MX2014001084A

MX2014001084A - Compuesto inhibidor de la señalizacion de la trayectoria notch.

Info

Publication number: MX2014001084A
Application number: MX2014001084A
Authority: MX
Inventors: Philip Arthur Hipskind; Gregory Alan Stephenson
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2011-07-27
Filing date: 2012-07-18
Publication date: 2014-02-27
Also published as: AR087107A1; PH12014500215A1; CO6862159A2; EP2736920A1; EP2736920B1; RS54135B1; NZ618891A; HRP20150771T1; SI2736920T1; DOP2014000011A; ES2544937T3; JP2014527042A; US20130029972A1; ME02171B; AP2014007362A0; HK1194086A1; KR101578309B1; AU2012287251B2; TW201315732A; BR112014001600A2

Abstract

La presente invención se refiere a un compuesto, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable, y una composición farmacéutica que contiene el compuesto, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable, útil como un inhibidor de la señalización de la trayectoria Notch para el tratamiento de cáncer.

Description

COMPUESTO INHIBIDOR DE LA SEÑALIZACIÓN DE LA TRAYECTORIA NOTCH La señalización Notch es una trayectoria conservada evolucionaría que juega un papel integral en el desarrollo y homeostasis de tejido en mamíferos. Los receptores Notch y ligandos contienen dominios de la transmembrana de paso único, son expresados en la superficie celular y, por tal razón, la señalización Notch es particularmente importante en la mediación de la comunicación entre células adyacentes que expresan los receptores y ligandos. Existen cuatro receptores Notch conocidos encontrados en roedores y humanos, llamados Notch 1 a Notch 4. Los receptores Notch son proteínas heterodiméricas compuestas de dominios extracel ulares e intracelulares que son inicialmente sintetizados como un polipéptidos único. La interacción receptor-ligando activa una serie de desdoblamientos proteolíticos del polipéptido del receptor Notch en el cual la actividad de ?-secretasa está involucrada. La actividad de ?-secretasa desdobla el dominio intracelular Notch a partir de la superficie celular la cual transloca al núcleo para formar un complejo del factor de transcripción . El dominio intracelular Notch (NICD) es la forma activa de la proteína. Varias funciones de señalización Notch incluyen proliferación , diferenciación, apoptosis, angiogénesis, migración y auto-renovación. Estos papeles diversos de señalización Notch durante el desarrollo y mantenimiento de tejidos normales son aberrantemente activados en diferentes formas de cáncer. Las funciones oncogénicas de señalización Notch incluyen la inhibición de apoptosis y la promoción de proliferación celular.

La ?-secretasa juega un papel central en la cascada de activación Notch. Como un resultado, inhibidores de ?-secretasa han sido activamente investigados por su potencial para bloquear la activación del receptor Notch. Los compuestos ejemplificados en el documento WO 98/28268 tales como 7C-203 son representativos de tales inhibidores de ?-secretasa. Debido a la promesa, no han emergido agentes quimioterapéuticos inhibidores de Notch comerciales.

Existe una necesidad para encontrar compuestos que tengan actividad inhibidora de señalización de la trayectoria Notch. Existe además una necesidad para encontrar compuestos los cuales tengan actividad inhibidora de ?-secretasa. Existe también una necesidad para encontrar compuestos que posean distintas características estructurales que puedan contribuir a la actividad de inhibición de señalización de la trayectoria Notch. Existe una necesidad adicional para encontrar compuestos que demuestren actividad de inhibición de señalización de la trayectoria Notch y deseables propiedades de distribución, metabolismo y excreción in vivo.

La Figura 1 es un patrón de difracción en polvo de rayos-X representativo para el compuesto del Ejemplo 2.

Un aspecto de la invención es proporcionar un compuesto inhibidor de la señalización Notch de la estructura: Compuesto 1 o una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable. Un segundo aspecto de la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende 4,4,4-trifluoro-N-[(1 S)-2-[[(7S)-5-(2-hidroxietil)-6-oxo-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-7-il]amino]-1-metil-2-oxo-etil]butanamida, o una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable, en asociación con un portador farmacéuticamente aceptable. En una modalidad particular, la composición farmacéutica comprende 4,4,4-trifluoro-N-[(1S)-2[[(7S)-5-(2-hidroxietil)-6-oxo-7H-pirido[2,3-d][3]benzoazepin-7-il]amino]-1 -metil-2-oxo-etil]butanamida, o una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable, junto con un portador farmacéuticamente aceptable y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos.

Un tercer aspecto de la presente invención proporciona un método para inhibir la señalización Notch en un paciente con cáncer en necesidad del mismo, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de, 4,4,4-trifluoro-N-[(1 S)-2-[[(7S)-5-(2-hidroxietil)-6-oxo-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-7-il]amino]-1-metil-2- oxo-etil]butanamida, o una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable, al paciente.

Un cuarto aspecto de la presente invención proporciona un método para tratar un cáncer el cual es leucemia linfoblástica aguda de células T, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielogenosa aguda, leucemia mielogenosa crónica, eritroleucemia, cáncer de mama, cáncer de ovario, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cervical, cáncer de próstata, cáncer hepático, carcinoma de células escamosas (oral), cáncer de piel o meduloblastoma en un paciente que comprende administrar al paciente en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de 4,4,4-trifluoro-N-[(1 S)-2-[[(7S)-5-(2-hidroxietil)-6-oxo-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-7-il]amino]-1-metil-2-oxo-etil]butanamida, o una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable.

Un quinto aspecto de la presente invención proporciona un método para tratar un cáncer el cual es leucemia linfoblástica aguda de células T, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielogenosa crónica, eritroleucemia, cáncer de mama, cáncer de ovario, melanoma, cáncer pancreático, glioblastoma o cáncer colorrectal en un paciente que comprende administrar al paciente en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de 4,4,4-trifluoro-N-[(1 S)-2-[[(7S)-5-(2-hidroxietil)-6-oxo-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-7-il]amino]-1-metil-2-oxo-etil]butanamida, o una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable.

Un sexto aspecto de la presente invención proporciona a compuesto 4,4,4-trifluoro-N-[(1 S)-2-[[(7S)-5-(2-hidroxietil)-6-oxo-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-7-il]amino]-1-metil-2-oxo-etil]butanamida, o una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable, para uso en terapia.

Un séptimo aspecto de la presente invención proporciona a compuesto 4,4,4-trifluoro-N-[(1 S)-2-[[(7S)-5-(2-hidroxietil)-6-oxo-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-7-il]amino]-1 -metil-2-oxo-etil]butanamida, o una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable, para uso en el tratamiento de un cáncer el cual es leucemia linfoblástica aguda de células T, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielogenosa aguda, leucemia mielogenosa crónica, eritroleucemia, cáncer de mama, cáncer de ovario, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cervical, cáncer de próstata, cáncer hepático, carcinoma de células escamosas (oral), cáncer de piel o meduloblastoma.

Un octavo aspecto de la presente invención proporciona a compuesto 4,4,4-trifluoro-N-[(1 S)-2-[[(7S)-5-(2-hidroxietil)-6-oxo-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-7-il]amino]-1-metil-2-oxo-etil]butanamida, o una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable, para uso en el tratamiento de un cáncer el cual es leucemia linfoblástica aguda de células T, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielogenosa crónica, eritroleucemia, cáncer de mama, cáncer de ovario, melanoma, cáncer pancreático, glioblastoma o cáncer colorrectal.

Un noveno aspecto de la presente invención proporciona el uso de un compuesto 4,4,4-trifluoro-N-[(1 S)-2-[[(7S)-5-(2-hidroxietil)-6-oxo-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-7-il]amino]-1-metil-2-oxo-etil]butanamida, o una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de un cáncer el cual es leucemia linfoblástica aguda de células T, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielogenosa aguda, leucemia mielogenosa crónica, eritroleucemia, cáncer de mama, cáncer de ovario, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cervical, cáncer de próstata, cáncer hepático, carcinoma de células escamosas (oral), cáncer de piel o meduloblastoma.

Un décimo aspecto de la presente invención proporciona el uso de un compuesto 4,4,4-trifluoro-N-[(1 S)-2-[[(7S)-5-(2-hidroxietil)-6-oxo-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-7-il]amino]-1-metil-2-oxo-etiljbutanamida, o una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de un cáncer el cual es leucemia linfoblástica aguda de células T, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielogenosa crónica, eritroleucemia, cáncer de mama, cáncer de ovario, melanoma, cáncer pancreático, glioblastoma o cáncer colorrectal.

El término "paciente" significa mamífero y "mamífero" incluye, pero no se limita a, un humano.

"Cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad efectiva" significa la dosificación del compuesto, o sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable, o composición farmacéutica que contiene el compuesto, o sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable, necesario para inhibir la señalización Notch en un paciente con cáncer, y ya sea destruir las células cancerígenas objetivo o reducir o detener el progreso del cáncer en un paciente. Dosificaciones anticipadas del Compuesto 1 o una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable están en el intervalo de 0.1 hasta 200 mg/paciente/día. Dosificaciones preferidas son anticipadas para estar en el intervalo de 1 hasta 175 mg/paciente/día. Dosificaciones más preferidas son anticipadas para estar en el intervalo de 5 hasta 150 mg/paciente/día. La dosificación exacta requerida para tratar un paciente y la longitud del tiempo de tratamiento serán determinadas por un especialista en vista de la etapa y severidad de la enfermedad así como también las necesidades específicas y respuesta del paciente individual. Aunque se expresa como dosificación en una base por día, el régimen de dosificación puede ser ajustado para proporcionar un beneficio terapéutico más óptimo a un paciente y administrar y aliviar la enteropatía mucoide (hipersecreción y acumulación de moco en el tracto gastrointestinal). Además de la dosificación diaria, dosificando cada dos días (Q2D); cada tercer día durante un periodo de cinco días seguido por dos días sin dosificación (T.I.W.); o cada tercer día (Q3D) puede ser apropiado. Un régimen de dosificación de cada dos días, T.I.W., o cada tercer día es preferido junto con la administración (pre-, concomitante o post-administración del Compuesto 1 de dexametasona para administrar o aliviar la enteropatía mucoide.

Los términos "tratamiento", "trata", y "tratar", significan incluir el aspecto completo de intervención para el cáncer a partir del cual el paciente está sufriendo, tal como administración del compuesto activo para aliviar o reducir o invertir uno o más de los síntomas y retardar el progreso del cáncer aún si el cáncer no es actualmente eliminado. El paciente a ser tratado es un mamífero, en particular un ser humano.

El compuesto de la presente invención es preferiblemente formulado como una composición farmacéutica usando un portador farmacéuticamente aceptable y administrado por una variedad de rutas. Preferiblemente, tales composiciones son para administración oral. Tales composiciones farmacéuticas y procesos para prepararlas son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (A. Gennaro, et al., eds., 19a ed., Mack Publishing Co., 1995). En una modalidad particular, la composición farmacéutica comprende 4,4,4-trifluoro-N-[(1 S)-2-[[(7S)-5-(2-hidroxietil)-6-oxo-7H-pirido[2,3-d][3]benzoazepin-7-il]amino]-1 -metil-2-oxo-etil]butanamida, o una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable, junto con un portador farmacéuticamente aceptable y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos particularmente para tratamiento de cáncer en general o un tipo de cáncer específico.

El compuesto de la presente invención es capaz de reaccionar con un número de ácidos orgánicos e inorgánicos para formar sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptable. Tales sales farmacéuticamente aceptables y metodología común para prepararlas son bien conocidas en la técnica. Véase por ejemplo, P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts, "Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, January 1977.

El Compuesto 1, o una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable, pueden ser preparados por una variedad de procesos conocidos en la técnica, así como también aquellos descritos abajo. Las etapas científicas específicas pueden ser combinadas en diferentes formas para preparar el Compuesto 1, o una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable.

El Compuesto 1 es nombrado: 4,4,4-trifluoro-N-[(1 S)-2-[[(7S)-5-(2-hidroxietil)-6-oxo-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-7-il]amino]-1-metil-2-oxo-etil]butanamida; y también puede ser nombrado: N-[(1S)-2-[[(7S)-6,7-dihidro-5-(2-hidroxietil)-6-oxo-5H-pirido[3,2-a][3]benzazepin-7-il]amino]-1-metil-2-oxoetil]-4,4,4-trifluorobutanamida; y otros nombres también pueden ser usados para identificar inequívocamente el Compuesto 1.

Se entenderá que el Compuesto 1 es representado como un estereoisómero único. Existen dos centros quirales que dan origen a cuatro estereoisómeros. Como se usa en la presente, referencias al Compuesto 1 están significando incluir también mezclas racémicas que incluyen el Compuesto 1. En la presente, las designaciones Cahn-Ingold-Prelog de (R)- y (S)- se usan para referirse a isómeros específicos. Se pueden preparar estereoisómeros específicos por síntesis estereoespecífica usando materiales de partida enantioméricamente puros o enriquecidos. Los estereoisómeros específicos de ya sea materiales de partida, intermediarios, o mezclas racémicas que incluyen el Compuesto 1 pueden ser resueltos por técnicas bien conocidas en el arte, tales como aquellas encontradas en Stereochemistrv of Organic Compuestos, E. I. Eliel y S. H. Wilen (Wiley 1994) y Enantiomers, Racemates, and Resolutions, J., Jacques, A. Collet, y S. H. Wilen (Wiley 1991), que incluyen cromatografía en fases estacionarias quirales, resoluciones enzimáticas, o cristalización fraccional o cromatografía de diastereómeros formados para tal propósito, tales como sales diastereoméricas. Mientras todas las mezclas que contienen el compuesto de la presente invención están contempladas dentro de la presente invención, la modalidad preferida es el Compuesto 1.

También se ha encontrado que el Compuesto 1 existe como atropisómeros, o confórmeros específicos. En soluciones acuosas, 8-9% de atropisómero 2 (atropisómero menor) se detecta por 1H NMR y LC-MS en equilibrio con atropisómero 1 (atropisómero principal) a temperatura ambiente después de 24 horas. En solventes orgánicos, a temperatura ambiente después de 24 horas, aproximadamente 1-2% de atropisómero 2 se detecta por H NMR y LC-MS en equilibrio con el atropisómero 1. Aunque detectable por análisis de 1H NMR y LC-MS, el atropisómero 2 no es aislable.

Los compuestos empleados como materiales de partida iniciales en la síntesis del compuesto de la presente invención son bien conocidos y, en la magnitud que no son comercialmente disponibles, son fácilmente son fácilmente sintetizados usando referencias específicas proporcionadas, por procedimientos estándares comúnmente empleados por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica o se encuentran en textos de referencia generales.

Ejemplos de procedimientos y métodos comunes incluyen aquellos descritos en textos de referencia generales tales como Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers I nc, 1989; Compendium of Organic Synthetic Methods, Volumes 1 -1 0, 1 974-2002, Wiley I nterscience; Advanced Organic Chemistry, Reactions Mechanisms, and Structure, 5a Edición, Michael B. Smith y Jerry March , Wiley Interscience, 2001 ; Advanced Organic Chem istry, 4a Edición, Parte B, Reactions and Synthesis, Francis A. Carey y Richard J . Sundberg , Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2000, etc. , y referencias citadas en ésta.

Los intermediarios y el Compuesto 1 son nombrados usando un Programa Drawing SymaxDraw versión 3.2, a partir de las estructuras, como el nombre I UPAC aplicado de manera consistente.

Preparación 1 (2S)-2-(4,4,4-trifluorobutanoilamino)propanoato de bencilo Quiral Se agregó sucesivamente clorhidrato de éster bencílico de L-alanina (7.00 g , 32.5 mmol), diisopropiletilam ina (28.30 m l_, 162.3 mmol) , hidrato de 1 -hidroxibenzotriazol (7.46 g, 48.7 mmol) y clorhidrato de 1 -(3-dimetilam ¡nopropil)-3-etilcarbodiimida (9.33 g 48.7 mmol) a una solución de ácido 4,4,4-trifluorobutírico (7.131 g, 48.7 mmol) en diclorometano ( 1 62 mL) a temperatura ambiente bajo nitrógeno y agitó por 20 horas. Se agregó una solución acuosa al 20% de ácido cítrico (1 50 mL, 162 m mol) , se agitó la mezcla por 5 minutos y se separaron las capas. Se extrajo de lo acuoso con diclorometano (1 00 mL). Se lavaron los orgánicos combinados con solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (1 50 mL), secaron sobre sulfato de sodio y concentraron. Se purificó el residuo por cromatografía instantánea, eluyendo con hexano: acetato de etilo (4: 1 a 2: 1 ) para dar el compuesto del título como un sólido blanco (9.22 g , 30.4 mmol, 94%). S (m/z):304(M+ 1 ); [a]Na25= -44.6° (c=5.0, metanol).

Preparación 2 Ácido (2S)-2-(4,4,4-Trifluorobutanoilamino)propanoico Quiral Se agregó paladio/carbono (5%, 1 .76 g , 0.8 mmol) en una porción a una solución de (2S)-2-(4,4,4-trifluorobutanoilamino)propanoato de bencilo (8.80 g, 29 mmol) en metanol (88 m L) a temperatura ambiente. La mezcla se desgasificó (vacío/nitrógeno), llenó con hidrógeno (una atmósfera) y agitó bajo hidrógeno (29 mmol) por 5 horas. Se filtró a través de Celite®, se enjuagó la torta de filtro con metanol y concentró lo filtrado para obtener el compuesto del título como un sólido blanco (6.11 g, 28.7 mmol, 99%). MS (m/z):214 (M + 1); [a]Na25= -24.7° (c=5.0, metanol).

Preparación 3 2-(2-bromofenil)acetato de Metilo Se agregó dimetilformamida (2.1ml_, 27.3 mmol) seguido por cloruro de tionilo (52.3 mL, 717.8 mmol) durante 7 minutos a una solución de ácido 2-bromofenilacético (150.0 g, 683.6 mmol) en diclorometano (1.50 L) se enfrió con un baño de agua a temperatura ambiente. Se agitó la mezcla por 5 horas, se agregó metanol (41.5 mL, 1.0 mol) durante 5 minutos. Se burbujeó nitrógeno a través de la solución durante la noche. Se concentró para obtener el compuesto del título como un aceite incoloro en rendimiento cuantitativo (166.0 g, 724.7 mmol). 1H NMR (300 MHz, CDCI3):7.57 (d, J= 7.9 Hz, 1H), 7.30-7.26 (m, 2H), 7.19-7.12 (m, 1H), 3.80 (s, 2H), 3.72 (s, 3H).

Preparación 4 2-[2-(4,4,5,5-tetrametil-1 ,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil]acetato de metilo Se desgasificó una suspensión de 2-(2-bromofenil)acetato de metilo (156.6 g, 684 mmol), bis(pinacolato)diboro (194.9 g, 752 mmol), y acetato de potasio (135.6 g, 1.4 mol) en N-metilpirrolidona (940 mL) con tres ciclos de vacío/nitrógeno. Se agregó cloruro de (1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno)paladio(ll) (11.4 g, 13.7 mmol) y calentó a 80°C. Después de 15 horas se agregó cloruro de (1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno)paladio(ll) (11.4 g, 13.7 mmol) y agitó a 90 °C por 24 horas. Se enfrió a temperatura ambiente y vertió sobre una mezcla de hielo y agua (3 L), se agregó y metil butiléter terciario (1 L). Se agitó la mezcla, se filtró a través de una almohadilla de Celite® y se separaron las capas. Se extrajo de lo acuoso con metil butiléter terciario (2x500 mL). Se lavaron los orgánicos combinados con agua (2x500 mL), salmuera (500 mL), se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron. Se purificó el residuo por cromatografía instantánea, eluyendo con hexano:acetato de etilo (9:1) para dar el compuesto del título como un sólido blanco (160.6 g, 581.6 mmol, 85%). MS (m/z):277(M + 1).

Preparación 5 5,7-Dihidropirido[2,3-d][3]benzazepin-6-ona Se agregó carbonato de potasio (235.7 g, 1.71 mol) a una solución de 2-amino-3-bromopiridina (88.5 g, 511.7 mmol) en 1,4-dioxano (550 mL) y agua (550 mL). La mezcla se desgasificó con tres ciclos de vacío/nitrógeno, se agregó acetato de paladio (II) (6.4 g, 28.4 mmol) y tetrafluoroborato de tri-t-butilfosfonio (16.5 g, 56.9 mmol) y agitó bajo nitrógeno a 88°C. Se agregó una solución de 2-[2-(4, 4,5,5-tetrametil-1 ,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil]acetato de metilo (157.0 g, 568.5 mmol) en 1,4-dioxano (550 mL) por goteo durante tres minutos y agitó la mezcla a 88°C por 20 minutos. Se enfrió la mezcla a 50°C, se agregó agua (100 mL), y se separaron las capas. Se extrajo de lo acuoso con acetato de etilo (2x100 mL), se secaron los orgánicos combinados sobre sulfato de sodio y se concentraron. Se disolvió el material concentrado en N-metilpirrolidona (314 mL), se enfrió en un baño de hielo y se agregó ácido sulfúrico (314 mL, 5.9 mol) por goteo para mantener una temperatura de aproximadamente 45°C. Se agitó la mezcla a 140°C por 90 minutos. Se enfrió a temperatura ambiente, se agregó hielo (4 kg) y basificó con adición por porciones de 50% de solución acuosa de NaOH hasta que la solución es de pH 7-8. Se enfrió la suspensión a 10-15°C, se filtraron los sólidos y lavaron con agua (2 L), hexanos (1 L) y metil butiléter terciario (1 L). Se secó bajo vacío a 40°C. Se trató el material con mezcla a reflujo de solución de metanol/diciorometano al 10% y filtró caliente (x4). Se concentraron los filtrados combinados para proporcionar el compuesto del título como un sólido ligeramente marrón (85 g, 404.3 mmol, 71%). MS (m/z):211 (M + 1).

Preparación 6 5-[2-(ter-butil(dimetil)silil)oxietil]-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-6-ona Se agregó carbonato de cesio (186.6 g, 572.7 mmol), (2-bromoethoxi)-ter-butildimetilsilano (88.0 mL, 409.1 mmol), y yoduro de sodio (6.1 g, 40.9 mmol) a una suspensión de 5,7-dihidropirido[2,3-d][3]benzazepin-6-ona (86.0 g, 409.1 mmol) en dimetilformamida (860 mL) y agitó a 70°C por 20 horas. Se enfrió la mezcla a temperatura ambiente, vertió sobre hielo y agua (100 mL), se agregó acetato de etilo (200 mL). Se filtró la mezcla a través de Celite®, después se lavó con acetato de etilo (100 mL). Se separaron las capas del filtrado, se extrajo de lo acuoso con acetato de etilo (2x50 mL). Se lavaron los orgánicos combinados con agua (2x100 mL), salmuera (100 mL), se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron. Se disolvió material en tetrahidrofurano (1.28 L), se agregó depurador de paladio unido a Silia® (16.7 g) y agitó a temperatura ambiente por 20 horas. Se filtró a través de una almohadilla de sílice, se lavó con tetrahidrofurano (200 mL) y se concentró para obtener el compuesto del título (155 g, 420.6 mmol) como un aceite ligeramente marrón que cristaliza en rendimiento cuantitativo. MS (m/z):369(M+1 ).

Método 2: Se calentó una mezcla de 5,7-dihidropirido[2,3-d][3]benzazepin-6-ona (22.5 g, 106.9 mmol) y dimetilformamida (500 mL) a 100°C por 5 minutos. Se enfrió a 40°C, se agregó carbonato de cesio (104.3 g, 320.1 mmol) y (2-bromoetoxi)-ter-butildimetilsilano (29.9 mL, 138.9 mmol) y agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se calentó a 60°C por aproximadamente 2 horas, y después se enfrió a temperatura ambiente. El residuo se dividió entre acetato de etilo (1 L) y agua (3 L), nuevamente se extrajo de la capa acuosa con acetato de etilo (2x500 mL), se lavaron los orgánicos combinados con salmuera (2x500 mL). Se secaron los orgánicos combinados sobre sulfato de sodio y se concentraron. Se purificó el residuo por cromatografía instantánea, eluyendo con acetato de etilo:hexano (0:100 a 100:0) para dar el compuesto del título como un aceite (39.4 g, 106.9 mmol, 89%). MS (m/z):369(M + 1).

Preparación 7 5-[2-(ter-butil(dimetil)silil)oxietil]-7-hidroxiimino-pirido[2,3- d][3]benzazepin-6-ona Se agregó 2-metilpropan-2-olato de potasio (66.1 g, 588.8 mmol) a una solución de 5-[2-(ter-butil(dimetil)silil)oxietil]-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-6-ona (155.0 g, 420.6 mmol) en tetrahidrofurano (1.6 L) a -5°C y agitó por 10 minutos. Se agregó nitrito de isoamilo (61.9 mL, 462.6 mmol) por goteo a -5°C y se agitó la mezcla por 10 minutos. Vertió sobre hielo/agua (2 L) y extrajo con acetato de etilo (3x200 mL). Se lavaron los orgánicos combinados con salmuera (200 mL), se secaron sobre sulfato de sodio. Se agregó tolueno (1 L) y se concentró (x3) para obtener el compuesto del título como un aceite marrón espeso (160.0 g, 402.5 mmol, 96%). MS (m/z):398(M + 1 ).

Preparación 8 (7S)-7-Amino-5-(2-hidroxietil)-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-6-ona Quiral Se agregó ácido trifluoroacético (124.0 mL, 1.64 mol) en varias porciones a una solución de 5-[2-(ter-butil(dimetil)síl¡l)ox¡etil]-7-hidroxiimino-pirido[2,3-d][3]benzazepin-6-ona (155.0 g, 389.9 mmol) en una mezcla de diclorometano (620 mL) y metanol (310 mL) en un baño de agua a temperatura ambiente. Se agregó zinc (76.5 g, 1.2 mol) en varias porciones de manera que la temperatura interna se mantuvo a 33-38°C. Se agitó por 15 horas a temperatura ambiente. Se filtró la mezcla a través de Celite®, se lavó con 10% metanol/diclorometano (100 mL) y concentró lo filtrado. Se agregó diclorometano (0.5 L) y hielo (500 g), agitó y basificó con una solución acuosa al 50% de NaOH. Se filtraron los sólidos, se separaron las capas de filtrado. Se extrajo de lo acuoso con diclorometano (2x100 mL), y se concentraron los orgánicos combinados. Los sólidos se formaron en suspensión en hexano, y después filtraron y se secaron bajo alto vacío para obtener el racemato del compuesto del título como un sólido ligeramente amarillo (74.0 g, 274.8 mmol, 71%). Se purificó el material en una columna Chiralpak® AD eluyendo con etanol (0.2% dimetilamina):acetonitrilo (0:100 a 100:0) para obtener el compuesto del título (35.0 g, 130 mmol, 33.3%) como un sólido blanco. S (m/z):270(M+1); [a]Na25= +187.83° (c=6.9, metanol).

Preparación 9 7-Azido-5-[2-(ter-butil(dirnetil)silil)oxietil]-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-6-ona Se lavó hidruro de potasio (aproximadamente 2 cucharadas, 35% en peso en aceite mineral) con hexanos y decantó para remover el aceite, se agregó tetrahidrofurano (60 ml_) y se enfrió a -78°C. Se secó una solución de azida de 2,4,6-tris(1-metiletil)-bencensulfonilo (37.6 g, 121.6 mmol) en tetrahidrofurano (60 ml_) sobre sulfato de sodio por 45 minutos. Se decantó la solución de azida en la suspensión de hidruro de potasio durante 15 minutos. Se removió el baño frío y dejó calentar a temperatura ambiente por 45 minutos; se dejó de lado la solución seca. Se enfrió una solución de diisopropilamina (17.0 ml_, 121.0 mmol) y tetrahidrofurano (50 ml_) a -78°C, se agregó n-butil litio (52.1 ml_, 130.3 mmol) por goteo durante 5 minutos. Se removió el baño frío y dejó calentar por 15 minutos después se enfrió nuevamente a -78°C. Se canuló en una solución a -78°C de 5-[2-(ter-butil(dimetil)silil)oxietil]-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-6-ona (34.3 g, 93.1 mmol) en tetrahidrofurano (400 mL) durante 5-10 minutos. Se agitó por una hora a -78°C después se removió el baño frío y dejó calentar por 15 minutos (hasta aproximadamente -45°C). Se enfrió a -78°C y se agregó la solución seca de azida de 2,4,6-tris(1-metiletil)-bencensulfonilo vía cánula durante 5-10 minutos. Se removió el baño y se dejó calentar a -5 hasta 0°C durante 1 hora. Se enfrió en un baño de hielo/agua y se agregó ácido acético (26.7 mL, 465.3 mmol) por goteo durante 13 minutos. Se dejó calentar a temperatura ambiente durante 65 minutos y apagó con solución saturada de bicarbonato de sodio (1L). Se diluyó la reacción con acetato de etilo (600 mL) y agua (2L), se separaron las capas, nuevamente se extrajo de lo acuoso con acetato de etilo (2 X 400 mL). Se lavaron los orgánicos combinados con solución saturada acuosa de bicarbonato de sodio (500 mL) y salmuera (500 mL), se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron. Se purificó el residuo por cromatografía instantánea, eluyendo con acetato de etilo:hexano (0:100 a 100:0) para dar el compuesto del título como un aceite (39.8 g, 92.3 mmol, 99%). MS (m/z):410(M + 1 ).

Preparación 10 7-Amino-5-[2-(ter-butil(dimetil)silil)oxietil]-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-6-ona Se agregó paladio/carbono (2.2 g, 1.0 mmol, 5% en carbono) a una solución purgada de nitrógeno de 7-azido-5-[2-(ter-butil(dimetil)silil)oxietil]-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-6-ona (39.8 g, 92.3 mmol) en etanol (923 ml_). Se evacuó/llenó con hidrógeno tres veces y agitó bajo hidrógeno (una atmósfera) a temperatura ambiente durante la noche. Se filtró sobre Celite®, se enjuagó con etanol y acetato de etilo y se concentró para obtener el compuesto del título como un aceite transparente (36.6 g, 89.9 mmol, 97%). MS (m/z):384(M + 1).

Preparación 11 N-[(1S)-2-[[5-[2-(ter-butil(dimetil)silil)ox¡etil]-6-oxo-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-7-il]amino]-1 -metil-2-oxo-etil]carbamato de ter-butilo Se enfrió una mezcla de 7-amino-5-[2-(ter-butil(dimetil)silil)oxietil]-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-6-ona (36.3 g, 89.9 mmol), diclorometano (360 ml_), trietilamina (16.3 ml_, 116.9 mmol), 3-hidroxitriazolo[4,5-b]piridina (15.9 g, 116.9 mmol), y ácido (2S)-2-(ter-butoxicarbonilamino)propanoico (22.5 g, 116.9 mmol) a 0°C. Se agregó clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (22.4 g, 116.9 mmol) y después de 5 minutos se dejó calentar a temperatura ambiente durante la noche. Se lavó con agua (500 mL x2) , solución saturada acuosa de bicarbonato de sodio (2 x 300 mL), salmuera (300 mL), y después se secó sobre sulfato de sodio y se concentró. Se purificó el residuo por cromatografía instantánea, eluyendo con alcohol isopropílico: hexano (5:95 a 1 0: 90) para dar el compuesto del título como una espuma blanca (43. 14 g , 77.77 mmol, 86.50%) . MS (m/z): 555(M + 1 ).

Preparación 1 2 (2S)-2-Amino-N-[5-(2-hidroxietil)-6-oxo-7H-pirído[2,3-d][3]benzazepin-7-il]propanamida Se agregó ácido trifluoroacético (30 mL, 396.76 mmol) durante 5 min utos a una solución a 0°C de N-[(1 S)-2-[[5-[2-(ter-butil(dimetil)silil)oxietil]-6-oxo-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-7-il]am ino]-1 -metil-2-oxo-etil]carbamato de ter-butilo (5.56 g , 10.0 mmol) y diclorometano (30 mL) y se dejó calentar y agitó a temperatura ambiente por 5 horas. Se purificó el residuo por cromatografía instantánea vía columnas SCX® (Isolute SCX-2 x6) eluyendo con metanol seguido por acetato de etilo : metanol (amoníaco 2N) (1 : 1 ) para obtener el compuesto del título como un sólido blanco (3.48 g , 1 0.2 mmol) en rendimiento cuantitativo. MS (m/z):341(M+1).

Ejemplo 1 4,4,4-Trifluoro-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-hidroxietil)-6-oxo-7H-pirido[2,3- d][3]benzazepin-7-il]amino]-1-metil-2-oxo-etil]butanamida Quiral Se agregó ácido (2S)-2-(4,4,4- trifluorobutanoilamino)propanoico (28.9 g, 135.7 mmol; preparado sustancialmente como se describe anteriormente en la Preparación 2), clorhidrato de 1 -(3-dimetilaminopropil)-3-et¡lcarbodiimida (29.7 g, 155.1 mmol) secuencialmente a una suspensión de (7S)-7-amino-5-(2- hidroxietil)-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-6-ona (34.8 g, 129.2 mmol) en diclorometano (696 mL) a 0°C, agitó por 5 minutos. Se agregó monohidrato de 1-hidroxibenzotriazol (24.7g, 155.1 mmol), se dejó agitar por una hora, y después calentó a temperatura ambiente. Se agregó ácido (2S)-2-(4,4,4-trifluorobutanoilamino)propanoico (0.6 g, 2.6 mmol) y agitó por 15 minutos a temperatura ambiente. Se agregó agua (600 mi), filtró el sólido blanco, y se separaron las capas del filtrado. Se lavó la capa orgánica con agua (3x200 mL), se secó sobre sulfato de sodio y se concentró para proporcionar una espuma ligeramente marrón . Se formó en suspensión el material en 50% de metil butiléter terciario hexanos (500 mL) , se filtraron los sólidos, se secaron bajo alto vacío para obtener 65 g de sólidos.

Se agregó agua (195 mL) y bicarbonato de potasio (14.0 g , 140.0 mmol) a una solución a 10°C de los sólidos previamente obtenidos (65.0 g , 140.0 mmol) en metanol (1 95 mL) y agitó a temperatura ambiente por 29 horas. Se concentró y extrajo con diclorometano (3x50 mL). Se lavaron los orgánicos combinados con agua (3x20 mL), se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron. Se purificó el residuo por cromatografía instantánea eluyendo con metanoLdiclorometano (98:2, 7N en amon íaco). Se trituró el material de 50% de metil butiléter terciarío/hexano, después se trituró de metil butiléter terciario (500 mi) . Se lavaron los sólidos con metil butiléter terciario (200 mL) y hexano (200 mL) y se secaron los sólidos bajo alto vacío para obtener el compuesto del título como un sólido blancuzco (42.0 g, 90.4 mmol, 65%) . MS (m/z):270(M+ 1 ); [a]Na25= -1 53.40° (c=5.0, metanol).

Método 2: Se agregó clorhidrato de 1 -(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (2.50 g , 13.0 mmol) a una mezcla a 0°C de (2S)-2-amino-N-[5-(2-hidroxietil)-6-oxo-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-7-iljpropanamida (3.4 g , 10.0 mmol), diclorometano (40 mL), 3-hidroxitriazolo[4,5-b]piridina (1 .8 g , 1 3.0 mmol) , ácido 4,4,4-trifluorobutanoico (1 .9 g , 1 3.0 mmol) , y trietilamina (1 .8 mL, 13.0 mmol) .

Se dejó agitar y calentó temperatura ambiente durante la noche. Se agregó agua (40 mL) y dividió entre diclorometano (1 00 mL) y agua (50 mL). Se separaron las capas, nuevamente se extrajeron de lo acuoso con diclorometano, se lavaron las capas orgánicas combinadas con solución saturada acuosa de bicarbonato de sodio (2 X 100 mL). Nuevamente se extrajo de las capas de bicarbonato con diclorometano (25 mL), se secaron las capas orgánicas combinadas sobre sulfato de sodio y se concentraron. Se purificó el resid uo por cromatografía instantánea, eluyendo con metanol (amoníaco 2N) :diclorometano (0: 100 a 5:95) para dar 3.77 g de la mezcla diastereomérica. Se purificó el material en una columna Chiralpak® AD eluyendo con etanol (0.2% dimetilamina):acetonitrilo (0: 1 00 a 100: 0) para obtener el compuesto del título como un sólido blanco (1 .7 g, 3.7 mmol, 37%) . MS (m/z) :465(M+ 1 ).

Preparación 1 3 2-(2-bromofenil)acetato de metilo Se combinó ácido 2-bromofenilacético (500.0 g , 2.33 mol) con metanol (5.0 L) bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó ácido sulfúrico concentrado (1 85.8 mL) por goteo a 20 -35 °C, y después se calentó a 60-65 °C con agitación por 3-4 horas. Se enfrió la mezcla de reacción a 45°C y se concentró bajo presión reducida por debajo de 45°C a un volumen de aproximadamente 750 mL. Se enfrió la mezcla de reacción a 10-30 °C y se agregó diclorometano (2.5 L). Se ajustó el pH a 7-8 con hidróxido de sodio (7%, 380.0 ml_) y se separaron las capas. Se concentró la fase orgánica a sequedad bajo presión reducida por debajo de 45°C para obtener el compuesto del título (516.5 g, 97.0%) como un aceite amarillo.

Preparación 14 5,7-Dihidropirido[2,3-d][3]benzazepin-6-ona Se combinó 2-(2-bromofenil)acetato de metilo (1.0 kg, 4.36 mol), dioxano (11.0 L), y /v-metil-2-pirrol¡dona (7.0 L) con agitación a temperatura ambiente. Se agregó bis(pinacolato)diboro (1.2 kg, 4.58 mol) y acetato de potasio (855.9 g, 8.72 mol) a la mezcla, y después se desgasificó la solución pasando gas de nitrógeno a través de la solución por 2-3 horas. Se cargó aducto de diclorometano de dicloruro de [1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]paladio(ll) (71.2 g, 97.2 mmol) bajo una atmósfera de nitrógeno y después se calentó la mezcla de reacción a 80-90 °C por 18-20 horas para obtener 2-[2-(4,4,5,5-tetrametil-1 ,3,2-dioxaborolan-2-il)fenil]acetato de metilo como una solución la cual se usó sin aislamiento. Se enfrió la mezcla de reacción a 15-25 °C y se agregó 2-amino-3-bromopiridina (675.0 g, 3.90 mol) y una solución de fosfato de potasio tribásico (2.41 kg, 11.3 mol) en agua (3.0 L). Se desgasificó la solución pasando gas de nitrógeno a través de la solución por 2-3 horas, y se agregó aducto de diclorometano de dicloruro de [1 , 1 '-bis(difenilfosfino)ferroceno] paladio(l l) (1 06.8 g, 1 30.8 mmol), después se calentó la mezcla de reacción a 80-90 °C por 1 8-40 horas. Se enfrió la mezcla de reacción a 50-60 °C, y se agregó lentamente una solución que consiste de bicarbonato de sodio saturado (13.0 L), cloruro de sodio saturado ( 1 3.0 L), y agua (1 3.0 L). Se agitó la mezcla por 2-3 horas a 50-60 °C, se enfrió a 1 5-25 °C y agitó por unas 1 8-20 horas adicionales. Se filtraron los sólidos resultantes y se lavó la torta de filtro con agua (2 x 2.0 L). Se transfirieron los sólidos a un recipiente de reacción limpio, se agregó acetato de etilo (5.0 L), y se calentó la mezcla a 60-70°C por 2-3 horas. Se enfrió la solución a 1 5 -25 °C y agitó por 1 -2 horas y se filtraron los sólidos resultantes. Se lavó la torta de filtro con acetato de etilo (2 x 750 ml_) y se secaron los sólidos resultantes bajo vacío para proporcionar el compuesto del título (644.0 g, 68.1 %) como un sólido blancuzco.

Preparación 1 5 5-[2-(ter-butil(dimetil)silil)oxie il]-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-6-ona Se agregó 5,7-dihidropirido[2,3-d][3]benzazepin-6-ona (33.8 g, 0.16 mol) en acetonitrilo (340.0 mL) y agitó a 20-30 °C por 0.5-1 hora. Se agregó carbonato de cesio (104.6 g, 0.32 mol) y (2-bromoethoxi)-ter- butildimetilsilano (42.2 g, 0.18 mol) y se calentó la mezcla de reacción a 70-80 °C por 18-20 horas. Se enfrió la mezcla de reacción a 20-25°C y se filtró a través de tierra diatomácea (50.6 g). Se lavó la torta de filtro con acetonitrilo (2 x 50.6 mL) y concentró lo filtrado bajo presión reducida para llegar a un volumen total de aproximadamente 67.5 mL. Se agregó tolueno (152 mL), active carbono (2.53 g) y se calentó la mezcla a 60-70 °C por 1-2 horas. Se enfrió la mezcla a 25-35 °C y filtró la mezcla de reacción sobre tierra diatomácea (50.6 g). Se enjuagó la torta de filtro con tolueno (17.0 mL) y se concentró bajo presión reducida para obtener el compuesto del título como un aceite ligeramente marrón que cristaliza en reposo (56.8 g, 92.2%).

Preparación 16 5-[2-(ter-butil(dimetil)silil)oxietil]-7-hidroxiimino-pirido[2,3- d][3]benzazepin-6-ona Se combinó 5-[2-(ter-butil(dimetil)silil)oxietil]-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-6-ona (30.0 g, 0.08 mol) y tolueno (300.0 mL), se enfrió la mezcla de reacción a -10-0 °C. Se agregó ter-butóxido de potasio (18.2 g, 0.16 mol), nitrito de isoamilo (13.34 g, 0.11 mol) y después agitó por 3-5 horas. Se transfirió la mezcla de reacción a una solución bifásica enfriada (0-5 °C) de acetato de etilo (210 mL) y agua (510 mL) y agitó por 15-30 minutos. Se calentó la mezcla de reacción a 15-25 °C y se separaron las capas. Se extrajo la capa acuosa con acetato de etilo adicional (120 mL) y metil ter-butil éter (120 mL) y se combinaron las capas orgánicas. Se concentró lo orgánico bajo presión reducida a un volumen de solución de aproximadamente 60-90 mL y después se agregó tolueno (240 mL) y acetato de etilo (75 mL). Se filtró la solución a través de gel de sílice (45.0 g), se enjuagó el gel de sílice con una mezcla de tolueno (210 mL) y acetato de etilo (60 mL), y concentró lo filtrado bajo presión reducida a un volumen de aproximadamente 75 mL. Se agregó heptano (120 mL) y se concentró la mezcla a un volumen de aproximadamente 60 mL y se filtraron los sólidos resultantes. Se lavó la torta de filtro con heptano (25 mL) y se secó bajo vacío para proporcionar el compuesto del título (28.3 g, 72.5%) como un sólido amarillo.

Preparación 17 7-Amino-5-[2-(ter-butil(dimetil)silil)oxietil]-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-6-ona Se combinó 5-[2-(ter-butil(dimetil)silil)oxietil]-7-hidroxiimino-pirido[2, 3-d][3]benzazepin-6-ona (206.0 g , 0.52 mol) y tetrahidrofurano (2.3 L) en una autoclave bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó n íquel Raney (232.0 g, 1 .1 3 equivalentes en p/p) a la mezcla de reacción e introdujo atmósfera de hidrógeno (87 psi). Se agitó la mezcla de reacción a 60-65 °C por 24 horas. Se filtró la mezcla sobre tierra diatomácea y se lavó el auxiliar de filtro con tetrahidrofurano (500 mL). Se concentró lo filtrado para obtener el compuesto del título (196.0 g , 93.2%) como un aceite marrón. MS (m/z):384 (M + 1 ).

Preparación 18 N-[(1 S)-2-[[5-(2-hidroxietil)-6-oxo-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-7-il]amino]-1 -metil-2-oxo-etil]carbamato de ter-butilo Se combinó 7-amino-5-[2-(ter-butil(dimetil)silil)oxietil]-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-6-ona (166.0 g , 0.43 mol), diclorometano (2.2 L) , y L-Boc-alanina ( 1 06.4 g, 0.56 mol) bajo atmósfera de nitrógeno. Se agregó hidroxibenzotriazol (1 .46 g, 1 0.8 mmol) y trietilamina (1 02.5 mL, 0.74 mol) manteniendo la temperatura interna por debajo de 30 °C. Se agregó 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (1 28.2 g , 0.67 mol) en porciones y agitó por 16-1 8 horas a 20-30 °C. Se purificó la mezcla de reacción por cromatografía de gel de sílice (300 g gel de sílice), eluyendo con diclorometano (498 mLx2). Se combinó la solución de diclorometano y se lavó con agua (2 x 3.3 L). Se concentró la fase orgánica bajo presión reducida a un volumen de 300 mL a 400 m L y se agregó acetato de etilo (664.0 mL). Se concentró la mezcla bajo presión reducida a un volumen de 300-400 mL, y se agregó acetato de etilo (664 mL). Se concentró la mezcla bajo presión reducida a un volumen de 300-400 mL, y se agregó acetato de etilo (1 .3 L). Se agregó trihidrato de fluoruro de tetra-n-butilamonio (149.4 g, 0.47 mol) y agitó por 16-18 horas a 20-30 °C. Se agregó una solución acuosa de cloruro de sodio (20%, 1 .6 L), se separaron las capas, y se lavó la fase orgánica nuevamente con cloruro de sodio acuoso (20%, 1 .6 L) . Se concentró lo orgánico a un volumen aproximado de 800-900 mL y se agitó la mezcla por 12-1 6 horas a 20-30 °C. Se filtraron los sólidos resultantes, se lavó la torta de filtro con acetato de etilo (91 .3 mL). Se purificó lo filtrado con cromatografía de gel de sílice (300 g gel de sílice) , eluyendo con acetato de etilo (2 x 500 mL) para proporcionar el compuesto del título (82.6 g , 85.2%o de, 100%ee, 51 .2% de rendimiento) como un aceite amarillo. MS (m/z):441 (M + 1).

Preparación 19 (2S)-2-Amino-N-[(7S)-5-(2-hidroxietil)-6-oxo-7H-p¡rido[2,3-d][3]benzazepin-7-il]propanamida Se combinó N-[(1 S)-2-[[5-(2-hidroxietil)-6-oxo-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-7-il]amino]-1 -metil-2-oxo-etil]carbamato de ter-butilo (54.0 g, 0.12 mol) y acetonitrilo (212.7 mL) bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó ácido clorhídrico (317.5 mL, 4N, 1.27 mol) por goteo para mantener la temperatura interna por debajo de 30 °C, y agitó la mezcla de reacción por 16-18 horas a 20-30 °C. Se agregó agua (324.0 mL) y diclorometano (430 mL) y se separaron las capas. Se descargó la capa orgánica y a la fase acuosa se agregó diclorometano (645 mL) y se ajustó el pH a aproximadamente 10 usando hidróxido de sodio acuoso (20%, 252 mL). Se separaron las capas, se extrajo la capa acuosa con diclorometano adicional (2 x 430 mL), y se combinó la fase orgánica. Se concentró lo orgánico bajo presión reducida por debajo de 45 °C a un volumen aproximado de 130-150 mL, y se agregó tetrahidrofurano (322 mL). Se concentró la solución bajo presión reducida por debajo de 45 °C a un volumen aproximado de 200-220 mL, y se agregó tetrahidrofurano adicional (21 3 mL) . Se concentró la mezcla de reacción bajo presión reducida a un volumen aproximado de 250-270 mL, y se calentó a 60-65 °C por 2-3 horas. Se enfrió la mezcla de reacción a 5-1 5 °C lentamente y agitó por 5-8 horas. Se filtraron los sólidos resultantes, se lavó la torta de filtro con acetato de etilo (56 mL). Se transfirieron los sólidos a un recipiente de reacción limpio, se agregó acetato de etilo ( 1 50 mL), y se calentó a 60-65 °C por 2-3 horas, después se enfrió la solución a 5-1 5 °C lentamente. Se agitó por 2-3 horas a esta temperatura y se recolectaron los sólidos suspendidos por filtración . Se lavó la torta de filtro con acetato de etilo (45 mL) y se secaron los sólidos en un horno bajo presión reducida por debajo de 60 °C para proporcionar el compuesto del título (21 .0 g, 99.2%de, 1 00%ee, 51 .0% de rendimiento) como un sólido blancuzco. MS (m/z): 341 (M+1 ).

Ejem plo 2 Hidrato de 4,4,4-Trifluoro-N-[(1 S)-2-[[(7S)-5-(2-hidroxietil)-6-oxo-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-7-il]amino]-1 -metil-2-oxo-etil]butanamida Se combinó (2S)-2-amino-N-[(7S)-5-(2-hidroxietil)-6-oxo-7H- pirido[2,3-d][3]benzazepin-7-il]propanam¡da (45.0 g, 132.2 mmol) y dimetilformamida (452.9 mL) bajo una atmósfera de nitrógeno. Se enfrió a 0-5 °C y se agregó W-etildiisopropilamina (77.4 mL, 444.0 mmol), ácido 4,4,4-trifluorobutírico (19.9 g, 139.3 mmol), y monohidrato de hidroxibenzotriazol (22.3 g, 153.1 mmol). Se agitó la solución por 5-10 min y se agregó clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (30.6 g, 159.6 mmol) en una porción. Se calentó la mezcla de reacción a 20 -25 °C y agitó por 1-2 horas. Se agregó acetato de etilo (1.4 L) y agua (1.8 L) y agitó por 0.5- 1 horas. Se separaron las fases y se lavó la capa orgánica con una solución acuosa de bicarbonato de sodio (5%, 1.0 L) y se concentró la solución bajo presión reducida para obtener un volumen de 200-300 mL. Se agregó etanol (522 mL) y se concentró la solución bajo presión reducida para obtener un volumen de 200-300 mL. Se repitió tres veces. Se agregó etanol (180 mL) y 5% de solución de carbonato de potasio (34.6 mL) y agitó por 0.5-1 horas a 20~25 °C. Se agregó agua (667 mL) y se sembraron cristales de hidrato de 4,4,4-trifluoro-N-[(1 S)-2-[[(7S)-5-(2-hidroxietil)-6-oxo-7H-pirido[2,3-d][3]benzazepin-7-il]amino]-1-metil-2-oxo-etil]butanamida (0.4 g, 0.86 mmol) (Los cristales sembrados pueden ser generados de los sólidos obtenidos de los lotes previos del producto, o se pueden obtener usando otros métodos conocidos comunes y usados por un experto en la técnica, tales como recristalización de una pequeña alícuota) y se agitó por 2-3 horas a 20-25 °C. Se filtró y se lavó la torta de filtro con una mezcla de etanol (63 mL) y agua (42 mL) dos veces. Se secaron los sólidos resultantes en un horno bajo presión reducida por debajo de 40 °C para proporcionar el compuesto del título (41 .9 g , 99.6%de, 1 00%ee, 65.3% de rendimiento) como un sólido blancuzco. MS (m/z) :465(M-H20+ 1 ) .

XRPD del Ejemplo 2 Los patrones de XRPD de sólidos cristalinos se obtuvieron en un difractrómetro de polvo de rayos-X Bruker D4 Endeavor, equ ipado con una fuente CuKa (? = 1 .54060 A) y un detector Vantec, operando a 35 kV y 50 mA. La muestra se barrió entre 4 y 40° en 2T, con un ta maño de etapa de 0.0087° en 2T y u na velocidad de exploración de 0.5 segundo/etapas, y con 0.6 mm de divergencia, 5.28 mm anti-dispersión fija , y ranuras detectoras de 9.5 mm . El polvo seco se envasó en un sujetador de m uestra de cuarzo y se obtuvo una superficie lisa usando una laminilla de vidrio. Es bien conocido en la técnica cristalog ráfica que, para cualquier forma de cristal dada, las intensidades relativas de los picos de d ifracción pueden variar debido a la orientación preferida que resulta de factores tales como morfolog ía de cristal y hábito. Donde los efectos de orientación preferidos están presentes, se altera n las intensidades pico, pero las posiciones pico características del poli morfo permanecen sin cambio. (Por ejemplo, véase. U. S. Pharmacopia 33 -National Form ulary 28 Chapter < 941 > Characterization of Crystall ine Sol ids by X-ray Powder Diffraction (XRPD) Official October 1 , 201 0-February 1 , 201 1 ). Además, también es bien conocido en la técnica cristalog ráfica que para cualquier forma de cristal dada las posiciones pico ang ulares pueden variar ligeramente . Por ejem plo, las posiciones pico pueden cambiar debido a una variación en la temperatura o humedad en la cual la muestra es analizada, desplazamiento de muestra, o la ausencia o presencia de un estándar interno. En el presente caso, una variabilidad de posición pico de ± 0.2 en 2T tomará en cuenta estas variaciones potenciales sin obstaculizar la identificación inequívoca de la forma de cristal indicada. La confirmación de una forma de cristal puede hacerse con base en cualquier combinación única de picos distintivos (en unidades de 0 2T), típicamente los picos más prominentes. La forma de cristal del patrón de difracción es recolectada a temperatura ambiente (19-25°C) y humedad relativa (20-60%).

De este modo, una muestra preparada del compuesto del Ejemplo 2 es caracterizada por un patrón de XRPD usando radicación de CuKa por tener picos de difracción (valores 2-theta) como se describe en la Tabla 1 abajo. La forma es cristalina y contiene picos a 22.97 grados en combinación con uno o más de los picos seleccionados del grupo que consiste de 11.96, 18.81, 20.78, y 21.07 grados 2-theta, con una tolerancia para los ángulos de difracción de 0.2 grados.

Tabla 1: Picos de difracción en polvo de rayos-X del Eje NMR de Estado Sólido del Ejemplo 2 Se obtuvieron espectros de NMR de giro de ángulo mágico/polarización cruzada 1 3C (CP/MAS) (NMR de estado sólido o SSNMR) usando un espectrómetro de NMR Bruker Avance II 400 MHz (Lilly etiqueta K299547) operando a una frecuencia de carbono de 100.622 MHz y equipado con una sonda de resonancia triple Bruker 4 mm (K299551). Se usó supresión de banda lateral TOSS junto con polarización cruzada empleando desacoplamiento SPINAL64 (70.8 Watts) y un pulso CP de núcleo H conformado RAMP100. Los parámetros de adquisición son como sigue: amplitud de pulso r.f. de protón 90° de 2.5 ps, el tiempo de contacto fue 3.5 ms, tiempo de repetición de pulso 5 s, frecuencia MAS de 10 kHz, amplitud espectral de 30 kHz, el tiempo de adquisición es 34 ms y el número de barridos es 10,587. Los cambios químicos son referenciados a adamantano (d = 29.5 ppm) en un experimento separado. 13 C NMR (estado sólido): d (ppm) 18.65, 27.52, 28.76, 47.66, 49.96, 55.02, 58.88, 122.87, 126.49, 129.73, 131.37, 132.31, 137.28, 145.01, 149.17, 168.53, 170.30, 175.55.

Titulación de Karl Fischer del Ejemplo 2 Se obtuvieron titulaciones de Karl Fischer usando un Coulómetro Brinkmann Methrohm 756 KF. El estándar de control se determinó usando Hydranol® como un estándar acuoso por duplicado.

Se corrió la muestra por triplicado y registró el porcentaje promedio de agua para determinar la cantidad de agua en la muestra. El resultado promedio de la Titulación Karl Fischer del Ejemplo 2 es 3.9% agua. El porcentaje teórico de un equivalente molar de agua en el Ejemplo 2 es 3.7%.

El cáncer se reconoce cada vez más como una colección heterogénea de enfermedades cuya iniciación y progreso se inducen por la función aberrante de uno o más genes que regulan la reparación de DNA, estabilidad de genoma, proliferación celular, muerte celular, adhesión , ang iogénesis, invasión, y metástasis en la célula y microambientes de tejidos. La función aberrante o variante de los genes "cancerígenos" puede resultar de polimorfismo de DNA que se origina naturalmente, cambios en el número de copias de genoma (a través de la amplificación, supresión, pérdida de cromosoma, o duplicación) , cambios en la estructura del cromosoma y gene (a través de translocación cromosomal , inversión u otro reacomodo que conduce a expresión de gene desregulada), y mutaciones de punto. Los neoplasmas cancerosos pueden ser inducidos por una función de gene aberrante, y mantenidos por la misma función de gene aberrante, o mantenimiento y progreso exacerbado por funciones de gene aberrantes adicionales.

Más allá de las aberraciones cromosomales genéticas mencionadas anteriormente, cada uno de los cánceres también puede incluir modificaciones epigenéticas del genoma que incluyen metilación de DNA, impresión genómica y modificación de histona por acetilación, metilación o fosforilación. Una modificación epigenética puede jugar un papel en la inducción y/o mantenimiento de la enfermedad.

Catálogos extensivos de las aberraciones citogenéticas en cáncer humano han sido compilados y se mantienen y actualizan regularmente en línea (véase The Mitelman Datábase of Chromosome Aberrations in Cáncer at the US National Cáncer I nstitute (NCI) Cáncer Genome Anatomy Project (CGAP) Web site: http://cqap. nci. nih .gov). La base de datos incluye aberraciones cromosomales para al menos algunos de los cánceres de la presente invención. El Wellcome Trust Sanger Institute Cáncer Genome Project mantiene un "Concenso de gene de Cáncer" en línea detallado de todos los genes humanos que han sido casualmente ligados a tumorigénesis (véase http://www.sanger.ac.uk/qenetics/CGP/Census) así como también la base de datos COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cáncer) de mutaciones somáticas en cáncer humano (véase http://www.sanaer.ac.uk/qenetics/CGP/cosmic). Una fuente adicional que contiene información abundante en cambios citogenéticos casualmente ligados a varios cánceres es el Atlas de Genética y Citogenética en Oncología y Hematología (http://atlasqeneticsoncoloqv.Org//Anomalies/Anomliste.html#MDS).

Estas bases de datos también incluyen las aberraciones cromosomales para al menos algunos de los cánceres de la presente invención.

El diagnóstico de males cancerosos por biopsia, inmunofenotipado y otras pruebas se conocen y usan de manera rutinaria. Además de las tecnologías de imagen cromosomal avanzadas y bandas de cromosomas de alta resolución, las aberraciones de cromosomas en casos sospechosos de cáncer pueden ser determinadas a través de análisis citogenético tal como hibridación in situ por fluorescencia (FISH), cariotipado, cariotipado espectral (SKY), FISH múltiple (M-FISH), hibridización genómica comparativa (CGH), arreglos de polimorfismo de nucleotido único (Fragmentos SNP) y otras pruebas de análisis y diagnóstico conocidas y usadas por aquellos expertos en la técnica.

El papel oncogénico de Notch fue reportado primero en leucemia de células-T humanas que involucra una translocación del dominio intracelular Notchl a la región promotora del receptor-B de células T, que resultan en la sobre expresión del dominio intracelular Notchl (Grabher et al. Nature Review Cáncer, 2006(6):347-359¡ Weng et al. Science, 2004(306):269-271 ). La sobre expresión del dominio intracelular de Notchl en células progenitoras hematopoyéticas de ratones causa que el ratón presente leucemia linfoblástica aguda de células-T similar a humanos. Además de la leucemia linfoblástica aguda de células-T, existe evidencia incrementada de que las señales de Notch son oncogénicas en otros cánceres a través de mecanismos múltiples que incluyen amplificación del receptor y sobre expresión de ligandos y/o receptores que incluyen leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielogenosa aguda, leucemia mielogenosa crónica y eritroleucemia. La señalización Notch constitutiva aberrante debido a la mutación o sobre expresión de ligandos y/o receptores también está implicada en un número de malignidades de tumores sólidos que incluyen cáncer de mama, cáncer de ovario (Park et al. Cáncer Research, 2006(66):6312-6318), melanoma (Gast et al. Genes, Chromosomes & Cáncer, 2010(49):733-745), cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas (Westhoff et al. PNAS, 2009(106):22293-22298), cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cervical, cáncer de próstata, cáncer hepático, carcinoma de células escamosas (oral), cáncer de piel y meduloblastoma (Ranganathan et al., Nature Review Cáncer. 2011 (11 ):338-351 y Supplementary information S1 (tabla)). La inhibición de la señalización Notch presenta un objetivo atractivo para proporcionar beneficios terapéuticos a pacientes con cáncer cuya enfermedad se indujo por activación aberrante de la trayectoria de señalización Notch constitutiva. Shih et al. Cáncer Research. 2007(67)1879-1882.

Los siguientes estudios in. vitro e [n vivo demuestran la actividad inhibidora de señalización de la trayectoria Notch y eficacia del Compuesto 1 contra varias líneas de células de cáncer específicas. Estos en sayos son en general reconocidos por aquellos expertos en la técnica como indicativos de actividad quimioterapéutica clínica humana. La inhibición del dominio intracelular Notch desdoblado por ?-secretasa se cree es efectivo contra cada uno de los receptores Notch 1, Notch 2, Notch 3 y Notch 4. Ensayos evidencian la actividad inhibidora de la señalización de la trayectoria Notch y se puede llevar a cabo la eficacia sustancialmente como sigue o por ensayos similares que proporcionan datos similares.

Ensayo de Imagen Celular de Acumulación Nuclear Notchl N1ICD Células ???293??12 (células HEK293 son diseñadas por ingeniería para expresar establemente cDNA Notchl de ratón que codifica para los aminoácidos 1703-2183, NP_032740.3, con secuencia peptídica de señal de 23 aminoácidos, MPRLLTPLLCLTLLPALAARGLR (SEC ID NO:1), en su N-término) son plaqueadas a 5000 células/cavidad en una placa de 96 cavidades, incubadas en Medio Eagle Modificado de Dulbecco de alta glucosa con 5% de suero bovino fetal a 37 °C, 5% de C02 por 24 horas. Las células se trataron con el compuesto de prueba, dosificando a 10 puntos de diluciones 1:3 a través del intervalo de 1000 nM a 0.05 nM, y con una concentración final de dimetil sulfóxido (DMSO) a 0.2%. Después de 24 horas de tratamiento, las placas celulares se procesaron a través de las siguientes etapas secuencialmente:células fijas con ???µ?/cavidad de fijativo PREFER™ por 30 minutos a temperatura ambiente (RT); células permeabilizadas con 10?µ?/cavidad de 0.1% TRITON® X100 en salina amortiguada de fosfato (PBS) por 2 min a TA; se lavó 3 veces con 10?µ?/cavidad de PBS cada una; se agregó d?µ?/cavidad de anticuerpo anti-N1ICD de conejo (Dominio Intracelular Notchl), a 1:2000 en PBS con 1% de albúmina de suero bovino e incubó 1.5 horas a 37 °C; se lavó 3 veces con 10?µ?/cavidad de PBS cada una; incubó con 50µl/cavidad de IgG anti-conejo de cabra Alexa 488 a dilución 1:100 en PBS con 1% de albúmina de suero bovino e incubó 1 hora a 37 °C ; se lavó 3 veces con 10?µ?/cavidad de PBS cada una y se agregó 10?µ?/cavidad de 15 µ? de yoduro de propidio con 50µg/ml de RNAasa por 30 minutos para teñir el núcleo. Las placas son barridas con citómetro de microplaca de fluorescencia de barrido láser ACUMEN EXPLORER™ (TTP LABTECH LTD) para medir el conteo nuclear celular total/cavidad y área nuclear total/cavidad con fluorescencia a 655nm— 705nm (emisión de yoduro de propidio unido a DNA) y fluorescencia de anticuerpo enlazante a N1ICD en la región nuclear a 505nm— 530nm. El rendimiento de ensayo principal es una relación de fluorescencia total de N1ICD nuclear a área nuclear total, la señal N1ICD nuclear normalizada. Se recolectó un perfil de citotoxicidad relativa, como % de número celular a células de control con DMS al 0.2%. El anticuerpo que reconoce el Notchl o N1ICD desdoblado se origina a un péptido humano que corresponde con el sitio de desdoblamiento amino terminal de Notchl humano a Val1744. En células de control no tratadas, el N1ICD generado de Notchl se traslocará y acumulará en el núcleo. Cuando las células son tratadas por un compuesto inhibidor del desdoblamiento de Notchl la señal del N1ICD nuclear se reducirá. La respuesta a la concentración y el IC50 se determinan por fijación de curva a una logística de cuatro parámetros para la señal N1ICD nuclear, mientras el % de número celular se traza en la misma gráfica para perfil de citotoxicidad. Se realizaron los ensayos esencialmente como se describe anteriormente, el IC5o promedio para el Compuesto 1 es 0.41nM (n=7). El compuesto no afecta el número de células hasta la concentración de 1000 nM.

Estos datos evidencian que el Compuesto 1 tiene afinidad para Notchl e inhibe la acumulación intracelular del péptido de señalización celular del dominio intracelular de Notch 1.

Inhibición de Desdoblamiento de N1ICD en líneas de células tumorales humanas Para evaluar la potencia del Compuesto 1 en su capacidad para inhibir el desdoblamiento de N1ICD, se utilizaron varias líneas de células tumorales humanas. A2780 es una línea de células de ovario humano (Sigma-Aldrich, No. 93112519); MIA PaCa-2 es una línea de células de páncreas humano (ATCC No. CRL-1420); BxPC-3 es una línea de células de páncreas humano (ATCC No. CRL-1687); SW480 es una línea de células colorrectales humanas (ATCC No. CCL-228); HCT 116 es una línea de células colorrectales humanas (ATCC No. CCL-247); DLD-1 es una línea de células colorrectales humanas (ATCC No. CCL-221); MDA-MB-231 es una línea de células de glándulas mamarias humana (ATCC No. HTB-26); U-87 MG es una línea de células de glioblastoma humano (ATCC No. HTB-14); A375 es una línea de células de melanoma maligno humano (ATCC No. CRL-1619); CCRF-CEM es una línea de células de leucemia linfoblástica aguda (ALL) humana (ATCC No. CCL-119); SUP-T1 es una línea de células de leucemia linfoblástica de células-T humana (ATCC No. CRL-1942); K-562 es una línea de células de leucemia mielogenosa crónica humana (CML) caracterizada por la presencia de un transcripto de fusión comprendido de los genes Bcr y AbM (ATCC No. CCL-243); Jurkat, Clon E6-1 es una línea de células de leucemia de células-T aguda humana (ATCC No. TIB-152); MOLT-3 es una línea de células de leucemia linfoblástica aguda (ALL) humana (ATCC No. CRL-1552); MOLT-4 es una línea de células de leucemia linfoblástica aguda (ALL) humana (ATCC No. CRL-1582); HEL 92.1.7 es una línea de células de eritroleucemia humana (ATCC No. TIB-180). Cada una de las líneas celulares se obtuvo de la Colección de Cultivos Tipo Americana (ATCC) en el número declarado de ATCC, excepto la línea de células A2780 la cual se obtuvo de Sigma-Aldrich en el número de catálogo declarado. Las células se hicieron crecer en su respectivo medio de cultivo a 37°C en 5% de C02 con humedad en la atmósfera. El medio de cultivo celular para carcinoma de ovario humano A2780 es RPMI-1640 (sin rojo de fenol) con 2.05 mM de L-glutamina, se agregó 2 mM de L-glutamina, 0.01 mg/ml de insulina y 10% de suero bovino fetal (FBS); para carcinoma colorrectal humano HCT 116 es McCoy's 5A con 1.5 mM de L-glutamina, 0.075% de bicarbonato de Na y 10% de FBS; para carcinoma colorrectal humano SW480 es RPMI-1640 con 2.05 mM de L-glutamina, 20 mM de HEPES y 10% de FBS; glioblastoma humano U-87 MG es Solución de Sal Balanceada Earl/Medio Esencial Mínimo con 2 mM de L-glutamina, 0.1 mM de aminoácidos no esenciales (NEAA), 1 mM de piruvato de Na, y 10% de FBS; para carcinoma pancreático humano MIA PaCa-2 es Medio Eagles Modificado de Dulbecco (DMEM) sin piruvato de Na, con alta glucosa (4500 mg/ml), 4 mM de L-glutamina, 2.5% de suero de caballo y 10% de FBS; para CML DE humano K-562 es DMEM con alta glucosa (4500 mg/ml), 4 mM de L-glutamina, 10 mM de HEPES, 0.1 mM de NEAA, 1 mM de piruvato de Na y 10% de FBS; para leucemia de células T agudas humanas Clon E6-1, Jurkat, es RPMI-1640 con 2.05 mM de L-glutamina, 2.5 g/l de glucosa, 10 mM de HEPES, 1 mM de piruvato de Na, 0.075% de bicarbonato de Na y 10% de FBS; para melanoma maligno humano A-375 y adenocarcinoma de mama humano MDA-MB-231 es DMEM con alta glucosa (4500 mg/ml), 4 mM de L-glutamina y 10% de FBS; para adenocarcinoma pancreático humano BxPC-3, adenocarcinoma colorrectal humano DLD-1, leucemia linfoblástica humana SUP-T1, ALL humana MOLT-3, ALL humana Molt-4, ALL humana CCRF-CEM y eritroleucemia humana HEL 92.1.7 es RPMI-1640 con 2.05 mM de L-glutamina, 2.5 g/l de glucosa, 20 mM de HEPES, 1 mM de piruvato de Na, y 10% de FBS. Cuando es 80-90% de confluencia, las células son tratadas con el compuesto, dosificando a 10 puntos de diluciones 1:3 a través del intervalo de 50 nM a 0.0025 nM, y con una concentración final de dimetil sulfóxido (DMSO) a 0.01%. Después de 24 horas de tratamiento, las placas celulares son procesadas esencialmente a través de las siguientes etapas secuencialmente: las células se recolectaron después de la tripsinizacion, se lavaron una vez con PBS enfriado en hielo, y sometieron a lisis en 100 µ? de amortiguador de lisis XY enfriado en hielo (25 mM de Tris pH 7.5, 10 g/ml de inhibidor de Tripsina/Quimiotripsina, 10 pg/ml de Aprotinina, 60 mM de fosfato de Beta-glicerol, 1% de Tritón® X-100, 10 mM de NaF, 2.5 mM de pirofosfato, 150 mM de NaCI, 15 mM de ácido etilendiaminatetra acético (EDTA) pH 8.0, 5 mM de ácido etilen glicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-tetra acético (EGTA) pH 8.0, 1 mM de Vanadato de Na, 10 pg/ml de Leupeptina, 1 mM de ditiotreitol, 1 µ? de microcistina LR, 10 pg/ml de clorometilcetona de N-p-tosil-L-fenilalanina (TPCK), 2 mM de Clorhidrato de éster metílico de Na-p-tosil-L-arginina (TAME), 15 mM de sal de di(tris) 4-nitrofenil fosfato (PNPP), 0.1 mM de clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencensulfonilo (AEBSF), 5 mM de benzamidina, 1 µ? de ácido okadaico) que contiene tableta Completa 1X (Roche Complete™ No. 11 697 498 001) y cóctel Inhibidor de Proteasa 1X (Sigma Aldrich P8340). El lisado se incubó en hielo por 15 min con breve sometimiento a vórtices cada 5 min y se sónico por 1 minuto en hielo. Las muestras son centrifugadas en una centrífuga eppendorf a 4°C a 30,000 rpm por 30 minutos y 80 µ? de sobrenadante se recolectaron para el análisis. La concentración de proteína total se determinó usando Pierce BCA Protein Assay Kit™ (Thermo Scientific, Rockford, IL) usando un lector de placa Thermomax™ (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se determinaron los niveles de N1ICD usando un Ensayo Inmunosorbente Ligado a la Enzima N1ICD habitual (ELISA). El analito se captura en un anticuerpo monoclonal de conejo habitual específico de (Val1744) de Notchl desdoblado y se detecta en un anticuerpo de oveja policlonal Notchl SULFO-TAG® (Meso Scale Diagnostics, Gaithersburg, Maryland) C-terminal (R&D Systems, Minneapolis, MN). Los Usados son diluidos a 1 Mg/µ? en amortiguador R60TX de lisis tris ELISA enfriado en hielo (Meso Scale Diagnostics, Gaithersburg, Maryland), que contiene tableta Completa 1X (Roche Complete™ mini No. 11 836 153 001) y cóctel Inhibidor de Proteasa 1X (Sigma Aldrich P8340), y se agregaron 25µ? a la placa ELISA. La incubación de 25 \ig de lisado de proteína se hizo a TA por una hora cada una para capturar el analito y con anticuerpo de detección. Las placas se leyeron en un Sector Imager 6000™ (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland). El N1ICD sustraído del antecedente se normaliza a la proteína total y presenta como % de inhibición con relación al grupo tratado con vehículo. El valor IC50 se determina por datos de respuesta de concentración de fijación al modelo de "respuesta de dosis sigmoidal de 4 parámetros (inclinación variable" usando el software GraphPad Prism® 4. El valor IC50 para el Compuesto 1 en varias líneas de células de tumor se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1 Los datos en la Tabla 1 evidencian la potencia del Compuesto 1 en su capacidad para inhibir la generación de péptido de señalización N 1 ICD inhibiendo la actividad de ?-secretasa y como un resultado de la acumulación del péptido de señalización N 1 ICD en líneas de células de tumor humano específicas.

Estudios de inh ibición de objetivo y eficacia in vivo Estudios en ani males Para evaluar la eficacia in vivo y el efecto del Compuesto 1 en la inhibición de la farmacodinámica de procesamiento (PD) de Notch, se usaron varias líneas celulares y modelos de injerto heterólogo derivados del paciente. Se implantaron células A2780 (2 x 106), SW480 (6 x 106), HCT 116 (6 x 106), U-87 MG (6 x 106), y A-375 (10 x 106) en una mezcla de matrigel 1:1 (0.2 mi de volumen) por inyección subcutánea en la pata trasera de ratones hembra sin pelo atímicos de 6-8 semanas de edad (Harían Laboratories). Se implantaron células K-562 (6 x 106) en una mezcla de matrigel 1:1 (0.2 mi de volumen) por inyección subcutánea en la pata trasera de ratones hembra ?µ/µ CD1 de 6-8 semanas de edad (Charles River Laboratories). HEL 92.1.7 (7 x 106) en una mezcla de matrigel 1:1 (0.2 mi de volumen) se implantaron por inyección subcutánea en la pata trasera de ratones hembra deficientes inmune combinadas severamente CB17 de 6-8 semanas de edad (Taconic Farms). Se machacaron tumores derivados del paciente en piezas de 1-2 mM y mezclaron con matrigel (1:1) en 0.2 mi de volumen e implantaron por inyección subcutánea en la pata trasera de ratones hembra sin pelo atímicos de 6-8 semanas de edad (Harían Laboratories). Los modelos de tumor derivados del paciente incluyen: glioblastoma humano (EL2144), carcinoma de cáncer ductal in vivo negativo triple humano (EL1997), y carcinoma de colon humano (EL1989, EL 1986, y EL 2056) con muestras obtenidas después del consentimiento del paciente y aprobación hospitalaria del IU Health, Methodist Hospital, Indianapolis, Indiana, USA 46206. Se usaron un total de 7 a 10 ratones para cada grupo. Justo antes del implante para A2780, SW480, HEL 92.1.7, A-375, K-562, y modelos de tumores derivados del paciente, los animales son irradiados (Irradiación Corporal Total 450). Los ratones se alimentaron a albedrío con alimento normal. El tratamiento se inició con administración oral (forzada) de compuesto o vehículo (Na-CMC al 1% en Tween 80 al 0.25%) en 0.2 mi de volumen cuando el tamaño de tumor alcanzó 150 ± 50 mm3. En los puntos de tiempo designados después del tratamiento, se sacrificaron los animales por asfixia con C02 y dislocación cervical. Los tumores se removieron y se usaron para análisis de respuesta PD. Se monltorearon el crecimiento de tumor y peso corporal durante un tiempo para evaluar la eficacia y signos de toxicidad. Las mediciones biodimensionales de tumores se realizaron dos veces a la semana y los volúmenes de tumores se calcularon en base a la siguiente fórmula: (Volumen de tumor) = [(L)x(W2)x(ll/6)] en donde L es la longitud media del eje y W es el ancho medio del eje. Los datos del volumen de tumor se transformaron a una escala log para igualar la varianza a través del tiempo y grupos de tratamiento. Los datos de volumen log se analizaron con un análisis de mediciones de repetición de dos vías de varianza por un tiempo y tratamiento usando los procedimientos MIXED™ en el software SAS™ (versión 8.2). El modelo de correlación para las mediciones repetidas es energía espacial. Los grupos tratados se comparar al grupo control en cada punto de tiempo. El procedimiento MIXED™ también se usó separadamente para cada grupo de tratamiento para calcular medias ajustadas y errores estándar en cada punto de tiempo. Ambos análisis cuentan para la autocorrelación dentro de cada animal y la pérdida de datos que ocurre cuando los animales con grandes tumores se remueven del primer estudio. Las medias ajustadas y errores estándar se grafican para cada grupo de tratamiento contra tiempo. La actividad antitumoral se expresa como porcentaje de inhibición de crecimiento del tumor (% de TGI) y se calcula comparando volumen de tumor en el grupo de tratamiento con el grupo de tratamiento del vehículo. El porcentaje de inhibición del Crecimiento del Tumor (% de TGI) y valor significante estadístico (valor p) para el Compuesto 1 se mide esencialmente como se describe anteriormente y se resumen en la Tabla 2.

Análisis de N1 ICD Para evaluar los niveles de N1ICD en tumores, se corta aproximadamente 75 mg del tumor congelado y muele antes de la homogenización (masa actual registrada). Las muestras de tumor congeladas se transfieren a tubos Matrix-D™ para Lisis y se resuspenden en amortiguador de lisis XY enfriado en hielo (Tris 25 mM, pH 7.5, 10 g/ml de inhibidor Trypsina/Quimotripsina, 10 pg/ml de Protinina, Fosfato beta-glicerol 60 mM, Tritón ® X-100 al 1%, NaF 10 mM, pirofosfato 2.5 mM, NaCI 150 mM, ácido etilen diamina tetra acético (EDTA) 15 mM, pH 8.0, ácido etilen glicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-tetra acético (EGTA) 5mM, pH 8.0, Vanadato Na 1 mM, 10 Mg/ml de leupeptina, ditiotreitol 1 mM, LR microcistina LR 1 µ?, 10 g/ml de N-p-tosil-L-fenilalanina clorometil cetona (TPCK), clorhidrato de éster metílico de ?a-?-tosil-L-arginina (TAME) 2 mM, sal d i (tris) 4-nitrofenil fosfato (PNPP) 15 mM, clorhidrato de 4-(2-aminoetil)bencensulfonil fluoruro (AEBSF) 0.1 mM, benzamida 5 mM, Ácido Okadaico 1 µ?) que contiene tableta Completa IX (Roche Complete™ No. 11697 498 001) y coctel Inhibidor de Proteasa IX (Sigma-Aldrich P8340) a una masa: relación de volumen de 75 mg/ml del amortiguador. Los tejidos se homogenizaron en un homogenizador Fast Prep FP120 (Thermo Scientific, Rockford, IL) a una velocidad de 6.0 por 30 segundos a 4°C, seguido por 15 minutos de incubación en hielo. Esto se repitió por un total de 2-3 ciclos hasta que se completó la homogenización. Los Usados se hacen girar en una centrifugadora eppendorf a 4°C a 30,000 rpm por 15 minutos para remover los desechos. Se removió 400 µ? de lo sobrenadante y se transfirió a un nuevo tubo eppendorf y se sometió a un ciclo congelamiento/descongelamiento. Las muestras se hicieron girar nuevamente en una centrifugadora eppendorf a 4°C a 30,000 rpm por 30 minutos y se recolectó 120 µ? de sobrenadante para análisis. La concentración de proteína total se determinó usando el Kit de Ensayo de Proteína Pierce BCA™ (Thermo Scientific, Rackford, IL) usando una placa lectora Thermomax™ (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se determinaron los niveles de N1ICD usando un ELISA N1ICD. Se capturó el analito con un anticuerpo monoclonal de conejo habitual específico a Notch.1 (VaM 744) desdoblado y se detectó usando un anticuerpo de oveja policlonal Notchl C-terminal SULFO-TAG™ (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland)(R&D Systems, Minneapolis, MN). Los Usados se diluyeron a 2 g ml en amortiguador de lisis tris ELISA enfriado en hielo (R60TX) (Meso Scale Discovery. Gaithersburg, Maryland) que contiene la tableta Completa IX (Roche Complete™ mini No. 11 836 153 001) y coctel de Inhibidor de Proteasa IX (Sigma-Aldrich P8340), y se agregó 25 µ? a la placa ELISA. La incubación de 50 pg de lisados de proteína se realizó a temperatura ambiente por una hora, cada una para captura del analito y con anticuerpo de detección. Las placas se leyeron en un Sector Imager 6000™ (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland). Se normalizó N1ICD sustraído antecedente a proteína total y se presentó como % de inhibición en relación al grupo tratado con el vehículo. Se midió el % de inhibición y significancia estadística de N1IDC (valor p) por el método de Dunett en tumores recolectados 4 horas después de la última dosis para el Compuesto 1, se analizó esencialmente como se describió anteriormente y se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2 * No determinado Los datos en la tabla 2 hacen evidente la inhibición del crecimiento de tumor, y la inhibición del desdoblamiento de N1ICD por el Compuesto 1 en varios modelos de injerto heterólogo de tumores humanos. Los datos en la tabla 2 además proporcionan una correlación in vivo para los datos celulares de actividad funcional descritos en la Tabla 1.

Metabolismo y Excreción Los compuestos que demuestran bajo metabolismo y modulación del Citocromo P450 (CYP450) o la falta de estos, tienen una probabilidad reducida para interacciones adversas con otras medicaciones al paciente tomando en cuenta que puede resultar en cambios de dosis o une necesidad para detener la medicación en conjunto. Cuando el metabolismo CYP450 conduce a una exposición apreciable de pacientes a metabolitos activos, la eficacia y seguridad pueden surgir problemas de la mayor variabilidad asociada con la contribución de múltiples especies activas; por lo tanto, generalmente se prefiere un fármaco que carece de metabolitos activos. Son deseables los agentes terapéuticos hacen evidente el bajo metabolismo o modulación de CYP450 o la falta de estos y pueden tener perfiles de seguridad superior en y para pacientes. Lynch et al., Am. Fam. Physician, 76, 391 (2007). El potencial para interacciones enzimáticas de CYP450 no se puede pronosticar en base únicamente a la estructura de un agente farmacéutico activo.

El compuesto 1 no es un inhibidor o inductor de las enzimas CYP450 principales y no metabolizan cualquier extensión apreciable por microsomas de hígado optimizadas para metabolismo CYR450 oxidativo. En ratas y perros in vivo, los metabolitos oxidativos principales no se observan en circulación o excremento. Por lo tanto, el Compuesto 1 tiene una baja probabilidad para interacciones en base a CYP450 con otras medicaciones que puede resultar en ajustes de dosis o una necesidad para limitar o detener medicaciones adicionales en un paciente siendo tratado por cáncer.

El compuesto 1 se evalúa in vivo en ratas canuladas por el ducto biliar para farmacocinéticos de estudio sistémico (PK), excreción y metabolismo, in vivo 51% de la dosis IV se descargó por excreción, predominantemente por orina, con baja exposición sistémica (2% del precursor) a un metabolito N-desalquilado, 4,4,4-trifluoro-N-[(1 S)-1 -metil-2-oxo-2-[[(7S)-6-oxo-5,7-dihidropirido[2,3-d][3]benzazep¡n-7-il]amino]etil]butanamida. Los perfiles de plasma en rata para metabolitos, indican la ausencia de metabolitos circulantes adicionales. Estudios adicionales en perros intactos de ducto biliar también soportaron la limpieza apreciable por excreción del compuesto precursor, así como también la ausencia de metabolitos activos circulantes principales.

El metabolismo completo y datos de excreción para el Compuesto 1 hacen evidente los mecanismos de limpieza deseables (excreción urinaria del compuesto precursor e hidrólisis de amida para un fragmento inactivo y no circulante, el cual no se forma en incubaciones con microsomas hepáticos optimizados para metabolismo de CYP450), así como también la ausencia de metabolitos circulantes activos principales.

En el entorno clínico, son deseables los perfiles de limpieza del Compuesto 1 preclínicos observados. Los compuestos eliminados principalmente por metabolismos oxidativos se conocen por exhibir exposición variable debido a interacciones del fármaco con medicaciones concomitantes y ciertos jugos de fruta/hierbas, enfermedades hepáticas y diferencias entre los pacientes en actividad enzimática. Se prefieren múltiples mecanismos de limpieza, porque disminuyen el impacto de interacciones de fármaco que se origina en cualquier de alguna trayectoria de eliminación. Por lo tanto, la limpieza del Compuesto 1 para tanto excreción (51%) como metabolismo (hidrólisis de amida), sin producción de metabolitos circulantes activos principales, es ventajoso para el paciente. Todas estas propiedades de limpieza disminuyen la probabilidad para ajustes de dosis clínicas, así como minimiza la seguridad y eficacia concernientes asociadas con metabolitos circulantes activos principales, administración de medicación concomitante y diferencias entre pacientes en actividad CYP450.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un compuesto caracterizado porque es de la estructura: Compuesto 1 una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable. Un compuesto caracterizado porque es de la estructura: Compuesto 1 o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable. 3. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, 2-oxo-etil]butanamida, o una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable, en asociación con un portador farmacéuticamente aceptable. 4. Un método para inhibir la señalización Notch en un paciente con cáncer en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, o una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable, al paciente. 5. Un método para tratar un cáncer el cual es leucemia linfoblástica aguda de células T, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielogenosa aguda, leucemia mielogenosa crónica, eritroleucemia, cáncer de mama, cáncer de ovario, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cervical, cáncer de próstata, cáncer hepático, carcinoma de células escamosas (oral), cáncer de piel o meduloblastoma en un paciente, caracterizado porque comprende administrar al paciente en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable. 6. Un método para tratar un cáncer el cual es leucemia linfoblástica aguda de células T, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielogenosa crónica, eritroleucemia, cáncer de mama, cáncer de ovario, melanoma, cáncer pancreático, glioblastoma o cáncer colorrectal en un paciente, caracterizado porque comprende administrar al paciente en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, o una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable. 7. Un compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, o una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable, para uso en terapia. 8. Un compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, o una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable, para uso en el tratamiento de un cáncer el cual es leucemia linfoblástica aguda de células T, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielogenosa aguda, leucemia mielogenosa crónica, eritroleucemia, cáncer de mama, cáncer de ovario, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cervical, cáncer de próstata, cáncer hepático, carcinoma de células escamosas (oral), cáncer de piel o meduloblastoma. 9. Un compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, o una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable, para uso en el tratamiento de un cáncer el cual es leucemia linfoblástica aguda de células T, leucemia mielogenosa crónica, eritroleucemia, cáncer de mama, cáncer de ovario, melanoma, cáncer pancreático, glioblastoma o cáncer colorrectal. 10. Uso de un compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, o una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de un cáncer el cual es leucemia linfoblástica aguda de células T, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielogenosa aguda, leucemia mielogenosa crónica, eritroleucemia, cáncer de mama, cáncer de ovario, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cervical, cáncer de próstata, cáncer hepático, carcinoma de células escamosas (oral), cáncer de piel o meduloblastoma. 11. Uso de un compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, o una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de un cáncer el cual es leucemia linfoblástica aguda de células T, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielogenosa crónica, eritroleucemia, cáncer de mama, cáncer de ovario, melanoma, cáncer pancreático, glioblastoma o cáncer colorrectal. 12. Un compuesto de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado porque es un hidrato cristalino distinguido por un patrón de difracción en polvo de rayos-X usando radiación CuKa que tiene un pico a 22.97 ±0.2 grados 2-theta en combinación con uno o más picos a 11.96 ±0.2, 18.81 ±0.2, 20.78 ±0.2 ó 21.07 ±0.2 grados 2-theta a temperatura ambiente y humedad relativa. RES U M EN La presente invención se refiere a un compuesto, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable, y una composición farmacéutica que contiene el compuesto, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable, útil como un inhibidor de la señalización de la trayectoria Notch para el tratamiento de cáncer.