CN104198689A - 一种检测g-蛋白耦联受体对缩血管物质反应的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测G-蛋白耦联受体对缩血管物质反应的方法，包括将实验动脉血管分成高血压患者大网膜动脉组、非高血压患者大网膜动脉组、SHR肠系膜动脉组和WKY大鼠肠系膜动脉组四组；累加浓度法加入去甲肾上腺素测定动脉环张力的变化，作量效曲线，考察α受体介导的收缩功能；同理分别加入5-羟色胺、蛇毒类似物、内皮素三种物质，依次考察5-HT、ETB、ETA三受体介导的收缩功能，用双因素方差分析和T检验考察显著性。该发明方法操作简单、高效，结果准确，且对环境友好。

Description

一种检测G-蛋白耦联受体对缩血管物质反应的方法
技术领域
本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种检测G-蛋白耦联受体对缩血管物质的反应的方法。
背景技术
高血压是严重危害人类健康的常见病。心排出量和外周血管阻力是血压形成的基本因素，而神经-体液在维持血压稳定中起重要作用，因此，神经-体液紊乱将导致高血压病的发生与发展。高血压时表现机体缩血管物质水平增加，如交感神经活性增高释放递质去甲肾上腺素(noradrenaline，NE)增加，血管内皮分泌内皮素增加，肾素-血管紧张素系统活性增高促进血管紧张素II生成，缩血管的反应性增强，引起血管外周阻力增高和心血管重构，导致高血压的发生和发展。G蛋白耦联受体是与GTP结合蛋白耦联的一组膜表面结合蛋白，是目前已发现的种类最多的一类受体，广泛分布于各组织和器官，血管上的主要受体如肾上腺素受体、血管紧张素II受体、胆碱能受体、5-羟色胺(5-hydroxytryptamin，5-HT)受体、内皮素受体等均属G-蛋白耦联受体[1]。报道中少见动物主要阻力血管，未见高血压病人大网膜动脉对NE、5-HT、Sarafotoxin 6c(S6c，ETB受体选择性激动剂)和内皮素-1(endothelin-1，ET-1)的缩血管反应。
发明内容
1 材料与方法
1.1 动脉环的准备
原发性高血压患者(n＝6，收缩压SBP 150-160mmHg，舒张压DBP 90-100mmHg，年龄45-64岁，4名男性，2名女性，高血压病史6-10年)，血压正常的患者(n＝8，SBP110-130mmHg，DBP 60-80mmHg，年龄30-54岁，4名男性，3名女性)，患者手术原因为急性阑尾炎、急性胰腺炎或者急性肠梗阻，手术室取出大网膜动脉，立即浸入冷Krebs液(含mM：NaCl 119、NaHCO315、KCl 4.6、MgCl21.2、NaH2PO41.2、CaCl21.5和葡萄糖5.5)；SHR(n＝16，尾动脉压204±16mmHg)，WKY大鼠(n＝16，尾动脉压110±11mmHg)(上海思莱克实验动物公司)均为20周龄，体重250-300g，大鼠乙醚麻醉后断头处死，迅速取出肠系膜动脉，立即浸入冷Krebs液，显微镜下剥离血管周围组织，0.1％Triton x-100血管内灌注10s，去除血管内皮，再用缓冲液冲洗10s，当乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)引起的舒张率＜10％，认为内皮已被去除，将处理好的血管切成1mm长的圆环[2，3]，患者每份标本取9个血管环，大鼠每份标本取8个血管环。手术前征求了患者同意并填写知情同意书，实验得到了伦理学会的批准。
1.2 药物和试剂
去甲肾上腺素(NE)，普萘洛尔(propranolol，Prop)，乙酰胆碱(ACh)，5-羟色胺(5-HT)，内皮素-1(ET-1)、Sarafotoxin 6c(S6c)，哌唑嗪(Prazosin)，萝芙素(Rauwolscine)，酮色林(Ketanserin)均为Sigma公司产品，由瑞典隆德大学提供。以上试剂溶于0.1％的牛血清白蛋白，临用以Krebs液稀释。浓度以浴槽中最终药物的浓度表示。
1.3 主要仪器
数据记录和分析系统，包括软件Chart5.0以及硬件8通道桥式放大器(ADInstruments Co，Australia)；张力换能器(Grass Instrument Co.Quincy，Mass.，U.S.A)；恒温浴漕(DMT，Denmark)。
1.4 体外实验方法建立
将血管环套在两个L型的金属针上，其中一个连接张力换能器，另一个连微调装置(可以调节负荷张力)，通过软件Chart5.0以及硬件PowerLab 8通道桥式放大器，将血管所负荷张力显示于屏幕[2]。将安装好的动脉环置入含有2.5ml Krebs液的37℃恒温浴槽，持续通入含95％O2和5％CO2的混合气体，pH保持7.4。实验前，动脉环静息负荷2mN，每20min换液一次，稳定1.5h。以K+-Krebs液(含K+63.5mM)检验动脉环收缩性，两次收缩高度大于1mN且收缩幅度相差＜10％者用于实验。K+-Krebs液组成为(mM：NaCl 60、NaHCO315、KCl63.5、MgCl21.2、NaH2PO41.2、CaCl21.5和葡萄糖5.5)[3]。
先用Prop(10-9M)于浴槽中孵育血管半小时阻断β受体，再浓度累加法加入NE(10-11～10-4M)，考察α受体功能；先分别用Prop与不同浓度哌唑嗪(10-11～10-8M)或不同浓度萝芙素(10-7～10-5M)孵育血管半小时，再浓度累加法加入NE，分别考察α1和α2受体功能。浓度累加法加入5-HT(10-11～10-4M)，考察5-HT受体功能；先分别用不同浓度酮色林(1-10～10-8M)孵育血管半小时，再浓度累加法加入5-HT，考察5-HT2A受体功能。先浓度累加法加入S6c(10-13～10-6M)，选择性激动ETB受体，考察ETB受体功能，收缩作用达到最大，等待ETB受体内化，收缩曲线逐渐降至基线水平并稳定30min后，累加浓度法加入ET-1(10-13～10-6M)，考察ETA受体功能[4]。可以分别获得α受体、5-HT受体、ETB受体、ETA受体量效曲线。
1.5 统计方法
数据以表示，收缩反应以不同浓度激动剂引起收缩效应相对于60mmol·L-1钾引起的收缩效应百分数表达，反应特征表述为Emax(最大收缩百分率)和pEC50(产生一半最大收缩时所需要受体激动剂浓度的负对数)。采用Arunlakshana和Schild(1959)描述的方法[5]计算拮抗剂pA2值。统计分析及作图使用Prism 4.0软件。采用双因素方差分析(Two-way ANOVA)及T检验(Student’s t test)考察显著性，当P＜0.05时被认为有显著性。
附图说明
图1为S6c，ET-1，5-HT和NE分别在患者大网膜动脉和大鼠肠系膜动脉引起收缩的Emax和pEC50；
A：S6c，ET-1，5-HT和NE在患者大网膜动脉引起的Emax
B：A：S6c，ET-1，5-HT和NE在患者大网膜动脉引起的pEC50
C：S6c，ET-1，5-HT和NE在大鼠肠系膜动脉引起的Emax
D：S6c，ET-1，5-HT和NE在大鼠肠系膜动脉引起的pEC50
Emax为最大收缩效应(相对于60mM K+引起收缩的百分率)，pEC50为引起一半最大收缩反应所需要激动剂浓度的负对数。数值表n＝实验中动物数或者患者人数。高血压患者与非高血压患者比较，SHR与WKY大鼠比较*P＜0.05，**P＜0.01。
图2为S6c和ET-1在大鼠肠系膜动脉(A，B)和患者大网膜动脉(C，D)引起的浓度-收缩量效曲线；
数值表n＝6-8(n＝实验中动物数或者患者人数)。与WKY大鼠或者非高血压患者比较*P＜0.05，**P＜0.01。
图3为5-HT在大鼠肠系膜动脉(A)和患者大网膜动脉(B)引起的浓度-收缩量效曲线；
数值表n＝6-8(n＝实验中动物数或者患者人数)。与WKY大鼠或者非高血压患者比较**P＜0.01。
图4为在5-HT2A受体拮抗剂酮色林(Ketanserin)存在条件下5-HT在SHR肠系膜动脉(A)和WKY大鼠肠系膜动脉(B)引起的浓度-收缩量效曲线；
数值表n＝8(n＝实验中大鼠数)。
图5为NE在大鼠肠系膜动脉(A)和患者大网膜动脉(B)引起的浓度-收缩量效曲线；
数值表n＝6-8(n＝实验中动物数或者患者人数)。与WKY大鼠或者非高血压患者比较**P＜0.01。
图6为在α1受体拮抗剂哌唑嗪存在条件下NE在SHR肠系膜动脉(A)和WKY大鼠肠系膜动脉(B)引起的浓度-收缩量效曲线；
数值表n＝8(n＝实验中大鼠数)。
图7为在α2受体拮抗剂萝芙素(Rauwolscine)存在条件下NE在SHR肠系膜动脉(A)和WKY大鼠肠系膜动脉(B)引起的浓度-收缩量效曲线；
数值表n＝8(n＝实验中大鼠数)。
具体实施方式
1 动脉对K+的收缩反应
60mmol·L-1的K+可使动脉产生明显的收缩，高血压患者动脉环对60mmol·L-1K+的收缩力为2.74±0.83mN(n＝24)，血压正常患者动脉环的收缩力为2.54±0.76mN(n＝32)，P＞0.05；WKY大鼠动脉环的收缩力为3.02±0.78mN(n＝32)，SHR动脉环的收缩力为3.02±0.78mN(n＝32)，P＞0.05。
2 ETB、ETA受体
S6c选择性激动ETB受体，在非高血压动脉基本上不引起收缩，但是在高血压病人大网膜动脉和SHR肠系膜动脉引起强烈的浓度依赖性收缩，Emax和pEC50均显著增高；ET-1在S6c存在条件下选择性激动ETA受体，在高血压情况下收缩作用增强，高血压病人大网膜动脉Emax和SHR肠系膜动脉pEC50均显著增高(图1A，1B，图2表1)。
3 5-HT受体
5-HT在WKY大鼠肠系膜动脉引起强的收缩，在非高血压病人大网膜动脉基本上不引起收缩，在SHR和高血压病人动脉引起强的收缩，Emax均显著增高，在SHR，pEC50显著增高(图1C，图3，表1)。
选择性5-HT2A受体拮抗剂ketanserin(10-10～10-8M)使5-HT量效曲线平行右移不伴有Emax值的显著改变，pA2值在SHR和WKY大鼠分别为9.50±0.12和9.43±0.10(图4)。
4 α受体
NE在人和大鼠的动脉上均引起强的收缩，在高血压的条件下收缩作用增强，pEC50均显著改变，在SHR，Emax显著增高，对大鼠血管的收缩作用显著强于对人血管的收缩作用(图1D，图5，表1)。
选择性α1受体拮抗剂哌唑嗪(10-11～10-8M)使NE量效曲线平行右移不伴有Emax值的显著改变，pA2值在SHR和WKY大鼠分别为11.02±0.24和10.88±0.23(图6)。
选择性α2受体拮抗剂rauwolscine(10-7～10-5M)使NE量效曲线平行右移不伴有Emax值的显著改变，pA2值在SHR和WKY大鼠分别为7.23±0.25和7.09±0.23(图7)。
表1.S6c，ET-1，5-HT和NE分别在患者大网膜动脉和大鼠肠系膜动脉引起收缩反应的Emax和pEC50
Emax为最大收缩效应(相对于60mM K+引起收缩的百分率)，pEC50为引起一半最大收缩反应所需要激动剂浓度的负对数。数值表n＝实验中动物数或者患者人数。高血压患者与非高血压患者比较，SHR与WKY大鼠比较*P＜0.05，**P＜0.01；SHR与高血压患者比较，WHY与非高血压患者比较#P＜0.05，**P＜0.01。
5 讨论
ET-1、5-HT以及NE等物质可以通过激动ETA、ETB、5-HT和α-受体等G-蛋白耦联受体，调节血压。ET-1通过激活细胞内丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)促进心肌细胞肥大与平滑肌细胞增生，导致心血管重构。此外，ET还能激活局部肾素-血管紧张素系统。ET与ET受体相互作用而发挥效应，ET受体有ETA、ETB、ETc受体3种亚型，对后者研究较少，如果先使用Sarafotoxin 6c(S6c，ETB受体选择性激动剂)与ETB受体结合，可研究ETB受体功能，并可以引起ETB受体内化、降解和脱敏，此时ET-1的激动作用只能通过ETA受体介导，可研究ETA受体功能[4]。原发性高血压患者血浆ET-1水平增高，并与高血压的程度呈正相关[6]。在不同种属高血压动物(如鼠、狗等)外周血管证明，ET-1诱导的缩血管效应增强[7，8]。本实验中发现非高血压病人和大鼠的阻力血管，选择性ETB受体激动剂S6c基本上不引起收缩，而在高血压情况下，收缩作用明显增强，显示在高血压条件下，由ETB受体介导的收缩作用增强是一个从无到有的现象，提示ETB受体介导的收缩在高血压病理发生、发展过程中起到了重要的作用。ETA受体激动剂在高血压病人阻力血管的收缩作用表现为Emax明显增高，而在SHR上表现为pEC50值明显增大，与文献报道高血压时血管对ET反应增高可能与ETA受体表达上调有关[9]一致。结果提示ET受体在在高血压发生、发展中是ETB受体，而非ETA受体起主要作用，并且存在种属差异。
近年研究发现，5-HT释放增多与高血压病的发生和发展有关。5-HT也是强效的血管收缩剂，特别是对已有内膜损伤的血管的收缩作用更强[10，11]。此外，5-HT还增强其他血管活性物质(如NE、血管紧张素II等)缩血管作用，以及影响血小板活化、粘附、聚集和释放。5-HT在机体内广泛分布，外周5-HT由肠嗜铬细胞产生，进入循环后主要由血小板摄取并储存，生理情况下血浆中游离的5-HT浓度极低，不足以引起血管收缩和张力增加。原发性高血压病患者血小板功能亢进，释放5-HT反应增强。研究发现，2型糖尿病伴高血压患者血小板内5-HT含量降低，提示5-HT自血小板内释放，血浆浓度可能升高[12]。有学者证明，高血压病患者血浆5-HT及代谢物(5-HIAA)含量显著高于健康对照组，并发现5-HT浓度与平均动脉压和高血压病情严重程度成正相关[13-14]。实验结果显示在非高血压患者的大网膜动脉，5-HT基本上不引起收缩，而在高血压病人，5-HT引起的缩血管作用明显增强，Emax约提高8倍，且pEC50值显著增高，说明高血压情况下，患者5-HT的缩血管作用效能和敏感性显著提高；5-HT在WKY大鼠缩血管作用Emax约是非高血压病人的10倍，而在SHR表现为量效曲线的左移，Emax无明显改变，pEC50值显著增大，与文献肺动脉高压大鼠肺动脉5-HT的收缩功能明显增强[15]不一致，可能因为肺动脉是弹性贮器血管。5-HT的缩血管作用在人和大鼠存在明显的种属差异。文献报道高血压时血管对5-HT反应增高与5-HT1B受体mRNA的水平升高有关[16]，实验结果显示当使用5-HT2A受体特异性拮抗剂，可以使5-HT量效曲线平行右移不伴有Emax值的显著改变，pA2值在SHR和WKY大鼠与Kihara等[17]以及Watts等[18]报道的5-HT2A拮抗剂pA2值一致，说明5-HT引起的收缩主要由5-HT2A受体介导，推测高血压时血管5-HT2A受体mRNA的水平也会升高。
NE除了可以调节血管张力，还可以促进心肌细胞肥大，凋亡[19]。交感神经对血压的短期调节和长期调节均有重要影响。交感神经兴奋，末梢释放去甲肾上腺素(NE)，激活心肌细胞膜上的β1受体，引起心率加快，心肌收缩力增强，心排出量增加；激动血管平滑肌细胞膜上的α1受体，引起血管收缩和肥厚，官腔变小，外周阻力升高。此外，NE激活肾小球球旁器的β1受体，引起肾素分泌，增加肾素-血管紧张素-醛固酮系统活性，可促进外周阻力升高和电解质失平衡。高血压动物(如SHR)血中肾上腺素和NE浓度较同龄WKY大鼠高4-6倍[20]。临床原发性高血压患者血浆NE浓度也显著高于健康对照组，且平均动脉压与血浆NE呈正相关[21-22]。本实验结果显示，SHR的肠系膜动脉对NE的反应性较WKY大鼠明显增强，Emax约是后者的1.8倍，与SHR的尾动脉对NE的反应性明显高于WKY大鼠[23]及SHR胸主动脉对NE、苯肾上腺素的反应性增高[24]一致。在高血压患者与非高血压患者大网膜动脉，NE引起的Emax无明显差异，但是高血压患者NE的量效曲线显著左移，pEC50值高于非高血压患者，反映了受体与配体亲和力增加。实验显示患者和大鼠对NE的反应性存在着种属差异，人大网膜动脉对NE的反应性明显低于大鼠肠系膜动脉，高血压和非高血压患者动脉量效曲线的Emax和pEC50均分别明显低于SHR和WKY大鼠量效曲线的Emax和pEC50。α1受体拮抗剂哌唑嗪和α2受体拮抗剂rauwolscine使SHR和WKY大鼠肠系膜动脉NE量效曲线平行右移不伴有Emax值的显著改变，实验中，rauwolscine的浓度是是哌唑嗪浓度的10000倍，说明NE引起的收缩主要由α1受体介导。与文献报道高血压时血管对NE反应性增高与α1受体表达上调有关[25]相一致。
ETB、5-HT、α1受体在高血压机体外周血管介导的收缩功能增强，推测这些G-蛋白耦联受体在高血压的形成中有一定的作用。
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Claims (1)

1.一种检测G-蛋白耦联受体对缩血管物质反应的方法，包括以下具体步骤：
将实验动脉血管分成高血压患者大网膜动脉组、非高血压患者大网膜动脉组、SHR肠系膜动脉组和WKY大鼠肠系膜动脉组四组；分别将四组动脉切成环置于浴槽中，累加浓度法加入去甲肾上腺素测定动脉环张力的变化，作量效曲线，考察α受体介导的收缩功能；同理分别加入5-羟色胺、蛇毒类似物、内皮素三种物质，依次考察5-HT、ETB、ETA三受体介导的收缩功能，用双因素方差分析和T检验检验考察显著性，同样试验方法在SHR组及WKY大鼠组用特异性5-HT2A受体拮抗剂酮色林，α1受体拮抗剂哌唑嗪和α2受体拮抗剂萝芙素考察5-HT2A受体、α1受体、α2受体在血管收缩中的作用，作量效曲线。
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