MX2013009421A - Tratamiento la esclerosis lateral amiotrófica con el uso de células derivadas del cordón umbilical. - Google Patents

Tratamiento la esclerosis lateral amiotrófica con el uso de células derivadas del cordón umbilical.

Info

Publication number
MX2013009421A
MX2013009421A MX2013009421A MX2013009421A MX2013009421A MX 2013009421 A MX2013009421 A MX 2013009421A MX 2013009421 A MX2013009421 A MX 2013009421A MX 2013009421 A MX2013009421 A MX 2013009421A MX 2013009421 A MX2013009421 A MX 2013009421A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
cells
umbilical cord
cells derived
cord tissue
cell
Prior art date
Application number
MX2013009421A
Other languages
English (en)
Other versions
MX343931B (es
Inventor
Sridevi Dhanaraj
Anna Gosiewska
Alexander M Harmon
Anthony J Kihm
Carrie H Fang
Original Assignee
Depuy Synthes Products Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Depuy Synthes Products Llc filed Critical Depuy Synthes Products Llc
Publication of MX2013009421A publication Critical patent/MX2013009421A/es
Publication of MX343931B publication Critical patent/MX343931B/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0605—Cells from extra-embryonic tissues, e.g. placenta, amnion, yolk sac, Wharton's jelly
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0607—Non-embryonic pluripotent stem cells, e.g. MASC
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0622—Glial cells, e.g. astrocytes, oligodendrocytes; Schwann cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C12N2500/95—Protein-free medium and culture conditions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/21—Chemokines, e.g. MIP-1, MIP-2, RANTES, MCP, PF-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/41—Hedgehog proteins; Cyclopamine (inhibitor)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/02—Coculture with; Conditioned medium produced by embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/03—Coculture with; Conditioned medium produced by non-embryonic pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C12N2506/025—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells from extra-embryonic cells, e.g. trophoblast, placenta
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/03—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from non-embryonic pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para tratar la esclerosis lateral amiotrófica; particularmente, la invención proporciona métodos para tratar la esclerosis lateral amiotrófica por medio de la administración de células derivadas del tejido del cordón umbilical, una cantidad efectiva de una población sustancialmente homogénea de células derivadas del tejido del cordón umbilical o una composición farmacéutica que comprende células derivadas del tejido del cordón umbilical a un paciente.

Description

TRATAMIENTO DE ESCLEROSIS LATERAL AMIOTRÓFICA CON EL USO DE CÉLULAS DERIVADAS DEL CORDÓN UMBILICAL REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDE RELACIONADAS Esta solicitude reclama el beneficio de la solicitud de E.U.A. No. 13/026,995, presentada el 14 de febrero, 2011 , que es una continuación en parte de la solicitud de E.U.A. No. 12/429,849, presentada el 24 de abril, 2009, que es una continuación de la solicitud de E.U.A. No. 10/877,269, presentada el 25 de junio, 2004, ahora la patente de E.U.A. No. 7,524,489, emitida el 28 de abril, 2009, que relclama el beneficio de la solicitud provisional de E.U.A. No. 60/483,264, presentada el 27 de junio, 2003, todo el contenido de las cuales se incorpora como referencia en la presente. Otras solicitudes relacionadas incluyen las siguientes solicitudes copendientes de propiedad común, todo el contenido de cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia: la solicitud de E.U.A. No. 10/877,012, presentada el 25 de junio, 2004, ahora la patente de E.U.A. No. 7,510,873, emitida el 13 de marzo, 2009; la solicitud de E.U.A. No.10/877,446, presentada el 25 de junio, 2004; la solicitud de E.U.A. No. 10/877,445, presentada el 25 de junio, 2004; la solicitud de E.U.A. No. 10/877,541 , presentada el 25 de junio, 2004, ahora la patente de E.U.A. No. 7,413,734, emitida el 19 de agosto, 2008; la solicitud de E.U.A. No. 10/877,009, presentada el 25 de junio, 2004, ahora la patente de E.U.A. 7,560,276, emitida el 14 de julio, 2009; la solicitud de E.U.A. No. 10/876,998, presentada el 25 de junio, 2004; la solicitud de E.U.A. No. 11/315,943, presentada el 22 de diciembre, 2005, ahora la patente de E.U.A. No. 7,875,275, emitida el 25 de enero, 2001 ; y la solicitud provisional de E.U.A. No. 60/555,908, presentada el 24 de marzo, 2004.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere, generalmente, a composiciones, métodos y kits útiles para terapia regenerativa o basada en células para enfermedades neurológicas y trastornos, tales como la esclerosis lateral amiotrófica. Particularmente, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas, dispositivos y métodos para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica con el uso de células derivadas del tejido del cordón umbilical.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN A lo largo de esta especificación se mencionan diversas patentes y otras publicaciones. Cada una de estas publicaciones se incorpora en su totalidad como referencia en la presente descripción.
Las enfermedades neurológicas y otros trastornos del sistema nervioso central y periférico están entre las más debilitantes que puede padecer un individuo, debido a los efectos que producen a nivel físico y en el rendimiento.
Una de esas enfermedades es la esclerosis lateral amiotrófica (ALS, por sus siglas en inglés) (conocida, además, como enfermedad de Lou Gehrig).
La ALS es una enfermedad neurodegenerativa progresiva que afecta principalmente las neuronas motoras y produce debilidad y atrofia muscular. La enfermedad se caracteriza por la degeneración prematura selectiva y la muerte de las neuronas motoras. Las neuronas afectadas muestran pérdida de dendritas, cambios citoesqueletales y acumulación de proteínas y cuerpos de inclusión. La ALS produce una parálisis progresiva que, típicamente, causa la muerte en unos pocos años como consecuencia de la insuficiencia respiratoria producida por la parálisis de los músculos respiratorios. La duración promedio de la enfermedad desde el inicio hasta la muerte del individuo es de tres a cinco años. Solo aproximadamente 10 % de los pacientes con ALS sobreviven diez o más años. En los Estados Unidos, 20,000 a 30,000 personas sufren de ALS y, anualmente, otras 5000 personas son diagnosticadas con esta enfermedad.
Los mecanismos patógenos de la ALS no se comprenden en su totalidad, pero se piensa que una variedad de procesos contribuyen a la ALS y estos incluyen la disfunción mitocondrial, el estrés oxidativo, la excitotoxicidad así como las alteraciones en el citoesqueleto, transporte axonal, procesamiento de proteínas y homeostasis del calcio (Nieva y otros (2009), J. Cell Biol. 187:761-72). A pesar de los muchos esfuerzos realizados, han surgido muy pocas opciones terapéuticas para hacer más lento el avance de la enfermedad; sin embargo, se han obtenido avances en la terapia paliativa. La terapia celular alogénica puede proporcionar una terapia de múltiples factores eficaz para el tratamiento de la ALS por medio de la elaboración de factores tróficos que reducen la degeneración de las neuronas motoras, preservan la función de las neuronas motoras y prolongan la vida.
Dados los efectos debilitantes de la ALS y la falta de tratamiento, existe una gran necesidad de tratar la ALS en un paciente y, de ese modo, mejorar la calidad de vida del paciente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los problemas presentados se resuelven por medio de las composiciones, métodos y kits de las modalidades ilustrativas descritas en la presente descripción. Esta invención proporciona composiciones y métodos aplicables a la terapia basada en células o regenerativa para trastornos y enfermedades neurológicas tales como la esclerosis lateral amiotrófica. Particularmente, la invención caracteriza composiciones farmacéuticas, dispositivos y métodos para la regeneración o reparación del tejido neural con el uso de células derivadas del tejido del cordón umbilical.
Un aspecto de la invención caracteriza una célula derivada del tejido del cordón umbilical aislada, sustancialmente libre de sangre, en donde la célula tiene la capacidad de autorenovarse y expandirse en el cultivo y el potencial de diferenciarse en una célula de un fenotipo neural; en donde la célula requiere L-valina para el crecimiento y puede crecer en al menos aproximadamente 5 % de oxígeno. Esta célula comprende, además, una o más de las siguientes características: (a) potencial para al menos aproximadamente 40 duplicaciones en el cultivo; (b) unión y expansión en un recipiente de cultivo del tejido, recubierto o no recubierto, en donde el recipiente de cultivo del tejido recubierto comprende un recubrimiento de gelatina, laminina, colágeno, poliornitina, vitronectina o fibronectina; (c) producción de al menos un factor tisular, vimentina y actina alfa del músculo liso; (d) producción de al menos un CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, PD-L2 o HLA-A,B,C; (e) falta de producción de al menos un CD31 , CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141 , CD178, B7-H2, HLA-G o HLA-DR,DP,DQ, según la detección realizada por medio de citometría de flujo; (f) expresión de un gen que, con respecto a una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal o una célula de la médula ósea de la cresta ilíaca aumenta para al menos un gen que codifica: interleucina 8; reticulón 1 ; ligando de quimocina (motivo C-X-C) 1 (actividad estimulante del crecimiento de melanoma, alfa); ligando de quimocina (motivo C-X-C) 6 (proteína quimiotáctica de granulocitos 2); ligando de quimocina (motivo C-X-C) 3; factor de necrosis tumoral, proteína 3 alfa-inducida; (g) expresión de un gen que, con respecto a una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal o una célula de la médula ósea de la cresta ilíaca se reduce para al menos un gen que codifica: caja homeótica de la estatura baja 2; proteína 2 de choque térmico de 27 kDa; ligando de quimocina (motivo C-X-C) 12 (factor 1 derivado de la célula estromal); elastina (estenosis aórtica supravalvular, síndrome de Williams-Beuren); ARNm humano; ADNc DKFZp586M2022 (del clon DKFZp586M2022); caja homeótica de la mesénquima 2 (caja homeótica específica de la detención del crecimiento); homólogo de la caja homeótica de sine oculis 1 (Drosophila); cristalina, alfa B; activador de morfogénesis asociado con disheveled 2; proteína DKFZP586B2420; similar a neuralin 1 ; tetranectina (proteína de unión al plasminógeno); homología a src tres (SH3) y dominio rico en cisteína; colesterol 25-hidroxilasa; factor de transcripción 3 relacionado con runt; receptor de interleucina 11 , alfa; mejorador de procolágeno C-endopeptidasa; homólogo de frizzled 7 (Drosophila); gen hipotético BC008967; colágeno, tipo VIII, alfa 1 ; tenascina C (hexabraquion); proteína 6 de la caja homeótica de iroquois; hefaestina; integrina, beta 8; glicoproteína 2 de la vesícula sináptica; neuroblastoma, supresión de tumorigenicidad 1; proteína 2 de unión al factor de crecimiento insulínico, 36 kDa; ADNc humano FLJ 12280 fis, clon AMMA1001744; factor 1 similar al receptor de citocina; canal de potasio activado por calcio de conductancia intermedia/baja, subfamilia N, miembro 4; integrina, beta 7; coactivador transcripcional con el motivo de unión a PDZ (TAZ); homólogo de la caja homeótica de sine oculis 2 (Drosophila); proteína KIAA1034; proteína 5 de la membrana vesicular (miobrevina); proteína 1 de matriz extracelular tipo fibulina contenedora de EGF; respuesta al crecimiento temprano 3; caja homeótica de distal-less 5; proteína hipotética FLJ20373; familia de aldo-ceto reductasa 1 , miembro C3 (3-alfa hidroxiesteroide deshidrogenase, tipo II); biglicano; coactivador transcripcional con el motivo de unión a PDZ (TAZ); fibronectina 1 ; proencefalina; integrina, beta-tipo 1 (con dominios de repeticiones tipo EGF); ARNm humano del clon EUROIMAGE 1968422 de ADNc de longitud completa; EphA3; proteína KIAA0367; receptor C/guanilato ciclasa C del péptido natriurético (receptor C del péptido atrionatriurético); proteína hipotética FLJ 14054; ARNm humano; ADNc DKFZp564B222 (del clon DKFZp564B222); proteína 3 de interacción BCL2/adenovirus E1 B de 19 kDa; proteína 1 de unión a AE; polipéptido 1 de la subunidad VI la de citocromo C oxidasa (músculo); similar a neuralin 1 ; gen 1 de translocación de células B; proteína hipotética FLJ23191; y DKFZp586L151; (h) secreción de al menos un MCP-1 , IL-6, IL-8, GCP-2, HGF, KGF, FGF, HB-EGF, BDNF, TPO, MIP1a, RANTES o TIMP1 ; y (i) falta de secreción de al menos un TGF-beta2, ANG2, PDGFbb, MIP1b, I309, MDC o VEGF, según la detección realizada por medio de ELISA.
En modalidades específicas, la célula umbilical tiene todas las características de identificación de cualquiera de las células siguientes: tipo de célula UMB 022803 (P7) (núm. de registro de ATCC PTA-6067); o tipo de célula UMB 022803 (P17) (núm. de registro de ATCC PTA-6068).
En ciertas modalidades, las células derivadas del tejido del cordón umbilical se aislan en presencia de una o más actividades enzimáticas que comprenden actividad de metaloproteasa, actividad mucolítica y actividad de proteasa neutral. Preferentemente, las células tienen un cariotipo normal que se mantiene a medida que se realiza el pase de las células en cultivo. En modalidades preferidas, las células derivadas después del parto comprenden CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa y HLA-A,B,C, pero no comprenden CD31 , CD34, CD45, CD1 17, CD141 o HLA-DR,DP,DQ, según se detecta por medio de citometría de flujo.
Otro aspecto de la invención caracteriza una población de células que comprende las células del tejido del cordón umbilical tal como se describió anteriormente. En una modalidad, la población es una población prácticamente homogénea de células derivadas del tejido del cordón umbilical. En una modalidad específica, la población comprende una línea celular clonal de las células derivadas del tejido del cordón umbilical. En otra modalidad, la población es una población heterogénea que comprende las células derivadas del tejido del cordón umbilical y al menos otro tipo de célula. En ciertas modalidades, el otro tipo celular es un astrocito, oligodendrocito, neurona, progenitor neural, célula madre neural u otra célula madre multipotente o pluripotente. En otras modalidades, la población de células se cultiva en contacto con uno o más factores que estimulan la diferenciación de la célula madre hacia un linaje neural.
Además, de conformidad con la presente invención, se caracteriza un lisado celular preparado a partir de células derivadas del tejido del cordón umbilical. El lisado celular se puede separar en una fracción de membrana enriquecida y una fracción celular soluble. La invención caracteriza, además, una matriz extracelular producida por las células derivadas del tejido del cordón umbilical, así como un medio acondicionado en el cual se cultivaron las células.
Otro aspecto de la invención caracteriza un método para tratar un paciente que padece una condición neurodegenerativa; el método comprende administrar al paciente células derivadas del tejido del cordón umbilical tal como se describió anteriormente, en una cantidad eficaz para tratar la condición neurodegenerativa. En ciertas modalidades, la condición neurodegenerativa es g una condición neurodegenerativa aguda, tal como un trauma cerebral, trauma de la médula espinal o trauma del nervio periférico. En otras modalidades, es una condición neurodegenerativa crónica o progresiva, tal como enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, tumor, esclerosis múltiple o lesión crónica del nervio periférico.
En una modalidad, las células derivadas del tejido del cordón umbilical son inducidas in vitro para diferenciarse en células de un linaje neural antes de la administración. En otra modalidad, las células se diseñan mediante ingeniería genética para producir un producto génico que promueve el tratamiento de la condición neurodegenerativa.
En ciertas modalidades, las células se administran con al menos otro tipo celular, tal como un astrocito, oligodendrocito, neurona, progenitor neural, célula madre neural u otra célula madre multipotente o pluripotente. En estas modalidades, el otro tipo celular se puede administrar simultáneamente o antes o después de las células derivadas del tejido del cordón umbilical. De manera similar, en estas u otras modalidades, las células se administran con al menos otro agente, tal como un fármaco para terapia neural u otro agente complementario benéfico, tal como un agente antiinflamatorio, agentes antiapoptóticos, antioxidante o factor de crecimiento. En estas modalidades, el otro agente se puede administrar simultáneamente o antes o después de las células derivadas del tejido del cordón umbilical.
En ciertas modalidades, las células se administran en un sitio predeterminado en el sistema nervioso central o periférico del paciente. Se pueden administrar por inyección o infusión o encapsularse dentro de un dispositivo implantable o por implantación de una matriz o estructura que contiene las células.
Una modalidad de la invención es un método para tratar la esclerosis lateral amiotrófica; el método comprende administrar a un paciente células derivadas del tejido del cordón umbilical en una cantidad eficaz para tratar la esclerosis lateral amiotrófica. En esta modalidad, las células derivadas del tejido del cordón umbilical se aislan del tejido del cordón umbilical humano sustancialmente libre de sangre, son capaces de autorenovarse y expandirse en cultivo, tienen el potencial de diferenciarse en células de otros fenotipos, pueden experimentar al menos 40 duplicaciones y tienen las siguientes características: (a) expresa cada uno de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, PD-L2 y HLA-A,B,C; (b) no expresa ninguno de CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD 117, CD141 , CD178, B7-H2, HLA-G o HLA-DR.DP.DQ; y (c) mayor expresión de interleucina-8; reticulón 1; y ligando del receptor de quimocina (motivo C-X-C) 3, con respecto a las de una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal o una célula de la médula ósea de la cresta ilíaca. En otra modalidad del método, las células derivadas del tejido del cordón umbilical no expresan hTERT o telomerasa. En aun otra modalidad, las células derivadas del tejido del cordón umbilical se administran por inyección (tal como, por ejemplo, infusión o inyección intravenosa o intratecal. En una modalidad, las células derivadas del tejido del cordón umbilical ejercen un efecto trófico en el sistema nervioso del paciente.
Otra modalidad de la invención es un método para tratar la esclerosis lateral amiotrófica; el método comprende administrar a un paciente una cantidad eficaz de una población de células derivadas del tejido del cordón umbilical sustancialmente homogénea. En esta modalidad, la población de células derivadas del tejido del cordón umbilical se aisla del tejido del cordón umbilical humano sustancialmente libre de sangre, es capaz de autorenovarse y expandirse en cultivo, tiene el potencial de diferenciarse en células de otros fenotipos, puede experimentar al menos 40 duplicaciones y tiene las siguientes características: (a) expresa cada uno de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, PD-L2 y HLA-A,B,C; (b) no expresa ninguno de CD31 , CD34, CD45, CD80, CD86, CD 117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G o HLA-DR,DP,DQ; y (c) mayor expresión de interleucina-8; reticulón 1; y ligando del receptor de quimocina (motivo C-X-C) 3, con respecto a las de una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal o una célula de la médula ósea de la cresta ilíaca. En una modalidad, las células derivadas del tejido del cordón umbilical no expresan hTERT o telomerasa. En otra modalidad, la población de células derivadas del tejido del cordón umbilical sustancialmente homogénea se administra por inyección o infusión. En una modalidad alterna, la población de células derivadas del tejido del cordón umbilical sustancialmente homogénea se administra por inyección intravenosa o intratecal. En aun otra modalidad, la población de células derivadas del tejido del cordón umbilical sustancialmente homogénea ejerce un efecto trófico en el sistema nervioso del paciente.
Aun otra modalidad de la invención es un método para tratar la esclerosis lateral amiotrófica; el método comprende administrar a un paciente una composición farmacéutica que comprende células derivadas del tejido del cordón umbilical en una cantidad eficaz para tratar la esclerosis lateral amiotrófica. En esta modalidad, las células derivadas del tejido del cordón umbilical se aislan del tejido del cordón umbilical humano sustancialmente libre de sangre, son capaces de autorenovarse y expandirse en cultivo, tienen el potencial de diferenciarse en células de otros fenotipos, pueden experimentar al menos 40 duplicaciones y tienen las siguientes características: (a) expresa cada uno de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, PD-L2 y HLA-A,B,C; (b) no expresa ninguno de CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD 117, CD141 , CD178, B7-H2, HLA-G o HLA-DR.DP.DQ; y (c) mayor expresión de interleucina-8; reticulón 1; y ligando del receptor de quimocina (motivo C-X-C) 3, con respecto a las de una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal o una célula de la médula ósea de la cresta ilíaca. En una modalidad, las células derivadas del tejido del cordón umbilical no expresan hTERT o telomerasa. En aun otra modalidad, las células derivadas del tejido del cordón umbilical se administran por inyección (tal como, por ejemplo, inyección intravenosa o intratecal) o infusión. En una modalidad, las células derivadas del tejido del cordón umbilical ejercen un efecto trófico en el sistema nervioso del paciente.
Otro aspecto de la invención caracteriza una composición farmacéutica para tratar a un paciente que padece una condición neurodegenerativa, tal como esclerosis lateral amiotrófica; la composición comprende un portador farmacéuticamente aceptable y las células derivadas del tejido del cordón umbilical descritas anteriormente. La condición neurodegenerativa que se tratará puede ser una condición neurodegenerativa aguda o puede ser una condición crónica o progresiva.
En ciertas modalidades, la composición farmacéutica comprende células que se indujeron in vitro para diferenciarse en células de un linaje neural antes de la formulación de la composición o células que se diseñaron por ingeniería genética para producir un producto génico que promueve el tratamiento de la condición neurodegenerativa.
En ciertas modalidades, la composición farmacéutica comprende al menos otro tipo celular, tal como un astrocito, oligodendrocito, neurona, progenitor neural, célula madre neural u otra célula madre multipotente o pluripotente. En estas u otras modalidades, la composición farmacéutica comprende al menos otro agente, tal como un fármaco para terapia neural u otro agente complementario benéfico, tal como un agente antiinflamatorio, agentes antiapoptóticos, antioxidante o factor de crecimiento.
En ciertas modalidades, la composición farmacéutica se formula para administración por inyección o infusión. Alternativamente, puede comprender un dispositivo implantable en el cual se encapsulan las células o una matriz o estructura que contiene las células.
De conformidad con otro aspecto de la invención se proporciona un kit para tratar a un paciente que padece una condición neurodegenerativa.
El kit comprende un portador farmacéuticamente aceptable, una población de las células derivadas del tejido del cordón umbilical descritas anteriormente e instrucciones para usar el kit en un método para tratar al paciente. El kit puede comprender, además, al menos un reactivo e instrucciones para cultivar las células derivadas del tejido del cordón umbilical. Además, puede comprender una población de al menos otro tipo celular o al menos otro agente para tratar una condición neurodegenerativa.
De conformidad con otro aspecto de la invención, se proporciona un método para tratar a un paciente que padece una condición neurodegenerativa (tal como, por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica); el método comprende administrar al paciente una preparación elaborada a partir de las células derivadas del tejido del cordón umbilical descritas anteriormente. Dicha preparación puede comprender un lisado celular (o fracción de este) de las células derivadas del tejido del cordón umbilical, una matriz extracelular de las células derivadas del tejido del cordón umbilical o un medio acondicionado en el cual se cultivaron las células derivadas del tejido del cordón umbilical. En otro aspecto, la invención caracteriza una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y una preparación elaborada a partir de las células derivadas del tejido del cordón umbilical, que puede ser un lisado celular (o fracción de este) de las células derivadas del tejido del cordón umbilical, una matriz extracelular de las células derivadas del tejido del cordón umbilical o un medio acondicionado en el cual se cultivaron las células derivadas del tejido del cordón umbilical. Además, se proporcionan kits para la práctica de este aspecto de la invención. Estos pueden incluir un portador farmacéuticamente aceptable y/u otro agente y/o reactivo, un lisado celular y/o fracción de este, una matriz extracelular o un medio acondicionado a partir de las células derivadas del tejido del cordón umbilical e instrucciones para usar los componentes del kit.
Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada y los siguientes ejemplos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra el control del peso del animal durante todo el estudio.
La Figura 2 muestra la respuesta de los grupos celulares diferentes a la prueba con amorfina.
La Figura 3 muestra el control de la diferencia en la cantidad de vueltas de la cabeza a la izquierda y derecha durante todo el estudio.
La Figura 4 muestra el control del consumo de alimentos por parte de los animales durante todo el estudio con el uso de una prueba de escalera.
Las Figuras 5A a 5C muestran gráficos de barra que ¡lustran la evaluación cualitativa de (5A) lba-1 ; (5B) ED-1 ; y (5C) tinción con DAPI realizada en el injerto celular de conformidad con el siguiente criterio: 0 = Ninguna (ausencia de células); 1 = Tinción visible; 2 = Tinción abundante; 3 = Tinción muy abundante; 4 = Densa.
Las Figuras 6A y 6B muestran gráficos de barra que ilustran la evaluación cualitativa de (6A) GFAP y (6B) tinción con vimentina realizada en el injerto celular de conformidad con el siguiente criterio: 0 = Ninguna (ausencia de células); 1 = Tinción visible; 2 = Tinción abundante; 3 = Tinción muy abundante; 4 = Densa.
Las Figuras 7A y 7B muestran el efecto de células derivadas del tejido del cordón umbilical humano (hUTC, por sus siglas en inglés) en la supervivencia en un modelo de ratón SOD1 (G93A) de ALS para (7A) los Grupos 1 y 2 y (7B) Grupos 3 y 4.
La Figura 8 muestra el lapso de vida de animales incluidos en los grupos a los que se administró el vehículo de control y las hUTC (ver el Ejemplo 21). El diagrama de barras muestra que los grupos tratados con células, especialmente en la Rama 2, tienen 15.75 días (2.25 semanas, P<0.035) más de vida que los grupos tratados con el vehículo, si bien la edad de inicio de la enfermedad es similar.
Las Figuras 9A a 9D muestran la actividad de locomoción de animales tratados con o sin hUTC. La Figura 9A muestra los puntajes de la prueba de Basso, Beattie y Bresnahan (BBB, por sus siglas en inglés) para los Grupos 1 y 2. La Figura 9B muestra los puntajes de la prueba de plano inclinado para los Grupos 1 y 2. La Figura 9C muestra los puntajes de la prueba BBB para los Grupos 3 y 4. La Figura 9D muestra los puntajes de la prueba de plano inclinado para los Grupos 3 y 4. Los datos demuestran la separación en las dos medidas principales de debilidad muscular en los grupos tratados con vehículo y con células.
La Figura 10 muestra la curva de supervivencia para la rama de 10 semanas (para todos los sujetos).
La Figura 11 muestra la curva de supervivencia para la rama de 12 semanas (para todos los sujetos).
La Figura 12 muestra la curva de supervivencia para la rama de 12 semanas (últimos dos pares).
La Figura 13 muestra los resultados de la prueba de plano inclinado para la rama de 10 semanas.
La Figura 14 muestra los puntajes de la prueba de BBB para la rama de 10 semanas.
La Figura 15 muestra los resultados de la prueba de plano inclinado para la rama de 12 semanas para los primeros seis pares.
La Figura 16 muestra los resultados de la prueba de plano inclinado para la rama de 12 semanas para los últimos dos pares.
La Figura 17 muestra los puntajes de la prueba de BBB para la rama de 12 semanas para los primeros seis pares.
La Figura 18 muestra los puntajes de la prueba de BBB para la rama de 12 semanas para los últimos dos pares.
Las Figuras 19A a 19C muestran la apariencia de secciones de la médula espinal de ratones SOD1 G93A teñidas con violeta de cresilo. La Figura 19A muestra la apariencia de secciones de la médula espinal de una cantidad impar de animales teñidas con violeta de cresilo. La Figura 19B muestra la apariencia de secciones de la médula espinal de una cantidad de animales de número par teñidas con violeta de cresilo. La Figura 19C muestra la apariencia de secciones de la médula espinal de animales normales teñidas con violeta de cresilo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Varios términos usados a lo largo de la especificación y en las reivindicaciones se definen tal como se expone más abajo.
Células madre son células indiferenciadas definidas por la capacidad de una célula individual para autorenovarse y diferenciarse para producir células de progenie que incluyen células progenitoras que se autorenuevan, células progenitoras que no se renuevan y células diferenciadas de forma terminal. Las células madre se caracterizan, además, por su capacidad para diferenciarse in vitro en células funcionales de varios linajes celulares a partir de múltiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo), así como para dar lugar a tejidos de múltiples capas germinales después del trasplante y contribuir sustancialmente a la mayoría, si no a todos, los tejidos después de la inyección dentro de los blastocistos.
Las células madre se clasifican de conformidad con su potencial de desarrollo como: (1) totipotentes; (2) pluripotentes; (3) multipotentes; (4) oligopotentes; y (5) unipotentes. Las células totipotentes son células capaces de originar todos los tipos de células embrionarias y extraembrionarias. Las células plunpotentes son células capaces de producir todos los tipos celulares embrionarios. Las células multipotentes incluyen aquellas que pueden producir un subconjunto de linajes celulares, pero todos dentro de un tejido, órgano o sistema fisiológico particular (por ejemplo, células madre hematopoyéticas (HSC, por sus siglas en inglés) que pueden producir una progenie que incluye HSC (autorenovación), células progenitoras oligopotentes restringidas a la célula sanguínea y todos los tipos y elementos celulares (por ejemplo, plaquetas) que son componentes normales de la sangre). Las células que son oligopotentes pueden producir un subconjunto más restringido de linajes celulares que las células madre multipotentes; y las células que son unipotentes son capaces de originar un único linaje celular (por ejemplo, células madres espermatogénicas).
Las células madre se categorizan, además, en función de la fuente a partir de la cual pueden obtenerse. Una célula madre adulta es, generalmente, una célula indiferenciada multipotente encontrada en el tejido que comprende múltiples tipos celulares diferenciados. La célula madre adulta se puede autorenovar. En condiciones normales, además, puede diferenciarse para producir los tipos celulares especializados del tejido a partir del cual se originaron y, posiblemente, otros tipos de tejidos. Una célula madre embrionaria es una célula pluripotente de la masa celular interna de un embrión en la etapa de blastocito. Una célula madre fetal es una célula que se origina a partir de tejidos o membranas fetales. Una célula madre obtenida después del parto es una célula multipotente o pluripotente que se origina, prácticamente, a partir de tejido extraembrionario disponible después del nacimiento, es decir, la placenta y el cordón umbilical. Se ha encontrado que estas células tienen rasgos característicos de las células madre pluripotentes, que incluyen la proliferación rápida y el potencial para diferenciación en muchos linajes celulares. Las células madre obtenidas después del parto pueden derivarse de la sangre (por ejemplo, tal como aquellas obtenidas a partir de sangre del cordón umbilical) o no derivarse de ella (por ejemplo, tal como se obtienen de los tejidos no sanguíneos del cordón umbilical y placenta).
Tejido embrionario se define, típicamente, como el tejido que se origina a partir del embrión (que en los seres humanos se refiere al período que abarca desde la fertilización hasta aproximadamente seis semanas de desarrollo. Tejido fetal se refiere al tejido que se origina a partir del feto que, en seres humanos, se refiere al período que abarca desde aproximadamente seis semanas de desarrollo hasta el momento del alumbramiento. Tejido extraembrionario es el tejido que está asociado con el embrión o el feto, pero que no se origina a partir de estos. Los tejidos extraembrionarios incluyen las membranas extraembrionarias (corión, amnios, saco vitelino y alantoides), cordón umbilical y placenta (que en sí misma se forma a partir del corión y la placenta materna).
La diferenciación es el proceso mediante el cual una célula no especializada ("no comprometida") o menos especializada adquiere las características de una célula especializada, tal como, por ejemplo, una célula nerviosa o una célula muscular. Una célula diferenciada es una célula que ha tomado una posición más especializada ("comprometida") dentro del linaje de una célula. El término comprometido, cuando se aplica al proceso de diferenciación, se refiere a una célula que ha seguido la vía de la diferenciación hasta un punto en el cual, en circunstancias normales, continuará diferenciándose en un tipo de célula específico o subconjunto de tipos de células o se revertirá a un tipo de célula menos diferenciada. La desdiferenciación se refiere al proceso mediante el cual una célula revierte a una posición menos especializada (o comprometida) dentro del linaje de una célula. Como se usa en la presente descripción, el linaje de una célula define la herencia de la célula, es decir las células de la cual se originó y las células que puede originar. El linaje de una célula posiciona a la célula dentro de un esquema hereditario de desarrollo y diferenciación.
En sentido amplio, una célula progenitora es una célula capaz de crear una progenie más diferenciada que ella misma y aun así retiene la capacidad para reponer el conjunto de progenitores. En base a esa definición, las células madre propiamente dichas son, además, células progenitoras, al igual que los precursores más inmediatos para células diferenciadas en forma terminal. Esta definición de célula progenitora puede usarse con referencia a las células de la presente invención, tal como se describe más abajo en mayor detalle. En un sentido más limitado, una célula progenitora se define, frecuentemente, como una célula intermedia en la ruta de diferenciación, es decir, una célula que se origina en una célula madre y que es intermedia en la producción de un tipo celular maduro o subconjunto de tipos celulares. Generalmente, este tipo de célula progenitora no es capaz de autorenovarse. En consecuencia, cuando se hace referencia a ese tipo de célula en la presente descripción, esta se mencionará como célula progenitora no renovable o como célula precursora o progenitora intermedia.
Como se usa en la presente descripción, la frase se diferencia en un linaje o fenotipo neural se refiere a una célula que se compromete parcialmente o totalmente con un fenotipo neural específico del SNC o SNP, es decir, una neurona o una célula glial, la última categoría incluye, sin limitarse a, astrocitos, oligodendrocitos, células de Schwann y microglia.
Generalmente, se hace referencia a las células de la presente invención como células derivadas del tejido del cordón umbilical (o UTC o hUTC). Además, algunas veces, se puede hacer referencia a ellas como células derivadas del ombligo (UDC, por sus siglas en inglés). Además, las células pueden describirse como células madre o progenitoras; el último término se usa en el sentido amplio. El término derivado se usa para indicar que las células se obtuvieron a partir de su fuente biológica y se cultivaron o manipularon de cualquier otra forma in vitro {por ejemplo, se cultivaron en un medio de crecimiento para expandir la población y/o para producir una línea celular). Las manipulaciones in vitro de células madre umbilicales y las características únicas de las células derivadas del ombligo tratadas en la presente invención se describen más abajo en detalle.
Varios términos se usan para describir las células en cultivo. Cultivo celular se refiere, generalmente, a células extraídas de un organismo vivo y cultivadas en condiciones controladas ("en cultivo" o "cultivadas"). Un cultivo celular primario es un cultivo de células, tejidos u órganos extraído directamente de uno o varios organismos antes del primer subcultivo. Las células se expanden en cultivo cuando se colocan en un medio de crecimiento en condiciones que facilitan el crecimiento y/o división celular de modo que se obtiene una mayor población de células. Cuando las células se expanden en cultivo, la velocidad de proliferación celular se mide algunas veces por la cantidad de tiempo necesario para que se duplique la cantidad de células. Esto se conoce como tiempo de duplicación.
Una línea celular es una población de células formada por uno o más subcultivos de un cultivo de células primario. Cada ronda de subcultivo se conoce como un pase. Cuando las células se subcultivan, se dice que se realizaron pases de las células. Una población específica de células, o una línea celular, se refiere a o se caracteriza a veces por el número de veces que reciben pases. Por ejemplo, una población de células cultivadas que recibe el pase diez veces puede mencionarse como un cultivo P10. El cultivo primario, es decir, el primer cultivo después del aislamiento de las células del tejido, se designa P0. Después del primer subcultivo, las células se describen como un cultivo secundario (P1 o pase 1). Después del segundo subcultivo, las células se convierten en un cultivo terciario (P2 o pase 2), y así sucesivamente. Los expertos en la materia entenderán que puede haber varias duplicaciones de las poblaciones durante el período de cambios de cultivo; por lo tanto, la cantidad de duplicaciones de las poblaciones de un cultivo es mayor que el número de pases. La expansión celular (es decir, la cantidad de duplicaciones de las poblaciones) durante el período comprendido entre pases depende de varios factores, que incluyen, sin limitarse a, la densidad de siembra, el sustrato, el medio, las condiciones de crecimiento y el tiempo entre pases.
Un medio acondicionado es un medio en el cual se cultivó una célula o población de células específica y, después, se eliminó. Cuando las células se cultivan en un medio, estas pueden secretar factores celulares que pueden proporcionar soporte trófico a otras células. Dichos factores tróficos incluyen, sin limitarse a, hormonas, citocinas, matriz extracelular (ECM, por sus siglas en inglés), proteínas, vesículas, anticuerpos y granulos. El medio que contiene los factores celulares es el medio acondicionado.
Generalmente, un factor trófico se define como una sustancia que promueve la supervivencia, el crecimiento, la diferenciación, la proliferación y/o la maduración de una célula o estimula la mayor actividad de una célula. La interacción entre células a través de factores tróficos puede producirse entre células de distintos tipos. La interacción celular por vía de factores tróficos se encuentra prácticamente en todos los tipos celulares y es un medio de comunicación particularmente significativo entre tipos celulares neurales. Los factores tróficos pueden funcionar, además, en una forma autócrina, es decir, una célula puede producir factores tróficos que afectan su propia supervivencia, crecimiento, diferenciación, proliferación y/o maduración.
Cuando se hace referencia a células vertebradas cultivadas, el término senescencia (además, senescencia replicativa o senescencia celular) se refiere a una propiedad atribuible a los cultivos celulares finitos; es decir, su incapacidad para crecer más allá de un número finito de duplicaciones de poblaciones (mencionado, algunas veces como límite de Hayflick). Si bien la senescencia celular se describió primero con el uso de células de tipo fibroblasto, la mayor parte de los tipos celulares humanos normales que se pueden cultivar exitosamente en un cultivo experimentan senescencia celular. La vida útil in vitro de distintos tipos celulares varía, pero la duración máxima de la vida es, típicamente, menor que 100 duplicaciones de poblaciones (esta es la cantidad de duplicaciones para todas las células en el cultivo que se tornarán senescentes y, por lo tanto, harán que el cultivo no pueda dividirse). La senescencia no depende del tiempo cronológico, sino que se mide por la cantidad de divisiones celulares o duplicaciones de población que el cultivo experimentó. Así, las células que se inactivan al eliminar los factores de crecimiento esenciales pueden reiniciar el crecimiento y la división cuando se reintroducen los factores de crecimiento y, después de eso, portan la misma cantidad de duplicaciones que las células equivalentes cultivadas en forma continua. De manera similar, cuando las células se congelan en nitrógeno líquido después de varias cantidades de duplicaciones de poblaciones y, después, se descongelan y cultivan, experimentan prácticamente la misma cantidad de duplicaciones que las células mantenidas sin congelar en el cultivo. Las células senescentes no son células muertas o que se están muriendo; verdaderamente, son resistentes a la muerte celular programada (apóptosis) y se han mantenido sin división hasta tanto como tres años. Estas células están mucho más vivas y metabólicamente activas, pero no se dividen. Aun no se ha encontrado que el estado sin división de las células senescentes sea reversibles por cualquier agente biológico, químico o viral.
El término condición (o trastorno) neurodegenerativo es un término inclusivo que abarca condiciones, trastornos o enfermedades agudas y crónicas del sistema nervioso central o periférico. Una condición neurodegenerativa puede estar relacionada con la edad o puede ser el resultado de una lesión o trauma o puede estar relacionada con una enfermedad o trastorno específico. Las condiciones neurodegenerativas agudas incluyen, sin limitarse a, condiciones asociadas con la muerte celular neuronal o el compromiso que incluye insuficiencia cerebrovascular, trauma cerebral focal o difuso, daño cerebral difuso, lesión de la médula espinal o trauma del nervio periférico, por ejemplo, que resulta de quemaduras físicas o químicas, cortes profundos o amputación de extremidades. Los ejemplos de trastornos neurodegenerativos agudos son: isquemia o infarto cerebral que incluye oclusión embólica y oclusión trombótica, reperfusión después de la isquemia aguda, lesión isquémica hipóxica perinatal, paro cardíaco, así como hemorragia intracraneal de cualquier tipo (tal como epidural, subdural, subaracnoideo e intracerebral) y lesiones intracraneales e intravertebrales (tal como contusión, penetración, corte, compresión y laceración), asi como el síndrome del niño sacudido. Las condiciones neurodegenerativas crónicas incluyen, sin limitarse a, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Pick, enfermedad por cuerpos de Lewy difusos, parálisis supranuclear progresiva (síndrome de Steel-Richardson), degeneración multisistema (síndrome de Shy-Drager), condiciones epilépticas crónicas asociadas con la neurodegeneración, enfermedades de neuronas motoras que incluyen la esclerosis lateral amiotrófica, ataxia degenerativa, degeneración basal cortical, complejo de ALS-Parkinson-Demencia de Guam, panencefalitis esclerosante subaguda, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, sinucleinopatías (que incluyen atrofia sistémica múltiple), afasia progresiva primaria, degeneración estriatonigral, enfermedad de Machado-Joseph / ataxia espinocerebelosa tipo 3 y degeneraciones olivopontocerebelosas, enfermedad de Gilíes De La Tourette, parálisis bulbar y pseudobulbar, atrofia muscular espinal y espinobulbar (enfermedad de Kennedy), esclerosis lateral primaria, paraplejía espástica familiar, enfermedad de Werdnig-Hoffmann, enfermedad de Kugelberg-Welander, enfermedad de Tay-Sach, enfermedad de Sandhoff, enfermedad espástica familiar, enfermedad de Wohlfart-Kugelberg-Welander, paraparesis espástica, leucoencefalopatía multifocal progresiva, disautonomia familiar (síndrome de Riley-Día) y enfermedades de priones (que incluyen, sin limitarse a, Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Gerstmann-Stráussler-Scheinker, Kuru e insomnio familiar fatal), enfermedades de desmielinación y trastornos que incluyen esclerosis múltiple y enfermedades hereditarias tales como leucodistrofias.
Otras condiciones neurodegenerativas incluyen tumores y otras condiciones neoplásicas que afectan el SNC y SNP. Si bien se considera que la enfermedad subyacente es proliferativa (más que neurodegenerativa), los tejidos circundantes pueden estar comprometidos. Además, la terapia celular puede usarse para suministrar moléculas apoptóticas u otras moléculas antineoplásicas al sitio del tumor, por ejemplo, a través del suministro de células modificadas por ingeniería genética para producir tales agentes.
Otras condiciones neurodegenerativas incluyen varias neuropatías, tales como neuropatías multifocales, neuropatías sensoriales, neuropatías motoras, neuropatías sensoriales-motoras, neuropatías relacionadas con una infección, neuropatías autonómicas, neuropatías sensoriales autonómicas, neuropatías desmielinizantes (que incluyen, sin limitarse a, el síndrome de Guillain-Barre y la polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica), otras neuropatías inflamatorias e inmunes, neuropatías inducidas por fármacos, neuropatías inducidas por tratamientos farmacológicos, neuropatías inducidas por toxinas, neuropatías traumáticas (que incluyen, sin limitarse a, neuropatías por compresión, aplastamiento, laceración y segmentación), neuropatías metabólicas, neuropatías endocrinas y paraneoplásicas, entre otras.
Otras condiciones neurodegenerativas incluyen demencias, independientemente de la etiología subyacente, que incluyen demencia relacionada con la edad y otras demencias y condiciones con pérdida de memoria que incluyen demencia asociada con la enfermedad de Alzheimer, demencia vascular, enfermedad difusa de la sustancia blanca (enfermedad de Binswanger), demencia de origen endocrino o metabólico, demencia por trauma en la cabeza y daño cerebral difuso, demencia pugilística y demencia del lóbulo frontal.
El término que trata (o tratamiento de) una condición neurodegenerativa se refiere al alivio de los efectos o la demora, detención o reversión del avance o la demora o prevención de la aparición, de una condición neurodegenerativa tal como se define en la presente descripción.
El término cantidad eficaz se refiere a una concentración o cantidad de un reactivo o composición farmacéutica, tal como un factor de crecimiento, agente de diferenciación, factor trófico, población celular u otro agentes, eficaz para producir un resultado previsto, que incluye crecimiento celular y/o diferenciación in vitro o in vivo o el tratamiento de una condición neurodegenerativa tal como se describe en la presente descripción. Con respecto a los factores de crecimiento, una cantidad eficaz puede ser de aproximadamente 1 nanogramo/mililitro a aproximadamente 1 microgramo/mililitro. Con respecto a las células, tal como se administran a un paciente in vivo, una cantidad eficaz puede ser de unos pocos, tal como varios cientos o menos, hasta muchos tal como varios millones o más. En modalidades específicas, una cantidad eficaz puede ser de 103-1011, más específicamente, al menos aproximadamente 104 células. Se apreciará que la cantidad de células que se administrarán variará dependiendo de las especificidades del trastorno que se tratará que incluye, sin limitarse a, el tamaño o volumen/área de superficie total que se tratará, como también la proximidad del sitio de administración al lugar de la región que se tratará, entre otros factores conocidos para el biólogo medicinal.
Los términos periodo (o tiempo) efectivo y condiciones efectivas se refieren a un periodo de tiempo u otras condiciones controlables {por ejemplo, temperatura, humedad para métodos in vitro), necesarias o preferidas para que un agente o composición farmacéutica alcance el resultado previsto.
El término paciente o sujeto se refiere a animales que incluyen mamíferos, preferentemente, seres humanos, tratados con las composiciones farmacéuticas o de conformidad con los métodos descritos en la presente descripción.
El término portador (o medio) farmacéuticamente aceptable, que se puede usar indistintamente con el término portador o medio biológicamente compatible, se refiere a reactivos, células, compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que no son solamente compatibles con las células y otros agentes que se administrarán terapéuticamente, sino que están, además, dentro del alcance del criterio médico razonable, adecuados para usar en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin causar toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otra complicación proporcional a una relación beneficio/riesgo razonable. Tal como se describe en mayor detalle en la presente descripción, los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados para usar en la presente invención incluyen líquidos, materiales semisólidos por ejemplo, geles) y materiales sólidos {por ejemplo, estructuras y matrices celulares, tubos, láminas y otros materiales de ese estilo conocidos en la materia y descritos en la presente descripción en mayor detalle). Estos materiales semisólidos y sólidos pueden diseñarse para resistir la degradación dentro del cuerpo (no biodegradables) o pueden diseñarse para degradarse dentro del cuerpo (biodegradable, bioerosionablé). Un material biodegradable puede ser, además, bioresorbible o bioabsorbible, es decir, se puede disolver y absorber en fluidos corporales (los implantes solubles en agua son un ejemplo) o degradarse y, en última instancia, eliminarse del cuerpo, ya sea por conversión en otros materiales o descomposición y eliminación a través de rutas naturales.
Con respecto a la terapia de reemplazo celular, en la presente descripción se usan varios términos. Los términos transferencia autóloga, transplante autólogo, autoinjerto y similares se refieren a tratamientos, en donde el donante de células es, además, el receptor de la terapia de reemplazo celular. Los términos transferencia alogénica, transplante alogénico, aloinjerto y similares se refieren a tratamientos, en donde el donante de células es de la misma especie que el receptor de la terapia de reemplazo celular, pero no es el mismo individuo. Una transferencia de células en la cual se hace que las células del donante coincidan histocompatiblemente con un receptor se menciona, algunas veces, como una transferencia singénica. Los términos transferencia xenogénica, transplante xenogénico, xenoinjerto y similares se refieren a tratamientos, en donde el donante de células es de una especie diferente al receptor de la terapia de reemplazo celular.
Descripción Las condiciones neurodegenerativas, que abarcan trastornos y enfermedades agudas, crónicas y progresivas que tienen causas ampliamente divergentes, tienen como característica común la disfunción o pérdida de un grupo específico o vulnerable de células neurales. Esta característica común permite el desarrollo de métodos terapéuticos similares para la reparación y regeneración de tejido neural vulnerable o dañado, uno de los cuales es una terapia basada en células. En estas diversas modalidades descritas en la presente descripción, la presente invención caracteriza métodos y composiciones farmacéuticas para la reparación y regeneración neural por medio del uso de células progenitoras y poblaciones celulares derivadas del tejido del cordón umbilical. La invención es aplicable a cualquier condición neurodegenerativa, pero se espera que sea particularmente adecuada para varios trastornos neurales para los cuales resulta difícil o aun no se ha encontrado el tratamiento o cura apropiados. Estos incluyen, sin limitarse a, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, derrame cerebral, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, lesión de la médula espinal y lesión del nervio periférico {por ejemplo, tal como se asocia con la neuropatía diabética). En una modalidad de la invención, la condición neurodegenerativa es esclerosis lateral amiotrófica (ALS).
Como se resumió anteriormente, la invención está dirigida generalmente, en uno de sus aspectos, a células derivadas del tejido del cordón umbilical (UTC, por sus siglas en inglés) aisladas sustancialmente libres de sangre. Las UTC son capaces de autorenovarse y expandirse en cultivo y tienen el potencial para diferenciarse en células de fenotipos neurales. Ciertas modalidades caracterizan poblaciones que comprenden tales células, composiciones farmacéuticas que comprenden las células o componentes o productos de estos y métodos para usar las composiciones farmacéuticas para el tratamiento de pacientes con condiciones neurodegenerativas agudas o crónicas. Las células derivadas del tejido del cordón umbilical se han caracterizado por sus propiedades de crecimiento en cultivo, por los marcadores de superficie celular correspondientes, por su expresión génica, por su capacidad para producir ciertos factores tróficos bioquímicos y por sus propiedades inmunológicas.
Preparación de células de tejido derivadas del ombligo y la placenta De conformidad con los métodos descritos en la presente descripción, la placenta y el cordón umbilical de un mamífero se recuperan en el momento o poco tiempo después de la finalización de una gestación a término o gestación prematura, por ejemplo, después de la expulsión, después del nacimiento. El tejido se puede transportar desde el sitio de nacimiento hasta un laboratorio en un recipiente estéril, tal como un matraz, vaso, plato de cultivo o bolsa. El recipiente puede tener una solución o medio que incluye, sin limitarse a, una solución salina, tal como, por ejemplo medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés) o solución salina regulada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) o cualquier solución usada para el transporte de órganos para trasplante, tal como la solución de la Universidad de Wisconsin o solución perfluoroquímica. En el medio o regulador se puede añadir uno o más agentes antibióticos y/o antimicóticos, tales como, pero sin limitarse a, penicilina, estreptomicina, anfotericina B, gentamicina y nistatina. El tejido del ombligo y placenta se puede enjuagar con una solución anticoagulante, tal como solución que contiene heparina. Preferentemente, el tejido se mantiene a aproximadamente 4-10 °C antes de la extracción de las células. Aun con mayor preferencia, el tejido no se congela antes de la extracción de las células derivadas del ombligo o placenta.
Preferentemente, el aislamiento de células se produce en un ambiente aséptico. El cordón umbilical se puede separar de la placenta por medios conocidos en la materia. Alternativamente, el cordón umbilical y la placenta se usan sin separarlos. Preferentemente, la sangre y los residuos se eliminan del tejido antes del aislamiento de las células. Por ejemplo, el tejido se puede lavar con solución reguladora, tal como, pero sin limitarse a, solución salina regulada con fosfato. El regulador de lavado puede comprender, además, uno o más agentes antimicóticos y/o antibióticos, tal como, pero sin limitarse a, penicilina, estreptomicina, anfotericina B, gentamicina y nistatina.
El tejido que comprende un cordón umbilical completo, placenta entera o un fragmento o sección de estos se separa por fuerza mecánica (fuerzas de cizallamiento o corte). En una modalidad preferida en la presente, el procedimiento de aislamiento usa, además, un proceso de digestión enzimática. En la materia se conocen muchas enzimas útiles para el aislamiento de células individuales a partir de matrices de tejido complejas para facilitar el crecimiento en cultivo. Tales enzimas están disponibles comercialmente y abarcan desde enzimas débilmente digestivas {por ejemplo, desoxirribonucleasas y la proteasa neutra, dispasa) hasta enzimas fuertemente digestivas (por ejemplo, papaina y tripsina). Una lista no exhaustiva de enzimas compatibles con la presente incluye actividades enzimáticas mucolíticas, metaloproteasas, proteasas neutras, proteasas serina (tal como tripsina, quimotripsina o elastasa) y desoxirribonucleasas. En la presente descripción se prefieren las actividades enzimáticas seleccionadas de metaloproteasas, proteasas neutras y actividades mucolíticas. Por ejemplo, se conoce que las colagenasas son útiles para aislar varias células de tejidos. Las desoxirribonucleasas pueden procesar por digestión el ADN monocatenario y pueden minimizar la aglutinación de células durante el aislamiento. Los métodos preferidos implican el tratamiento enzimático, por ejemplo, con colagenasa y dispasa o colagenasa, dispasa y hialuronidasa, y se proporcionan métodos de ese tipo, en donde, en modalidades preferidas se usa una mezcla de colagenasa y la proteasa dispasa neutra en la etapa de disociación. Con mayor preferencia, se usan los métodos que emplean digestión en presencia de al menos una colagenasa de Clostridium histolyticum, y cualquiera de las actividades de proteasa, dispasa y termolisina. Aun con mayor preferencia, se usan métodos que emplean digestión con actividades enzimáticas de colagenasa y dispasa. Además, se prefieren métodos que incluyen digestión con una actividad de hialuronidasa además de actividades de colagenasa y dispasa. Una persona con experiencia en la materia apreciará que muchos de esos tratamientos enzimáticos se conocen en la materia como tratamientos para aislar células a partir de varias fuentes de tejido. Por ejemplo, la serie de combinaciones de enzimas LIBERASE™ Blendzyme (Roche) es adecuada para usar en los métodos de la presente invención. Se conocen otras fuentes de enzimas y la persona con experiencia puede obtener, además, tales enzimas directamente de sus fuentes naturales. Además, la persona con experiencia en la materia está preparada adecuadamente para evaluar enzimas o combinaciones de enzimas nuevas o adicionales para determinar su utilidad en el aislamiento de las células de la invención. Los tratamientos enzimáticos preferidos tienen una duración de 0.5, 1 , 1.5 o 2 horas o mayor. En otras modalidades preferidas, el tejido se incuba a 37 °C durante el tratamiento enzimático de la etapa de disociación.
En algunas modalidades de la invención, el tejido se separa en secciones que comprenden varios aspectos del tejido, tales como aspectos neonatales, neonatales/maternales y maternales de la placenta, por ejemplo. Después, las secciones separadas se disocian por disociación mecánica y/o enzimática de conformidad con los métodos descritos en la presente descripción. Las células de linaje neonatal o maternal pueden identificarse por cualquier medio conocido en la materia, por ejemplo, por análisis de cariotipos o hibridación in situ para un cromosoma Y.
Las células o el tejido aislado a partir del cual crecen las hUTC se pueden usar para iniciar o sembrar cultivos celulares. Las células aisladas se transfieren a recipientes de cultivo de tejido estéril no recubierto o recubierto con matriz extracelular o ligandos, tales como laminina, colágeno (nativo, desnaturalizado o reticulado), gelatina, fibronectina y otras proteínas de la matriz extracelular. Las hUTC se cultivan en cualquier medio de cultivo capaz de mantener el crecimiento de las células tales como, pero sin limitarse a, DMEM (alto o bajo contenido de glucosa), DMEM avanzado, DMEM/MCDB 201 , medio basal de Eagle, medio F10 de Ham (F10), medio F-12 de Ham (F12), medio de Dulbecco modificado por Iscove, medio de crecimiento de células madre mesenquimales (MSCGM, por sus siglas en inglés), DMEM/F12, RPMI 1640 y Cellgro FREE™. El medio de cultivo se puede suplementar con uno o más componentes que incluyen, por ejemplo, suero fetal bovino (FBS, por sus siglas en inglés), preferentemente, aproximadamente 2-15 % (v/v); suero equino (ES, por sus siglas en inglés); suero humano (HS, por sus siglas en inglés); beta-mercaptoetanol (BME o 2-ME), preferentemente, aproximadamente 0.001 % (v/v); uno o más factores de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento insulínico 1 (IGF-1), factor inhibidor de leucocitos (LIF, por sus siglas en inglés) y eritropoietina; aminoácidos que incluyen L-valina; y uno o más agentes antibióticos y/o antimicóticos para controlar la contaminación microbiana, tal como, por ejemplo, penicilina G, sulfato de estreptomicina, anfotericina B, gentamicina y nistatina, solos o combinados. El medio de cultivo comprende, preferentemente, medio de crecimiento (DMEM con bajo contenido de glucosa, suero, BME y un agente antibiótico).
Las células se siembran en recipientes de cultivo a una densidad que permite el crecimiento celular. En una modalidad preferida, las células se cultivan a aproximadamente 0 a aproximadamente 5 porcentaje en volumen de C02 en aire. En algunas modalidades preferidas, las células se cultivan a aproximadamente 2 a aproximadamente 25 por ciento de 02 en aire, preferentemente, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 por ciento de O2 en aire. Las células se cultivan, preferentemente, a aproximadamente 25 a aproximadamente 40 °C y, con mayor preferencia, se cultivan a 37 °C. Preferentemente, las células se cultivan en un incubador. El medio en el vaso para cultivo puede ser estático o se puede agitar, por ejemplo, con el uso de un bioreactor. Preferentemente, las células se cultivan en condiciones de estrés oxidativo bajo {por ejemplo, con adición de glutatión, vitamina C, catalasa, vitamina E, N-acetilcisteína). Como se usa en la presente descripción, "estrés oxidativo bajo", se refiere a condiciones en las cuales los radicales libres no generan o generan un daño mínimo en las células cultivadas.
Los métodos para seleccionar el medio de cultivo, la preparación del medio y las técnicas de cultivo celular más adecuados son conocidos en la materia y se describen en diversas fuentes que incluyen Doyle y otros, (eds.), 1995, Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons, Chichester; y Ho y Wang (eds.), 1991, Animal Cell Bioreactors, Butterworth-Heinemann, Boston, incorporadas en la presente descripción como referencia.
Después de cultivar las células o fragmentos de tejido aislados por un tiempo suficiente, las UTC habrán crecido, ya sea como resultado de migración desde el tejido o por la división celular o ambos. En algunas modalidades de la invención, se realiza el pase de las UTC o estas se extraen a un recipiente de cultivo separado que contiene medio fresco del mismo tipo o un tipo diferente al usado inicialmente, en donde la población de células se puede expandir mitóticamente. Las células de la invención se pueden usar en cualquier punto entre el pase 0 y la senescencia. Preferentemente, se realiza el pase de las células entre aproximadamente 3 y aproximadamente 25 veces, con mayor preferencia, de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 veces y, preferentemente, 10 u 11 veces. Para confirmar que se aisló una población clonal de células se puede realizar clonación y/o subclonación.
En algunos aspectos de la invención, los distintos tipos de células presentes en el tejido del cordón umbilical o placenta se fraccionan en subpoblaciones a partir de las cuales se aislan las células. Esto se puede producir con el uso de técnicas estándar para la separación celular que incluyen, sin limitarse a, tratamiento enzimático para disociar el tejido en las células componentes, seguido de la clonación y selección de tipos celulares específicos, por ejemplo, sin limitarse a, la selección basada en marcadores morfológicos y/o bioquímicos; el cultivo selectivo de células deseadas (selección positiva), destrucción selectiva de células no deseadas (selección negativa); separación basada en la capacidad de aglutinación celular diferencial en la población mixta, tal como, por ejemplo, con aglutinina de frijol de soja; procedimientos de congelamiento-descongelamiento; propiedades de adherencia diferencial de las células en la población mixta; filtración; centrifugación convencional y zonal; elutriacion centrífuga (centrifugación contracorriente); separación de unidades por gravedad; distribución contracorriente; electroforesis; y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés). Un análisis de las técnicas de selección clonal y separación de células se encuentra en Freshney, 1994, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, 3. ° Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, incorporada en la presente descripción como referencia.
El medio de cultivo se cambia, según sea necesario, por ejemplo, mediante la aspiración cuidadosa del medio del plato, por ejemplo, con una pipeta, y se vuelve a llenar con medio fresco. La incubación continúa hasta que se acumula una cantidad o densidad suficiente de células en el plato. Las secciones originales del tejido explantado se pueden extraer y las células restantes se tripsinizan con el uso de técnicas estándar o con un raspador de células. Después de la tripsinización, las células se recolectan, se transfieren a un medio fresco y se incuban como se describió anteriormente. En algunas modalidades, el medio se cambia al menos una vez aproximadamente 24 horas después de la tripsinización para eliminar cualquier célula flotante. Se considera que las células que quedan en el cultivo son UTC.
Las UTC se pueden criopreservar. En consecuencia, en una modalidad preferida descrita más adelante en mayor detalle, las UTC para transferencia autóloga (para la madre o el niño) se pueden derivar a partir de tejidos posparto adecuados después del nacimiento de un niño, después, se criopreservan de modo que estén disponibles en caso de necesitarlas más adelante para trasplante.
Características de células derivadas del ombligo y la placenta Las células derivadas del ombligo y la placenta pueden caracterizarse, por ejemplo, en función de las características de crecimiento (por ejemplo, capacidad de duplicación de la población, tiempo de duplicación, pases a senescencia), análisis de cariotipos {por ejemplo, cariotipo normal; linaje maternal o neonatal), citometría de flujo {por ejemplo, análisis por FACS), inmunohistoquímica y/o inmunocitoquímica {por ejemplo, para la detección de epítopos), perfilado de expresión génica {por ejemplo, conjuntos de matrices génicas; reacción en cadena de la polimerasa (por ejemplo, PCR con transcripción inversa, PCR en tiempo real y PCR convencional)), matrices de proteínas, secreción de proteínas {por ejemplo, por ensayo de coagulación de plasma o análisis de medio acondicionado con PDC, por ejemplo, por medio del ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés)), reacción linfocitaria mixta {por ejemplo, como medida de la estimulación de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés)) y/u otros métodos conocidos en la materia.
Se depositaron ejemplos de células derivadas de tejido placentario en la Colección Americana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection - ATCC, Manassas, VA) y se asignaron los siguientes números de registro de ATCC: (1) la cepa designada PLA 071003 (P8) se depositó el 15 de junio de 2004 y se asignó el núm. de registro PTA-6074; (2) la cepa designada PLA 071003 (P11) se depositó el 15 de junio de 2004 y se asignó el núm. de registro PTA-6075; y (3) la cepa designada PLA 071003 (P16) se depositó el 16 de junio de 2004 y se asignó el núm. de registro PTA-6079. Se depositaron ejemplos de células derivadas de tejido del ombligo en la Colección Americana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection) el 10 de junio de 2004 y se asignó los siguientes núms. de registro de ATCC: (1) a la cepa designada UMB 022803 (P7) se asignó el núm. de registro PTA-6067; y (2) a la cepa designada UMB 022803 (P17) se asignó el núm. de registro PTA-6068.
En varias modalidades, las células tienen uno o más de los siguientes características de crecimiento (1) requieren L-valina para crecer en cultivo; (2) son capaces de crecer en atmósferas que contienen oxígeno en una cantidad de aproximadamente 5 % a al menos aproximadamente 20 % (3) tienen el potencial para al menos aproximadamente 40 duplicaciones en cultivo antes de llegar a la senescencia; y (4) se unen y expanden en un recipiente de cultivo del tejido recubierto o no recubierto, en donde el recipiente del cultivo de tejido recubierto comprende un recubrimiento de gelatina, laminina, colágeno, poliornitina, vitronectina o fibronectina.
En ciertas modalidades, las células tienen un cariotipo normal que se mantiene a medida que se realizan los pases de células. El cariotipado es particularmente útil para identificar y distinguir las células neonatales de las maternales derivadas de la placenta. Los métodos para el cariotipado están disponibles y son conocidos para aquellos con experiencia en la materia.
En otras modalidades, las células se pueden caracterizar por la producción de ciertas proteínas que incluyen (1) la producción de al menos un factor tisular y/o vimentina y/o actina alfa del músculo liso; y (2) producción de al menos un marcador de la superficie celular CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, PD-L2 o HLA-A,B,C, según la detección realizada por medio de citometría de flujo. En otras modalidades, las UTC se pueden caracterizar por la falta de producción de al menos un marcador de la superficie celular CD31 , CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141 , CD178, B7-H2, HLA-G O HLA-DR.DP.DQ, según la detección realizada por medio de citometría de flujo. Particularmente, se prefieren las células que producen al menos dos de los siguientes: un factor tisular, vimentina y actina alfa del músculo liso. Con mayor preferencia, se usan las células que producen las siguientes tres proteínas: factor tisular, vimentina y actina alfa del músculo liso.
En otras modalidades, las células se pueden caracterizar por la expresión génica que, con respecto a una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal o una célula de la médula ósea de la cresta ilíaca, aumenta para un gen que codifica al menos uno de interleucina 8; reticulón 1; ligando de quimocina (motivo C-X-C) 1 (actividad estimulante del crecimiento de melanoma, alfa); ligando de quimocina (motivo C-X-C) 6 (proteína quimiotáctica de granulocitos 2); ligando de quimocina (motivo C-X-C) 3; factor de necrosis tumoral y proteína 3 alfa-inducida.
En aun otras modalidades, las células se pueden caracterizar por la expresión génica que, con respecto a una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal o una célula de la médula ósea de la cresta iliaca, se reduce para un gen que codifica al menos uno de: caja homeótica de la baja estatura 2; proteína 2 de choque térmico de 27 kDa; ligando de quimocina (motivo C-X-C) 12 (factor 1 derivado de la célula estromal); elastina (estenosis aórtica supravalvular, síndrome de Williams-Beuren); ARNm humano; ADNc DKFZp586M2022 (del clon DKFZp586M2022); caja homeótica de la mesénquima 2 (caja homeótica específica de la detención del crecimiento); homólogo de la caja homeótica de sine oculis 1 (Drosophila); cristalina, alfa B; activador de morfogénesis asociado con disheveled 2; proteína DKFZP586B2420; similar a neuralin 1 ; tetranectina (proteína de unión al plasminógeno); homología a src tres (SH3) y dominio rico en cisteína; colesterol 25-hidroxilasa; factor de transcripción 3 relacionado con runt; receptor de interleucina 11 , alfa; mejorador de procolágeno C-endopeptidasa; homólogo de frizzled 7 {Drosophila); gen hipotético BC008967; colágeno, tipo VIII, alfa 1 ; tenascina C (hexabraquion); proteína 6 de la caja homeótica de iroquois; hefaestina; integrina, beta 8; glicoproteína 2 de la vesícula sináptica; neuroblastoma, supresión de tumorigenicidad 1; proteina 2 de unión al factor de crecimiento insulínico, 36 kDa; ADNc humano FLJ12280 fis, clon MAMMA1001744; factor 1 similar al receptor de citocina; canal de potasio activado por calcio de conductancia intermedia/baja, subfamilia N, miembro 4; integrina, beta 7; coactivador transcripcional con el motivo de unión a PDZ (TAZ); homólogo de la caja homeótica de sine oculis 2 (Drosophila); proteína KIAA1034; proteína 5 de la membrana vesicular (miobrevina); proteína 1 de matriz extracelular tipo fibulina contenedora de EGF; respuesta al crecimiento temprano 3; caja homeótica de distal-less 5; proteína hipotética FLJ20373; aldo-ceto reductasa familia 1, miembro C3 (3-alfa hidroxiesteroide deshidrogenasa, tipo II); biglicano; coactivador transcripcional con el motivo de unión a PDZ (TAZ); fibronectina 1 ; proencefalina; integrina, beta-tipo 1 (con dominios de repeticiones tipo EGF); ARNm humano del clon EUROIMAGE 1968422 de ADNc de longitud completa; EphA3; proteína KIAA0367; receptor C/guanilato ciclasa C del péptido natriurético (receptor C del péptido atrionatriurético); proteína hipotética FLJ 14054; ARNm humano; ADNc DKFZp564B222 (del clon DKFZp564B222); proteína 3 de interacción BCL2/adenovirus E1 B de 19 kDa; proteína 1 de unión a AE; y polipéptido 1 de la subunidad Vlla de citocromo C oxidasa (músculo).
En otras modalidades, las células se pueden caracterizar por la secreción de al menos uno de MCP-1 , IL-6, IL-8, GCP-2, HGF, KGF, FGF, HB-EGF, BDNF, TPO, MIP1a, RANTES y TIMP1. En modalidades alternativas, las células se pueden caracterizar por la falta de secreción de al menos uno de TGF-beta2, ANG2, PDGFbb, MIP1b, I309, MDC y VEGF, según la detección realizada por medio de ELISA.
En modalidades preferidas, la célula comprende dos o más de las características de crecimiento, producción de marcadores de proteínas/superficie, expresión génica o secreción de sustancia listadas anteriormente. Con mayor preferencia, las células comprenden tres, cuatro, cinco o más de esas características. Aun con mayor preferencia, las células comprenden seis, siete, ocho o más de esas características. Aun con mayor preferencia, las células comprenden todas las características anteriores.
En una modalidad de la invención, las células son células derivadas del tejido del cordón umbilical que se aislan del tejido del cordón umbilical humano sustancialmente libre de sangre, son capaces de autorenovarse y expandirse en cultivo, tienen el potencial de diferenciarse en células de otros fenotipos, pueden experimentar al menos 40 duplicaciones y tienen las siguientes características: (a) expresa cada uno de cada uno de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, PD-L2 y HLA-A,B,C; (b) no expresa ninguno de CD31 , CD34, CD45, CD80, CD86, CD 117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G o HLA-DR,DP,DQ; y (c) mayor expresión de interleucina-8; reticulón 1 ; y ligando del receptor de quimocina (motivo C-X-C) 3, con respecto a las de una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal o una célula de la médula ósea de la cresta ilíaca. En una modalidad, estas células derivadas del cordón umbilical tienen, además, una o más de las siguientes características: (a) secreción de cada uno de los siguientes: factor MCP-1 , MlPIbeta, IL-6, IL-8, GCP-2, HGF, KGF, FGF, HB-EGF, BDNF, TPO, RANTES y TIMP1 ; y (b) falta de secreción de cualquiera de los factores SDF-1alfa TGF-beta2, ANG2, PDGFbb, MIP1a y VEGF. En otra modalidad, estas células derivadas del tejido del cordón umbilical no expresan hTERT o telomerasa.
Entre las células preferidas en la presente para usar con la invención en varios de sus aspectos se encuentran las células derivadas del tejido del cordón umbilical que tienen las características descritas anteriormente y, más particularmente, aquellas en donde las células tienen cariotipos normales y mantienen cariotipos normales con los pases y, además, en donde las células expresan cada uno de los marcadores CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa y HLA-A,B,C, en donde las células producen las proteínas detectables inmunológicamente que corresponden a los marcadores listados. Aun con mayor preferencia, las células son aquellas que, además de lo anterior, no producen proteínas que corresponden a ninguno de los marcadores CD31 , CD34, CD45, CD117, CD141 o HLA-DR.DP.DQ, según la detección realizada por medio de citometría de flujo.
Ciertas células que tienen el potencial para diferenciarse a lo largo de las líneas que llevan a varios fenotipos son inestables y, por lo tanto, pueden diferenciarse espontáneamente. Actualmente, se prefiere usar con la invención las células que no se diferencian espontáneamente, por ejemplo, a lo largo de líneas neurales. Las células preferidas, cuando se cultivan en un medio de crecimiento, son sustancialmente estables con respecto a los marcadores celulares producidos en su superficie y con respecto al patrón de expresión de varios genes, por ejemplo, según se determina con el uso de Affymetrix GENECHIP®. Las células se mantienen sustancialmente constantes, por ejemplo, en las características de sus marcadores de superficie durante los pases, a través de múltiples duplicaciones de poblaciones.
Sin embargo, una característica de las células es que pueden inducirse deliberadamente para diferenciarse en fenotipos de linaje neural cuando se exponen a condiciones de cultivo celular que inducen la diferenciación. Para ello se puede usar uno o más métodos conocidos en la materia. Por ejemplo, tal como se ilustra en la presente descripción, las células derivadas del tejido del cordón umbilical se pueden sembrar en placas en matraces recubiertos con laminina en medio Neurobasal-A (Invitrogen, Carlsbad, CA) que contiene B27 (suplemento B27, Invitrogen), L-glutamina y penicilina/estreptomicina, la combinación de los cuales se menciona en la presente descripción como medio de expansión de progenitores neurales (NPE, por sus siglas en inglés). El medio NPE puede suplementarse aún más con bFGF y/o EGF. Alternativamente, las UTC se pueden inducir para diferenciarse in vitro por medio del (1) cocultivo de las UTC con células progenitoras neurales o (2) el cultivo de las UTC en medio acondicionado con células progenitoras neurales.
La diferenciación de las UTC se puede demostrar por medio de una morfología celular bipolar con procesos extendidos. Las poblaciones de células inducidas pueden dar un resultado positivo en la tinción para determinar la presencia de nestina. Las UTC diferenciadas pueden evaluarse por detección de nestina, TuJ1 (tubulina Bill), GFAP, tirosina hidroxilasa, GABA, 04 y/o MBP. En algunas modalidades, las UTC han demostrado la capacidad para formar cuerpos tridimensionales característicos de la formación de células madre neuronales o neuroesferas.
Poblaciones de UTC. modificaciones, componentes y productos Otro aspecto de la invención caracteriza poblaciones de las UTC descritas anteriormente. En algunas modalidades, la población de células es heterogénea. Una población de células heterogénea de la invención puede comprender al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de las UTC de la invención. Las poblaciones de células heterogéneas de la invención pueden comprender, además, células madre u otras células progenitoras, tales como células progenitoras neurales o pueden comprender, además, células neurales totalmente diferenciadas. En algunas modalidades, la población es sustancialmente homogénea, es decir, comprende prácticamente solo UTC (preferentemente, al menos aproximadamente 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más UTC). La población de células homogénea de la invención comprende células derivadas del ombligo. Las poblaciones homogéneas de células derivadas del ombligo están, preferentemente, libres de células de linaje maternal. La homogeneidad de una población de células puede obtenerse por cualquier método conocido en la materia, por ejemplo, por clasificación celular {por ejemplo, citometría de flujo) o expansión clonar de conformidad con métodos conocidos. Por lo tanto, las poblaciones de UTC homogéneas preferidas pueden comprender una línea celular clonal de células derivadas del tejido del cordón umbilical. Dichas poblaciones son particularmente útiles cuando se ha aislado un clon celular con una funcionalidad altamente deseable.
Además, en la presente descripción se proporcionan poblaciones de células incubadas en presencia de uno o más factores o en condiciones que estimulan la diferenciación de células madre a lo largo de una ruta neurogénica. Esos factores son conocidos en la materia y la persona con experiencia en la materia apreciará que la determinación de las condiciones adecuadas para la diferenciación puede realizarse por la experimentación de rutina. Dichas condiciones pueden optimizarse por medio de diseño y análisis experimental estadístico, por ejemplo, la metodología de superficie de respuesta permite optimizar simultáneamente múltiples variables, por ejemplo, en un cultivo biológico. Los factores preferidos en la presente descripción incluyen, sin limitarse a, factores tales como los factores de crecimiento y tróficos, agentes desmetilantes, cocultivo con células de linaje neural o cultivo en un medio acondicionado con células de linaje neural, así como otras condiciones conocidas en la materia como condiciones que estimulan la diferenciación de células madre a lo largo de una ruta o linaje neurogénico (ver, por ejemplo, Lang, K.J.D. y otros, 2004, J. Neurosci. Res. 76: 184-192; Johe, K.K. y otros, 1996, Genes Devel. 10: 3129-3140; Gottleib, D., 2002, Ann. Rev. Neurosci. 25: 381-407).
Las UTC, además, se pueden modificar genéticamente para producir productos génicos neuroterapéuticamente útiles o para producir agentes antineoplásicos, por ejemplo, para el tratamiento de tumores. La modificación genética puede realizarse con el uso de cualquiera de los diversos vectores que incluyen, sin limitarse a, vectores virales de integración, por ejemplo, vector de retrovirus o vectores virales adenoasociados; vectores de replicación no integrantes, por ejemplo, vectores del virus del papiloma, vectores SV40, vectores adenovirales; o vectores virales de replicación defectuosa. Otros métodos para introducir ADN en células incluyen el uso de liposomas, electroporación, una pistola de partículas o por inyección directa de ADN.
Preferentemente, las células huésped se transforman o transfectan con ADN controlado por o en asociación operativa con uno o más elementos de control de la expresión adecuados tales como secuencias promotoras o mejoradoras, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, entre otros, y un marcador seleccionarle. Para realizar la expresión del gen insertado se puede usar cualquier promotor. Por ejemplo, los promotores virales incluyen, sin limitarse a, el promotor/intensificador de CMV, SV 40, virus del papiloma, virus Epstein-Barr o el promotor del gen de elastina. En algunas modalidades, los elementos de control usados para controlar la expresión del gen de interés pueden permitir la expresión regulada del gen de modo que el producto se sintetice solamente cuando se necesita in vivo. Si se desea obtener una expresión transitoria, se usan, preferentemente, promotores constitutivos en un vector no integrante y/o de replicación defectuosa. Alternativamente, podrían usarse promotores inducibles para conducir la expresión del gen insertado cuando es necesario. Los promotores inducibles incluyen, sin limitarse a, aquellos asociados con metalotioneína y proteínas de choque térmico.
Después de la introducción del ADN foráneo puede dejarse que las células diseñadas por ingeniería genética crezcan en un medio enriquecido y, después, se cambie el medio a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el ADN foráneo confiere resistencia a la selección y permite que las células integren establemente el ADN foráneo, por ejemplo, en un plásmido, en sus cromosomas y crezcan para formar foci que, a su vez, pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Este método puede usarse favorablemente para diseñar por ingeniería genética líneas celulares que expresan el producto génico.
Las células de la invención se pueden diseñar mediante ingeniería genética para "eliminar" o "reducir significativamente" la expresión de los factores que promueven la inflamación o el rechazo en el sitio de implante. Las técnicas moduladoras negativas para reducir los niveles de expresión génica objetivo o los niveles de actividad del producto génico objetivo se detallan más abajo. Como se usa en la presente descripción, "modulación negativa" se refiere a una reducción en el nivel y/o actividad del producto génico objetivo con respecto al nivel y/o actividad del producto génico previsto en ausencia del tratamiento modulador. La expresión de un gen nativo a una neurona o célula glial se puede reducir o eliminar con el uso de varias técnicas que incluyen, por ejemplo, la inhibición de la expresión por la inactivación del gen con el uso de la técnica de recombinación homologa. Típicamente, un exón que codifica una región importante de la proteína (o un exón 5' para esa región) es interrumpido por un marcador seleccionable positivo, por ejemplo, neo, que evita la producción de ARNm normal a partir del gen objetivo y resulta en la inactivación del gen. Un gen puede inactivarse, además, por la creación de una deleción en una parte de un gen o por la deleción del gen entero. Por medio del uso de un constructo con dos regiones de homología al gen objetivo que están lejos en el genoma, se puede eliminar las secuencias que intervienen las dos regiones (Mombaerts y otros, 1991, Proc. Nal Acad. Sci. U.S.A. 88:3084-3087). Las moléculas no codificante, ADNzimas, ribozimas, ARN interferente pequeño (ARNip) y otras moléculas de ese tipo que inhiben la expresión del gen objetivo pueden usarse, además, para reducir el nivel de actividad del gen objetivo. Por ejemplo, se ha demostrado que las moléculas de ARN no codificante que inhiben la expresión de complejos genéticos mayores de histocompatibilidad (HLA) son más versátiles con respecto a las respuestas inmunes. Aun más, las moléculas de hélice triple se pueden usar para reducir el nivel de actividad del gen objetivo. Estas técnicas son descritas en detalle por L.G. Davis y otros (eds), 1994, Basic Methods in Molecular Biology, 2. ° ed., Appleton & Lange, Norwalk, CN.
En otros aspectos, la invención proporciona lisados celulares y fracciones celulares solubles preparadas a partir de UTC o poblaciones de células heterogéneas u homogéneas que comprenden UTC, así como UTC o poblaciones de estas que se modificaron por ingeniería genética o se estimularon para su diferenciación a lo largo de una ruta neurogénica. Dichos lisados y fracciones de estos tienen muchas utilidades. El uso de una fracción soluble en lisado de UTC (es decir, sustancialmente libre de membranas) in vivo, por ejemplo, permite usar el medio intracelular benéfico en forma alogénica en un paciente sin introducir una cantidad considerable de las proteínas de la superficie celular que más probablemente desencadene el rechazo u otras respuestas inmunológicas adversas. Los métodos para lisar células son conocidos en la materia e incluyen varios medios de alteración mecánica, alteración enzimática o alteración química o combinaciones de estos. Tales lisados celulares se pueden preparar a partir de células directamente en su medio de cultivo y, de ese modo, contienen factores de crecimiento secretados y similares o pueden prepararse a partir de células lavadas libres de medio, por ejemplo, en PBS u otra solución. Las células lavadas se pueden resuspender en concentraciones mayores que la densidad de la población original, si se prefiere.
En una modalidad, los lisados de células enteras se preparan, por ejemplo, mediante la alteración de células sin una separación de fracciones celulares posterior. En otra modalidad, una fracción de membrana celular se separa a partir de una fracción soluble de las células por métodos de rutina conocidos en la materia, por ejemplo, centrifugación, filtración o métodos similares.
Los lisados celulares o fracciones celulares solubles preparadas a partir de poblaciones de células derivadas del tejido del cordón umbilical se pueden usar en su estado original, más concentradas, por ejemplo por ultrafiltración o liofilización o incluso secadas, parcialmente purificadas, combinadas con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables tal como se conocen en la materia o combinadas con otros compuestos tales como compuestos biológicos, por ejemplo, composiciones proteicas farmacéuticamente útiles. Los lisados celulares o fracciones de estos se pueden usar in vitro o in vivo, solos o, por ejemplo, con células vivas singénicas o autólogas. Los lisados, si se introducen in vivo, se pueden introducir localmente en un sitio de tratamiento o remotamente para proporcionar a un paciente, por ejemplo, factores de crecimiento celular necesarios.
En otra modalidad, las UTC se pueden cultivar in vitro para generar una alta producción de productos biológicos. Por ejemplo, aquellas células que producen naturalmente un producto biológico particular de interés (por ejemplo, un factor trófico) o que se diseñaron mediante ingeniería genética para producir un producto biológico se pueden expandir clonalmente con el uso de las técnicas de cultivo descritas en la presente descripción. Alternativamente, las células se pueden expandir en un medio que induce la diferenciación en un linaje neural. En cualquier caso, los productos biológicos producidos por la célula y secretados en el medio se pueden aislar fácilmente del medio acondicionado con el uso de técnicas de separación estándar, por ejemplo, tal como precipitación diferencial de proteínas, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de filtración en gel, electroforesis y HPLC, entre otras. Un "biorreactor" se puede usar para aprovechar el método de flujo para alimentación, por ejemplo, un cultivo tridimensional in vitro. Prácticamente, a medida que pasa medio nuevo a través del cultivo tridimensional, el producto biológico se elimina del cultivo por lavado y, después, puede aislarse del flujo de salida, como se indicó anteriormente.
Alternativamente, un producto biológico de interés puede permanecer dentro de la célula y, por lo tanto, para recolectar puede ser necesario que las células estén lisadas, tal como se describió anteriormente. Después, el producto biológico se puede purificar con el uso de una o más técnicas enumeradas anteriormente.
En otras modalidades, la invención proporciona medio acondicionado a partir de UTC cultivadas para usar in vitro e in vivo tal como se describe más abajo. El uso del medio acondicionado con UTC permite usar los factores tróficos benéficos secretados por las UTC alogénicamente en un paciente sin introducir células intactas que podrían desencadenar rechazo u otras respuestas inmunológicas adversas. Para preparar el medio acondicionado las células se cultivan en un medio de cultivo y, después, las células se extraen del medio.
El medio acondicionado preparado a partir de poblaciones de células derivadas del tejido del cordón umbilical se puede usar en su estado original, más concentrado, por ejemplo por ultrafiltración o liofilización o incluso secado, parcialmente purificado, combinado con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables tal como se conocen en la materia o combinado con otros compuestos tales como compuestos biológicos, por ejemplo, composiciones proteicas farmacéuticamente útiles, el medio acondicionado se puede usar in vitro o in vivo, solo o, por ejemplo, con células vivas singénicas o autólogas. El medio acondicionado, si se introduce in vivo, se puede introducir localmente en un sitio de tratamiento o remotamente para proporcionar a un paciente, por ejemplo, factores de crecimiento celular o tróficos necesarios.
En otra modalidad, una matriz extracelular (ECM) producida por el cultivo de UTC en sustratos líquidos, sólidos o semisólidos se prepara, recolecta y usa como alternativa para el implante de células vivas en un sujeto que necesita una reparación o reemplazo de tejido. Las UTC se cultivan in vitro, en un marco tridimensional tal como se describe en alguna otra parte de la presente descripción, en condiciones tales que se secreta una cantidad deseada de ECM sobre el marco. Aquellas que comprenden el tejido nuevo se eliminan y la ECM se procesa para uso posterior, por ejemplo, como una preparación inyectable. Para ello, las células en el marco se exterminan y cualquier resto celular se elimina del marco. Este proceso se puede realizar en varias formas diferentes. Por ejemplo, el tejido viviente se puede congelar instantáneamente en nitrógeno líquido sin criopreservante o el tejido se puede sumergir en agua destilada estéril de modo que las células estallen en respuesta a la presión osmótica.
Una vez que las células se exterminaron, las membranas celulares se pueden alterar y los residuos celulares se pueden eliminar por el tratamiento con un enjuague detergente suave, tal como EDTA, CHAPS o un detergente zwitteriónico. Alternativamente, se puede realizar la digestión enzimática y/o extracción de tejido con reactivos que descomponen las membranas celulares y permiten eliminar el contenido de células. Los ejemplos de tales enzimas incluyen, sin limitarse a, hialuronidasa, dispasa, proteasas y nucleasas. Los ejemplos de detergentes incluyen detergentes no iónicos tales como, por ejemplo, alcohol poliéter alquilarilo (TRITON X-100), octil fenoxi polietoxietanol (Rohm and Haas Philadelphia, PA), BRIJ-35, lauril éter polietoxietanol (Atlas Chemical Co., San Diego, CA), polisorbato 20 (TWEEN 20), monolaurato de sorbitán polietoxietanol (Rohm and Haas), polietilenlauril éter (Rohm and Haas); y detergentes iónicos tales como, por ejemplo, dodecil sulfato de sodio, alcoholes alifáticos sulfatados de alto peso molecular, aléanos sulfonados y alquitárenos sulfonados que contienen de 7 a 22 átomos de carbono en una cadena ramificada o no ramificada.
La ECM se puede recolectar de diversas formas que dependen, por ejemplo, de factores tales como si el nuevo tejido se formó en un marco tridimensional que es biodegradable o no biodegradable. Por ejemplo, si el marco no es biodegradable, la ECM se puede eliminar al exponer el marco a sonicación, chorros de agua de alta presión, raspado mecánico o tratamiento suave con detergentes o enzimas o cualquier combinación de los anteriores.
Si el marco es biodegradable, para recolectar la ECM se puede dejar, por ejemplo, que el marco se degrade o disuelva en solución. Alternativamente, si el marco biodegradable está compuesto de un material que en sí mismo se puede inyectar junto con la ECM, el marco y la ECM se pueden procesar in toto para la inyección posterior. Alternativamente, la ECM se puede eliminar del marco biodegradable por cualquiera de los métodos descritos anteriormente para recolección de la ECM a partir de un marco no biodegradable. Todos los procesos de recolección se diseñan, preferentemente, de modo que se evite la desnaturalización de la ECM.
Una vez que se recolectó, la ECM se puede procesar aun más. Por ejemplo, la ECM se puede homogeneizar a partículas finas con el uso de técnicas muy conocidas en la materia, tal como sonicación, de modo que pueda pasar a través de una aguja quirúrgica. Los componentes de la ECM se pueden reticular, si se desea, por irradiación gamma. Preferentemente, la ECM se puede irradiar de 0.25 a 2 mega rads para esterilizar y reticular la ECM. Si bien, generalmente, se prefiere evitarlo, se puede usar agentes tóxicos, tales como glutaraldehído, para la reticulación química.
Las cantidades y/o relaciones de proteínas, tales como los diversos tipos de colágeno presentes en la ECM se pueden ajustar por el mezclado de la ECM producido por las células de la invención con ECM de uno o más de otros tipos celulares. Además, en la ECM se puede incorporar sustancias biológicamente activas tales como proteínas, factores de crecimiento y/o fármacos. Las sustancias biológicamente activas ilustrativas incluyen factores de crecimiento del tejido, tales como TGF-beta y similares, que promueven la curación y reparación del tejido en el sitio de la inyección. Dichos agentes adicionales se pueden usar en cualquiera de las modalidades descritas anteriormente en la presente descripción, por ejemplo, con lisados de células enteras, fracciones celulares solubles o componentes y productos más purificados producidos por las UTC.
Composiciones farmacéuticas que comprenden UTC. componentes de UTC o productos En otro aspecto, la invención proporciona el uso de composiciones farmacéuticas que incluyen UTC, poblaciones de UTC, componentes y productos de UTC en varios métodos para el tratamiento de condiciones neurodegenerativas (tales como, por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica). Ciertas modalidades abarcan composiciones farmacéuticas que comprenden células vivas (UTC solas o mezcladas con otros tipos celulares). Otras modalidades abarcan composiciones farmacéuticas que comprenden componentes celulares de UTC (por ejemplo, lisados celulares, fracciones celulares solubles, medios acondicionados, ECM o componentes de cualquiera de los anteriores) o productos (por ejemplo, factores tróficos y otros factores biológicos producidos naturalmente por las UTC o a través de modificación genética, medio acondicionado a partir del cultivo de UTC). En cualquier caso, la composición farmacéutica puede comprender, además, otros agentes activos, tales como agentes antiinflamatorios, agentes antiapoptóticos, antioxidantes, factores de crecimiento, factores neurotróficos o fármacos neurodegenerativos o neuroprotectores tal como se conocen en la materia.
Los ejemplos de otros componentes que se pueden añadir a las composiciones farmacéuticas de UTC incluyen, pero no se limitan a: (1) otros fármacos neuroprotectores o neurobenéficos; (2) componentes de la matriz extracelular seleccionados, tal como uno o más tipos de colágenos conocidos en la materia y/o factores de crecimiento, plasma rico en plaquetas y fármacos (alternativamente, las UTC se pueden diseñar mediante ingeniería genética para expresar y producir factores de crecimiento); (3) agentes antiapoptóticos (por ejemplo, eritropoietina (EPO), compuesto que mimetiza EPO, trombopoietina, factor de crecimiento insulínico (IGF)-I, IGF-II, factor de crecimiento de hepatocitos, inhibidores de caspasa); (4) compuestos antiinflamatorios (por ejemplo, inhibidores de p38 MAP quinasa, inhibidores de TGF-beta, estatinas, inhibidores de IL-6 y IL-1 , PEMIROLAST, TRANILAST, REMICADE®, SIROLIMUS y fármacos antiinflamatorios no esteroides (NSAIDS, por sus siglas en inglés) (tales como TEPOXALINA, TOLMETINA y SUPROFENO); (5) agentes inmunosupresores o inmunomoduladores, tales como inhibidores de calcineurina, inhibidores de mTOR, antiproliferativos, corticosteroides y varios anticuerpos; (6) antioxidantes tales como probucol, vitaminas C y E, coenzima Q-10, glutatión, L-cisteína y N-acetilcisteína; y (7) anestésicos locales, entre otros.
Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden UTC o componentes o productos de estas, formulados con un portador o medio farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen agua, solución salina (tal como solución de Ringer), alcoholes, aceites, gelatinas y carbohidratos, tales como lactosa, amilosa o almidón, ésteres de ácidos grasos, hidroximetilcelulosa y polivinil pirrolidina. Tales preparaciones se pueden esterilizar y, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares tales como lubricantes, conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsificantes, sales para influir en la presión osmótica, reguladores y colorantes. Los portadores farmacéuticos adecuados para usar en la presente invención son conocidos en la materia y se describen, por ejemplo, en Pharmaceutical Sciences (17. 0 Ed., Mack Pub. Co., Easton, PA) y en el patente núm. WO 96/05309.
Típicamente, pero sin ser exclusivo, las composiciones farmacéuticas que comprenden componentes o productos de UTC, pero no células vivas, se formulan como líquidos (o como tabletas sólidas, cápsulas y similares, cuando el suministro por vía oral es adecuado). Estas pueden formularse para administración por cualquier vía aceptable conocida en la materia para suministrar fármacos y moléculas biológicas al tejido neural objetivo que incluye, pero no se limita a, vía oral, nasal, oftálmica y parenteral, incluso intravenosa. Las vías particulares de administración parenteral incluyen, sin limitarse a, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intracerebral, intraventricular, intracerebroventricular, intratecal, intracisternal, intraespinal y/o vías periespinales de administración por suministro a través de agujas intracraneales o intravertebrales y/o catéteres con o sin dispositivos de bomba.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden células UTC vivas se formulan, típicamente, como líquidos, semisólidos (por ejemplo, geles) o sólidos (por ejemplo, matrices, estructuras y similares, según corresponda para el diseño de tejido neural por ingeniería genética). Las composiciones liquidas se formulan para administración por cualquier vía aceptable conocida en la materia para suministrar células vivas a los tejidos neurales objetivo. Típicamente, estas incluyen inyección o infusión en el SNC o SNP, ya sea en forma difusa o dirigida al sitio de la afección o enfermedad neurológica, por una vía de administración que incluye, sin limitarse a, vías intraocular, intracerebral, intraventricular, intracerebroventricular, intratecal, intracisternal, intraespinal y/o periespinales de administración por el suministro por medio de agujas y/o catéteres intracraneales o intravertebrales con o sin dispositivos de bomba.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden células vivas en un portador semisólido o sólido se formulan, típicamente, para implantación quirúrgica en el sitio de afección o daño neurológico. Se apreciará que las composiciones líquidas pueden administrarse, además, por procedimientos quirúrgicos. En modalidades particulares, las composiciones farmacéuticas semisólidas o sólidas pueden comprender geles semipermeables, redes cristalinas, estructuras celulares y similares, ya sea biodegradables o no biodegradables. Por ejemplo, en ciertas modalidades, puede ser deseable o adecuado secuestrar las células exógenas de sus alrededores, y aun permitir que las células secreten y suministren moléculas biológicas (por ejemplo, factores neurotróficos) a las células neu rales circundantes. En estas modalidades, las células se pueden formular como implantes autónomos que comprenden UTC vivas o poblaciones de células que comprenden UTC rodeadas por una barrera no degradable selectivamente permeable que separa físicamente las células transplantadas del tejido huésped. Tales implantes se mencionan, algunas veces, como "inmunoprotectores" ya que tienen la capacidad de evitar que las células inmunes y macromoléculas exterminen las células trasplantadas en ausencia de inmunosupresión inducida farmacológicamente (una revisión de dichos dispositivos y métodos se encuentra, por ejemplo, en P.A. Tresco y otros, 2000, Adv. Drug Delivery Rev. 42: 3-27).
En una modalidad de la invención, las composiciones farmacéuticas que comprenden células derivadas del tejido del cordón umbilical, las poblaciones sustancialmente homogéneas que comprenden células derivadas del tejido del cordón umbilical o las células derivadas del tejido del cordón umbilical se administran por medio de inyección intravenosa o intratecal. En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas que comprenden células derivadas del tejido del cordón umbilical, las poblaciones sustancialmente homogéneas que comprenden células derivadas del tejido del cordón umbilical o las células derivadas del tejido del cordón umbilical se administran en forma repetida por inyección intravenosa y/o intratecal.
En otras modalidades, se usan distintas variedades de geles y redes degradables para las composiciones farmacéuticas de la invención.
Por ejemplo, los materiales degradables particularmente adecuados para las formulaciones de liberación sostenida incluyen polímeros biocompatibles, tales como poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-co-gl ¡cólico), metilcelulosa, ácido hialurónico, colágeno y similares. La estructura, selección y uso de polímeros degradables en vehículos de suministro de fármacos se ha analizado en varias publicaciones que incluyen A. Domb y otros, 1992, Polymers for Advanced Technologies 3:279.
En otras modalidades, por ejemplo, para reparar lesiones neurales importantes, tales como un corte o daño en la médula espinal o cordón nervioso de una extremidad amputada puede ser deseable o adecuado suministrar las células en una estructura o matriz biodegradable, preferentemente, bioreabsorbible o bioabsorbible. Estos biomateriales, típicamente tridimensionales, contienen las células vivas unidas a la estructura, dispersadas dentro de la estructura o incorporadas en una matriz extracelular atrapada en la estructura. Una vez implantados en la región objetivo del cuerpo, estos implantes se integran con el tejido huésped, en donde las células trasplantadas se establecen gradualmente (ver, por ejemplo, P.A. Tresco y otros, 2000, supra; ver, además, D.W. Hutmacher, 2001 , J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 12: 107-174).
Los ejemplos de material de estructura o matriz (mencionado, algunas veces, colectivamente como "marco"), que pueden usarse en la presente invención, incluyen paños de tela de no tejida, espumas porosas o péptidos de autoensamble. Los paños de tela de no tejida pueden formarse, por ejemplo, con el uso de fibras que comprenden un copolímero absorbible sintético de ácidos glicólico y láctico (PGA/PLA), que se venden con el nombre comercial VICRYL (Ethicon, Inc., Somerville, NJ). Además, se puede usar espumas compuestas, por ejemplo, de copolímero de poli(epsilon-caprolactona)/poli(ácido glicólico) (PCL/PGA), formado por procesos tales como secado por congelamiento o liofilizados tal como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 6,355,699. Además, se puede usar hidrogeles tales como péptidos de autoensamble (por ejemplo, RAD16). Además, las redes degradables que se forman In situ son adecuadas para usar en la invención (ver, por ejemplo, Anseth, K.S. y otros, 2002, J. Controlled Reléase 78: 199-209; Wang, D. y otros, 2003, Biomaterials 24: 3969-3980; la publicación de patente de los Estados Unidos núm. 2002/0022676 de He y otros). Estos materiales se formulan como fluidos adecuados para inyección, se pueden inducir, después, por diversos medios {por ejemplo, cambio en la temperatura, pH, exposición a la luz) para formar redes de hidrogel degradable in situ o in vivo.
En otra modalidad, el marco es fieltro que puede estar compuesto de un hilo multifilamento fabricado a partir de un material bioabsorbible, por ejemplo, copolímeros o mezclas de PGA, PLA, PCL o ácido hialurónico. El hilo se fabrica en un fieltro con el uso de técnicas estándar de procesamiento de telas que consisten en corrugado, corte, cardado y punzonado. En otra modalidad, las células se siembran sobre estructuras de espuma que pueden ser estructuras compuestas.
En muchas de las modalidades mencionadas anteriormente, el marco puede moldearse en una forma útil, tal como la forma de la médula espinal con columnas segregadas para la reparación del tracto nervioso, por ejemplo (Friedman JA y otros, 2002, Neurosurgery 51 : 742-51). Además, se apreciará que las UTC se pueden cultivar en dispositivos implantables o quirúrgicos no degradables preformados, por ejemplo, en una forma que corresponde a la usada para preparar espirales endovasculares de GDC que contienen fibroblastos, por ejemplo (Marx, W.F. y otros, 2001 , Am. J. Neuroradiol. 22: 323-333).
La matriz, estructura o dispositivo se puede tratar antes de la inoculación de células para mejorar la unión celular. Por ejemplo, antes de la inoculación, las matrices de nailon se pueden tratar con ácido acético 0.1 molar e incubarse en polilisina, PBS y/o colágeno para recubrir el nailon. El poliestireno se puede tratar de manera similar con el uso de ácido sulfúrico. Las superficies externas de un marco pueden modificarse, además, para mejorar la unión o el crecimiento de células y diferenciación del tejido, tal como por recubrimiento con plasma del marco o la adición de una o más proteínas {por ejemplo, colágenos, fibras elásticas, fibras reticulares), glicoproteínas, glicosaminoglicanos (por ejemplo, sulfato de heparina, condroitina-4-sulfato, condroitina-6-sulfato, dermatán sulfato, sulfato de queratina), una matriz celular y/u otros materiales tales como, pero sin limitarse a, gelatina, alginatos, agar, agarosa y gomas vegetales, entre otros.
Los marcos que contienen UTC se preparan de conformidad con métodos conocidos en la materia. Por ejemplo, las células se pueden cultivar libremente en un recipiente de cultivo para subconfluencia o confluencia, se pueden extraer del cultivo e inocularse sobre el marco. Los factores de crecimiento se pueden añadir al medio de cultivo antes, durante o después de la inoculación de las células para desencadenar la diferenciación y la formación de tejido, si se desea. Alternativamente, los marcos propiamente dichos se pueden modificar de modo que mejore el crecimiento celular sobre ellos o que se reduzca el riesgo de rechazo del implante. Por lo tanto, uno o más compuestos biológicamente activos que incluyen, sin limitarse a, antiinflamatorios, inmunosupresores o factores de crecimiento se pueden añadir al marco para liberación local.
Métodos para usar UTC, componentes de UTC o productos Las UTC o poblaciones de células que comprenden UTC o componentes de o productos producidos por UTC se pueden usar en diversas formas para soportar y facilitar la reparación y regeneración de células y tejidos neurales. Dichas utilidades abarcan métodos in vitro, ex vivo e in vivo. Por ejemplo, las UTC o poblaciones de células que comprenden UTC o componentes de o productos producidos por UTC se pueden usar para tratar la esclerosis lateral amiotrófica.
Métodos in vitro y ex vivo: En una modalidad, se puede usar UTC in vitro para analizar varios compuestos para determinar la efectividad y citotoxicidad de agentes farmacéuticos, factores de crecimiento, factores reguladores y similares. Por ejemplo, dicho análisis se puede realizar en poblaciones sustancialmente homogéneas de UTC para evaluar la eficacia o toxicidad de compuestos candidatos que se formularán con o coadministrarán con las UTC para el tratamiento de una condición neurodegenerativa. Alternativamente, dicho análisis puede realizarse en UTC estimuladas para diferenciación en una célula neural o célula progenitora neural para evaluar la eficacia de nuevos candidatos de fármacos farmacéuticos. En esta modalidad, las UTC se mantienen ¡n vitro y se exponen al compuesto que se probará. La actividad de un compuesto potencialmente citotóxico puede medirse por su capacidad para dañar o exterminar células en cultivo. Esto puede evaluarse fácilmente por técnicas de tinción vital. El efecto de los factores de crecimiento o reguladores se puede evaluar mediante el análisis de la cantidad o robustez de las células cultivadas, en comparación con células no expuestas a los factores. Para esto se puede usar técnicas citológicas y/o histológicas estándar que incluyen el uso de técnicas inmunocitoquímicas por medio de anticuerpos que definen antígenos celulares de tipo específico.
En otra modalidad, tal como se describió anteriormente, las UTC se pueden cultivar ¡n vitro para producir productos biológicos generados naturalmente por las células o generados por las células cuando se inducen para diferenciarse en linajes neurales o generados por las células a través de ingeniería genética. Por ejemplo, se encontró que TIMP1 , TPO, KGF, HGF, FGF, HBEGF, BDNF, MIP1b, MCP1 , RANTES, I309, TARC, MDC e IL-8 se secretan a partir de células derivadas del ombligo cultivadas en medio de crecimiento. Se encontró que TI P1 , TPO, KGF, HGF, HBEGF, BDNF, MIP1a, MCP-1 , RANTES, TARC, Eotaxina e IL-8 se secretan a partir de células derivadas de la placenta cultivadas en medio de crecimiento (ver los ejemplos). Algunos de estos factores tróficos, tales como BDNF e IL-6 son importantes en la regeneración neural. Otros factores tróficos, aun no detectados o no examinados, de uso en la reparación y regeneración neural, probablemente son producidos por UTC y posiblemente secretados en el medio.
A este respecto, otra modalidad de la invención caracteriza el uso de UTC para la producción de medio acondicionado, ya sea a partir de UTC no diferenciadas o UTC incubadas en condiciones que estimulan la diferenciación en un linaje neural. Se contempla el uso de dichos medios acondicionados en cultivos in vitro o ex vivo de células precursoras neurogénicas o in vivo para soportar células trasplantadas que comprenden poblaciones homogéneas de UTC o poblaciones heterogéneas que comprenden UTC y progenitores neurales, por ejemplo.
Aun otra modalidad comprende el uso de lisados celulares de UTC, fracciones de células solubles o componentes de estas o ECM o componentes de este para diversos propósitos. Como se mencionó anteriormente, algunos de estos componentes se pueden usar en composiciones farmacéuticas. En otras modalidades se usa un lisado celular o ECM para recubrir o, de cualquier otra forma, tratar sustancias o dispositivos que se usarán quirúrgicamente o para implantación o para propósitos ex vivo, para promover la curación o supervivencia de células o tejidos que entran en contacto en el transcurso de dichos tratamientos.
Como se describió en los Ejemplos 13 y 15, las células derivadas de ombligo y placenta han demostrado la capacidad para soportar la supervivencia, el crecimiento y la diferenciación de células progenitoras neurales adultas cuando se cultivan en cocultivo con esas células. En consecuencia, en otra modalidad, las UTC se usan favorablemente en cocultivos in vitro para proporcionar soporte trófico a otras células, particularmente, células neurales o progenitores neurales. Para el cocultivo, preferentemente, las UTC y otras células deseadas se cocultivan en condiciones en las cuales los dos tipos celulares están en contacto. Para ello, por ejemplo, las células pueden sembrarse como una población de células heterogénea en medio de cultivo o sobre un sustrato de cultivo adecuado. Alternativamente, las UTC pueden cultivarse primero para la confluencia y, después, para usarse como un sustrato para el segundo tipo celular deseado en cultivo. En esta última modalidad, además, las células se pueden separar físicamente, por ejemplo, por medio de una membrana o dispositivo similar de modo que se pueda eliminar el otro tipo celular y usarse separadamente después del periodo de cocultivo. El uso de UTC en cocultivo para promover la expansión y diferenciación de tipos celulares neurales puede ser aplicable en la investigación y en áreas clínicas/terapéuticas. Por ejemplo, el cocultivo de UTC se puede usar para facilitar el crecimiento y la diferenciación de células neurales en cultivo, para propósitos de investigación básica o para usar en ensayos de análisis de fármacos, por ejemplo. El cocultivo de UTC puede usarse, además, para la expansión ex vivo de progenitores neurales para la administración posterior para propósitos terapéuticos. Por ejemplo, las células neurales progenitoras se pueden recolectar a partir de un individuo expandido ex vivo en cocultivo con UTC, después, se pueden devolver a ese individuo (transferencia autóloga) u otro individuo (transferencia singénica o alogénica). En estas modalidades, se apreciará que, después de la expansión ex vivo, la población de células mixta que comprende las UTC y los progenitores neurales podría administrarse a un paciente que necesita tratamiento. Alternativamente, en situaciones en las cuales la transferencia autóloga es adecuada o deseable, las poblaciones de células cocultivadas se pueden separar físicamente en cultivo lo que permite extraer los progenitores neurales autólogos para administración al paciente.
Métodos in vivo: Como se expuso en los Ejemplos 16 y 17 se ha demostrado que las UTC se trasplantan eficazmente en el cuerpo y suministran la función neural perdida en un modelo animal aceptado por su capacidad de predicción de eficacia en humanos. Estos resultados soportan una modalidad preferida de la invención, en donde las UTC se usan en la terapia celular para tratar una condición neurodegenerativa tal como esclerosis lateral amiotrófica. Una vez trasplantadas en un lugar neural objetivo en el cuerpo, las UTC propiamente dichas pueden diferenciarse en uno o más fenotipos neurales o pueden proporcionar soporte trófico para progenitores neurales y células neurales in situ o pueden ejercer un efecto benéfico en estas dos formas, entre otras.
Las UTC se pueden administrar solas {por ejemplo, como poblaciones sustancialmente homogéneas) o como mezclas con otras células. Como se describió anteriormente, las UTC se pueden administrar tal como se formulan en una preparación farmacéutica con una matriz o estructura o con portadores farmacéuticamente aceptables convencionales. Cuando las UTC se administran con otras células, pueden administrarse simultáneamente o en secuencia con las otras células (antes o después de las otras células). Las células que pueden administrarse en conjunto con las UTC incluyen, sin limitarse a, neuronas, astrocitos, oligodendrocitos, células neurales progenitoras, células neurales madre y/u otras células madre multipotentes o pluripotentes. Las células de tipos diferentes se pueden mezclar con las UTC inmediatamente o poco tiempo antes de la administración o se pueden cocultivar juntas por un periodo de tiempo anterior a la administración.
Las UTC se pueden administrar con otros fármacos neurobenéficos o moléculas biológicas u otros agentes activos, tales como agentes antiinflamatorios, agentes antiapoptóticos, antioxidantes, factores de crecimiento, factores neurotróficos o fármacos neuroregenerativos o neuroprotectores tal como se conocen en la materia. Cuando las UTC se administran con otros agentes, se pueden administrar juntos en una sola composición farmacéutica o en composiciones farmacéuticas separadas, simultáneamente o en secuencia con los otros agentes (antes o después de la administración de los otros agentes).
Los ejemplos de otros componentes que pueden administrarse con UTC incluyen, sin limitarse a: (1) otros fármacos neuroprotectores o neurobenéficos; (2) componentes de la matriz extracelular seleccionados, tal como uno o más tipos de colágenos conocidos en la materia y/o factores de crecimiento, plasma rico en plaquetas y fármacos (alternativamente, las UTC se pueden diseñar mediante ingeniería genética para expresar y producir factores de crecimiento); (3) agentes antiapoptóticos (por ejemplo, eritropoietina (EPO), compuesto que mimetiza EPO, trombopoietina, factor de crecimiento insulínico (IGF)-I, IGF-II, factor de crecimiento de hepatocitos, inhibidores de caspasa); (4) compuestos antiinflamatorios {por ejemplo, inhibidores de p38 MAP quinasa, inhibidores de TGF-beta, estatinas, inhibidores de IL-6 y IL-1 , PEMIROLAST, TRANILAST, REMICADE®, SIROLIMUS y fármacos antiinflamatorios no esferoides (NSAIDS, por sus siglas en inglés) (tales como TEPOXALINA, TOLMETINA y SUPROFENO); (5) agentes inmunosupresores o inmunomoduladores, tales como inhibidores de calcineurina, inhibidores de mTOR, antiproliferativos, corticosteroides y varios anticuerpos; (6) antioxidantes tales como probucol, vitaminas C y E, coenzima Q-10, glutatión, L-cisteína y N-acetilcisteína; y (7) anestésicos locales, entre otros.
En una modalidad, las UTC se administran como células no diferenciadas, es decir, tal como se cultivan en medio de crecimiento. Alternativamente, las UTC se pueden administrar después de la exposición en cultivo a condiciones que estimulan la diferenciación hacia un fenotipo neural deseado, por ejemplo, astrocito, oligodendrocito o neurona y, más específicamente, neuronas serotoninérgicas, dopaminérgicas, colinérgicas, GABA-érgicas o glutamatérgicas (ver, por ejemplo, Isacson, O., 2003. The Lancet (Neurology) 2: 417-424).
Las células de la invención pueden implantarse quirúrgicamente, inyectarse, suministrarse (por ejemplo, a través de un catéter o jeringa) o administrarse de cualquier otra forma directamente o indirectamente al sitio de daño o afección neurológica (por ejemplo, para el tratamiento de esclerosis lateral amiotrófica). Las vías de administración de las células de la invención o composiciones de estas incluyen, sin limitarse a, vías intravenosa, intramuscular, subcutánea, intranasal, intracerebral, intraventricular, intracerebroventricular, intratecal, intracisternal, intraespinal y/o periespinal de administración por medio del suministro a través de agujas y/o catéteres intracraneales o intravertebrales con o sin dispositivos de bomba.
Cuando las células se administran en dispositivos semisólidos o sólidos, la implantación quirúrgica en un lugar preciso en el cuerpo es, típicamente, un medio de administración adecuado. Sin embargo las composiciones farmacéuticas líquidas o fluidas pueden administrarse en un lugar más general en el SNC o SPN {por ejemplo, en toda un área afectada difusamente, tal como sería el caso en la enfermedad de Parkinson o lesión isquémica difusa, por ejemplo), en tanto que se ha demostrado que las células neurales progenitoras son capaces de migrar ampliamente de un punto de entrada al sistema nervioso a un lugar particular, por ejemplo, al seguir la glia radial o como respuesta a señales químicas.
Ciertamente, esta capacidad migratoria de células neurales madre ha abierto un nuevo camino para el tratamiento de tumores cerebrales malignos, es decir, el uso de células progenitoras para suministrar genes o productos génicos terapéuticos para el tratamiento de estos tumores migratorios. Por ejemplo, se ha reportado que las células madre neurales cuando se implantan en gliomas intracraneales in vivo en roedores adultos, se distribuyen rápidamente y ampliamente a través del lecho del tumor y migran en yuxtaposición con la expansión y avance de células tumorales, y al mismo tiempo expresan establemente un gen foráneo (Aboody, K. y otros, 2000, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97: 12846-12851). Además, se espera que las UTC sean adecuadas para este tipo de uso, es decir, UTC modificadas genéticamente para producir un agente apoptótico u otro agente antineoplásico, por ejemplo, IL-12 (Ehtesham, M. y otros, 2002, Cáncer Research 62: 5657-5663) o el ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (Ehtesham, M. y otros, 2002, Cáncer Research 62: 7170-7174) se puede inyectar o, de cualquier otra forma, administrar a un sitio general de un tumor maligno {por ejemplo, glioblastoma), después de lo cual las UTC pueden migrar a las células tumorales para el suministro local del agente terapéutico.
Otras modalidades abarcan métodos para tratar condiciones neurodegenerativas (tales como, por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica) por la administración de composiciones farmacéuticas que comprenden componentes celulares de UTC (por ejemplo, Usados celulares o componentes de estos) o productos celulares de UTC {por ejemplo, factores tróficos y otros factores biológicos producidos naturalmente por las UTC o a través de modificación genética, medio acondicionado a partir del cultivo de UTC). Nuevamente, estos métodos pueden comprender, además, la administración de otros agentes activos, tales como factores de crecimiento, factores neurotróficos o fármacos neuroregenerativos o neuroprotectores tal como se conocen en la materia.
Las formas y regímenes de dosificación para administrar las UTC o cualquiera de las otras composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción se desarrollan de conformidad con la práctica médica adecuada, en función de la condición del paciente individual, por ejemplo, la naturaleza y el alcance de la condición neurodegenerativa, la edad, el género, el peso corporal y la condición médica general, y otros factores conocidos para los médicos. Por lo tanto, la cantidad eficaz de una composición farmacéutica para administrar a un paciente se determina en base a estas consideraciones tal como se conocen en la materia.
Dado que el SNC es de alguna forma un tejido inmunoprivilegiado puede no ser necesario o deseable inmunosuprimir a un paciente antes del inicio de la terapia celular con UTC. Además, tal como se expone en el Ejemplo 11, se ha demostrado que las UTC no estimulan las PBMC alogénicas en una reacción linfocitaria mixta. En consecuencia, en algunos casos puede tolerarse el trasplante con UTC alogénicas o aun xenogénicas.
Sin embargo, en otros casos puede ser deseable o adecuado inmunosuprimir farmacológicamente a un paciente antes de iniciar la terapia celular. Esto se puede realizar por medio del uso de agentes inmunosupresores locales o sistémicos o por el suministro de las células en un dispositivo encapsulado, tal como se describió anteriormente. Estos y otros medios adecuados para reducir o eliminar una respuesta inmune a las células transplantadas son conocidos en la materia. Como alternativa, las UTC se pueden modificar genéticamente para reducir su inmunogenicidad, tal como se mencionó anteriormente.
La supervivencia de las UTC trasplantadas en un paciente vivo puede determinarse por medio del uso de diversas técnicas de exploración, por ejemplo, exploración por tomografía axial computerizada (CAT o CT, por sus siglas en inglés), imágenes por resonancia magnética (MRI, por sus siglas en inglés) o exploración por tomografía por emisión de positrones (PET, por sus siglas en inglés). La supervivencia del trasplante puede determinarse, además, después de la muerte por la extracción del tejido neural y el análisis del tejido visualmente o a través de un microscopio. Alternativamente, las células se pueden tratar con tinciones específicas para células neurales o productos de estas, por ejemplo, neurotransmisores. Las células trasplantadas pueden identificarse, además, por la incorporación previa de tintes trazadores tales como microesferas marcadas con rodamina o fluoresceína, azul rápido, micropartículas férricas, bisbenzamida o productos de genes reporteros introducidos genéticamente, tales como beta-galactosidasa o beta-glucuronidasa.
La integración funcional de UTC trasplantadas en el tejido neural de un sujeto se puede evaluar por el examen de la restauración de la función neural que exhibe daño o enfermedad. Tales funciones incluyen, sin limitarse a, funciones motoras, cognitivas, sensoriales y endocrinas, de conformidad con procedimientos conocidos para los neurobiólogos y médicos.
Kits y bancos que comprenden UTC, componentes de UTC o productos En otro aspecto, la invención proporciona kits que usan las UTC, poblaciones de UTC, componentes y productos de UTC en varios métodos para la regeneración y reparación neural tal como se describió anteriormente. En una modalidad de la invención, los kits son útiles para el tratamiento de esclerosis lateral amiotrófica. Cuando se usan para el tratamiento de condiciones neurodegenerativas u otro tratamiento programado, los kits pueden incluir una o más poblaciones de células que incluyen al menos UTC y un portador farmacéuticamente aceptable (líquido, semisólido o sólido). Los kits pueden incluir, además, opcionalmente, un medio para administrar las células, por ejemplo, por inyección. Los kits pueden incluir, además, instrucciones de uso de las células. Los kits preparados para uso en hospitales de campo, tal como para uso militar pueden incluir suministros de procedimiento completo que incluyen estructuras de tejido, suturas quirúrgicas y similares, en donde las células se usarán en conjunto con la reparación de lesiones agudas. Los kits para ensayos y los métodos in vitro tal como se describen en la presente descripción pueden contener uno o más de (1) UTC o componentes o productos de UTC, (2) reactivos para la práctica del método in vitro, (3) otras células o poblaciones de células, según corresponda, y (4) instrucciones para realizar el método in vitro.
En otro aspecto, la invención proporciona, además, almacenamiento en bancos de tejidos, células, componentes celulares y poblaciones celulares de la invención. Como se describió anteriormente, las células se criopreservan fácilmente. Por lo tanto, la invención proporciona métodos para criopreservar las células en un banco, en donde las células se almacenan congeladas y se asocian con una caracterización completa de las células en base a las propiedades inmunológicas, bioquímicas y genéticas de las células. Las células congeladas se pueden descongelar y expandir o usar directamente para terapia autóloga, singénica o alogénica, dependiendo de los requerimientos del procedimiento y las necesidades del paciente. Preferentemente, la información en cada muestra criopreservada se almacena en una computadora en la que puede buscarse en base a los requerimientos del cirujano, procedimiento y paciente con coincidencias adecuadas basadas en la caracterización de las células o poblaciones. Preferentemente, las células de la invención se cultivan y expanden hasta la cantidad de células deseada y las composiciones celulares terapéuticas se preparan separadamente o como cocultivos en presencia o ausencia de una matriz o soporte. Si bien para algunas aplicaciones puede usarse, preferentemente, células recién preparadas, el resto se puede criopreservar y almacenar en bancos mediante el congelamiento de las células y el ingreso de la información en la computadora para asociar los datos ingresados en la computadora con las muestras. Aun cuando no sea necesario correlacionar una fuente o donante con un receptor de tales células, para propósitos inmunológicos, el sistema de banco facilita la correlación, por ejemplo, de propiedades bioquímicas o genéticas deseables de las células almacenadas en el banco con las necesidades terapéuticas. Una vez que las propiedades deseadas se correlacionan con una muestra almacenada en el banco, la muestra se recupera y prepara para uso terapéutico. Los lisados celulares, ECM o componentes celulares preparados tal como se describió en la presente descripción, además, se pueden criopreservar o preservar de cualquier otra forma (por ejemplo, por liofilización) y almacenarse en el banco de conformidad con la presente invención.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir la invención en mayor detalle. Están previstos para ilustrar y no para limitar la invención.
Como se usa en los siguientes ejemplos y en otros lugares de la especificación, el término medio de crecimiento se refiere, generalmente, a un medio suficiente para el cultivo de UTC. Particularmente, un medio preferido en la presente para el cultivo de las células de la invención comprende medio esencial modificado por Dulbecco (abreviado, además, en la presente descripción como DMEM). Se prefiere, particularmente, el DMEM con bajo contenido de glucosa (además, DMEM-LG en la presente descripción) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Preferentemente, el DMEM con bajo contenido de glucosa está suplementado con 15 % de suero fetal bovino (v/v) [por ejemplo suero fetal bovino definido, Hyclone, Logan UT), antibióticos/antimicóticos ((preferentemente, 50-100 unidades/mililitro de penicilina, 50- 100 microgramos/mililitro de estreptomicina y 0-0.25 microgramo/mililitro de anfotericina B; Invitrogen, Carisbad, CA)) y 0.001 % (v/v) de 2-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis MO). Como se usa en los ejemplos siguientes, medio de crecimiento se refiere a DMEM con bajo contenido de glucosa con 15 % de suero fetal bovino y antibióticos/antimicóticos (cuando se incluye penicilina/estreptomicina, preferentemente, se usan en una cantidad de 50 U/mililitro y 50 microgramos/mililitro respectivamente; cuando se usa penicilina/estreptomicina/anfotericina B, estas se incluyen, preferentemente, en una cantidad de 100 U/mililitro, 100 microgramos/mililitro y 0.25 microgramos/mililitro, respectivamente). En algunos casos se usan medios de crecimiento diferentes o se proporcionan suplementaciones distintas, y estas se indican normalmente en el texto como suplementos para el medio de crecimiento.
Además, con relación a los siguientes ejemplos y tal como se usa en otras partes de la especificación, el término condiciones de cultivo estándar se refiere al cultivo de células a 37 °C, en una atmósfera estándar que comprende 5 % de CO2. Si bien las condiciones anteriores son útiles para el cultivo, se entiende que la persona con experiencia en la materia puede modificar esas condiciones y estimará las opciones disponibles en la materia para cultivar células.
Las siguientes abreviaturas pueden aparecer en los ejemplos y en otras partes de la especificación y reivindicaciones: ANG2 (o Ang2) para angiopoietina 2; APC para células que presentan antígenos; BDNF para el factor neurotrófico derivado del cerebro; bFGF para el factor de crecimiento de fibroblastos; bid (BID) para "bis in die" (dos veces al día); CK18 para citoqueratina 18; SNC para el sistema nervioso central; CXC ligando 3 para el ligando del receptor de quimocina 3; DMEM para el medio esencial mínimo de Dulbecco; DMEM:lg (o DMEMiLg, DMEM:LG) para el DMEM con bajo contenido de glucosa; EDTA para el ácido etilendiaminatetraacético; EGF (o E) para el factor de crecimiento epidérmico; FACS para la clasificación celular activada por fluorescencia; FBS para el suero fetal bovino; FGF (o F) para el factor de crecimiento de fibroblastos; GCP-2 para la proteína quimiotáctica de granulocitos 2; GFAP para la proteína acídica fibrilar glial; HB-EGF para el factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina; HCAEC para las células endoteliales de la arteria coronaria humana; HGF para el factor de crecimiento de hepatocitos; hMSC para las células madre mesenquimales humanas; HNF-1alfa para el factor de transcripción específico de hepatocitos 1 alfa; HUVEC para las células endoteliales de la vena umbilical humana; 1309 para una quimocina y el ligando para el receptor de CCR8; IGF-1 para el factor de crecimiento insulínico 1 ; IL-6 para la interleucina-6; IL-8 para la interleucina 8; K19 para la queratina 19; K8 para la queratina 8; KGF para el factor de crecimiento de queratinocitos; LIF para el factor inhibidor de leucemia; MBP para la proteína básica de mielina; MCP-1 para la proteína quimiotáctica de monocitos 1 ; MDC para la quimocina derivada de macrófagos; MlPlalfa para la proteína inflamatoria de macrófagos 1 alfa; MlPIbeta para la proteína inflamatoria de macrófagos 1 beta; MMP para la metaloproteasa de matriz (MMP); MSC para las células madre mesenquimales; NHDF para los fibroblastos dérmicos humanos normales; NPE para los medios de expansión de progenitores neurales; 04 para el marcador de diferenciación glial o de oligodendrocitos 04; PBMC para la célula mononuclear de sangre periférica; PBS para la solución salina regulada con fosfato; PDGFbb para el factor de crecimiento derivado de plaquetas; PO para "per os" (por boca); SNP para el sistema nervioso periférico; Rantes (o RANTES) para la célula T normal expresada y secretada regulada en la activación; rhGDF-5 para el factor de diferenciación y crecimiento humano recombinante 5; SC para la vía subcutánea; SDF-1alfa para el factor derivado del estroma 1 alfa; SHH para el hedgehog sónico; SOP para el procedimiento operativo estándar; TARC para el timo y quimocina regulada por la activación; TCP para el plástico de cultivo tisular; TCPS para el poliestireno de cultivo tisular; TGFbeta2 para el factor de crecimiento de transformación beta2; TGF beta-3 para el factor de crecimiento de transformación beta-3; TIMP1 para el inhibidor tisular de la metaloproteinasa 1 de la matriz; TPO para la trombopoietina; TuJ1 para la Bill tubulina; VEGF para el factor de crecimiento endotelial vascular; vWF para el factor de von Willebrand; y alphaFP para la alfa-fetoproteína.
Ejemplo 1 Derivación de células a partir de tejido del ombligo y placenta Este ejemplo describe las células de preparación a partir de tejidos de la placenta y cordón umbilical. Los cordones umbilicales y placentas se obtuvieron en el nacimiento de un bebé nacido a término o antes de término. Las células se recolectaron de 5 donantes individuales de tejido de ombligo y placenta. Se probó distintos métodos de aislamiento de células para determinar su capacidad para producir células con: 1) el potencial para diferenciarse en células con fenotipos diferentes, una característica común para las células madre o 2) el potencial para proporcionar factores tróficos útiles para otras células y tejidos.
Métodos v Materiales Aislamiento de células umbilicales. Se obtuvo cordones umbilicales de National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA). Los tejidos se obtuvieron después de partos normales. El protocolo de aislamiento celular se realizó asépticamente en una campana de flujo laminar. Para eliminar la sangre y residuos, el cordón se lavó en solución salina regulada con fosfato (PBS; Invitrogen, Carisbad, CA) en presencia de antimicótico y antibiótico (100 unidades/mililitro de penicilina, 100 microgramos/mililitro de estreptomicina, 0.25 microgramos/mililitro de anfotericina B). Después, los tejidos se disociaron mecánicamente en placas de cultivo de tejido de 150 cm2 en presencia de 50 mililitros de medio (DMEM con bajo contenido de glucosa o DMEM con alto contenido de glucosa; Invitrogen) hasta que el tejido se redujo a una pulpa fina. Los tejidos pulverizados se transfirieron a tubos cónicos de 50 mililitros (aproximadamente 5 gramos de tejido por tubo). Después, el tejido se procesó por digestión en medio DMEM con bajo contenido de glucosa o medio DMEM con alto contenido de glucosa, cada uno de ellos con antimicótico y antibiótico tal como se describió anteriormente. En algunos experimentos, se usó una mezcla enzimática de colagenasa y dispasa ("C:D;" colagenasa (Sigma, St Louis, MO), 500 unidades/mililitro; y dispasa (Invitrogen), 50 unidades/mililitro en medio DMEM con bajo contenido de glucosa). En otros experimentos se usó una mezcla de colagenasa, dispasa y hialuronidasa ("C:D:H") (colagenasa, 500 unidades/mililitro; dispasa, 50 unidades/mililitro; y hialuronidasa (Sigma), 5 unidades/mililitro en DMEM con bajo contenido de glucosa). Los tubos cónicos que contenían el tejido, el medio y las enzimas de digestión se incubaron a 37 °C en un agitador orbital (Environ, Brooklyn, NY) a 225 rpm por 2 h.
Después de la digestión, los tejidos se centrifugaron a 150 x g por 5 minutos y el sobrenadante se aspiró. El gránulo se resuspendió en 20 mililitros de medio de crecimiento (DMEM con bajo contenido de glucosa (Invitrogen), 15 por ciento (v/v) de suero fetal bovino (FBS; suero bovino definido; lote núm. AND18475; Hyclone, Logan, UT), 0.001 % (v/v) de 2-mercaptoetanol (Sigma), 1 mililitro por 100 mililitros de antibiótico/antimicótico tal como se describió anteriormente. La suspensión de células se filtró a través de un filtro de células de nailon de 70 micrómetros (BD Biosciences). Se pasó otro enjuague de 5 mililitros que comprendía medio de crecimiento a través del filtro. Después, la suspensión de células se pasó a través de un filtro de células de nailon de 40 micrómetros (BD Biosciences) y se probó con un enjuague de otros 5 mililitros de medio de crecimiento.
El filtrado se resuspendió en medio de crecimiento (volumen total de 50 mililitros) y se centrifugó a 150 x g por 5 minutos. El sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron en 50 mililitros de medio de crecimiento fresco. Este proceso se repitió dos veces más.
Cuando se realizó la centrifugación final, el sobrenadante se aspiró y el gránulo celular se resuspendió en 5 mililitros de medio de crecimiento fresco. La cantidad de células viables se determinó con el uso de tinción con azul tripán. Después, las células se cultivaron en condiciones estándar.
Las células aisladas de los cordones umbilicales se sembraron en una cantidad de 5000 células/cm2 sobre matraces T de 75 cm2 recubiertos con gelatina (Corning Inc., Corning, NY) en medio de crecimiento con antibióticos/antimicóticos tal como se describió anteriormente. Después de 2 días (en varios experimentos las células se incubaron entre 2 y 4 días), el medio usado se aspiró de los matraces. Las células se lavaron con PBS tres veces para eliminar los residuos y las células derivadas de la sangre. Después, se repuso el medio de crecimiento de las células y se esperó a que crecieran hasta la confluencia (aproximadamente 10 días desde el pase 0) con el pase 1. En los pases posteriores (del pase 1 al 2 y así sucesivamente), las células alcanzaron la subconfluencia (75-85 por ciento de confluencia) en 4-5 días. Para estos pases posteriores, las células se sembraron en una cantidad de 5000 células/cm2. Las células se cultivaron en un incubador humidificado con 5 por ciento de dióxido de carbono y oxígeno atmosférico a 37 °C.
Aislamiento de células placenterías. Se obtuvo tejido placentario de NDRI (Philadelphia, PA). Los tejidos procedían de una etapa de embarazo y se obtuvieron en el momento de un parto quirúrgico normal. Las células placentarias se aislaron tal como se describió para el aislamiento de células umbilicales.
El siguiente ejemplo se aplica al aislamiento de poblaciones separadas de células de tejido placentario de la madre y del recién nacido.
El protocolo de aislamiento celular se realizó asépticamente en una campana de flujo laminar. El tejido placentario se lavó en solución salina regulada con fosfato (PBS; Invitrogen, Carisbad, CA) en presencia de antimicótico y antibiótico (tal como se describió anteriormente) para eliminar la sangre y los residuos. Después, el tejido placentario se cortó y separó en tres secciones, línea superior (lado o aspecto neonatal), línea media (aislamiento de células mixtas neonatales y maternales) y línea inferior (lado o aspecto maternal).
Las secciones separadas se lavaron individualmente varias veces en PBS con antibiótico/antimicótico para eliminar aun más la sangre y residuos. Después, cada sección se disoció mecánicamente en placas de cultivo de tejido de 150 cm2 en presencia de 50 mililitros de DMEM/bajo contenido de glucosa, hasta obtener una pulpa fina. La pulpa se transfirió a tubos cónicos de 50 mililitros. Cada tubo contenía aproximadamente 5 gramos de tejido. El tejido se procesó por digestión en medio DMEM con bajo contenido de glucosa o DMEM con alto contenido de glucosa que contenía antimicótico y antibiótico (100 U/mililitro de penicilina, 100 microgramos/mililitro de estreptomicina, 0.25 microgramos/mililitro de anfotericina B) y enzimas de digestión. En algunos experimentos se usó una mezcla enzimática de colagenasa y dispasa ("C:D") que contenía colagenasa (Sigma, St Louis, MO) en una cantidad de 500 unidades/mililitro y dispasa (Invitrogen) en una cantidad de 50 unidades/mililitro en medio DMEM con bajo contenido de glucosa. En otros experimentos se usó una mezcla de colagenasa, dispasa y hialuronidasa (C:D:H) (colagenasa, 500 unidades/mililitro; dispasa, 50 unidades/mililitro; y hialuronidasa (Sigma), 5 unidades/mililitro en DMEM con bajo contenido de glucosa). Los tubos cónicos que contenían el tejido, el medio y las enzimas de digestión se incubaron por 2 h a 37 °C en un agitador orbital (Environ, Brooklyn, NY) a 225 rpm.
Después de la digestión, los tejidos se centrifugaron a 150 x g por 5 minutos y el sobrenadante se eliminó por aspiración. El gránulo se resuspendió en 20 mililitros de medio de crecimiento con penicilina/estreptomicina/anfotericina B. La suspensión de células se filtró a través de un filtro celular de nailon de 70 micrometros (BD Biosciences) y se realizó un enjuague con otros 5 mililitros de medio de crecimiento. La suspensión total de células se pasó a través de un filtro celular de nailon de 40 micrometros (BD Biosciences) seguido de un medio de crecimiento adicional de 5 mililitros como enjuague.
El filtrado se resuspendió en medio de crecimiento (volumen total de 50 mililitros) y se centrifugó a 150 x g por 5 minutos. El sobrenadante se aspiró y el gránulo celular se resuspendió en 50 mililitros de medio de crecimiento fresco. Este proceso se repitió dos veces más. Después de la centrifugación final, el sobrenadante se aspiró y el gránulo celular se resuspendió en 5 mililitros de medio de crecimiento fresco. Se determinó un recuento celular con el uso de la prueba de exclusión con azul tripán. Después, las células se cultivaron en condiciones estándar.
Aislamiento de células con LIBERASE™. Las células se aislaron de tejidos del ombligo en medio DMEM con bajo contenido de glucosa con LIBERASE™ (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN) (2.5 miligramos por mililitro, Blendzyme 3; Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN) y hialuronidasa (5 unidades/mililitro, Sigma). La digestión del tejido y el aislamiento de las células se realizaron tal como se describió para otras digestiones de proteasa anteriores, con el uso de la mezcla de LIBERASE™/hialuronidasa en lugar de la mezcla enzimática C:D o C:D:H. La digestión del tejido con LIBERASE™ produjo el aislamiento de las poblaciones de células a partir del ombligo y tejidos placentarios que se expandieron fácilmente.
Aislamiento de células con el uso de otras combinaciones enzimáticas. Se comparó los procedimientos para aislar células del cordón umbilical con el uso de combinaciones enzimáticas diferentes. Las enzimas comparadas para la digestión incluyen: i) colagenasa; ii) dispasa; iii) hialuronidasa; iv) mezcla colagenasa:dispasa (C;D); v) mezcla colagenasa:hialuronidasa (C:H); vi) mezcla dispasa:hialuronidasa (D:H); y vii) mezcla colagenasa:dispasa:hialuronidasa (C:D:H). Se observaron las diferencias en el aislamiento celular con el uso de estas condiciones de digestión enzimática diferentes (Tabla 1-1).
Tabla 1-1. Aislamiento de células a partir del tejido del cordón umbilical con el uso de diversas combinaciones enzimáticas Clave: + = buena, ++ = muy buena, +++ = excelente, X = no exitoso en las condiciones probadas Aislamiento de células a partir de sangre residual en los cordones. Se realizaron otros intentos para aislar conjuntos de células a partir del cordón umbilical por medio de distintos métodos. En un caso, se cortó el cordón umbilical y se lavó con medio de crecimiento para separar los coágulos de sangre y el material gelatinoso. La mezcla de sangre, material gelatinoso y medio de crecimiento se recolectó y centrifugó a 150 x g. El gránulo se resuspendió y sembró sobre matraces recubiertos con gelatina en medio de crecimiento. A partir de estos experimentos se aisló una población de células que se expandió inmediatamente.
Aislamiento de células de sangre del cordón. Además, las células se aislaron de muestras de sangre del cordón obtenidas de NDRI. El protocolo de aislamiento que se usó aquí era el de la solicitud de patente internacional PCT/US2002/029971 de Ho y otros (Ho, T. W. y otros, patente núm. WO2003025149 A2). Las muestras (50 mililitros y 10.5 mililitros, respectivamente) de sangre del cordón umbilical (NDRI, Philadelphia PA) se mezclaron con regulador de lisis (cloruro de amonio 155 mM esterilizado con filtro, bicarbonato de potasio lO milimoles, EDTA 0.1 milimoles regulado hasta pH 7.2 (todos los componentes de Sigma, St. Louis, MO)). Las células se lisaron en una relación de 1:20 entre la sangre del cordón y el regulador de lisis. La suspensión de células resultante se agitó en vórtice por 5 segundos y se incubó por 2 minutos a temperatura ambiente. El Usado se centrifugó (10 minutos a 200 x g). El gránulo celular se resuspendió en medio esencial mínimo completo (Gibco, Carlsbad CA) que contenia 10 por ciento de suero fetal bovino (Hyclone, Logan UT), glutamina 4 milimoles (Mediatech Herndon, VA), 100 unidades de penicilina por 100 mililitros y 100 microgramos de estreptomicina por 100 mililitros (Gibco, Carlsbad, CA). Las células resuspendidas se centrifugaron (10 minutos a 200 x g), el sobrenadante se aspiró y el gránulo celular se lavó en medio completo. Las células se sembraron directamente en matraces T75 (Corning, NY), matraces T75 recubiertos con laminina o matraces T175 recubiertos con fibronectina (ambos de Becton Dickinson, Bedford, MA).
Aislamiento de células con el uso de distintas combinaciones enzimáticas y condiciones de cultivo. Para determinar si las poblaciones de células podrían aislarse en condiciones diferentes y expandirse en diversas condiciones inmediatamente después del aislamiento, las células se procesaron por digestión en medio de crecimiento con o sin 0.001 por ciento (v/v) de 2-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO), con el uso de la combinación enzimática C:D:H, de conformidad con los procedimientos proporcionados anteriormente. Las células derivadas de placenta aisladas de esta forma se sembraron en diversas condiciones. Todas las células se cultivaron en presencia de penicilina/estreptomicina. (Tabla 1-2).
Tabla 1-2. Aislamiento y expansión de células en cultivo en diversas Aislamiento de células con el uso de distintas combinaciones enzimáticas y condiciones de cultivo. En todas las condiciones las células se unieron y expandieron adecuadamente entre el pase 0 y el pase 1 (Tabla 1-2). Se demostró que las células en las condiciones 5-8 y 13-16 se proliferan adecuadamente hasta 4 pases después del sembrado momento en el cual se criopreservan y almacenan en bancos.
Resultados Aislamiento de células con el uso de combinaciones enzimáticas diferentes. La combinación de C:D:H proporcionó la mayor producción de células después del aislamiento y generó células que se expandieron por muchas más generaciones en cultivo que las otras condiciones (Tabla 1). Cuando se usó solamente colagenasa o hialuronidasa no se obtuvo una población de células expandibles. No se intentó determinar si este resultado es específico para el colágeno probado.
Aislamiento de células con el uso de distintas combinaciones enzimáticas y condiciones de cultivo. Las células se unieron y expandieron adecuadamente entre los pases 0 y 1 en todas las condiciones probadas para la digestión y crecimiento de enzimas (Tabla 2). Las células en las condiciones experimentales 5-8 y 13-16 proliferaron adecuadamente hasta 4 pases después del sembrado, momento en el cual se criopreservaron. Todas las células se almacenaron en bancos para la investigación posterior.
Aislamiento de células a partir de sangre residual en los cordones. Las células nucleadas se unieron y crecieron rápidamente. Estas células se analizaron por citometría de flujo y eran similares a las células obtenidas por digestión de enzimas.
Aislamiento de células de sangre del cordón. Las preparaciones contenían glóbulos rojos y plaquetas. Durante las primeras 3 semanas las células nucleadas no se unieron ni dividieron. El medio se cambió 3 semanas después del sembrado y no se observó unión ni crecimiento de células.
Resumen. Las poblaciones de células se pueden derivar de tejido del cordón umbilical y placentario eficazmente con el uso de la combinación enzimática de colagenasa (una metaloproteasa de matriz), dispasa (una proteasa neutra) y hialuronidasa (una enzima mucolítica que descompone el ácido hialurónico). Además, se puede usar LIBERASE™, que es una Blendzyme. Específicamente, se usó, además, Blendzyme 3, que es colagenasa (4 unidades Wunsch/g) y termolisina (1714 unidades de caseína/g) junto con hialuronidasa para aislar células. Estas células se expandieron inmediatamente en muchos pases cuando se cultivaron en medio de crecimiento sobre plástico recubierto con gelatina.
Las células se aislaron, además, de sangre residual en los cordones, pero no de sangre del cordón. La presencia de células en coágulos de sangre lavados del tejido, que se adhieren y crecen en las condiciones usadas, puede ser el resultado de la liberación de células durante el proceso de corte y separación.
Ejemplo 2 Características de crecimiento de células derivadas del ombligo y la placenta El potencial de expansión celular de las células derivadas de la placenta y tejido del cordón umbilical se comparó con otras poblaciones de células madre aisladas. El proceso de expansión celular hasta la senescencia se menciona como el límite de Hayflick (Hayflick L. (1974) J Am Geríatr Soc. 22:1-12; Hayflick L. (1974) Geontologist. 14:37-45). Las células del tejido del cordón umbilical son muy adecuadas para uso terapéutico ya que se pueden expandir inmediatamente hasta un número de células suficiente.
Materiales y métodos Matraces con recubrimiento de gelatina. Los matraces plásticos para cultivo de tejidos se recubrieron por medio de la adición de 20 mililitros de gelatina porcina al 2 % (p/v) (Tipo B: 225 Bloom; Sigma, St Louis, MO) en un matraz T75 (Corning, Corning, NY) por 20 minutos a temperatura ambiente. Después de extraer la solución de gelatina se añadió 10 mililitros de salina regulada con fosfato (PBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA) y, después, se aspiró.
Comparación del potencial de expansión de las UTC con otras poblaciones celulares. Para comparar el potencial de expansión de crecimiento se usaron las siguientes poblaciones de células; i) células madre mesenquimales (MSC; Cambrex, Walkersville, MD); ¡i) Células adiposas (patente de los Estados Unidos núm. 6,555,374 B1 ; solicitud de publicación de patente de los Estados Unidos núm. 2004/0058412); iii) fibroblastos de piel dérmica normal (cc-2509 lote núm. 9F0844; Cambrex, Walkersville, MD); iv) células derivadas del ombligo; y v) células derivadas de la placenta (solicitud de publicación de patente de los Estados Unidos núm. 2004/0048372). Las células se sembraron inicialmente en una cantidad de 5000 células/cm2 en matraces T75 recubiertos con gelatina en medio de crecimiento con penicilina/estreptomicina/anfotericina B. Para los pases posteriores, los cultivos celulares se trataron de la siguiente manera. Después de la tripsinización, las células viables se contaron después de la tinción con azul tripán. La suspensión de células (50 microlitros) se combinó con azul tripán (50 mililitros, Sigma, St. Louis MO). Las cantidades de células viables se calcularon con el uso de un hemicitómetro.
Después del recuento, las células se sembraron en una cantidad de 5000 células/cm2 sobre matraces T 75 recubiertos con gelatina en 25 mililitros de medio de crecimiento fresco. Las células se cultivaron en condiciones estándar a 37 °C. El medio de crecimiento se cambió dos veces por semana. El pase se realizó una vez que las células alcanzaron una confluencia de aproximadamente 85 por ciento; este proceso se repitió hasta que las células alcanzaron la senescencia.
Las células se tripsinizaron y contaron en cada pase. Se calculó la producción de células viables, la duplicación de poblaciones [en (células finales/células iniciales)/en 2] y el tiempo de duplicación (tiempo en cultivo (h)/duplicación de población). Para determinar la expansión celular óptima, se calculó la producción celular total por pase por medio de la multiplicación de la producción total para el pase previo por el factor de expansión para cada pase (es decir, factor de expansión = células finales/células iniciales).
Potencial de expansión de bancos de células a densidad baja. Además, se probó el potencial de expansión de células almacenadas en bancos en el pase 10 con el uso de un conjunto de condiciones diferentes. Se probaron fibroblastos dérmicos normales (cc-2509 lote núm. 9F0844; Cambrex, Walkersville, MD), células derivadas del ombligo y células derivadas de la placenta. Estas poblaciones de células se almacenaron previamente en bancos en el pase 10, se cultivaron en una cantidad de 5000 células/cm2 y se cultivaron hasta la confluencia en cada pase hasta ese punto. Se determinó el efecto de la densidad celular en las poblaciones de células después del descongelamiento de células en el pase 10. Las células se descongelaron en condiciones estándar y se contaron con el uso de azul tripán. Después, las células descongeladas se sembraron en una cantidad de 1000 células/cm2 en medio de crecimiento DMEM:bajo contenido de glucosa con antibiótico/antimicótico tal como se describió anteriormente. Las células se cultivaron en condiciones atmosféricas estándar a 37 °C. El medio de crecimiento se cambió dos veces a la semana y se realizaron el pase de las células cuando alcanzaron una confluencia de aproximadamente 85 %. Después, se realizaron pases de las células hasta la senescencia, es decir, hasta que no se pudieron expandir más. Las células se tripsinizaron y contaron en cada pase. Se calculó la producción de células, la duplicación de poblaciones (en (células finales/células iniciales)/en 2) y el tiempo de duplicación (tiempo en cultivo (h)/duplicación de población). Se determinó la producción total de células por pase por la multiplicación de la producción total para el pase previo por el factor de expansión para cada pase (es decir, factor de expansión = células finales/células iniciales).
Expansión de UTC a baja densidad a partir del sembrado de células iniciales. Se probó el potencial de expansión de UTC aisladas recientemente en condiciones de sembrado con pocas células. Las UTC se prepararon tal como se describió anteriormente. Las células se sembraron en una cantidad de 1000 células/cm2 y se realizaron los pases tal como se describió anteriormente hasta la senescencia. Las células se cultivaron en condiciones atmosféricas estándar a 37 °C. El medio de crecimiento se cambió dos veces por semana. Se realizaron los pases de células cuando alcanzaron una confluencia de aproximadamente 85 %. En cada pase, las células se tripsinizaron y contaron por medio de tinción con azul tripán. Se calculó la producción de células, la duplicación de poblaciones (en (células finales/células iniciales)/en 2) y el tiempo de duplicación (tiempo en cultivo (h)/duplicación de población) para cada pase. Se determinó la producción total de células por pase por la multiplicación de la producción total para el pase previo por el factor de expansión para cada pase (es decir, factor de expansión = células finales/células iniciales). Las células se cultivaron en matraces no recubiertos y recubiertos con gelatina.
Expansión de células derivadas de la placenta del neonato clónales. Se usó clonación para expandir una población de células de recién nacido a partir de tejido placentario. Después del aislamiento de tres poblaciones de células diferenciales a partir de la placenta (tal como se describe en la presente descripción), estas poblaciones de células se expandieron en condiciones de cultivo estándar y, después, se cariotiparon para revelar la identidad de las poblaciones de células aisladas. Dado que las células se aislaron de una madre que dio a luz un varón, se puedo distinguir fácilmente entre los cromosomas masculinos y femeninos para realizar las dispersiones de metafases. Estos experimentos demostraron que en las células de aspecto fetal tenían un cariotipo positivo para el fenotipo neonatal, las células de la capa media tenían un cariotipo positivo para los fenotipos neonatales y maternales y las células de aspecto maternal tenían un cariotipo positivo para las células maternales.
Expansión de células en condiciones de cultivo con poco oxígeno. Se ha demostrado que las condiciones de cultivo de células con poco oxígeno pueden mejorar la expansión celular en ciertas circunstancias (solicitud de publicación de patente de los Estados Unidos núm. 2004/0005704). Para determinar si podría mejorarse la expansión celular de UTC por medio de la alteración de las condiciones de cultivo celular, los cultivos de células derivadas del ombligo se cultivaron en poco oxígeno. Las células se sembraron en una cantidad de 5000 células/cm2 en medio de crecimiento sobre matraces recubiertos con gelatina. Las células se cultivaron inicialmente en condiciones atmosféricas estándar hasta el pase 5, momento en el cual se transfirieron a condiciones de cultivo con poco oxígeno (5 % de O2).
Otras condiciones de cultivo. En otros protocolos las células se expandieron en placas no recubiertas, recubiertas con colágeno, recubiertas con fibronectina, recubiertas con laminina y recubiertas con proteínas de matriz extracelular. Se ha demostrado que los cultivos se expanden adecuadamente en estas matrices diferentes.
Resultados Comparación del potencial de expansión de UTC con otras poblaciones de células madre y células no madre. Las células derivadas del ombligo y de la placenta se expandieron para más de 40 pases de modo que se generó una producción de células > 1E17 de células en 60 días. En contraposición, las MSC y fibroblastos senescieron después de < 25 días y <60 días, respectivamente. Si bien las células adiposas se expandieron por casi 60 días, estas generaron producciones de células totales de 4.5E12. Por lo tanto, cuando se sembraron en una cantidad de 5000 células/cm2 en las condiciones experimentales usadas, las células derivadas después del parto se expandieron mucho mejor que los otros tipos celulares cultivados en las mismas condiciones (Tabla 2-1).
Tabla 2-1. Características de crecimiento para distintas poblaciones de células cultivadas hasta la senescencia Potencial de expansión de bancos de células a densidad baja.
Las células derivadas del ombligo, de la placenta y fibroblastos se expandieron para más de 10 pases de modo que se generó una producción de células de > 1E11 células en 60 días (Tabla 2-2). Después de 60 días en estas condiciones, los fibroblastos se volvieron senescentes mientras que las poblaciones de células derivadas del ombligo y la placenta senescieron después de 80 días, de modo que se completaron >50 y > 40 duplicaciones de poblaciones, respectivamente.
Tabla 2- 2. Características de crecimiento para distintas poblaciones de células con el uso de expansión de crecimiento de baja densidad desde el pase 10 hasta la senescencia Expansión de UTC a baja densidad a partir del sembrado inicial de células. Las UTC se expandieron a baja densidad (1000 células/cm2) en placas o matraces no recubiertos o recubiertos con gelatina. El potencial de crecimiento de estas células en estas condiciones fue adecuado. Las células se expandieron inmediatamente en un crecimiento de fase logarítmica. La velocidad de expansión celular fue similar a la observada cuando las células derivadas de la placenta se sembraron en una cantidad de 5000 células/cm2 en matraces recubiertos con gelatina en medio de crecimiento. No se observaron diferencias en el potencial de expansión celular entre los cultivos realizados en matraces no recubiertos y en matraces recubiertos con gelatina. Sin embargo, las células parecían fenotípicamente mucho más pequeñas en los matraces recubiertos con gelatina y se observó fenotipos celulares más grandes en los matraces no recubiertos.
Expansión de células derivadas de la placenta maternal o neonatal clonal. Una población de células maternales o neonatales clónales se puede expandir a partir de células derivadas de placenta aisladas del aspecto neonatal o el aspecto material, respectivamente, de la placenta. Las células se diluyen en serie y, después, se siembran sobre placas recubiertas con gelatina en medio de crecimiento para expansión a 1 célula/pocilio en placas de 96 pocilios recubiertos con gelatina. A partir de esta clonación inicial se identificaron clones expansivos, se tripsinizaron y se volvieron a sembrar en placas de 12 pocilios recubiertos con gelatina en medio de crecimiento y, después, se realizaron los pases a matraces T25 recubiertos con gelatina en una cantidad de 5000 células/cm2 en medio de crecimiento. La subclonacion se realiza para garantizar que se ha identificado una población de células clonal. Para los experimentos de subclonacion, las células se tripsinizan y se siembran otra vez en una cantidad de 0.5 células/pocilio. Los subclones que crecieron adecuadamente se expanden en matraces T25 recubiertos con gelatina en una cantidad de 5000 células cm2 /matraz. Se realizaron los pases de células en una cantidad de 5000 células cm2 /matraz T75. Las características de crecimiento de un clon se pueden graficar para demostrar la expansión celular. El análisis por cariotipado puede confirmar que el clon es neonatal o maternal.
Expansión de células en condiciones de cultivo con poco oxígeno. Las células se expandieron adecuadamente en condiciones de oxígeno reducido, sin embargo, el cultivo en condiciones de oxígeno reducido no pareció tener un efecto significativo en la expansión celular de UTC en las condiciones usadas.
Resumen. Las condiciones de expansión celular que comprenden el cultivo de células derivadas del tejido del cordón umbilical aisladas a densidades de aproximadamente 5000 células/cm2 en medio de cultivo en matraces no recubiertos o recubiertos con gelatina, en oxígeno atmosférico estándar, son suficientes para generar cantidades grandes de células en el pase 11. Además, los datos sugieren que las células se pueden expandir inmediatamente con el uso de condiciones de cultivo de menor densidad (por ejemplo, 1000 células/cm2). La expansión de células derivadas del tejido del cordón umbilical en condiciones de oxígeno reducido facilita, además, la expansión celular, si bien no se ha observado aun una mejora incremental en el potencial de expansión celular cuando se usan estas condiciones para el crecimiento. Actualmente, se prefiere cultivar las células derivadas del tejido del cordón umbilical en condiciones atmosféricas estándar para generar conjuntos grandes de células. Sin embargo, cuando se alteran las condiciones de cultivo se puede alterar, además, la expansión de células derivadas del tejido del cordón umbilical. Esta estrategia puede usarse para mejorar la capacidad de proliferación y diferenciación de estas poblaciones de células.
En las condiciones usadas, mientras que el potencial de expansión de MSC y células adiposas es limitado, las células derivadas del tejido del cordón umbilical se expanden inmediatamente hasta cantidades grandes.
Ejemplo 3 Evaluación del medio de crecimiento para células derivadas de la placenta Se evaluaron varios medios de cultivo celular para determinar su capacidad para soportar el crecimiento de células derivadas de la placenta. El crecimiento de células derivadas de la placenta en oxígeno normal (20 %) y bajo (5 %) se evaluó después de 3 días con el uso del ensayo colorimétrico de MTS.
Métodos y Materiales Las células derivadas de la placenta en el pase 8 (P8) se sembraron en una cantidad de 1 x 103 células/pocilio en placas de 96 pocilios en medio de crecimiento con penicilina/estreptomicina. Después de 8 horas se cambió el medio tal como se describe más abajo y las células se incubaron en oxígeno normal (atmosférico) o bajo (5 %, v/v) a 37 °C, 5 % de C02 por 48 horas. El MTS se añadió al medio de cultivo (ensayo de proliferación de células Cell Titer 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Madison, Wl) por 3 horas y se midió la absorbancia a 490 nanómetros (Molecular Devices, Sunnyvale CA).
Tabla 3-1. Medios de cultivo Resultados Las curvas estándar para el ensayo de MTS establecieron una correlación lineal entre un aumento en la absorbencia y un aumento en la cantidad de células. Los valores de absorbancia obtenidos se convirtieron en números de células calculados y se calculó el cambio (%) con respecto al sembrado inicial.
Efecto del suero. La adición de suero en los medios en condiciones normales de oxígeno produjo un aumento dependiente de la dosis reproducible en absorbancia y, por lo tanto, la cantidad de células viables. La adición de suero en MSCGM completo produjo una reducción de la absorbancia dependiente de la dosis. En el medio en el cual no se añadió suero, las células crecieron solamente en forma apreciable en Cellgro FREE™, F10 de Ham y DMEM.
Efecto del oxígeno. Una cantidad baja de oxígeno aparentemente aumentó la velocidad de crecimiento de las células en medio de crecimiento, F10 de Ham y MSCGM. Cuando se redujo el orden de crecimiento, los medios con los que se obtuvo un crecimiento óptimo de las células fueron el medio de crecimiento >MSCGM> Iscove's + 10 % de FBS = DMEM-H + 10 % FBS = F12 de Ham + 10 % de FBS = RPMI 1640 + 10 % de FBS.
Resumen. Las células derivadas de la placenta se pueden cultivar en diversos medios de cultivos en oxígeno normal o bajo. El crecimiento a corto plazo de las células derivadas de la placenta se determinó en doce medios básales con 0, 2 y 10 % (v/v) de suero en 5 % u oxígeno atmosférico. Generalmente, las células derivadas de la placenta no crecieron tan bien en condiciones sin suero, excepto F10 de Ham y Cellgro FREE™ que, además, no contenían proteínas. El crecimiento en estos medios libres de suero fue de aproximadamente 25-33 % del crecimiento máximo observado con los medios que contenían 15 % de suero.
Ejemplo 4 Crecimiento de tejido del cordón umbilical y células derivadas de la placenta en medio que contiene D-valina Se ha reportado que el medio que contiene D-valina en lugar de la isoforma de L-valina normal se puede usar para inhibir selectivamente el crecimiento de células de tipo fibroblasto en cultivo (Hongpaisan J. 2000. Cell Biol Int. 24:1-7; Sordillo y otros 1988. Cell Biol Int Rep. 12:355-64). Anteriormente, se desconocía si las células del tejido del cordón umbilical y células derivadas de la placenta podrían crecer en medio que contiene D-valina.
Métodos y Materiales Las células derivadas de la placenta (P3), fibroblastos (P9) y células derivadas del ombligo (P5) se sembraron en una cantidad de 5 x 103 células/cm2 en matraces T75 recubiertos con gelatina (Corning, Corning, NY). Después de 24 horas el medio se eliminó y las células se lavaron con solución salina regulada con fosfato (PBS) (Gibco, Carlsbad, CA) para eliminar el medio residual. El medio se reemplazó con un medio de cultivo modificado (DMEM con D-valina (orden especial de Gibco), 15 % (v/v) de suero fetal bovino dializado (Hyclone, Logan, UT), 0.001 % (v/v) de betamercaptoetanol (Sigma), penicilina/estreptomicina (Gibco)).
Resultados Las células derivadas de la placenta, derivadas del ombligo y fibroblastos sembrados en el medio que contenía D-valina no proliferaron, a diferencia de las células sembradas en medio de crecimiento que contenía suero dializado. Las células fibroblastos cambiaron morfológicamente de modo que aumentaron en tamaño y cambiaron su forma. Todas las células murieron y, eventualmente, se separaron de la superficie del matraz después de 4 semanas. Estos resultados indican que el medio que contiene D-valina no es adecuado para el crecimiento selectivo de células derivadas después del parto.
Ejemplo 5 Medios de criopreservación para células derivadas de la placenta Se evaluaron los medios de criopreservación para la criopreservación de células derivadas de la placenta.
Métodos y Materiales Las células derivadas de la placenta cultivadas en medio de crecimiento en un matraz T75 recubierto con gelatina se lavaron con PBS y se tripsinizaron con el uso de 1 mililitro de tripsina/EDTA (Gibco). La tripsinización se detuvo por medio de la adición de 10 mililitros de medio de crecimiento. Las células se centrifugaron a 150 x g, el sobrenadante se eliminó y el gránulo celular se resuspendió en 1 mililitro de medio de crecimiento. Se extrajo una alícuota de suspensión de células, 60 microlitros, y se añadió en 60 microlitros de azul tripán (Sigma). La cantidad de células viables se calculó con el uso de un hemocitómetro. La suspensión de células se dividió en cuatro alícuotas ¡guales, cada una contenía 88 x 104 células. La suspensión de células se centrifugó y resuspendió en 1 mililitro de cada uno de los medios mencionados más abajo y se transfirió a crioviales (Nalgene). 1.) Medio de crecimiento +10 % (v/v) de DMSO (Hybrimax, Sigma, St. Louis, MO) 2.) Medio de congelamiento de células con DMSO, con metilcelulosa, libre de suero (C6295, Sigma, St. Louis, MO) 3.) Medio de congelamiento de células libre de suero (C2639, Sigma, St. Louis, MO) 4.) Medio de congelamiento de células con glicerol (C6039, Sigma, St. Louis, MO) Las células se enfriaron a aproximadamente -1 °C/min de la noche a la mañana en un congelador a -80 °C con el uso de un recipiente de congelamiento "Mr Frosty" de conformidad con las instrucciones del fabricante (Nalgene, Rochester, NY). Los matraces de células se transfirieron a nitrógeno líquido por 2 días antes del descongelamiento rápido en un baño maría a 37 °C. Las células se añadieron en 10 mililitros de medio de crecimiento y se centrifugaron antes de calcular la cantidad y viabilidad de las células. Las células se sembraron sobre matraces recubiertos con gelatina en una cantidad de 5000 células/cm2 para determinar si las células se unirían y proliferarían.
Resultados La viabilidad inicial de las células que se iban a criopreservar se evaluó por tinción con azul tripán en 100 %. La viabilidad inicial de las células que se iban a criopreservar se evaluó por tinción con azul tripán en 100 %.
Se produjo una reducción proporcional en la cantidad de células con viabilidad para C6295 debido a la lisis de las células. Las células viables criopreservadas en las cuatro soluciones se unieron, dividieron y produjeron una monocapa confluente dentro de los 3 días. No se produjo una diferencia distinguible en la velocidad de crecimiento calculada.
Resumen. La criopreservación de células es un procedimiento disponible para la preparación de un banco de células o un producto de células. Se compararon cuatro mezclas de criopreservación para determinar su capacidad para proteger las células humanas derivadas de la placenta a partir del daño por congelamiento. El medio preferido entre los medios comparados para la criopreservación de células derivadas de la placenta es el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y 10 % (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO).
Ejemplo 6 Análisis de cariotipo de células derivadas del tejido del cordón umbilical v derivadas de la placenta Las líneas celulares usadas en la terapia celular son, preferentemente, homogéneas y están libres de cualquier tipo celular contaminante. Las células usadas en la terapia celular deberían tener una estructura y cantidad de cromosomas normales (46). Para identificar líneas de células derivadas de placenta y ombligo homogéneas y libres de células originadas a partir en tejidos obtenidos antes del parto, se analizaron los cariotipos de muestras de células.
Materiales y métodos Las UTC de tejido obtenido después del parto de un varón recién nacido se cultivaron en medio de crecimiento que contenía penicilina/estreptomicina. El tejido obtenido después del parto de un varón recién nacido (X,Y) se seleccionó para permitir la distinción entre células derivadas de recién nacidos y células derivadas de la madre (X,X). Las células se sembraron en una cantidad de 5000 células por centímetro cuadrado en medio de cultivo en un matraz T25 (Corning, Corning, NY) y se expandieron hasta alcanzar una confluencia del 80 %. Un matraz T25 que contenía células se llenó hasta el cuello con medio de cultivo. Las muestras se enviaron por correo privado a un laboratorio de citogenética clínica (el tiempo calculado para el transporte entre un laboratorio y el otro es de una hora). Las células se analizaron durante la metafase que es cuando se visualizan mejor los cromosomas. De las veinte células en metafase contadas, cinco se analizaron para determinar el número de cariotipo homogéneo normal (dos). Una muestra celular se caracterizó como homogénea cuando se observaron dos cariotipos. Una muestra celular se caracterizó como heterogénea cuando se observaron más de dos cariotipos. Se contaron otras células de metafase y se analizaron cuando se identificó un número de cariotipo heterogéneo (cuatro).
Resultados Todas las muestras celulares enviadas para el análisis de cromosomas se interpretaron como células con una apariencia normal. Tres de las dieciséis líneas celulares exhibieron un fenotipo heterogéneo (XX y XY) que indicaba la presencia de células derivadas de origen neonatal y maternal (Tabla 6-1). Las células derivadas del tejido Placenta-N se aislaron del aspecto neonatal de la placenta. En el pase cero, esta línea celular aparentaba ser XY homogéneo. Sin embargo, en el pase nueve, la línea celular era heterogénea (XX/XY), lo que indica una presencia previamente no detectada de células de origen materno.
Tabla 6-1. Resultados del análisis de cariotipos celulares Clave: N- Aspecto neonatal; V- Región vellosa; M- Aspecto maternal; C- Clon Resumen. El análisis de cromosomas identificó células derivadas de la placenta y ombligo, cuyos cariotipos parecían normales tal como interpretó el laboratorio citogenético clínico. El análisis de cariotipos identificó, además, líneas celulares libres de células maternales según se determinó por cariotipo homogéneo.
Ejemplo 7 Evaluación de marcadores de superficie celular derivados del tejido del cordón umbilical humano y de la placenta por citometría de flujo La caracterización de "marcadores" o proteínas de la superficie celular por citometría de flujo se puede usar para determinar la identidad de una línea celular. La consistencia de la expresión se puede determinar a partir de múltiples donantes y en células expuestas a distintas condiciones de procesamiento y cultivo. Las líneas celulares aisladas de la placenta y ombligo se caracterizaron (por citometría de flujo) lo que proporcionó un perfil para la identificación de estas líneas celulares.
Materiales v métodos Medios y recipientes de cultivo. Las células se cultivaron en medio de crecimiento (Gibco Carlsbad, CA) con penicilina/estreptomicina. Las células se cultivaron en matraces de cultivo de tejido T75, T150 y T225 tratados con plasma (Corning, Corning, NY) hasta la confluencia. Las superficies de crecimiento de los matraces se recubrieron con gelatina por medio de la incubación de 2 % (p/v) de gelatina (Sigma, St. Louis, MO) por 20 minutos a temperatura ambiente.
Tinción de anticuerpos y análisis por citometría de flujo. Las células adherentes en los matraces se lavaron en PBS y se separaron con tripsina/EDTA. Las células se recolectaron, centrifugaron y resuspendieron en 3 % (v/v) de FBS en PBS en una concentración de células de 1x107 por mililitro. De conformidad con las especificaciones del fabricante, se añadió anticuerpo al marcador de superficie celular de interés (ver más abajo) en una cantidad de cien microlitros de suspensión de células y la mezcla se incubó en la oscuridad por 30 minutos a 4 °C. Después de la incubación, las células se lavaron con PBS y se centrifugaron para eliminar el anticuerpo no unido. Las células se resuspendieron en 500 microlitros de PBS y se analizaron por citometría de flujo. El análisis por citometría de flujo se realizó con un instrumento FACScalibur (Becton Dickinson, San José, CA).
Se usaron los siguientes anticuerpos para los marcadores de superficie celular.
Anticuerpo Fabricación Número de catálogo CD10 BD Pharmingen (San Diego, CA) 555375 CD13 BD pharmingen 555394 CD31 BD pharmingen 555446 CD34 BD pharmingen 555821 CD44 BD pharmingen 555478 CD45RA BD pharmingen 555489 CD73 BD pharmingen 550257 CD90 BD pharmingen 555596 CD117 BD pharmingen 340529 CD141 BD pharmingen 559781 PDGFr-alfa BD pharmingen 556002 HLA-A, B, C BD pharmingen 555553 HLA-DR, DP, DQ BD pharmingen 555558 IgG-FITC Sigma (St. Louis, O) F-6522 IgG- PE Sigma P-4685 Comparación entre la placenta y el ombligo. Las células derivadas de la placenta se compararon con las células derivadas del ombligo en el pase 8.
Comparación entre pases. Las células derivadas de la placenta y el ombligo se analizaron en los pases 8, 15 y 20.
Comparación entre donantes. Para comparar las diferencias entre donantes, se compararon entre sí las células derivadas de la placenta de distintos donantes y las células derivadas del ombligo de distintos donantes.
Comparación del recubrimiento de superficie. Las células derivadas de la placenta cultivadas en matraces recubiertos con gelatina se compararon con células derivadas de la placenta cultivadas en matraces no recubiertos. Las células derivadas del ombligo cultivadas en matraces recubiertos con gelatina se compararon con células derivadas del ombligo cultivadas en matraces no recubiertos.
Comparación de enzimas de digestión. Se compararon cuatro tratamientos usados para el aislamiento y preparación de células. Se compararon células aisladas de placenta por el tratamiento con 1) colagenasa; 2) colagenasa/dispasa; 3) colagenasa/hialuronidasa; y 4) colagenasa/hialuronidasa/dispasa.
Comparación de la capa placentaria. Las células derivadas del aspecto maternal del tejido placentario se compararon con las células derivadas de la región vellosa del tejido placentario y células derivadas del aspecto fetal neonatal de la placenta.
Resultados Comparación de la placenta y el ombligo. Las células derivadas de la placenta y derivadas del ombligo analizadas por citometría de flujo mostraron una expresión positiva de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa y HLA-A, B, C, indicada por los mayores valores de fluorescencia con respecto a la IgG de control. Estas células fueron negativas para la expresión detectable de CD31 , CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DR, DP, DQ, indicada por valores de fluorescencia comparables con la IgG de control. Se justificaron las variaciones en los valores de fluorescencia de curvas positivas. La media (es decir, CD13) y el intervalo (es decir, CD90) de las curvas positivas mostraron cierta variación, pero las curvas parecían normales lo que confirma una población homogénea. Ambas curvas exhibieron individualmente valores mayores que la IgG de control.
Comparación de células derivadas de la placenta entre un pase y otro. El resultado del análisis de las células derivadas de la placenta en los pases 8, 15 y 20 por medio de citometría de flujo fue positivo para la expresión de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa y HLA-A, B, C, según se refleja en el mayor valor de fluorescencia con respecto a la IgG de control. Las células fueron negativas para la expresión de CD31 , CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DR, DP, DQ con valores de fluorescencia consistentes con los de la IgG de control.
Comparación de células derivadas del ombligo entre un pase y otro. El resultado del análisis de todas las células derivadas del ombligo en los pases 8, 15 y 20 por medio de citometría de flujo fue la expresión de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa y HLA-A, B, C, indicado por la mayor fluorescencia en comparación con la de la IgG de control. Estas células fueron negativas para CD31 , CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DR, DP, DQ, indicado por los valores de fluorescencia consistentes con la IgG de control.
Comparación entre donantes de células derivadas de la placenta. Las células derivadas de la placenta aisladas de donantes separados que se analizaron por citometría de flujo expresaron CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa y HLA-A, B, C, con mayores valores de fluorescencia con respecto a la IgG de control. Las células fueron negativas para la expresión de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DR, DP, DQ tal como lo indica el valor de fluorescencia consistente con el de la IgG de control.
Comparación entre donantes de células derivadas del ombligo. Las células derivadas del ombligo aisladas de donantes separados analizadas por citometría de flujo mostraron expresión positiva de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa y HLA-A, B, C, que se refleja en los mayores valores de fluorescencia con respecto a la IgG de control. Estas células fueron negativas para la expresión de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DR, DP, DQ con valores de fluorescencia consistentes con la IgG de control.
Efecto del recubrimiento de superficie con gelatina en células derivadas de la placenta. Todas las células derivadas de la placenta que se expandieron en matraces no recubiertos o recubiertos con gelatina analizadas por citometría de flujo expresaron CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa y HLA-A, B, C, lo que se refleja en los mayores valores de fluorescencia con respecto a la IgG de control. El resultado de estas células fue negativo para la expresión de CD31 , CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DR, DP, DQ, indicada por los valores de fluorescencia consistentes con la IgG de control.
Efecto del recubrimiento de superficie con gelatina en células derivadas del ombligo. El resultado de todas las células derivadas del ombligo expandidas en matraces no recubiertos y recubiertos con gelatina analizadas por citometría de flujo fue positivo para la expresión de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa y HLA-A, B, C, con mayores valores de fluorescencia con respecto a la IgG de control. Estas células fueron negativas para la expresión de CD31 , CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DR, DP, DQ con valores de fluorescencia consistentes con la IgG de control.
Efecto del procedimiento de digestión enzimática usado para preparar las células en el perfil del marcador de superficie celular. Todas las células derivadas de la placenta aisladas con el uso de varias enzimas de digestión analizadas por citometría de flujo expresaron CD 0, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa y HLA-A, B, C, según se indica por los mayores valores de fluorescencia con respecto a la IgG de control. El resultado de estas células fue negativo para la expresión de CD31 , CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DR, DP, DQ según se indica por los valores de fluorescencia consistentes con la IgG de control.
Comparación de la capa placentaria. Las células aisladas de capas maternales, vellosas y neonatales de la placenta, respectivamente, analizadas por citometría de flujo mostraron expresión positiva de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa y HLA-A, B, C, según se indica por el mayor valor de fluorescencia con respecto a la IgG de control. El resultado de estas células fue negativo para la expresión de CD31 , CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DR, DP, DQ según se indica por los valores de fluorescencia consistentes con la IgG de control.
Resumen. El análisis de células derivadas de placenta y ombligo por citometría de flujo estableció una identidad de estas líneas celulares. Las células derivadas de la placenta y el ombligo son positivas para CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, HLA-A,B,C y negativas para CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DR, DP, DQ. Esta identidad fue consistente entre variaciones en variables que incluyen el donante, pase, recubrimiento de superficie del recipiente de cultivo, enzimas de digestión y capa placentaria. Se observó cierta variación en los intervalos y promedios de la curva del histograma de los valores de fluorescencia individuales, pero todas las curvas positivas en todas las condiciones probadas fueron normales y expresaron valores de fluorescencia mayores que la IgG de control, y por lo tanto, confirma que las células comprenden una población homogénea con expresión positiva de los marcadores.
Ejemplo 8 Caracterización inmunohistoquímica de fenotipos de tejido placentario y del cordón umbilical Los fenotipos de células encontrados dentro del cordón umbilical humano y placenta se analizaron por inmunohistoquímica.
Materiales y Métodos Preparación del tejido. Se recolectó tejido de la placenta y cordón umbilical humano y se fijó por inmersión en 4 % (p/v) de paraformaldehído de la noche a la mañana a 4 °C. Se realizó inmunohistoquímica con el uso de anticuerpos dirigidos contra los siguientes epítopos: vimentina (1:500; Sigma, St. Louis, MO), desmina (1.150, dirigidos contra conejo; Sigma; o 1:300, dirigida contra ratón; Chemicon, Temecula, CA), actina alfa del músculo liso (SMA; 1 :400; Sigma), citoqueratina 18 (CK18; 1 :400; Sigma), factor de von Willebrand (vWF; 1:200; Sigma) y CD34 (CD34 humana clase III; 1 :100; DAKOCytomation, Carpintería, CA). Además, se probaron los siguientes marcadores: GROalpha antihumana - PE (1:100; Becton Dickínson, Franklin Lakes, NJ), GCP-2 antihumano (1 :100; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), receptor LDL oxidado antihumano 1 (ox-LDL R1; 1 :100; Santa Cruz Biotech) y NOGO-A antihumano (1 :100; Santa Cruz Biotech). Se recortaron especímenes fijos con un escalpelo y se colocaron dentro de un compuesto que contenía OCT (Tissue-Tek OCT; Sakura, Torrance, CA) en un baño de hielo seco que contenía etanol. Después, se cortaron y separaron bloques congelados (10 pm de espesor) con el uso de un criostato estándar (Leica Microsystems) y se colocaron sobre portaobjetos de vidrio para la tinción.
Inmunohistoquímica. Se realizó inmunohistoquímica de manera similar a estudios anteriores (por ejemplo, Messina, y otros, 2003, Exper. Neurol. 184: 816-829). Las secciones de tejido se lavaron con solución salina regulada con fosfato (PBS) y se trataron con una solución de bloqueo de proteínas que contenía PBS, 4 % (v/v) de suero de cabra (Chemicon, Temecula, CA) y 0.3 % (v/v) de tritón (Tritón X-100; Sigma) por 1 hora para acceder a los antígenos intracelulares. En instancias en las cuales el epítopo de interés estaría ubicado en la superficie celular (CD34, ox-LDL R1), se omitió el Tritón en todas las etapas del procedimiento para evitar la pérdida del epítopo. Además, en instancias en las cuales el anticuerpo primario estaba dirigido contra cabra (GCP-2, ox-LDL R1 , NOGO-A) se usó 3 % (v/v) de suero de asno en lugar de suero de cabra durante todo el procedimiento. Los anticuerpos primarios, diluidos en solución bloqueante se aplicaron después a las secciones por un periodo de 4 horas a temperatura ambiente. Las soluciones de anticuerpos primarios se eliminaron y los cultivos se lavaron con PBS antes de la aplicación de soluciones de anticuerpos secundarios (1 hora a temperatura ambiente) que contenían el bloque junto con IgG antiratón de cabra - Texas Red (1 :250; Molecular Probes, Eugene, OR) y/o IgG anticonejo de cabra IgG -Alexa 488 (1 :250; Molecular Probes) o IgG anticabra de asno - FITC (1 :150; Santa Cruz Biotech). Los cultivos se lavaron y se aplicó DAPI 10 m ¡cromóles (Molecular Probes) por 10 minutos para visualizar los núcleos celulares.
Después de la inmunotinción, se visualizó la fluorescencia con el uso del filtro de fluorescencia adecuado en un microscopio epifluorescente invertido Olympus (Olympus, Melville, NY). La tinción positiva se representó por una señal de fluorescencia por encima de la tinción de control. Las imágenes representativas se captaron con el uso de una videocámara de color digital y el programa ImagePro (Media Cybernetics, Carlsbad, CA). Para las muestras con triple tinción se tomó cada imagen con el uso de solamente un filtro de emisión por vez. Después, se prepararon los montajes en capas con el uso del programa Adobe Photoshop (Adobe, San José, CA).
Resultados Caracterización del cordón umbilical. Se expresó marcadores de vimentina, desmina, SMA, CK18, vWF y CD34 en un subconjunto de las células encontradas dentro del cordón umbilical. Particularmente, la expresión de vWF y CD34 se limitó a los vasos sanguíneos contenidos dentro del cordón. Las células CD34+ estaban en la capa más interna (lado del lumen). Se encontró la expresión de vimentina en toda la matriz y vasos sanguíneos del cordón. El SMA se limitó a la matriz y paredes externas de la arteria y vena, pero no estaba contenido con los vasos propiamente dichos. Se observó CK18 y desmina dentro de los vasos solamente, la desmina limitada a la capa media y externa.
Caracterización de la placenta. Se observó vimentina, desmina, SMA, CK18, vWF y CD34 dentro de la placenta y en regiones específicas.
Expresión de tejido con GROalpha, GCP-2, ox-LDL R1 y NOGO-A. Dentro del tejido del cordón umbilical o placenta no se observó ninguno de estos marcadores.
Resumen. La vimentina, desmina, actina alfa del músculo liso, citoqueratina 18, factor de von Willebrand y CD 34 se expresan en células dentro del cordón umbilical y placenta humana.
Ejemplo 9 Análisis de células con el uso de matrices de oliqonucleótidos Se usó matrices Affymetrix GENECHIP® para comparar los perfiles de expresión génica de células derivadas del ombligo y placenta con fibroblastos, células madre mesenquimales humanas y otra línea celular derivada de la médula ósea humana. Este análisis proporcionó una caracterización de las células e identificó marcadores moleculares únicos para estas células.
Materiales y métodos Aislamiento y cultivo de células. Se obtuvo cordones umbilicales y placenta humana de National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA) a partir de partos a término normales con el consentimiento de la paciente. Se recibieron los tejidos y las células se aislaron tal como se describe en el Ejemplo 1. Las células se cultivaron en medio de crecimiento (con el uso de DMEM-LG) en matraces de plástico para cultivo de tejido recubiertos con gelatina. Los cultivos se incubaron a 37 °C con 5 % de CO2.
Se adquirió fibroblastos dérmicos humanos de Cambrex Incorporated (Walkersville, MD; número de lote 9F0844) y ATCC CRL-1501 (CCD39SK). Ambas líneas se cultivaron en medio DMEM/F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) con 10 % (v/v) de suero fetal bovino (Hyclone) y penicilina/estreptomicina (Invitrogen). Las células se cultivaron en plástico tratado con tejido estándar.
Las células madre humanas mesenquimales (h SC) se adquirieron de Cambrex Incorporated (Walkersville, MD; números de lote 2F1655, 2F1656 y 2F1657) y se cultivaron de conformidad con las especificaciones del fabricante en medios MSCGM (Cambrex). Las células se cultivaron en plástico cultivado con tejido estándar a 37 °C con 5 % de CO2.
La médula ósea de la cresta ilíaca humana fue suministrada por NDRI con el consentimiento del paciente. La médula ósea se procesó de conformidad con el método descrito por Ho y otros (patente núm. WO 03/025149). La médula ósea se mezcló con regulador de lisis (NH CI 155 mM, KHCO3 10 mM y EDTA 0.1 mM, pH 7.2) en una relación de 1 parte de médula ósea por 20 partes de regulador de lisis. La suspensión de células se agitó en vórtice, se incubó por 2 minutos a temperatura ambiente y se centrifugó por 10 minutos a 500 x g. El sobrenadante se descartó y el gránulo celular se resuspendió en medio esencial mínimo alfa (Invitrogen) suplementado con 10 % (v/v) de suero fetal bovino y glutamina 4 mM. Las células se centrifugaron otra vez y el gránulo celular se resuspendió en medio fresco. Las células mononucleares viables se contaron con el uso de exclusión con azul tripán (Sigma, St. Louis, MO). Las células mononucleares se sembraron en matraces plásticos cultivados con tejido a 5 x 104 células/cm2. Las células se incubaron a 37 °C con 5 % de C02 en 02 atmosférico estándar o a 5 % de O2. Las células se cultivaron por 5 días sin cambiar los medios. Los medios y las células no adherentes se eliminaron después de 5 días de cultivo. Las células adherentes se mantuvieron en cultivo.
Aislamiento de ARNm y análisis GENECHIP®. Los cultivos de células con crecimiento activo se extrajeron de los matraces con un raspador de células en PBS frío. Las células se centrifugaron por 5 minutos a 300 x g. El sobrenadante se eliminó y las células se resuspendieron en PBS fresco y se centrifugaron otra vez. El sobrenadante se eliminó y el gránulo celular se congeló inmediatamente y se almacenó a -80 °C. Se extrajo el ARNm celular y se transcribió en ADNc que, después, se transcribió en ARNc y se marcó con biotina. El ARNc marcado con biotina se hibridó con una matriz de oligonucleótidos HG-U133A GENECHIP® (Affymetrix, Santa Clara CA). La hibridación y recolección de datos se realizó de conformidad con las especificaciones del fabricante. Los análisis se realizaron con el uso del programa "análisis de importancia de micromatrices" (SAM) versión 1.21 (Stanford University; Tusher, V.G. y otros, 2001 , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98: 51 6-5121 ).
Resultados Se analizaron catorce poblaciones de células diferentes. Las células, junto con la información del pase, el sustrato de cultivo y los medios de cultivo se enumeran en la Tabla 9-1.
Tabla 9-1. Células analizadas por medio del estudio de micromatrices. Las lineas celulares se enumeran por el código de identificación en conjunto con el pase en el momento del análisis, el sustrato de cultivo celular y el medio de cultivo.
Los datos se evaluaron por análisis de los componentes principales y se analizaron 290 genes que se expresaron diferencialmente en las células. Este análisis permite hacer una comparación relativa para determinar las similitudes entre las poblaciones. La Tabla 9-2 muestra las distancias euclidianas que se calcularon para comparar los pares celulares. Las distancias euclidianas se basaron en la comparación de las células en base a los 290 genes que se expresaron diferencialmente entre los tipos celulares. La distancia euclideana es inversamente proporcional a la similitud entre la expresión de los 290 genes (es decir, cuanto mayor es la distancia, menor es la similitud).
Tabla 9-2. Las distancias euclidianas para los pares celulares.
Par celular Distancia euclidiana ICBM-hMSC 24.71 Placenta-ombligo 25.52 ICBM-fibroblasto 36.44 ICBM-placenta 37.09 Fibroblasto-MSC 39.63 ICBM-umbilical 40.15 Fibroblasto-umbilical 41.59 MSC-placenta 42.84 MSC-umbilical 46.86 ICBM-placenta 48.41 Las Tablas 9-3, 9-4 y 9-5 muestran la expresión de genes incrementada en células derivadas de la placenta (Tabla 9-3), incrementada en células derivadas del ombligo (Tabla 9-4) y reducida en células derivadas del ombligo y de la placenta (Tabla 9-5). La columna titulada "Ident. del conjunto de sondas" se refiere al código de identificación del fabricante para los conjuntos de varias sondas de oligonucleótidos ubicadas en un sitio específico en el chip, que se hibridan al gen nombrado (columna "nombre del gen"), que comprenden una secuencia que puede encontrarse dentro de la base de datos del NCBI (GenBank) en el número de registro especificado (columna "número de registro del NCBI").
Las Tablas 9-6, 9-7 y 9-8 muestran la expresión de genes incrementada en fibroblastos humanos (Tabla 9-6), células ICBM (Tabla 9-7) y MSC (Tabla 9-8).
Tabla 9-6. Genes que se demostró tienen una expresión incrementada en fibroblastos en comparación con las otras líneas celulares ensayadas.
Fosfatasa 2 de especificidad dual Proteína KIAA0527 ADNc humano: FLJ23224 fis, clon ADSU02206 Dineína, citoplásmico, polipéptido intermedio 1 Anquirina 3, nodo de Ranvier (anquirina G) Inhibina, beta A (polipéptido alfa de activina A, adivina AB) Ectonucleótido pirofosfatasa/fosfodiestreasa 4 (función putativa) Proteina KIAA1053 Proteína asociada con microtúbulos 1A Proteína 41 con dedos de zinc Proteína HSPC019 ADNc humano: FLJ23564 fis, clon LNG 10773 ARNm humano; ADNc DKFZp564A072 (del clon DKFZp564A072) Proteína LIM (similar al enigma de unión a la proteína quinasa C de rata) Inhibidor del mejorador de genes polipéptidos de cadena ligera kappa en células B, proteina asociada al complejo de quinasa Proteína hipotética FLJ22004 Secuencia de ARNm humano (clon CTG-A4) EST, moderadamente similares al factor similar al receptor de citocina 2; precursor del receptor de citocina CRL2 [humano] Factor de crecimiento de transformación, beta 2 Proteína hipotética GC29643 Antígeno identificado por el anticuerpo monoclonal MRC OX-2 Proteina de retinopatia ligada a X putativa Tabla 9-7. Genes que se demostró tienen una expresión incrementada en las células derivadas de ICBM en comparación con las otras líneas celulares ensayadas •Proteína de repetición de anquirina cardíaca •ORF de la región de clase I de MHC •Integrina, alfa 10 •Proteína hipotética FLJ22362 •UDP-N-acetil-alfa-D-galactosamina:pol¡péptido N-acetilgalactosaminiltransferasa 3 (GalNAc-T3) •Proteina inducida por interferón 44 •SRY (región Y determinante del género)-caja 9 (displasia campomélica, reversión sexual autosómica) •Proteina asociada a la queratina 1-1 •Hipocalcina tipo 1 •Jagged 1 (síndrome de Alagille) •Proteoglicano 1 , gránulo secretor Tabla 9-8. Genes que se demostró tienen una expresión incrementada en las células de MSC en comparación con las otras líneas celulares ensayadas.
•Interleucina 26 •Maltasa-glucoamilasa (alfa-glucosidasa) •Receptor nuclear, subfamilia 4, grupo A, miembro 2 •Homólogo del oncogen viral de osteosarcoma murino v-fos FBJ •Proteina hipotética DC42 •Receptor nuclear, subfamilia 4, grupo A, miembro 2 •Homólogo B del oncogen viral de osteosarcoma murino FBJ •Proteína de la ruta de señalización inducible por WNT1 1 •Secuencia de transformación derivada de la linea celular de MCF.2 •Canal de potasio, subfamilia K, miembro 15 •Homeoproteína 1 de clase pareada de cartílago •ADNc humano FLJ12232 fis, clon MAMMA1001206 •ADNc humano FLJ34668 fis, clon LIVER2000775 •Protooncogen jun B •Célula B CLL/linfoma 6 (proteina de dedo de zinc 51) •Proteína de dedo de zinc 36, tipo C3H, homólogo (ratón) Resumen. Este estudio se realizó para proporcionar una caracterización molecular de las células derivadas del cordón umbilical y placenta. Este análisis incluyó células derivadas de tres cordones umbilicales diferentes y tres placentas diferentes. El estudio incluyó, además, dos lineas diferentes de fibroblastos dérmicos, tres líneas de células madre mesenquimales y tres líneas de células de la médula ósea de la cresta ilíaca. El ARNm expresado por estas células se analizó con el uso de una matriz de oligonucleótidos que contenia sondas para 22,000 genes. Los resultados mostraron que 290 genes se expresan diferencialmente en estos cinco tipos de células diferentes. Estos genes incluyeron diez genes específicamente incrementados en las células derivadas de la placenta y siete genes específicamente incrementados en las células derivadas del cordón umbilical. Se encontró que cincuenta y cuatro genes tenían niveles de expresión específicamente menores en la placenta y el cordón umbilical, en comparación con los tipos celulares. La expresión de genes seleccionados se confirmó por PCR (ver el siguiente ejemplo). Estos resultados demuestran que las células tienen un perfil de expresión génica distinto, por ejemplo, en comparación con las células y fibroblastos derivados de la médula ósea.
Ejemplo 10 Marcadores celulares en células derivadas de la placenta v tejido del cordón umbilical En el ejemplo anterior, las similitudes y diferencias en células derivadas de la placenta humana y el cordón umbilical humano se evaluaron por la comparación de sus perfiles de expresión génica con los de las células derivadas de otras fuentes (con el uso de una matriz de oligonucleótidos). Se identificaron seis genes "distintivos": receptor 1 de LDL oxidado, interleucina-8, renina, reticulón, ligando del receptor de quimocina 3 (ligando CXC 3) y proteína quimiotáctica de granulocitos 2 (GCP-2). Estos genes "distintivos" se expresaron a niveles relativamente altos en las células.
Los procedimientos descritos en este ejemplo se realizaron para verificar los datos de micromatrices y encontrar concordancia/falta de concordancia entre la expresión de genes y proteínas, así como para establecer una serie de ensayos confiables para detectar identificadores únicos para las células derivadas de la placenta y el ombligo.
Métodos y Materiales Células. Las células derivadas de la placenta (tres aislados que incluyen un aislado mayormente neonatal tal como se identificó por análisis de cariotipado), células derivadas del ombligo (cuatro aislados) y fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF; neonatos y adultos) cultivados en medio de crecimiento con penicilina/estreptomicina en un matraz T75 recubierto con gelatina. Las células madre mesenquimales (MSC) se cultivaron en un kit de medio de crecimiento para células madre mesenquimales (MSCGM; Cambrex, Walkerville, MD).
Para el protocolo de IL-8, las células se descongelaron a partir de nitrógeno líquido y se sembraron en placas en matraces recubiertos con gelatina en una cantidad de 5000 células/cm2, se cultivaron por 48 horas en medio de crecimiento y, después, se cultivaron por otras 8 horas en 10 mililitros de medio con bajo contenido de suero [DMEM con bajo contenido de glucosa (Gibco, Carlsbad, CA), penicilina/estreptomicina (Gibco, Carlsbad, CA) y 0.1 % (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA; Sigma, St. Louis, MO)]. Después de este tratamiento se extrajo el ARN y los sobrenadantes se centrifugaron a 150 x g por 5 minutos para eliminar los residuos celulares. Después, los sobrenadantes se congelaron a -80 °C para el análisis ELISA.
Cultivo celular para el ensayo ELISA. Las células derivadas de la placenta y el ombligo, así como los fibroblastos humanos derivados del prepucio de un ser humano recién nacido se cultivaron en medio de crecimiento en matraces T75 recubiertos con gelatina. Las células se congelaron en el pase 11 en nitrógeno líquido. Las células se descongelaron y transfirieron a tubos de centrífuga de 15 mililitros. Después de la centrifugación a 150 x g por 5 minutos, el sobrenadante se desechó. Las células se resuspendieron en 4 mililitros de medio de cultivo y se contaron. Las células se cultivaron en un matraz de 75 cm2 que contenía 15 mililitros de medio de cultivo a 375,000 células/matraz por 24 horas. El medio se cambió a un medio con bajo contenido de suero por 8 horas. El medio con bajo contenido de suero se recolectó al final de la incubación, se centrifugó a 14,000 x g por 5 minutos (y se almacenó a -20 °C).
Para calcular el número de células en cada matraz se añadió en cada uno de ellos 2 mililitros de tripsina/EDTA (Gibco, Carlsbad, CA). Después de que las células se separaron del matraz, la actividad de tripsina se neutralizó con 8 mililitros de medio de crecimiento. Las células se transfirieron a un tubo de centrífuga de 15 mililitros y se centrifugaron a 150 x g por 5 minutos. El sobrenadante se eliminó y se añadió 1 mililitro de medio de crecimiento en cada tubo para resuspender las células. La cantidad de células se calculó con el uso de un hemocitómetro.
Ensayo ELISA. La cantidad de IL-8 secretada por las células en un medio con bajo contenido de suero se analizó con el uso de ensayos ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN). Todos los ensayos se probaron de conformidad con las instrucciones suministradas por el fabricante.
Aislamiento de ARN total. El ARN se extrajo a partir de fibroblastos y células derivadas del ombligo y placenta confluentes o para la expresión de IL-8 a partir de células tratadas tal como se describió anteriormente. Las células se lisaron con 350 microlitros de regulador RLT que contenía beta-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (RNeasy Mini Kit; Qiagen, Valencia, CA). El ARN se extrajo de conformidad con las instrucciones del fabricante (RNeasy Mini Kit; Qiagen, Valencia, CA) y se expuso a tratamiento con ADNasa (2.7 U/muestra) (Sigma St. Louis, MO). El ARN se eluyó con 50 microlitros de agua tratada con DEPC y se almacenó a -80 °C.
Transcripción inversa. El ARN se extrajo, además de placenta y ombligo humanos. El tejido (30 miligramos) se suspendió en 700 microlitros de regulador RLT que contenía 2-mercaptoetanol. Las muestras se homogeneizaron mecánicamente y la extracción de ARN prosiguió de conformidad con la especificación del fabricante. El ARN se extrajo con 50 microlitros de agua tratada con DEPC y se almacenó a -80 °C. El ARN se sometió a transcripción inversa con el uso de hexámeros aleatorios con los reactivos de transcripción inversa TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA) a 25 °C por 10 minutos, 37 °C por 60 minutos y 95 °C por 10 minutos. Las muestras se almacenaron a -20 °C.
Los genes identificados por micromatriz de ADNc como regulados únicamente en células obtenidas después del parto (genes distintivos, que incluyen receptor de LDL oxidado, interleucina-8, renina y reticulón) se investigaron aun más con el uso de PCR convencional y en tiempo real.
PCR en tiempo real. Se realizó PCR en muestras de ADNc con el uso de productos de expresión génica Assays-on-Demand™: receptor de LDL oxidado (Hs00234028); renina (Hs00166915); reticulón (Hs00382515); ligando de CXC 3 (Hs00171061)¡ GCP-2 (Hs00605742); IL-8 (Hs00174103); y GAPDH (Applied Biosystems, Foster City, CA) se mezclaron con ADNc y mezcla maestra de PCR TaqMan Universal de conformidad con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA) con el uso de un sistema de detección de 7000 secuencias con el programa SDS ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las condiciones del ciclo térmico eran inicialmente de 50 °C por 2 min y 95 °C por 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 °C por 15 s y 60 °C por 1 min. Los datos de la PCR se analizaron de conformidad con las especificaciones del fabricante (boletín del usuario núm. 2 de Applied Biosystems para el sistema de detección de secuencias ABI Prism 7700).
PCR convencional. Se realizó la PCR convencional con el uso de un equipo ABI PRISM 7700 (Perkin Elmer Applied Biosystems, Boston, Massachusetts, Estados Unidos) para confirmar los resultados de la PCR en tiempo real. Se realizó PCR con el uso de 2 microlitros de solución de ADNc, mezcla universal 1* AmpliTaq Gold, regulador de la reacción de PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) y desnaturalización inicial a 94 °C por 5 minutos. La amplificación se optimizó para cada conjunto de iniciadores. Para la IL-8, CXC ligando 3 y reticulón (94 °C por 15 segundos, 55 °C por 15 segundos y 72 °C por 30 segundos para 30 ciclos); para la renina (94 °C por 15 segundos, 53 °C por 15 segundos y 72 °C por 30 segundos por 38 ciclos); para el receptor de LDL oxidado y GAPDH (94 °C por 15 segundos, 55 °C por 15 segundos y 72 °C por 30 segundos para 33 ciclos). Los iniciadores usados para amplificación se enumeran en la Tabla 1. La concentración de iniciadores en la reacción de PCR final fue de 1 micromol excepto para GAPDH que fue de 0.5 micromoles. Los iniciadores de GAPDH fueron los mismos que para la PCR en tiempo real, excepto que la sonda TaqMan del fabricante no se añadió a la reacción de PCR final. Las muestras se procesaron en 2 % (p/v) de gel de agarosa y se mancharon por tinción con bromuro de etidio (Sigma, St. Louis, MO). Se captaron imágenes con el uso de una película 667 Universal Twinpack (VWR International, South Plainfield, NJ) con una cámara Polaroid de longitud focal (VWR International, South Plainfield, NJ).
Tabla 10-1. Iniciadores usados Nombre del iniciador Iniciadores Receptor de LDL oxidado S: 5 -GAGAAATCCAAAGAGCAAATGG-3' (sec. con núm. de ident.:1) A: 5 -AGAATGGAAAACTGGAATAGG-3' (sec. con núm. de ident.:2) Renina S: 5'-TCTTCGATGCTTCGGATTCC-3' (sec. con núm. de ident.:3) A: 5 -GAATTCTCGGAATCTCTGTTG-3' (sec. con núm. de ident.:4) Reticulón S: 5'- TTACAAGCAGTGCAGAAAACC-3' (sec. con núm. de ¡dent.:5) A: 5'- AGTAAACATTGAAACCACAGCC-3' (sec. con núm. de ¡dent.:6) lnterleucina-8 S: 5 - TCTGCAGCTCTGTGTGAAGG-3' (sec. con núm. de ¡dent.:7) A: 5'-CTTCAAAAACTTCTCCACAACC- 3' (sec. con núm. de ident.:8) Ligando de quimocina (CXC) 3 S: 5'- CCCACGCCACGCTCTCC-3' (sec. con núm. de ¡dent.:9) A: 5'-TCCTGTCAGTTGGTGCTCC -3' (sec con núm. de ¡dent.:10) Inmunofluorescencia. Las células derivadas se fijaron con 4 % (p/v) de paraformaldehído frío (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) por 10 minutos a temperatura ambiente. Se usó un aislado de células derivadas del ombligo y un aislado de células derivadas de placenta en el pase 0 (PO) (directamente después del aislamiento) y pase 11 (P11) (dos aislados de células derivadas de placenta, dos aislados de células derivadas del ombligo) y fibroblastos (P11). Se realizó inmunohistoquimica con el uso de anticuerpos dirigidos contra los siguientes epítopos: vimentina (1:500, Sigma, St. Louis, MO), desmina (1:150; Sigma - dirigido contra conejo; o 1:300; Chemicon, Temecula, CA - dirigido contra ratón), actina alfa del músculo liso (SMA; 1 :400; Sigma), citoqueratina 18 (CK18; 1:400; Sigma), factor de von Willebrand (vWF; 1 :200; Sigma) y CD34 (CD34 humana clase III; 1 :100; DAKOCytomation, Carpintería, CA). Además, se probaron los siguientes marcadores en células posteriores al parto del pase 11 : GRO alfa antihumano - PE (1 :100; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), GCP-2 antihumano (1 :100; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), receptor LDL oxidado antihumano 1 (ox-LDL R1 ; 1 :100; Santa Cruz Biotech) y NOGA-A antihumano (1 :100; Santa Cruz, Biotech).
Los cultivos se lavaron con solución salina regulada con fosfato (PBS) y se expusieron a una solución de bloqueo de proteínas que contenia PBS, 4 % (v/v) de suero de cabra (Chemicon, Temecula, CA) y 0.3 % (v/v) de tritón (Tritón X-100; Sigma, St. Louis, MO) por 30 minutos para acceder a los antígenos intracelulares. Cuando el epítopo de interés estaba ubicado en la superficie celular (CD34, ox-LDL R1) se omitió el Tritón X-100 en todas las etapas del procedimiento para evitar la pérdida del epítopo. Además, en instancias en las cuales el anticuerpo primario estaba dirigido contra cabra (GCP-2, ox-LDL R1, NOGO-A) se usó 3 % (v/v) de suero de asno en lugar de suero de cabra durante todo el procedimiento. Los anticuerpos primarios, diluidos en solución bloqueante se aplicaron después a los cultivos por un periodo de 1 hora a temperatura ambiente. Las soluciones de anticuerpos primarios se eliminaron y los cultivos se lavaron con PBS antes de la aplicación de soluciones de anticuerpos secundarios (1 hora a temperatura ambiente) que contenían el bloque junto con IgG antiratón de cabra - Texas Red (1:250; Molecular Probes, Eugene, OR) y/o IgG anticonejo de cabra IgG - Alexa 488 (1 :250; Molecular Probes) o IgG anticabra de asno - FITC (1:150, Santa Cruz Biotech). Después, los cultivos se lavaron y se aplicó DAPI lO micromoles (Molecular Probes) por 10 minutos para visualizar los núcleos celulares.
Después de la inmunotinción, se visualizó la fluorescencia con el uso de un filtro de fluorescencia adecuado en un microscopio epi-fluorescente invertido Olympus (Olympus, Melville, NY). En todos los casos, la tinción positiva representaba la señal de fluorescencia por encima de la tinción de control, en donde se siguió el procedimiento completo descrito anteriormente, excepto por la aplicación de una solución de anticuerpos primarios. Las imágenes representativas se captaron con el uso de una videocamara de color digital y el programa ImagePro (Media Cybernetics, Carisbad, CA). Para las muestras con triple tinción se tomó cada imagen con el uso de solamente un filtro de emisión por vez. Después, se prepararon los montajes en capas con el uso del programa Adobe Photoshop (Adobe, San José, CA).
Preparación de células para análisis por FACS. Las células adherentes en los matraces se lavaron en solución salina regulada con fosfato (PBS) (Gibco, Carisbad, CA) y se separaron con tripsina/EDTA (Gibco, Carisbad, CA). Las células se recolectaron, centrifugaron y resuspendieron en 3 % (v/v) de FBS en PBS a una concentración de células de 1x107 por mililitro. Se suministró alícuotas de cien microlitros en tubos cónicos. Las células con tinción para antígenos intracelulares se permeabilizaron con Perm/regulador de lavado (BD Pharmingen, San Diego, CA). Se añadió anticuerpo en alícuotas según las especificaciones del fabricante y las células se incubaron en la oscuridad por 30 minutos a 4 °C. Después de la incubación, las células se lavaron con PBS y se centrifugaron para eliminar el anticuerpo excedente. Las células que requerían un anticuerpo secundario se resuspendieron en 100 microlitros de 3 % de FBS. El anticuerpo secundario se añadió según la especificación del fabricante y las células se incubaron en la oscuridad por 30 minutos a 4 °C. Después de la incubación, las células se lavaron con PBS y se centrifugaron para eliminar el anticuerpo secundario. Las células lavadas se resuspendieron en 0.5 mililitros de PBS y se analizaron por citometría de flujo. Se usaron los siguientes anticuerpos: receptor de LDL oxidado 1 (sc-5813; Santa Cruz, Biotech), GROa (555042; BD Pharmingen, Bedford, MA), lgG1 kappa de ratón, (P-4685 y -5284; Sigma), IgG de asno contra cabra (sc-3743; Santa Cruz, Biotech.). El análisis por citometría de flujo se realizó con un instrumento FACScalibur (Becton Dickinson San José, CA).
Resultados Los resultados de la PCR en tiempo real para los genes "distintivos" seleccionados realizada en ADNc de células derivadas de placenta humana, fibroblastos de adultos y recién nacidos y células madre mesenquimales (MSC) indican que tanto el receptor de LDL oxidado como la renina se expresaron a un nivel mayor en las células derivadas de la placenta en comparación con otras células. Los datos obtenidos de la PCR en tiempo real se analizaron por el método de CT y se expresaron en una escala logarítmica. Los niveles de expresión de reticulón y LDL oxidado fueron mayores en células derivadas del ombligo en comparación con otras células. No se encontró una diferencia significativa en los niveles de expresión del ligando de CXC 3 y GCP-2 entre las células derivadas de la placenta y los controles. Los resultados de la PCR en tiempo real se confirmaron por PCR convencional. La secuenciación de productos de PCR validó aún más estas observaciones. No se encontró una diferencia significativa en el nivel de expresión del ligando 3 de CXC entre las células derivadas de la placenta y los controles con el uso de los iniciadores de ligando 3 de CXC para PCR convencional enumerados anteriormente.
La producción de la citocina, IL-8 en etapa posterior al parto fue elevada en las células cultivadas en medio de crecimiento y derivadas del medio con poca cantidad de suero. Todos los datos de la PCR en tiempo real se validaron con PCR convencional y por la secuenciación de productos de PCR.
Cuando se examinaron los sobrenadantes de células cultivadas en medio sin suero para determinar la presencia de IL-8, las cantidades más altas se detectaron en medios derivados de células umbilicales y algunos aislados de células de placenta (Tabla 10-1). No se detectó IL-8 en el medio derivado a partir de fibroblastos dérmicos humanos.
Tabla 10-1. Cantidad de proteina de IL-8 medida por ELISA ND: No detectado Además, se examinaron células derivadas de la placenta para determinar la producción del receptor de LDL oxidado, GCP-2 y GROalpha por análisis FACS. El resultado de la prueba de las células fue positivo para GCP-2. El receptor de LDL oxidado y GRO no se detectaron por este método.
Además, las células derivadas de la placenta se probaron para determinar la producción de proteínas seleccionadas por análisis inmocitoquímico. Inmediatamente después del aislamiento (pase 0), las células derivadas de la placenta humana se fijaron con 4 % de paraformaldehído y se expusieron a anticuerpos para seis proteínas: factor de von Willebrand, CD34, citoqueratina 18, desmina, actina alfa del músculo liso y vimentina. La tinción de las células fue positiva para la actina alfa del músculo liso y vimentina. Este patrón se conservó hasta el pase 11. Solamente unas pocas células (<5 %) en el pase 0 resultaron positivas en la tinción para citoqueratina 18.
Las células derivadas del cordón umbilical humano en el pase 0 se sondearon para la producción de proteínas seleccionadas por análisis inmunocitoquímico. Inmediatamente después del aislamiento (pase 0), las células se fijaron con 4 % de paraformaldehído y se expusieron a anticuerpos para seis proteínas: factor de von Willebrand, CD34, citoqueratina 18, desmina, actina alfa del músculo liso y vimentina. El resultado de las células derivadas del ombligo fue positivo para la actina alfa del músculo liso y vimentina con el patrón de tinción consistente hasta el pase 11.
Resumen. La concordancia entre los niveles de expresión génica medida por micromatríces y PCR (tiempo real y convencional) se ha establecido para cuatro genes: receptor de LDL oxidado 1 , renina, reticulón e IL-8. La expresión de estos genes se reguló diferencialmente en el nivel de ARNm en las células derivadas del tejido y células derivadas de la placenta, con IL-8 regulada, además, diferencialmente, en el nivel de proteínas. La presencia del receptor de LDL oxidado no se detectó en el nivel de proteínas por análisis de FACS en células derivadas de la placenta. La expresión diferencial de GCP-2 y el ligando 3 de CXC no se confirmó en el nivel de ARNm; sin embargo, se detectó GCP-2 en el nivel de proteínas por análisis de FACS en las células derivadas de la placenta. Si bien este resultado no se refleja por los datos obtenidos originalmente a partir del experimento de micromatrices, esto posiblemente se deba a una diferencia en la sensibilidad de las metodologías.
Inmediatamente después del aislamiento (pase 0), las células derivadas de la placenta humana dieron un resultado positivo en la tinción para actina alfa del músculo liso y vimentina. Este patrón se observó, además, en las células en el pase 11. Estos resultados sugieren que la expresión de vimentina y actina alfa del músculo liso se puede preservar en células con los pases, en el medio de crecimiento y en las condiciones usadas en estos procedimientos. Las células derivadas del cordón umbilical humano en el pase 0 se sondearon para la expresión de la actina alfa del músculo liso y vimentina y fueron positivas para ambos. El patrón de tinción se mantuvo hasta el pase 11.
Ejemplo 11 Evaluación inmunológica in vitro del tejido del cordón umbilical y células derivadas de la placenta Se evaluaron células UTC in vitro para determinar sus características inmunológicas en un intento para predecir la respuesta inmunológica, de haberla, que estas células podrían generar en el trasplante in vivo. Las UTC se ensayaron por citometría de flujo para determinar la presencia de HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, CD80, CD86 y B7-H2. Estas proteínas se expresan por medio de las células que presentan antígenos (APC) y son necesarias para la estimulación directa de células T CD4+ T vírgenes (Abbas & Lichtman, Cellular and Molecular Immunology, 5. 0 Ed. (2003) Saunders, Philadelphia, pág. 171). Las líneas celulares se analizaron, además, por citometría de flujo para determinar la expresión de HLA-G (Abbas & Lichtman, 2003, supra), CD 178 (Coumans, y otros, (1999) Journal of Immunological Methods 224, 185-196), y PD-L2 (Abbas & Lichtman, 2003, supra, Brown y otros. (2003) The Journal of Immunology 170, 1257-1266). Se piensa que la expresión de estas proteínas por medio de las células residentes en tejidos placentarios media el estado inmunoprivilegiado de los tejidos placentarios in útero. Para predecir el alcance hasta el cual las líneas celulares derivadas de la placenta y ombligo generan una respuesta inmune in vivo se probaron las líneas celulares en una reacción linfocitaria mixta (MLR, por sus siglas en inglés) unidireccional.
Materiales y métodos Cultivo celular. Las células se cultivaron hasta la confluencia en medio de crecimiento que contenía penicilina/estreptomicina en matraces T75 (Corning, Corning, NY) recubiertos con 2 % de gelatina (Sigma, St. Louis, MO).
Tinción de anticuerpos. Las células se lavaron en solución salina regulada con fosfato (PBS) (Gibco, Carlsbad, CA) y se separaron con tripsina/EDTA (Gibco, Carlsbad, MO). Las células se recolectaron, centrifugaron y resuspendieron en 3 % (v/v) de FBS en PBS a una concentración de células de 1x107 por mililitro. Se añadió anticuerpos (Tabla 11-1) en cien microlitros de suspensión celular según las especificaciones del fabricante y se incubaron en la oscuridad por 30 minutos a 4 °C. Después de la incubación, las células se lavaron con PBS y se centrifugaron para eliminar el anticuerpo no unido. Las células se resuspendieron en quinientos microlitros de PBS y se analizaron por citometría de flujo con el uso de un instrumento FACS Calibur (Becton Dickinson, San José, CA).
Tabla 11-1. Anticuerpos Anticuerpo Fabricante Número de catálogo HLA-DRDPDQ BD Pharmingen (San Diego, CA) 555558 CD80 BD Pharmingen (San Diego, CA) 557227 CD86 BD Pharmingen (San Diego, CA) 555665 B7-H2 BD Pharmingen (San Diego, CA) 552502 HLA-G Abcam (Cambridgeshire, Reino Unido) ab 7904-100 CD 178 Santa Cruz (San Cruz, CA) sc-19681 PD-L2 BD Pharmingen (San Diego, CA) 557846 lgG2a de ratón Sigma (St. Louis, MO) F-6522 IgGl kappa de ratón Sigma (St. Louis, MO) P-4685 Reacción linfocitaria mixta. Los viales criopreservados de células derivadas del ombligo del pase 10 marcadas como línea celular A y células derivadas de placenta del pase 11 marcadas como línea celular B se enviaron sobre hielo seco a CTBR (Senneville, Quebec) para realizar una reacción linfocitaria mixta con el uso de CTBR SOP núm. CAC-031. Se recolectaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) de múltiples donantes masculinos y femeninos voluntarios. Se trató las PBMC alogénicas (donante) estimulantes, PBMC autólogas y líneas celulares umbilicales y placentarias con mitomicina C. Las células estimulantes autólogas y tratadas con mitomicina C se añadieron a las PBMC respondedoras (receptores) y se cultivaron por 4 días. Después de la incubación, se añadió [3H]-timidina en cada muestra y se cultivó por 18 horas. Después de la recolección de las células, se extrajo ADN radiomarcado y la incorporación de [3H]-timidina se midió con el uso de un contador de centelleo.
El índice de estimulación para el donante alogénico (SIAD, por sus siglas en inglés) se calculó como la proliferación promedio del receptor más el donante alogénico tratado con mitomicina C dividido por los valores iniciales de la proliferación del receptor. El índice de estimulación de las UTC se calculó como la proliferación promedio del receptor más la línea celular posterior al parto tratada con micromicina C dividido por los valores iniciales de proliferación del receptor.
Resultados Reacción linfocitaria mixta - células derivadas de la placenta.
Se analizaron siete donantes de sangre voluntarios humanos para identificar un solo donante alogénico que exhibiría una respuesta de proliferación robusta en una reacción linfocitaria mixta con los otros seis donantes de sangre. Este donante se seleccionó como el donante de control positivo alogénico. Los otros seis donantes de sangre se seleccionaron como receptores. El donante de control positivo alogénico y las líneas celulares derivadas de la placenta se trataron con mitomicina C y se cultivaron en una reacción linfocitaria mixta con los seis receptores alogénicos individuales. Las reacciones se realizaron por triplicado con el uso de dos placas de cultivo celular con tres receptores por placa (Tabla 11-2). El índice de estimulación promedio era de 1.3 (placa 2) a 3 (placa 1 ) y los controles positivos de donantes alogénicos eran de 46.25 (placa 2) a 279 (placa 1) (Tabla 11-3).
Tabla 11-2. Datos de la reacción linfocitaria mixta - Línea celular B (Placenta) Ident. de la placa: Placa 2 Tabla 11-3. Indice de estimulación promedio de células de la placenta y un donante alogénico en una reacción linfocitaria mixta con seis receptores alogénicos individuales índice promedio de estimulación Reacción linfocitaria mixta - células derivadas del ombligo.
Se analizaron seis donantes de sangre voluntarios humanos para identificar un solo donante alogénico que exhibirá una respuesta de proliferación robusta en una reacción linfocitaria mixta con los otros cinco donantes de sangre. Este donante se seleccionó como el donante de control positivo alogénico. Los otros cinco donantes de sangre se seleccionaron como receptores. El donante de control positivo alogénico y las líneas celulares de la placenta se trataron con mitomicina C y se cultivaron en una reacción linfocitaria mixta con los cinco receptores alogénicos individuales. Las reacciones se realizaron por triplicado con el uso de dos placas de cultivo celular con tres receptores por placa (Tabla 1 1-4). El índice de estimulación promedio era de 6.5 (placa 1) a 9 (placa 2) y los controles positivos de donantes alogénicos eran de 42.75 (placa 1) a 70 (placa 2) (Tabla 11-5).
Tabla 11-4. Datos de la reacción linfocitaria mixta - Línea celular A (Ombligo) DPM para el ensayo de proliferación Ident. de la placa: Placa 1 Tabla 11-5. índice de estimulación promedio de células derivadas del ombligo y un donante alogénico en una reacción linfocitaria mixta con cinco receptores alogénicos individuales. índice promedio de estimulación Marcadores celulares que presentan antígenos - células derivadas de la placenta. Los histogramas de células derivadas de la placenta analizadas por citometría de flujo mostraron una expresión negativa de HLA-DR, DP, DQ, CD80, CD86 y B7-H2, según se observó por el valor de fluorescencia consistente con la IgG de control, lo que indica que las líneas celulares placentarias carecen de las moléculas de superficie celular necesarias para estimular directamente las células T CD4+.
Marcadores de inmunomodulación - células derivadas de la placenta. Los histogramas de células derivadas de la placenta analizadas por citometría de flujo mostraron una expresión positiva de PD-L2, según se observó por el mayor valor de fluorescencia con respecto a la IgG de control y expresión negativa de CD178 y HLA-G, según se observó por el valor de fluorescencia consistente con la IgG de control.
Marcadores celulares que presentan antígenos - células derivadas del ombligo. Los histogramas de células derivadas del ombligo analizadas por citometría de flujo mostraron una expresión negativa de HLA-DR, DP, DQ, CD80, CD86 y B7-H2, según se observó por un valor de fluorescencia consistente con la IgG de control lo que indica que las líneas celulares umbilicales carecen de las moléculas de superficie celular necesarias para estimular directamente las células T CD4+.
Marcadores celulares de inmunomodulación - células derivadas del ombligo. Los histogramas de células derivadas del ombligo analizadas por citometría de flujo mostraron una expresión positiva de PD-L2, según se observó por el mayor valor de fluorescencia con respecto a la IgG de control y expresión negativa de CD178 y HLA-G, según se observó por el valor de fluorescencia consistente con la IgG de control.
Resumen. En las reacciones linfocitarias mixtas realizadas con líneas celulares derivadas de placenta, el índice de estimulación promedio fue de 1.3 a 3 y el de los controles positivos alogénicos de 46.25 a 279. En las reacciones linfocitarias mixtas realizadas con líneas celulares derivadas del ombligo el índice de estimulación promedio fue de 6.5 a 9 y el de los controles positivos alogénicos de 42.75 a 70. Las líneas celulares derivadas de placenta y ombligo fueron negativas para la expresión de las proteínas estimulantes HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, CD80, CD86 y B7-H2, según se midió por citometría de flujo. Las líneas celulares derivadas de placenta y ombligo fueron negativas para la expresión de las proteínas inmunomoduladoras HLA-G y CD178 y positivas para la expresión de PD-L2, según se midió por citometría de flujo. Las PBMC donantes alogénicas contienen células que presentan antígenos que expresan HLA-DR, DQ, CD8, CD86 y B7-H2 y, de ese modo, permiten la estimulación de células T CD4+ naive. La ausencia de moléculas de superficie celular que presentan antígenos en células derivadas de placenta y ombligo necesarias para la estimulación directa de células T CD4+ naive y la presencia de PD-L2, una proteína inmunomodulante, puede justificar el índice de estimulación bajo exhibido por estas células en una MLR en comparación con los controles alogénicos.
Ejemplo 12 Secreción de factores tróficos por las células derivadas de la placenta y tejido del cordón umbilical Se midió la secreción de factores tróficos seleccionados de células derivadas de placenta y ombligo. Los factores seleccionados para la detección incluyeron: (1) aquellos que se conoce tienen actividad angiogénica, tal como el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) (Rosen y otros (1997) Ciba Found. Symp. 212:215-26), la proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1) (Salcedo y otros (2000) Blood 96;34-40), interleucina-8 (IL-8) (Li y otros (2003) J. Immunol. 170:3369-76), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (Hughes y otros (2004) Ann. Thorac. Surg. 77:812-8), metaloproteinasa de la matriz 1 (TIMP1), angiopoietina 2 (ANG2), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-bb), trombopoietina (TPO), factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina (HB-EGF), factor derivado del estroma 1 alfa (SDF-1alfa); (2) aquellos que se conoce tienen actividad neurotrófica/neuroprotectora, tal como el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) (Cheng y otms (2003) Dev. Biol. 258;319-33), interleucina-6 (IL-6), proteína quimiotáctica de granulocitos 2 (GCP-2), factor de crecimiento transformante beta2 (TGFbeta2); y (3) aquellos que se conoce tienen actividad de quimocina, tales como la proteína inflamatoria de macrófagos 1alfa (MIP1a), proteína inflamatoria de macrófagos 1beta (MIP1b), quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1), Rantes (regulada en la activación, célula T normal expresada y secretada), I309, timo y quimocina regulada por activación (TARC), eotaxina, quimocina derivada de macrófagos (MDC), IL-8).
Métodos y Materiales Cultivo de células. Se cultivó células de la placenta y ombligo así como fibroblastos humanos derivados del prepucio de un humano recién nacido, en medio de crecimiento con penicilina/estreptomicina en matraces T75 recubiertos con gelatina. Las células se criopreservaron en el pase 1 1 y se almacenaron en nitrógeno líquido. Después de descongelar las células, el medio de crecimiento se añadió a las células seguido de la transferencia a un tubo de centrífuga de 15 mililitros y la centrifugación de las células a 150 x g por 5 minutos. El sobrenadante se descartó. El gránulo celular se resuspendió en 4 mililitros de medio de cultivo y las células se contaron. Las células se sembraron a 375,000 células/matraz de 75 cm2 que contenía 15 mililitros de medio de crecimiento y se cultivaron por 24 horas. El medio se cambió a medio libre de suero (DMEM con bajo contenido de glucosa (Gibco), 0.1 % (p/v) de albúmina sérica bovina (Sigma), penicilina/estreptomicina (Gibco)) por 8 horas. El medio libre de suero acondicionado se recolectó al final de la incubación por centrifugación a 14,000 x g por 5 minutos y se almacenó a -20 °C. Para evaluar la cantidad de células en cada matraz, las células se lavaron con PBS y se separaron con el uso de 2 mililitros de tripsina/E DTA. La actividad de tripsina se inhibió por la adición de 8 mililitros de medio de crecimiento. Las células se centrifugaron a 150 x g por 5 minutos. El sobrenadante se eliminó y las células se resuspendieron en 1 mililitro de medio de crecimiento. La cantidad de células se calculó con el uso de un hemocitómetro.
Ensayo ELISA. Las células se cultivaron a 37 °C en 5 % de dióxido de carbono y oxígeno atmosférico. Las células derivadas de la placenta (lote 101503) se cultivaron, además, en 5 % de oxígeno o beta-mercaptoetanol (BME). La cantidad de MCP-1 , IL-6, VEGF, SDF-1alfa, GCP-2, IL-8 y TGF-beta 2 producidos por cada muestra celular se midió por un ensayo ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN). Todos los ensayos se realizaron de conformidad con las instrucciones del fabricante.
Ensayo ELISA multiplexado Searchlight™. Las quimocinas (MIP1a, MIP1b, MCP-1, Rantes, I309, TARC, Eotaxina, MDC, IL8), BDNF y factores angiogénicos (HGF, KGF, bFGF, VEGF, TIMP1 , ANG2, PDGF-bb, TPO, HB-EGFDD) se midieron con el uso de matrices de proteomas SearchLight (Pierce Biotechnology Inc.). Las matrices de proteomas son ensayos ELISA multiplexados en sandwich para la medición cuantitativa de dos a 16 proteínas por pocilio. Las matrices se producen por medio de elaborar un patrón 2 x 2, 3 x 3 o 4 x 4 de cuatro a 16 anticuerpos de captura diferentes en cada pocilio de una placa de 96 pocilios. Después de un procedimiento de ELISA sándwich, se hace una imagen de toda la placa para captar la señal quimioluminiscente generada en cada grupo dentro de cada pocilio de la placa. La señal generada en cada grupo es proporcional a la cantidad de proteína objetivo en el estándar original o muestra.
Resultados Ensayo ELISA. Se secretó MCP-1 e IL-6 por medio de células derivadas de placenta y ombligo y fibroblastos dérmicos (Tabla 12-1). Se secretó SDF-1alfa por medio de células derivadas de la placenta cultivadas en 5 % de 02 y por fibroblastos. Se produjo la secreción de GCP-2 e IL-8 por medio de células derivadas del ombligo y células derivadas de la placenta cultivadas en presencia de BME o 5 % de 02. Además, se secretó GCP-2 por medio de fibroblastos humanos. Por medio del ensayo ELISA no se detectó TGF-beta2.
Tabla 12-1. Resultados del ensayo ELISA (los valores se expresan en picogramos/mililitro/millón de células (n=2, sem) Clave: ND: No detectado.
Ensayo ELISA multiplexado Searchlight™. Se secretó TIMP1 , TPO, KGF, HGF, FGF, HBEGF, BDNF, MIP1b, MCP1 , RANTES, I309, TARC, MDC e IL-8 a partir de células derivadas del ombligo (Tablas 12-2 y 12-3). Se secretó TIMP1, TPO, KGF, HGF, HBEGF, BDNF, MIP1a, MCP-1 , RANTES, TARC, Eotaxina e IL-8 a partir de células derivadas de la placenta (Tablas 12-2 y 12-3). No se detectó Ang2, VEGF o PDGF-bb.
Tabla 12-2. Resultados del ensayo ELISA multiplexado Searchlight™ Clave: hFB (fibroblastos humanos), P1 (células derivadas de la placenta (042303)), U1 (células derivadas del ombligo (022803)), P3 (células derivadas de la placenta(071003)), U3 (células derivadas del ombligo (071003)). ND: No detectado.
Tabla 12-3. Resultados del ensayo ELISA multiplexado Searchlight Clave: hFB (fibroblastos humanos), P1 (células derivadas de la placenta (042303)), U1 (células derivadas del ombligo (022803)), P3 (células derivadas de la placenta(071003)), U3 (células derivadas del ombligo (071003)). ND: No detectado.
Resumen. Las células derivadas del ombligo y derivadas de la placenta secretaron varios factores tróficos. Algunos de estos factores tróficos, tales como HGF, bFGF, MCP-1 e IL-8, tienen una participación importante en la angiogénesis. Otros factores tróficos, tales como BDNF e IL-6, tienen una participación importante en la regeneración neural.
Ejemplo 13 Diferenciación neural a corto plazo de células derivadas del tejido del cordón umbilical v de la placenta Se analizó la capacidad de las células derivadas de la placenta y el ombligo para diferenciarse en células de linaje neural.
Materiales y Métodos Aislamiento y expansión de células derivadas del ombligo y la placenta. Las células de tejidos placentarios y umbilicales se aislaron y expandieron tal como se describe en el Ejemplo 1.
Protocolo de Woodbury-Black. (A) Este ensayo se adaptó a partir de un ensayo realizado originalmente para probar el potencial de inducción neural de las células estromales de la médula ósea (1). Las células derivadas del ombligo (022803) P4 y células derivadas de la placenta (042203) P3 se descongelaron y cultivaron expandidas en medio de crecimiento en una cantidad de 5000 células/cm2 hasta alcanzar la subconfluencia (75 %). Después, las células se tripsinizaron y sembraron a 6000 células por pocilio de un portaobjetos de vidrio Titretek II (VWR International, Bristol, CT). Como controles, se sembraron, además, células madre mesenquimales (P3; 1F2155; Cambrex, Walkersville, MD), osteoblastos (P5; CC2538; Cambrex), células adiposas (Artecel, US6555374 B1) (P6; donante 2) y fibroblastos dérmicos humanos neonatales (P6; CC2509; Cambrex) en las mismas condiciones.
Todas las células se expandieron inicialmente por 4 días en medio DMEM/F12 (Invítrogen, Carisbad, CA) que contenía 15 % (v/v) de suero fetal bovino (FBS; Hyclone, Logan, UT), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF; 20 nanogramos/mililitro; Peprotech, Rocky Hill, NJ), factor de crecimiento epidérmico (EGF; 20 nanogramos/mililitro; Peprotech) y penicilina/estreptomicina (Invitrogen). Después de cuatro días, las células se enjuagaron en solución salina regulada con fosfato (PBS; Invitrogen) y, posteriormente, se cultivaron en medio DMEM/F12 + 20 % (v/v) de FBS + penicilina/estreptomicina por 24 horas. Después de 24 horas, las células se enjuagaron con PBS. Después, las células se cultivaron por 1 - 6 horas en un medio de inducción que comprendía DMEM/F12 (libre de suero) que contenia hidroxianisol butilado 200 mM, cloruro de potasio 10 µ?, 5 miligramos/mililitro de insulina, forescolina 10 ?, ácido valproico 4 µ? e hidrocortisona 2 µ? D(todas las sustancias químicas de Sigma, St. Louis, MO). Después, las células se fijaron en metanol al 100 % enfriado en hielo y se realizó la inmunocitoquímica (ver los métodos más abajo) para evaluar la expresión de la proteína nestina humana.
(B) Se descongeló células derivadas (ombligo (022803) P11; placenta (042203) P11) y fibroblastos dérmicos humanos adultos (1F1853, P11) y se expandieron en cultivo en medio de crecimiento en una cantidad de 5000 células/cm2 hasta alcanzar la subconfluencia (75 %). Después, las células se tripsinizaron y sembraron a una densidad similar como en (A), pero sobre (1) 24 placas de pocilios tratadas para cultivo de tejido (TCP, Falcon brand, VWR International), (2) pocilios de TCP + 2 % (p/v) de gelatina adsorbida por 1 hora a temperatura ambiente o (3) pocilios de TCP + 20 pg/mililitro adsorbido de laminina de ratón (adsorbido por un mínimo de 2 horas a 37 °C; Invitrogen).
Exactamente como en (A), las células se expandieron inicialmente y los medios se cambiaron en los marcos de tiempo mencionados anteriormente. Se fijó un conjunto de cultivos, igual que antes, a 5 días y seis horas, esta vez con 4 % de paraformaldehído (p/v) enfriado en hielo (Sigma) por 10 minutos a temperatura ambiente. En el segundo conjunto de cultivos, se eliminó el medio y se cambió a medio de expansión de progenitores neurales (NPE, por sus siglas en inglés) que consiste en medio Neurobasal-A (Invitrogen) que contiene B27 (suplemento B27; Invitrogen), L-glutamina (4 mM) y penicilina/estreptomicina (Invitrogen). El medio NPE se suplemento, además, con ácido retinoico (RA; 1 µ?; Sigma). Este medio se eliminó 4 días después y los cultivos se fijaron con 4 % (p/v) de paraformaldehído (Sigma) enfriado en hielo por 10 minutos a temperatura ambiente y se realizó la tinción para determinar la expresión de proteínas nestina, GFAP y TuJ1 (ver la Tabla 13-1).
Tabla 13-1. Resumen de los anticuerpos primarios usados Anticuerpo Concentración Proveedor Rata 401 (nestina) 1 :200 Chemicon, Temecula, CA Nestina humana 1:100 Chemicon TuJ1 (tubulina Bill) 1:500 Sigma, St. Louis, MO GFAP 1 :2000 DakoCytomation, Carpintería, CA Tirosina hidroxilasa (TH) 1 :1000 Chemicon GABA 1 :400 Chemicon Desmina (ratón) 1 :300 Chemicon Alfa - actina alfa del músculo liso 1 :400 Sigma Proteína nuclear humana (hNuc) 1 :150 Chemicon Protocolo de diferenciación en dos etapas. Se descongelaron células derivadas (ombligo (042203) P11, placenta (022803) P11), fibroblastos dérmicos humanos adultos (P11; 1F1853; Cambrex) y se expandieron por cultivo en medio de cultivo en una cantidad de 5000 células/cm2 hasta alcanzar la subconfluencia (75 %). Después, las células se tripsinizaron y sembraron a 2000 células/cm2, pero sobre 24 placas de pocilios recubiertos con laminina (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) en presencia de medios NPE suplementados con bFGF (20 nanogramos/mililitro; Peprotech, Rocky Hill, NJ) y EGF (20 nanogramos/mililitro; Peprotech) [composición de medio completo mencionada, además, como NPE + F + E]. Al mismo tiempo, los progenitores neurales de rata adulta aislados de hipocampos (P4; (062603), además, se sembraron en placas sobre 24 placas de pocilios recubiertos con laminina en medios NPE + F + E. Todos los cultivos se mantuvieron en esas condiciones por un periodo de 6 días (las células se alimentaron una vez durante ese tiempo) y en ese tiempo los medios se cambiaron a las condiciones de diferenciación enumeradas en la Tabla N1-2 por un periodo adicional de 7 días. Los cultivos se fijaron con 4 % (p/v) de paraformaldehído enfriado en hielo (Sigma) por 10 minutos a temperatura ambiente y se realizó la tinción para determinar la expresión de proteínas nestina, GFAP y TuJ1 en humanos o ratas.
Tabla 13-2. Resumen de condiciones para el protocolo de diferenciación de dos etapas B Protocolo de múltiples factores de crecimiento. Las células derivadas del ombligo (P11 ; (042203)) se descongelaron y expandieron por cultivo en medio de cultivo en una cantidad de 5000 células/cm2 hasta alcanzar la subconfluencia (75 %). Después, las células se tripsinizaron y sembraron a 2000 células/cm2, sobre placas de 24 pocilios recubiertas con laminina (BD Biosciences) en presencia de NPE + F (20 nanogramos/mililitro) + E (20 nanogramos/mililitro). Además, algunos pocilios contenían NPE + F + E + 2 % de FBS o 10 % de FBS. Después de cuatro días de condiciones de "prediferenciación" todos los medios se eliminaron y las muestras se cambiaron a medio NPE suplementado con hedgehog sónico (SHH; 200 nanogramos/mililitro; Sigma, St. Louis, MO), FGF8 (100 nanogramos/mililitro; Peprotech), BDNF (40 nanogramos/mililitro; Sigma), GDNF (20 nanogramos/mililitro; Sigma) y ácido retinoico (1 µ?; Sigma). Siete días después del cambio de medio, los cultivos se fijaron con 4 % (p/v) de paraformaldehído (Sigma) enfriado en hielo por 10 minutos a temperatura ambiente y se realizó la tinción para determinar la expresión de nestina, GFAP, TuJ1 , desmina y actina alfa del músculo liso en humanos.
Protocolo de cocultivo de progenitores neurales. Los progenitores hipocampales de ratas adultas (062603) se sembraron en placas como neuroesferas o células simples (10,000 células/pocilio) sobre platos de 24 pocilios recubiertos con laminina (BD Biosciences) en NPE + F (20 nanogramos/mililitro) + E (20 nanogramos/mililitro).
En forma separada, se descongelaron células derivadas del ombligo (042203) P11 y células derivadas de la placenta (022803) P11 y se expandieron por cultivo en NPE + F (20 nanogramos/mililitro) + E (20 nanogramos/mililitro) en una cantidad de 5000 células/cm2 por un periodo de 48 horas. Después, las células se tripsinizaron y sembraron en una cantidad de 2500 células/pocilio sobre cultivos de progenitores neurales existentes. En ese momento, el medio existente se intercambió por medio fresco. Cuatro días después, los cultivos se fijaron con 4 % (p/v) de paraformaldehído (Sigma) enfriado en hielo por 10 minutos a temperatura ambiente, y se tiñeron para determinar la proteína nuclear humana (hNuc; Chemicon) (Tabla NU1-1 anterior) para identificar las células del tejido del cordón umbilical y células derivadas de la placenta.
Inmunocitoquímica. Se realizó inmunocitoquímica con el uso de los anticuerpos enumerados en la Tabla NU1-1. Los cultivos se lavaron con solución salina regulada con fosfato (PBS) y se expusieron a una solución de bloqueo de proteínas que contenía PBS, 4 % (v/v) de suero de cabra (Chemicon, Temecula, CA) y 0.3 % (v/v) de tritón (Tritón X-100; Sigma) por 30 minutos para acceder a los antígenos intracelulares. Los anticuerpos primarios, diluidos en solución bloqueante se aplicaron después a los cultivos por un periodo de 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las soluciones de anticuerpos primarios se eliminaron y los cultivos se lavaron con PBS antes de la aplicación de soluciones de anticuerpos secundarios (1 hora a temperatura ambiente) que contenían solución bloqueante junto con IgG antiratón de cabra - Texas Red (1 :250; Molecular Probes, Eugene, OR) e IgG anticonejo de cabra - Alexa 488 (1:250; Molecular Probes). Después, los cultivos se lavaron y se aplicó DAPI lO micromoles (Molecular Probes) por 10 minutos para visualizar los núcleos celulares.
Después de la inmunotinción, se visualizó la fluorescencia con el uso del filtro de fluorescencia adecuado en un microscopio epifluorescente invertido Olympus (Olympus, Melville, NY). En todos los casos, la tinción positiva representaba la señal de fluorescencia por encima de la tinción de control, en donde se siguió el procedimiento completo descrito anteriormente, excepto por la aplicación de una solución de anticuerpos primarios. Las imágenes representativas se captaron con el uso de una videocámara de color digital y el programa ImagePro (Media Cybemetics, Carisbad, CA). Para las muestras con triple tinción se tomó cada imagen con el uso de solamente un filtro de emisión por vez. Después, se prepararon los montajes en capas con el uso del programa Adobe Photoshop (Adobe, San José, CA).
Resultados Protocolo de Woodbury-Black. (Woodbury, D. y otros (2000). J Neurosci. Research. 61(4): 364-70). (A) Cuando se hizo la incubación en esta composición de inducción neural, todos los tipos celulares se transformaron en células con morfologías bipolares y procesos extendidos. Se observó, además, otras morfologías no bipolares más grandes. Además, el resultado de las poblaciones celulares inducidas fue positivo en la tinción para nestina, un marcador de células progenitoras y madre neurales multipotentes.
(B) Cuando se repitió en platos de plástico para cultivo de tejido (TCP) no se observó expresión de nestina salvo que la laminina se preadsorbió en la superficie del cultivo. Para evaluar aún más si las células que expresan nestina podrían después avanzar para generar neuronas maduras, las células del tejido del cordón umbilical, las células derivadas de placenta y fibroblastos se expusieron a NPE + RA (1 µ?), una composición de medios que se conoce induce la diferenciación de células progenitoras y madre neurales en tales células (Jang, Y.K. y otros (2004). J. Neurosci. Research. 75(4): 573-84; Jones-Villeneuve, EM. y otros (1983). Mol Cel Biol. 3(12): 2271-9; Mayer-Proschel, M. y otros (1997). Neuron. 19(4): 773-85). Las células se tiñeron para TuJ1 , un marcador para neuronas inmaduras y maduras, GFAP, un marcador de astrocitos y nestina. En las condiciones probadas, no se detectó TuJ1 ni se observaron células con morfología neuronal lo que sugiere que las neuronas no se generaron a corto plazo. Además, la expresión de nestina y GFAP por parte de las células derivadas del ombligo y placenta no continuó, tal como se determinó por inmunocitoquímica.
Diferenciación en dos etapas. Los aislados de ombligo y placenta (así como fibroblastos humanos y progenitores neurales de roedores como tipos celulares de control negativo y positivo, respectivamente) se sembraron en placas sobre platos recubiertos con laminina (promotores neurales) y se expusieron a 13 condiciones de cultivo diferentes (y dos condiciones de control) que se conoce promueven la diferenciación de progenitores neurales en neuronas y astrocitos. Además, se añadieron dos condiciones para examinar la influencia de GDF5 y BMP7 en la diferenciación celular. Generalmente, se asumió un método de diferenciación de dos etapas, en donde las células se colocaron primero en condiciones de expansión de progenitores neurales por un periodo de 6 días, seguido de las condiciones de diferenciación completa por 7 días. Morfológicamente, ambas células derivadas del ombligo y placenta exhibieron cambios fundamentales en la morfología celular durante todo este procedimiento. Sin embargo, no se observaron células con forma de astrocitos o neuronales excepto en las condiciones de sembrado en placas de progenitores neurales, de control. La inmunocitoquímica, negativa para la nestina humana, TuJ1, y GFAP confirmó las observaciones morfológicas.
Múltiples factores de crecimiento. Después de la exposición por una semana a diversos agentes de diferenciación neural, las células se tiñeron para determinar los marcadores indicativos de progenitores neurales (nestina humana), neuronas (TuJ1) y astrocitos (GFAP). Las células cultivadas en la primera etapa en medios sin suero tenían morfologías diferentes a las de las células cultivadas en medio con suero (2 % o 10 %) lo que Índica una diferenciación neural potencial. Específicamente, después de un procedimiento de dos etapas de exposición de células derivadas del ombligo a EGF y bFGF, seguido de SHH, FGF8, GDNF, BDNF y ácido retinoico, las células mostraron procesos extendidos prolongados similares a la morfología de astrocitos cultivados. Cuando se incluyó 2 % de FBS o 10 % de FBS en la primera etapa de diferenciación, la cantidad de células aumentó y la morfología celular no se modificó a partir de cultivos de control a densidad alta. La diferenciación neural potencial no se evidenció por análisis inmunocitoquímico para nestina humana, TuJ1 o GFAP.
Cocultivo de progenitor neural y UTC. Las células derivadas del ombligo y placenta se sembraron en placas sobre cultivos de progenitores neurales de rata sembrados dos días antes en las condiciones de expansión neural (NPE + F + E). Si bien la confirmación visual de células derivadas de placenta y UTC sembradas en placas demostró que estas células se sembraron en placas como células simples, la tinción nuclear específica para humanos (hNuc) 4 días después de la siembra en placas (6 días en total) mostró que tendieron a aglutinarse y evitar el contacto con los progenitores neurales. Además, cuando las UTC se unieron, estas células se dispersaron y parecían estar inervadas por neuronas diferenciadas originadas en ratas lo que sugiere que las UTC pueden haberse diferenciado en células musculares. Esta observación se basó en la morfología identificada por microscopía de contraste de fases. Otra observación fue que, típicamente, los cuerpos celulares grandes (más grandes que los progenitores neurales) tenían morfologías de progenitores neurales con procesos finos que abarcaban direcciones múltiples. La tinción de HNuc (encontrada en la mitad del núcleo de la célula) sugirió que en algunos casos estas células humanas pueden haberse fusionado con progenitores de rata y asumido su fenotipo. Los pocilios de control que contenían solamente progenitores neurales tenían una cantidad de progenitores totales y células aparentemente diferenciadas menor que los pocilios de cocultivo que contenían células derivadas del ombligo o placenta, lo que indica, además, que tanto las células derivadas del ombligo como de la placenta influyeron en la diferenciación y comportamiento de progenitores neurales, ya sea por la liberación de quimocinas y citocinas o por efectos mediados por el contacto.
Resumen. Se realizaron protocolos múltiples para determinar el potencial a corto plazo de las células derivadas de placenta y UTC para diferenciarse en células de linaje neural. Estas incluían la captación de imágenes de contraste de fases de morfología en conjunto con inmunocitoquímica para nestina, TuJ1 y GFAP, proteínas asociadas con células progenitoras y células madre neurales multipotentes, neuronas maduras e inmaduras y astrocitos, respectivamente. Se observó evidencia que sugería que la diferenciación neural se produjo en ciertas instancias en estos protocolos a corto plazo.
Se hicieron varias observaciones notables en cocultivos de UTC y células derivadas de placenta con progenitores neurales. Este método, con el uso de células derivadas de placenta y UTC humanas junto con un tipo de células xenogénicas permitió la determinación absoluta del origen de cada célula en estos cultivos. Primero, se observaron algunas células en estos cultivos, en donde el citoplasma celular se agrandó, con procesos de tipo neurita que se extienden lejos del cuerpo celular, y aun así solamente la mitad del cuerpo está marcada con proteína hNuc. Estas células pueden haber sido células derivadas de placenta y UTC que se habían diferenciado en células de linaje neural o pueden haber sido células derivadas de placenta y UTC que se fusionaron con progenitores neurales. Segundo, aparentemente, los progenitores neurales extendieron las neuritas a células derivadas de placenta y UTC en una forma que indica que los progenitores se diferenciaron en neuronas e inervaron las células derivadas de placenta y UTC. Tercero, los cultivos de progenitores neurales y células derivadas de placenta y UTC tenían más células originadas en rata y una diferenciación mayor que los cultivos de control de los progenitores neurales solos, lo que indica, además, que las células derivadas de placenta y UTC proporcionaron factores solubles y/o mecanismos dependientes del contacto que estimularon la supervivencia, proliferación y/o diferenciación de progenitores neurales.
Ejemplo 14 Diferenciación neural a largo plazo de células derivadas de la placenta y del tejido del cordón umbilical Se evaluó la capacidad de las células derivadas de placenta y ombligo para experimentar diferenciación a largo plazo en células de linaje neural.
Materiales y Métodos Aislamiento y expansión de células. Las células se aislaron y expandieron tal como se describió en ejemplos anteriores.
Descongelamiento y sembrado de células en placas. Se descongelaron alícuotas de células congeladas (ombligo (022803) P11 ; (042203) P11 ; (071003) P12; placenta (101503) P7) cultivadas previamente en medio de cultivo y se sembraron en placas en una cantidad de 5000 células/cm2 en matraces T-75 recubiertos con laminina (BD, Franklin Lakes, NJ) en medio Neurobasal-A (Invitrogen, Carlsbad, CA) que contenía B27 (suplemento B27, Invitrogen), L-glutamina (4 mM) y penicilina/estreptomicina (10 mililitros), la combinación de los cuales se menciona en la presente descripción como medio de expansión de progenitores neurales (NPE). El medio NPE se suplemento, además, con bFGF (20 nanogramos/mililitro, Peprotech, Rocky Hill, NJ) y EGF (20 nanogramos/mililitro, Peprotech, Rocky Hill, NJ), mencionado en la presente descripción como NPE + bFGF + EGF.
Sembrado de células de control en placas. Además, se descongeló fibroblastos dérmicos humanos adultos (P11 , Cambrex, Walkersville, MD) y células madre mesenquimales (P5, Cambrex) y se sembraron en placas con la misma densidad de sembrado celular en matraces T-75 recubiertos con laminina en NPE + bFGF + EGF. Como control adicional, los fibroblastos y las células de ombligo y placenta se cultivaron en medio de crecimiento por el periodo especificado para todos los cultivos.
Expansión de células. Los medios de todos los cultivos se reemplazaron con medio fresco una vez a la semana y se observó las células para determinar la expansión. Generalmente, se realizó el pase de cada cultivo una vez en un periodo de un mes debido al crecimiento limitado en NPE + bFGF + EGF.
Inmunocitoquímica. Después de un periodo de un mes, todos los matraces se fijaron con 4 % (p/v) de paraformaldehído (Sigma) frío por 10 minutos a temperatura ambiente. Se realizó inmunocitoquímica con el uso de anticuerpos dirigidos contra TuJ1 (tubulina Bill; 1 :500; Sigma, St. Louis, MO) y GFAP (proteína acídica fibrilar glial; 1 :2000; DakoCytomation, Carpintería, CA). En síntesis, los cultivos se lavaron con solución salina regulada con fosfato (PBS) y se expusieron a una solución de bloqueo de proteínas que contenía PBS, 4 % (v/v) de suero de cabra (Chemicon, Temecula, CA) y 0.3 % (v/v) de tritón (Tritón X-100; Sigma) por 30 minutos para acceder a los antígenos intracelulares. Los anticuerpos primarios, diluidos en solución bloqueante se aplicaron después a los cultivos por un periodo de 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las soluciones de anticuerpos primarios se eliminaron y los cultivos se lavaron con PBS antes de la aplicación de soluciones de anticuerpos secundarios (1 hora a temperatura ambiente) que contenían solución bloqueante junto con IgG antiratón de cabra - Texas Red (1:250; Molecular Probes, Eugene, OR) e IgG anticonejo de cabra - Alexa 488 (1 :250; Molecular Probes). Después, los cultivos se lavaron y se aplicó DAPI 10 micromoles (Molecular Probes) por 10 minutos para visualizar los núcleos celulares.
Después de la inmunotinción, se visualizó la fluorescencia con el uso del filtro de fluorescencia adecuado en un microscopio epi-fluorescente invertido Olympus (Olympus, Melville, NY). En todos los casos, la tinción positiva representaba la señal de fluorescencia por encima de la tinción de control, en donde se siguió el procedimiento completo descrito anteriormente, excepto por la aplicación de una solución de anticuerpos primarios. Las imágenes representativas se captaron con el uso de una videocámara de color digital y el programa ImagePro (Media Cybernetics, Carlsbad, CA). Para las muestras con triple tinción se tomó cada imagen con el uso de solamente un filtro de emisión por vez. Después, se prepararon los montajes en capas con el uso del programa Adobe Photoshop (Adobe, San José, CA).
Tabla 14-1. Resumen de los anticuerpos primarios usados Anticuerpo Concentración Proveedor TuJ1 (tubulina Bill) 1 :500 Sigma, St. Louis, MO GFAP 1 :2000 DakoCytomation, Carpintería, CA Resultados Medio de NPE + bFGF + EGF muestra proliferación de UTC y altera su morfología. Inmediatamente después del sembrado en placas, un subconjunto de células se unió a los matraces de cultivo recubiertos con laminina. Posiblemente, esto se debió a la muerte celular como una función del proceso de congelamiento/descongelamiento o a las nuevas condiciones de cultivo. Las células que se unieron adoptaron morfologías diferentes a las observadas en el medio de crecimiento.
Una vez que se alcanzó la confluencia, se realizó el pase de los cultivos y se observaron para determinar el crecimiento. Aquellas células que sobrevivieron al pase se expandieron en forma muy limitada. En este punto comenzaron a aparecer células muy pequeñas sin morfología de dispersión y con características de fase clara en cultivos de células derivadas del ombligo. Se hizo el seguimiento de estas áreas del matraz en el tiempo. A partir de estas células pequeñas, emergieron procesos de bifurcación con varicosidades en sus longitudes, características muy similares a los progenitores neurales de PSA-NCAM+ descritos anteriormente y neuronas inmaduras TuJ1+ derivadas del cerebro y la médula espinal (Mayer-Proschel, M. y otros (1997). Neuron. 19(4): 773-85; Yang, H. y otros (2000). PNAS. 97(24): 13366-71). Con el tiempo, estas células crecieron en número, y aun así solamente se encontraron en clones.
Clones de células derivadas del ombligo expresan proteínas neuronales. Los cultivos se fijaron un mes después del descongelamiento/sembrado en placas y se tiñeron para determinar la proteína neuronal TuJ1 y GFAP, un filamento intermedio encontrado en los astrocitos. Si bien todos los cultivos de control se cultivaron en medio de crecimiento y se encontró que los fibroblastos humanos y las MSC cultivadas en medio NPE + bFGF + EGF eran TuJ1-/GFAP-, se detectó TuJ1 en células derivadas del ombligo y placenta. Se observó expresión en células con y sin morfologías de tipo neuronal. No se observó expresión de GFAP en cualquiera de los cultivos. El porcentaje de células que expresan TuJ1 con morfologías neuronales fue menor o igual que 1 % de la población total (n = 3 aislados de células derivadas del ombligo probados). Si bien no se cuantificó, el porcentaje de células TuJ1 + sin morfologías neuronales fue mayor en cultivos de células derivadas del ombligo que en los cultivos de células derivadas de la placenta. Aparentemente, estos resultados eran específicos ya que los controles concordantes con la edad en medio de crecimiento no expresan TuJ1.
Resumen. Se desarrollaron métodos para generar neuronas diferenciadas (basadas en la expresión de TuJ1 y morfología neuronal) a partir de células derivadas del ombligo. Si bien no se analizó la expresión para TuJ1 antes de un mes ¡n vitro, es evidente que al menos una pequeña población de células derivadas del ombligo puede dar lugar a neuronas por medio de diferenciación predeterminada o a través de inducción a largo plazo después de exposición durante un mes a un medio mínimo suplementado con L-glutamina, FGF básico y EGF.
Ejemplo 15 Factores tróficos para el soporte de progenitores neurales Se analizó la influencia de células derivadas del ombligo y placenta en la supervivencia y diferenciación de células progenitoras y células madre neurales adultas a través de mecanismos dependientes de la falta de contacto (tróficas).
Materiales y Métodos Aislamiento de células progenitoras y células madre neurales adultas. Se sacrificó 344 ratas adultas Fisher por asfixia con C02 seguido de dislocación cervical. Se extrajeron los cerebros enteros intactos con el uso de pinzas gubias y el tejido hipocampal se cortó y separó en base a incisiones coronales posteriores a las regiones motoras y somatosensoriales del cerebro (Paxinos, G. y Watson, C. 1997. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates). Se lavó tejido en medio Neurobasal-A (Invitrogen, Carlsbad, CA) que contenía B27 (suplemento B27; Invitrogen), L-glutamina (4 mM; Invitrogen) y penicilina/estreptomicina (Invitrogen), la combinación de los cuales se menciona en la presente descripción como medio de expansión de progenitores neurales (NPE). El medio NPE se suplemento, además, con bFGF (20 nanogramos/mililitro, Peprotech, Rocky Hill, NJ) y EGF (20 nanogramos/mililitro, Peprotech, Rocky Hill, NJ), mencionado en la presente descripción como NPE + bFGF + EGF.
Después del lavado, se extrajeron las meninges subyacentes y el tejido se cortó con un escalpelo. El tejido cortado se recolectó y se añadió tripsina/EDTA (Invitrogen) de modo que constituya 75 % del volumen total. Además, se añadió ADNasa ( 00 microlitros por 8 mililitros de volumen total, Sigma, St. Louis, MO). A continuación, se realizó el pase del tejido/medio en secuencia a través de una aguja de calibre 18, aguja de calibre 20 y, por último, una aguja de calibre 25 una vez a través de cada una (todas las agujas eran de Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). La mezcla se centrifugó por 3 minutos a 250 g. Se eliminó el sobrenadante, se añadió NPE + bFGF + EGF nuevo y el granulo se resuspendió. Se realizó el pase de la suspensión celular resultante a través de un filtro celular de 40 micrómetros (Becton Dickinson), se sembró sobre matraces T-75 recubiertos con laminina (Becton Dickinson) o placas de 24 pocilios de agregado bajo (Becton Dickinson) y se cultivó en medio NPE + bFGF + EGF hasta que se obtuvo una cantidad suficiente de células para los estudios descritos.
Sembrado de células en placas. Las células derivadas (ombligo (022803) P12, (042103) P12, (071003) P12; placenta (042203) P12) cultivadas previamente en medio de crecimiento se sembraron en placas en una cantidad de 5000 células / pocilio accesorio TransweII (con un tamaño adecuado para una placa de 24 pocilios) y se cultivaron por un periodo de una semana en medio de crecimiento en los accesorios para alcanzar la confluencia.
Sembrado de progenitores neurales adultos en placas. Los progenitores neurales, cultivados como neuroesferas o como células simples se sembraron sobre placas de 24 pocilios recubiertos con laminina a una densidad de aproximadamente 2000 células / pocilio en NPE + bFGF + EGF por un periodo de un día para promover la unión celular. Un día después, los accesorios TransweII que contenían células derivadas se añadieron de conformidad con el siguiente esquema: (1) TransweII (células derivadas del ombligo en medio de crecimiento, 200 microlitros) + progenitores neurales (NPE + bFGF + EGF, 1 mililitro) (2) TransweII (células derivadas de placenta en medio de crecimiento, 200 microlitros) + progenitores neurales (NPE + bFGF + EGF, 1 mililitro) (3) TransweII (fibroblastos dérmicos humanos adultos [1F1853; Cambrex, Walkersville, MD] P12 en medio de crecimiento, 200 microlitros) + progenitores neurales (NPE + bFGF + EGF, 1 mililitro) (4) Control: progenitores neurales solamente (NPE + bFGF + EGF, 1 mililitro) (5) Control: progenitores neurales solamente (NPE solo, 1 mililitro) Inmunocitoquímica. Después de 7 días en cocultivo, todas las condiciones se fijaron con 4 % de paraformaldehído (p/v) (Sigma) frío por un periodo de 10 minutos a temperatura ambiente. Se realizó inmunocitoquímica con el uso de anticuerpos dirigidos contra los epítopos enumerados en la Tabla 15-1. En síntesis, los cultivos se lavaron con solución salina regulada con fosfato (PBS) y se expusieron a una solución de bloqueo de proteínas que contenía PBS, 4 % (v/v) de suero de cabra (Chemicon, Temecula, CA) y 0.3 % (v/v) de tritón (Tritón X-100; Sigma) por 30 minutos para acceder a los antígenos intracelulares. Los anticuerpos primarios, diluidos en solución bloqueante se aplicaron después a los cultivos por un período de 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las soluciones de anticuerpos primarios se eliminaron y los cultivos se lavaron con PBS antes de la aplicación de soluciones de anticuerpos secundarios (1 hora a temperatura ambiente) que contenían solución bloqueante junto con IgG antiratón de cabra - Texas Red (1:250; Molecular Probes, Eugene, OR) e IgG anticonejo de cabra - Alexa 488 (1:250; Molecular Probes). Después, los cultivos se lavaron y se aplicó DAPI lO micromoles (Molecular Probes) por 10 minutos para visualizar los núcleos celulares.
Después de la inmunotinción, se visualizó la fluorescencia con el uso del filtro de fluorescencia adecuado en un microscopio epi-fluorescente invertido Olympus (Olympus, Melville, NY). En todos los casos, la tinción positiva representaba la señal de fluorescencia por encima de la tinción de control, en donde se siguió el procedimiento completo descrito anteriormente, excepto por la aplicación de una solución de anticuerpos primarios. Las imágenes representativas se captaron con el uso de una videocámara de color digital y el programa ImagePro (Media Cybernetics, Carisbad, CA). Para las muestras con triple tinción se tomó cada imagen con el uso de solamente un filtro de emisión por vez. Después, se prepararon los montajes en capas con el uso del programa Adobe Photoshop (Adobe, San José, CA).
Tabla 15-1. Resumen de los anticuerpos primarios usados Anticuerpo Concentración Proveedor Rata 401 (nestina) 1 :200 Chemicon, Temecula, CA TuJ1 (tubulina Bill) 1 :500 Sigma, St. Louis, MO Tirosina hidroxilasa (TH) 1 :1000 Chemicon GABA 1 :400 Chemicon GFAP 1 :2000 DakoCytomation, Carpinteria, CA Proteína básica de mielina ( BP) 1 :400 Chemicon Análisis cuantitativo de la diferenciación de progenitores neurales. Se analizó la cuantificación de la diferenciación de progenitores neurales hipocampales. Se contó un mínimo de 1000 por condición o en caso de ser menor, la cantidad total de células observadas en esa condición. El porcentaje de células positivas para una mancha positiva se evaluó por medio de la división de la cantidad de células positivas por la cantidad total de células según se determinó por tinción con DAPI (nuclear).
Análisis por espectrometría de masa y electroforesis en gel 2D. Para identificar factores únicos secretados como un resultado del cocultivo, las muestras de medios acondicionados tomadas antes de la fijación del cultivo se congelaron a -80 °C de la noche a la mañana. Después, las muestras se aplicaron a dispositivos de centrifugado para ultrafiltración (peso molecular de corte: 30 kD). El producto retenido se aplicó a cromatografía por inmunoafinidad (anti-Hu-albúmina; IgY) (la inmunoafinidad no eliminó la albúmina de las muestras). El filtrado se analizó por MALDI. El pasaje se aplicó a cromatografía por afinidad Cibachron Blue. Las muestras se analizaron por medio de SDS-PAGE y electroforesis 2D en gel.
Resultados El cocultivo de células derivadas estimula la diferenciación de progenitores neurales adultos. Después del cultivo con células derivadas del ombligo o placenta, las células progenitoras neurales cocultivadas derivadas de hipocampos de ratas adultas exhibieron una diferenciación significativa en los tres linajes principales en el sistema nervioso central. Este efecto se observó claramente después de cinco días en cocultivo, con numerosos procesos complejos de elaboración de células y con la pérdida de sus rasgos de fase clara característicos de la división de células progenitoras. Por el contrario, los progenitores neurales cultivados solos en ausencia de bFGF y EGF parecían ser no saludables y la supervivencia fue limitada.
Después de completar el procedimiento, se realizó la tinción de los cultivos para determinar los marcadores indicativos de células madre y células progenitores (nestina) no diferenciadas, neuronas inmaduras y maduras (TuJ1), astrocitos (GFAP) y oligodendrocitos maduros (MBP). La diferenciación en los tres linajes se confirmó mientras las condiciones de control no exhibieron una diferenciación significativa tal como se evidenció por la retención de tinción positiva a la nestina entre la mayoría de las células. Si bien tanto las células derivadas del ombligo como las derivadas de la placenta indujeron la diferenciación celular, el grado de diferenciación para los tres linajes fue menor en cocultivos con células derivadas de placenta que en cocultivos con células derivadas del ombligo.
Se cuantificó el porcentaje de progenitores neurales diferenciados después del cocultivo con células derivadas del ombligo (Tabla 15-2). Las células derivadas del ombligo mejoraron significativamente la cantidad de oligodendrocitos maduros (MBP) (24.0 % contra 0 % en ambas condiciones de control). Además, el cocultivo mejoró la cantidad de astrocitos GFAP+ y neuronas TuJ1+ en cultivo (47.2 % y 8.7 %, respectivamente). Estos resultados se confirmaron por tinción con nestina lo que indica que se perdió el estado progenitor después del cocultivo (13.4 % comparado con 71.4 % en la condición de control 4).
Además, aunque aparentemente los fibroblastos humanos adultos afectaban la diferenciación, dichas células no lograron promover la diferenciación de oligodendrocitos maduros ni generar una cantidad apreciable de neuronas. Sin embargo, si bien no se cuantificaron, los aparentemente, mejoran la supervivencia de progenitores neurales.
Tabla 15-2. Cuantificación de la diferenciación de progenitores en el cocultivo de control comparado con el cocultivo en Transwell con células derivadas del ombligo (E=EGF, F=bFGF) Anticuerpo F+E / Umb F+E/F+E F+E/eliminado [Cond.1] [Cond. 4] [Cond. 5] TuJ1 8.7 % 2.3 % 3.6 % GFAP 47.2 % 30.2 % 10.9 % MBP 23.0 % 0 % 0 % Nestina 13.4 % 71.4 % 39.4 % Identificación de compuestos únicos. Se analizó el medio acondicionado de cocultivos derivados de ombligo y placenta en conjunto con los controles adecuados (medio NPE ± 1.7 % de suero, medio de cocultivo con fibroblastos) para determinar las diferencias. Se identificaron compuestos potencialmente únicos y se extrajeron a partir de sus geles 2D respectivos.
Resumen. El cocultivo de células progenitoras neurales adultas con células derivadas del ombligo o placenta produce la diferenciación de esas células. Los resultados presentados en este ejemplo indican que la diferenciación de células progenitoras neurales adultas después del cocultivo con células derivadas del ombligo es particularmente significativa. Específicamente, se generó un porcentaje significativo de oligodendrocitos maduros en cocultivos de células derivadas del ombligo. En vista de la falta de contacto entre las células derivadas del ombligo y los progenitores neurales, este resultado parece ser una función de factores solubles liberados a partir de las células derivadas del ombligo (efecto trófico).
Se realizaron otras diversas observaciones. Primero, la condición de control en la cual se eliminó EGF y bFGF exhibió una cantidad muy baja de células. La mayoría de las células murieron y en promedio había aproximadamente 100 células o menos por pocilio. Segundo, se espera encontrar una diferenciación mínima en la condición de control en la cual se retuvo EGF y bFGF en el medio durante todo el tiempo, ya que normalmente este es un medio de expansión. Si bien se observó que aproximadamente 70 % de las células retuvo el estado progenitor (nestina+), aproximadamente 30 % eran GFAP+ (indicativo de astrocitos). Posiblemente, esto se debe a que dicha expansión significativa se produjo durante todo el transcurso del procedimiento y que el contacto entre los progenitores indujo esta diferenciación (Song, H. y otros 2002. Nature 417(6884): 39-44).
Ejemplo 16 Transplante de células derivadas del ombligo y la placenta Las células derivadas del ombligo y placenta son útiles para terapias de regeneración. Se evaluó el tejido producido por células derivadas de placenta y del tejido del cordón umbilical transplantadas en ratones SCID con un material biodegradable. Se evaluaron los siguientes materiales: tela no tejida Vicryl, espuma 35/65 PCL/PGA e hidrogel de péptido autoensamblante RAD 16.
Métodos y Materiales Cultivo de células. Las células derivadas de la placenta y ombligo se cultivaron en medio de cultivo (DMEM con bajo contenido de glucosa (Gibco, Carlsbad CA), 15 % (v/v) de suero fetal bovino (núm. de cat. SH30070.03; Hyclone, Logan, UT), 0.001 % (v/v) de betamercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO), penicilina/estreptomicina (Gibco)) en matraces recubiertos con gelatina.
Preparación de la muestra. Se sembró un millón de células viables en 15 microlitros de medio de crecimiento sobre estructuras de tela no tejida Vicryl de 5 mm de diámetro, 2.25 mm de espesor (64.33 miligramos/cc; lote núm. 3547-47-1) o espuma de 35/65 PCL/PGA de 5 mm de diámetro (lote núm. 3415-53). Se dejó que las células se unieran por dos horas antes de añadir medio de crecimiento adicional para cubrir las estructuras. Las células se cultivaron en estructuras de la noche a la mañana. Además, las estructuras sin células se incubaron en medio.
Se obtuvo péptidos autoensamblantes RAD16 (3D Matrix, Cambridge, MA en virtud de un acuerdo de transferencia de material) como una solución estéril al 1 % (p/v) en agua que se mezcló 1 :1 con 1 x 106 células en sacarosa al 10 % (p/v) (Sigma, St Louis, MO), HEPES 10 mM en medio modificado de Dulbecco (DMEM; Gibco) inmediatamente antes del uso. La concentración de células final en hidrogel RAD16 fue de 1 x 106 células/100 microlitros.
Material de prueba (N=4/Rx) 1. Tela no tejida Vicryl + 1 x 106 células derivadas del ombligo 2. Espuma 35/65 PCL/PGA + 1 x 106 células derivadas del ombligo 3. Péptido autoensamblante RAD 16 + 1 x 106 células derivadas del ombligo 4. Tela no tejida Vicryl + 1 x 106 células derivadas de la placenta 5. Espuma 35/65 PCL/PGA + 1 x 10e células derivadas de la placenta 6. Péptido autoensamblante RAD 16 + 1 x 106 células derivadas de placenta 7. Espuma 35/65 PCL/PGA 8. Tela no tejida Vicryl Preparación de los animales. Los animales se manipularon y mantuvieron de conformidad con los requerimientos de la Ley de bienestar animal. Las leyes públicas anteriores se cumplieron por medio de la adhesión a las reglamentaciones de bienestar animal (9 CFR) y el cumplimiento de las normas actuales estipuladas en la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, séptima edición.
Ratones (Mus Musculus)/Fox Chase SCID/Machos (Harían Sprague Dawley, Inc., Indianapolis, Indiana), 5 semanas de edad. Toda la prueba de los ratones SCID se realizó debajo de una campana. Se pesó cada ratón y se los anestesió con una inyección intraperitoneal de una mezcla de 60 miligramos/kg de KETASET (clorhidrato de ketamina, Aveco Co., Inc., Fort Dodge, lowa) y 10 miligramos/kg de RO PUN (xilazina, Mobay Corp., Shawnee, Kansas) y solución salina. Después de la inducción de la anestesia, toda la parte posterior del animal desde el área cervical dorsal hasta el área lumbosacra dorsal se sujetó, sin pelo, con sujetadores libre de pelo con el uso de sujetadores eléctricos para animales. Después, el área se limpió con diacetato de clorhexidina, se enjuagó con alcohol, se secó y se pintó con una solución de yodóforo acuosa disponible con yodo al 1 %. Se aplicó pomada oftálmica en los ojos para evitar que el tejido se seque durante el período de anestesia.
Técnica de implantación subcutánea. Se realizaron cuatro incisiones en la piel, cada una con una longitud de aproximadamente 1.0 cm en el dorso de los ratones. Dos sitios craneales se ubicaron transversalmente sobre la región torácica lateral dorsal, aproximadamente 5 mm caudales al borde inferior palpado de la escápula, uno a la izquierda y uno a la derecha de la columna vertebral. Otros dos se colocaron transversalmente sobre el área muscular del glúteo en el nivel sacro-lumbar caudal, aproximadamente 5 mm caudales a la cresta ilíaca palpada, uno en cada lado de la línea media. Los implantes se colocaron aleatoriamente en estos sitios de conformidad con el diseño del experimento. La piel se separó del tejido conectivo subyacente para formar un bolsillo pequeño y el implante se colocó (o inyectó para RAD16) aproximadamente a 1 cm caudal a la incisión. El material de prueba adecuado se implantó en el espacio subcutáneo. La incisión en la piel se cerró con sujetadores metálicos.
Alojamiento de los animales. Los ratones se alojaron individualmente en jaulas microaislantes durante el transcurso del estudio en un intervalo de temperatura de 17.8 °C - 26.1 °C (64 °F - 79 °F) y una humedad relativa de 30 % a 70 % y se mantuvieron en un ciclo de aproximadamente 12 horas de luz/12 horas de oscuridad. En lo posible, la temperatura y humedad relativa se mantuvieron dentro de los intervalos mencionados. Se alimentó a los animales con Irradiated Pico Mouse Chow 5058 (Purina Co.) y el agua se proporcionó libremente.
Se aplicó eutanasia en los ratones en los intervalos asignados por medio de inhalación de dióxido de carbono. Se extirpó los sitios de implante subcutáneo con la piel suprayacente y se congelaron para histología.
Histología. La piel extirpada con el implante se fijó con formalina regulada neutra al 10 % (Richard-Alian Kalamazoo, MI). Las muestras con tejido suprayacente y adyacente se bisecaron centralmente, se procesaron con parafina y se incorporaron en la superficie cortada con el uso de métodos de rutina. Se obtuvo secciones de tejido de cinco micrómetros por medio de un micrótomo y se realizó la tinción con hematoxilina y eosina (Poly Scientific Bay Shore, NY) con el uso de métodos de rutina.
Resultados Se produjo crecimiento del tejido hacia el interior mínimo en las espumas (sin células) implantadas subcutáneamente en ratones SCID después de 30 días. En contraposición se produjo un amplio relleno de tejido en espumas implantadas con células derivadas del ombligo o células derivadas de placenta. Se observó cierto crecimiento de tejido hacia el interior en estructuras de tela no tejida Vicryl. Las estructuras de tela no tejida sembradas con células derivadas del ombligo o placenta mostraron un aumento en la deposición de matriz y vasos sanguíneos maduros.
Resumen. Se sembró discos de tela no tejida/espuma absorbibles sintéticos (5.0 mm de diámetro x 1.0 mm de espesor) o hidrogel de péptidos autoensamblantes con células derivadas de ombligo o placenta humana y se implantaron subcutáneamente en forma bilateral en la región de la espina dorsal de ratones SCID. Los resultados demostraron que las células posteriores al parto podrían aumentar drásticamente la formación de tejido de buena calidad en estructuras biodegradables.
Ejemplo 17 Uso de células derivadas de placenta y del tejido del cordón umbilical en la reparación de nervios Las lesiones de células ganglionares retínales (RGC, por sus siglas en inglés) se han usado ampliamente como modelos para varias estrategias de reparación en el SNC de mamíferos adultos. Se ha demostrado que la sección retrobulbar de axones de RGC de roedores adultos resulta en abortos (Zeng BY y otros J. Anat. 186:495-508 (1995)) y la muerte progresiva de la población de células genitoras (Villegas-Perez y otros, J Neurosci.8:265-80 (1988)). Varios estudios han demostrado los efectos estimulantes de diversos factores exógenos y endógenos en la supervivencia de RGC axotomizados y la regeneración de sus axones (Yip and So, Prog Retín Eye Res. 19: 559-75 (2000); Fischer D y otros Exp Neurol. 172: 257-72 (2001)). Además, otros estudios han demostrado que los trasplantes celulares pueden usarse para promover la regeneración de varios axones nerviosos (Li y otros, 2003; Ramon-CuetoA. y otros, Neuron 25: 425-35 (2000)). Por lo tanto, estos y otros estudios han demostrado que la terapia basada en células se puede usar para el tratamiento de trastornos neurales que afectan la médula espinal, nervios periféricos, nervios pudendos, nervios ópticos y otras enfermedades/trauma debido a lesión en la cual se puede producir daño nervioso.
Los péptidos autoensamblantes (PuraMatrix™, patentes de los Estados Unidos núms. 5,670,483, 5,955,343, solicitud del PCT núm. US2002/0160471 , patente núm. WO 02/062969) se han desarrollado para actuar como una estructura para la unión celular para encapsular células en 3-D, células de placas en recubrimientos 2-D o como microportadores en cultivos de suspensión. Para el cultivo celular tridimensional ha sido necesario usar materiales derivados de animales (extracto de sarcoma de ratón) con sus cuestiones inherentes de reproductibilidad y señalización celular o estructuras sintéticas mucho más grandes, que no logran acercarse a la escala nanométrica física y los atributos químicos de la ECM nativa. RAD 16 (NH2-(RADA)3-COOH) y KLD (NH2-(KLDL)3-COOH) se sintetizan en fragmentos oligopeptídicos pequeños (RAD16 es 5 nanometros) que se autoensamblan en nanofibras en una escala similar a la matriz extracelular in vivo (ECM) (3D Matrix, Inc Cambridge, MA). El autoensamble se inicia por medio de cationes mono y divalentes encontrados en medios de cultivo o el entorno fisiológico. En los protocolos descritos en este ejemplo se usó RAD 16 como un microportador para la implantación de células derivadas de placenta y del tejido del cordón umbilical en el defecto ocular. En este ejemplo, se demuestra que los trasplantes de células derivadas de placenta y de tejido del cordón umbilical pueden proporcionar eficacia en un modelo de regeneración axonal del nervio óptico de rata adulta.
Métodos y Materiales Células. Los cultivos de células derivadas de placenta y del ombligo y células fibroblastos de humanos adultos (pase 10) se expandieron para 1 pase. Todas las células se sembraron inicialmente en una cantidad de 5000 células/cm2 en matraces T75 recubiertos con gelatina en medio de crecimiento con 100 unidades por mililitro de penicilina, 100 microgramos por mililitro de estreptomicina, 0.25 microgramos por mililitro de anfotericina B (Invitrogen, Carlsbad, CA). En el pase 11, las células se tripsinizaron y se determinó la viabilidad con el uso de tinción con azul tripán. En síntesis, se combinó 50 microlitros de suspensión celular con 50 microlitros de 0.04 % p/v de azul tripán (Sigma, St. Louis MO) y la cantidad de células viables se calculó con el uso de un hemocitómetro. Después, las células se lavaron tres veces en medio sin suplemento L-15 de Leibovitz (Invitrogen, Carlsbad, CA). Después, las células se suspendieron a una concentración de 200,000 células en 25 microlitros de RAD-16 (3DM Inc., Cambridge, MA) que se reguló y se transformó en isotónico según las recomendaciones del fabricante. Se añadió cien microlitros de medio sin suplemento L-15 de Leibovitz encima de la suspensión de células/matriz para mantenerla húmeda hasta el uso. Estos cultivos de células/matriz se mantuvieron en condiciones atmosféricas estándar hasta que se realizó el trasplante. El exceso de medio se eliminó en el momento del trasplante.
Animales y cirugía. Se usaron ratas hembra Long Evans (peso corporal 220-240 gramos). Bajo anestesia con tribromoetanol ¡ntraperitoneal (peso corporal 20 miligramos/100 gramos) se expuso el nervio óptico y se cortó la vaina óptica intraorbitalmente a aproximadamente 2 milímetros del disco óptico, el nervio se levantó de la vaina para realizar la transección final con tijeras finas (Li Y y otros, 2003, J. of Neuro. 23(21 ):7783-7788). La observación visual de la separación total de los muñones proximal y distal permitió confirmar que la transección se había completado. El grupo de control consistió de ratas con lesiones sin trasplantes. En las ratas trasplantadas se insertaron células posteriores al parto cultivadas en RAD-16 entre los muñones proximal y distal con el uso de un par de microfórceps. Se implantó aproximadamente 75,000 células en RAD-16 en el nervio óptico cortado. La célula/matriz se esparció en el corte con el uso de un par de microfórceps finos. Se cerró la vaina cortada del nervio óptico con nailon monofilamento negro 10/0 (Ethicon, Inc., Edinburgh, Reino Unido). Por lo tanto, el espacio se cerró por el arrastre de los extremos proximal y distal del nervio uno hacia el otro.
Después de las inyecciones celulares, se inyectó a los animales dexametasona (2 miligramos/kilogramo) por 10 días después del trasplante.
Durante todo el estudio los animales se mantuvieron con ciclosporina oral A (210 miligramos/litro de agua potable; concentración sanguínea resultante: 250-300 microgramos/litro) (Bedford Labs, Bedford, Ohio) desde 2 días previos al trasplante hasta el final del estudio. Los alimentos y el agua estaban disponibles libremente. Se sacrificó a los animales a los 30 o 60 días posteriores al trasplante.
Aplicación de CTB. Tres días antes de sacrificar a los animales, bajo anestesia, se insertó una micropipeta de vidrio con una punta de 30-50 milímetros tangencialmente a través de la escalera detrás de la lente y se inyectó dos alícuotas de 4-5 microlitros de una solución acuosa de la subunidad B de la toxina del cólera (CTB, por sus siglas en inglés) retrógrada al 1 % (List Biologic, Campbell, CA) en el vitreo. Se realizó la perfusión de los animales con fijador y los nervios ópticos se recolectaron en el mismo fijador por 1 hora. Los nervios ópticos se transfirieron a sacarosa de la noche a la mañana. Se incubó secciones del criostato de veinte micrómetros en glicina 0.1 moles por 30 minutos y se bloquearon en una solución de PBS que contenía 2.5 % de albúmina sérica bovina (BSA) (Boeringer Mannheim, Mannheim, Alemania) y 0.5 % de tritón X-100 (Sigma, St. Louis, MO), seguido de una solución que contenía anticuerpo anti-CTB de cabra (List Biologic, Campbell, CA) diluida 1:4000 en una PBS que contenía 2 % de suero de conejo normal (NRS) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 2.5 % de BSA y 2 % de Tritón X-100 (Sigma, St. Louis, MO) en PBS, y se incubó en anticuerpo IgG anticabra de conejo biotinilado (Vector Laboratories, Burlinghame, CA) diluido 1 :200 en 2 % de Triton-X100 en PBS por 2 horas a temperatura ambiente. Después de eso se realizó la tinción en 1:200 de estreptavidina-verde (Alexa Flour 438; Molecular Probes, Eugene, OR) en PBS por 2 horas a temperatura ambiente. Después, las secciones manchadas se lavaron en PBS y se contramancharon con yoduro de propidio para la microscopía confocal.
Preparación de histología. En síntesis, 5 días después de la inyección de CTB se realizó la perfusión de las ratas con 4 % de paraformaldehído. Se suministró a las ratas 4 centímetros cúbicos de uretano y, después, se perfusionaron con PBS (0.1 moles), después, con 4 % de paraformaldehído. La medula espinal se cortó y se extrajo el hueso de la cabeza de modo que el colículo quedara expuesto. Después, el colículo se extrajo y se colocó en 4 % de paraformaldehído. Se extrajo el ojo por medio del corte alrededor de la parte externa del ojo y se avanzó lo máximo posible. Con cuidado se intentó no cortar el nervio óptico que está en la parte inferior del ojo. Se extrajo el ojo y los músculos se cortaron de modo que el nervio óptico quedó expuesto, y este se colocó, después, en 4 % de paraformaldehído.
Resultados Solamente lesiones. Un mes después del corte retrotubular del nervio óptico se identificó varios axones marcados con CTB en el segmento nervioso unido a la retina. En los 200 micrómetros más cercanos al corte se observó que los axones emiten varios colaterales a ángulos rector con respecto al eje principal y terminan como una maraña neuromatosa en la superficie cortada. En este corte entre los muñones proximal y distal se observó que la separación tenía puentes progresivos constituidos por un segmento de tejido conectivo vacularizado de 2-3 milímetros; sin embargo, no se observó el avance de axones a esta área de puentes. Por lo tanto, no se observó crecimiento para alcanzar el muñón distal en los animales que solo recibieron lesiones.
Transplante de RAD-16. Después del trasplante de RAD-16 en el corte se observó un crecimiento hacia el interior visible del tejido conectivo vascularizado. Sin embargo, no se observó crecimiento axonal hacia el interior entre los muñones proximal y distal. Los resultados demuestran que la aplicación de RAD-16 solamente no es suficiente para inducir la regeneración axonal en esta situación.
Trasplante de células derivadas de placenta o del tejido del cordón umbilical. El trasplante de células al nervio óptico cortado estimuló el recrecimiento del nervio óptico. Además, se observó cierto recrecimiento en condiciones en las cuales se implantó células fibroblastos, si bien ese recrecimiento fue mínimo en comparación con el observado cuando se usaron las células derivadas de placenta transplantadas. Se observó recrecimiento del nervio óptico en 4/5 animales trasplantados con células derivadas de placenta, 3/6 animales trasplantados con fibroblastos dérmicos adultos y en 1/4 animales trasplantados con células derivadas del ombligo. En situaciones en las cuales se observó recrecimiento, el marcado con CTB confirmó la regeneración de axones celulares ganglionales retínales que, se demostró, penetran a través del área de trasplante. Además, se realizó marcado con GFAP para determinar el nivel de cicatrices gliales. La expresión de GFAP se intensificó en el muñón proximal con cierta inmunotinción observada a través del injerto reinervado.
Resumen. Estos resultados demuestran que las células del tejido del cordón umbilical y placenta de humanos adultos pueden estimular y guiar la regeneración de los axones celulares ganglionales retínales.
Ejemplo 18 Uso de células derivadas del ombligo y placenta en la reparación del nervio dopaminérgico Se probó células derivadas de ombligo y placenta después del parto para determinar su capacidad para impartir mejoras funcionales en roedores con lesiones en 6-hidroxidopamina (6-OHDA) como modelo para tratar la enfermedad neurodegenerativa, tal como la enfermedad de Parkinson (Eisenhofer, G. y otros (2003) FASEB J. 17L1248-1255; Rios M. y otros (1999) J. Neurosa. 1999:3519-26; Xu Y. y otros (1998) J. Neurosci. Res. 54:691-7).
Métodos y Materiales Modelos y agrupamientos de animales. Las lesiones neuroquímicas intraparenquimales del estriato, SNc o ruta nigrostriatal por 6-hidroxidopamina (6-OHDA) se usa comúnmente como un modelo de roedor confiable para la enfermedad de Parkinson. La 6-OHDA destruye las neuronas dopaminérgicas lo que lleva al desarrollo del Parkinson. Se adquirió ratas Sprague-Dawley hembra de dos meses de edad (275-300 g) que se lesionarían con 6-OHDA en el haz prosencefálico medial para inducir un fenotipo parquisoniano, directamente de Charles River Laboratories (Montreal, Canadá).
Una vez recibidos, se esperó una semana para que los animales se habituaran antes del trasplante y se dejó que se alimentaran libremente durante todo el periodo experimental excepto durante el ayuno requerido por la prueba de alcance de la pata descrita más abajo. Se alojó a dos ratas por jaula, se monitorearon diariamente para registrar la variación en el peso y se probaron durante la fase de luz de un ciclo 12:12 h luz:oscuridad. Se cuidó a los animales y se realizaron experimentos de conformidad con la Guía canadiense para el cuidado y uso de animales de laboratorio y todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado Animal de la Universidad Laval (Institutional Animal Care Committee of Laval University). Se evaluó las deficiencias de comportamiento asociado con la lesión 6-OHDA a las dos semanas y media posteriores a la cirugía por la prueba con apomorfina.
Se usó puntajes rotativos para asignar los animales a cuatro grupos. Dos investigadores que participaron en este estudio realizaron un injerto ciego. Se injertó a tres grupos con distintos tipos celulares (n=18 por tipo celular; desconocidos para el grupo de investigación) y un grupo recibió vehículo (medio de cultivo celular) y se usó como control (n=6). Las ratas se sacrificaron a las 4, 8 y 16 semanas después del trasplante (n=6 por tipos celulares y n=2 control en cada punto temporal). Antes de cada sacrificio se evaluó a las ratas periódicamente con el uso de tres medidas del comportamiento: prueba con apomorfina, prueba de alcance de la pata y giros de la cabeza.
Trasplantes de células. Se expandió cultivos de células derivadas del ombligo, derivadas de la placenta y fibroblastos (originales) (pase 10) para un pase. Todas las células se sembraron inicialmente en una cantidad de 5000 células/cm2 en matraces T75 recubiertos con gelatina en medio de crecimiento. Para los pases posteriores, todas las células se trataron de la siguiente manera. Después de la tripsinización, las células viables se contaron después de la tinción con azul tripán para determinar la viabilidad. En síntesis, se combinó 50 microlitros de suspensión celular con 50 microlitros de azul tripán (Sigma, St. Louis MO) y la cantidad de células viables se calculó con el uso de un hemocitómetro. Las células se tripsinizaron y lavaron tres veces en medio DMEM con bajo contenido de glucosa (Invitrogen, Carlsbad, CA) (este medio está libre de suero y de suplemento). Los cultivos de células derivadas del ombligo, derivadas de la placenta y fibroblastos humanos (pase 11) se tripsinizaron y lavaron dos veces en medio L-15 de Leibovitz (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células (2 X 105 células por inyección) se resuspendieron en 2 microlitros de medio L-15 de Leibovitz (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Cirugía de los animales. Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con los protocolos aprobados por IACUC (Centre de Recherche du CHUL, Local RC-9800, 2705 Blvd Laurier, Ste-Foy, Quebec, Canadá G1V 4G2). El trasplante se realizó bajo anestesia con ketamina/xilazina (75/10 mg/kg de i.p.) con los animales colocados sobre un marco estereotáxico para animales pequeños (modelo 900, David Kopf Instruments, Tujunga, CA). Cada trasplante se realizó por la infusión de las células a través de una agua biselada de acero inoxidable de calibre 26 (45°) unida a una microjeringa de 5 µ? (Hamilton Company, Reno, NV) montada en una bomba de infusión de unidad de microinyección motorizada (modelo UMPII, David Kopf Instruments, Tujunga, CA). Las células (o el medio de cultivo) se infundieron en el estriato a una velocidad de 1.0 µ?/min/sitio a una concentración promedio de 100,000 células/µ? para un total de 2 µ? por animal de conformidad con las siguientes coordenadas (cuando la concentración era menor, el volumen de inyección se ajustó para trasplantar consistentemente la misma cantidad de células en todos los animales): A= 0.5 mm anterior a la bregma, L= 3.0 mm lateral a la línea media, V= -4.7 mm (sitio 1) y -4.5 mm (sitio 2) vertical debajo de la duramadre, con la barra incisora configurada a -2.5 mm por debajo de la línea interaural. Una vez completada la inyección celular, la aguja se dejó en el lugar por otros 3 min para permitir la difusión de las células antes de la retracción de la aguja. Las ratas se trataron con 30 mg/kg de ciclosporina A (CsA 25 mg/ml diluido en aceite de oliva, Bedford Laboratories, Bedford, OH) un día antes del trasplante y recibieron 15 mg/kg/día de CsA para el periodo restante del experimento por medio de inyección subcutánea (s.c). Los animales útiles como controles no recibieron CsA. Todos los animales recibieron 10 mi de lactato y 0.03 mg/kg de buprenorfina antes de la cirugía como tratamiento previo a la operación y dos veces al día (lactato una vez al día) por tres días después de la cirugía.
Prueba de comportamiento de rotación con apomorfina. Las ratas se probaron inicialmente dos semanas y media antes del trasplante y, posteriormente, 2 días antes de sacrificarlas (4, 8 y 16 semanas posteriores al trasplante). Cada rata recibió una dosis de 0.05 mg/kg por inyección i.p. y se colocó inmediatamente en el aparato para la prueba con apomorfina (tazón esférico). Un arnés que consistía de un elástico colocado alrededor del pecho de la rata justo detrás de los codos, se une por medio de un sujetador Velero a una soga aproximadamente a 40.6 cm (16 pulgadas) adosada a un rotámetro conectado a una computadora para registrar la cantidad total de giros corporales completos realizados por la rata y la dirección de rotación (Rotometer System, San Diego Instruments, San Diego, CA). El puntaje final usado para el análisis se obtuvo por medio de la resta de la cantidad total de vueltas ipsilaterales a partir de la cantidad total de giros contralaterales. Se realizó el análisis estadístico por mediciones repetidas con el uso de AIMOVA (programa de estadísticas de SAS).
Giros de la cabeza. Se probó a los animales antes del trasplante para establecer los valores iniciales y, después, se probaron cada dos semanas posteriores al trasplante. Cada rata se probó con respecto a la posición de la cabeza relativa al cuerpo por 60 segundos cada cinco minutos tres veces por prueba. La cantidad total de desviaciones de cabeza de su cabeza (una desviación mayor que 10° se consideró como un giro de la cabeza) se registró para los lados izquierdo y derecho separadamente y la cantidad promedio de giros por minuto en tres minutos se calculó para ambos lados. Se realizó la evaluación independientemente de la actividad de la rata, incluida la cría y el acicalamiento. La diferencia entre la cantidad promedio de giros a la izquierda y a la derecha se calculó para determinar la recuperación del comportamiento y se realizaron mediciones ANOVA repetidas al igual que para la prueba con apomorfina.
Prueba de alcance de la pata. Se evaluó la capacidad de alcance de la pata de la extremidad anterior a las 4, 8 y 16 semanas posteriores al trasplante por medio de un protocolo publicado anteriormente (Moore y otros, 2001 Exp Neurol. 2001 172(2):363-76). El aparato está compuesto por un recipiente de vidrio Plexiform que tiene dos compartimentos. La cámara principal (300 mm de largo X 1 15 mm de alto X 103 mm de ancho) dentro de la cual se coloca la rata tiene otro componente corredizo con orificios de aire. Una sección más angosta conduce fuera de esta cámara (185 mm X 115 mm X 60 mm) y contiene una plataforma central de 22 mm de ancho que se extiende a lo largo de su longitud a una altura de 62 mm. En ambos lados de la plataforma hay una artesa de 19 mm, en la cual se ubica una escalera de siete peldaños. La rata trepa sobre la plataforma y recolecta gránulos de alimentos de 45 mg de pocilios pequeños dentro de cada peldaño. La plataforma sobre la cual la rata trepa es suficientemente angosta para evitar que la rata de vueltas y alcance la artesa derecha con la pata izquierda o viceversa. Para asegurar que la rata no raspe simplemente los gránulos de alimentos hasta el lado de la plataforma, la parte superior de la plataforma cuelga 5 mm a cada lado (Moore y otros, 2001). Esta versión de la prueba se realiza durante 12 días divididos en cuatro componentes: alojamiento, práctica, reducción de alimentos y prueba. Alojamiento: (días 1-3) Las ratas se colocan en cajas vacías por 20 minutos cada día, después de lo cual se sacan de las cajas y se colocan nuevamente en sus jaulas de vivienda. Práctica: (días 4 y 5) Las ratas se colocan en jaulas de prueba con cebo en la escalera 2-6 compuesto por 6 gránulos de alimento de 45 mg por peldaño para un total de 30 gránulos por lado de cada sesión de prueba. Las ratas se dejan en el aparato por 20 minutos, después de lo cual se colocan nuevamente en la jaula de vivienda. Reducción de alimentos: (días 6 y 7) Se reduce la cantidad de alimento para las ratas y se deja que ingieran por cuatro horas directamente después de las pruebas/práctica diaria (se deja agua en forma permanente). Prueba: (días 8-12) Cada rata se prueba por 20 minutos, por cinco días. Las escaleras 2-6 tienen cebos, como en el protocolo de práctica. Después de la prueba, las ratas se extraen de sus jaulas, se devuelven a su jaula de vivienda y se deja que se alimenten libremente por cuatro horas. Se calcula la cantidad de gránulos que tomó y comió cada rata y se registra para las patas izquierda y derecha en forma separada. Las relaciones se promediaron para los últimos 5 días de la prueba y ello dio un puntaje de precisión promedio para cada rata que se analizó con el uso de mediciones ANOVA repetidas.
Histología. En el momento del sacrificio se anestesió a los animales profundamente por medio de una inyección i.p. de pentobarbital (60 mg/ml, [0.1 ml/100 g]) y se realizó la perfusión intracardial con solución salina al 0.9 % que contenía 0.1 % de heparina seguido de 4 % de paraformaldehído (PFA) en solución salina regulada con fosfato 0.1 M (PBS) pH 7.4. Después de la perfusión, se recolectó los cerebros y se fijaron posteriormente por seis horas en 4 % de PFA y, después, se colocaron en sacarosa al 20 % en PBS. Se realizaron cortes de los cerebros con un grosor de 35 pm en un microtomo de congelamiento (Leica Microsystems, Montreal, Canadá) y se recolectaron serialmente y almacenaron en anticongelante, posteriormente se recuperaron y lavaron en PBS para cada experimento.
Para la inmunohistología, se lavaron secciones tres veces en PBS (0.1 M pH 7.4) y se preincubaron en una solución que contenía 0.4 % de Tritón X-100, 5 % de NGS en PBS por 60 minutos. Después, las secciones se incubaron de la noche a la mañana a 4 °C en los anticuerpos primarios de conformidad con las siguientes combinaciones: anti-lba-1 de conejo (Wako Puré Chemicals Industries, Richmond, VA; 1:1000) y anti-ED1 de ratón (Serotech, Raleigh, NC; 1:1000), proteína acidica fibrilar anti-glial de conejo (GFAP, DakoCytomation, Mississauga, ON; 1 :4000) y mitocondria antihumana de ratón (Chemicon, Temecula, CA; 1:500) o anti-GABA de conejo (Chemicon, Temecula, CA; 1 :200) (combinado, además, con mitrocondria anti-humana) diluido en PBS con 0.4 % de Tritón X-100. Después de los lavados en PBS, las secciones se incubaron en anticuerpos secundarios; anti-conejo de cabra 488 Alexa Fluor® con alta adsorción selectiva (Molecular Probes, Eugene, OR; 1:200) y antiratón de cabra Rhodamine Red-X con alta adsorción selectiva (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA; 1:200) en PBS por dos horas y media a temperatura ambiente (RT). Después de los lavados, las secciones se incubaron en PBS que contenía 0.022 % de DAPI (Molecular Probes, Eugene, OR), se lavaron y se colocaron sobre portaobjetos recubiertos con gelatina, se taparon con cubreobjetos con medio de montaje DABCO elaborado en forma casera (alcohol polivinílico, DABCO, Tris-HCI 1.0 M pH 8.0, agua destilada, glicerol) y se sellaron con esmalte de uñas. Se evaluó la tinción por fluorescencia con el uso de un microscopio de fluorescencia ¡90 Nikon acoplado a una cámara monocromática Hamamatsu 1394 ORCA-285 con la versión del programa Simple PCI 5.3.0.1102 (Compix Inc Imaging Systems, PA, Estados Unidos).
En el caso de la inmunofluorescencia doble, en donde se prepararon ambos anticuerpos primarios en los mismos huéspedes, las secciones se lavaron en PBS 0.1 M y se preincubaron en PBS 0.1 M que contenía 1 % de albúmina sérica bovina (BSA) y 0.4 % de Tritón X-100 (ambos de Sigma, St. Louis, MO). Después de una hora de incubación a temperatura ambiente con el primer anticuerpo primario; anti-vimentina de ratón (Sigma, St Louis, MO; 1 :5000) antitubulina isoforma ß??? (Chemicon, Temecula, CA) o proteína nuclear específica antineuronas de ratón (NeuN, Chemicon, Temecula, CA; 1:5000), las secciones se lavaron e incubaron una hora en una solución que contenía IgG anti-ratón de cabra conjugado con FITC de anticuerpo secundario (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA; 1:400) en PBS 0.1 M, 1 % de BSA y 0.4 % de Tritón X-100. Después de los lavados en PBS las secciones se incubaron por una hora con 5 % de suero de ratón normal (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) y, después, se lavaron otra vez antes de la incubación con un exceso de anticuerpos de fragmentos de Fab contra las especies huésped de anticuerpos primarios (20 pg/ml, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) por una hora y, además, se enjuagaron con PBS. Después, las secciones se incubaron una hora a temperatura ambiente con el segundo anticuerpo primario; mitocondria anti-humana de ratón (Chemicon, Temecula, CA; 1:500) en PBS que contenía 1 % de BSA y 0.4 % de Tritón X-100. Después de unos pocos lavados en PBS, las secciones se incubaron finalmente con IgG antiratón de cabra Rhodamine (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA; 1:400) en PBS 0.1 M, 1 % de BSA, 0.4 % de Tritón X-100 por una hora. Después, las secciones se lavaron e incubaron con DAPI por 7 min (Molecular Probes, Eugene, OR), se colocaron y se cubrieron con el cubreobjetos como se describió anteriormente.
Para la inmunotinción con tirosina hidroxilasa (TH), las secciones se lavaron tres veces en PBS 0.1 M pH 7.4 y se colocaron en 3 % de peróxido por 30 min a temperatura ambiente. Las secciones se lavaron posteriormente en PBS 0.1 M y, después, se preincubaron en una solución que contenía PBS 0.1 M, 0.1 % de Tritón X-100 (Sigma, St. Louis, MO) y 5 % de suero de cabra normal (NGS, Wisent Inc., St-Jean-Baptiste de Rouville, QC) por 30 min a RT. Las secciones se incubaron de la noche a la mañana a 4 °C con anti-TH (Pel-Freez, Rogers, AR; 1 :5000) en PBS, 0.1 % de Tritón X-100 y 5 % de NGS. Después de la incubación de la noche a la mañana, las secciones se lavaron en PBS 0.1 M y se incubaron por 1 h a temperatura ambiente en una solución de PBS que contenía 0.1 % de Tritón X-100, 5 % de NGS y anticonejo de cabra biotinilado (Vector Laboratories, Burlington, ON; 1:1500). Después de tres lavados en PBS 0.1 M, las secciones se colocaron en una solución de complejo de avidina-biotina peroxidasa (ABC Elite kit, Vector Laboratories, Burlington, ON) por 1 h a temperatura ambiente. Los anticuerpos se revelaron por medio de la colocación de las secciones en solución regulada con Tris que contenía 0.05 % de tetraclorhidrato de 3.3'-diaminobenzidina (DAB, Sigma, St.Louis, MO) y 0.1 % de peroxidasa de hidrógeno al 30 % a temperatura ambiente. La reacción se detuvo por medio del lavado en regulador Tris 0.05 M y lavados con PBS posteriores. Las secciones se colocaron en portaobjetos recubiertos con gelatina, se secaron al aire de la noche a la mañana, se deshidrataron en grados crecientes de etanol y se cubrieron con el cubreobjetos con medio de montaje DPX (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA).
Resultados Control del peso. El peso del animal se controló diariamente. Como se muestra en la Figura 1 , las ratas exhibieron un aumento de peso lento y regular 2 semanas después del trasplante. La pérdida de peso registrada a las 3-4, 7 y 15 semanas después del trasplante posiblemente se debió al ayuno requerido para la prueba de la escalera. Después de la primera prueba con apomorfina la baja ligera de peso continuó, probablemente debido a una pérdida temporal del apetito. Dos animales del tipo celular 1 que se sacrificarían a las 8 semanas se intercambiaron por dos ratas que se sacrificarían a las 4 semanas debido a su pérdida de peso progresiva (ratas núms. 27, 49). A las 8 semanas posteriores al trasplante fue necesario sacrificar a la rata núm. 60 del tipo celular 1 un día antes del programado por razones similares. A las 10 semanas posteriores al trasplante, otros animales n=2 del tipo celular 2 padecían diarrea y mostraron una pérdida de peso significativa. Se suministró a estos animales inyecciones diarias de lactato, pero se los encontró muertos en la jaula 24 horas después de estas precauciones adicionales. Otras dos ratas del Grupo 2 comenzaron a mostrar problemas de salud similares y, por prevención, fueron sacrificadas. Las otras n=2 en el Grupo 2 fueron sacrificadas al final (24 horas después de la última perfusión de animales del Grupo 2). Además, se sacrificó a la rata núm. 40 del Grupo 3 durante la semana 13 del protocolo experimental debido a cuestiones de salud similares a las observadas en el Grupo 2. La rata núm. 66 del Grupo 1 fue encontrada muerta en su jaula a las 15 semanas. Los síntomas previos se asemejaban a aquellos observados en animales no saludables de los Grupos 2y3. En síntesis, los animales del Grupo 2 (n=6 restantes) fueron sacrificados 10 semanas después del transplante, los animales de los Grupos 1 y 3 fueron sacrificados a las 16 semanas después del trasplante tal como se programó (n=5 para cada grupo). ABREVIATURAS: BB: Valores iniciales del comportamiento; TP: Transplante.
Prueba con apomorflna. Los cuatro grupos (células 1, 2, 3, vehículo) se analizaron con el uso de mediciones ANOVA repetidas (variable: núm. de rotaciones), que reveló que solamente el factor "tiempo" fue significativo (p=0.0048) lo que indica un efecto de "tiempo" para todos los grupos. Las comparaciones múltiples mostraron una recuperación funcional significativa (reducción en la cantidad de rotaciones) de todos los grupos entre el punto temporal "0" (valores iniciales) y las 4 semanas después del trasplante (Figura 2). Esta reducción se mantuvo en el tiempo después de las 4 semanas. El último punto temporal de 16 semanas posteriores al trasplante no podría analizarse con el uso de medidas ANOVA repetidas ya que el Grupo 2 fue sacrificado antes de este punto temporal (Figura 2).
Un grupo de cinco animales, lesionados independientemente con 6-OHDA, pero que no experimentaron intervención quirúrgica (trasplante) se añadió al análisis ANOVA de medidas repetidas. Cuando este grupo se añade a los cálculos de ANOVA de medidas repetidas, solamente el grupo de interacción/tiempo tiene una tendencia fuerte hacia la importancia (p=0.0985). Posiblemente una cantidad más significativa de animales habrían reforzado esta tendencia a resultados significativos. Considerando que esta tendencia fue indicativa de la recuperación funcional en el tiempo, el análisis posterior reveló que solamente las células umbilicales (célula 1) indujeron efectos benéficos significativos en el tiempo (p=0.0056) y que los animales lesionados que no experimentaron intervenciones quirúrgicas intracraneales mostraron una tendencia hacia la falta de recuperación funcional en el tiempo (este resultado no es significativo a p=0.0655).
Giros de la cabeza. El giro de la cabeza representa la cantidad total de rotaciones ipsilaterales realizadas por animales después del transplante celular. En los puntos temporales probados (2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16 semanas después del trasplante) no se observaron diferencias significativas entre animales trasplantados con células o animales que recibieron solamente vehículo (Figura 3). El giro de la cabeza es puramente subjetivo y determina la tendencia natural de la rata a rotar su cabeza hacia la izquierda o derecha después de la lesión. Todos los grupos se analizaron con el uso de medidas ANOVA repetidas (variable: diferencia entre la cantidad de giros de la cabeza hacia la izquierda y derecha). A medida que el tiempo aumentó en este estudio se observó una mejora en términos de falta de desviación para el giro de la cabeza, sin embargo, esto fue aparente en todos los grupos (Figura 3).
Prueba de la escalera. No se identificaron diferencias significativas entre los grupos trasplantados o de control con el uso de esta prueba. La prueba de la escalera midió la ingestión de alimentos en periodos de prueba de 20 minutos, en donde es necesario realizar movimientos finos para tomar el alimento que está en las escaleras. Todos los grupos se analizaron con el uso de medidas ANOVA repetidas (variable: relaciones entre granulos ingeridos y gránulos tomados). En esta prueba se determinó que con el tiempo se observó una diferencia en los comportamientos de ingestión; sin embargo, no se pudo determinar una diferencia significativa entre los grupos (Figura 4).
Inmunotinción. Las secciones H y E demostraron un injerto celular adecuado 1 día después del trasplante. Las células se identificaron en los sitios de trasplante hasta 8 semanas después del trasplante por tinción con antígenos nucleares humanos si bien la cantidad de células humanas había disminuido en respuesta al tiempo en el injerto. Actualmente, los datos no confirmaron que las células posteriores al parto se diferenciaron en un fenotipo neuronal después del trasplante in vivo en el sistema de este modelo.
Los injertos celulares se analizaron para determinar la presencia del marcador microglial lba-1. Como se muestra en la Figura 5a, el lba-1 se expresó en forma abundante por cada tipo celular, especialmente, con respecto a los vehículos de control. Se encontró que la expresión de lba-1 tiende a declinar con el tiempo (Figura 5a). La evaluación de ED-1 en animales trasplantados demostró que una respuesta de macrófagos fue evidente después del trasplante, el nivel de tinción de ED-1 se redujo en todos los grupos excepto en los animales trasplantados con fibroblastos en el tiempo (Figura 5b). La tinción con DAPI se mantuvo generalmente constante durante todo el estudio (Figura 5c).
De manera similar, la determinación de los niveles de proteína acídica fibrilar glial (GFAP) en los injertos para determinar cantidades de astrocitos reactivos después del injerto demostró que los astrocitos inicialmente reactivos se identificaron después del trasplante o administración del vehículo, un efecto que disminuyó en el tiempo (Figura 6a). Consistente con otras observaciones que muestran la diferenciación de las células en el injerto, se encontró que la vimentina se expresó en forma abundante en las células cuatro semanas después del injerto, pero la expresión se redujo firmemente en las doce semanas siguientes (Figura 6b).
El resultado de la tinción para la tirosina hidroxilasa humana fue negativo. Por lo tanto, ni las células umbilicales ni las placentarias se diferenciaron en células dopaminérgicas en las condiciones de tratamiento usadas.
Resumen Los resultados demostraron que el implante de células umbilicales proporcionó una mejora en el tiempo en un modelo 6-OHDA de Parkinson según la evaluación realizada por la capacidad de respuesta de comportamiento a la prueba con apomorfina. Las pruebas de la escalera y del giro de cabeza se realizaron para determinar los efectos en la activación de distintos circuitos y/o mecanismos neuronales. No se identificaron diferencias con el uso de estos parámetros de prueba y, por lo tanto, un mecanismo relacionado con el beneficio positivo observado a las 4 y 8 semanas en animales que reciben trasplantes umbilicales aun no se ha resuelto.
La tinción inmunohistoquímica no evidenció diferenciación celular después del injerto de células. No se pudo demostrar la diferenciación neuronal o, más específicamente, la diferenciación dopaminérgica en estos estudios. Por lo tanto, no se pudo verificar evidencia de diferenciación celular en el sitio de injerto. Esto sugiere, además, que las mejoras observadas en el comportamiento por la prueba con apomorfina después del trasplante de células umbilicales probablemente se deben a una respuesta trófica y no a un resultado del potencial regenerativo de las células.
No se observaron células TH inmunopositivas en cualquier tipo celular en ningún punto temporal. Sin embargo, la TH no es la única ruta celular para producir dopamina. La dopamina se puede producir independientemente a partir de tirosina hidroxilasa a través de la ruta de tirosina. Además, la dopamina, en presencia de tirosinasa, modifica e inactiva covalentemente la tirosina hidroxilasa. Además, las células trasplantadas pueden permitir el procesamiento de DOPA (aminoácido de alimentos) en plasma después de una comida a DOPA.
Ejemplo 19 Matrices de citocina RayBio® y BD Powerblot™ Se usó la matriz C de anticuerpos de citocina humana serie 1000 para analizar la expresión de 120 proteínas en lisados y células derivadas después del parto. Este análisis proporcionó una caracterización de las UTC e identificó un espectro de expresión de factores tróficos clave para estas células.
Materiales v métodos Cultivo y recolección de células. Las células derivadas del ombligo se sembraron en una cantidad de 5000 células por cm2 en matraces recubiertos con gelatina con medio de crecimiento y se expandieron por 3 a 4 días (25,000 células por cm2 de densidad de recolección destino). Las células se procesaron con tripsina, se recolectaron y centrifugaron a 300 rcf por 5 minutos. La combinación tripsina/medio se eliminó por aspiración y las células se lavaron tres veces con solución salina regulada con fosfato (PBS).
Lavado y separación de las células en alícuotas. Después del lavado, las células se resuspendieron a 107 célula/ml en PBS y se suministraron como 1 mi de alícuotas en tubos de microcentrífuga siliconados estériles de 1.5 mi. Las células se centrifugaron a 300 rcf por 5 minutos y la PBS se eliminó por aspiración. Las células se lísaron y analizaron por medio de la matriz o se lisaron y liofilizaron para análisis.
Preparación de muestras liofilizadas. Se prepararon tres lotes de células (lotes de UTC L040405, L052505, L050505) para liofilización eventual por inmersión en nitrógeno líquido (LN2) por 60 segundos. Después, los tubos se extrajeron del LN2 y se sumergieron inmediatamente en un baño maría a 37 °C por 60 segundos o hasta que se descongelaron (tiempo de incubación máxima de 3 minutos). Este proceso se repitió otras dos veces. Las muestras congeladas-descongeladas se centrifugaron por 10 minutos a 13,000 rcf a 4 °C y se colocaron sobre hielo. El fluido sobrenadante de cada tubo se eliminó. Para determinar el contenido de proteínas totales, el lisado se diluyó en PBS y la dilución se analizó por medio del ensayo Bradford.
Para la liofilización, se cargó múltiples crioviales estériles de 1.5 mi marcados con lisado en un autoclave y estos enfriaron el bloque de transferencia térmica. Se cargó alícuotas de fluido sobrenadante de lisado a una concentración de proteínas totales definidas en los crioviales. El bloque térmico que contenía los crioviales sin tapa se cargó asépticamente en una bolsita de autoclave sin usar esterilizada en el autoclave. La bolsita se cargó en el liofilizador.
Los materiales de prueba con lisado aplicado se cargaron en un secador de bandeja FTS Systems Dura-Stop MP Stoppering Tray Dryer y se liofilizaron con el uso del siguiente programa de incremento de temperatura. Todas las etapas se realizaron con un índice de incremento de temperatura de 2.5 °C/minuto y un vacío de 100 mT.
Preparación de gránulos celulares. Los granulos celulares congelados (lotes 063004B, 022803, 050604B, 072804, 120304, 071404C, 090304) se Usaron con el uso de una mezcla 1 :1 de regulador RIPA (Tris HCI 50 mM, pH8, NaCI 150 mM, 1 % de NP-40, 0.5 % de desoxicolato de sodio y 0.1 % de SDS) y regulador de lisis celular proporcionado en el kit de matrices de citocinas RayBio® 1000.1 (Raybiotech Inc. Norcross, GA). Se usó glóbulos de vidrio (Sigma, O) para alcanzar la lisis celular completa. La concentración de proteínas se midió con el uso del kit para ensayo de proteínas BCA (Pierce Biotechnology, Inc. Rockford, IL).
Análisis de matrices RayBio®. Las matrices RayBio® VI y VII, que constituyen la matriz 1000.1 se probaron de la noche a la mañana con cantidades iguales de proteína de cada muestra. El protocolo restante se realizó según las directivas del fabricante. Las manchas en la membrana se analizaron cualitativamente para determinar las proteínas de interés. Para la comparación cuantitativa entre muestras, estas manchas se podrían analizar por densitometría y los cambios en la expresión podrían confirmarse por medio de ELISA.
Resultados Se analizó un total de diez poblaciones de UTC diferentes. Se identificó cualitativamente cuarenta y ocho proteínas y se enumeran en la Tabla 19-1. Algunas proteínas se expresaron en concentraciones relativamente altas en todas las muestras probadas mientras que otras se expresaron en ciertas muestras.
Resumen La matriz RayBio® confirma la expresión de proteínas identificadas previamente por análisis de matrices génicas y/o análisis ELISA. Se han identificado varios factores tróficos benéficos para el tratamiento de enfermedades específicas. Por ejemplo, se identificó FGF, TGF-b y GCSF en UTC y estos factores de crecimiento se identificaron previamente con mejoras en modelos animales de derrame cerebral agudo y recuperación de derrame cerebral. Además, en las UTC se identificó BDNF, BMP-4, BMP-6 y TGF-b 1 asociadas positivamente con la enfermedad de Parkinson. Todos los datos presentados se evalúan cualitativamente; el análisis cuantitativo del nivel de expresión para las proteínas de interés está pendiente.
Ejemplo 20 Expresión de telomerasa en células derivadas del ombligo Las funciones de la telomerasa para sintetizar repeticiones de telómeros sirven para proteger la integridad de cromosomas y para prolongar la duración de vida de replicación de las células (Liu, K, y otros, PNAS, 1999; 96:5147-5152). La telomerasa consiste de dos componentes, la plantilla de ARN de telomerasa (hTERT) y la transcriptasa inversa de la telomerasa (hTERT). La regulación de la telomerasa se determina por transcripción de hTERT, pero no de hTERT. Por lo tanto, la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR) para el ARNm de hTERT es un método aceptado para determinar la actividad de telomerasa de las células.
Aislamiento de células. Se realizaron experimentos de PCR en tiempo real para determinar la producción de telomerasa de células derivadas del tejido del cordón umbilical humano. Las células derivadas del tejido del cordón umbilical humano se prepararon de conformidad con los ejemplos que se exponen anteriormente. Generalmente, los cordones umbilicales obtenidos del National Disease Research Interchange (Philadelphia, Pa.) proporcionados en la forma habitual se lavaron para eliminar la sangre y residuos y se disociaron mecánicamente. Después, el tejido se incubó con enzimas de digestión que incluyeron colagenasa, dispasa y hialuronidasa en medio de cultivo a 37 °C. Las células derivadas del tejido del cordón umbilical humano se cultivaron de conformidad con los métodos expuestos en los ejemplos anteriores. Las células madre mesenquimales y fibroblastos de la piel dérmicos normales (cc-2509 lote núm. 9F0844) se obtuvieron de Cambrex, Walkersville, Md. Se adquirió una línea celular de carcinoma (teratoma) embrionario testicular humano pluripotente, células nTera-2 (NTERA-2 cl.DI), (ver, Plaia y otros, Stem Cells, 2006; 24(3):531-546) de ATCC (Manassas, Va.) y se cultivó de conformidad con los métodos que se exponen anteriormente.
Aislamiento de ARN total. Se extrajo ARN de las células con el uso del kit RNeasy® (Qiagen, Valencia, Ca.). El ARN se eluyó con 50 microlitros de agua tratada con DEPC y se almacenó a -80 °C. El ARN se sometió a transcripción inversa con el uso de hexámeros aleatorios con los reactivos de transcripción inversa TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, Ca.) a 25 °C por 10 minutos, 37 °C por 60 minutos y 95 °C por 10 minutos. Las muestras se almacenaron a -20 °C.
PCR en tiempo real. La PCR se realizó en muestras de ADNc con el uso de Applied Biosystems Assays-On-Demand™ (conocido, además, como ensayos de expresión génica TaqMan®) de conformidad con las especificaciones del fabricante (Applied Biosystems). Este kit comercial se usa ampliamente para ensayar la telomerasa en células humanas. En síntesis, se mezcló hTERT (gen de telomerasa humana) (Hs00162669) y GAPDH humana (un control interno) con ADNc y mezcla maestra de PCR TaqMan® Universal con el uso de un sistema de detección de secuencias 7000 con el programa SDS 700 ABI prism (Applied Biosystems). Las condiciones del ciclo térmico eran inicialmente de 50 °C por 2 minutos y 95 °C por 10 minutos seguido de 40 ciclos de 95 °C por 15 segundos y 60 °C por 1 minuto. Se analizaron los datos de PCR de conformidad con las especificaciones del fabricante.
Se ensayaron células derivadas del tejido del cordón umbilical humano (núm. de registro en ATCC PTA-6067), fibroblastos y células madre mesenquimales para determinar hTERT y 18S RNA. Como se muestra en la Tabla 20-1 , no se detectó hTERT, y en consecuencia, telomerasa en células derivadas del tejido del cordón umbilical humano.
Se ensayó células derivadas del tejido del cordón umbilical humano (aislado 022803, núm. de registro del ATCC PTA-6067) y células nTera-2 y los resultados no mostraron expresión de la telomerasa en dos lotes de células derivadas del tejido del cordón umbilical humano mientras que la línea celular del teratoma reveló un alto nivel de expresión (Tabla 20-2).
Por lo tanto, se puede concluir que las células derivadas del tejido umbilical humano de la presente invención no expresan telomerasa.
Ejemplo 21 Uso de células derivadas del tejido del cordón umbilical en el tratamiento de ALS Este estudio evaluó los efectos modificadores de la enfermedad producidos por células derivadas del tejido del cordón umbilical humano ("hUTC") al principio o una semana después del inicio de la enfermedad para imitar el paradigma clínico en el cual los pacientes que presentan síntomas de ALS podrían recibir hUTC. Particularmente, el objetivo de este estudio fue determinar la eficacia de las células derivadas del tejido del cordón umbilical humano ("hUTC") en un modelo de rata SOD1 G93A de esclerosis lateral amiotrófica (ALS). El efecto de la administración de hUTC en la supervivencia de los animales y la función de locomoción se evaluaron después del suministro de hUTC a través de inyección intratecal.
La razón para suministrar hUTC localmente a través de inyección intratecal se basó en suministrar la célula justo en el sitio de inicio de la enfermedad. Además, esta vía de administración supera la barrera hematoencefálica y permite acceder rápidamente a sitios reactivos potenciales para el artículo de prueba en la médula espinal (Ochs G y otros (1999) J Pain Symptom Manage. 18:229Y32). Las evaluaciones funcionales de la actividad locomotora se realizaron una vez a la semana en la prueba de Basso, Beattie y Bresnahan (BBB) (Basso DM y otros (1996) Exp. Neurol. 139: 244-256) y la prueba del plano inclinado (Rivilin AS, Tator CH. (1977) J Neurosurg 47(4): 577; Lindberg RL y otros (1999) J. Clin Invest. 103(8): 1127-1134).
Actualmente, los modelos de roedores SOD1 G93A son el único tipo de modelo animal para ALS. Es un método rentable útil para analizar nuevas terapias para la enfermedad tal como demostraron otros investigadores con respecto a la eficacia de varios agentes/compuestos en ALS (Karussis y oíros (2010) Arch Neurol. 67(10): 1187-94; Xu y otros (2009) J Comp Neurol. 514(4):297-309; Xu y otros (2006) Transplantation. 82(7):865-75; Garbuzova-Davis S y otros (2003) J. Hematother Stem Cell Res. 12(3):255-70; Galán y otros (2010) Neurología. 25(8):467-469; Kim y otros (2010) Neurosci Lett. 468(3):190-4; Gros-Louis y otros (2010) J Neurochem. 113(5): 1188-99; Israelson A y otros (2010) Neuron. 26; 67(4): 575-87).
Métodos y Materiales Se cruzó ratas macho SOD1 G93A proporcionadas por Dr. David S. Howland, University of Washington, Seattle, con ratas hembra N (SD) de Taconic (Germantown, NY). Las ratas se cruzaron por una semana en pares de un macho: una hembra. Las crías se destetaron y genotipificaron a los 21 días de edad y las crías transgénicas positivas se identificaron para inscripción en el estudio. La colonia se propagó por medio de retrocruza de crías macho de la misma carnada con los reproductores hembra originales para reducir la varianza fenotípica. Todos los procedimientos de cuidado y quirúrgicos de los animales en este estudio se realizaron de conformidad con protocolos aprobados por el Comité de cuidado y uso de animales (Animal Care and Use Committee) de Johns Hopkins Medical Institutions.
Las hUTC (aisladas de tejido del cordón umbilical humano) se descongelaron a partir de material inicial congelado tal como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 7,510,873 y se diluyeron en solución salina regulada con fosfato (PBS). Las células se centrifugaron a 1500 X g por 5 minutos y, después, se resuspendieron otra vez en PBS y se contaron. La concentración de células se ajustó hasta 20 millones de células por mililitro y se suministró 50 microlitros de esta suspensión a cada rata intratecalmente.
Los animales positivos para el gen de superóxido dismutasa 1 (SOD1) se inscribieron en el estudio. Estos animales se pesaron dos veces a la semana para determinar el momento en el cual se registró una baja en el peso corporal por dos mediciones consecutivas, y ese momento se definió como el inicio de la enfermedad. Esta es una medida sensible y muy objetiva para determinar el inicio de la enfermedad en modelos de roedores de ALS (Xu y otros (2006) Transplantation. 82(7):865-75). Las ratas que exhibieron inicio de la enfermedad se asignaron aleatoriamente en forma de pares a grupos tratados con vehículo o células.
El estudio consistía de dos ramas (Tabla 21-1). Cada rama estaba dividida en dos grupos. El Grupo 1 de la Rama 1 recibió una sola inyección intratecal de solución salina regulada con fosfato (PBS, vehículo de control) en el momento del inicio de la enfermedad. El Grupo 2 de la Rama 1 se trató con 1 millón de células hUTC aproximadamente al inicio de la enfermedad. Las células se suministraron en PBS a través de inyección intratecal. El Grupo 3 de la Rama 2 se trató con una sola inyección intratecal con PBS (vehículo de control) 1 semana después del inicio aproximado de la enfermedad. El Grupo 4 de la Rama 2 se trató con recombinante con 1 millón de células hUTC 1 semana después del inicio aproximado de la enfermedad. Las células se suministraron en PBS a través de inyección intratecal.
Para minimizar las lesiones y maximizar la recuperación inmediata del animal se usó un método de inyección transcutánea para suministrar células intratecalmente en el fluido cerebroespinal (CSF, por sus siglas en inglés) de la cisterna lumbar de ratas SOD1. Los animales se colocaron sobre un dispositivo estereotáxico Kopf y se anestesiaron con gas anestésico (isoflurano: oxígeno: óxido nitroso = 1 :33:66). Se realizó el afeitado de la región lumbar y se colocó un elemento cilindrico de soporte debajo de la parte inferior del abdomen de la rata para estirar los espacios intervertebrales de la columna lumbar. Las células se suministraron con microjeringas de 200-500 µ? equipadas con una aguja de 25 G x 2.54 cm (1"). La aguja con la microjeringa que contenia 50 microlitros de células se insertó lentamente en el espacio subaracnoideo en los espacios intervertebrales L4-5 o L6-S1. Cuando se observó una señal física de irritación de la cauda equina (es decir, movimiento rápido de la pata delantera o trasera), las células se infundieron lentamente en el espacio subaracnoideo durante un periodo de 1 minuto. La jeringa se mantuvo en el lugar por 2 minutos y, después, se extrajo la aguja. El punto de entrada de la aguja se presionó con la punta de un cotonete de algodón sumergido en yodo por 1 minuto y, después, se bajó al animal y se lo colocó sobre una almohadilla térmica para que se recuperara. Una vez que el animal se despertó, fue devuelto a su jaula.
El avance de la enfermedad y la eficacia terapéutica potencial se controlaron a través de dos evaluaciones funcionales: (1) actividad locomotora (medida todas las semanas); y (2) peso corporal (medido dos veces a la semana). Las pruebas de locomoción incluyeron la prueba de Basso, Beattie y Bresnahan (BBB) (Basso y otros (1995) J Neurotrauma 1995; 12(1): 1 ; Basso y otros (1996) Exp. Neurol. 139: 244-256) y la prueba de plano inclinado (Rivlin AS, Tator CH. (1977) J Neurosurg 47(4): 577).
Para determinar el puntaje de BBB, las ratas se domesticaron y adaptaron al campo abierto. Una vez que una rata caminó en forma continua en el campo abierto, dos examinadores que desconocían el tratamiento, realizaron una sesión de prueba de 4 minutos con el uso de la escala de clasificación de locomoción de BBB que es una escala de 21 puntos de alta reproducibilidad intra e interobservadores. La prueba de campo abierto se grabó en video. A partir de esta cinta, dos examinadores evaluaron cuantitativamente la cantidad de movimientos de la extremidad trasera (HL, por sus siglas en inglés) que se realizaron en un periodo de 1 minuto; este periodo de tiempo está compuesto por episodios producidos durante la sesión de pruebas de 4 minutos cuando se visualiza en forma total con la cámara cada HL. El límite de tiempo de 1 minuto aseguró que se evaluara las HL derecha e izquierda de cada animal por el mismo tiempo, ya que no siempre la cámara visualiza ambas HL en su totalidad. En aquellos casos en los cuales los puntajes de los examinadores no coincidían, las imágenes se evaluaron nuevamente a velocidad lenta. Se asignó un puntaje de 0 cuando no se produjo movimiento observable de la extremidad trasera y los puntos iniciales se asignaron para los movimientos aislados de las articulaciones. El puntaje aumentó en los casos en que se identificó movimiento en más articulaciones y/o cuando los movimientos eran más amplios. A medida que aumentó la locomoción, se asignó puntos para la colocación de la planta de la pata, el soporte de peso y la coordinación entre la extremidad delantera y trasera. Los puntos finales se obtuvieron por la separación entre los dedos de la pata, la estabilidad del tronco y la posición de la cola.
El plano inclinado es otra tarea conductual que evalúa la capacidad del animal para mantener su posición en una plancha de caucho acanalada; esta plancha se elevó en incrementos de 5o. El ángulo máximo en el cual un animal puede soportar su peso por 5 segundos se define como el ángulo de capacidad. Esta prueba analiza la realimentación sensorial, la coordinación y la resistencia muscular necesarias para la locomoción.
La etapa final de la enfermedad se determinó por la presencia de una parálisis tan severa que el animal no se podría enderezar por sí mismo dentro de los 20 segundos después de colocarlo de costado. Los puntajes de las pruebas de BBB y de plano inclinado en este punto son cero, y este es un valor final usado frecuentemente para ratas mutantes SOD1 y consistente con los requisitos del Animal Care and Use Committee de Johns Hopkins University.
Los puntajes de las pruebas de BBB y de plano inclinado se analizaron por medio de análisis de varianza con mediciones repetidas (ANOVA) seguido de la prueba posterior de la diferencia estadísticamente significativa (LSD) de Fisher para obtener las diferencias entre los grupos tratados con células y con vehículo. El curso de la enfermedad como un efecto de tratamiento se analizó por la comparación de la edad al inicio de la enfermedad y la edad en el momento de la muerte entre los dos grupos (con la prueba student t) así como con el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier seguido de la prueba de clasificación logarítmica.
Análisis histológico El estado de las neuronas motoras huésped se analizó por tinción con violeta de cresilo de neuronas motoras en la protuberancia lumbar (L4-5) (los datos no se muestran). La cantidad de neuronas motoras disminuye ampliamente y muchas neuronas aparecen como perfiles degenerativos en grupos de células madre y control, un patrón consistente con el hecho de que todos los tejidos de la médula espinal se adquieren en la etapa final de la enfermedad. No se encontraron células madre sobrevivientes dentro del parénquima de la médula espinal con el uso de tinción ICC con anticuerpos antinucleares específicos humanos. Las raices ventrales de L4-L5 de ambos grupos se estudiaron por medio de tinción con azul de toluidina. La degeneración de axones y la desmielinación fueron significativas y similares en los grupos de células madre y control, consistente con la adquisición de estas preparaciones en la etapa terminal de la enfermedad.
Resultados Los gráficos de Kaplan-Meier muestran un aumento en la supervivencia de los animales para el grupo tratado con células en comparación con los animales de control (n=10 para los Grupos 1 y 2, n=8 para los Grupos 3 y 4) durante todo el tratamiento, que comienza en el inicio de la enfermedad (Figura 7A, Rama 1) o una semana después del inicio (Figura 7B, Rama 2), con excepción de un animal en el Grupo 1 que vivió más tiempo que el resto de los animales del estudio (Figura 7A). Si bien el tiempo promedio de inicio de la enfermedad no fue diferente entre animales que recibieron vehículos y animales a los que se inyectó hUTC en las dos ramas (Figura 8), la duración de vida promedio aumentó después de la administración intratecal de hUTC, especialmente en la Rama 2 en la cual los animales exhibieron un tiempo de vida más prolongado en 15.75 días (2.25 semanas, P<0.035) que el grupo vehículo si bien la edad de inicio de la enfermedad era similar.
Las Figuras 9A a 9D muestran que la administración de hUTC en el inicio de la enfermedad (Figuras 9A y 9B) o 1 semana después del inicio de la enfermedad (Figuras 9C y 9D) se asoció con puntajes mayores en la prueba de BBB y prueba de rendimiento de plano inclinado, lo que indica un avance más lento de la debilidad muscular en animales injertados con hUTC en comparación con animales que recibieron solamente vehículo. Estos resultados sugieren que las hUTC podrían ser capaces de preservar la actividad locomotora en este modelo.
Por lo tanto, los datos descritos en este ejemplo, resumidos en la Tabla 21-2 más abajo, muestran que la inyección intratecal de hUTC puede preservar la función de las neuronas motoras y prolongar la vida en el modelo de rata de ALS.
Definiciones para la Tabla 21-2 Inicio de la enfermedad. El momento en el cual se identifica que el peso corporal disminuyó dos veces consecutivas. Esta es una medida sensible y muy objetiva para determinar el inicio de la enfermedad en modelos de roedores de ALS (Xu L. y otros (2006)).
Determinación de la etapa final de la enfermedad: La etapa en la cual la parálisis es tan severa que el animal no se puede enderezar por sí solo dentro de los 20 s cuando se lo coloca de costado (un valor final usado frecuentemente para las ratas SOD1 mutantes) y en la cual se requiere la aplicación de eutanasia a los animales (Israelson y otros, 2010).
Duración de la enfermedad. El periodo que abarca desde el momento de inicio de la enfermedad y la etapa final de la enfermedad Tiempo de vida. El periodo entre el momento del nacimiento y la eutanasia.
Ejemplo 22 Uso de células derivadas del tejido del cordón umbilical en el tratamiento preventivo de ALS Los efectos modificadores de la enfermedad producidos por las hUTC se evaluaron antes del inicio de la enfermedad (10 o 12 semanas de edad) como tratamiento preventivo. Las células se administraron por medio de una inyección intravenosa en la vena de la cola, una vía de administración clínicamente ventajosa. Las evaluaciones funcionales de la actividad locomotora se realizaron una vez a la semana en la prueba de Basso, Beattie y Bresnahan (BBB) y la prueba del plano inclinado.
Propósito y alcance del estudio El objetivo de este estudio consistió en explorar el rol preventivo de las células derivadas del cordón umbilical, autorenovables y expandibles, en los aspectos clínicos de ALS en ratas transgénicas, tal como sucede en ratas SOD1 G93A en conjunto con las líneas metodológicas principales publicadas en el trabajo realizado por Koliatsos y otros (Yan y otros (2006) Stem Cells 24: 1976-1985; Yan y otros (2007) PLoS Med 4: e39; Xu y otros (2006) Transplantation 82:865-875). Se eligieron dos ramas: (1) una rama de 10 semanas que recibió células derivadas del cordón umbilical o vehículo a las 10 semanas de edad; y (2) una rama de 12 semanas que recibió células o vehículo a las 12 semanas de edad. Dentro de cada rama, el Grupo A (ciego en la mayoría de los casos como una cantidad impar de animales) se asignó para recibir las células derivadas del cordón umbilical y el Grupo B (ciego en la mayoría de los casos como un número par de animales) se asignó al tratamiento con vehículo. No se realizó una protección inmunitaria de eventos de injerto en función de los huéspedes tal como propuso en estudios anteriores Koliatsos Lab (Yan y otros (2006); Xu y otros (2006)). El siguiente análisis no toma en cuenta el cambio de fenotipo de la colonia desde uno muy variable a uno menos variable y, eventualmente, una población optimizada con respecto al inicio y severidad de la enfermedad.
Observaciones de cria y optimización de fenotipos al inicio de la enfermedad y el tiempo de vida La colonia de ratas SOD1 se propagó por medio de retrocruza de crías macho de la misma carnada con los reproductores hembra originales para reducir la varianza fenotípica. El estándar indicaba que el tiempo de inicio de la enfermedad en el reproductor macho debería ser de 90-120 días. De cualquier otra forma, se observó que el fenotipo de sus progenies se volvió "inestable", es decir, el inicio de la enfermedad podría inclinarse tanto como hasta los 180 días de edad y mayor. Los reproductores iniciales que se usaron para generar animales para este estudio estaban fuera de este marco de 90 a 120 días, un problema que causó una desviación fenotípica sustancial en su progenie. Para reducir el impacto del cambio fenotípico, cada animal asignado al Grupo A se apareó inicialmente con un animal del mismo género de la misma carnada asignado al grupo B. Los tiempos de inicio promedio para la enfermedad para los Grupos A y B en la rama de 10 semanas fueron de 153.15 ± 12.71 y 154.0 ± 13.75 días y los tiempos de vida para los Grupos A y B fueron de 202.0 ± 10.32, 202.75 ± 17.31 días, respectivamente. El tiempo de inicio promedio de la enfermedad para los Grupos A y B en la rama de 12 semanas fue de 149.0 ± 27.58 y 146.5 ± 28.53 días; los tiempos de vida para los Grupos A y B fueron de 180.5 ± 30.25, 174.88 ± 35.87 días, respectivamente. Si bien el tiempo promedio de inicio de la enfermedad y el tiempo de vida en el Grupo A fueron mayores que en el Grupo B, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas. Dado que los últimos dos pares en la rama de 12 semanas comprendían ratas SOD1 genotípicamente difíciles, es decir, progenies de ratas SOD1 con tiempos de inicio de la enfermedad dentro del intervalo de 90-120 días, estas ratas se analizaron en forma separada de otras ratas de la misma rama. El tiempo promedio de inicio de la enfermedad de estos dos pares en los Grupos A y B fue de 114.5 ± 0.5 y 111.0 ± 0.61 días, una diferencia que no era estadísticamente significativa. Los tiempos de vida de los animales de estos dos pares asignados al Grupo A fueron de 133.5 ± 0.03, es decir, 10 días más que los tiempos de vida de los animales del Grupo B (123.0 ± 0.41 días).
Patrones de la curva de supervivencia Las curvas de Kaplan-Meyer estudiadas por medio de análisis de clasificación logarítmica no mostraron diferencias significativas entre los Grupos A y B en los experimentos de las ramas de 10 y 12 semanas (Figura 10 y Figura 11). Sin embargo, en el experimento de la rama de 12 semanas, se observó una tendencia del Grupo A a una mayor supervivencia; los tiempos de supervivencia promedio para los Grupos A y B fueron de 194 y 185 días, respectivamente (ver la Figura 11). Si bien no hubo una diferencia significativa entre los últimos dos pares en el experimento de la rama de 12 semanas, el análisis de la curva de supervivencia muestra que el Grupo A puede sobrevivir más tiempo (Figura 12).
Pruebas de comportamiento de los animales en las dos ramas - datos de las pruebas de plano inclinado y BBB. Los datos seriales de estas dos pruebas ANOVA con mediciones repetidas ANOVA (RM ANOVA) se analizaron en dos formas. En el primer modo, se recabaron datos desde una semana antes de que el primer animal mostrara signos de enfermedad y se analizaron por medio de comparación (paneles superiores de la izquierda en las Figuras 13-18). En el segundo modo, se recabaron datos desde el inicio de la enfermedad (paneles inferiores a la izquierda en las Figuras 13-18). Cuando se realizaron estos análisis se aplicó, además, una corrección "compensadora" para eliminar el factor de desviación de la curva causada por las curvas de supervivencia muy dispares (debido a la varianza genotípica) (paneles a la derecha en las Figuras 13-18). Al aplicar esta compensación, se tomó el puntaje más bajo de la prueba de comportamiento para el animal que estaba en una etapa próxima a su muerte y se ingresó junto con los puntajes de los animales sobrevivientes del mismo grupo en puntos temporales posteriores (un método alternativo sería eliminar este punto temporal de los conjuntos de datos de comportamiento posteriores y hacer el análisis en un n menor de animales). Los resultados de RM ANOVA en los datos del plano inclinado y BBB no mostraron diferencias significativas entre los dos grupos en los experimentos de las ramas de 10 y de 12 semanas, correcciones y ajustes para el inicio de la enfermedad y supervivencia (Figuras 13-15, 17). Sin embargo, cuando se analizó los últimos dos pares del experimento de la rama de 12 semanas por las razones explicadas en la sección de reproducción anterior, se encontró que los resultados del comportamiento tenían una varianza similar a los del estudio de supervivencia (ver arriba; Figuras 16, 18). Si bien no se encontró una diferencia estadística en los puntajes de comportamiento entre estos dos pares, se identificó una tendencia a un mejor desempeño del Grupo A en comparación con el Grupo B.
Análisis histológico Todas las ratas SOD1 , independientemente de que se hayan inyectado en ellas células madre o no, fueron sacrificadas cuando su enfermedad alcanzó la etapa final (puntaje de BBB <3). Después de la perfusión con 4 % de PFA, se extrajo el cerebro y otros órganos del animal y se crioprotegieron y congelaron para procesamiento posterior. Para explorar si había alguna célula madre humana remanente en secciones de órganos/tejidos relevantes se realizó inmunocitoquímica con el anticuerpo nuclear específico humano (HNu). Estos tejidos incluyeron la médula espinal lumbar (como un agente terapéutico relevante) y pulmón (como órgano de control con una concentración alta anticipada de células madre inyectadas). La tinción con HNu no mostró supervivencia para células injertadas en estos órganos en animales en la etapa final.
Observaciones de secciones de la médula espinal. Las ratas G93A SOD1 sintetizan muchos síntomas cardinales de ALS humana. La degeneración de neuronas motoras en la médula espinal de ratas SOD1 proviene de las neuronas motoras lumbares que inervan los músculos de las extremidades inferiores a neuronas motoras cervicales y torácicas que inervan músculos respiratorios. Los animales mueren por inanición y falla respiratoria. El objetivo histológico de este experimento fue limitado debido a la falta de tejidos adecuados de animales en la etapa media de la enfermedad y una extensión fenotípica sustancial. Los tejidos de la médula espinal disponibles pertenecían a animales sacrificados en la etapa final y la mayoría de las neuronas motoras se habían degenerado, aun en animales que, supuestamente, habían sido protegidos por medio de inyección de células madre. Por lo tanto, el único valor del análisis histológico consistió en representar la neuropatología en bruto en las médulas espinales de animales tratados con células vivas o muertas. Se procesaron cinco de esas médulas espinales. De cada una se estudió seis pares de secciones separadas por espacios iguales cada 300 pm a través de la región L4-6 de la columna lumbar. Una sección del par se tiñó con violeta de cresilo y la otra con hematoxilina y eosina. Se seleccionaron tres casos de los animales de número impar y dos casos de los animales de número par.
Las secciones manchadas revelan una apariencia de la médula espinal bruta normal con todos los segmentos principales de la médula espinal delineados claramente (Figura 19A y Figura 19B). No se detectaron tumores (Figura 19A y Figura 19B). Tal como se predijo en base al fenotipo de neuronas motoras de animales SOD1 G93A se produjo una pérdida considerable de neuronas motoras en animales de números pares e impares. Cuando se contaron los números de los dos grupos basados en los números de los nucléolos presentes en los perfiles basofílicos del asta ventral con una magnificación de 100X no se observaron tendencias apreciables en los números de células neuronales motoras entre los dos grupos (cantidad impar de animales, 423; cantidad par de animales, 418). Se usó el ajuste de Abercrombie para el error de células divididas para corregir las diferencias posibles en el diámetro nucleolar entre los dos grupos (Ni = ni.t/t+d, en donde ni = número contado, t = grosor de la sección y d = diámetro promedio del perfil).
La evaluación de BBB y puntajes de animales tratados con células muestra una tendencia mejor que los animales no tratados. Por lo tanto, los resultados de este estudio sugieren que los tiempos de administración más cercanos o posteriores al inicio de la enfermedad pueden tener una mayor eficacia terapéutica.
Ejemplo 23 Factores tróficos para la diferenciación de progenitores neurales Las células madre neurales en el sistema nervioso central (SNC) pueden autorenovarse y son multipotentes ya que pueden diferenciarse en neuronas, oligodendrocitos y astrocitos. Estas células pueden activarse después de un ataque e iniciar la neurogénesis. Sin embargo, esta eficacia en la diferenciación es muy baja y las neuronas recientemente generadas son mayormente de vida corta, posiblemente debido a la ausencia de la formación de cualquier sinapsis funcional. El suministro exógeno de productos basados en células puede mejorar la neurogénesis y la formación de nuevas sinapsis y, en consecuencia, superar esta cuestión y, por lo tanto, pueden mejorar la recuperación funcional en condiciones de trauma o degenerativas. Estudios recientes han sugerido que las tecnologías basadas en células pueden ser una terapia eficaz para múltiples condiciones neurológicas. Para comprender el o los mecanismos subyacentes, se determinó el efecto de hUTC en la diferenciación de células neurales adultas.
Materiales y Métodos Cultivo de células.
Se descongeló células derivadas del tejido umbilical humano (hUTC) (lote núm. 22042008, en el pase P3 o P4) y se sembraron sobre matraces T75 y/o T225 y se cultivaron en medio de crecimiento Hayflick (DMEM con bajo contenido de glucosa (Gibco, catálogo número 11885-084), 15 % v/v de suero fetal bovino (FBS, Hyclone catálogo número SH30070.03IR), Glutamax 4 mM (Gibco, catálogo número 3505-061) y 1 % de penicilina/estreptomicina (Gibco catálogo número 15070063) de la noche a la mañana o por 48 horas para formar una capa confluente. Después de que las células alcanzaron la capa confluente, se lavaron tres veces con solución salina regulada con fosfato (PBS, Invitrogen, catálogo número 25200-056) y se incubaron con medio DMEM libre de suero por 8 horas o 24 horas tal como se indicó. Las células se separaron con el uso de TrypLE™ (Gibco, catálogo número 12604-021) y se cuantificaron con el uso de un instrumento Guava® (Guava Technologies).
Se descongeló células madre neurales hipocampales de ratas adultas (núm. de lote R0706F0009, Millipore, catálogo número SCR022) (P3 o P4), se sembraron sobre matraces T75 recubiertos con poli-L-ornitina (Sigma, catálogo núm. P3655) y laminina (Sigma, catálogo número 2020) (Corning, catálogo número 430641) y se cultivaron en DMEM/F12 (Millipore, catálogo número DF-042-B) con suplemento B27 (Invitrogen, catálogo número 17504044), 1 % de penicilina/estreptomicina y FGF-2 (Millipore, catálogo número GF003) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Cuando las células alcanzaron una confluencia del 80 %, se separaron con el uso de Accutase® (Millipore, catálogo número SCR005) y se cuantificaron con el uso de un instrumento Guava®. Para el ensayo de diferenciación, las células se sembraron a 20,000 células/cm2 sobre placas de 6 pocilios recubiertos (Millipore, catálogo número PICL06P05).
Ensayo de cocultivo.
Para el ensayo de cocultivo, se usó un sistema de 6 pocilios Transwell (Corning catálogo número 3450). Las células madre neurales hipocampales de ratas adultas se sembraron en placas solas o con hUTC a 20,000 células/cm2 sobre el fondo del pocilio. Los cultivos se incubaron con DMEM/F12 con suplemento B27 y sin FGF; la mitad del medio se reemplazó por medio fresco día por medio.
Extracción de ARN/proteína.
Se preparó ARN y proteína con el uso del kit de ARN/proteína AHPrep (Qiagen, catálogo número 80404) de conformidad con las instrucciones del fabricante. El regulador de lisis usado para las células cultivadas en las placas de 6 pocilios se incrementó consecuentemente.
Síntesis de ARNc y eliminación de ADN genómico.
El procedimiento fue el aislamiento de ARNm y la preparación posterior de ADNc con el kit de transcripción inversa QuantiTect® (Qiagen, catálogo número 205313). El ADN genómico se eliminó de conformidad con las instrucciones del fabricante antes de la síntesis del ADNc. El ADNc se sintetizó con 0.5 microgramos de ARN total aislado de células madre neurales hipocampales de rata adulta con el uso del kit RT de QuantiTect® en un volumen total de 20 microlitros de conformidad con las instrucciones del fabricante.
PCR TaqMan cuantitativa.
La PCR se realizó en un sistema de PCR en tiempo real ABI 7000 en placas de reacción ópticas de 96 pocilios (Applied Biosystems, catálogo número 4306737) en un volumen final de 20 microlitros. Se detectó transcriptos de roedores con una mezcla de reacción que contenía 10 microlitros de mezcla maestra de PCR universal 2x TaqMan (Applied Biosystems, catálogo número 4364338), 1 microlitro - ensayo de expresión génica 20X TaqMan (Applied Biosystems, catálogo número 4331182); GFAP (ident. del ensayo: Rn 00566603_m1), nestina (Rn00364394_R1), proteína básica de mielina (ident. del ensayo: Rn00566745_m1), Sox2 (rn00584808_m1), isoforma de tubulina beta III (ident. del ensayo: Rn 00594933_m1) y GAPDH (ident. del ensayo: 99999916_s1). Se preparó 1 microlitro de ADN plantilla y 8 microlitros de agua libre de RNasa (Sigma, catálogo número W4502). Se realizaron amplificaciones a partir de una etapa de activación de UNG a 50 °C por 2 minutos seguido de una etapa de desnaturalización de plantilla de 10 minutos a 95 °C. Se realizaron 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C por 15 segundos y se combinó hibridación/extensión de iniciadores a 60 °C por 1 minuto.
Inmunoelectrotransferencia de proteínas.
Se desnaturalizó lisados de células completas (20 microgramos) por la ebullición en regulador Laemmli (Boston Bioproducts, catálogo número BP-111R) por 3 minutos. Posteriormente, las muestras se resolvieron por SDS-PAGE en un gel de tris-glicina al 10 % (Invitrogen, catálogo número: EC6078BOX) en regulador activo Tris glicina para SDS (Boston Bioproducts, catálogo número BP-150) a 40 mA por 1 hora. Las proteínas se transfirieron sobre una membrana de PVDF de 0.45 micrómetros (Invitrogen, catálogo número LC2005) con el uso de una célula electroforética semiseca Trans-Blot® (Bio-Rad) en regulador de transferencia (base Tris 25 mM; glicina 192 mM; 10 % (v/v) de metanol). La transferencia se realizó a 25 V por 45 minutos. La membrana se bloqueó con 3 % (p/v) de BSA en PBST (PBS más 0.1 % (v/v) de Tween 20) a temperatura ambiente por 1 hora. Las membranas se probaron con anticuerpos primarios por 1 hora a temperatura ambiente. Después de eso, las membranas se lavaron 3 veces con PBST y, posteriormente, se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante por 1 hora a temperatura ambiente a 1 :5000 en PBS. Las señales se detectaron con el uso de sustrato de duración extendida SuperSignal® West Dura (Pierce, catálogo número 34076). Se usaron los siguientes anticuerpos: isoforma anti-tubulina III beta (1:250, Millipore, catálogo número MAB 1637); anti-GFAP (1 :2000, DAKO, catálogo número Z0334); anti-Sox (1:1000, Abcam, catálogo número ab59776); anti-MBP (1 :500, Millipore, catálogo número MAB 382), conjugado de peroxidasa anti-GAPDH (1 :5000, Sigma, catálogo número G9295); IgG antiratón de cabra HRP (R&D systems, catálogo número HAF007); e IgG anticonejo de cabra HRP (Sigma, catálogo número A0545).
Citometría de flujo.
Las células madre neurales hipocampales de rata adulta se separaron con Accutase® después del ensayo de cocultivo y se suspendieron brevemente en PBS que contenía 1 % de paraformaldehído. Después, las células se resuspendieron e incubaron con regulador bloqueante (PBS con 0.3 % de Tritón X-100 (Sigma, catálogo número T9284)) y 0.3 % de suero de cabra (Millipore, catálogo número S26) por 15 a 30 minutos seguido de anticuerpos primarios (1 :200, excepto por GFAP a 1 :2000) en regulador bloqueante por 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se lavaron tres veces con regulador (PBS con 0.3 % de Triton-X100) antes de la incubación con los anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo adecuados (1 :400), tales como por ejemplo, IgG anticonejo de cabra conjugada con R-ficoeritrina (Molecular Probes, catálogo número P-2771 MP) e IgG antiratón de cabra conjugada 488 Alexa Fluor® (Molecular Probes, catálogo número A-1 1029), en regulador bloqueante por 45 minutos. Después de eso, las células manchadas se lavaron tres veces con regulador de lavado, se suspendieron en PBS y se analizaron con el uso citometría de flujo (FACScalibur™).
Inmunocitoquímica.
Las células madre neurales hipocampales de rata adulta sembradas en una placa de 24 pocilios en el día 5 después del ensayo de cocultivo se lavaron con PBS frío y se fijaron con 3 % de paraformaldehído por 20 minutos a 4 °C. Las células fijadas se lavaron dos veces con PBS seguido de la permeabilización con regulador bloqueante (temperatura ambiente, 15 minutos) y la incubación a temperatura ambiente por 1 hora con anticuerpos primarios (1:200, excepto para GFAP a 1 :2000). Las células manchadas se lavaron tres veces en regulador de lavado antes de la incubación con los anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo adecuados. Después del lavado final (cinco veces en regulador de lavado), las células manchadas se examinaron por medio de microscopía de fluorescencia confocal (Olympus). Todas las imágenes se captaron con un lente objetivo de 20X.
Resultados Las hUTC inducen la diferenciación de células madre neurales.
Para investigar el efecto de las hUTC en la diferenciación de las células madre neurales se realizó un experimento de cocultivo con o sin la adición de FGF-2. Sin suplemento de FGF-2, las células tienden a diferenciarse deficientemente. Para analizar la capacidad de diferenciación de las células madre neurales con o sin hUTC después de 3 días se cuantificaron los marcadores neuronales y no neuronales por PCR en tiempo real, análisis Western y citometría de flujo. Se identificó el fenotipo celular por la medición de la expresión de genes marcadores principales: SOX para células progenitoras; proteína acídica fibrilar glial (GFAP) para astrocitos; beta tubulina III para neuronas y proteínas básicas de mielina (MBP) para oligodendrocitos. Los resultados muestran que las hUTC indujeron un aumento en los transcriptos de GFAP; el aumento fue aún mayor en presencia de FGF-2 exógeno. La expresión de la isofomna de beta tubulina III fue tres veces mayor en presencia de hUTC y FGF-2. Además, aumentó el nivel de proteína de GFAP. La citometría de flujo mostró: (1) una población de células clara que exhibió expresión de GFAP; y (2) una población clara, pero pequeña de células positivas para beta tubulina III. Se observó una expresión de proteínas similar en ausencia o presencia de FGF-2 en el medio. El mismo sistema experimental se realizó con el uso de células madre neurales lesionadas químicamente por medio de azida sódica y desoxiglucosa. Cuando se trató las células madre neurales isquémicas con hUTC se observó una tendencia similar de expresión de transcritos y proteínas, excepto que los transcritos de GFAP aumentaron 100-200 veces en presencia de FGF-2.
Transcritos neuronales y no neuronales cuantificados por PCR en tiempo real.
Las células madre neurales hipocampales de rata adulta se cocultivaron indirectamente (Tabla 23-1) o directamente con hUTC (Tabla 23-2). El nivel del transcrito se expresa como un aumento en veces con respecto a las células control (células madre neurales solas). Los resultados se indican en tablas a partir de dos conjuntos independientes de experimentos. Los datos son promedios de ± S.D.
Resumen. Los factores secretados por hUTC promovieron la diferenciación de células madre neurales en gliales y neuronales ¡n vitro.
Ejemplo 24 Factores tróficos para la diferenciación de progenitores neurales con el uso de células PC 12 como modelo Las células PC 2 son un sistema de modelo útil para la diferenciación neuronal. Estas células se proliferan indefinidamente en cultivo, pero pueden diferenciarse en células similares a las neuronas cuando se tratan con factores específicos, que incluyen el factor de crecimiento nervioso (NGF), el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y, posiblemente, la interleucina 6 (IL-6), el factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF) y el factor inhibidor de leucemia (LIF). Los estudios previos han demostrado que las hUTC secretan factores neurotróficos in vitro. El objetivo de este estudio era determinar si los factores solubles de hUTC podrían promover la diferenciación de células PC12.
Materiales y métodos Cultivo de células y medio acondicionado.
Se descongelaron cuatro millones de células derivadas del tejido umbilical humano (hUTC) (núm. de lote 1027, pase 2 o 4), se sembraron sobre matraces T75 y se cultivaron en medio de crecimiento Hayflick (DMEM con bajo contenido de glucosa (Gibco, catálogo número 1885-084), 15 % v/v de suero fetal bovino (FBS, Hyclone catálogo número SH30070.03IR), Glutamax 4 mM (Gibco, catálogo número 3505-061) y 1 % de penicilina/estreptomicina (Gibco catálogo número 1070063) de la noche a la mañana. Al día siguiente, las células se lavaron tres veces con solución salina regulada con fosfato (PBS, Invitrogen, catálogo número 25200-056) y se incubaron con Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI, ATCC, catálogo número 30-2001), 0.5 % de suero de caballo inactivado por calor (Gibco, catálogo número 26050088) y 1 % de penicilina/estreptomicina por 48 horas. El medio se eliminó y centrifugó a 2500 rpm por 5 minutos.
Se descongelaron células Neuroscreen-1 , células del subclon de PC12 (núm. de lote NS1081219, Cellomics, catálogo número R04-0001-C1) (P2 o P6), se sembraron sobre matraces recubiertos de colágeno I (Nunc, catálogo número 132707) y se cultivaron en RPMI con 10 % de suero de caballo inactivado con calor, 5 % de FBS (ATCC, catálogo número 30-2020) y 1 % de penicilina/estreptomicina de conformidad con las instrucciones del fabricante. Cuando las células alcanzaron 70 % de confluencia, se separaron con el uso de TrypLE™ (Gibco, catálogo número 12604-021) y se cuantificaron con el uso de un instrumento Guava®. Para el ensayo de diferenciación, las células se sembraron a 20 a 30,000 células/cm2 en placas de 6 pocilios recubiertos con colágeno (Millipore, catálogo número PICL06P05).
Tratamiento con factores de crecimiento y medio acondicionado.
Se lavaron células Neuroscreen-1 tres veces con PBS y se inactivaron por 18-24 horas con RPMI y 0.5 % de suero de caballo antes del tratamiento con 10 ng/ml de factor de crecimiento nervioso humano beta (NGF, Millipore, catálogo número GF028) o medio acondicionado. Las células se cultivaron por 4 días.
Ensayo del crecimiento de neuritas.
Se realizó la evaluación inmunocitoquímica del crecimiento de neuritas con el uso de un kit de crecimiento de neuritas de conformidad con las instrucciones del fabricante (Thermo Fisher Scientific). Después del tratamiento con NGF o medio acondicionado con hUTC en el momento especificado las células se fijaron por 20 minutos con el uso de 4 % de paraformaldehído en PBS a 37 °C. Los cuerpos celulares y procesos se marcaron con el uso de un anticuerpo primario anti-beta III tubulina seguido del anticuerpo secundario conjugado con 488 Alexa Fluor®. Se incluyó tinte Hoechst 33258 en el fijador para marcar los núcleos celulares. Después, las placas se cargaron en una plataforma de imágenes de alto contenido de VTI Cellomics ArrayScan® para la captura y análisis automático de las imágenes. Este sistema se basa en un microscopio de epifluorescencia invertido que enfoca y explora automáticamente los campos en pocilios individuales con el uso de una etapa motorizada. Se produjeron imágenes de fluorescencia con el uso de un filtro de emisión de múltiples pases de banda y filtros de excitación coincidentes para el canal azul (núcleos) y el canal verde (cuerpo celular y procesos) y se captaron con una cámara con dispositivo de carga de alta resolución acoplado. Las imágenes adquiridas se analizaron con el programa ArrayScan® por la bioaplicación de perfilado neuronal (Thermo Fisher Scientific) para medir varios parámetros morfológicos que incluyen la longitud total de neuritas por célula, las neuritas por célula, los puntos de ramificación y el área corporal de la célula para cada célula válida en la imagen. Una célula se definió como diferenciada cuando tenia una longitud de neuritas total > 5 micrómetros, que es el doble de la longitud de neuritas total en células en ausencia de NGF. Con el uso de un objetivo 10? se adquirió una cantidad suficiente de campos para el análisis de al menos 500 células por pocilio.
Resultados Para evaluar si las hUTC inducen la neurogénesis en células neuroscreen-1 se usó medio acondicionado (a partir de hUTC cultivadas) para cultivar células PC12 inactivadas por 4 días. Para el control positivo, se trataron células neuroscreen-1 con 10 ng/ml de NGF. El efecto de NGF o medio acondicionado se observó por microscopía. En ausencia de NGF o medio acondicionado con hUTC las células son relativamente pequeñas y redondeadas y tienen muy pocas neuritas visibles. El tratamiento con NGF o medio acondicionado por 2 a 4 días produjo cuerpos celulares ligeramente más grandes con una red de extensión de neuritas. Se produjo un aumento gradual en la longitud de neuritas después de la exposición a NGF o medio acondicionado. Más del 40 % de las células se diferenciaron en el cuarto día de exposición al medio acondicionado. Para cuantificar la diferenciación de células neuroscreen-1 , las células se marcaron con anticuerpos de la isoforma de beta-tubulina III; las imágenes se captaron y analizaron por medio de Neuronal Profiling BioApplication. En células PC12 tratadas con medio acondicionado con hUTC y NGF se produjeron aumentos en la longitud de las neuritas, la cantidad de neuritas y los puntos de ramificación por células. Por lo tanto, el medio acondicionado con hUTC es suficiente para inducir la diferenciación de las células PC 12.
Células Neuroscreen-1 inducidas por NGF y medio acondicionado con hUTC por 48 horas (Tabla 24-1).
Se cultivó células Neuroscreen-1 en placas de 12 pocilios por 4 días en 0.5 % de RPMI de suero de caballo (control negativo) o con 20 ng/ml de NGF (control positivo) o medio acondicionado por 48 horas. Después de 4 días, las células se fijaron y mancharon tal como se describió en la sección Materiales y métodos. Los resultados se indican en tablas a partir de dos conjuntos independientes de experimentos. Los datos son promedios de ± S.D.
Resumen. Los resultados indican que los factores solubles secretados por las hUTC inducen la neurogénesis en células PC 12 tal como indican los cambios morfológicos Ejemplo 25 Protocolo esperado para la administración múltiple de hUTC para la esclerosis lateral amiotrófica Los resultados del estudio sugieren que las hUTC pueden ser eficaces en el modelo de rata SOD1 G93A de esclerosis lateral amiotrófica (ALS) con una sola administración. Como tal, los estudios adicionales pueden demostrar que la administración repetida de hUTC puede tener una eficacia adicional en este modelo de enfermedad.
Las ratas SOD1 G93A se pueden tratar con hUTC en o cerca del momento de inicio de la enfermedad con hUTC inyectadas directamente en el espacio intratecal o cisterna magna. Las células se pueden inyectar en forma semanal o con una frecuencia mayor o menor. Para minimizar la lesión y maximizar la recuperación inmediata del animal, se puede usar un método de inyección transcutánea para suministrar intratecalmente el producto de células de hUTC en el CSF de la cisterna lumbar de ratas SOD1. Los animales se colocan sobre un dispositivo estereotáxico Kopf y se anestesian con gas anestésico (isoflurano: oxígeno: óxido nitroso = 1 :33:66). Se realiza el afeitado de la región lumbar y se coloca un elemento cilindrico de soporte debajo de la parte inferior del abdomen de la rata para estirar los espacios intervertebrales de la columna lumbar. Las células se suministran con microjeringas de 200-500 µ? equipadas con una aguja de 25Gx2.54 cm (1"). La aguja con la microjeringa vacía se inserta lentamente en el espacio subaracnoideo en los espacios invertebrales L4-5 o L6-S1. Cuando se observa una señal física de irritación de la cauda equina, es decir, un movimiento rápido de la pata delantera o trasera, las células se infunden lentamente en el espacio subaracnoideo durante un periodo de 1 minuto. La jeringa se mantiene en el lugar por 2 minutos y, después, se extrae. El punto de entrada de la aguja se presiona con la punta de un cotonete de algodón sumergido en yodo por 1 minuto y, después, se quita al animal y se lo resucita en una almohadilla térmica. Una vez que el animal se despierta, es devuelto a su jaula.
Los animales se pueden tratar con hUTC en niveles de dosis diferentes con el suministro de una cantidad constante de volumen de inyección total. Los animales se pueden tratar con hUTC en intervalos de aproximadamente dos semanas y evaluarse hasta la etapa final.
El avance de la enfermedad y la eficacia terapéutica potencial se controlan a través de dos mediciones resultantes: (1) actividad locomotora funcional (medida semanalmente); y (2) peso corporal (medido dos veces a la semana). Las pruebas de locomoción incluyen la prueba de Basso, Beattie y Bresnahan (BBB) (Basso y otros (1995) J Neurotrauma 1995; 12(1): 1 ; Basso y otros (1996) Exp. Neurol. 139: 244-256) y la prueba de plano inclinado (Rivlin AS, Tator CH. (1977) J Neurosurg 47(4): 577).
Para el puntaje de BBB, las ratas se domestican y adaptan al campo abierto. Una vez que una rata camina en forma continua en el campo abierto, dos examinadores que desconocían el tratamiento, realizan una sesión de prueba de 4 minutos con el uso de la escala de clasificación de locomoción de BBB que es una escala de 21 puntos de alta reproducibilidad intra e interobservadores. La prueba de campo abierto se grabó en video. A partir de esta cinta, dos examinadores evaluaron cuantitativamente la cantidad de movimientos de la extremidad trasera (HL, por sus siglas en inglés) que se realizaron en un periodo de 1 minuto; este periodo está compuesto por episodios producidos durante la sesión de pruebas de 4 minutos cuando se visualiza en forma total con la cámara cada HL. El límite de tiempo de 1 minuto asegura que se evalúan las HL derecha e izquierda de cada animal por el mismo tiempo, ya que no siempre la cámara visualiza ambas HL en su totalidad. En aquellos casos en los cuales los puntajes de los examinadores no coinciden, las imágenes se evalúan nuevamente a velocidad lenta. Se asigna un puntaje de 0 cuando no se produce movimiento observable de la extremidad trasera y los puntos iniciales se asignaron para los movimientos aislados de las articulaciones. El puntaje aumenta cuando más articulaciones muestran movimiento y/o los movimientos son más extensos. A medida que aumenta la locomoción, se asigna puntos para la colocación de la planta de la pata, el soporte de peso y la coordinación entre la extremidad delantera y trasera. Los puntos finales se obtienen por la separación entre los dedos de la pata, la estabilidad del tronco y la posición de la cola.
El plano inclinado es otra tarea conductual que evalúa la capacidad del animal para mantener su posición en una plancha de caucho acanalada; esta plancha se elevó en incrementos de 5o. El ángulo máximo en el cual un animal puede soportar su peso por 5 segundos se define como el ángulo de capacidad. Esta prueba analiza la realimentación sensorial, la coordinación y la resistencia muscular necesarias para la locomoción.
La etapa final de la enfermedad se determina por la presencia de una parálisis tan severa que el animal no se podría enderezar por sí mismo dentro de los 20 segundos después de colocarlo, un valor final usado frecuentemente para ratas mutantes SOD1. Los puntajes de las pruebas de BBB y plano inclinado en este punto son cero.
La presente invención no se limita a las modalidades descritas y ejemplificadas anteriormente. Pueden variar y modificase dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (60)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1. El uso de células derivadas del tejido del cordón umbilical, en donde las células derivadas del tejido del cordón umbilical se aislan del tejido del cordón umbilical humano sustancialmente libre de sangre, son capaces de autorenovarse y expandirse en cultivo, tienen el potencial de diferenciarse en células de otros fenotipos, pueden experimentar al menos 40 duplicaciones y tienen las siguientes características: (a) expresa cada uno de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, PD-L2 y HLA-A,B,C; (b) no expresa ninguno de CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD 117, CD141 , CD178, B7-H2, HLA-G o HLA-DR,DP,DQ¡ y (c) mayor expresión de interleucina-8; reticulón 1 ; y ligando del receptor de quimocina (motivo C-X-C) 3, con respecto a las de una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal o una célula de la médula ósea de la cresta ilíaca, en la preparación de un medicamento para tratar la esclerosis lateral amiotrófica en un paciente.
2. El uso como se reclama en la reivindicación 1, en donde las células derivadas del tejido del cordón umbilical no expresan hTERT o telomerasa.
3. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde las células derivadas del tejido del cordón umbilical se inducen in vitro para diferenciarse en una línea celular neural.
4. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento está adaptado para ser administrable con al menos otro tipo celular de un astrocito, oligodendrocito, neurona, progenitor neural, célula madre neural u otra célula madre multipotente o pluripotente.
5. El uso como se reclama en la reivindicación 1, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable en un sitio predeterminado en el sistema nervioso del paciente.
6. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento está adaptado para ser administrable por medio de inyección o infusión.
7. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento está adaptado para ser administrable por inyección intravenosa o intratecal.
8. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento está adaptado para ser administrable encapsulado dentro de un dispositivo implantable.
9. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento está adaptado para ser administrable por medio de la implantación de una matriz o estructura que contiene las células.
10. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde las células derivadas del tejido del cordón umbilical ejercen un efecto trófico en el sistema nervioso del paciente.
11. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde las células derivadas del tejido del cordón umbilical se diseñan mediante ingeniería genética para producir un producto génico que promueve el tratamiento de la condición neurodegenerativa.
12. El uso de una población sustancialmente homogénea de células derivadas del tejido del cordón umbilical, en donde la población de células derivadas del tejido del cordón umbilical se aisla de tejido del cordón umbilical humano sustancialmente libre de sangre, puede autorenovarse y expandirse en cultivo, tiene el potencial de diferenciarse en células de otros fenotipos, puede experimentar al menos 40 duplicaciones y tiene las siguientes características: (a) expresa cada uno de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, PD-L2 y HLA-A,B,C; (b) no expresa ninguno de CD31 , CD34, CD45, CD80, CD86, CD 117, CD141 , CD178, B7-H2, HLA-G o HLA-DR,DP,DQ; y (c) mayor expresión de interleucina-8; reticulón 1; y ligando del receptor de quimocina (motivo C-X-C) 3, con respecto a las de una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal o una célula de la médula ósea de la cresta ilíaca, en la preparación de un medicamento para tratar la esclerosis lateral amiotrófica en un paciente.
13. El uso como se reclama en la reivindicación 12, en donde la población sustancialmente homogénea de células derivadas del tejido del cordón umbilical no expresan hTERT o telomerasa.
14. El uso como se reclama en la reivindicación 12, en donde la población sustancialmente homogénea de células derivadas del tejido del cordón umbilical se induce in vitro para diferenciarse en una línea celular neural.
15. El uso como se reclama en la reivindicación 12, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable con al menos otro tipo celular de un astrocito, oligodendrocito, neurona, progenitor neural, célula madre neural u otra célula madre multipotente o pluripotente.
16. El uso como se reclama en la reivindicación 12, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable en un sitio predeterminado en el sistema nervioso del paciente.
17. El uso como se reclama en la reivindicación 12, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable por inyección o infusión.
18. El uso como se reclama en la reivindicación 12, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable por inyección intravenosa o intratecal.
19. El uso como se reclama en la reivindicación 12, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable encapsulo dentro de un dispositivo implantable.
20. El uso como se reclama en la reivindicación 12, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable por medio del implante de una matriz o estructura que contiene las células.
21. El uso como se reclama en la reivindicación 12, en donde la población sustancíalmente homogénea de células derivadas del tejido del cordón umbilical ejerce un efecto trófico en el sistema nervioso del paciente.
22. El uso de una composición farmacéutica que comprende células derivadas del tejido del cordón umbilical, en donde las células derivadas del tejido del cordón umbilical se aislan del tejido del cordón umbilical humano sustancíalmente libre de sangre, son capaces de autorenovarse y expandirse en cultivo, tienen el potencial de diferenciarse en células de otros fenotipos, pueden experimentar al menos 40 duplicaciones y tienen las siguientes características: (a) expresa cada uno de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, PD-L2 y HLA-A,B,C; (b) no expresa ninguno de CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141 , CD178, B7-H2, HLA-G o HLA-DR,DP,DQ; y (c) mayor expresión de interleucina-8; reticulón 1 ; y ligando del receptor de quimocina (motivo C-X-C) 3, con respecto a las de una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal o una célula de la médula ósea de la cresta ilíaca, en la preparación de un medicamento para tratar la esclerosis lateral amiotrófica en un paciente.
23. El uso como se reclama en la reivindicación 22, en donde las células derivadas del tejido del cordón umbilical no expresan hTERT o telomerasa.
24. El uso como se reclama en la reivindicación 22, en donde las células derivadas del tejido del cordón umbilical se inducen in vitro para diferenciarse en una línea celular neural.
25. El uso como se reclama en la reivindicación 22, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable con al menos otro tipo celular de un astrocito, oligodendrocito, neurona, progenitor neural, célula madre neural u otra célula madre multipotente o pluripotente.
26. El uso como se reclama en la reivindicación 22, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable en un sitio predeterminado en el sistema nervioso del paciente.
27. El uso como se reclama en la reivindicación 22, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable por inyección o infusión.
28. El uso como se reclama en la reivindicación 22, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable por inyección intravenosa o intratecal.
29. El uso como se reclama en la reivindicación 22, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable encapsulo dentro de un dispositivo implantable.
30. El uso como se reclama en la reivindicación 22, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable por implantación de una matriz o estructura que contiene las células.
31. Células derivadas del tejido del cordón umbilical, en donde las células derivadas del tejido del cordón umbilical se aislan del tejido del cordón umbilical humano sustancialmente libre de sangre, son capaces de autorenovarse y expandirse en cultivo, tienen el potencial de diferenciarse en células de otros fenotipos, pueden experimentar al menos 40 duplicaciones y tienen las siguientes características: (a) expresa cada uno de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, PD-L2 y HLA-A,B,C; (b) no expresa ninguno de CD31 , CD34, CD45, CD80, CD86, CD 117, CD141 , CD178, B7-H2, HLA-G o HLA-DR,DP,DQ; y (c) mayor expresión de interleucina-8; reticulón 1 ; y ligando del receptor de quimocina (motivo C-X-C) 3, con respecto a las de una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal o una célula de la médula ósea de la cresta ilíaca, para usarse en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica en un paciente.
32. Las células derivadas del tejido del cordón umbilical de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizadas además porque las células derivadas del tejido del cordón umbilical no expresan hTERT o telomerasa.
33. Las células derivadas del tejido del cordón umbilical de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizadas además porque las células derivadas del tejido del cordón umbilical se inducen ¡n vitro para diferenciarse en una línea celular neural.
34. Las células derivadas del tejido del cordón umbilical de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizadas además porque las células derivadas del tejido del cordón umbilical están adaptadas para ser administrables con al menos otro tipo celular de un astrocito, oligodendrocito, neurona, progenitor neural, célula madre neural u otra célula madre multipotente o pluripotente.
35. Las células derivadas del tejido del cordón umbilical de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizadas además porque las células derivadas del tejido del cordón umbilical están adaptadas para ser administrables en un sitio predeterminado en el sistema nervioso del paciente.
36. Las células derivadas del tejido del cordón umbilical de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizadas además porque las células derivadas del tejido del cordón umbilical están adaptadas para ser administrables por medio de inyección o infusión.
37. Las células derivadas del tejido del cordón umbilical de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizadas además porque las células derivadas del tejido del cordón umbilical están adaptadas para ser administrables por inyección intravenosa o intratecal.
38. Las células derivadas del tejido del cordón umbilical de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizadas además porque las células derivadas del tejido del cordón umbilical están adaptadas para ser administrables encapsuladas dentro de un dispositivo implantable.
39. Las células derivadas del tejido del cordón umbilical de conformidad con la reivindicación 31, caracterizadas además porque las células derivadas del tejido del cordón umbilical están adaptadas para ser administrables por medio de la implantación de una matriz o estructura que contiene las células.
40. Las células derivadas del tejido del cordón umbilical de conformidad con la reivindicación 31, caracterizadas además porque las células derivadas del tejido del cordón umbilical ejercen un efecto trófico en el sistema nervioso del paciente.
41. Las células derivadas del tejido del cordón umbilical de conformidad con la reivindicación 31, caracterizadas además porque las células derivadas del tejido del cordón umbilical se diseñan mediante ingeniería genética para producir un producto génico que promueve el tratamiento de la condición neurodegenerativa.
42. Una población sustancialmente homogénea de células derivadas del tejido del cordón umbilical, en donde la población de células derivadas del tejido del cordón umbilical se aisla de tejido del cordón umbilical humano sustancialmente libre de sangre, puede autorenovarse y expandirse en cultivo, tiene el potencial de diferenciarse en células de otros fenotipos, puede experimentar al menos 40 duplicaciones y tiene las siguientes características: (a) expresa cada uno de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, PD-L2 y HLA-A,B,C; (b) no expresa ninguno de CD31 , CD34, CD45, CD80, CD86, CD 117, CD141 , CD178, B7-H2, HLA-G o HLA-DR.DP.DQ; y (c) mayor expresión de interleucina-8¡ reticulón 1 ; y ligando del receptor de quimocina (motivo C-X-C) 3, con respecto a las de una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal o una célula de la médula ósea de la cresta ilíaca, para usarse en el tratamiento de esclerosis lateral amiotrófica en un paciente.
43. La población sustancialmente homogénea de células derivadas del tejido del cordón umbilical de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque la población sustancialmente homogénea de células derivadas del tejido del cordón umbilical no expresan hTERT o telomerasa.
44. La población sustancialmente homogénea de células derivadas del tejido del cordón umbilical de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque la población sustancialmente homogénea de células derivadas del tejido del cordón umbilical se induce in vitro para diferenciarse en una línea celular neural.
45. La población sustancialmente homogénea de células derivadas del tejido del cordón umbilical de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque la población sustancialmente homogénea de células derivadas del tejido del cordón umbilical está adaptada para ser administrable con al menos otro tipo celular de un astrocito, oligodendrocito, neurona, progenitor neural, célula madre neural u otra célula madre multipotente o pluripotente.
46. La población sustancialmente homogénea de células derivadas del tejido del cordón umbilical de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque la población sustancialmente homogénea de células derivadas del tejido del cordón umbilical está adaptada para ser administrable en un sitio predeterminado en el sistema nervioso del paciente.
47. La población sustancialmente homogénea de células derivadas del tejido del cordón umbilical de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque la población sustancialmente homogénea de células derivadas del tejido del cordón umbilical está adaptada para ser administrable por inyección o infusión.
48. La población sustancialmente homogénea de células derivadas del tejido del cordón umbilical de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque la población sustancialmente homogénea de células derivadas del tejido del cordón umbilical está adaptada para ser administrable por inyección intravenosa o intratecal.
49. La población sustancialmente homogénea de células derivadas del tejido del cordón umbilical de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque la población sustancialmente homogénea de células derivadas del tejido del cordón umbilical está adaptada para ser administrable encapsula dentro de un dispositivo implantable.
50. La población sustancialmente homogénea de células derivadas del tejido del cordón umbilical de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque la población sustancialmente homogénea de células derivadas del tejido del cordón umbilical está adaptada para ser administrable por medio del implante de una matriz o estructura que contiene las células.
51. La población sustancialmente homogénea de células derivadas del tejido del cordón umbilical de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque la población sustancialmente homogénea de células derivadas del tejido del cordón umbilical ejerce un efecto trófico en el sistema nervioso del paciente.
52. Una composición farmacéutica que comprende células derivadas del tejido del cordón umbilical, en donde las células derivadas del tejido del cordón umbilical se aislan del tejido del cordón umbilical humano sustancialmente libre de sangre, son capaces de autorenovarse y expandirse en cultivo, tienen el potencial de diferenciarse en células de otros fenotipos, pueden experimentar al menos 40 duplicaciones y tienen las siguientes características: (a) expresa cada uno de CD10, CD 3, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, PD-L2 y HLA-A,B,C; (b) no expresa ninguno de CD31 , CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141 , CD178, B7-H2, HLA-G o HLA-DR.DP.DQ; y (c) mayor expresión de interleucina-8; reticulón 1 ; y ligando del receptor de quimocina (motivo C-X-C) 3, con respecto a las de una célula humana que es un fibroblasto, una célula madre mesenquimal o una célula de la médula ósea de la cresta ilíaca, para usarse en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica en un paciente.
53. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada además porque las células derivadas del tejido del cordón umbilical no expresan hTERT o telomerasa.
54. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada además porque las células derivadas del tejido del cordón umbilical se inducen in vitro para diferenciarse en una línea celular neural.
55. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada además porque el medicamento está adaptado para ser administrable con al menos otro tipo celular de un astrocito, oligodendrocito, neurona, progenitor neural, célula madre neural u otra célula madre multipotente o pluripotente.
56. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada además porque la composición farmacéutica está adaptada para ser administrable en un sitio predeterminado en el sistema nervioso del paciente.
57. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada además porque la composición farmacéutica está adaptada para ser administrable por inyección o infusión.
58. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada además porque la composición farmacéutica está adaptada para ser administrable por inyección intravenosa o intratecal.
59. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada además porque la composición farmacéutica está adaptada para ser administrable encapsula dentro de un dispositivo implantable.
60. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada además porque la composición farmacéutica está adaptada para ser administrable por implantación de una matriz o estructura que contiene las células.
MX2013009421A 2011-02-14 2012-02-14 Tratamiento de la esclerosis lateral amiotrofica con el uso de celulas derivadas del cordon umbilical. MX343931B (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/026,995 US8491883B2 (en) 2003-06-27 2011-02-14 Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using umbilical derived cells
PCT/US2012/025086 WO2012112576A1 (en) 2011-02-14 2012-02-14 Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using umbilical derived cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
MX2013009421A true MX2013009421A (es) 2014-02-27
MX343931B MX343931B (es) 2016-11-28

Family

ID=45755574

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2013009421A MX343931B (es) 2011-02-14 2012-02-14 Tratamiento de la esclerosis lateral amiotrofica con el uso de celulas derivadas del cordon umbilical.

Country Status (12)

Country Link
US (1) US8491883B2 (es)
EP (1) EP2675464B1 (es)
JP (1) JP6000982B2 (es)
AU (1) AU2012217782B2 (es)
BR (1) BR112013020586A2 (es)
ES (1) ES2616457T3 (es)
MX (1) MX343931B (es)
PL (1) PL2675464T3 (es)
RU (1) RU2612391C2 (es)
SG (2) SG10201603861RA (es)
WO (1) WO2012112576A1 (es)
ZA (1) ZA201306916B (es)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9592258B2 (en) 2003-06-27 2017-03-14 DePuy Synthes Products, Inc. Treatment of neurological injury by administration of human umbilical cord tissue-derived cells
US9572840B2 (en) 2003-06-27 2017-02-21 DePuy Synthes Products, Inc. Regeneration and repair of neural tissue using postpartum-derived cells
WO2008132722A1 (en) 2007-04-26 2008-11-06 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Pluripotent autologous stem cells from oral mucosa and methods of use
BRPI1013409A2 (pt) 2009-03-26 2018-01-16 Advanced Tech And Regenerative Medicine Llc células de tecido de cordão umbilical humano como terapia para doença de alzheimer
US8796315B2 (en) 2009-06-25 2014-08-05 Darlene E. McCord Methods for improved wound closure employing olivamine and human umbilical vein endothelial cells
KR101468123B1 (ko) * 2012-11-27 2014-12-08 차의과학대학교 산학협력단 탯줄 유래 줄기세포를 포함하는 근위축 질환 개선 또는 치료용 조성물
US9144555B2 (en) 2012-11-30 2015-09-29 Darlene E. McCord Hydroxytyrosol and oleuropein compositions for induction of DNA damage, cell death and LSD1 inhibition
US20140274649A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 Sean Kerr Bone Marrow Concentrator
US20150079062A1 (en) * 2013-07-12 2015-03-19 Patrick J. Casey Method for harvesting, processing, and storage of proteins from the mammalian feto-placental unit and use of such proteins in compositions and medical treatment
US20190127702A1 (en) * 2014-08-14 2019-05-02 Avita International Ltd. Stem cell compositions and methods of producing stem cells for therapeutic applications
JP7126703B2 (ja) * 2016-05-24 2022-08-29 国立大学法人 東京大学 臍帯由来細胞を含む脳障害の治療剤
WO2021231905A1 (en) * 2020-05-15 2021-11-18 The University Of Kansas Ketamine treatment for amyotrophic lateral sclerosis

Family Cites Families (178)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4352883A (en) 1979-03-28 1982-10-05 Damon Corporation Encapsulation of biological material
US5266480A (en) 1986-04-18 1993-11-30 Advanced Tissue Sciences, Inc. Three-dimensional skin culture system
US5863531A (en) * 1986-04-18 1999-01-26 Advanced Tissue Sciences, Inc. In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework
US5902741A (en) 1986-04-18 1999-05-11 Advanced Tissue Sciences, Inc. Three-dimensional cartilage cultures
US4963489A (en) 1987-04-14 1990-10-16 Marrow-Tech, Inc. Three-dimensional cell and tissue culture system
CA1322262C (en) 1987-06-26 1993-09-21 Yoshito Ikada Artificial skin
NZ226750A (en) 1987-10-29 1990-09-26 Amrad Corp Ltd Immortalisation of neural precursor cells by introducing a retrovirus vector containing a myc-oncogene
US5192553A (en) * 1987-11-12 1993-03-09 Biocyte Corporation Isolation and preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood and methods of therapeutic use
US5004681B1 (en) * 1987-11-12 2000-04-11 Biocyte Corp Preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood
US20030032178A1 (en) * 1988-08-04 2003-02-13 Williams Robert Lindsay In vitro propagation of embryonic stem cells
US5437994A (en) 1989-06-15 1995-08-01 Regents Of The University Of Michigan Method for the ex vivo replication of stem cells, for the optimization of hematopoietic progenitor cell cultures, and for increasing the metabolism, GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of human stromal cells
US5840580A (en) 1990-05-01 1998-11-24 Becton Dickinson And Company Phenotypic characterization of the hematopoietic stem cell
US5342761A (en) 1990-10-01 1994-08-30 Research Development Foundation Oncofetal gene, gene product and uses therefor
US5486359A (en) * 1990-11-16 1996-01-23 Osiris Therapeutics, Inc. Human mesenchymal stem cells
US5811094A (en) 1990-11-16 1998-09-22 Osiris Therapeutics, Inc. Connective tissue regeneration using human mesenchymal stem cell preparations
US5286632A (en) * 1991-01-09 1994-02-15 Jones Douglas H Method for in vivo recombination and mutagenesis
US6399369B1 (en) * 1991-07-08 2002-06-04 Neurospheres Holdings Ltd. Multipotent neural stem cell cDNA libraries
WO1994000484A1 (en) 1992-06-22 1994-01-06 Young Henry E Scar inhibitory factor and use thereof
US5320962A (en) * 1992-07-22 1994-06-14 Duke University DNA encoding the human A1 adenosine receptor
US5589376A (en) 1992-07-27 1996-12-31 California Institute Of Technology Mammalian neural crest stem cells
US20040224409A1 (en) 1992-09-25 2004-11-11 Laurent Pradier Recombinant adenoviruses coding for brain-derived neurotrophic factor (BDNF)
AU673865B2 (en) 1992-10-29 1996-11-28 Australian National University, The Angiogenesis inhibitory antibodies
US5670483A (en) 1992-12-28 1997-09-23 Massachusetts Insititute Of Technology Stable macroscopic membranes formed by self-assembly of amphiphilic peptides and uses therefor
US5955343A (en) 1992-12-28 1999-09-21 Massachusetts Institute Of Technology Stable macroscopic membranes formed by self-assembly of amphiphilic peptides and uses therefor
US5707643A (en) * 1993-02-26 1998-01-13 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. Biodegradable scleral plug
WO1994025584A1 (en) 1993-04-28 1994-11-10 Johns Hopkins University School Of Medicine Chronic endothelial cell culture under flow
IL110589A0 (en) 1993-08-10 1994-11-11 Bioph Biotech Entw Pharm Gmbh Growth/differentiation factor of the TGF- beta family
JP3680114B2 (ja) * 1993-09-17 2005-08-10 敏一 中村 脳神経障害治療剤
US6686198B1 (en) * 1993-10-14 2004-02-03 President And Fellows Of Harvard College Method of inducing and maintaining neuronal cells
US6432711B1 (en) 1993-11-03 2002-08-13 Diacrin, Inc. Embryonic stem cells capable of differentiating into desired cell lines
US5698518A (en) 1994-03-30 1997-12-16 Oklahoma Medical Research Foundation Method for regulating inflammation and tumor growth with calmodulin, calmodulin analogues or calmodulin antagonists
US5466233A (en) 1994-04-25 1995-11-14 Escalon Ophthalmics, Inc. Tack for intraocular drug delivery and method for inserting and removing same
US5834308A (en) 1994-04-28 1998-11-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans
US6001647A (en) 1994-04-28 1999-12-14 Ixion Biotechnology, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof
US6703017B1 (en) * 1994-04-28 2004-03-09 Ixion Biotechnology, Inc. Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US6309853B1 (en) 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US5725493A (en) * 1994-12-12 1998-03-10 Avery; Robert Logan Intravitreal medicine delivery
US5684032A (en) 1994-12-13 1997-11-04 Smithkline Beecham Corporation Compounds
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US5736396A (en) 1995-01-24 1998-04-07 Case Western Reserve University Lineage-directed induction of human mesenchymal stem cell differentiation
US5906934A (en) * 1995-03-14 1999-05-25 Morphogen Pharmaceuticals, Inc. Mesenchymal stem cells for cartilage repair
US5869079A (en) * 1995-06-02 1999-02-09 Oculex Pharmaceuticals, Inc. Formulation for controlled release of drugs by combining hydrophilic and hydrophobic agents
US5641750A (en) * 1995-11-29 1997-06-24 Amgen Inc. Methods for treating photoreceptors using glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product
US6200606B1 (en) * 1996-01-16 2001-03-13 Depuy Orthopaedics, Inc. Isolation of precursor cells from hematopoietic and nonhematopoietic tissues and their use in vivo bone and cartilage regeneration
US5842477A (en) 1996-02-21 1998-12-01 Advanced Tissue Sciences, Inc. Method for repairing cartilage
US6413735B1 (en) 1996-03-15 2002-07-02 Munin Corporation Method of screening for a modulator of angiogenesis
JP2000508922A (ja) 1996-04-26 2000-07-18 ケース ウエスターン リザーブ ユニバーシティ 間葉幹細胞を用いる皮膚再生
US6358737B1 (en) * 1996-07-31 2002-03-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Osteocyte cell lines
US6787355B1 (en) * 1996-08-26 2004-09-07 Mcgill University Multipotent neural stem cells from peripheral tissues and uses thereof
US5919702A (en) * 1996-10-23 1999-07-06 Advanced Tissue Science, Inc. Production of cartilage tissue using cells isolated from Wharton's jelly
AU738334B2 (en) * 1997-05-30 2001-09-13 Osteobiologics, Inc. Fiber-reinforced, porous, biodegradable implant device
US5902598A (en) * 1997-08-28 1999-05-11 Control Delivery Systems, Inc. Sustained release drug delivery devices
AU1615599A (en) * 1997-12-02 1999-06-16 Zen Bio, Inc. Differentiation of adipose stromal cells into osteoblasts and uses thereof
US6291240B1 (en) 1998-01-29 2001-09-18 Advanced Tissue Sciences, Inc. Cells or tissues with increased protein factors and methods of making and using same
ATE286118T1 (de) * 1998-03-13 2005-01-15 Osiris Therapeutics Inc Anwendungen für humane nicht autologe, mesenchymale stammzellen
US6179872B1 (en) * 1998-03-17 2001-01-30 Tissue Engineering Biopolymer matt for use in tissue repair and reconstruction
US6171610B1 (en) * 1998-04-24 2001-01-09 University Of Massachusetts Guided development and support of hydrogel-cell compositions
WO1999056759A1 (en) * 1998-05-07 1999-11-11 University Of South Florida Bone marrow cells as a source of neurons for brain and spinal cord repair
EP1082410B1 (en) * 1998-05-29 2007-08-01 Osiris Therapeutics, Inc. Human cd45+ and/or fibroblast + mesenchymal stem cells
US6323188B1 (en) 1998-07-01 2001-11-27 Donald L. Weissman Treatment and prevention of cardiovascular diseases, heart attack, and stroke, primary and subsequent, with help of aspirin and certain vitamins
US20040037818A1 (en) * 1998-07-30 2004-02-26 Brand Stephen J. Treatment for diabetes
US5958767A (en) * 1998-08-14 1999-09-28 The Children's Medical Center Corp. Engraftable human neural stem cells
US6284245B1 (en) 1998-08-25 2001-09-04 Diacrin, Inc. Neural retinal cells and retinal pigment epithelium cells and their use in treatment of retinal disorders
US6444205B2 (en) 1998-09-30 2002-09-03 Diacrin, Inc. Transplantation of neural cells for the treatment of chronic pain or spasticity
US6610540B1 (en) * 1998-11-18 2003-08-26 California Institute Of Technology Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells
IL144378A0 (en) 1999-02-04 2002-05-23 Univ Mcgill Platform for the differentiation of cells
WO2000047720A2 (en) 1999-02-10 2000-08-17 Curis, Inc. Pancreatic progenitor cells, methods and uses related thereto
US20030007954A1 (en) * 1999-04-12 2003-01-09 Gail K. Naughton Methods for using a three-dimensional stromal tissue to promote angiogenesis
EP1171006B1 (en) * 1999-04-16 2006-03-29 Wm. MARSH RICE UNIVERSITY Functionalized poly(propylene fumarate) and poly(propylene fumarate-co-ethylene glycol)
US6372494B1 (en) * 1999-05-14 2002-04-16 Advanced Tissue Sciences, Inc. Methods of making conditioned cell culture medium compositions
US6287340B1 (en) * 1999-05-14 2001-09-11 Trustees Of Tufts College Bioengineered anterior cruciate ligament
US6355699B1 (en) * 1999-06-30 2002-03-12 Ethicon, Inc. Process for manufacturing biomedical foams
US6333029B1 (en) 1999-06-30 2001-12-25 Ethicon, Inc. Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue
US7621606B2 (en) * 2001-08-27 2009-11-24 Advanced Cell Technology, Inc. Trans-differentiation and re-differentiation of somatic cells and production of cells for cell therapies
US6555374B1 (en) * 1999-08-19 2003-04-29 Artecel Sciences, Inc. Multiple mesodermal lineage differentiation potentials for adipose tissue-derived stromal cells and uses thereof
US6429013B1 (en) 1999-08-19 2002-08-06 Artecel Science, Inc. Use of adipose tissue-derived stromal cells for chondrocyte differentiation and cartilage repair
US6331313B1 (en) 1999-10-22 2001-12-18 Oculex Pharmaceticals, Inc. Controlled-release biocompatible ocular drug delivery implant devices and methods
US20030129745A1 (en) * 1999-10-28 2003-07-10 Robl James M. Gynogenetic or androgenetic production of pluripotent cells and cell lines, and use thereof to produce differentiated cells and tissues
US20020164307A1 (en) 1999-12-06 2002-11-07 Habener Joel F. Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus
US20010046489A1 (en) * 1999-12-06 2001-11-29 Habener Joel E. Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus
US20030082155A1 (en) * 1999-12-06 2003-05-01 Habener Joel F. Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus
US7785882B2 (en) 2000-01-18 2010-08-31 Cornell Research Foundation, Inc. Neuronal progenitor cells from hippocampal tissue and a method for isolating and purifying them
US7544509B2 (en) * 2000-01-24 2009-06-09 Mcgill University Method for preparing stem cell preparations
US6610535B1 (en) 2000-02-10 2003-08-26 Es Cell International Pte Ltd. Progenitor cells and methods and uses related thereto
US7514259B2 (en) 2000-02-11 2009-04-07 Schepens Eye Research Institute Isolation and transplantation of retinal stem cells
ES2292564T3 (es) 2000-02-11 2008-03-16 Philadelphia Health And Education Corporation Diferenciacion de celulas de la medula osea en celulas neuronales y usos asociados.
WO2001066698A1 (en) * 2000-03-09 2001-09-13 Cryo-Cell International, Inc. Human cord blood as a source of neural tissue for repair of the brain and spinal cord
US6436704B1 (en) 2000-04-10 2002-08-20 Raven Biotechnologies, Inc. Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof
US6673606B1 (en) * 2000-04-12 2004-01-06 The Children's Hospital Of Philadelphia Therapeutic uses for mesenchymal stromal cells
AT412303B (de) 2000-04-18 2004-12-27 Hoerbiger Ventilwerke Gmbh Ventil
US6375972B1 (en) * 2000-04-26 2002-04-23 Control Delivery Systems, Inc. Sustained release drug delivery devices, methods of use, and methods of manufacturing thereof
CA2408701A1 (en) 2000-05-12 2001-11-22 University Of Utah Research Foundation Compositions and methods for tissue dedifferentiation and regeneration
US8273570B2 (en) 2000-05-16 2012-09-25 Riken Process of inducing differentiation of embryonic cell to cell expressing neural surface marker using OP9 or PA6 cells
US7049072B2 (en) 2000-06-05 2006-05-23 University Of South Florida Gene expression analysis of pluri-differentiated mesenchymal progenitor cells and methods for diagnosing a leukemic disease state
US6759039B2 (en) * 2000-06-30 2004-07-06 Amcyte, Inc. Culturing pancreatic stem cells having a specified, intermediate stage of development
US6984522B2 (en) 2000-08-03 2006-01-10 Regents Of The University Of Michigan Isolation and use of solid tumor stem cells
WO2002026941A2 (en) 2000-09-29 2002-04-04 Kooy Derek V D Primitive neural stem cells and method for differentiation of stem cells to neural cells
US20020098584A1 (en) * 2000-11-06 2002-07-25 Palmer Theo D. Postmortem stem cells
WO2002102997A2 (en) 2000-11-30 2002-12-27 Stemron Inc. Isolated homozygous stem cells differentiated cells derived therefrom and materials and methods for making and using same
US7311905B2 (en) 2002-02-13 2007-12-25 Anthrogenesis Corporation Embryonic-like stem cells derived from post-partum mammalian placenta, and uses and methods of treatment using said cells
KR100915482B1 (ko) 2000-12-06 2009-09-03 하리리 로버트 제이 태반 줄기 세포의 회수 방법
US6599323B2 (en) * 2000-12-21 2003-07-29 Ethicon, Inc. Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use
DE60230593D1 (de) 2001-02-06 2009-02-12 Massachusetts Inst Technology Peptidgerüstverkapselung von gewebszellen und verwendungen davon
US7449180B2 (en) 2001-02-06 2008-11-11 John Kisiday Macroscopic scaffold containing amphiphilic peptides encapsulating cells
MX348185B (es) 2001-02-14 2017-06-02 Anthrogenesis Corp Placenta de mamíferos postparto, su uso y células madres placentales extraídas de ella.
EP2316919B1 (en) * 2001-02-14 2015-10-07 Anthrogenesis Corporation Post-partum mammalian placenta, its use and placental stem cells therefrom
US7202080B2 (en) 2001-03-29 2007-04-10 Ixion Biotechnology, Inc. Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic differentiation pathway
US20030211605A1 (en) 2001-05-01 2003-11-13 Lee Sang-Hun Derivation of midbrain dopaminergic neurons from embryonic stem cells
US20030022369A1 (en) * 2001-05-18 2003-01-30 Helen Fillmore Differentiation of specialized dermal and epidermal cells into neuronal cells
CA2451838A1 (en) * 2001-05-25 2002-12-05 Cythera, Inc. Stem cell differentiation
AU2002324645C1 (en) * 2001-08-08 2008-11-06 Levesque Biosciences, Inc. Compositions and methods for isolation, propagation, and differentiation of human stem cells and uses thereof
US20030211603A1 (en) 2001-08-14 2003-11-13 Earp David J. Reprogramming cells for enhanced differentiation capacity using pluripotent stem cells
US20030104997A1 (en) * 2001-09-05 2003-06-05 Black Ira B. Multi-lineage directed induction of bone marrow stromal cell differentiation
CN1195055C (zh) 2001-09-06 2005-03-30 周胜利 从胎盘组织中提取造血干细胞用于建立造血干细胞库的新方法
US9969980B2 (en) 2001-09-21 2018-05-15 Garnet Biotherapeutics Cell populations which co-express CD49c and CD90
US20050053588A1 (en) * 2001-10-18 2005-03-10 Li Yin Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells
US7129034B2 (en) * 2001-10-25 2006-10-31 Cedars-Sinai Medical Center Differentiation of whole bone marrow
JP2005533480A (ja) * 2001-11-09 2005-11-10 アーテセル・サイエンシズ・インコーポレーテツド 脂肪組織由来間質細胞の膵内分泌分化およびその使用
ATE438708T1 (de) * 2001-11-15 2009-08-15 Childrens Medical Center Verfahren zur isolierung, expansion und differenzierung fötaler stammzellen aus chorionzotte, fruchtwasser und plazenta und therapeutische verwendungen davon
JP3728750B2 (ja) * 2001-11-22 2005-12-21 ニプロ株式会社 培養皮膚及びその製造方法
EP1449542B1 (en) 2001-11-28 2012-06-13 AnGes MG, Inc. Hgf as genetic remedy for parkinson's disease
US20030109036A1 (en) * 2001-12-06 2003-06-12 The Regents Of The University Of California Method for differentiating islet precursor cells into beta cells
CA2692325C (en) * 2001-12-07 2015-10-20 Geron Corporation Islet cells from human embryonic stem cells
US20030113910A1 (en) * 2001-12-18 2003-06-19 Mike Levanduski Pluripotent stem cells derived without the use of embryos or fetal tissue
US7101546B2 (en) 2001-12-21 2006-09-05 Amcyte, Inc. In situ maturation of cultured pancreatic stem cells having a specified, intermediate stage of development
WO2003055989A2 (en) * 2001-12-21 2003-07-10 Mount Sinai Hospital Cellular compositions and methods of making and using them
CA2473503C (en) 2002-01-14 2010-01-05 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Use of modified pyrimidine compounds to promote stem cell migration and proliferation
US20030162290A1 (en) 2002-01-25 2003-08-28 Kazutomo Inoue Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells
KR101176146B1 (ko) * 2002-02-13 2012-08-22 안트로제네시스 코포레이션 산후 포유류 태반으로부터 유래한 배아-유사 줄기 세포와그 세포를 사용한 용도 및 치료방법
AU2003215297A1 (en) 2002-02-15 2003-09-09 Cornell Research Foundation, Inc. Enhancing neurotrophin-induced neurogenesis by endogenous neural progenitor cells by concurrent overexpression of brain derived neurotrophic factor and an inhibitor of a pro-gliogenic bone morphogenetic protein
US7736892B2 (en) 2002-02-25 2010-06-15 Kansas State University Research Foundation Cultures, products and methods using umbilical cord matrix cells
US20030161818A1 (en) 2002-02-25 2003-08-28 Kansas State University Research Foundation Cultures, products and methods using stem cells
US7150990B2 (en) 2002-03-06 2006-12-19 Reprocell, Inc. Self-renewing pluripotent hepatic stem cells
US7498171B2 (en) 2002-04-12 2009-03-03 Anthrogenesis Corporation Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof
JP4136434B2 (ja) 2002-04-17 2008-08-20 進 清野 インスリン産生細胞の誘導
CA2483010A1 (en) 2002-04-19 2003-10-30 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Placental derived stem cells and uses thereof
AU2003239176A1 (en) 2002-04-25 2003-11-10 Wisconsin Alumni Research Foundation Neurodegenerative disorder treatment using gdnf secreting neural cells
US20040029269A1 (en) * 2002-05-07 2004-02-12 Goldman Steven A Promoter-based isolation, purification, expansion, and transplantation of neuronal progenitor cells, oligodendrocyte progenitor cells, or neural stem cells from a population of embryonic stem cells
AU2003233119A1 (en) * 2002-05-08 2003-11-11 Neuronova Ab Modulation of neural stem cells with s1p or lpa receptor agonists
AU2003231950A1 (en) * 2002-05-30 2003-12-19 Celgene Corporation Modulating cell differentiation and treating myeloproliferative disorders with JNK/MKK inhibitors
US7410797B2 (en) * 2002-06-11 2008-08-12 Ogle Roy C Meningeal-derived stem cells
US7285415B2 (en) * 2002-07-11 2007-10-23 The Regents Of The University Of California Oligodendrocytes derived from human embryonic stem cells for remyelination and treatment of spinal cord injury
US7390659B2 (en) * 2002-07-16 2008-06-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for inducing differentiation of embryonic stem cells and uses thereof
EP1551955A4 (en) 2002-07-16 2006-11-29 Yissum Res Dev Co METHOD FOR IMPLANTING MESENCHYMAL STEM CELLS FOR TISSUE PAIRING AND FORMATION
AU2003265856A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-19 University Of Florida Neurogenesis from hepatic stem cells
US9969977B2 (en) * 2002-09-20 2018-05-15 Garnet Biotherapeutics Cell populations which co-express CD49c and CD90
US20090169597A1 (en) 2007-12-27 2009-07-02 Ethicon, Incorporated Treatment of intervertebral disc degeneration using human umbilical cord tissue-derived cells
BRPI0407221A (pt) 2003-02-11 2006-01-31 John E Davies Extrato de geléia de wharton, método para a obtenção de uma célula progenitora humana, métodos para a produção de uma população de células, populações de células e método para a produção de tecido ósseo
US8518390B2 (en) * 2003-06-27 2013-08-27 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Treatment of stroke and other acute neural degenerative disorders via intranasal administration of umbilical cord-derived cells
JP4950660B2 (ja) * 2003-06-27 2012-06-13 エチコン、インコーポレイテッド 分娩後由来細胞を使用する眼組織の修復および再生
US7875272B2 (en) 2003-06-27 2011-01-25 Ethicon, Incorporated Treatment of stroke and other acute neuraldegenerative disorders using postpartum derived cells
US20050089513A1 (en) * 2003-10-28 2005-04-28 Norio Sakuragawa Side population cells originated from human amnion and their uses
US7534606B2 (en) * 2004-01-12 2009-05-19 National Health Research Institutes Placental stem cell and methods thereof
US8039258B2 (en) * 2004-09-28 2011-10-18 Ethicon, Inc. Tissue-engineering scaffolds containing self-assembled-peptide hydrogels
EP2913393B8 (en) * 2004-11-17 2020-02-26 Seneca Biopharma, Inc. Transplantation of human neural cells for treatment of neurodegenerative conditions
US20060166361A1 (en) 2004-12-21 2006-07-27 Agnieszka Seyda Postpartum cells derived from placental tissue, and methods of making, culturing, and using the same
WO2006101548A2 (en) 2004-12-21 2006-09-28 Ethicon, Inc. Postpartum cells derived from umbilical cord tissue, and methods of making, culturing, and using the same
US20060153815A1 (en) 2004-12-21 2006-07-13 Agnieszka Seyda Tissue engineering devices for the repair and regeneration of tissue
AU2005322068B2 (en) * 2004-12-23 2011-09-01 Ethicon Incorporated Treatment of stroke and other acute neural degenerative disorders using postpartum derived cells
PL1831356T3 (pl) 2004-12-23 2017-07-31 DePuy Synthes Products, Inc. Komórki poporodowe pochodzące z tkanki pępowinowej i sposoby ich wytwarzania i stosowania
US7923007B2 (en) 2005-08-08 2011-04-12 Academia Sinica Brain tissue damage therapies
PL1971681T3 (pl) 2005-12-16 2018-01-31 Depuy Synthes Products Inc Kompozycje oraz sposoby do hamowania niepożądanej odpowiedzi immunologicznej w przypadku transplantacji z brakiem zgodności tkankowej
CN101410511B (zh) * 2005-12-19 2015-02-25 伊西康公司 产后来源的细胞在滚瓶中的体外扩增
ES2628129T3 (es) 2005-12-28 2017-08-01 DePuy Synthes Products, Inc. Tratamiento de la enfermedad vascular periférica utilizando células derivadas del posparto
ZA200804718B (en) * 2005-12-29 2010-04-28 Anthrogenesis Corp Co-culture of placental stem cells and stem cells from a second source
EP1976977B1 (en) 2005-12-29 2015-07-08 Anthrogenesis Corporation Placental stem cell populations
GB0619500D0 (en) 2006-10-03 2006-11-08 Univ Keele Treatment of fibrosis
CA2673521C (en) * 2006-10-12 2017-01-17 Ethicon, Inc. Kidney-derived cells and methods of use in tissue repair and regeneration
JP5670053B2 (ja) 2006-11-13 2015-02-18 エシコン・インコーポレイテッドＥｔｈｉｃｏｎ， Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ マイクロキャリアを使用した、産褥由来の細胞の生体外での拡大
US20080305148A1 (en) 2007-03-19 2008-12-11 National Yang Ming University Treatment of spinal injuries using human umbilical mesenchymal stem cells
RU2347579C1 (ru) * 2007-07-03 2009-02-27 Общество с ограниченной ответственностью "Медицинские технологии" Способ получения клеточной культуры для лечения сосудистых и демиелинизирующих заболеваний нервной системы и клеточная культура, полученная этим способом (варианты)
CN102036688B (zh) * 2007-10-05 2014-07-02 伊西康公司 使用人脐带组织来源的细胞进行肾脏组织的修复和再生
US8236538B2 (en) 2007-12-20 2012-08-07 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Methods for sterilizing materials containing biologically active agents
AU2009327382B2 (en) * 2008-12-19 2014-07-17 DePuy Synthes Products, LLC Umbilical cord tissue derived cells for treating neuropathic pain and spasticity
US10179900B2 (en) * 2008-12-19 2019-01-15 DePuy Synthes Products, Inc. Conditioned media and methods of making a conditioned media
ES2665883T3 (es) * 2008-12-19 2018-04-30 DePuy Synthes Products, Inc. Tratamiento de enfermedades y trastornos pulmonares y pulmonares
JP6095893B2 (ja) * 2008-12-19 2017-03-15 デピュイ・シンセス・プロダクツ・インコーポレイテッド 傷害後の神経組織の再生および修復
BRPI1013409A2 (pt) 2009-03-26 2018-01-16 Advanced Tech And Regenerative Medicine Llc células de tecido de cordão umbilical humano como terapia para doença de alzheimer

Also Published As

Publication number Publication date
AU2012217782B2 (en) 2016-05-26
SG192705A1 (en) 2013-09-30
RU2013141914A (ru) 2015-03-27
MX343931B (es) 2016-11-28
BR112013020586A2 (pt) 2019-05-07
WO2012112576A1 (en) 2012-08-23
JP2014509319A (ja) 2014-04-17
EP2675464A1 (en) 2013-12-25
JP6000982B2 (ja) 2016-10-05
ZA201306916B (en) 2015-04-29
EP2675464B1 (en) 2016-11-16
AU2012217782A1 (en) 2013-09-05
US8491883B2 (en) 2013-07-23
RU2612391C2 (ru) 2017-03-09
US20110223205A1 (en) 2011-09-15
SG10201603861RA (en) 2016-07-28
ES2616457T3 (es) 2017-06-13
PL2675464T3 (pl) 2017-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5425399B2 (ja) 産褥由来細胞を用いたパーキンソン病および関連の障害の治療
AU2004252568B2 (en) Regeneration and repair of neural tissue using postpartum-derived cells
JP6000982B2 (ja) 臍由来細胞を使用する筋萎縮性側索硬化症の治療
US9572840B2 (en) Regeneration and repair of neural tissue using postpartum-derived cells
CA2747758A1 (en) Regeneration and repair of neural tissue following injury
AU2011226863B2 (en) Regeneration and repair of neural tissue using postpartum-derived cells
AU2011226836B2 (en) Treatment of parkinson&#39;s disease and related disorders using postpartum derived cells
AU2011226961B2 (en) Regeneration and repair of neural tissue using postpartum-derived cells

Legal Events

Date Code Title Description
HH Correction or change in general
FG Grant or registration