CN103339150A - 抗缓激肽b2受体(bkb2r)单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明通常涉及抗缓激肽B2受体(BKB2R)抗体以及制备和使用它们的方法。具体地，本文所述的具有可变区序列的抗BKB2R抗体对于改变BKB2R和/或GSK-3β信号通路的一种或多种，用于治疗诸如癌症、糖尿病、心血管障碍及其他病症的疾病、障碍和病症是有用的。

Description

抗缓激肽B2受体(BKB2R)单克隆抗体
序列表
本申请相关的序列表以文本格式提供来代替纸件，并在此通过引用并入说明书。包含序列表的文本文件的名称是260065_401PC_SEQUENCE_LISTING.txt。该文本文件为大约73KB，于2011年12月1日创建并通过EFS-Web电子提交。
背景
技术领域
目前公开的发明实施方案通常涉及抗缓激肽B2受体(BKB2R)抗体以及制备和使用这种抗体的方法。具体地，本文所述的方法对于治疗与受BKB2R活性影响的生物信号转导通路相关的诸如糖尿病和癌症的疾病和障碍以及相关病症是有用的。
相关领域描述
糖尿病有两种普遍公认的形式。1型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)的患者产生的胰岛素很少或不产生胰岛素，胰岛素是调控葡萄糖利用的激素。2型糖尿病或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)患者通常具有与非糖尿病个体相比相同甚至升高的血浆胰岛素水平；然而，这些患者对主要的胰岛素敏感性组织(肌肉、肝脏和脂肪组织)中胰岛素对葡萄糖和脂类代谢的刺激作用产生了抵抗，并且血浆胰岛素水平虽然升高，还是不足以克服明显的胰岛素抵抗。
目前对2型DM的药物治疗包括注射胰岛素和旨在降低血糖水平的口服剂。当前可利用的口服剂包括(i)磺酰脲类药物，其通过提高胰腺β细胞对葡萄糖的敏感性而作用，由此增加响应给定葡萄糖负荷的胰岛素分泌；(ii)双胍类药物，其提高葡萄糖清除率并抑制肝脏葡萄糖排出；(iii)噻唑烷二酮类药物，其通过与细胞核过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR，参见，例如Spiegelman,1998Diabetes47:507-514;Schoonjans et al,1997Curr.Opin.Lipidol.8:159-166;Staels et al,1997Biochimie79:95-99)相互作用而提高外周胰岛素敏感性；(iv)瑞格列奈(repaglinide)，其通过与ATP依赖性钾通道相互作用而增加胰岛素分泌；以及(v)阿卡波糖(acarbose)，其减少肠道吸收碳水化合物。注射剂包括二甲双胍，格列奈类药物(glinides)，α-葡糖苷酶阻断剂，GLP-1和GLP-1类似物，以及DPP-IV抑制剂。然而，这些常规抗糖尿病剂或抗高血糖剂的使用可能与多种副作用相关，最终患者可能对这些药剂的作用形成抵抗或者糖尿病向药剂不再有效的更晚期的状态发展。
在监测糖尿病治疗中，HbA1c值(血红蛋白B链的非酶糖基化产物)是异常重要的。由于其形成本质上依赖于血糖水平和红细胞的寿命，从“血糖记忆”的意义上而言，HbA1c值反映了之前4-12周的平均血糖水平。通过更加集中的糖尿病治疗，在长时间内HbA1c水平受到良好控制的糖尿病患者(即样品中的总血红蛋白<6.5%)明显更好地预防了糖尿病微血管病变。可利用的糖尿病治疗在HbA1c水平上可给予糖尿病个体平均提高大约1.0-1.5%。在所有糖尿病患者中，HbA1C水平的这种减少不足以带给他们<7.0%，优选<6.5%，且更优选<6%HbA1c的期望目标范围。
在细胞水平，可能是晚发型糖尿病特征的退化表型包括，例如受损的胰岛素分泌，降低的ATP合成和增加的活性氧水平。研究已表明，2型DM可能以某些相关障碍为先导或与某些相关障碍相关。例如，据估计，美国有四千万个体患有糖耐量受损(IGT)。葡萄糖负荷之后，与未受影响的个体相比，IGT患者中的循环葡萄糖浓度上升到更高的水平且更慢地回落到基线水平。每年较小百分比的IGT个体(5-10%)向非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)发展。糖尿病的这种形式——2型DM，与胰腺β细胞释放胰岛素减少和响应胰岛素的终末器官减少相关。糖尿病的其他症状以及在糖尿病之前的病症或与糖尿病相关的病症包括肥胖、血管病变、外周和感觉神经病病变以及失明。
显然目前没有药物疗法纠正2型DM中潜在的生化缺陷。这些目前可利用的任何治疗都不能改善2型DM中的全部生理异常，如受损的胰岛素分泌，胰岛素抵抗和/或过多的肝葡萄糖排出。此外，使用这些药剂的治疗失败是常见的，这样多药物疗法经常是必要的。
哺乳动物中的细胞表面缓激肽B2受体(BKB2R)(如人BKB2R，SEQ ID NO:71；鼠BKB2R，SEQ ID NO:72)介导激肽，并且是G蛋白偶联受体(Leeb-Lundberg et al,2005Pharmacol Rev57:27-77;Belanger et al,2009Peptides30:777-787)。BKB2R受体对缓激肽(BK)和胰激肽具有高亲和力，并且负责介导大部分已知的BK生理作用。已知BK和其他激肽具有多种器官保护作用和心脏保护作用。通过BKB2R，BK辅助释放器官保护分子，如一氧化氮、前列腺素和组织型纤溶酶原激活物。BK还引发葡萄糖转运蛋白GLUT4从细胞质易位至细胞表面质膜。因此，BKB2R的激动作用被认为对糖尿病及其相关病症，以及诸如高血压、肥大、动脉粥样硬化和缺血性心脏病的心血管病症具有潜在的疗效。BKB2R激活作用还被认为是有益的，作为其最重要的作用之一是下游抑制糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)，糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是与很多疾病相关联的主要的药物靶点(Meijer et al,2004Trends Pharmacol Sci25:9,471-80)。
BKB2R的激动剂——胰激肽激活该受体并依次引起GSK-3β的下游抑制性磷酸化作用(对第9位的丝氨酸残基)，导致增强糖原合成(Stambolic et al,1994Biochem J303,701-704)。BKB2R受体的激活还促进一氧化氮(NO)的释放，导致血管舒张并增强胰岛素递送至组织；以及引起葡萄糖转运蛋白-4(GLUT4)易位至细胞表面，这有利于增加细胞对葡萄糖的摄取(Kishi et al,1998Diabetes47:4,550-8)。
GSK-3β位于细胞内的细胞质之中，因而很难接近细胞外抗体。GSK-3β是调控多种信号通路(如Wnt通路，胰岛素通路)的组成型活化激酶，并且GSK-3β还通过磷酸化作用调控多种转录因子(Doble et al,2003J Cell Sci116:1175-86)。因此，GSK-3β被认为是几种细胞功能和发育功能(如新陈代谢、细胞周期、细胞运动、细胞因子表达和细胞凋亡)的主要中心介质(“主开关”)。GSK-3β活性通过多种机制受到严格控制，所述多种机制包括(i)导致GSK-3β抑制性磷酸化作用的受体介导的信号转导，(ii)在可利用GSK-3β作用的这种底物之前，在某些情况下需要通过GSK-3β靶蛋白上的GSK-3β底物结合识别序列的其他激酶“引发磷酸化作用”，(iii)与大量确定的多蛋白复合物的特异性GSK-3β分子间的相互作用，以及(iv)调控GSK-3β亚细胞定位。考虑到GSK-3β在细胞中多种生物学过程中的中心性，破坏GSK-3β的调控(如假设过多的GSK-3β活性具有有害的后果)与多种疾病和障碍相关(Doble et al,2003J Cell Sci116:1175-86)。
尽管近期的关注点已集中于GSK-3β，并且制药业提名GSK-3β作为药物开发的靶点，但有效的GSK-3β抑制剂的开发大多未成功，部分是由于其作为多种细胞内通路介体的中心作用而无法获取选择性影响期望的生物效应的具体工具。明显地，需要精细的方法以选择性方式来开发GSK-3β对特定生物信号转导的调控，包括在临床相关的背景下。在此公开的本发明解决了这种需求并提供了其他相关的优势。
发明简述
根据本文所述发明的某些实施方案，提供了能与人缓激肽B2受体(BKB2R)相结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：含有VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列的重链可变区；以及含有VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列的轻链可变区，其中其具有以下的至少一种情况：(1)(A)所述VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列分别包含(i)SEQ ID NOS:19、20和21，(ii)SEQ IDNOS:22、23和24，或(iii)SEQ ID NOS:25、26和27所示的氨基酸序列；以及(B)所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列分别包含(i)SEQ ID NOS:34、35和36，(ii)SEQ ID NOS:37、38和39，或(iii)SEQ ID NOS:40、41和42所示的氨基酸序列；或者(2)(A)所述VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列分别包含(i)SEQ IDNOS:13、14和15，或(ii)SEQ ID NOS:16、17和18所示的氨基酸序列；以及(B)所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列分别包含(i)SEQ ID NOS:28、29和30，或(ii)SEQ ID NOS:31、32和33所示的氨基酸序列。
在某些进一步的实施方案中，所述重链可变区包含分别如SEQ IDNOS:22、23和24所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列，以及所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NOS:40、41和42所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列。在某些其他进一步的实施方案中，所述重链可变区包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。在某些其他的实施方案中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述轻链可变区包含SEQ IDNOS:8-12中任一项所示的氨基酸序列。在某些进一步的实施中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变域，所述重链可变域包含与SEQ ID NOS:3-7中任一项所示的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述重链可变区包含SEQ ID NOS:3-7中任一项所示的氨基酸序列。在某些进一步的实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含轻链可变域，所述轻链可变域包含与SEQ IDNOS:8-12中任一项所示的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述重链可变区包含分别如SEQ ID NOS:19、20和21所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列，以及所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NOS:37、38和39所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列。在某些进一步的实施方案中，所述重链可变区包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。在某些其他的进一步实施方案中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，提供了能与人缓激肽B2受体(BKB2R)相结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区；以及含有SEQ ID NO:2所示的VLCDR3氨基酸序列的轻链可变区。
在以上所述分离的抗体或其抗原结合片段的某些实施方案中，所述抗体是人源化的。在某些进一步的实施方案中，所轻链可变域包含SEQ ID NOS:8-12中任一项所示的氨基酸序列。在某些其他进一步的实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变域，所述重链可变域包含与SEQ ID NOS:3-7中任一项所示的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变域，所述重链可变域包含SEQ IDNOS:3-7中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，以上所述分离的抗体或其抗原结合片段中的任意一种包含人免疫球蛋白κ轻链恒定区，所述人免疫球蛋白κ轻链恒定区包含SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，以上所述分离的抗体或其抗原结合片段中的任意一种包含人免疫球蛋白IgG2重链恒定区，所述人免疫球蛋白IgG2重链恒定区包含SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列。
在以上所述主题的某些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含以下的一种或两种：(a)包含SEQ ID NOS:83-87中任一项所示的氨基酸序列的免疫球蛋白IgG2重链；和(b)包含SEQ IDNOS:88-92中任一项所示的氨基酸序列的免疫球蛋白κ轻链。在某些实施方案中，以上所述分离的抗体或其抗原结合片段中的任意一种包括选自单链抗体、ScFv、缺乏铰链区的单价抗体和微抗体的抗体。在某些实施方案中，以上所述分离的抗体或其抗原结合片段中的任意一种包括Fab或Fab’片段。在某些实施方案中，以上所述分离的抗体或其抗原结合片段中的任意一种是F(ab’)2片段。在某些实施方案中，以上所述分离的抗体的任意一种是全抗体。在某些实施方案中，以上所述分离的抗体或其抗原结合片段中的任意一种包含人IgG Fc结构域。
在某些实施方案中，提供了包含生理可接受的载体和治疗有效量的上述分离的抗体或其抗原结合片段的任意一种的组合物。
在某些实施方案中，提供了用于治疗患有糖尿病或与BKB2R活性相关的病症的患者的方法，所述方法包括给予患者包含生理可接受的载体和治疗有效量的上述分离的抗体或其抗原结合片段的任意一种的组合物，从而治疗与BKB2R活性相关的病症，其中所述与BKB2R活性相关的病症选自高血糖症、高胆固醇血症、高血压、心血管疾病、视网膜病变、肾病、神经病变和胰岛素抵抗。在某些实施方案中，提供了用于治疗患有心血管疾病的患者的方法，其包括给予患者包含生理可接受的载体和治疗有效量的上述分离的抗体或其抗原结合片段的任意一种的组合物，从而治疗所述心血管疾病。在某些实施方案中，提供了用于治疗患有高胆固醇血症的患者的方法，其包括给予患者包含生理可接受的载体和治疗有效量的上述分离的抗体或其抗原结合片段的任意一种的组合物，从而治疗所述高胆固醇血症。在某些实施方案中，提供了用于治疗患有高血压的患者的方法，其包括给予患者包含生理可接受的载体和治疗有效量的上述分离的抗体或其抗原结合片段的任意一种的组合物，从而治疗所述高血压。
在某些实施方案中，提供了用于治疗或预防对GSK3-β抑制敏感的癌症的方法，其包括给予患有所述癌症的患者包含生理可接受的载体和治疗有效量的上述分离的抗体或其抗原结合片段的任意一种的组合物，从而治疗或预防所述癌症。在某些实施方案中，所述癌症选自混合谱系白血病、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、结肠癌、肝癌、胃癌以及胰腺癌。在某些实施方案中，提供了抑制癌细胞增殖或存活的方法，其中所述癌细胞可操作地表达GSK3-B信号通路中的BKB2R蛋白，所述方法包括用包含生理可接受的载体和治疗有效量的上述分离的抗体或其抗原结合片段的任意一种的组合物接触所述癌细胞。
在某些实施方案中，提供了通过GSK3-B信号通路抑制可操作地表达BKB2R蛋白的细胞中的信号转导的方法，其包括用上述抗体或其抗原结合片段的任意一种接触所述细胞。在某些实施方案中，提供了用于改变表达BKB2R的细胞的(i)辐射照射，(ii)流感感染，和(iii)卒中中的至少一种的方法，其包括在足以使以上所述的抗体或其抗原结合片段中的任意一种与所述细胞特异性结合的条件和时间下，用所述抗体接触所述细胞。
参考以下详述和附图之后，本文所述发明的这些和其他方面以及实施方案将是显而易见的。本说明书中所引用的和/或申请信息表中所列的全部美国专利、美国专利申请公开文本、美国专利申请、国外专利、国外专利申请和非专利出版物通过引用以其整体并入本文，如同每一篇文献都单独地并入一样。如果必要的话，可以改变本发明的方面和实施方案，以利用各种专利、申请和出版物的概念来提供更进一步的实施方案。
附图简述
图1是显示通过抗BKB2R单克隆抗体体内诱导GSK-3β抑制的柱状图。该图显示通过ELISA测定的3T3小鼠细胞中GSK-3β在丝氨酸-9处的磷酸化水平，作为GSK-3β抑制的指示。
图2是显示通过抗BKB2R单克隆抗体诱导GSK-3β抑制的柱状图。该图显示通过ELISA测定的WI-38人细胞中GSK-3β在丝氨酸-9处的磷酸化水平，作为GSK-3β抑制的指示。
图3是急性单克隆抗体剂量应答图。该图示出输注之后，全部四组指定的抗BKB2R单克隆抗体组的平均数动脉压响应。每组的数据点以平均值±标准误差表示。
图4是描述体内给予1、2和3小时之后，抗BKB2R单克隆抗体对血压影响的图。该图示出每组的平均值±SEM(相对5F12G1的基线，*p<0.05)。
图5示出通过qRT-PCR测定的Tamiflu
Figure BDA00003538139100081
减少A549细胞中的流感病毒复制。该图示出相对荧光的增强，这反映与流感病毒M节段的扩增部分成正比的Taqman
Figure BDA00003538139100082
探针渐增的位移和裂解。具有较低Tamiflu浓度的样品在较早的Ct(循环阈值)时荧光增强，表明更高的病毒滴度。
图6示出1500荧光单位的荧光阈值时Ct(y-轴)相对Tamiflu
Figure BDA00003538139100083
浓度(x-轴)的实际图和趋势图。Tamiflu
Figure BDA00003538139100084
以剂量依赖的方式降低病毒滴度。
图7示出通过qRT-PCR测定的证实抗BKB2R单克隆抗体5F12G1(“G1”)减少A549细胞中的流感病毒复制的图。该图示出相对荧光的增强，这反映与流感病毒M节段的扩增部分成正比的Taqman
Figure BDA00003538139100085
探针渐增的位移和裂解。具有较低G1浓度的样品在较早的Ct(循环阈值)时荧光增强，表明更高的病毒滴度。
图8示出1500荧光单位的荧光阈值时Ct(y-轴)相对抗BKB2R单克隆抗体5F12G1(“G1”)浓度(x-轴)的实际图和趋势图。
图9示出对照细胞活力的百分比和MDCK细胞中抗BKB2R单克隆抗体G1相对A/Brisbane/59/07的细胞病变效应(CPE)的百分比降低。
图10示出对照细胞活力的百分比和MDCK细胞中抗BKB2R单克隆抗体G7相对A/Brisbane/59/07的CPE的百分比降低。
图11示出对照细胞活力的百分比和MDCK细胞中抗BKB2R单克隆抗体H9相对A/Brisbane/59/07的CPE的百分比降低。
图12示出对照细胞活力的百分比和MDCK细胞中抗BKB2R单克隆抗体H3相对A/Brisbane/59/07的CPE的百分比降低。
图13示出对照细胞活力的百分比和MDCK细胞中Tamiflu相对A/Brisbane/59/07的CPE的百分比降低。
图14示出对照细胞活力的百分比和MDCK细胞中抗BKB2R单克隆抗体G1相对流感病毒(CA/07/09)的CPE的百分比降低。
图15示出对照细胞活力的百分比和MDCK细胞中抗BKB2R单克隆抗体G7相对流感病毒(CA/07/09)的CPE的百分比降低。
图16示出对照细胞活力的百分比和MDCK细胞中抗BKB2R单克隆抗体H9相对流感病毒(CA/07/09)的CPE的百分比降低。
图17示出对照细胞活力的百分比和MDCK细胞中抗BKB2R单克隆抗体H3相对流感病毒(CA/07/09)的CPE的百分比降低。
图18示出对照细胞活力的百分比和MDCK细胞中Tamiflu
Figure BDA00003538139100092
相对流感病毒(CA/07/09)的CPE百分比降低。
图19示出用不同浓度的抗BKB2R单克隆抗体1F2G7和5F12G1处理时相对于对照百分比的BxPC-3细胞活力。
图20示出用不同浓度的抗BKB2R单克隆抗体1F2G7和5F12G1处理时相对于对照百分比的MV-4-11细胞活力。
图21示出用不同浓度的抗BKB2R单克隆抗体1F2G7和5F12G1处理时相对于对照百分比的Hep G2细胞活力。
图22示出用不同浓度的抗BKB2R单克隆抗体1F2G7和5F12G1处理时相对于对照百分比的RS4;11细胞活力。
图23示出用不同浓度的抗BKB2R单克隆抗体1F2G7和5F12G1处理时相对于对照百分比的HT-29细胞活力。
图24示出用不同浓度的抗BKB2R单克隆抗体1F2G7和5F12G1处理时相对于对照百分比的NUGC-4细胞活力。
图25示出用不同浓度的抗BKB2R单克隆抗体1F2G7和5F12G1处理时作为对照百分比的PC-3细胞活力。
图26示出高胰岛素-正常血糖钳夹试验中，与载体对照相比，单克隆抗BKB2R抗体F512G1的葡萄糖输注率。
图27示出高胰岛素-正常血糖钳夹试验中，与载体对照相比，单克隆抗BKB2R抗体F512G1的葡萄糖输注率AUC。
图28A示出口服葡萄糖耐量试验期间，用不同剂量的单克隆抗体5F12G1处理的Zucker大鼠的血糖水平。
图28B示出口服葡萄糖耐量试验期间，用不同剂量的单克隆抗体5F12G1处理的Zucker大鼠的血糖水平的曲线下面积(AUC)。
图29A示出口服葡萄糖耐量试验期间，用不同剂量的单克隆抗体5F12G1处理的Zucker大鼠的血清胰岛素水平。
图29B示出口服葡萄糖耐量试验期间，用不同剂量的单克隆抗体5F12G1处理的Zucker大鼠的血清胰岛素水平的曲线下面积(AUC)。
图30A示出口服葡萄糖耐量试验期间，用不同剂量的单克隆抗体5F12G1处理的DIO小鼠的血糖水平。
图30B示出口服葡萄糖耐量试验期间，用不同剂量的单克隆抗体5F12G1处理的DIO小鼠的血糖水平的曲线下面积(AUC)。
图31示出口服葡萄糖耐量试验期间，用不同剂量的单克隆抗体5F12G1处理的DIO小鼠的血清胰岛素水平。
图32A示出口服葡萄糖耐量试验期间，第0天ZDF fa/fa大鼠的血糖水平，图32B显示口服葡萄糖耐量试验期间，用不同剂量的单克隆抗体5F12G1、艾塞那肽(exenatide)、西他列汀(sitagliptin)或MG2b-57处理之后第21天，ZDF fa/fa大鼠的血糖水平。
图33示出口服葡萄糖耐量试验期间，用不同剂量的5F12G1、艾塞那肽、西他列汀或MG2b-57处理之后第21天，ZDF fa/fa大鼠的血糖水平的曲线下面积(AUC)。
图34A示出口服葡萄糖耐量试验期间，第0天ZDF fa/fa大鼠的血清胰岛素水平，图34B显示口服葡萄糖耐量试验期间，用不同剂量的5F12G1、艾塞那肽、西他列汀或MG2b-57处理之后第21天，ZDFfa/fa大鼠的血清胰岛素水平。
图35示出用不同剂量的单克隆抗体5F12G1、艾塞那肽、西他列汀或MG2b-57处理之后第0至21天，ZDF fa/fa大鼠的空腹血糖水平。
图36示出用不同剂量的5F12G1、艾塞那肽、西他列汀或MG2b-57处理之后第21天，ZDF fa/fa大鼠的血清胆固醇水平。
图37示出用不同剂量的单克隆抗体5F12G1、艾塞那肽、西他列汀或MG2b-57处理之后第21天，ZDF fa/fa大鼠的百分比糖基化血红蛋白(HbA1c)水平。
图38示出用不同剂量的5F12G1、艾塞那肽、西他列汀或MG2b-57处理之后第14天，ZDF fa/fa大鼠的尿液中检测的葡萄糖水平。
图39A示出ZDF fa/fa大鼠第0天的收缩压，图39B显示用不同剂量的5F12G1、艾塞那肽、西他列汀或MG2b-57处理之后第21天的收缩压。
图40A示出ZDF fa/fa大鼠第0天的舒张压，图40B显示用不同剂量的5F12G1、艾塞那肽、西他列汀或MG2b-57处理之后第21天的舒张压。
图41A示出ZDF fa/fa大鼠第0天的心率，图41B显示用不同剂量的5F12G1、艾塞那肽、西他列汀或MG2b-57处理之后第21天的心率。
图42示出高胰岛素-正常血糖钳夹试验期间，用不同剂量的5F12G1、艾塞那肽、西他列汀或MG2b-57处理之后第21天，ZDF fa/fa大鼠中葡萄糖输注率的曲线下面积(AUC)。
图43总结了来自口服葡萄糖耐量试验的曲线下面积(AUC)数据，所述葡萄糖耐量试验监测与载体对照相比，口服给予ZDF fa/fa大鼠葡萄糖之后，单次给予5F12G1或人源化抗BKB2R单克隆抗体后的血糖浓度。
序列简要说明
SEQ ID NO:1是5F12G1抗BKB2R抗体的鼠重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是5F12G1抗BKB2R抗体的鼠轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是人源化抗BKB2R抗体的H1重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是人源化抗BKB2R抗体的H2重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是人源化抗BKB2R抗体的H37重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是人源化抗BKB2R抗体的H38重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是人源化抗BKB2R抗体的H39重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8是人源化抗BKB2R抗体的L1轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是人源化抗BKB2R抗体的L2轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10是人源化抗BKB2R抗体的L37轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11是人源化抗BKB2R抗体的L38轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12是人源化抗BKB2R抗体的L39轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13是人源化抗BKB2R抗体的H1VHCDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14是人源化抗BKB2R抗体的H1VHCDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15是人源化抗BKB2R抗体的H1VHCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16是人源化抗BKB2R抗体的H2VHCDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17是人源化抗BKB2R抗体的H2VHCDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18是人源化抗BKB2R抗体的H2VHCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19是人源化抗BKB2R抗体的H37VHCDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20是人源化抗BKB2R抗体的H37VHCDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21是人源化抗BKB2R抗体的H37VHCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22是人源化抗BKB2R抗体的H38VHCDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23是人源化抗BKB2R抗体的H38VHCDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24是人源化抗BKB2R抗体的H38VHCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25是人源化抗BKB2R抗体的H39VHCDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:26是人源化抗BKB2R抗体的H39VHCDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27是人源化抗BKB2R抗体的H39VHCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28是人源化抗BKB2R抗体的L1VLCDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29是人源化抗BKB2R抗体的L1VLCDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:30是人源化抗BKB2R抗体的L1VLCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31是人源化抗BKB2R抗体的L2VLCDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:32是人源化抗BKB2R抗体的L2VLCDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:33是人源化抗BKB2R抗体的L2VLCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:34是人源化抗BKB2R抗体的L37VLCDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:35是人源化抗BKB2R抗体的L37VLCDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:36是人源化抗BKB2R抗体的L37VLCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:37是人源化抗BKB2R抗体的L38VLCDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:38是人源化抗BKB2R抗体的L38VLCDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:39是人源化抗BKB2R抗体的L38VLCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:40是人源化抗BKB2R抗体的L39VLCDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:41是人源化抗BKB2R抗体的L39VLCDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:42是人源化抗BKB2R抗体的L39VLCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:43是鼠5F12G1抗BKB2R抗体的VHCDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:44是鼠5F12G1抗BKB2R抗体的VHCDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:45是鼠5F12G1抗BKB2R抗体的VHCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:46是鼠5F12G1抗BKB2R抗体的VLCDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:47是鼠5F12G1抗BKB2R抗体的VLCDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:48是鼠5F12G1抗BKB2R抗体的VLCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:49是编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多核苷酸，即编码5F12G1抗BKB2R抗体的鼠重链可变区的多核苷酸。
SEQ ID NO:50是编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多核苷酸，即编码5F12G1抗体的鼠轻链可变区的多核苷酸。
SEQ ID NO:51是编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸，即编码抗BKB2R抗体的H1人源化重链可变区的多核苷酸。
SEQ ID NO:52是编码SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多核苷酸，即编码抗BKB2R抗体的H2人源化重链可变区的多核苷酸。
SEQ ID NO:53是编码SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多核苷酸，即编码抗BKB2R抗体的H37人源化重链可变区的多核苷酸。
SEQ ID NO:54是编码SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多核苷酸，即编码抗BKB2R抗体的H38人源化重链可变区的多核苷酸。
SEQ ID NO:55是编码SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多核苷酸，即编码抗BKB2R抗体的H39人源化重链可变区的多核苷酸。
SEQ ID NO:56是编码SEQ ID NO:8的氨基酸序列的多核苷酸，即编码抗BKB2R抗体的L1人源化轻链可变区的多核苷酸。
SEQ ID NO:57是编码SEQ ID NO:9的氨基酸序列的多核苷酸，即编码抗BKB2R抗体的L2人源化轻链可变区的多核苷酸。
SEQ ID NO:58是编码SEQ ID NO:10的氨基酸序列的多核苷酸，即编码抗BKB2R抗体的L37人源化轻链可变区的多核苷酸。
SEQ ID NO:59是编码SEQ ID NO:11的氨基酸序列的多核苷酸，即编码抗BKB2R抗体的L38人源化轻链可变区的多核苷酸。
SEQ ID NO:60是编码SEQ ID NO:12的氨基酸序列的多核苷酸，即编码抗BKB2R抗体的L39人源化轻链可变区的多核苷酸。
SEQ ID NOS:61-68是寡核苷酸RACE引物序列。
SEQ ID NOS:69-70是寡核苷酸测序引物序列。
SEQ ID NO:71显示人BKB2R氨基酸序列。
SEQ ID NO:72显示小鼠BKB2R氨基酸序列。
SEQ ID NO:73显示免疫原性的人BKB2R肽片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:74显示免疫原性的小鼠BKB2R肽片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:75是人免疫球蛋白IgG2重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:76是编码SEQ ID NO:75的氨基酸序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:77是人免疫球蛋白κ轻链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:78是编码SEQ ID NO:77的氨基酸序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:79是人免疫球蛋白IgG2重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:80是编码SEQ ID NO:79的氨基酸序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:81是人疫球蛋白κ轻链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:82是编码SEQ ID NO:81的氨基酸序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:83是包括人IgG2恒定区的人源化H1重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:84是包括人IgG2恒定区的人源化H2重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:85是包括人IgG2恒定区的人源化H37重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:86是包括人IgG2恒定区的人源化H38重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:87是包括人IgG2恒定区的人源化H39重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:88是包括人Igκ恒定区的人源化L1轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:89是包括人Igκ恒定区的人源化L2轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:90是包括人Igκ恒定区的人源化L37轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:91是包括人Igκ恒定区的人源化L38轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:92是包括人Igκ恒定区的人源化L39轻链的氨基酸序列。
发明详述
根据本文公开的某些发明实施方案，提供了涉及特异性抗BKB2R单克隆抗体的组合物和方法，特别是涉及具有本文所述的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3序列和/或VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3序列和/或VH和/或VL序列的人源化抗BKB2R抗体的组合物和方法。同样如本文所述，当在此公开的抗BKB2R抗体与表达BKB2R的细胞相接触时，所述抗体意外地显示针对BKB2R的激动剂活性，并且令人惊奇地导致GSK-3β的抑制。
本文所述的抗BKB2R抗体将获得在许多情况下的应用，其中BKB2R活性和/或BKB2R活性起作用的生物学信号通路的干预和改变(例如诸如以可检测的活性水平在统计学上的显著增加或降低)可能是期望的。例如，根据非限制性理论，许多临床定义的病症似乎是由于过度的GSK-3β活性造成的，以致由在此所述的抗BKB2R抗体意外表现出的GSK-3β抑制性特性可以有利地被利用。因而，本文还提供了用于治疗与BKB2R活性相关的病症的组合物和方法，所述与BKB2R活性相关的病症可包括但无需限于糖尿病和/或心血管障碍，视网膜病变，神经病变或肾病伴随的风险，癌症，心血管疾病，以及许多相关病症，包括高血压、血糖浓度过高、血清胆固醇浓度升高、病毒感染、卒中、辐射照射或其他疾病。
BKB2R代表已知的内源性细胞信号通路(PI3K/Akt)的起点，所述细胞信号通路(PI3K/Akt)导致通过Ser9磷酸化抑制GSK-3β。该通路被内源性用来辅助调节血糖水平，并且很可能也是在神经发生的过程中，当酶组织激肽释放酶1(KLK1)剪切激肽原时，释放激活BKB2R受体的激肽(缓激肽和胰激肽(Lys-缓激肽))。通常，KLK-1产生胰激肽，一种寿命短(体内～30秒)但有效的BKB2受体激动剂(Kd～0.89nM)。通过胰激肽结合触发BKB2R G蛋白偶联受体通过PI3K/Akt通路诱导下游的信号转导事件，导致GSK-3β在色氨酸-9处的磷酸化和失活。抑制GSK-3β依次可以增加糖原合成，并且还可以减少Tau磷酸化、细胞凋亡和炎症。并不希望受理论限制，认为本发明的某些本文所述的实施方案的抗BKB2R抗体通过结合BKB2受体上非常特异的蛋白序列限定的结构而模拟该通路，这导致BKB2R激活并最终下游抑制GSK-3β。进一步根据非限制性理论，认为本发明的单克隆抗体特异性靶向BKB2R受体上的细胞外表位，使得所述抗体起激动性作用。通过这种特异性，本文所述的抗BKB2R抗体消除了之前其他GSK-3β抑制剂中所见到的“脱靶”结合的可能性，有利地降低了由于之前的抑制剂的作用机制特异性较低而造成的相关副作用的风险。
与BKB2R活性相关的病症包括许多疾病和障碍，其中涉及非正常调控的GSK-3β活性。非限制的示意性实例包括：
(a)辐射照射——在一些情况下，抑制GSK-3β可通过Bax信号通路(诱导细胞凋亡的p53依赖型通路)阻止细胞凋亡，因此可预防暴露于有害水平的全身辐射之后骨髓细胞和可能的胃肠粘膜组织受损。已对激肽释放酶-1(KLK-1)治疗辐射照射进行了研究，尽管尚未知晓所报道的KLK-1对辐射存活的作用是通过胰激肽对BKB2R受体的作用介导，还是通过激活生长因子介导，或者这两者的组合；
(b)II型糖尿病和高血压——2型糖尿病主要的共同病理之一是高血压，其可延迟向组织递送胰岛素，但是可通过BKB2R受体激活而降低；
(c)癌症——混合谱系白血病(MLL)细胞对GSK-3β抑制敏感。这种关系有点违反直觉，因为GSK-3β通常激活凋亡通路。该机制并不涉及抗体依赖型细胞毒性(ADCC)且不需要独特的癌症特异性生物标记物(BKB2受体在细胞中广泛表达)。相反地，细胞死亡仅发生在对GSK-3β抑制敏感的那些细胞中。已提议将GSK-3β作为许多不同癌症中潜在的下游靶标，所述癌症如食管癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、结肠癌、肝癌、胃癌和胰腺癌；
(d)心肌梗死和卒中——已知KLK-1保护并改善缺血之后的心脏恢复。这些效果在临床前研究中通过利用BKB2受体拮抗剂(如HOE140)而被阻断；以及
(e)流感——已证实GSK-3β在甲型流感RNA病毒中是病毒侵入宿主细胞所必需的因子。抑制或阻断GSK-3β会阻止复制从而减弱感染。
因而，本发明的实施方案涉及与能BKB2R(广泛表达的细胞表面G蛋白偶联受体蛋白，如SEQ ID NO:71)相结合的抗体，制备这种抗体的方法，以及利用这种抗体来改变(如以统计学上显著的方式增加或降低)表达BKB2R的细胞中BKB2R相关信号通路事件的方法，包括导致抑制GSK-3β的方法。本文所述的方法对于治疗与BKB2R活性相关的病症是有用的，所述与BKB2R活性相关的病症如糖尿病、癌症以及其他疾病、障碍和病症。示例性抗BKB2R抗体(包括人源化抗体)或其抗原结合片段或其互补决定区(CDR)的氨基酸序列，以SEQ IDNOS:1-48、75、77、79、81、83-92示出，并且由SEQ ID NOS:49-60、76、78、80、82所示的多核苷酸序列编码。
在某些实施方案中且根据非限制性理论，可以将本文所述的抗BKB2R抗体与表达BKB2R的细胞(包括体内或离体的细胞，或者体外分离的细胞)相接触来诱导或激活BKB2R相关的信号通路，包括在某些实施方案中来抑制GSK-3β。“分离的”细胞是已脱离其原始存在的自然环境的细胞，或者已在体外维持、繁殖或产生的这种细胞的后代。
因此在某些实施方案中，本发明提供了改变BKB2R通路活性的方法，其包括在足以使本文所述的抗BKB2R抗体与表达BKB2R的细胞特异性结合的条件和时间下，将所述细胞与所述抗体相接触，其中BKB2R通路的活性水平相对于未与抗BKB2R抗体相接触的细胞中存在的BKB2R通路活性水平被改变(如以统计学上显著的方式增加或降低，在某些优选实施方案中是增加)。
因而根据本文所述的某些实施方案，已明确考虑了这样的方法，通过该方法可以将这些和/或相关系统用于在表达BKB2R的细胞中确定或产生由BKB2R或BKB2R相关的信号通路的抗BKB2R抗体的激活或诱导，或者确定或产生由GSK-3β的抗BKB2R抗体的抑制。
测定BKB2R相关信号通路活性的标准在本文中进行了描述，并且是本领域内已知且本领域技术人员可理解的。生物信号转导的通路，包括与细胞分裂、细胞存活、凋亡、增殖和分化相关的那些通路，在某些情况下可被称为“生物信号转导通路”或“诱导型信号通路”，并且可包括参与控制细胞中这些和类似过程的细胞和细胞外分子成分间的暂时或稳定的连通或相互作用。取决于所关注的特定通路，可以基于领域公认的标准选择用于测定这种通路诱导的一个或多个合适的参数。
例如，对于与细胞复制或增殖相关的信号通路，可利用定量复制或增殖的各种已知的方法，包括，例如，通过增殖细胞将含氚胸腺嘧啶并入细胞DNA，监测细胞呼吸活性的可检测的(如荧光或比色)指示剂(例如代谢活性细胞中将四唑盐(黄色)3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)或3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(MTS)转化成甲臜染料(紫色))，或者细胞计数等。
类似地，在细胞生物学领域，已知通过许多已知的方法中的任何一种来评估细胞存活和测定凋亡的多种技术，所述评估细胞存活的方法包括通过显微镜、生化、分光光度法、光谱法、光散射、包括流式细胞计数和细胞荧光的细胞计数或其他技术(例如，诸如台盼蓝的活体染料、诸如碘化丙啶的DNA结合荧光团，代谢指示剂等)来测定活力，所述测定凋亡的方法，例如膜联蛋白V结合、DNA断裂分析、半胱天冬酶激活、标记物分析例如聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)等。
其他信号通路与特定细胞表型相关，例如基因表达的特异性诱导(如作为转录或翻译产物，或通过生物测定这样的产物，或作为细胞质因子的核定位而可检测的)，细胞内介体(如激活的激酶或磷酸酶，环核苷酸或生理活性的离子种类水平的改变，一种或多种特异性磷酸化底物的磷酸化程度水平的改变等)水平的改变(如统计学上显著增加或减少)，细胞周期谱的改变或细胞形态的改变等，这样可以易于鉴定对如本文所提供的特定刺激的细胞反应性，以确定特定细胞是否正在经历或已经历过BKB2R介导的事件或GSK-3β介导的事件或其他明确的信号通路介导的事件(例如，表达BKB2R的细胞诸如BKB2R-转染的CHO细胞系中的钙离子流分析，GSK-3β磷酸化(如丝氨酸-9的磷酸化)或GSK-3β活性抑制的分析，GSK-3β的ELISA测定，GSK-3β结合分析等)。
在某些实施方案中，如果期望确定个体或生物来源是否属于指征2型糖尿病的临床参数，可将本领域技术人员认可的2型糖尿病的标志和症状用于这样指定个体或生物来源，例如Gavin等(Diabetes Care22(suppl.1):S5-S19,1999,American Diabetes Association ExpertCommittee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus)及其引用的文献中提及的临床标志，或本领域已知的诊断2型糖尿病的其他方法。
在糖尿病和某些其他代谢性疾病或障碍中，一种或多种生化过程相对于其在无病或正常个体如合适的对照个体中存在的水平被改变(如以统计学上显著的方式增加或减少)或调节(如统计学上显著程度的上调或下调)，所述一种或多种生化过程可以是合成代谢或分解代谢(如分别位物质的组建或分解)。所述改变可能是由参与特定过程的任何一种生化反应中的底物、酶、辅助因子或任何其他成分的增加或减少造成的。例如，已描述了用于确定糖尿病的存在和表征糖尿病的一大类改变的线粒体功能指示剂(参见，如U.S.6,140,067)。
BKB2R相关的信号通路成分可包括由胰岛素诱导的信号转导通路中的成分，并且可以例如，通过测定胰岛素受体β(IR-β)的酪氨酸磷酸化的水平，和/或下游信号分子PKB/Akt的水平，和/或如本文所提供的可能是特定信号转导通路的成分的任何一种其他下游多肽的水平来评估。与BKB2R活性相关的病症还可包括诸如JNK-相关障碍(如癌症、心肌肥大、缺血、糖尿病、高血糖诱导的细胞凋亡、炎症、神经退行性疾病)的障碍，以及与不同信号转导通路相关的其他障碍，例如，癌症、自体免疫性疾病、细胞增殖性疾病、神经退行性疾病和传染病(参见，如Fukada et al.,2001J.Biol.Chem.276:25512;Tonks et al.,2001Curr.Opin.Cell Biol.13:182;Salmeen et al.,2000Mol.Cell6:1401;Huet al.,J.Neurochem.85:432-42(2003);及其中引用的参考文献)。
个体中出现的恶性病症是指个体中出现发育异常的、癌性的和/或转化的细胞，包括，例如赘生物、肿瘤、非接触抑制的或致肿瘤物转化的细胞等(如，诸如腺癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、燕麦细胞癌等的癌，诸如软骨肉瘤、骨肉瘤等的肉瘤)，这些都是本领域已知的，并且已建立了其诊断和分类标准(如Hanahan and Weinberg,2011Cell144:646;Hanahan and Weinberg2000Cell100:57;Cavallo et al.,2011Canc.Immunol.Immunother.60:319;Kyrigideis et al.,2010J.Carcinog.9:3)。在本发明考虑的优选实施方案中，例如，这样的癌细胞可以是混合谱系白血病、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、结肠癌、肝癌、胃癌以及胰腺癌的细胞。
抗体及其抗原结合片段
“抗体”是能够通过至少一个表位识别位点特异性结合靶标的免疫球蛋白分子，所述靶标如碳水化合物、多核苷酸、脂类、多肽等，所述表位识别位点位于所述免疫球蛋白分子的可变区(在此又被称为可变域)。本文所使用的术语“抗体”不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，还包括其片段（如单可变区抗体(dAb)，或其他已知的抗体片段如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv等）、单链(ScFv)、其合成变体、天然存在的变体、包含具有所需特异性的抗原结合片段的抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、以及包含所需特异性的抗原结合位点或片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其他改造或修饰的构型。通过基因融合构建的多价或多特异性片段的“双体(diabodies)”(WO94/13804;Holliger et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448,1993)同样是本文所考虑的抗体的特定形式。本文还包括了包含相连接的CH3结构域和scFv的微型抗体(minibodies)(Hu et al,Cancer Res.,56,3055-3061,1996;还参见，如Ward et al.,Nature341,544-546(1989);Bird et al,Science242,423-426,1988;Huston et al,PNAS USA,85,5879-5883,1988;PCT/US92/09965;WO94/13804;Holliger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448,1993;Reiter etal.,Nature Biotech14,1239-1245,1996;Hu et al,Cancer Res.56,3055-3061,1996)。还考虑的是纳米抗体(nanobodies)和大型抗体(maxibodies)(参见，如U.S.6,765,087;U.S.6,838,254;WO 06/079372;WO 2010/037402)。
本文所使用的术语“抗原结合片段”指包含能结合所关注抗原的免疫球蛋白重链和/或轻链的至少一个CDR的多肽片段，在本文所述的特别优选的实施方案中抗原是BKB2R受体。在这方面，本文所述抗体的抗原结合片段可包含来自能结合BKB2R的抗体的本文所示的VH和/或VL序列的一个、两个、三个、四个、五个或全部六个CDR。本文所述的BKB2R-特异性抗体的抗原结合片段能够与BKB2R相结合。在某些实施方案中，抗原结合片段的结合阻止或抑制BKB2R配体(如缓激肽(BK)、胰激肽(Lys-缓激肽))与BKB2R受体相结合，中断由配体与受体相结合导致的生物反应。在某些实施方案中，抗原结合片段特异性结合和/或抑制或调节人BKB2R的生物活性。
术语“抗原”指能够被诸如抗体的选择性结合因子结合，并且另外能够用于动物中来产生能结合该抗原表位的抗体的分子或分子的一部分。抗原可以具有一个或多个表位。
术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任何决定簇，优选多肽决定簇。表位是由抗体结合的抗原区。在某些实施方案中，表位决定簇包括诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基的分子的化学活性表面基团，并且在某些实施方案中，可具有特定的立体结构特征和/或特定的电荷特征。在某些实施方案中，当抗体优先识别其处于蛋白和/或大分子的复合混合物中的靶抗原时，认为该抗体特异性结合抗原。根据某些实施方案，当抗体-抗原结合的平衡解离常数小于或等于10-6M，或者小于或等于10-7M，或者小于或等于10-8M时，可认为抗体特异性结合抗原。在一些实施方案中，平衡解离常数可小于或等于10-9M或者小于或等于10-10M。
蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割IgG分子以产生几个片段，其中的两个片段(F(ab)片段)每个都包含含有完整的抗原结合位点共价异二聚体。酶，胃蛋白酶能切割IgG分子以提供几个片段，包括F(ab’)2片段，其包含两个抗原结合位点。在本发明的某些实施方案中使用的Fv片段可以通过优先水解切割IgM，偶尔水解切割IgG或IgA免疫球蛋白分子而产生。然而，Fv片段更通常是利用本领域内已知的重组技术得到。Fv片段包括非共价的VH::VL异二聚体，其包含保留天然抗体分子的大部分抗原识别和结合能力的抗原结合位点(Inbar et al.(1972)Proc.Nat.Acad.Sci.USA69:2659-2662;Hochman et al.(1976)Biochem15:2706-2710;和Ehrlich et al.(1980)Biochem19:4091-4096)。
在某些实施方案中，考虑了单链Fv或scFV抗体。例如，可按照本申请关于选择具有期望的特异性抗体的教导，利用标准分子生物学技术来制备κ抗体(Ill et al.,Prot.Eng.10:949-57(1997)；微型抗体(Martin et al.,EMBO J13:5305-9(1994)；双体(Holliger et al.,PNAS90:6444-8(1993))；或Janusins(Traunecker et al.,EMBO J.10:3655-59(1991)及Traunecker et al.Int.J.Cancer Suppl.7:51-52(1992))。在其他实施方案中，可制备包含本发明的配体的双特异性或嵌合抗体。例如，嵌合抗体可包含来自不同抗体的CDR和框架区，而双特异性抗体可被产生以通过一个结合结构域特异性结合BKB2R，并通过第二结合结构域特异性结合第二分子。这些抗体可通过重组分子生物学技术产生或可通过物理方法偶联在一起。
单链Fv(sFv)多肽是共价连接的VH::VL异二聚体，其由包含通过编码肽的接头连接的VH-和VL-编码基因的基因融合物表达。Hustonetal.(1988),Proc.Nat.Acad.Sci.USA85(16):5879-5883)。已描述了许多方法来辨别将来自抗体V区的天然聚合但是用化学分离的轻多肽链和重多肽链转化成sFv分子的化学结构，所述sFv分子将折叠成基本与抗原结合位点结构类似的立体结构。参见，如Huston等的美国专利号5,091,513和5,132,405；以及Ladner等的美国专利号4,946,778。
抗体的dAb片段由VH结构域组成(Ward et al.,Nature341,544-546(1989))。
在某些实施方案中，本文所公开的抗体(如BKB2R特异性抗体)为双体的形式。双体是多肽的多聚体，每一多肽包括包含免疫球蛋白轻链的结合区的第一结构域和包含免疫球蛋白重链的结合区的第二结构域，所述两个结构域被连接(如通过肽接头)但是不能相互联合形成抗原结合位点；抗原结合位点通过多聚体中的一条多肽的第一结构域与多聚体中另一多肽的第二结构域的联合形成(WO94/13804)。
如果使用双特异性抗体，可以是常规的双特异性抗体，其可以多种方法制备(Holliger and Winter,Current Opinion Biotechnol.4,446-449(1993))，例如化学制备或由混合的杂交瘤制备，或可以是以上提及的任何一种双特异性抗体片段。仅利用可变区而无需Fc区就可构建双体和scFv，潜在地降低引起免疫应答的可能性和严重程度，如在接受给予这种抗体的个体中的抗个体基因型反应。
双特异性双体，与双特异性全抗体相反，由于它们易于在大肠杆菌中构建和表达，同样可以是特别有用的。利用噬菌体展示技术(WO94/13804)，可易于从文库中选择适当结合特异性的双体(和许多其他多肽如抗体片段)。如果双体的一个臂保持不变，如具有针对抗原X的特异性，就可以制备其中另一个臂是变化的且选择适当特异性的抗体的文库。双特异性全抗体可通过旋钮成孔(knobs-into-holes)工程制备(Ridgeway et al,Protein Eng.,9,616-621,1996)。
在某些实施方案中，本文所述的抗体可以UniBody
Figure BDA00003538139100251
的形式提供。UniBody
Figure BDA00003538139100252
是去除铰链区的IgG4抗体(参见GenMab Utrecht,TheNetherlands；还参见，如US/2009/0226421)。该专有的抗体技术形成了稳定的较小的抗体形式，其具有比目前的小抗体形式预期更长的治疗窗。IgG4抗体被认为是惰性的，因而不与免疫系统相互作用。完全人IgG4抗体可通过消除抗体的铰链区来修饰，以获得相对于相应完整IgG4具有不同稳定性特征的半分子片段(GenMab,Utrecht)。均分IgG4分子仅在UniBody
Figure BDA00003538139100253
上留下一个可结合同源抗原(如疾病靶标)的区域，因而UniBody
Figure BDA00003538139100254
单价结合靶细胞上的唯一位点。对于某些癌细胞表面抗原，这种单价结合可能不如可在利用具有相同抗原特异性的双价抗体中观测到的那样刺激癌细胞生长，因而UniBody
Figure BDA00003538139100255
技术可为用常规抗体可能难以治疗的一些类型的癌症提供治疗选择。UniBody
Figure BDA00003538139100261
为常规IgG4抗体的大约一半大小。治疗一些形式的癌症时，这种小尺寸可能大有益处，其允许分子在较大的实体瘤上更好的分布并有力地增强效力。
在某些实施方案中，本发明的抗体可采用纳米抗体的形式。纳米抗体由单基因编码并且在几乎所有的原核和真核宿主中高效地产生，所述原核和真核宿主如大肠杆菌(参见，如美国专利号6,765,087)、霉菌(例如曲霉属或木霉属)和酵母(例如酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属或毕赤酵母属(参见，如美国专利号6,838,254))。所述生产过程是可放大的并且已产生了多种千克量的纳米抗体。纳米抗体被可制成具有长保质期的即用型溶液。NanocloneTM方法(参见，如WO 06/079372)是基于自动化高通量选择B细胞的产生针对期望靶标的NanobodiesTM的专有方法。
在某些实施方案中，本文所述的抗体及其抗原结合片段包括重链和轻链CDR组，其分别穿插在重链和轻链框架区(FR)组之间，所述重链和轻链框架区组为CDR提供了支持并限定了CDR相互之间的空间关系。如本文所使用的术语“CDR组”是指重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N-端开始，这些区分别被称为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点包括六个CDR，其包含来自重链和轻链V区的每一个的CDR组。包含单个CDR(如CDR1、CDR2或CDR3)的多肽在此被称为“分子识别单位”。许多抗原-抗体复合物的晶体分析已表明CDR的氨基酸残基与结合的抗原形成广泛的接触，其中最广泛的抗原接触是与重链CDR3。因而，分子识别单位主要负责抗原结合位点的特异性。
本文所使用的术语“FR组”指构造重链或轻链V区的CDR组的CDR的四段侧翼氨基酸序列。一些FR残基可接触结合的抗原；然而，FR主要负责将V区折叠成抗原结合位点，特别是直接邻近CDR的FR残基。在FR中，某些氨基酸残基和某些结构特征是极其高度保守的。在这方面，所有V区序列包含大约90个氨基酸残基的内部二硫键环。当V区折叠成结合位点时，CDR表现为形成抗原结合表面的突出环基序。通常认为存在保守的FR结构区，其影响CDR环形成某些“典型的”结构的折叠形状—而与精确的CDR氨基酸序列无关。进一步地，已知某些FR残基参与使抗体重链和轻链的相互作用稳定的非共价结构域间接触。
免疫球蛋白可变区的结构和位置可参考Kabat,E.A等(Sequencesof Proteins of Immunological Interest,4th Edition,US Department ofHealth and Human Services,1987,)及其新版(现可在互联网址(immuno.bme.nwu.edu)获得)来确定。
“单克隆抗体”指均质的抗体群，其中单克隆抗体由参与选择性结合表位的氨基酸(天然存在的和非天然存在的)组成。单克隆抗体针对单表位是高度特异性的。术语“单克隆抗体”不仅包括完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体，还包括其片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)，单链(ScFv)，其变体，包含抗原结合部分的融合蛋白，人源化单克隆抗体，嵌合单克隆抗体，以及包含所需特异性且能够结合表位的能力的抗原结合片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型。并不打算对抗体来源或其制备的方式(如通过杂交瘤、噬菌体筛选、重组表达、转基因动物等)进行限制。该术语包括以上所述的全免疫球蛋白以及片段等。
“人源化”抗体指通常利用重组技术制备的嵌合分子，其具有源自非人类免疫球蛋白的抗原结合位点和保留的基于人免疫球蛋白的结构和/或序列的分子的免疫球蛋白结构。抗原结合位点可包含融合至恒定结构域的完整可变区或仅包含移植至可变域中适当的框架区上的CDR。表位结合位点可以是野生型的或可通过一个或多个氨基酸取代修饰。这种嵌合结构排除了非人类来源的恒定区作为人类个体的免疫原，但是保留了对外来可变区的免疫应答的可能性(LoBuglio et al.,(1989)Proc Natl Acad Sci USA86:4220-4224;Queen et al.,PNAS(1988)86:10029-10033;Riechmann et al.,Nature(1988)332:323-327)。根据本发明某些实施方案，示例性人源化的抗体包含以SEQ ID NOS:3-12和83-92提供的人源化序列。
另一种方法不仅集中于提供人来源的恒定区，而且还集中于修饰可变区，以便改造它们尽可能地接近人的形式。如以上所述，已知重链和轻链的可变区都包含三个互补决定区(CDR)，其随着所考虑的表位而不同并决定结合能力，两侧是在给定物种中相对保守且推定为CDR提供支架的四个骨架区(FR)。当制备针对特定表位的非人抗体时，可变区可通过将源自非人抗体的CDR移植至待修饰的人抗体中存在的FR上而被“改造”或“人源化”。这种方法在不同抗体中的应用已在以下文献中报道：Sato et al.,(1993)Cancer Res53:851-856;Riechmann etal.,(1988)Nature332:323-327;Verhoeyen et al.,(1988)Science239:1534-1536;Kettleborough et al.,(1991)Protein Engineering4:773-3783;Maeda et al.,(1991)Human Antibody Hybridoma2:124-134;Gorman et al.,(1991)Proc Natl Acad Sci USA88:4181-4185;Tempest etal.,(1991)Bio/Technology9:266-271;Co et al.,(1991)Proc Natl AcadSci USA88:2869-2873;Carter et al.,(1992)Proc Natl Acad Sci USA89:4285-4289；以及Co et al.,(1992)J Immunol148:1149-1154。在一些实施方案中，人源化抗体保留全部CDR序列(例如，包含来自小鼠抗体的全部六个CDR的人源化小鼠抗体)。在其他实施方案中，人源化抗体具有相对于原始抗体而改变的一个或多个CDR(一个，两个，三个，四个，五个，六个)，这又被称为一个或多个CDR“源自”原始抗体的一个或多个CDR。
在某些实施方案中，本发明的抗体可以是嵌合抗体。在这方面，嵌合抗体由可操作地连接或以其它方式融合至不同抗体的异源Fc部分的抗BKB2R抗体的抗原结合片段组成。在某些实施方案中，异源Fc结构域是人类来源的。在其他实施方案中，异源Fc结构域可来自与母体抗体不同的Ig类别，包括IgA(包括IgA1和IgA2亚类)，IgD，IgE，IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类)，以及IgM。在某些实施方案中，所述异源Fc结构域可由来自一种或多种不同Ig类别的CH2和CH3结构域组成。如以上关于人源化抗体所述的，嵌合抗体的抗BKB2R抗原结合片段可只包含本文所述抗体的一个或多个CDR(如本文所述抗体的1、2、3、4、5或6个CDR)，或可包含整个可变域(VL、VH或二者)。
在某些实施方案中，结合BKB2R的抗体包含本文所述抗体的一个或多个CDR。在此方面，在某些情况下已显示可进行仅转移抗体的VHCDR3，同时仍保留期望的特异性结合(Barbas et al.,PNAS(1995)92:2529-2533)。还参见，McLane et al.,PNAS(1995)92:5214-5218,Barbaset al.,J.Am.Chem.Soc.(1994)116:2161-2162。
Marks等(Bio/Technology,1992,10:779-783)描述了产生抗体可变域所有组成成分的方法，其中使用针对或邻近可变域区5’端的通用引物连同人VH基因的第三框架区的通用引物，以提供缺乏CDR3的VH可变域的所有组成成分。Marks等进一步描述了该所有组成成分如何与特定抗体的CDR3结合。利用类似的技术，本文所述抗体的源自CDR3的序列可以与缺乏CDR3的VH或VL结构域的所有组成成分进行改组，并且所改组的完整VH或VL结构域联合同源的VL或VH结构域，以提供能结合BKB2R的抗体或其抗原结合片段。然后可以在合适的宿主系统如WO92/01047的噬菌体展示系统中展示所有组成成分，以便可选择合适的抗体或其抗原结合片段。所有组成成分可由至少约104个单独的成员并向上至几个数量级，例如至约106至108或1010或更多的成员组成。Stemmer(Nature,1994,370:389-391)同样公开了类似的改组或组合技术，其结合β-内酰胺酶基因描述了所述技术，但是评述该方法可用于抗体的生成。
进一步可供选择的是利用一个或多个所选择的VH和/或VL基因的随机突变在整个可变域内形成突变，以形成携带本文所述发明实施方案的一个或多个源自CDR序列的新的VH或VL区。Gram等(1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:3576-3580)描述了这样的技术，其使用易错PCR。可使用的其他方法是针对VH或VL基因的CDR区的突变。这种技术由Barbas等(1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3809-3813)和Schier等(1996J.Mol.Biol.263:551-567)公开。
在某些实施方案中，可使用本文所述抗体的特异性VH和/或VL来筛选互补的可变域文库，以鉴定具有期望特性如增强对BKB2R的亲和力的抗体。这样的方法描述于，例如Portolano et al.,J.Immunol.(1993)150:880-887;和Clarkson et al.,Nature(1991)352:624-628中。
还可使用其他方法来混合和匹配CDR，以鉴定具有期望结合活性的抗体，如与BKB2R结合。例如：Klimka等(British Journal of Cancer(2000)83:252-260)描述了利用小鼠VL和具有保留了小鼠VH的CDR3和FR4的人VH文库的筛选方法。获得抗体之后，针对人VL文库筛选所述VH以获得结合抗原的抗体。Beiboer等(J.Mol.Biol.(2000)296:833-849)描述了利用整个小鼠重链和人轻链文库的筛选方法。获得抗体之后，将一个VL与具有保留小鼠的CDR3的人VH文库结合。获得了能够结合抗原的抗体。Rader等(Proc.Nat.Acad.Sci.USA(1998)95:8910-8915)描述了与以上Beiboer等的方法类似的方法。
这些刚刚所述的技术本身就是本领域内已知的。然而，本领域技术人员基于本文，利用本领域的常规技术，将能使用这样的技术来获得本文所述发明的几种实施方案的抗体或其抗原结合片段。
本文所还公开了用于获得BKB2R抗原特异的抗体抗原结合结构域的方法，所述方法包括通过在本文所示的VH结构域的氨基酸序列中添加、缺失、置换或插入一个或多个氨基酸的方式，提供是所述VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域。因而任选地，所提供的VH结构域可与一个或多个VL结构域相结合。然后可检测所述VH结构域或VH/VL的一个或多个组合，以鉴定针对BKB2R的特异性结合成员或特异性抗体抗原结合结构域，并且任选地进一步具有一个或多个优选特性。所述VL结构域可具有基本上如本文所列出的氨基酸序列。可使用类似的方法，其中将本文所公开的VL结构域的一个或多个序列变体与一个或多个VH结构域相结合。
“特异性结合”或“优先结合”(在此可替换使用)抗体或多肽的表位是本领域所熟知的术语，确定这样的特异性或优先结合的方法同样是本领域所熟知的。如果与可选择的细胞或物质的反应或联合相比，分子以更频繁、更快速且具有更持久和/或更大的亲和力与特定细胞或物质反应或联合，则这样的分子被认为显示出“特异性结合”或“优先结合”。如果与其他物质的结合相比，抗体与靶标的结合具有更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更持久，则抗体“特异性结合”或“优先结合”靶标。例如，特异性或优先结合特定BKB2R表位的抗体是这样的抗体，该抗体与其结合其他BKB2R表位或非BKB2R表位相比，与某一BKB2R表位的结合具有更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更持久。通过阅读该定义还可理解的是，例如，特异性或优先结合第一靶标的抗体(或部分或表位)能或不能特异性或优先结合第二靶标。同样地，“特异性结合”或“优先结合”并非必须需要(虽然其可包括)排他性结合。一般但非必须地，涉及结合意指优先结合。
免疫结合通常指发生在免疫球蛋白分子和对免疫球蛋白特异的抗原之间的非共价相互作用的类型，例如以阐明且非限制的方式，由于静电、离子、亲水性和/或疏水性引力或斥力、空间力、氢键、范德华力的结果以及其他相互作用。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以结合相互作用的解离常数(Kd)来表达，其中越小的Kd代表越大的亲和力。所选择多肽的免疫结合特性可利用本领域所熟知的方法来定量。一种这样的方法必需测定抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中这些速率取决于复合物配偶体的浓度，相互作用的亲和力，以及在两个方向上同等影响速率的几何参数。因而，“结合(on)速率常数”(Kon)和“解离(off)速率常数”(Koff)都可通过计算浓度以及结合和解离的实际速率来确定。Koff/Kon的比率能够删除与亲和力不相关的所有参数，因而等于解离常数Kd。通常参见，Davies等(1990),Annual Rev.Biochem.59:439-473。
关于表位的术语“免疫活性”或“剩余的免疫活性”，指抗体(如抗BKB2R抗体)在不同条件下(例如表位已经经受还原和变性条件之后)结合表位的能力。
根据本申请的某些优选实施方案，抗体或其抗原结合片段可以是与本文所述的任何抗体竞争结合BKB2R的抗体，本文所述的抗体既(i)与抗原特异性结合，又(ii)包含本文所公开的VH和/或VL结构域，或包含本文所公开的VH CDR3，或这些中任一种的变体。结合成员之间的竞争可易于在体外检测，例如利用ELISA和/或通过将特定报告分子标记于一个结合成员上，从而能够鉴定结合同一表位或重叠表位的特异性结合成员，其中可在另一未标记的结合成员存在下检测所述特定的报告分子。
因而，在此提供了特异性抗体或其抗原结合片段，其包含与本文所述的抗体竞争结合BKB2R的抗体抗原结合位点，如本文实施例所述的抗体(如克隆5F12G1及其人源化衍生物，如H1/L1、H2/L2、H37/L37、H38/L38；H39/L39)。
免疫球蛋白的恒定区显示比可变区少的序列多样性，并且负责结合许多天然蛋白以引起重要的生化事件。人类存在5种不同类别的抗体，包括IgA(其包括IgA1和IgA2亚类)、IgD、IgE、IgG(其包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类)以及IgM。这些抗体类别之间的区别特征在于它们的恒定区，但是V区可存在微小的差异。
抗体的Fc区与许多Fc受体和配体相互作用，赋予被称为效应器功能的一些重要的功能能力。对于IgG，Fc区包含Ig结构域CH2和CH3及通向CH2的N-端铰链区。对于IgG类别，Fc受体的重要家族是Fcγ受体(FcγRs)。这些受体介导抗体之间的通讯和免疫系统的细胞臂(cellular arm)(Raghavan et al.,1996,Annu Rev Cell Dev Biol12:181-220;Ravetch et al.,2001,Annu Rev Immunol19:275-290)。人类当中该蛋白家族包括FcγRI(CD64)，包括FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc亚型；FcγRII(CD32)，包括FcγRIIa亚型(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb亚型(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc亚型；以及FcγRIII(CD16)，包括FcγRIIIa亚型(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb亚型(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)(Jefferis et al.,2002,ImmunolLett82:57-65)。这些受体通常具有介导与Fc结合的细胞外结构域、跨膜区和细胞内结构域，所述细胞内结构域可介导细胞内的一些信号转导事件。这些受体在多种免疫细胞中表达，所述免疫细胞包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、郎格汉斯(Langerhans’)细胞、自然杀伤(NK)细胞和T细胞。Fc/FcγR复合体的形成将这些效应细胞募集至结合抗原的位点，通常导致细胞内的信号转导事件和随后重要的免疫应答，如炎症介质的释放、B细胞激活、内吞作用、吞噬作用和细胞毒性攻击。
介导细胞毒性和吞噬的效应器功能的能力是潜在的机制，通过该机制抗体破坏靶定的细胞。其中表达FcγRs的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体并接着引起靶细胞裂解的细胞介导的反应被称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)(Raghavan et al.,1996,Annu Rev Cell Dev Biol12:181-220;Ghetie et al.,2000,Annu RevImmunol18:739-766;Ravetch et al.,2001,Annu Rev Immunol19:275-290)。其中表达FcγRs的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并接着引起靶细胞吞噬作用的细胞介导的反应被称为抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)。所有FcγRs结合Fc上位于Cg2(CH2)结构域的N-末端和前面铰链区处的同一区域。这种相互作用已在结构上得到较好的表征(Sondermann et al.,2001,J Mol Biol309:737-749)，并且已解释了结合至人FcγRIIIb的细胞外结构域的人Fc的几种结构(pdb登录码1E4K)(Sondermann et al.,2000,Nature406:267-273)(pdb登录码1IIS和1IIX)(Radaev et al.,2001,J Biol Chem276:16469-16477)。
不同的IgG亚类对FcγRs具有不同的亲和力，且IgG1和IgG3通常比IgG2和IgG4能基本上更好地结合受体(Jefferis et al.,2002,Immunol Lett82:57-65)。所有FcγRs结合IgG Fc上的同一区域，但是具有不同的亲和力：高亲和力结合体FcγRI对IgG1具有10-8M-1的Kd，而低亲和力受体FcγRII和FcγRIII一般分别以10-6和10-5结合IgG1。FcγRIIIa和FcγRIIIb的细胞外结构域96%是一致的，然而FcγRIIIb并不具有细胞内信号结构域。此外，FcγRI、FcγRIIa/c和FcγRIIIa是触发免疫复合体激活的正调节因子，其特征为具有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)的细胞内结构域，而FcγRIIb具有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)因而是抑制性的。因此，前者被称为活化受体，而FcγRIIb被称为抑制性受体。受体在不同免疫细胞上的表达模式和水平同样有区别。
另一种复杂性水平是人蛋白质组中存在许多FcγR多态性。具有临床意义的特别相关的多态性是V158/F158FcγRIIIa。人IgG1与V158同种异型相结合的亲和力比与F158同种异型相结合的亲和力更大。亲和力的这种差异及假定其对ADCC和/或ADCP的作用已被证明是抗CD20抗体利妥昔单抗(rituximab，IDEC制药公司的注册商标Rituxan
Figure BDA00003538139100341
)效力的重要决定因素。具有V158同种异型的患者积极应答利妥昔单抗治疗；然而，具有低亲和力F158同种异型的患者应答较差(Cartron etal.,2002Blood99:754-758)。大约10-20%的人是V158/V158纯合体，45%的人是V158/F158杂合体，35-45%的人是F158/F158纯合体(Lehrnbecher et al.,1999Blood94:4220-4232;Cartron et al.,2002Blood99:754-758)。因而80-90%的人是低应答者，就是说他们具有至少一个F158FcγRIIIa的等位基因。
Fc区还参与补体级联的激活。在经典补体通路中，C1以其C1q亚基结合至IgG或IgM的Fc片段，这样与抗原形成复合体。在本发明的某些实施方案中，对Fc区的修饰包括改变(提高或降低)本文所述的BKB2R特异性抗体激活补体系统能力的修饰(参见如美国专利7,740,847)。为了评估补体激活，可进行补体依赖性细胞毒性(CDC)分析(参见，如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Meth.202:163(1996))。例如，可用缓冲液稀释不同浓度的(Fc)变体多肽和人补体。可将(Fc)变体抗体混合物、稀释的人补体和表达抗原(BKB2R)的细胞添加到96孔平底组织培养板中，并于37℃和5%CO2下孵育2小时，以促进补体介导的细胞裂解。然后向各孔添加50微升阿尔玛蓝(AccumedInternational)并于37℃过夜孵育。利用96-孔荧光计于530nm处激发且590nm处发射来测定吸光度。结果可表示为相对荧光单位(RFU)。可由标准曲线计算样品浓度，报道关注变体抗体相比非变体抗体的百分比活性。
因而在某些实施方案中，本发明提供了具有修饰的Fc区的抗BKB2R抗体，所述修饰的Fc区具有改变的功能特性，如提高的ADCC、ADCP、CDC，或提高对特异性FcγR的结合亲和力。Fc区的示例性修饰包括如Stavenhagen等(2007Cancer Res.67:8882)所述的那些修饰。本文考虑的其他修饰的Fc区描述于，例如授权的美国专利7,317,091；7,657,380；7,662,925；6,538,124；6,528,624；7,297,775；7,364,731；公开的美国专利申请US2009092599；US20080131435；US20080138344；以及公开的国际申请WO2006/105338；WO2004/063351；WO2006/088494；WO2007/024249。
可利用本领域技术人员已知的不同方法来评估抗BKB2R抗体所期望的功能特性，包括但不限于由表达BKB2R的细胞的钙释放，亲和力/结合分析(例如，表面等离子体共振、竞争性抑制分析)；细胞毒性分析，细胞活力分析(如利用诸如台盼蓝、碘化丙啶等的染料排斥试验)，利用体外或体内模型的癌细胞和/或肿瘤生长抑制(如细胞增殖和/或集落形成实验；锚定依赖性增殖试验；标准人肿瘤异种移植模型)(参见，如Culp PA,et al.,Clin.Cancer Res.16(2):497-508)。其他分析可检测本文所述的抗体阻断正常BKB2R介导的应答的能力，如用于细胞内糖原合成的分析和/或作为GSK-3β抑制指示物的GSK-3β丝氨酸-9处的磷酸化的ELISA测定。这样的分析可基于本文公开的内容和本领域的知识进行，例如，利用本领域技术人员已知的已完善的实验方法(参见如Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publ.Assoc.Inc.&John Wiley&Sons,Inc.,NY,NY)；Current Protocols in Immunology(Edited by:John E.Coligan,Ada M.Kruisbeek,David H.Margulies,Ethan M.Shevach,Warren Strober2001John Wiley&Sons,NY,NY)；或可商购的试剂盒。
在一实施方案中，本文所述的抗BKB2R抗体阻断激肽(如缓激肽和胰激肽(Lys-缓激肽))或BKB2R的任何其他配体与BKB2R受体相结合。可使用结合分析和竞争性抑制分析来测定本文所述抗体或其变体或其抗原结合片段的阻断活性。
在某些实施方案中，本文所述的抗BKB2R抗体与BKB2R相结合并刺激、激活或以其它方式诱导BKB2R信号通路中的下游信号事件。在具体的实施方案中，相对于缺乏本文所公开的抗BKB2R抗体时BKB2R信号的水平，由抗BKB2R抗体提供的BKB2R信号刺激的水平在经由BKB2R的信号水平上可统计学上显著增加至少约10%、至少约25%、至少约50%、至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、至少约90%、或至少约95%、96%、97%、98%、99%或100%。在某些实施方案中，在BKB2R信号刺激的水平上的统计学上的显著增加可超过缺乏本文所公开的抗BKB2R抗体时检测的水平的至少100%，这在某些情况下可超过200%、300%或更多。
因而，本发明提供了调节GSK-3β信号通路组分的抗BKB2R抗体。调节意指以统计学上显著的方式(例如，如利用适当对照测定的，以统计学上显著的方式抑制，或以统计学上显著的方式增加)改变GSK-3β信号通路组分的活性、蛋白水平、基因表达水平或磷酸化状态。BKB2RG蛋白偶联受体的组分通过PI3K/Akt信号通路诱导下游信号事件，这包括但不限于GSK-3β在丝氨酸-9处的磷酸化和失活。
在某些实施方案中，BKB2R信号通路组分的调节可包括调节所述通路的一个或多个组分的磷酸化状态。在某些实施方案中，本发明的抗BKB2R抗体与BKB2R受体相结合，可以统计学上显著的方式引起GSK-3β在丝氨酸-9处增加的磷酸化及其失活。
用于测定抗体是否改变(如以统计学上显著的方式增加或降低)BKB2R信号的体内和体外分析是本领域已知的。例如，可以使用基于细胞的分析来测定体外BKB2R信号水平，如在用本文所述的抗BKB2R抗体或其他相关刺激物诱导后的细胞裂解物中，诱导型钙流检测(induced calcium mobilization assay)，或利用BKB2R相关通路组分如GSK-3β的免疫化学检测的分析(如Assay Designs
Figure BDA00003538139100361
GSK-3βenzymeimmunometric assay,Assay Designs,Inc.,Ann Arbor,MI)。这样的分析实例还描述于本文的实施例1和9中。还可以将在BKB2R配体如BK或胰激肽存在下，存在BKB2R结合抗体时BKB2R信号的水平与不存在BKB2R结合抗体时的信号水平相比。本文的实施例中提供了利用基于细胞的分析来评估抗BKB2R单克隆抗体对BKB2R信号的作用的非限制性的具体实例。此外，BKB2R结合抗体对信号的作用可通过测定抗体对由BKB2R相关通路组分调节的基因表达水平的作用在体外或体内测定，所述BKB2R相关通路如一个或多个公认的GSK-3β参与的通路。本领域技术人员已知用于测定BKB2R信号通路组分调节的其他测定和可商购的系统。
在某些实施方案中，本发明提供了编码本文所述的抗体或其抗原结合片段的分离的核酸，例如编码CDR或VH或VL结构域的核酸。核酸包括DNA和RNA。这些和相关的实施方案可包括编码能结合本文所述BKB2R的抗体的多核苷酸。本文所使用的术语“分离的多核苷酸”应指基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸或以上的组合，由于其来源，分离的多核苷酸(1)与所述分离的多核苷酸天然存在的全部或部分多核苷酸不连结，(2)连接到其在天然状态时不连接的多核苷酸，或(3)并不作为较大序列的一部分天然存在。
术语“可操作地连接”意指该术语所应用的成分处于允许它们在适宜条件下实现它们固有功能的关系中。例如，“可操作地连接”至蛋白编码序列的转录控制序列连接到那里，以便在与控制序列的转录活性相容的条件下实现蛋白编码序列的表达。
本文所使用的术语“控制序列”指可影响它们连接或可操作地连接的编码序列的表达、加工或细胞内定位的多核苷酸序列。这种控制序列的性质可取决于宿主有机体。在特定的实施方案中，原核生物的转录控制序列可包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。在其他特定实施方案中，真核生物的转录控制序列可包括含有转录因子的一个或多个识别位点的启动子、转录增强子序列、转录终止序列和聚腺苷酸化序列。在某些实施方案中，“控制序列”可包括前导序列和/或融合伴侣列。
本文所涉及的术语“多核苷酸”意指单链或双链核酸聚合物。在某些实施方案中，包括多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或修饰形式的任一类型的核苷酸。所述修饰包括诸如溴尿核苷的碱基修饰、诸如阿拉伯糖苷和2’,3’-二脱氧核糖的核糖修饰，以及核苷酸间键合修饰如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phoshoraniladate)和氨基磷酸酯(phosphoroamidate)。术语“多核苷酸”特别包括单链和双链形式的DNA。
术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。术语“修饰的核苷酸”包括具有修饰或取代糖基等的核苷酸。术语“寡核苷酸键”包括诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、氨基磷酸酯等的寡核苷酸键。参见，例如LaPlanche et al.,1986,Nucl.Acids Res.,14:9081;Stec et al.,1984,J.Am.Chem.Soc.,106:6077;Stein et al.,1988,Nucl.Acids Res.,16:3209;Zon et al.,1991,anti-Cancer Drug Design,6:539;Zon et al.,1991,OLIGONUCLEOTIDES和ANALOGUES:A PRACTICALAPPROACH,pp.87-108(F.Eckstein,Ed.),Oxford University Press,Oxford England;Stec et al.,美国专利号5,151,510;Uhlmann andPeyman,1990,Chemical Reviews,90:543，其公开内容在此通过引用并入用于任何目的。寡核苷酸可包括可检测的标记以能够检测寡核苷酸或其杂交。
术语“载体”用于指用于将编码信息转移至宿主细胞的任何分子(如核酸、质粒或病毒)。术语“表达载体”指适合于转化宿主细胞并含有指导和/或控制所插入异源核酸序列表达的核酸序列的载体。表达包括但不限于诸如转录、翻译和RNA剪切(如果存在内含子的话)的过程。
本领域技术人员将理解的是，多核苷酸可包括表达或可适合于表达蛋白、多肽、肽等的基因组序列、基因组外的质粒编码的序列以及较小的改造基因节段。这样的节段可以是天然分离的或由本领域人员人工修饰的。
本领域技术人员将认识到，多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链的，并且可以是DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子可包括HnRNA分子(其包含内含子并以一一对应的方式对应DNA分子)和mRNA分子(其不含内含子)。根据本发明，额外的编码或非编码序列可以但是无需存在于多核苷酸内，并且多核苷酸可以但是无需连接至其他分子和/或支持材料。多核苷酸可包含天然序列或可包含编码这种序列的变体或衍生物的序列。
因此，根据这些和相关的实施方案，所提供的多核苷酸包括SEQID NOS:49-60、76、78、80和82的任一种或多种所示的多核酸序列的一些或全部，SEQ ID NOS:49-60、76、78、80和82的任一种或多种所示的多核苷酸序列的互补体，以及SEQ ID NOS:49-60、76、78、80和82的任一种或多种所示的多核酸序列的简并变体。在某些优选的实施方案中，本文所示的多核苷酸序列编码如本文其他地方所述的能结合BKB2R的抗体或其抗原结合片段。在某些优选的实施方案中，本文所示的多核苷酸序列编码具有SEQ ID NOS:1-48、75、77、79、81和83-92所示的氨基酸序列的多肽。
在其他相关实施方案中，多核苷酸变体可具有与本文以SEQ IDNOS:49-60、76、78、80和82公开的序列基本上相同的序列，例如利用本文所述的方法(如利用以下所述的标准参数的BLAST分析)，与诸如本文所公开序列的参照多核苷酸序列相比，包含至少70%序列同一性，优选至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的序列同一性的那些序列。本领域技术人员将认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、读码框定位等，可以适当调整这些值以确定由两条核苷酸序列编码的蛋白的相应同一性。
一般地，多核苷酸变体将包含一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，优选使得相对于由本文具体示出的多核苷酸序列编码的抗体，由变体多核苷酸编码的抗体的结合亲和力基本上不减小。
在某些其他相关的实施方案中，多核苷酸片段可包含与本文所公开的一种或多种序列相同或互补的不同长度的连续的序列区段，或者基本上由与本文所公开的一种或多种序列相同或互补的不同长度的连续的序列区段组成。例如，所提供的多核苷酸包含本文所公开的一种或多种序列的至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、200、300、400、500或1000个或更多个连续的核苷酸及其中所有的中间长度的核苷酸，或基本上由本文所公开的一种或多种序列的至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、200、300、400、500或1000个或更多个连续的核苷酸及其中所有的中间长度的核苷酸组成。易于理解的是，在上下文中，“中间长度”意指所提出的值之间的任意长度，如50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括200-500；500-1,000等的全部整数。在此所述的多核苷酸序列可通过添加天然序列中不存在的额外核苷酸在一端或两端延伸。该额外序列可由在所公开序列的任意一端或所公开序列的两端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸组成。
在另一实施方案中，所提供的多核苷酸能够在中度至严紧严格条件下与本文所提供的多核苷酸序列或其片段或其互补序列杂交。杂交技术是分子生物学领域公知的。为了阐明的目的，检测本文所提供的多核苷酸与其他多核苷酸杂交的合适的中度严紧条件包括在5倍SSC、0.5%SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的溶液中预洗；在50℃-60℃下，5倍SSC中过夜杂交；之后分别用含0.1%SDS的2倍、0.5倍和0.2倍SSC，于65℃下清洗两次，每次20分钟。本领域技术人员将理解的是，可易于操作杂交的严紧性，如通过改变杂交溶液的盐含量和/或进行杂交的温度。例如，在另一实施方案中，合适的高度严紧的杂交条件包括以上所述的条件，除了提高杂交的温度，如达到60-65℃或65-70℃。
在某些实施方案中，以上所述的诸如多核苷酸变体、片段和杂交序列的多核苷酸编码能结合BKB2R的抗体或其抗原结合片段。在其他实施方案中，这样的多核苷酸编码能结合至少约50%，优选至少约70%，并且更优选至少约90%的BKB2R的抗体或其抗原结合片段或其CDR以及本文具体列出的抗体序列。在进一步的实施方案中，这样的多核苷酸编码能比本文所示的抗体以更大的亲和力与BKB2R相结合的抗体或其抗原结合片段或其CDR(例如，在数量上结合至少约105%、106%、107%、108%、109%或110%)以及本文具体列出的抗体序列。
代表性多肽(如本文所提供的变体BKB2R特异性抗体，例如具有本文所提供的抗原结合片段的抗体蛋白)的立体结构的确定可通过常规方法进行，这样为了确定如此衍生的结构变体是否保留本文所公开种类的空间填充特性，实际上可用所选择的天然或非天然氨基酸取代、添加、缺失或插入一个或多个氨基酸来进行建模。参见，例如Donateet al.,1994Prot.Sci.3:2378;Bradley et al.,Science309:1868-1871(2005);Schueler-Furman et al.,Science310:638(2005);Dietz et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA103:1244(2006);Dodson et al.,Nature450:176(2007);Qian et al.,Nature450:259(2007);Raman et al.Science327:1014-1018(2010)。一些可适用于这些及相关实施方案的计算机算法的另外的非限制实例，如用于本文所提供的BKB2R-特异性抗体抗原结合结构域的合理设计，包括NAMD——设计用于高效模拟大生物分子体系的并行分子动力学代码，以及VMD，其是利用3-D制图和嵌入式脚本显示、绘制和分析大生物分子体系的分子可视化程序(参见Phillips,et al.,Journal of Computational Chemistry,26:1781-1802,2005;Humphrey,et al.,“VMD-Visual Molecular Dynamics”,J.Molec.Graphics,1996,vol.14,pp.33-38；还参见位于Urbana-Champagne的伊利诺伊大学的理论和计算生物物理学组的网站ks.uiuc.edu/Research/vmd/)。许多其他计算机程序是本领域已知的且可为本领域技术人员获得，其允许由以下确定原子大小：能量最小化构型的空间填充模型(范德华半径)；GRID，其试图确定不同化学基团的高亲和力区域从而增强结合，蒙特卡罗(Monte Carlo)搜索，其计算数学排列，以及CHARMM(Brooks et al.(1983)J.Comput.Chem.4:187-217)和AMBER(Weiner et al(1981)J.Comput.Chem.106:765)，其评估力场计算并分析(还参见Eisenfield et al.(1991)Am.J.Physiol.261:C376-386;Lybrand(1991)J.Pharm.Belg.46:49-54;Froimowitz(1990)Biotechniques8:640-644;Burbam et al.(1990)Proteins7:99-111;Pedersen(1985)Environ.Health Perspect.61:185-190;和Kiniet al.(1991)J.Biomol.Struct.Dyn.9:475-488)。还可商购各种适合计算的计算机程序，如购自
Figure BDA00003538139100411
(Munich,Germany)。
可将本文所述的多核苷酸或其片段(不考虑编码序列自身的长度)与其他DNA序列相结合，这样它们的总长度可能相差很大，其中所述其他DNA序列如启动子、多腺苷酸化信号、额外的限制性酶切位点、多克隆位点、其他编码节段等。因此，考虑的是可以使用几乎任何长度的核酸片段，其总长度优选限于易于制备和在预期的重组DNA方案中应用。例如，考虑总长度为长度约10,000，约5000，约3000，约2,000，约1,000，约500，约200，约100，约50个碱基对等(包括所有的中间长度)的示例性多核苷酸片段是有用的。
比较多核苷酸序列时，如果如以下所述，当进行最大一致性比对时两条序列的核苷酸序列是相同的，则这两条序列被认为是“一致的”。两条序列之间的比较一般通过以下来进行：在比较窗中比较序列以鉴定和比较序列相似性的局部区域。本文所使用的“比较窗”是指至少约20个连续位置的节段(通常30至约75，40至约50)，其中对两条序列进行最佳比对之后，序列可与相同数量连续位置的参照序列进行比较。
用于比较的序列的最佳比对可通过生物信息学Lasergene软件包(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)中的Megalign程序，利用缺省参数来执行。该程序包含以下文献所述的几种比对方案：Dayhoff,M.O.(1978)Amodel of evolutionary change in proteins–Matrices for detecting distantrelationships，Dayhoff,M.O.(ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DC Vol.5,Suppl.3,pp.345-358;Hein J.,Unified Approach to Alignment和Phylogenes,pp.626-645(1990);Methods in Enzymology vol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA;Higgins,D.G.and Sharp,P.M.,CABIOS5:151-153(1989);Myers,E.W.and Muller W.,CABIOS4:11-17(1988);Robinson,E.D.,Comb.Theor11:105(1971);Santou,N.Nes,M.,Mol.Biol.Evol.4:406-425(1987);Sneath,P.H.A.and Sokal,R.R.,Numerical Taxonomy–the Principles and Practice of Numerical Taxonomy,Freeman Press,SanFrancisco,CA(1973);Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.,Proc.Natl.Acad.,Sci.USA80:726-730(1983)。
可选择地，用于比较的序列的最佳比对可通过以下方法执行：Smith和Waterman(Add.APL.Math2:482(1981))的局部同一性算法；Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:443(1970))的同一性比对算法；Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444(1988))的相似性搜索方法；这些算法的计算机执行(GAP,BESTFIT,BLAST,FASTA,以及Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,WI的TFASTA)；或者目测。
适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的优选例子是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等(Nucl.Acids Res.25:3389-3402(1977))和Altschul等(J.Mol.Biol.215:403-410(1990))中。BLAST和BLAST2.0可与本文所述的参数一起使用，来确定两条或更多条多核苷酸之间的百分比序列同一性。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开获得。在一个示例性实例中，对于核苷酸序列，可以利用参数M(成对匹配残基的奖励分值；通常>0)和N(错配残基的罚分值；通常<0)计算累计分值。每个方向的字符命中延伸在以下情况停止：累计比对值从获得的最大值减小量X；由于累计一个或更多负分值残基比对，累计分值达到零或零以下；或者两个序列的任一序列到达终点。BLAST算法的参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用以下缺省值：字长(W)11和期望(E)10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff and Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))比对，(B)50，期望(E)10，M=5,N=-4和两条链的比较。
在某些实施方案中，“序列同一性的百分比”通过在至少20个位置的比较窗中比较两条最佳比对的序列来确定，其中为了最佳比对两条序列，与参照序列(其不含添加或缺失)相比，在比较窗中的部分多核苷酸序列可包含20%或更少的，通常5至15%或10至12%的添加或缺失(即空位)。所述百分比通过以下计算：确定两条序列中存在的相同核酸碱基的位置数以产生匹配位置的数目；用匹配位置的数目除以参照序列(即窗口大小)中的位置总数并乘以100以产生序列同一性的百分比。
本领域的普通技术人员将认识到，由于基因密码的简并性，有许多编码本文所述抗体的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与天然或原始多核苷酸序列（如本文所述的编码能结合BKB2R的抗体的多核苷酸序列）的核苷酸序列具有最小的序列同一性。然而，本发明明确考虑了由于密码子使用差异而改变的多核苷酸。在某些实施方案中，特别考虑的是已对哺乳动物表达优化的密码子序列。
因此，在本发明的另一实施方案中，可以使用诸如位点特异性突变的突变方法来制备本文所述抗体的变体和/或衍生物。通过该方法，可通过编码多肽序列的潜在多核苷酸的突变进行多肽序列的特异性修饰。这些技术提供了制备和测试序列变体的简单方法，例如，通过将一个或多个核苷酸序列变化导入多核苷酸中，并入一种或多种前述的考虑事件。
位点特异性突变允许通过利用特定寡核苷酸序列(其编码所期望突变的DNA序列)及足够数量的邻近核苷酸来产生突变体，所述邻近的核苷酸用于提供足够大小和序列复杂性的引物序列来在横跨的缺失接合处两侧形成稳定的双链体。可在所选择的多核苷酸序列中使用突变以提高、改变、降低、修饰或以其它方式改变多核苷酸自身的特性，和/或改变所编码多肽的特性、活性、组成、稳定性或一级序列。
在某些实施方案中，本发明人考虑将所公开的多核苷酸序列突变成改变所编码多肽的一种或多种特性，如抗体或其抗原结合片段的结合亲和力，或特定Fc区的功能，或Fc区对特定FcγR的亲和力。位点特异性突变的技术是本领域所熟知的，并且广泛用于形成多肽和多核苷酸的变体。例如，位点特异性突变通常用于改变DNA分子的特定部分。在这样的实施方案中，使用的引物一般包含长度约14至约25个核苷酸左右，且序列接合处两侧约5至约10个残基被改变。
本领域技术人员将认识到，位点特异性突变技术常常使用以单链或双链形式存在的噬菌体载体。在定点突变中使用的常见载体包括诸如M13噬菌体的载体。这些噬菌体易于商购获得，并且它们的应用通常是本领域技术人员所熟知的。双链质粒还在定点突变中常规使用，这去除了将目的基因从质粒转移至噬菌体的步骤。
通常，根据本文的定点突变通过首先获得单链载体或解链分开双链载体的两条链来进行，所述载体在其序列内包括编码所期望肽的DNA序列。制备(通常是合成)具有期望突变序列的寡核苷酸引物。然后将该引物与单链载体退火，并经受诸如大肠杆菌聚合酶I Klenow片段的DNA聚合酶，以完成具有突变的链的合成。因而，形成异源双链体，其中一条链编码原始的非突变序列，而第二条链具有所期望的突变。然后将该异源双链体载体用于转化适当的细胞如大肠杆菌细胞，并选择包括具有突变序列排列的重组载体的克隆。
利用定点突变制备所选择的编码肽的DNA节段的序列变体提供了产生可能有用的种类的方法，并且这并不意味着限定，因为有可获得肽的序列变体和编码它们的DNA序列的其他方法。例如，可用诸如羟胺的诱变剂处理编码所期望肽序列的重组载体，以获得序列变体。关于这些方法和方案的具体细节见于Maniatis等(1982,下文)的教导以及以下所引用的分子生物学和分子遗传学及相关方法的其他来源，每一篇都通过引用并入本文用于该目的。
术语“寡核苷酸定向突变程序”指模板依赖的过程和载体介导的增殖，这导致特定核酸分子的浓度相对于其初始浓度增加，或导致可检测信号如扩增的浓度增加。术语“寡核苷酸定向突变程序”意图指涉及引物分子的模板依赖性延伸的过程。术语“模板依赖性过程”指RNA或DNA分子的核酸合成，其中核酸的新合成链的序列由所熟知的互补碱基配对规则决定(参见，例如Watson,1987)。一般，载体介导的方法包括将核酸片段导入DNA或RNA载体，克隆扩增载体，以及回收所扩增的核酸片段。这种方法的例子由美国专利号4,237,224提供，通过引用以其整体特别并入本文。
用于产生多肽变体的另一方法中，可使用如美国专利号5,837,458所述的递归序列重组。在该方法中，进行重组和筛选或选择的重复循环，以“逐步形成”具有例如增加的结合亲和力的个体多核苷酸变体。某些实施方案还提供了包含本文所述的至少一个多核苷酸的质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体。
根据某些相关的实施方案，提供了包含本文所述的一种或多种构建体的重组宿主细胞；编码任何一种抗体、CDR、VH或VL结构域或其抗原结合片段的核酸；以及产生编码产物的方法，该方法包括从其编码核酸表达。表达可通过在适当条件下培养含有核酸的重组宿主细胞来方便地实现。通过表达产生之后，可利用任何合适的技术分离和/或纯化抗体或其抗原结合片段，然后按需要使用。
本文提供的抗体或其抗原结合片段以及编码核酸分子和载体可以基本上纯的或均质的形式，或者对于核酸，可以不含或基本上不含除编码具有期望功能的多肽的序列之外来源的核酸或基因的形式，从例如其天然环境中分离和/或纯化。核酸可包括DNA或RNA，并且可以是整体或部分合成的。除非上下文要求并非如此，涉及本文列出的核苷酸序列包括具有指定序列的DNA分子，以及包括具有指定序列的RNA分子，其中U取代T。
用于在各种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是众所周知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。本领域可利用的表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NSO小鼠黑素瘤细胞以及许多其他细胞。常用的优选的细菌宿主是大肠杆菌。
本领域已很好地建立了抗体和抗原结合片段在原核细胞如大肠杆菌中的表达。关于综述，参见例如Pluckthun,Bio/Technology9:545-551(1991)。本领域技术人员同样可利用在培养的真核细胞中表达作为产生抗体或其抗原结合片段的选择，参见最新综述，例如Ref，(1993)Curr.Opinion Biotech.4:573-576;Trill et al.(1995)Curr.Opinion Biotech6:553-560。
可选择或构建含有适当调控序列的合适载体，所述调控序列包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因及需要的其他序列。按需要，载体可以是质粒、病毒如噬菌体或噬菌粒。进一步的详述参见，例如《分子克隆实验指南》(第二版)(MolecularCloning:a Laboratory Manual,Sambrook等,1989,Cold Spring HarborLaboratory Press)；还参见以下所引用的关于分子生物学方法的其他参考文献。用于在例如制备核酸构建体、突变、测序、将DNA导入细胞和基因表达，以及分析蛋白中操作核酸的许多已知的技术和方案详细描述于《最新分子生物学实验技术》(第二版)(Current Protocols inMolecular Biology,Ausubel等编著,John Wiley&Sons,1992)或其后续的修订本。
术语“宿主细胞”用于指已导入编码一种或多种本文所述抗体的核酸序列的细胞，或能够导入编码一种或多种本文所述抗体的核酸序列的细胞，其进一步表达所选择的目的基因或能够表达所选择的目的基因，所述目的基因如编码任何本文所述抗体的基因。该术语包括母细胞的后代，无论该后代的形态或遗传组成是否与原始母细胞相同，只要存在所选择的的基因即可。因此，还考虑的是包括将这样的核酸导入宿主细胞的方法。导入可使用任何可利用的技术。对于真核细胞，合适的技术可包括磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖，电穿孔，脂质体介导的转染，以及利用逆转录病毒或其他病毒如牛痘病毒或杆状病毒(用于昆虫细胞)的转导。对于细菌细胞，合适的技术可包括氯化钙转化，电穿孔以及利用噬菌体转染。导入之后可产生或允许核酸的表达，如通过在基因表达的条件下培养宿主细胞。在一实施方案中，核酸整合至宿主细胞的基因组(如染色体)中。整合可根据标准技术，通过包含促进与基因组重组的序列来促进。
在某些实施方案中，本发明还提供了包括利用以上所述的构建体在表达系统中表达特定多肽如本文所述的BKB2R特异性抗体的方法。术语“转导”用于指通常通过噬菌体将基因从一种细菌转移到另一种细菌。“转导”还指通过逆转录病毒获取并转移真核细胞序列。术语“转染”用于指由细胞摄取外来或外源DNA，并且外源DNA已被导入细胞膜内时，细胞已被“转染”。本领域已知且本文公开了许多转染技术。参见，如Graham et al.,1973,Virology52:456;Sambrook et al.,2001,MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL,Cold SpringHarbor Laboratories;Davis et al.,1986,BASIC METHOD1NMOLECULAR BIOLOGY,Elsevier；以及Chu et al.,1981,Gene13:197。可使用这样的技术来将一种或多种外源DNA部分导入合适的宿主细胞。
本文所使用的术语“转化”指细胞遗传特征的变化，并且当细胞被改造成包含新DNA时，细胞已被转化。例如，细胞由其天然状态被基因改造时，细胞被转化。转染或转导之后，转化的DNA可通过物理整合至细胞的染色体而与细胞的DNA重组，或者可作为附加元件暂时被保持而不被复制，或者可作为质粒独立复制。当DNA随着细胞的分裂被复制时，认为细胞被稳定地转化。术语“天然存在的”或“天然的”与诸如核酸、多肽、宿主细胞等的生物物质联合使用时，指天然存在的且未经人工操作的物质。类似地，本文所使用的“非天然存在”或“非天然的”指不是天然存在的物质，或人为进行结构改造或合成的物质。
术语“多肽”、“蛋白”和“肽”以及“糖蛋白”可交替使用，意指不限于任何长度的氨基酸聚合物。该术语并不排除诸如十四烷基化、硫酸酯化、糖基化、磷酸化和添加或缺失信号序列的修饰。术语“多肽”或“蛋白”意指氨基酸的一条或多条链，其中每条链包含通过肽键共价连接的氨基酸，并且其中所述多肽或蛋白可包含非共价和/或通过肽键共价连接在一起的多条链，具有天然蛋白(即由天然存在且特别是非重组的细胞或者基因改造或重组的细胞产生的蛋白)的序列，并且包含具有天然蛋白的氨基酸序列的分子，或者具有天然序列的一个或多个氨基酸缺失、添加和/或取代的分子。术语“多肽”和“蛋白”特别包括能与本发明的BKB2R相结合的抗体，或者具有抗BKB2R抗体的一个或多个氨基酸缺失、添加和/或取代的序列。因而，“多肽”或“蛋白”可包含一条(被称为“单体”)或多条(被称为“多聚体”)氨基酸链。
关于蛋白的术语“分离的”在此是指主体蛋白：(1)不含通常在天然状态下存在的至少一些其他蛋白，(2)基本上不含来自相同来源如来自相同物种的其他蛋白，(3)通过来自不同物种的细胞表达，(4)已从其在天然状态下结合的至少约50%的多核苷酸、脂质、碳水化合物或其他物质分离，(5)与“分离的蛋白”在天然状态下相结合(通过共价或非共价相互作用)的蛋白部分不相结合，(6)与其在天然状态下不相结合的多肽可操作地相结合(通过共价或非共价相互作用)，或(7)天然不存在。这样分离的蛋白可由基因组DNA、cDNA、mRNA或其他RNA编码、或者可以是合成来源的或以上的任意组合。在某些实施方案中，所分离的多肽基本上不含在其天然环境中存在的会干扰其应用(治疗、诊断、预防、研究或其他)的蛋白或多肽或其他污染物。
术语“多肽片段”指可以是单体或多聚体的多肽，其具有天然存在或重组产生的多肽的氨基端缺失、羧基端缺失和/或内部缺失或取代。在某些实施方案中，多肽片段可包含长至少5至约500个氨基酸的氨基酸链。将认识到在某些实施方案中，片段至少长5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸。特别有用的多肽片段包括功能结构域，包括抗体的抗原结合结构域或片段。对于抗BKB2R抗体，有用的片段包括但不限于CDR区，特别是重链或轻链的CDR3区；重链或轻链的可变域；一部分抗体链或仅其包括两个CDR的可变区等。
本文所述的作为BKB2R功能的调节因子、激动剂或拮抗剂的BKB2R结合抗体或其抗原结合片段明确地包括于所考虑的实施方案中。这些激动剂、拮抗剂和调节因子抗体或其抗原结合片段与BKB2R的一个或多个抗原决定簇位点或BKB2R的表位片段或变体相互作用。
本领域技术人员将认识到，有许多已知的用于制备能与特定抗原如BKB2R相结合的抗体的方法，包括标准技术，参见如Harlow andLane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988。通常，抗体，如特异性阻断本文明确公开的BKB2R结合抗体与其同源抗原相结合的抗体，可通过细胞培养技术产生，包括产生本文所述的单克隆抗体或通过将抗体基因转染至适当的细菌或哺乳动物细胞宿主，以允许产生重组抗体。在某些实施方案中，首先将包含多肽抗原(如包含SEQ ID NO:71示出的氨基酸序列的人BKB2R蛋白或其片段，所述片段如包含SEQ ID NO:73示出的氨基酸序列的多肽)的免疫原注射至多种哺乳动物(如小鼠、大鼠、兔、绵羊和山羊)的任一种中。在该步骤中，多肽可用作免疫原而无需修饰。可选择地，特别是相对短的多肽，如果多肽连接到载体蛋白如牛血清白蛋白或钥孔虫戚血蓝蛋白，在某些情况下可激发高级免疫应答。将免疫原注射至动物宿主，优选根据并入一种或多种加强免疫的预定时间表，并定期采集动物血液。然后通过例如利用与适当的固相支持物偶联的多肽的亲和层析，可以从这样的抗血清中纯化对多肽特异的多克隆抗体。
在某些实施方案中，可例如利用Kohler和Milstein(Eur.J.Immunol.6:511-519,1976)的技术及其改进方法来制备对目的抗原多肽特异的单克隆抗体。简而言之，这些方法包括制备能够产生具有期望特异性(即与目的多肽反应)的抗体的永生化细胞系。这样的细胞系可由例如获自以上所述的免疫动物的脾细胞产生。然后通过例如与骨髓瘤细胞融合伴侣相融合，使脾细胞永生化，优选与免疫动物同源的骨髓瘤细胞融合伴侣。可使用各种融合技术。例如，可将脾细胞和骨髓瘤细胞与非离子去污剂相结合几分钟，然后以低密度接种于支持杂种细胞生长但不支持骨髓瘤细胞生长的选择培养基。优选的选择技术利用HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶脱氧核苷)选择。时间足够之后，通常约1至2周，观测杂种集落。选择单集落，并检测它们的上清液针对多肽的结合活性。具有高反应性和特异性的杂交瘤是优选的。
可从生长的杂交瘤集落的上清液中分离单克隆抗体。此外，可使用不同的技术来增加产量，如将杂交瘤细胞系注射至合适的脊椎动物宿主如小鼠的腹膜腔中。然后可从腹水或血液采集单克隆抗体。通过常规技术可从抗体去除污染物，所述常规技术如层析、凝胶过滤、沉淀和萃取。多肽可用于纯化过程如亲和层析步骤中。
使用方法和药物组合物
本文提供了利用能结合BKB2R的抗体的治疗方法。在一实施方案中，将本发明的抗体给予患有涉及生物学信号通路的疾病、障碍或病症的患者，可通过激动BKB2R改变(如以统计学上显著的方式增加或降低)所述生物学信号通路的活性，在本发明的上下文中，这意味着包括特征为异常BKB2R和/或GSK-3β活性的疾病和障碍，例如这是由于存在的蛋白的量或活性，或突变蛋白的存在的改变(如统计学上显著增加或降低)，或二者同时。过多可由任何原因引起，包括但不限于相对于其正常检测时，GSK-3β在分子水平的过表达，在作用位点处的延长或累积出现，或增加(如以统计学上显著的方式)活性。可相对于GSK-3β的正常表达、出现或活性测定这种过多的GSK-3β活性，并且所述测定在本文所述的抗体开发和/或临床检测中可能起重要作用。
具体地，本文所述的抗体通过与BKB2R相结合及随后的信号事件，对于治疗糖尿病，特别是某些糖尿病并发症是有用的。因而，在某些实施方案中，本文所述的抗体对于治疗与糖尿病包括2型糖尿病相关的疾病或其他相关障碍或病症是有用的，所述与糖尿病相关的疾病如糖耐量受损、胰岛素抵抗，所述其他相关障碍或病症包括相关的症状、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、心血管疾病、高血压、肾病、视网膜病变和神经病变。
在II型糖尿病中，对胰岛素的抵抗导致缺乏组织如骨骼肌对葡萄糖的摄取。胰岛素抵抗导致较高的血糖水平，并且胰腺产生更多的胰岛素来补偿较高的血糖水平。运动研究发现胰岛素抵抗、骨骼肌葡萄糖摄取与BKB2R之间的联系。运动过程中，骨骼肌内局部增加激肽释放。这种增加导致肌细胞表面表达的葡萄糖转运蛋白GLUT-4的增加，并提高肌细胞摄取葡萄糖(Kishi et al,1998Diabetes47:4,550-8)。已证明肌细胞的胰岛素抵抗通过添加对II型糖尿病的BKB2R起作用的激肽而提高(Henriksen et al.,1998Am J Physiol275(1Pt2):R40-5。
2型糖尿病胰岛素抵抗的动物模型中，发现过度活跃的糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)负责胰岛素抵抗。下调GSK-3β导致减少胰岛素抵抗并增加机体对葡萄糖的利用(Tanabe et al,2007PLos Biol6:307-318)。虽然主要是基于自身免疫的疾病，I型糖尿病现在同样已被认为具有胰岛素抵抗成分(Xu,et al.,2007Diabetes Care30:2314-20)。可通过高胰岛素-正常血糖钳夹来诊断胰岛素抵抗。可将某些本发明实施方案的BKB2R抗体给予显示胰岛素抵抗的糖尿病患者。
1型和2型糖尿病并发症可包括导致严重损伤肾脏(肾病)、眼睛(视网膜病变)和/或神经(神经病变)的长期高血糖症和胰岛素抵抗的结果，并且额外或可选择地，可包括导致心血管疾病(如心肌梗死、心肌病变和卒中)的高胆固醇血症和/或高血压。已证明BKB2R的激活明显有助于保护肾脏免于糖尿病肾病(Allard et al.2008Am J Physiol RenalPhysiology294:F1249-56;Yuan et al,2007Endocrinology148;2016-2026)，而某些BKB2K多态性增加糖尿病肾病的风险(Maltais et al,2002Can J Physiol Pharmacol80:323-7)。BKB2R表达似乎在糖尿病视网膜病变中起重要作用，激活BKB2R应当改善糖尿病视网膜病变(Kato et al.2009Eur J Pharamcol606:187-90)和神经病变(Kakoki et al,2010Proc Natl Acd Sci USA107:10190-5)。因而，根据某些考虑的实施方案，可将目前提供的抗BKB2R抗体给予糖尿病患者来逆转或预防肾病、神经病变或视网膜病变的进一步发展。
糖尿病还与心血管疾病相关。由缓激肽B2受体(BKB2R)激活的组织激肽释放酶，在心脏保护中起重要作用。已证明敲除缓激肽B2受体的小鼠出现与血管周围纤维化和修复性纤维化相关的扩张型心肌病(Emanueli et al.,1999Circulation,100;2359-2365)。在高血压大鼠中，全身递送携带组织激肽释放酶基因的腺病毒导致血压降低和心肌肥厚和纤维化的减弱(Chao et al1999Stroke;30;1925-1932)。而且，在心肌梗死之后血压正常的大鼠和遗传高血压但不明显影响血压的大鼠中，激肽释放酶基因转移减弱了心肌肥大和纤维化。此外，BKB2R激活提高心功能并减少心肌梗死之后的梗死面积和心室纤维性颤动的发病率；艾替班特(icatibant)破坏了这些有益效果(Yin et al.,2005J.Biol.Chem.280,8022–8030)。还注意到心肌梗死之后BKB2R肽激动剂的使用赋予心功能有益的作用(Marketou et al,2010Am J Hypertens23:562-568)。通过刺激激肽B2受体-Akt-GSK-3b和Akt-Bad-14-3-3信号通路，激肽预防体内和培养细胞中缺血/再灌注诱导的心肌细胞凋亡。此外，一氧化氮(NO)通过阻抑氧化应激、TGF-b1/Smad2和JNK/p38MAPK信号通路以及NF-kB激活，在BKB2R介导的预防心肌缺血/再灌注诱导的炎症和心室重塑中起重要作用。这些发现表明激肽释放酶在影响或不影响血压的情况下预防心脏损伤并提高心功能。总之，体内和体外研究的结果表明，通过BKB2R激活的组织激肽释放酶凭借增加NO形成和阻抑氧化应激介导的信号级联，通过抑制细胞凋亡、炎症、肥大和纤维化来预防心脏损伤。因而，根据某些明确考虑的实施方案，可将本文所述的抗BKB2R抗体给予糖尿病患者以逆转或预防心血管疾病的进一步发展。
另一实施方案提供了通过将表达BKB2R的细胞与本文公开的足以降低胆固醇水平的量的BKB2R特异性抗体相接触，来抑制该细胞中GSK-3β通路信号的方法。作为简要背景，当血液中存在的胆固醇非常高时，发生高胆固醇血症。长期的高胆固醇血症导致伴有动脉硬化(动脉粥样硬化)的心血管疾病以及更高风险的心肌梗死和卒中。循环的总胆固醇浓度低于200mg/dL是期望的，然而，一般200-239mg/dL被认为是边缘性高水平，且240mg/dL以上被认为是高水平。为了降低心血管疾病的风险，可取的是可将总胆固醇降低至200mg/dL以下，其中LDL胆固醇在理想状况下应当在100mg/dL以下，或对于处于非常高风险的人群来说在70mg/dL以下，并且HDL胆固醇在40mg/dL以下。虽然饮食和锻炼可有助于降低总胆固醇水平，单独这样的方案并不总是成功的，因而可能需要额外的药物治疗。患有糖尿病的个体被认为处于高风险，因而一般被建议小心控制胆固醇水平。在链脲霉素诱导的糖尿病大鼠中，由BKB2R激活的激肽释放酶同样通过改善心功能、血糖和血脂谱包括胆固醇而预防心肌病变(Montanari et al.,2005Diabetes54;1573-1580)。在2型糖尿病中，与未处理的动物相比，通过重组逆转录病毒向高脂饮食动物模型导入组织激肽释放酶基因表达导致显著降低总胆固醇水平(Yuan,G,et al,2007Endocrinology148;2016-2026)。因此，通过给予本文的激动型抗BKB2R抗体，根据某些实施方案考虑本文所公开的治疗干预有利地降低循环的胆固醇水平。
根据某些其他的实施方案，对于用本文所述的抗体治疗高血压，已知激肽(Lys-缓激肽和缓激肽)结合组成型表达的细胞表面受体BKB2R(缓激肽2型受体)，引起血管中的平滑肌松弛，这导致血压降低。血管紧张素转换酶(ACE)通过进一步代谢激肽以至于它们不再结合BKB2R而对抗这些激肽的低血压特性。BKB2R在血压调节中的重要性通过敲除受体表达时血压升高而进一步得到加强(Madeddu et al,1996Hypertension28:980-987)。在另一项研究中，在高血压动物模型中，通过BKB2R起作用的组织激肽释放酶的过表达导致血压持续降低(Wang et al1995J Clin Invest.95:1710-1760)。因而在这些和相关的实施方案中，可将本文所述的BKB2R抗体给予患者来治疗高血压。
特别是，本文的抗体对于治疗与BKB2R和/或GSK-3β的表达和/或活性相关的多种癌症是有用的。例如，本发明的一种实施方案提供了通过给予癌症患者治疗有效量的本文公开的BKB2R特异性抗体来治疗癌症的方法，所述癌症包括但不限于混合谱系白血病、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、结肠癌、肝癌、胃癌和胰腺癌。给予之后，以统计学上显著的方式(即相对于本领域技术人员已知的适当对照)抑制、防止或延缓癌症进程和/或转移的量被认为是有效的。
另一实施方案提供了通过将表达BKB2R的细胞与本文公开的足以抑制信号转导和抑制癌细胞生长的量的BKB2R特异性抗体相接触，来抑制该细胞中GSK-3β通路信号的方法。已确定某些癌症对糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)抑制敏感。具体地，已证明与非肿瘤组织相比，胰腺癌、肝细胞癌、胃癌和结直肠癌具有增加的GSK-3β表达。抑制GSK-3β导致癌细胞的存活和增殖减弱，并且在细胞培养物和小鼠异种移植物中增加细胞凋亡(Mai et al,Clin Cancer Res2009;15(22)6810-6819)。本文所述的抗BKB2R抗体在抑制源自肝细胞癌、胃癌和结直肠癌的细胞系生长中同样是有效的。在食道癌中，GSK-3β抑制类似地导致培养的细胞系的细胞周期阻滞(Wang et al,Worl JGastroenterol,2008;14(25):3982-3989)。
在前列腺癌中，抑制GSK-3β阻遏了雄激素受体的表达并抑制前列腺癌细胞系的生长(Mazor et al,Oncogene2004;23;7882-7892)。在卵巢癌中，GSK-3β活性参与培养物和动物模型中人卵巢癌细胞的增殖。抑制GSK-3β防止了由人卵巢癌细胞系产生的肿瘤在裸鼠中形成(Caoet al,2006Cell Research;16;671-677)。在MLL(骨髓/淋巴或混合谱系白血病)中，已表明GSK-3β对于具有MLL原癌基因突变的人白血病的维持是致癌必需的。抑制GSK-3β导致培养的几种MLL细胞系的细胞周期阻滞。在人MLL白血病的临床前鼠模型中，GSK-3β抑制导致显著延长小鼠的存活时间(Wang et al,2008Nature;455;1205-1210)。本文所述的抗BKB2R抗体在抑制源自前列腺癌和MML白血病的细胞系生长中是有效的。
另一实施方案提供了通过将表达BKB2R的细胞与本文公开的足以抵抗辐射照射的量的抗BKB2R特异性抗体相接触，来抑制该细胞中GSK-3β通路信号的方法。暴露于来自不同来源(核事故、核武器爆炸、肿瘤放射疗法)的辐射可导致非常严重且威胁生命的身体和神经功能缺损。GSK-3β的抑制可以是在细胞水平抵抗辐射照射的方法，并且已注意到有助于战胜由肿瘤放射疗法引起的神经功能缺损(Yazlovtskaya et al,2006Cancer Res66:11179-86)。
另一实施方案提供了通过将表达BKB2R的细胞与本文公开的足以抵抗暴露于流感病毒感染的量的BKB2R特异性抗体相接触，来抑制该细胞中GSK-3β通路信号的方法。呼吸道的流感病毒感染是全世界每年主要的患病和死亡原因。目前，抗病毒疗法，如对抗流感而使用的奥司他韦(Oseltamivir)，由于病毒的快速突变率而变得失效。流感病毒依赖宿主细胞机构进行病毒侵入和复制。已鉴定的流感病毒所需的宿主细胞蛋白之一是GSK-3β(Konig,R,et al,(2010)Nature463:813-817)，并且用siRNA敲除GSK-3β表达，导致大量减少病毒复制。本文公开的某些实施方案，通过由本文提供的抗BKB2R抗体的激动剂信号活性抑制GSK-3β，因而根据非限制性理论，预期治疗流感病毒感染的治疗方法不可能导致病毒抗性。
另一实施方案提供了通过将表达BKB2R的细胞与本文公开的足以抑制GSK-3β通路信号的量的BKB2R-特异性抗体相接触，来抑制该细胞中GSK-3β通路信号以治疗卒中患者的方法。当大脑的血管被血凝块堵塞时发生缺血性卒中，导致没有血流到达大脑。到达大脑的血流的减少导致大脑组织的特定区域受损，引起衰弱性损伤。已知BKB2R在缺血性卒中中的保护作用。利用MCAO缺血性卒中模型，发现与正常小鼠相比，BKB2R缺陷小鼠中的梗死体积和神经功能缺损评分更显著(Chao et al,2006Front Biosci11:1323-7)。还发现BKB2R缺陷小鼠的存活率更低。因此，某些在此公开的实施方案涉及通过给予本文所述的抗BKB2R抗体来治疗卒中的方法。
以纯的形式或适当的药物组合物给予的本文所述的BKB2R特异性抗体，可以通过用于类似应用的给予药剂的任何公认的方式来实施。药物组合物可通过将抗体或含有抗体的组合物与适当的生理可接受的载体、稀释剂或赋形剂相组合来制备，并且可被配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球以及喷雾剂。此外，其他药物活性成分和/或适合的赋形剂如盐、缓冲液和稳定剂可以存在于组合物中，但不是必须的。可通过各种不同的途径来实现给予，包括口服、肠胃外、鼻腔、静脉内、皮内、皮下或局部。优选的给予方式取决于待治疗或预防的病症的性质。给予之后减少、抑制、预防或延缓癌症进程和/或转移的量被认为是有效的。
在某些实施方案中，给予的量足以导致降低血压，和/或减少血糖浓度，和/或减少血清胆固醇浓度，和/或降低病毒负荷，和/或肿瘤退化，和/或降低心血管疾病、视网膜病变、神经病变或肾病的风险，和/或降低卒中或辐射照射之后的发病率或死亡率，如通过治疗干预所指向的一种或多种参数的统计学上的显著降低所表明的。精确的剂量和治疗持续时间是被治疗疾病的函数，并且可利用已知的测试方案凭经验来确定，或通过在本领域已知的模型系统中测试组合物并由此外推。还可进行临床对照试验。剂量还可随着待缓解的病症的严重程度而改变。药物组合物通常被配制和给予，以发挥治疗有用的效果同时使不期望的副作用最小化。组合物可以一次给予，或可以分成若干小剂量以间隔时间给予。对于任何特定的个体，可根据个体需要随着时间调整具体的给药方案。
因而，给予这些和相关药物组合物的常见途径包括但不限于，口服、局部、经皮、吸入、肠胃外、舌下、口腔、直肠、阴道以及鼻内。本文所使用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌肉、胸腔注射或输注技术。配制本发明某些实施方案的药物组合物以在给予患者组合物时，使其中包含的活性成分是可生物利用的。给予个体或患者的组合物可采取一个或多个剂量单位的形式，其中例如，片剂可以是单剂量单位，而喷雾剂形式的本文所述的BKB2R特异性抗体的容器可以容纳多个剂量单位。制备这种剂型的现行方法是本领域技术人员已知的或显而易见的；例如，参见Remington:The Science and Practice ofPharmacy,20th Edition(Philadelphia College of Pharmacy and Science,2000)。无论如何，被给予的组合物包含用于治疗本文教导的所关注疾病或病症的治疗有效量的本文公开的抗体。
药物组合物可以是固体或液体的形式。在一实施方案中，载体是微粒，使得组合物例如为片剂或粉末形式。与组合物一起的载体可以是液体，例如口服油、可注射的液体或喷雾剂，其在例如吸入给予中是有用的。当意图用于口服给予时，药物组合物优选为固体或液体形式，其中半固体、半液体、悬浮液和凝胶形式包括于本文所考虑的固体或液体形式之中。
作为用于口服给予的固体组合物，药物组合物可配制成粉剂、颗粒、压缩片、丸剂、胶囊、咀嚼胶、薄糖片等。这样的固体组合物一般含有一种或多种惰性稀释剂或可食用的载体。此外，可含有以下的一种或多种：粘合剂，如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，如淀粉、乳糖或糊精；崩解剂，如海藻酸、海藻酸钠、Primogel、玉米淀粉等；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotex；助流剂，如胶质二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙香精；以及着色剂。当药物组合物为胶囊形式时，例如明胶胶囊，除了以上类型的物质之外，其可包含液体载体，如聚乙二醇或油。
药物组合物可以为液体的形式，如酏剂、糖浆、溶液、乳剂或悬浮液。作为两个实例，液体用于口服给予或通过注射递送。当意图用于口服给予时，优选的组合物除了本化合物外，还包含甜味剂、防腐剂、染料/着色剂以及增味剂的一种或多种。在意图通过注射给予的组合物中，可包含表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲液、稳定剂以及等渗剂的一种或多种。
液体药物组合物，无论其为溶液、悬浮液或其他类似的形式，可包含一种或多种以下佐剂：无菌稀释液，如注射用水、盐溶液优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠、固定油如可用作溶剂或悬浮介质的合成甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗菌剂，如苄醇或对羟基苯甲酸酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节渗透压的试剂如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可以装入由玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶。生理盐水是优选的佐剂。可注射的药物组合物优选是无菌的。
意图用于肠胃外或口服给予的液体药物组合物应当包含本文所公开的量的BKB2R特异性抗体，以便获得合适的剂量。通常，该量是组合物中至少0.01%的抗体。意图用于口服给予时，该量可在组合物重量的0.1至约70%之间变化。某些口服药物组合物包含约4%至约75%的抗体。在某些实施方案中，制备本发明的药物组合物和制剂，以便在稀释之前肠胃外剂量单位包含以重量计0.01至10%的抗体。
药物组合物可用于局部给予，在这种情况下载体可适当包括溶液、乳液、油膏或凝胶基质。所述基质，例如可包括以下的一种或多种：矿脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂如水和酒精，以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可存在于用于局部给予的药物组合物中。如果意图用于经皮给予，所述组合物可包括透皮贴剂或离子电渗疗法装置。药物组合物可以例如栓剂的方式用于直肠给予，其将在直肠中融化并释放药物。用于直肠给予的组合物可包含作为合适的无刺激性赋形剂的油质基质。这样的基质包括但不限于羊毛脂、可可油和聚乙二醇。
药物组合物可包含多种材料，其改性固体或液体剂量单位的物理形式。例如，组合物可包含围绕活性成分形成包衣壳的材料。形成包衣壳的材料通常是惰性的，并且可选自例如，糖、虫胶和其他肠溶包衣剂。可选择地，活性成分可装入明胶胶囊。固体或液体形式的药物组合物可包含能与本发明的抗体相结合的试剂，由此辅助递送化合物。可在这方面作用的合适的试剂包括其它单克隆或多克隆抗体，一种或多种蛋白或脂质体。药物组合物可基本上由可作为喷雾剂给予的剂量单位组成。术语喷雾剂用于表示从胶体性质的系统至由密封包装组成的系统的各种系统。可以通过液化或压缩气体，或者通过分配活性成分的合适的泵系统来递送。为了递送活性成分，可以单相、双相或三相系统来递送喷雾剂。喷雾剂的递送包括必要的容器、活化剂、阀、小容器等，这些在一起可形成试剂盒。本领域普通技术人员无需过多试验即可确定优选的喷雾剂。
药物组合物通过制药领域所熟知的方法制备。例如，意图通过注射给予的药物组合物可通过将组合物与无菌蒸馏水组合以便形成溶液来制备，所述组合物包含本文所述的BKB2R特异性抗体和任选的盐、缓冲液和/或稳定剂的一种或多种。可添加表面活性剂以促进均质溶液或悬浮液形成。表面活性剂是与抗体组合物非共价相互作用的化合物，以便促进抗体在水递送系统中溶解或均匀悬浮。
组合物可以治疗有效量给予，所述治疗有效量取决于多种要素，包括所使用具体化合物(如BKB2R特异性抗体)的活性；化合物的代谢稳定性和有效时长；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；给予模式和时间；排泄率；联合用药；特定障碍或症状的严重程度；以及个体接受的治疗。通常，治疗有效的日剂量(对于70kg的哺乳动物)是约0.001mg/kg(即0.07mg)至约100mg/kg(即7.0g)；优选地，治疗有效剂量(对于70kg的哺乳动物)是约0.01mg/kg(即0.7mg)至约50mg/kg(即3.5g)；更优选地，治疗有效剂量(对于70kg的哺乳动物)是约1mg/kg(即70mg)至约25mg/kg(即1.75g)。
可将包含本文所述的BKB2R特异性抗体的组合物给予患有本文所述疾病如癌症的个体。对于治疗人类疾病的体内应用，通常在给予之前将本文所述的抗体并入药物组合物中。药物组合物包含一种或多种本文所述的抗体与本文其他地方所述的生理可接受的载体或赋形剂的组合。为了制备药物组合物，将有效量的一种或多种化合物与本领域技术人员已知的适合于特定给予方式的任何药物载体或赋形剂相混合。药物载体可以是液体、半液体或固体。用于肠胃外、皮内、皮下或局部应用的溶液或悬浮液可包括，例如无菌稀释液(如水)、盐溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗微生物剂(如苄醇和对羟基苯甲酸酯)；抗氧化剂(如抗坏血酸和亚硫酸氢钠)和螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；缓冲液(如乙酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐)。如果静脉注射给予，合适的载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及含有增稠剂和增溶剂的溶液，如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇及其混合物。
包含如本文所述的BKB2R特异性抗体的组合物可与载体一起制备，所述载体保护抗体免于在体内快速消除，如延时释放制剂或包衣。这样的载体包括控释制剂，如但不限于埋植剂和微囊化递送系统以及生物可降解的生物兼容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、聚正酯、聚乳酸以及本领域技术人员所熟知的那些聚合物。
在整篇说明书中，除非上下文要求并非如此，措词“包含(comprise)”或其变型如“包含(comprise)”或“包含(comprising)”被理解为隐含包括指明的要素或整数或要素组或整数组在内但是不排除任何其他的要素或整数或要素组或整数组。
除非上下文明确指明并非如此，本文所使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数方面。因而，例如，提到“一个细胞”，包括单个细胞以及两个或更多个细胞；提到“一种试剂”包括一种试剂，以及两种或更多种试剂；以此类推。
除非明确说明并非如此，本说明书中所述的每个实施方案加以必要的修改可用于每一个其他的实施方案。
重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化中可以使用标准技术(如电穿孔、脂质转染)。可根据厂商说明书或本领域常用的或本文所述的，进行酶反应和纯化技术。通常根据本领域所熟知的和本说明书中所引用和讨论的微生物学、分子生物学、生物化学、分子遗传学、细胞生物学、病毒学和免疫技术中的多种通用和更具体的参考文献中所述的常规方法实施这些和相关的技术和步骤。参见，如Sambrook,etal.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3d ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.;Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley and Sons,updated July2008);ShortProtocols in Molecular Biology:A Compendium of method from CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates andWiley-Interscience;Glover,DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I&II(IRL Press,Oxford Univ.Press USA,1985);Current Protocols inImmunology(Edited by:John E.Coligan,Ada M.Kruisbeek,David H.Margulies,Ethan M.Shevach,Warren Strober2001John Wiley&Sons,NY,NY);Real-Time PCR:Current Technology and Applications,Editedby Julie Logan,Kirstin Edwards and Nick Saunders,2009,CaisterAcademic Press,Norfolk,UK;Anand,Techniques for the Analysis ofComplex Genomes,(Academic Press,New York,1992);Guthrie and Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(Academic Press,NewYork,1991);Oligonucleotide Synthesis(N.Gait,Ed.,1984);Nucleic AcidHybridization(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1985);Transcription andTranslation(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1984);Animal Cell Culture(R.Freshney,Ed.,1986);Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984);Next-Generation Genome Sequencing(Janitz,2008Wiley-VCH);PCR Protocols(Method in Molecular Biology)(Park,Ed.,3rd Edition,2010Humana Press);Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press,1986);the treatise,Method In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.);GeneTransfer Vectors For Mammalian Cell(J.H.Miller and M.P.Calos eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory);Harlow and Lane,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998);Immunochemical Method In Cell and Molecular Biology(Mayer andWalker,eds.,Academic Press,London,1987);Handbook Of ExperimentalImmunology,Volumes I-IV(D.M.Weir andCC Blackwell,eds.,1986);Riott,Essential Immunology,6th Edition,(Blackwell ScientificPublications,Oxford,1988);Embryonic Stem Cells:Method andProtocols(Method in Molecular Biology)(Kurstad Turksen,Ed.,2002);Embryonic Stem Cell Protocols:Volume I:Isolation and Characterization(Method in Molecular Biology)(Kurstad Turksen,Ed.,2006);EmbryonicStem Cell Protocols:Volume II:Differentiation Models(Method inMolecular Biology)(Kurstad Turksen,Ed.,2006);Human EmbryonicStem Cell Protocols(Method in Molecular Biology)(Kursad Turksen Ed.,2006);Mesenchymal Stem Cells:Method and Protocols(Method inMolecular Biology)(Darwin J.Prockop,Donald G.Phinney,and Bruce A.Bunnell Eds.,2008);Hematopoietic Stem Cell Protocols(Method inMolecular Medicine)(Christopher A.Klug,and Craig T.Jordan Eds.,2001);Hematopoietic Stem Cell Protocols(Method in Molecular Biology)(Kevin D.Bunting Ed.,2008)Neural Stem Cells:Method and Protocols(Method in Molecular Biology)(Leslie P.Weiner Ed.,2008)。
除非提供了具体的定义，结合本文所述的分子生物学、分析化学、合成有机化学和医药化学的实验步骤和技术使用的术语是本领域内已知的且常用的。重组技术，分子生物学，微生物学，化学合成，化学分析，药物制备、配制和递送以及治疗患者可以使用标准技术。
除非上下文要求并非如此，在整篇说明书和权利要求书中，措词包含(comprise)”及其变型如“包含(comprise)”或“包含(comprising)”被解释为开放式包括的意思，即如同“包括，但不限于”。“由……组成”意指包括，通常限于短语“由……组成”之后的要素。“基本上由……组成”意指包括该短语之后列出的任何要素，并且限于不抵触或有助于本公开内容中为所列要素指明的活性或作用的其它要素。因而，短语“基本上由……组成”表明所列的要素是必须的或强制的，但是没有其他要素是可以的，其取决于它们是否影响所列要素的活性或作用而可存在或不存在。
在本说明书和所附的权利要求中，除非上下文明确指明并非如此，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数引用。在特定实施方案中，本文所使用的术语“约”或“大约”在数值之前时，表示该值加上或减去5%、6%、7%、8%或9%的范围。在其它实施方案中，术语“约”或“大约”在数值之前时，表示该值加上或减去10%、11%、12%、13%或14%的范围。在又一实施方案中，术语“约”或“大约”在数值之前时，表示该值加上或减去15%、16%、17%、18%、19%或20%的范围。
在整篇说明书中提及“一实施方案”或“一个实施方案”或“一方面”意指与该实施方案有关的所述具体特征、结构或特性包括于本发明的至少一个实施方案中。因而，在整篇说明书中不同地方出现的短语“在一实施方案中”或“在实施方案中”并非必然全部指的是同一个实施方案。此外，所述具体特征、结构或特性可以在一个或多个实施方案中以任何合适的方式相结合。
实施例
实施例1 BKB2受体单克隆抗体的筛选和选择
本实施例描述了筛选具有激活p-GSK3β能力的含有通过针对BKB2R多肽免疫而产生的抗体的杂交瘤上清液。激活通过免疫分析测定裂解物中的GSK3β来评估，所述裂解物由用抗BKB2R杂交瘤上清液处理60分钟之后的WI-38人成纤维细胞制备，以及由用抗BKB2R杂交瘤上清液处理10分钟之后的3T3小鼠成纤维细胞制备。
用BKB2R多肽(SEQ ID NOS:73和74)免疫小鼠，并利用标准实验方案分离杂交瘤。从用小鼠序列(SEQ ID NO:74)免疫的动物的融合脾细胞中产生50个杂交瘤，从用人序列(SEQ ID NO:73)免疫的动物的融合脾细胞中也产生50个杂交瘤。将来自每一个杂交瘤的抗体添加到ELISA板的孔中来测量肽结合，所述ELISA板已用BKB2R肽预先包被。
对50份杂交瘤上清液进行抗BKB2R抗体存在的筛选，所述抗BKB2R抗体能够刺激鼠成纤维细胞3T3细胞和WI-38人成纤维细胞中的GSK-3β(糖原合成酶激酶3β)的磷酸化。GSK-3β的磷酸化是通过所述抗体激活BKB2受体而使GSK-3β失活的指示。
3T3细胞的刺激 在补充有10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素(P/S)的DMEM中培养鼠3T3细胞。刺激之前48小时，将细胞以5x104细胞/cm2接种于12-孔板含有FBS的1mL培养液中(大约1.8x105细胞/ml/孔)。刺激之前12至24小时，用1mL不含血清的DMEM更换培养液。
试剂 将血小板衍生生长因子(PDGF,Sigma P8147-1VL,250ng)溶解于含有0.1%BSA的4mM HCl中，得到含有5μg/mL PDGF的溶液，将该溶液在4mM HCL/0.1%BSA中进一步稀释，得到含有1000ng/mLPDGF的原液。将该原液按1:10(v/v)进一步稀释于不含血清的培养液中，得到100ng/mL(“2倍”)溶液，然后与样品按1:1稀释，得到50ng/mL的最终样品处理浓度。
裂解缓冲液(“RIPA CLB”)含有5μl/mL蛋白酶抑制剂混合物(“PIC”,Sigma,St.Louis,MO;产品编号P8340)、2mM NaVO4、20mMNa4P2O7和1mM苯甲磺酰氟(PMSF)。
样品 从3T3细胞培养物中去除培养液并用不含添加血清的新鲜DMEM以每孔0.5mL更换；小心不破要坏粘附至培养孔的细胞。阳性对照孔容纳含50ng/mL PDGF的DMEM/FBS；阴性对照孔容纳单独的DMEM/FBS。测试孔容纳0.5mL杂交瘤上清液。于37℃孵育10分钟之后，通过抽吸去除培养液，并用PBS轻轻冲洗贴壁细胞，将平板置于冰上。
裂解 向每个孔添加0.5ml裂解缓冲液，在冰上裂解细胞30分钟。用细胞刮铲将每个孔中的内容物转移到微量离心管中。将上清液微量离心15分钟，以去除不可溶的物质。然后将上清液收集到新的管中于-80℃保存。
ELISA 利用Assay Design
Figure BDA00003538139100641
试剂盒(Assay Designs,Inc.,Ann Arbor,MI,产品编号900-123)，根据厂商说明书，进行免疫分析以定量细胞裂解物中的GSK-3β。样品和对照按1:50稀释。结果示于图1中。基于它们的高活性水平，选择两个杂交瘤克隆(样品编号8和17)来扩增。
WI-38细胞(人)的刺激 在含有10%FBS、1%P/S和2mM L-谷氨酰胺的MEM中培养人WI-38细胞。刺激之前48小时，将细胞以5x104细胞/cm2接种于12孔板含有FBS的1mL培养液中(～1.8x105细胞/ml/孔)。刺激之前12至24小时，用1mL不含血清的MEM更换培养液。
试剂 如上所述制备PDGF。将激肽释放酶(KLK,Sigma产品编号K3627)溶解于含有10%FBS的MEM中并稀释成200μg/mL(2倍)；将500μL KLK溶液添加至所选择的培养孔中达到100μg/mL的终浓度。将LiCl(Sigma L-8895)溶解于PBS并在MEM/10%FBS中稀释成40mM；将500μL LiCl溶液添加至所选择的培养孔中达到20mM的终浓度。裂解缓冲液(RIPA CLB,来自Assay Designs,Inc.,MBL#061708C)如上所述。
样品 从WI-38细胞培养物中去除培养液，并用不含添加血清的新鲜DMEM以每孔0.5mL更换；小心不要破坏粘附至培养孔的细胞。对照孔容纳以下处理中的一种：(A)含50ng/mL PDGF的DMEM/FBS；(B)LiCl(20mM)；(C)KLK(500μg/mL)；(D)KLK(100μg/mL)；(E)阴性对照，单独的DMEM/FBS；(F)阴性对照，不含血清的DMEM。测试孔容纳0.5mL杂交瘤上清液。于37℃孵育60分钟之后，通过抽吸去除培养液，并用PBS轻轻冲洗贴壁细胞，将平板置于冰上。
如上所述，裂解并进行ELISA免疫测定以定量GSK-3β。结果示于图2中。多个杂交瘤上清液诱导的GSK-3β显著超过背景水平。特别是杂交瘤上清液样品编号55、65和66显示超过背景水平3000pg/mLp-GSK-3B以上。
含有抗BKB2R抗体的杂交瘤上清液似乎已经激活了BKB2R受体，引起GSK-3B的失活(通过磷酸化作用)。
实施例2 抗BKB2R抗体对Wistar大鼠模型的血压的急性效应
本实施例描述了几种抗BKB2R抗体对麻醉的Wistar大鼠血压的急性效应。
研究设计 雄性Wistar大鼠(Charles River Laboratories,Boston,MA)为7.0至7.6周龄，平均体重245克，用Purina5001鼠粮喂养，随意取食。适应实验室一周之后，在一天时间内进行股骨导管手术和药物给予处理，测量于同一天开始并持续接下来的三周随访期。处理组为(1)3H3H3(抗BKB2R)抗体(n=8)，(2)3H3H9(抗BKB2R)抗体(n=8)，(3)1F2G7(抗BKB2R)抗体(n=3)，(4)5F12G1(抗BKB2R)抗体(n=8)。
血压测量 用氯胺酮(30mg/kg,IM)和仲丁硫巴比妥(50mg/kg,IP)麻醉大鼠。将插管植入股动脉用于血压测量，植入股静脉用于药物给予。用含有10UI/ml肝素的生理盐水充满动脉导管，以在试验中保持导管开放并避免频繁冲洗动脉导管。15-20分钟的平衡期之后，一旦血压稳定，记录基线血压15分钟，然后给予药物并评估其对血压的影响。对于抗体，给予单次剂量(0.5mg/kg)并记录血压3小时。所有药物都稀释于生理盐水或PBS中，达到1ml/kg的总体积。以平均40秒的时间缓慢给予药物。试验期间于37℃饲养动物。试验结束时，将动物无痛处死，未采集血液或组织。
计算 基线血压，血压对药物反应的时长，最大血压变化和血压反应的曲线下面积(AUC)。输注抗体之后1、2和3小时时的血压。
结果 所有四种抗BKB2R抗体对血压都有瞬时效应，IV给予之后马上开始。5F12G1在给予之后所有的时间点都显示温和但显著地降低血压。在该组中，基线处的血压为109±3mm Hg，在给予抗体1小时时降低至95±3mm Hg，2小时时降低至94±3mm Hg，3小时时降低至95±3mm Hg。对于这些组，最高血压反应和反应时长(在血压回落到基线之前)值在表1中给出，并以图的形式示于图3和图4中。
表1 血压反应和反应时长
抗体 血压反应时长(秒) 最高血压反应(mm HG)
3H3H3 193+/-23 41+/-1
3H3H9 171+/-28 45+/-5
1F2G7 147+/-18 45+/-1
5F12G1 168+/-29 57+/-4
实施例3 由单克隆抗体减少A549细胞病毒滴度的QRT-PCR分析
定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)法已用作初级低通量筛选，作为利用流感病毒的验证筛选并用于作用机制研究。本实施例描述了利用qRTPCR分析来测定存在测试化合物时，病毒感染的细胞中病毒基因组RNA的量，作为与复制病毒颗粒的数量直接相互关联。该分析提供了还可表明作用机制的直接且可靠的测量手段。结合该分析，开发了用于定量病毒群的分离的cDNA的96-孔低通量测序。
试验设计和方法
A549细胞培养和流感病毒感染 A549细胞(ATCC CCL-185,ATCC,Manassas,VA)在组织培养板上长到～95%汇合。在补充有10%FBS和1%青霉素/链霉素/谷氨酰胺(Invitrogen,Carlsbad,CA)的DMEM中维持并接种细胞。接种之后24小时，将抗体5F12G1(“G1”)、1F2G7(“G7”)、3H3H9(“H9”)和3H3H3(“H3”)，以及阳性对照药物Tamiflu
Figure BDA00003538139100661
以稀释于培养基中的稀释液添加到平板上，之后将平板放回37℃/5%CO2下孵育1小时。然后用病毒感染或假感染细胞。利用流感株A/Brisbane/07(H1N1)以0.1的感染复数(MOIs)进行感染。为感染细胞，去除生长培养液并用DPBS冲洗细胞3次。于DMEM-PSG中稀释病毒(或使用不含病毒的DMEM-PSG来假感染)并添加至细胞。再次添加新鲜的抗体制备物，之后将平板放回37℃/5%CO2下孵育1小时。然后从孵育器中取出细胞，将感染培养液更换为含有适当抗体、对照药物或假稀释液的新鲜培养液[OptiProTM(Invitrogen,Carlsbad,CA)，不含血清的培养液/2μg/ml胰蛋白酶]，并将细胞放回孵育器。将细胞于37℃/5%CO2孵育，并在感染后72小时时收获用于qRT-PCR分析。作为阴性对照，使未感染的细胞经过相同的程序。还分析了仅具有给予抗体的对照板(无病毒感染)来确定A549细胞中每一抗体剂量的细胞毒性程度。如上所述制备对照板，但是没有病毒(培养液假感染)被添加到细胞。72小时之后测定细胞活力。
利用Qiagen提取试剂盒(Qiagen GmbH,Valencia,CA)按基质类型的需要对生物基质(如组织、流体或分泌物)进行DNA和RNA定量分析。通过光密度(A260)测定所提取的RNA样品的浓度。利用TaqMan分析(Invitrogen)，用专门设计的与流感M节段的200nt部分互补的引物，通过实时PCR定量cDNA序列。利用Invitrogen SuperScriptTM逆转录酶，根据供应商说明书，首先将RNA样品转录成cDNA，并以与上述DNA相同的方式(qRT-PCR)定量cDNA。为了通过qRT-PCR进行这种分析，将重复样品合并并分析；同样运行阳性对照、阴性对照和无模板对照。使用已知量的模板(如包含流感M基因的质粒)来生成标准曲线。通过针对已知拷贝数的模板绘制Ct值形成线性比较。然后使用该图来评估未知样品中cDNA的量。利用微软的Excel进行统计分析并作图。
结果 结果总结于表2和图5至8中。qRT-PCR分析结果表明，Tamiflu
Figure BDA00003538139100672
对照以剂量反应的方式减少所测量的病毒基因组拷贝的数目。抗BKB2R抗体G1(5F12G1)在100μg/ml的最高测试浓度处显示病毒滴度的急剧降低(病毒滴度降低100倍)，因而被认为是治疗流感病毒的备选物。
表2 用于qRT-PCR分析的Ct值
Figure BDA00003538139100681
实施例4 单克隆抗BKB2R抗体显示针对MDCK(转化)细胞的细胞毒性
本实施例描述了单克隆抗BKB2R抗体对Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞系(永生化转化的肾上皮细胞系，Kushida et al.,1999)的影响。令人惊奇地观测到抗BKB2R抗体对MDCK细胞是有细胞毒性的，使得这些抗体成为用作癌症治疗的备选者，例如用于肾癌。
方法 抗病毒和毒性分析已被批准且基本上如Noah等(AntiviralRes.2007Jan;73(1):50-9)所述的进行。使用Madin Darby犬肾(MDCK)细胞来检测抗BKB2R单克隆抗体或其它化合物在预防由流感感染诱导的细胞病变效应(CPE)中的效力。每次检测中包括奥司他韦羧酸盐(Tamiflu
Figure BDA00003538139100691
)作为阳性对照化合物。将MDCK细胞的亚汇合培养物接种于96-孔板用于细胞活力分析(细胞毒性)。在接种时将抗体或其它药物添加至细胞中。24小时之后，CPE孔还容纳流感病毒的100倍组织培养物感染剂量(100TCID50)。72小时之后测定细胞活力。利用CellTiter-GloTM(Promega,Madison,WI)来评估细胞活力。计算使细胞数目减少50%和90%的药物中毒浓度(分别为TC50和TC90)。
用于细胞活力的CellTiter-Glo TM 检测分析 流感诱导的CPE的测量是基于定量ATP(代谢活性细胞的指示物)。CPE分析按照供应商说明书，使用可商购获得的CellTiter-GloTM发光法细胞活力试剂盒(Promega,Madison,WI)来测定培养物中的细胞毒性和细胞增殖。简而言之，细胞培养物孵育之后，将CellTiter-GloTM试剂直接添加至培养液中之前培养的亚汇合的细胞，诱导细胞裂解和生物性发光信号(半衰期大于5小时，取决于细胞类型)的产生，所述信号与存在的ATP量(作为细胞活力的生物标记物)成比例。
第一天，MDCK细胞长成90%汇合，然后用胰蛋白酶处理，回收，离心并在PBS中冲洗两次以去除残留的血清。将细胞重悬并稀释于DMEM/青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺中，等分到96-孔板并使其于37℃附着至平板18小时。然后将抗体(抗BKB2R mAb)或其他测试化合物，或载体(介质)对照添加至测试孔中。
第二天，目测确认细胞活力，视觉估计80-90%汇合。将每一病毒(含有终浓度2μg的胰蛋白酶)的100TCID50(72小时内引起50%致死率的组织培养物感染量的100倍)添加至测试孔中。将单独的培养液(同样含有胰蛋白酶)添加至对照孔中。最终孔容量是100mL。将平板于37℃/5%CO2孵育72小时。
第五天，将100ml CellTiter-GloTM试剂添加至每个孔中，随后通过发光检测法分析平板。
测试抗体在MDCK细胞中的细胞毒性 第一天，将从90%汇合的单层细胞回收的MDCK细胞接种于细胞96-孔板，分析之前18小时，选择达到90%汇合的细胞密度用于第二天未感染的细胞。紧接着接种之后，将稀释于含有少于1%DMSO的培养液中的测试化合物(抗BKB2R mAb或Tamiflu
Figure BDA00003538139100701
)添加到重复的孔中(对于效力测定一式三份，对于细胞毒性测定一式两份)；对照孔仅容纳培养液。抗BKB2R单克隆抗体(mAb)的测试化合物(“药物”)制备物具有100、33、11、3.7、1.2、0.4、0.14、0.05μg/ml的终浓度；Tamiflu
Figure BDA00003538139100702
制备物具有0.023、0.07、0.2、0.6、1.9、5.5、16.6、50mM的终浓度。将培养物于37℃/5%CO2保持过夜，于第二天添加病毒。向进行效力测定的每个孔添加100TCID50(最终测试浓度)的病毒；没有容纳病毒的孔用于细胞毒性测定。于37℃/5%CO2额外孵育平板72小时，之后利用以上所述的Promega CellTiter-GloTM试剂盒通过发光分析测定细胞活力。
结果 在MDCK细胞中，所有测试的抗BKB2R抗体在更高的测试浓度时显示出细胞毒性。图9至图18以图的形式总结了与A/Brisbane/59/07和流感CA/07/09相比的不同抗体的结果。
实施例5 抗BKB2R单克隆抗体显示针对多种癌细胞系的细胞毒性
本实施例描述了本文所述的抗BKB2R单克隆抗体对一组癌细胞系的细胞毒活性的表征。BxPC-3是最初分离自胰腺(胰腺癌)的人腺癌细胞系(ATCC#CRL-1687;Tan et al.,Cancer Invest.4:15-23,1986.PubMed:3754176)。MV-4-11是最初分离自外周血的人双表型B髓单核细胞白血病(混合谱系白血病，MLL-AF4)细胞系(ATCC#CRL-959;Lange et al.,Blood70:192-199,1987.PubMed:3496132)。Hep G2是分离自肝脏(肝癌)的人肝细胞癌细胞系(ATCC#HB-8065;Aden et al.,Nature282:615-616,1979.PubMed:233137)。RS4;11是分离自骨髓的人急性淋巴细胞白血病(混合谱系白血病，MLL-AF4)细胞系(ATTC#CRL-1873;Stong et al.,Blood65:21-31,1985.PubMed:3917311)。HT-29是分离自结肠(结肠癌)的人结直肠腺癌细胞系(ATTC#HTB-38;Fogh et al.,J.Natl.Cancer Inst.58:209-214,1977.PubMed:833871)。NUGC-4是分离自胃旁淋巴结的人胃癌细胞系(JCRB#JCRB0834;Akiyama et al.,Jpn.J.Surg.,18:438-446,1988)。PC-3是最初分离自骨转移(前列腺癌)的人前列腺癌细胞系(ATCC#CRL-1435;Kaighn et al.,Invest.Urol.17:16-23,1979.PubMed:447482)。
测试抗BKB2R单克隆抗体(1F12G7和5F12G1)在癌细胞系 BxPC-3、MV-4-11、Hep G2、RS4;11、HT-29和NUGC-4中的细胞毒 性 利用每种细胞系的ATCC(ATCC,Manassas,VA)指南所建议的培养液、血清和培养条件培养细胞系。在第0天，将细胞以30,000细胞/孔接种于96-孔培养板体积为0.1mL的完全培养液中。然后将平板置于37℃，具有5%CO2和95%HEPA过滤的室内空气的加湿孵育器中24小时。接着，将0.1mL无血清培养液添加至指定的孔中，并将平板放回孵育器120小时(5天)，所述0.1mL无血清培养液中，以期望的终浓度的2倍(50,000ng/ml、25,000ng/ml、12,500ng/ml、6,250ng/ml、3125ng/ml、1563ng/ml、781ng/nl、391ng/ml、195ng/ml或98ng/ml)稀释每种测试抗体。使用以下浓度的阳性对照(0.1mL2倍浓度的抗癌药物顺铂)：300,050.000ng/ml、75,012.500ng/ml、18,753.125ng/ml、4,688.281ng/ml、1,172.070ng/ml、293.018ng/ml、73.254ng/ml、18.314ng/ml、4.578ng/ml或1.145ng/ml。
MTT试验 利用ATCC的MTT细胞增殖试剂盒(产品编号30-1010K)体外评估测试化合物对指定细胞系的抗增殖活性。用药物(如抗BKB2R mAb或顺铂)孵育120小时之后，通过向每个孔添加MTT试剂并额外孵育4小时来测定细胞增殖。该步骤之后，添加细胞裂解/MTT溶解试剂并过夜孵育。测定测试孔的吸光度(570nm)，然后相对于未容纳药物的对照孔定量。结果表示为百分比抑制相对化合物浓度并作图，对于细胞系BxPC-3、MV-4-11、HepG2、RS-4;11、HT-29、NUGC-4和PC-3，分别如图19至图25所示。基于这些结果，计算每种抗体在每种细胞系中的EC50浓度，并在以下表3中相对于顺铂处理的对照列表。暴露120小时之后，所测试的抗BKB2R mAb对所有测试癌细胞系都显示显著的细胞毒性。
表3 抗BKB2R mAb对癌细胞系的细胞毒性
Figure BDA00003538139100721
实施例6 缓激肽受体激动剂单克隆抗体5F12G1提高胰岛素敏感性
高胰岛素-正常血糖钳夹技术(hyperinsulinemic euglycemic clamp)被认为是测定2型糖尿病药物的胰岛素敏感性效应的标准体内技术。在本方法中，给予测试动物胰岛素来提高胰岛素浓度，同时输注葡萄糖来维持血糖正常。维持血糖正常所需要的葡萄糖输注比(GIR)是胰岛素作用或提高胰岛素敏感性的反映。在血糖钳夹研究中测试了缓激肽受体激动剂(抗BKB2R)单克隆抗体克隆5F12G1，以测定其提高胰岛素敏感性的能力。
材料和方法 研究使用体重275-300g的健康年幼雄性SpragueDawley大鼠(Harlan Laboratory,Indianapolis,USA)。在受控的环境(温度70-72℉，湿度30-70%，12小时光照和12小时黑暗的光周期)中喂养大鼠。并随意供给大鼠TEKLADTM2018-Global18%食物和饮用水。适应环境7天之后，将大鼠分成4组。
高胰岛素-正常血糖钳夹试验 通过腹膜内注射氯胺酮加上甲苯噻嗪混合物来麻醉动物，并且通过皮瓣切口从外部向右颈静脉和左颈动脉插入导管。让插入导管的动物恢复5天。恢复5天之后，使动物禁食6小时，然后施加120-分钟的高胰岛素-正常血糖钳夹，以4mU/kg/分钟的恒速连续输注人胰岛素(Humulin,Eli Lilly,Indianapolis,IN)。同时，以变速输注20%葡萄糖溶液，并且每10分钟调整一次速率以维持115±5mg/dl的目标血糖水平。胰岛素和葡萄糖都通过插入右颈静脉的导管输注，从插入导管的左颈动脉监测血糖水平。利用血糖仪(Accu-ChekTM Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)和大鼠胰岛素ELISA试剂盒，在输注之前t=-120、-90、-30、-15和0分钟测定动脉血糖水平和血浆胰岛素水平，然后每10分钟测定一次，总共120分钟(t=120)。所述钳夹持续120分钟(t=120)之后终止试验。用PBS(i.m.)在t=-30分钟时注射载体组，用抗体5F12G1(i.m.)在t=-30分钟时以0.5mg/kg浓度注射处理组。
用抗体5F12G1处理之后，葡萄糖输注率显著提高，与载体相比最高增加291%(t=60分钟)(p=0.0066)，与载体相比总葡萄糖输注率的AUC增加179%(p=0.0035)。这些结果表明5F12G1通过增强胰岛素作用显著提高胰岛素敏感性的能力。将这些结果列表(表4)，将葡萄糖输注率作为时间的函数(图26)和曲线下面积(AUC)的函数(图27)作图。
表4 计算的葡萄糖输注率曲线下面积(mg/kg)
动物# 载体 5F12G1
1 1193 4560
2 1746 4317
3 1693 3243
4 673 2685
实施例7 5F12G1对Zucker糖尿病肥胖大鼠OGTT的影响
本实施例描述了对用5F12G1单克隆抗体处理的Zucker糖尿病肥胖大鼠(ZDF fa/fa)的口服葡萄糖耐量的评价。雄性ZDF fa/fa大鼠(Charles River)随意用Harlan Tekled食物和Arrowhead饮用水喂养，并让其适应一周。根据以下处理组处理每组的6只动物：1，无菌PBS(载体对照)；2，1.0mg/kg鼠单克隆抗体(mAb)5F12G1(VH包含SEQ IDNO:1，VL包含SEQ ID NO:2)；3，0.2mg/kg mAb5F12G1；4，0.04mg/kgmAb5F12G1。
口服葡萄糖耐量试验 对过夜禁食(16小时)的大鼠进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。葡萄糖负荷之前30分钟，皮下给予载体对照(PBS)或5F12G1单克隆抗体。在蒸馏水中制备D-葡萄糖并以2g/kg体重口服给予。
在多个时间点(0、15、30、60、90和120分钟)采集每次大约50μl的血样，并处理以分离血浆。利用超灵敏小鼠胰岛素ELISA试剂盒(Crystal Chem,Inc.,Downers Grove,IL)，通过ELISA法分析血浆样品的胰岛素。利用微软Excel或Windows的GraphPad Prism5.00版(GraphPad Software,San Diego California USA)收集ELISA数据并用于计算平均值±标准误差(SEM)。
结果 结果示于图28A、图28B、图29A和图29B中。DIO大鼠口服负荷葡萄糖之后，与用载体对照的处理相比，单次给予单克隆抗体5F12G1(1.0、0.2和0.04mg/kg)降低了血糖浓度的曲线下面积(AUC)。1.0mg/kg的血糖AUC的降低较高，之后为0.2和0.04mg/kg体重。单克隆抗体5F12G1剂量依赖地增加OGTT ZDF fa/fa大鼠中的胰岛素活性。
实施例8 5F12G1对DIO小鼠OGTT的影响
本实施例描述了对用抗BKB2R单克隆抗体5F12G1(VH包含SEQID NO:1，VL包含SEQ ID NO:2)处理的饮食诱导肥胖(DIO)小鼠的口服葡萄糖耐量的评价。雄性C57BL/6J小鼠(Jackson Laboratory,BarHarbor,ME)随意用Research Diet的60kcal%脂肪食物和Arrowhead饮用水喂养，并让其适应8周的时间。根据以下处理组处理每组10只动物：1，无菌PBS(载体对照)；2，1.0mg/kg鼠单克隆抗体(mAb)5F12G1；3，0.2mg/kg mAb5F12G1；4，0.04mg/kg mAb5F12G1。
口服葡萄糖耐量试验 对过夜禁食(16小时)的小鼠进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。葡萄糖负荷之前30分钟，皮下给予载体对照(PBS)或5F12G1单克隆抗体。在蒸馏水中制备D-葡萄糖并以2g/kg体重口服给予。利用Accu-ChekTM血糖仪(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)，根据厂商说明书，在给予载体或5F12G1之前(-30分钟)和正好负荷葡萄糖时(0分钟)以及随后15、30、60、90和120分钟的时间点测定血糖水平。
在多个时间点(0、15、30、60、90和120分钟)采集每次大约50μl的血样，并处理以分离血浆。利用超灵敏小鼠胰岛素ELISA试剂盒(Crystal Chem,Inc.,Downers Grove,IL)，通过ELISA法分析血浆样品的胰岛素。利用微软Excel或Windows的GraphPad Prism5.00版(GraphPad Software,San Diego California USA)收集ELISA数据并用于计算平均值±标准误差(SEM)。
结果 结果示于图30A、图30B和图31中。DIO大鼠口服负荷葡萄糖之后，与用载体对照的处理相比，单次给予单克隆抗体5F12G1(1.0、0.2和0.04mg/kg)降低了血糖浓度的曲线下面积(AUC)。1.0mg/kg的血糖AUC的降低较高，之后为0.2和0.04mg/kg体重。单克隆抗体5F12G1剂量依赖地增加OGTT DIO小鼠中的胰岛素活性。
实施例9 5F12G1是人缓激肽B2受体的激动剂
本实施例描述了通过下游细胞内钙释放所测定的单克隆抗BKB2R抗体5F12G1对缓激肽受体B2的剂量依赖性刺激反应的测试。使用表达人BKB2受体的稳定CHO细胞系(CHO-K1/B2/Gα15)来筛选。将抗体从0.5mg/ml经3倍稀释增量而稀释成5种不同的浓度，对一式两份细胞样品进行筛选。
通过暴露于阳性对照缓激肽来验证CHO-K1/B2/Gα15细胞系中的人BKB2受体的表达和功能活性。EC50值与所报道的缓激肽值相似。512G1抗体的刺激活性相对阳性对照标准化；数据收集为%激活。
为进行分析，在试验日之前20小时，将CHO-K1/B2/Gα15细胞以每孔20μL生长培养液中20,000细胞的密度接种于384-孔黑壁透明底平板的孔中，并在37℃/5%CO2下维持。将20μL负荷染料的溶液(FLIPRTM Calcium4assay kit,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)添加至每个孔，并将平板置于37℃孵育器60分钟，之后置于室温15分钟。总读数时间是120秒。20秒读数建立基线之后，将抗体或激动剂添加至所选择的孔，在另外的100秒(21至120秒)捕获荧光信号。选择来自含有用分析缓冲液(0.03%Na3N PBS，含1%DMSO)刺激的细胞的孔的读数作为筛选的背景值，选择来自用激动剂缓激肽(10uM)刺激的细胞的孔的读数作为阳性对照。
结果 对于用mAb5F12G1处理的细胞，0.5mg/ml时激活百分率为72.7+/-3.5%(平均值+/-SD,n=2)，ED50为0.24mg/ml。对于用缓激肽处理的细胞，激活百分率为93.1+/-5.7%(平均值+/-SD,n=2)，ED50为0.95nm/l。暴露于单克隆抗体5F12G1因而导致表达人缓激肽受体B2的细胞高%激活。
实施例10 给予5F12G1抗体对慢性2型糖尿病的影响
本实施例描述了与艾塞那肽、西他列汀和mAb MG2b-57相比，三种不同剂量的抗BKB2R mAb5F12G1对ZDF fa/fa大鼠慢性II型糖尿病模型的影响的21天评估。
ZDF fa/fa大鼠是基于由遗传的肥胖基因突变(其导致胰岛素抵抗)而引起葡萄糖耐量受损的2型糖尿病模型。ZDF fa/fa大鼠中，高血糖症在大约7周龄时初次显现，并且肥胖的雄性大鼠到大约12周时完全患糖尿病。在7周至10周龄之间，这些动物的血液胰岛素水平升高(高胰岛素血症)，但是随后由于胰腺β细胞停止响应葡萄糖刺激，胰岛素水平降低。
空腹高血糖症，在10至12周龄时初次出现，随着年龄增长而发展；胰岛素抵抗和异常葡萄糖耐量随着年龄增长而变得越来越严重。未经处理的话，ZDF大鼠最终表现出高血脂症、高甘油三酯血症和高胆固醇血症，导致轻度高血压。
在本研究中所使用的测试化合物和载体是：1.小鼠单克隆抗BKB2R抗体5F12G1(IgG2b,κ)；2.小鼠单克隆抗体MG2b-57(BioLegend,San Diego,CA)，选择作为5F12G1的同型匹配对照(IgG2b,κ)，具有不相关的抗原特异性(例如阴性对照)；3.西他列汀(Selleck Chemicals LLC,Houston,TX)；4.艾塞那肽(Bachem Americas,Torrance,CA)。
西他列汀(Januvia
Figure BDA00003538139100761
)是二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂类的抗高血糖药(抗糖尿病药)。西他列汀通过竞争性抑制酶二肽基肽酶-4(DPP-4)起作用，所述酶分解响应于进餐而释放的肠胃激素——肠促胰岛素GLP-1和GIP。通过防止GLP-1和GIP失活，它们能够通过胰腺增强胰岛素分泌并抑制胰高血糖素释放。这种作用促使血糖水平正常化。
艾塞那肽是39个氨基酸的肽，胰岛素促分泌素，具有糖调节的作用。艾塞那肽是合成形式的exendin-4——其是显示类似于人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的生物特性的激素，所述人胰高血糖素样肽-1是葡萄糖代谢和胰岛素分泌的调控因子。艾塞那肽增强胰腺β细胞的葡萄糖依赖的胰岛素分泌，抑制不适当增加的胰高血糖素分泌并减慢胃排空。
动物雄性ZDF fa/fa大鼠获自CRL(Kingston,NY)。送达时大鼠7周龄。将大鼠单独安置于每个笼中，置于12小时光照和12小时黑暗光周期的房间，环境温度70-72℉，并用常规啮齿动物食物和水随意喂养。11周龄时，基于空腹血糖水平，将大鼠分成6组(表5)，每组8只大鼠。每组4只大鼠的亚组与主组平行饲养，为了高胰岛素-正常血糖钳夹试验，进行类似给药21天。
表5 ZDF fa/fa大鼠组
Figure BDA00003538139100771
每三天一次皮下给予测试化合物5F12G1和MG2b-57。在21天的时间中，每天两次腹腔内给予艾塞那肽，每天一次口服给予西他列汀。分别以下列剂量给予：5F12G1，三种不同的剂量：0.2、0.4和0.008mg/kg；艾塞那肽，1μg/kg；西他列汀，10mg/kg；MG2b-57，0.2mg/kg。
在第0、7、14和21天对每个研究组进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。在OGTT期间的每个时间点还采集血浆样品来测定胰岛素水平。体重、食物和饮水量一周测定两次。利用非入侵性尾套法，在第0、7、14和21天监测血压和心率(每只大鼠读取5次读数然后求平均值)。OGTT之前第0、7、14和21天采集空腹血清样品，用于测定甘油三酯和总胆固醇水平。在第7和14天采集尿样用于测定糖尿。研究结束时，测定糖化(糖基化)血红蛋白(HbA1c)。这些研究的分析试剂盒列于表6中，按照供应商说明书使用。
表6 分析试剂盒
Figure BDA00003538139100781
口服葡萄糖耐量试验(OGTT)
由于本研究开始时大鼠的年龄，预期ZDF fa/fa大鼠具有轻微的胰岛素抵抗，导致OGTT期间血糖水平比正常增加的更高。预期大鼠的胰岛素抵抗在21天研究期间随着动物年龄增长而增加，导致随后的OGTT血糖水平更高。
在第0、7、14和21天进行OGTT。大鼠禁食过夜并测定空腹血糖水平(t=0min)，然后每只大鼠通过经口喂食给予1.5ml单次剂量的葡萄糖溶液(溶解于去离子水中的D-(+)-葡萄糖(G7528,Sigma)，2g/kg体重)。然后通过葡萄糖仪在15、30、60、90和120分钟测定血糖水平来观测来自血液的葡萄糖随时间的清除率。OGGT的每个时间点采集大约50-60μl血液并处理成血浆来测定胰岛素水平。
第0天，如预期，所有组显示相似模式的对OGTT的血糖反应：血糖水平从t=0分钟时约100mg/dl增加，并在t=30分钟时达到峰值约340-370mg/dl，然后在接下来的60至90分钟逐渐回落到基线(参见图32A)。第7、14和21天时，阴性对照组MG2b-57中的大鼠逐步显示更高的空腹血糖水平，更高的峰值血糖水平，并且葡萄糖水平在OGTT期间随着时间延长而升高。该结果是预期的，因为ZDF大鼠发展成2型糖尿病并逐步丧失血糖控制。处理21天之后，阴性对照组MG2b-57中的大鼠和西他列汀处理组中的动物在OGTT开始时具有明显更高的空腹血糖水平(228mg/dl)，并且血糖水平在30分钟时升高到488mg/dl并保持高水平(图32B)。OGTT期间血糖水平的这种增加表明如预期的，ZDF fa/fa大鼠正在向2型糖尿病发展。然而，与阴性对照大鼠相比，用5F12G1处理的大鼠在OGTT开始时具有显著更低的血糖水平(对于0.2mg/kg的组，150+/-20mg/dl；对于0.04mg/kg的组，163+/-40mg/dl；对于0.008mg/kg的组，190+/-40mg/dl)。OGTT期间第21天时5F12G1的血糖谱与第0天时的相似(参见图32B)，30分钟时具有以下血糖水平峰值：对于0.2mg/kg，312mg/dL；对于0.04mg/kg，355mg/dL；对于0.008mg/kg，400mg/dL，然后降低。用艾塞那肽处理的大鼠具有类似于低剂量5F12G1的OGTT谱。这些结果表明，用抗BKB2R mAb5F12G1处理预防或延缓胰岛素抵抗和2型糖尿病发作。
以上所述的OGTT期间测定的总血糖水平表示为曲线下面积(AUC)。所有组中的大鼠在第0天时具有的AUC血糖范围为27044-31167(mg/dL(分钟))，参见图33。第7、14和21天时，如预期，阴性对照组(MG2b-57)中的血糖水平由于2型糖尿病的发展而增加，导致随后每一次OGTT中显著更高的葡萄糖AUC(数据未显示)。到第21天，用MG2b-57处理的大鼠具有50569.88+/-4124.62mg/dL(分钟)的AUC量，西他列汀处理组具有53765.75+/-2281.45mg/dL(分钟)的AUC量，这等于用艾塞那肽获得的血糖AUC(39450.13+/-6087.89mg/dL(分钟))。相比之下，5F12G1(0.2mg/kg)处理组第21天时具有33241.13+/-3910.62mg/dL(分钟)的AUC葡萄糖，并且与西他列汀和MG2b-57相比，第7、14和21天时具有统计学上更低的血糖AUC。用5F12G1处理的大鼠第7、14和21天时具有的AUC血糖水平与第0天时相似，表明用5F12G1处理预防胰岛素抵抗的进一步发展并维持葡萄糖控制。
预期ZDF大鼠中的胰岛素水平过了11周龄时显著降低。OGTT期间第0天测定了平均血浆胰岛素浓度并示于图34A。如预期，第0天组间没有观测到显著差异，并且平均空腹胰岛素水平为大约8-11ng/ml，在OGTT期间15分钟时增加至大约15-19ng/ml。然而，第7天时，与空腹期间和OGTT期间第0天时相比，用阴性对照MG2b-57处理的大鼠具有显著降低的胰岛素水平。用5F12G1处理的动物OGTT期间第7天时具有的胰岛素水平相当于第0天时的胰岛素水平。到第21天，用5F12G1以0.2、0.04和0.008mg/kg处理的动物具有的胰岛素水平相当于第0天时的胰岛素水平，与MG2b-57、西他列汀和艾塞那肽相比，具有显著更高的胰岛素水平(参见图34B)。用0.2、0.04和0.008mg/kg的5F12G1处理的动物分别具有17+/-5、12+/-3和14+/-3ng/ml的空腹胰岛素水平，OGTT15分钟时增加到30+/-7、26+/-3和24+/-6ng/ml，然后回落到基线。相比之下，阴性对照组中的动物具有4+/-1.6ng/ml的空腹胰岛素水平，15分钟时增加到9+/-2.8。用西他列汀和艾塞那肽处理的大鼠分别具有10+/-3.5和7+/-2.5ng/ml的空腹胰岛素水平，15分钟时两组都增加到15+/-4ng/ml，然后缓慢降低。用5F12G1处理的组中检测到第21天时胰岛素分泌接近正常水平，很可能是由于维持了胰岛素敏感性(防止胰岛素抵抗，高胰岛素血症)，血糖控制以及全部β细胞功能。
预期ZDF fa/fa大鼠在研究开始时具有略微升高的空腹血糖水平。预期空腹血糖水平的这种升高随着大鼠年龄增长而增加。在第0、7、14和21天测定空腹血糖水平。所有组中的空腹血糖水平在第0天时为大约117-120mg/dl。如预期，阴性对照组中的空腹血糖水平在第7、14和21天时增加，西他列汀组中的水平也增加。到第21天时，阴性对照组(MG2b-57)和西他列汀组中的空腹血糖水平从基线116.5+/-25.8mg/dl分别增加到227.5+/-34.3mg/dl和247+/-14mg/dl(参见图35)，MG2b-57增加了111.0+/-12.1mg/dl。5F12G1组(0.2mg/dl)中的空腹血糖水平到第21天时仅从117.6+/-14.2mg/dl分别增加到大约150.8+/-56.5、163+/-21和190+/-40mg/dl，从基线增加了33.1+/-19.7mg/dl。与阴性对照动物相比，用高剂量5F12G1处理的ZDF大鼠的空腹血糖水平具有显著更低的增加(p=0.0058)。艾塞那肽处理组第21天时的空腹血糖水平同样相对少量的增加到167+/-22mg/dl。用5F12G1处理防止空腹血糖水平以剂量依赖的方式增加。如通过空腹血糖水平所测定，通过5F12G1预防2型糖尿病发展与艾塞那肽类似，比西他列汀提高，并且是维持血糖控制和胰岛素敏感性的指示。
利用实验室天平在给药之前测定体重，之后每周测定两次。11周龄的ZDF大鼠未达到它们的最大体重，预期体重会增长。用所有剂量的5F12G1处理的动物组到第21天时体重增长大约13+/-1%，而阴性对照、艾塞那肽和西他列汀处理组中的动物到第21天时体重增长大约10+/-2%。用5F12G1处理的动物的体重增长很可能是由于改善了动物健康状况，特别是预防了2型糖尿病发展。
通过提供测定的食物和水的量并减去测定的剩余食物和水的量，每周两次测定摄取的食物和水。5F12G1组(所有剂量组)中的摄食量略低，并且与MG2b-57、西他列汀和艾塞那肽处理组相比有显著区别。第0天时，所有动物的摄食量为大约29-30g/大鼠/日。到第21天时，与5F12G1组(0.2mg/kg时，28+/-1g/大鼠/日；0.04mg/kg时，27+/-2g大鼠/日；0.008mg/kg时，30+/-0.5g/大鼠/日)相比，MG2b-57(33+/-1g/大鼠/日)、艾塞那肽(31+/-1g/大鼠/日)和西他列汀(31+/-2g/大鼠/日)处理组的摄食量略高。然而，与以全部三个剂量组的5F12G1处理的动物(0.2mg/kg时，26+/-3ml/大鼠/日；0.04mg/kg时，40+/-10ml/大鼠/日；0.008mg/kg时，28+/-4ml/大鼠/日)相比，用MG2b-57(59+/-10ml/大鼠/日)、艾塞那肽(48+/-4ml/大鼠/日)和西他列汀(48+/-7ml/大鼠/日)处理的动物的摄水量显著增加。阴性对照和西他列汀组中增加的摄水量可能是由于更高的血糖水平，这会导致多尿症。5F12G1处理组中减少的摄水量可表明更好的血糖控制且动物未发展成糖尿病。与对照动物相比，用5F12G1处理的动物摄食量减少但体重增长同样表明更好的血糖控制。
血清采集第0、7、14和21天时，通过剪尾从空腹大鼠采集血样置于血清分离管(BD Biosciences,USA)，并使血液于室温静置30分钟。然后离心样品，将血清上清液用移液管转移至0.5ml eppendorfTM微离心管中，于-80℃保存用于分析总胆固醇和甘油三酯水平。
血浆采集OGTT试验期间第0、7、14和21天时，在每个时间点(0、15、30、60、90和120分钟)，通过剪尾从大鼠采集血样置于含有肝素锂(BD Biosciences,USA)的管中并放置于冰上。然后于4℃离心样品以分离血浆，将血浆上清液用移液管转移至0.5ml eppendorfTM管中，于-80℃保存用于分析胰岛素水平。
尿液采集第7和14天(OGTT之后24小时)时，通过现留(spot)采集法从每只大鼠采集尿样。利用葡萄糖自动型试剂盒(WakoChemicals USA,Inc.)，按照厂商说明书，对尿样进行糖尿分析。
血浆、血清和尿液的分析如以上所述，保持未处理的ZDF大鼠最终出现高脂血症、高甘油三酯血症和高胆固醇血症，导致轻度高血压。利用Wako试剂盒(Wako Chemicals USA,Inc.Richmond,VA)对血清样品进行甘油三酯和总胆固醇浓度分析。利用葡萄糖自动型试剂盒(Wako Chemicals USA,Inc.Richmond,VA)分析尿样。第0、7、14和21天时测定血清中的总胆固醇水平(参见图36)。11周龄的ZDF大鼠中第0天时的总胆固醇范围为144-169mg/dl，比正常大鼠高大约2倍。如预期，用MG2b-57处理的动物第21天时具有显著更高的血清胆固醇水平(198+/-11ml/dl)，从基线增加了28+/-11mg/dl，这类似于用艾塞那肽处理的大鼠第21天时所测定的血清胆固醇水平(195+/-11ml/dl)。用0.2mg/kg5F12G1处理的动物的血清胆固醇在处理期间降低，第21天时为145+/-26mg/dl，从基线降低了12+/-8mg/dl。0.04和0.008mg/kg5F12G1处理组中的血清胆固醇在整个研究过程中略微增加，到第21天时分别为162+/-18和167+/-7mg/dl。西他列汀处理组中的血清胆固醇到第21天时为170+/-14mg/dl。与阴性对照相比，用5F12G1处理预防ZDF大鼠发展成高胆固醇血症，在5F12G1最高剂量组中，差异是统计学上显著的(p=0.0156)。
第0、7、14和21天测定甘油三酯水平。第0天时ZDF大鼠的血清甘油三酯水平是600至750mg/dl，或比正常大鼠高大约3倍。整个研究中各个组之间未观测到血清甘油三酯水平有显著差异。
第21天时测定糖基化或糖化血红蛋白A1c(HbA1c)的百分比，平均值示于图37中。预期ZDF fa/fa大鼠的HbA1c水平增加，因为动物随着年龄增长变得血糖过多。如预期，到第21天，在用MG2b-57处理的动物中检测到显著更高的HbA1c百分比(8.8+/-0.7%)，并且在艾塞那肽(7.9+/-0.8%)和西他列汀(8.8+/-0.4%)处理组中检测到类似的HbA1c百分比。在5F12G1的全部剂量组中检测到显著更低的HbA1c百分比，高剂量5F12G1具有6.3+/-0.5%百分比，较低剂量的组具有稍微更高的量。高剂量5F12G1和阴性对照动物之间的HbA1c百分比差异是-2.58+/-0.85，并且是统计学上显著的(p=0.0103)。这些结果与用5F12G1处理的大鼠中检测到更低的血糖水平相一致，表明与艾塞那肽或西他列汀相比，5F12G1提供了更好的保护，使ZDF fa/fa大鼠免于增加HbA1c。
随着研究的进展，预期ZDF fa/fa大鼠具有增加的尿糖水平。由于大鼠发展成2型糖尿病，增加的血糖水平最终导致尿液中出现过量的葡萄糖。第7和14天时测定尿糖水平，第14天的结果示于图38中。第14天时，观测到显著差异，在用MG2b-57处理的大鼠尿液中检测到最高的葡萄糖水平(98+/-14mg/dL)，用艾塞那肽和西他列汀处理的大鼠中同样检测到升高的尿糖。与MG2b-57、艾塞那肽和西他列汀相比，用0.2、0.04和0.008mg/kg5F12G1处理的所有组(分别为31+/-2、49+/-6和54+/-11mg/dL)具有显著更低的尿糖水平。这些结果进一步证实了用5F12G1处理预防大鼠发展高血糖症。
利用血压检测仪和数据采集软件进行血压测量。在第0、7、14和21天时，通过在血压监测之前大约10至15分钟将大鼠置于专业限制器中，用保温垫来控制温度，来进行测量。然后将闭塞袖带(occlusioncuff)滑到尾巴根部，之后是VPR(容量压力记录)传感器袖带。VPR传感器利用差压变换器来非入侵性测量尾部血容量，测定收缩压、舒张压和心率。每只大鼠读取5个读数，所示出的数据为平均值。
第0、7、14和21天时监测收缩压、舒张压和心率，数据示于图39、图40和图41中。如预期，第0天时，未观测到各组之间的收缩压、舒张压和心率的测量结果有显著差异(图39A、图40A和图41A)。所有接受5F12G1给药的动物在第21天时观测到收缩压、舒张压和心率的测量结果(参见图39B、图40B和图41B)低于对照组MG2b-57。用5F12G1处理很可能是通过预防2型糖尿病发作而导致ZDF fa/fa大鼠的收缩压和舒张压降低，以及心率降低。特别地，以最高剂量的5F12G1处理导致舒张压从基线增加了0.12+/-4.4mm Hg，与阴性对照组增加了25.5+/-2.9mm Hg相比，具有统计学上的显著性差异(p=0.0004)。
高胰岛素-正常血糖钳夹研究研究和定量胰岛素抵抗的金标准是高胰岛素-正常血糖钳夹，如此命名是因为其测定补偿增加的胰岛素水平所必须的葡萄糖量而不引起低血糖症。处理21天之后，使未实施之前测试的亚组中的动物(每种处理N=4)禁食过夜，并对亚组中的动物进行120分钟的高胰岛素-正常血糖钳夹研究。使动物麻醉并在整个过程中使其保持处于异氟烷麻醉之下。将导管插入隐静脉和股动脉。使用隐静脉导管输注人胰岛素(Humalin
Figure BDA00003538139100841
R,Eli Lilly,Indianapolis,IN)和20%的葡萄糖溶液。使用股动脉导管采集血样并监测动脉血糖水平。钳夹研究开始时，以8mU/kg/分钟的恒速输注胰岛素。为了补偿胰岛素输注导致的血糖水平下降，以变速输注20%葡萄糖溶液，每10分钟调整一次速率以维持目标血糖水平。利用血糖仪(Accu-Chek
Figure BDA00003538139100842
RocheDiagnostics)，在输注前t=-120、-90、-30和0分钟测定动脉血糖水平，然后每10分钟测定一次，总共120分钟(t=120)。测试期间的葡萄糖输注率(GIR)决定了胰岛素敏感性。如果需要高GIR来补偿胰岛素输注，则认为动物是胰岛素敏感的。如果需要低的GIR则认为动物对胰岛素作用有抵抗。
高胰岛素-正常血糖钳夹研究期间测定了葡萄糖输注率(GIR)、AUC-GIR和动脉血糖，AUC-GIR的数据示于图42中。如预期，用阴性对照MG2b-57处理的大鼠对胰岛素抵抗，并且具有低的AUC-GIR。用0.2和0.04mg/kg5F12G1处理的动物，具有显著更高的AUC-GIR，表明21天之后所述处理保留了这些动物的胰岛素敏感性。用西他列汀和艾塞那肽处理的组的AUC-GIR类似于高剂量5F12G1的处理组。用5F12G1处理21天保留了ZDF fa/fa大鼠的胰岛素敏感性。
数据分析 数据以从微软Excel或Windows的Graph Pad Prism5.00版(Graph Pad Software,San Diego California USA)获得的平均值±标准误差(SEM)示出。利用Graph Pad Prism
Figure BDA00003538139100843
软件的T检验分析计算P值。组间差异P<0.05被认为是显著的。
利用协方差分析调整基线水平，对高剂量(5F12G1,0.2mg/kg)和阴性对照(MG2b-57,0.2mg/kg)组之间从基线(第0天)至第21天的空腹血糖(mg/dL)、血清胆固醇(mg/dL)以及收缩压(mm Hg)的平均变化量进行比较。利用独立于两样本t-检验的不等方差，对高剂量(5F12G1,0.2mg/kg)大鼠的平均HbA1c百分比与阴性对照(MG2b-57,0.2mg/kg)大鼠的平均HbA1c百分比进行了比较。所有检验中以α=0.05作为显著水平，所有分析利用SAS统计软件(vs.9.2,Cary,North Carolina,U.S.A.)进行。
总之，以不同剂量给予5F12G1是耐受良好的且未发现有毒性作用。
以0.2和0.04mg/kg每日给予ZDF fa/fa大鼠5F12G121天，如通过OGTT所测定，预防了发展胰岛素抵抗，维持了血糖控制、胰岛素分泌、血糖水平和HbA1c。用MG2b-57、西他列汀和艾塞那肽处理的动物的上述参数全部都显著恶化。与其他处理组相比，5F12G1处理还预防了血压、心率、甘油三酯和胆固醇水平的升高。
实施例11 抗BKB2R抗体的序列
本实施例描述了鼠单克隆抗BKB2R抗体5F12G1的测序。利用RNAeasyTM试剂盒，根据厂商说明书(Qiagen,Valencia,CA)，提取杂交瘤5F12G1的总RNA。利用MMLV逆转录酶，通过改进的5’-RACETM试剂盒(SMART RACE cDNA kit,Clontech,Mountain View,CA)说明书所述的方法合成cDNA。
利用以下序列中的一种作为RACE-特异性引物，如所述(ClontechSMART RACETM kit)进行5’-RACE PCR：小鼠IgG1、IgG2a，MOCG12FOR(CTC AAT TTT CTT GTC CAC CTT GGT GC)(SEQ IDNO:61)；小鼠IgG2b，MOCG2bFOR(CTC AAG TTT TTT GTC CACCGT GGT GC)(SEQ ID NO:62)；小鼠IgG3，MOCG3FOR(CTC GATTCT CTT GAT CAA CTC AGT CT)(SEQ ID NO:63)；IgM，MOCMFOR(TGG AAT GGG CAC ATG CAG ATC TCT)(SEQ ID NO:64)；小鼠κ，CKMOsp(CTC ATT CCT GTT GAA GCT CTT GAC AAT GGG)(SEQID NO:65)；小鼠λ1，CL1FORsp(ACA CTC AGC ACG GGA CAA ACTCTT CTC CAC AGT)(SEQ ID NO:66)；CL2FORsp(ACA CTC TGCAGG AGA CAG ACT CTT TTC CAC AGT)(SEQ ID NO:67)，以及CL4FORsp(ACA CTC AGC ACG GGA CAA ACT CTT CTC CAC ATG)(SEQ ID NO:68).(A Bradbury,通过RACE克隆杂交瘤cDNA，抗体工程，第二版，2010)。
利用标准链终止技术从两端对cDNA进行测序，并利用Topo TA克隆试剂盒(Life Technologies)克隆至pCR-Topo2.1。利用M13反向引物(TCACACAGGAAACAGCTATGA)(SEQ ID NO:69)和T7正向引物(TAATACGACTCACTATAGG)(SEQ ID NO:70)，对含有cDNA的克隆进行测序。
所得到的序列是SEQ ID NO:49所示的鼠5F12G1免疫球蛋白重链可变区结构域编码序列和SEQ ID NO:50所示的鼠5F12G1免疫球蛋白轻链可变区结构域编码序列。鼠5F12G1免疫球蛋白重链可变区结构域推测翻译的氨基酸序列以SEQ ID NO:1示出，鼠5F12G1免疫球蛋白轻链可变区结构域推测翻译的氨基酸序列以SEQ ID NO:2示出。
接着，将本文公开的能特异性结合人BKB2R且发挥激动剂作用的鼠杂交瘤mAb5F12G1人源化，以获得会避免针对小鼠单克隆抗体的潜在的人免疫反应(免疫原性)的抗BKB2R单克隆抗体，从而允许在人中多次注射和/或长期应用抗体。
通过将适当的小鼠互补性决定区(CDR)编码节段(负责期望的结合特性)插入至人抗体“支架”来完成抗体人源化处理。利用Kabat法(Kabat EA,et al.(1991))Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition.NIH Publication No.91-3242)鉴定抗体重链中的三个小鼠CDR区(SEQ ID NOS:43-45)和轻链中的三个CDR区(SEQ ID NOS:46-48)，并将其移植至VH和VL人供体支架区。针对小鼠抗体的人源化首次描述了CDR移植法(Queen,et al.Proc Natl Acad Sci USA.(1989)Dec;86(24):10029-33)，最近由Tsurushita和Vasquez(2004)以及Almagro和Fransson(2008)(Tsurushita N,et al.,J Immunol methods.2004Dec;295(1-2):9-19;Almagro JC and Fransson J.Front Biosci.(2008)13:1619-33)修订。
为确定能最好接受小鼠CDR并允许与表位结合的人抗体基因序列，分析了小鼠5F12G1单克隆抗体序列周围的Fv区，并且利用由Panorama Research Inc.(Sunnyvale,California,USA)和LakePharma,Inc.(Belmont,California,USA)提供的专有方法，使用最佳拟合(best-fit)法来选择适当的供体人基因序列。
简而言之，所使用的人抗体框架序列是生殖系或接近生殖系。与生殖系基因VH3-33、VH3-73、VH3-7等相关的人VH序列提供了最佳匹配。与生殖系基因VK2-28、VK2-30等相关的人VL序列提供了最佳匹配。利用轻链和重链可变区的组合来产生模型，构建了靶抗体的Fv的几个3D模型。用于选择主链的一些考虑在于，人模板使CDR长度和典型结构与由小鼠5F12G1序列预测的那些匹配。鉴定了鼠和人之间不同且可能影响抗原结合的框架区中的氨基酸位置。人抗体所有组成部分中显示高度利用的框架主链的某些抗体基因是选择的积极因素，因为其相对于其他生殖系选择在结构上有意义的框架位置处具有良好的保守性。
由Panorama Research Inc.(Sunnyvale,California,USA)完成的专有人源化优化产生了序列表中分别以SEQ ID NOS:3-4和8-9示出的人源化抗BKB2R免疫球蛋白重链(H1、H2)和轻链(L1、L2)可变区结构域。由LakePharma,Inc.(Belmont,California,USA)完成的专有人源化优化产生了序列表中分别以SEQ ID NOS:5-7和10-12示出的人源化抗BKB2R免疫球蛋白重链(H37、H38、H39)和轻链(L37、L38、L39)可变区结构域。
因而，基于小鼠5F12G2克隆，由以上两个实例形成了5种不同形式的人源化轻链和5种形式的人源化重链，并且氨基酸和编码多核苷酸序列，包括CDR、V区以及H和L链在序列表中以SEQ IDNOS:3-48、51-60和75-92示出。
实施例12 人源化的抗人BKB2R单克隆抗体的表达和纯化
H1、H2、L1、L2
H1(SEQ ID NO:3)、H2(SEQ ID NO:4)、L1(SEQ ID NO:8)和L2(SEQ ID NO:9)人源化可变区序列的编码序列分别为SEQ ID NOS:51、52、56和57，将其合成制备成DNA构建体(BioBasic,MarkhamOntario)。将H1和H2重链的DNA序列分别克隆至pDH2载体与人IgG2Fc区符合读码框。类似地，将L1和L2人源化轻链分别克隆至pDH2载体与人κ恒定区符合读码框。利用标准的脂质体转染方案，将人源化VL、VH或者嵌合VL和VH的不同组合(混合和匹配法)瞬时转染至至少100ml293衍生细胞(如293F)。具体地，编码序列H1的载体与编码L1的载体或编码L2的载体或原始小鼠5F12G1VL共转染。类似地，编码H2的载体与编码L1或L2的载体共转染，以及编码原始小鼠5F12G1VH的载体与L1或L2共转染。利用Gibco’s Freestyle无血清培养液以悬浮培养的方式培养HEK-293细胞。将培养物于37℃在含有5%CO2和95%空气的环境中孵育。利用500mL无菌的一次性Corning Erlenmeyer烧瓶产生100mL测试表达，利用3L Corning无菌一次性烧瓶进行500mL和1L表达。将悬浮培养物放置于具有100rpm搅拌速率的平台摇床。当细胞密度达到1.5x106细胞/mL时，将培养物用所选择的质粒对转染。使用聚乙烯亚胺(PEI，25kDa线性，PolyplusTransfections)作为转染试剂，与质粒DNA成4:1的比率。每升培养物使用总共1mg质粒。将所转染的细胞孵育120小时，收集上清液并利用0.2微米真空过滤装置(Nalgene)无菌过滤。纯化之前，将无菌上清液保存于2-8℃。
利用亲和层析纯化培养上清液中存在的重组IgG。对于每100mL表达，1mL Protein G Sepharose Fast Flow(GE Bioscience)利用PBS pH7.4平衡并直接添加到上清液中。将IgG于2-8℃温和搅拌下分批吸收16小时。孵育之后，将树脂/上清液化合物转移到锥形离心瓶，并让树脂沉淀。将上清液(流过物)轻轻倒出并将树脂转移到一次性柱子(GE)中。用20体积的PBS利用重力流动冲洗树脂。IgG利用0.1M甘氨酸pH3.0每次1mL洗脱成3至5部分。每部分管中添加1M Tris pH9.0来中和甘氨酸缓冲液的pH。通过SDS PAGE(考马斯亮蓝染色)分析洗脱样品和流过物，合并含有IgG的部分。将合并的洗脱物透析过滤并利用离心超滤器(Millipore Centricon,50kDa MWCO)浓缩于PBS中。如果可能，利用0.2微米注射器过滤装置(Millipore PES)微过滤(μfilter)使终产物无菌。利用A280吸光度测定每一样品的蛋白浓度，具有1.4的消光系数。样品在装运之前于2-8℃保存。除了使用4mL树脂来捕获IgG，用于500mL和1L培养物的条件与上述的条件相同。质粒对的表达总结于表7中。
表7 人源化H+L链
质粒对 纯化的rIgG，mg/L 规模(L) mg IgG
L1/H1 0.56 0.1 0.056
L1/HC 0.48 0.1 0.048
L2/HC 0.53 0.1 0.053
L2/H1 1.28 0.1 0.128
L1/H2 1.13 0.1 0.113
L2/H2 1.61 0.1 0.161
L1/H1 4.00 2 8.2
L2/H2 4.00 1 4.2
L2/H1 075 05 038
各种纯化的IgG制备物的非还原性SDS-PAGE凝胶产生表明完整IgG抗体预期重量的电泳图，由此证实适当的抗体表达和纯化。
H37、H38、H39、L37、L38、L39
使用以上所述的相似策略来产生人源化重链H37与L37、L38、L39；H38与L37、L38或L39，以及H39与L37、L38或L39的组合。将VH和VL序列以符合读码框的方式克隆至编码人IgG2重链或轻链恒定区的pcDNA3.3载体。将含有全长重链和轻链序列的质粒用Lafectine转染试剂(LakePharma产品编号4502030)转染至CHO细胞。转染之后4天收集上清液，利用Fc ELISA(LakePharma catalog number2001002)测定上清液中总的IgG水平。利用MabSelect SuReTM珠子(GEHealthcare)上的蛋白A配体纯化来自CHO瞬时转染物的上清液。由珠子所捕获的抗体通过pH3.0的乙酸洗脱并保存于200mM Tris pH7.5，0.4%乙酸钠和150mM NaCl中。抗体制备物包含浓度为大约0.9至1.7mg/ML的分离蛋白(大约0.3-0.85mg)，SDS-PAGE分析表明纯度高于95%，具有预期的重链(50kDa)和轻链(25kDa)分子量。
实施例13 结合亲和力和亲合力
检测对应于所有组合的人源化或嵌合(人IgG2主链上的5F12G1VH和VL)抗体的蛋白与人BKB2R-衍生的表位肽SE ID NO:73的结合。
使用ForteBio(Menlo Park,CA,USA)平台来分析人源化单克隆抗体与肽表位(SEQ ID NO:73)的结合亲和力和结合特征，并与原始小鼠单克隆5F12G1进行比较。该平台通过光学分析由两个表面反射的白光干涉图，采用测定生物分子的相互作用的无标记技术，所述两个表面是生物传感器顶端上的固定化蛋白层和内部参考层。结合到生物传感器顶端的分子数量的任何变化都会引起实时测定的干涉图中的位移。监测了结合特异性以及结合和解离速率。
对于Octet研究，通过抗体的动力学滴定来分析抗体。抗体在动力学缓冲液(0.001M磷酸盐缓冲盐水(NaCl0.0138M;KCl-0.00027M)；pH7.4，于25℃，0.1mg/ml BSA，0.002%吐温和0.005%叠氯化钠)中制备，之后以1:2连续稀释。
传感器准备：通过在含有50μg/ml的肽(Seq ID No.2-PEG-生物素)(Biosyn,Lewisville,Texas)的溶液中孵育(300秒/1000rpm摇动)来包被链霉亲和素生物传感器(FortéBio Inc,Menlo Park,CA)。使用96孔半量板进行检测。每孔装入90μl的样品。让传感器在动力学缓冲液(60秒/1000rpm)中平衡至基线。接着将传感器置于不同的抗体稀释液中使其与探针结合(联合)500秒/1000rpm，然后进行测定。接着将传感器移入动力学缓冲液中，没有抗体解离(500秒/1000rpm)，然后进行测定。Octet系统软件计算结合速率/解离速率/亲和力的动力学常数。
检测3000nM(450μg/ml)起始浓度的对照小鼠抗体5F12G1(样品号ab404)，接着检测以1:2稀释的抗体。为了检测人源化单克隆抗体，使用的最高浓度是500nM，之后以1:2稀释。每个浓度检测两次。HC和LC代表小鼠原始5F12G1VH和VL序列。示例性数据示于表8和表9中。
表8 抗体结合数据
样品ID 浓度(nM) 最大反应 KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
ab404 3333 0.0757 4.62E-07 2.35E+03 1.09E-03
ab404 1667 0.0544 4.62E-07 2.35E+03 1.09E-03
ab404 1000 0.0385 4.62E-07 2.35E+03 1.09E-03
ab404 833 0.0265 4.62E-07 2.35E+03 1.09E-03
L1/H1 500 0.216 2.33E-06 4.04E+05 9.42E-01
样品ID 浓度(nM) 最大反应 KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
L1/HC 500 0.194 3.98E-06 5.43E+05 2.16E+00
L2/HC 500 0.1434 4.53E-06 1.45E+05 6.55E-01
L2/H1 500 0.1715 4.19E-09 1.21E+06 5.07E-03
L1/H2 500 0.161 4.03E-07 2.43E+06 9.76E-01
L2/H2 500 0.171 2.25E-08 9.92E+05 2.23E-02
L1/H1 250 0.2864 4.41E-07 1.59E+06 7.01E-01
L1/HC 250 0.1481 3.04E-06 2.39E+05 7.28E-01
L2/HC 250 0.2042 3.37E-07 2.17E+06 7.32E-01
L2/H1 250 0.1799 2.03E-08 2.16E+05 4.38E-03
L1/H2 250 0.174 2.05E-06 3.50E+05 7.19E-01
L2/H2 250 0.1705 2.04E-08 1.76E+06 3.59E-02
表9 抗体结合数据
样品ID 浓度(nM) 最大反应 KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
H37/L37 500 0.1198 7.58E-07 1.55E+06 1.18E+00
H37/L38 500 0.1726 2.20E-07 9.47E+06 2.08E+00
H37/L39 500 0.1215 1.23E-06 1.11E+06 1.98E+00
H38/L37 500 0.5774 3.11E-06 9.44E+06 2.94E+01
H38/L38 500 0.1315 2.49E-09 3.06E+06 7.63E-03
H38/L39 500 0.0681 9.32E-08 1.14E+09 1.06E+01
H39/L37 500 0.1191 2.34E-08 1.23E+06 2.88E-02
H39/L38 500 0.1435 7.61E-07 6.44E+06 4.90E+00
H39/L39 500 0.0915 1.73E-06 7.29E+05 1.26E+00
具有轻链L2联合重链H1或H2的人源化单克隆抗显示比原始小鼠单克隆抗体更强的结合(更低的KD)。同样地，H38/L38、H38/L39和H39/L37的组合似乎显示比原始小鼠单克隆抗体更强的结合(更低的KD)。
实施例14 检测人源化单克隆抗体的生物活性
本实施例描述了评估小鼠mAb5F12G1及其12种人源化克隆在Zucker糖尿病肥胖(ZDF fa/fa)大鼠中对动物胰岛敏感性的作用。Zucker糖尿病大鼠出现类似于2型糖尿病的症状并且在遗传学上对胰岛素抵抗。Zucker大鼠在OGTT期间显示血糖水平过度升高。因而，Zucker大鼠是检测单克隆抗体增加胰岛素敏感性的能力的良好模型，特别是OGTT中。
雄性ZDF fa/fa大鼠获自Charles River(Kingston,ON)。送达时，大鼠10周龄。将大鼠单独安置于每个笼中，置于12小时光照和12小时黑暗光周期的房间，环境温度70-72℉，并用常规啮齿动物食物和水随意喂养。适应7天之后，将大鼠分组成14组，每组3只大鼠(表10)。
表10 ZDF fa/fa组
口服葡萄糖耐量试验对禁食过夜(16小时)的大鼠进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。大鼠在给予葡萄糖30分钟之前，接受皮下给予0.2mg/kg体重剂量的人源化mAb，小鼠mAb5F12G1(阳性对照)和PBS(载体对照)。在蒸馏水中制备D-葡萄糖并以2g/kg体重口服给予。利用Accu-chekTM血糖仪，在给予人源化mAbs、5F12G1或载体之前(t=-30分钟)和正好负荷葡萄糖时(0分钟)，以及30、60、90和120分钟的时间点测定血糖水平。
结果和数据分析：数据(图34)以从微软Excel或Windows的GraphPad Prism5.00版(GraphPad Software,San Diego California USA)获得的平均值±标准误差(SEM)示出。
与载体对照相比，除了mAb L1/H1之外，单次给予源自5F12G1的人源化抗BKB2R mAb和5F12G1(0.2mg/kg)减小了ZDF fa/fa大鼠中口服给予葡萄糖之后血糖浓度的曲线下面积(AUC)。H38/L39的血糖AUC的减小较高，之后效应的次序为H37/L38、L2/H2、H38/L38、H37/L37、H38/L38、H39/l37、H39/L39、H37/L37、H39/L38、H37/L39和L1/H1。mAb5F12G1同样显示提高的葡萄糖耐量。
以上所述的各种实施方案可以组合以提供进一步的实施方案。本说明书中所引用的和/或申请信息页列出的全部美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、国外专利、国外专利申请和非专利出版物在此通过引用以其整体并入。如果必须采用不同专利、申请和出版物以提供更进一步的实施方案，可以改进实施方案的各方面。
根据以上详述可以对实施方案做出这些或其他变化。总之，在以下的权利要求中，所使用的术语不应当被解释为将权利要求限制成说明书和权利要求书中公开的具体实施方案，而是应当被解释为包括这样的权利要求所赋予的所有可能的实施方案及等同项的全部范围。因此，权利要求书并不受所公开内容的限制。
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Claims (34)

1.能与人缓激肽B2受体(BKB2R)相结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：含有VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列的重链可变区；以及含有VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列的轻链可变区，其中其具有以下的至少一种：
(1)(A)所述VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列分别包含以下所示的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NOS:19、20和21，
(ii)SEQ ID NOS:22、23和24，或
(iii)SEQ ID NOS:25、26和27；以及
(B)所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列分别包含以下所示的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NOS:34、35和36，
(ii)SEQ ID NOS:37、38和39，或
(iii)SEQ ID NOS:40、41和42；或者
(2)(A)所述VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列分别包含以下所示的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NOS:13、14和15，或
(ii)SEQ ID NOS:16、17和18；以及
(B)所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列分别包含以下所示的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NOS:28、29和30，或
(ii)SEQ ID NOS:31、32和33。
2.如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含分别如SEQ ID NOS:22、23和24所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列，以及所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NOS:40、41和42所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
4.如权利要求2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NOS:8-12中任一项所示的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其还包含重链可变域，所述重链可变域包含与SEQ ID NOS:3-7中任一项所示的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。
7.如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID NOS:3-7中任一项所示的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其还包含轻链可变域，所述轻链可变域包含与SEQ ID NOS:8-12中任一项所示的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。
9.如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含分别如SEQ ID NOS:19、20和21所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列，以及所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NOS:37、38和39所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列。
10.如权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
11.如权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
12.能与人缓激肽B2受体(BKB2R)相结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：含有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链可变区；以及含有SEQ ID NO:2所示的VLCDR3氨基酸序列的轻链可变区。
13.如权利要求1或12所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人源化的。
14.如权利要求13所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变域包含SEQ ID NOS:8-12中任一项所示的氨基酸序列。
15.如权利要求14所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其还包含重链可变域，所述重链可变域包含与SEQ ID NOS:3-7中任一项所示的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。
16.如权利要求14所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其还包含重链可变域，所述重链可变域包含SEQ ID NOS:3-7中任一项所示的氨基酸序列。
17.如权利要求1-16中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其还包含人免疫球蛋白κ轻链恒定区，所述人免疫球蛋白κ轻链恒定区包含SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列。
18.如权利要求1-16中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其还包含人免疫球蛋白IgG2重链恒定区，所述人免疫球蛋白IgG2重链恒定区包含SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列。
19.如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含以下的任一种或两种：
(a)免疫球蛋白IgG2重链，其包含SEQ ID NOS:83-87中任一项所示的氨基酸序列；以及
(b)免疫球蛋白κ轻链，其包含SEQ ID NOS:88-92中任一项所示的氨基酸序列。
20.如权利要求1-16中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自单链抗体、ScFv、缺乏铰链区的单价抗体以及微抗体。
21.如权利要求1-16中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是Fab或Fab’片段。
22.如权利要求1-16中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是F(ab’)2片段。
23.如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是全抗体。
24.如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含人IgG Fc结构域。
25.组合物，其包含生理可接受的载体和治疗有效量的权利要求1-24中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段。
26.用于治疗患有糖尿病并患有与BKB2R活性相关的病症的患者的方法，所述方法包括给予所述患者权利要求25所述的组合物，从而治疗所述与BKB2R活性相关的病症，其中所述与BKB2R活性相关的病症选自高血糖症、高胆固醇血症、高血压、心血管疾病、视网膜病变、肾病、神经病变和胰岛素抵抗。
27.用于治疗患有心血管疾病的患者的方法，其包括给予所述患者权利要求25所述的组合物，从而治疗所述心血管疾病。
28.用于治疗患有高胆固醇血症的患者的方法，其包括给予所述患者权利要求25所述的组合物，从而治疗所述高胆固醇血症。
29.用于治疗患有高血压的患者的方法，其包括给予所述患者权利要求25所述的组合物，从而治疗所述高血压。
30.用于治疗或预防对GSK3-β抑制敏感的癌症的方法，其包括给予患有癌症的患者权利要求25所述的组合物，从而治疗或预防所述癌症。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述癌症选自混合谱系白血病、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、结肠癌、肝癌、胃癌以及胰腺癌。
32.抑制癌细胞增殖或存活的方法，其中所述癌细胞可操作地表达GSK3-β信号通路中的BKB2R蛋白，所述方法包括用权利要求25所述的组合物接触所述癌细胞。
33.抑制可操作地表达BKB2R蛋白的细胞中GSK3-β信号通路的信号的方法，其包括用权利要求1-24中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触所述细胞。
34.用于改变表达BKB2R的细胞中的(i)辐射照射，(ii)流感感染，和(iii)卒中中的至少一种的方法，其包括在足以使权利要求1-24中任一项所述的抗BKB2R抗体或其抗原结合片段与所述细胞特异性结合的条件和时间下，用所述抗体或其抗原结合片段接触所述细胞。
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