MX2013006039A

MX2013006039A - Anticuerpo monoclonal anti-receptor de bradiquinina b2 (bkb2r).

Info

Publication number: MX2013006039A
Application number: MX2013006039A
Authority: MX
Inventors: Mark S Williams; Matthew L Charles
Original assignee: Diamedica Inc
Priority date: 2010-12-03
Filing date: 2011-12-01
Publication date: 2013-10-25
Also published as: JP2014502274A; EP2646471A2; WO2012075342A3; CN103339150A; US20140017242A1; BR112013013674A2; WO2012075342A2; AU2011336472A1; CA2819504A1; KR20140014100A; ZA201303774B

Abstract

La presente invención se refiere en general a anticuerpos anti-receptor de bradiquinina B2 (BKB2R) y métodos para elaborarlos y usarlos. En particular, los anticuerpos anti-BKB2R que tiene las secuenciase de región variable descritas en la presente son útiles para alterar una o más de las rutas de señalización de BKB2R y/o GSK3-ß para el tratamiento de enfermedades, trastornos y condiciones tal como cáncer, diabetes, trastornos cardiovasculares y otras condiciones.

Description

ANTICUERPO MONOCLONAL ANTI -RECEPTOR DE BRADIQUININA B2 (BKB2R) Campo de la Invención Las modalidades de la invención actualmente descrita se relacionan en general a anticuerpos anti-receptor de bradiquinina B2 (BKB2R, por sus siglas en inglés) y a métodos para producir y usar estos anticuerpos. En particular, los métodos descritos en la presente son útiles para el tratamiento de enfermedades y trastornos que se asocian con rutas de transduccion de señales biológica que se ven influenciadas por la actividad de BKB2R, tal como diabetes y cáncer, y condiciones relacionadas.

Antecedentes de la Invención En general hay dos formas reconocidas de diabetes .

En la diabetes tipo 1, o diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM, por sus siglas en inglés), los pacientes producen poca o ninguna insulina, la hormona que regula la utilización de glucosa. En la diabetes tipo 2, o diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM, por sus siglas en inglés), los pacientes tienen frecuentemente niveles en plasma de insulina que son los mismos o aún elevados en comparación en sujetos no diabéticos; sin embargo, estos pacientes han desarrollado una resistencia a la insulina que estimula el efecto en el metabolismo de glucosa y lípidos en Ref . 241343 los tejidos principales sensibles a insulina, que son tejidos de músculo, hígado y tejido adiposo, y los niveles en plasma de insulina, en tanto que están elevados, son insuficientes para superar la resistencia pronunciada a insulina.

Las actuales terapias farmacológicas para DM tipo 2 incluyen insulina inyectada, y agentes orales que se diseñan para bajar los niveles en sangre de glucosa. Los agentes orales actualmente disponibles incluyen (i) las sulfonilureas , que actúan al mejorar la sensibilidad de la célula beta pancreática a glucosa, incrementado de este modo la secreción de insulina en respuesta a una carga dada de glucosa; (ii) las biguanidas, que mejoran las velocidades de eliminación de glucosa e inhiben la salida hepática de glucosa; (iii) las tiazolidinadionas , que mejoran la sensibilidad periférica a insulina a través de la interacción con receptores nucleares activados por el proliferador de peroxisoma (PPAR, ver por ejemplo, Spiegelman, 1998 Diabetes 47:507-514; Schoonjans et al., 1997 Curr. Opin. Lipidol . 8:159-166; Staels et al., 1997 Biochimie 79:95-99), (iv) repaglinida, que mejora la secreción de insulina a través de la interacción con canales de potasio dependientes de ATP; y (v) acarbosa, que disminuye la absorción intestinal de carbohidratos. Los agentes inyectables incluyen metformina, glinidas, bloqueadores de alfa-glucosidasa, GLP-1 y análogos de GLP-1, e inhibidores de DPP-IV. Sin embargo, el uso de estos agentes antidiabéticos o antihiperglicétnicos convencionales se puede asociar con varios efectos adversos, y eventualmente los pacientes pueden llegar a ser resistentes a los efectos de estos, agentes o la diabetes progresa a un estado más avanzado en donde los agentes no son efectivos por más tiempo.

En el monitoreo del tratamiento de diabetes mellitus, el valor de HbAlc, el producto de una glicación no enzimática de la cadena de hemoglobina B, es de importancia excepcional. Puesto que su formación depende esencialmente del nivel en sangre de azúcar y de la duración de vida de los eritrocitos, el valor de HbAlc en el sentido de una "memoria de azúcar en sangre" refleja el nivel promedio de azúcar en sangre de las 4-12 semanas presentes. Los pacientes diabéticos cuyo nivel de HbAlc se ha controlado bien durante un largo tiempo por un tratamiento más intenso de diabetes (es decir, <6.5 % de la hemoglobina total en la muestra) se protegen significativamente mejor de la microangiopatía diabética. Los tratamientos disponibles para diabetes pueden dar al sujeto diabético una mejora promedio en el nivel de HbAlc por el orden de 1.0-1.5 %. Esta reducción en el nivel de HbAlC no es suficiente en todos los diabéticos para llevarlos al intervalo objetivo deseado de <7.0 %, de manera preferente <6.5 % y de manera más preferente <6 % de HbAlc.

A nivel celular, el fenotipo degenerativo que puede ser característico de diabetes mellitus de comienzo tardío incluye, por ejemplo, secreción deteriorada de insulina, síntesis disminuida de ATP y niveles incrementados de especies reactivas de oxígeno. Los estudios han mostrado que la DM tipo 2 se puede preceder por, o estar asociada con, ciertos trastornos relacionados. Por ejemplo, se estima que cuarenta millones de individuos en los Estados Unidos de América padecen de tolerancia deteriorada a glucosa (IGT, por sus siglas en inglés) . Después de una carga de glucosa, las concentraciones en circulación de glucosa en pacientes con IGT aumentan a mayores niveles, y retornan a niveles de línea base más lentamente, que en individuos sin afectación. Un pequeño porcentaje de individuos con IGT (5-10 %) progresan a diabetes no dependiente de insulina (NIDDM) cada año. Esta forma de diabetes mellitus, DM tipo 2, se asocia con liberación disminuida de insulina por células beta pancreáticas y una respuesta disminuida de órgano final a insulina. Otros síntomas de la diabetes mellitus y condiciones que la preceden o se asocian con diabetes mellitus incluyen obesidad, patologías vasculares, neuropatías periféricas y sensoriales y ceguera.

Es claro que ninguna de las terapias farmacológicas actuales corrige el defecto bioquímico subyacente en la DM tipo 2. Ninguno de estos tratamientos actualmente disponibles mejoran todas las anormalidades fisiológicas en la DM tipo 2 tal como secreción deteriorada de insulina, resistencia a insulina y/o producción hepática excesiva de glucosa. Además, las fallas del tratamiento son comunes con estos agentes, tal que frecuentemente es necesaria una terapia con múltiples fármacos.

El receptor de bradiquinina B2 (BKB2R) de superficie celular en mamíferos (por ejemplo, BKB2R humana, SEQ ID NO: 71; BKB2R murina, SEQ ID NO: 72) media las cininas y es un receptor de proteína G-acoplada (Leeb-Lundberg et al, 2005 Pharmacol Rev 57:27-77; Belanger et al, 2009 Peptides 30:777-787). Los receptores de BKB2R tienen alta afinidad para bradiquinina (BK) y calidina, y son responsables de mediar la mayoría de los efectos fisiológicos conocidos de la BK. Se conoce que la BK y otras cininas tienen varios efectos cardioprotectores y órganoprotectores . Mediante la BKB2R, la BK ayuda a liberar moléculas organoprotectoras tal como óxido nítrico, prostaglandinas , y activador de plasminógeno tipo tejido. La BK también activa la transcolocación del transportador GLUT4 de glucosa desde el citoplasma a la membrana plasmática de superficie celular. Por lo tanto, se piensa que el agonismo de BKB2R tiene efectos terapéuticos potenciales en diabetes y condiciones relacionadas, y en condiciones cardiovasculares tal como hipertensión, hipertrofia, aterosclerosis y enfermedad isquémica del corazón. También se piensa que la activación de BKB2R es benéfica, en cuando a que uno de sus efectos más importantes es la inhibición en etapa posterior de la glicógeno-sintasa-cinasa-3 -beta (GSK-3P) , un objetivo farmacológico principal que se ha enlazado a una amplia variedad de enfermedades (Meijer et al, 2004 Trends Pharmacol Sci 25:9, 471-80).

La calidina, que es un agonista de BKB2R, activa el receptor y de esta manera activa la fosforilación inhibitoria de etapa posterior (en el residuo de serina en la posición número 9) de GSK-3P, conduciendo a síntesis incrementada de glicógeno (Stambolic et al, 1994 Bioche J 303, 701-704). La activación del receptor de BKB2R también promueve la liberación de óxido nítrico (NO) , que conduce a vasodilación y distribución incrementa de insulina a tejidos; y activa la transcolocación del transportador-4 de glucosa (GLUT4) a la superficie celular, facilitando la captación incrementada de glucosa por células (Kishi et al, 1998 Diabetes 47:4, 550-8).

La GSK-3p está localizada de manera celular, dentro del citoplasma y de esta manera es bastante inaccesible a anticuerpos extracelulares . La GSK-3P es una cinasa constitutivamente activa que regula múltiples rutas de señalización (por ejemplo, ruta de Wnt, ruta de insulina), y la GSK-3 regula múltiples factores de transcripción mediante la fosforilación (Doble et al, 2003 J Cell Sci 116: 1175-86). Por lo tanto, la GSK-3p se considera como un mediador central principal ("interruptor principal") de varias funciones celulares y de desarrollo (por ejemplo, metabolismo, ciclo celular, motilidad celular, expresión de citocina y apoptosis) . La actividad de GSK-3p está bastante controlada mediante múltiples mecanismo que incluyen (i) señalización mediada por receptor que conduce a fosforilación inhibitoria de GSK-3 beta, (ii) un requisito en ciertos casos para "fosforilación de cebadura" por otras cinasas de una secuencia de reconocimiento que se une al substrato de GS -3 en las proteínas objetivo de GSK-3 antes de la disponibilidad de estos substratos para la acción de 03?-3 , (iii) interacciones intermoleculares específicas de GS -3P con varios complejos multiproteína definidos, y (iv) localización subcelular regulada de GSK-3P. Dada la centralidad de s3?-3ß a múltiples procesos biológicos en células, un rompimiento en la regulación de la GSK-3p (por ejemplo, en casos de actividad excesiva de GSK-33 con consecuencias peligrosas) se ha implicado en una variedad de enfermedades y trastornos (Doble et al, 2003 J Cell Sci 116: 1175-86) .

A pesar de la reciente atención que se ha enfocado recientemente a GSK-3 , y la nominación de GSK-3P por la industria farmacéutica como un objetivo para el desarrollo de fármacos, el desarrollo de inhibidores efectivos de GSK-3p ha sido no exitoso por bastante tiempo, debido en parte a su papel central como un mediador de múltiples rutas intracelulares sin la disponibilidad de herramientas específicas que tengan influencia de forma selectiva en los efectos biológicos deseados. Claramente, hay una necesidad de un planteamiento refinado para aprovechar la regulación de T3 -3 de la transduccion de señales biológicas particulares de una manera selectiva, incluyendo en contextos clínicamente pertinentes. La invención actualmente descrita afronta esta necesidad y proporciona otras ventajas relacionadas.

Breve Descripción de la Invención De acuerdo a ciertas modalidades de la invención descrita en la presente, se proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a un receptor de bradiquinina B2 (BKB2R) de humano, que comprende una región variable de cadena pesada que reconoce las secuencias de aminoácidos de VHCDRl, VHCDR2 y VHCDR3 ; y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 , en donde al menos una de: (1) (A) las secuencias de aminoácidos de VHCDRl, VHCDR2 y VHCDR3 comprenden, respectivamente, las secuencias de aminoácidos expuestas en (i) SEQ ID N0S:19, 20 y 21, (ii) SEQ ID N0S:22, 23 y 24, o (iii) SEQ ID NOS:25, 26 y 27; y (B) las secuencias de aminoácidos de VLCDR1 , VLCDR2 y VLCDR3 comprende, respectivamente, las secuencias de aminoácidos expuestas en (i) SEQ ID NOS: 34, 35 y 36, (ii) SEQ ID NOS:37, 38 y 39, o (iii) SEQ ID NOS:40, 41 y 42 ; O (2) (A) las secuencias de aminoácidos de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 comprenden, respectivamente, las secuencias de aminoácidos expuestas en (i) SEQ ID NOS: 13, 14 y 15, o (ii) SEQ ID NOS: 16, 17 y 18; y (B) las secuencias de aminoácidos de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 comprenden, respectivamente, las secuencia s de aminoácidos expuestas en (i) SEQ ID NOS: 28, 29 y 30, o (ii) SEQ ID NOS: 31, 32 y 33.

En ciertas modalidades adicionales, la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de aminoácidos de VHCDRl, VHCDR2 y VHCDR3 expuestas en SEQ ID NOS: 22, 23 y 24, respectivamente, y región variable de cadena ligera comprenden las secuencias de aminoácidos de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 expuestas en SEQ ID NOS: 40, 41 y 42, respectivamente. En ciertas modalidades aún adicionales, la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6. En ciertas modalidades diferentes, la región variable de cadena ligera comprenden la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12. En ciertas modalidades la región variable de cadena ligera comprenden la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 8-12. En ciertas modalidades adicionales el anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprenden un dominio variable de cadena pesadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 3 -7.

En ciertas modalidades la región variable de cadena pesada comprenden la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 3-7. En ciertas modalidades adicionales el anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprenden un dominio variable de cadena ligera que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 8-12.

En ciertas modalidades la región variable de cadena pesada comprenden las secuencias de aminoácidos de VHCDR1 , VHCDR2 y VHCDR3 expuestas en SEQ ID NOS:19, 20 y 21, respectivamente, y la región variable de cadena ligera comprenden las secuencias de aminoácidos de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 ' expuestas en SEQ ID NOS:37, 38 y 39, respectivamente. En ciertas modalidades adicionales la región variable de cadena pesada comprenden la secuencia de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 5. En ciertas modalidades adicionales diferentes, la región variable de cadena ligera comprenden la secuencia de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 11.

En ciertas modalidades se proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a un receptor de bradiquinina B2 (BKB2R) de humano, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO : 1 ; y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de VLCDR3 expuestas en SEQ ID NO: 2.

En ciertas modalidades del anticuerpo aislado descrito anteriormerlte o fragmento de unión a antígeno del mismo, el anticuerpo está humanizado. En ciertas modalidades adicionales el dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 8-12. En ciertas modalidades aún adicionales, el anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprenden un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 3-7. En ciertas modalidades, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS : 3 -7.

En ciertas modalidades, cualquiera de los anticuerpos aislado descritos anteriormente, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, comprende una región constante de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en ya sea SEQ ID NO: 77 o SEQ ID NO: 81. En ciertas modalidades, cualquiera de los anticuerpos aislados descritos anteriormente, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, comprenden una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina IgG2 humana que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en ya sea SEQ ID NO: 75 o SEQ ID NO: 79.

En ciertas modalidades de la materia descrita anteriormente, el anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprenden ya sea una o ambas de (a) una cadena pesada de inmunoglobulina IgG2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 83 -87; y (b) una cadena ligera kappa de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 88-92. En ciertas modalidades, cualquiera de los anticuerpos aislados descritos anteriormente, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, comprenden un anticuerpo que se selecciona de un anticuerpo de cadena simple, un ScFv, un anticuerpo univalente que carece de una región de bisagra, y un minicuerpo. En ciertas modalidades, cualquiera de los anticuerpos aislados descritos anteriormente, o fragmentos de unió a antígeno de los mismos, comprende un fragmento Fab o Fab1. En ciertas modalidades., cualquiera de los anticuerpos aislados descritos anteriormente, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, es un fragmento F(ab')2- En ciertas modalidades, cualquiera de los anticuerpos aislados descritos anteriormente es un anticuerpo entero. En ciertas modalidades, cualquiera de los anticuerpos aislados descritos anteriormente, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, comprenden un dominio Fe de IgG humana.

En ciertas modalidades, se proporciona una composición que comprende un portador fisiológicamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los anticuerpos aislados descritos anteriormente, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos .

En ciertas modalidades se proporciona un método para tratar un paciente con diabetes y que tiene una condición asociada con actividad de BKB2R que se selecciona de hiperglicemia, hipercolesterolemia, hipertensión, enfermedad cardiovascular, retinopatía, nefropatía, neuropatía y resistencia a insulina, el método que comprende administrar al paciente la composición que comprende un portador fisiológicamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los anticuerpos aislados descritos anteriormente, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y tratar de este modo la condición asociada con actividad de BKB2R. En ciertas modalidades se proporciona un método para tratar un paciente con enfermedad cardiovascular, que comprende administrar al paciente la composición que comprende un portador fisiológicamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los anticuerpos aislados descritos anteriormente, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, tratando de este modo la enfermedad cardiovascular. En ciertas modalidades se proporciona un método para tratar un paciente con hipercolesterolemia, que comprende administrar al paciente la composición que comprende un portador fisiológicamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los anticuerpos aislados descritos anteriormente, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, tratando de este modo la hipercolesterolemia. En ciertas modalidades se proporciona un método para tratar un paciente con hipertensión, que comprende administrar al paciente la composición que comprende un portador fisiológicamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los anticuerpos aislados descritos anteriormente, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, tratando de este modo la hipertensión.

En ciertas modalidades se proporciona un método para tratar o prevenir un cáncer que es sensible a inhibición de GSK-3p, que comprende administrar, un paciente que tiene el cáncer, la composición que comprende un portador fisiológicamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los anticuerpos aislados descritos anteriormente, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y tratar o prevenir de este modo el cáncer. En ciertas modalidades el cáncer se selecciona de leucemia de linaje mezclado, cáncer esofágico, cáncer ovárico, cáncer prostático, cáncer renal, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer de estómago, y cáncer pancreático. En ciertas modalidades se proporciona un método para inhibir la proliferación o supervivencia de una célula de cáncer, en donde la célula de cáncer expresa de manera estable una proteína de BKB2R en una ruta de señalización de GSK3-B, el método que comprende poner en contacto las células de cáncer con la composición que comprende un portador fisiológicamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los anticuerpos aislados descritos anteriormente, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos .

En ciertas modalidades se proporciona un método para inhibir la señalización por una ruta de señalización de GSK3-B en una célula que expresa de manera operable una proteína de BKB2R, que comprende poner en contacto la célula con cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente, o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En ciertas modalidades se proporciona un método para alterar al menos una de (i) exposición a radiación (ii) infección de influenza, y (iii) ataque en una célula que expresa BKB2R, que comprende poner en contacto la célula con cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para la unión específica del anticuerpo a la célula.

Estos y otros aspectos y modalidades de la invención descrita en la presente serán evidentes en referencia a la siguiente descripción detallada y figuras anexas. Todas las Patentes de los Estados Unidos, publicaciones de solicitudes de Patente de los Estados Unidos, solicitudes de Patente de los Estados Unidos, patentes extranjeras, solicitudes de Patente extranjera y publicaciones no de Patente referidas en esta descripción y/o listadas en la hoja de datos de la solicitud, se incorporan en la presente como referencia en su totalidad, como si cada una se incorporará de manera individual . Los aspectos y modalidades de la invención se pueden modificar, si es necesario, para emplear conceptos de las varias patentes, solicitudes y publicaciones para proporcionar modalidades aún adicionales .

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 es una gráfica de barras que ilustra la inducción de la inhibición de GSK-3P in vivo por anticuerpos monoclonales anti-BKB2R. La gráfica muestra el nivel de "fosforilación de T3?-3 en serina-9 en células de ratón 3T3 como se mide por ELISA, como una indicación de la inhibición de s??-3ß.

La Figura 2 es una gráfica de barras que ilustra la inducción de la inhibición de GSK-?ß por anticuerpos monoclonales anti-BKB2R. La gráfica muestra el nivel de fosforilación de GSK-?ß en serina-9 en células humanas en WI-38 como se mide por ELISA, como una indicación la inhibición de s3?-3ß.

La Figura 3 es una gráfica de la respuesta aguda a la dosis de anticuerpo monoclonal . La gráfica gráfica la respuesta a la presión arterial media promedio para los cuatro grupos indicados de anticuerpo monoclonales anti-BKB2R. Los puntos de datos para cada grupo se presentan como medio ± Error Estándar.

La Figura 4 es una gráfica que representa el efecto de los anticuerpos monoclonales anti-BKB2R en la presión sanguínea, una hora, dos horas y tres horas después de la administración in vivo. La gráfica gráfica la media + SEM para cada grupo (*p<0.05 vs línea base para 5F12G1) .

La Figura 5 muestra que TamifluMR redujo la replicación de influenza en células A549, como se determina por qRT-PCR. La gráfica muestra el incremento en la fluorescencia relativa que reflejo el desplazamiento creciente y escisión creciente de la sonda TaqmanMR en proporción directa a la porción amplificada del segmento de influenza M. Las muestras con menores concentraciones de Tamiflu se incrementaron en fluorescencia a un Ct anterior (ciclo de umbral), indicando un mayor título viral.

La Figura 6 muestra una gráfica real y de tendencia del Ct (eje y) versus la concentración de TamifluMR (eje x) en un umbral de fluorescencia de 1500 unidades de fluorescencia. TamifluMR disminuyó el título viral de una manera dependiente de la dosis.

La Figura 7 muestra una gráfica que evidencia que el anticuerpo monoclonal anti-BKB2R 5F12G1 ("Gl") redujo la replicación de influenza en células A549, como se determina por qRT-PCR. La gráfica muestra el incremento en la fluorescencia relativa que reflejó el desplazamiento incrementado y escisión incrementada de la sonda TaqmanMR en proporción directa a la porción amplificada del segmento de influencia M. Las muestras con menores concentraciones de Gl se incrementaron en fluorescencia en un Ct más temprano (ciclo de umbral), indicando un mayor título viral.

La Figura 8 muestra una gráfica real y de tendencia del Ct (eje y) versus la concentración del anticuerpo monoclonal anti -BKB2R 5F12G1 ("Gl") (eje x) a un umbral de fluorescencia de 1500 unidades de fluorescencia. Gl disminuyó el título viral de una manera dependiente de la dosis.

La Figura 9 muestra el porcentaje de la viabilidad de células de control y el porcentaje de reducción del efecto citopático (CPE, por sus siglas en inglés) para el anticuerpo monoclonal anti-BKB2R, Gl versus A/Brisbane/59/07 en células MDCK.

La Figura 10 muestra el porcentaje de la viabilidad de células de control y el porcentaje de reducción de CPE para el anticuerpo monoclonal anti -BKB2R, G7 versus A/Brisbane/59/07 en células MDCK.

La Figura 11 muestra el porcentaje de la viabilidad de células de control y el porcentaje de reducción de CPE para el anticuerpo monoclonal anti-BKB2R, H9, versus A/Brisbane/59/07 en células MDCK.

La Figura 12 muestra el porcentaje de la viabilidad de células de control y el porcentaje de reducción de CPE para el anticuerpo monoclonal anti-BKB2R, H3 versus A/Brisbane/59/07 en células MDCK.

La Figura 13 muestra el porcentaje de la viabilidad de células de control y el porcentaje de reducción de CPE para TamifluMR versus A/Brisbane/59/07 en células MDCK.

La Figura 14 muestra el porcentaje de la viabilidad de células de control y el porcentaje de reducción de CPE para el anticuerpo monoclonal anti-BKB2R Gl versus influenza (CA/07/09) en células MDCK.

La Figura 15 muestra el porcentaje de la viabilidad de células de control y el porcentaje de reducción de CPE para el anticuerpo monoclonal anti -BKB2R G7 versus influenza (CA/07/09) en células MDCK.

La Figura 16 muestra el porcentaje de la viabilidad de células de control y el porcentaje de reducción de CPE para el anticuerpo monoclonal anti-BKB2R H9 versus influenza (CA/07/09) en células MDCK.

La Figura 17 muestra el porcentaje de la viabilidad de células de control y el porcentaje de reducción de CPE para el anticuerpo monoclonal anti-BKB2R H3 versus influenza (CA/07/09) en células MDCK.

La Figura 18 muestra el porcentaje de la viabilidad de células de control y el porcentaje de reducción de CPE para TamifluMR versus influenza (CA/07/09) en células MDCK.

La Figura 19 muestra la viabilidad de células BxPC-3 como un porcentaje del control cuando se tratan con varias concentraciones de los anticuerpos monoclonales anti-BKB2R 1F2G7 y 5F12G1.

La Figura 20 muestra la viabilidad de células MV-4- 11 como un porcentaje de control cuando se tratan con varias concentraciones de los anticuerpos monoclonales a anti-BKB2R 1F2G7 y 5F12G1.

La Figura 21 muestra la viabilidad de células Hep G2 como un porcenta e de control cuando se tratan con varias concentraciones de los anticuerpos monoclonales anti-BKB2R 1F2G7 y 5F12G1.

La Figura 22 muestra la viabilidad de células RS4;11 como un porcentaje de control cuando se tratan con varias concentraciones de los anticuerpos monoclonales anti- BKB2R 1F2G7 y 5F12G1.

La Figura 23 muestra la viabilidad de células HT-29 como un porcentaje de control cuando se tratan con varias concentraciones de los anticuerpos monoclonales anti-BKB2R 1F2G7 y 5F12G1.

La Figura 24 muestra la viabilidad de células NUGC-4 como un porcentaje de control cuando se tratan con varias concentraciones de los anticuerpos monoclonales anti-BKB2R 1F2G7 y 5F12G1.

La Figura 25 muestra la viabilidad de células PC-3 como un porcentaje de control cuando se tratan con varias concentraciones de los anticuerpos monoclonales anti-B B2R 1F2G7 y 5F12G1.

La Figura 26 muestra la velocidad de infusión de glucosa del anticuerpo monoclonal anti -BKB2R F512G1 en pinzas euglicémicas hiperinsulinémicas, en comparación a un control con vehículo.

La Figura 27 muestra la velocidad de infusión de glucosa AUC del anticuerpo monoclonal anti-BKB2R F512G1 en las pinzas euglicémicas hiperinsulinémicas, en comparación a un control con vehículo.

La Figura 28A muestra los niveles sanguíneos de glucosa durante una prueba oral de tolerancia a glucosa en ratas Zucker tratadas con varias dosis de, anticuerpo monoclonal 5F12G1.

La Figura 28B muestra el área bajo la curva (AUC, por sus siglas en inglés) de los niveles sanguíneos de glucosa durante una prueba oral de tolerancia a glucosa en ratas Zucker tratadas con varias dosis de anticuerpo monoclonal 5F12G1.

La Figura 29A muestra los niveles en suero de insulina durante una prueba oral de tolerancia a glucosa en ratas Zucker tratadas con varias dosis de anticuerpo monoclonal 5F12G1.

La Figura 29B muestra el área bajo la curva (AUC) de los niveles de insulina en suero durante una prueba oral de tolerancia a glucosa en ratas Zucker tratadas con varias dosis de anticuerpo monoclonal 5F12G1.

La Figura 30A muestra los niveles en sangre de glucosa durante una prueba oral de tolerancia a glucosa en ratones de DIO tratados con varias dosis de anticuerpo monoclonal 5F12G1.

La Figura 30B muestra el área bajo la curva (AUC) de niveles en sangre de glucosa durante una prueba oral de tolerancia a glucosa en ratones DIO tratados con varias dosis de anticuerpo monoclonal 5F12G1.

La Figura 31 muestra los niveles en suero de insulina durante una prueba oral de tolerancia a glucosa en ratones DIO tratados con varias dosis de anticuerpo monoclonal 5F12G1.

La Figura 32A muestra los niveles de glucosa en sangre durante una prueba oral de tolerancia a glucosa en ratas ZDF fa/fa en el día 0, y la Figura 32B muestra los niveles en sangre de glucosa durante una prueba oral de tolerancia a glucosa en el día 21, después del tratamiento con varias dosis de anticuerpo monoclonal 5F12G1, exenatida, sitagliptina o MG2b-57.

La Figura 33 muestra el área bajo la curva (AUC) de niveles sanguíneos de glucosa en ratas ZDF fa/fa durante una prueba oral de tolerancia a glucosa en el día 21 después del tratamiento con varias dosis de 5F12G1, exenatida, sitagliptina o MG2b-57.

La Figura 34A muestra los niveles en suero de insulina durante una prueba oral de tolerancia a glucosa en ratas ZDF fa/fa en el día 0, y la Figura 34B muestra los niveles en suero de insulina durante una prueba oral de tolerancia a glucosa en ratas ZDF fa/fa en el día 21, después del tratamiento con varias dosis de anticuerpo monoclonal 5F12G1, exenatida, sitagliptina o MG2b-57.

La Figura 35 muestra los niveles de glucosa en sangre en ayuno en ratas ZDF fa/fa del día 0 al día 21 del tratamiento con varias dosis del anticuerpo monoclonal 5F12G1, exenatida, sitagliptina o MG2b-57.

La Figura 36 muestra los niveles en suero de colesterol en ratas ZDF fa/fa en el día 21 después del tratamiento con varias dosis de 5F12G1, exenatida, sitagliptina o MG2b-57.

La Figura 37 muestra el porciento de los niveles de hemoglobina glicosilada (HbAlc) en ratas ZDF fa/fa en el día 21 después del tratamiento con varias dosis de anticuerpo monoclonal 5F12G1, exenatida, sitagliptina o MG2b-57.

La Figura 38 muestra los niveles de glucosa detectados en la orina de ratas ZDF fa/fa en el día 14 después del tratamiento con varias dosis de 5F12G1, exenatida, sitagliptina o MG2b-57.

La Figura 39A muestra la presión sanguínea sistólica en ratas ZDF fa/fa en el día 0, y la Figura 39B muestra la presión sanguínea sistólica en el día 21, después del tratamiento con varias dosis de 5F12G1, exenatida, sitagliptina o MG2b-57.

La Figura 40A muestra la presión sanguínea diastólica en ratas ZDF fa/fa en el día da 0 , y la Figura 40B muestra la presión sanguínea diastólica en el día 21 después del tratamiento con varias dosis de 5F12G1, exenatida, sitagliptina o MG2b-57.

La Figura 41A muestra la frecuencia cardíaca en ratas ZDF fa/fa en el día 0, y la Figura 41B muestra la frecuencia cardíaca en el día 21, después del tratamiento con varias dosis de 5F12G1, exenatida, sitagliptina o MG2b-57.

La Figura 42 muestra el área bajo la curva (AUC) de la velocidad de infusión de glucosa en ratas ZDF fa/fa durante una pinza hiperinsulinémica-euglicémica en el día 21 después del tratamiento con varias dosis de 5F12G1, exenatida, sitagliptina o MG2b-57.

La Figura 43 resume los datos del área bajo la curva (AUC) de una prueba ora de tolerancia a glucosa que monitorizó la concentración en sangre de glucosa después de la administración individual de anticuerpos monoclonales 5F12G1 o humanizado anti-BKB2R, después de la administración oral de glucosa en ratas ZDF fa/fa, en comparación a un control con vehículo.

Breve Descripción del Listado de Secuencias SEQ ID N0:1 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada murina del anticuerpo 5F12G1 anti -BKB2R .

SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera murina del anticuerpo 5F12G1 anti -BKB2R .

SEQ ID NO: 3 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada Hl del anticuerpo anti-BKB2R humanizado .

SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada H2 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 5 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada H37 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 6 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada H38 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 7 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada H39 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 8 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera Ll del anticuerpo anti-BKB2R humanizado .

SEQ ID NO: 9 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera L2 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 10 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera L37 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 11 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera L38 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 12 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera L39 del anticuerpo anti-BKB2R humanizada.

SEQ ID NO: 13 es la secuencia de aminoácidos de la Hl VHCDRl del anticuerpo anti -BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 14 es la secuencia de aminoácidos de la Hl VHCDR2 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 15 es la secuencia de aminoácidos de la Hl VHCDR3 del anticuerpo anti -BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 16 es la secuencia de aminoácidos de la H2 VHCDRl del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 17 es la secuencia de aminoácidos de la H2 VHCDR2 del anticuerpo an i -BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 18 es la secuencia de aminoácidos de la H2 VHCDR3 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 19 es la secuencia de aminoácidos de la H37 VHCDRl del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 20 es la secuencia de aminoácidos de la H37 VHCDR2 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 21 es la secuencia de aminoácidos de la H37 VHCDR3 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 22 es la secuencia de aminoácidos de la H38 VHCDRl del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 23 es la secuencia de aminoácidos de la H38 VHCDR2 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 24 es la secuencia de aminoácidos de la H38 VHCDR3 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 25 es la secuencia de aminoácidos de la H39 VHCDRl del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 26 es la secuencia de aminoácidos de la H39 VHCDR2 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 27 es la secuencia de aminoácidos de la H39 VHCDR3 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 28 es la secuencia de aminoácidos de la Ll VLCDR1 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 29 es la secuencia de aminoácidos de la Ll VLCDR2 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 30 es la secuencia de aminoácidos de la Ll VLCDR3 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 31 es la secuencia de aminoácidos de la L2 VLCDR1 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 32 es la secuencia de aminoácidos de la L2 VLCDR2 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 33 es la secuencia de aminoácidos de la L2 VLCDR3 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 34 es la secuencia de aminoácidos de la L37 VLCDR1 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 35 es la secuencia de aminoácidos de la L37 VLCDR2 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 36 es la secuencia de aminoácidos de la L37 VLCDR3 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 37 es la secuencia de aminoácidos de la L38 VLCDRl del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 38 es la secuencia de aminoácidos de la L38 VLCDR2 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 39 es la secuencia de aminoácidos de la L38 VLCDR3 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 40 es la secuencia de aminoácidos de la L39 VLCDRl del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 41 es la secuencia de aminoácidos de la L39 VLCDR2 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 42 es la secuencia de aminoácidos de la L39 VLCDR3 del anticuerpo anti-BKB2R humanizado.

SEQ ID NO: 43 es la secuencia de aminoácidos de la VHCDR1 anticuerpo anti-BKB2R 5F12G1 raurino.

SEQ ID NO: 44 es la secuencia de aminoácidos de VHCDR2 del anticuerpo anti-BKB2R 5F12G1 murino.

SEQ ID NO: 45 es la secuencia de aminoácidos de VHCDR3 del anticuerpo anti -BKB2R 5F12G1 murino.

SEQ ID NO: 46 es la secuencia de aminoácidos de la VLCDRl del anticuerpo anti -BKB2R 5F12G1 murino.

SEQ ID NO: 47 es la secuencia de aminoácidos de la VLCDR2 del anticuerpo anti -BKB2R 5F12G1 murino.

SEQ ID NO: 48 es la secuencia de aminoácidos de la VLCDR3 del anticuerpo anti-BKB2R 5F12G1 murino.

SEQ ID NO:49 es el polinucleótido que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:1, es decir, que codifica para la región variable de cadena pesada murina para el anticuerpo anti -BKB2R 5F12G1.

SEQ ID NO: 50 es el polinucleótido que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, es decir, que codifica para la región variable de cadena ligera raurina para el anticuerpo 5F12G1.

SEQ ID NO: 51 es el polinucleotido que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, es decir, que codifica para la región variable de cadena pesada humanizada Hl para el anticuerpo anti-BKB2 .

SEQ ID NO: 52 es el polinucleotido que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, es decir, que codifica para la región variable de cadena pesada humanizada H2 para el anticuerpo anti-BKB2R.

SEQ ID NO: 53 es el polinucleotido que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, es decir, que codifica para la región variable de cadena pesada humanizada H3 para el anticuerpo anti-BKB2R.

SEQ ID NO: 54 es el polinucleotido que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, es decir, que codifica para la región variable de cadena pesada humanizada H38 para el anticuerpo anti-BKB2R.

SEQ ID NO: 55 es el polinucleotido que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, es decir, que codifica para la región variable de cadena pesada humanizada H39 para el anticuerpo anti-BKB2R.

SEQ ID NO: 56 es el polinucleotido que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, es decir, que codifica para la región variable de cadena ligera humanizada Ll para el anticuerpo anti-BKB2R.

SEQ ID NO: 57 es el polinucleótido que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, es decir, que codifica para la región variable de cadena ligera humanizada L2 para el anticuerpo anti -BKB2R.

SEQ ID NO: 58 es el polinucleótido que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, es decir, que codifica para la región variable de cadena ligera humanizada L37 para el anticuerpo anti-BKB2R.

SEQ ID NO: 59 es el polinucleótido que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, es decir, que codifica para la región variable de cadena ligera humanizada L38 para el anticuerpo anti -BKB2R .

SEQ ID NO: 60 es el polinucleótido que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, es decir, que codifica para la región variable de cadena ligera humanizada L39 para el anticuerpo anti-BKB2R.

SEQ ID NOS: 61-68 son secuencias de los cebadores RACE de oligonucleótido .

SEQ ID NOS: 69-70 so secuencias de cebadores de secuenciación de oligonucleótido.

SEQ ID NO: 71 muestra una secuencia de aminoácidos de BKB2R humana.

SEQ ID NO: 72 muestra una secuencia de aminoácidos de BKB2R de ratón.

SEQ ID NO: 73 muestra la secuencia de aminoácidos de un fragmento peptídico inmunogénico de BKB2R humana.

SEQ ID NO: 74 muestra la secuencia de aminoácidos de un fragmento peptídico inmunogénico de BKB2R de ratón.

SEQ ID NO: 75 es la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de inmunoglob lina IgG2.

SEQ ID NO: 76 es la secuencia del polinucleótido que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75.

SEQ ID NO: 77 es la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana .

SEQ ID NO: 78 es la secuencia del polinucleótido que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77.

SEQ ID NO: 79 es la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina humana IgG2 humana .

SEQ ID NO: 80 es la secuencia del polinucleótido que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79.

SEQ ID NO: 81 es la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana .

SEQ ID NO: 82 es la secuencia del polinucleótido que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81.

SEQ ID NO: 83 es la secuencia de aminoácidos: de la cadena pesada Hl humanizada, que incluye la región constante de lgG2 humana .

SEQ ID NO: 84 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada H2 humana, que incluye la región constante de IgG2 humana .

SEQ ID NO: 85 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada H37 humanizada, que incluye la región constante de IgG2 humana .

SEQ ID NO: 86 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada H38 humanizada, que incluye la región constante de IgG2.

SEQ ID NO: 87 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada H39 humanizada, que incluye la región constante de IgG2 humana .

SEQ ID NO: 88 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera Ll humanizada, que incluye la región constante kappa de Ig humana .

SEQ ID NO: 89 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera L2 humanizada, que incluye la región constante kappa de Ig humana.

SEQ ID NO: 90 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera L37 humanizada, que incluye la región constante kappa de Ig humana .

SEQ ID NO: 91 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera L38 humanizada, que incluye la región constante kappa de Ig humana .

SEQ ID NO: 92 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera L39 humanizada, que incluye la región constante kappa de Ig humana .

Descripción Detallada de la Invención De acuerdo a ciertas modalidades descritas en la presente, se proporcionan composiciones y métodos que se relacionan a anticuerpos monoclonales anti-BKB2R específicos, y en particular a anticuerpos anti -BKB2R humanizados que tienen las secuencias VHCDR1, VHCDR2 , y VHCDR3 y/o las secuencias VLCDR1, VLCDR2 , y VLCDR3 y/o las secuencias VH y/o VL, como se describe en la presente. Como también se describe en la presente, los antecuerpos anti-BKB2R actualmente descritos exhibieron inesperadamente actividad agonista hacia el BKB2R cuando los anticuerpos se pusieron en contacto con células que expresan BKB2R y dieron por resultado de forma sorprendente la inhibición de GSK-3p.

Los anticuerpos anti-BKB2R descritos en la presente encontrarán usos en un gran número de contextos donde pueda ser deseable la intervención y alteración (por ejemplo, un incremento de disminución estadísticamente significativos, tal como en un nivel detectable de actividad) de la actividad de BKB2R y/o de una ruta de señalización biológica a la cual contribuye a la actividad de BKB2R. Por ejemplo, varias condiciones clínicamente definidas parecen resultar, de acuerdo a una teoría no limitante, de una actividad excesiva de GSK-3P, tal que es pueden aprovechar de manera benéfica las propiedades inhibitorias de GSK-3 que se exhibieron de manera inesperada por los anticuerpos anti -BKB2R actualmente descritos, por lo tanto, también se proporcionan en la presente composiciones y métodos para tratar una condición asociada con actividad de BKB2R, que puede incluir pero no necesita limitarse a diabetes y/o riesgos acompañantes de trastornos cardiovasculares, retinopatía, neuropatía o nefropatía, cáncer, enfermedades cardiovasculares y varias condiciones relacionadas, incluyendo alta presión sanguínea, concentraciones excesivas de glucosa en sangre, concentraciones elevadas de colesterol en suero, infecciones virales, ataque, exposición a radiación u otras enfermedades.

El BKB2R representa un punto de inicio de una ruta de señalización celular, endógena, conocida (PI3K/Akt) que conduce a la inhibición de GSK-3 mediante a la fosforilación de Ser9. Esta ruta se utiliza de forma endógena para ayudar a regular los niveles en sangre de glucosa y probablemente en el proceso de la neurogénesis también, cuando la enzima, calicreina 1 (KLK1) de tejido escinde los cininógenos para liberar cininas (bradiquinina y calidina (Lys-bradiquinina) ) que activa el receptor de BKB2R. Normalmente, KLK-1 genera calidina, un agonista de vida corta (-30 segundos in vivo) pero potente del receptor de BKB2R (Kd ~ 0.89 nM) . La selección como objetivo del receptor acoplado a proteína G de BKB2R por la unión de calidina induce eventos de señalización de etapa posterior mediante mediante la ruta PI3K/Akt, que conduce a la fosforilación y desactivación de GS -3p en serina-9. La inhibición de GSK-3 a su vez puede incrementar la síntesis de glicógeno, y también puede disminuir la fosforilación Tau, la apoptosis y la inflamación. Sin que se desee que se una una teoría, se cree que los anticuerpos anti-BKB2R de ciertas modalidades descritas en la presente invención imitan esa ruta por la unión a una estructura definida por secuencia de proteína muy específica en el receptor de BKB2R, que conduce a la activación de BKB2R y la eventual inhibición en etapa posterior de GSK-3 . Adicionalmente , de acuerdo a una teoría no limitante, se cree que los presentes anticuerpos monoclonales tienen como objetivo específicamente un epítopo extracelularmente colocado en el receptor BKB2R, tal que los anticuerpos actúan de manera agonística. Por esta especificidad, los anticuerpos anti -BKB2R descritos en la presente niegan la posibilidad de unión "fuera de objetivo" que se ha visto previamente con otros inhibidores de GSK-3p, reduciendo específicamente el riesgo de efectos secundarios asociados que dan por resultado un mecanismo menos específico de acción por los inhibidores anteriores .

Las condiciones asociadas con la actividad de BKB2R incluyen varias enfermedades y trastornos en los cuales se ha implicado la actividad inapropiadamente regulada de GSK-3p. Los ejemplos ilustrativos no limitantes incluyen: (a) exposición a radiación - inhibición de GSK-3P en algunas circunstancias puede intervenir la apoptosis mediante la ruta de señalización Bax, una ruta dependiente de p53 que induce apoptosis, y de esta manera puede impedir la pérdida de células de la médula ósea y posiblemente tejido mucoso gastrointestinal después de la exposición a niveles peligrosos de radiación en el cuerpo entero. Se ha estudiado la calicreina-1 (KLK-1) como un tratamiento para exposición radiación aunque no se conoce si el efecto reportado de KLK-1 en la supervivencia a radiación se media a través de la acción de calidina en el receptor BKB2R, o por la activación de factores de crecimiento, una combinación de ambos ; (b) diabetes tipo II e hipertensión.- una de las co-patologías principales de la diabetes tipo 2 es la hipertensión, que puede retrasar la distribución de insulina a tejidos pero se puede disminuir mediante la activación del receptor BKB2R; (c) cáncer.- las células de leucemia de linaje mezclado (MLL, por sus siglas en inglés) son susceptibles a la inhibición de GSK-3 . Esta relación es algo contraintuitiva puesto que GSK-3p activa típicamente rutas apoptóticas. Este mecanismo no comprende una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) y no requiere un biomarcador específico único de cáncer (el receptor de BKB2 se expresa de manera ubicua en las células) . En cambio, la muerte celular se presenta sólo en aquellas células sensibles a la inhibición de GSK-3p. también se ha sugerido GSK-3p como un objetivo potencial de etapa posterior en varios cánceres diferentes, tal como cáncer esofágico, ovárico, de próstata, de riñon, de colon, de hígado, de estómago y pancreático; (d) infarto al miocardio y ataque.- se conoce que KLK-1 protege y mejora la recuperación cardíaca después de isquemia. Estos efectos se han bloqueado en estudios preclínicos a través del uso de agonistas del receptor de BKB2 (por ejemplo, HOE 140) ; y (e) influenza.- se ha confirmado que T??-?ß es un factor necesario para la entrada viral en una célula hospedadora en virus de ARN de influenza A. La inhibición o bloqueo de GSK-3P detendrá la replicación y por lo tanto atenuará la infección.

Las modalidades de la presente invención se refiere de esta manera a anticuerpos que se unen a BKB2R, una proteína de receptor acoplada a proteína G, de superficie celular, expresada ampliamente (por ejemplo, SEQ ID NO:71), a métodos para producir estos anticuerpos, y a métodos para usar estos anticuerpos, para alterar (por ejemplo, para incrementar o disminuir de una manera estadísticamente significativa) los eventos de la ruta de señalización asociada a BKB2R en células que expresan BKB2R, incluyendo a métodos que dan por resultado la inhibición de GSK-3P. Los métodos descritos en la presente son útiles para el tratamiento de condiciones asociadas con la actividad de BKB2R, tal como diabetes, cáncer y otras enfermedades, trastornos y condiciones. Las secuencias de aminoácidos de anticuerpos anti -BKB2R ilustrativos incluyendo anticuerpos humanizados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, o regiones determinantes de complementariedad (CDRs, por sus siglas en inglés) de los mismos. Se exponen en SEQ ID NOs: 1-48, 75, 77, 79, 81, 83-92, y se codifican por las secuencias de polinucleótido expuestas en SEQ ID NOs:49-60, 76, 78, 80, 82.

En ciertas modalidades y de acuerdo a una teoría no limitante, los anticuerpos anti-BKB2R descritos en la presente se pueden poner en contacto con células que expresan BKB2R, incluyen células in vivo o ex vivo o células aisladas in vitro, para inducir o activar una ruta de señalización asociada a BKB2R, incluyendo en ciertas modalidades inhibir GSK-3p. Una célula "aislada" es una que se ha removido del ambiente natural en el cual se presenta de forma original, o progenie de esta célula que se ha mantenido, propagado o generado in vitro.

Por consiguiente, en ciertas modalidades la presente invención proporciona un método para alterar la actividad de una ruta de BKB2R, que comprende poner en contacto una célula que expresa BKB2R con un anticuerpo anti-BKB2R como se describe en la presente, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para la unión específica del anticuerpo a la célula, en donde se altera un nivel de actividad de una ruta de BKB2R (por ejemplo, se incrementa o disminuye de una manera estadísticamente significativa, y en ciertas modalidades preferidas se incrementa) con relación al nivel de la actividad de la ruta de BKB2R que está presente en una célula que no se ha puesto en contacto con el anticuerpo anti-BKB2R.

De esta manera, se contemplan de manera expresa, de acuerdo a ciertas modalidades descritas en la presente, métodos por los cuales se pueden usar estos sistemas y/o sistemas relacionados para determinar o efectuar la activación o inducción por un anticuerpo anti-BKB2R de un BKB2R o una ruta de señalización asociada a BKB2R, o para determinar o efectuar la inhibición por un anticuerpo anti-BKB2R de GSK-3P en una célula que expresa BKB2R.

Los criterios para determinar la actividad de una ruta de señalización asociada a BKB2R se describen en la presente y se conocen en la técnica y se apreciarán por aquellos expertos en la técnica. Las rutas para transducción de señales biológicas, incluyendo aquellas asociadas con división celular, supervivencia celular, apoptosis, proliferación y diferenciación, se pueden referir en ciertos casos como "rutas de transducción de señales biológicas" o "rutas de señalización inducibles" se pueden incluir asociaciones o interacciones transcientes o estables entre componentes moleculares celulares y extracelulares que están comprendidos en el control de estos y procesos similares en células. Dependiendo de las rutas particulares de interés, se pueden seleccionar uno o más parámetros apropiados para determinar la inducción de estas rutas en base a criterios aceptados en la técnica.

Por ejemplo, para rutas de señalización asociadas con replicación o proli eración celular, están disponibles una variedad de metodologías bien conocidas para cuantificar la replicación o proliferación, incluyendo, por ejemplo, la incorporación por células proliferantes de timidina tritiada en ADN celular, monitoreo de indicadores detectables (por ejemplo, fluorométrico o colorimétrico) de actividad respiratoria celular (por ejemplo, conversión de sales de tetrazolio (amarillo) bromuro de 3- (4 , 5-dimetiltiazol-2-il) -2 , 5-difeniltetrazolio (MTT) o 3- (4 , 5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazolio (MTS) a tintes de formazan (púrpuras) en células metabólicamente activas), o conteo celular, o similares.

De manera similar, en la técnica de bilogía celular, se conocen múltiples técnicas para valorar la supervivencia celular por cualquiera de varias metodologías conocidas que incluyen determinación de viabilidad por técnica microscópica, y bioquímica, espectrofotométrica, espectroscópica, de dispersión de luz, citométrica incluyendo citométrica de flujo y citofluorimétrica, u otras (por ejemplo, tintes vitales tal como Azul de Tripano, fluoróforos que se unen a ADN tal como yoduro de propidio, indicadores metabólicos, etc.) y para determinar apoptosis (por ejemplo, unión a anexina V, ensayos de fragmentación de ADN, activación de caspasa, análisis por marcadores, por ejemplo, poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) , etc.).

Otras rutas de señalización se asociarán con fenotipos celulares particulares, por ejemplo inducción específica de expresión génica (por ejemplo, detectable como productos de transcripción o traducción, o por biomasa de estos productos, o como localización nuclear de factores citoplásmicos) , niveles alterados (por ejemplo, incrementos o disminuciones estadísticamente significativos) de mediadores intracelulares (por ejemplo, cinasas o fosfatasas alteradas, niveles alterados de nucleótidos cíclicos o de especies iónicas fisiológicamente activas, niveles alterados del grado de fosforilación de uno o más substratos específicos de fosforilación etc.), perfiles alterados del ciclo celular, o morfología celular alterada, y similares, tal que las sensibilidades celulares a un estímulo particular como se proporciona en la presente se pueden identificar fácilmente determinar si una célula particular está experimentando o se ha sometido a un evento mediado por BKB2 o mediado por GSK-3ß o mediado por otra ruta de señalización definida (por ejemplo, ensayos de flujo de calcio en células que expresan BKB2R tal como la línea de células CHO transíectadas con BKB2R, ensayos de fosforilación de s3?-3ß tal como fosforilación de serina-9 o inhibición de la actividad de T3?-3 , determinación por ELISA de GSK-3 , ensayos de unión de GSK-3P, etc.) .

En ciertas modalidades donde es deseable determinar si o no un sujeto o fuente biológico cae dentro de los parámetros clínicos indicativos de diabetes mellitus tipo 2, los signos y síntomas de la diabetes mellitus tipo 2 que se aceptan por aquellos expertos en la técnica se pueden usar para designar un sujeto o fuente biológica, por ejemplo, signos clínicos referidos en Gavin et al. {Diabetes Care 22(suppl. 1) :S5-S19, 1999, American Diabetes Association Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus) y referencias citadas en el mismo, u otro medio conocido en la técnica para diagnosticar diabetes tipo 2.

En diabetes y ciertas enfermedades o trastornos metabólicos diferentes, uno o más procesos bioquímicos, que pueden ser ya sea anabólicos o catabólicos (por ejemplo, acumulación o desintegración de sustancias, respectivamente) , se alteran (por ejemplo, se incrementan o disminuyen de una manera estadísticamente significativa) o se modulan (por ejemplo, se favorecen en la expresión o se reducen en expresión a un grado estadísticamente significativo) con relación a los niveles en los cuales se presentan en un sujeto normal o libre de enfermedad tal como un individuo apropiado de control . La alteración puede resultar de un incremento o disminución en un substrato, enzima, co-factor, o cualquier otro componente en una reacción bioquímica comprendida en un proceso particular. Un conjunto extenso de indicadores alterados de función mitocondrial , por ejemplo, se ha descrito para el uso en la determinación de la presencia de, y caracterización, de diabetes (ver, por ejemplo, U.S. 6,140,067).

Los componentes de la ruta de señalización relacionada a BKB2R pueden incluir componentes en la ruta de transduccion de señal inducida por insulina y por ejemplo se puede evaluar al determinar el nivel de fosforilación de tirosina del receptor beta de insulina (IR-ß) y/o de la molécula de señalización de etapa posterior PKB/Akt y/o de cualquier otro polipéptido de etapa posterior que puede ser un componente de una ruta particular de transduccion de señal como se proporciona en la presente. Las condiciones asociadas con actividad de BKB2R también pueden incluir trastornos tal como trastornos asociados a JNK (por ejemplo, cáncer, hipertrofia cardíaca, isquemia, diabetes, apoptosis inducida pro hiperglicemia , inflamación, trastornos neurodegenerativos) , y otros trastornos asociados con diferentes rutas de transducción de señales, por ejemplo, cáncer, autoinmunidad, trastornos proliferativos celulares, trastornos neurodegenerativos, y enfermedades infecciosas (ver, por ejemplo, Fukada et al., 2001 J". Biol . Chem. 276:25512; Tonks et al., 2001 Curr. Opin. Cell Biol. 13:182; Salmeen et al., 2000 Mol. Cell 6:1401; Hu et al., J. Neurochem. 85:432-42 (2003); y referencias citadas en los mismos) .

La presencia de una condición maligna en un sujeto se refiere a la presencia de células displásticas, cancerosas y/o transformadas en el sujeto, incluyendo, por ejemplo células neoplásticas, tumorales, no inhibidas por contacto u oncogénicamente transformadas, o similares (por ejemplo, carcinomas tal como adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células pequeñas, carcinoma de células tipo avena, etc., sarcomas tal como condrosarcoma, osteosarcoma, etc.) que se conocen en la técnica y para los cuales están establecidos criterios para diagnóstico y clasificación (por ejemplo, Hanahan y Weinberg, 2011 Cell 144:646; Hanahan y Weinberg 2000 Cell 100:57; Cavallo et al . , 2011 Canc. Immunol . Immunothe . 60:319; yrigideis et al . , 2010 J. Carcinog. 9:3) en modalidades preferidas contempladas por la invención, por ejemplo, estas células de cáncer pueden ser células de leucemia de linaje mezclado, cáncer esofágico, cáncer ovárico, cáncer de próstata, cáncer de riñon, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer de estómago y cáncer pancreático .

Anticuerpos y Fragmentos de Unión a Antígeno de los Mismos Un "anticuerpo" es una molécula de inmunoglobulina capaz de unión específica a un objetivo o diana, tal como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de epítopo, localizado en la región variable (también referida en la presente como el dominio variable) de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" abarca no solo anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también fragmentos de los mismos (tal como un anticuerpo de región variable individual (dAb) , u otros fragmentos conocidos de anticuerpo tal como Fab, Fab 1 , F(ab' )2, Fv y similares, Fv de cadena simple (ScFv) , variantes sintéticas de los mismos, variantes que se presentan de forma natural, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo con un fragmento de unión a antígeno de la especificidad requerida, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, y cualquier otra configuración modificada o alterada por ingeniería de la molécula de inmunoglobulina que comprende un fragmento o sitio de unión a antígeno (sitio de reconocimiento de epítopo) de la especificidad requerida. Los "diacuerpos" , fragmentos multivalentes o multiespecífieos construidos por fusión génica (WO94/13804; Holliger et al, Proc . Nati. Acad. Sci. EUA 90 6444-6448, 1993) también son una forma particular de anticuerpo contemplada en la presente. Los minicuerpos que comprenden un scFv unidos a un dominio CH3 también se pueden incluir en la presente (Hu et al, Cáncer Res., 56, 3055-3061, 1996; ver también por ejemplo, Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989); Bird et al, Science 242, 423-426, 1988; Huston et al, PNAS EUA, 85, 5879-5883, 1988; PCT/US92/09965 ; WO94/13804; Holliger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90 6444-6448, 1993; Reiter et al., Nature Biotech 14, 1239-1245, 1996; Hu et al, Cáncer Res. 56, 3055-3061, 1996) . Los nanocuerpos y maxicuerpos también se contemplan (ver, por ejemplo, U.S. 6,765,087; U.S. 6,838,254; WO 06/079372; WO 2010/037402) .

El término "fragmento de unión a antígeno" como se usa en la presente se refiere a un fragmento de polipéptido que contiene al menos una CDR de una cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina que se une al antígeno de interés, antígeno que en modalidades particularmente preferidas descritas en la presente es el receptor BKB2R. En este respecto, un fragmento que se une a antígeno de los anticuerpos descritos en la presente pueden comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o todas las seis CDR de una secuencia VH y/o VL expuestas en la presente de anticuerpos que se unen a BKB2R. Un fragmento de unión a antígeno de los anticuerpos específicos de BKB2R descritos en la presente es capaz de la unión a B B2R. En ciertas modalidades, la unión de un fragmento de unión a antígeno previene o inhibe la unión de los ligandos de BKB2R (por ejemplo, bradiquinina (BK) , calidina (Lys-bradiquinina) al receptor BKB2R, interrum iendo la respuesta biológica que de otro modo resultaría de la unión por el ligando por el receptor. En ciertas modalidades, el fragmento de unión a antígeno se une específicamente a y/o inhibe o modula la actividad biológicas de BKB2R humano.

El término "antígeno" se refiere a una molécula o a una porción de una molécula capaz de unirse por un agente de unión selectiva, tal como un anticuerpo, y adicionalmente capaz de ser usada en un animal para producir anticuerpos capaces de unirse a un epítopo de ese antígeno. Un antígeno puede tener uno o más epítopos.

El término "epítopo" incluye cualquier determinante, de manera preferente un determinante de polipéptido, que es capaz de la unión específica a una inmunoglobulina o receptor de células T. Un epítopo es una región de un antígeno que se une por un anticuerpo. En ciertas modalidades, los determinantes de epítopo incluyen agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tal como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo o sulfonilo, y en ciertas modalidades pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, y/o características específicas de carga. En ciertas modalidades, se dice que un anticuerpo se une de manera específica a un antígeno cuando reconoce preferencialmente su antígeno objetivo o diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas . Un anticuerpo se puede decir, de acuerdo a ciertas modalidades que se une a un antígeno específicamente cuando la constante de disociación en equilibrio para la unión a anticuerpo-antígeno es menos de o igual a 10"6 M, o menos de o igual a 10~7 M, o menos de o igual a 10"8 M. En algunas modalidades, la constante de disociación de equilibrio puede ser menor que o igual a 10"9 M o menos de o igual a 10~10 M.

La enzima proteolítica, papaína, escinde de manera preferencial moléculas de IgG para producir varis fragmentos, dos de los cuales (los fragmentos F(ab)) comprenden cada uno un heterodímero covalente que incluye un sitio de unión a antígeno, intacto. La enzima pepsina es capaz de escindir moléculas de IgG para proporcionar varios fragmentos, incluyendo el fragmento F(ab')2 que comprende también sitios de unión a antígeno. Un fragmento Fv para el uso a ciertas modalidades de la presente invención se puede producir por escisión proteolítica preferencial de una IgM, y en ocasiones raras de una molécula de inmunoglobulina tipo IgG o IgA. Sin embargo, los fragmentos Fv se derivan más comúnmente usando técnicas recombinantes conocidas en la técnica. El fragmento Fv incluye un heterodímero VH: :VL no covalente que incluye un sitio de unión a antígeno que retiene mucho de las capacidades de unión y reconocimiento de antígeno de la molécula nativa de anticuerpo (Inbar et al. (1972) Proc. Nat . Acad. Sci. EUA 69:2659-2662; Hochman et al. (1976) Biochem 1:2706-2710; y Ehrlich et al. (1980) Biochem 9:4091 -4096).

En ciertas modalidades, los anticuerpos Fv o scFV de cadena simple se contemplan. Por ejemplo, se pueden preparar cuerpos Kappa (III et al., Prot . Eng. 10:949-57 (1997); minicuerpos (Martin et al., EMBO J 13:5305-9 (1994); diacuerpos (Holliger et al, PNAS 90:6444-8 (1993)); o Janusinas (Traunecker et al, EMBO J. 10:3655-59 (1991) y Traunecker et al. Int. J. Cáncer Suppi . 7:51-52 (1992)), usando técnicas normales de biología molecular siguiente las enseñanzas de la presente solicitud con respecto a la selección de anticuerpos que tienen la especificidad deseada. En aún otras modalidades, se pueden producir anticuerpos biespecífieos o quiméricos que abarcan los ligandos de la presente descripción. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender CDR y regiones menos variables de diferentes anticuerpos, en tanto que se pueden generar anticuerpos biespecí fieos que se unen de manera específica a B B2R a través de un dominio de unión y a una segunda molécula a través de un segundo dominio de unión. Estos anticuerpos se pueden producir a través de técnicas de biología molecular recombinante o se pueden conjugar físicamente de forma conjunta .

Un polipéptido de Fv de cadena simple (sFv) es un heterodímero de VH: :VL covalentemente enlazado que se expresa de una fusión génica que incluye genes que codifican para VH y para VL enlazados por un ligador que codifica para el péptido. Huston et al. (1988) Proc. Nat . Acad. Sci. EUA 85 (16) : 5879-5883. Se han descrito varios métodos para discernir estructuras químicas para convertir las cadenas ligera y pesada de polipéptido, naturalmente agregadas, pero químicamente separadas, de una región de V de anticuerpo en una molécula sFv que se plegará en una estructura tridimensional sustancialmente similar a la estructura de un sitio de un antígeno, ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos Nos. 5,091, 513 y 5,132,405, de Huston et al . ¦ y Patente de los Estados Unidos No. 4,946,778, de Ladner et al.

Un fragmento dAb de un anticuerpo consiste de un dominio VH ( ard et al., Nature 341, 544-546 (1989)).

En ciertas modalidades, un anticuerpo como se describe en la presente (por ejemplo, anticuerpo específico de BKB2R) está en la forma de un diacuerpo. Los diacuerpos son multímeros de polipéptidos , cada polipéptido que comprende un primer dominio que comprende una región de unión de una cadena ligera de inmunoglobulina y un segundo dominio que comprende una región de unión de una cadena pesada de inmunoglobulina, los dos dominios que se enlazan (por ejemplo mediante un ligador peptídico) pero son incapaces de asociarse entre sí para formar un sitio de unión a antígeno; se forman sitios de unión a antígeno por la asociación del primer dominio de un polipéptido dentro del multímero con el segundo dominio de otro polipéptido dentro del multímero (WO94/13804) .

Donde se van a usar anticuerpos biespecíficos , estos pueden ser anticuerpos biespecíficos convencionales, que se pueden elaborar por una variedad de maneras (Holliger y Winter, Current Opinión Biotechnol . 4, 446-449 (1993)), por ejemplo preparar químicamente o de hibridomas híbridos, o pueden ser cualquiera de los fragmentos de anticuerpos biespecíficos mencionados anteriormente. Los diacuerpos y scFv se pueden construir sin una región Fe, usando sólo regiones variables, reduciendo potencialmente la probabilidad o severidad de una respuesta inmunitaria provocada, tal como una reacción anti-idiotípica, en un sujeto que recibe una administración de estos anticuerpos. · Los diacuerpos biespecífieos , como lo opuesto a anticuerpos enteros biespecífieos , también pueden ser particularmente útiles debido a que se pueden construir fácilmente y expresar en E. coli. Los diacuerpos (y muchos otros polipéptidos tal como fragmentos de anticuerpos) de especificidades apropiadas de unión se pueden seleccionar fácilmente usando visualización en fagos (WO94/13804) de bibliotecas. Si un brazo del anticuerpo se va a mantener constante, por ejemplo, con una especificidad dirigida contra el antígeno X, entonces una biblioteca se puede producir donde el otro brazo se varíe y se seleccione un anticuerpo de especificidad apropiada. Los anticuerpos enteros biespecíficos se pueden producir por ingeniería de protuberancia en agujeros (Ridgeway et al, Protein Eñg. , 9, 616-621, 1996) .

En ciertas modalidades, los anticuerpos descritos en la presente se pueden proporcionar en la forma de un UniBody™*. Un UniBody"1* es un anticuerpo tipo IgG4 con la región de bisagra removida (ver GenMab Utrecht, Los países bajos; ver también, por ejemplo, US/2009/0226421) . Esta tecnología patentada de anticuerpo crea un formato estable de anticuerpo más pequeño con una ventana terapéutica anticipada más grande que los actuales formatos de anticuerpo pequeño.

Los anticuerpos tipo IgG4 se consideran inertes y de esta manera no interactúan con el sistema inmunitario. Los anticuerpos tipo IgG4 completamente humanos se pueden modificar al eliminar la región de bisagra del anticuerpo para obtener fragmentos de media molécula que tienen distintas propiedades de estabilidad con relación a la IgG4 intacta correspondiente (GenMab, Utrecht) . Dividiendo la mitad la molécula de IgG4 se deja sólo un área en el UniBody1 que puede unirse a antígenos cognados (por ejemplo, objetivos o dianas de enfermedad) y el UniBody™1 se une por lo tanto de manera univalente a sólo un sitio en las células objetivo. Para ciertos antígenos de superficie de células de cáncer, esta unión univalente no puede estimular a que las células de cáncer crezcan como se puede ver usando anticuerpos bivalentes que tienen la misma especificidad de antígeno, y por lo tanto la tecnología UniBody™ puede dar opciones de tratamiento para algunos tipos de cáncer que puedan ser refractarios al tratamiento con anticuerpos convencionales. El UniBodyMR es aproximadamente la mitad del tamaño del anticuerpo tipo IgG4 regular. Este pequeño tamaño puede ser un gran beneficio cuando se tratan algunas formas de cáncer, permitiendo una mejor distribución de la molécula sobre tumores sólidos más grandes e incrementando potencialmente la eficiencia .

En ciertas modalidades, los anticuerpos de la presente descripción pueden tomar la forma de un nanocuerpo. Los nanocuerpos se codifican por genes individuales y se produce de manera eficiente en casi todos los hospedadores procarióticos y eucarióticos, por ejemplo, E. coli (ver por ejemplo Patente de los Estados Unidos No. 6,765,087), moldes (por ejemplo Aspergillus o Trichoderma) y levadura (por ejemplo Saccharomyces, Kluyvermyces, Hansenula o Pichia (ver por ejemplo Patente de los Estados Unidos No. 6,838,254)). El proceso de producción se puede aumentar en escala y se han producido cantidades de múltiples quilogramos de nanocuerpos. Los nanocuerpos se pueden formular como una solución lista para usar que tiene una larga vida en anaquel. El método NanocloneMR (ver, por ejemplo, O 06/079372) es un método patentado para generar NanocuerposMR contra un objetivo o diana deseada, en base a selección automatizada de alto rendimiento de células B.

En ciertas modalidades, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos como se describe en la presente incluyen un conjunto de CDR de cadena pesada y de cadena ligera, respectivamente interpuestas entre un conjunto de regiones menos variables (FR) de cadena pesada y de cadena ligera que proporcionan soporte a las CDR y definen la relación espacial de las CDR con relación una a la otra. Como se usa en la presente, el término "conjunto de CDR" se refiere a las tres regiones hipervariables de una región V de una cadena pesada o ligera. Precediendo del N-término de una cadena pesada o ligera, estas regiones se denotan respectivamente como "CDR1", "CDR2" , y "CDR3" . Un sitio de un antígeno, por lo tanto, incluye seis CDR, que comprenden el conjunto de CDR de cada una de una región de cadena V pesada y ligera. Un polipéptido que comprende una CDR individual, (por ejemplo, una CDR1, CDR2 o CDR3) se refiere en la presente como una "unidad de reconocimiento molecular" . Los análisis cristalográficos de varios complejos de antígeno-anticuerpo han demostrado que los residuos de aminoácido de las CDR forman contacto extensivo con el antígeno unido, en donde el contacto más extensivo de antígeno es con la CDR3 de cadena pesada. De esta manera, las unidades de reconocimiento molecular son principalmente responsables para la especificidad de un sitio de unión a antígeno.

Como se usa en la presente, el término "conjunto de FR" se refiere a las cuatro secuencias de aminoácidos de flanqueo que traman las CDR de un conjunto de CDR de una región V de cadena pesada o ligera. Algunos residuos de FR pueden hacer contacto con el antígeno unido; sin embargo, las FR son principalmente responsables del plegado de la región V en el sitio de unión a antígeno, particularmente los residuos de FR directamente adyacentes a las CDR. Dentro de las FR, ciertos residuos de aminoácido y ciertas características estructurales están muy altamente conservadas. A este respecto, todas las secuencias de región V contienen una asa interna de disulfuro de aproximadamente 90 residuos de aminoácido. Cuando las regiones V se pliegan en un sitio de unión, las CDR se visualizan como motivos de asas salientes que forman una superficie de unión a antígeno. En general se reconoce que hay regiones estructurales conservadas de las FR que tienen influencia en la forma plegada de las asas de CDR en ciertas estructuras "canónicas", a pesar de la secuencia precisa de aminoácidos de las CDR. Adicionalmente , ciertos residuos de FR se conoce que participan en contactos interdominio no covalentes que estabilizan la interacción de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo.

Las estructuras y ubicaciones de las regiones variables de inmunoglobulina se pueden determinar por referencia a Kabat, E. A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a Edición, US Department of Health and Human Services, 1987, y actualizaciones de esto, ahora disponibles en la Internet (immuno.bme.nwu.edu).

Un "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población de anticuerpos homogéneos en donde el anticuerpo monoclonal está comprendido de aminoácidos (que se presentan de forma natural y que no se presenta de forma natural) que están comprendidos en la unión selectiva de un epítopo. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, que se dirigen contra un epítopo individual. El término "anticuerpo monoclonal" abarca no solo anticuerpos raonoclonales intactos y anticuerpos monoclonal de longitud completa, sino también fragmentos de los mismos (tal como Fab, Fab 1 , F(ab')2, Fv) , de cadena simple (ScFv) , variantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de unión a antígeno, anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos monoclonales quiméricos, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobul na que comprende un fragmento de unión a antígeno (sitio de reconocimiento de epítopo) de la especificidad requerida y la capacidad para unirse a un epítopo. No se propone que se limite con respecto a la fuente del anticuerpo o la manera en la cual se hace (por ejemplo, por hibridoma, selección en fago, expresión recombinante , animales transgénicos , etc.). El término incluye inmunoglobulinas enteras así como los fragmentos descritos anteriormente etc.

Los anticuerpos "humanizados" se refieren a una molécula quimérica, preparada en general usando técnicas recombinantes , que tienen un sitio en unión a antígeno derivado de una inmunoglobulina de una especie no humana y la estructura restante de inmunoglobulina de la molécula en base a la estructura y/o secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de unión a antígeno puede comprender ya sea regiones variables completas fusionadas a dominios constantes o sólo las CDR injertadas en regiones menos variables apropiadas en los dominios variables. Los sitios de unión a epítopo serán de tipo silvestre o se pueden modificar por una o más sustituciones de aminoácido. Esta estructura quimérica elimina la región constante de origen no humano como un inmunógeno en individuos humanos, pero permanece la posibilidad de una respuesta inmunitaria a la región variable extraña (LoBuglio et al., (1989) Proc Nati Acad Sci EUA 86:4220-4224; Queen et al, PNAS (1988) 86:10029-10033; Riechmann et al., Nature (1988) 332:323-327) . Los anticuerpos humanizados ilustrativos de acuerdo a ciertas modalidades de la presente invención comprenden las secuencias humanizadas proporcionadas en SEQ ID NOs: 3-12 y 83-92.

Otro planteamiento se enfoca no sólo en proporcionar regiones constantes derivadas de humano, sino también en modificar las regiones variables así como reformarlas tan cercanamente como sea posible a la forma humana. Como también se señala anteriormente, se conocen que las regiones variables de las cadenas tanto pesada como ligera contienen tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que pueden variar en respuesta los epítopos en cuestión y determinar la capacidad de unión, flanqueadas por cuatro regiones menos variables (FR) que están relativamente conservadas en una especie determinada y que proporcionan putativamente un soporte para las CDR. Cuando se preparan anticuerpos no humanos con respecto a un epítopo particular, las regiones variables se pueden "reformar" o "humanizar" al injertar CDR derivadas de anticuerpo no humano en las FR presentes en el anticuerpo humano que se va a modificar. La aplicación de este planteamiento a varios anticuerpos se ha reportado por Sato et al., (1993) Cáncer Res 53:851-856; Riechmann et al, (1988) Wafcure 332:323-327; Verhoeyen et al., (1988) Science 239:1534-1536; Kettleborough et al., (1991) Protein Engineering 4:773-3783; Maeda et al., (1991) Human Anticuerpos Hybridoma 2:124-134; Gorman et al., (1991) Proc Nati Acad Sci EUA 88:4181-4185; Tempest et al., (1991) Bio/Technology 9:266-271 ; Co et al., (1991) Proc Nati Acad Sci EUA 88:2869-2873; Cárter et al., (1992) Proc Nati Acad Sci EUA 89:4285-4289; y Co et al . , (1992) J Immunol 148:1149-1154. En algunas modalidades, los anticuerpos humanizados conservan todas las secuencias de CDR (por ejemplo, un anticuerpo de ratón humanizado que contiene todas las seis CDR de los anticuerpos de ratón) . En otras modalidades, los anticuerpos humanizados tienen una o más CDR (una, dos, tres, cuatro, cinco, seis) que se alteran con respecto al anticuerpo original, que también se llaman una o más CDR "derivadas de" una o más CDR del anticuerpo original.

En ciertas modalidades, los anticuerpos de la presente descripción pueden ser anticuerpos quiméricos. A este respecto, un anticuerpo quimérico está comprendido de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-BKB2R operablemente enlazado o fusionado de otro modo o una porción Fe heteróloga de un anticuerpo diferente. En ciertas modalidades, el dominio Fe heterólogo es de origen humano. En otras modalidades, el dominio Fe heterólogo puede ser de una diferente clase de Ig que el anticuerpo de origen, incluyendo IgA (incluyendo subclases IgAl e IgA2) , IgD, IgE, IgG (incluyendo subclases IgGl , IgG2, IgG3 , e IgG4 ) , e IgM. En ciertas modalidades, el dominio Fe heterólogo puede estar comprendido en los dominio CH2 y CH3 de una o más de las diferentes clases de Ig. Como se señala anteriormente con respecto a los anticuerpos humanizados, el fragmento de unión a antígeno anti-BKB2R de un anticuerpo quimérico puede comprender sólo una o más de las CDR de los anticuerpos descritos en la presente (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, o 6 CDR de los anticuerpos descritos en la presente) , o puede comprender un dominio variable completo (VL, VH o ambos) .

En ciertas modalidades, un anticuerpo que se une a BKB2R comprende una o más de las CDR de los anticuerpos descritos en la presente. En este respecto, se ha mostrado en algunos casos que la transferencia de sólo la VHCDR3 de un anticuerpo se puede hacer en tanto que aún retenga la unión específica deseada (Barbas et al., PNAS (1995) 92: 2529-2533). Ver también, McLane et al., PNAS (1995) 92:5214-5218, Barbas et al., J. Am. Chem. Soc . (1994) 116:2161-2162.

Marks ' et al (Bio/'Technology, 1992, 10:779-783) describen métodos para producir repertorios de dominios variables de anticuerpo en los cuales los cebadores de consenso dirigidos en o adyacentes al extremo 51 del área de dominio variable se usan en unión con cebadores de consenso a la tercera región menos variable de los genes VH humanos, para proporcionar un repertorio de dominios variables VH que carecen de una CDR3. Marks et al describieron adicionalmente como este repertorio se puede combinar con una CDR3 de un anticuerpo particular. Usando técnicas análogas, las secuencias derivadas de CDR3 de los anticuerpos actualmente descritos se pueden transponer con repertorios de los dominios VH o VL que carecen de una CDR3 , y los dominios VH o VL completos transpuestos combinados con un dominio VL o VH cognado para proporcionar un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a BKB2R. El repertorio entonces se puede visualizar en un sistema hospedadora adecuado tal como sistema de visualización en fago de WO92/01047 de modo que se puedan seleccionar los anticuerpos adecuados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Un repertorio puede consistir de al menos aproximadamente 104 miembros individuales y hasta varios órdenes de magnitud, por ejemplo, hasta aproximadamente de 106 a 108 o 1010 o más miembros. También se describen técnicas análogas de transposición o combinación por Stemmer {Nature, 1994, 370:389-391), quien describe la técnica con relación al gen de ß-lactamasa pero observa que el planteamiento se puede usar para la generación de anticuerpos.

Una alternativa adicional es generar nuevas regiones VH que tienen una o más secuencias derivadas de CDR de las modalidades de la invención descritas en la presente usando mutagénesis aleatoria de un o más genes VH y/o VL seleccionados, para generar mutaciones dentro del dominio variable completo. Esta técnica se describe por Gram et al. (1992 Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89:3576-3580), quien usó PCR propensa a error. Otro método que se puede usar es dirigir la mutagénesis a regiones CDR de genes VH o VL. Estas técnicas se describen por Barbas et al. (1994 Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 91:3809-3813) y Schier et al. (1996 J. Mol. Biol . 263 : 551-567) .

En ciertas modalidades, una VH y/o VL específica de los anticuerpos descritos en la presente se puede usar para examinar una biblioteca del dominio variable complementario para identificar anticuerpos con propiedades deseables tal como afinidad incrementada para BKB2R. Estos métodos se describen, por ejemplo, en Portolano et al., J. Immunol . (1993) 150:880-887; y Clarkson et al., Nature (1991) 352:624-628.

Se pueden usar otros métodos para mezclar y hacer corresponder las CDR para identificar anticuerpos que tienen actividad deseada de unión, tal como unión a BKB2R. Por ejemplo: Klimka et al, British Journal of Cáncer (2000) 83: 252-260, describen un proceso de examen que usa una biblioteca de VL de ratón y VH de humano con CDR3 y FR4 retenidas de la VH de ratón. Después de obtener los anticuerpos, la VH se examina contra una biblioteca de VL de humano para tener anticuerpos que se unen al antígeno Beiboer et al., J". Mol. Biol . (2000) 296:833-849 describen un proceso de examen que usa una cadena pesada completa de ratón y una biblioteca de cadena ligera humana. Después de obtener los anticuerpos, se obtiene una VL con una biblioteca de VH de humano con la CDR3 del ratón retenida. Se obtuvieron anticuerpos capaces de unirse al antígeno. Rader et al., Proc. Nat. Acad. Sci. EUA (1998) 95:8910-8915 describen un proceso similar a aquel de Beiboer et al anterior.

Estas técnicas se conocen, en sí mismas, como tales en la técnica. En base a la presente descripción, la persona experta será capaz, sin embargo, de usar estas tánicas para obtener anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de acuerdo a varias modalidades de la invención descrita en la presente, usando metodología de rutina en la técnica .

También en la presente se describe un método para obtener un dominio de unión a antígeno de anticuerpo específico para el antígeno BKB2R, el método que comprende proporcionar, por medio de adición, supresión, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un Dominio VH expuesto en la presente, un dominio VH que es una variante de secuencia de aminoácidos del dominio VH. Opcionalmente , el dominio VH proporcionado de esta manera se puede combinar con uno o más dominios VL. El dominio VH, o combinación o combinaciones VHA/L, entonces se pueden probar para identificar un miembro específico de unión o un dominio de unión a antígeno de anticuerpo específico para BKB2R, y opcionalmente que tiene además una o más propiedades preferidas. Estos dominios VL pueden tener una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente como se expone en la presente. Se puede emplear un método análogo en el cual se combinen una o más variantes de secuencia de un dominio VL descrito en la presente con uno o más dominios VH.

Un epítopo que "se une de manera específica" o "se une de manera preferencial" (usado de manera indistinta en la presente) a un anticuerpo o un polipéptido es un término bien entendido en la técnica, y en la técnica también son bien conocidos los métodos para determinar esta unión específica o preferencial . Se dice que una molécula exhibe "unión específica" o "unión preferencial" si reacciona o se asocia más frecuentemente, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con una célula o sustancia particular que lo que lo hace con células o sustancias alternativas. Un anticuerpo "se une de manera específica" o "se une de manera preferencia" a un objetivo o diana si se une con mayor afinidad, avidez, más fácilmente, y/o con mayor duración que lo que se a otras sustancias. Por ejemplo, un anticuerpo que se une de manera específica o preferencialmente a un epítopo particular de BKB2R es un anticuerpo que se une a un epítopo de BKB2R con mayor afinidad, avidez, más fácilmente, y/o con mayor duración de lo que se une con otros epítopos de BKB2R o a epítopos no de BKB2R. También se entiende a leer esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo (o porción o epítopo) que se une de manera específica o preferencialmente a un primer objetivo o diana se puede unir o no de manera específica o preferencial a un segundo objetivo o diana. Como tal, "unión específica" o "unión preferencial" no requiere necesariamente (aunque puede incluir) unión exclusiva. En general, pero no necesariamente, la referencia a unión significa unión preferencial.

La unión inmunológica se refiere en general a las interacciones no covalentes del tipo que se presentan entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para lo cual es específica la inmunoglobulina , por ejemplo a manera de ilustración y no de limitación, como resultado de atracciones o repulsiones electrostáticas, iónicas, hidrófilas y/o hidrófobas, fuerzas estéricas, unión por hidrógeno, fuerzas de van der Waals, y otras interacciones. La fuerza, o afinidad de las interacciones de unión inmunológica , se puede expresar en términos de la constante de disociación ( K¿) de la interacción, en donde una ¾ más pequeña representa una mayor afinidad.

Las propiedades de unión inmunológica de polipéptidos seleccionados pueden cuantificar usando métodos bien conocidos en la técnica. Este método conlleva a medir las velocidades de formación y disociación del complejo de antígeno-sitio de unión a antígeno, en donde estas velocidades dependen de las concentraciones de los compañeros complejos, la afinidad de la interacción, y de los parámetros geométricos que tiene influencia igualmente en la velocidad en ambas direcciones. De esta manera, tanto la "constante de asociación" (Kon) y la "constante de disociación" (Koff) se puede determinar por cálculo de las concentraciones y de las velocidades reales de asociación y disociación. La relación de Koff/Kon permite la cancelación de todos los parámetros no relacionados a la afinidad, y de esta manera es igual a la constante de disociación K^. Ver, en general, Davies et al. (1990) Annual Rev. Biochem. 59:439-473.

El término "inmunológicamente activo", con referencia a un epítopo que es o "que permanece inmunológicamente activo", se refiere a la capacidad de un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo anti-BKB2R) para unirse al epítopo bajo diferentes condiciones, por ejemplo, después de que el epítopo se ha sometido a condiciones reductoras y desnaturalizadoras .

Un anticuerpo o fragmento de un antígeno del mismo de acuerdo a ciertas modalidades preferidas de la presente invención puede ser uno que compita para la unión a BKB2R co cualquier anticuerpo descrito en la presente que tanto (i) se una de manera específica al antígeno como (ii) comprenda un dominio VH y/o VL descrito en la presente, o comprenda una VH CDR3 descrita en la presente, o una variante de cualquiera de estos. La competición entre los miembros de unión se puede valorar fácilmente in vitro, por ejemplo usando ELISA y/o al marcar una molécula indicadora específica al miembro de unión lo que se puede detectar en la presencia de otros miembros de unión no marcados, para permitir la identificación de miembros específicos de unión que se unen al mismo epítopo o en un epítopo de traslape.

De esta manera, se proporciona actualmente un anticuerpo específico o fragmento de unió a antígeno el mismo, que comprende un sitio de unión a antígeno de anticuerpo que compite con un anticuerpo descrito en la presente que se une a BKB2R, tal como los anticuerpos descritos en los Ejemplos de la presente (por ejemplo, clones 5F12G1 y derivados humanizados de los mismos, por ejemplo, Hl/Ll , H2/L2, H37/L37, H38/L38; H39/L39) .

Las regiones constantes de las inmunoglobulinas muestran menos diversidad de secuencia que las regiones variables, y son responsables de la unión de varias proteínas naturales para producir eventos bioquímicos importantes. En los humanos, hay cinco diferentes clases de anticuerpos que 5 incluyen IgA (que incluyen las subclases IgAl e IgA2) , IgD, IgE, IgG (que incluye las subclases IgGl, lgG2 , IgG3, e IgG4), e IgM. Las características distintivas entre estas clases de anticuerpo son sus regiones constantes, aunque pueden existir diferencias más sutiles en la región V. 1Q La región Fe de un anticuerpo interactúa con varios receptores Fe y ligandos, impartiendo un arreglo de capacidades funcionales importantes referidas como funciones efectoras. Para IgG la región Fe comprende los dominios CH2 y CH3 d Ig y la bisagra N-terminal que conduce a CH2. Una ^j. familia importante de receptores Fe para la clase IgG son los receptores gamma Fe (FcyRs) . Estos receptores median la comunicación entre anticuerpos y el brazo celular del sistema inmunitario (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275- 2Q 290) . En humanos, esta familia de proteínas incluye FcyRI (CD64) , que incluye las isoformas FcyRIa, FcyRIb, y FcyRIc; FcyRII (CD32) , incluyendo las isoformas FcyRIIa (que incluye los alotipos H131 y R131) , FcyRIIb (que incluye FcyRIIb-l y FcYRIIb-2), y FcyRIIc; y FCTRIII (CD16), que incluye las 25 isoformas FcyRIIIa (que incluye los alotipos V158 y F158) y FcyRIIIb (que incluye los alotipos FcyRIIIb-NAI y FeyRIIIb-IW) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65). Estos receptores tienen típicamente un dominio extracelular que media la unión a Fe, una región que abarca la membrana y un dominio intracelular que puede mediar algún evento de señalización dentro de la célula. Estos receptores expresan una variedad de células inmunitarias que incluyen monocitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos, células cebadas, plaquetas, células B, linfocitos granulares grandes, células de Langerhans, células aniquiladoras naturales (NK) , y células T. La formación de complejo Fc/FcyR recluta estas células efectoras a sitios del antígeno unido, dando por resultado típicamente eventos de señalización dentro de las células e importantes respuestas inmunitarias subsiguientes tal como liberación de mediadores e inflamación, activación de células B, endocitosis, fagocitosis y ataque citotóxico.

La capacidad para mediar las funciones efectoras citotóxicas y fagocíticas es un mecanismo potencial por el cual los anticuerpos destruyen las células seleccionadas como objetivo o diana. La reacción mediada por células en donde células citotóxicas no específicas que expresan FcyR reconocen el anticuerpo unido en una célula objetivo y provocan subsiguientemente la lisis de la célula objetivo, se refiere como citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC) (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290) . La reacción mediada por células en donde células citotóxicas no específicas que expresan FcyR reconocen el anticuerpo unido en una célula objetivo y provocan subsiguientemente la fagocitosis de la célula objetivo, se refiere como fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCP, por sus siglas en inglés) . Todos los FcyR se unen a la misma región en Fe, en el extremo N-terminal del dominio Cg2 (CH2) y la bisagra precedente. Eta interacción se caracteriza bien de forma estructural (Sondermann et al., 2001, J" Mol Biol 309:737-749), y se han resuelto varias estructuras de la Fe unidas al dominio extracelular de FcyRIIIb humano (código de acceso pdb 1E4K) (Sondermann et al., 2000, Nature 406:267-273.) (código de acceso pdb 1IIS y 11IX) (Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469-16477).

Las diferentes subclases de IgG tienen diferentes afinidades para los FcyR, con IgGl e IgG3 que se unen típicamente sustancialmente mejor a los receptores que IgG2 e IgG4 (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65). Todos los FcyRs se unen a la misma región en IgG Fe, aún con diferentes afinidades: el aglutinante de mayor afinidad FcyRI para Ka para IgGl de 10"8 M"1, en tanto que los receptores de baja afinidad FcyRII y FC RIII se unen en general a.10"6 y 10" 5 respectivamente. Los dominios extracelulares para FcyRIIIa y FcyRIIIb son 96% idénticos, sin embargo, FcyRIIIb no reconoce un dominio de señalización intracelular . Adicionalmente, en tanto que FcyRI, FcyRIIa/c, y FcyRIIIa son reguladores positivos de la activación activada por inmunocomplejo, caracterizados por tener un domino extracelular que tiene un motivo de activación a base de tirosina de inmunoreceptora (ITA , por sus siglas en inglés) , FcyRIIb tiene un motivo de inhibición a base de tirosina de inmunoreceptora (ITIM, por sus siglas en inglés) y por lo tanto es inhibitorio. De esta manera, los anteriores se refieren como receptores de activación, y FcyRIIb se refiere como un receptor inhibitorio. Los receptores también difieren en el patrón de expresión y en los niveles de diferentes células inmunitarias .

Aún otro nivel de complejidad es la existencia de varios polimorfismos de FcyR en el proteoma humano. Un polimorfismo particularmente pertinente con significado químico es V158/F158 FcyRIIIa. IgGl humana se une con mayor afinidad al alotipo V158 que al alotipo F158. Esta diferencia en la afinidad, y presumiblemente su efecto en la ADCC y/o ADCP, se ha mostrado que es un determinante significativo de la eficacia del del anticuerpo anti-CD20 rituximab (RituxanMR, una marca comercial registrada de IDEC Pharmaceuticals Corporation) . Los pacientes con el alotipo V158 responden favorablemente al tratamiento con rituximab; sin embargo, los pacientes con el alotipo F158 de menor afinidad responden pobremente (Cartron et al., 2002 Blood 99:754-758). Aproximadamente 10-20% de los humanos son homocigotos a V158A/158, 45% son heterocigotos a V158/F158, y 35-45% de los humanos son homocigotos a F158/F158 (Lehrnbecher et al., 1999 Blood 94:4220-4232 Cartron et al., 2002 Blood 99:754-758). De esta manera, 80-90% de los humanos son pobres respondedores, es decir tienen al menos un alelo del F158 FcyRIIIa.

La región Fe también está comprendida en la activación de la cáscara de complemento. En la ruta clásica de complemento, Cl se une con su subunidades Cl q a los fragmentos Fe de IgG o IgM, que han formado un complejo con los antígenos. En ciertas modalidades de la invención, las modificaciones a la región Fe comprenden modificaciones que alteran (ya sea mejoran o disminuyen) la capacidad de un anticuerpo específico de BKB2R descrito en la presente para activar el sistema de complemento (ver por ejemplo, Patente de los Estados unidos 7,740,847). Para valorar la activación de complemento, se puede realizar un ensayo de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) (ver, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Meth. 202:163 (1996)). Por ejemplo, con amortiguador se pueden diluir varias concentraciones de polipéptido variante (Fe) y complemento humano. Las mezclas - de anticuerpos variantes (Fe), complemento humano diluido y células que expresan el antígeno (BKB2R) se pueden adicionar a una placa de 96 concavidades de cultivo de tejido de fondo plano y se deja incubar durante 2 horas a 37°C y 5% de C02 para facilitar la lisis celular mediada por complemento. Entonces se pueden adicionar cincuenta microlitros de azul alamar (Accumed International) a cada concavidad y se incuba durante la noche a 37°C. La absorbancia se puede medir usando un perímetro de 96 concavidades con excitación a 530 nm y emisión a 590 nm. Los resultados se pueden expresar en unidades de fluorescencia relativa (RFU, por sus siglas en inglés) . Las concentraciones de muestra se pueden computar de una cura normal y el porcentaje de actividad en comparación al anticuerpo no variante se puede reportar para el anticuerpo variante de interés.

De esta manera, en ciertas modalidades, la presente invención proporciona anticuerpos anti-BKB2R que tienen una región Fe modificada con propiedades funcionales alteradas, tal como ADCC, ADCP, CDC mejoradas, o afinidad mejorada de unión para un FcyR específico. Las modificaciones ilustrativas de la región Fe incluyen aquellas descritas en, por ejemplo, Stavenhagen et al., 2007 Cáncer Res. 67:8882. Otras regiones Fe modificadas contempladas en la presente se describen, por ejemplo, en las patentes emitidas de los Estados Unidos 7,317,091; 7,657,380; 7,662,925; 6,538,124; 6,528,624; 7,297,775; 7,364,731; Solicitudes Publicadas de patente de los Estados Unidos US2009092599 ; US20080131435 ; US20080138344 ; y Solicitudes Internacionales publicadas WO2006/105338; WO2004/063351 ; WO2006/088494 ; WO2007/024249.

Las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-BKB2R se pueden valorar usando una variedad de métodos conocidos por la persona experta, incluyendo pero no limitado a liberación de calcio por células que expresan BKB2R, ensayos de afinidad/unión (por ejemplo, resonancia de plasmón superficial, ensayos de inhibición competitivas); ensayos de citotoxicidad, ensayos de viabilidad celular (por ejemplo, usando exclusión de tienta tal como Azul de Trypan, yoduro de propidio, etc.), inhibición de células cancerosas y/o crecimiento tumoral usando modelos in vi tro o in vivo (por ejemplo, ensayos de proliferación celular y/o formación de colonias; ensayos de proliferación dependientes de anclaje; modelos de xenoinjerto de tumor humano normal) (ver, por ejemplo, Culp PA, et al., Clin. Cáncer Res. 16(2) :497-508) . Otros ensayos pueden probar la capacidad de los anticuerpos descritos en la presente para bloquear las respuestas normales mediadas por BKB2R, tal como ensayos para la síntesis de glicógeno intracelular y/o determinación por ELISA de la fosforilación de GSK-3P en serina-9 como indicadores de la inhibición de GSK-3 . Estos ensayos se pueden realizar en base a la descripción de la presente y del conocimiento en la técnica, por ejemplo, usando protocolos bien establecidos conocidos por la persona experta (ver por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publ . Assoc. Inc. & John iley & Sons, Inc., NY, NY) ; Current Protocols in Immunology (Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY) ,- o equipos comercialmente disponibles.

En una modalidad, los anticuerpos anti-BKB2R descritos en la presente o bloquean la unión de las cininas (por ejemplo, bradiquinina y calidina (Lys-bradiquinina) ) o cualquier otro ligando para BKB2R, al receptor BKB2R. Los ensayos de unión y los ensayos de inhibición competitiva se pueden usar para determinar la actividad bloqueadora de los anticuerpos descritos en la presente, o variantes o fragmentos de unión a antígeno de unión de los mismos.

/ En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-BKB2R descritos en la presente se unen a BKB2R y estimulan, activan o inducen de otro modo eventos de señalización de etapa posterior en la ruta de señalización de BKB2R. en modalidades particulares, un nivel de estimulación de señalización de BKB2R proporcionado por un anticuerpo anti -BKB2R puede ser un incremento estadísticamente significativo en el nivel de señalización mediante BKB2R de al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% con relación al nivel de señalización de BKB2R en la ausencia del anticuerpo anti-BKB2R descrito en la presente. En ciertas modalidades, el incremento estadísticamente significativo en el nivel de estimulación de la señalización de BKB2R puede estar en exceso de al menos 100% mayor que el nivel que es detectable en la ausencia del anticuerpo anti-BKB2R descrito en la presente que en algunos casos puede ser mayor por 200%, 300% o más .

De esta manera, la presente descripción proporciona anticuerpos anti-BKB2R que modulan los componentes de la ruta de señalización de GSK-3B. Por modularla se quiere decir alterar la actividad, nivel e proteína, nivel de expresión génica, o estado de fosforilación de un componente de la ruta de señalización de GSK-3B de una manera estadísticamente significativa (por ejemplo, inhibir de una manera estadísticamente significativa, o incrementar de una manera estadísticamente significativa, como se mide usando controles apropiados) . Un componente del receptor acoplado a proteína G de BKB2R induce eventos de señalización de etapa posterior mediante la ruta de señalización y PI3K/Akt, que incluye, pero no se limita a, fosforilación y desactivación de a=?-3 en serina-9.

En ciertas modalidades, la modulación de los componentes de la ruta de señalización de BKB2R puede comprender la modulación del estado de fosforilación de uno o más componentes de la ruta. En ciertas modalidades, la unión de los anticuerpos anti-BKB2R de la presente invención al receptor BKB2R puede provocar, de una manera estadísticamente significativa, fosforilación incrementada de GSK-3B en serina-9 y su desactivación.

Los ensayos in vivo e in vi tro para determinar si un anticuerpo altera (por ejemplo, incrementa o disminuye de una manera estadísticamente significativa) la señalización de BKB2R se conocen en la técnica. Por ejemplo, los ensayos a base de células tal como ensayos de movilización de calcio inducida, o ensayos que utilizan detección inmunologica de un componente de la ruta relacionada a BKB2R tal como GSK-3 , en lisados celulares después de la inducción con los anticuerpos anti-BKB2R descritos en la presente u otros estímulos pertinentes, se puede usar para medir los niveles de señalización de BKB2R in vitro (por ejemplo, ensayo inmunométerico enzimático Assay Designs® GSK-3B, Assay Designs, Inc., Ann Arbor, MI) . También en la presente en los ejemplos 1 y 9 se describen ejemplos de estos ensayos BKB2R el nivel de señalización de BKB2R en la presencia de ligandos de BK tal como BK o calidina cuando está presente el anticuerpo que se une a BKB2R se puede comparar también al nivel de señalización sin que esté presente el anticuerpo que se une a BKB2R. Los ejemplos específicos no limitantes del uso de los ensayos a base de células para valorar un efecto de un anticuerpo monoclonal anti -BKB2R en la señalización de BKB2R se proporcionan en los ejemplos de la presente. Además, el efecto de un anticuerpo que se une a BKB2R en la señalización se puede medir in vitro o in vivo al medir el efecto del anticuerpo en el nivel de expresión de genes que se regulan por componentes de rutas relacionadas a BKB2R, tal como una o más de las rutas reconocidas en las cuales participa GSK-3B. Otros ensayos y sistemas comercialmente disponibles para determinar la modulación de componentes de la ruta de señalización de BKB2R se conocen por la persona experta .

La presente invención proporciona, en ciertas modalidades, un ácido nucleico aislado que codifica para un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en la presente, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica para un dominio VH o VL de CDR. Los ácidos nucleicos incluyen ADN y AR . Estas modalidades y modalidades relacionadas pueden incluir polinucleótidos que codifican para anticuerpos que se unen a BKB2R como se describe en la presente. El término "polinucleótido aislado" como se usa en la presente debe significar un polinucleótido de origen genómico, ADNc , o sintético o alguna combinación de esto, que en virtud de su origen el polinucleótido aislado (1) no está asociado con todo o una porción de un polinucleótido en el cual se encuentra la naturaleza el polinucleótido aislado, (2) se enlaza a un polinucleótido al cual no está enlazado en la naturaleza o (3) no se presenta en la naturaleza como parte de una secuencia más grande.

El término "operablemente enlazado" significa que los componentes a los cuales se aplica el término están en una relación que les permite llevar a cabo sus funciones inherentes bajo condiciones adecuadas. Por ejemplo, una secuencia de control de transcripción "operablemente enlazado" a una secuencia codificadora de proteínas se liga a esta de modo que se logra la expresión de la secuencia codificadora de proteína bajo condiciones compatibles con la actividad transcripcional de las secuencias de control .

El término "secuencia de control" como se usa en la presente se refiere a secuencias de polinucleótido que afecta la expresión, procesamiento o localización intracelülar de secuencias codificadoras a las cuales se ligan o enlazan de manera operable. La naturaleza de estas secuencias de control puede depender del organismo hospedador. En modalidades particulares, las secuencias de control de transcripción para procariotas pueden incluir un promotor, un sitio de unión ribosomal, y secuencia de terminación de transcripción. En otras modalidades particulares, las secuencias de control de transcripción para eucariotas pueden incluir promotores que comprenden uno o una pluralidad de sitios de reconocimiento para factores de transcripción, secuencias intensificadoras de transcripción, secuencias de terminación de transcripción y secuencias de poliadenilación. En ciertas modalidades, "secuencias de control" pueden incluir secuencias guías y/ secuencias de compañeros de fusión.

El término "polinucleótido" como se refiere en la presente significa polímeros de ácido nucleico de hebra individual o de doble hebra. En ciertas modalidades, los nucleótidos que comprenden el polinucleótido pueden ser ribonucleótidos o desoxiribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. Esta modificaciones incluyen modificaciones base tal como bromouridina, modificaciones por ribosa tal como arabinosa y 21 , 31 -didesoxiribosa y modificaciones de enlace internucleótido tal como fosforotioato, fosforoditioato , fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato y fosforoamidato . El término "polinucleótido" incluye de manera específica formas de hebra individual y doble de ADN.

El término "nucleótidos que se presentan de forma natural" incluye desoxiribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" incluye nucleótidos con grupos de azúcar sustituidos o modificados y similares. El término "enlaces de oligonucleótido" incluye enlaces de oligonucleótido tal como fosforotioato, fosforoditioato , fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, foshoraniladato, fosforoamidato, y similares. Ver, por ejemplo, LaPlanche et al., 1986, Nucí. Acids Res., 14:9081; Stec et al., 1984, J". Am. Chem. Soc, 106:6077; Stein et al., 1988, Nucí. Acids Res., 16:3209; Zon et al, 1991, Anti-Cancer Drug Design, 6:539; Zon et al, 1991, OLIGONUCLEÓTIDOS AND A ALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, pp . 87-108 (F. Eckstein, Ed.), Oxford University Press, Oxford England; Stec et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,151 ,510; Uhlmann y Peyman, 1990, Chemical Reviews, 90:543, las descripciones de lo cual se incorporan de este modo como referencia para cualquier propósito. Un oligonucleótido puede incluir una marca detectable para permitir la detección del oligonucleótido o hibridación del mismo.

El término "vector" se usa para referirse a cualquier molécula (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido, o virus) usada para transferir información codificadora a una célula hospedadora. El término "vector de expresión" se refiere a un vector que es adecuado para la transformación de una célula hospedadora y contiene secuencias de ácido nucleico que dirigen y/o controlan la expresión de secuencias de ácido nucleico, heterólogas, insertadas. La expresión incluye, pero no se limita a, procesos, tal como transcripción, traducción y empalme de ARN, si están presente intrones .

Como se entenderá por aquellos expertos en la técnica, los polinucleótidos pueden incluir secuencias genómicas, secuencias extra-genómicas y codificadas por plásmido y segmentos génicos manejados más pequeños que expresan, o se pueden adaptar para expresar, proteínas, polipéptidos , péptidos y similares. Estos segmentos se pueden asilar de manera natural, o modificar de manera sintética por la persona experta.

Como se reconocerá también por la persona experta, los polinucleótidos pueden ser de hebra individual (codificadores o antisentido) o de doble hebra, y pueden ser moléculas de ADN (genómicas, ADNc o sintéticas) o de ARN. Las moléculas de ARN pueden incluir moléculas HnARN, que contiene intrones y corresponde a una molécula de ADN de una manera uno a uno, y las moléculas de ARNm que no contienen intrones. Las secuencias codificadoras o no codificadoras adicionales pueden estar presentes, pero no es necesario, dentro de un polinucleótido de acuerdo a la presente descripción, y un polinucleótido se puede enlazar, pero no es necesario, a otras moléculas y/o materiales de soporte. Los polinucleótidos pueden comprenden una secuencia nativa o pueden comprender una secuencia que codifica para una variante o derivado de esta secuencia.

Por lo tanto, de acuerdo a estas modalidades y modalidades relacionadas, se proporcionan polinucleótidos que comprenden algo o toda de una secuencia de polinucleótido expuesta en cualquiera de una o más de SEQ ID NOs : 9-60, 76, 78, 80 y 82, complementos de una secuencia de polinucleótido expuesta en cualquiera de una o más de SEQ ID NOs: 49-60, 76, 78, 80 y 82, y variantes degeneradas de una secuencia de polinucleótido expuesta en cualquiera de una o más de SEQ ID NOs: 49-60, 76, 78, 80 y 82. En ciertas modalidades preferidas, la secuencia de polinucleótido expuesta en la presente codifica para anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, que se unen al BKB2R, como se describe en otra parte de la presente. En ciertas modalidades preferidas, las secuencias de polinucleótido expuestas en la presente codifican para polipéptidos que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NOS: 1-48, 75, 77, 79, 81, y 83-92.

En otras modalidades relacionadas, las variantes de polinucleótido pueden tener identidad sustancial a las secuencias descritas en la presente en SEQ ID NOs : 49-60, .76, 78, 80 y 82, por ejemplo aquellas que comprenden al menos 70% de identidad de secuencia, de manera preferente al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% o mayor identidad de secuencia en comparación a una secuencia de polinucleótido de referencia tal como la secuencia descritas en la presente, usando los métodos descritos en la presente (por ejemplo, análisis BLAST usando parámetros normales, como se describe más adelante) . Un experto en la técnica reconocerá que estos valores se pueden ajustar de manera apropiada para determinar la identidad correspondiente de proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos al tomar en cuenta la degeneración de codones, similitud de aminoácidos, colocación del cuadro de lectura y similares.

Típicamente, las variantes de polinucleótido contendrán una o más sustituciones, adiciones, supresiones y/o inserciones, de manera preferente tal que la afinidad de unión del anticuerpo codificado por el polinucleótido variante no se disminuye de manera sustancial con relación a un anticuerpo codificado por una secuencia de polinucleótido específicamente expuesta en la presente.

En ciertas modalidades relacionadas diferentes, los fragmentos de polinucleótido pueden comprenden o consistir esencialmente de varias longitudes de tramos contiguos de secuencia idénticos a o complementarios a una o más de las secuencias descritas en la presente. Por ejemplo, se proporcionan polinucleótidos que comprenden o consisten esencialmente de al menos aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 400, 500 o 1000 O más nucleótidos contiguos de una o más de las secuencias descritas en la presente así como longitudes intermedias entre esto. Se entenderá fácilmente que "longitudes intermedias", en ese contexto, significa cualquier longitud entre los valores citados, tal como 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.; incluyendo todos los números enteros a través de 200-500; 500-1,000, y similares. Una secuencia de polinucleótido como se describe aquí se puede extender en uno o ambos extremos por nucleótidos adicionales no encontrados en la secuencia nativa. Esta secuencia adicional puede consistir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, O 20 nucleótidos en cualquier extremo de la secuencia descrita o en ambos extremos de la secuencia descrita.

En otra modalidad, se proporcionan polinucleótidos que son capaces de hibridar bajo condiciones de severidad moderada a alta a una secuencia de polinucleótido proporcionada en la presente, o un fragmento de esto, o una secuencia complementaria de esto. Las técnicas de hibridación son bien conocidas en la técnica de bilogía molecular. Para propósitos de ilustración, las condiciones moderadamente severas adecuadas para probar la hibridación de un polinucleótido como se proporciona en la presente con otros polinucleótidos incluyen prelavado en una solución de 5 X SSC, 0.5% SDS, EDTA 1.0 mM (pH 8.0); hibridación a 50°C-60°C, 5 X SSC, durante la noche; seguido por lavado dos veces a 65°C durante 20 minutos con cada uno de 2X, 0.5X y 0.2X SSC que contiene 0.1% de SDS. Un experto en la técnica entenderá que la severidad de la hibridación se puede manipular fácilmente, tal como al alterar el contenido de sal de la solución de hibridación y/o la temperatura a la cual se realiza la hibridación. Por ejemplo, en otra modalidad, las condiciones adecuadas de hibridación altamente severa incluyen aquellas descritas anteriormente con la excepción que la temperatura de hibridación se incrementa, por ejemplo, a 60-65°C o 65-70°C.

En ciertas modalidades, los polinucleótidos descritos anteriormente, por ejemplo, variantes de polinucleótido, fragmentos y secuencias de hibridación, codifican para anticuerpo que se unen a BKB2R, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En otra modalidades, estos polinucleótidos codifican para anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, o CDR de los mismos, que se unen a BKB2R al menos aproximadamente 50%, de manera preferente al menos aproximadamente 70%, y de manera más preferente al menos aproximadamente 90% así como una secuencia de anticuerpo específicamente expuesta en la presente. En modalidades adicionales, estos polinucleótidos codifican para anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, o CDR de los mismos, que se unen a BKB2R con mayor afinidad que los anticuerpos expuestos en la presente, por ejemplo, que se unen de manera cuantitativa al menos aproximadamente 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, o 110% así como una secuencia de anticuerpo específicamente expuesta en la presente.

La determinación de las estructuras tridimensionales de polipéptidos representativos (por ejemplo, anticuerpos variantes específicos de BKB2R como se proporciona en la presente, por ejemplo, una proteína de anticuerpo que tiene un fragmento de unión a antígeno como se proporciona en la presente) se puede producir a través de metodologías de rutina tal como sustitución, adición, supresión o inserción de uno o más aminoácidos con aminoácidos naturales o no naturales seleccionados que se puede modelar virtualmente para propósitos de determinar si una variante estructural derivada de este modo retiene las propiedades de relleno de espacio de la especies actualmente descrita. Ver, por ejemplo, Dónate et al., 1994 Prot. Sci. 3:2378; Bradley et al., Science 309: 1868-1871 (2005); Schueler-Furman et al., Science 310:638 (2005); Dietz et al., Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 103:1244 (2006); Dodson et al., Nature 450:176 (2007); Qian et al., Nature 450:259 (2007); Raman et al. Science 327:1014-1018 (2010). Algunos ejemplos no limitantes adicionales de algoritmos de computadora que se pueden usar para estas modalidades y modalidades relacionadas, tal como para el diseño racional de anticuerpos específicos de BKB2R o dominios de unión a antígeno de los mismos como se proporciona en la presente, incluyen NAMD, un código dinámico molecular dinámico molecular paralelo diseñado para simulación de alto desempeño de sistemas biomoleculares grandes, y VMD que es un programa de visualización molecular para visualizar, animar y analizar sistemas biomoleculares grandes usando gráfica 3-D de encriptación integrada (ver Phillips, · et al., Journal of Computational Chemistry, 26:1781-1802, 2005; Humphrey, et al., "VMD - Visual Molecular Dynamics", J. Molec. Graphics, 1996, vol . 14, pp. 33-38; ver también el sitio web para el Theoretical and Computational Biophysics Group, University of Illinois en Urbana-Champagne , en ks.uiuc.edu/Research/vmd/). Se conocen en la técnica muchos otros programas de computadora y están disponibles para una persona experta en la técnica y permiten determinar las dimensiones atómicas de modelos de relleno de espacio (radios de van der Waals) de conformaciones reducidas al mínimo de energía; GRID, que busca determinar regiones de alta afinidad para diferentes grupos químicos, mejorando de este modo la unión, Monte Cario searches, que calcula alineación matemática, y CHARMM (Brooks et al. (1983) J. Comput . Chem. 4:187-217) y AMBER (Weiner et al (1981) J. Comput. Chem. 106: 765), que valora los cálculos del campo de fuerza, y análisis (ver también, Eisenfield et al. (1991) Am. J. Physiol. 261 : C376-386 ; Lybrand (1991 ) J. Pharm. Belg. 46:49-54; Froimowitz (1990) Biotechniques 8:640-644; Burbam et al. (1990) Proteins 7:99-111; Pedersen (1985) Environ. Health Perspect. 61:185-190; y Kini et al. (1991) J. Biomol . Struct . Dyn. 9:475-488). Están comercialmente disponibles también una variedad de programas computacionales apropiados de computadora, tal como Schrodinger (Munich, Alemania) .

Los polinucleótidos descritos en la presente, o fragmentos de los mismos, a pesar de la longitud de la secuencia codificadora de los mismos se pueden combinar con otras secuencias de ADN, tal como promotores, señales de poliadenilación, sitios adicionales de enzimas de restricción, múltiples sitos de clonación, otros segmentos codificadores y similares tal que puede variar considerablemente su longitud total. Por lo tanto, se contempla que un fragmento de ácido nucleico dé casi cualquier longitud se puede emplear, con la longitud total que se limita de manera preferente por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ADN recombinante propuesto. Por ejemplo, los segmentos de polinucleótidos ilustrativos con longitudes totales de aproximadamente 10,000, aproximadamente 5000, aproximadamente 3000, aproximadamente 2,000, aproximadamente 1,000, aproximadamente 500, aproximadamente 200, aproximadamente 100, aproximadamente 50 pares de base de longitud, y similares, (incluyendo todas las longitudes intermedias) se contemplan que son útiles.

Cuando se comparan secuencias de polinucleótido, se dice que las dos secuencias son "idénticas" si la secuencia de nucleótidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinea para correspondencia máxima, como se describe más adelante. Las comparaciones entre dos secuencias se realizan típicamente al comparar las secuencias sobre una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación" como se usa en la presente, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, usualmente de 30 a aproximadamente 75, 40 a aproximadamente 50, en la cual se puede comparar una secuencia a una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que se alinean de manera óptima las dos secuencias.

La alineación óptima de las secuencias para comparación se puede llevar a cabo usando el programa Megalign en la suit Lasergene de software bioinformático (DNASTAR, Inc., Madison, WI) , usando los parámetros por defecto. Este programa incorpora varios esquemas de alineación descritos en las siguientes referencias: Dáyhoff, .O. (1978) A model of evolutionary change in proteins Matrices for detecting diatant relationships . In D yhoff, M.O. (ed. ) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl . 3, pp . 345-358; Hein J., Unified Approach to Alignment and Phylogenes, pp. 626-645 (1990); Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., CABIOS 5:151-153 (1989); Myers, E.W. and Muller W., CABIOS 4:11-17 (1988); Robinson, E.D., Comb . Theor 77:105 (1971 ); Santou, N. Nes , M. , Mol. Biol . Evol . 4:406-425 (1987); Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., Numerical Taxonomy -the Principies and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA (1973); Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., Proc. Nati. Acad., Sci. EUA 80:726-730 (1983).

De manera alternativa, se puede llevar a cabo la alineación óptima de secuencias para comparación por el algoritmo de identidad loca de .Smith y Waterman, Add. APL . Math 2:482 (1981), por el algoritmo de alineación de identidad de Needleman y Wunsch, J". Mol. Biol. 48:443 (1970), por la búsqueda para métodos de similitud de Pearson and Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85: 2444 (1988), por implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG) , 575 Science Dr., Madison, WI), o por inspección.

Los ejemplos preferidos de algoritmos que son adecuados para determinar el por ciento de identidad de secuencia y a similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., Nucí. Acids Res. 25:3389-3402 (1977), y Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), respectivamente. Se pueden usar BLAST y BLAST 2.0, por ejemplo con los parámetros descritos en la presente para determinar el por ciento de identidad de secuencia entre dos o más polinucleótidos . El software para realizar los análisis BLAST está públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information. En un ejemplo ilustrativo, se pueden calcular puntuaciones acumulativas usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos de correspondencia; siempre >0) y N (puntuación de penalidad para residuos de mala correspondencia; siempre <0) .

La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detienen cuando: la puntuación de alineación acumulativa disminuye por la cantidad X desde su máximo valor logrado; la puntuación acumulativa va a cero o más abajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuo de puntuación negativa; o se alcanza el extremo de su secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 11, y una expectación (E) de 10, y las alineaciones de la matriz de puntuación BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89:10915 (1989)), (B) de 50, expectación (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas hebras.

En ciertas modalidades, el "porcentaje de identidad de secuencia" se determina al comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, separaciones) de 20 por ciento o menos, usualmente de 5 a 15 por ciento, o 10 a 12 por ciento, en comparación a las secuencias de referencia (que no comprenden adiciones ni supresiones) para alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar el número de posiciones en las cuales se presentan las bases idénticas de ácido nucleico en ambas secuencias para producir el número de posiciones correspondidas, dividiendo el número de posiciones correspondidas por el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de la ventana) y al multiplicar los resultados por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.

Se apreciará por los expertos en la técnica que, como resultado de la degeneración del código genético, hay muchas secuencias de nucleótidos que codifican para un anticuerpo como se describe en la presente. Algunos de estos polinucleótidos tiene identidad mínima de secuencia a la secuencia de nucleótidos de la secuencia nativa u original de polinucleotido, tal como aquellos descritos en la presente que codifica para anticuerpos que se unen a BKB2R. Sin embargo, los polinucleótidos que varían debido a las diferencias en el uso del codón se contemplan de manera expresa por la presente descripción. En ciertas modalidades, se contemplan de manera específica secuencias que se han optimizado por codón para expresión en mamíferos.

Por lo tanto, en otra modalidad de la invención, se puede emplear un planteamiento de mutagénesis, tal como mutagénesis específica del sitio para la preparación de variantes y/o derivados de los anticuerpos descritos en la presente. Por este planteamiento, se pueden hacer modificaciones específicas en una secuencia de polipéptido a través de la mutagénesis de los polinucleótidos subyacentes que los codifican. Estas técnicas proporcionan un planteamiento directo para preparar y probar variantes de secuencia, por ejemplo, al incorporar una o más de las consideraciones anteriores, al introducir uno o más cambios de la secuencia de nucleótidos en el polinucleotido.

La mutagénesis dirigida al sitio permite la producción de mutantes a través del uso de secuencias específicas de oligonucleótido que codifica la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia cebadora de tamaño suficiente y complejidad de secuencia suficiente para formar un dúplex estable en ambos lados de la unión por supresión que se cruza. Se pueden emplear mutaciones en una secuencia seleccionada de polinucleótidos para mejorar, alterar, disminuir, modificar o cambiar de otro modo las propiedades del polinucleótido mismo, y/o alterar las propiedades, actividad, composición, estabilidad, o secuencia primaria del polipéptido codificado.

En ciertas modalidades, los inventores contemplan la mutagénesis de las secuencias de polinucleótido descritas para alterar una o más propiedades del polinucleótido codificado, tal como la afinidad de unión del anticuerpo o el fragmento de un antígeno del mismo, o la función de una región Fe particular, o la afinidad de la región Fe para un FcyR particular. Las técnicas para la mutagénesis específica al sitio son bien conocidas en la técnica, y se usan ampliamente para crear variantes tanto de polipéptidos como de polinucleótidos. Por ejemplo, frecuentemente, se uas mutagénesis específica del sitio para alterar una porción específica de una molécula de ADN. En estas modalidades, se emplea un cebador que comprende típicamente de aproximadamente 14 a aproximadamente 25 nucleótidos o así de longitud, con aproximadamente 5 a aproximadamente 10 residuos en ambos lados de la unión de la secuencia que se altera.

Como se apreciará por aquellos expertos en la técnica, las técnicas de mutagénesis específicas del sitio han empleado frecuentemente un vector de fago que existe tanto en una forma de hebra individual como de doble hebra. Los vectores típicos útiles en la mutagénesis dirigida al sitio incluye vectores tal como el fago M13. Estos fagos están fácilmente disponibles de forma comercial y su uso se conoce bien en general por los expertos en la técnica. También de forma rutinaria se emplean plásmidos de doble hebra en la mutagénesis dirigida al sitio que eliminan el paso de transferir el gen de interés de un plásmido a un fago .

En general, la mutagénesis dirigida al sitio de acuerdo con la presente se realiza al obtener primero un vector de hebra individual o fusión con la excepción de dos hebras de un vector de doble hebra que incluye dentro de su secuencia una secuencia de ADN que codifica para el péptido deseado. Un cebador de oligonucleótido que tiene la secuencia mutada deseada se prepara, en general de forma sintética. Este cebador entonces se fija con el vector de hebra individual, se somete a enzimas de polimerización de ADN tal como fragmento Klenow de polimerasa I de E . coli, a fin de completar la síntesis de la hebra que tiene la mutación. De esta manera, se forma un heterodúplex en donde una hebra codifica para la secuencia no mutada original y la segunda hebra tiene la mutación deseada. El vector de heterodúplex entonces se usa para transformar células apropiadas, tal como células de E. coli, y se seleccionan clones que incluyen vectores recombinantes que tienen el arreglo de secuencia mutadas .

La preparación de variantes de secuencia de los segmentos de ADN que codifican para el péptido seleccionado usando mutagénesis dirigida al sitio proporciona un medio para producir especies potencialmente útiles y no se propone que sea limitante puesto que hay otras maneras en las cuales se pueden obtener variantes de secuencia de péptidos y las secuencias de ADN que los codifican. Por ejemplo, se pueden tratar vectores recombinantes que codifican para la secuencia peptídica deseada con agentes mutagénicos tal como hidroxilamina, para obtener variantes de secuencia. Los detalles específicos con respectó a estos métodos y protocolos se encuentran en las enseñanzas de Maniatis et al., 1982, infra, y otras fuentes citadas más adelante para biología molecular y genética molecular y metodología relacionadas, cada uno incorporado en la presente como referencia para ese propósito.

El término "procedimiento de mutagénesis dirigida por oligonucleótido" se refiere a los procesos dependientes de plantillas y propagación mediada por vector que da por resultado un incremento en la concentración de una molécula específica de ácido nucleico con relación a su concentración inicial, o un incremento en la concentración de una señal detectable, tal como amplificación. El término "procedimiento de mutagénesis dirigido por oligonucleótido" se propone que se refiere a un proceso que comprende la extensión dependiente de plantilla de una molécula cebadora. El término "proceso dependiente de plantilla" se refiere a la síntesis de ácido nucleico de una molécula de ARN o de ADN en donde la secuencia de la hebra recién sintetizada de ácido nucleico se dicta por las reglas bien conocidas de apareamiento de bases complementarias (ver, por ejemplo, Watson, 1987) . Típicamente, las metodologías mediadas por vector comprenden la introducción del fragmento de ácido nucleico en un vector de ADN o ARN, la amplificación clonal del vector, y la recuperación del fragmento amplificado de ácido nucleico. Los ejemplos de estas metodologías se proporcionan por la Patente de los Estados Unidos No. 4,237,224, específicamente incorporado en la presente como referencia en su totalidad.

En otro planteamiento para la producción de variantes de polipéptido, se puede emplear recombinación recursiva de secuencia, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,837,458. En este planteamiento, los ciclos iterativos de recombinación y examen o selección se realizan para "hacer evolucionar" variantes individuales de polinucleótido que tienen, por ejemplo, afinidad incrementada de unión. En ciertas modalidades proporcionan también en la forma de plásmidos, vectores, casetes de transcripción o expresión que comprenden al menos un polinucleótido como se describe en la presente.

De acuerdo a ciertas modalidades relacionadas, se proporciona una célula hospedadora recombinante que comprende una o más construcciones como se describe en la presente; un ácido nucleico que codifica para cualquier anticuerpo, CDR, dominio VH o VL, o fragmento de unión a antígeno del mismo; y un método de producción del producto codificado, método que comprende la expresión del ácido nucleico codificador para el mismo. La expresión se puede lograr de manera conveniente al cultivar bajo condiciones apropiadas células hospedadoras recombinantes que contienen el ácido nucleico. Después de la producción por la expresión, se puede aislar un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, y/o se purifica usando cualquier técnica adecuada y luego se usa como se desea .

Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos como se proporciona en la presente, y moléculas de ácido nucleico codificadoras y vectores, se pueden aislar y/o purificar, por ejemplo de su ambiente natural, en una forma sustancialmente pura u homogénea, o en el caso de ácido nucleico, libre o sustancialmente libre de ácido nucleico o genes de origen diferentes de la secuencia que codifica para un polipéptido co la función deseada. El ácido nucleico, puede comprender ADN o ARN y puede ser completamente o parcialmente sintético. La referencia o una secuencia de nucleótidos como se expone en la presente abarca una molécula de ADN con una secuencia especificada, y abarca una molécula de ARN o la secuencia especificada en la cual U se sustituye por T, al menos que el contexto requiera lo contrario.

Son bien conocidos los sistemas para clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de células hospedadoras diferentes. Las células hospedadoras adecuadas incluyen bacterias, células mamíferas, levadura y sistemas de baculovirus. Las líneas de células mamíferas disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster Chino, células HeLa, células de riñon de hámster neonato, células de melanoma de ratón NSO y muchas otras . Un hospedador bacteriano como un preferido es E. coli.

La expresión de of anticuerpos y fragmentos que se unen a antígeno en células procariotas tal como E. coli está bien establecido en la técnica. Para una revisión, ver, por ejemplo Pluckthun, Bio/'Technology 9: 545-551 (1991). También está disponible la expresión en células eucarióticas en cultivo para los expertos en la técnica como una opción para la producción de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, ver revisiones recientes, por ejemplo, Ref, (1993) Curr. Opinión Biotech. 4: 573-576; Trill et al . (1995) Curr. Opinión Biotech 6: 553-560.

Los vectores adecuados se pueden elegir o construir, que contienen secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias terminadoras , secuencias de poliadenilación, secuencias intensificadoras , genes marcadores y otras secuencias como sea apropiado. Los vectores pueden ser plásmidos, virales, por ejemplo, fago, o fagémido, como sea apropiado. Para detalles adicionales, ver, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press,· ver también referencias adicionales citadas más adelante con respecto a métodos de biología molecular. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo en la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y análisis de proteínas, se describen en detalle en Current Protocols in Molecular Biology, Segunda Edición, Ausubel et al. eds . , John iley & Sons, 1992, o actualizaciones subsiguientes a esto.

El término "célula hospedadora" se usa para referirse a una célula en la cual se ha introducido, o que es capaz de haber sido introducida en la misma, una secuencia de ácido nucleico que codifica para uno o más de los anticuerpos descritos en la presente, y que expresa adicionalmente o que es capaz de expresar un gen seleccionado de interés, tal como un gen que codifica para cualquier anticuerpo descrito en la presente. El término incluye la progenie de la célula de origen, si o no la progenie sea idéntica en morfología o en constitución genética a la original, en tanto que esté presente el gen seleccionado. Por consiguiente, también se contempla un método que comprende introducir este dicho ácido nucleico en una célula hospedadora . La introducción puede emplear cualquier técnica disponible. Para células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir transfección con fosfato de calcio, DEAE-dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción usando retrovirus u otros virus, por ejemplo, vaccinia o, para células insectiles, baculovirus. Para las células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro de calcio, electroporación y transfección usando bacteriófago. La introducción se puede seguir al provocar o permitir la expresión del ácido nucleico, por ejemplo, al cultivar células hospedadoras bajo condiciones para la expresión del gen. En una modalidad, el ácido nucleico se integra en el genoma (por ejemplo cromosoma) de la célula hospedadora. Se puede promover la integración por inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma, de acuerdo con técnicas estándar.

La presente invención también proporciona, en ciertas modalidades, un método que comprende usar una construcción como se señala anteriormente en un sistema de expresión a fin de expresar un polipéptido particular, tal como un anticuerpo específico de BKB2R como se describe en la presente. El término "transducción" se usa para referirse a la transferencia de genes desde una bacteria a otra, usualmente por un fago. "Transducción" también se refiere a la adquisición y transferencia de secuencias celulares eucarióticas por retrovirus. El término "transfección" se usa para referirse a la captación de ADN extraño o exógeno por una célula, y una célula se ha "transfectado" cuando el ADN exógeno se ha introducido dentro de la membrana celular. En la técnica se conocen varias técnicas de transfección y se describen en la presente. Ver, por ejemplo, Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories; Davis et al., 1986, BASIC METHODS 1N MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier; y Chu et al., 1981, Gene 13:197. Estas técnicas se puede usar para introducir una o más porciones de ADN exógeno en células hospedadoras adecuadas.

El término "transformación" como se usa en la presente, se refiere a un cambio en las características genéticas de la célula, y una célula se ha transformado cuando se ha modificada para contener un nuevo ADN. Por ejemplo, una célula se transforma donde se modifica genéticamente de su estado nativo. Después de la transfección o transducción, el ADN transformante puede recombinarse con aquel de la célula al integrarse físicamente en un cromosoma de la célula, o se puede mantener de manera momentánea como un elemento episomal sin que se replique, o puede replicarse independientemente como un plásmido. Se considera que una célula se ha transformado de manera estable cuando el ADN se replica por la división de la célula. El término "que se presenta de forma natural" o "nativo" cuando se usa en unión con materiales biológicos tal como moléculas de ácido nucleico, polipéptidos, células hospedadora, y similares, se refiere a materiales que se encuentran en la naturaleza y no se han manipulados por un humano. De manera similar, "que no se presenta de forma natural" o "no nativo" como se usa en la presente, se refiere a un material que no se encuentra en la naturaleza o que se ha modificado o sintetizado estructuralmente por un humano.

Los términos "polipéptido" , "proteína" y "péptido" y "glicoproteína" se usan de manera indistinta y significan un polímero de aminoácidos no limitado a ninguna longitud particular. El término no excluye modificaciones tal como miristilación, sulfatación, glicosilación, fosforilación y adición o supresión de secuencias de señal. Los términos "polipéptido" o "proteína" significan una o más cadenas de aminoácidos, en donde cada cadena comprende aminoácidos covalentemente enlazados por enlaces peptídicos, y en donde el polipéptido o proteína puede comprender una pluralidad de cadenas enlazadas covalentemente y/p no covalentemente de forma conjunta por enlaces peptídicos, que tienen la secuencia de proteínas nativas, es decir, proteínas producidas por células que se presentan de forma natural y específicamente no recombinantes , o células genéticamente manejadas o recombinantes, y comprenden moléculas que tienen la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa, o moléculas que tienen supresiones de, adiciones a, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la secuencia nativa. Los términos "polipéptido" y "proteína" abarcan específicamente los anticuerpos que se unen a BKB2R de la presente descripción, o secuencias que tienen supresiones de, adiciones a, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de un anticuerpo anti-BKB2R. De esta manera, un "polipéptido" o una "proteína" puede comprender una (llamada "un monómero" ) o una pluralidad (llamada "un multímero") de cadenas de aminoácido.

El término "aislado" con respecto a una proteína referida en la presente significa que una proteína (1) está libre de al menos algunas otras proteínas con las cuales se encontraría típicamente en la naturaleza, (2) está esencialmente libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, de la misma especie, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, (4) se ha separado de al menos aproximadamente 50 por ciento de los polinucleótidos , lípidos, carbohidratos, u otros materiales con los cuales está asociada la naturaleza, (5) no está asociada (por interacción covalente o no covalente) con porciones de una con las cuales se asocia en la naturaleza la "proteína aislada", (6) está operablemente asociada (por interacción covalente o no covalente) con un polipéptido con el cual no está asociada la naturaleza, o (7) no se presente en la naturaleza. Esta proteína aislada se puede codificar por ADN genómico, ADNc, AR m u otro ARN, o puede ser de origen sintético, o cualquier combinación de estos. En ciertas modalidades, la proteína aislada está sustancialmente libre de proteínas o polipéptidos u otros contaminantes que se encuentran en su ambiente natural que interferirían con su uso (terapéutico, diagnóstico, profiláctico, investigación o de otro modo) .

El término "fragmento de polipéptido" se refiere a un polipéptido, que puede ser monomérico o multimérico, que tiene una supresión amino- erminal , una supresión carboxil-terminal, y/o una supresión o sustitución interna de un polipéptido de que se presenta de forma natural o producido de forma recombinante . En ciertas modalidades, un fragmento de polipéptido puede comprender una cadena de aminoácidos de al menos 5 a aproximadamente 500 aminoácidos de larga. Se apreciará que en ciertas modalidades, los fragmentos son de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, o 450 aminoácidos de largo. Los fragmentos de polipéptido particularmente útiles incluyen dominios funcionales, incluyendo dominios de unión a antígenos o fragmentos de anticuerpos. En el caso de un anticuerpo anti-BKB2R, los fragmentos útiles incluyen, pero no se limitan a: una región CDR, especialmente una región CDR3 de la cadena pesada o ligera; un dominio variable de una cadena pesada o ligera; una porción de una cadena de anticuerpo o su región variable incluyendo dos CDR, y similares.

Los anticuerpos de unión a BKB2R o fragmentos de unión a antígeno de los mismos como se describe en la presente que son moduladores, agonistas o antagonistas de la función de BKB2R se incluyen de manera expresa dentro de las modalidades contempladas. Estos agonistas, antagonistas y anticuerpos moduladores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos interactúan con uno o más de los sitios determinantes antigénicos de BKB2R, o fragmentos o de epítopo variantes de BKB2R.

Como se reconocerá por la persona experta, hay muchos métodos conocidos para producir anticuerpos que se unen a un antígeno particular, tal como BKB2R, incluyendo tecnologías normales, ver, por ejemplo, Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En general, los anticuerpos, tal como anticuerpos que bloquean de manera específica la unión de los anticuerpos que se unen a BKB2R expresamente descritos en la presente a sus antígenos cognados, se puede producir por técnicas de cultivo celular, que incluyen la generación de anticuerpos monoclonales como se describe en la presente, o mediante transfección de genes de anticuerpo en hospedadores de células bacterianas o mamíferas adecuadas, a fin de permitir la producción de anticuerpos recombinantes . En ciertas modalidades, un inmunógeno que comprende un antígeno de polipéptido (por ejemplo, proteína de BKB2R humana que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 71, o un fragmento de la misma tal como el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 73) se inyecta inicialmente en cualquiera de una amplia variedád de mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, ovejas o cabras). En este paso, el polipéptido puede servir como el inmunógeno sin modificación. De manera alternativa, particularmente para polipéptidos relativamente cortos, una respuesta inmunitaria superior en algunos casos se puede producir si el polipéptido se une a una proteína portadora, tal como albúmina de suero bovino o hemocianina de lapa. El inmunógeno se inyecta en el hospedador animal, de manera preferente de acuerdo a un programa predeterminado que incorpora una o más inmunizaciones de refuerzo, y los animales se sangran de manera periódica. Los anticuerpos policlonales específicos para el polipéptido entonces se pueden purificar de estos antisueros por, por ejemplo, cromatografía de afinidad usando el polipéptido acoplado a un soporte sólido adecuado.

En ciertas modalidades, se pueden preparar anticuerpos monoclonales específicos para un polipéptido antigénico de interés, por ejemplo, usando la técnica de Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976, y mejora a esto. Brevemente, estos métodos comprenden la preparación de líneas de células inmortales capaces de producir anticuerpos que tienen la especificidad deseada (es decir, reactividad con el polipéptido de interés) . Estas líneas celulares se pueden producir, por ejemplo, de muestras de vaso obtenidas de un animal inmunizado como se describe anteriormente. Las células de vaso se entonces se inmortalizan, por ejemplo, fusión con un compañero de fusión de células de mieloma, de manera preferente uno que es singénico con el animal inmunizado. Se pueden emplear una variedad de técnicas de fusión. Por ejemplo, las células de vaso y las células de mieloma se pueden combinar con un detergente no iónico durante unos pocos minutos y luego se colocan en placa a baja densidad en un medio selectivo que soporta el crecimiento de células híbridas, pero no células de mieloma. Una técnica de selección preferida usa selección por HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina) . Después de un tiempo suficiente, usualmente de aproximadamente de 1 a 2 semanas, se observan colonias de híbridos. Se seleccionan colonias individuales y sus sobrenadantes de cultivo se prueban para actividad de unión contra el polipéptido. Se prefieren hibridomas que tienen alta reactividad y especificidad.

Se pueden aislar anticuerpos monoclonales los sobrenadantes de colonias de hibridomas en crecimiento. Además, se pueden emplear varias técnicas para mejorar el rendimiento, tal como inyección de la línea de células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un hospedador o vertebrado adecuado, tal como un ratón. Los anticuerpos monoclonales entonces se pueden recolectar del ' fluido de ascitis o la sangre. Se pueden remover contaminantes de los anticuerpos por técnicas convencionales, tal como cromatografía, filtración en gel, precipitación, y extracción. Los polipéptidos se pueden usar en el proceso de purificación en, por ejemplo, un paso de cromatografía por afinidad.

Métodos de uso y composiciones farmacéuticas En la presente se proporcionan métodos de tratamiento que usan los anticuerpos que se unen a BKB2R. En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención se administra a un paciente que tiene una enfermedad, trastorno o condición que comprende una ruta de señalización biológica, la actividad de la cual se puede alterar (por ejemplo, incrementar o disminuir de una manera estadísticamente significativa) al agonizar el BKB2R, que se propone en el contexto de la presente descripción que incluya enfermedades y trastornos caracterizados por actividad anormal de BKB2R, debido por ejemplo a alteraciones (por ejemplo, incrementos o disminuciones estadísticamente significativas) en la cantidad o actividad de un proteína que está presente, o la presencia de una proteína mutante, o ambos. Una abundancia excesiva puede ser debido a cualquier causa, incluyendo pero no limitado a sobreexpresión a nivel molecular, a aparición prolongada o acumulada en el sitio de acción, o actividad incrementada (por ejemplo, de una manera estadísticamente significativa) de GSK-? con relación a aquella que normalmente es detectable. Esta sobreabundancia excesiva de la actividad de GSK-3P se puede medir con relación a la expresión normal, apariencia, o actividad de GSK-3p, y esta medición puede jugar un papel importante en el desarrollo y/o prueba clínica de los anticuerpos descritos en la presente.

En particular, los presentes anticuerpos descritos en la presente son útiles para el tratamiento de diabetes y específicamente ciertas complicaciones de diabetes, por la unión a BKB2R y eventos subsiguientes de señalización. De esta manera, en ciertas modalidades, los anticuerpos descritos en la presente son útiles para el tratamiento de enfermedades asociadas con diabetes incluyendo diabetes tipo 2, tal como, tolerancia deteriorada a glucosa, resistencia a insulina, u otros trastornos o condiciones relacionadas, incluyendo síntomas asociados, hipercolesterolemia , hipertrigliceridemia , enfermedades cardiovasculares, hipertensión, nefropatía, retinopatía y neuropatía.

En diabetes tipo II, la resistencia a insulina da por resultado la carencia de captación de glucosa por tejidos tal como músculos esqueléticos. La resistencia a insulina da por resultado mayores niveles en sangre de glucosa y el páncreas produce más insulina para compensar los mayores niveles en sangre de glucosa. Estudios de ejercicio han descubierto la conexión entre la resistencia a insulina, la captación de glucosa por músculo esquelético y el BKB2R. Durante el ejercicio, dentro de los músculos esqueléticos hay un incremento localizado de la liberación de cinina. Este incremento da por resultado la expresión incrementada en la superficie de las células del músculo del transportador de glucosa GLUT-4 y captación mejorada de glucosa en las células de ratón (Kishi et al, 1998 Diabetes 47:4, 550-8). Se ha mostrado que la resistencia a insulina de las células musculares se mejora por la adición de cininas que actúan en el BKB2R para diabetes tipo II (Henriksen et al, 1998 Am J Physiol 275 (1 Pt 2): R40-5.

En modelos animales de la resistencia a insulina en diabetes tipo 2, se encontró que la glicógeno-sintasa-cinasa-3 -beta (GSK-3P) sobreactiva es responsable de la resistencia a insulina. La regulación de la expresión de GSK-3|3 da por resultado resistencia reducida a insulina y mejora la utilización de glucosa por el cuerpo (Tanabe et al, 2007 PLos Biol . 6:307-318). Aunque principalmente una enfermedad de base autoinmunitaria, la diabetes tipo I ahora se está reconociendo como que tiene también un componente de resistencia a insulina, (Xu, et al., 2007 Diabetes Care 30:2314-20). La resistencia a la insulina se puede diagnosticar mediante una pinza hiperinsulinémica-euglicémica. Los anticuerpos de BKB2R de ciertas modalidades de la presente invención se pueden administrar a pacientes diabéticos que exhiben resistencia a insulina.

Las complicaciones de la diabetes, tipo 1 y tipo 2, pueden incluir los resultados de hiperglucemia a largo plazo y resistencia a insulina que conduce a daño severo de ríñones (nefropatía) , ojos (retinopatía) , y/o nervios (neuropatía) , y puede incluir adicionalmente , o de manera alternativa, hipercolesterolemia y/o hipertensión que conducen a enfermedad cardiovascular (por ejemplo, infarto de miocardio, cardiomiopatía y ataque) . Se ha mostrado que la activación de BKB2R contribuyen de forma significativa a la protección de los ríñones contra nefropatía diabética (Allard et al. 2008 Am J Physiol Renal Physiology 294 : F1249-56 ; Yuan et al, 2007 Endocrinology 148; 2016-2026) y ciertos polimorfismos de BKB2K incrementan el riesgo de nefropatía diabética (Maltais et al, 2002 Can J Physiol Pharmacol 80:323-7). Parece que la expresión de BKB2R juega un papel importante en la retinopatía diabética y la activación de BKB2R debe mejorar la retinopatía diabética (Kato et al. 2009 Eur J Phara col 606:187-90) y también la neuropatía (Kakoki et al, 2010 Proc Nati Red Sci EUA 107:10190-5). Los anticuerpos anti-BKB2R actualmente proporcionadas de esta manera, se pueden administrar de acuerdo a ciertas modalidades contempladas, a pacientes diabéticos para revertir o prevenir el desarrollo adicional de nefropatía, neuropatía o retinopatía.

La diabetes también está asociada con enfermedad cardiovascular. La calicreína de tejido, mediante la activación del receptor de bradicinina B2 (BKB2R) , juega un papel importante en la cardioprotección . Se mostró que ratones con supresión del receptor de bradiquinina B2 desarrollan miocardiopatía dilatada en asociación con fibrosis perivascular y reparativa (Emanueli et al, Circulation 1999, 100; 2359-2365) . La distribución sistémica de adenovirus que tiene el gen de calicreína de tejido conduce a reducción de presión sanguínea y a la atenuación de hipertrofia cardiaca y fibrosis en ratas hipertensas (Chao et al 1999 Stroke, 30, 1925-1932) . Además, la transferencia del gen de calicreína atenuó la hipertrofia cardiaca y fibrosis en ratas normotensas después de infarto al miocardio y en ratas genéticamente hipertensas sin afectar aparentemente la presión sanguínea. Adicionalmente, la activación de BKB2R mejoró la función cardíaca y redujo el tamaño de infarto después del infarto al miocardio y la incidencia de fibrilación ventricular; el icatibant anuló estos efectos benéficos (Yin et al, 2005 J. Biol. Chem. 280, 8022-8030) . El uso de un agonista del péptido de BKB2R después del infarto. al miocardio también se ha señalada que confiere un efecto benéfico en la función cardiaca (Marketou y col, 2010 Am J Hypertens 23:562-568) . Kinina protege contra apoptosis de cardiomiocitos inducida por isquemia/reperfusión, in vivo y en células cultivadas mediante estimulación de las rutas de señalización de receptor de cinina B2 -Akt-GSK-3b y Akt-Bad-14-3-3. Además, el óxido nítrico (NO) juega un papel importante en la protección mediada por BKB2R contra inflamación inducida por isquemia/reperfusión miocárdica y remodelado ventricular mediante supresión de estrés oxidativo, rutas de señalización de TGF-bl/Smad2 y JNK/p38MAPK y activación de NF-kB. Estos hallazgos indican que la calicreína protege contra lesión cardíaca y mejora la función cardíaca con o sin afectar a la presión sanguínea. Tomados conjuntamente, los resultados de estudios in vivo e in vitro indican que la calicreína de tejido, a través de la activación de BKB2R, protege contra la lesión cardíaca al inhibir la apoptosis, inflamación, hipertrofia y fibrosis a través del incremento de la formación de NO y al suprimir las cascadas de señalización mediadas por estrés oxidativo. Los anticuerpos anti-BKB2R descritos en la presente se pueden administrar por lo tanto, acuerdo a ciertas modalidades contempladas de manera expresa, a pacientes diabéticos para invertir o prevenir el desarrollo adicional de enfermedad cardiovascular .

Otra modalidad proporciona un método para inhibir la señalización de la ruta la T??-3ß en una célula que expresa BKB2R al poner en contacto la célula con una cantidad de un anticuerpo específico de BKB2R descrito en la presente suficiente para disminuir los niveles de colesterol . Por medio de un breve antecedente, la hipercolesterolemia se presenta cuando es muy alta la presencia de colesterol en la sangre. La hipercolesterolemia a largo plazo da por resultado enfermedad cardiovascular con endurecimiento de las arterias (aterosclerosis) y un mayor riesgo de infarto al miocardio y ataque. Las concentraciones totales de colesterol en la circulación de menos de 200 mg/dL son deseables, sin embargo, entre 200-239 mg/dL se consideran típicamente como un alto nivel límite y por arriba de 240· mg/dL se considera alto. A fin de reducir los riesgos de enfermedad cardiovascular, el colesterol total se puede disminuir de forma deseable a menos de 200 mg/dL, en el cual el colesterol LDL debe estar idealmente por abajo de 100 mg/dL, o por abajo de 70 mg/dL para aquellos en muy alto riesgo, y colesterol HDL por abajo de 40 mg/dL. Aunque la dieta y el ejercicio pueden contribuir a disminuir los niveles de colesterol total, este régimen solo no siempre es exitoso y de esta manera se puede indicar terapia adicional con fármaco. Los sujetos que tienen diabetes se consideran que están en alto riesgo, y de esta manera se les aconseja típicamente controlar de forma cuidadosa los niveles de colesterol . La calicreína mediante la activación de BKB2R también protege contra miocardiopatía al mejorar la función cardíaca, perfiles de glucosa y lípidos en suero, incluyendo colesterol, en ratas diabéticas inducidas con estreptozotocina (Montanari et al, 2005 Diabetes 54; 1573-1580) . En un modelo de animal con diabetes de tipo 2 con dieta alta en grasa, la introducción de la expresión del gen de calicreína de tejido mediante un retrovirus recombinante conduce a reducción significativa en los niveles de colesterol total en comparación a los animales no tratados (Yuan, G, et al, 2007 Endocrinology 148; 2016- 2026) . Por consiguiente, la intervención terapéutica como se describe en la presente, mediante la administración del presente anticuerpo anti-BKB2R agonístico, se contempla de acuerdo a ciertas modalidades, para disminuir de manera benéfica los niveles de colesterol en circulación.

Con respecto al tratamiento de hipertensión con el anticuerpo descrito en la presente de acuerdo a ciertas modalidades diferentes, se conoce que las cininas (Lys-bradicinina y bradicininas ) se unen al receptor de superficie celular constitutivamente expresado BKB2R (receptor de bradiquinina tipo 2) , que conduce a relajación del músculo liso en los vasos sanguíneos lo que da por resultado una caída en la presión sanguínea. La enzima convertidora de angiotensina (ACE, por sus siglas en inglés) contrarresta las propiedades hipotensivas de estas cininas al metabolizarlas adicionalmente de modo que no se pueden unir por más tiempo al BKB2R. La importancia del BKB2R en la regulación de la presión sanguínea se resaltada adicionalmente por un incremento en la presión sanguínea cuando se suprime la expresión del receptor (Madeddu et al, 1996 Hypertension 28:980-987) . En otro estudio, la sobreexpresión de la calicreína de tejido que actúa a través del BKB2R en un modelo de animal con hipertensión conduce a reducciones sostenidas en la presión sanguínea ( ang et al 1995 J" Clin Invest 95:1710-1760). Los anticuerpos BKB2R descritos en la presente de esta manera se pueden administrar, en estas modalidades y modalidades relacionadas, a pacientes para tratar hipertensión.

En particular, los presentes anticuerpos son útiles para el tratamiento de una variedad de cánceres asociados con la expresión y/o actividad de BKB2R y/o GSK-3p. Por ejemplo, una modalidad de la invención proporciona un método para el tratamiento de un cáncer, que incluye, pero no se limita a, leucemia de linaje mezclado, cáncer esofágico, cáncer ovárico, cáncer de próstata, cáncer de riñon, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer de estómago, y cáncer pancreático, al administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo específico BKB2R descrito en la presente. Una cantidad que, después de la administración, inhibe, previene o retrasa el progreso y/o metástasis de un cáncer de una manera estadísticamente significativa (es decir, con relación a un control apropiado, como se conocerá por aquellos expertos en la técnica se considera efectiva.

Otra modalidad proporciona un método para inhibir la señalización de la ruta de GSK-3 en una célula que expresa BKB2R al poner en contacto la célula con la cantidad de un anticuerpo específico de BKB2R descrito en la presente suficiente para inhibir la señalización y para inhibir el crecimiento de células de cáncer. Se ha determinado que ciertos cánceres son sensibles a la inhibición de glucógeno-sintasa-cinasa-3 -beta (GSK-3p) . Específicamente, se ha mostrado que el carcinoma pancreática, carcinoma hepatocelular , cáncer gástrico y cáncer colorrectal, tienen expresión incrementada de GSK-3P en comparación a tejidos no neoplásticos. La inhibición de GSK-313 da por resultado supervivencia atenuada y proliferación de las células de cáncer, y apoptosis incrementada en el cultivo celular y en xenoinjertos en ratón (Mai et al, Clin Cáncer Res 2009; 15(22) 6810-6819). Los anticuerpos anti -BKB2R descritos en la presente también fueron efectivos en inhibir el crecimiento de líneas celulares derivadas de carcinoma hepatocelular, cáncer gástrico y cáncer colorrectal. En cáncer esofágico, la inhibición de GSK-3p de manera similar da por resultado detención del ciclo celular de la línea celular en cultivo (Wang et al, Iorl J Gastroenterol, 2008, 14 (25) : 3982-3989) .

En cáncer de próstata, la inhibición de GSK-3P reprimió la expresión del receptor de andrógeno inhibió el crecimiento de las líneas de células de cáncer de próstata (Mazor et al, Oncogene 2004; 23; 7882-7892). En cáncer de ovario, la actividad de GSK-313 comprendió la proliferación de células de cáncer ovárico humano, tanto en cultivo como en un modelo de animal. La inhibición de GSK-3p previno la formación en ratones desnudos de tumores generados de la línea de células de cáncer ovárico humano (Cao et al, 2006 Cell Research; 16; 671-677) . En MLL (leucemia de linaje mezclado o mieloide/linfoide) se ha demostrado que T3?-3ß es un requisito oncogénico para el mantenimiento de leucemia humana con mutaciones en el proto-oncogen de MLL. La inhibición de GSK-3P dio por resultado detención del ciclo celular de varias líneas de células de MLL en cultivo. En un modelo murino preclínico de leucemia de .MLL humana, la inhibición de GSK-3P dio por resultado prolongación significativa de supervivencia de los ratones ( ang et al, 2008 Nature; 455; 1205-1210). Los anticuerpos anti-BKB2R descritos en la presente fueron efectivos en inhibir el crecimiento de líneas celulares derivadas de cáncer de próstata y leucemia MML.

Otra modalidad proporciona un método para inhibir la señalización de la ruta de GSK-3 en una célula que expresa BKB2R al poner en contacto una célula con una cantidad de un anticuerpo específico an Í-B B2R descrito en la presente suficiente para contrarrestar la exposición a radiación. La exposición a radiación de una variedad de fuentes (accidente nuclear, detonación de arma nuclear, terapia de radiación de cáncer) puede conducir a déficits físicos y neurológicos muy severos y amenazadores de la vida. La inhibición de GSK-3p puede ser de una manera para contrarrestar la exposición a radiación a nivel celular y se ha señalado que ayuda a superar los déficit neurológicos de la radioterapia de radicación de cáncer (Yazlovtskaya et al, 2006 Cáncer Res. 66:11179-86).

Otra modalidad proporciona un método para inhibir señalización de la ruta de GSK-3P en una célula que expresa BKB2R al poer en contacto la célula con una cantidad de un anticuerpo específico de BKB2R descrito en la presente suficiente para contrarrestar la exposición a infección por virus de influenza. La infección por virus de influenza del tracto respiratorio es una causa principal de enfermedad y muerte a nivel mundial cada año. Actualmente, los productos terapéuticos anti-virales , tal como Oseltamivir, cuando se usan contra influenza, están llegando a ser inefectivos debido a la rápida velocidad de mutación del virus. El virus de influenza depende de la maquinaria de la célula hospedadora para la entrada y replicación viral. Una de las proteínas identificadas de la célula hospedadora, requeridas por la influenza es GSK-3P (Konig, R, et al, (2010) Nature 463:813-817), y la supresión de la expresión de GSK-3P con AR si, conduce a una gran reducción en la replicación viral. Ciertas modalidades descritas en la presente, al inhibir GSK-3ß a través de la actividad de señalización del agonista de los anticuerpos anti -BKB2R actualmente proporcionados, contemplan por lo tanto un planteamiento terapéutico al tratamiento de infecciones de virus de influenza que, de acuerdo a una teoría no limitante, no van a dar por resultado probablemente resistencia viral.

Otra modalidad proporciona un método para inhibir la señalización de la ruta de GSK-3 en una célula que expresa BKB2R al poner en contacto la célula con una cantidad de un anticuerpo específico de BKB2R descrito en la presente suficiente para inhibir la señalización mediante la ruta de T3?-3 para el tratamiento de pacientes con ataque. Un ataque isquémico se presenta cuando se bloquea un vaso sanguíneo al cerebro por un coágulo sanguíneo, que da por resultado detención del flujo sanguíneo al cerebro. La pérdida de flujo sanguíneo al cerebro da resultado daño a que el tejido del cerebro en un área particular que conduce a lesión debilitante. El BKB2R se conoce por su papel protector en ataque isquémico. Se encuentran que el volumen de infarto y las puntuaciones de déficit neurológico con más pronunciados en ratones deficientes de BKB2R en comparación a ratones normales usando el modelo de ataque isquémico de MCAO (Chao et al, 2006 Front Biosci 11:1323-7). También se encontró que las proporciones de supervivencia son menores en los ratones deficientes en BKB2R. Por lo tanto, ciertas modalidades actualmente descritas se refieren a métodos para tratar ataque al administrar los anticuerpos anti-BKB2R descritos en la presente.

La administración de los anticuerpos específicos de BKB2R descritos en la presente, en forma pura o en una composición farmacéutica apropiada, se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los modos aceptados de administración de agentes para servir para utilidades similares. Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar al combinar un anticuerpo o composición que contiene el anticuerpo con un portador, diluyente o excipiente fisiológicamente aceptable, apropiado y se pueden formular en preparaciones en forma sólida, semi-sólida, líquida o gaseosa, tal como tabletas, cápsulas, polvos, gránulos, ungüentos, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes, geles, microesferas , y aerosoles. Además, otros ingredientes farmacéuticamente activos y/o excipientes adecuados tal como sales, amortiguadores y estabilizantes pueden estar presentes, pero no necesita, dentro de la composición. Se puede administrar la administración por una variedad de diferentes rutas, incluyendo oral, parenteral, nasal, intravenosa, intradérmica, subcutánea o tópica. Los modos preferidos de administración dependen de la naturaleza de la condición que se va a tratar o prevenir. Una cantidad que, después de la administración, reduce, inhibe, previene o retrasa el progreso y/o metástasis de un cáncer se considera efectiva.

En ciertas modalidades, la cantidad administrada es suficiente para dar por resultado presión sanguínea reducida, y/o concentraciones disminuidas de glucosa en sangre, y/o concentraciones disminuidas de colesterol en suero, y/o carga viral reducida, y/o regresión tumoral, y/o riesgo reducido de enfermedad cardiovascular, retinopatía, neuropatía o nefropatía, y/o morbilidad o mortalidad reducida después de ataque o exposición a radiación, como se indica por una disminución estadísticamente significativa en uno o más de los parámetros particulares para los cuales se indica la intervención terapéutica. La dosis y duración precisa de tratamiento es una función de la enfermedad que se trata y se puede determinar de forma empírica usando protocolos conocidos de prueba o al probar la composición en sistemas modelo conocido en la técnica y al extrapolar de esto. También se pueden realizar ensayos clínicos controlados. Las dosis también pueden variar con la severidad de la condición que se va a aliviar. Una composición farmacéutica se formula y se administra en general para ejercer un efecto terapéuticamente útil, en tanto que reduce al mínimo los efectos secundarios indeseables. La composición se puede administrar de una sola vez, o se puede dividir en varias dosis más pequeñas que se van a administrar a intervalos de tiempo. Para cualquier sujeto particular, los regímenes específicos de dosis se pueden ajustar con el paso del tiempo de acuerdo a la necesidad individual.

Las rutas típicas para administrar estas composiciones farmacéuticas que incluyen de esta manera, sin limitación, oral, tópica, transdérmic , inhalación, parenteral, sublingual, bucal, rectal, vaginal, e intranasal . El término parenteral, como se usa en la presente, incluye inyecciones subcutáneas, técnicas de infusión de inyección intravenosa, intramuscular e intraesternal . Las composiciones farmacéuticas de acuerdo a ciertas modalidades de la presente invención se formulan para permitir que los ingredientes activos contenidos en las mismas estén biodisponible en la administración de la composición a un paciente. Las composiciones que se administrarán a un sujeto o paciente pueden tomar la forma de una o más unidades de dosis, donde por ejemplo, una tableta puede ser una unidad de dosis individual, y un recipiente de un anticuerpo específico de BKB2R descrito en la presente en forma de aerosol puede mantener una pluralidad de unidades de dosis. Se conocen métodos reales para preparar estas formas de dosis, o serán evidentes, para aquellos expertos en esta técnica, por ejemplo, ver Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20- Edición (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000) . La composición que se va a administrar, contendrá en cualquier caso, una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la presente descripción, para el tratamiento de una enfermedad o condición de interés de acuerdo con enseñanzas en la presente.

Una composición farmacéutica puede estar en la forma de un sólido o líquido. En una modalidad, los portadores están en la forma partículas, de modo que las composiciones están por ejemplo en forma de tableta o polvo. Los portadores pueden ser líquidos, con las composiciones que son, por ejemplo, un aceite oral, líquido inyectable o un aerosol, que es útil por ejemplo, en administración por inhalación. Cuando se propone para administración oral, la composición farmacéutica está preferentemente en ya sea forma sólida o líquida, donde se incluyen las formas semi-sólida, semi-líquida, en suspensión y en gel dentro de las formas consideradas en la presente, como ya sea sólida o líquida.

Como una composición sólida para administración oral, la composición farmacéutica se puede formular en un polvo, gránulo, tableta comprimida, pildora, cápsula, goma de mascar, oblea o similar. Esta composición sólida contendrá típicamente uno o más diluyentes inertes o portadores comestibles. Además, uno o más de los siguientes pueden estar presentes: aglutinantes tal como carboximetilcelulosa, etilcelulosa, celulosa micro-cristalina, goma de tragacanto o gelatina; excipientes tal como almidón, lactosa o dextrinas, agentes desintegrantes tal como ácido algínico, alginato de sodio, Primogel, almidón de maíz y similares; lubricantes tal como estearato de magnesio o Sterotex; deslizantes tal como dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes tal como sacarosa o sacarina; un agente saborizante tal como hierbabuena, salicilato de metilo o sabor naranja; y un agente colorante. Cuando la composición farmacéutica está en la forma de una cápsula, por ejemplo, una cápsula de gelatina, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un portador líquido tal como polietilenglicol o aceite.

La composición farmacéutica puede estar en la forma de un líquido, por ejemplo, un elixir, jarabe, solución, emulsión o suspensión. El líquido puede ser para administración oral o para distribución por inyección, como dos ejemplos. Cuando se propone para la administración oral, la composición preferida contiene, además de los presentes compuestos, uno o más de un agente edulcorante, conservadores, tinte/colorante y mej orador de sabor. En una composición propuesto para que se administre por inyección, se pueden incluir uno o más de un agente tensioactivo, conservador, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, amortiguador, estabilizador y agente isotónico.

Las composiciones farmacéuticas líquidas, ya sea que sean soluciones, suspensiones u otra forma similar, pueden incluir uno o más de los siguientes adyuvantes: diluyentes estériles tal como agua para inyección, solución salina, preferentemente solución salina fisiológica, solución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites no volátiles tal como mono- o di-glicéridos sintéticos que pueden servir como el disolvente o medio de suspensión, polietilenglicoles , glicerina, propilenglicol u otros solventes; agentes antibacterianos tal como alcohol bencílico o metil-parabeno; antioxidantes tal como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tal como ácido etilendiaminotetraacético ; amortiguadores tal como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de tonicidad tal como cloruro de sodio o dextrosa. La preparación parenteral se puede encerrar en ampollas, jeringas desechables o múltiples frascos de dosis elaborados de vidrio o plástico. La solución salina fisiológica es un adyuvante preferido. Una composición farmacéutica inyectable es preferentemente estéril.

Una composición farmacéutica líquida propuesta ya sea para administración parenteral u oral debe contener una cantidad de un anticuerpo específico de BKB2R como se describe en la presente tal que se obtendrá una dosis adecuada. Típicamente, esta cantidad es al menos 0.01% del anticuerpo en la composición. Cuando se propone para administración oral, esta cantidad se puede variar para estar entre 0.1 y aproximadamente 70% del peso de la composición. Ciertas composiciones farmacéuticas orales contienen entre aproximadamente 4% y aproximadamente 75% del anticuerpo. En ciertas modalidades, se preparan composiciones farmacéuticas y preparaciones de acuerdo a la presente invención de modo que una unidad de dosis parenteral contiene entre 0.01 a 10% en peso del anticuerpo antes de la dilución.

La composición farmacéutica se puede proponer para administración tópica, caso en el cual el portador puede comprender de manera adecuada una solución, emulsión, ungüento o base de gel. Por ejemplo, la base puede comprender uno o más de lo siguiente: petrolato, lanolina, polietilenglicoles , cera de abeja, aceite mineral, diluyentes tal como agua y alcohol, y emulsionadores y estabilizadores. Los agentes espesantes pueden estar presentes en una composición farmacéutica para la administración tópica. Si se propone para administración transdérmica, la composición puede incluir un parche transdérmico o dispositivo de iontoforesis . La composición farmacéutica se puede proponer para administración rectal, en la forma de, por ejemplo, un supositorio, que se fundirá en el recto y liberará el fármaco. La composición para administración rectal puede contener una base oleaginosa al como un excipiente no irritante adecuado. Estas bases incluyen, sin limitación, lanolina, manteca de cacao y polietilenglicol .

La composición farmacéutica puede incluir varios materiales, que modifican la forma física de una unidad de dosis sólida o líquida. Por ejemplo, la composición puede incluir materiales que forman una cubierta de revestimiento alrededor de los ingredientes activos. Los materiales que forman la cubierta de revestimiento son típicamente inertes, y se pueden seleccionar de, por ejemplo, azúcar, goma; laca y otros agentes de revestimiento entérico. De manera alternativa, los ingredientes activos se pueden encajonar en una cápsula de gelatina. La composición farmacéutica en forma sólida , o líquida puede incluir un agente que se une al anticuerpo de la invención y ayuda de este modo en la distribución del compuesto. Los agentes adecuados que pueden actuar en esta capacidad incluyen otros anticuerpos monoclonales o policlonales , una o más proteínas o un liposoma. La composición farmacéutica puede consistir esencialmente de unidades de dosis que se pueden administrar como un aerosol . El término aerosol se usa para denotar una variedad de sistemas que varían desde aquellos de naturaleza coloidal a sistemas que consisten de envases presurizados. La distribución puede ser por un gas licuado o comprimido o por un sistema de bomba adecuada que dispensa los ingredientes activos. Se pueden distribuir aerosoles en sistemas de una sola fase, bi-fásicos, o tri-fásicos a fin de distribuir los ingredientes activos. La administración del aerosol incluye el recipiente necesario, activadores, válvulas, recipientes secundarios, y similares, que conjuntamente pueden formar un equipo. Un experto en la técnica, sin experimentación indebida puede determinar los aerosoles preferidos .

Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar por metodología bien conocida en la técnica farmacéutica. Por ejemplo, una composición farmacéutica propuesta para que se administre por inyección se puede preparar al combinar una composición que comprende un anticuerpo específico de BKB2R descrito en la presente y, opcionalmente , uno o más de sales, amortiguadores y/o estabilizadores, con agua estéril destilada para formar una solución. Se puede adicionar un agente tensioactivo para facilitar la formación de una solución o suspensión homogénea. Los agentes tensioactivos son compuestos que interactúan de manera no covalente con la composición de anticuerpo para facilitar la disolución o suspensión homogénea del anticuerpo en el sistema de distribución acuosa.

Las composiciones se pueden administrar en una cantidad terapéuticamente efectiva, que variará dependiendo de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico (por ejemplo, anticuerpo específico de BKB2R) empleado; la estabilidad metabólica y la duración de acción del compuesto, la edad, peso corporal, salud general, género, y dieta del paciente; el modo y tiempo de administración; la velocidad de excreción; la combinación con fármacos; la severidad del trastorno o condición particular, y el sujeto que se somete a terapia. En general, una dosis diaria terapéuticamente efectiva es (para un mamífero de 70 kg) de aproximadamente 0.001 mg/kg (es decir, 0.07 mg) a aproximadamente 100 mg/kg (es decir, 7.0 g) ; de manera preferente una dosis terapéuticamente efectiva es (para un 70 mamífero de kg) de aproximadamente 0.01 mg/kg (es decir, 0.7 mg) a aproximadamente 50 mg/kg (es decir, 3.5 g) ; de manera más preferente una dosis terapéuticamente efectiva es (para un mamífero de 70 kg) de aproximadamente 1 mg/kg (es decir, 70 mg) a aproximadamente 25 mg/kg (es decir, 1.75 g) .

Las composiciones que comprenden anticuerpos específicos de BKB2R descritos en la presente se pueden administrar a un individuo afligido con una enfermedad t como se describe en la presente, tal como un cáncer. Para el uso in vivo para el tratamiento de enfermedad humana, los anticuerpos descritos en la presente se incorporan en general en una composición farmacéutica antes de la administración. Una composición farmacéutica que comprende uno o más de los anticuerpos descritos en la presente en combinación con un portador o excipiente fisiológicamente aceptable como se describe en otra parte de la presente. Para preparar una composición farmacéutica, se mezcla una cantidad efectiva de uno o más de los compuestos con cualquier portador o excipiente farmacéutico conocido por el experto en la técnica como que es adecuado para el modo particular de administración. Un portador farmacéutico puede ser líquido, semi-líquido o sólido. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica, subcutánea o tópica pueden incluir, por ejemplo, un diluyente estéril (tal como agua), solución salina, aceite no volátil, polietilenglicol , glicerina, propilenglicol u otros solventes sintéticos; agentes antimicrobianos (tal como alcohol bencílico y metil-parabenos) ; antioxidantes (tal como ácido ascórbico y bisulfito de sodio) y agentes quelantes (tal como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) ) ; amortiguadores (tal como acetatos, citratos y fosfatos) . Si se administra de manera intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica o solución salina amortiguada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) , y soluciones que contienen agentes espesantes y solubilizantes , tal como glucosa, polietilenglicol , polipropilenglicol y mezclas de estos.

Las composiciones que comprenden anticuerpos específicos de BKB2R como se describe en la presente se pueden preparar con portadores que protegen el anticuerpo de la rápida eliminación del cuerpo, tal como formulaciones o revestimiento de liberación en tiempo. Estos portadores incluyen formulaciones de liberación controlada, tal como, pero no limitado a, implantes y sistemas microencapsulados de distribución, y polímeros biocompatibles , biodegradables , tal como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos , ácido poliglicólico, poliortoésteres , ácido poliláctico y otros conocidos por aquellos expertos en la técnica.

A todo lo largo de esta especificación, a menos que el contexto requiera otro modo, la palabra "comprende", o variaciones tal como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un elemento señalado o entero o grupo de elementos o enteros pero no la exclusión de ningún otro elemento o entero o grupo de elementos o enteros.

Como se usa en la presente las formas singulares "un", "una" y "el" "la" incluyen aspectos plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una célula individual, así como dos o más células; la referencia a "un agente" incluye un agente, así como dos o más agentes; y así sucesivamente.

Cada modalidad descrita en esta especificación se va a aplicar mutatis mutandis a cada otra modalidad a menos que se señale expresamente lo contrario.

Se pueden usar técnicas estándar para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótido, u transformación de cultivo de tejido (por ejemplo, electroporación, lipofección) . Se pueden realizar reacciones enzimáticas y técnicas de purificación de acuerdo a las especi icaciones del fabricante o como se logre comúnmente en la técnica o como se describe en la presente. Estas técnicas y procedimientos y técnicas y procedimientos relacionados se pueden realizar en general de acuerdo a métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas en microbiología, biología molecular, bioquímica, genética molecular, biología celular, virología y técnicas de inmunología que se citan y analizan a todo lo largo de la presente especificación. Ver, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. ; Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley y Sons, updated July 2008) ,- Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Métodos from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub . Associates and Wiley- lnterscience ; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol . I & II ( IRL Press, Oxford Univ. Press EUA, 1985); Current Protocols in Immunology (Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY) ; Real-Time PCR: Current Technology and Applications, Edited by Julie Logan, Kirstin Edwards y Nick Saunders, 2009, Caister Academic Press, Norfolk, UK; Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992) ; Guthrie y Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press, New York, 1991); Oligonucleótido Synthesis (N. Gait, Ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, Eds . , 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, Ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) ; Next-Generation Genome Sequencing (Janitz, 2008 Wiley-VCH) ; PCR Protocole (Métodos in Molecular Biology) (Park, Ed. , 3 Edition, 2010 Humana Press) ; Immobilized Células And Enzymes (IRL Press, 1986); the treatise, Métodos In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Células (J. H. Miller y M . P. Calos eds . , 1987, Cold Spring Harbor Laboratory) ; Harlow y Lañe, Antíbodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998); Immunochemical Métodos In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes 1-IV (D. . Weir andCC Blackwell, eds., 1986); Riott, Essential Immunology, 6th Edition, (Blackwell Scientific Publications , Oxford, 1988) ; Embryonic Stem Células: Métodos and Protocols (Métodos in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed. , 2002); Embryonic Stem Cell Protocols: Volume I: Isolation and Characterization (Métodos in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed. , 2006); Embryonic Stem Cell Protocols: Volume II: Differentiation Models (Métodos in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed. , 2006) ; Human Embryonic Stem Cell Protocols (Métodos in Molecular Biology) (Kursad Turksen Ed. , 2006) ; Mesenchymal Stem Células: Métodos and Protocols (Métodos in Molecular Biology) (Darwin J. Prockop, Donald G. Phinney, y Bruce A. Bunnell Eds., 2008); Hematopoietic Stem Cell Protocols (Métodos in Molecular Medicine) (Christopher A. Klug, y Craig T. Jordán Eds., 2001 ) ; Hematopoietic Stem Cell Protocols (Métodos in Molecular Biology) (Kevin D. Bunting Ed. , 2008) Neural Stem Células: Métodos and Protocols (Métodos in Molecular Biology) (Leslie P. einer Ed. , 2008).

A menos que se proporciones definiciones específicas, la nomenclatura usada en unión con, y los procedimientos de laboratorio y técnicas de, biología molecular, química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica, descrita en la presente, son aquellas bien conocidas y usadas en la técnica. Se pueden usar técnicas estándar para tecnología recombinante , síntesis biológica, microbiológica, química, molecular, análisis clínico, preparación farmacéutica, formulación y distribución, y tratamiento de pacientes.

A menos que el contexto requiera lo contrario, a todo lo largo de la presente especificación y de las reivindicaciones, la palabra "comprende" y variaciones de la misma, tal como, "comprenden" y "que comprende" se van a considerar en un sentido incluyente abierto, es decir, como "que incluye, pero no se limita a". Por "consiste de" se quiere decir que incluye, y típicamente limitado a, cualquiera que siga la frase "que consiste de" . Por "que consiste esencialmente de" se quiere decir que incluye cualesquiera de los elementos listados después de la frase, ilimitado a otros elementos que no interfieran con o contribuyan a la actividad o acción especificada a la descripción para los elementos listados. De esta manera, la frase "que consiste esencialmente de" indica que los elementos listados se requieren o son obligatorios, pero que no se requieren otros elementos y pueden o no estar presentes dependiendo de sí o no afecten la actividad o acción de los elementos listados.

En esta especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una" y "el", "la" incluyen las referencias plurales a menos que el contenido dicte claramente lo contario. Como se usa en la presente, en modalidades particulares, los términos "cerca de" o "aproximadamente" cuando preceden un valor numérico indican el valor más o menos un intervalo de 5%, 6%, 7%, 8% o 9%. En otras modalidades, los términos "cerca de" o "aproximadamente" cuando preceden un valor numérico indican el valor más o menos un intervalo de 10%, 11%, 12%, 13% o 14%. En aún otras modalidades, los términos "cerca de" o "aproximadamente" cuando preceden un valor numérico indican el valor más o menos un intervalo de 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o 20%.

La referencia a todo lo largo de esta especificación a "una modalidad" o "una modalidad" o "un aspecto" significa que una característica, estructura o rasgo particular descrito en unión con la modalidad se incluye en al menos una modalidad de la presente invención. De esta manera, las apariciones de las frases "en un una modalidad" o "en una modalidad" en varios lugares a todo lo largo de esta especificación no necesariamente se refieren todos a la misma modalidad. Adicionalmente , los rasgos, estructuras o características particulares se pueden combinar de cualquier manera adecuada en una o más modalidades.

Ej emplos Ejemplo 1 Examen y Selección de Anticuerpos Monoclonales del Receptor de BKB2 Este ejemplo describe el examen de sobrenadantes de hibridoma que contienen anticuerpos generados por inmunización contra un polipéptido de BKB2R, para la capacidad para activar p-GSK3p. La activación se puede valorar por determinación por inmunoensayo de GSK3P en lisados preparados de fibroblastos humanos WI-38 después de 60 minutos de tratamiento con sobrenadantes de hibridoma anti -BKB2R y en lisados preparados de células de fibroblastos de ratón 3T3 después de 10 minutos de tratamiento con sobrenadantes de hibridoma anti-BKB2R.

Los ratones se inmunizan con polipéptidos de BKB2R (SEQ ID NOS: 73 y 74) y los hibridomas se aislaron, usando protocolos estándar. Se cultivaron cincuenta hibridomas de esplenocitos fusionados de animales inmunizados con la secuencia de ratón (SEQ ID NO: 74) y 50 también se cultivaron de esplenocitos fusionados de animales inmunizados con la secuencia humana (SEQ ID NO:73). Los anticuerpos de cada hibridoma se adicionaron a concavidades de una placa de ELISA que se ha pre-revestido con el polipéptido BKB2R para medir la unión al péptido.

Se examinaron cincuenta sobrenadantes de hibridoma para la presencia de anticuerpos anti-BKB2R que fueron capaces de estimular la fosforilación de GSK-3B (Glycogen Sintasa-Cinasa-3 -beta) tanto en células 3T3 de fibroblastos murinos y células WI-38 de fibroblastos humanos. La fosforilación de GSK-3B es una indicación de la desactivación de GSK-3B , a través de la activación del receptor de BKB2 por los anticuerpos.

Estimulación de células 3T3. Se cultivaron células 3T3 murinas en DMEM complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (P/S) . cuarenta y ocho horas antes de la estimulación, las células se colocaron en placa a 5 x 104 células/cm2 en placas de 12 concavidades en un mL de medio de cultivo con FBS (aproximadamente 1.8 x 105 células/ml/concavidad) . Doce a veinticuatro horas antes de la estimulación, el medio de cultivo se reemplazó con un mL de DMEM libre de suero.

Reactivos. El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, Sigma P8147-1VL, 250 ng) se reconstituyó en HC1 4 mM que contiene 0.1% de BSA para obtener una solución que contiene PDGF a 5 mL, que se diluyó adicionalmente en HCL 4 mM/0.1% de BSA para obtener una solución concentrada que contiene PDGF a 1000 ng/mL. Esta solución concentrada se diluyó adicionalmente 1:10 (v/v) en medio libre de suero para obtener una solución a 100 ng/mL ("2X"), que entonces se diluyó 1:1 con muestras para lograr una concentración final de tratamiento de muestra de 50 ng/mL.

El amortiguador de lisis ("RIPA CLB" ) contuvo 5 µ?/mL de cóctel de inhibidor de proteasa ("PIC", Sigma, St . Louis, MO; número de catálogo P8340) , NaV04 2 mM, Na4P2O720 mM y fenilmetilsulfonilfluoruro 1 mM (PMSF) .

Muestras.- El medio de cultivo se removió de cultivos de células 3T3 y se reemplazó con 0.5 mL por concavidad de DMEM fresco que no contiene suero adicionado; se tomó cuidado de no perturbar la adherencia celular a las concavidades de cultivo. Las concavidades de control positivo recibieron 50 ng/mL de PDGF en DMEM/FBS; las concavidades de control negativo recibieron DMEM/FBS solo. Las concavidades de prueba recibieron 0.5 mL de sobrenadante de hibridoma. Después de una incubación de diez minutos a 37°C, el medio se removió por aspiración y las células adherentes se enjuagaron suavemente con PBS y las placas se mantuvieron en hielo.

Lisis.- 0.5 mi de amortiguador de lisis se adicionó a cada concavidad y las células se lisaron en hielo durante 30 minutos. Se usó un elevador celular para transferir los contenidos de cada concavidad a un tubo de microcentrífuga . Los sobrenadantes se microcentrifugaron durante 15 minutos para remover el material insoluble . Los sobrenadantes entonces se recolectaron en tubos frescos y se almacenaron a -80°C.

ELISA.- Un inmunoensayo para cuantificar GSK-3 e los Usados celulares se realizó usando el equipo Assay DesignMR Kit (Assay Designs, Inc., Ann Arbor, Mi, No. Cat 900-123) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las muestras y controles se diluyeron 1:50. Los resultados se muestran en la Figura 1. Se seleccionaron dos clones de hibridoma (muestra número 8 y 17) para expansión, en base a sus altos niveles de actividad.

Estimulación de células WI-38 (humana) . Se cultivaron células WI-38 humanas en MEM que contiene 10% de FBS, 1% de P/S y L-glutamina 2mM. 48 horas antes de la estimulación, las células se colocaron en placa a 5 x 104 células/cm2 en placas con 12 concavidades (-1.8 x 105 células/mL/concavidad) en 1 mL de medio de cultivo con FBS. 12-24 horas antes de la estimulación, el medio se reemplazó con 1 mL de MEM libre de suero.

Reactivos . - Se preparó PDGF como se describe anteriormente. Se disolvió Calicreina (KLK, Sigma Cat. No. K3627) en MEM que contiene 10% de FBS y se diluyó a 200 g/mL (2X) ; se adicionaron 500 pL de la solución de KLK a concavidades de cultivo seleccionadas para lograr una concentración final de 100 µg/mL . Se disolvió LiCl (Sigma L-8895) en PBS y se diluyó a 40 mM en MEM/10% de FBS ; se adicionaron 500 µ? de la solución de LiCl a las concavidades de cultivo seleccionadas para lograr una concentración final de 20 mM. El amortiguador de lisis (RIPA CLB, de Assay Designs, Inc., MBL#061708C) fue como se describe anteriormente .

Muestras. Se removió el medio de cultivo de cultivos de células WI-38 y se reemplazó con 0.5 mL por concavidad de DMEM fresco que no se le adicionó suero; se tomó cuidado de no perturbar la adherencia celular a las concavidades de cultivo. Las concavidades de control recibieron uno de los siguientes tratamientos: (A) 50 ng/mL de PDGF en DMEM/FBS; (B) LiCl (20 mM) , (C) KLK (500 µg/mL) , (D) KLK (100 µg/mL) , (E) control negativo, DMEM/FBS solo, (F) control negativo, DMEM libre de suero. Las concavidades de prueba recibieron 0.5 mL de sobrenadantes de hibridoma. Después de una incubación de sesenta minutos a 37°C, el medio se removió por aspiración y las células adherentes se enjuagaron suavemente con PBS y las placas se mantuvieron en hielo .

La lisis y el inmunoensayo tipo ELISA para cuantificar GSK-3 fueron como se describe anteriormente. Los resultaos se muestran en la Figura 2. Múltiples sobrenadantes de hibridoma indujeron GSK-3P de forma significativa con respecto a los niveles de fondo. De manera específica, las muestra número 55, 65 y 66 del sobrenadante de hibridoma mostraron más de 3000 pg/mL de p-GSK-3B con respecto al fondo .

Los sobrenadantes de hibridoma que contienen el anticuerpo anti-BKB2R parecen haber activado el receptor BKB2R, activando la inactivación (a través de la fosforilación) de GSK-3B.

Ejemplo 2 Efectos Agudos de Anticuerpos Anti-Bkb2r en Presión Sanguínea Usando el Modelo de Rata Wistar Este ejemplo describe los efectos agudos de varios anticuerpos anti-BKB2R en la presión sanguínea en ratas Wistar anestesiadas.

Diseño de Estudio.- Ratas Wistar machos (Charles River Laboratories, Boston, MA) de 7.0 a 7.6 semanas de edad, que pesan en promedio 245 gramos, se mantuvieron con alimento de rata Purina 5001 ad libitum. Después de una semana de aclimatación en laboratorio, se llevaron a cabo tratamientos de cirugía de catéter femoral y administración de fármaco en un período de un día con mediciones que comienzan el mismo día y continúan durante un período de seguimiento corriente de tres semanas. Los grupos de tratamiento fueron (1) anticuerpo 3H3H3 (an i -BKB2R) (n=8) , (2) anticuerpo 3H3H9 (anti-BKB2R) (n=8) , (3) anticuerpo 1 F2G7 (anti-BKB2R) , (n=3), (4) anticuerpo 5F12G1 (anti-BKB2R) (n=8) .

Mediciones de Presión Sanguínea.- las ratas se anestesiaron con cetamina (30 mg/kg, IM) e Inactina (50 mg/kg, IP) . Se implantaron las cánulas en la arteria femoral para mediciones de presión sanguínea y en la vena femoral para la administración de fármaco. La línea arterial se rellenó con solución salina con 10 Ul/ml de heparina para mantener la línea patente sobre el experimento y evitar inundación frecuente de la línea arterial. Después de 15-20 minutos de período de equilibrio, y una vez que fue estable la presión sanguínea, se registró durante 15 minutos; una presión sanguínea de línea base; entonces, los fármacos se administraron y se valoraron sus efectos en la presión sanguínea. Para los anticuerpos se administró una dosis individual (0.5 mg/kg) y la presión sanguínea se registró durante tres horas. Todos los fármacos se diluyeron en solución salina o PBS para lograr un volumen total de 1 ml/kg. Los fármacos se administraron lentamente, en un período de 40 segundos en promedio. Los animales se mantuvieron a 37°C durante el experimento. Al final de los experimentos, los animales se sacrificaron por eutanasia y no se recolectó sangre ni tejidos.

Cálculos. Presión sanguínea de línea base, duración de respuesta de presión sanguínea a fármaco, cambio máximo en presión sanguínea y Área Bajo la Curva (AUC) para la respuesta de presión sanguínea. La presión sanguínea a l, 2 y 3 horas después de la infusión para los anticuerpos.

Resultados. Los cuatro anticuerpos anti-BKB2R tienen un efecto transciente en la presión sanguínea que inicia inmediatamente después de la administración IV. 5F12G1 mostró una reducción moderada pero significante en la presión sanguínea en todos los puntos de tiempo después de la administración. En este grupo, la presión sanguínea en línea base fue 109 + 3 rara de Hg, y disminuyó a 95 + 3 mm de Hg en una hora, a 94 ± 3 mm de Hg en dos horas y 95 + 3 mm de Hg en tres horas después de que se administró el anticuerpo. Para estos grupos, en la Tabla 1 se presentan los valores de la Respuesta Pico de Presión Sanguínea y la duración del tratamiento (hasta que la presión sanguínea retornó a la línea base) y se muestran en forma de gráfica en las Figuras 3 y 4.

Tabla 1.- Respuesta de Presión Sanguínea y Duración, de Respuesta Ejemplo 3 Análisis por QRT-PCR de Reducción de Título Viral en Células A549 por los Anticuerpos Monoclonales Se han usado métodos de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativos (qRT-PCR) como un examen primario de bajo rendimiento, como un examen confirmatorio y para mecanismos de estudios de acción usando virus de influenza. Este ejemplo describe el uso de un ensayo qRTPCR para medir la cantidad de ADN genómico viral en células viralmente infectadas en la presencia de un compuesto ' de prueba, como una correlación directa al número de partículas virales replicadas. El ensayo proporciona mediciones directas y confiables que también pueden sugerir el mecanismo de acción. En unión con este ensayo, se ha desarrollado la secuenciación de bajo rendimiento de 96 concavidades de los ADNc aislados para la cuantificación de la población de virus.

Diseño Experimental y Métodos Cultivo de células A549 e infección con virus de influenza. Se cultivaron células A549 (ATCC CCL-185, ATCC, Manassas, VA) a -95% de confluenza en placas de cultivo de tejido, las células se mantuvieron y pusieron en placa en DMEM complementado con 10% de FBS y 1% de Penicilina/Estreptomicina/Glutamina (Invitrogen, Carlsbad, CA) . 24 horas después de colocar en placa, se adicionaron los anticuerpos 5F12G1 ("Gl"), 1 F2G7 ("G7"), 3H3H9 ("H9"), y 3H3H3 ("H3"), así como el fármaco de control positivo TamifluMR a las placas como diluciones en medio de cultivo, después de lo cual las placas se regresaron a incubar a 37°C/5% de C02 durante 1 hora. Las células entonces se infectaron o infectaron en falso con virus. La infección toma lugar usando 0.1 multiplicidad de infección (MOI, por sus siglas en inglés) de la cepa A de influenza A/Brisbane/07 (H1N1) . Para infectar células, el medio de crecimiento se removió y las células se lavaron 3X con DPBS . El virus se diluyó en DMEM-PSG (o solo DMEM-PSG que no contiene virus se usó para las infecciones en falso) y se adicionó a las células. Se adicionaron preparaciones frescas de anticuerpo nuevamente, después de lo cual las placas se regresaron a incubar a 37°C/5% de C02 durante 1 hora. Las células entonces se removieron de la incubadora, el medio de infección se reemplazó con medio fresco que contiene el anticuerpo apropiado, fármaco de control, o dilución en falso en OptiProMR (Invitrogen, Carlsbad, CA) medio libre de suero/2 ug/ml de tripsina, y las células se retornaron, a la incubadora. Las células se incubaron a 37°C/5% de CO¾, y se recolectaron 72 horas después de la infección para análisis por qRT-PCR. Como un control negativo, las células no infectadas se sometieron a los mismos procedimientos. También se analizó una placa de control con los anticuerpos dosificados, únicamente (sin infección viral) para determinar el grado de citotoxicidad de cada dosis de anticuerpo en células A549. La placa de control se preparó como se describe anteriormente pero no se adicionó virus (medio de infección en falso) a las células. Se determinó la viabilidad celular después de 72 horas.

El análisis de las cantidades de ADN y ARN de matrices biológicas (por ejemplo, tejidos, fluidos, o escretas) se llevó a cabo usando equipos de extracción Qiagen (Qiagen GmbH, Valencia, CA) como se requiere por el tipo de matriz. La concentración de muestras de ARN extraídas se midió por densidad óptica (A26o) · Las secuencias de ADNc se cuantificaron por PCR de tiempo real usando un ensayo TaqManMR (Invitrogen) con cebadores diseñados a medida, complementarios a una sección de 200 nt del segmento M de influenza. Primero se transcribieron muestras de ARN en ADNc la Transcriptasa Inversa SuperscriptMR de Invitrogen según las instrucciones del proveedor, y se cuantificó el ADNc de la misma manera como el ADN anterior (qRT-PCR) . Para este análisis por qRT-PCR, se mezclaron muestras duplicadas y se analizaron; también se corrieron controles positivos, negativos y sin plantilla. Se usó una cantidad conocida de plantilla (por ejemplo, plásmido que contiene el gen M de influenza) para generar una curva estándar. Se creó una comparación lineal al graficar valores de Ct contra el número de copia conocido de la plantilla. Esta gráfica entonces se usó para estimar la cantidad de ADNc de muestras desconocidas. Se realizó el análisis estadístico y se gráfico usando Microsoft Excel .

Resultados. Los resultados se resumen en la tabla 2 y en las Figuras 5 a 8. Los resultados del ensayo de qRT-PCR muestran que el control TamifluMR redujo el número medido de copias genómicas virales de una manera sensible a la dosis. El anticuerpo Gl (5F12G1) Anti-BKB2R mostró una fuerte reducción en el título viral (reduciendo el título viral por 100 veces) a la concentración más alta probada de 100 ug/ml, y se consideró por lo tanto un candidato para el tratamiento de virus de influenza.

Tabla 2. Valores de Ct para el ensayo de qRT-PCR Ejemplo 4 Anticuerpos Monoclonales ANTI -BKB2R Exhiben Citotoxicidad contra Células MDCK (Transformadas) Este ejemplo describe los efectos de un anticuerpo monoclonal anti-BKB2R en la línea de células de riñon canino de Madin-Darby (MDCK, por sus siglas en inglés) , una línea de células epiteliales renales, transformadas, y mortal (Kushida et al., 1999) . Se observó de manera sorprendente que los anticuerpos anti-BKB2R fueron citotóxicos a las células MDCK, haciendo a estos anticuerpos candidatos para el uso como productos terapéuticos de cáncer, tal como cánceres rectales.

Métodos.- El ensayo antiviral y de toxicidad se ha validado y se realizó esencialmente como se describe en Noah et. al, Antiviral Res. 2007 Enero;73 (l):50-9. Células de riñon canino de Madin Darby (MDCK) se usaron para probar la eficiencia de los anticuerpos monoclonales anti-BKB2R u otros compuestos para prevenir el efecto citopático (CPE) inducido por infección de influenza. Se incluyó Oseltamivir carboxilato (TamifluMR) en cada corrida como uon compuesto de control positivo. Los cultivos subconfluentes de células MDCK se colocaron en placas de 96 concavidades para el análisis de viabilidad celular (citotoxicidad) . Se adicionaron anticuerpos u otros fármacos a las células en el momento de la colocación en placa. 24 horas después, las concavidades de CPE también recibieron 100 dosis infecciosas de cultivo de tejido (100 TCID50s) de virus de influenza. 72 horas después se determinó la viabilidad celular. La viabilidad celular se valoró usando Cell Titer-GloMR (Promega, Madison, WI) . Las concentraciones tóxicas del fármaco que redujeron los números celulares por 50% y 90% (TC50 y TC90, respectivamente) se calcularon .

Ensayo de Detección CellTiter-GloMR para Viabilidad Celular. La medición del CPE inducido por influenza se basa en la cuantificación de ATP, un indicador de células metabólicamente activas. El ensayo de CPE empleó un Equipo de Viabilidad Celular Luminiscente CellTiter-GloMR comercialmente disponible (Promega, Madison, WI) de acuerdo a las instrucciones del proveedor, para determinar la citotoxicidad y proliferación celular en cultivo. Brevemente, después de una incubación de cultivo celular, se adicionó directamente el Reactivo CellTiter-GloMR a células subconfluentes previamente cultivadas en el medio, induciendo lisis celular y la producción de una señal bioluminiscente (vida media mayor de 5 horas, dependiendo del tipo de células) que fue proporcional a la cantidad de ATP presente (como un biomarcador para viabilidad celular) .

En el día uno, las células MDCK se cultivaron a 90% de confluencia, luego se tripsinizaron, se recuperaron, se centrifugaron y se lavaron dos veces en PBS para remover el suero residual. Las células se resuspendieron y diluyeron en DMEM/penicilina/estreptomicina/L-glutamina, se tomaron en alícuota en placas de 96 concavidades y se dejaron unir a la placa durante 18 horas a 37°C. Entonces a las concavidades de prueba se adicionaron anticuerpos (mAb anti-BKB2R) o controles con vehículo, (medio), en el día dos, una observación visual confirmó la viabilidad celular, con confluencia visualmente estimada a 80-90%. A las concavidades de prueba se adicionó 100 TCIDSOs (100 veces la dosis infecciosa de cultivo de tejido que provoca 50% de letalidad en 72 horas) (que contiene 2 g de tripsina, concentración final) se adicionó el medio solo (que contiene también tripsina) a las concavidades de control. Los volúmenes finales de las concavidades fueron 100 mL. Las placas se incubaron durante 72 horas a 37°C/5% de C02.

En el día cinco, a cada concavidad se adicionaron 100 mi del reactivo CellTiter-GloM , y las placas se analizaron de manera subsiguiente por detección de luminiscencia .

Prueba de Anticuerpos para Citotoxicidad en Células MDCK.- En el día uno, células MDCK recuperadas de momocapas 90% confluentes se sembraron con células en placas de 96 concavidades 18 horas antes del ensayo, a una densidad celular seleccionada para lograr 90% de confluencia para células no infectadas en el día dos. Inmediatamente después de la colocación en placa, los compuestos de prueba (mAb anti-BKB2R o Tamiflu ) diluidos en el el raedo de cultivo que contiene menos de 1% de DMSO se adicionaron a concavidades replicadas (triplicado para determinaciones de eficiencia, dublicado para determinaciones de citotoxicidad) ; la concavidades de control recibieron el medio solo. Las preparaciones del compuesto de prueba ("fármaco") para los anticuerpos anti-BKB2R (mAb) tienen concentraciones finales de 100, 33, 11, 3.7, 1.2, 0.4, 0.14, 0.05 pg/ml las preparaciones de TamifluMR tienen concentraciones finales de 0.023, 0.07, 0.2, 0.6, 1.9, 5.5, 16.6, 50 mM. Los cultivos se mantuvieron durante la noche ' a 37°C/5% de C02 y en el día dos, se adicionó el virus. A cada concavidad en la cual se va a llevar a cabo la determinación de eficiencia, se adicionaron 100TCID50s de virus (concentraciones finales de prueba) ; las concavidades que no recibieron virus se usaron para determinaciones de citotoxicidad. Las placas se incubaron durante 72 horas adicionales a 37°C/5% de C02, después de lo cual se midió la viabilidad celular por análisis de luminiscencia usando el equipo Promega CellTiter-GloMR como se describe anteriormente.

Resultados.- Todos los anticuerpos anti-BKB2R probados mostraron citotoxicidad en células MDCK a las mayores concentraciones probadas. Las Figuras 9-18 resumen, en forma de gráfica, los resultados, con los varios anticuerpos, en comparación a A/Brisbane/59/07 e Influenza CA/07/09.

Ejemplo 5 Anticuerpos Monoclonales Anti-BKB2R Exhiben Citoboxicidad contra una Variedad de Líneas de Células de Cáncer Este Ejemplo describe la caracterización de la actividad citotóxica de los anticuerpos monoclonales anti-BKB2R descritos en la presente contra un panel de líneas de células de cáncer. BxPC-3 es una línea de células de adenocarcinoma humano originalmente aislada del páncreas (cáncer pancreático) (ATCC # CRL-1687; Tan et al., Cáncer Invest. 4: 15-23, 1986. PubMed: 3754176). MV-4-11 es una línea de células de leucemia mielomonocítica bifenotípica B humana (leucemia de linaje mezclado, MLL-AF4) originalmente aislada de la sangre periférica (ATCC # CRL-959; Lange et al., Blood 70: 192-199, 1987. PubMed: 3496132). Hep G2 es una línea de células de carcinoma hepatocelular humano aislada del hígado (cáncer de ligado) (ATCC # HB-8065; Aden et al., Nature 282: 615-616, 1979. PubMed: 233137). RS4 ; 11 es una línea de células de leucemia linfoblástica aguda humana (leucemia de linaje mezclado, MLL-AF4) de la médula ósea (ATTC # CRL-1873) Stong et al., Blood 65: 21-31, 1985. PubMed: 3917311) . HT-29 es una línea de células de adenocarcinoma colorectal humano (ATTC # HTB-38) aislada del colón (cáncer de colon). Fogh et al., J. Nati. Cáncer Inst. 58: 209-214, 1977. PubMed: 833871). NUGC-4 es un carcinoma de estómago, humano aislado del nodulo linfático paragastírico de estómago (JCRB # JCRB0834; Akiyama et al., Jpn. J. Surg. , 18: 438-446, 1988). PC-3 es una línea de células de adenocarcinoma próstata humano originalmente aislada de metástasis ósea (cáncer de próstata) (ATCC # CRL-1435; Kaighn et al., Invest. Urol . 17: 16-23, 1979. PubMed: 47482).

Prueba de anticuerpos monoclonales anti-BKB2R (1F12G7 y 5F12G1) para citotoxicidad en las líneas de células de cáncer y BxPC-3, MV-4-11, Hep G2 , RS4 ; 11, HT-29 y NUGC-4. Las líneas de células se cultivaron usando medios, suero y condiciones de cultivo recomendadas por las guías de ATCC para cada línea de células (ATCC, Manassas, VA) . Las células se sembraron en placas de cultivo de 96 concavidades a 30,000 células/concavidad en el día 0 en un volumen de 0.1 mL de medio completo. Las placas entonces se colocaron en una incubadora humidificada a 37°C con aire de cuarto filtrado con 95% de HEPA y 5% de C02 durante 24 horas, entonces, a las concavidades indicadas se adicionaron 0.1 mL de medio; libres de suero en el cual se diluyó cada anticuerpo de prueba a dos veces (2X) la concentración final deseadas (50,000 ng/ml, 25,000 ng/ml, 12,500 ng/ml 6,250 ng/ml, 3125 ng/mí, 1563 ng/ml, 781 ng/nl , 391 ng/ml, 195 ng/ml, o 98 ng/ml); y las placas se regresaron a la incubadora durante 120 horas (5 días) . Se usó un control positivo, 0.1 mi de una concentración 2X del fármaco anti-cáncer cisplatina, a las siguiente concentraciones: 300,050.000 ng/ml, 75,012.500 ng/ml, 18,753.125 ng/ml, 4,688.281 ng/ml, 1,172.070 ng/ml, 293.018 ng/ml, 73.254 ng/ml, 18.314 ng/ml, 4.578 ng/ml o 1.145 ng/ml.

Ensayo de MTT. La actividad anti-proliferativa de los compuestos de prueba contra las líneas de células indicadas se evaluó in v tro usando el Ensayo de Proliferación de células MTT de la ATCC (Catálogo No. 30-1010K) . Después de 120 horas de incubación con el fármaco (por ejemplo, mAb anti-BKB2R o cisplatina) , se midió la proliferación celular por la adición del reactivo MTT a cada concavidad e incubación durante 4 horas adicionales. Este paso se siguió entonces por la adición del reactivo de solubilización de MTT/lisis celular e incubación durante la noche. Se midió la absorbancia óptica (570 nm) de las concavidades de prueba y luego se cuantificó con relación a las concavidades de control que no recibieron fármaco. Los resultados se expresaron como por ciento de inhibición versus concentración de compuesto y se graficaron, como se muestra en las Figuras 19-25, para las líneas de células BxPC-3, MV-4;11, HepG2, RS-4; 11, HT-29, NUGC-4, y PC-3, respectivamente. En base a estos resultados, la concentración de EC50 para cada anticuerpo, en cada línea celular, se calculó y tabuló en comparación al control tratado con cisplatina, en la Tabla 3, posterior. Ambos mAb anti -BKB2R mostraron citotoxicidad marcada hacia todas las líneas de células de cáncer probadas después de 120 horas de exposición .

Tabla 3. Citotoxicidad de mAb anti-BKB2R hacia línea de células de cáncer Ejemplo 6 Anticuerpo Monoclonal 5F12G1 Agonista del Receptor de Badiquinina Incrementa la Sensibilidad a Insulina La pinza hiperinsulinéemica-euglicémica se ha considerado como la técnica estándar in vivo para medir los efectos de sensibilidad a insulina de los fármacos de diabetes tipo 2. En este procedimiento, se administra insulina a un animal de prueba para aumentar la concentración de insulina, en tanto que se da por infusión glucosa para mantenerla euglicemia. La velocidad de infusión de glucosa (GIR, por sus siglas en inglés) necesaria para mantener la euglicemia es un reflejo de la acción de insulina o sensibilidad mejorada a insulina. El clon 5F12G1 del anticuerpo monoclonal agonista del receptor de bradiquinina (anti-BKB2R) se probó en un estudio de pinza euglicémica para medir su capacidad para mejorar la sensibilidad a insulina.

Materiales y Métodos . - Ratas Sprague Dawley machos jóvenes saludables que pesan 275-300g se usaron para el estudio (Harían Laboratory, Indianapolis , EUA) . Las ratas se mantuvieron en un ambiente controlado a una temperatura de 70-72°F (21.11-22.22°C) , humedad de 30-70%, con un fotociclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Se proveyeron con una dieta TEKLADMR 2018-Global 18% y agua para beber ad libitum. Después de siete días de aclimatación, las ratas se agruparon en grupos de cuatro.

Pinza Hiperinsulinémica-Euqlicémica . - Los animales se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de cóctel de cetamina-plus-xilazina y la vena yugular derecha y la arteria carótida izquierda se cateterizaron externamente a través de una incisión en el colgajo de piel. Los animales con catéter se dejaron recuperar durante cinco días. Después de cinco días de recuperación, los animales ayunaron durante seis horas y se aplicó una pinza hiperinsulinémica-euglicémica de 120 minutos con infusión continua de insulina humana (Humulin, Eli Lilly, Indianapolis, IN) a una velocidad constante de 4mU/kg/minuto . Al mismo tiempo, se dio por infusión una solución de glucosa al 20% a velocidad variable y la velocidad se ajustó cada 10 minutos para mantener un nivel objetivo de glucosa en sangre de 115 ± 5 mg/dl . Tanto la insulina como la glucosa se dieron por infusión a través de la vena yugular derecha con catéter y se monitorizaron los niveles en sangre de glucosa de la arteria carótida con catéter. Los niveles de glucosa sanguínea arterial y los niveles de insulina en plasma se midieron antes de la infusión a t=-120, -90, -30, -15 y 0 minutos y luego cada 10 minutos durante 120 minutos (t=120), usando un medidor de Glucosa (Accu-ChekMR Roche Diagnostics, Indianapolis , IN) y un equipo de ELISA de insulina de rata. Las pinzas se continuaron durante 120 minutos (t=120) , después de lo cual se terminó el experimento. El grupo de vehículo se inyectó con PBS (i.m.) a t=-30 min y el grupo tratado con 5F12G1 se inyectó con el anticuerpo (i.m.) a t=-30 min a una concentración de 0.5 mg/kg.

La velocidad de infusión de glucosa se incrementó significativamente en el tratamiento con el anticuerpo 5F12G1 con un incremento pico de 291% en comparación al vehículo (t=60 min) (p=0.0066) y un incremento de 179% en la velocidad de infusión total de glucosa AUC en comparación al vehículo (p=0.0035). Estos resultados demostraron la capacidad de 5F12G1 para incrementar de manera significativa la sensibilidad a insulina al mejorar la acción de insulina. Los resultados se tabularon y la velocidad de infusión de glucosa se gráfico como una función del tiempo. (Figura 26), y como área bajo la curva (AUC) (Tabla 4 y Figura 27) .

Tabla 4: Velocidad Calculada de Infusión de Glucosa, Área Bajo la Curva (mg/kg) Ejemplo 7 Efectos de 5F12G1 en OGTT en Rata Grasosas Diabéticas Zucker Este Ejemplo describe la evaluación de la tolerancia oral a glucosa en ratas grasosas diabéticas Zucker (ZDF fa/fa) tratadas con el anticuerpo monoclonal 5F12G1. Ratas ZDF fa/fa machos (Charles River) se mantuvieron en una dieta Harían Tekled con agua para beber Arrowhead ad libitum Y se dejaron aclimatar durante una semana. Seis animales por grupo se trataron de acuerdo a los siguientes grupos de tratamiento: 1, PBS estéril (control con vehículo); 2, 1.0 mg/kg de anticuerpo monoclonal murino (mAb) 5F12G1 (VH que comprende SEQ ID NO : 1 , VL que comprende SEQ ID NO : 2 ) ; 3 , 0.2 mg/kg mAb 5F12G1; 4, 0.04 mg/kg mAb 5F12G1.

Prueba de Tolerancia Oral a Glucosa.- La prueba de tolerancia oral a glucosa (OGTT) se realizó en ratas ayunadas durante la noche (16 horas) . El control con vehículo (PBS) o anticuerpo monoclonal 5F12G1 se administró subcutáneamente treinta minutos antes de la carga de glucosa. Se preparó D-glucosa en agua destilada y se administró oralmente a 2g/kg de peso corporal .

En múltiples puntos de tiempo (0, 15, 30, 60, 90 y 120 minutos) se recolectaron muestras de sangre de aproximadamente 50µ1 cada una y se procesaron para aislar el plasma. Las muestras de plasma se analizaron para insulina por un método de ELISA usando un equipo de ELISA de insulina de ratón ultrasensible (Crystal Chem, Inc., Downers Grove, IL) . Los datos de ELISA se compilaron y usaron para calcular la media + error estándar (SEM) con Microsoft Excel o GraphPad Prism versión 5.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego California EUA) .

Resultados. Los resultados se presentan en las Figuras 28A, 28B, 29A, y 29B. En comparación al tratamiento con el vehículo de control, la administración individual del anticuerpo monoclonal 5F12G1 (1.0, 0.2 y 0.04 mg/kg) disminuyó el área bajo la curva (AUC) de la concentración en sangre de glucosa después de la carga oral de glucosa en ratas DIO. La disminución en la AUC de glucosa sanguínea fue mayor con 1.0 mg/kg seguido por 0.2 y 0.04 mg/kg de peso corporal. La dosis del anticuerpo monoclonal 5F12G1 incrementó dependientemente la actividad de insulina en ratas OGTT ZDF fa/fa.

Ejemplo 8 Efectos de 5F12G1 en OGTT en Ratones DIO Este Ejemplo describe la evaluación de la tolerancia oral a glucosa en ratones obesos inducidos por dieta (DIO, por sus siglas en inglés) tratados con el anticuerpo monoclonal 5F12G1 anti-BKB2R (VH que comprende SEQ ID NO:l , VL que comprende SEQ ID NO : 2 ) . Ratones C57BL/6J macho (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) se mantuvieron en una dieta grasa con 60% de kcal con Dieta de Investigación y Agua para Beber Arrowhead ad libitu y se les permitió aclimatarse durante un período de 8 semanas. Diez animales por grupo se trataron de acuerdo a los siguientes grupos de tratamiento: 1, PBS estéril (control con vehículo); 2, 1.0 mg/kg de anticuerpo monoclonal murino (mAb) 5F12G1; 3, 0.2 mg/kg mAb 5F12G1; 4, 0.04 mg/kg mAb 5F12G1.

Prueba de Tolerancia Oral a Glucosa (OGTT) se realizó en ratones ayunados durante la noche (16 horas) . El control con vehículo (PBS) o el anticuerpo monoclonal 5F12G1 se administró subcutáneamente treinta minutos antes de la carga de glucosa. Se preparó D-glucosa en agua destilada y se administró oralmente a 2g/kg de peso corporal. Los niveles en sangre de glucosa se midieron después de la administración de vehículo o 5F12G1 (-30 minutos) y justo antes de la carga de glucosa (0 minuto) y en puntos de tiempo subsiguientes de 15, 30, 60 90 y 120 minutos usando un medidor de glucosa Accu-ChekMR (Roche Diagnostics, Indianapolis , IN) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

En múltiples puntos de tiempo (0, 15, 30, 60, 90 y 120 minutos) se recolectaron muestras de sangre de aproximadamente 50 µ? cada una y se procesaron para aislar el plasma. Las muestras de plasma se analizaron para insulina por un método de ELISA usando un equipo de ELISA de insulina de ratón ultrasensible (Crystal Chem, Inc., Downers Grove, IL) . Los datos de ELISA se compilaron y usaron para calcular la media + error estándar (SEM, por sus siglas en inglés) con Microsoft Excel o GraphPad Prism versión 5.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego California EUA) .

Resultados. Los resultados se presentan en las Figuras 30A, 30B y 31. En comparación al tratamiento con el control con vehículo, la administración individual de anticuerpo monoclonal 5F12G1 (1.0, 0.2 y 0.04 mg/kg) disminuyó el área bajo la curva (AUC) de la concentración de glucosa en sangre después de la carga oral de glucosa en ratones DIO. La disminución en la AUC de la glucosa sanguínea fue mayor con 1.0 mg/kg seguido por 0.2 y 0.04 mg/kg de peso corporal. La dosis del anticuerpo monoclonal 5F12G1 incrementó de forma dependiente la actividad de insulina en ratones OGTT DIO.

Ejemplo 9 5F12G1 es un agonista del receptor de bradiquinina B2 de humano Este ejemplo describe la prueba de la respuesta estimulatoria dependiente de la dosis del anticuerpo monoclonal 5F12G1 anti-BKB2R en el receptor de bradiquinina B2 como se mide por la liberación de calcio intracelular de etapa posterior. Una línea de células CHO estable que expresa el receptor BKB2 humano (CHO-Kl/B2/Gal5 ) se usó para el examen. El anticuerpo se diluyó a cinco diferentes concentraciones, desde 0.5 mg/ml, mediante incrementos de dilución de tres veces, y se examinó en muestras duplicadas de células.

Se validaron la expresión y actividad funcional del receptor de BKB2 humano en la línea de células CH0-Kl/B2/Gal5 por exposición a bradiquinina de control positivo. El valor de EC50 fue similar a los valores reportados para ' bradiquinina. La actividad estimulatoria del anticuerpo 512G1 se normalizó al control positivo; los datos se compilaron % de activación.

Para realizar el ensayo, las células CHO- K1/B2/GOÍ15 se sembraron en concavidades de una placa de fondo claro, de pared negra de 384 concavidades a una densidad de 20,000 células por concavidad en 20 µ?. de medio de crecimiento 20 horas antes al día del experimento, y se mantuvieron a 37°C/5% de C02. Se adicionaron 20 µL de solución de carga de tinte (FLIPRMR Calcium 4 assay kit, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) en cada concavidad y la placa se colocó en una incubadora a 37°C durante 60 minutos, seguido por 15 minutos a temperatura ambiente. El tiempo total de lectura fue de 120 seg. Después de una lectura a 20 segundos para establecer la línea base, se adicionaron el anticuerpo o agonista a las concavidades seleccionadas y se capturó la señal fluorescente durante otros 100 segundos (21s a 120s) . Las lecturas de las concavidades que contienen las células estimuladas con el amortiguador de ensayo (0.03% Na3N PBS) que contiene 1% de DMSO se eligieron como los valores de fondo para el examen; las lecturas de las concavidades que contienen células estimuladas con el agonista bradiquinina (a 10 uM) se eligieron como el control positivo .

Resultados.- Para células tratadas con mAb, 5F12G1, el porcentaje de activación fue 72.7 +/-3.5% (media +/- SD, n = 2) a 0.5 mg/ml, y la ED50 fue 0.24 mg/ml . Para células tratadas con bradiquinina, el porcentaje de activación fue 93.1 +/-5.7% (media +/- SD, n = 2), y la ED5Q fue 0.95 nm/1. La exposición al anticuerpo monoclonal 5F12G1 de por resultado este modo un alto % de activación% de células que expresan el receptor de bradiquinina B2 de humano.

Ejemplo 10 Efectos de la administración del anticuerpo 5F12G1 en diabetes tipo 2 crónica Este ejemplo describe la evaluación de 21 días de los efectos del mAb 5F12G1 anti-BKB2R a tres diferentes dosis en el modelo de diabetes tipo II crónica en ratas ZDF fa/fa, en comparación a exenatida, sitagliptina y mAb MG2b-57.

La rata ZDF fa/fa es un modelo para diabetes tipo 2 en base a intolerancia deteriorada a glucosa provocada por la mutación del gen heredado de obesidad que conduce a resistencia a insulina. En ratas ZDF fa/fa, la hiperglucemia se manifiesta inicialmente en aproximadamente siete semanas de edad, y las ratas macho obesas son completamente diabética por aproximadamente 12 semanas. Entre la séptima y décima semanas de edad, los niveles en sangre de insulina en estos animales se elevan (hiperinsulinemia) , pero los niveles de insulina caen subsiguientemente conforme las células beta pancreáticas cesan de responder a los estímulos de glucosa.

La hiperglucemia en ayuno, que aparece primero a las 10 a 12 semanas de edad, progresa con el envejecimiento; la resistencia a insulina y la tolerancia anormal a glucosa llegan a ser progresivamente peor con la edad. Dejadas sin tratar, las ratas ZDF exhiben eventualmente hiperlipidemia, hipertrigliceridemia e hipercolesterolemia, dando por resultado hipertensión moderada.

Los compuestos de prueba y vehículo usados en este estudio fueron: 1. Anticuerpo monoclonal 5F12G1 anti-BKB2R de ratón (IgG2b, ?) ; 2. anticuerpo monoclonal MG2b-57 (BioLegend, San Diego, CA) , de ratón elegido como un control correspondido en isotipo (IgG2b, ?) para 5F12G1 y que tiene una especificidad irrelevante de antígeno (por ejemplo, control negativo); 3. sitagliptina (Selleck Chemicals LLC, Houston, TX) ; 4. exenatida (Bachem Americas, Torrance, CA) .

La sitagliptina (JanuviaMR) es un antihiperglicémico (fármaco antidiabético) de la clase de inhibidor de dipeptidil-peptidasa-4 (DPP-4) . La sitagliptina trabaja para inhibir competi ivamente la enzima dipeptidil-peptidasa-4 (DPP-4), que destruye las incretinas GLP-1 y GIP, hormonas gastrointestinales liberadas en respuesta a un alimento. Al impedir la inactivación de GLP-1 y de GIP, que son capaces de incrementar la secreción de insulina y suprimir la liberación de glucagón por el páncreas. Este efecto impulsa los niveles de glucosa en sangre a lo normal .

La exenatida es un péptido de 39 aminoácidos, un secretagogo de insulina, con efectos glucorreguladores . La exenatida es una versión sintética de exendina-4, una hormona que presenta propiedades biológicas similares al péptido-1 tipo glucagón (GLP-1) humano, un regulador del metabolismo de glucosa y secreción de insulina. La exenatida mejora la secreción de insulina dependiente de glucosa por las células beta pancreáticas, suprime la secreción inapropiadamente elevada de glucagón, y muestra vaciado gástrico.

Animales.- Se obtuvieron ratas ZDF fa/fa machos de CRL (Kingston, NY) . En el arribo, las ratas eran de siete semanas de edad. Las ratas se alojaron individualmente por jaula en una habitación con un fotociclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad y una temperatura ambiente de 70-72°F (21.11-22.22 °C) y alimentan con dieta regular de roedor y agua ad libitum. A la edad de once semanas,, las ratas se dividieron en seis grupos (tabla 5) de ocho ratas por grupo en base a los niveles en sangre de glucosa en ayuno. Un sub-grupo de cuatro ratas por grupo se mantuvo en paralelo a los grupos principales y se dosificó de manera similar durante veintiún días para un estudio de pinza hiperinsulinémica-euglucémica .

Tabla 5. Grupos de ratas ZDF fa/fa Los compuestos de prueba 5F12G1 y MG2b-57 se administraron subcutáneamente una vez cada tres días. La exenatida se administró intraperitonealmente dos veces cada día y la sitagliptina se administró oralmente una vez al día durante un período de veintiún días. Se administró 5F12G1 a tres diferentes dosis, 0.2, 0.4 y 0.008 mg/kg, exenatida a 1 pg/kg, sitagliptina a 10 mg/kg y MG2b-57 a 0.2 mg/kg, respectivamente .

Se realizó una prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT, por sus siglas en inglés) en el día 0, 1, 14 y 21 para cada grupo del estudio. Se recolectaron muestras de plasma en cada punto de tiempo durante la OGTT para medir también los niveles de insulina. Se midieron el peso corporal, ingestión agua y alimento dos veces por semana. Se monitorizan a presión sanguínea y las frecuencias cardíacas en el día 0, 7, 14 y 21 usando un método invasivo de manga en cola (con cinco lecturas por rata tomadas y luego promediadas) . Se recolectaron muestras de suero en ayuno en el día 0, 7, 14 y 21 antes de la OGTT para determinación del nivel de triglicéridos y colesterol total. Se recolectaron muestras de orina en el día 7 y 14 para determinación de glicosuria. Se midió la hemoglobina glicada (glucosilada) (HbAlc) al final del estudio. Los equipos de ensayo para estos estudios se prepararon como se presenta en la tabla 6, y se usaron de acuerdo a las instrucciones de los proveedores .

Tabla 6. Equipos de prueba Prueba de tolerancia oral a glucosa (OGTT) Debido a la edad de las ratas al inicio de este estudio, se esperaba que las ratas ZDF fa/fa tengan ligera resistencia a insulina que da por resultado mayor incremento normal en los niveles sanguíneos de glucosa durante un OGTT. Se espera que la resistencia a insulina en ratas incremente durante el estudio de 21 días conforme los animales envejecen, dando por resultado mayores niveles en sangre de glucosa en las OGTT subsiguientes Se realizaron OGTT en el día 0, 7, 14 y día 21. Las ratas se ayunaron durante la noche y se midieron los niveles en sangre de glucosa en ayuno (t = 0 min) , y entonces a cada rata se le dio una dosis individual de 1.5 mi de solución de glucosa (2 g/kg de peso corporal de D- (+) -glucosa (G7528, Sigma) solubilizada en agua desionizada) administrada por cebadura. Entonces se midieron los niveles de glucosa en sangre mediante medidor de glucosa a los 15, 30, 60, 90 y 120 minutos para observar la velocidad de depuración de glucosa de la sangre con el paso del tiempo. En cada punto de tiempo de una OGGT aproximadamente se recolectaron 50-60 µ?? de sangre y se procesaron para plasma para medir los niveles de insulina .

En el día-0, como se espera, todos los grupos mostraron un patrón similar de respuesta glicémica a la OGTT, ya que los niveles en sangre de glucosa se incrementaron de aproximadamente 100 mg/dl en el tiempo 0, a un pico de aproximadamente 340-370 mg/dl a t = 30 minutos, y luego regresaron gradualmente a línea base durante los siguientes 60 a 90 minutos (ver figura 32A) . En el día 7, 14 y 21, las ratas en el grupo de control negativo, MG2b-57, exhibieron niveles en sangre de glucosa en ayuno progresivamente mayores, niveles de glucosa en sangre, pico, superiores, y los niveles de glucosa se elevaron durante períodos de tiempo cada vez más prolongados durante la OGTT. Este resultado se espera puesto que las ratas ZDF desarrollar diabetes tipo 2 y se pierde progresivamente el control glicémico. Después de 21 días de tratamiento, las ratas en el grupo de control negativo, MG2b-57, y los animales en el grupo de tratamiento con sitagliptina tuvieron niveles significativamente mayores de glucosa en sangre en ayuno (228 mg/dl) al inicio de la OGTT y los niveles en sangre de glucosa aumentaron a 488 mg/dl en 30 minutos y permanecieron altos (figura 32B) . Este incremento en los niveles en sangre de glucosa durante una OGTT indicaron que las ratas ZDF fa/fa estuvieron desarrollando diabetes tipo 2, como se espera. Sin embargo, las ratas tratadas con 5F12G1 tuvieron niveles en sangre de glucosa significativamente disminuidos al inicio de la OGTT (150 +/-20 mg/dl para el grupo 0.2 mg/kg, 163 +/- 40 mg/dl para el grupo 0.04 mg/kg y 190-+/-40 mg/dl para el grupo 0.008 mg/kg) en comparación a las ratas de control negativo.

El perfil de glucosa en sangre durante la OGTT del día 21 para 5F12G1 fue similar al perfil en el día 0 (ver figura 32B) con los niveles en sangre de glucosa que tienen picos en 312 mg/dL para 0.2 mg/kg, 355 mg/dL para 0.04 mg/kg y 400 mg/dL para 0.008 mg/dl a 30 minutos, luego, disminuyendo. Las ratas tratadas con exenatida tuvieron perfiles de OGTT similares a la dosis baja de 5F12G1. Estos resultados sugirieron que el tratamiento con el mAb 5F12G1 anti-BKB2R previene o retrasa la resistencia a insulina y el comienzo de diabetes tipo 2.

Los niveles de glucosa total en sangre medidos durante la OGTT descrita anteriormente se expresaron como el área bajo la curva (AUC) . Las ratas en todos los grupos en el día 0 tienen un intervalo de glucosa en sangre AUC de 27.044-31.167 (mg/dl (min) ) ver figura 33. En los días 7, 14 y 21, como se esperaba, los niveles en sangre de glucosa en el grupo de control negativo (MG2b-57) se incrementaron debido al desarrollo de diabetes tipo 2, dando por resultado AUC de glucosa significativamente mayor en cada OGTT subsiguiente (datos no mostrados) . Por el día 21, las ratas tratadas con MG2b-57 tienen cantidades de AUC de 50569.88 -+/ -4124.62 mg/dL (min) , el grupo de tratamiento de sitagliptina tiene cantidades de AUC de 53765.75+/-2281.45 mg/dL (min), que fue igual a la AUC de azúcar en sangre obtenida con exenatida (39.450.13+/-6087.89 mg/dL (min)). En contraste, el grupo de tratamiento de 5F12G1 (0.2 mg/kg) tiene una glucosa de AUC de 33241.13 +/- 3910.62 mg/dL (min) en el día 21, y AUC de azúcar en sangre estadísticamente menor en los días -7, 14 y 21 en comparación a sitagliptina y MG2b-57. Las ratas tratadas con 5F12G1 tienen niveles de glucosa en sangre de AUC en días -7, 14 y 21 que fueron similares al día 0, indicando que el tratamiento con 5F12G1 previno el desarrollo adicional de resistencia a insulina y mantenimiento de control de glucosa.

Se esperaba que los niveles de insulina en las ratas ZDF disminuyeran significativamente más allá de las 11 semanas de edad. Las concentraciones medias de insulina en plasma se midieron durante la OGTT en el día 0 y se presentan en la figura 34A. Como se espera, no se observaron diferencias significativas en el día 0 entre los grupos, y los niveles medios de insulina en ayuno fueron de aproximadamente 8-11 ng/ml, que durante la OGTT se incrementó a aproximadamente 15-19 ng/ml a los 15 minutos. Sin embargo, en el día -7, las ratas tratadas con el control negativo MG2b-57 tuvieron niveles de insulina significativamente disminuidos en comparación al día 0 durante el ayuno y durante la OGTT. Los animales tratados con 5F12G1 tuvieron niveles de insulina durante la OGTT en el día 7 comparables al día 0. Por el día -21, los animales tratados con 5F12G1 a 0.2, 0.04 y 0.008 mg/kg tuvieron niveles de insulina que fueron comparables al día 0, y niveles de insulina significativamente mayores en comparación a MG2b-57, sitagliptina y exenatida (ver figura 34B) . Los animales tratados con 5F12G1 a 0.2, 0.04 y 0.008 mg/kg tuvieron niveles de insulina en ayuno de 17+/-5, 12+/-3 y 14 ng+/-3 ng/ml, respectivamente, que incrementaron a 30+/-7, 26+/-3 y 24+/-6 ng/ml a los 15 minutos de la OGTT y regresaron a la línea base. En contraste, los animales en el grupo de control negativo tuvieron niveles de insulina en ayuno de 4+/ -1.6 ng/ml que se incrementaron a 9+/-2.8 a los 15 minutos. Las ratas tratadas con sitagliptina y exenatida tienen niveles de insulina en ayuno de 10+/-3.5 y 7+/-2.? ng/ml, respectivamente, que se incrementaron a 15+/ -4 ng/ml en ambos grupos a los 15 minutos y disminuyeron lentamente. La detección de niveles casi normales de secreción de insulina en los grupos tratados con 5F12G1 en el día 21 fue probablemente debida al mantenimiento de la sensibilidad a insulina (prevención de resistencia a insulina, hiperinsulinemea) , control glucémico y función total de células beta.

Se esperaba que las ratas ZDF fa/fa tengan un nivel en glucosa en sangre en ayuno ligeramente elevado al inicio del estudio. Esta elevación en el nivel de glucosa en sangre en ayuno se espera que se incremente con la edad de la rata. Los niveles de glucosa en sangre en ayuno se midieron en el día 0, 7, 14 y 21. Los niveles de glucosa en sangre en ayuno en todos grupos fueron de aproximadamente 117 a 120 mg/dl en el día 0. Como se espera, los niveles de glucosa en sangre en ayuno en el grupo de control negativo se incrementaron en el día 7, 14 y 21, como lo hicieron los niveles en el grupo de sitagliptina . Por el día 21, el nivel de glucosa en sangre en ayuno en el grupo de control negativo (MG2b-57) y grupo de sitagliptina se incrementó desde una línea de base de 116.5+/-25.8 mg/dl a 227.5+/-34.3 mg/dl y 247+/-14 mg/dl, respectivamente (ver figura 35), un incremento de 111.0+/-12.1 mg/dl para MG2b-57. Los niveles de glucosa en sangre en ayuno en el grupo 5F12G1 (0.2 mg/dl) solo se incrementaron de 117.6+/-14,2 mg/dl a aproximadamente 150.8+/ -56.5 , 163+/-21 y 190+/-40 mg/dl por día 21, respectivamente, un incremento de 33.1+/-19.7 mg/dl desde la línea base. Las ratas ZDF tratadas con altas dosis de 5F12G1 tuvieron un incremento significativamente menor en los niveles de glucosa en sangre en ayuno (p = 0.0058) en comparación a los animales de control negativo. Los niveles en sangre de glucosa en ayuno para el grupo tratado con exenatida también se incrementaron una cantidad relativamente pequeña, a 167+/-22 mg/dl en el día 21. El tratamiento con 5F12G1 protegió contra un incremento en los niveles en sangre de glucosa en ayuno de una manera dependiente de la dosis. La protección por 5F12G1 del desarrollo de diabetes tipo 2, como se mide por los niveles de glucosa en sangre en ayuno, fue similar a exenatida y mejoró con respecto a sitagliptina, y fu indicativa del mantenimiento de control glicémico y sensibilidad a insulina.

Se midieron los pesos corporales antes de la dosificación y dos veces por semana posteriormente usando una balanza de laboratorio. Las ratas ZDF a las 11 semanas de edad no habían alcanzado su peso corporal máximo y se espera que se incrementen en su peso. Los animales tratados con 5F12G1 en todos los grupos de dosis tienen un incremento 13+/-1 por ciento aproximado en el peso corporal en el día 21, donde como animales en los grupos tratados con exenatida y sitagliptina de control negativo tienen un incremento de 10+/-2 por ciento en los pesos corporales en el día 21. El incremento de peso corporal en los animales tratados con 5F12G1 probablemente fue debido a salud mejorada de los animales, específicamente prevención de desarrollo de diabetes tipo 2.

Se midieron las ingestiones de alimento y agua dos veces por semana, al proporcionar cantidades medidas de alimento y agua y al sustraer las cantidades medidas de alimento y agua que se dejan. El consumo de alimento fue ligeramente menor en el grupo 5F12G1 (todos los grupos de dosis) y diferenciados significativamente en comparación a los grupos tratados con MG2b-57, sitagliptina y exenatida.

Todos los animales tienen consumo de alimento de aproximadamente 29-30 g/rata/día en el día 0. En el día 21, el consumo de alimento fue ligeramente mayor con MG2b-57 33+/-1 g/rata/día, exenatida 31+/-1 g/rata/día y grupos tratados con sitagliptina 31+/-2 g/rata/día en comparación a los grupos de 5F12G1 (28+/-1 g/rata/día a 0.2 mg/kg, 27+/-2 g/rata/día a 0.04 mg/kg y 30+/-0.5 g/rata/día a 0.008 mg/kg). Sin embargo, el consumo de agua se incrementó significativamente en animales tratados con MG2b-57 (59+/-10 ml/rata/día) , exenatida (48+/-4 ml/rata/día) y sitagliptina (48+/-7 ml/rata/día), en comparación a los animales tratados con 5F12G1 en tres grupos de dosis (26+/-3 ml/rata/día a 0.2 mg/kg, 40+/-10 ml/rata/día a 0.04 mg/kg y 28+/-4 ml/rata/día) . El consumo incrementado de agua en el control negativo y grupo de sitagliptina puede haber sido debido a mayores niveles en sangre de glucosa, lo que dio por resultado poliuria. El consumo disminuido de agua en el grupo de tratamiento de 5F12G1 puede haber indicado mejor control glicémico, y que los animales no han desarrollado diabetes. El consumo disminuido de alimento y pesos incrementados de animales tratados con 5F12G1 en comparación a los animales control también puede indicar mejor control glicémico.

Recolección de suero. En el día 0, 7, 14 y 21, se recolectaron muestras de sangre de las ratas en ayuno en tubos separadores de suero (BD Biosciences, EUA) por pellizco en cola, y la sangre se dejó reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las muestras entonces se centrifugaron y el sobrenadante en suero se . transfirió en tubos de microcentrífuga eppendorfMR de 0.5 mi por pipeta y se almacenaron a -80°C para el análisis de niveles totales de colesterol y triglicéridos .

Recolección de plasma. En los días 0, 7, 14 y 21 durante una prueba OGTT, se recolectaron muestras de sangre de las ratas en cada punto de tiempo (0, 15, 30, 60, 90 y 120 minutos) en tubos que contienen heparina con litio (BD Biosciences, EUA) por pellizco de cola y se mantuvieron en hielo. Las muestras entonces se centrifugaron a 4°C para separación de plasma y los sobrenadantes de plasma se transfirieron en tubos de eppendorfMR de 0.5 mi por pipeta y se almacenaron a -80 °C para el análisis de niveles de insulina .

Recolección de orina. En los días 7 y 14 (24 horas después de la OGTT) se recolectaron muestras de orina para cada rata por el método de recolección de punto. Las muestras de orina se analizaron para glucosuria usando auto equipo de glucosa (Wako Chemicals EUA, Inc.) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Análisis de plasma, suero y orina. Como se menciona anteriormente, dejadas sin tratar, las ratas ZDF eventualmente exhibieron hiperlipidemia, hipertriglice- ridemia e hipercolesterolemia dando por resultado hipertensión moderada. Las muestras de suero se analizaron para concentraciones de triglicéridos y colesterol total usando equipos ako ( ako Chemicals EUA, Inc., Richmond, VA). Las muestras de orina se analizaron usando un auto equipo de glucosa (Wako Chemicals EUA, Inc., Richmond, VA). Los niveles de colesterol total se midieron en suero en los días 0, 7, 14 y 21 (ver figura 36) . El colesterol total en el día 0 a las 11 semanas de edad varió de 144-169 mg/dl en el ratas ZDF, o aproximadamente 2 veces mayor que en las ratas normales. Como se espera, los animales tratados con MG2b-57 tienen niveles de colesterol en suero significativamente mayores (198+/ -11 ml/dl) en el día 21, un incremento de 28+/-11 mg/dl desde la línea base, que fue similar a los niveles de colesterol en suero medidos en ratas tratadas con exenatida en el día 21 (195+/-11 ml/dl) . El colesterol en suero en animales tratados con 0.2 mg/kg 5F12G1 disminuyó durante el tratamiento y fue 145+/-26 mg/dl en el día 21, una disminución de 12+/-8 mg/dl de línea base. El colesterol en suero en grupos de tratamiento con 5F12G1 0.04 y 0.008 mg/kg se incrementó ligeramente a lo largo del estudio, y por el día 21 fue 162+/-18 y 167+/-7 mg/dl, respectivamente. El colesterol en suero en los grupos de tratamiento con sitagliptina 170+/ -14 mg/dl en el día 21. El tratamiento con 5F12G1 previno el desarrollo de hipercolesterolemia en ratas ZDF en comparación a controles negativos, y en el grupo de más alta dosis de 5F12G1 la diferencia fue estadísticamente significativa (p = 0.0156) .

Se midieron los niveles de triglicéridos en los días 0, 7, 14 y 21. Los niveles en suero de triglicéridos en el día 0 estuvieron entre 600 y 750 mg/dl, o aproximadamente tres veces mayor en ratas ZDF en comparación a ratas normales. No se observaron diferencias significativas en los niveles en suero de triglicéridos entre cualquiera de los grupos a todo lo largo del estudio.

El por ciento de hemoglobina glicosilada o glicada Alc(HbAlc) se midió en el día 21, y los valores medios se presentan en la figura 37. Se espera que los niveles de HBAlc en las ratas ZDF fa/fa se incrementen conforme el animal llega a ser hiperglicémico con la edad. Como se espera, por el día 21, se detectaron porcentajes significativamente mayores de HbAlc en animales tratados con MG2b-57 (8.8+/-0.7%), y se detectaron porcentajes similares de HbAlc en los grupos de tratamiento con exenatida (7.9 +/-0.8%) y sitagliptina (8.8+/-0.4%) se detectó un porciento significativamente menor de HbAlc en todos los grupos de dosis de 5F12G1, con el porcentaje a 6.3+/ -0.5% para el grupo con alta dosis de 5F12G1 y cantidades ligeramente mayores para grupos de menor dosis. La diferencia en porciento de HbAlc entre la alta dosis de 5F12G1 y animales de control negativo fue -2.58+/-0.85, y fue estadísticamente significativo (p = 0.0103). Estos resultados fueron consistentes con los menores niveles de glucosa en sangre que se detectan en ratas tratadas con 5F12G1, y sugirieron que 5F12G1 ofrece mejor protección contra HbAlc incrementada en las ratas ZDF fa/fa que ya sea exenatida o sitagliptina .

Se espera que las ratas ZDF fa/fa tengan niveles incrementados de glucosa en la orina conforme progresa el estudio. Puesto que las ratas desarrollan diabetes tipo 2, los niveles incrementados de glucosa en sangre dan por resultado eventualmente aparición de glucosa en exceso la orina. Se midieron los niveles de glucosa en la orina en el día 7 y 14 , y los resultados del días 14 se presentan en la figura 38. En el día 14, se observaron diferencias significativas, con los niveles más altos de glucosa detectados en la orina en ratas tratadas con MG2b-57 (98+/-14 mg/dL) , y glucosa elevada en orina también se detectó en ratas tratadas con exenatida y sitagliptina. Todos los grupos tratados con 5F12G1 a 0.2, 0.04 y 0.008 mg/kg (31+/-2, 49+/-6, y 54+/-11 mg/dL, respectivamente) tuvieron niveles significativamente menores de glucosa en la orina en comparación con MG2b-57, exenatida y sitagliptina. Estos resultados confirmaron adicionalmente que el tratamiento con 5F12G1 previno el desarrollo de hiperglucemia en las ratas.

Se realizaron mediciones de presión sanguínea usando un monitor de presión sanguínea y software de adquisición de datos. Las mediciones se realizaron en los días 0, 7, 14 y 21 al colocar la rata en un restrictor especializado durante aproximadamente 10 a 15 minutos antes del monitoreo de la presión sanguínea, con una almohadilla calentadora para controlar la temperatura. La manga de oclusión entonces se deslizó a la base de la cola, seguida por la manga de sensor de VPR (registro de presión en volumen) . El sensor VPR utilizó un transductor de presión diferencial para medir de manera no invasiva el volumen de sangre en la cola, y determinó la presión sanguínea sistólica, la presión sanguínea diastólica y la frecuencia cardíaca. Se tomaron cinco lecturas por rata y los datos se presentaron como un promedio.

La presión sanguínea sistólica, diastólica y la frecuencia cardiaca se monitorizaron en los días 0, 7, 14 y 21, y los datos se presentan en las Figuras 39, 40 y 41. Como se espera, en el día 0, no se observaron diferencias significativas entre los grupos en mediciones de presión sanguínea sistólica, diastólica y frecuencia cardíaca (figuras 39A, 40A y 41A) . Todos los animales que reciben dosis de 5F12G1 se observaron en el 21 (ver figuras 39B, 40B y 41B) que tienen mediciones de presión sanguínea sistólica, diastólica y frecuencia cardíaca que están por abajo del grupo de control, MG2b-57. El tratamiento con 5F12G1 dio por resultado menor presión sanguínea sistólica y diastólica y también menor frecuencia cardíaca en los ratas ZDF fa/fa, probablemente a través de la prevención del comienzo de diabetes tipo 2. Específicamente, el tratamiento con 5F12G1 a la dosis más alta dio por resultado un incremento en la presión sanguínea sistólica de 0.12+/-4.4 mm de la línea base, en comparación al grupo de control negativo que tuvo un incremento de 25.5+/-2.9, la diferencia que es estadísticamente significativa (p = 0.0004).

Estudio de pinza hiperinsulinémica-euglucémica . La norma de oro para investigar y cuantificar la resistencia a insulina es la pinza hiperinsulinémica-euglicemica, llamada así debido a que mide la cantidad de glucosa necesaria para compensar un nivel incrementado de insulina sin provocar hipoglucemia . Después de 21 días de tratamiento, los animales en los sub-grupos secundarios (N = 4 por tratamiento) que no se sometieron a prueba anterior se ayunaron durante la noche y se realizó un estudio de pinza hiperinsulinémica-euglicámica de 120 minutos en animales en los sub-grupos secundarios. Los animales se anestesiaron y mantuvieron a todo lo largo del procedimiento bajo anestesia de isoflurano. La vena saferosa y arteria femoral se cateterizaron. El catéter de la vena saferosa se usó para dar por infusión insulina humana (HumalinMR R, Eli Lilly, Indianapolis , IN) y solución de glucosa al 20%. El catéter de la arteria femoral se usó para recolectar muestras de sangre y monitoreo de los niveles de glucosa en sangre arterial. Al inicio del estudio de pinza, se dio por infusión insulina a una velocidad constante de 8 mU/kg/minuto . A fin de compensar la caída resultante en los niveles en sangre de glucosa de la infusión de insulina, se dio por infusión una solución de glucosa al 20% a velocidad variable, ajustada cada 10 minutos, para mantener un nivel objetivo de glucosa en sangre. Se midieron los niveles de glucosa en sangre arterial antes de la infusión a t = -120, -90, -30, y 0 minutos y entonces a cada 10 minutos durante 120 minutos (t = 120) , usando un medidor de glucosa (Accu-ChekMR, Roche Diagnóstico) . La velocidad de infusión de glucosa (GIR) durante la prueba determinó la sensibilidad a insulina. Si se requirió una alta GIR para compensar la infusión de insulina, entonces se consideró al animal sensible a insulina. Si se requirió una baja GIR, el animal se consideró resistente a la acción de insulina.

La velocidad de infusión de glucosa (GIR) la AUC-GIR y la glucosa de sangre arterial se midieron durante el estudio de pinza hiperinsulinémica-euglucémica y los datos para la AUC-GIR se presentan en la figura 42. Como se espera, las ratas tratadas con el control negativo, MG2b-57, fueron resistentes a insulina y tuvieron una baja AUC-GIR. Los animales tratados con 5F12G1 a 0.2 y 0.04 mg/kg tuvieron una AUC-GIR significativamente mayor, indicando qúe el tratamiento ha conservado la sensibilidad a insulina en estos animales después de 21 días. La AUC-GIR para grupos tratados con exenatida y sitagliptina fueron similares al grupo de tratamiento de alta dosis de 5F12G1. El tratamiento con 5F12G1 durante 21 días conservó la sensibilidad a insulina en las ratas ZDF fa/fa.

Análisis de datos.- Se presentan datos como la media ± error estándar (SEM) obtenidos de Microsoft Excel o Graph Pad Prism versión 5.00 para Windows (Graph Pad Software, San Diego, California, EUA) . Los valores p se calcularon usando el análisis de prueba t en el software Graph Pad PrismMR. Las diferencias entre los grupos se consideraron significativas a P <0.05.

El cambio medio en glucosa en sangre en ayuno (mg/dl) , colesterol en suero (mg/dL) y presión sanguínea sistólica (mm de Hg) desde la línea base (día 0) al día 21 se comparó entre los grupos de alta dosis (5F12G1, 0.2 mg/kg) y de control negativo (MG2b-57, 0.2 mg/kg) usando un análisis de covarianza para ajustar los niveles de línea base. El porcentaje medio de HbAlc en las ratas de alta dosis (5F12G1, 0.2 mg/kg) se comparó al porcentaje medio de HbAlc para ratas de control negativo ( G2b-57, 0.2 mg/kg) usando una prueba t de dos muestras independiente de varianzas desigual, se usó un nivel de significación de a = 0.05 para todas las pruebas, y todos los análisis se llevaron a cabo usando software estadístico de SAS (vs 9.2, Cary, Carolina del Norte, EUA) .

En conjunto, la administración de 5F12G1 a diferentes dosis fue bien tolerada y no se observaron efectos tóxicos.

La administración de 5F12G1 a 0.2 y 0.04 mg/kg diariamente durante 21 días a ratas ZDF fa/fa previno el desarrollo de resistencia a insulina, y control glicémico mantenido como se mide por OGTT, secreción de insulina, niveles de glucosa en sangre y HbAlc. Los animales tratados con MG2b-57, sitagliptina y exenatida tuvieron todos deterioro significativo de los parámetros anteriores. El tratamiento con 5F12G1 también impidió incrementos en la presión sanguínea, frecuencia cardíaco, niveles de triglicéridos y colesterol en comparación a los otros grupos de tratamiento.

Ejemplo 11 Secuencia de anticuerpo anti-BKB2R Este ejemplo describe la secuenciación del anticuerpo anti-BKB2R monoclonal murino, 5F12G1. El ARN total de 5F12G1 de hibridoma se extrajo usando un equipo R Aeasy"11 de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Qiagen, Valencia, CA) . El ADNc se sintetizó por una modificación del método descrito en las instrucciones para los equipos 5'-RACEMR (equipo SMART RACE cDNA, Clontech, Mountain View, CA) , usando transcriptasa inversa de M LV.

Se realizó 5 '-RACE PCR como se describe (Clontech S ART RACEMR kit) usando uno de los siguientes como el cebador específico de RACE: M0CG12F0R (CTC AAT TTT CTT GTC CAC CTT GGT GC) (SEQ ID NO: 61) para IgGl de ratón, IgG2a, M0CG2bF0R (CTC AAG TTT TTT GTC CAC CGT GGT GC) (SEQ ID NO: 62) para IgG2b de ratón, M0CG3F0R (CTC GAT TCT CTT GAT CAA CTC AGT CT) (SEQ ID NO: 63) para IgG3 de ratón, MOCMFOR (TGG AAT GGG CAC ATG CAG ATC TCT) (SEQ ID NO: 64) para IgM, CKMOsp (CTC ATT CCT GTT GAA GCT CTT GAG AAT GGG) (SEQ ID NO: 65) para kappa de ratón, CLIFORsp (ACA CTC AGC ACG GGA CAA ACT CTT CTC CAC AGT) (SEQ ID NO: 66) para Lambda 1 ratón, CL2FORsp (ACA CTC TGC AGG AGA CAG ACT CTT TTC CAC AGT) (SEQ ID NO: 67), y CL4F0Rsp (ACA CTC AGC ACG GGA CAA ACT CTT CTC CAC ATG) (SEQ ID NO: 68). (A Bradbury, Cloning Hybridoma cDNA by RACE, Antibody Engineering 2- Edición, 2010) .

El ADNc se secuenció de ambos extremos usando tecnología de terminación de cadena normal, así como se clonó en pCR-Topo2.1 usando el equipo de clonación Topo TA (Life Technologies) . Los clones que contienen el ADNc se secuenciaron usando M13rev (TCACACAGGAAACAGCTATGA) (SEQ ID NO: 69) y cebadores T7-directos (TAATACGACTCACTATAGG) (SEQ ID NO: 70) .

Las secuencias resultantes fueron el dominio de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina 5F12G1 murina que codificación para el conjunto de secuencias expuestas en SEQ ID NO: 49, y el dominio de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina 5F12G1 murina que codifica para el conjunto de secuencias expuestas en SEQ ID NO: 50. La secuencia de aminoácidos, traducida, deducida para el dominio de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina 5F12G1 murina se expone en SEQ ID NO: 1, y la secuencia de aminoácidos, traducida, deducida para el dominio de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina 5F12G1 murina se expone en SEQ ID NO : 2.

El mAb, 5F12G1 de hibridoma murino, que se une específicamente al BKB2R humano y ejerció un efecto agonista, como se describe en la presente, entonces se humanizó para obtener un anticuerpo monoclonal anti-BKB2R que evitaría las potenciales reacciones inmunitarias humanas ( inmunogenicidad) contra el anticuerpo monoclonal de ratón, para permitir múltiples inyecciones y/o uso a largó plazo de los anticuerpos en humanos .

El proceso de humanización de anticuerpos sé logró al insertar los segmentos codificadores de la región determinante de complementariedad (CDR) de ratón, apropiados, en respuesta a las propiedades deseadas de unión, en una "estructura" de anticuerpo humano. Tres regiones CDR de ratón en la cadena pesada (SEC ID NOS: 43 -45) y tres regiones CDR en la cadena ligera (SEQ ID NOS: 46-48) del anticuerpo se identificaron usando el método de Kabat (Kabat, EA, et al. (1991) ) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No . 91-3242) y se injertaron en las regiones de estructura, donadoras, humanos VH y VL. El planteamiento de injerto de CDR se describió primero para humanización de un anticuerpo de ratón (Queen, et al. Proc Nati Acad Sci EUA. Diciembre de (1989); 86 (24) : 10029-33) y se revisó recientemente por Tsurushita y Vasquez (2004) y Almagro y Fransson (2008) (Tsurushita N, et al., J" Immunol Methods. Diciembre del 2004 ; 295 ( 1-2 ) : 9- 19 ; Almagro JC, y Fransson J. Front Biosci. (2008) 13:1619-33).

Para determinar la secuencia del gen de anticuerpo humano que puede aceptar mejor las CDR de ratón y aún permitir la unión al epítopo, se analizaron las regiones FV circundantes en la secuencia de anticuerpo monoclonal 5F12G1 de ratón, y se usó un método de mejor ajuste para seleccionar la secuencia génica humana donadora más apropiada usando metodología patentada proporcionada por Panorama Research Inc. (Sunnyvale, California, EUA) y LakePharma, Inc. (Belmont, California, EUA).

Brevemente, se usaron secuencias menos variables de anticuerpo humano que fueron línea germinal o cercanas a línea germinal. Las secuencias de VH humanas que se relacionaron a los genes de línea terminal VH3-33, VH3-73, VH3-7, entre otros, proporcionaron las mejores correspondencias. Las secuencias de VL que se relacionaron a los genes de línea germinal VK2-28, VK2-30, entre otros, proporcionaron las mejores correspondencias. Varios modelos 3D de la Fv del anticuerpo objetivo se construyeron usando combinaciones de dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada para producir modelos. Algunas de las consideraciones que se usaron para elegir la estructura fueron que las plantillas humanas correspondieron a las longitudes de CDR y estructuras canónicas con aquellas previstas de la secuencia de 5F12G1 de ratón. Se identificaron posiciones de aminoácido en las regiones menos variables que difirieron entre murina y humana y que pueden haber influenciado a la unión al antígeno. Que ciertos genes de anticuerpo exhibieran alto uso de las estructuras menos variables en el repertorio de anticuerpos humanos fue un factor positivo para la selección, como lo que la buena conversión en posiciones menos variables estructuralmente menos significativas con relación a otras elecciones de línea germinal .

Las optimizaciones de humanización patentadas realizadas por Panorama Research Inc. (Sunnyvale, California, EUA) produjeron los dominios de región variable de cadena pesada (Hl, H2) , y ligera (Ll, L2) de inmunoglobulina, anti-BKB2R, humanizados, expuestos en el listado de secuencias como SEQ ID NOS: 3-4 y 8-9, respectivamente. Las optimizaciones de humanización patentadas realizadas por LakePharma, Inc. (Belmont, California, EUA) produjeron los dominios de región variable de cadena pesada inmunoglobulina anti-BKB2R (H37, H38, H39) , y ligera light (L37, L38, L39) de inmunoglobulina, anti-BKB2R humanizados expuestos en el listado de secuencias como SEQ ID NOS : 5-7 y 10-12, respectivamente .

Cinco versiones diferentes de cadenas ligeras humanizadas y cinco versiones de cadenas pesadas humanizadas se crearon de esta manera de ambos casos anteriores, en base al clon 5F12G2 de ratón, y las secuencias de polinucleótidos codificadoras y de aminoácidos, incluyendo las CDR, regiones V, y cadenas H y L, se exponen en el Listado de Secuencia como SEQ ID NOS:3-48, 51-60, y 75-92.

Ejemplo 12 Expresión y Purificación de Anticuerpos Monoclonales Humanizados Anti-BKB2R de Humano Hl, H2, Ll, L2 Las secuencias codificadoras, respectivamente, SEQ ID NO: 51, 52, 56 y 57, para las secuencias de región variable humanizadas Hl (SEQ ID NO:3), H2 (SEQ ID N0:4), Ll (SEQ ID NO:8) y L2 (SEQ ID NO:9), se elaboraron de forma sintética en construcciones de ADN (BioBasic, Markham Ontario) . Las secuencias de ADN para las cadenas pesadas Hl y H2 se clonaron cada una en un vector pDH2 en cuadro con una región Fe de IgG2 humana. De manera similar, las cadenas ligeras humanizadas Ll y L2 se clonaron cada una en un vector pDH2 en cuadro con la región constante kappa humana. Varias combinaciones de VL, VH humanizad o VL y VH quimérica (planteamiento de mezcla de correspondencia) se transfectaron de manera transciente en al menos 100 mi de células 293-derivadas (por ejemplo, 293F) usando protocolo estándar de transfección a base de lípidos. Específicamente, el vector que codifica para la secuencia Hl se co-transfectó con el vector que codifica para Ll , o el vector que codifica para L2, o la VKL de 5F12G1 de ratón original. De manera similar, el vector que codifica para H2 se co-transfectó con vectores que codifican para Ll o L2, y el vector que codifica para VH de 5F12G1 de ratón original se co-transfectó con Ll , o L2. Se cultivaron células HEK-293 en cultivo .de suspensión usando medio libre de suero Gibco 1 s Freestyle. Los cultivos se incubaron a 37°C en una atmósfera qe comprende 5% de C02 y 95% de aire. Se produjeron las expresiones de prueba de 100 mL usando matraces Corning Erlenmeyer, desechables, estériles, de 500 mL, y las expresiones de 500 mL y un litro se llevaron a cabo usando matraces desechables estériles Corning de 3 litros. Los cultivos de suspensión se colocaron en un agitador de plataforma con una velocidad de agitación de 100 rpm. Cuando la densidad celular alcanzó 1.5xl06 células por mL, los cultivos se transfectaron con el par seleccionado de plásmidos. Se usó polietilenoimina (PEI, 25 kDa linear, Poliplus Transíections) como el reactivo de transfección en una relación de 4:1 con ADN de plásmido. Un total de 1 mg de plásmido se usó para cada litro de cultivo. Las células transíectadas se incubaron durante 120 horas y el sobrenadante se recolectó y filtro estéril usando unidades de filtro al vacío de 0.2 micrones (Nalgene) . El sobrenadante estéril se almacenó a 2-8°C antes de la purificación.

La IgG recombinante presente en el sobrenadante de cultivo se purificó usando cromatografía de afinidad. Para cada expresión de 100 mL, 1 mL de proteína G-Sefarosa, flujo rápido (GE Bioscience) se puso en equilibrio usando PBS pH 7.4 y se adicionó directamente al sobrenadante. La IgG se absorbió por lote a 2-8°C durante 16 horas con agitación moderada. Después de la incubación, la mezcla de resina/sobrenadante se transfirió a una botella centrífuga cónica y la resina se dejó asentar. El sobrenadante (flujo de paso) se decantó y la resina se transfirió a una columna desechable (GE) . La resina se lavó con 20 volúmenes de PBS usando flujo por gravedad. La IgG se eluyó en tres á cinco fracciones de 1 mL cada una usando glicina 0.1 M pH 3.0. Se adicionó un volumen de Tris 1 M pH 9.0 a cada tubo de fracción para neutralizar el pH del amortiguador de glicina. Las muestras de elución y el flujo de paso se analizaron por SDS-PAGE (tinción con Coomassie) y se mezclaron las fracciones que contienen la IgG. Los productos eluidos mezclados se diafiltraron y concentraron en PBS usando ultrafiltros centrífugos (Millipore Centricon, 50 kDa MWCO) . Si es posible los productos finales se esterilizaron en filtro micrométrico usando unidades de filtro de jeringa de 0.2 micrones (Millipore PES) . La concentración de proteína de cada muestra se determinó usando absorbancia de A2eo y un coeficiente de extinción de 1.4. Las muestras se almacenaron a 2-8°C antes del envío. Las condiciones usadas para los cultivos de 500 mL y 1 litro fueron idénticas a aquellas resumidas anteriormente con la excepción de que se usaron 4 mL de resina para capturar la IgG. Los pares de plásmido se expresaron como se resumen en la Tabla 7.

Tabla 7. Cadenas H+L Humanizadas Un gel de SDS-PAGE no reducido de las varias preparaciones de IgG purificadas produjo un electroforetograma que demuestra el peso esperado de un anticuerpo tipo IgG intacto, confirmando de esta manera la expresión y purificación apropiada del anticuerpo.

H37, H38, H39, L37, L38, L39 Una estrategia similar a aquella descrita anteriormente se usó para generar combinaciones de cadena pesada H37 humanizada con L37, L38, L39; H38 con L37, L38 o L39, y H39 con L37, L38 o L39. Las secuencias de VH y VL se clonaron en cuadro en vectores pcDNA 3.3 que codifican para la región constante de cadena pesada o ligera de IgG2 humana. Los plásmidos que contienen las secuencias de cadena pesada y cadena ligera de longitud completa se transfectaron en células CHO con reactivo de transfección Lafectine (LakePharma número de catálogo 4502030) . Los sobrenadantes se recolectaron durante cuatro días después de la transfección, y se determinaron los niveles de IgG total en los sobrenadantes usando Fe ELISA (LakePharma número de catálogo 2001002) . Los sobrenadantes de las transfecciones transcientes de CHO se purificaron usando un ligando de proteína A en cuentas MabSelect SuReMR (GE Healthcare) . Los anticuerpos capturados por las cuentas se eluyeron por ácido acético pH 3.0, y se almacenaron en Tris 200 mM pH 7.5, 0.4% de acetato de sodio y NaCl 150 mM. Las preparaciones de anticuerpo contuvieron proteínas aisladas (aproximadamente 0.3-0.85 mg) a concentraciones de aproximadamente 0.9 a 1.7 mg/ML, y los análisis por SDS-PAGE demostraron por esas mayores de 95%, con los pesos moleculares esperados de cadena pesada (50 kDa) y ligera (25 kDa) .

Ejemplo 13 Avidez y Afinidad de Unión Las proteínas que corresponden a todas las combinaciones de anticuerpos humanizados o quiméricos (VH y VL de 5F12G1 en estructura de IgG2 humana) se probaron para la unión al péptido de epítopo derivado de BKB2R humano, SE ID NO: 73.

Se usó una plataforma ForteBio (Menlo Park, CA, EUA) OctetMR para analizar las afinidades de unión y características de unión de los anticuerpos monoclonales humanizados del epítopo peptídico (SEQ ID NO: 73) y se comparó al 5F12G1 monoclonal de ratón original. Esta plataforma empleó tecnología libre de marca para medir las interacciones biomoleculares por análisis óptico del patrón de interferencia de luz blanca reflejada de dos superficies: una capa de proteína inmovilizada en la punta de biosensor y una capa de referencia interna. Cualquier cambio en el número de moléculas unidas a la punta de biosensor provocó un cambio en el patrón de interferencia que se midió en tiempo real. Se monitorizaron la especificidad de unión y las constantes de asociación y disociación.

Para el estudio Octet, se analizaron anticuerpos por titulación cinética de los anticuerpos. Los anticuerpos se prepararon en amortiguador cinético (solución salina amortiguada con fosfato 0.001 M (NaCl 0.0138 M; KCI - 0.00027 M) ; pH 7.4, a 25°C, 0.1 mg/ml BSA, 0.002% Tween y 0.005% Azida Sódica) seguido por diluciones en serie 1:2.

Preparación de Sensor: se revistieron biosensores de estreptavidina (ForteBio Inc, Menlo Park, CA) por incubación en una solución que contiene un péptido (Seq ID No. 2 -PEG-biotina) (Biosyn, Lewisville, Texas) a 50 ug/ml (300 segundos/1000 rpm de agitación) . Placas de medio volumen de 96 concavidades se usaron para la prueba. Por concavidad se colocaron 90 µ? de muestra. Los sensores se dejaron poner en equilibrio a la línea base en amortiguador cinético (60 segundos/1000 rpm) . Los sensores entonces se colocaron en las varias diluciones de anticuerpo para permitir la unión (asociación) a la sonda durante 500 segundos/1000 rpm, y se tomaron las mediciones. Los sensores entonces se movieron a amortiguador cinético sin anticuerpo para disociación (500 segundos/1000 rpm), y se tomaron las mediciones. El software del sistema Octet calculó las constantes cinéticas para la constante de asociación/constante de disociación/afinidad.

El anticuerpo 5F12G1 de ratón de control (muestra No. ab 404) se probó a una concentración inicial de 3000 nM (450 pg/ml) seguido por diluciones 1:2. Para los anticuerpos monoclonales humanizados de prueba, la concentración más alta usada fue 500 nM seguido por diluciones 1:2. Cada concentración se probó dos veces. La HC y LC representan las secuencias de VH y VL de 5F12G1 original de ratón. Los datos de ejemplo se presentan en las Tablas 8 y 9.

Tabla 8. Datos de Unión de Anticuerpo Tabla 9. Datos de Unión a Anticuerpo Los anticuerpos monoclonales humanizados con cadena ligera L2 acoplada con la cadena pesada Hl o H2 demostraron más fuerte unión (KD menor) que el anticuerpo monoclonal de ratón original. También, las combinaciones de H38/L38, H38/L39 y H39/L37 parecieron demostrar más ' fuerte unión (KD menor) anticuerpo monoclonal de ratón original.

Ejemplo 14 Prueba de bioactividad y Anticuerpos Monoclonales Humanizados Este ejemplo describe la evaluación de mAb 5F12G1 de ratón y sus doce clones humanizados en ratas grasosas Diabéticas Zucker (ZDF fa/fa) para los efectos en la sensibilidad a insulina en animales. Las Ratas Diabéticas Zucker desarrollan síntomas similares a la diabetes tipo 2 y en general son genéticamente resistentes a la insulina. Las ratas Zucker demuestran incrementos excesivos en los niveles de glucosa en sangre durante OGTT. Por lo tanto, la rata Zucker es un buen modelo para probar la capacidad del anticuerpo monoclonal para incrementar la sensibilidad a insulina, especialmente en una OGTT.

Ratas ZDF machos fa/fa se obtuvieron de Charles River (Kingston, ON) . En el arribo, las ratas eran de diez semanas de edad. Las ratas se alojaron individualmente por jaula en un cuarto con un fotociclo de dos horas de luz y 12 horas de 12 horas de oscuridad y una temperatura ambiente de 70-72°F (21.11-22.22°C) y se alimentaron con dieta regular de roedor y agua ad libitum. Después de siete días de aclimatación las ratas se agruparon en catorce grupos de tres ratas por grupo (Tabla 10) .

Tabla 10. Grupos ZDF fa/fa Prueba de Tolerancia Oral a Glucosa.- Se realizó una prueba de tolerancia oral a glucosa (OGTT) en ratas ayunadas durante la noche (16 horas) . Las ratas recibieron mAb humanizado subcutáneamente administrados, mAb 5F12G1 de ratón (Control positivo) y PBS (control con vehículo) a una dosis de 0.2 mg/kg de peso corporal, treinta minutos antes de la administración de glucosa. Se preparó D-Glucosa en agua destilada y se administró oralmente^ a 2g/kg de peso corporal . Los niveles en sangre de glucosa se midieron antes de la administración de los mAb humanizados, 5F12G1 o vehículo (t = -30 minutos) y justo antes de la carga de glucosa (0 minutos) , y en los puntos de tiempo de 30, 60, 90 y 120 minutos, usando el medidor de glucosa Accu-chekMR.

Resultados y Análisis de Datos: Los datos (Figura 34) se presentaron como la media ± error estándar (SEM) obtenida de Microsoft Excel o GraphPad Prism versión 5.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego California EUA).

La administración individual de mAb anti-BKB2R derivó de 5F12G1, y de 5F12G1 (0.2 mg/kg), disminuyó el área bajo la curva (AUC) de concentración de glucosa en sangre después de la administración oral de glucosa en ratas ZDF fa/fa en comparación al control con vehículo, excepto para mAb Ll/Hl. La disminución en la AUC de glucosa en sangre fue mayor con H38/L39 seguido en orden de efecto por H37/L38, L2/H2, H38/L38, H37/L37, H38/L38, H39/I37, H39/L39, H37/L37, H39/L38, H37/L39, y Ll/Hl. mAb 5F12G1 también mostró mejora en la tolerancia a glucosa.

Las varias modalidades descritas anteriormente se pueden combinar para proporcionar modalidades adiciónales. Todas las patentes de los Estados Unidos, Publicaciones de Solicitudes de Patente de los Estados unidos, solicitudes de patente de los Estados Unidos, patentes extranjeras, solicitudes de patentes extranjeras y publicaciones no de patente, referida en esta especificación y/o listadas en la hoja de datos de la solicitud, se incorporan en la presente como referencia, en su totalidad. Los aspectos de las modalidades se pueden modificar, si es necesario para emplear conceptos de las varias patentes, solicitudes y publicaciones para proporcionar modalidades aún adicionales.

Estos y otros cambios se pueden hacer las modalidades en vista de la descripción detallada anterior. En general, en las siguientes reivindicaciones, los términos usados no se deben considerar que limiten las reivindicaciones a las modalidades específicas descritas en la especificación y en las reivindicaciones, pero se debe considerar que incluye todas las posibles modalidades junto con el alance completo de equivalentes a las cuales están facultadas las reivindicaciones. Por consiguiente, las reivindicaciones no se limitan por la descripción.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a un receptor de bradiquinina B2 (BKB2R) de humano, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 ; y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de VLCDRl, VLCDR2 y VLCDR3 , caracterizado porque al menos uno de: (1) (A) las secuencias de aminoácidos de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 comprenden, respectivamente, las secuencias de aminoácidos expuestas en (i) SEQ ID N0S:19, 20 y 21, (ii) SEQ ID NOS:22, 23 y 24, o (iii) SEQ ID NOS:25, 26 ynd 27; y (B) las secuencias de aminoácidos de VLCDRl, VLCDR2 y VLCDR3 comprenden, respectivamente, las secuencias de aminoácidos expuestas en (i) SEQ ID NOS:34, 35 y 36, (ii) SEQ ID NOS: 37, 38 y 39, O (Üi) SEQ ID NOS:40, 41 y 42; O (2) (A) las secuencias de aminoácidos de VHCDR1 , VHCDR2 y VHCDR3 comprenden, respectivamente, las secuencias de aminoácidos expuestas en (i) SEQ ID NOS: 13, 14 y 15 , o (ii) SEQ ID NOS: 16, 17 y 18; y (B) las secuencias de aminoácidos de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 comprenden, respectivamente, las secuencias de aminoácidos expuestas en (i) SEQ ID NOS:28, 29 y 30, o (ii) SEQ ID NOS: 31, 32 y 33 .

2. El anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de aminoácidos de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 expuestas en SEQ ID NOS: 22, 23 y 24, respectivamente, y la región variable de cadena ligera comprende las secuencias de aminoácidos de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 expuestas en SEQ ID NOS: 40, 41 y 42, respectivamente.

3. El anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 6.

4. El anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 12.

5. El anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS : 8-12.

6. El anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque además comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 3 -7.

7. El anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS : 3-7.

8. El anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque además comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 8-12.

9. El anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de aminoácidos de VHCDR1 , VHCDR2 y VHCDR3 expuestas en SEQ ID NOS: 19, 20 y 21, respectivamente, y la región variable de cadena ligera comprenden las secuencias de aminoácidos de VLCDR1 , VLCDR2 y VLCDR3 expuestas en SEQ ID NOS: 37, 38 y 39, respectivamente.

10. El anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 5.

11. El anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 11.

12. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a un receptor de bradiquinina B2 (BKB2R) de humano, caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuestas en SEQ ID N0:1; y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de VLCDR3 expuesta en SEQ ID NO: 2.

13. El anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 12, caracterizado porque el anticuerpo está humanizado .

14. El anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS : 8-12.

15. El anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque además comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 3-7.

16. El anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque además comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 3-7.

17. El anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizado porque además comprende un región constante de cadena ligera kappa de inmunoglpbulina humana que comprende la secuencia de aminoácidos expuésta en ya sea SEQ ID NO: 77 o SEQ ID NO: 81.

18. El anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizado porque además comprende una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina IgG2 humana que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en ya sea SEQ ID NO: 75 o SEQ ID NO: 79.

19. El anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende ya sea uno o ambos de: (a) una cadena pesada de inmunoglobulina IgG2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 83-87; y (b) una cadena ligera kappa de inmunoglobulina que comprende la' secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 88-92.

20. El anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo de cadena simple, un ScFv, un anticuerpo univalente que carece de una región de bisagra, y un minicuerpo.

21. El anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16 caracterizado porque es un fragmento Fab o Fab 1.

22. El anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento F(ab')2.

23. El anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un anticuerpo entero.

24. El anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un dominio Fe de IgG humana.

25. Una composición, caracterizada porque comprende un portador fisiológicamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24.

26. Un método para tratar un paciente con diabetes y que tiene una condición asociada con actividad de BKB2R que se selecciona de hiperglicemia, hipercolesterolemia , hipertensión, enfermedad cardiovascular, retinopatía, nefropatía, neuropatía y resistencia a insulina, caracterizado porque comprende administrar al paciente la composición de conformidad con la reivindicación 25, y tratar de este modo la condición asociada con la actividad de BKB2R.

27. Un método para tratar un paciente con enfermedad cardiovascular, caracterizado porque comprende administrar al paciente la composición de conformidad con la reivindicación 25, tratando de este modo la enfermedad cardiovascular .

28. Un método para tratar un paciente con hipercolesterolemia, caracterizado porque comprende administrar al paciente la composición de conformidad con la reivindicación 25, tratando de este modo la hipercolesterolemia.

29. Un método para tratar un paciente con hipertensión, caracterizado porque comprende administrar al paciente la composición de conformidad con la reivindicación 25, tratando de este modo la hipertensión.

30. Un método para tratar o prevenir un cáncer que es sensible a inhibición de GSK3-p, caracterizado porque comprende administrar, a un paciente que tiene el cáncer, la composición de conformidad con la reivindicación 25, y tratar o prevenir de este modo el cáncer.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de leucemia de linaje mezclado, cáncer esofágico, cáncer ovárico, cáncer de próstata, cáncer de riñon, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer de estómago y cáncer pancreático.

32. Un método para inhibir la proliferación o supervivencia de una célula de cáncer, en donde la célula de cáncer expresa de manera operable una proteína de BKB2R en una ruta de señalización de GSK3-B, caracterizado porque comprende pone en contacto las células de cáncer con la composición de conformidad con la reivindicación 25.

33. Un método para inhibir la señalización por una ruta de señalización de GSK3-B en una célula que expresa de manera operable una proteína de BKB2R, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24.

34. Un método para alterar al menos uno de (i) exposición a radiación (ii) infección de influenza, y (iii) ataque en una célula que expresa BKB2R, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con el anticuerpo anti-BKB2R, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para l unión específica del anticuerpo a la célula.