MX2013009715A - Proteinas de membrana solubles en agua y metodos para la preparacion y uso de las mismas. - Google Patents

Abstract

La presente invención está dirigida a proteínas de membrana solubles en agua, métodos para su preparación y métodos para su uso.

Description

PROTEÍNAS DE MEMBRANA SOLUBLES EN AGUA Y MÉTODOS PARA LA PREPARACIÓN Y USO DE LAS MISMAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional Estadounidense No. 61/445,740, presentada el 23 de Febrero de 2011. Las enseñanzas completas de la(s) solicitud (es) anterior (es) se incorporan en este documento mediante referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las proteínas de membrana juegan papeles vitales en todos los sistemas vivos. Aproximadamente ~30% de todos los genes en casi todos los genomas secuenciados , codifican para proteínas de membrana. Sin embargo, nuestro entendimiento detallado de su estructura y función dista mucho del de las proteínas solubles. Hasta Febrero de 2012, había más de 79, 500 estructuras en el Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do), sin embargo, hay 952 estructuras de proteínas de membrana con 320 estructuras únicas incluyendo 8 receptores acoplados de proteína G. Aunque hay alrededor de 400 receptores olfativos funcionales en el humano, no se ha determinado ni un solo receptor olfativo.

Hay varios cuellos de botella cuando se trata de aclarar la estructura y la función de los receptores olfativos y su reconocimiento y proteínas enlazantes de odorante aunque son de mucho interés . La tarea más crítica y que presenta más retos es que es extremadamente difícil producir cantidades en miligramos de receptores solubles y estables. Se necesitan desesperadamente métodos de producción a gran escala que no sean costosos, y por lo tanto han sido el enfoque de investigación extensiva. Sólo es posible llevar a cabo estudios estructurales detallados una vez que estos obstáculos preliminares han sido superados. Por lo tanto, existe una necesidad en la materia por métodos mejorados para el estudio de receptores acoplados de proteína G, incluyendo receptores olfativos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a péptidos de membrana solubles en agua, composiciones que comprenden dichos péptidos, métodos para su preparación y métodos para su uso.

La invención abarca un polipéptido soluble en agua que comprende una dominio a-helicoidal modificado, en donde el dominio a-helicoidal modificado comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o más residuos de aminoácido hidrofóbico dentro de un dominio -helicoidal de una proteina de membrana nativa es reemplazado con uno o más residuos .de aminoácido hidrofilico. La invención también abarca un método para la preparación de un polipéptido soluble en agua que comprende el reemplazo de uno o más residuos de aminoácido hidrofóbico con el dominio a-helicoidal de una proteína de membrana nativa con uno o más residuos de aminoácido hidrofilico. La invención abarca adicionalmente un polipéptido preparado al reemplazar uno o más residuos de aminoácido hidrofóbico dentro del dominio a-helicoidal de una proteína de membrana nativa con uno o más residuos de aminoácido hidrofilico.

La invención abarca, además, un método para el tratamiento de un trastorno o enfermedad que está mediada por la actividad de una proteína de membrana en un sujeto en necesidad del mismo, comprendiendo la administración a dicho sujeto de una cantidad efectiva de polipéptido soluble en agua que comprende un dominio a-helicoidal modificado, en donde el dominio a-helicoidal modificado comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o más residuos de aminoácido hidrofóbico dentro de un dominio a-helicoidal de la proteína de membrana es reemplazado con uno o más residuos de aminoácidos hidrofilico. En ciertos aspectos, el polipéptido soluble en agua retiene la actividad enlazante de ligando de la proteina de membrana. Ejemplos de trastornos y enfermedades que se pueden tratar administrando un péptido soluble en agua de la invención incluyen, pero no están limitados a, cáncer (tal como cáncer pulmonar de célula pequeña, melanoma, cáncer de mama triple negativo) , enfermedad de Parkinson, enfermedad cardiovascular, hipertensión, y asma bronquial.

La invención también abarca una composición farmacéutica que comprende un péptido soluble en agua de la invención y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable .

En algunos aspectos, el dominio -helicoidal es un dominio a-helicoidal 7-transmembránico . En una modalidad adicional, la proteína de membrana nativa es un receptor acoplado de proteína G (GPCR) . En algunos aspectos de esta modalidad, el GPCR se selecciona del grupo que comprende receptores purinérgicos (P2YX, P2Y2, P2Y4, P2YJ , receptores de acetilcolina muscarínicos M1 y M3, receptores de trombina [receptor activado por proteasa (PAR)-l, PAR-2], tromboxano (TXA2) , esfingosina 1-fosfato (S1P2, S1P3, S1P4 y S1P5) , ácido lisofosfatídico (LPAj, LPA2, LPA3) , angiotensina II (ATJ , serotonina (5-HT2c y 5-HT4) , somatostatina (sst5) , endotelina (ETA y ETB) , colecistoquinina (CCK , receptores de vasopresina Vla, receptores de dopamina D5, receptores de péptido de formilo fMLP, receptores de galanina GAL2, receptores de prostanoide EP3, receptores de adenosina Air receptores adrenérgicos alf receptores de bombesina BB2, receptores de bradiquinina B2, receptores sensibles al calcio, receptores de quimioquina, receptores de quimioquina KSHV-ORF74, receptores de taquiquina ?? receptores estimulantes de la tiroides (TSH) , receptores activados por proteasa, receptores de neuropéptidos, receptores de adenosina A2B, purinoceptores P2Y, receptores de glutamato metabólico, GRK5, GPCR-30, y CXCR . En otra modalidad adicional más, la proteina de membrana nativa es una proteina de mamífero. En otro aspecto adicional, la proteína de membrana nativa es un receptor olfativo. En modalidades adicionales, el receptor olfativo es mOR103-15.

En algunos aspectos, los residuos hidrofílico (que reemplazan uno o más residuos hidrofóbico en el dominio a-helicoidal de una proteína de membrana nativa) se seleccionan del grupo que consiste de glutamina (Q) , treonina (T) , tirosina (Y) y cualquier combinación de las mismas. En aspectos adicionales, uno o más residuos hidrofóbico seleccionados de leucina (L) , isoleucina (I) , valina (V) y fenilalanina (F) son reemplazados.

En ciertas modalidades, uno o más residuos de fenilalanina del dominio a-helicoidal de la proteína son reemplazados con tirosina. En ciertas modalidades adicionales, uno o más residuos de isoleucina y/o valina del dominio a-helicoidal de la proteína son reemplazados con treonina. En aspectos adicionales, uno o más residuos de fenilalanina del dominio a-helicoidal de la proteina son reemplazados con tirosina y uno o más residuos de isoleucinas y/o valina del dominio a-helicoidal de la proteína son reemplazados con treonina. En modalidades adicionales, uno o más residuos de leucina del dominio a-helicoidal de la proteína son reemplazados con glutamina. En modalidades adicionales, uno o más residuos de leucina del dominio a-helicoidal de la proteína son reemplazados con glutamina y uno o más residuos de isoleucina y/o valina de la proteína son reemplazados con treonina. En modalidades adicionales, uno o más residuos de leucina del dominio a-helicoidal de la proteína son reemplazados con glutamina y uno o más residuos de fenilalanina del dominio a-helicoidal de la proteína son reemplazados con tirosina. En aspectos adicionales, uno o más residuos de leucina del dominio a-helicoidal de la proteína son reemplazados con glutamina, uno o más residuos de fenilalanina del dominio a-helicoidal de la proteína son reemplazados con tirosina, y uno o más residuos de isoleucina y/o valina del dominio a-helicoidal de la proteína son reemplazados con treonina.

En modalidades adicionales, el polipéptido soluble en agua retiene al menos algo de la actividad biológica de la proteína de membrana nativa. En un aspecto de esta modalidad, el polipéptido soluble en agua retiene la capacidad de enlazar el ligando que normalmente se-enlaza a la proteina de membrana nativa. En otra modalidad, uno o más aminoácidos dentro de los sitios potenciales enlazantes de ligando de la proteina de membrana nativa no son reemplazados. En un aspecto de esta modalidad, ejemplos de proteínas de membrana nativas con uno o más aminoácidos no reemplazados dentro de los sitios enlazantes de ligando potenciales son receptores purinérgicos (P2YX, P2Y2, P2Y4, P2YJ , receptores de acetilcolina muscarínicos Mx y M3, receptores de trombina [receptor activado por proteasa (PAR)-l, PAR-2], tromboxano (TXA2) , esfingosina 1-fosfato (S1P2, S1P3, S1P4 y S1P5), ácido lisofosfatídico (LPAX, LPA2, LPA3) , angiotensina II (AT , serotonina (5-HT2c y 5-HT , somatostatina (sst5) , endotelina (ETA y ETB) , colecistoquinina (CCK , receptores de vasopresina Vla, receptores de dopamina D5, receptores de péptido de formilo fMLP, receptores de galanina GAL2, receptores de prostanoide EP3, receptores de adenosina Alf receptores adrenérgicos alf receptores de bombesina BB2, receptores de bradiquinina B2, receptores sensibles al calcio, receptores de quimioquina, receptores de quimioquina KSHV-ORF74, receptores de taquiquina NKt, receptores estimulantes de la tiroides (TSH) , receptores activados por proteasa, receptores de neuropéptidos, receptores de adenosina A2B, purinoceptores P2Y, receptores de glutamato metabólico, GRK5, GPCR-30, y CXCR4.

En otra modalidad, uno o más aminoácidos dentro de los sitios enlazantes de odorante potenciales de la proteina de membrana nativa no son reemplazados.

En una modalidad, el polipéptido soluble en agua que comprende un dominio a-helicoidal modificado comprende la secuencia de aminoácidos MERRNHTGRV SEFVLLGFPA PAPQRALQFF QSLQAYVQTL TENIQTITAI RNHPTLH PM YYFLANMSFYL ETWYTTVTTP KMQAGYIGSE ENHGQLISFE ACMTQLYFFQ GLGCTECTLL AVMAYDRYVA TCHPLHYPVI VSSRQCVQMA AGS AGGFGT SMTVKVYQISR LSYCGPNTIN HFFCDVSPLL NLSCTDMSTA ELTDFILAIF ILLGPLSVTG ASYMAITGAV MRIPSAAGRH KAFSTCASHL TTVITYYAAS IY YARPKAL SAFDTNKLVS VLYAVIVPLL NPIIYCLRNQ EVKKALRRTL HLAQGDANT KKSSRDGGSS GTETSQVAPA (SEQ ID NO: 2) . En otra modalidad adicional más, el polipéptido soluble en agua que comprende un dominio x-helicoidal 7-transmembránico modificado comprende una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos: a. PQRALQFFQSLQAYVQTLTE IQTITAI R (SEQ ID NO: 3) b. M YYFLANMSFYLETWYTTVTTPK QAGYI (SEQ ID NO: 4) C . CMTQLYFFQGLGCTECTLLAVMAYDRYVA TC (SEQ ID NO: 5) d. RQCVQMAAGS AGGFGTSMTVKVYQ (SEQ ID NO: 6) e. LTDFILAIFILLGPLSVTGASYMAITGAV (SEQ ID NO: 7) f . HKAFSTCASHLTTVITYYAAS IYTY (SEQ ID NO: 8) g. TNKLVSVLYAVIVPLLNPIIYCLRN (SEQ ID NO : 9) En ciertos aspectos de la invención, la estructura secundaria del péptido soluble en agua se determina. En algunas modalidades, la estructura secundaria se determina usando dicroismo circular.

En ciertas modalidades, se mide el ligando que se enlaza al polipéptido soluble en agua. En algunos aspectos, la afinidad enlazante del ligando del polipéptido soluble en agua se compara con la de la proteína nativa. En aspectos adicionales, el enlace del ligando se mide usando termofóresis a microescala, ensayo de influjo de calcio o cualquier combinación de los mismos.

En otra modalidad adicional más, la invención abarca una célula transfectada con un péptido soluble en agua que comprende un dominio oí-helicoidal modificado. En ciertas modalidades, la célula es una célula de mamífero. Un ejemplo de una célula de mamífero que se puede transfectar es una célula HEK293.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los anteriores y otros objetos, características y ventaj as de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción más particular de modalidades preferidas de la invención, como se ilustra en los dibujos adjuntos en los que los caracteres de referencia se refieren a las mismas partes en todas las diferentes vistas. Los dibujos no están necesariamente a escala, poniéndose en su lugar se coloca en ilustrar los principios de la invención.

La figura 1 muestra las secuencias de aminoácidos mOR103-15 nativos y mOR103-15 mutado usando reemplazos de glutamina, treonina y tirosina (QTY) . El uso de reemplazos de QTY para mutar de forma sistemática los principales residuos en los -helicoidales 7-transmembránicos para convertir un receptor olfativo insoluble en agua en uno soluble en agua una. Sólo cambiamos las posiciones de b, c, f con los residuos más solubles en agua, Q, T, Y. Estas posiciones son en la cara hidrofílica de los helicoidales.

Mantenemos las posiciones a, d, e, g, que están en la cara hidrofóbica. Es probable que estos cambios mantengan los a-helicoidales individuales. Las mutaciones están etiquetadas en letras mayúsculas azules en la parte superior de la secuencia del receptor. Las letras pequeñas, abcdefg, son las posiciones de las ruedas helicoidales. Los subrayados son las ubicaciones de los a-helicoidales 7-transmembránicos . Los números (8, 7, 3, 5, 4, 5, 4) son las mutaciones en cada uno de los a-helicoidales. Hay 36cambios de residuos, ~ 10.5% del total de 340 residuos.

La figura 2 muestra los modelos moleculares de un receptor olfativo mOR103-15 de reemplazo de QTY . Un total de 36 mutaciones se han hecho (~10,5%) en los segmentos helicoidales 7-transmembránicos . Estas mutaciones no afectan a los residuos cargados, por lo que la masa del receptor variante y pl se mantienen sin cambios. Las formas moleculares y tamaños de los aminoácidos, Q, T, e Y son muy similares a L, V/I e Y, por lo que hay cambios en la forma local general mínimos. Un segmento de 20 aminoácidos en el término C no se modela para mayor claridad.

Figuras 3A-3C. A) Vista superior de los reemplazos QTY y B) vista lateral de los reemplazos QTY. Nótese que las mutaciones están sólo en un lado de los helicoidales. El receptor nativo sin mutaciones tiene una estructura plegada similar a un receptor adrenérgico ai, mientras que después de la mutación, la estructura es similar a la de los receptores adrenérgicos ß2· C) Estructuras simuladas de mOR103-15 (rojo) nativos superpuestos y la mutación de QTY diseñada de mOR103-15 (azul) . La diferencia estructural general es un promedio de ~0, 8Á.

Figura 4. Espectro de dicroísmo circular de CXCR4 y mutación de QTY diseñada de CXCR4-QTY.

Figura 5. Gel SDS que muestra la comparación del peso molecular entre CXCR4 y CXCR4 nativos con mutaciones de QTY (SEQ ID NO 10: CXCR4 QTY) .

Figura 6. Uso de reemplazos de QTY para mutar sistemáticamente residuos clave en los alfa-helicoidales 7-transmembránicos y algunos otros residuos hidrofóbicos para convertir el CXCR4 de forma de membrana insoluble en agua en una forma soluble en agua. A) Hemos cambiado las posiciones b,c,f con la mayor cantidad de residuos solubles en agua, Q, T, Y. No cambiamos las posiciones a, ú, e, g. Estas posiciones se cree que mantienen el agrupamiento especifico de alfa-helicoidales individuales. B) . Las superposiciones de CXCR4 de forma de membrana (rojo) y QTY CRCR4 soluble en agua (azul) . C) Los residuos nativos están marcados en letras rojas y D) Las mutaciones están marcadas en letras azules en la secuencia. Se han realizado un total de 29 mutaciones QTY entre los 352 residuos (alrededor del 8.2%) en los siete segmentos helicoidales transmembránicos . Estas mutaciones no afectan a los residuos cargados, por lo que la masa del receptor variante y pl se mantienen sin cambios. Las formas moleculares y tamaños de los aminoácidos, Q, T e Y son muy similares a L, V/I e Y, por lo que hay cambios mínimos en la forma local, general.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Sigue una descripción de modalidades preferidas de la invención.

Las palabras "un" o "una" se pretende que abarquen uno/a o más, a menos que se especifique lo contrario .

En algunos aspectos, la invención está dirigida al uso del método de reemplazo QTY (glutamina, treonina y tirosina) para cambiar sistemáticamente los residuos hidrofóbicos a-helicoidal 7-transmembránico de leucina (L) , isoleucina (I) , valina (V) , y fenilalanina (F) de una proteina nativa de los residuos hidrofilicos de glutamina (Q) , treonina (T) y tirosina (Y) . Esta invención convertirá la proteina de membrana nativa de una insoluble en agua a un homólogo soluble en agua.

Otra innovación de la invención consiste en convertir el receptor olfativo insoluble en agua mOR103-15 en uno soluble en agua con alrededor de 10.5% de residuos de cambios específicos (36aa/340aa) . Esto se logrará mediante el cambio de forma sistemática y selectivamente de los residuos clave en las posiciones a-helicoidales b, c, f que por lo general están frente a la superficie hidrofílica, mientras que se mantienen los residuos hidrofóbicos en las posiciones a-helicoidales a, d, e, g. El método de diseño de la biología sintética es general y ampliamente aplicable al estudio de otros receptores olfativos y los receptores acoplados a proteina G. Esta estrategia tiene el potencial de superar el cuello de botella de la cristalización de los receptores olfativos, asi como los GPCR adicionales y otras proteínas de membrana .

Se utilizaron métodos de biología sintética para convertir un receptor olfativo insoluble en agua en uno soluble en agua con un ~10.5% de los cambios de residuos (36aa/340aa) (Fig. 1 y 2) . Hemos cambiado de manera sistemática y selectivamente residuos clave en las posiciones a-helicoidales b, c, f (que suelen formar la superficie hidrofílica) , pero mantuvo los residuos hidrofóbicos en las posiciones a-helicoidales a, d, e, g (figura 1) . Nuestro método de diseño de la biología sintética es de naturaleza general, por lo que es ampliamente aplicable a los otros receptores olfativos de estudio, de quimioquinas CXCR4, así como otros receptores acoplados a proteínas G (GPCR) y otras proteínas de membrana. Esta estrategia simple puede superar en parte el cuello de botella de los estudios estructurales de los receptores olfativos, GPCRs, y otras proteínas de membrana si las proteínas de membrana convertidas a solubles en agua siguen siendo biológicamente funcionales.

Con el fin de facilitar el estudio de los aspectos estructurales de los receptores olfativos y sus propiedades de unión, vamos a utilizar el método de reemplazo QTY para diseñar un receptor olfativo helicoidal soluble en agua de 7 haces mOR103-15 (figuras 1-3) . Se sabe que los siete aminoácidos tienen tendencias formadoras de a-helicoidales (32): leucina (L) (1.30), glutamina (Q) (1.27), fenilalanina (F) (1.07), tirosina (Y) (0.72), isoleucina (I) (0.97), valina (V) (0.91) y treonina (T) (0.82) . Sabemos también que las cadenas laterales de Q, Y y T pueden todas formar enlaces de hidrógeno con agua: Q puede formar 4 enlaces de H (2 donantes de H de -NH2, 2 aceptores de H de C=0) , y T e Y pueden formar 3 enlaces de H cada uno (-OH, 1 donante de H y 2 aceptantes de O) . Los residuos de Q, T, Y son más solubles en agua que L, F, I, o V, que no pueden formar enlaces de hidrógeno con cualquiera de sus cadenas laterales . Las sustituciones propuestas no tendrán ningún cambio de cargas negativas o positivas. Por otra parte, las formas moleculares y tamaños son muy similares para los pares: leucina/glutamina, fenilalanina/tirosina, valina/treonina, e isoleucina/treonina (33-34). Asi pues, los cambios propuestos deben aumentar la solubilidad de a-helicoidales 7-transmembránicos mientras se mantiene la estructura general helicoidal (figura 3C) .

En este diseño del receptor olfativo soluble, hemos realizado las siguientes sustituciones: de fenilalanina a tirosina (F->Y) , isoleucina/valina a treonina (I/V->T) , y leucina a glutamina (L->Q) . La estructura secundaria del receptor olfativo soluble en agua, asi como la medición de sus capacidades de enlace a odorantes pueden ser examinadas. Si se detecta enlace de odorante con los reemplazos QTY, entonces es probable que hayamos conservado componentes importantes de la estructura original . La estructura secundaria y el enlace del receptor olfativo soluble en agua diseñado con el receptor olfativo nativo se pueden preparar. Cantidades de miligramos del receptor soluble en agua se pueden producir y pantallas de cristal se pueden configurar con y sin odorantes.

En una modalidad, la proteina de membrana nativa es un receptor acoplado a proteina G (GPCR) . En aún otra modalidad, la proteina de membrana nativa es un receptor olfativo. En algunas modalidades, el receptor olfativo es un receptor de mamífero. En aún otra modalidad, el receptor olfativo es mORl03-15. En ciertos aspectos, el polipéptido soluble en agua retiene al menos algo de la actividad biológica de la proteína de membrana nativa. En aún otro aspecto, la proteína de membrana es un receptor de membrana que media una enfermedad o condición.

En una modalidad adicional, la proteína de membrana nativa es un GPCR seleccionado de entre el grupo que comprende los receptores purinérgicos (P2Yi, P2Y2, P2Y<j, ?2?d) , receptores de acetilcolina muscarinicos ?? y M3, receptores de trombina [receptor activado por proteasa (PAR)-l, PAR-2], tromboxano (TXA2) , esfingosina 1-fosfato (S1P2, SIP3, S1P4 y SIP5) , ácido lisofosfatidico (LPAi, LPA2, LPA3), angiotensina II (ATi) , serotonina (5-HT2c y 5-HT4) , somatostatina (sst5) , endotelina (ETA y ETB) , colecistoquinina (CCKi) , receptores de vasopresina Via, receptores de dopamina D5, receptores de péptido de formilo f LP, receptores de galanina GAL2, receptores de prostanoide EP3, receptores de adenosina Ai, receptores adrenérgicos ai, receptores de bombesina BB2, receptores de bradiquinina B2, receptores sensibles al calcio, receptores de quimioquina, receptores de quimioquina KSHV-ORF74, receptores de taquiquina NKi, receptores estimulantes de la tiroides (TSH) , receptores activados por proteasa, receptores de neuropéptidos, receptores de adenosina A2B, purinoceptores P2Y, receptores de glutamato metabólico, GRK5, GPCR-30, y CXCR . En una modalidad adicional, la invención está dirigida a una composición farmacéutica o método de tratamiento descrito en este documento en el que la proteina de membrana nativa es un GPCR seleccionado de entre el grupo que comprende los receptores purinérgicos (?2??, P2Y2, P2Y4, P2Y6) , receptores de acetilcolina muscarínicos i y M3, receptores de trombina [receptor activado por proteasa (PAR)-l, PAR-2], tromboxano (TXA2) , esfingosina 1-fosfato (S1P2, S1P3, S1P y S1P5) , ácido lisofosfatidico (LPAj., LPA2, LPA3) , angiotensina II ( Ti) , serotonina (5-HT2c y 5-HT4) , somatostatina (sst5) , endotelina (ETA y ETB) , colecistoquinina (CCKX) , receptores de vasopresina Via, receptores de dopamina D5, receptores de péptido de formilo fMLP, receptores de galanina GAL2, receptores de prostanoide EP3, receptores de adenosina Ai, receptores adrenérgicos OÍI, receptores de bombesina BB2, receptores de bradiquinina B2, receptores sensibles al calcio, receptores de quimioquina, receptores de quimioquina KSHV-ORF74, receptores de taquiquina NKi, receptores estimulantes de la tiroides (TSH) , receptores activados por proteasa, receptores de neuropéptidos, receptores de adenosina A2B, purinoceptores P2Y, receptores de glutamato metabólico, GRK5, GPCR-30, y CXCR .

En otra modalidad, el polipéptido soluble en agua retiene la al menos algo de la actividad de enlace al ligando de la proteina de membrana. En algunas modalidades, los GPCR son receptores de mamíferos.

En una modalidad adicional, uno o más aminoácidos dentro de los posibles sitios de enlace a ligando de la proteína de membrana nativa no se reemplazan. En un aspecto de esta modalidad, los ejemplos de proteínas de membrana nativas con sitios de enlace a ligandos potenciales que tienen uno o más aminoácidos no reemplazados incluyen los receptores purinérgicos (?2??, P2Y2, P2Y4, P2Y6) , receptores de acetilcolina muscarinicos Mi y M3, receptores de trombina [receptor activado por proteasa (PAR)-l, PAR-2], tromboxano (TXA2) , esfingosina 1-fosfato (S1P2, S1P3, S1P4 y S1P5) , ácido lisofosfatídico (LPAi, LPA2, LPA3) , angiotensina II (ATi) , serotonina (5-HT2c y 5-HT4) , somatostatina (sst5) , endotelina (ETA y ETB) , colecistoquinina (CCKi) , receptores de vasopresina Via, receptores de dopamina D5 receptores de péptido de formilo fMLP, receptores de galanina GAL2, receptores de prostanoide EP3, receptores de adenosina ??, receptores adrenérgicos «i, receptores de bombesina BB2, receptores de bradiquinina B2, receptores sensibles al calcio, receptores de quimioquina, receptores de quimioquina KSHV-ORF74, receptores de taquiquina NKi, receptores estimulantes de la tiroides (TSH) , receptores activados por proteasa, receptores de neuropéptidos, receptores de adenosina A2B, purinoceptores P2Y, receptores de glutamato metabólico, GRK5 , GPCR-30, y CXCR4.

La invención abarca además un método de tratamiento de un trastorno o enfermedad que está mediada por la actividad de una proteina de membrana, que comprende el uso de un polipéptido soluble en agua para el tratamiento de dichos trastornos y enfermedades, en el que dicho polipéptido soluble en agua comprende un dominio o¡-helicoidal modificado, y en el que dicho polipéptido soluble en agua retiene la actividad de enlace al ligando de la proteina de membrana nativa. Ejemplos de tales trastornos y enfermedades incluyen, pero no se limitan a, cáncer, cáncer de pulmón de células pequeñas, melanoma, cáncer de mama, enfermedad de Parkinson, enfermedad cardiovascular, hipertensión, y asma.

Como se describe en este documento, los péptidos solubles en agua descritos en este documento pueden ser utilizados para el tratamiento de condiciones o enfermedades mediadas por la actividad de una proteina de membrana. En ciertos aspectos, los péptidos solubles en agua pueden actuar como "señuelos" para el receptor de membrana y se enlazan al ligando que activa el receptor de membrana. Como tal, los péptidos solubles en agua descritos en este documento pueden ser utilizados para reducir la actividad de una proteina de membrana. Estos péptidos solubles en agua pueden permanecer en la circulación y enlazarse a ligandos específicos, reduciendo de este modo la actividad de los receptores enlazantes a membrana. Por ejemplo, el GPCR CXCR4 está sobre expresado en el cáncer de pulmón de células pequeñas y facilita la metástasis de las células tumorales . El enlace de este ligando por un péptido soluble en agua, tal como el descrito en este documento puede reducir significativamente la metástasis.

El receptor de quimioquinas, CXCR4, se conoce en la investigación viral como un correceptor principal para la entrada de la linea de células T- VIH trópico HIV (Feng, et al. (1996) Science 272: 872-877; Davis, et al. (1997) J Exp Med 186: 1793-1798; Zaitseva, et al. (1997) Nat Med 3: 1369-1375; Sánchez, et al. (1997) J Biol Chem 272: 27529-27531) . El factor derivado de célula estromal T 1 (SDF-1) es una quimioquina que interactúa específicamente con CXCR . Cuando el SDF-1 se enlaza a CXCR4, el CXCR4 activa la señalización mediada por la proteína Go¡i (sensible a la toxina pertussis) (Chen, et al (1998) Mol Pharmacol 53:111-181) , incluyendo las vías descendentes de la quinasa tales como quinasas Ras/MAP y fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) /Akt en linfocitos, megacariocitos y células madre hematopoyéticas (Bleul, et al. (1996) Nature 382: 829-833; Deng, et al. (1997) Nature 388: 296-300; Kijowski, et al. (2001) Ste Cells 19: 453-466; Majka, et al. (2001) Folia. Histochem. Cytobiol. 39: 235-244; Sotsios, et al. (1999) J. Immunol. 163: 5954-5963; Vlahakis, et al. (2002J J. Immunol. 169: 5546-5554) . En los ratones transplantados con ganglios linfáticos humanos, el SDF-1 induce la migración de células CXCR -positivas al ganglio linfático trasplantado (Blades, et al (2002) J. Immunol 168 4308-4317) .

Recientemente, estudios han demostrado que las interacciones de CXCR4 pueden regular la migración de las células metastásicas . La hipoxia, una reducción en la presión parcial de oxigeno, es un cambio microambiental que se produce en la mayoría de los tumores sólidos y es un importante inductor de la angiogénesis tumoral y la resistencia terapéutica. La hipoxia aumenta los niveles de CXCR4 (Staller, et al (2003) Nature 425: 307-311) . El análisis de microseries en una sub-población de células de un modelo de metástasis ósea con actividad metastásica elevada mostró que uno de los genes que se incrementó en el fenotipo metastásico fue CXCR4. Por otra parte, la sobreexpresión de CXCR4 en células aisladas incrementó significativamente la actividad metastásica (Kang, et al (2003) Cáncer Cell 3: 537-549) . En las muestras recolectadas de varios pacientes con cáncer de mama, Muller et al. (Muller, et al (2001) Nature 410: 50-56) se encontró que el nivel de expresión de CXCR4 es mayor en los tumores primarios con respecto a la glándula mamaria normal o las células epiteliales. Por otra parte, el tratamiento con anticuerpos de CXCR4 ha demostrado inhibir la metástasis a los ganglios linfáticos regionales en comparación con los isótopos de control que hacen todos metástasis a los ganglios linfáticos y los pulmones (Muller, et al. (2001)) . Como tal, un modelo de terapia de señuelo es adecuado para el tratamiento de enfermedades y trastornos mediados por CXCR .

En otra modalidad de la invención, se refiere al tratamiento de una enfermedad o trastorno que implica la quimiotaxis dependiente de CXCR4, en el que la enfermedad está asociada con el reclutamiento o activación aberrante de leucocitos. La enfermedad se selecciona del grupo que consiste de artritis, psoriasis, esclerosis múltiple, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, alergia, asma, encefalitis asociada al SIDA, erupción cutánea maculopapular asociada al SIDA, neumonía intersticial relacionada con el SIDA, enteropatía relacionada con el SIDA, inflamación hepática periportal relacionada con el SIDA y la nefritis glomérulo relacionada SIDA.

En otro aspecto, la invención se refiere al tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado de artritis, linfoma, cáncer de pulmón no pequeñas, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de próstata, esclerosis múltiple, enfermedad del desarrollo del sistema nervioso central, demencia, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, tumor, fibroma, astrocitoma, mieloma, glioblastoma, una enfermedad inflamatoria, un rechazo de trasplante de órganos, SIDA, infección por VIH o angiogénesis .

La invención también abarca una composición farmacéutica que comprende dicho polipéptido soluble en agua y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones también pueden incluir, dependiendo de la formulación deseada, vehículos o diluyentes no tóxicos, farmacéuticamente aceptables, que se definen como vehículos comúnmente utilizados para formular composiciones farmacéuticas para la administración animal o humana. El diluyente se selecciona de manera que no afecte la actividad biológica del agente o composición farmacológica. Ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, solución salina fisiológica tamponada con fosfato, solución de Ringer, solución de dextrosa, y solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica también puede incluir otros vehículos, adyuvantes, o estabilizantes no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y similares. Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente tales como proteínas, polisacáridos tales como quitosano, ácidos poliláctico, poliglicólico y copolímeros (tales como látex funcionalizado Sepharose™, agarosa, celulosa, y similares) , aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, y agregados de lipidos (tales como gotítas de aceite o liposornas) .

Las composiciones se pueden administrar por vía parenteral, tal como, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular, intratecal o subcutánea. La administración parenteral puede llevarse a cabo mediante la incorporación de una composición en una solución o suspensión. Tales soluciones o suspensiones también pueden incluir diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles , glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos. Las formulaciones parenterales también pueden incluir agentes antibacterianos, tales como, por ejemplo, alcohol bencílico o metil parabenos, antioxidantes tales como, por ejemplo, ácido ascórbico o bisulfito de sodio y agentes quelantes tales como EDTA. También pueden añadirse tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. La preparación parenteral puede contenerse en ampollas, jeringas desechables o ampolletas de múltiples dosis hechas de vidrio o plástico.

Adicionalmente, las sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, surfactantes, sustancias tamponantes de pH y similares, pueden estar presentes en las composiciones. Otros componentes de composiciones farmacéuticas son los de origen del petróleo, animal, vegetal, o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja, y aceite mineral. En general, los glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicol son vehículos líquidos preferidos, particularmente para soluciones inyectables.

Las formulaciones inyectables se pueden preparar ya sea como soluciones líquidas o suspensiones; las formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección, también se pueden preparar. La preparación también se puede emulsionar o encapsular en liposomas o micropartículas tales como polilactida, poliglicolida, o copolímero para un efecto adyuvante mejorado, como se discutió anteriormente. Langer, Science 249:1527, 1990 y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997. Las composiciones y los agentes farmacológicos descritos en este documento se pueden administrar en la forma de una inyección de depósito o preparación de implante que puede formularse de una manera tal que permita una liberación sostenida o pulsátil del ingrediente activo.

La administración transdérmica incluye la absorción percutanea de la composición a través de la piel . Las formulaciones transdérmicas incluyen parches, ungüentos, cremas, geles, pomadas y similares. La administración transdérmica puede conseguirse utilizando un parche en la piel o utilizando transferosomas . [Paul et al, Eur. J. Immunol. 25:3521-24, 1995; Cevc et al, Biochem. Biophys. Acta 1368: 201-15, 1998].

"Tratar" o "tratamiento" incluye prevenir o retrasar la aparición de los síntomas, complicaciones o indicios bioquímicos de una enfermedad, aliviar o mejorar los síntomas o detener o inhibir aún más el desarrollo de la enfermedad, condición, o trastorno. Un "paciente" es un sujeto humano en necesidad de tratamiento.

Una "cantidad eficaz" se refiere a aquella cantidad del agente terapéutico que es suficiente para mejorar uno o más síntomas de un trastorno y/o para prevenir el avance de un trastorno, causar la regresión de la enfermedad y/o para lograr un efecto deseado.

La invención se comprenderá mejor en relación con el siguiente ejemplo, que pretende ser ilustrativo solamente y no limitativo del alcance de la invención. Varios cambios y modificaciones a las modalidades descritas serán evidentes para los expertos en la materia y tales cambios y pueden hacerse sin apartarse del espíritu de la invención y el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Análisis Sistemático de las propiedades enlazantes de ligando de los receptores olfativos El reemplazo QTY Q (glutamina) T (Treonina) Y (tirosina) se utiliza para convertir un receptor olfativo insoluble en agua a uno soluble en agua para análisis bioquímicos, biofísicos y estructurales. Nuestros objetivos específicos son: 1) Usar el método de reemplazo QTY (glutamina, treonina y tirosina) para cambiar sistemáticamente los residuos -helicoidales 7-transmembránicos hidrofóbicos leucina (L) , isoleucina (I), valina (V), y fenilalanina (F) a los residuos hidrofílicos glutamina (Q) , treonina (T) y tirosina (Y) . Este método convierte la proteína de un receptor olfativo insoluble en agua a uno soluble en agua. 2) Producir y purificar cantidades de miligramos de receptores olfativos nativos y biodiseñados utilizando sistemas de traslación libres de células in vitro comerciales (Invitrogen y Qiagen). 3) Determinar la estructura secundaria de los receptores olfativos purificados utilizando dicroísmo circular (DC) . 4) Determinar la afinidad de enlace de las variantes de receptores olfativos nativos y biodiseñados utilizando termofóresis a microescala. 5) Transfectar los genes nativos y variantes en células HEK293, y utilizar los ensayos de influjo de calcio para medir la activación de odorante de los receptores olfativos nativos y mutantes. Estas mediciones correlacionarán los datos de enlace de termofóresis a microescala a las respuestas funcionales dentro de las células . 6) Proyectar sistemáticamente los receptores olfativos nativos y biodiseñados para condiciones de cristalización en la presencia y ausencia de odorantes y la presencia y ausencia de detergente.

ESTRATEGIA DE INVESTIGACIÓN Uso del reemplazo QTY para diseñar un receptor olfativo 7-helicoidal de haces soluble mOR103-15. Una novedad de este estudio consiste en convertir el receptor olfativo insoluble en agua mORI03-15 en uno soluble en agua con cerca de 10.5% cambios de residuos específicos (36aa/340aa) . Hemos cambiado de manera sistemática y selectivamente los residuos clave en las posiciones -helicoidales b, c, f, que por lo general están frente a la superficie hidrofilica, mientras se mantienen los residuos hidrofóbicos en las posiciones a-helicoidales a, d, e, g. Nuestro método de diseño de la biología sintética es general y ampliamente aplicable al estudio de otros receptores olfativos y receptores acoplados a proteína G. Esta estrategia tiene el potencial de superar el cuello de botella de la cristalización de los receptores olfativos, así como GPCR adicionales y otras proteínas de membrana. Mientras que nuestro diseño para cambiar la solubilidad de la secuencia se centra en las posiciones b,c,f de la rueda helicoidal, algunos cambios adicionales en otras partes de la secuencia se pueden hacer sin afectar significativamente la función o la estructura del péptido, polipéptido o proteína. Por ejemplo, se pueden hacer mutaciones conservadoras.

Enfoque experimental 1) Uso de reemplazos QTY para diseñar un receptor olfativo 7-helicoidal de haces soluble mOR103-15. Se utilizaron métodos de biología sintética para convertir un receptor olfativo insoluble en agua en uno soluble en agua con -10.5% de los cambios de residuos (36aa/340aa) (figuras 1-3) . Hemos cambiado de manera sistemática y selectivamente los residuos clave en las posiciones de a-helicoidales b, c, f (que suelen formar la superficie hidrofilica) , pero mantuvimos los residuos hidrofóbicos en las posiciones OÍ-helicoidales a, d, e, g (figura 1) . Nuestro método de diseño de biología sintética es de naturaleza general, por lo que es ampliamente aplicable a los otros receptores olfativos del estudio, así como a otros receptores acoplados a proteína G (GPCR) . Esta estrategia simple puede superar en parte el cuello de botella de los estudios estructurales de los receptores olfativos, GPCRs, y otras proteínas de la membrana si las proteínas de membrana solubles en agua convertidas siguen siendo biológicamente funcionales .

Con el fin de facilitar el estudio de los aspectos estructurales de los receptores olfativos y sus propiedades de enlace, podemos usar el método de sustitución QTY para diseñar un receptor olfativo 7-helicoidal de haces soluble mOR103-15 (figuras 1-3) . Se sabe que los siete aminoácidos tienen tendencias formadoras de a-helicoidales (32): leucina (L) (1.30), glutamina (Q) (1.27), fenilalanina (F) (1.07), tirosina (Y) (0.72), isoleucina (I) (0.97), valina (V) (0.91) y treonina (T) (0.82) . Sabemos también que las cadenas laterales de Q, Y y T pueden todas formar enlaces de hidrógeno con agua: Q puede formar 4 enlaces de H (2 donantes H de-NH2, 2 aceptores H de C=0) , y T e Y pueden formar 3 enlaces de H cada uno (-OH, donante IH de H y 2 aceptores de -0) . Los residuos Q, T, Y son más solubles en agua que L, F, I, o V, que no pueden formar enlaces de hidrógeno con sus cadenas laterales. Las sustituciones no tendrán cambios de cargas negativas o positivas. Por otra parte, las formas y tamaños moleculares son muy similares para los pares: leucina/glutamina, fenilalanina/tirosina, valina/treonina, e isoleucina/treonina . Los cambios aumentan la solubilidad de a-helicoidales 7-transmembránicos, mientras que mantienen la estructura general helicoidal.

En este diseño del receptor olfativo soluble, hemos realizado las siguientes sustituciones: leucina -> glutamina (L->Q) , isoleucina/valina -> treonina (IN->T) y fenilalanina -> tirosina (F->Y) . En el estudio, se puede examinar la estructura secundaria del receptor olfativo soluble en agua, asi como medir sus capacidades de enlace a odorante. Si el enlace a odorante se mide con los reemplazos QTY, entonces es probable que hayamos conservado componentes importantes de la estructura original. Podemos comparar la estructura secundaria y la unión del receptor olfativo nativo con el receptor olfativo soluble en agua diseñado. También podemos producir cantidades de miligramos del receptor soluble en agua, y crear pantallas de cristal con y sin odorantes.

KB RNHTGRV SEPVLLGFPA PAPQRALQPF QSLQAYVQTL TENIQTITAI RKHPTLHKPM YrPLANMSYI, tTWYTTVTTP abcdefg» bcdafgabcd efgabcdefg a a bcd«fgtbcd «fgtbcdefg KMQACYICSE ENRGQLISFB ACMTQLYFTO GLG TECTIX AVMAYPP.WA TCHPtBYPVI VSSRQCVQMA AG5WAGGPCT abcdefg abcdofgab cdefgebcdo fgabcdofg» bc abcdafg ibcdefgabc S TKVYQISP. LSYCCPNTIH HFFCDVSPI4, NtSCTDKSTA ELTOFIQAIY TLLGPLSTTG ASYMAITGAV MRIPSAACH defgabcd abcdafgab cdefgabcde fgabcdofg» a AFSTCASHL TTVITYYAAS IY YABPKAL SAPDT KLVS VLYAVITPLQ HPITYCQRWQ EVKKALRRTL HLAQSQDAKT bcdefgabcd efgabcdefg abcd obedef g»bcdofgab edofgabc KKSSRDGCSS GTBTSQVAPA. (36*» mutaciones /3< aa, -10.5% mutaciones ) 2) Producir y purificar cantidades de miligramos de variantes nativas de receptores olfativos y biodiseñadas . Podemos utilizar sistemas libres de células comerciales para producir miligramos de mORI03-15nativo y soluble en agua. Podemos utilizar los protocolos optimizados que tenemos desarrollados en nuestro laboratorio: este es el progreso e innovación clave que hemos logrado en los últimos años. Podemos producir y purificar los receptores olfativos nativos y variantes en un solo dia con la purificación por inmunoafinidad . La filtración en gel se puede utilizar después para separar las formas monoméricas y diméricas del receptor. 3) Determinar la estructura secundaria utilizando dicroismo circular. Podemos utilizar el análisis espectral de dicroismo circular (DC) para medir las estructuras secundarias de los receptores purificados. El DC es una técnica muy sensible que es capaz de detectar pequeños cambios estructurales entre los receptores nativos y mutantes . Específicamente, el análisis de DC se puede utilizar para calcular el porcentaje de a-helicoidales y láminas ß en una proteína. Si se altera la estructura de una proteína, se puede revelar en el análisis de DC . Además de determinar si las mutaciones específicas alteran la estructura del receptor, el DC también se puede utilizar para medir los cambios estructurales inducidos por el odorante. Ver la figura 4. 4) Ensayo de enlace al ligando de los receptores olfativos. La termofóresis a microescala se utiliza para medir la afinidad de enlace de las proteínas nativas y biodiseñadas y sus ligandos odorantes. Las ventajas clave de esta técnica sobre el SPR u otras tecnologías de enlace a ligandos son que está totalmente libre de superficie y de marcado libre. Por lo tanto, los receptores no necesitan ser modificados. Las mediciones se pueden realizar en solución utilizando triptófano nativo como la fuente de señal. Además, los pequeños ligandos (MW ~ 200 Daltons) pueden ser valorados con fiabilidad. Además, cada medida necesita 0.5J.tl (Ulg/J.tl) de muestra por lo tanto, se deben guardar las valiosas muestras del receptor. Estos resultados indican si los receptores olfativos mutantes son capaces de enlazarse a odorantes tan eficientemente como la proteína nativa. 5) Uso de ensayo de activación de influjo de calcio para medir la activación del receptor olfativo. Podemos utilizar ensayos de flujo de calcio para examinar la activación inducida por odorante de los receptores olfativos nativos y variantes en células HEK293. Estos datos se pueden correlacionar a las mediciones de termofóresis a microescala . La termofóresis a microescala mide directamente el enlace a ligando, mientras que el ensayo de influjo de calcio mide la activación. Combinados, estos ensayos pueden verificar si las mutaciones especificas afectan el enlace, la activación, o ambos. Además, podemos distinguir entre agonistas y antagonistas de ligandos. 6) Proyección sistemática de las condiciones de cristalización. Podemos rastrear sistemáticamente las variantes de receptores olfativos nativos y biodiseñados para la cristalización de las condiciones en ausencia y presencia de odorantes . La tecnología para la detección de la cristalización de proteínas solubles en agua está bien desarrollada. Hay filtros comerciales disponibles que suministran una variedad de precipitadores, sales, tampones con gradientes de pH ajustados, y una serie de sustancias catiónicas y aniónicas . Todas estas variables son bien conocidas y se utilizará en la cristalización de proteínas de membrana. Un ingrediente único adicional de la proyección de proteínas de membrana es la presencia de una o más moléculas de detergente. Sin embargo, las técnicas de precipitación que implican la eliminación lenta de agua de la gota colgante pueden seguir siendo eficaces. Aunque es útil formar cristales grandes, los resultados de un filtro de cristal pueden producir cristales más pequeños.

Análisis de resonancia de plasmón superficial de QTY CXCR4 CXCR4 humano y nuestras proteínas QTY CXCR4 obtenidas de la producción libre de células y purificadas con perlas de afinidad fueron captados en celdas de diferentes flujos en una ficha CM5 Biacore con anticuerpos (Ac) 1D4 inmovilizados en un instrumento Biacore 2000.

Diferentes concentraciones de SDFla, el ligando nativo para el receptor hCXCR4, se inyectaron sobre la superficie para permitir la interacción con los receptores.

QTY CXCR4 HUMANO (SEQ ID NO: 10) MEGISIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANYNKTFLPTIYSIIYQTGTVGNGLV I LVMGYQK LRSMTDKYRLHLSTADLQFVTTLPYWATDATANWYFGNFLCKAVHVIYTVN LYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKWYVGVWTPAQLLTTPDYTFANVS EADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQHIMVGLILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKA LKTTTTLIQAFFACWQPYYTGISIDSYILLEI IKQGCEFENTVHKWISTTEAQAFYHCC TNPTQYAYLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSSSFHS Inmovilización del Anticuerpo 1D4 Fichas CM5 Biacore se activaron con l-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida y N-hidroxisuccinimida de acuerdo con el protocolo del fabricante antes de una inyección de 7 minutos a 5µ1/p??? de Ac 1D4 a las celdas de flujo 2-4 a 70yg/ml seguido por la desactivación de las superficies de todas las 4 celdas de flujo con un pulso corto de etanolamina. El nivel de inmovilización del Ac 1D4 varia de 8,000 a 25,000 unidades de respuesta (UR) .

Captación de GPCRs CXCR4 y QTY CXCR4 mutante son captados por el Ac 1D4 en la ficha CM5 mediante la inyección de un 0.1 mg/ml de muestra de la proteina a una sola celda de flujo a 5µ1/p??? durante 15min con ambas muestras y tampón de ejecución que contiene 0.2% de detergente de Fos-colina-14. Los receptores fueron captados a un nivel de 800-3000 RU.

Análisis de Interacción SDFla se inyectaron sobre todas las celdas de flujo para permitir la interacción con ambos receptores y la celda de flujo uno se utiliza como una celda de referencia sin ninguna proteina inmovilizada. Las inyecciones se realizaron a los 0, 7.8nM, 15.6nM, 31.25nM, 62.5nM, 125Nm, 250 nM, 500 nM, ?µ? por triplicado, en 20ul/min durante 2 minutos con 15 minutos de tiempo de espera para permitir la disociación. HBST (50 mM de Hepes, pH 7.4, 150 mM de NaCl, 0.005% de Tween-20) con la adición de 0.2% de BSA y 0.2% de Fos-colina-14 fue utilizado como tampón de ejecución y para la dilución de las muestras de SDFla .

Conclusión : El estudio descrito anteriormente muestra el enlace del ligando QTY CXCR4.

REFERENCIAS 1. Choma C, Gratkowski H, Lear JD y DeGrado WF. (2000) Asparagine-mediated self-association of a model transmembrane helix. Nat Struct Biol 7, 161-6. 2. Slovic AM, Kono H, Lear JD, Saven JG y DeGrado WF. (2004) Computational design of water-soluble analogues of the potassium channel KcsA. Proc Nati Acaú Sci E.U.A. 101, 1828-33. 3. alters RF y DeGrado WF. (2006) Helix-packing motifs ín membrane proteins. Proc Nati Acad Sci E.U.A. 103, 13658-63. 4. Zhang Y, Kulp DW, Lear JD y DeGrado WF. (2009) Experimental and co putational evaluation of forces directing the association of transmembrane hélices. J Am Chem Soc 131, 11341-11343.

Mientras que esta invención se ha mostrado y descrito particularmente con referencias a sus modalidades preferidas, los expertos en la materia entenderán que varios cambios en la forma y detalles pueden hacerse sin apartarse del alcance de la invención abarcada por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (90)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido soluble en agua gue comprende un dominio a-helicoidal modificado que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o más residuos de aminoácidos hidrofóbicos dentro de un dominio a-helicoidal de una proteina de membrana nativa es reemplazado con uno o más residuos de aminoácido hidrofilico.

2. El polipéptido soluble en agua de la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio o¡-helicoidal es un dominio a-helicoidal 7-transmembránico .

3. El polipéptido soluble en agua de la reivindicación 1, caracterizado porque la proteina de membrana nativa es un receptor acoplado de proteina G (GPCR) .

4. El polipéptido soluble en agua de la reivindicación 1, caracterizado porque la proteina de membrana nativa es una proteina de membrana integral.

5. El polipéptido soluble en agua de la reivindicación 1, caracterizado porque los residuos hidrofilicos son seleccionados del grupo que consiste en glutamina (Q) , treonina (T) , tirosina (Y) y cualquier combinación de las mismas.

6. El polipéptido soluble en agua de la reivindicación 1, caracterizado porque uno o más de los residuos hidrofóbicos leucina (L) , isoleucina (I), valina (V) y fenilalanina (F) son reemplazados.

7. El polipéptido soluble en agua de la reivindicación 1, caracterizado porque uno o más residuos de fenilalanina del dominio a-helicoidal de la proteina de membrana nativa son reemplazados con tirosina.

8. El polipéptido soluble en agua de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 7, caracterizado porque uno o más residuos de isoleucina y/o valina del dominio a-helicoidal de la proteina son reemplazados con treonina.

9. El polipéptido soluble en agua de cualquiera de las reivindicaciones 1, 7 y 8, caracterizado porque los residuos de leucina del dominio a-helicoidal de la proteína de membrana nativa son reemplazados con glutamina.

10. El polipéptido soluble en agua de la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína de membrana nativa es un receptor olfativo o receptor de quimioquina CXCR4.

11. El polipéptido soluble en agua de la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína de membrana nativa es una proteína de mamífero.

12. El polipéptido soluble en agua de la reivindicación 10, caracterizado porque la proteína de membrana nativa es mOR103-15 o receptor de quimioquina CXCR4.

13. El polipéptido soluble en agua de la reivindicación 1, caracterizado porque los residuos de aminoácido hidrofóbico en las posiciones -helicoidales b, c y f son reemplazados .

14. El polipéptido soluble en agua de la reivindicación 12, caracterizado porque los residuos de aminoácido hidrofóbico en las posiciones a-helicoidales a, d, e y g no son reemplazados.

15. El polipéptido soluble en agua de la reivindicación 1, comprendiendo la secuencia de aminoácidos MERRNHTGRV SEFVLLGFPA PAPQRALQFF QSLQAYVQTL TENIQTITAIRNHPTLHKPM YYFLAN SFYL ETWYTTVTTP KMQAGYIGSE ENHGQLISFE ACMTQLYFFQ GLGCTECTLL AVM YDRYVA TCHPLHYPVI VSSRQCVQMA AGSWAGGFGT S TVKVYQISR LSYCGPNTIN HFFCDVSPLL NLSCTDMSTA ELTDFILAIF ILLGPLSVTG ASYMAITGAV MRIPSAAGRH KAFSTCASHL TTVITYYAAS IYTYARPKAL SAFDTNKLVS VLYAVIVPLL NPIIYCLRNQ EVKKALRRTL HLAQGDANT KKSSRDGGSS GTETSQVAPA (SEQ ID NO: 2) ; MEGISIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANYNKTFLP IYSIIYQTGTVGNGLV ILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSTADLQFVTTLPY ATDATANWYFGNFLC AVHVIYTV NLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKWYVGVWTPAQLLTTPDYTFANV SEADDRYICDRFYPNDLWVWFQFQHIMVGLILPGIVILSCYCII ISKLSHSKGHQKRK ALKTTTTLIQAFFAC QPYYTGISIDSYILLEIIKQGCEFENTVHK ISTTEAQAFYHC CTNPTQYAYLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKG RGGHSSVSTESESSSSFHS (SEQ ID NO: 10) .

16. El polipéptido soluble en agua de la reivindicación 2, caracterizado porque el dominio ot-helicoidal 7-transmembránico comprende una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos: a. PQRALQFFQSLQAYVQTLTENIQTITAI R (SEQ ID NO: 3) b. M YYFLANMSFYLETWYTTVTTPKMQAGYI (SEQ ID NO: 4) c. CMTQLYFFQGLGCTECTLLAVMAYDRYVA TC (SEQ ID NO: 5) d. RQCVQMAAGSWAGGFGTSMTVKVYQ (SEQ ID NO: 6) e. LTDFILAIFILLGPLSVTGASYMAITGAV (SEQ ID NO: 7) f. HKAFSTCASHLTTVITYYAAS IYTY (SEQ ID NO: 8) g. TNKLVSVLYAVIVPLLNPI IYCLRN (SEQ ID NO: 9) .

17. El polipéptido soluble en agua de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque el polipéptido retiene la actividad biológica de la proteina de membrana nativa.

18. El polipéptido soluble en agua de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque uno o más aminoácidos dentro de los sitios potenciales enlazantes de odorante no son reemplazados.

19. Un método para la preparación de un polipéptido soluble en agua que comprende reemplazar uno o más residuos de aminoácidos hidrofóbicos dentro del dominio -helicoidal de una proteina de membrana' nativa con uno o más residuos de aminoácido hidrofílico.

20. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque el dominio a-helicoidal es un dominio a-helicoidal transmembránico .

21. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque la proteina de membrana nativa es un receptor acoplado de proteina G (GPCR) .

22. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque los residuos hidrofilicos se seleccionan del grupo que consiste de glutamina (Q) , treonina (T) , tirosina (Y) o cualquier combinación de los mismos .

23. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque los residuos hidrofóbico de leucina (L) , isoleucina (I) , valina (V) y fenilalanina (F) son reemplazados .

24. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque uno o más residuos de fenilalanina del dominio a-helicoidal 7-transmembránico de la proteina de membrana nativa son reemplazados con tirosina.

25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 19 y 24, caracterizado porque uno o más residuos de isoleucina y/o valina del dominio a-helicoidal de la proteina de membrana nativa son reemplazados con treonina .

26. El método de cualquiera de las reivindicaciones 19, 24 y 25, caracterizado porque uno o más residuos de leucina del dominio oí-helicoidal de la proteina de membrana nativa son reemplazados con glutamina.

27. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque la proteina nativa es un receptor olfativo.

28. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque la proteina nativa es una proteina de mamífero .

29. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque la proteína nativa es mOR103-15 o receptor de quimioquina CXCR4.

30. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos MERRNHTGRV SEFVLLGFPA PAPQRALQFF QSLQAYVQTL TENIQTITAI RNHPTLHKPM YYFLANMSFYL ETWYTTVTTP KMQAGYIGSE ENHGQLISFE ACMTQLYFFQ GLGCTECTLL AVMAYDRYVA TCHPLHYPVI VSSRQCVQ A AGSWAGGFGT SMTVKVYQISR LSYCGPNTIN HFFCDVSPLL NLSCTDMSTA ELTDFILAIF ILLGPLSVTG ASYMAITGAV MRIPSAAGRH KAFSTCASHL TTVITYYAAS IYTYARPKAL SAFDTNKLVS VLYAVIVPLL NPI IYCLRNQ EVKKALRRTL HLAQGDANT KKSSRDGGSS GTETSQVAPA (SEQ ID NO: 2); o MEGISIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANYNKTFLPTIYSIIYQTGTVGNGLV ILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSTADLQFVTTLPYWATDATANWYFGNFLCKAVHVIYTV NLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGV TPAQLLTTPDYTFANV SEADDRYICDRFYPNDL VWFQFQHIMVGLILPGIVILSCYCII ISKLSHSKGHQKRK ALKTTTTLIQAFFAC QPYYTGISIDSYILLEIIKQGCEFENTVHKWISTTEAQAFYHC CTNPTQYAYLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSSSFHS (SEQ ID NO:10) .

31. El método de la reivindicación 24, caracterizado porque el dominio a-helicoidal 7-transmembránico comprende una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos: a. PQRALQFFQSLQAYVQTLTENIQTITAI R (SEQ ID NO: 3) b. M YYFLANMSFYLET YTTVTTPKMQAGYI (SEQ ID NO: 4) C . CMTQLYFFQGLGCTECTLLAVMAYDRYVA TC (SEQ ID NO: 5) d. RQCVQMAAGSWAGGFGTSMTVKVYQ (SEQ ID NO: 6) e. LTDFILAIFILLGPLSVTGASYMAITGAV (SEQ ID NO: 7) f. HKAFSTCASHLTTVITYYAAS IYTY (SEQ ID NO: 8) g. TNKLVSVLYAVIVPLLNPIIYCLRN (SEQ ID NO: 9) SEQ ID NO: 2.

32. El método de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 31, caracterizado porque el polipéptido soluble en agua retiene la actividad biológica de la proteina de membrana nativa.

33. El método de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 31, comprendiendo, además, la determinación de la estructura secundaria del polipéptido.

34. El método de la reivindicación 33, caracterizado porque la estructura secundaria se determina usando dicroismo circular.

35. El método de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 31, comprendiendo, además, la medición del enlace de ligando.

36. El método de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 31, caracterizado porque el polipéptido se prepara usando un sistema libre de células.

37. El método de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 31, caracterizado porque la proteina es un receptor olfativo y comprendiendo, además, la medición del enlace de odorante al receptor olfativo.

38. El método de la reivindicación 35, caracterizado porque la afinidad del enlace de ligando del polipéptido soluble en agua se compara con la proteina de membrana nativa.

39. El método de la reivindicación 35, caracterizado porque el enlace de ligando se mide usando termofóresis a microescala.

40. El método de la reivindicación 35, caracterizado porque el enlace de ligando se mide usando un ensayo de influjo de calcio.

41. Un polipéptido producido de conformidad con el método de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 31.

42. Una célula transfectada con el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1.9 a 31.

43. El método de la reivindicación 42, caracterizado porque la célula es una célula de mamífero.

44. La célula de la reivindicación 43, caracterizada porque la célula es una célula HEK293.

45. Un método para el tratamiento de un mamífero que sufre de un trastorno o enfermedad que está mediada por la actividad de una proteína de membrana nativa, comprendiendo la administración a dicho mamífero de una cantidad eficaz de un polipéptido soluble en agua que comprende un dominio -helicoidal modificado, en donde el dominio a-helicoidal modificado comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o más residuos de aminoácido hidrofóbico dentro de un dominio -helicoidal de la proteina de membrana nativa es reemplazado con uno o más residuos de aminoácido hidrofilico.

46. El método de la reivindicación 45, caracterizado porque el dominio a-helicoidal es un dominio a-helicoidal 7-transmembránico .

47. El método de la reivindicación 45, caracterizado porque la proteina de membrana nativa es un receptor acoplado de proteina G (GPCR) .

48. El método de la reivindicación 45, caracterizado porque la proteina de membrana nativa es una proteina de membrana integral .

49. El método de la reivindicación 45, caracterizado porque los residuos hidrofilicos son seleccionados del grupo que consiste de glutamina (Q) , treonina (T) , tirosina (Y) y cualquier combinación de los mismos .

50. El método de la reivindicación 45, caracterizado porque uno o más de los residuos hidrofóbicos leucina (L) , isoleucina (I), valina (V) y fenilalanina (F) son reemplazados.

51. El método de la reivindicación 45, caracterizado porque uno o más residuos de fenilalanina del dominio a-helicoidal de la proteina de membrana nativa son reemplazados con tirosina.

52. El método de cualquiera de las reivindicaciones 45 y 50, caracterizado porque uno más residuos de isoleucina y/o valina del dominio oí-helicoidal de la proteina son reemplazados con treonina. 5

53. El método de cualquiera de las reivindicaciones 45 y . 50, caracterizado porque uno más residuos de leucina del dominio a-helicoidal de la proteina í son reemplazados con glutamina.

54. El método de la reivindicación 45, 10 caracterizado porque dicha proteina de membrana nativa es anormalmente activada, regulada hacia arriba o sobre expresada en un trastorno o enfermedad.

55. El método de la reivindicación 45, caracterizado porque la enfermedad es cáncer. 15

56. El método de la reivindicación 55, caracterizado porque el cáncer es cáncer de células pequeñas .

57. El método de la reivindicación 55, caracterizado porque el cáncer es melanoma. 20

58. El método de la reivindicación 55, caracterizado porque el cáncer es cáncer de mama.

; 59. El método de la reivindicación 45, 1 caracterizado porque la enfermedad es la enfermedad de

Parkinson. 25 60. El método de la reivindicación 45, caracterizado porque la enfermedad es enfermedad cardiovascular .

61. El método de la reivindicación 45, caracterizado porque la enfermedad es hipertensión.

62. El método de la reivindicación 45, caracterizado porque la enfermedad es asma.

63. El método de la reivindicación 45, caracterizado porque la proteina de membrana nativa se selecciona del grupo que comprende receptores purinérgicos (P2Ylf P2Y2, P2Y4, P2Y6) , receptores de acetilcolina muscarinicos M1 y M3, receptores de trombina [receptor activado por proteasa (PAR)-l, PAR-2], tromboxano (TXA2) , esfingosina 1-fosfato (S1P2, S1P3, S1P4 y S1P5) , ácido lisofosfatidico (LPA, LPA2, LPA3) , angiotensina II (ATJ , serotonina (5-HT2c y 5-HTJ , somatostatina (sst5) , endotelina (ETA y ETB) , colecistoquinina (CCK , receptores de vasopresina Vla, receptores de dopamina D5, receptores de péptido de formilo fMLP, receptores de galanina GAL2, receptores de prostanoide EP3, receptores de adenosina Alf receptores adrenérgicos alf receptores de bombesina BB2, receptores de bradiquinina B2, receptores sensibles al calcio, receptores de quimioquina, receptores de quimioquina KSHV-0RF7 , receptores de taquiquina NKX, receptores estimulantes de la tiroides (TSH) , receptores activados por proteasa, receptores de neuropéptidos , receptores de adenosina A2B, purinoceptores P2Y, receptores de glutamato metabólico, GRK5 , GPCR-30, y CXCR .

64. El método de cualquiera de las reivindicaciones 45 a 63, caracterizado porque dicho polipéptido retiene la actividad de enlazar el ligando de la proteina de membrana nativa.

65. El método de cualquiera de las reivindicaciones 45 a 63, caracterizado porque dicho polipéptido soluble en agua retiene la habilidad de enlazar el ligando que normalmente se enlaza a la proteina de membrana nativa.

66. El método de cualquiera de las reivindicaciones 45 a 65, caracterizado porque uno o más aminoácidos dentro de los sitios de enlace de ligando potenciales no son reemplazados.

67. El método de la reivindicación 45, caracterizado porque el mamífero es un humano.

68. El método de cualquiera de las reivindicaciones 45 a 67, caracterizado porque dicho aminoácido hidrofóbico está presente en la cara hidrofílica del dominio a-helicoidal.

69. El método de cualquiera de las reivindicaciones 45 a 67, caracterizado porque dicho aminoácido hidrofóbico está presente en la posición b, c ó f en un diagrama helicoidal.

70. El método de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 29, caracterizado porque alrededor del 10% a alrededor del 100% de los residuos de aminoácidos hidrofóbicos presentes en la cara hidrofilica de un dominio a-helicoidal es reemplazado.

71. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque al menos alrededor del 15%, o alrededor del 25%, o alrededor del 50, o alrededor del 70% de los residuos de aminoácidos hidrofóbicos del dominio a-helicoidal son reemplazados.

72. El método de conformidad con la reivindicación 70 ó 71, caracterizado porque el contenido helicoidal del dominio helicoidal modificado es de al menos alrededor del 35%, o alrededor del 50%, o alrededor del 75%, o alrededor del 95% del dominio helicoidal de la proteina nativa.

73. Un método para la producción de un polipéptido modificado de enlace de ligando nativo de una proteina transmembránica que comprende el paso de reemplazar o mutar al menos algunos de los residuos de aminoácidos hidrofóbicos por residuos de aminoácidos hidrofilicos, en donde dicho polipéptido modificado retiene al menos algunas de las propiedades de enlace de ligando de dicha proteina transmembránica.

74. Un método para tratar una enfermedad o trastorno mediado por enlace de ligando de una proteina transmembránica que comprende el paso de administrar un polipéptido modificado en donde dicho polipéptido corresponde a una secuencia de aminoácidos mutada de dicha proteina en donde dicha región transmembránica de la secuencia se modifica para que al menos algunos de los residuos de aminoácidos hidrofóbicos sean reemplazados por residuos de aminoácidos hidrofilicos .

75. El método de conformidad con la reivindicación 73 ó 74, caracterizado porque dicha región transmembránica es a-helicoidal.

76. El método de conformidad con la reivindicación 73 ó 74, caracterizado porque dichos residuos de aminoácidos hidrofóbicos que corresponden a al menos una de las posiciones b, c, o f de la rueda helicoidal son reemplazados por residuos de aminoácidos hidrofilicos .

77. El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque dichos residuos hidrofilicos se seleccionan de glutamina (Q) , treonina (T) , tirosina (Y) y cualquier combinación de los mismos.

78. El método de conformidad con las reivindicaciones 75 ó 76, caracterizado porque dichos residuos hidrofóbicos son seleccionados de leucina (L) , isoleucina (I) , valina (V) y fenilalanina (F) .

79. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 73-78, caracterizado porque dicho polipéptido modificado retiene afinidad de enlace de ligando de dicha proteina transmembránica .

80. El método de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado porque dicha afinidad de enlace de ligando de dicho polipéptido es sustancialmente similar o mejor que la afinidad de enlace de ligando de dicha proteina transmembránica.

81. El método de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado porque dicha afinidad de ligando de dicho polipéptido es de alrededor del 10%, o alrededor del 20%, o alrededor del 30%, o alrededor del 40%, o alrededor del 50%, o alrededor del 60%, o alrededor del 70%, o alrededor del 80%, o alrededor del 90% de la afinidad de enlace de ligando de dicha proteina transmembránica .

82. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 73-80, caracterizado porque dicho polipéptido modificado es soluble en agua.

83. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 73-82, caracterizado porque dicha proteina transmembránica es un receptor acoplado de proteina G (GPCR) .

84. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 73-82, caracterizado porque dicha proteína transmembránica se selecciona del grupo que comprende receptores purinérgicos (?2?:, P2Y2, P2Y4, P2Y6) , receptores de acetilcolina muscarínicos Mx y 3, receptores de trombina [receptor activado por proteasa (PAR)-l, PAR-2], tromboxano (TXA2) , esfingosina 1-fosfato (S1P2, S1P3, S1P4 y S1P5) , ácido lisofosfatídico (LPAt, LPA2, LPA3) , angiotensina II (ATX) , serotonina (5-HT2c y 5-HT4) , somatostatina (sst5) , endotelina (ETA y ' ETB) , colecistoquinina (CCKX) , receptores de vasopresina Vla, receptores de dopamina D5, receptores de péptido de formilo fMLP, receptores de galanina GAL2, receptores de prostanoide EP3, receptores de adenosina lf receptores adrenérgicos ctir receptores de bombesina BB2, receptores de bradiquinina B2, receptores sensibles al calcio, receptores de quimioquina, receptores de quimioquina KSHV-ORF74, receptores de taquiquina K1? receptores estimulantes de la tiroides (TSH) , receptores activados por proteasa, receptores de neuropéptidos , receptores de adenosina A2B, purinoceptores . P2Y, receptores de glutamato metabólico, GRK5, GPCR-30, y CXCR .

85. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque dicho polipéptido modificado se enlaza con el ligando nativo correspondiente.

86. El método de conformidad con la reivindicación 84 u 85, caracterizado porque dicho polipéptido modificado es QTY CXCR4.

87. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 73-86, caracterizado porque dicho polipéptido modificado es al menos alrededor de 10%, o alrededor de 20%, o alrededor de 30%, o alrededor de 40%, o alrededor de 50%, o alrededor de 60%, o alrededor de 70%, o alrededor de 80%, o alrededor de 90%, o alrededor de 100%, o alrededor de 125%, o alrededor de 150%, o alrededor de 175%, o alrededor de 200%, o alrededor de 225%, o alrededor de 250%, o alrededor de 300% más soluble en agua que dicha proteina transmembránica .

88. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45-54 ó 63-87, caracterizado porque dicha enfermedad o trastorno se selecciona de artritis, linfoma, cáncer de pulmón no pequeño, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de próstata, esclerosis múltiples, enfermedad del desarrollo del sistema nervioso central, demencia, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, tumor, fibroma, astrocitoma, mieloma, glioblastoma, una enfermedad inflamatoria, un rechazo de trasplante de órganos, o angiogénesis .

89. Un polipéptido modificado producido por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 83-87.

90. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido soluble en agua de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 99, 11 u 88, y un diluyente o transportador farmacéuticamente aceptable.