MX2013009608A

MX2013009608A - Analogos de cistamina para el tratamiento de la enfermedad de parkinson.

Info

Publication number: MX2013009608A
Application number: MX2013009608A
Authority: MX
Inventors: Francesca Cicchetti; Claude Rouillard; Frederic Calon
Original assignee: Univ Laval
Priority date: 2011-02-23
Filing date: 2012-02-23
Publication date: 2013-09-16
Also published as: JP2014508758A; WO2012113079A1; KR20140115239A; EP2678009A1; AU2012220314A1; RU2630583C2; US20140073694A1; EP2678009B1; MX350195B; RU2013137645A; BR112013021616A2; EP2678009A4; CN103442704A; JP6000985B2; CA2732440C; CA2732440A1; AU2012220314B2

Abstract

La presente invención se refiere al uso de análogos de cistamina para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. La presente invención también se refiere al uso de una composición que comprende análogos de cistamina y cisteína. La presente invención se refiere a un método para modificar el progreso de la enfermedad de Parkinson que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable de un análogo de cistamina a un paciente necesitado del mismo.

Description

ANALOGOS DE CISTAMINA PARA EL TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD DE PARKINSON Antecedentes de la Invención Los tratamientos actuales para la enfermedad de Parkinson (PD, por sus siglas en inglés) son sintomáticos en su mayor parte y no previenen la degeneración neuronal que es causante del progreso de la enfermedad. Las propiedades de la cistamina en la enfermedad de Parkinson y en la enfermedad de Huntington han sido estudiadas en varios modelos animales. En modelos animales de la enfermedad de Huntington (HD, por sus siglas en inglés), la cistamina ha mostrado efectos neuroprotectores al prolongar el periodo de vida y disminuir los síntomas motores de ratones que portan el gen de la enfermedad de Huntington (Dedeoglu y colaboradores 2002; Karpuj y colaboradores 2002). La evidencia in vitro e in vivo ha mostrado la capacidad de la cistamina para inhibir la transglutaminasa , una enzima implicada en agregados de proteínas tal como la forma mutada de la proteína huntingtina (Green 1993; Jeitner y colaboradores 2005; Wang y colaboradores 2005) . El incremento en los niveles en el cerebro 'del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF, por sus siglas en inglés) también ha sido determinado con precisión como uno de los elementos clave de este efecto protector neuronal (Borrell-Pages y colaboradores 2006) . Una Ref. 243106 alta dosis de cistamina suministrada a través de agua potable atenúa el estrés oxidante y el efecto perjudicial de la 1-metil-4-fenil-1, 2, 3, ß-tetrahidropiridina (MPTP) sobre las funciones mitocondriales (Stack y colaboradores 2008). Los efectos de la cistamina y/o cisteamina han sido reportados en el modelo de ratón de MPTP de la enfermedad de Parkinson (Sun y colaboradores 2010, Tremblay y colaboradores 2006; Stack y colaboradores 2008; Gibrat y colaboradores 2010).

El metabolismo de la cistamina genera varios productos intermedios que incluyen no únicamente la cisteamina, sino también la hipotaurina y la taurina. La cistamina y la cisteamina son ambas compuestos orgánicos y se describieron inicialmente como radioprotectores (Bacq y Beaumariage 1965) . Aunque la cisteamina es la forma descarboxilada de la cisteina, la fuente principal resulta de su producción constitutiva por parte de todos los tejidos por vía de la degradación de la coenzima A (Pitari y colaboradores 1992), la cual está implicada en procesos metabólicos notablemente en la generación de ATP a través del ciclo de Krebs (Leonardi y colaboradores 2005) . Aunque la cisteina es un constituyente común de la mayoría de proteínas (Lee y colaboradores 2004), los niveles en plasma de cisteina basal son usualmente bajos debido a que su tiol es susceptible a la oxidación y conduce al derivado de disulfuro cistina.

La cisteamina, la forma reducida de cistamina (2-aminoet-anotiol ) está aprobada para el tratamiento de la cistinosis, un trastorno de la niñez el cual causa insuficiencia renal a través de la acumulación intracelular de cistina (Dohil y colaboradores 2009) . Debido a que la cisteamina ha mostrado eficacia significativa en modelos de ratones de . la enfermedad de Huntington (Borrell-Pages y colaboradores 2006) y su seguridad se ha documentado, la molécula está actualmente en desarrollo para pacientes que sufren de este trastorno (Dubinsky y Gray 2006) .

Un ensayo preliminar con bitartrato de cisteamina (CYSTAGONMR) se realizó recientemente en pacientes con la enfermedad de Huntington, en parte para establecer una dosis terapéutica segura (Dubinsky y Gray, 2006). Nueve pacientes con la enfermedad de Huntington se enrolaron en este ensayo clínico fase I con identidad conocida, de centro individual. Los sujetos recibieron un tratamiento con cisteamina de 10 mg/kg al día con un incremento semanal de 10 mg/kg adicionales al día hasta una dosis máxima de 70 mg/kg o hasta el desarrollo de efectos colaterales intolerables (náusea y deterioro motriz). El ensayo concluyó que una dosis de 20 mg/kg al día de cisteamina fue tolerable en personas que sufrían de la enfermedad de Huntington (Dubinsky y Gray, 2006) . Sin embargo, no se demostró eficacia clínica. Incluso si no son transferibles completamente a los humanos, los estudios llevados a cabo en modelos de animales de la enfermedad de Huntington mostraron que se requirieron dosis mucho más altas de cistamina o cisteamina para lograr un efecto terapéutico significativo. Adicionalmente, aunque la cisteamina puede cruzar la barrera hematoencefálica (BBB, por sus siglas en inglés), toma dosis más grandes de cistamina o cisteamina (i.p. o p.o.) para detectar una variación en la cisteamina o sus metabolitos en el cerebro (Bousquet y colaboradores , 2010) . La eficacia de la cistamina y cisteamina para modificar el progreso de la enfermedad de Parkinson, asi como también sus propiedades de transporte en el cerebro se desconocen.

Las terapias existentes para la enfermedad de Parkinson están diseñadas principalmente para el manejo de síntomas y hasta ahora no existe un tratamiento disponible para atenuar el progreso de la enfermedad. Por lo tanto, existe la necesidad del desarrollo de agentes terapéuticos que pueden modificar la velocidad de progreso de la enfermedad de Parkinson.

Los inventores han demostrado, por primera vez, que los análogos de cistamina se pueden utilizar para modificar el progreso de la enfermedad de Parkinson.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona un método para modificar el progreso de la enfermedad de Parkinson, el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un análogo de cistamina, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, una composición o una combinación de la invención a un paciente necesitado del mismo .

La presente invención proporciona el uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un análogo de cistamina, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, una composición o una combinación de la invención para modificar el progreso de la enfermedad de Parkinson en un paciente necesitado del mismo.

La presente invención proporciona el uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo como un agente de neurorrescate y/o como un agente de neurorrestauración para modificar el progreso de la enfermedad de Parkinson en un paciente.

La presente invención proporciona una combinación o una composición farmacéutica para modificar el progreso de la enfermedad de Parkinson que comprende por lo menos un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y que comprende cisteina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

La presente invención proporciona una combinación o una composición farmacéutica para modificar el progreso de la enfermedad de Parkinson que comprende por lo menos un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo como un agente de neurorrescate y/o un agente de neurorrestauración y que comprende cisteina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

En aún otro aspecto, se proporciona el uso de un análogo de cistamina, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, una composición o una combinación de la invención para la manufactura de un medicamento como se describe en este documento.

Breve Descripción de las Figuras Figuras 1A-1C: Efectos bénéficos de la cistamina sobre neuronas nigrales positivas para tirosina hidroxilasa.

Figura 1A. Los conteos estereologicos de células de neuronas positivas para tirosina hidroxilasa (TH) en la substantia nigra pars compacta (SNpc) revelaron una disminución significativa en el número total de neuronas positivas para TH en ratones PTP tratados con solución salina, en comparación con animales tratados con solución salina + solución salina (p < 0.001) . Figura 1A. Los ratones tratados con cistamina Pre y Pos-MPTP demostraron un número similar de neuronas positivas para TH que los animales tratados con solución salina (cuyo titulo es: "Neuronas nigrales positivas para TH") . Figura IB. Las fotomicrografías de la SNpc que muestran un número elevado (comparable a la solución salina) de neuronas teñidas con Cresilo y positivas para TH en la solución salina y ratones tratados con cistamina pos-MPTP en comparación con ratones tratados con solución salina MPTP. La tabla en la Figura 1C recapitula los conteos estereológicos de células de Cresilo y TH. Los paneles inferiores ilustran las lineas de tiempo de las programaciones pre y pos-tratamiento. Los valores se expresan como medios ± S.E.M. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando un análisis ANOVA unidireccional. Diferencia significativa con el grupo tratado con solución salina + solución salina: *** = p < 0.001. Diferencia significativa con el grupo tratado con MPTP + solución salina: # = p < 0.05; ## = p < 0.01; ### = p < 0.001. Barra de escala en la Figura IB = 400 µp?, inserción = 25 µp?. Abreviaciones: Pre-Tx (tratamiento con cistamina pre-MPTP) ; Pos-Tx (tratamiento con cistamina pos-MPTP) .

Figuras 2A-2B : Efecto benéfico de la cistamina sobre la expresión de ARNm de Nurrl nigral.

Figura 2A. Mediciones densitométricas de niveles de ARNm de Nurrl (un gen implicado en la expresión y mantenimiento del fenotipo de dopamina (DA)) en la SNpc revelaron que los niveles de 3 grupos de control (solución salina + solución salina; solución salina + cistamina Pre-Tx, solución salina + cistamina Pos-Tx) y animales MPTP tratados con cistamina fueron similares, mientras que los niveles de ARNm de Nurrl en animales MPTP tratados con solución salina se disminuyeron significativamente (p < 0.01) (cuyo titulo es: "Niveles de ARNm de Nurrl"). Figura 2B. Las fotomicrografías a nivel de la SNpc (véase la flecha) ilustran los niveles normales de ARNm de Nurrl en los ratones de control y tratados con cistamina pos-MPTP en comparación con ratones tratados con solución salina MPTP Figura 2B. Los valores se expresan como medios ± S.E.M. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando un análisis ANOVA unidireccional. Diferencia significativa con el grupo tratado con solución salina + solución salina: ** = p < 0.01. Diferencia significativa con el grupo tratado con MPTP + solución salina: # = p < 0.05; ## = p < 0.01. Barra de escala én la Figura 2B = 1 mm.

Figuras 3A-3C: Efecto benéfico de cistamina sobre células nigrales positivas para DAT.

La expresión del ARNm del transportador de DA (DAT) también se reveló por. medio de la hibridación in situ. Figura 3A. Los conteos celulares estereológicos de células que expresaban DAT en la SNpc mostraron una disminución significativa en el número total de neuronas en ratones MPTP tratados con solución salina, en comparación con animales tratados con solución salina + solución salina (p < 0.001). Figura 3A. Los ratones tratados con cistamina pre y pos-MPTP mostraron un número comparable de células positivas para DAT como los animales tratados con solución salina (cuyo titulo es: "Neuronas nigrales positivas para DAT") . Figura 3B. Las fotomicrografías de la SNpc representan células que expresan ARNm de DAT. La inserción representa la autorradiografía de ARNm de DAT antes de la emulsión (medida por medio de la densitometría) . La tabla en la Figura 3C recapitula los conteos estereológicos de células y mediciones densitométricas de la expresión de ARNm de DAT en la SNpc. Los valores se expresan como medios ± S.E.M. Se realizaron análisis estadísticos utilizando el análisis ANOVA unidireccional. Diferencia significativa con el grupo tratado con solución salina + solución salina: * = p < 0.05; *** = p < 0.001. Diferencia significativa con el grupo tratado con MPTP + solución salina: # = p < 0.05; ## = p < 0.01. Barra de escala en la Figura 3B = 400 µta, inserción = 500 um.

Figuras 4A-4C: Curso temporal de la pérdida de células positivas para TH nigrales en el modelo de MPTP subagudo .

Figura 4A. Los conteos celulares estereológicos de neuronas positivas para TH en la SNpc revelaron una disminución significativa en el número total de neuronas positivas para TH 7 y 14 días después de la última inyección de MPTP en comparación con el grupo tratado con solución salina (p < 0.01) y el grupo pos-MPTP 1 día, lo cual solo mostró una tendencia hacia un número disminuido de neuronas (p = 0.063) (cuyo título es: "Neuronas nigrales positivas para TH") . Figura 4B. Las fotomicrografías de la SNpc representan un número reducido de neuronas teñidas con Cresilo y positivas para TH en los grupos pos-MPTP 7 y 14 días. La tabla en la Figura 4C recapitula los conteos estereológicos de células de Cresilo y TH. Los valores se expresan como medios + S.E.M. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando un análisis ANOVA unidireccional. Diferencia significativa con el grupo tratado con solución salina: ** = p < 0.01. Barra de escala en la Figura 4B = 400 µ??.

Figuras 5A-5B: Curso temporal de disminuciones en la expresión de ARNm de Nurrl y DAT en el modelo de MPTP subagudo .

Las mediciones densitométricas de la expresión del ARNm Figura 5A Nurrl y Figura 5B DAT mostraron niveles significativamente disminuidos de ambos marcadores de DA en la SNpc comenzando 24 horas después del tratamiento con MPTP (p < 0.01 y p < 0.05 respectivamente) . Los valores se expresan como medios ± S.E.M. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando un análisis ANOVA unidireccional. Diferencia significativa con el grupo de control: ** = p < 0.01. * = P < 0.05 (cuyos títulos son: Figura 5A "Expresión de ARNm de Nurrl Nigral" y Figura 5B "Expresión de ARNm de DAT Nigral") .

Figuras 6A-6C: Curso temporal del proceso apoptótico de DA nigral en el modelo de MPTP subagudo.

Análisis de Western Blot de niveles de proteínas Figura 6A BAX y Figura 6B Bcl-2 en el mesencéfalo ventral. Figura 6C . La relación de BAX/Bcl2 se incrementa significativamente 24 horas después de la última inyección de MPTP (p < 0.05) lo que sugiere que, con este régimen específico de suministro de MPTP, un proceso apoptótico ya ha comenzado en este momento. Los valores se expresan como medios ± S.E.M. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el análisis ANOVA unidireccional. Diferencia significativa con el grupo de control: * = p < 0.05 (cuyos títulos son: Figura 6A "Niveles de proteínas BAX en el mesencéfalo ventral", Figura 6B "Niveles de proteínas Bcl2 en el mesencéfalo ventral" y Figura 6C "Relación de BAX/Bcl2") .

Figuras 7A-7C: Niveles incrementados de cisteamina en el cerebro. Niveles cerebrales de cisteamina Figura 7B y cisteína Figura 7C medidos por medio de HPLC acoplada con detección de fluorescencia. Las estructuras moleculares y los perfiles de elución de HPLC de una solución estándar de cisteamina (2) y cisteína (1) se representan en la Figura 7A. La cisteamina se incrementa significativamente en respuesta a una inyección i.p. individual de cistamina de 50 mg/kg en ratones sacrificados 1 hora después de la inyección, en comparación con ratones tratados con vehículo sacrificados en el mismo punto de tiempo (p < 0.05) Figura 7B. La dosis de 200 mg/kg también provoca un incremento significativo de cisteamina 1 hora y 3 horas después de la inyección de cistamina (p < 0.01) Figura 7b. Los niveles cerebrales de cisteina son estables independientemente de las dosis y los tiempos de perfusión Figura 7C. Los datos se expresan como medios (nmol/mg de proteina) ± S.E. . * p < 0.05; ** p < 0.01.

Figuras 8A-8C: Niveles constantes de hipotaurina y taurina en el cerebro. Concentraciones cerebrales de hipotaurina Figura 8B y taurina Figura 8C medidas por medio de HPLC acoplada con detección de UV. Las estructuras moleculares y los perfiles de elución de HPLC de una solución estándar que contiene 1 ng/mL de taurina (1) e hipotaurina (2) se representan en la Figura 8A. Se observaron medidas estables de hipotaurina Figura 8B y taurina Figura 8C en el cerebro. Los datos se expresan como medios (nmol/mg de proteina) ± S.E.M.

Figuras 9A-9C: Captación incrementada en el cerebro de cisteamina en presencia de cisteina. Demostración de la captación en el cerebro de cisteamina y cisteina utilizando una técnica de perfusión cerebral in situ y la cuantificación por medio de un método de HPLC. Ilustración esquemática del método de perfusión cerebral in situ Figura 9?. Un catéter se inserta directamente en la arteria carótida, interna, derecha para asegurar que 100% del perfusado alcanza el hemisferio derecho después de las ligaduras apropiadas (vasos azules) Figura 9A. Tanto la cisteina Figura 9B como la cisteamina Figura 9C pueden cruzar la BBB como se demuestra por el alto coeficiente de aclaración de cada molécula (µ?,/q/s) . Cuando se co-perfusionan, los coeficientes de aclaramiento de cisteina y cisteamina incrementan significativamente. Los datos se expresan como medios + S.E.M. (µ?,/q/s) * p < 0.05 (cuyos títulos son: Figura 9B "Captación de cisteina en el cerebro" y Figura 9C "Captación de cisteamina en el cerebro" ) .

Figuras 10A-10E: La cistamina rescata las neuronas dopaminérgicas en el modelo de ratón de ß-OHDA estriatal unilateral de la enfermedad de Parkinson. El panel de la Figura 10E ilustra el curso temporal del experimento. Todos los ratones se sujetaron a una inyección intraestriatal unilateral de 6-OHDA (4 ug) o un volumen equivalente de vehículo (simulacro) . Tres días después, durante el proceso degenerativo dopaminérgico en curso, los ratones recibieron un tratamiento de 10 mg/kg de cistamina (o solución salina) diariamente durante 14 días. Se realizó una perfusión transcardíaca a los ratones 24 horas después de la última inyección de cistamina y los cerebros se procesaron para análisis post mortem. Figura 10A. Un conteo celular estereológico de neuronas positivas para TH en la SNpc reveló una disminución significativa del 72% en el número total de neuronas positivas para TH en ratones 6-OHDA tratados con solución salina, en comparación con animales tratados con simulacro + solución salina (p < 0.001). Los ratones 6-OHDA tratados con cistamina exhibieron solo una disminución del 27% en el número total de neuronas positivas para TH en comparación con los animales tratados con simulacro + cistamina (p < 0.05). El grupo tratado con 6-OHDA + solución salina fue significativamente diferente del grupo tratado con 6-OHDA + cistamina (p < 0.001). Figura 10B y Figura 10C. Mediciones densitométricas para los niveles de ARNm de Nurrl y DAT en la SNpc, respectivamente. Estos 2 marcadores adicionales de integridad dopaminérgica revelaron el mismo patrón observado para la tinción de TH en la Figura 10A, confirmando las propiedades de neurorrescate de la cistamina. Figura 10D. Las mediciones del contenido de DA estriatal realizadas por medio de HPLC mostraron niveles significativamente disminuidos de DA solo en ratones 6-OHDA tratados con solución salina en comparación con los ratones de control (p<0.01) . Los valores se expresan como medios ± S.E.M. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando un análisis ANOVA unidireccional. * = p < 0.05; ** = p < 0.01; *** = p < 0.001 (cuyos títulos son: Figura 10A "Neuronas nigrales positivas para TH", Figura 10B "Expresión de ARNm de Nurrl Nigral", Figura 10C "Expresión de ARNm de DAT Nigral", Figura 10D "Niveles de doparaina estratiales") .

Figuras 11A-11D: La cistamina invierte los deterioros conductuales inducidos por lesiones de 6-OHDA estríateles en ratones. El panel de la Figura 11D ilustra el curso temporal del experimento. Todos los ratones se sujetaron a una inyección intraestriatal unilateral de 6-OHDA (4 ug) o un volumen equivalente de vehículo (simulacro) . Tres semanas después, cuando la lesión era estable y había alcanzado una degeneración máxima, los ratones recibieron un tratamiento de 10 mg/kg de cistamina (o solución salina) diariamente durante 6 semanas. Durante todo el experimento, los ratones se evaluaron con 3 diferentes pruebas conductuales en 3 puntos de tiempo distintos: antes del inicio del tratamiento con cistamina (3 semanas después de la cirugía), 6 semanas y 9 semanas después de la lesión. Las pruebas conductuales se seleccionaron para evaluar las asimetrías sensorio-motrices que son indicativas del grado de lesión dopaminérgica unilateral. Figura 11A. Las rotaciones contralaterales inducidas por apomorfina acumulativa se midieron con un aparato rotámetro. La lesión de 6-OHDA unilateral indujo un incremento de rotaciones contralaterales 3, 6 y 9 semanas después de la lesión atenuado significativamente por el tratamiento con cistamina 6 y 9 semanas , después de la cirugía (p < 0.05) . Figura 11B. La prueba de desplazamiento reveló una disminución en el porcentaje de ajuste de pasos para la pata anterior contralateral (en comparación con homolateral) . Figura 11C. La asimetría de uso de extremidades también se muestra para la prueba de cilindro en la cual los ratones lesionados por 6-OHDA mostraron una disminución significativa en el porcentaje de contactos contralaterales en 3 semanas, 6 semanas y 9 semanas después de la cirugía en comparación con los ratones de simulacro. Esta asimetría no fue visible para los ratones lesionados por 6-OHDA tratados con cistamina en 6 y 9 semanas después de la lesión. Los valores se expresan como medios + S.E.M. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando un análisis ANOVA unilateral. *= P < 0.05; ** = p < 0.01; ***¦ = p < 0.001 (cuyos títulos son: "Comportamiento motor inducido por fármacos" Figura 11A "Rotaciones inducidas por apomorfina", "Comportamientos motores espontáneos" Figura 11B "Prueba de ajuste de pasos (desplazamiento)", Figura 11C "Prueba de asimetría de uso de extremidades (cilindro)").

Figuras 12A-12D: La cistamina restaura algunos aspectos del sistema nigral dopaminérgico y cambia los contenidos catecolaminérgicos estriatales y la dinámica en el modelo de ratón de 6-OHDA estriatal unilateral de la enfermedad de Parkinson. El panel de la Figura 12D ilustra el curso temporal del experimento. Como se muestra en la Figura 11, todos los ratones se sujetaron a una inyección intraestriatal , unilateral de 6-OHDA (4 ug) o un volumen equivalente de vehículo (simulacro) y el tratamiento con cistamina (o solución salina) comenzó 3 semanas después durante un periodo de 6 semanas. Se realizó una . perfusión transcardíaca a los ratones 24 horas después de la última inyección de cistamina y los cerebros se procesaron para análisis post mortem. Figura 12A. El conteo celular estereológico de neuronas positivas para TH en la SNpc reveló una disminución significativa del 93% en el número total de neuronas positivas para TH en ratones 6-OHDA tratados con solución salina, en comparación con los animales de simulacro + solución salina (p < 0.001). Los ratones 6-OHDA tratados con cistamina exhibieron solo una disminución del 65% en el número total de neuronas positivas para TH en comparación con los animales de simulacro + cistamina (p < 0.001). El grupo de 6-OHDA + solución salina es significativamente diferente del grupo de 6-OHDA + cistamina (p < 0.01). Figura 12B. Los niveles DA de cistamina medidos por medio de HPLC en ratones lesionados por 6-OHDA se disminuyeron por 88% y 84% para los animales tratados con solución salina y cistamina respectivamente (p < 0.001). La cistamina no restauró significativamente el contenido de DA en el cuerpo estriado lesionado. Figura 12C. Sin embargo, la cistamina ejerció una fuerte tendencia a normalizar la producción de DA en comparación con los ratones 6-OHDA tratados con solución salina, lo cual se correlaciona significativamente con las pruebas de evaluación de lesiones conductuales (los datos no se muestran). Los valores se expresan como medios ± S.E.M. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando un análisis ANOVA unidireccional. *= P < 0.05; ** = p < 0.01; *** = p < 0.001 (cuyos títulos son: Figura 12A "Neuronas nigrales positivas para TH", Figura 12B "Niveles de dopamina estríateles" y Figura 12C "Producción de dopamina estriatal") .

Descripción Detallada de la Invención Usos y Métodos En una modalidad, los análogos de cistamina y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos se pueden utilizar como agentes de neurorrescate y/o de neurorreconstitución . Esta actividad de neurorrescate/ neurorreconstitución se puede distinguir de la actividad de un agente neuroprotector .

Como se utiliza' en este documento, "un agente neuroprotector" puede proteger las neuronas "saludables" restantes del proceso degenerativo. Por lo tanto, se puede apreciar que un agente neuroprotector se podría administrar al momento de la diagnosis.

Como se utiliza en este documento, "un agente de neurorrescate" puede detener el proceso neurodegenerativo en las neuronas que están lesionadas, pero no muertas, con o sin una recuperación funcional. Por lo tanto, se puede entender que un agente de neurorrescate se debe administrar tan pronto como sea posible, pero se puede administrar después de la diagnosis de PD.

Como se utiliza en este documento, "un agente de neurorreconstitución" puede restablecer una función por medio de una restauración funcional y/o estructural y la regeneración de neuronas lesionadas. Por lo tanto, se puede apreciar que un agente de neurorreconstitución es sumamente relevante para el uso clínico en PD puesto que puede mostrar la eficacia máxima después de la diagnosis.

En una modalidad adicional, los análogos de cistamina y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos se pueden utilizar para modificar el progreso de la enfermedad de Parkinson.

En una modalidad, "modificar el progreso de la enfermedad de Parkinson" se caracteriza por a) una reducción del proceso neurodegenerativo por una acción anti-apoptótica sobre neuronas que están lesionadas, pero no muertas, con o sin una recuperación funcional; y/o b) restauración funcional y/o estructural y regeneración.

En una modalidad adicional, "modificar el progreso de la enfermedad de Parkinson" se caracteriza por uno de los siguientes mecanismos: a) una reducción del proceso neurodegenerativo por una acción anti-apoptótica sobre neuronas que están lesionadas, pero no muertas, con o sin una recuperación funcional; y/o b) una restauración funcional y/o estructural y regeneración de neuronas lesionadas, y/o c) la promoción de la neurogénesis .

En todavía otra modalidad, el progreso de la enfermedad de Parkinson se cuantifica por medio de la calificación de la Escala de Clasificación de la Enfermedad Parkinson Unificada Total (Total UPDRS, por sus siglas en inglés) , un incremento en la calificación de Total UPDRS representa un progreso de los síntomas de la enfermedad de Parkinson y el incremento en la calificación de UPDRS Total durante un periodo de tiempo representa la velocidad del progreso de la enfermedad de Parkinson. Véase por ejemplo: Goetz CG, Tilley BC, Shaftman SR, Stebbins GT, Fahn S, Martínez-Martin P, Poewe W, Sampaio C, Stern MB, Dodel R y colaboradores (2008) Movement Disorder Society-sponsored revisión of the Unified Parkinson' s Disease Rating Scale (MDS-UPDRS) : scale presentation and clinimetric testing results. Mov Disord 23:2129-2170.

En todavía otra modalidad de este método, el periodo de tiempo es 12, 24 o 36 semanas después del inicio de la administración de un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Como se utiliza en este documento, las etapas de un paciente con la enfermedad de Parkinson son descritas por Hoehn y Yahr en las siguientes cinco etapas distintas dependiendo de los síntomas (Hoehn M M, Yahr D, Parkinsonism: onset, progression and mortality. Neurology 1967, 17:427-42).

Etapa I: (enfermedad leve o inicial): Los síntomas afectan únicamente un lado del cuerpo.

Etapa II: Ambos lados del cuerpo son afectados, pero la postura permanece normal.

Etapa III: (enfermedad moderada): Ambos lados del cuerpo son afectados y existe un desequilibrio leve durante la permanencia de pie o el desplazamiento. Sin embargo, la persona sigue siendo independiente.

Etapa IV: (enfermedad avanzada) : Ambos lados del cuerpo son afectados y existe una inestabilidad discapacitante mientras permanece de pie o se desplaza. La persona en esta etapa requiere ayuda sustancial.

Etapa V: Está presente una enfermedad grave, completamente desarrollada. La persona está restringida a una cama o una silla.

Como se utiliza en este documento, un "paciente con la enfermedad de Parkinson en etapa inicial" es un paciente con la enfermedad de Parkinson en Etapa I o II de la Enfermedad de Parkinson como se define por Hoehn y Yahr, y quien no requiere una terapia sintomática anti-enfermedad de Parkinson. En una modalidad, este paciente con la enfermedad de Parkinson no requiere un tratamiento sintomático durante por lo menos los siguientes 9 meses. Un paciente con la enfermedad de Parkinson en etapa inicial se puede identificar como tal al realizar una prueba relevante.

En una modalidad, el paciente es un paciente con la enfermedad de Parkinson en etapa inicial.

En todavía otra modalidad, el paciente con la enfermedad de Parkinson en etapa inicial es un paciente en Etapa I de acuerdo con la clasificación de Hoehn y Yahr.

En todavía otra modalidad, el paciente con la enfermedad de Parkinson en etapa inicial es un paciente que tiene una calificación total de UPDRS menor que 30; menor que 25; menor que 23; menor que 21; o menor que 20.

En todavía otra modalidad, el paciente con la enfermedad de Parkinson es un paciente en Etapa I, II, III, IV o V de acuerdo con la clasificación de Hoehn y Yahr.

En todavía otra modalidad, el paciente con la enfermedad de Parkinson es un paciente en Etapa III, IV o V de acuerdo con la clasificación de Hoehn y Yahr.

En todavía otra modalidad, el paciente , con la enfermedad de Parkinson es un paciente en Etapa III o IV de acuerdo con la clasificación de Hoehn y Yahr.

En todavía otra modalidad, el paciente con la enfermedad de Parkinson está en la Etapa III de acuerdo con la clasificación de Hoehn y Yahr.

La presente invención se refiere a usos o métodos para : reducir la fatiga en un paciente con la enfermedad de Parkinson; reducir .la gravedad de síntomas no motores en un paciente con la enfermedad de Parkinson; reducir la decadencia funcional en un paciente con la enfermedad de Parkinson; reducir el progreso clínico de la enfermedad; o disminuir la velocidad del progreso clínico de la enfermedad .

La presente invención proporciona todavía además un método para tratar a un paciente que exhibe la enfermedad de Parkinson, que comprende la identificación de pacientes que exhiben la enfermedad de Parkinson y administrar periódicamente al paciente identificado de esta manera una cantidad de un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o una composición o una combinación de la invención que es efectiva para tratar al paciente .

La presente invención se refiere a un método para disminuir la velocidad o reducir el progreso de la enfermedad de Parkinson en un paciente que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, una composición o una combinación de la invención.

La presente invención se refiere al uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, una composición o una combinación de la invención para disminuir la velocidad o reducir el progreso de la enfermedad de Parkinson en un paciente.

La presente invención proporciona además el uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o una composición o una combinación de la invención para disminuir la velocidad del progreso clínico de la enfermedad de Parkinson en un paciente con la enfermedad de Parkinson.

La presente invención se refiere además a un método para disminuir la velocidad del progreso clínico de la enfermedad de Parkinson en un paciente con la enfermedad de Parkinson que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o una composición o una combinación de la invención.

La presente invención proporciona todavía además el uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable o una composición o una combinación de la invención para reducir la gravedad de síntomas no motores en un paciente con la enfermedad de Parkinson.

La presente invención proporciona todavía además un método para reducir la gravedad de síntomas no motores en un paciente con la. enfermedad de Parkinson que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable o una composición o una combinación de la invención.

La presente invención proporciona todavía además un método para tratar a un paciente que tiene la Etapa I, II, III, IV o V de la enfermedad de Parkinson (de acuerdo con la clasificación de Hoehn y Yahr) , que comprende la identificación de pacientes que exhiben la enfermedad de Parkinson y administrar periódicamente al paciente identificado de esta manera una cantidad de un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición o una combinación de la invención que es efectiva para tratar al paciente.

La presente invención proporciona además un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición o una combinación de la invención para el uso en el tratamiento de un paciente que exhibe síntomas iniciales de la enfermedad de Parkinson.

La presente invención proporciona todavía además una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición o una combinación de la invención para el uso en la reducción de la velocidad del progreso de la enfermedad de Parkinson en un paciente con la enfermedad de Parkinson en etapa inicial.

La presente invención proporciona todavía además el uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o una composición o una combinación de la invención para tratar a un paciente que exhibe síntomas iniciales de la enfermedad de Parkinson.

La presente invención proporciona todavía además un método para tratar a un paciente que exhibe síntomas iniciales de la enfermedad de Parkinson, que comprende la identificación de pacientes que exhiben síntomas iniciales de la enfermedad de Parkinson y administrar periódicamente al paciente identificado de esta manera una cantidad de un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición o una combinación de la invención que es efectiva para tratar al paciente.

La presente invención proporciona además un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o una composición o una combinación de la invención para el 7 uso en la reducción de la fatiga en un paciente con la enfermedad de Parkinson en etapa inicial.

La presente invención proporciona todavia además el uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de un análogo de cistamina- o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o una composición o una combinación de la invención para reducir la fatiga en un paciente con la enfermedad de Parkinson en etapa inicial.

La presente invención proporciona todavia además un método para reducir la fatiga en un paciente con la-enfermedad de Parkinson en etapa inicial, gue comprende identificar a un paciente gue es un paciente con la enfermedad de Parkinson en etapa inicial y administrar periódicamente al paciente identificado de esta manera una cantidad de un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo gue es efectiva para reducir la fatiga.

La presente invención proporciona todavia además un método para reducir la gravedad de síntomas no motores en un paciente con la enfermedad de Parkinson en etapa inicial, gue comprende identificar a un paciente gue es un paciente con la enfermedad de Parkinson en etapa inicial y administrar periódicamente al paciente identificado de esta manera una cantidad de un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o una composición o una combinación de la invención que es efectiva para reducir la gravedad de los síntomas no motores.

La presente invención proporciona además un método para reducir la fatiga en un paciente con la enfermedad de Parkinson en etapa inicial, que comprende administrar periódicamente a un paciente con la enfermedad de Parkinson en etapa inicial una cantidad de un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o una composición o una combinación de la invención que es efectiva para reducir la fatiga.

La presente invención proporciona además un método para reducir la gravedad de síntomas no motores en un paciente con la enfermedad de Parkinson en etapa inicial, que comprende administrar periódicamente a un paciente con la enfermedad de Parkinson en etapa inicial una cantidad de un análogo de cistamina o una sal' farmacéuticamente aceptable del mismo o una composición o una combinación de la invención que es efectiva para reducir la gravedad de los síntomas no motores .

La presente invención proporciona además un método para disminuir la velocidad del progreso clínico de la enfermedad de Parkinson en un paciente con la enfermedad de Parkinson que comprende administrar periódicamente al paciente con la enfermedad de Parkinson una cantidad de un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición o una combinación de la invención que es efectiva para disminuir la velocidad del progreso clínico de la enfermedad de Parkinson en el paciente .

La presente invención proporciona además un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición o una combinación de la invención para el uso en la reducción de la velocidad del progreso de la enfermedad de Parkinson en un paciente con la enfermedad de Parkinson en etapa inicial.

La presente invención proporciona además un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición o una combinación de la invención para el uso en la reducción de la decadencia funcional en un paciente con la enfermedad de Parkinson en etapa · inicial .

Composiciones Farmacéuticas y Análogos de Cistamina En un aspecto, el análogo de cistamina es cisteamina, cistamina, taurina o hipotaurina o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas.

En un aspecto adicional, el análogo de cistamina es cistamina o cisteamina o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas.

En un aspecto adicional, el análogo de cistamina es bitartrato de cisteamina.

En un aspecto adicional, el análogo de cistamina es clorhidrato de cisteamina.

En un aspecto adicional, el análogo de cistamina es clorhidrato de cistamina.

En otro aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende por lo menos un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y por lo menos un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable .

En otro aspecto, se proporciona una combinación que comprende un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y uno o más agentes adicionales tales como bromocriptina, benzotropina, levodopa, ropinirol, pramipexol, rotigotina, cabergolina, entacopona, tolcapona, amantidina, selegilina y rasagilina.

En aún otro aspecto, se proporciona el uso de un análogo de cistamina, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, una composición o una combinación de la invención para la manufactura de un medicamento para modificar el progreso de la enfermedad de Parkinson en un paciente.

De acuerdo con una modalidad adicional, los compuestos de la presente invención son representados por las siguientes fórmulas: NH2- (CH2) 2-SH Cisteamina NH2- (CH2) 2-S-S- (CH2) 2-NH2 Cistamina NH2- (CH2) 2-S (02) -OH Taurina NH2- (CH2) 2-S (0) -0H Hipotaurina L-cisteina o sales armacéuticamente aceptables de las mismas.

Los análogos de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos se pueden obtener por medio de métodos bien conocidos en el campo. Los compuestos están disponibles de diferentes fuentes, por ejemplo, de Sigma-Aldrich, St. Louis, O. EUA.

En una modalidad, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende por lo menos un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que se describe en este documento y que comprende además por lo menos un agente adicional en donde el agente adicional es cisteina.

En una modalidad, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende por lo menos un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que se describe en este documento y que comprende además por lo menos un agente adicional en donde el agente adicional es L-cisteina.

En otra modalidad, se proporciona una combinación que comprende por lo menos un análogo de cistamina descrito en este documento y uno o más agentes adicionales.

En una modalidad, en donde el agente adicional es cisteina.

En una modalidad, en donde el agente adicional es L-cisteina .

En una modalidad, el análogo de cistamina y cisteina están presentes en una relación de 10:1 a 1:10 de análogo de cistamina y cisteina, respectivamente. En una modalidad adicional, el análogo de cistamina y cisteina están presentes en una relación de 1:1.

En una modalidad de combinación, el análogo de cistamina y el agente adicional se administran o son adecuados para utilizarse secuencialmente .

En otra modalidad de combinación, el' análogo de cistamina y el agente adicional se administran o son adecuados para utilizarse simultáneamente.

Las combinaciones referidas anteriormente se pueden presentar convenientemente para el uso en la forma de una formulación farmacéutica y de esta manera las formulaciones farmacéuticas que comprenden una combinación como se definiera anteriormente junto con un portador farmacéuticamente aceptable comprenden por lo tanto un aspecto adicional de la invención.

Los componentes individuales para el uso en el método de la presente invención o las combinaciones de la presente invención se pueden administrar ya sea secuencial o simultáneamente en formulaciones farmacéuticas separadas o combinadas .

En una modalidad, la presente invención proporciona el uso de un compuesto, una composición o una combinación como se describe en este documento para la manufactura de un medicamento .

A menos que se establezca de otra manera, las estructuras representadas en este documento también están hechas para incluir todas las formas isoméricas (por ejemplo, enantioméricas , diastereoméricas y geométricas (o conformacionales ) ) de la estructura; por ejemplo, las configuraciones R y S para cada centro asimétrico, los isómeros de enlace doble (Z) y (E) y los isómeros conformacionales (Z) y (E) . Por lo tanto, los isómeros estereoquimicos individuales asi como también las mezclas enantioméricas, diastereoméricas y geométricas (o conformacionales ) de los presentes compuestos se encuentran dentro del alcance de la invención. El isómero óptico individual o enantiómero se puede obtener por medio de un método bien conocido en el campo, tal como la HPLC quiral, la resolución enzimática y un auxiliar quiral.

, En una modalidad, donde sea aplicable, los análogos de cistamina o la cisterna se proporcionan en la forma de un estereoisómero individual por lo menos 75%, 85%, 90%, 95%, 97% y 99% libre de los estereoisómeros correspondientes.

También se proporcionan sales farmacéuticamente aceptables de los análogos de cistamina o la cisteína. Por el término sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos se da a entender aquellos derivados de ácidos y bases inorgánicos y orgánicos farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de ácidos adecuados incluyen ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, perclórico, fumárico, maleico, fosfórico, glicólico, láctico, salicílico, succínico, tolueno-p-sulfónico, tartárico, acético, trifluoroacético, cítrico, metanosulfónico, fórmico, benzoico, malónico, naftaleno-2-sulfónico y bencenosulfónico . Otros ácidos tal como el ácido oxálico, mientras que por sí mismos no son farmacéuticamente aceptables, pueden ser útiles como productos intermedios en la obtención de análogos de cistamina y sus sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables .

Las sales derivadas de aminoácidos también están incluidas (por ejemplo, L-arginina, L-lisina) .

Las sales derivadas de bases apropiadas incluyen metales alcalinos (por ejemplo, sodio, litio, potasio) y metales alcalinotérreos (por ejemplo calcio, magnesio) .

Una referencia en lo sucesivo a los análogos de cistamina o la cisteina incluye ese compuesto y sus sales farmacéuticamente aceptables.

En una modalidad, la sal es una sal de bitartrato.

En una modalidad, la sal es una sal de clorhidrato.

Con respecto a las sales farmacéuticamente aceptables, véase también la lista de sales promovidas comercialmente aprobadas por la FDA que se encuentra en la Tabla I de Berge y colaboradores, Pharmaceutical Salts, J. of Phar. Sci., volumen 66, no. 1, Enero de 1977, páginas 1-19, la descripción del cual se incorpora en este documento a manera de referencia.

Aquellas personas expertas en el campo apreciarán que los compuestos pueden existir en diferentes formas polimórficas . Como se sabe en el campo, el polimorfismo es una capacidad de un compuesto para cristalizarse como más de una especie cristalina o "polimórfica" distinta. Un polimorfo es una fase cristalina sólida de un compuesto con por lo menos dos diferentes ordenaciones o formas polimórficas de esa molécula de compuesto en el estado sólido. Las formas polimórficas de cualquier compuesto determinado son definidas por la misma fórmula química o composición y son tan distintas en la estructura química como las estructuras cristalinas de dos compuestos químicos diferentes.

Aquellas personas expertas en el campo, apreciarán que los compuestos de acuerdo con la presente invención pueden existir en diferentes formas de solvato, por ejemplo hidratos. Los solvatos de los análogos de cistamina o la cisteína también se pueden formar cuando las moléculas de solvente se incorporan en la estructura reticular cristalina de la molécula del compuesto durante el proceso de cristalización.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan en este documento tienen el mismo significado que aquel entendido comúnmente por una persona de experiencia ordinaria en el campo al cual pertenece esta invención. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos únicamente y no pretende que sean limitantes.

Para los propósitos de esta invención, los elementos químicos se identifican de acuerdo con la Tabla Periódica de los Elementos, versión CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 75a Ed. Adicionalmente, los principios generales de la química orgánica se describen en "Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, y' "March' s Advanced Organic Chemistry", 5a Ed., Ed. : Smith, M.B. y March, J. , John Wiley & Sons, Nueva York: 2001.

Adicionalmente, a menos que se establezca de otra manera, los análogos de cistamina o la cisteina representados en este documento también están hechos para incluir compuestos que difieren únicamente en la presencia de uno o más átomos isotópicamente enriquecidos. Por ejemplo, los análogos de cistamina o la cisteina, en donde uno o más átomos de hidrógeno son deuterio o tritio reemplazado, o uno o más átomos de carbono son reemplazados por carbono enriquecido en 13C o 14C se encuentran dentro del alcance de esta invención. Estos compuestos son útiles, por ejemplo, como herramientas analíticas, sondas en ensayos biológicos o compuestos con un perfil terapéutico mejorado.

Se apreciará que la cantidad de análogos de cistamina requeridos para el uso en el tratamiento variará no únicamente . con el compuesto particular seleccionado sino también con la ruta de administración, el carácter de la condición para la cual se requiere el tratamiento y la edad y condición del paciente y estará finalmente a discreción del médico que atiende el caso. En general, sin embargo, una dosis adecuada estará en el intervalo de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 750 mg/kg de peso corporal al dia, por ejemplo, en el intervalo de 0.5 a 60 mg/kg/día o, por ejemplo, en el intervalo de 1 a 20 mg/kg/día.

La dosis deseada se puede presentar convenientemente en una dosis individual o como una dosis dividida que se administra en intervalos apropiados, por ejemplo como dos, tres, cuatro o más dosis al día.

El análogo de cistamina se administra convenientemente en una forma de dosificación unitaria; por ejemplo que contiene de 5 a 2000 mg, de 10 a 1500 mg, convenientemente de 20 a 1000 mg, mucho más convenientemente de 50 a 700 mg de ingrediente activo por forma de dosificación unitaria. En una modalidad, el análogo de cistamina se administra convenientemente en una forma de dosificación unitaria de 600 mg dos veces al día.

Cuando los análogos de cistamina o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos se utilizan en combinación con un segundo agente terapéutico que es activo contra la enfermedad de Parkinson, la dosis de cada compuesto puede ser ya sea la misma que o puede diferir de aquella cuando el compuesto se utiliza solo. Las . dosis apropiadas serán apreciadas fácilmente por aquellas personas expertas en el campo.

Mientras que es posible que, para el uso en la terapia, los análogos de cistamina se pueden administrar como el producto químico en bruto, es preferible presentar el ingrediente activo como una composición farmacéutica. De esta manera, la invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende los análogos de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable de la presente invención de los mismos junto con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables y por lo tanto, opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos y/o profilácticos. El (los) portador (es) debe(n) ser "aceptable ( s ) " en el sentido de que sea compatible con otros ingredientes de la formulación y no sea perjudicial para el paciente.

Las composiciones farmacéuticas incluyen aquellas que son adecuadas para la administración oral, rectal, nasal, tópica (que incluye bucal y sublingual), transdérmica, vaginal o parenteral (que incluye intramuscular, subcutánea e intravenosa) o en una forma adecuada para la administración por medio de la inhalación o insuflación. Donde sea apropiado, las composiciones se pueden presentar convenientemente en unidades de dosificación discretas y se pueden preparar por medio de cualquiera de los métodos bien conocidos en el campo de la farmacia. Todos los métodos incluyen el paso que consiste en poner en asociación el ingrediente activo con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos y luego, si es necesario, dar forma al producto en la composición deseada.

Las composiciones farmacéuticas que son adecuadas para la administración oral se pueden presentar convenientemente como unidades discretas tales como cápsulas, sellos o tabletas cada uno que contiene una cantidad predeterminada del ingrediente activo; como un polvo o gránulos; como una solución, una suspensión o como una emulsión. El ingrediente activo también se puede presentar como un bolo, electuario o pasta. Las tabletas y las cápsulas para la administración oral pueden contener excipientes convencionales tales como agentes aglutinantes, materiales de relleno, lubricantes, desintegrantes o agentes de humedecimiento . Las tabletas se pueden revestir de acuerdo con métodos bien conocidos en el campo. Las preparaciones liquidas orales pueden estar en la forma de, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleosas, soluciones, emulsiones, jarabes o elixires o se pueden presentar como un producto seco para la constitución con agua u otro vehículo adecuado antes del uso. Estas preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de suspensión, agentes emulsionantes, vehículos no acuosos (los cuales pueden incluir aceites comestibles) o conservadores.

Los análogos de cistamina también se pueden formular para la administración parenteral (por ejemplo, por medio de la inyección, por ejemplo la inyección de bolo o la infusión continua) y se pueden presentar como una forma de dosis unitaria en ampolletas, jeringas llenadas previamente, infusión de volumen pequeño o en envases de múltiples dosis con un conservador agregado. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo, se puede obtener por medio del aislamiento aséptico de un sólido estéril o por medio de la liofilización a partir de una solución, para la constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes del uso.

'Para la administración tópica a la epidermis, los análogos de cistamina se pueden formular como ungüentos, cremas o lociones, o como un parche transdérmico . Estos parches transdérmicos pueden contener estimuladores de la penetración tales como linalool, carvacrol, timol, citral, mentol y t-anetol. Los ungüentos y las cremas se pueden formular, por ejemplo, con una base acuosa u oleosa con la adición de agentes de espesamiento y/o gelificación adecuados. Las lociones se pueden formular con una base acuosa u oleosa y también contendrán en general uno o más agentes emulsionantes, agentes de estabilización, agentes de dispersión, agentes de suspensión, agentes de espesamiento y agentes colorantes.

Las composiciones que son adecuadas para la administración tópica en la boca incluyen pastillas rombóticas que comprenden ingrediente activo en una base saborizada, usualmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y goma arábiga; y enjuagues bucales que comprenden el ingrediente activo en un portador liquido adecuado.

Las composiciones farmacéuticas que son adecuadas para la administración rectal en donde el portador es un sólido se presentan por ejemplo como supositorios de dosis unitarias. Los portadores adecuados incluyen manteca de cacao y otros materiales utilizados comúnmente en el campo, y los supositorios se pueden formar convenientemente por medio de una mezcla del compuesto activo con el (los) portador (es) ablandado (s) o fundido (s) seguido por el enfriamiento y la conformación en moldes.

Las composiciones que son adecuadas para la administración vaginal se pueden presentar como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o atomizaciones que contienen además del ingrediente activo estos portadores que se sabe en el campo que son apropiados.

Para la administración intra-nasal, los compuestos o las combinaciones se pueden utilizar como una atomización liquida o un polvo dispersable o en la forma de gotas. Las gotas se pueden formular con una base acuosa o no acuosa que comprende también uno o más agentes de dispersión, agentes de solubilización o agentes de suspensión. Las atomizaciones liquidas se suministran convenientemente desde empaques presurizados .

Para la administración mediante la inhalación, los compuestos o combinaciones se suministran convenientemente desde un insuflador, nebulizador o un empaque presurizado u otro medio convencional para suministrar una atomización de aerosol. Los empaques presurizados pueden comprender un gas propelente tal como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar al proporcionar una válvula para suministrar una cantidad medida .

Alternativamente, para la administración por medio de la inhalación o insuflación, los compuestos o combinaciones pueden tomar la forma de una composición de polvo seco, por ejemplo una mezcla de polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón. La composición en polvo se puede presentar en una forma de dosificación unitaria en, por ejemplo, cápsulas o cartuchos o por ejemplo gelatina o empaques tipo burbuja de los cuales el polvo se puede administrar con la ayuda de un inhalador o un insuflador.

Cuando se desee, se pueden emplear las composiciones descritas anteriormente que están adaptadas para proporcionar una liberación sostenida o modificada del ingrediente activo. Los ejemplos de la formulación de cisteamina se describen por ejemplo en la publicación de los Estados Unidos 20090076166.

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que la cistamina tiene efectos benéficos en los animales parkinsonianos cuando se administra antes y después de la toxina MPTP capaz de desencadenar la patología. Los presentes inventores han determinado que la cistamina puede anular un proceso neurodegenerativo iniciado. Como se describe en los ejemplos, los ratones se intoxicaron por vía subcutánea con MPTP siguiendo un régimen de 5 días de 7 inyecciones i.p. de 20 mg/kg y administradas 10 mg/kg de cistamina i.p. diariamente ya sea 1) 2 días antes del inicio de las inyecciones de MPTP o 2) 24 horas después de la última dosis de MPTP y las cuales continuaron durante 14 días después de la lesión. Al final del estudio, se realizaron análisis post mortem para evaluar el estado del sistema dopaminérgico (DAérgico) , mas particularmente centrados en la ENFERMEDAD DE PARKINSON. Los presentes inventores descubrieron sorprendentemente que la administración i.p. de cistamina (10 mg/kg/día) a ratones tratados con MPTP comenzando después del deterioro del sistema nigroestriatal (24 horas después del tratamiento con MPTP), indujo una recuperación significativa del número de neuronas dopaminérgicas nigrales, evaluado por medio del conteo estereológico de células TH-inmunorreactivas , (p<0.05), del número de células que expresaban el ARNm de DAT (p<0.05) así como también los niveles de ARNm de Nurrl nigral (p<0.05). Los presentes inventores también han determinado que la cistamina rescata las neuronas dopaminérgicas en el modelo de ratón de ß-OHDA estriatal unilateral de la enfermedad de Parkinson. Además como se muestra en los ejemplos en este documento, la cistamina invierte los deterioros conductuales que son inducidos por las lesiones de 6-OHDA estriatal en ratones y restaura algunos aspectos del sistema nigral dopaminérgico y cambia los contenidos catecolaminérgicos estriatales y la dinámica en el modelo de ratón de 6-OHDA estriatal unilateral de la enfermedad de Parkinson. Los presentes inventores han descubierto gue el papel de los compuestos de cistamina no está limitado únicamente a la conservación de las neuronas existentes. Los compuestos también pueden invertir un proceso apoptótico inducido y de esta manera pueden rescatar las neuronas dañadas de una degeneración que se está experimentando.

Sin desear ser limitados a teoría específica alguna, los presentes inventores creen que la cisteamina es el compuesto neuroactivo clave después de la administración sistémica de cistamina. Entre las moléculas investigadas a través de mediciones de HPLC, las cuales incluyeron cisteamina, cisteína, hipotaurina y taurina, se descubrió que la cisteamina era la única que incrementó significativamente en los cerebros de ratones naturales después de una inyección i.p. individual de 50 mg/kg y 200 mg/kg. En contraste, los niveles de cisteina, hipotaurina y taurina permanecieron sin cambios o bajo el umbral de detección. Además, los presentes inventores han demostrado que la cisteamina cruza la BBB en una cantidad significativa in vivo. Estas observaciones proporcionan información importante que pertenece a la neurofarmacologia de la cisteamina y dan soporte adicional a su relevancia clínica.

La BBB es un obstáculo importante para la aplicación clínica de una gran mayoría de compuestos potencialmente neuroactivos y cuando se administran se debe tener en cuenta que metabolito de cistamina ejerce su efecto terapéutico. Los transportadores de aminoácidos son componentes de BBB bien estudiados y comprenden sistemas que prefieren leucina, alanina, serina o cisteina (Wade y Katzman, 1975; Sershen y Lajtha 1979) . Se ha reconocido que la cisteina utiliza el sistema que prefiere leucina para cruzar la BBB (Wade y Brady 1981) . La capacidad de la taurina para cruzar la BBB también ha sido descrita en ratas utilizando ISCP y aparentemente involucra un sistema de afluencia dependiente de sodio y cloro de células endoteliales (Benrabh y colaboradores 1995) . Por otra parte, el mecanismo por medio del cual la cisteamina puede cruzar la BBB requiere investigaciones adicionales. En este punto, una técnica cuantitativa y sumamente susceptible se empleó para estudiar el transporte a través de la BBB de cisteamina y cisteina. Esto se realizó sin comprometer la integridad física o funcional de la BBB y al eludir los procesos de metabolismo periférico asociados con la administración sistémica. Los inventores demostraron la capacidad de la cisteamina y la cisteina para alcanzar el cerebro en una cantidad significativa.

La captación de cisteamina del cerebro se facilitó adicionalmente por la adición de cisteina en el perfusado.

En lo anterior y en los siguientes ejemplos, todas las temperaturas se exponen no corregidas en grados Celsius; y, a menos que se indique de otra manera, todas las partes y porcentajes son en peso.

Los siguientes ejemplos.se pueden repetir con éxito similar al sustituir los reactivos descritos genérica o específicamente y/o las condiciones de operación de esta invención por aquellas utilizadas en los ejemplos precedentes.

EJEMPLOS : EJEMPLO 1: Efecto de la cistamina después del parkinsonismo inducido por MPTP en roedores Animales Los ratones macho C57BL/6 adultos jóvenes (9 semanas de edad, 25 gramos) se adquirieron de Charles River Laboratories (Montréal, QC, Canadá). Los animales se alojaron 4 por jaula bajo condiciones estándar con libre acceso al alimento y al agua, se aleatorizaron y se manipularon bajo las mismas condiciones por un investigador. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con the Canadian Council on Animal Care y fueron aprobados por the Institutional Committee of the Centre Hospitalier de I'Université Laval (CHUL, Québec, Canadá). Durante todo el experimento, el estado de salud de todos los ratones incluidos en el estudio se supervisó de cerca por la pérdida de peso u otros síntomas de problemas relacionados con la salud. No se escatimaron esfuerzos para minimizar el dolor e incomodidad de los animales.

Administración de MPTP Los ratones recibieron 7 inyecciones i.p., dos en los primeros 2 días del protocolo experimental en un intervalo de 12 horas y una vez al día en 3 días subsecuentes, ya sea de solución salina al 0.9% o MPTP-HC1 (20 mg/kg de base libre, Sigma, St. Louis, O) disuelto en solución salina al 0.9% preparada recientemente (Trernblay y colaboradores, 2006; Gibrat y colaboradores, 2007; Gibrat y colaboradores, 2010).

Tratamientos con cistamina Los efectos benéficos de la cistamina en ratones parkinsonianos (diclorhidrato de cistamina, Sigma, St . Louis, MO) se evaluaron con una dosis de 10 mg/kg disuelta en solución salina estéril al 0.9% y preparada recientemente para la inyección i.p. diaria 1 hora antes de la administración de MPTP. La elección de la dosis y el régimen de administración se basaron en los descubrimientos previos (Tremblay y colaboradores, 2006; Gibrat y colaboradores, 2010). La primera inyección de cistamina1 se administró ya sea 1) 2 dias antes del inicio de las inyecciones de MPTP (pre-tratamiento) o 2) 24 horas después de la última dosis de MPTP (pos-tratamiento) y el tratamiento continuó diariamente durante 14 días después de la lesión.

Este estudio se dividió en 2 experimentos distintos .

Experimento no.l. Propiedades de neurorrescate de la cistamina en ratones lesionados con MPTP Los efectos de la cistamina sobre la toxicidad de MPTP se estudiaron en los siguientes grupos experimentales: Grupo I, Solución Salina + Solución Salina; Grupo II, Solución Salina + Cistamina pos-tratamiento; Grupo III; Solución Salina + Cistamina pre-tratamiento; Grupo IV, MPTP + Solución Salina; Grupo V, MPTP + Cistamina pos-tratamiento, Grupo VI, MPTP + Cistamina pre-tratamiento. En total, se utilizaron 96 ratones (n=16 por grupo) , supervisados diariamente por la variación del peso y se sacrificaron finalmente por medio de la perfusión 24 horas después de la última inyección de cistamina (o vehículo) .

Experimento no.2. Curso temporal de la muerte de neuronas dopami érgicas nigrales inducida por un tratamiento subagudo con MPTP Para este experimento, se utilizó un total de 72 ratones y se dividieron en 6 grupos (n=12 por grupo) . Los Grupos I, II y III recibieron un tratamiento subagudo con MPTP mientras que a los Grupos IV, V y VI se les administró solución salina al 0.9%. Los Grupos I y IV se sacrificaron 24 horas, los Grupos II y V: se sacrificaron 7 días y los Grupos III y VI: se sacrificaron 14 días después de la última inyección de MPTP (o solución salina) .

Perfusión y procesamiento de tejidos Los animales se sacrificaron bajo anestesia profunda con quetamina/xilazina . (Vetalar, Bioniche, Belleville, ON/Rompun, Bayer, Toronto, ON) y se perfusionaron de acuerdo con dos métodos en condiciones libres de ARNasa: Experimento 1. Todos los ratones se sujetaron a una perfusión intracardíaca con solución salina amortiguada con fosfato 0.1 M libre de ARNasa (PBS) . Después de la perfusión intracardíaca, los cerebros se recolectaron y los dos hemisferios se separaron. El hemisferio izquierdo se pos-fijó en paraformaldehído al 4% (PFA) durante 48 horas y se transfirió a sacarosa al 20% en PBS 0.1 M para la crioprotección . Las secciones coronales del cerebro de 25 µp? de espesor se cortaron sobre un microtomo congelante (Leica Microsystems, Montreal, QC) y se recolectaron en serie en solución anti-congelamiento (monofosfato de sodio monobásico 0.2 M, monofosfato de sodio dibásico 0.2 M, etilenglicol al 30%, glicerol al 20%) y se mantuvieron a -20 °C hasta el uso. Las secciones del hemisferio izquierdo se utilizaron para la inmunohistoquimica adicional y los protocolos de hibridación in situ. Los hemisferios derechos se congelaron instantáneamente en 2-metil-butano y luego se almacenaron a -80°C hasta la disección en un criostato para la HPLC y análisis de Western Blot (WB) .

Experimento 2. En este experimento, los 2 hemisferios de cada animal se congelaron instantáneamente y se utilizaron para la HPLC y análisis de WB. Los 5 ratones restantes de cada grupo se perfusionaron intracardialmente por medio de solución salina libre de ARNasa (0.9%) seguido de PFA al 4%, pH 7.4. Después de la perfusión intracardiaca, los cerebros se recolectaron y se pos-fijaron en PFA al 4% durante 24 horas y se transfirieron a sacarosa al 20% en PBS 0.1 M para la crioprotección . Los cerebros se cortaron en secciones coronales de 25 µp\ de espesor. Estas secciones se utilizaron para la inmunohistoquimica y la hibridación in situ requeridas para la terminación del experimento 2.

Cuantificación de catecolamina por medio de la HPLC Las concentraciones de DA estriatal, ácido 3,4- dihidroxifenilacético (DOPAC) y ácido homovanilico (HVA) se midieron por medio de la HPLC acoplada con la detección electroquímica (Calón y colaboradores, 2001; Calón y colaboradores, 2003) . Cada muestra estriatal comprendió diez secciones de criostato de 20 µ?t? de espesor de la estructura que varía entre los niveles de +1.145 y +1.345 (Alien, 2008; Lein y colaboradores, 2007). Doscientos µ? de ácido perclórico (0.1 N; J.T. Baker) se agregaron a cada muestra, las cuales se homogenizaron y se centrifugaron (13000 xg) para generar un sobrenadante. Cincuenta µ? de sobrenadante de tejidos estriatales se inyectaron directamente en el sistema de cromatografía que consistía de un inyector automático de tomamuestras automático Waters 717 plus, una bomba binaria Waters 1525 equipada con una columna Atlantis dC18 (3 µ?), un detector electroquímico Waters 2465 y un electrodo de carbón vitreo (Waters Limited, Lachine, QC, Canadá). El potencial electroquímico se ajustó a 10 nA. La fase móvil consistió de NaH2P04 47.8 mM, octil-sulfato de sodio 0.9 mM (J.T. Baker), EDTA 0.4 mM, NaCl 2 mM y metanol al 8% (J.T. Baker) a pH 2.9 y se suministró a 1.0 ml/minuto. Los picos se identificaron utilizando el software Breeze (Waters). Las cuantificaciones de la HPLC se normalizaron a concentraciones de proteína, determinadas con un kit de ensayo de proteínas con ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL, EUA) .

Inmunohistoquímica de HT Para la evaluación de la pérdida neuronal dopaminérgica, la inmunohistoquímica contra la enzima HT se realizó como se describiera previamente (Tremblay y colaboradores, 2006; Gibrat y colaboradores, 2009) . En resumen, las secciones que flotaban libremente, después de varios lavados y la pre-incubación de bloqueo, se incubaron durante toda la noche a 4°C con un anticuerpo anti-TH de conejo (Pel-Freez, Rogers, AR; 1:5000). Las secciones luego se incubaron durante í hora a temperatura ambiente (RT, por sus siglas en inglés) en una solución que contenía IgG antiratón de cabra biotinilada (Vector Laboratories, Burlington, ON; 1:1500) y se colocaron subsecuentemente en una solución que contenía complejo de avidina-biotina peroxidasa (kit ABC Elite; Vector Laboratories, Burlington, ON) durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, la reacción se desarrolló en solución de tetraclorhidrato de 3 , 3 ' -diaminobencidina (DAB) (Sigma, St. Louis, O) y 0.1% de peróxido de hidrógeno al 30% (Sigma, St. Louis, MO) a temperatura ambiente. Otras secciones se trataron como antes excepto que el anticuerpo principal se omitió del medio de incubación. Estas secciones permanecieron virtualmente libres de inmunotinción y sirvieron como controles negativos. Después de la reacción de DAB, las secciones se montaron en portaobjetos revestidos con gelatina y se contratiñeron con violeta de cresilo (Sigma, St. Louis, MO) . Todas las secciones se secaron con aire finalmente, se deshidrataron en grados ascendentes de etanol, se limpiaron en xileno y se les colocó un cubreobjetos con medios de montaje DPX (Electron icroscopy Science, Hatfield, PA) .

Hibridación in situ para Nurrl y DAT Una sonda especifica de ARN complementario (ARNc) etiquetada con [35S]UTP se utilizó para evaluar los niveles de ARNm en el tejido de Nurrl, un receptor nuclear asociado con el sistema dopaminérgico (Zetterstrom y colaboradores, 1997) . La sonda de ARNc para Nurrl surge de un fragmento de EcoRI-BamHI (número de acceso de gene bank: 1504-1907 NM_ 013613) de 403 pb de un ADNc de Nurrl de ratón de longitud completa subclonado en pBluescript SK+ y linealizado con Xba I .

La sonda de DAT, un fragmento de 2238 pb de longitud, se clonó en el plásmido pBluescript II SK+. La linealización se hizo con la enzima Notl. Una sonda antisentido se sintetizó con [35S]UTP y ARN polimerasa T7.

También se generaron sondas de percepción para estos marcadores y no se obtuvo una señal especifica (los datos no se muestran) . Las secciones de cerebro se hibridizaron siguiendo los procedimientos descritos posteriormente y protocolos publicados previamente (Beaudry y colaboradores, 2000; Cossette y colaboradores, 2004; Lapointe y colaboradores, 2004).

Este protocolo in situ se condujo en condiciones libres de ARNasa. Los cortes se montaron sobre portaobjetos Snowcoat X-traMR (Surgipath, Winnipeg, Canadá) y se almacenaron bajo vacio durante toda la noche antes del uso. Las secciones de cerebro se fijaron en PFA al 4% pH 7.4 a temperatura ambiente durante 20 minutos. El pre-tratamiento se hizo con varios baños consecutivos (PBS 0.1 M dos veces durante 5 minutos, proteinasa K 0.1 g/ml 10 minutos a 37 °C, baño de acetilación (anhídrido acético al 0.25%, trietanolamina 0.1 M) 10 minutos, dos veces durante 5 minutos en solución salina estándar de citrato (SSC, por sus siglas en inglés) (NaCl 0.3 M, citrato de sodio 30 mM) ) . Los baños sucesivos de soluciones de etanol (30%, 60%, 100%, 100%; 3 minutos cada uno) se realizaron para la deshidratación . La hibridación in situ de las ribosondas en secciones de tejido se realizó a 58 °C durante toda la noche en un amortiguador de hibridación estándar (formamida desionizada al 50%, cloruro de sodio 5 M, Tris 1 M, EDTA 0.5 M, solución de Denhart 50X, sulfato de dextrano al 50%, ARNt 10 mg/mL, DTT 1 M, 35S acoplado con 2xl06 cpm/µ? de sonda) . El pos-tratamiento se condujo utilizando diferentes baños sucesivos: SSC 4X (30 minutos), remoción de los cubreob etos, SSC 2X dos veces (5 minutos) , ARNasa A 20 µg/mL (1 hora) a 37°C, agua milliQ dos veces (15 segundos), SSC 2X (15 minutos), SSC 0.5X (30 minutos) a 60°C, SSC 0.1 X (30 minutos) a 60 °C, SSC 0. IX (5 minutos) a temperatura ambiente. Los baños repetitivos de soluciones de etanol (30%, 60%, 100%, 100%; 3 minutos cada uno) se utilizaron para la deshidratación adicional. Las secciones de tejido luego se colocaron contra películas sensibles radioactivas BiomaxMR (Kodak, New Haven, CT) . Las autorradiografías se desarrollaron utilizando una exposición durante 72 horas para Nurrl y una exposición durante 5 horas para DAT.

La eliminación de la grasa se realizó con 4 baños de etanol, 2 baños de xileno y 3 baños de etanol. Después de estos pasos, los portaobjetos se sumergieron en emulsión NTB (Kodak, New Haven, CT) fundida a 42 °C, se secaron con aire durante 4 horas y se almacenaron en la oscuridad durante 5 días a 4°C. La emulsión luego se desarrolló (3.5 minutos) en desarrollador D-19 (Kodak, New Haven, CT) , se enjuagaron en agua desionizada y se fijaron (5 minutos) en solución Rapid Fixer de Kodak. Los portaobjetos se enjuagaron en agua desionizada durante 1 hora y luego se colorearon. La coloración se realizó utilizando tionina (1 minuto), seguido por agua y gotas de etanol luego 3 baños de etanol (1 minuto) y 3 baños de xileno (3 minutos) . A los portaobjetos se les colocaron los cubreobjetos con medios de montaje DPX.

Análisis de Western Blot Las muestras se homogenizaron en 8 volúmenes de amortiguador de lisis (NaCl 150 mM, NaH2P04 10 mM, Tritón X-100 al 1% (v/v), SDS al 0.5% y desoxicolato de sodio al 0.5%) que contenia un cóctel de inhibidores de proteasa (Roche, Mississauga, ON, Canadá) e inhibidores de fosfatasa (Sigma, St-Louis, MO, EUA) . Las muestras se sonicaron (3 x 10 segundos) y se centrifugaron a 100,000 g durante 20 minutos a 4°C. El sobrenadante se recolectó y se almacenó a -80°C. La concentración de proteina en cada fracción se determinó con un kit de ensayo de proteínas de ácido bicinconinico . Veinte µg de proteina total por muestra se agregaron al amortiguador de carga de Laemmli y se calentaron a 95°C durante 5 minutos. Las muestras luego se cargaron y se sujetaron a la electroforesis de gel de SDS-poliacrilamida (12%). Las proteínas se electrotransfirieron sobre membranas de PVDF ImmobilonMR de 0.45 µp\ (Millipore, Billerica, MA, EUA) y sé bloquearon en leche desnatada en polvo al 5% y BSA al 1% en PBS IX durante 1 hora. Las membranas se inmunotransfirieron con anticuerpos primarios, anti-TH de conejo (Pel-Freez; 1:5,000), anti-BAX de conejo (Cell signalling technology; Danvers, MA; 1:1,000), anti-Bcl2 de conejo (Cell signaling technology; 1:1,000), anti-actina de ratón (ABM Inc, Richmond, BC, Canadá; 1:10,000) y con anticuerpos secundarios apropiados, anti-conejo o anti-ratón de cabra (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA; 1:100,000) seguido por la adición de reactivos de quimioluminiscencia (KPL, Mandel • Scientific, Guelph, ON, Canadá) . Las intensidades de banda se cuantificaron utilizando un ImageQuant Las 4000 Digital Imaging System (Science Lab 2003 Image Gauge Software versión 4.2, Fujifilm, New Haven, CT) .

Mediciones densitométricas de niveles de ARNm de Nurrl y DAT Los niveles de etiquetado autorradiográfico se cuantificaron por medio de la densitometria computerizada . Las imágenes digitalizadas del cerebro y sus análisis se hicieron con el mismo equipo que aquel mencionado anteriormente. La densidad óptica de las autorradiográflas se tradujo en µ??/^ de -tejido utilizando estándares de radioactividad de 14C (ARC 146-14C standards, American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO) . Los niveles de ARNm de Nurrl y DAT se midieron en la substantia nigra compacta (SNc) utilizando niveles antero-posteriores similares para todas las secciones. El etiquetado promedio para cada nivel de SNc se calculó a partir de 3 secciones de cerebro adyacentes del mismo ratón. Las intensidades de fondo tomadas de áreas blancas de la substantia nigra reticulada (SNr) carentes de los niveles de ARNm de Nurrl o DAT se substrajeron de cada medición.

Cuantificación estereológica de neuronas TH-inmuno reactivas La pérdida de neuronas dopaminérgicas se determinó por medio de conteos estereológicos de células TH- inmunorreactivas (somas identificables ) bajo iluminación de campo claro. Cada 10a sección a través de la SNc se analizó utilizando el software Stereo investigatorMR (MicroBrightfield, Colchester, VT, EUA) vinculado a un microscopio E800 NikonMR (Nikon Canadá Inc., Mississauga, ON, Canadá) . Después de la delineación de la SNc a baja magnificación (objetivo 4X) , una cuadricula de puntos se colocó sobre cada sección. Para el nivel más rostral de la SNc analizada (bregma -3.08 mm) , la SNc se delineó por los limites visibles con el núcleo terminal medial. Para los niveles intermedios (bregma -3.28 mm) y más caudales de la SNc analizada (bregma -3.58 mm) , la estructura se delimitó por la salida del tercer nervio craneal. Las células inmunoteñidas se contaron por medio del método del disector óptico a una magnificación más alta (objetivo 20X) . Las variables de conteo fueron de la siguiente manera: distancia entre marcos de conteo (150 µ?? X 150 um) , tamaño de marcos de conteo (75 µ??) y espesor de zona de protección (1 µp) . Las células se contaron solo si no intercectaron lineas prohibidas. El método de disector óptico (Glaser y Glaser, 2000) se utilizó para contar las células positivas para TH (positivas para TH y violeta de cresilo) y negativas para TH (solo positivas para violeta de cresilo) . Los conteos estereológicos de células fueron realizados obcecadamente por dos. investigadores independientes. Se debe observar que los análisis de los perfiles TH-inmunorreactivos se restringieron a la SNc y de esta manera se excluyó el área del tegmento ventral (VTA, por sus siglas en inglés) .

Análisis estadísticos y preparación de imágenes Todos los análisis se expresan como medios de grupos ± S.E.M. Los datos que pertenecen al experimento no. 1 y no. 2 se evaluaron mediante un análisis ANOVA bidireccional . Cuando el análisis ANOVA bidireccional produjo términos de interacción no significativos, los datos se analizaron adicionalmente por la significación utilizando la prueba de comparación múltiple post hoc de Tukey. En todos los casos, un valor P menor que 0.05 se consideró que era significativo. Se tomaron fotomicrografías por medio del software Picture Frame (MicroBrightfield) vinculado a un microscopio E800 NikonMR (Nikon Instruments, Toronto, ON) . Las imágenes se finalizaron para la ilustración utilizando Adobe Photoshop CS3.

RESULTADOS Los efectos de la cistamina sobre el sistema dopaminérgico Efectos neuroprotectores de la cistamina en un modelo de ratón de MPTP subagudo La evaluación histológica de criterio de valoración se condujo en todos los ratones comprendidos en este estudio para investigar los efectos benéficos de la cistamina utilizando varios marcadores específicos relacionados con el sistema DA. La TH es la enzima limitante de la velocidad en la biosintesis de DA y un marcador para las neuronas DA. Nurrl es un factor de transcripción involucrado en el mantenimiento del fenotipo dopaminérgico y el transportador de dopamina, DAT, es un marcador sumamente especifico de neuronas nigroestriatales pro-dopaminérgicas y de esta manera, su expresión refleja el estado de muerte de neuronas dopaminérgicas .

El tratamiento con MPTP generó una pérdida significativa de neuronas TH-inmunorreactivas gue -se asoció con una pérdida concomitante de neuronas teñidas de Nissl en la SNpc, consistente con una degeneración de neuronas DA a diferencia de una regulación por decremento de la expresión de TH (p < 0.001, Figura 1). Esto se acompañó por una disminución significativa en los niveles de ARNm de Nurrl y DAT nigral en la SNpc (p < 0.01, Figura 2 ; p < 0.001, Figura 3) . La administración diaria de fármaco de 10 mg/kg de cistamina inició 2 días antes de la intoxicación con MPTP, confirmando su acción neuroprotectora como se reveló por la densidad de incremento de células TH-inmunorreactivas en la SNpc (p < 0.001, Figura 1), en comparación con animales no tratados con MPTP. El análisis post mortem del sistema DA en ratones pre-tratados con cistamina demostró adicionalmente la normalización de los niveles de ARNm de Nurrl (p < 0.01, Figura 2), asi como también la densidad de neuronas de SNpc gue expresaban DAT (p < 0.01, Figura 3) .

Potencial de neurorrescate d la cistamina en un modelo de ratón de MPTP subagudo Las propiedades de neurorrescate del tratamiento con cistamina se evaluaron comenzando 24 horas después de la última inyección de MPTP. En ratones pos-tratados con 10 mg/kg de cistamina, la neurotoxicidad dopaminérgica inducida por MPTP también se redujo significativamente. Los ratones tratados con cistamina después de la lesión de MPTP exhibieron un número significativamente mayor de neuronas positivas para TH y positivas para Nissl (p < 0.01, Figuras 1A-1C) asi como también un nivel más alto de ARNm de Nurrl (p < 0.5, Figuras 2A-2B) y DAT (p < 0.5, Figuras 3A-3C) , comparable a aquellos observados en ratones no tratados con MPTP.

En conjunto, las evaluaciones de estos tres marcadores específicos relacionados con el sistema DA produjeron patrones similares y mostraron los efectos benéficos de un tratamiento pos-MPTP de cistamina, que no confinan la cistamina a la neuroprotección sino que extienden las propiedades de la cistamina al neurorrescate.

Con el propósito de concluir sobre la capacidad de la cistamina para no solo prevenir (neuroprotección) sino también para detener (neurorrescate) el proceso neurodegenerativo, los inventores realizaron un estudio con el propósito de definir el curso temporal de la degeneración relacionada con DA del modelo de MPTP utilizado en estos experimentos .

Curso temporal de la degeneración de células dopaminérgicas nigrales inducida por la administración de MPTP subaguda La pérdida de neuronas positivas para TH y positivas para Nissl varió entre 20% y 27% en los grupos de MPTP sacrificados desde el día 1 hasta el día 14 después de la última inyección de MPTP, pero solo fue estadísticamente significativa en el día 7 y 14 en comparación con los grupos de solución salina correspondientes (p < 0.01, Figuras 4A-4C) . A pesar de la ausencia de una pérdida significativa de células positivas para TH en el día 1, se observó una reducción significativa en los niveles de ARNm de Nurrl y DAT en la SNpc (p < 0.05, Figuras 5A-5B) , lo que indica algo de vulnerabilidad de las neuronas DA. Por otra parte, las proteínas pro- y anti-apoptóticas , BAX y Bcl2, se incrementaron y disminuyeron respectivamente 24 horas después de la última inyección de MPTP como se evaluó por medio de los análisis de Western Blot (p < 0.05, Figuras 6A-6C) . Tomados en conjunto, estos descubrimientos indican que aunque las neuronas dopaminérgicas no han comenzado a degenerarse 24 horas después de la última inyección de MPTP, se involucran en la vía apoptótica. Notablemente, esto da soporte a que el efecto benéfico de la cistamina es de carácter de neurorrescate .

RESULTADOS Los efectos de la cistamina sobre el sistema dopaminérgico EJEMPLO 2 : Metabolismo de la cistamina y propiedades de transporte en el cerebro Animales y administración de la cistamina Los ratones macho C57BL/6 adultos jóvenes (9 semanas de edad, 25 gramos) se adquirieron de Charles River Laboratories (Montréal, QC, Canadá) . Los animales se alojaron cuatro por jaula bajo condiciones estándar con libre acceso al alimento y al agua, se aleatorizaron y se manipularon bajo las mismas condiciones por un investigador. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con the Canadian Council on Animal Care y fueron aprobados por the Institutional Committee of the Centre Hospitalier de I'Université Laval (CHUL) . Durante todo el experimento, el estado de salud de todos los ratones incluidos en el estudio se supervisó de cerca. Para identificar claramente el producto intermedio activo después de la inyección de cistamina, asi como también para entender su metabolismo sistémico y cerebral, una inyección intraperitoneal (i.p.) individual de cistamina se administró a ratones macho C57BL/6 adultos, normales utilizando tres diferentes dosis: 10, 50 y 200 mg/kg, como se determinó por publicaciones anteriores (Tremblay y colaboradores 2006; Gibrat y colaboradores 2010).

Estas dosis se compararon finalmente con inyecciones de solución salina. La cistamina se disolvió en solución salina estéril (0.9%) y se inyectó 1, 3, 12, 24 y 48 horas antes de la aniquilación. Los animales se sacrificaron bajo anestesia profunda con quetamina/xilazina y se perfusionaron por via de una infusión intracardiaca con solución salina amortiguada con fosfato 0.1 M. Después de la perfusión intracardiaca, los cerebros se recolectaron, se congelaron instantáneamente en 2-metil-butano y luego se almacenaron a -80°C hasta la disección en criostato para análisis de HPLC. Un total de 200 ratones se asignaron para este estudio (n = 10 por grupo) .

Mediciones de HFLC de cisteina y cisteamina La HPLC vinculada con la detección de fluorescencia se utilizó en la cuantificación de cisteina y cisteamina de ambos conjuntos de experimentos: el estudio de respuesta a la dosis y los procedimientos de perfusión cerebral in situ (ISCP, por sus siglas en inglés) . La corteza frontal se homogenizo en 200 µL de NaHC03 y luego se centrifugó a 15,700 g (4°C) durante 20 minutos. Cincuenta µL de sobrenadante se derivatizaron directamente con 30 µL de reactivo de 4-fluoro-7-sulfamoilbenzo-furazano (ABD-F) . La reacción de alquilación-se completó a 55°C durante 15 minutos y se detuvo con 4.9 µL de HCl 12 N. Después de la centrifugación durante 10 minutos a 7500 g (4°C), el sobrenadante se inyectó inmediatamente en el cromatógrafo que consistía de un inyector automático de tomamuestras automático Waters 717 plus ajustado a 4°C, una bomba binaria Waters 1525 equipada con una columna Atlantis dC18 (3 µ??; 3.9 x 150 mm) y un detector de Absorbencia Doble Waters 2487 (Waters limited, Lachine, QC, Canadá) . La excitación se ajustó a 385 nm y la emisión a 515 nm. La fase móvil, la cual consistió de metanol al 2.5% y acetato de amonio 0.1 M ajustado a pH 4.0, se suministró a 1 mL/minuto (Santa y colaboradores 2006) . Los picos se identificaron y se cuantificaron utilizando el software BreezeMR (Waters limited) . Las cuantificaciones de HPLC se normalizaron a las concentraciones de proteina. Las mediciones de proteina se determinaron con un kit de ensayo de proteina de ácido bicinconinico (Pierce, Rockford, IL, EUA) como se describe por el protocolo del fabricante.

Mediciones de HPLC de taurina e hipotaurina La taurina y la hipotaurina se midieron por medio de HPLC vinculada con la detección de UV. El sobrenadante de NaHC03 extractos de cerebro (bregma 1.54 a -0.58 mm) (véase la sección anterior para los detalles) se derivatizó directamente con el reactivo cloruro de dansilo (Sigma-Aldrich, St . Louis, MO, EUA) con base en métodos publicados, modificados (Sailer y Czupryna 1989; Calón y colaboradores 1999). En resumen, 50 L de cloruro de dansilo (1.2 mg/mL) y 50 µ?, de muestra o solución estándar se mezclaron y luego se incubaron durante 30 minutos a 90°C. Después de la 7 centrifugación durante 10 minutos a 7500 g (4°C), los sobrenadantes se inyectaron inmediatamente en el cromatógrafo descrito anteriormente. La absorbancia se ajustó a 337 nm y la sensibilidad a una escala completa de unidad de absorbancia 0.5. La fase móvil consistió de una mezcla de agua-acetonitrilo (88.5-11.35% en v/v) que contenia 0.15% (v/v) de ácido fosfórico y se suministró a una velocidad de 0.8 mL/minuto. Los resultados se obtuvieron utilizando el mismo método descrito anteriormente.

Perfusión cerebral in situ La perfusión cerebral in situ (ISCP) se realizó bajo anestesia profunda motivada por una inyección i.p. de una mezcla de quetamina/xilazina (140/8 mg/kg) y como se describiera previamente (Dagenais y colaboradores 2000; Ouellet y colaboradores 2009) . Para asegurar que 100% del perfusado alcanzó la BBB, se insertó un catéter en la arteria carótida, común, derecha después de la ligadura de la ramificación externa (véase la Figura 3a para una representación esquemática) . Luego se abrió el tórax, el corazón se retiró y la perfusión inició inmediatamente a un caudal de 2.5 mL/minuto. La solución de perfusión consistió de solución salina fisiológica amortiguada con bicarbonato: NaCl 128 mM, N.aH-C03 24 mM, KC1 4.2 mM, NaH2P04 2.4 mM, CaCl2 1.5 mM, MgCl2 0.9 mM y D-glucosa 9 mM. La solución se gasificó con 02 al 95% y C02 al 5% para obtener un pH de 7.4 y se calentó subsecuentemente a 37°C. En todos los experimentos, un trazador radioetiquetado (14C-sacarosa 0.3 µa/mL) se co-perfusionó con cisteamina (259 µ?) y cisteina (165 µ?) , como un marcador de la integridad de BBB y del volumen vascular. Cuatro grupos distintos de ratones Cándidos (n = 3) se evaluaron en este estudio y se perfusionaron con cisteina, cisteamina, ambas moléculas con la 14C-sacarosa sola la cual sirvió como el control.

El procedimiento se terminó mediante la decapitación del ratón después de 60 segundos de perfusión. El hemisferio cerebral derecho se recolectó y la corteza frontal se diseccionó y se congeló rápidamente sobre hielo seco para las mediciones de HPLC de cisteina y cisteamina.

El tejido cerebral restante de este hemisferio se digirió en 2 mL de SolvableMR ( Perkin-Elmer Life Sciences, Waltham, MA, EUA) a 50°C durante 48 horas y se mezcló con 9 mL de cóctel de centelleo HisafeMR (Perkin-Elmer Life Sciences) . Las alícuotas del fluido de perfusión se tomaron antes de agregar el marcador radioetiquetado para la cuantificación de HPLC y después de su paso a través de la jeringa y catéter para el conteo de centelleo, al final de cada experimento, para el cálculo del coeficiente de transporte en el cerebro (véase la ecuación posterior) . El isótopo 14C se contó en la digestión de cerebro y en el perfusado en un contador de centelleo WallacMR (Perkin-Elmer Life Sciences) . Los coeficientes de aclaramiento de captación de cisteina y cisteamina (Clup; µL/g/s) se calcularon a partir del volumen medido de distribución de cisteina y cisteamina, corregido con el espacio vascular determinado con la 14C-sacarosa . El espacio vascular fue constante y bajo 20 µL/g. La siguiente ecuación se utilizó para cálculos finales, como se describiera previamente (Dagenais y colaboradores 2000) .

Clup (µ? g'1 s'1) = Vd, en la cual Vd = c¡steina - Xi sacarosa T Cpsrí. de cisteina Cperf. de sacarosa Vd ^L/g) representa el volumen de distribución del compuesto de estudio, T (s) es el tiempo de perfusión, cisteina (ng/mg de tejido) o Sacarosa (dpm/g) es la cantidad de cisteina o sacarosa encontrada en la corteza frontal o en el tejido restante del hemisferio, respectivamente. C es la concentración (nq/µL; dpm/mL) en la solución de perfusión (la cisteina sirve como un ejemplo en la ecuación anterior) .

Datos y análisis estadísticos Todos los datos se expresan como media de grupo ± S.E.M. Los datos se evaluaron por medio de un análisis ANOVA bidireccional y se analizaron por la significación utilizando la prueba t de Student . Cada grupo se comparó con el grupo de 0 mg/kg de los puntos de tiempo asociados (1, 3, 12, 24 o 48 horas) . Para los experimentos de ISCP, la prueba t de Student se utilizó para analizar la significación. En todos los casos, un valor p menor que 0.05 se consideró que era significativo .

Resultados Efecto general de la administración de cistamina Por todo el estudio de respuesta a la dosis, no se reportaron muertes y todos los ratones exhibieron una buena salud excepto por el grupo de 200 mg/kg de cistamina donde los ratones exhibieron síntomas de hipotermia (estremecimiento) y somnolencia (cierre de los párpados) durante un periodo de aproximadamente 2 horas, como se reportó previamente (Gibrat y colaboradores 2010) .

Niveles de cisteina y cisteamina en plasma y cerebro después de la administración de cistamina Para investigar los metabolitos encontrados en el plasma y el cerebro de ratones inyectados . con una dosis i.p. individual de cistamina, un método de HPLC sumamente susceptible se utilizó y permitió medir específicamente la cisteamina y la cisteina a través de una derivatización de tiol (-SH) utilizando un compuesto ABD-F antes de la detección de la fluorescencia (Figura 7A) . La cisteamina no fue detectable en el plasma de ratones tratados con cistamina. Contrario a la expresión corporal, los análisis cerebrales de las concentraciones de cisteamina y cisteina revelaron un incremento notable en la cisteamina en el cerebro (Figura 7B) . Este incremento se observó para las tres dosis de cistamina administradas y en cada punto de tiempo fijado como objetivo por este estudio de respuesta a la dosis. El análisis ANOVA bidireccional reveló diferencias significativas para ambos factores; dosis y tiempo asi como también una interacción significativa entre esos dos factores (p < 0.0001). Los análisis post hoc revelaron incrementos significativos específicamente a 1 hora después de la inyección para las dosis de 50 mg/kg (p < 0.05) y 200 mg/kg (p < 0.01). Los niveles de cisteamina permanecieron elevados significativamente 3 horas después de la administración de cistamina (p < 0.01) y disminuyeron progresivamente a través de 48 horas, en comparación con el grupo de solución salina. La administración de cistamina no afectó los niveles de cisteina en plasma (los datos no se muestran) o el cerebro, incluso en la dosis más alta de 200 mg/kg (Figura 7C) . No hubo indicaciones de algún cambio significativo en los niveles de cisteina en plasma y/o el cerebro para ninguna de las dosis o puntos de tiempo estudiados.

Niveles de hipotaurina y taurina en plasma y cerebro después de la administración de cistamina La hipotaurina es un metabolito principal de la cisteamina, el' cual, en parte, puede generar taurina. Para determinar la concentración de estas dos moléculas, se utilizó una derivatización de grupos amino primarios con cloruro de dansilo antes de la detección de UV (Figura 8A) .

Esta reacción tiene lugar en amina tanto aromática como alifática, lo que produce aductos de sulfonamida estables y permite la detección de tanto hipotaurina (Figura 8A; compuesto 2) como taurina (Figura 8A; compuesto 1) dentro del mismo método. A pesar de alguna variación entre los grupos, no se observó una alteración significativa de la hipotaurina y la taurina en el cerebro para ninguna de estas tres dosis (10, 50 o 200 mg/kg) y en comparación con los grupos de control (Figuras 8B y 8C) . No hubo síntomas de acumulación de hipotaurina y taurina en el cerebro en ninguno de los puntos de tiempo de la aniquilación (1, 3, 12, 24 y 48 horas) . Los niveles en plasma permanecieron debajo o cerca del umbral de detección .

La cisteina facilita el transporte de clsteamlna en el cerebro Como una gran mayoría de compuestos endógenos y exógenos son inactivos en el CNS debido a que no cruzan la BBB, los inventores investigaron la captación de cisteamina y cisteina en el cerebro. Utilizando ISCP, los inventores midieron los parámetros de transporte de cisteamina y cisteina en la sangre-cerebro al infusionar directamente el cerebro por vía de la arteria carótida (Dagenais y colaboradores 2000; Ouellet y colaboradores 2009) (Figura 9A) . Tanto la cisteina como la cisteamina cruzaron la BBB, como se observó por su coeficiente de transporte en el cerebro (Clup), el cual correspondió a 4.39 ± 0.47 y 0.15 ± 0.02 µ??,/^/d, respectivamente (Figuras 9B y 9C) . En comparación, un fármaco del CNS utilizado rutinariamente, como la morfina, exhibe un Clup de 0.3 µ!_.^/3, mientras que los fármacos sumamente difundibles como diazepam o ácidos grasos exhiben un Clup el cual alcanza hasta 40 µ??/^/? (Bourasset y colaboradores 2003; Ouellet y colaboradores 2009) . De un modo interesante, la co-perfusión de cisteina y cisteamina incrementó el efecto de su absorción en el cerebro. En realidad, un incremento significativo del Clup de cisteamina (+133%, p < 0.05) y de cisteina (+59% p < 0.05) se midió cuando ambos compuestos se inyectaron simultáneamente. La hipotaurina y la taurina, las cuales se ha mostrado que cruzan la BBB, no se reevaluaron (Benrabh y colaboradores 1995) .

EJEMPLO 3 Propiedades de neurorrescate y neurorreconstitución de cistamina después de la administración xntraestriatal de 6-OHDA Material y método Animales Los ratones macho C57BL/6 adultos jóvenes (9 semanas de edad, 25 gramos) se adquirieron de Charles River Laboratories (Montréal, QC, Canadá) . Los animales se alojaron 4 por jaula bajo condiciones estándar con libre acceso al alimento y al agua, se aleatorizaron y se manipularon bajo las mismas condiciones por un investigador. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con the Canadian Council on Animal Care y fueron aprobados por the Institutional Committee of the Centre Hospitalier de I'Université Laval (CHUL) . Durante todo el experimento, el estado de salud de todos los ratones incluidos en el estudio se supervisó de cerca por la pérdida de peso u otros síntomas de problemas relacionados con la salud. No se escatimaron esfuerzos para minimizar el dolor e incomodidad de los animales.

Tratamiento con 6-OHDA y cistamina Este protocolo se basó en la inyección intra-estriatal, estereotáxica, unilateral de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) . La administración intraestriatal de 6-OHDA crea cambios degenerativos, progresivos y retrógrados en las neuronas DA de la substantia nigra (Bjorklund y colaboradores, 1997; Costantini y colaboradores, 2001). Los ratones se anestesiaron utilizando isoflurano y se colocaron en un marco estereotáctico adaptado para ratones. La 6-OHDA se disolvió a una concentración de 2 µg/µl en solución salina al 0.9% y ácido ascórbico al 0.02% y se inyectaron 2 µ? en el cuerpo estriado derecho a una velocidad de 0.5 µ?/minuto. La aguja se dejó en este lugar durante 3 minutos después de la inyección antes de la retracción. La inyección se realizó utilizando una jeringa Hamilton de acuerdo con las coordenadas estereotáxicas : AP: +0.04 cm, ML: -0.18 cm, DV: -0.31 cm (que corresponden al atlas de Alian P. 2008).

Para servir como controles, otros ratones se sujetaron a los mismos procedimientos quirúrgicos, pero solo se inyectaron 2 µ? de solvente (solución salina al 0.9% y ácido ascórbico al 0.02%) en las mismas coordenadas. El estudio se dividió adicionalmente en 2 experimentos distintos : 1) Los efectos de neurorrescate de la cistamina (diclorhidrato de cistamina, Sigma, St . Louis, MO) en ratones lesionados con 6-OHDA. Para este experimento, la primera inyección i.p. de 10 mg/kg de cistamina se administró 3 días después de la cirugía y el tratamiento continuó diariamente durante 14 días. 2) Los efectos de neurorrestauración de cistamina (diclorhidrato de cistamina, Sigma, St. Louis, MO) en ratones lesionados con 6-OHDA. El tratamiento de cistamina comenzó 3 semanas después de la cirugía, cuando se sabe que la lesión dopaminérgica (DAérgica) es estable y ha alcanzado su punto máximo. El tratamiento se continuó diariamente durante 6 semanas .

Los efectos de la cistamina sobre la toxicidad de 6-OHDA se estudiaron en los siguientes grupos experimentales: Grupo I, Simulacro + Solución Salina; Grupo II, 6-OHDA + Solución Salina; Grupo III; Simulacro + Cistamina; Grupo IV, 6-OHDA + Cistamina. En total, 40 ratones (n=10 por grupo) se utilizaron para cada experimento, se supervisaron diariamente por la variación del peso y se sacrificaron finalmente por medio de la perfusión 24 horas después de la última inyección de cistamina (o vehículo) . Los resultados se muestran en las Figuras 10A-10E, 11A-11D y 12A-12.

Perfusión y procesamiento de tejido Los animales se sacrificaron bajo anestesia profunda con quetamina/xilazina (Vetalar, Bioniche, Belleville, ON/Rompun, Bayer, Toronto, ON) . Todos los ratones se sujetaron a una perfusión intracardíaca con solución salina amortiguada con fosfato 0.1 libre de ARNasa (PBS). Después de la perfusión intracardíaca, los cerebros se recolectaron y el cerebro posterior de cada ratón, que comprendía el mesencéfalo completo, se pos-fijó en PFA al 4% para análisis adicionales de inmunohistoquímica e hibridación in situ. El cerebro anterior, que comprende el cuerpo estriado derecho e izquierdo, se congeló instantáneamente y se utilizó para análisis de HPLC y WB.

La cuantificación de catecolamina por medio de HPLC, la inmunohistoquímica de TH y la hibridación in situ para Nurrl y DAT se condujeron como se describe en el Ejemplo 1.

Mediciones densitometricas de niveles de ARNm de Nurrl y DAT Los niveles de etiquetado autorradiográfico se cuantificaron por medio de la densitometría computarizada .

Las imágenes digitalizadas del cerebro y su análisis se hicieron con el mismo equipo que aquel mencionado anteriormente. La densidad óptica de las autorradiografias se tradujo en µ??/^ de tejido utilizando estándares de radioactividad de 14C (ARC 146-14C standards, American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO) . Los niveles de ARNm de Nurrl y DAT se midieron en la substantia nigra compacta (SNc) utilizando niveles antero-posteriores similares para todas las secciones. El etiquetado promedio para cada nivel de SNc se calculó a partir de 3 secciones de cerebro adyacentes del mismo ratón. Las intensidades de fondo tomadas de áreas blancas de la substantia nigra reticulata (SNr) carentes de los niveles de ARNm de Nurrl o DAT se sustrajeron de cada medición.

Cuantificación estereológica de neuronas TH-inmunorreactivas La pérdida de neuronas dopaminérgicas se determinó por medio de conteos estereológicos de células TH-inmunorreactivas (somas identificables ) bajo iluminación de campo claro. Cada 10a sección a través de la SNc se analizó utilizando el software Stereo investigatorMR (MicroBrightfield, Colchester, VT, EUA) vinculado a un microscopio E800 NikonMR (Nikon Canadá Inc., Mississauga, ON, Canadá) . Después de la delineación de la SNc a baja magnificación (objetivo 4X) , una cuadricula de puntos se colocó sobre cada sección. Para el nivel más rostral de la SNc analizada (bregma -3.08 mm) , la SNc se delineó por los limites visibles con el núcleo terminal medial. Para los niveles intermedios (bregma -3.28 mm) y más caudales de la SNc analizada (bregma -3.58mm), la estructura se delimitó por la salida del tercer nervio craneal. Las células inmunoteñidas se contaron por medio del método del disector óptico a una magnificación más alta (objetivo 20X) . Las variables de conteo fueron de la siguiente manera: distancia entre marcos de conteo (150 µp? X 150 µp?) , tamaño de marcos de conteo (75 um) y espesor de zona de protección (1 µp?) . Las células se contaron solo si no intercectaron lineas prohibidas. El método de disector óptico (Glaser y Glaser, 2000) se utilizó para contar las células de expresión positivas para TH (positivas para TH y violeta de cresilo) y negativas para TH (solo positivas para violeta de cresilo) . Los conteos estereológicos de células fueron realizados obcecadamente por dos investigadores independientes. Se debe observar que los análisis de los perfiles TH-inmunorreactivos se restringieron a la SNc y de esta manera se excluyó el área del tegmento ventral (VTA, por sus siglas en inglés) .

Rotación inducida por apomorfina El comportamiento giratorio se considera que representa una medida fisiológica confiable del agotamiento de DA y la estimulación asimétrica de receptores de DA. Al aplicar agonistas de DA tal como la apomorfina (Anden y colaboradores, 1966; Ungerstedt y colaboradores, 1968) , los receptores de DA son estimulados directamente lo que conduce a una rotación contralateral al hemisferio agotado en DA. Los ratones se desafiaron con apomorfina (0.5 mg/kg, Sigma- Aldrich) en 3, 6 y 9 semanas después de la lesión y los comportamientos giratorios se evaluaron durante 45 minutos utilizando un sistema de rotómetro automatizado. Los ' resultados se promediaron y se expresaron como una rotación neta (= número de rotaciones contralaterales - número de rotaciones homolaterales ) como se describe previamente (Metz 2002). Los animales se dejaron habituarse durante 5 minutos después de la inyección antes de que comenzara el registro de las rotaciones.

Prueba de desplazamiento La prueba de ajuste de pasos se adaptó de los estudios en ratas (Lindner y colaboradores, 1995) y ratones tratados con MPTP (Blume y colaboradores, 2009) . Los ratones se sujetaron por la base de la cola con sus extremidades posteriores suspendidas sobre la mesa y se movieron hacia atrás a una velocidad constante de modo que recorrieron 1 metro de distancia durante 3-4 s. Los ratones se grabaron en video utilizando una cámara de video digital (Sony Handcam, DCR-HC90E PAL) , pero el video se analizó fuera de linea al contar el número de ajuste de pasos hecho con la pata contralateral o homolateral, en relación con el hemisferio lesionado, sobre la distancia total. Se realizaron tres ensayos en ratones a 3 semanas, 6 semanas y 9 semanas después de la cirugía y los datos intermedios se calcularon en todos los ensayos.

Prueba de cilindro La prueba de asimetría de uso de extremidades (cilindro) , la cual mide los movimientos de las extremidades anteriores que cargan el peso durante el erguimiento, se ha mostrado que es un buen indicador de la pérdida de células nigroestriatales en ratas y ratones inyectados con 6-OHDA unilateral (Schallert y colaboradores, 2000; Tillerson y colaboradores, 2001; Lundblad y colaboradores, 2004; Lancu y colaboradores, 2005). Para examinar la desviación lateral en el uso espontáneo de las extremidades anteriores durante la actividad de exploración, los ratones se colocaron individualmente dentro de un cilindro de vidrio (10 centímetros de diámetro, 14 centímetros de altura) , el cual se localizó al frente de dos espejos verticales con el propósito de poder observar los ratones desde todos los ángulos. Los ratones se grabaron en video inmediatamente durante 3 minutos. No se permitió la habituación de los animales al cilindro de prueba antes de la grabación en video. Las grabaciones en video luego se examinaron para contar el número de toques en la pared de soporte (contactos con los dedos completamente extendidos) ejecutados independientemente con la extremidad anterior homolateral y contralateral respecto a la lesión. Una medida de la asimetría del uso de las extremidades anteriores se obtuvo al expresar los toques realizados por la pata contralateral respecto a la lesión (pata derecha) como un porcentaje del número total de toques en cada lesión.

Análisis estadísticos Todos los análisis se expresan como promedio de grupo ± S.E. . Los datos se evaluaron por medio de un análisis ANOVA bidireccional . Cuando el análisis ANOVA bidireccional produjo términos de interacción no significativos, los datos se analizaron adicionalmente por la significación utilizando la prueba de comparación múltiple post hoc de Tukey. En todos los casos, un valor P menor que 0.05 se consideró que era significativo.

REFERENCIAS : Alien P. Alien brain atlas. Seattle ( A) : Alien Institute for . Brain Science; 2008. Disponible de: http : //www. brain-map . org ..

Anden, N.E., Dahlstrom, A., Fuxe, K. , Larsson, K., 1966.

Functional role of the nigrostriatal dopamine neurons. Acta Pharmacol. Toxicol. 24,236-274.

Bacq Z. M . y Beaumariage M. L. (1965) Radioprotective action of cysteamine and cystamine in mice as a function of the period of time between injection of the protector and the start of X-Ray irradiation. Aren. Int. Pharmacodyn. Ther 153, 457-459.

Beaudry G, Langlois MC, eppe I, Rouillard C, Levesque D. Contrasting (2000) patterns and cellular specificity of transcriptional regulation of the nuclear receptor nerve growth factor-inducible B by haloperidol and clozapine in the rat forebrain. J Neurochem 2000; 75:1694-702.

Benrabh H., Bourre J. . y Lefauconnier J. M . (1995) Taurine transport at the blood-brain barrier: an in vivo brain perfusión study. Brain Res. 692, 57-65.

Bjorklund, A., Rosenblad, C, Winkler, C, Kirik, D., 1997. Studies on neuroprotective and regenerative effects of GDNF in a partial lesión model of Parkinson' s disease. Neurobiol Dis 4, 186-200.

Blume SR, Cass DK, Tseng KY. Stepping test in mice: a reliable approach in determining forelimb akinesia in MPTP-induced Parkinsonism. Exp Neurol 2009;219:208-11.

Borrell-Pages M . , Canals J. M . , Cordelieres F. P. y colaboradores (2006) Cystamine and cysteamine increase brain levéis of BDNF in Huntington disease via HSJlb and transglutaminase . J. Clin. Invest 116, 1410-1424.

Bouckenooghe T . , Remacle C. y Reusens B. (2006) Is taur-ine a functional nutrient? Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care 9, 728-733.

Bourasset F. , Cisternino S., Temsamani J. y Scherrmann J. M. (2003) Evidence for an active transport of morphine-6-beta-d-glucuronide but not P-glycoprotein-mediated at the blood-brain barrier. J. Neurochem. 86, 1564-1567.

Bousquet M, Gibrat C, Saint-Pierre M, Julien C, Calón F, Cicchetti F. Modulation of brain-derived neurotrophic factor as a potential neuroprotective mechanism of action of omega-3 fatty acids in a parkinsonian animal model. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 de Noviembre de 2009;33 (8) : 1401-8. Epub 24 de Julio de 2009.

Bousquet M . , Gibrat C, Ouellet M. , Rouillard C, Calón F. y Cicchetti F. (2010) Cystaminemetabolism and brain transport properties: clinical implications for neurodegenerative diseases. J. Neurochem. (2010) 114, 1651-1658.

Bousquet M, Gue K, Emond V, Julien P, Kang JX, Cicchetti F, Calón F. Transgenic conversión of omega-6 into omega-3 fatty acids in a mouse model of Parkinson's disease. J Lipid Res. (2011) Feb;52(2) :263-71. Epub 29 de Noviembre de 2010.

Calón F . , Morissette M., Goulet M., Grondin R. , Blanchet P. J., Bedard P. J. y Di Paolo T. (1999) Chronic DI and D2 dopaminomimetic treatment of MPTP-denervated monkeys: effects on basal ganglia GABA (A) /benzodiazepine receptor complex and GABA content. Neurochem. Int 35, 81-91.

Calón F. y colaboradores, Effect of MPTP-induced denervation on basal ganglia GABA(B) receptors: correlation with dopamine concentrations and dopamine transporter. Synapse 1 de Junio de 2001; 40 (3) :225-34.

Calón F. y colaboradores, Changes of GABA receptors and dopamine turnover in the postmortem brains of parkinsonians with levodopa-induced motor complications . Mov Disord. Marzo de 2003; 18 (3) :241-53.

Cavallini D . , Scandurra R. y Demarco C. (1963) The enzymatic oxidation of cysteamine to hypotaurine in the presence of sulfide. J. Bio. Chem. 238, 2999-3005.

Coloso R. M . , Hirschberger L. L . , Dominy J. E . , Lee J.

I. y Stipanuk M. H (2006) Cysteamine dioxygenase: evidence for the physiological conversión of cysteamine to hypotaurine in rat and mouse tissues. Adv. Exp. Med. Biol. 583, 25-36.

Costantini LC, Colé D, Chaturvedi P, Isacson O. Immunophilin ligands can prevent progressivedopaminergic degeneration in animal models of Parkinson' s disease. Eur' J Neurosci. Mar.

Cossette M, Parent A, Levesque D. Tyrosine hydroxylase-positive neurons intrinsic to the human striatum express the transcription factor Nurrl. Eur J NeuroSci. 2004;20:2089-95.

Dagenais C, Rousselle C, Pollack G. M. y Scherrmann J. M. (2000) Development of an in situ mouse brain perfusión model and its application to mdrla P-glycoprotein- deficient mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 20, 381-386.

Dedeoglu A., Kubilus J. K., Jeitner T. M. y colaboradores (2002) Therapeutic effects of cystamine in a murine model of Huntington's disease. J. Neurosci. 22, 8942-8950.

Dohil R., Fidler M. , Gangoiti J. A., Kaskel F. , Schneider J. A. y Barshop B. A. (2009) Twice-daily cysteamine bitartrate therapy for children with cystinosis. J. Pediatr. 156, 71-75.

Dominy J. , Eller S. y Dawson R. Jr (2004) Building biosynthetic schools: reviewing compartmentation of CNS taurine synthesis. Neurochem. Res. 29, 97-103.

Dominy J. E. Jr, Simmons C. R. , Hirschberger L. L., Hwang J. , Coloso R. . y Stipanuk M. H. (2007) Discovery and characterization of a second mammalian thiol dioxygenase, cysteamine dioxygenase. J. Biol. Chem. 282, 25189-25198.

Dubinsky R. y Gray C. (2006) CYTE-I-HD: phase I dose finding and tolerability study of cysteamine (Cystagon) in Huntington's disease. Mov. Disord. 21, 530-533.

Ewetz L. y Sorbo B. (1966) Characteristics of the cysteinesulfinate-forming enzyme system in rat liver. Biochim. Biophys . Acta 128, 296-305.

Fox J. H., Barber D. S., Singh B. y colaboradores (2004) Cystamine increases L-cysteine levéis in Huntington' s disease transgenic mouse brain and in a PC12 model of polyglutamine aggregation. J. Neurochem. 91, 413-422.

French E. D., Vezzani A., Whetsell W. O. Jr . y Schwarcz R. (1986) Anti-excitotoxic actions of taurine in the rat hippocampus studied in vivo and in vitro. Adv. Exp. Med. Biol. 203, 349-362.

Gibrat C, Bousquet M., Saint-Pierre M., Levesque D., Calón F. , Rouillard C. y Cicchetti F. (2010) Cystamine prevents MPTP-induced toxicity in young adult mice via the up-regulation of the brain-d rived neurotrophic factor. Prog. Neuropsychopharmacol . Biol. Psychiatry 34, 193-203.

Gibrat C, Saint-Pierre M, Rouillard C, Cicchetti F. (2007) . Neuroprotective properties of cystamine in acute vs chronic models of Parkinson's disease. The Canadian Journal of Neurological Sciences Suppl. 3-S42.

Gibrat C, Bousquet M, Saint-Pierre M, Lévesque D, Calón F, Rouillard C, Cicchetti F.' 2009. Neuroprotective mechanisms of cystamine in a murine model of Parkinson's disease. Parkinsonism and Related Disorders 15S2, S29-S199.

Gibrat C, Saint-Pierre M, Bousquet M, Levesque D, Rouillard C, Cicchetti F. Differences between subacute and chronic MPTP mice models: investigation of dopaminergic neuronal degeneration and alpha-synuclein inclusions. J Neurochem (2009 B) ; 109:1469-82.

Green H. (1993) Human genetic diseases due to codon reiteration: relationship to an evolutionary mechanism. Cell 74, 955-956.

Huxtable R. J. (1992) Physiological actions of taurine.

Physiol. Rev. 72, 101-163.

Iancu R, Mohapel P, Brundin P, Paul G. Behavioral characterization of a unilateral 6-OHDA-lesion model of Parkinson's disease in mice. Behav Brain Res 2005;162:1-10.

Jeitner T. M., Delikatny E. J., Ahlqvist J. , Capper H. y Cooper A. J. (2005) Mechanism for the inhibition of transglutaminase 2 by cystamine. Biochem. Pharmacol. 69, 961-970.

Karpuj M. V., Becher M. W., Springer J. E . , Chabas D., Youssef S., Pedotti R. , Mitchell D . y Steinman L. (2002) Prolonged survival and decreased abnormal movements in transgenic model of Huntington . disease, with administration of the transglutaminase inhibitor cystamine. Nat. Med. 8, 143-149.

Lapointe N, St-Hilaire M, Martinoli MG, Blanchet J, Gould P, Rouillard C, et (2004) Rotenone induces non-specific central nervous system and systemic toxicity. FASEB J. 2004;18:717-9.

Lee J. I., Londono M., Hirschberger L. L. y Stipanuk M. H. (2004) Regulation of cysteine dioxygenase and gamma-glutamylcysteine synthetase is associated ith hepatic cysteine level. J Nutr. Biochem. 15, 112-122.

Lein ES, Hawrylycz MJ, y colaboradores. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature 2007;445:168-76.

Leonardi R. , Zhang Y. M., Rock C. 0. y Jackowski S. (2005) Coenzyme A: back in action. Prog. Lipid Res. 44, 125-153.

Lindner MD, Winn SR, Baetge EE, Hammang JP, Gentile FT, Doherty E y colaboradores. Implantation of encapsulated catecholamine and GDNF-producing cells in rats with unilateral dopamine depletions and parkinsonian symptoms. Exp Neurol 1995;132:62-76. 690.

Lundblad M, Picconi B, Lindgren H, Cenci MA. A model of I-DOPA-induced dyskinesia in 6-hydroxydopamine lesioned mice: relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function. Neurobiol Dis 2004;16:110-23.

Martignoni M. , Groothuis G. M. y de Kanter R. (2006) Species differences between mouse, rat, dog, monkey and human CYP-mediated drag metabolism, inhibition and induction. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 2, 875-894.

Muramatsu M . , Kakita K., Nakagawa K. y Kuriyama K. (1978) A modulating role of taurine on reléase of acetylcholine and norepinephrine from neuronal tissues. Jpn . J. Pharmacol. 28, 259-268.

Oja S. S. y Saransaari P. (1996) Taurine as osmoregulator and neuromodulator in the brain. Metab. Brain Dis. 11, 153-164.

Oldendorf . H. y Szabo J. (1976) Amino acid assigmnent to one of three blood-brain barrier amino acid carriers . Am.

J. PhysiQl. 230, 94-98.

Ouellet M . , Emond V., Chen C. T . , Julien C, Bourasset F. , Oddo S., LaFerla E, Bazinet R. P. y Calón F. (2009) Diffusion of docosahexaenoic and eicosapentaenoic acids through the blood-brain barrier: and in situ cerebral perfusión study. Neurochem. Int. 55, 416-482.

Pasantes-Morales H . , Arzate N. E. y Cruz C. (1981) The role of taurine in nervous tissue: its effects on ionic fluxes. Adv Exp Med Biol 139, 273-292.

Pinto J. T., Van Raamsdonk J. . , Leavitt B. R., Hayden M. R., Jeitner T. M . , Thaler H. T., Krasnikov B. F. y Cooper A. J. (2005) Treatment of YAC128 mice and their wild-type littermates with cystamine does not lead to its accumulation in plasma or brain: implications for the treatment of Huntington disease. J Neurochem 94, 1087-1101.

Pinto J. T., Khomenko T., Szabo S., McLaren G. D., Dentón T. T . , Krasnikov B. F . , Jeitner T. M. y Cooper A. J. ¦ (2009) Measurement of sulfur-containing compounds involved in the metabolism and transport of cysteamine and cystamine. Regional differences in cerebral metabolism. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 877, 3434-3441.

Pitari G., Maurizi G. , Flati V., Ursini C. L., Spera L., Dupre S. y Cavallini D. (1992) Enzymatic synthesis of S-aminoethyl-L-cysteine from pantetheine. Biochim Biophys Acta 1116, 27-33.

Saller C. F. y Czupryna M. J. (1989) gamma-Aminobutyric acid, glutamate, glycine and taurine analysis using reversed-phase high-performance liquid chromatography and ultraviolet detection of dansyl chloride derivatives. J Chromatogr '487, 167-172.

Santa T . , Aoyama C, Fukushima T., Imai K. y Funatsu T. (2006) Suppression of thiol exchange reaction in the determination of reduced-form thiols by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection after derivatization with fluorogenic benzofurazan reagent, 7-fluoro-2 , 1, 3-benzoxadiazole-4-sulfonate and 4-aminosulfonyl- 7-fluoro-2, 1, 3-benzoxadiazole . Biomed Chromatogr 20, 656-661.

Schallert T, Fleming SM, Leasure JL, Tillerson JL, Bland S . CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury.

Neuropharmacology 2000; 39: 777-87.

Sershen H. y Lajtha A. (1979) Inhibition pattern by analogs indicates the presence of ten or more transport systems for amino acids in brain cells. J Neurochem 32, 719- 726.

Stack E. C, Ferro J. L . , Kim J. , Del Signore S. J., Goodrich S., Matson S., Hunt B. B . , Cormier K. , Smith K., Matson W. R . , Ryu H. y Ferrante R. J. (2008) Therapeutic attenuation of mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurotoxin models of Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta 1782, 151-162.

Sun L . , Xu S., Zhou . , ang C . , Wu Y . y Chan P. (2010) Effects of cysteamine on MPTP-induced dopaminergic neurodegeneration in mice. Brain Res. 1335, 74-82.

Tillerson JL, Cohén AD, Philhower J, Miller G , Zigmond MJ, Schallert T. Forced limb-use effects on the behavioral and neurochemical effects of 6-hydroxydopamine . J Neurosci 2001;21:4427-35.

Tremblay M. E., Saint-Pierre M., Bourhis E . , Levesque D . , Rouillard C. y Cicchetti F. (2006) Neuroprotective effects of cystamine in aged parkinsonian mice . Neurobiol Aging 27, 862-870.

Ungerstedt, U., 1968. 6-Hydroxydopamine-induced degeneration of. central monoamine neurons. Eur. J. Pharmacol. 5, 5107-5110.

Wade L. A. y Katzman R. (1975) Synthetic amino acids and the nature of L-DOPA transport at the blood-brain barrier. J Neurochem 25, 837-842.

Wade L. A. y Brady H. M. (1981) Cysteine and cystine transport at the blood-brain barrier. J Neurochem 37, 730-734.

Wang X., Sarkar A., Cicchetti F . , Yu M . , Zhu A . , Jokivarsi K . , Saint-Pierre . y Brownell A . L. (2005) Cerebral PET imaging and histological evidence of transglutaminase inhibitor cystamine induced neuroprotection in transgenic R6/2 mouse model of Huntington' s disease. J Neurol Sci 231, 57-66.

Zetterstrom, Rolf H. Ludmila Solomin, Lottie Jansson, Barry J. Hoffer, Lars Olson, Thomas Perlmann. Dopamine neuron agenesis in Nurrl-deficient mice. Science 11 de Abril de 1997,-276 (5310) :248-50.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. El uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para modificar el progreso de la enfermedad de Parkinson en un paciente.

2. El uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo como un agente de neurorrescate para modificar el progreso de la enfermedad de Parkinson en un paciente.

3. El uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo como un agente de neurorrestauración para modificar el progreso de la enfermedad de Parkinson en un paciente.

4. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para reducir la fatiga en un paciente con la enfermedad de Parkinson.

5. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para reducir la gravedad de síntomas, no motores en un paciente con la enfermedad de Parkinson.

6. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para reducir la decadencia funcional en un paciente con la enfermedad de Parkinson.

7. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para reducir el progreso clínico de la enfermedad.

8. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para disminuir la velocidad del progreso clínico de la enfermedad.

9. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el paciente es un paciente con la enfermedad de Parkinson en etapa inicial.

10. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el paciente con la enfermedad de Parkinson en etapa inicial es un paciente en etapa III o IV de acuerdo con la clasificación de Hoehn y Yahr .

11. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el paciente con la enfermedad de Parkinson es un paciente con etapa III de acuerdo con la clasificación de Hoehn y Yahr.

12. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo está en el intervalo de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 750 mg/kg de peso corporal al día.

13. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo está en el intervalo de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 60 mg/kg/día.

14. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo está en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mg/kg/día.

15. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo es adecuada para ser administrada en una forma de dosificación unitaria que contiene de 5 a 2000 mg de ingrediente activo por forma de dosificación unitaria.

16. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo es adecuada para ser administrada en una forma de dosificación unitaria que contiene de 10 a 1500 mg de ingrediente activo por forma de dosificación unitaria.

17. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo es adecuada para ser administrada en una forma de dosificación unitaria que contiene de 20 a 1000 mg de ingrediente activo por forma de dosificación unitaria.

18. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un análogo de cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo es adecuada para ser administrada en una forma de dosificación unitaria que contiene de 50 a 700 mg de ingrediente activo por forma de dosificación unitaria.

19. Una combinación, caracterizada porque comprende por lo menos un análogo de cistamina y cisteina o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para modificar el progreso de la enfermedad de Parkinson.

20. La combinación de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el análogo de cistamina y cisteina están presentes en una relación de 10:1 a 1:10 de análogo de cistamina y cisteina, respectivamente.

21. La combinación de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el análogo de cistamina y cisteina están presentes en una relación de 1:1.

22. La combinación de conformidad con las reivindicaciones 19, 20 o 21, caracterizada porque el análogo de cistamina y el agente adicional son adecuados para utilizarse secuencialmente .

23. La combinación de conformidad con las reivindicaciones 19, 20 o 21, caracterizada porque el análogo de cistamina y el agente adicional son adecuados para utilizarse simultáneamente.

24. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende por lo menos un análogo de cistamina o sales farmacéuticamente aceptables del mismo y que comprende cisteina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

25. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el análogo de cistamina y cisteina están presentes en una relación de 10:1 a 1:10 del análogo de cistamina y cisteina, respectivamente.

26. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el análogo de cistamina y cisteina están presentes en una relación de 1:1.

27. La composición de conformidad con las reivindicaciones 24, 25 o 26, caracterizada porque el análogo de cistamina y el agente adicional son adecuados para utilizarse secuencialmente .

28. La composición de conformidad con las reivindicaciones 24, 25 o 26, caracterizada porque el análogo de cistamina y el agente adicional son adecuados para utilizarse simultáneamente.

29. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28 o la combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, en donde el análogo de cistamina es cisteamina, cistamina, taurina o hipotaurina o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas.

30. El uso de conformidad, con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28 o la combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, en donde el análogo de cistamina es cistamina o cisteamina o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas .

31. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28 o la combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, en donde el análogo de cistamina es cistamina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

32. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28 o la combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, en donde el análogo de cistamina es cisteamina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.