BR112013021616A2

BR112013021616A2 - análogos de cistamina para o tratamento de doença de parkinson

Info

Publication number: BR112013021616A2
Application number: BR112013021616-6A
Authority: BR
Inventors: Francesca Cicchetti; Claude Rouillard; Frédéric Calon
Original assignee: UNIVERSITé LAVAL
Priority date: 2011-02-23
Filing date: 2012-02-23
Publication date: 2020-09-29
Also published as: AU2012220314A1; CA2732440C; MX2013009608A; EP2678009A1; CA2732440A1; EP2678009A4; MX350195B; JP6000985B2; AU2012220314B2; KR20140115239A; RU2630583C2; RU2013137645A; US20140073694A1; JP2014508758A; WO2012113079A1; EP2678009B1; CN103442704A

Abstract

USOS DE ANÁLOGOS DE CISTAMINA, COMBINAÇÃO E COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO OS MESMOS A presente invenção refere-se ao uso de análogos de cistamina para o tratamento da doença de Parkinson. A presente invenção também se relaciona com o uso da composição compreendendo os análogos de cistamina e cisteína. A presente invenção refere-se a um método para modificar a progressão da doença de Parkinson compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um análogo de cistamina ou um sal farmaceuticamente aceitável de um análogo de cistamina a um paciente com necessidade do mesmo.

Description

USOS DE ANÁLOGOS DE CISTAMINA, COMBINAÇÃO E COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO OS MESMOS

[001] Os tratamentos atuais para a doença de Parkinson (DP) são amplamente sintomáticos e não impedem a degeneração neuronal subjacente à progressão da doença. As propriedades da cistamina na doença de Parkinson e como na doença de Huntington tem sido estudadas em vários modelos de animais. Em modelos de animais da doença de Huntington (DH), cistamina revelou efeitos neuroprotetores, prolongando a vida útil e diminuindo os sintomas motores de camundongos portadores do gene da doença de Huntington (Dedeoglu et al. 2002, Karpuj et al. 2002). Evidência in vitro e in vivo demonstraram a capacidade da cistamina para inibir a transglutaminase, uma enzima implicada na agregados de proteínas, tais como a forma mutante da proteína huntingtina (Green 1993; Jeitner et al. 2005, Wang et al. 2005). O aumento dos níveis cerebrais do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) têm também sido apontado como um dos elementos-chave deste efeito protetor neuronal (Borrell-Pages et al., 2006). A dose alta de cistamina liberada através da água potável atenua o stress oxidativo e o efeito deletério de l-metil-4-fenil-1,2,3,6- tetra-hidropiridina (MPTP) nas funções mitocondriais (Stack et al. 2008). Os efeitos de cistamina e/ou cisteamina foram relatados num modelo de camundongo da doença de Parkinson com MPTP (Sun et al. 2010, Tremblay et al. 2006; Stack et al. 2008; Gibrat et al. 2010).

[002] O metabolismo de cistamina gera vários intermediários, incluindo não somente cisteamina, mas também hipotaurina e taurina. Cistamina e cisteamina são ambos compostos orgânicos e foram inicialmente descritos como radioprotetores (Bacaq e Beaumariage (1965). Embora a cisteamina é a forma descarboxilada de cisteína, a fonte principal resulta da sua produção constitutiva por todos os tecidos, através da degradação da coenzima A (Pitari et al. 1992), que está envolvida em processos metabólicos nomeadamente na geração de ATP através do ciclo de Krebs (Leonardi et al. 2005). Embora a cisteína é um constituinte comum da maior parte das proteínas (Lee et al. 2004), os níveis plasmáticos de cisteína basais são geralmente baixos, porque a sua tiol é susceptível a oxidação e leva para o derivado de dissulfeto de cistina.

[003] Cisteamina, a forma reduzida da cistamina (2- aminoeth-anethiol) está aprovada para o tratamento da cistinose, um distúrbio da infância que provoca insuficiência renal através da acumulação intracelular de cistina (Dohil et al. 2009). Porque cisteamina demonstrou eficácia significativa em modelos de camundongos da doença de Huntington (Borrell-Pages et al. 2006) e sua segurança tem sido documentada, a molécula está atualmente em desenvolvimento para os pacientes que sofrem deste distúrbio (Dubinsky e Gray, 2006).

[004] Um estudo preliminar com bitartarato de cisteamina (CYSTAGONO) foi realizado recentemente em pacientes com doença de Huntington, em parte para estabelecer uma dose terapêutica segura (Dubinsky e Gray, 2006). Nove pacientes com doença de Huntington estavam matriculados nestes ensaios clínicos, fase aberta I, centro único. Os indivíduos receberam tratamento com cisteamina de mg/kg por dia com um aumento semanal de um adicional de mg/kg por dia, até uma dose máxima de 70 mg/kg ou até que o desenvolvimento de efeitos colaterais intoleráveis (náusea e deficiência motora). O estudo concluiu que uma dose de 20 mg/kg por dia de cisteamina foi tolerável nas pessoas que sofrem de doença de Huntington (Dubinsky e Gray, 2006). No entanto, a eficácia clínica não foi demonstrada. Mesmo que não são inteiramente transponíveis para os seres humanos, os estudos realizados em modelos de animais da doença de Huntington revelou que foram necessárias doses muito mais elevadas de cistamina Ou cisteamina para alcançar um efeito terapêutico significativo. Além disso, embora cisteamina pode atravessar a barreira hematoencefálica (BHE), leva doses maiores de cistamina ou cisteamina (i.p. ou p.o.) para detectar uma variação de cisteamina ou dos seus metabólitos no cérebro (Bousquet et al., 2010). A eficácia da cistamina e cisteamina para modificar a progressão da doença de Parkinson, bem como as suas propriedades de transporte do cérebro são desconhecidas.

[005] Terapias para a doença de Parkinson existentes são projetadas principalmente para administração de sintomas e até agora não há nenhum tratamento disponível para atenuar a progressão da doença. Existe, portanto, uma necessidade para o desenvolvimento de agentes terapêuticos que podem modificar a taxa de progressão da doença de Parkinson.

[006] Os inventores demonstraram, pela primeira vez, que os análogos de cistamina podem ser utilizados para modificar a progressão da doença de Parkinson.

[007] A presente invenção proporciona um método para modificar a progressão da doença de Parkinson, o método compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um análogo de cistamina, um seu sal farmaceuticamente aceitável, uma composição ou combinação da invenção a um paciente em necessidade da mesma.

[008] A presente invenção proporciona a utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um análogo de cistamina, um seu sal farmaceuticamente aceitável, uma composição ou combinação da invenção, para modificar a progressão da doença de Parkinson em um paciente com necessidade da mesma.

[009] A presente invenção proporciona a utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável como um agente de neuroresgate e/ou como um agente de neurorestauração para modificar a progressão da doença de Parkinson num paciente.

[010] A presente invenção proporciona uma combinação ou uma composição farmacêutica para modificar a progressão da doença de Parkinson compreendendo pelo menos um análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e que compreende cisteíina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

[011] A presente invenção proporciona uma combinação ou uma composição farmacêutica para modificar a progressão da doença de Parkinson compreendendo pelo menos um análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável como um agente de neuroresgate e/ou agente de neurorestauração e que compreende cisteína ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

[012] Em ainda um outro aspecto, é proporcionada a utilização de um análogo de cistamina ou um sal farmaceuticamente aceitável, uma composição ou combinação da invenção para a fabricação de um medicamento tal como aqui descrito.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS:

[013] Figura 1: Efeitos benéficos da cistamina em neurônios positivos de tirosina hidroxilase nigral.

[014] (a) Contagem de células estereológicas de tirosina hidroxilase (TH)-neurônios positivos na subtantia nigra pars compacta (SNpc) revelou uma diminuição significativa no número total de neurônios TH-positivos em MPTP em camundongos tratados com solução salina, em comparação com animais da solução salina + solução salina (p <0,001). (a) camundongos tratados com cistamina pré e pós-MPTP demonstraram um número semelhante de neurônios TH- positivos do que os animais tratados com solução salina. (b) As fotomicrografias da SNpc mostrando um número elevado (comparável com solução salina) de neurônios corados com Cresyl e TH-positivo nos camundongos tratados com solução salina de cistamina pós-MPTP, em comparação com camundongos tratados com solução salina de MPTP. A tabela em (c) recapitula as contagens de células estereológicos de Cresyl e TH. Painéis inferiores mostram as linhas de tempo dos programas pré e pós-tratamento. Os valores são expressos em média + S.E.M. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se ANOVA numa via. Diferença significativa com o grupo salina + salina: *** = p <0,001. Diferença significativa com o grupo salina + MPTP: À = p <0,05; dt = p <0,01; HHH = p <0,001. Barra de escala em (b) = 400 um, inserir = 25 upM. Abreviaturas: Pré-Tx (tratamento com cistamina pré-MPTP); Pós-Tx (tratamento com cistamina pós- MPTP) .

[015] Figura 2: Efeito benéfico da cistamina na expressão de mRNA Nurrl nigral.

[016] (a) Medições densitométricas de níveis de mRNA Nurrl (um gene envolvido na expressão e manutenção do fenótipo de dopamina (DA)) na SNpc revelaram que os níveis dos três grupos de controle (solução salina + solução salina, solução salina + cistamina Pré-Tx, solução salina + cistamina Pós-Tx) e animais tratados com MPTP com cistamina eram semelhantes, enquanto que os níveis de mRNA Nurrl em animais tratados com MPTP com solução salina foram significativamente diminuídos (p<0,01). (b) Fotomicrografias ao nível do SNpc (ver seta) ilustram os níveis normais de mRNA Nurrl no controle e camundongos tratados de cistamina .pós-MPTP, em comparação com camundongos tratados com solução salina MPTP (b). Valores são expressos como médias + S.E.M. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se ANOVA numa via. Diferença significativa com o grupo solução salina + solução salina: ** = p <0,01. Diferença significativa com o grupo MPTP + solução salina: À = p <0,05; dk = p <0,01. Barra de escala em b = 1 mm.

[017] Figura 3: Efeito benéfico de cistamina em células positivas DAT nigral.

[018] A expressão do transportador DA (DAT) de mRNA também foi revelada por hibridização in situ. (a) Contagens de células de estereológicas de células que expressam DAT no SNpc mostraram uma diminuição significativa no número total de neurônios em camundongos tratados com MPTP em solução salina, em comparação com animais da solução salina + solução salina (p <0,001). (a) Camundongos tratados com pré e pós-MPTP com cistamina revelou um número comparável de células DAT-positivas do que os animais tratados com solução salina. (b) Fotomicrografias de SNpc representam células que expressam DAT de mRNA. A inserção mostra a autorradiografia de DAT de mRNA antes da emulsão (medido por densitometria). A tabela em (c) recapitula as contagens de células estereológicas e medições densitométricas de expressão do DAT de mRNA na SNpc. Os valores são expressos em média + S.E.M. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se ANOVA numa nova via. Diferença significativa com o grupo de solução salina + solução salina: * = p <0,05; *** = p<0,001. Diferença significativa com MPTP + grupo de solução salina: À = p <0,05; dt = P <0,01. Barra de escala em b = 400 m, inserto = 500 um.

[019] Figura 4: Curso de tempo da perda de células positivas TH nigral no modelo com MPTP subaguda.

[020] (a) Contagens estereológicas de células de neurônios TH-positivos na SNpc revelaram uma diminuição significativa no número total de neurônios TH-positivo 7 e 14 dias após a última injeção de MPTP, em comparação com a solução salina (p <0,01) e o grupo pós-MPTP de 1 dia, que só mostrou uma tendência de diminuição do número de neurônios (p = 0,063).

[021] (b) Fotomicrografias da SNpc representa um número reduzido de Cresyl manchado e neurônios TH-positivo 7 e 14 dias dos grupos pós-MPTP. A tabela em (c) recapitula as contagens de células estereológicos Cresyl e TH. Os valores são expressos em média t+ S.E.M. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se ANOVA numa via. Diferença significativa com o grupo de solução salina: ** = p <0,01. Barra de escala em b = 400 um.

[022] Figura 5: Curso de tempo da diminuição da expressão de DAT de mRNA e Nurrl no modelo com MPTP subaguda.

[023] As medições densitométricas de (a) Nurrl e (b) a expressão de DAT de mRNA níveis significativamente reduzidos de ambos os marcadores DA na SNpc começando às 24 h após o tratamento com MPTP (p <0,01l e p <0,05 respectivamente). Os valores são expressos como média + S.E.M. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se ANOVA numa via. Diferença significativa com o grupo controle: ** = p < 0,01. * = P < 0,05.

[024] Figura 6: Curso de tempo do processo apoptótico DA nigral no modelo com MPTP subaguda.

[025] A análise de Western blot de (a) BAX e (b) níveis de proteína Bcl-2 no mesencéfalo ventral. (c) A proporção de BAX/Bcl2 é significativamente aumentada 24 horas após a última injeção de MPTP (p <0,05), sugerindo que, com este regime específico de liberação de MPTP, um processo apoptótico já começou neste momento. Os valores são expressos em média t S.E.M. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se ANOVA numa via. Diferença significativa com o grupo controle: * = p < 0,05.

[026] Figura 7: Níveis aumentados de cisteamina cerebral. Níveis de cisteamina cerebral (b) e cisteína (c)

medidos por HPLC acoplado com detecção de fluorescência. Estruturas moleculares e perfis de eluição de HPLC de uma solução-padrão de cisteamina (2) e cisteína (1) estão representados em (a). A cisteamina é significativamente aumentada em resposta a uma única injeção de cistamina i.p. de 50 mg/kg em camundongos mortos 1 hora após a injeção, em comparação com os camundongos mortos do veículo no mesmo ponto de tempo (p <0,05) (b). A dose de 200 mg/kg também provoca um aumento significativo de cisteamina 1 h e 3 h após a injeção de cistamina (p <0,01) (b). Níveis cerebrais de cisteína são estáveis, independentemente das doses e tempos de perfusão (c). Os dados estão expressos como médias (nmol/mg de proteína) + S.E.M. * p <0,05, ** p <0,01.

[027] Figura 8: Níveis constantes de hipotaurina e taurina cerebrais. Concentrações de hipotaurina cerebral (b) e taurina (c) medidas por HPLC acopladas com detecção de UV. Estruturas moleculares e perfis de eluição de HPLC de uma solução padrão contendo 1 ng/ml de taurina (1) e hipotaurina (2) estão representados em (a). Foram observadas medidas cerebrais estáveis de hipotaurina (b) e taurina (c). Os dados estão expressos como médias (nmol/mg de proteína) t+ S.E.M..

[028] Figura 9: Captação no cérebro de cisteamina aumentada na presença de cisteína. Demonstração de captação no cérebro de cisteamina e cisteína utilizando a técnica de perfusão cerebral in situ e quantificação por um método de HPLC. Ilustração esquemática no método de perfusão cerebral in situ (a). Um cateter é introduzido diretamente no interior da artéria carótida interna direita para garantir que 100% do perfusato atinja o hemisfério direito após ligaduras apropriadas (vasos azuis) (a). Ambos cisteína (b), e cisteamina (c) podem atravessar a BHE como demonstrado pelo elevado coeficiente de apuramento de cada molécula (upl/g/s). Quando co-perfusado, coeficientes de apuramento de cisteína e cisteamina aumentam significativamente. Os dados são expressos em média + S.E.M. (pl/g/s)* p < 0,05.

[029] Figura 10: Cistamina resgata neurônios dopaminérgicos no modelo de camundongo de 6-OHDA estriatal unilateral da doença de Parkinson. O painel (E) ilustra o curso de tempo do experimento. Todos os camundongos foram sujeitos a uma injeção intraestriatal unilateral de 6-OHDA (4 pg) ou o volume equivalente de veículo (placebo). Três dias mais tarde, durante o curso do processo degenerativo DAergic, os camundongos receberam um tratamento de 10 mg/kg de cistamina (ou solução salina), diariamente durante 14 dias. Os camundongos foram transcardialmente perfundidos 24 horas após a última injeção de cistamina e os cérebros processados para análises post-mortem. (A) Contagem de células estereológicas de neurônios TH-positivo na SNpc célula revelou uma significativa diminuição de 72% no número total de neurônios TH-positivos nos camundongos tratados com 6-O0HDA com solução salina, em comparação com os animais placebo + solução salina (p < 0,001). Camundongos tratados com 6-OHDA com cistamina exibiram apenas uma redução de 27% no número total de neurônios TH- positivo, em comparação com os animais placebo + cistamina (p < 0,05). O grupo 6-OHDA + solução salina foi significativamente diferente do grupo 6-OHDA + cistamina (p

< 0,001). (B) e (C) Medições densitométricas para níveis de Nurrl e de DAT mRNA na SNpc respectivamente. Estes dois marcadores adicionais de integridade DAergic revelou o mesmo padrão observado para a coloração de TH em (A), o que confirma as propriedades de neuroresgate de cistamina. (D) As medições dos teores DA estriatais realizadas por HPLC mostraram níveis significativamente reduzidos de DA apenas em camundongos tratados com 6-OHDA com solução salina, em comparação com camundongos de controle (p < 0,01). Os valores são expressos em média + S.E.M. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se ANOVA numa via. * = P < 0,05; ** = p < 0,01; *** = p < 0,001.

[030] Figura 11: Cistamina inverte deficiências comportamentais induzidas por lesões com 6-OHDA estriatal em camundongos. O painel (D) ilustra o curso de tempo do experimento. Todos os camundongos foram sujeitos a uma injeção intraestriatal unilateral de 6-OHDA (4 ug) Ou O volume equivalente de veículo (placebo). Três semanas mais tarde, quando a lesão era estável e tinha alcançado a máxima degeneração, os ratos receberam um tratamento de 10 mg/kg de cistamina (ou solução salina) por dia, durante 6 semanas. Durante o experimento, os camundongos foram avaliadas com 3 diferentes testes comportamentais em três momentos distintos: antes do início do tratamento de cistamina (3 semanas de pós-operatório), 6 semanas e 9 semanas pós-lesão. os testes comportamentais foram escolhidos para avaliar as assimetrias sensório motoras indicativas da extensão da lesão DAergic unilateral. (A Rotações contralaterais induzidas pela apomorfina acumuladas foram medidas com um aparelho de rotômetro. A lesão unilateral de 6-OHDA induziu um aumento de 20 rotações contralaterais 3, 6 e 9 semanas pós-lesão significativamente atenuadas por tratamento com cistamina 6 e 9 semanas após a cirurgia (p < 0,05). (B) O ensaio de intensificação revelou uma diminuição na percentagem de etapas para o ajuste contralateral (em comparação com ipsilateral). (C) Uma assimetria do uso do membro também é mostrada para o ensaio do cilindro em que os camundongos 6- OHDA lesionados mostraram uma significativa diminuição do percentual de contatos contralateral em 3 semanas, 6 semanas e 9 semanas de pós-operatório em relação ao placebo de camundongos. Esta assimetria não era visível para camundongos 6-OHDA lesionados tratados com cistamina em 6 e 9 semanas pós-lesão. Os valores são expressos em média + S.E.M. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se ANOVA numa via. * = P <0,05; ** = p <0,01; *** = p <0,001.

[031] Figura 12: Cistamina restaura alguns aspectos do sistema dopaminérgico nigral e muda os conteúdos catecolaminérgicos estriatal e dinâmicos do modelo de camundongo de 6-OHDA estriatal unilateral da doença de Parkinson. O painel (D) ilustra o decurso de tempo do experimento. Como mostrado na figura 11, todos os camundongos foram submetidos à injeção intraestriatal unilateral de 6-OHDA (4 ug) ou o volume equivalente de veículo (placebo) e o tratamento com cistamina (ou solução salina) começou três semanas mais tarde, durante um período de 6 semanas. Os camundongos foram transcardialmente perfundidos 24 horas após a última injeção de cistamina e os cérebros processados para análises post-mortem. (A)

Contagem de células estereológicas de neurônios de TH- positivo na SNpc revelou uma redução significativa de 93% no número total de neurônios TH-positivo em camundongos tratados com 6-OHDA com solução salina, em comparação com os animais placebo + solução salina (p <0,001). os camundongos tratados com 6-OHDA com cistamina exibiu apenas uma diminuição de 65% no número total de neurônios TH- positivo, em comparação com os animais placebo + cistamina (p <0,001). o grupo solução salina + 6-OHDA é significativamente diferente do grupo cistamina + 6-OHDA (p <0,01). (B) Os níveis de DA da cestamina medido por meio de HPLC em camundongos 6-OHDA lesionados foram diminuídos em 88% e 84% para animais tratados com solução salina e cistamina, respectivamente (p <0,001). Cistamina não restaurou significativamente o teor de DA no estriado lesionado. (C) No entanto cistamina exerceu uma forte tendência para normalizar o turnover de DA em comparação com camundongos tratados com 6-OHDA com solução salina, que se correlaciona de forma significativa com os testes de avaliação do comportamento das lesões (dados não mostrados). Os valores são expressos em média + S.E.M. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se ANOVA numa via. * =P <0,05; ** =p <0,01; *** = p <0,001. Usos e Métodos

[032] Numa forma de realização, os análogos de cistamina e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser utilizados como agentes neuroresgate e/ou neurorestauração. Esta atividade neuroresgate/neurorestauração pode ser distinguida a partir da atividade de um agente de neuroproteção.

[033] Tal como aqui utilizado, "um agente de neuroproteção" pode proteger os neurônios restantes "saudáveis" do processo degenerativo. Por conseguinte, pode ser apreciado que um agente de neuroproteção podem ser administrado no momento do diagnóstico.

[034] Tal como aqui utilizado, "um agente de neurorestauração" pode parar o processo neurodegenerativo em neurônios que estão lesionados, mas não mortos, com ou sem recuperação funcional. Por isso, pode-se compreender que um agente de neurorestauração deve ser administrado tão cedo quanto possível, mas pode ser administrado após o diagnóstico da DP.

[035] Tal como aqui utilizado, "um agente de neurorestauração" pode restabelecer a função por recuperação funcional e/ou estrutural, e a regeneração dos neurônios lesionados. Pode, portanto ser apreciado que um agente de neurorestauração é altamente relevante para o uso clínico em PD, uma vez que pode mostrar eficácia máxima após o diagnóstico.

[036] Numa outra forma de realização, os análogos de cistamina e seus sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser utilizados para modificar a progressão da doença de Parkinson.

[037] Numa forma de realização, "modificar a progressão da doença de Parkinson" está caracterizada por: a)uma redução do processo neurodegenerativo por uma ação anti- apoptótica em neurônios que estão lesionados, mas não mortos, com ou sem recuperação funcional, e/ou b) restauração funcional e/ ou estrutural, e regeneração.

[038] Numa outra forma de realização, "modificar a progressão da doença de Parkinson" é caracterizada por um dos seguintes mecanismos: a) uma redução do processo neurodegenerativo por uma ação anti-apoptótica em neurônios que estão lesionados, mas não mortos, com ou sem recuperação funcional, e/ou b) recuperação funcional e/ou estrutural, e a regeneração dos neurônios lesionados, e/ou c) promover a neurogênese.

[039] Ainda numa outra forma de realização, a progressão da doença de Parkinson é quantificada pela pontuação da Escala de classificação total unificada da doença de Parkinson (Total da UPDRS), um aumento na pontuação total da UPDRS representa a progressão dos sintomas da doença de Parkinson, e o incremento do aumento da pontuação total da UPDRS ao longo de um período de tempo representa a taxa de progressão da doença de Parkinson. Ver, por exemplo: Goetz CG, Tilley BC, Shaftman SR, Stebbins GT, Fahn S, Martinez-Martin P, Poewe W, Sampaio C, Stern MB, Dodel R et al. (2008) Movement Disorder Society revisão patrocinada pela Escala de Avaliação da Doença de Parkinson Unificada (MDS-UPDRS): apresentação de escala e os resultados dos testes clinimétricos. Mov Disord 23:2129-

2170.

[040] Ainda numa outra forma de realização do presente método, o período de tempo é de 12, 24 ou 36 semanas após o início da administração do análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

[041] Tal como aqui utilizado, as fases de um paciente com doença de Parkinson é descrita por Hoehn e Yahr nas seguintes cinco fases distintas, dependendo dos sintomas (Hoenn MM, Yahr MD, Parkinsonismo: Início, progressão e mortalidade. Neurologia 1967, 17:427-42).

[042] Fase 1: (doença ligeira Ou precoce): Sintomas afetam apenas um lado do corpo.

[043] Fase II: Ambos os lados do corpo são afetados, mas a postura permanece normal.

[044] Fase IIT: (doença moderada): Ambos os lados do corpo são afetados, e há um desequilíbrio ligeiro quando em pé ou andando. No entanto, a pessoa nesta fase se mantem independente.

[045] Fase IV: (doença avançada): Ambos os lados do corpo são afetados, e há uma instabilidade incapacitante em pé ou andando. A pessoa nesta fase requer ajuda substancial.

[046] Fase V: Doença totalmente desenvolvida, grave está presente. A pessoa que está limitada a uma cama Ou cadeira.

[047] Tal como aqui utilizado, "pacientes da doença de Parkinson de estágio inicial" é um paciente com doença de Parkinson na Fase I ou II da Doença de Parkinson, tal como definido por Hoehn e Yahr, e que não necessitam de terapia anti-Parkinsoniana sintomática. Numa forma de realização, tal paciente da doença de Parkinson não requer tratamento sintomático durante pelo menos os 9 meses seguintes. Um paciente com doença de Parkinson inicial pode ser identificado como tal pela realização de testes relevantes.

[048] Numa forma de realização, Oo paciente é paciente numa fase inicial da doença de Parkinson.

[049] Ainda numa outra forma de realização, O paciente da doença de Parkinson inicial é um paciente da Fase I de acordo com a classificação de Hoehn e Yahr.

[050] Ainda noutra forma de realização, O paciente na fase inicial da doença de Parkinson é um paciente que tem um total de UPDRS de menos de 30, menos de 25, menos de 23, menos de 21, ou menos de 20.

[051] Ainda numa outra forma de realização, O paciente da doença de Parkinson é um paciente da fase I, II, III, IV ou V de acordo com a classificação de Hoehn e Yahr.

[052] Ainda numa outra forma de realização, O paciente da doença de Parkinson é um paciente da fase III, IV ou V, de acordo com a classificação Hoehn e Yahr.

[053] Ainda numa outra forma de realização, O paciente da doença de Parkinson é um paciente da fase III, ou IV de acordo com a classificação de Hoehn e Yahr.

[054] Ainda numa outra forma de realização, O paciente da doença de Parkinson é um paciente da fase III de acordo com a classificação de Hoehn e Yahr.

[055] A presente invenção relaciona-se com usos e métodos para: reduzir a fadiga em um paciente com doença de Parkinson; reduzir a gravidade dos sintomas não motores em um paciente com doença de Parkinson; reduzir o declínio funcional em um paciente com doença de Parkinson, reduzir a progressão clínica da doença, ou retardar a progressão clínica da doença.

[056] A presente invenção proporciona ainda um método de tratamento de um paciente que apresenta doença de Parkinson, compreendendo a identificação de pacientes que exibem doença de Parkinson, e administrar periodicamente ao paciente assim identificardo uma quantidade de análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, ou uma composição ou combinação da invenção eficaz para tratar oO paciente.

[057] A presente invenção refere-se a um método para retardar ou reduzir a progressão da doença de Parkinson em um paciente compreendendo a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, uma composição ou combinação da invenção.

[058] A presente invenção refere-se ao uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, uma composição ou combinação da invenção para retardar Ou reduzir a progressão da doença de Parkinson num paciente.

[059] A presente invenção proporciona ainda o uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz do análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, uma composição ou combinação da invenção, para retardar a progressão clínica da doença de Parkinson em um paciente com doença de Parkinson.

[060] A presente invenção proporciona ainda se refere a um método para retardar a progressão clínica da doença de Parkinson em um paciente com doença de Parkinson compreendendo a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz do análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, uma composição ou combinação da presente invenção.

[061] A presente invenção proporciona ainda o uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz do análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou uma composição ou combinação da invenção para reduzir a gravidade dos sintomas não motores em um paciente com doença de Parkinson.

[062] A presente invenção proporciona ainda um método para reduzir a gravidade dos sintomas não motores em um paciente com doença de Parkinson compreendendo a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um análogo de cistamina ou um sal farmaceuticamente aceitável, ou uma composição Ou combinação da invenção.

[063] A presente invenção proporciona ainda um método de tratamento de um paciente tendo fase I, II, III, IV ou V da doença de Parkinson (segundo a classificação de Hoehn e Yahr) que compreende a identificação de pacientes que apresentam a doença de Parkinson, e, periodicamente, a administração ao paciente assim identificado uma quantidade de análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, ou uma composição ou combinação da invenção eficaz para tratar o paciente.

[064] A presente invenção proporciona ainda um análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, ou uma composição ou combinação da invenção para uso no tratamento de um paciente que apresente sinais precoces da doença de Parkinson.

[065] A presente invenção proporciona ainda uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade farmaceuticamente eficaz do análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, ou uma composição Ou combinação da invenção para uso na redução da velocidade de progressão da doença de Parkinson numa fase precoce do paciente da doença de Parkinson.

[066] A presente invenção proporciona ainda o uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz do análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou uma composição ou combinação da invenção para o tratamento de um paciente que apresente sinais precoces da doença de Parkinson.

[067] A presente invenção proporciona ainda um método de tratamento de um paciente que apresente sinais precoces da doença de Parkinson, que compreende a identificação de pacientes que exibem sinais precoces da doença de Parkinson, e administrar periodicamente o paciente assim identificado uma quantidade de análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, ou uma composição ou combinação da invenção eficaz para tratar o paciente.

[068] A presente invenção proporciona ainda um análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, ou uma composição ou combinação da presente invenção para uso na redução da fadiga em um estágio inicial do paciente com a doença de Parkinson.

[069] A presente invenção proporciona ainda o uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz do análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, ou uma composição ou combinação da invenção para reduzir a fadiga em fase precoce do paciente da doença de Parkinson.

[070] A presente invenção proporciona ainda um método de redução da fadiga, em pacientes com doença de Parkinson em uma fase inicial, compreendendo a identificação de um paciente a ser um paciente da doença de Parkinson em uma fase inicial, e administrar periodicamente ao paciente assim identificado uma quantidade de análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável eficaz para reduzir a fadiga.

[071] A presente invenção proporciona ainda um método de redução da gravidade dos sintomas não motores em pacientes com doença de Parkinson em uma fase inicial, compreendendo a identificação de um paciente a ser um paciente da doença de Parkinson em uma fase inicial, e administrar periodicamente ao paciente assim identificado uma quantidade de análogo de cistamina ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, ou uma composição ou combinação da invenção eficaz para reduzir a gravidade dos sintomas não motores.

[072] A presente invenção proporciona ainda um método de redução da fadiga, em pacientes com doença de Parkinson um uma fase inicial, compreendendo a administração periódica a um paciente da doença de Parkinson em uma fase precoce, uma quantidade de análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, ou uma composição Ou combinação da invenção eficaz para reduzir a fadiga.

[073] A presente invenção proporciona ainda um método de redução da gravidade dos sintomas não motores no paciente da doença de Parkinson numa fase precoce, que compreende a administração periódica a um paciente da doença de Parkinson em uma fase precoce uma quantidade de análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, ou uma composição ou combinação da invenção eficaz para reduzir a gravidade dos sintomas não motores.

[074] A presente invenção proporciona ainda um método para retardar a progressão clínica da doença de Parkinson em um paciente com doença de Parkinson compreendendo a administração periódica ao paciente da doença de Parkinson, uma quantidade de análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, ou uma composição ou combinação da invenção eficaz para retardar a progressão clínica da doença de Parkinson, no paciente.

[075] A presente invenção proporciona ainda análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, ou uma composição ou combinação da invenção para uso na redução da velocidade de progressão da doença de Parkinson em um paciente da doença de Parkinson em uma fase inicial.

[076] A presente invenção proporciona ainda análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, ou uma composição ou combinação da presente invenção para uso na redução da diminuição funcional no paciente da doença de Parkinson em uma fase inicial.

Composições farmacêuticas e análogos de cistamina

[077] Num aspecto, o análogo de cistamina é cisteamina, cistamina, taurina ou hipotaurina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

[078] Num outro aspecto, o análogo de cistamina é cistamina ou cisteamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

[079] Num outro aspecto, o análogo de cistamina é bitartarato de cisteamina.

[080] Num outro aspecto, o análogo de cistamina é o cloridrato de cisteamina.

[081] Num outro aspecto, o análogo de cistamina é o dicloridrato de cistamina.

[082] Num outro aspecto, é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e pelo menos um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[083] Num outro aspecto, é proporcionada uma combinação compreendendo um análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e um ou mais agentes adicionais, tais como a bromocriptina, benzotropina, levodopa, ropinirol, pramipexol, rotigotina, cabergolina, entacopona, tolcapona, amantadina, selegilina e rasagilina.

[084] Em ainda um outro aspecto, é proporcionado o uso de um análogo de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, uma composição ou combinação da invenção para a fabricação de um medicamento para modificar a progressão da doença de Parkinson num paciente.

[085] De acordo com uma outra forma de realização, OS compostos da presente invenção são representados pelas seguintes fórmulas: NH7- (CH>) 2-SH Cisteamina NH2- (CH2) 2-S-S- (CH2) 2-NH> Cistamina

NH2- (CH2) 2-8 (02) -OH Taurina NH2- (CH2) 2-8 (0) -OH Hipotaurina

O raw

OH >sH L-cisteína ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

[086] Análogos de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável podem ser obtidos por métodos bem conhecidos na técnica. Os compostos estão disponíveis a partir de diferentes fontes, por exemplo, da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. EUA.

[087] Numa forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um análogo de cistamina ou seu sal farmaceuticamente aceitável descrito aqui, e que compreende ainda, pelo menos, um agente adicional, em que o agente adicional é cisteína.

[088] Numa forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos análogo de cistamina ou seu sal farmaceuticamente aceitável descrito aqui, e que compreende ainda, pelo menos, um agente adicional, em que o agente adicional é a L-cisteína.

[089] Numa outra forma de realização, é proporcionada uma combinação que compreende pelo menos um análogo de cistamina descrito aqui e um ou mais agentes adicionais.

[090] Numa forma de realização, em que o agente adicional é cisteína.

[091] Numa forma de realização, em que o agente adicional é a L-cisteína.

[092] Numa forma de realização, o análogo de cistamina e cisteína estão presentes numa proporção de 10:1-1:10 de análogo de cistamina e cisteína, respectivamente. Numa outra forma de realização, oO análogo de cistamina e cisteína estão presentes numa proporção de 1:1.

[093] Em uma forma de realização de combinação, O análogo de cistamina e agente adicional são administrados ou adequados para ser utilizados em sequência.

[094] Em uma outra forma de realização de combinação, o análogo de cistamina e agente adicional são administrados ou adequados para ser utilizados em simultâneo.

[095] As combinações acima referidas podem ser convenientemente apresentadas para uso na forma de uma formulação farmacêutica e assim formulações farmacêuticas compreendendo uma combinação como acima definida juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável compreendem um aspecto adicional da invenção.

[096] Os componentes individuais para uso no método da presente invenção ou combinações da presente invenção podem ser administrados quer sequencialmente ou simultaneamente em formulações farmacêuticas separadas ou combinadas.

[097] Numa forma de realização, a presente invenção proporciona o uso de um composto, composição ou combinação, tal como aqui descrito para a fabricação de um medicamento.

[098] A menos que indicado de outra forma, as estruturas aqui representadas pretendem também incluir todas as formas isoméricas da estrutura (por exemplo, enantiomérica, diastereomérica e geométrica (ou conformacional)), por exemplo, as configurações R e S para cada centro assimétrico, isômeros de ligação dupla (2) e (E), e isômeros conformacionais (2) e (E). Portanto, os isômeros estereoquímicos individuais bem como misturas enantioméricas, diastereoméricas, e geométricas (ou conformacionais) dos presentes compostos estão dentro do âmbito da invenção. O isômero óptico individual ou enantiômero podem ser obtidos através de método bem conhecido na técnica, tais como HPLC quiral, resolução enzimática e auxiliar quiral.

[099] Numa forma de realização, se for o caso, os análogos de cistamina ou cisteína são fornecidos sob a forma de um único estereoisômero, pelo menos, 75%, 85%, 90%, 295%, 297% e 99% livre dos estereoisômeros correspondentes.

[100] São também proporcionados sais farmaceuticamente aceitáveis dos análogos de cistamina ou cisteína. Pelo termo sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos são entendidos aqueles derivados de ácidos inorgânicos e orgânicos farmaceuticamente aceitáveis, e bases. Exemplos de ácidos adequados incluem ácidos clorídrico, bromídrico sulfúrico, nítrico, perclórico, fumárico, maleico, fosfórico, glicólico, láctico, salicílico, succínico,

tolueno-p-sulfônico, tartárico, acético, trifluoroacético, cítrico, metanossulfônico, fórmico, benzóico, malónico, naftaleno-2-sulfônico e benzenossulfônico. Outros ácidos tais como o oxálico, embora eles próprios não farmaceuticamente aceitáveis podem ser úteis como intermediários na obtenção dos análogos de cistamina e os seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis.

[101] Os sais derivados de aminoácidos são também incluídos (por exemplo, L-arginina, L-lisina).

[102] Os sais derivados de bases adequadas incluem metais alcalinos (por exemplo, sódio, lítio, potássio) e metais alcalino-terrosos (por exemplo, cálcio, magnésio).

[103] Uma referência a seguir aos análogos de cistamina ou cisteína inclui esse composto e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

[104] Numa forma de realização, o sal é um sal bitartarato.

[105] Numa forma de realização, Oo sal é um sal de cloridrato.

[106] Com relação aos sais farmaceuticamente aceitáveis, ver também a lista de sais comercializados no mercado aprovados pelo FDA listados na Tabela I da Berge et al., Sais farmacêuticos, J. of Phar. Sei., Vol. 66, n. 1, janeiro de 1977, pp 1-19, cuja divulgação é aqui incorporada por referência.

[107] Será apreciado por aqueles peritos na técnica que os compostos podem existir em diferentes formas polimórficas. Como é conhecido na técnica, o polimorfismo é a capacidade de um composto cristalizar como mais de uma espécie cristalina distinta ou "polimórfica". Um polimorfo é uma fase sólida cristalina de um composto com pelo menos dois diferentes arranjos ou formas polimórficas daquela molécula do composto em estado sólido. As formas polimórficas de um determinado composto são definidas pela mesma fórmula química ou composição e são tão distintas na estrutura química que as estruturas cristalinas de dois compostos químicos diferentes.

[108] Será ainda apreciado por aqueles peritos na técnica que os compostos de acordo com a presente invenção podem existir em diferentes formas de solvato, por exemplo, hidratos. Os solvatos dos análogos de cistamina ou cisteína também podem formar quando as moléculas de solvente são incorporadas na estrutura da rede cristalina da molécula do composto durante o processo de cristalização.

[109] Salvo disposição em contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui têm o mesmo significado que vulgarmente entendido por um perito na técnica à qual pertence esta invenção. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretende ser limitativos.

[110] Para os fins desta invenção, os elementos químicos são identificados de acordo com a Tabela Periódica dos Elementos, versão CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 75 ed. Adicionalmente, os princípios gerais de química orgânica são descritos em "Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999 e "March's Advanced Organic Chemistry", 5º Ed, Ed:. Smith, M.B. e March, J., John Wiley & Sons, Nova York: 2001.

[111] Além disso, a menos que indicado de outra forma, os análogos de cistamina ou cisteína aqui descritos pretendem também incluir compostos que diferem apenas na presença de um ou mais átomos isotopicamente enriquecidos. Por exemplo, os análogos de cistamina ou cisteína, em que um ou mais átomos de hidrogênio são deutério ou trítio substituídos, ou a um ou mais átomos de carbono são substituídos por um carbono 13C ou 14C enriquecido estão dentro do âmbito desta invenção. Tais compostos são úteis, por exemplo, como ferramentas analíticas, sondas em ensaios biológicos, ou compostos com um melhor perfil terapêutico.

[112] Será apreciado que a quantidade de análogos de cistamina requeridos para uso no tratamento irá variar não só com o composto particular selecionado, mas também com a via de administração, a natureza da condição para a qual é necessário o tratamento e a idade e condição do paciente e será em última análise à discrição do médico assistente. Em geral, no entanto, uma dose adequada estará na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 750 mg/kg do peso corporal por dia, por exemplo, na faixa de 0,5 a 60 mg/kg/dia, ou, por exemplo, na faixa de 1 a 20 mg/kg/dia.

[113] À dose desejada pode ser convenientemente apresentada numa dose única ou como doses divididas administradas em intervalos apropriados, por exemplo, como duas, três, quatro ou mais doses por dia.

[114] O análogo de cistamina é convenientemente administrado na forma de dosagem unitária, por exemplo, contendo 5 a 2000 mg, 10 a 1500 mg, convenientemente 20 a 1000 mg, mais convenientemente 50 a 700 mg de ingrediente ativo por forma de dosagem unitária. Numa forma de realização, o análogo de cistamina é convenientemente administrado na forma de dosagem unitária de 600 mg duas vezes por dia.

[115] Quando os análogos de cistamina ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis são utilizados em combinação com um segundo agente terapêutico ativo contra a doença de Parkinson, a dose de cada composto poderá ser quer à mesma ou diferir daquela quando o composto é utilizado sozinho. As doses apropriadas serão prontamente apreciadas pelos peritos na técnica.

[116] Embora seja possível que, para uso em terapia, os análogos de cistamina podem ser administrados como oO produto químico em bruto, é preferível apresentar O ingrediente activo como uma composição farmacêutica. Assim, a invenção proporciona ainda uma composição farmacêutica que compreende os análogos de cistamina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável da presente invenção, juntamente com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, portanto, e, opcionalmente, outros ingredientes terapêuticos e/ou profiláticos. O veículo (s) devem ser "aceitáveis" no sentido de serem compatíveis com os outros ingredientes da formulação e não deletérios ao seu recipiente.

[117] As composições farmacêuticas incluem aquelas adequadas para administração oral, retal, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), transdérmica, vaginal ou parentérica (incluindo intramuscular, subcutânea, e intravenosa), ou numa forma adequada para administração por inalação ou insuflação. As composições podem, quando apropriado, ser convenientemente apresentadas em unidades de dosagem discretas e podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica da farmácia. Todos os métodos incluem a etapa de colocar em associação o ativo com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos e depois, se necessário, moldando o produto para a composição desejada.

[118] As composições farmacêuticas adequadas para administração oral podem convenientemente ser apresentadas como unidades discretas tais como cápsulas, pílulas ou comprimidos contendo cada um uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo, como um pó ou grânulos, como uma solução, uma suspensão ou como uma emulsão. O ingrediente ativo pode também ser apresentados como um bólus, eletuário ou pasta. Os comprimidos e cápsulas para administração oral podem conter excipientes convencionais tais como agentes aglutinantes, enchimentos, lubrificantes, desintegrantes, ou agentes umectantes. Os comprimidos podem ser revestidos de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. As preparações líquidas orais podem estar na forma de, por exemplo, suspensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões, xaropes ou elixires, ou podem ser apresentadas como um produto seco para constituição com água ou outro veículo adequado antes da utilização. Tais preparações líquidas podem conter aditivos convencionais, tais como agentes de suspenção, agentes emulsificantes, veículos não aquosos (que podem incluir óleos comestíveis), ou conservantes.

[119] Os análogos de cistamina podem também ser formulados para administração parentérica (por exemplo, por injeção, por exemplo, injeção de bólus ou infusão contínua) e podem ser apresentados na forma de dose unitária em ampolas, seringas pré-cheias, infusão de pequeno volume ou em recipientes de multidose com um conservante adicionado. As composições podem tomar formas tais como suspensões, soluções, ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação, tais como suspensão, estabilização e/ou dispersão. Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar na forma de pó, obtido por isolamento asséptico de sólido estéril ou por liofilização a partir da solução, por constituição com um veículo adequado, por exemplo, água isenta de pirogênio estéril, antes da utilização.

[120] Para administração tópica à epiderme, os análogos de cistamina podem ser formulados como pomadas, cremes ou loções, ou como um adesivo transdérmico. Tais adesivos transdérmicos podem conter promotores de penetração tais como linalol, carvacrol, timol, citral, mentol e t-anetol. Os unguentos e cremes podem, por exemplo, ser formulados com uma base aquosa ou oleosa com a adição de agentes espessantes e/ou gelificantes adequados. As loções podem ser formuladas com uma base aquosa Ou Oleosa e em geral também contêm um ou mais agentes emulsionantes, agentes estabilizantes, agentes dispersantes, agentes de suspensão, agentes espessantes ou agentes corantes.

[121] As “composições adequadas para administração tópica na boca incluem pastilhas compreendendo o ingrediente ativo numa base aromatizada, normalmente sacarose e acácia ou tragacanto, pastilhas compreendendo o ingrediente ativo numa base inerte tal como a gelatina e glicerina ou sacarose e goma arábica, e colutórios compreendendo o ingrediente ativo num veículo líquido adequado.

[122] As composições farmacêuticas adequadas para administração retal em que o veículo é um sólido, por exemplo, são apresentadas como supositórios de dose unitária. Os veículos apropriados incluem manteiga de cacau e outros materiais vulgarmente utilizados na técnica, e os supositórios podem ser convenientemente formados por mistura do composto ativo com o veículo amolecido ou derretido (s) seguido pelo resfriamento e moldagem em moldes.

[123] As composições adequadas para administração vaginal podem ser apresentadas como pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou sprays contendo, além do ingrediente ativo tais veículos como são conhecidos na técnica como sendo apropriados.

[124] Para administração intranasal os compostos ou combinações podem ser usados como um spray líquido ou pó dispersível ou na forma de gotas. As gotas podem ser formuladas com uma base aquosa ou não aquosa compreendendo também um ou mais agentes dispersantes, agentes solubilizantes ou agentes de suspensão. Sprays líquidos são convenientemente liberados a partir de embalagens pressurizadas.

[125] Para administração por inalação, os compostos ou combinações são convenientemente administrados a partir de um insuflador, nebulizador ou uma embalagem pressurizada ou outros meios convenientes de fornecimento de um aerossol. Embalagens pressurizadas podem compreender um propulsor adequado tal como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando uma válvula para liberar uma quantidade medida.

[126] Alternativamente, para administração por inalação ou insuflação, os compostos ou as combinações podem tomar a forma de uma composição em pó seco, por exemplo, uma mistura de pó do composto e uma base em pó adequada tal como lactose ou amido. A composição em pó pode ser apresentada em forma de dosagem unitária em, por exemplo cápsulas ou cartuchos ou, por exemplo, embalagens de gelatina ou blister a partir das quais o pó pode ser administrado com o auxílio de um inalador ou insuflador.

[127] Quando desejado, as composições acima descritas adaptadas para proporcionar uma liberação sustentada Ou modificada do ingrediente ativo pode ser empregadas. Exemplos de formulação de cisteamina são descritos, por exemplo, na publicação US 20090076166.

[128] Os presentes inventores verificaram surpreendentemente que a cistamina tem efeitos benéficos nos animais parkinsonianos, quando administrada antes e após a toxina MPTP capaz de desencadear a patologia. Os presentes inventores determinaram que a cistamina pode derrubar um processo neurodegenerativo iniciado. Conforme descrito nos exemplos, camundongos foram subagudamente intoxicados com MPTP seguindo um regime de 5 dias, de 7 de injeções i.p. de 20 mg/kg e administrado 10 mg/kg de cistamina i.p. diária ou 1) 2 dias antes do início das injeções de MPTP ou 2) 24 horas após a última dose de MPTP, e que prosseguiu durante 14 dias após a lesão. No final do estudo, a análise post-mortem foram realizados para avaliar o estado do sistema dopaminérgico (DAergic), mais especialmente direcionados na doença de Parkinson. Os presentes inventores verificaram Ssurpreendentemente que administração i.p. de cistamina (10 mg/kg/dia) aos camundongos “tratados com MPTP, com início após a deterioração do sistema nigroestriatal (24 horas após o tratamento com MPTP), induziu uma recuperação significativa do número de neurônios da substância nigra DAergic, tal como avaliado por contagem de estereologia de células TH- imunorreativas (p <0,05), de o número de células que expressam DAT mRNA de DAT (p <0,05), bem como os níveis de mMRNA Nurrl nigral (p <0,05). Os presentes inventores determinaram também que a cistamina resgata neurônios dopaminérgicos no modelo de camundongo 6-OHDA estriatal unilateral da doença de Parkinson. Além disso, como mostrado nos exemplos aqui apresentados, cistamina inverte deficiências comportamentais induzidas por lesões de 6-OHDA estriatais em camundongos e restaura alguns aspectos do sistema nigral dopaminérgico e alterações dos conteúdos catecolaminérgicos estriatal e dinâmicas no modelo de camundongo de 6-OHDA estriatal unilateral da doença de Parkinson. Os presentes inventores verificaram que o papel dos compostos de cistamina não é apenas limitado a preservar os neurônios existentes. Os compostos também podem reverter o processo de apoptose solicitado e, portanto, resgatar os neurônios danificados de sofrer degeneração.

[129] Sem estar ligado a qualquer teoria específica, os presentes inventores acreditam que a cisteamina é o composto chave neuroativo após administração sistêmica de cistamina. Entre as moléculas investigadas através de medições de HPLC, que incluem cisteamina, cisteína, hipotaurina e taurina, cisteamina foi verificada ser a única que aumentou significativamente nos cérebros de camundongos naive, após uma única injeção i.p. de 50 mg/kg e 200 mg/kg. Em contraste, os níveis de cisteína, hipotaurina, e taurina manteve-se inalterado ou abaixo do limiar de detecção. Além disso, os presentes inventores demonstraram que atravessa a certificação da BBB de cisteamina em quantidade significativa in vivo. Estas observações fornecem informações importantes relativas à neurofarmacologia da cisteamina e apoiar ainda mais a sua relevância clínica.

[130] A BBB é um grande obstáculo para a aplicação clínica de uma grande maioria dos compostos potencialmente neuroativos e deve ser levada em conta ao determinar que metabólito de cistamina exerce o seu efeito terapêutico. Transportadores de aminoácidos são componentes BBB bem estudados e compreendem sistemas preferindo leucina, alanina, serina, ou cisteína (Wade e Katzman 1975; Sershen e Lajtha 1979). A cisteína foi reconhecida por utilizar o sistema preferindo leucina para atravessar a BBB (Wade e Brady, 1981). A capacidade de taurina para atravessar a BBB foi também descrita em camundongos utilizando ISCP e aparentemente envolve uma célula endotelial de sódio e sistema de influxo dependente de cloreto (Benrabh et al. 1995). O mecanismo pela qual a cisteamina, por outro lado, pode atravessar a BBB requer novas investigações. Aqui, uma técnica quantitativa e altamente sensível, foi utilizada para estudar o transporte de BBB da cisteamina e cisteína.

Isto foi realizado sem comprometer a integridade física ou funcional da BBB e ignorando os processos de metabolismo periféricos associados com a administração sistêmica. Os inventores demonstraram a capacidade de cisteamina e cisteína para alcançar ao cérebro em quantidades significativas.

[131] Captação no cérebro de cisteamina foi facilitada pela adição de cisteína no perfusado.

[132] No anterior e nos exemplos seguintes, todas as temperaturas são apresentadas não corrigidas em graus Celsius e, a menos que indicado em contrário, todas as partes e as percentagens são em peso.

[133] Os exemplos que se seguem podem ser repetidos com sucesso semelhante substituindo os reagentes genericamente ou especificamente descritos e/ou condições de operação desta invenção para aqueles utilizados nos exemplos precedentes.

EXEMPLOS: EXEMPLO 1: Efeito da cistamina seguindo o parkinsonismo induzido por MPTP em roedores Animais

[134] Camundongos C57BL/6 adulto jovem (9 semanas de idade, 25 gramas) masculinos foram adquiridos de Charles River Laboratories (Montréal, QC, Canadá). Os animais foram alojados 4 por gaiola em condições normais, com acesso livre à comida e água, randomizado e tratado nas mesmas condições por um investigador. Todos os experimentos foram realizados em conformidade com a Canadian Council on Animal Care e foram aprovados pelo Comitê Institucional do Centro Hospitalar de l'Université Laval (CHUL, Québec, Canadá).

Durante todo o experimento, o estado de saúde de todos camundongos incluídos no estudo foi acompanhado de perto para perda de peso ou outros sinais de problemas relacionados com a saúde. Todos os esforços foram feitos para minimizar a dor animal e desconforto. Administração de MPTP

[135] Os camundongos receberam 7 injeções i.p., duas vezes, nos primeiros 2 dias do protocolo experimental com um intervalo de 12 horas e uma vez por dia em 3 dias consecutivos, de solução salina a 0,9% ou MPTP-HCl (20 mg/kg de base livre, Sigma, St. Louis, MO) dissolvida numa solução salina a 0,9% preparada fresco (Tremblay et al., 2006;. Gibrat et al., 2007, Gibrat et al., 2010). Tratamentos com cistamina

[136] Os efeitos benéficos da cistamina em camundongos parkinsonianos (dicloridrato de cistamina, Sigma, St. Louis, MO) foram avaliados com uma dose de 10 mg/kg, dissolvidos em solução salina estéril a 0,9% e preparada para injeção i.p. diária 1 hora antes da administração de MPTP. A escolha da dose e regime de administração foi com base em nossos achados anteriores (Tremblay et al., 2006; Gibrat et al., 2010). A primeira injeção de cistamina foi administrada ou 1) 2 dias antes do início das injeções de MPTP (pré-tratamento) ou 2) 24 horas após a última dose de MPTP (pós-tratamento), e o tratamento continuou diariamente durante 14 dias após a lesão.

[137] Este estudo foi dividido em dois experimentos distintos. Experimento no.l1. Propriedades de Neuroresgate de cistamina em camundongos lesionados com MPTP

[138] Os efeitos da cistamina sobre a toxicidade de MPTP foram estudados nos seguintes grupos experimentais: Grupo I, solução salina + solução salina; Grupo II, solução salina e + pós-tratamento com cistamina; Grupo III, solução salina + pré-tratamento com cistamina; Grupo IV, MPTP + solução salina; Grupo V, MPTP + pós-tratamento com cistamina; Grupo VI, MPTP + pré-tratamento com cistamina. No total, 96 camundongos (n = 16 por grupo) foram utilizados, monitorados diariamente para a variação de peso, e finalmente sacrificados por perfusão 24 horas após a última injeção de cistamina (ou veículo).

Experimento no. 2. Curso do tempo da morte neuronal nigral DAergic induzida por um tratamento subagudo de MPTP

[139] Para este experimento, um total de 72 camundongos foram usados e divididos em seis grupos (n = 12 por grupo). Grupo I, II e III receberam um tratamento subagudo de MPTP enquanto o Grupo IV, V e VI foram administrados com uma solução salina a 0,9%. Grupo I e IV foram sacrificados 24 h, Grupo II e V: 7 dias e grupo III e VI: 14 dias após a última injeção de MPTP (ou soro fisiológico).

Perfusão e processamento de tecidos

[140] Os animais foram sacrificados sob anestesia profunda com cetamina/xilazina (Vetalar, Bioniche, Belleville, ON/Rompun, Bayer, Toronto, ON) e perfundidos de acordo com dois métodos em condições livres de RNAse:

[141] Experimento 1. Todos os camundongos foram submetidos a perfusão intracardíaca com RNAse livre de solução salina tamponada com fosfato 0,1 M (PBS). Após perfusão intracardíaca, os cérebros foram recolhidos e os dois hemisférios foram separados. O hemisfério esquerdo foi pós-fixados em 4% de paraformaldeído (PFA) durante 48 horas e transferidos para sacarose a 20% em 0,1 M de PBS durante crioproteção. Seções cerebrais coronais de 25 um de espessura foram cortadas em um micrôtomo de congelamento (Leica Microsystems, Montreal, QC) e recolhidas em série em solução anticongelante (monofosfato de sódio monobásico 0,2 M, monofosfato de sódio dibásico 0,2 M, etilenoglicol 30%, glicerol 20%) e mantidas a -20ºC até utilização. Seções do hemisfério esquerdo foram utilizadas para imuno- histoquímica adicional e em protocolos de hibridização in situ. Os hemisférios direito foram congelados rapidamente em 2-metil-butano e, em seguida, armazenados a -80ºC até à dissecação criostato para HPLC e análises western-blot (WB) .

[142] Experimento 2. Neste experimento, os dois hemisférios de cada animal foram congelados rapidamente e utilizados para análises de HPLC e WB. Os cinco camundongos restantes de cada grupo foram perfundidos intracardiacalmente por solução salina (0,9%) RNAse, seguido de PFA a 4%, pH 7,4. Após a perfusão intracardíaca, os cérebros foram recolhidos e pós-fixados em PFA a 4% durante 24 horas e transferidos para sacarose a 20% em 0,1 M de PBS durante crioproteção. Cérebros foram cortados em cortes coronais de 25 um de espessura. Estas seções foram usadas para imuno-histoquímica e hibridação in situ necessária para a realização do experimento 2. Quantificação por catecolamina por HPLC

[143] Estriatal DA, concentrações de ácido 3,4-di- hidroxifenilacético (DOPAC), e ácido homovanílico (HVA) foram medidos por HPLC acoplado com detecção eletroquímica

(Calon et al, 2001, Calon et al., 2003). Cada amostra estriatal compreendeu dez seções criostáticas de espessura de 20 uM da estrutura de níveis que variam entre +1,145 e +1,345 (Allen, 2008; Lein et al., 2007). Duzentos 1pl de ácido perclórico (0,1 N, J.T. Baker) foram adicionados a cada uma das amostras, as quais foram homogeneizadas e centrifugadas (13000 x9), para gerar um sobrenadante. Cinquenta pl do sobrenadante a partir de tecidos estriatais foram diretamente injetados no sistema que consiste num cromatógrafo Waters 717, mais injetor automático amostrador automático, uma bomba Waters 1525 binário equipada com uma coluna Atlantis DC18 (3 ul), um detector eletroquímico Waters 2465, e um eletrodo de carbono vítreo (Waters Limited, Lachine, QC, Canadá). Potencial eletroquímico foi fixado em 10 nA. A fase móvel consistiu em 47,8 mM de NaH;POs, 0,9 mM de octil sulfato de sódio (J.T. Baker), EDTA a 0,4 mM, NaCl a 2 mM e 8% de metanol (J.T. Baker) a pH 2,9 e foi liberada a 1,0 ml/min. Os picos foram identificados utilizando o software Breeze (Waters). Quantificações de HPLC foram normalizadas para as concentrações de proteína, tal como determinado com um kit de ensaio de proteínas de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL, EUA). Imuno-histoquímica TH

[144] Para a avaliação de perda neuronal DaAergic, imuno-histoquímica contra a enzima TH foi realizada como descrito anteriormente (Tremblay et al, 2006;. Gibrat et al., 2009). Resumidamente, as seções de livre flutuação, após várias lavagens e bloqueio pré-incubação, foram incubadas durante a noite a 4ºC com um coelho anti-TH (Pel-

Freez, Rogers, AR; 1:5000). As seções foram então incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente (TA) numa solução contendo de cabra biotinilada anti-IgG de coelho (Vector Laboratories, Burlington, ON; 1:1500) e, posteriormente, colocadas numa solução contendo complexo peroxidase avidina-biotina (ABC Elite Kit, Vector Laboratories, Burlington, ON), durante 1 hora à temperatura ambiente. Finalmente, a reação foi desenvolvida em solução de 3,3'- diaminobenzidina (DAB) (Sigma, St. Louis, MO) e 0,1% de peróxido de hidrogênio a 30% (Sigma, St. Louis, MO) à temperatura ambiente. Outras seções foram tratadas como acima, exceto que o anticorpo primário foi omitido do meio de incubação. Estas seções permaneceram praticamente livres de imunocoloração e serviram como controles negativos. Seguindo a reação DAB, as seções foram montadas em lâminas revestidas com gelatina e contrastadas com cresil violeta (Sigma, St. Louis, MO). Todas as seções foram finalmente secadas com ar, desidratadas em graus ascendentes de etanol, limpas em xileno, e lameladas com meio de montagem DPX (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA). Hibridização in situ para Nurrl e DAT

[145] Uma sonda específica RNA (CRNA) complementar rotulada [*S]UTP foi usada para avaliar os níveis de mRNA de tecido de Nurrl, um receptor nuclear, em associação com o sistema DAergico (Zetterstrom et al., 1997). A sonda cRNA para Nurrl decorre de um bp 403 (número de acesso no banco de gens: 1504-1907 NM 013613) fragmento EcoRI-BamHI de um camundongo completo Nurrl cDNA subclonado em pBluescript SK + e linearizado com Xba 1.

[146] A sonda DAT, um fragmento de comprimento 2238 bp, foi clonado em pBluescript II SK + plasmídeo. A linearização foi efetuada com a enzima Notl. Sonda anti- sentido foi sintetizada com [35S] UTP e T7 RNA polimerase.

[147] Sondas de sentido, também foram geradas por esses marcadores e nenhum sinal específico foi obtido (dados não mostrados). As seções cerebrais foram hibridadas seguindo os procedimentos descritos abaixo e protocolos previamente publicados (Beaudry et al., 2000; Cossete et al, 2004, Lapointe et al., 2004).

[148] Este protocolo in situ foi realizado em condições de livres de RNAse. As fatias foram montadas em lâminas Snowcoat x-tra* (Surgipath, Winnipeg, Canadá) e armazenadas sob vácuo durante a noite antes de usar. As seções cerebrais foram fixadas em 4% de PFA pH 7,4 à temperatura ambiente durante 20 min. O pré-tratamento foi feito com vários banhos consecutivos (PBS 0,1 M, duas vezes min, proteinase K 0,1 ug/ml, 10 min a 37ºC, banho de acetilação (0,25% de anidrido acético, trietanolamina O,1l M) 10 minutos, duas vezes durante 5 min em citrato salino padrão (SSC) (NaCl 0,3 M, citrato de sódio 30 mM)). Banhos sucessivos de soluções de etanol (30%, 60%, 100%, 100%, 3 min cada) foram realizados para a desidratação. A hibridação in situ das ribossondas em seções de tecido foi realizada a 58ºC durante a noite num tampão de hibridação padrão (desionizada formamida a 50%, cloreto de sódio 5 M, Tris 1 M, EDTA 0,5 M, solução de Denhart 50X, sulfato de dextrana a 50%, tRNA 10 mg/ml, DTIT 1 M, **S acoplado 2x106 cpm/ul da sonda). O pós-tratamento foi realizado utilizando diferentes banhos sucessivos: SSC 4X (30 min), remoção de lamelas, SSC 2X duas vezes (5 min), RNase A 20 pg/ml (1 h), a 37ºC, água milliQ duas vezes (15 s), SSC 2X (15 min), SSC 0,5 X (30 min) a 60ºC, SSC 0,1 X (30 min) a 60ºC, SSC 0,1 X (5 min) a temperatura ambiente. Soluções de banhos sucessivos de etanol (30%, 60%, 100%, 100%, 3 min cada) foram usados para uma desidratação adicional. Seções de tecidos foram colocados contra filmes sensíveis radioativos BiomaxMR (Kodak, New Haven, CT). Autorradiogramas foram desenvolvidos após uma exposição de 72 h para Nurrl e 5 h de exposição para DAT.

[149] Desengorduramento foi realizado com 4 banhos de etanol, 2 banhos de xilol e 3 banhos de etanol. Após estas etapas, as lâminas foram mergulhadas em emulsão NTB (Kodak, New Haven, CT), fundida a 42ºC, seco ao ar durante 4 horas e armazenada no escuro durante 5 dias a 4ºC. A emulsão foi, então, desenvolvida (3,5 min) em revelador D-19 (Kodak, New Haven, CT), enxaguado em água desionizada e fixo (5 min) numa solução de fixador rápido da Kodak. As lâminas foram lavadas em água desionizada durante 1 hora e depois coradas. A coloração foi realizada com tionina (1 min), seguido por água e etanol, em seguida, três banhos de etanol (1 min) e três banhos de xileno (3 min). As lâminas foram lamínulas com meios de montagem DPX.

Análises Western-blot

[150] As amostras foram homogeneizadas em 8 volumes de tampão de lise (150 mM de NaCl, 10 mM de NaH/;POs, 1% (v/v) de Triton X-100, 0,5% de SDS, e desoxicolato de sódio a 0,5%) contendo um coquetel de inibidores de protease (Roche, Mississauga, ON, Canadá) e inibidores de fosfatase (Sigma, St-Louis, MO, EUA). As amostras foram sonicadas (3 x 10 segundos) e centrifugadas a 100.000 gq durante 20 min a 4ºC. O sobrenadante foi coletado e armazenado a -80ºC. A concentração de proteína em cada fração foi determinada através um kit de ensaio de proteína do ácido bicinconínico. Vinte ug de proteína total por amostra foram adicionados ao tampão de carga Laemmli e aquecidas a 95ºC durante 5 min. As amostras foram então carregadas e submetidas a eletroforese em gel em SDS-poliacrilamida (12%). As proteínas foram eletrotransferidas para membranas Immobilon PVDF 0,45 um (Millipore, Billerica, MA, EUA) e bloqueadas em 5% de leite em pó desnatado e 1% de BSA em PBS 1X durante 1 h. Membranas foram imunotransferidas com anticorpos primários de coelho anti-TH (Pel-Freez; 1:5.000), coelho ant-BAX (tecnologia de sinalização Cell Danvers, MA; 1:1.000), coelho anti-Bcl2 (tecnologia de sinalização Cell; 1:1000), camundongo anti-actina (ABM Inc., Richmond, BC, Canadá; 1:10.000), e com os anticorpos secundários apropriados, de cabra anti-coelho ou anti- camundongo (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA; 1:100.000), seguido pela adição de reagentes de quimiluminescência (KPL, Mandei Scientific, Guelph, ON, Canadá). Intensidades das bandas foram quantificadas usando um sistema de imagem digital ImageQuant Las 4000 (Laboratório de Ciências 2003 calibre de imagem versão Software 4.2, Fujifilm, New Haven, CT). Medições densitométricas de níveis Nurrl e DAT de mRNA

[151] Níveis de rotulagem autoradiográfica foram quantificados por densitometria computadorizada. Imagens digitalizadas do cérebro e as suas análises foram feitas com o mesmo equipamento, como mencionado acima. A densidade óptica dos autorradiogramas foi traduzida em yunCi/g de tecido utilizando padrões de radioatividade “C (padrões ARC de 146-*C, American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO). Nurrli e os níveis de DAT mRNA foram medidos na substância nigra compacta (SNc) utilizando níveis antero- posteriores semelhantes para todas as seções. A rotulagem média para cada nível de SNc foi calculada a partir de 3 seções cerebrais adjacentes do mesmo camundongo. Intensidades de fundo retiradas de áreas brancas da substância nigra reticulata (SNR) desprovida de Nurrl ou níveis de DAT mRNA foram subtraídos de cada medição. Quantificação estereológica dos neurônios TH-imunorreativos

[152] A perda de neurônios DAergic foi determinada por contagens estereológicas de células imunorreativas-TH (somas identificáveis), sob iluminação de campo claro. Cada 10º seção através do SNc foi analisada utilizando o software investigador Stereo (MicroBrightfield, Colchester, VT, EVA), ligado a um microscópio Nikon E800 (Nikon Canada Inc., Mississauga, ON, Canadá). Após a delimitação do SNc em baixa ampliação (objetivo 4X), uma grade de pontos foi coberta em cada seção. Para o nível mais rostral do SNc analisado (bregma, 3,08 milímetro), o SNc foi delineado pelas fronteiras visíveis com o núcleo do terminal medial. Para o intermediário (bregma - 3,28 milímetros) e níveis mais caudais do SNc analisados (bregma-3,58 milímetros), a estrutura foi demarcada pela saída do terceiro nervo craniano. Células imunomarcadas foram contadas pelo método de fracionamento óptico a uma ampliação maior (20x objetivo). As variáveis de contagem foram as seguintes: distância entre quadros de contagem (150 uM X 150 um),

contando tamanho do quadro (75 mm) e espessura da zona de guarda (1 um). As células foram contadas apenas se elas não cruzavam as linhas proibidas. O método de fracionamento óptico (Glaser e Glaser, 2000) foi usado para contar células TH-positivo (TH- e cresil violeta positivas) e TH- negativo (cresil violeta positiva). Contagem de células estereológicas foram realizadas às cegas por dois investigadores independentes. Note-se que as análises de perfis de TH-imunorreativos foram restringidos ao SNc, e, portanto, excluída a área tegmental ventral (VTA). Análises estatísticas e preparação de imagem

[153] Todas as análises são expressas como a média de grupo t SEM. Dados referentes ao experimento nº. 1 e 2 foram avaliados por ANOVA de duas vias. Quando o ANOVA de duas vias gerou termos de interação não significativas, os dados foram analisados para a significância utilizando o teste de comparação múltipla de Tukey post hoc. Em todos os casos, um valor de P inferior a 0,05 foi considerado significativo. Fotomicrografias foram tiradas por software Picture Frame (Microbrightfield) acoplado a um microscópio Nikon E800 (Nikon Instruments, Toronto, ON). As imagens foram finalizadas para ilustração usando o Adobe Photoshop cs3.

RESULTADOS Os efeitos da cistamina no sistema DAergic Efeitos neuroprotetores do cistamina em um modelo de camundongo MPTP subagudo

[154] Avaliação histológica Endpoint foi conduzida em todos os camundongos compreendidas neste estudo para investigar os efeitos benéficos da cistamina utilizando diversos marcadores específicos relacionados ao sistema de DA. TH é a enzima limitante na biossíntese de DA e um marcador para neurônios DA. Nurrl é um fator de transcrição envolvidos na manutenção do fenótipo DAergico e o transportador de dopamina, DAT, é um marcador muito específico dos profissionais neurônios nigrostiatais DAergic e, assim, à sua expressão reflete o estado de saúde neuronal DAergico.

[155] O tratamento com MPTP gerou uma perda significativa de neurônios TH-imunorreativos que estava associado com uma perda concomitante de neurônios Nissl corados em SNpc, consistente com uma degeneração de neurônios DA em oposição a uma regulação negativa da expressão de TH (p <0,001, Fig. l1.). Isto foi acompanhado por uma diminuição significativa na nigral Nurrl e os níveis de mRNA no DAT em SNpc (p <0,01, Figura 2,.. Pp <0,001, Fig. 3). A administração diária de droga de 10 mg/kg de cistamina iniciada dois dias antes da intoxicação com MPTP, confirmando a sua ação neuroprotetora como revelado pelo aumento da densidade de células TH- imunorreativas em SNpc (p <0,001, Fig. l1.), em relação aos animais não tratados com MPTP. A análise post-mortem do sistema de DA em camundongos pré-tratados com cistamina demonstraram também a normalização dos níveis de Nurrl de mMRNA (p <0,01; Fig. 2), bem como a densidade de neurônios SNpc que expressam DAT (p <0,01, fig. 3).

Potencial de neuroresgate de cistamina em um modelo de camundongo MPTP subagudo

[156] As propriedades neuroresgate de tratamento de cistamina foram avaliadas a partir de 24 horas após a última injeção de MPTP. Nos camundongos pós-tratados com 10 mg/kg de cistamina, neurotoxicidade DAergic induzida por MPTP foi também significativamente reduzida. Camundongos tratados com cistamina após a lesão com MPTP exibiram um número significativamente maior de neurônios TH-positivos e de Nissl positivo (p <0,01, Figura 1.), bem como um nível elevado de Nurrl (p <0,5, Fig. 2.) E DAT (p <0.5, Fig. 3.) MRNA, comparáveis aos observados em camundongos não tratados com MPTP.

[157] Em geral, as avaliações destes três marcadores específicos relacionados com o sistema DA produziu padrões semelhantes e mostrou os efeitos benéficos de um tratamento de pós-MPTP de cistamina, não confinando cistamina a neuroproteção, mas estendendo as propriedades de cistamina para neuroresgate.

[158] Para concluir sobre a capacidade da cistamina não somente para impedir (neuroprotetor), mas também para impedir (neuroresgate) o processo neurodegenerativo, OS inventores realizaram um estudo a fim de definir o tempo de curso da degeneração relacionada a DA do modelo MPTP utilizado nestes experimentos.

Tempo de curso de células de degeneração de nigral DAergic induzida pela administração subaguda de MPTP

[159] A perda de neurônios TH-positivos e de Nissl positivo variou entre 20% e 27% nos grupos de MPTP sacrificados desde o dia 1 até ao dia 14 alterados pela última injeção de MPTP, mas era estatisticamente significativa apenas no dia 7 e l4, em comparação com os grupos de solução salina correspondente (p <0,01, fig. 4). Apesar da ausência de uma perda significativa de células

TH-positiva no dia 1, uma redução significativa em Nurrl e os níveis de DAT mRNA em SNpc (p <0,05, fig. 5) foi observada, indicando alguma vulnerabilidade dos neurônios DA. Além disso, as proteínas pró e anti-apoptótica BAX e BCl2, foram, respectivamente, aumentadas e diminuídas 24 h alteradas pela última injeção de MPTP como avaliado por análises de Western-blot (p <0,05, fig. 6). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que, embora os neurônios DAergic não começaram a degenerar 24 horas alterados pela última injeção de MPTP, eles estão engajados na via apoptótica. Importante, este apoio que o efeito benéfico de cistamina é de natureza de neuroresgate.

RESULTADOS Efeitos da cistamina no sistema DAergic Exemplo 2: Metabolismo de cistamina e propriedades de transporte cerebrais Animais e administração de cistamina

[160] Jovens adultos (idade de 9 semanas, 25 9), camundongos machos C57BL/6 foram adquiridos de Charles River Laboratories (Montréal, QC, Canadá). Os animais foram alojados quatro por gaiola sob condições padrão com acesso livre à comida e água, randomizado e mantido nas mesmas condições por um investigador. Todos os experimentos foram realizados em conformidade com a Canadian Council on Animal Care e foram aprovados pelo Cornmittee Institucional do Centro Hospitalar de l'Université Laval (CHUL). Durante todo o experimento, o estado de saúde de todos os camundongos incluídos no estudo da saúde foi acompanhada de perto. Para identificar claramente o intermédio ativo a seguir à injeção de cistamina, bem como para compreender o seu metabolismo sistêmico e cerebral, uma única injeção intraperitoneal (i.p.) de cistamina foi administrada a camundongos machos adultos normais C57BL/6, por meio de três doses diferentes: 10, 50, e 200 mg/kg, como determinado em publicações anteriores (Tremblay, et al. 2006, Gibrat et al. 2010). Estas doses foram finalmente comparadas com injeções de solução salina. Cistamina foi dissolvida em solução salina estéril (0,9%) e injetada 1, 3, 12, 24 e 48 h antes do abate. Os animais foram sacrificados sob anestesia profunda com cetamina/xilazina e perfundidos através de perfusão intracardíaca com 0,1 M de solução salina tamponada com fosfato. Após a perfusão intracardíaca, os cérebros foram coletados, congelados em 2-metil-butano e, em seguida, armazenados a -80 º C até dissecção criostática para análises por HPLC. Um total de 200 camundongos foram atribuídos a este estudo (n = 10 por grupo). Medições de HPLC de cisteína e cisteamina

[161] HPLC acoplado a um detetor de fluorescência foi utilizado na quantificação de cisteína e cisteamina de ambos os conjuntos de experimentos: o estudo de dose- resposta e em procedimentos de perfusão cerebral in situ (ISCP). Córtex frontal foram homogenizado em 200 ul de NaHCO; e, em seguida, centrifugado a 15 700 g (4ºC) durante min. Cinquenta pl do sobrenadante foram diretamente derivados com 30 nl de reagente de 4-fluoro-7- sulfamoilbenzo-furazano (ABD-F). A reação de alquilação foi concluída a 55ºC durante 15 min e interrompida com 4,9 ul de HCl 12 N.

[162] Após uma centrifugação de 10 min a 7500 g (4ºC), o sobrenadante foi imediatamente injetado no cromatógrafo consistindo de um Waters 717 mais injetor automático amostrador fixado em 4ºC, uma bomba binária Waters 1525 equipada com uma coluna Atlantis DC18 (3 ul, 3,9 x 150 mm) e um detetor de Absorvância Dual Waters 2487 (Waters limitada, Lachine, QC, Canadá). A excitação foi fixada em 385 nm e emissão a 515 nm. A fase móvel, que consistiu em 2,5% de metanol e acetato de amónio 0,1 M ajustado ao pH 4,0, foi fornecido a 1 ml/min (Santa et al. 2006). Os picos foram identificados e quantificados usando software Breeze (Waters limitada). Quantificações de HPLC foram normalizadas para as concentrações de proteína. Medições de proteína foram determinadas com um kit de ensaio de proteína de ácido bicinconínico (Pierce, Rockford, IL, EUA), como descrito por protocolo do fabricante. Medições de HPLC de taurina e hipotaurina

[163] Taurina e hipotaurina foram medidos por HPLC acoplado com detecção de UV. Sobrenadante de extratos cérebro de NaHCO; (bregma 1,54 a -0,58 mm) (ver a seção acima para mais detalhes) foram diretamente derivados com o reagente de cloreto de dansila (Sigma-Aldrich, St. Louis MO, EUA) com base em métodos publicados modificados (Saller e Czupryna 1989; Calon et al. 1999). Resumidamente, 50 L de cloreto de dansila(1,2 mg/ml) e 50 pl de solução de amostra ou padrão foram misturados e depois incubados durante 30 min a 90ºC. Após uma centrifugação de 10 min a 7500 g (4ºC), os sobrenadantes foram imediatamente injetados no cromatógrafo descrito acima. Absorbância foi fixada em 337 nm e sensibilidade na escala da unidade de absorbância 0,5. A fase móvel consistiu numa mistura de água-acetonitrila (88,5-11,35% v/v) contendo 0,15% (v/v) de ácido fosfórico e foi administrado a uma taxa de O,8 ml/min. Os resultados foram obtidos usando o mesmo método como descrito acima. Perfusão cerebral in situ

[164] A perfusão cerebral in situ (ISCP) foi realizada sob anestesia profunda induzida pela injeção i.p., de uma mistura de cetamina/xilazina (140/8 mg/kg) e como anteriormente descrito (Dagenais et al. 2000; Ouellet et al. 2009). Para garantir que 100% do perfusato atingiu a certificação, a artéria carótida comum direita foi cateterizada seguindo ligadura da ramificação externa (ver fig. 3a para a representação esquemática). O tórax foi então aberto, o coração retirado e a perfusão imediatamente iniciada a uma taxa de fluxo de 2,5 ml/min. A solução de perfusão consistiu de solução salina fisiológica tamponada de bicarbonato: 128 mM de NaCl, 24 mM de NaHCO3z, 4,2 mM de KCl, 2,4 mM de NaH;POs, 1,5 mM de CaCl;, 0,9 mM de MgCl,; e 9 mM de D-glucose. A solução foi gaseificada com 95% de O; e 5% de CO, para se obter um pH de 7,4 e subsequentemente aquecida a 37ºC. Em todos os experimentos, um marcador radiomarcado (“C-sacarose 0,3 pCi/ml) foi co-perfundido com cisteamina (259 UM) e cisteína (165 u1uM), como um marcador de certificação da integridade e do volume vascular. Quatro grupos distintos de camundongos naive (n = 3) foram avaliados neste estudo e foram perfundidos com cisteína, cisteamina, ou ambas as moléculas com o “c- sacarose sozinha, que serviu como controle.

[165] O procedimento foi terminado por decapitação do camundongo após 60 s de perfusão. O hemisfério cerebral direito foi recolhido e o córtex frontal foi dissecado e rapidamente congelado em gelo seco para as medições de HPLC de cisteína e cisteamina.

[166] O tecido cerebral restante deste hemisfério foi digerido em 2 ml de Solvable (Perkin-Elmer Life Sciences, Waltham, MA, EUA)), a 50ºC durante 48 h e misturado com 9 ml de coquetel de cintilação Hisafe (Perkin-Elmer Life Sciences). Alíquotas do líquido de perfusão foram tomadas antes de se adicionar o marcador radiomarcado por quantificação por HPLC e de alterar a sua passagem através da seringa e do cateter para contagem de cintilação, no final de cada experimento, para o cálculo do coeficiente de transporte cerebral (ver equação abaixo). Isótopo “Cc foi contado na digestão do cérebro e no perfusato num contador de cintilação Wallac (Perkin-Elmer Life Sciences). Os coeficientes de absorção de apuramento da cisteína e cisteamina (Clup; p1pl/9g/s) foram calculados a partir do volume medido da distribuição de cisteína ou cisteamina, corrigido com o espaço vascular determinado com a No- sacarose. O espaço vascular foi constante e com menos de 20 ul/g. A seguinte equação foi utilizada para cálculos finais, tal como previamente descrito (Dagenais et al. 2000).

Clup (pl gº s*) = Va, em que Va = Xcisteina = Xsacarose T Ceisteina perf Csacarose perf

[167] Vd (pl/g) representa o volume de distribuição do composto em estudo, T (s) é o tempo de perfusão, Xcisteina (ng/mg de tecido) Ou Xsacarose (dpm/g) é a quantidade de cisteína ou sacarose encontrada no córtex frontal ou no tecido restante do hemisfério, respectivamente. C é a concentração (ng/ul; dpm/ml) na solução de perfusão (cisteína servindo como um exemplo, na equação acima). Dados e análises estatísticas

[168] Todos os dados são expressos como média do grupo + S.E.M. Os dados foram analisados por ANOVAS de duas vias e analisados para a significância utilizando o teste t de student. Cada grupo foi comparada com o grupo 0 mg/kg, de pontos de tempo associados (1, 3, 12, 24 ou 48 h). Para os experimentos de ISCP, teste t de Student foram usados para analisar significância. Em todos os casos, um valor de p inferior a 0,05 foi considerado ser significativo. Resultados Efeito geral da administração de cistamina

[169] Ao longo do estudo dose-resposta, nenhuma morte foi relatada e todos os camundongos exibiram boa saúde, exceto para o grupo de 200 mg/kg de cistamina onde camundongos mostraram sinais de hipotermia (tremor) e sonolência (fechamento das pálpebras) durante um período de cerca de 2 h, conforme relatado anteriormente (Gibrat et al. 2010). Plasma e níveis de cisteína e cisteamina do cérebro após a administração de cistamina

[170] Para investigar os metabólitos encontrados no plasma e no cérebro de camundongos injetados com uma única dosagem de i.p de cistamina, um método HPLC altamente sensível foi utilizado e nos permitiu medir especificamente cisteamina e cisteína através de uma derivação de tiol (- SH) usando composto ABD-F antes da detecção de fluorescência (Figura 7a). Cisteamina foi indetectável no plasma dos camundongos tratados com cistamina. Contrariamente à expressão corporal, as análises das concentrações cerebrais de cisteamina e cisteína revelaram um aumento marcado de cisteamina no cérebro (fig. 7b). Este aumento foi observado em todas as três doses de cistamina administradas e em cada ponto de tempo definido para este estudo de dose-resposta. ANOVA de duas vias revelou diferenças significativas para ambos os fatores, doses e tempo, bem como uma interação significativa entre esses dois fatores (p < 0,0001). Testes post hoc revelaram aumentos significativos especificamente às 1 h pós-injecção para as doses 50 mg/kg (p < 0,05) e 200 mg/kg (p < 0,01) Níveis de cisteamina — permaneceram significativamente elevados de 3 horas após à administração de cistamina (p < 0,01) e progressivamente diminuído por meio de 48 horas, quando comparado com o grupo de solução salina. Administração de cistamina não afetou plasma de cisteína (dados não mostrados), ou os níveis cerebrais, mesmo com a dose mais elevada de 200 mg/kg (fig. 7c). Não houve quaisquer indicações de modificações significativas no plasma de cisteína e/ou níveis do cérebro por qualquer uma das doses ou pontos de tempo estudados. Plasma e níveis de taurina e hipotaurina do cérebro após a administração de cistamina

[171] Hipotaurina é um metabólito principal de cisteamina, que pode, em parte, gerar taurina. Para determinar a concentração destas duas moléculas, uma derivatização do grupo amino primário com cloreto de dansila antes da detecção de UV foi utilizada (Fig. 8a)

Esta reação tem lugar em ambos amina aromática e alifática, produzindo adutos de sulfonamida estáveis e permite a detecção de ambas hipotaurina (fig. 8a; composto 2) e taurina (fig. 8a; composto 1) dentro do mesmo método. Apesar de algumas variações entre os grupos, não se observou qualquer alteração significativa da hipotaurina e taurina do cérebro para qualquer uma das três doses (10, 50 ou 200 mg/kg) e, em comparação com grupos de controle (Fig. 8b e c). Não houve sinais de acumulação no cérebro de hipotaurina e taurina em qualquer um dos pontos de tempo de matar (1, 3, 12, 24 e 48 h). Os níveis plasmáticos permaneceram sob ou perto do limite de detecção. Cisteína facilita o transporte no cérebro de cisteamina

[172] Como uma vasta maioria de compostos exógenos e endógenos são inativos no CNS, porque não atravessar a BBB, os inventores investigaram a captação no cérebro de cisteamina e cisteína. Usando ISCP, os inventores mediram os parâmetros de transporte de sangue do cérebro de cisteamina e cisteína, infundindo diretamente o cérebro através da artéria carótida (Dagenais et al. 2000; Ouellet et al. 2009) (Fig. 9a). Ambos cisteína e cisteamina atravessou a BBB, como observado por seu coeficiente de transporte do cérebro (Clup), o que correspondeu a 4,39 + 0,47 e 0,15 + 0,02 nl/g/s, respectivamente (Fig. 9b e c) Em comparação, uma droga CSN rotineiramente utilizada, como a morfina, exibe uma Clup de 0,3 1pl/g/s, enquanto que drogas altamente difusíveis como diazepam ou ácidos graxos exibem um Clup que atinge até 40 npl/g/s (Bourasset et al. 2003; Ouellet et al. 2009 ). Curiosamente, a co-perfusão de cisteíina e cisteamina potenciou a sua penetração no cérebro. Com efeito, o aumento significativo do Clup da cisteamina (+133%, p <0,05) e de cisteína (+59%, p <0,05) foi medido quando ambos os compostos foram injetados simultaneamente. Hipotaurina e taurina, que foram mostrados para atravessar a BBB, não foram reavaliados (Benrabh et al. 1995). EXEMPLO 3 Propriedades neuroresgate e neurorestauração de cistamina após administração intraestriatal de 6-OHDA Material e método Animais

[173] Camundongos C57BL/6 machos adultos jovem (9 semanas de idade, 25 gramas) foram adquiridos da Charles River Laboratories (Montréal, QC, Canadá). Os animais foram alojados 4 por gaiola, sob condições padrão com acesso livre a alimento e água, randomizado e manipulados sob as mesmas condições por um investigador. Todos os experimentos foram realizados em conformidade com a Canadian Council on Animal Care e foram aprovados pelo Comitê Institucional do Centro Hospitalar de l'Université Laval (CHUL). Durante todo o experimento, o status de saúde de todos os animais incluídos no estudo foi acompanhado de perto para perda de peso ou outros sinais de problemas relacionados com a saúde. Todos os esforços foram feitos para minimizar a dor e desconforto do animal. Tratamento com 6-OHDA e cistamina

[174] Este protocolo foi baseado na injeção intraestriatal estereotáxica unilateral de e- hidroxidopamina (6-OHDA). Administração intraestriatal de 6-OHDA cria alterações degenerativas — progressivas e retrógradas nos neurônios DA da substantia nigra (Bjorklund et al, 1997, Costantini et al., 2001). Os camundongos foram anestesiados utilizando isoflurano e colocados sobre uma estrutura estereotáxica adaptada para camundongos. 6-OHDA foi dissolvida a uma concentração de 2 ug/ml em 0,9% de solução salina e 0,02% de ácido ascórbico e de 2 ul foi injetado no estriado direito a uma taxa de 0,5 ul/min. A agulha foi deixada no local por 3 min após a injeção antes de retração. A injeção foi realizada utilizando uma seringa Hamilton de acordo com as coordenadas estereotáxicas: AP: +0,04 cm, ML: -0,18 cm, DV: -0,3l cm (correspondente ao atlas de Allan P. 2008).

[175] Para servir como controle, outros camundongos foram submetidos aos mesmos procedimentos cirúrgicos, mas somente 2 pl de solvente (0,9% de solução salina e 0,02% de ácido ascórbico) foi injetado nas mesmas coordenadas. O estudo foi dividido em dois experimentos distintos: 1) Os efeitos neuroresgate de cistamina (dicloridrato de cistamina, Sigma, St. Louis, MO) em camundongos com 6-OHDA lesionados. Para este experimento, a primeira injeção por via i.p. de 10 mg/kg de cistamina foi administrada três dias após a cirurgia e o tratamento continuou diariamente durante 14 dias.

2) Os efeitos neurorestauração de cistamina (dicloridrato de cistamina, Sigma, St. Louis, MO) em camundongos com 6- OHDA lesionados. O tratamento com cistamina começou três semanas após a cirurgia, quando a lesão dopaminérgico (DAergic) é conhecida por ser estável e atingiu o seu pico. O tratamento foi continuado diariamente durante 6 semanas.

[176] Os efeitos da cistamina sobre a toxicidade de 6- OHDA foram estudados nos seguintes grupos experimentais:

Grupo I, placebo + solução salina, Grupo II, 6-OHDA + solução salina; Grupo III; placebo + cistamina; Grupo IV, 6-OHDA + cistamina. No total, 40 camundongos (n = 10 por grupo) foram utilizados para cada experimento, monitorados diariamente para a variação de peso, e finalmente sacrificados por perfusão 24 horas após a última injeção de cistamina (ou veículo). Os resultados são mostrados nas Figuras 10, 11 e 12.

Perfusão e processamento de tecidos

[177] Os animais foram sacrificados sob anestesia profunda com cetamina/xilazina (Vetalar, Bioniche, Belleville, ON/Rompun, Bayer, Toronto, ON). Todos OS camundongos foram submetidos a perfusão intracardíaca com 0,1 M de solução salina tamponada com fosfato (PBS) livre de RNAse. Depois da perfusão intracardíaca, os cérebros foram recolhidas e o cérebro posterior de cada um dos camundongos, compreendendo a totalidade do mesencéfalo foi pós-fixada em 4% de PFA para adicional análises por imuno- histoquímica e hibridação in situ. O cérebro anterior, que compreende o corpo estriado direito e esquerdo, foi congelado e utilizado para análises de HPLC e WB.

[178] Quantificação de catecolamina por HPLC, imuno- histoquímica para TH e hibridação in situ para Nurrl e DAT foram conduzidos como descrito no exemplo 1.

Medições densitométricas de níveis de Nurrl e DAT mRNA

[179] Níveis de rotulagem autoradiográfica foram quantificados por densitometria computadorizada. Imagens cerebrais digitalizadas e suas análises foram feitas com o mesmo equipamento, como mencionado acima. A densidade óptica dos autorradiogramas foi traduzida em yunCi/g de tecido, utilizando padrões de radioatividade e (padrões ARC 146-%C, American Radiolabelled Chemicals Inc., St. Louis, MO). Níveis de Nurrl e DAT mRNA foram medidos na substância nigra compacta (SNc) utilizando níveis antero- posteriores semelhantes para todas as seções. A rotulagem média para cada nível de SNc foi calculada a partir de três seções cerebrais adjacentes do mesmo camundongo. Intensidades de fundo retiradas de áreas brancas da substantia nigra reticulata (SNR) desprovidas dos níveis de Nurrl ou DAT mRNA foram subtraídos de cada medição. Quantificação estereológica dos neurônios TH-imunorreativos

[180] A perda de neurônios DAergic foi determinada por contagens de estereologia de células TH-imunorreativas (somas identificáveis) sob iluminação de campo brilhante. Cada seção 10 através da SNc foi analisado utilizando oO software investigador Stereo (MicroBrightfield, Colchester, VT, EVA), ligado a um microscópio Nikon E800 (Nikon Canada Inc., Mississauga, ON, Canadá). Após a delimitação da SNc em baixa ampliação (objetiva 4X), uma grade de pontos foi coberto em cada seção. Para o nível mais rostral de SNc analisado (bregma, 3,08 mm), a SNC foi delineada pelas fronteiras visíveis com o núcleo do terminal médio. Para os níveis intermediários (bregma-3,28 mm) e mais caudal de SNc analisados (bregma-3,58 milímetros), a estrutura foi demarcada pela saída do terceiro nervo craniano. Células imunomarcadas foram contabilizadas pelo método de fracionamento óptico a maior ampliação (objetiva 20X). As variáveis de contagem foram as seguintes: distância entre quadros de contagem (150 um X 150 um), contando tamanho do quadro (75 um) e protetor de espessura da zona (1 um). As células foram contadas apenas se eles não cruzem as linhas proibidas. O método de fracionamento óptico (Glaser e Glaser, 2000) foi usado para contar as células que expressam TH-positivas (TH- e cresil violeta positivo) e TH-negativas (cresil violeta positivo apenas). Contagem de células estereológicas foram realizadas às cegas por dois investigadores independentes. Nota-se que a análise dos perfis de TH-imunorreativos foram restringidos ao SNc, e, portanto, excluído a área tegmental ventral (VTA). Rotação induzida por apomorfina

[181] Comportamento rotacional é considerado para representar uma medida fisiológica fiável da depleção DA e a estimulação de receptores DA assimétricos. Através da aplicação de agonistas de DA, tais como apomorfina (Anden et al., 1966; Ungerstedt et al., 1968), os receptores de DA são diretamente estimulados levando a rotação contralateral ao hemisfério DA-empobrecido. os camundongos foram desafiados com a apomorfina (0,5 mg/kg, Sigma-Aldrich) a 3, 6 e 9 semanas após a lesão, e comportamentos de rotação foram avaliados durante 45 min, utilizando um sistema de rotâmero automatizado. Os resultados foram calculados e expressos como rotação net (= número de rotações contralaterais - número de rotações ipsilaterais) como descrito anteriormente (Metz, 2002). Animais foram deixados habituar durante 5 min após a injeção antes da gravação de rotações começarem. Teste de passos

[182] O teste de passos de ajuste foi adaptado a partir de estudos em ratos (Lindner et al., 1995) e os camundongos tratados com MPTP (Blume et al., 2009). Os camundongos foram mantidos pela base da cauda, com os seus membros posteriores suspensos por cima da mesa e movidos para trás, a uma taxa constante de modo a que eles percorreram 1 metro de distância ao longo de 3-4 s. Os camundongos foram vídeo- gravados com uma câmera de vídeo digital (Sony Handcam, DCR-HC90E PAL), mas o vídeo foi analisado desligado através da contagem do número de passos de ajuste feitos com a pata contralateral ou ipsilateral, em relação ao hemisfério lesionado, ao longo da distância total. Três experimentos foram realizados com camundongos em 3 semanas, 6 semanas e 9 semanas após a cirurgia e dados médios foram calculados através de ensaios. Teste do cilindro

[183] O teste (cilindro) do uso do membro de assimetria, que mede o peso de rolamento dos movimentos dos membros anteriores durante a criação, foi mostrado ser um bom indicador da perda celular no nigroestriatal em ratos e camundongos injetados com 6-OHDA unilaterais (Schallert et al., 2000; Tillerson et al., 2001;. Lundblad et al., 2004; Lancu et al., 2005). Para examinar diagonalmente de lado na utilização espontânea do membro anterior durante a atividade exploratória, os camundongos foram colocados individualmente dentro de um cilindro de vidro (10 centímetros de diâmetro, 14 cm de altura), que foi colocado em frente de dois espelhos verticais, a fim de ser capaz de visualizar os camundongos de todos os ângulos. Camundongos foram imediatamente vídeo gravados por 3 min. Nenhuma habituação dos animais ao cilindro de teste foi permitido antes da gravação de vídeo. As gravações de vídeo foram,

então, examinadas para contar o número de toques de suporte de parede (contatos com dígitos totalmente estendidos) executados de forma independente com o membro anterior ipsilateral e contralateral à lesão. Uma medida da utilização da assimetria dos membros anteriores foi obtida expressando os toques realizados pela pata contralateral à lesão (pata direita) como uma percentagem do número total de toques, em cada sessão. Análises estatísticas

[184] Todas as análises são expressas como a média do grupo t SEM. Os dados foram analisados ANOVA de duas vias. Quando ANOVA de duas vias gerou termos de interação não significativas, os dados foram posteriormente analisados para a significância utilizando o teste de comparação múltipla de Tukey post hoc. Em todos os casos, um valor de P inferior a 0,05 foi considerado significativo.

REFERÊNCIAS Allen P. Allen brain atlas. Seattle (WA): Allen Institute for Brain Science; 2008. Disponível de: http://www.brain-map.org. Anden, N.E., Dahlstrom, A., Fuxe, K., Larsson, K., 1966. Functional role of the nigrostriatal dopamine neurons. Acta Pharmacol. Toxicol. 24,236-274. Bacq Z. M. and Beaumariage M. L. (1965) Radioprotective action of cysteamine and cystamine in mice as a function of the period of time between injection of the protector and the start of X-Ray irradiation. Arch. Int. Pharmacodyn. Ther 153, 457-459.

Beaudry G, Langlois MC, Weppe I, Rouillard C, Levesque D.

Contrasting (2000) patterns and cellular specificity of transcriptional regulation of the nuclear receptor nerve growth factor-inducible B by haloperidol and clozapine in the rat forebrain.

J Neurochem 2000; 75:1694-702. Benrabh H., Bourre J.

M. and Lefauconnier J.

M. (1995) Taurine transport at the blood-brain barrier: an in vivo brain perfusion study.

Brain Res. 692, 57-65. Bjorklund, A., Rosenblad, C., Winkler, C., Kirik, D., 1997. Studies on neuroprotective and regenerative effects of GDNF in a partial lesion model of Parkinson's disease.

Neurobiol Dis 4, 186-200. Blume SR, Cass DK, Tseng KY.

Stepping test in mice: a reliable approach in determining forelimb akinesia in MPTP-induced Parkinsonism.

Exp Neurol 2009;219:208-11. Borrell-Pages M., Canals J.

M., Cordelieres F.

P. et al. (2006) Cystamine and cysteamine increase brain levels of BDNF in Huntington disease via HSJlb and transglutaminase.

J.

Clin.

Invest 116, 1410-1424. Bouckenooghe T., Remacle C. and Reusens BB. (2006) Is taurine a functional nutrient? Curr: Opin.

Clin.

Nutr.

Metab.

Care 9, 728-733.

Bourasset F., Cisternino S., Temsamani J. and Scherrmann JJ. M. (2003) Evidence for an active transport of morphine-6- beta-d-glucuronide but not P-glycoprotein-mediated at the blood-brain barrier. J. Neurochem. 86, 1564-1567. Bousquet M, Gibrat C, Saint-Pierre M, Julien C, Calon F, Cicchetti F. Modulation of brain-derived neurotrophic factor as a potential neuroprotective mechanism of action of omega-3 fatty acids in a parkinsonian animal model. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 2009 Nov 13;33(8) :1401-8. Epub 2009 Jul 24. Bousquet M., Gibrat C.,Ouellet M., , Rouillard C., Calon F., and Cicchetti F. (2010) Cystaminemetabolism and brain transport properties: clinical implications for neurodegenerative diseases. J. Neurochem. (2010) 114, 1651-

1658. Bousquet M, Gue K, Emond V, Julien P, Kang JX, Cicchetti F, Calon F. Transgenic conversion of omega-6 into omega-3 fatty acids in a mouse model of Parkinson's disease. JJ Lipid Res. (2011) Feb;52(2):263-71. Epub 2010 Nov 29. Calon F., Morissette M., Goulet M., Grondin R., Blanchet P. J., Bedard P. J. and Di Paolo T. (1999) Chronic Dl and D2 dopaminomimetic treatment of MPTP-denervated monkeys: effects on basal ganglia GABA(A)/benzodiazepine receptor complex and GABA content. Neurochem. Int 35, 81-

91.

Calon F. et al., Effect of MPTP-induced denervation on basal ganglia GABA(B) receptors: correlation with dopamine concentrations and dopamine transporter.

Synapse 2001, June 1;40(3) :225-34. Calon F. et al., Changes of GABA receptors and dopamine turnover in the postmortem brains of parkinsonians with levodopa-induced motor complications.

Mov Disord. 2003 Mar;18(3):241-53. Cavallini D., Scandurra R. and Demarco (CC. (1963) The enzymatic oxidation of cysteamine to hypotaurine in the presence of sulfide.

J.

Bio.

Chem. 238, 2999- 3005. Colosso R.

M., Hirschberger L.

L., Dominy J.

E., Lee J.

I. and Stipanuk M.

H (2006) Cysteamine dioxygenase: evidence for the physiological conversion of cysteamine to hypotaurine in rat and mouse tissues.

Adv.

Exp.

Med.

Biol. 583, 25-36. Costantini LC, Cole D, Chaturvedi P, Isacson O.

Immunophilin ligands can prevent progressivedopaminergic degeneration in animal models of Parkinson's disease.

Eur J Neurosci.

Mar.

Cossette M, Parent A, Levesque D.

Tyrosine hydroxylase- positive neurons intrinsic to the human striatum express the transcription factor Nurrl.

Eur JT NeuroSci. 2004;20:2089-95.

Dagenais C., Rousselle C., Pollack G.

M. and Scherrmann JJ.

M. (2000) Development of an in situ mouse brain perfusion model and its application to mdrla P-glycoprotein- deficient mice.

J.

Cereb.

Blood Flow Metab. 20, 381-386. Dedeoglu A., Kubilus J.

K., Jeitner T.

M. et al. (2002) Therapeutic effects of cystamine in a murine model of Huntington's disease.

J.

Neurosci. 22, 8942-8950. Dohil R., Fidler M., Gangoiti J.

A., Kaskel F., Schneider J.

A. and Barshop B.

A. (2009) Twice-daily cysteamine bitartrate therapy for children with cystinosis.

J.

Pediatr. 156, 71-75. Dominy J., Eller S. and Dawson R.

Jr (2004) Building biosynthetic schools: reviewing compartmentation of CNS taurine synthesis.

Neurochem.

Res. 29, 97-103. Dominy J.

E.

Jr, Simmons C.

R., Hirschberger L.

L., Hwang J., Coloso R.

M. and Stipanuk M.

H. (2007) Discovery and characterization of a second mammalian thiol dioxygenase, cysteamine dioxygenase.

J.

Biol.

Chem. 282, 25189-25198. Dubinsky R. and Gray C. (2006) CYTE-I-HD: phase I dose finding and tolerability study of cysteamine (Cystagon) in Huntington's disease.

Mov.

Disord. 21, 530-533. Ewetz L. and Sorbo B. (1966) Characteristics of the cysteinesulfinate-forming enzyme system in rat liver.

Biochim.

Biophys.

Acta 128, 296-305.

Fox J.

H., Barber D.

S., Singh B. et al. (2004) Cystamine increases L-cysteine levels in Huntington's disease transgenic mouse brain and in a PC1l2 model of polyglutamine aggregation.

J.

Neurochem. 91, 413-422. French E.

D., Vezzani A., Whetsell W.

O.

Jr. and Schwarcz R. (1986) Anti-excitotoxic actions of taurine in the rat hippocampus studied in vivo and in vitro.

Adv.

Exp.

Med.

Biol. 203, 349-362. Gibrat C., Bousquet M., Saint-Pierre M., Levesque D., Calon F., Rouillard C. and Cicchetti F. (2010) Cystamine prevents MPTP-induced toxicity in young adult mice via the up- regulation of the brain-derived neurotrophic factor.

Prog.

Neuropsychopharmacol.

Biol.

Psychiatry 34, 193-203. Gibrat CC, Saint-Pierre M, Rouillard C, Cicchetti PF. (2007). Neuroprotective properties of cystamine in acute vs chronic models of Parkinson's disease.

The Canadian Journal of Neurological Sciences Suppl. 3 - S42. Gibrat C, Bousquet M, Saint-Pierre M, Lévesque D, Calon F, Rouillard (CC, Cicchetti FF. 2009. Neuroprotective mechanisms of cystamine in a murine model of Parkinson's disease.

Parkinsonism and Related Disorders 1582, S29-S199. Gibrat C, Saint-Pierre M, Bousquet M, Levesque D, Rouillard (CC, Ciccechetti F.

Differences between subacute and chronic MPTP mice models: investigation of dopaminergic neuronal degeneration and alpha-synuclein inclusions. JJ Neurochem (2009 B);109:1469-82. Green EH. (1993) Human genetic diseases due to codon reiteration: relationship to an evolutionary mechanism. Cell 74, 955-956. Huxtable R. J. (1992) Physiological actions of taurine. Physiol. Rev. 72, 101-163. Iancu R, Mohapel P, Brundin P, Paul G. Behavioral characterization of a unilateral 6-OHDA-lesion model of Parkinson's disease in mice. Behav Brain Res 2005;162:1-

10. Jeitner T. M., Delikatny E. J., Ahlqvist J., Capper H. and Cooper A. J. (2005) Mechanism for the inhibition of transglutaminase 2 by cystamine. Biochem. Pharmacol. 69, 961-970. Karpuj M. V., Becher M. W., Springer J. E., Chabas D., Youssef S., Pedotti R., Mitchell D. and Steinman L. (2002) Prolonged survival and decreased abnormal movements in transgenic model of Huntington disease, with administration of the transglutaminase inhibitor cystamine. Nat. Med. 8, 143-149. Lapointe N, St-Hilaire M, Martinoli MG, Blanchet J, Gould P, Rouillard C, et (2004) Rotenone induces non-specific central nervous system and systemic toxicity. FASEB 4. 2004;18:717-9. Lee J. I., Londono M., Hirschberger L. L. and Stipanuk M. H. (2004) Regulation of cysteine dioxygenase and gamma- glutamylcysteine synthetase is associated with hepatic cysteine level. J Nutr. Biochem. 15, 112-122. Lein ES, Hawrylycz MJ, et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature 2007;445:168-

76. Leonardi R., Zhang Y. M., Rock C. Oo. and Jackowski S. (2005) Coenzyme A: back in action. Prog. Lipid Res. 44, 125-153. Lindner MD, Winn SR, Baetge EE, Hammang JP, Gentile FT, Doherty E, et al. Implantation of encapsulated catecholamine and GDNF-producing cells in rats with unilateral dopamine depletions and parkinsonian symptoms. Exp Neurol 1995;132:62-76. 690. Lundblad M, Picconi B, Lindgren H, Cenci MA. A model of 1- DOPA-induced dyskinesia in 6-hydroxydopamine lesioned mice: relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function. Neurobiol Dis 2004;16:110-23. Martignoni M., Groothuis G. M. and de Kanter R. (2006) Species differences between mouse, rat, dog, monkey and human CYP-mediated drag metabolism, inhibition and induction.

Expert Opin.

Drug Metab.

Toxicol. 2, 875-894. Muramatsu M., Kakita K., Nakagawa K. and Kurivyama K. (1978) A modulating role of taurine on release of acetylcholine and norepinephrine from neuronal tissues.

Jpn.

JT.

Pharmacol. 28, 259-268. Ooja Ss.

Ss. and Saransaari P. (1996) Taurine as osmoregulator and neuromodulator in the brain.

Metab.

Brain Dis. 11, 153-164. Oldendorf W.

H. and Szabo J. (1976) Amino acid assigmnent to one of three blood- brain barrier amino acid carriers.

Am.

J.

Physiol. 230, 94-98. Ouellet M., Emond V., Chen C.

T., Julien C., Bourasset F., Oddo S., LaFerla E, Bazinet R.

P. and Calon F. (2009) Diffusion of docosahexaenoic and eicosapentaenoic acids through the blood-brain barrier: and in situ cerebral perfusion study.

Neurochem.

Int. 55, 476-482. Pasantes-Morales H., Arzate N.

E. and Cruz C. (1981) The role of taurine in nervous tissue: its effects on ionic fluxes.

Adv Exp Med Biol 139, 273-292. Pinto J.

T., Van Raamsdonk J.

M., Leavitt B.

R., Hayden M.

R., Jeitner T.

M., Thaler H.

T., Krasnikov B.

F. and Cooper A.

J. (2005) Treatment of YAC128 mice and their wild-type littermates with cystamine does not lead to its accumulation in plasma or brain: implications for the treatment of Huntington disease. J Neurochem 94, 1087-

1101. Pinto J. T., Khomenko T., Szabo S., McLaren G. D., Denton T. T., Krasnikov B. F., Jeitner T. M. and Cooper A. JJ. (2009) Measurement of sulfur-containing compounds involved in the metabolism and transport of cysteamine and cystamine. Regional differences in cerebral metabolism. UT Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 877, 3434-3441. Pitari G., Maurizi G., Flati V., Ursini C. L., Spera L., Dupre S. and Cavallini D. (1992) Enzymatic synthesis of S- aminoethyl-L-cysteine from pantetheine. Biochim Biophys Acta 1116, 27-33. Saller C. F. and Czupryna M. J. (1989) gamma-Aminobutyric acid, glutamate, glycine and taurine analysis using reversed-phase high-performance liquid chromatography and ultraviolet detection of dansyl chloride derivatives. UT Chromatogr 487, 167-172. Santa T., Aoyama C., Fukushima T., Imai K. and Funatsu T. (2006) Suppression of thiol exchange reaction in the determination of reduced-form thiols by high- performance liquid chromatography with fluorescence detection after derivatization with fluorogenic benzofurazan reagent, 7T-fluoro-2,1,3- benzoxadiazole-d4d-

sulfonate and 4-aminosulfonyl-7-fluoro-2,1,3- benzoxadiazole.

Biomed Chromatogr 20, 656-661. Schallert T, Fleming SM, Leasure JL, Tillerson JL, Bland ST.

CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury.

Neuropharmacology 2000;39:777-87. Sershen H. and Lajtha A. (1979) Inhibition pattern by analogs indicates the presence of ten or more transport systems for amino acids in brain cells.

J Neurochem 32, 719-726. Stack E.

C., Ferro J.

L., Kim J., Del Signore S.

JJ., Goodrich S., Matson S., Hunt B.

B., Cormier K., Smith K., Matson W.

R., Ryu H. and Ferrante R.

J. (2008) Therapeutic attenuation of mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurotoxin models of Parkinson's disease.

Biochim Biophys Acta 1782, 151-162. Sun L., Xu S., Zhou M., Wang C., Wu Y. and Chan P. (2010) Effects of cysteamine on MPTP-induced dopaminergic neurodegeneration in mice.

Brain Res. 1335, 74- 82. Tillerson JL, Cohen AD, Philhower J, Miller GW, Zigmond MJ, Schallert T.

Forced limb-use effects on the behavioral and neurochemical effects of 6-hydroxydopamine.

JI Neurosci 2001;21:4427-35.

Tremblay M. E., Saint-Pierre M., Bourhis E., Levesque D., Rouillard C. and Cicchetti FF. (2006) Neuroprotective effects of cystamine in aged parkinsonian mice. Neurobiol Aging 27, 862-870. Ungerstedt, U., 1968. 6-Hydroxydopamine-induced degeneration of central monoamine neurons. Eur. J. Pharmacol. 5, 5107-5110. Wade L. A. and Katzman R. (1975) Synthetic amino acids and the nature of L-DOPA transport at the blood-brain barrier. J Neurochem 25, 837-842. Wade L. A. and Brady H. M. (1981) Cysteine and cystine transport at the blood-brain barrier. J Neurochem 37, 730-

734. Wang X., Sarkar A., Cicchetti F., Yu M., Zhu A., Jokivarsi K., Saint-Pierre M. and Brownell A. L. (2005) Cerebral PET imaging and histological evidence of transglutaminase inhibitor cystamine induced neuroprotection in transgenic R6/2 mouse model of Huntington's disease. J Neurol Sci 231, 57-66. Zetterstrom, Rolf H. Ludmila Solomin, Lottie Jansson,Barry J. Hoffer, Lars Olson, Thomas Perlmann. Dopamine neuron agenesis in Nurrl-deficient mice. Science 1997 Apr 11;276(5310) :248-50.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um análogo de cistamina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para modificar a progressão da doença de Parkinson em um paciente.

2. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um análogo de cistamina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um agente de neuroresgate para modificar a progressão da doença de Parkinson em um paciente.

3. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um análogo de cistamina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um agente de neurorestauração para modificar a progressão da doença de Parkinson em um paciente.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser para: i) reduzir a fadiga em um paciente com doença de Parkinson; ii) reduzir a gravidade de sintomas não motores em um paciente com doença de Parkinson; iii) reduzir o declínio funcional em um paciente com doença de Parkinson; iv) reduzir a progressão clínica da doença; e/ou v) retardar a progressão clínica da doença.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o paciente é um paciente que está em fase precoce da doença de Parkinson.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o paciente com a doença de Parkinson é um paciente de fase III ou IV segundo a classificação de Hoehn e Yahr.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um análogo de cistamina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo está na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 750 mg/kg de peso corporal por dia ou cerca de 0,5 a cerca de 60 mg/kg/dia, ou cerca de 1 a cerca de 20 mg/kg/dia.

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações l1 a 6, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um análogo de cistamina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é adequada para ser administrada na forma de dosagem unitária contendo 5 a 2000 mg de ingrediente ativo por forma de dosagem unitária, ou 10 a 1500 mg de ingrediente ativo por forma de dosagem unitária, ou 20 a 1000 mg de ingrediente ativo por forma de dosagem unitária, ou 50 a 700 mg de ingrediente ativo por forma de dosagem unitária.

9. Combinação caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um análogo de cistamina e um agente adicional, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis para modificar a progressão da doença de Parkinson.

10. Combinação, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o análogo de cistamina e o agente adicional estão presentes em uma proporção de 10:01 a 1:10 de análogo de cistamina e de agente adicional, respectivamente.

11. Combinação, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o análogo de cistamina e o agente adicional estão presentes em uma proporção de 1:1.

12. Combinação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizada pelo fato de que o análogo de cistamina e o agente adicional são adequados para serem utilizados sequencialmente.

13. Combinação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizada pelo fato de que o análogo de cistamina e o agente adicional são adequados para serem utilizados simultaneamente.

14. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um análogo de cistamina ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis e que compreende cisteína ou seu sal farmaceuticamente aceitável.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o análogo de cistamina e a cisteína estão presentes em uma proporção de 10:1 a 1:10 de análogo de cistamina e cisteína, respectivamente.

16. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o análogo de cistamina e cisteína estão presentes em uma proporção de 1:1.

17. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizada pelo fato de que o análogo de cistamina e o agente adicional são adequados para serem utilizados sequencialmente.

18. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizada pelo fato de que o análogo de cistamina e o agente adicional são adequados para serem utilizados simultaneamente.

19. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, ou combinação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado pelo fato de que o análogo de cistamina é cisteamina, cistamina, taurina ou hipotaurina ou um sal farmaceuticamente aceitável das mesmas.

20. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, ou combinação de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado pelo fato de que o análogo de cistamina é cistamina Ou cisteamina ou um sal farmaceuticamente aceitável das mesmas.

21. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, ou combinação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado pelo fato de que o análogo de cistamina é cistamina ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma.

22. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, ou combinação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado pelo fato de que o análogo de cistamina é cisteamina ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma.

O 1 1/11 =. Figura 1 a D : Neurônios de TH nigral FONE ALEGRIA E SERA : oca ge

DIRETO RASA o MIRA, É É

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. Figura 2 a) Níveis de MPNA Nurrl es [3 a E 2 os : E Bus E mM 2 ES = Vaga [2 o ms A 2 6 So Soo 3 ri | E E e | 8 mm a = ou Ds É Solsalita Pós —pré isolsalha Pós pré.

Tratamento Sol.

Salina MPTP de lesões b) Sol. salina + Sol. saliha — MPTP + sol. salina MPTP + cist.

Pós-tratmento EE o GEE - F Tabaie o TERA A CEA - o NE EO TA Er FE Dn NARA o ÁS | mo Ve PIANO CNES o TON Na Ásia oo E po NE o ci SER ES O FER « 3 No É, bo A AE DE .. o EA Co É t Es To [ER CO AÊ) ã LÁ Lato O 0 >, ER, OR AE so FERAS:

| 3/11 Figura 3 > Sn i » e Neurônios de DAT nigral se a ooo jeto a Bs E E ã ARA AN O a : o AA 2 4000 opta "od 2 ss ud prima s Sadi «4 PAPERS à É oo SN sul z 2 = AE aro 3 8 Pouso 32 . PE, à * 200 EPA E asd ES o, TE LS k Eae o.

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Sol Satina Póst Pré Íf5olSalinaPós Pré Tratamento “ RT EE HW ãe SE TEARS 2 Sol.

Salina MPTP delesões 17Ér RENA à e : = sm semi mes res ess e A ne mes cem er Tratamento Contagem de células estereológicas Densidade óptica | Sol. solina + sol.

Salina | 35TI 2 152 2644 401145 Sol.

Salina + pós-tratamento cist 37244183 2.554 = 01604 Sol.

Salina + pré-tratamento cist 3383 4153 2.453] + 01522, MPTP + sol. solina 24582 2107*+ 1.974 « 0.81342 7 MPTP + pós-tratamento cist 3325 2 2274 IATA 2 01524 MPTP + pré-trotamento cist o MSTENIDAO 2748: 01SGBAr pm osâoa7 0PÚ O". “s 0 ssesútA 6“ - "e pr ..S ... 0 >a o . o 4/11 - Figura 4 ") D mero ôni ie FESSTIRA TA TNTEC Ss Neurônios de TH nigral E A id a Lindo ffóios LERNER Sr ARENS A AAA) E SAE ATOR A UAScA 20000 RARA AIRE AINDA cair 4 soles MRI A 5 8 Ps ES ta a vELdA x 18000 ] neo DA AAA ME RENT o 3 Esc ES EEE % 12500 ; LES aAA atS ação A ] Fis ANSA DS RB +13 DRI AESA TASs MARIE = Fr Y NE IEA AOS SEARA gs om ESA eo tai NS EA ANA ni -” g 750 RIAA ria OA ÉS RENA OEA LE A ABr NC D 3 AU OAÇER gs REA dO & 15 DEAN AE A ASILO Z EE Nao UigOoA ' E EDTA TICARAEA S id 7a ag fia 74 4d Tratomento FECGo CSA o ã Z Sol, salina MPTP de sacrifício E NES mrEa ER au CANNA EAR ANA DA az: o POTE ra A A Er O : AAA ADO à 9 RSA o NE raiar at od, guess as mos 2 raia soc cid LS SADO T retamentos Contagem de célulos estereológicas — 7 Et Ta Di Rd ara * à stmo1a 1, Cresilvioletas ——— THe TH+ &cresil- ato a E do Fixas jol. salina 1 GOO22RS 174102287 [SOR 7 BOSS AA RATES AE REA Sol cla 7d 9892240 — ISGOOCGM [07681840 Em SERES RA Sol.soliai4d 19122274 1829904741 — 20202502 SEABRA Ac MeTPIS 6132186 — 138302805 144432 1036 AESA E ar crdd o MPTP 7d 16514863 — 1283021449" jaagisl1590 — AGUIAR AAA s MPTP 14d 25232663 12320+15377* 14843: 105º? [ROSS ANADIA TEA MARÇO cod S 252332663 1232015977? japan daoso AR A SE ANTA Ea

Figura 5 1 - | a) b) Expressão de Nurrl mRNA nigrol Expressão de DAT mRNA nigrol |

0.7 8 É 0.6. 7 nm o < os 6 ” Z + É 04 . $ x) 4 $ os , z 2 2 os 1 o o 1d. 7d 148 1d Td Mi 1d 7d Md dig 7d Md Tratamento Sol. Salina MPTP Sol. Salina MPTP — desoerifício Figura 6 a) níveis de proteina BAX b) — níveisde proteina Bcl2 em oO relação BAX/Bel2 em mesencéfalo ventral mesencéfolo ventrol 150 . aso .... os . £ 200 1 2 m 250 os | + 2o 1 150 so as 8 100 | = : o o 0. o) 1d 7a Ma [1d 7a ao TRETECTE MrERTENTT [ENETTTEITEETENTTAÇOO O Sol. Salina MPTP Sol. Salina MPITP Sol. Salina MPTPOO ramo

Figura 7 é isteína (1) cisteína - no o A o | a se É cisteamina (2) z| AMX 3 Ss : Po——d

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SE a E se : LU TN]! 3122848 312 2468/13 122448 Tempo de socrifíco o o so 200 de cistamina (ma/ko) Cc 0.03 s Es 2 2 002 L ' ve ' | 3% || | 3? | É Soo E ss + 3: | ZE | O RH 1 3 1224 48 Tempo de sacrifício o 10 so 200 de cistamina (mo/ko)

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A - t Tourino(1) Í Ho, º Í Ne 7 N82 : Í | * i i i Í hipotaurina (2)

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EE o so | d FT | | Ss os E | SS | = 80 3E | 2* Im 131224481 312 24481 31224481 3 122448 Tempo de sacrifício o 10 so 200 de cistamina (mg/kg)

Te ” : a Figura 9 A . Cérebro - GE > S hemisfério o ND hemisfério om NESquerdo tc Ego direito a» artéria carótida A Neo ON externa direita: Sis fr ó i UMA o artéria carótida sa comum direita artéria carótida interna direita & & perfusato cateter So o B Captação no cérebro de C Captação no cérebro de cisteamina cisteina

0.45 z 8 . 0.40 DO L- cistepina 7 0.35 ; ; EM cisteamino SS 0.30 SS 0.25 ME Perfusão de L-cisteína = 4 0.20. e cisteamina E: 3 0.15 Dn 2?2 0.10: 1 0.05 o o

"Ta ma. A s Si Neurônios de Th nigral Neurônios de Nurrl mRNA nigral e +. - 8 + 8 PP 3 ns * E ns ts FZ SE 3 10 2 ES 2% ES ss Is - te É 8 Sx so É E 50 E sx 8% os SB 25 nÊ [| 28 o FS o Fechos DADA LIretomento | Sol satins | cistomino ) [ set. soma | esstomino | Figura 100 Figura 10b Expressão de DAT Níveis de dopamina estriatal mRNA nigral * s ss e s ns t 125 ” g g SS 100 $& 10 2 e Sº SS 7 | ts To 8 8 E% so E E 50 x S É sx bh % 25 8 Ss Rn o, 2 OS, [rssão riscebos-orDa|riscebo s-0H5A] | Trotamento | Sol salina | cistomino | [Sol solio | cistomino | Í ; i | Figura 10c Figura 10d | > 1 | ' ETIENNE NENE e bb fo. ) * istomi e. sã cistamina (10 mg/kg) E o O o . * & So /15c] E Nó Uma injeção i.p. EPA: E %s por dia por 14 ri

E Y , e 1 1 ) 1, eba so nº 2 REA À > ESSE a = > RESENDE E Rh

FA Figura 10e (o . — '

E ' > | | o) iip:oESAAZ)“3 AC .O.g.N2 “» “D2. .ÂÂ999º“OÔUOOOOO“OOO UU 10/11 er. Ts Comportamento motor induzido por fármaco - 450 rotações induzidas por apomorfina | : "t- Placebo + sol. salina a 32504 |. = 6-OHDA + sol. salina p= Placebo + cistamina FNE . me 6-OHDA + cistamina z + 3 150; í Z s o so] linha de base 6spóslesão — 9s pós-lesão Figura 11lq Comportamentos motores espontâneos Teste de etapas de ajuste (passos) Teste de assimetria do uso dos membros (cilindro) 3 8 ss FR z

SI 3º da. 3 E so 3 É 4s “ 2: o T b z E &% d 88 3s $$» 3? E x 30 z s l FO : & o Ss 25 2 linhade base Gspós-lesão — 95 pós-lesão linha de base 65 pós-lesão — 95 pós-lesão Figura 11b Figura 11c . : NEI ARIAÇÃO ú " - à z ê a Cistamina (10 mg/kg) E o si e Uma injeção i.p. por dia = em E É - por 6 semanas ERTSInon e H É E) s 1 11 Via | TM 1 Ji (E : À õ 4 ss À HS ; as ' 22) 3 ó E = i e . 3 Á À A Testes de comportamento RR aaa SRT PA lisas doa oNSAA AG) AB) FC) i / Í Figura 11d | bn D+ - Neurônios de Th nigral Níveis de dopamina estriatal ? + 8 — as S 100 8 nm =. — TS is 38 % g 1 Es S se Ee” sx so se 8 Ex S Ss à + | | 3 à” — [) o — 2 o A [uso Fisco ora rieceha -oHDA [Trotamento ] Sot solima | cistamino | [sl sotina | “cistamina | Figura 120 Figura 12b Níveis de dopamina estriatal i q as

TE 22 2 ss ve om se 238 1m e 2 à. o [5 — restos opa cora [Tretomento ] Sel salina | cistamino | i Figura 12c .. ie = x ENS NCUrores tauração) E , Cistamina (10 mg/k: 8 | E Rs Uma inje o o - Es ado " ã ç Jeção tp. por dia NBS norte: 8 & Ss porá semanas Elo Ss

28. Vs 1 ig Jo Us É le Lt ã : A tes de comportamento. Testas de comportamento IN ra TULL AXE) AE) E) | i é i É Figura 12d :