 25 µL de una solución de activación que contiene 20 m de colato de sodio (como activador de sales biliares) en PBS con 0.1% de BSA. Estas soluciones son pre- incubadas en un espectrofotómetro a +27°C durante 5 minutos. Justo antes de medir, se añaden 25 µ? de una solución de sustrato bien mezclada que contiene 5 mM de PNPB en PBS-Tween. La formación de -nitrofenol puede detectarse por su absorbancia a 400 nm y el incremento en absorbancia se mide durante 90 segundos. La cantidad activa de BSSL se determina usando una curva estándar de un estándar de referencia de rhBSSL.

Formulación líquida adecuada para liofilización: La concentración de la solución de rhBSSL DS global se ajusta a 10130 U/mL con 10 mM de fosfato de sodio, 25 mM de cloruro de sodio, pH 7 en un recipiente de alrededor de 300 L con agitación, equipado con agitador magnético, y los excipientes listados en la tabla 5 se añaden a la concentración final mostrada para formar una formulación líquida de rhBSSL adecuada para liofilización . El pH de esta formulación es típicamente de entre 6.6 y 7.2.

Tabla 5 Composición de una formulación líquida de rhBSSL adecuada para liofilización * Concentraciones molares de fosfato de sodio calculadas usando pesos moleculares promedio ponderados y masa de material de los dos componentes de fosfato de sodio.

Liofilización y preparación de dosis únicas: La formulación líquida preparada arriba se hace alícuotas en viales de vidrio de 6 mL (6R) blanco transparentes de la norma ISO (Sofferia Bertolini), cada uno conteniendo 1.26 mL de formulación líquida, y lotes de viales hechos alícuotas se ponen en un liofilizador . Las muestras se enfrían a -50°C a una velocidad de aproximadamente 0.8°C/hora y se dejan equilibrar a -50 °C durante 5 horas, y el secado primario se lleva a cabo al aplicar un vacío de 0.2 mbares que se mantiene durante 13 horas con una temperatura de anaquel de 0°C. Durante este tiempo la temperatura de una muestra se acerca a la temperatura del anaquel, indicando que la sublimación de cristales de hierro es completa. Secado secundario se inicia al reducir la presión de la cámara a 0.02 mbares y elevar la temperatura de los anaqueles a +25°C a una velocidad de aproximadamente l°C/hora. Secado secundario se continúa durante alrededor de 10 horas hasta que el producto tenga un contenido de humedad de entre aproximadamente 0.8° y 0.2%, después de lo cual los viales son sellados al vacío con tapones de caucho (West Pharmaceutical Services) .

Cada vial producido como se describe arriba es una forma de dosis única de una formulación liofilizada que comprende rhBSSL con los componentes y en las cantidades como se listan en la tabla 6. La difracción de rayos X en polvo (como la descrita en el ejemplo 1 de esta formulación no muestra evidencia de cristales de glicina (véanse figuras 15A y 15b) , y tampoco evidencia de cristales de fosfato de sodio o cloruro de sodio.

Tabla 6 sición por vial (forma de dosis única) de una formulación liofilizada optimizada que comprende rhBSSL * Cantidades dadas como masa del componente de fosfato de sodio respectivo.

Por variación menor de las concentraciones de los excipientes en la pre- formulación y el volumen de llenado, ahora dentro de la experiencia de la persona de capacidad ordinaria siguiendo la descripción de la presente invención, se forman otras formulaciones liofilizadas optimizadas que comprenden rhBSSL. Por ejemplo, la formulación que comprende rhBSSL con los componentes y en las cantidades listados en la tabla 7.

Tabla 7 Composición por vial (forma de dosis única) de una formulación liofilizada optimizada que comprende rhBSSL * Cantidades dadas como masa del componente de fosfato de sodio respectivo.

La composición absoluta por vial (forma de dosis única) puede depender de la velocidad de dosis que se administrará, y particularmente si se administra a bebés prematuros, cantidades absolutas más bajas de rhBSSL por vial pueden ser deseadas, mientras se mantiene casi la misma composición relativa de los excipientes. Esto se puede lograr, por ejemplo, usando un volumen de relleno pequeño (tal como aproximadamente la mitad de los volúmenes dados arriba) de la misma pre- formulación líquida, y en ciertos casos (tal como para diferenciar cantidades de dosis) usando viales más pequeños o de colores diferentes. En consecuencia, la composición de formulaciones liofilizadas optimizadas que comprenden rhBSSL (tales como la mostrada arriba) puede representarse con relación por ejemplo a la cantidad de rhBSSL presente en la formulación, tal como la cantidad en mg de cada excipiente por 10,000 U de rhBSSL.

Tabla 8 Composición relativa por vial (forma de dosis única) de una formulación liofilizada optimizada que comprende rhBSSL en mg/10,000 U de rhBSSL * Cantidades relativas con base en la masa del componente de fosfato de sodio respectivo.

Reconstitución de la formulación liofilizada: La dosis única descrita arriba se reconstituye en un alimento líquido para bebés, por ejemplo por adición y agitación para disolver esta formulación en 100 inL de leche materna pasteurizada de fórmula para bebés. Este alimento líquido para bebés que contiene rhBSSL puede usarse convenientemente para administrar una cantidad efectiva de rhBSSL a un bebé que requiera tratamiento con la misma, tal como un bebé prematuro. Esta administración puede presentarse oralmente por alimentación con una mamila, o por medio del tracto GI usando alimentación nasal. El pH de este alimento líquido para bebés que comprende rhBSSL reconstituido a partir de una formulación liofilizada de la invención se encuentra típicamente de entre 6.4 y 7.4.

Como una alternativa a un alimento líquido para bebés, varias formas de dosis única (o una dosis única que comprende una cantidad más grande de cada componente) se reconstituyen análogamente en jugo de frutas o agua. rhBSSL Reconstituida de tal manera puede usarse convenientemente para administrar oralmente una cantidad efectiva de rhBSSL a niños o adultos, tales como aquellos que sufran de insuficiencia pancreática, en particular aquella causada por fibrosis quística.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (17)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las s, por sus siglas en inglés iguientes reivindicaciones:

1. Una formulación adecuada para liofilización caracterizada porque comprende: (i) una lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante (rhBSSL) ; (ii) un agente volumétrico cristalino; y (iii) un estabilizador amorfo que es una entidad química diferente al agente volumétrico cristalino y esta presente en una cantidad relativa entre aproximadamente 0. lmg y aproximadamente 0.5 mg por mg de rhBSSL.

2. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el estabilizador amorfo se selecciona del grupo que consiste en: L-arginina; L-histidina ; L-prolina; L-alanina y glicina.

3. La formulación de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el estabilizador amorfo es glicina.

4. La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el estabilizador amorfo está presente en una concentración de entre 10 mM y 100 mM.

5 . La formulación de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el estabilizador amorfo está presente en una concentración de entre 35 mM y 50 mM.

6 . La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 , caracterizada porque el agente volumétrico cristalino es manitol .

7 . La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 , caracteri zada porque el agente volumétrico cristalino está presente a una concentración de entre 100 mM y 400 mM .

8 . La formulación de conformidad con la reivindicación 7 , caracterizada porque el agente volumétrico cristalino está presente a una concentración de entre 180 mM y 210 mM.

9. La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 , caracteri zada porque la rhBSSL está presente a una concentración de entre 1 mg/mL y 35 mg/mL .

10 . La formulación de conformidad con la reivindicación 9 , caracterizada porque la rhBSSL está presente a una concentración de entre 10 mg/mL y 15 mg/mL .

11 . La formulación de conformidad con la reivindicación 10 , caracterizada porque comprende : ( i ) rhBSSL presente en una concentración de entre 10 mg/mL y 15 mg/mL; ( ü ) manitol presente en una concentración de entre 180 mM y 210 mM; y (iii) glicina presente en una concentración de entre 35 raM y 50 mM;

12. La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones l a 11, caracterizada porque tiene un valor de pH de entre 6.3 y 7.5.

13. La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque comprende además fosfato de sodio, presente en una concentración de fosfato de entre 2 mM y 20 mM.

14. La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada porque comprende además cloruro de sodio, presente en una concentración de cloruro de entre 5 mM y 50 mM.

15. Una formulación liofilizada caracterizada porque se puede obtener mediante la liofilización de la formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

16. Una formulación reconstituida de rhBSSL, caracterizada porque comprende: (i) la rhBSSL presente en una cantidad absoluta de entre 10 mg y 20 mg; (ii) manitol presente en una cantidad absoluta de entre 27 mg y 62 mg; (iii) glicina presente en una cantidad absoluta de entre 2 mg y 6 mg, y en donde la formulación se reconstituye en un alimento líquido para bebés, y la formulación reconstituida tiene un pH de entre 6.4 y 7.4.

17. Uso de glicina para estabilizar rhBSSL, presente en una formulación liofilizada que comprende además un agente volumétrico cristalino que no es glicina, en donde la glicina está presente en la formulación liofilizada en forma no cristalina; y/o la glicina está incluida en la formulación liofilizada en una cantidad relativa de entre 0.2 mg y 0.3 mg por mg de la rhBSSL.