MX2013004664A - Metodos, cepas y composiciones utiles para recuperacion mejorada de petroleo mediante el uso de microbios: arcobacter de clado. - Google Patents

Metodos, cepas y composiciones utiles para recuperacion mejorada de petroleo mediante el uso de microbios: arcobacter de clado.

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Abstract

Se proporcionan métodos, microorganismos y composiciones, en donde depósitos de petróleo se inoculan con microorganismos que pertenecen a Arcobacter de clado 1 y un medio que incluye un aceptor de electrones. Las cepas de Arcobacter crecen en el depósito de petróleo para formar biopelículas obturadoras que reducen la permeabilidad en áreas de formaciones subterráneas y, por lo tanto, aumentan la eficiencia de barrido y mejoran la recuperación de petróleo.

Description

METODOS, CEPAS Y COMPOSICIONES UTILES PARA RECUPERACION MEJORADA DE PETROLEO MEDIANTE EL USO DE MICROBIOS: ARCOBACTER DE CLADO 1 CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta descripción se relaciona con el campo de la microbiología ambiental y modificación de las propiedades de pozos de petróleo crudo mediante el uso de microorganismos. Más específicamente, se presentan métodos para mejorar la recuperación de petróleo de un depósito subterráneo y se identifican nuevos microorganismos que se pueden usar para la recuperación de petróleo.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Durante la recuperación de petróleo de depósitos de petróleo, típicamente, solo una porción menor del petróleo original en el estrato que contiene petróleo se recupera mediante métodos de recuperación primaria que usan solamente las fuerzas naturales presentes en un depósito de petróleo. Para mejorar la recuperación de petróleo, se han usado una variedad de técnicas de recuperación suplementaria tales como inundación de agua, que involucra la inyección de agua, a través de orificios de pozo, en el depósito de petróleo. A medida que el agua se desplaza hacia el depósito desde un pozo de inyección y se desplaza a través del estrato del depósito, esta desplaza el petróleo a uno o más pozos de producción, en Ref . 240029 donde se recupera el petróleo. Uno de los problemas que se presenta, comúnmente, con las operaciones de inundación con agua es la poca eficiencia de barrido del agua de inyección. La poca eficiencia de barrido ocurre cuando el agua se canaliza, preferentemente, a través de zonas altamente permeables del depósito de petróleo a medida que se desplaza desde el (los) pozo(s) de inyección hacia el (los) pozo(s) de producción, sin entrar en contacto, así, con estratos que contienen petróleo y que son menos permeables. Así, el petróleo en las zonas menos permeables no se recupera. La poca eficiencia de barrido puede deberse, además, a diferencias en la movilidad del agua en comparación con la del petróleo.
Se han usado microorganismos para mejorar la recuperación de petróleo de formaciones subterráneas mediante el uso de varios procesos que pueden mejorar la eficiencia de barrido y/o la liberación de petróleo. Por ejemplo, se pueden inyectar microorganismos viables en un depósito de petróleo, en donde estos pueden crecer y adherirse a las superficies de poros y canales en las matrices de roca o arena en las zonas permeables para reducir la canalización del agua y, así, dirigir el flujo del agua de inyección hacia estratos menos permeables que contengan petróleo. Los procesos para fomentar el crecimiento de microbios autóctonos mediante la inyección de soluciones nutrientes en formaciones subterráneas se describen en la patente de los Estados Unidos núm. 4,558,739 y en la patente de los Estados Unidos núm. 5,083,611. La inyección de microorganismos aislados de sitios de recuperación de petróleo hacia formaciones subterráneas, conjuntamente con soluciones nutrientes, ha sido descrita, incluida la inyección de Pseudomonas putida y Klebsiella pneumoniae (patente de los Estados Unidos núm. 4,800,959), de una cepa de Bacillus o cepa de Pseudomonas 1-2 (ATCC 30304) aislada de agua de grifo (patente de los Estados Unidos núm. 4,558,739), y de Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Corynebacterium lepus, Mycobacterium rhodochrous, y Mycobacterium vaccae (patente de los Estados Unidos núm. 5,163,510). La inyección de microorganismos aislados y un tensioactivo se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 5,174,378.
Se necesitan métodos y cepas de microbios adicionales útiles para mejorar la recuperación de petróleo y mejorar aún más la recuperación de petróleo de depósitos de petróleo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con métodos para mejorar la recuperación de petróleo de un depósito de petróleo, así como para aislar microorganismos y composiciones que se puedan usar para mejorar la recuperación de petróleo.
En consecuencia, la invención proporciona un método para mejorar la recuperación de petróleo de un depósito de petróleo; el método comprende: a) proporcionar una composición que comprende: i) por lo menos una cepa de Arcobacter que pertenece a Arcobacter de ciado 1; y ii) un medio de crecimiento mínimo que comprende por lo menos un aceptor de electrones; b) proporcionar un depósito de petróleo; c) inocular el depósito de petróleo con la composición de (a) de forma que el Arcobacter que contiene la composición habite y crezca en el depósito de petróleo; y d) recuperar petróleo del depósito de petróleo; en donde el crecimiento del Arcobacter en el depósito de petróleo mejora la recuperación de petróleo.
' En una modalidad, la cepa de Arcobacter que pertenece a Arcobacter de ciado 1 comprende la secuencia consenso redundante ADNr 16S de la sec . con núm. de ident.: 40.
En otra modalidad, la cepa de Arcobacter que pertenece a Arcobacter de ciado 1 comprende una secuencia ADNr 16S que tiene por lo menos aproximadamente 97 % de identidad de secuencia de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la sec. con núms . de ident. :1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 39.
En otra modalidad adicional, la invención proporciona un microorganismo aislado de una cepa seleccionada del grupo que consiste en 97AE3-3 (ATCC núm. PTA- 11410) y 97AE3-12 (ATCC núm. PTA- 11409) .
En otra modalidad adicional, la invención proporciona una composición que mejora la recuperación de petróleo,- la composición comprende: a) por lo menos una cepa aislada de Arcobacter que comprende una secuencia parcial ADNr 16S seleccionada del grupo que consiste en la sec . con núms . de ident.;l, 33, 34, 35, 36, 37 y 38; b) uno o más aceptores de electrones; y c) por lo menos una fuente de carbono.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La presente invención se comprenderá con mayor facilidad a partir de la siguiente descripción detallada, las figuras y descripciones de secuencias acompañantes, las cuales forman parte de esta solicitud.
La Figura 1 muestra un árbol filogenético molecular de la especia Arcobacter y bacterias relacionadas en base a secuencias de gen ADNr 16S (ADNr) , que separan el Arcobacter spp. descrito en por lo menos tres ciados filogenéticos .
La Figura 2 muestra un árbol filogenético molecular de la especia Arcobacter recién aislada, y bacterias de referencia en base a secuencias del gen ADNr 16S (ADNr) .
Las Figuras 3A-3D muestran una alineación de secuencias ADNr 16S para el consenso dominante de Arcobacter de ciado 1, consenso redundante de Arcobacter de ciado 1, cepa 97AE3-12, consenso redundante de Arcobacter de ciado 2 y consenso redundante de Arcobacter de ciado 3.
La Figura 4 muestra un análisis Riboprinter® de varias cepas de Arcobactor sp.
Las Figuras 5A-5C muestran secuencias distintivas dominantes y redundantes para la especie Shewanella en regiones variables de ADNr 2 (Figura 5A) , 5 (Figura 5B) y 8 (Figura 5C) . Las posiciones variables están subrayadas. En la Figura 5B la leyenda se suministran nucleótidos alteARJVtivos para cada designación de posición variable.
La Figura 6 muestra un diagrama esquemático del ajuste experimental de tubo delgado que se usa para medir la obturación de paquetes de arena permeable La Figura 7 muestra un gráfico de la disminución de presión a lo largo de un tubo delgado no inoculado.
La Figura 8 muestra un gráfico de la disminución de presión a lo largo de un tubo delgado que se inoculó con Arcobacter sp 97AE3-12 (ATCC núm. : PTA-11409) y luego se alimentó en lote periódicamente.
La Figura 9 muestra un gráfico de la disminución de presión a lo largo de un tubo delgado que se inoculó con Arcojbacter sp 97AE3-12 (ATCC núm. PTA-11409) y luego se alimentó de forma continua.
Las siguientes secuencias cumplen con el Título 37 del §§ C.F.R., 1.821-1.825 ("Requisitos para solicitudes de patentes que contienen descripciones de secuencias de nucleótidos y/o secuencias de aminoácidos - Reglas de las secuencias") según la norma ST.25 (2009) de la Organización Mundial de Propiedad Intelectual ( IPO, por sus siglas en inglés) y los requisitos para listados de secuencias de la EPO y el PCT (Reglas 5.2 y 49.5(a-bis), y Sección 208 y Anexo C de las Instrucciones administrativas. Los símbolos y el formato que se usan para los datos de las secuencias nucleótidas y de aminoácidos cumplen con las reglas que se exponen en el Título 37 del C.F.R., §1.822.
Tabla 1. Secuencias ADNr 16S de cepas de Arcobacter, que incluyen las coordenadas 8 a 1511 en la secuencia ADNr del E. Coli.
Un aislado es una colonia aislada a partir de una muestra Un clon contiene un fragmento amplificado de PCR generado a partir de ADN bacteriano aislado de una muestra, el cual es secuenciado para determinar la composición de una población La sec . con núm . de ident . : 32 es una secuencia parcial de ADNr 16S de E. Coli que se usa en alineaciones de secuencias de ADNr 16S de Arcojbacter.
La sec . con núm. de ident . : 33 es una secuencia parcial de ADNr 16S de Arcobacter sp. 97AE3 -1.
La sec . con núm . de ident . : 34 es una secuencia parcial de ADNr 16S de Arcojbacter sp. 97AE3 -3.
La sec . con núm. de ident . : 35 es una secuencia parcial de ADNr 16S de Arcobacter sp. 97AE3 -7.
La sec . con núm. de ident . : 36 es una secuencia parcial de ADNr 16S de Arcobacter sp. 97AE4 -1.
La sec . con núm. de ident . : 37 es una secuencia parcial de ADNr 16S de Arcojbacter sp. 97AE4 -5.
La sec. con núm. de ident.:38 es una secuencia parcial de ADNr 16S de Arcobacter sp. 97AE4-6.
La sec. con núm. de ident.:39 es una secuencia consenso dominante de ADNr 16S de Arcobacter sp. de ciado 1.
La sec. con núm. de ident . :40 es una secuencia consenso redundante de ADNr 16S de Arcobacter sp. de ciado 1.
La sec. con núm. de ident. :41 es una secuencia consenso dominante de ADNr 16S de Arcobacter sp . de ciado 2.
La sec. con núm. de ident. :42 es una secuencia consenso dominante de ADNr 16S de Arcobacter sp. de ciado 3.
Las sec. con núms . de ident. :43-46 son iniciadores 1492R, 8F, M13 inverso y M13 directo, respectivamente.
La sec. con núm. de ident..-47 es la secuencia distintiva dominante de Shewanella para la región variable 2 de ADNr 16S.
La sec. con núm. de ident. -.48 es la secuencia distintiva redundante Shewanella para la región variable 2 de ADNr 16S. , La sec. con núm. de ident. :49 es la secuencia distintiva dominante de Shewanella para la región variable 5 de ADNr 16S.
La sec. con núm. de ident.: 50 es la secuencia distintiva redundante de Shewanella para la región variable 5 de ADNr 16S.
La sec. con núm. de ident.: 51 es la secuencia distintiva dominante de Shewanella para la región variable 8 de ADNr 16S.
La sec. con núm. de ident.: 52 es la secuencia distintiva redundante de Shewanella para la región variable 8 de ADNr 16S.
Los solicitantes hicieron los siguientes depósitos biológicos conforme a los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento InteARiVcional del Depósito de Microorganismos para Propósitos de Procedimientos de Patentes: Tabla 2. Información de cepas depositadas DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los solicitantes incorporan específicamente todo el contenido de todas las referencias citadas en esta descripción. A menos que se establezca de cualquier otra forma, todos los porcentajes, partes, relaciones, etc., se expresan en peso. Las marcas registradas se muestran en mayúsculas. Adicionalmente, cuando una cantidad, concentración, u otro valor o parámetro se da ya sea como µ? intervalo, el intervalo preferido o una lista de valores preferibles superiores y valores preferibles inferiores, esto se entenderá específicamente para describir todos los intervalos formados de cualquier par de cualquier límite de intervalo superior o valor preferido y cualquier límite de intervalo inferior o valor preferido, sin considerar si los intervalos se describen separadamente. En los casos en que en la presente descripción se menciona un intervalo de valores numéricos, a menos que se establezca de cualquier otra forma, el intervalo pretende incluir los límites de este y todos los números enteros y fracciones comprendidos dentro del intervalo. No está previsto que el alcance de la invención esté limitado a los valores específicos mencionados al definir un intervalo.
La invención se relaciona con métodos para mejorar la recuperación de petróleo de un depósito de petróleo mediante la inoculación de en un depósito de petróleo de una cepa de Arcobacter: que según análisis filogenético molecular de la secuencia de ADNr 16S pertenece a Arcobacter de ciado 1 (definido en la presente descripción) , y un medio de crecimiento mínimo que fomenta el crecimiento de el Arcobacter bajo condiciones desnitrificantes en la ubicación subterránea. El crecimiento de el Arcobacter en el depósito de petróleo puede formar biopelículas que obturan las zonas más permeables en las capas de arena o arenisca para reenrutar así el agua hacia áreas menos permeables y más ricas en petróleo. Se mejora así, la eficiencia de barrido, lo que conlleva a un aumento en la recuperación de petróleo.
Además, la invención se relaciona con microorganismos anteriormente desconocidos aislados de muestras de agua obtenidas de un depósito de petróleo y composiciones que contienen cualesquiera de estos microorganismos, u otró Arcobacter de ciado 1, que son útiles en métodos de recuperación de petróleo. Mejorar la recuperación de petróleo mediante el uso de los métodos y microorganismos descritos aumentaría la producción de pozos de petróleo activos.
Las siguientes definiciones se suministran para las abreviaturas y términos especiales que se usan en esta solicitud: El término "PCR" se refiere a reacción en cadena de la polimerasa .
El término "d TP" se refiere a trifosfatos de deoxirribonucleótido .
El término "ASTM" se refiere a la Sociedad Estadounidense de Pruebas y Materiales (American Society for Testing and Materials) .
La abreviatura "NCBI" se refiere al Centro Nacional de Información de Biotecnología.
La abreviatura "BSL" se refiere a nivel de bioseguridad. La abreviatura "ARN" se refiere a ácido ribonucleico. La abreviatura "AEW" se refiere a ácido desoxirribonucleico .
La abreviatura "ATCC" se refiere a la Depositaría InteANcional Estadounidense de Colección de Cultivos de Tipos (American Type Culture Collection InteARiVtional Depository) , Manassas, VA, Estados Unidos de América. "ATCC núm." se refiere al número de orden de los cultivos depositados en la ATCC.
La abreviatura "CCUG" se refiere a la Colección de Cultivos de la Universidad de Góteborg, Suecia, que es una colección de microorganismos.
La abreviatura "DSM" o "DSMZ" se refiere a "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH", que es una colección alemana de microorganismos y cultivos celulares (Braunschweig, Alemania) .
Los términos "pozo de petróleo", "depósito de petróleo", y "estrato que contiene petróleo" se pueden usar en la presente indistintamente, y se refieren a una formación subterránea o ubicada debajo del lecho marino de la cual se puede recuperar petróleo. La formación es, generalmente, un cuerpo de rocas y suelo que tiene suficiente porosidad y permeabilidad para almacenar y transmitir petróleo.
El término "orificio de pozo" se refiere a un canal que va desde la superficie hasta un estrato que contiene petróleo ¦ con tamaño suficiente para permitir el bombeo de fluidos bien sea desde la superficie hasta el estrato que contiene petróleo (pozo de inyección) o desde el estrato que contiene petróleo hasta la superficie (pozo de producción) .
Los términos "desnitrificante" y "desnitrificación" significan reducir el nitrato para ser usado en la generación de energía respiratoria.
El término "eficiencia de barrido" se refiere a la fracción de un estrato que contiene petróleo a través de la cual ha pasado fluido o agua para desplazar petróleo hacia pozos de producción. Un problema que puede surgir con operaciones de inundación con agua es la eficiencia de barrido relativamente pobre del agua, es decir, el agua puede canalizarse a través de ciertas porciones de un depósito a medida que se desplaza desde el pozo o pozos de inyección hacia el pozo o pozos de producción y, por lo tanto, pasa por alto otras porciones del depósito. La eficiencia pobre del barrido puede deberse, por ejemplo, a diferencias en la movilidad del agua en comparación con la movilidad del petróleo, así como a las variaciones de permeabilidad dentro del depósito que promueven el flujo a través de ciertas porciones del depósito y no a través de otras.
El término "cultivo puro" significa un cultivo derivado de un solo aislado celular de una especie microbiana. Los cultivos puros específicamente mencionados en la presente incluyen aquellos que están disponibles públicamente en una depositaría y aquellos identificados en la presente descripción.
El término "biopelícula" significa una película o "capa de biomasa" de microorganismos. Las biopelículas a menudo están incrustadas en polímeros extracelulares, los cuales se adhieren a superficies sumergidas en, o sometidas a, ambientes acuáticos. Las biopelículas consisten en una matriz de una masa compacta de microorganismos con heterogeneidad estructural, que pueden tener diversidad genética, interacciones complejas de comunidad y una matriz extracelular de sustancias poliméricas.
El término "biopelícula obturadora" significa una biopelícula que es capaz de alterar la permeabilidad de un material poroso, y así retardar el movimiento de un fluido a través de un material poroso que está relacionado con la biopelícula .
El término "nitratos simples" y "nitritos simples" se refiere a nitrato (N03~) y nitrito (N02~) , respectivamente, tal y como ocurren en sales iónicas como nitrato de potasio, nitrato de sodio y nitrito de sodio.
El término "agua de inyección" se refiere a fluido inyectado en depósitos de petróleo para recuperación secundaria de petróleo. El agua de inyección puede ser suministrada por cualquier fuente apropiada y puede incluir, por ejemplo, agua de mar, Salmuera, agua de producción, agua recuperada de un acuífero subterráneo, incluyendo aquellos acuíferos que están en contacto con el petróleo, o agua de superficie proveniente de una corriente, río, laguna o lago. Como se conoce en la materia, es posible que sea necesario retirar del agua materia particulada, incluido polvo, pedazos de roca o arena y productos de la corrosión tales como herrumbre, antes de la inyección en uno o más orificios de pozo. Los métodos para retirar la materia particulada incluyen filtración, sedimentación y centrif gación.
El término "agua de producción" significa agua recuperada de fluidos de producción extraídos de un depósito de petróleo. Los fluidos de producción contienen tanto agua usada en recuperación secundaria de petróleo como petróleo crudo producido del depósito de petróleo.
El término "inocular un pozo de petróleo" significa inyectar uno o más microorganismos o poblaciones de microbios o un consorcio en un pozo de petróleo o depósito de petróleo de forma que los microorganismos sean proporcionados al pozo o depósito sin pérdida de viabilidad.
Los términos "tipificación filogenética", "esquema filogenético" , o "clasificación filogenética" pueden ser usados indistintamente en la presente descripción y se refieren a una forma de clasificación en la cual los microorganismos son agrupados de acuerdo con su linaje genético evolutivo. La tipificación filogenética en la presente invención es de cepas de microorganismos aislados de muestras ambientales y se basa en secuencias de gen codificador (ADNr) de ARN ribosomal 16S (AR r) .
El término "regiones hipervariables", como se usa en la presente descripción, se refiere a regiones de secuencia en el gen ADNr 16S, en donde la secuencia de nucleótido es altamente variable. En la mayoría de los microbios, la secuencia de ADNr 16S consiste en nueve regiones hipervariables que demuestran una considerable diversidad de secuencia entre diferentes géneros y especies de bacterias y se pueden usar para la identificación de géneros y especies El término "secuencias distintivas", como se usa en la presente descripción, se refiere a nucleótidos específicos en posiciones específicas (posiciones distintivas) de gen codificador de AR r 16S (ADNr) , que usualmente ocurren dentro de las regiones hipervariables , que son distintivos para microorganismos en diferentes niveles. En las posiciones distintivas, los nucleótidos que distinguen entre especies pueden ser una o más sustituciones, inserciones o eliminaciones específicas de base. Cuando se toman juntas, las secuencias distintivas del ADNr 16S son útiles para describir microbios a nivel de especie, cepa o aislado, y se pueden usar en la identificación de un microbio.
El término "redundancia o posición base redundante" se refiere al caso en donde más de un nucleótido (A, G, C o T(U)) es posible en una posición particular en una secuencia de ADN o ARN. Una posición es un sitio "que redunda dos veces" si solo dos de cuatro posibles nucleótidos pueden estar en esa posición. Una posición es un sitio "que redunda tres veces" si tres de cuatro posibles nucleótidos pueden estar en esa posición. Una posición es un sitio "que redunda cuatro veces" si todos los cuatro nucleótidos pueden estar en esa posición.
El término "secuencia distintiva redundante" se refiere a una secuencia distintiva que puede tener una o más posibles posiciones de base redundante en la secuencia distintiva.
El término "filogenética" se refiere al campo de la biología que trata con la identificación y comprensión de las relaciones evolutivas entre organismos, y particularmente, la filogenética molecular usa homologías de secuencia de ADN en este análisis. Particularmente, las similitudes o diferencias en las secuencias de ADNr 16S, incluidas las secuencias distintivas, identificadas mediante el uso de algoritmos de similitud, sirven para definir las relaciones filogenéticas .
El término "árbol filogenético" se refiere a un diagrama ramificado que describe las relaciones evolutivas entre organismos. El árbol filogenético en la presente invención se basa en homologías de secuencia de ADN de varios ADNr 16S, incluidos de secuencias distintivas en el ADNr 16S, y muestra relaciones de las cepas actuales con cepas y especies relacionadas.
El término "ciado filogenético" o "ciado" se refiere a una rama en un árbol filogenético . Un ciado incluye todos los organismos relacionados ubicados en la rama, en base al punto de la rama que se haya escogido.
El término "genomovar" se usa para describir una clasificación de sub-especie que se usa cuando un grupo de cepas de una especie es diferenciable mediante una secuencia de ADN, pero el fenotipo no se puede distinguir. Los genomovares se definen e identifican mediante hibridización ADN-ADN y/o mediante secuencias distintivas de ADNr 16S. Esta terminología ha sido usada para describir Pseudomonas stutzeri por Bennasar et al. (1996) Int. J. of Syst . Bacteriol . 6 : 200-205) .
El término "ribotipificación" significa el registro detallado de fragmentos de restricción de ADN genómicos que contienen la totalidad o una parte de los genes que codifican los AR ribosomales 16S y 23S. La ribotipificación se realiza mediante el uso del sistema RiboPrinter® de DuPont .
El término "RiboPrint™" se refiere al registro genómico único de una cepa o aislado microbiano específico, generado mediante el uso del sistema DuPont RiboPrinter®.
El término "cepa tipo" se refiere a la cepa de referencia para una especie particular cuya descripción se usa para definir y caracterizar a una especie particular.
El término "software para el análisis de secuencia" se refiere a cualquier programa de software o algoritmo computacional que resulta útil para el análisis de secuencias de nucleótidos o aminoácidos. El "software para el análisis de secuencia" puede estar disponible comercialmente o puede ser desarrollado de manera independiente. El software típico para el análisis de secuencia incluye, pero no se limita a: El conjunto de programas GCG (Wisconsin Package Versión 9.0, Genetics Computer Group (GCG) , Madison, WI) , BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol . 215, 403-410, 1990), AD2VSTAR (ADiVSTAR, Inc., Madison, WI) , y el programa FASTA que incorpora el algoritmo Smith-Waterman (Pearson, W. R. , Comput . Methods Genome Res., Proc. Int. Symp, Meeting Date 1992, 111-120, Eds : Suhai, Sandor, Plenum Publishing, New York, NY, 1994) . Dentro del contexto de esta solicitud, se entenderá que, cuando el software para el análisis de secuencia se usa para análisis, los resultados del análisis estarán basados en los "valores predeterminados" del programa de la referencia, a menos que se especifique de cualquier otra forma. Como se usa en la presente descripción, "valores predeterminados" significará cualquier conjunto de valores o parámetros que se cargan originalmente con el software la primera vez que se inicia.
El término "aceptor de electrones" se refiere a un compuesto que recibe o acepta a un electrón durante la respiración celular. Los microorganismos obtienen energía para crecer al transferir electrones desde un "donante de electrón" a un aceptor de electrones. Durante este proceso, el aceptor de electrones es reducido y el donante de electrón es oxidado. Algunos ejemplos de aceptores de electrones incluyen oxígeno, nitrato, fumarato, hierro (III) , manganeso (IV) , sulfato y dióxido de carbono. Azúcares, ácidos orgánicos de bajo peso molecular, carbohidratos, ácidos grasos, hidrógeno y petróleo crudo, o sus componentes tales como hidrocarburos de petróleo o hidrocarburos aromáticos policíclicos , son ejemplos de compuestos que pueden actuar como donantes de electrones.
"Darcy" es una unidad de permeabilidad. Un medio con una permeabilidad de 1 darcy permite un flujo de 1 cm3/s de un fluido con viscosidad de 1 cP (1 mPa-s) bajo un gradiente de presión de 101.3 kPa/cm (1 atm/cm) para actuar en un área de 1 cm2. Un milidarcy (mD) es igual a 0.001 darcy.
Microorganismos aislados Microorganismos capaces de crecer bajo condiciones anaeróbicas en presencia de nitrato, fumarato o el ión férrico (Fe (III)) como aceptor de electrones y lactato como fuente de carbono se aislaron de las aguas de producción e inyección del Pozo núm. 2 que está ubicado en el campo Wainwright en la provincia de Alberta, Canadá. El Pozo núm. 2 tiene una salinidad de aproximadamente 65 partes por mil (ppt) tanto en las aguas de producción como en las aguas de inyección, lo cual es aproximadamente dos veces la salinidad del agua de mar.
Los microorganismos aislados se caracterizaron mediante análisis de sus secuencias de ADN ribosomal 16S (ADNr) y mediante el registro detallado de sus fragmentos de restricción de ADN genómico que contienen la totalidad o una parte de los genes que codifican los ARN ribosomales 16S y 23S (ARNrs; ribotipificación) . Las cepas aisladas 97AE3-12, 97AE 3-3, 97AE3-1, 97AE 4-6, 97AE 4-5, 97AE 3-7, y 97AE 4-1 se identificaron como nuevas cepas pertenecientes al género Arcobacter. Los patrones RiboPrint™ para estas cepas eran distintos a los de la estrechamente relacionada cepa Arcojacter halophilus (ATCC BAA-1022) , la cual tiene más de 96 % de identidad de secuencia de la cepa 97AE3-12 en el ADNr 16S (sec. con núms . de ident.:6 y 1, respectivamente). Los patrones iboPrint™ (Figura 4) indican que las cepas recién aisladas forman 3 grupos: 1) 97AE3-12, 97AE4-1 y 97AE4-5; 2) 97AE3-3 y 97AE4-6; y 3) 97AE3-7 y 97AE3-1. Las cepas 97AE3-12 y 97AE 3-3 se depositaron con la presente, conforme al Tratado de Budapest, como ATCC núm. PTA-11409 y ATCC núm. PTA-11410, respectivamente.
Además, las cepas se caracterizaron como pertenecientes a Arcobacter de ciado 1 según se determinó mediante análisis filogenético molecular de las secuencias de ADNr 16S descritas en el Ejemplo 2 en la presente descripción. El árbol filogenético producido por el análisis se muestra en la Figura 1, con las cepas recién aisladas representadas la cepa 97AE3-12. El árbol filogenético muestra que tres ciados, o grupos, se forman a partir de especies conocidas de Arcobacter, las cuales se clasifican en la figura. El ciado 3 incluye cepas patogénicas tales como Arcobacter butzleri y Arcobacter cryaerophilus, las cuales están clasificadas como BSL2. El ciado 2 incluye el Arcobacter nitrofigilis . El ciado 1 incluye las especies conocidas Arcobacter marinus, Arcobacter halophilus, Arcobacter molluscoru y Arcobacter mytili. En el presente método se puede usar cualquier cepa de Arcobacter que pertenezca al ciado 1. El ciado 1 incluye las cepas listadas anteriormente, así como cualquier cepa que pertenezcan al mismo ciado al que pertenecen estas cepas cuando se analizan mediante filogenética molecular por medio del uso de las secuencias de ADNr 16S descritas en la presente descripción.
Las cepas de ciado 1 de Arcobacter, que son cepas del presente método, se pueden definir adicionalmente como cepas con secuencias de ADNr que tienen por lo menos aproximadamente 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de las secuencias de ADNr 16S de cualquiera de esas cepas que se muestran en el ciado 1 en la Figura 1: Solar Lake Arcobacter sp (sec. con núm. de ident.:2), Arcobacter sp YJQ-18 (clon no cultivado; sec. con núm. de ident.:3), Arcobacter marinus (sec. con núm. de ident.:4), clon de depósito de petróleo de alta temperatura EB27 (sec. con núm. de ident.:5), Arcobacter halophilus (sec. con núm. de ident.:6), y Arcobacter mytili (sec. con núm. de ident.:8). Además, las cepas del presente método incluyen aquellas con secuencias de ADNr que tienen por lo menos aproximadamente 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de la secuencia de ADNr 16S del Arcojbacter molluscorum F98-3T (sec. con núm. de ident.:7), la cual también pertenece al ciado 1. Las secuencias de ADNr 16S de cepas de diferentes ciados en la Figura 1 tienen identidades de secuencia de menos de 96 %.
Un árbol filogenético molecular preparado en la presente muestra la relación de las cepas recién aisladas de 97AE3-12, 97AE 3-1, 97AE3-3, 97AE 3-7, 97AE 4-1, 97AE 4-5 y 97AE 4-6 entre sí y con otras cepas del ciado 1, así como i con una cepa de los ciados 2 y 3, en la Figura 2. Las cepas están estrechamente relacionadas entre si en una rama del ciado 1. Estas cepas están caracterizadas por sus secuencias de ADNr: sec . con núms . de ident.:l, 33, 34, 35, 36, 37 y 38, respectivamente. Así, las cepas con las secuencias parciales de ADNr de estos nuevos aislados (sec. con núms. de ident.:l, 33, 34, 35, 36, 37 y 38) son cepas de Arcobacter de ciado 1 del presente método.
Las secuencias de ADNr 16S de cepas en cada uno de los ciados 1, 2 y 3 se analizaron como grupos para identificar las secuencias distintivas en las posiciones especificadas que se pueden usar para distinguir los tres ciados. Tal como se describe en el Ejemplo 2 en la presente descripción, las posiciones específicas en la secuencia de ADNr 16S tienen nucleótidos que son característicos para cada ciado de Arcoiacter, los cuales pueden ser fijos o pueden tener alguna redundancia, según se lista en la Tabla 6. Adicionalmente, puede haber una inserción o supresión en algunas posiciones. El conjunto (todas las posiciones juntas) de secuencias distintivas para cada ciado de Arcojbacter listado en la Tabla 6 difiere de cada uno de los conjuntos de secuencias distintivas de los otros ciados de Arcobacter. La secuencia consenso dominante (más prevalente) de ADNr 16S de Arcobacter de ciado 1 (que no puede ser la longitud total) que contiene las secuencias distintivas se proporciona como sec. con núm. de ident.:39. Las cepas microbianas conocidas o recién aisladas se pueden identificar como pertenecientes al Arcobacter de ciado 1 y, por lo tanto, son cepas del presente método, al tener un ADNr 16S con por lo menos aproximadamente 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de la sec . con núm. de ident.:39.
Las secuencias distintivas redundantes (incluidas las posiciones de inserción/supresión) están presentes en la secuencia consenso redundante de ADNr 16S para el ciado 1 (sec. con núm. de ident.:40), la secuencia consenso redundante de ADNr 16S para el ciado 2 (sec. con núm. de ident.:41), y la secuencia consenso redundante de ADNr 16S para el ciado 3 (sec. con núm. de ident.:42). Las cepas microbianas conocidas o recién aisladas se pueden identificar como pertenecientes al Arcojbacter de ciado 1 y, por lo tanto, son cepas del presente método, al tener un ADNr 16S que es el de la sec. con núm. de ident.:40. Además, las cepas microbianas conocidas o recién aisladas se pueden identificar como pertenecientes al Arcobacter de ciado 1 y, por lo tanto son cepas del presente método, al tener un ADNr 16S que incluye las secuencias distintivas redundantes del ciado 1 listadas para posiciones específicas en la Tabla 6.
Se determinó que las cepas de Arcobacter sp 97AE3-12, 97AE 3-3, 97AE3-1, 97AE 4-6, 97AE 4-5, 97AE 3-7 y 97AE 4-1, según se muestra en ejemplos en la presente descripción, tienen propiedades que indican su capacidad para mejorar la recuperación de petróleo al crecer para formar biopelículas obturadoras . Las cepas fueron capaces de formar biopelículas obturadoras en condiciones de salinidad alta (75 ppt) . La cepa 97AE3-12 creció en presencia de aceite de petróleo, en condiciones desnitrificantes tanto de baja (15 ppt) como de alta (64 ppt) salinidad. Las biopelículas obturadoras se produjeron en medios de baja (15 ppt) y alta (35 ppt y 68 ppt) salinidad. Las biopelículas obturadoras se formaron con alimentación de nutrientes continua o por lotes. Adicionalmente , la conglomeración de partículas de sílice se demostró en medios de alta (64 ppt) salinidad.
Estas propiedades de las cepas aisladas de Arcobacter de ciado 1 demuestran su uso para formar biopelículas para obturar zonas altamente permeables en arena o roca permeable de depósitos de petróleo. La obturación de zonas hiperpermeables puede re-dirigir el agua hacia áreas menos permeables y más ricas en petróleo, para mejorar, así, la eficiencia de barrido, lo que conlleva a un aumento en la recuperación de petróleo. Composiciones para mejorar la recuperación de petróleo Las cepas recién aisladas de Arcobacter 97AE3-12 (ATCC núm. PTA-11409) , 97AE 3-3 (ATCC núm. PTA-11410) , 97AE 4-6, 97AE 4-5, 97AE 3-7 y 97AE 4-1 descritas anteriormente se pueden incluir como componentes en composiciones para mejorar la recuperación de petróleo que son una modalidad de la presente invención. Así, las presentes composiciones incluyen por lo menos una cepa de Arcobacter que tiene una secuencia parcial de ADNr de la sec . con núm. de ident.:l, 33, 34, 35, 36, 37 o 38, que son las secuencias de ADNr de estas nuevas cepas . Cada una de las cepas puede estar en composiciones para mejorar la recuperación de petróleo separadas, o cualquier combinación de más de una de las cepas puede estar en la misma composición.
Además de una o más de estas nuevas cepas de Arcobacter de ciado 1, la presente composición para mejorar la recuperación de petróleo incluye uno o más aceptores de electrones y por lo menos una fuente de carbono. En una modalidad, el aceptor de electrones es nitrato. El nitrato se reduce a nitrito y/o nitrógeno durante el crecimiento de las cepas de Arcobacter descritas. El nitrito también puede servir como un aceptor de electrones en la composición. En varias modalidades, el aceptor de electrones es una o más sales iónicas de nitrato, una o más sales iónicas de nitrito, o cualquier combinación de sales iónicas de nitrato y nitrito.
La fuente de carbono puede ser un compuesto simple o complejo que contenga carbono. La fuente de carbono puede ser materia orgánica compleja tal como peptona, licor de maíz macerado o extracto de levadura. En otra modalidad, la fuente de carbono es un compuesto simple tal como citrato, fumarato, maleato, piruvato, succinato, acetato, formato o lactato.
Las composiciones para mejorar la recuperación de petróleo pueden incluir componentes adicionales que promueven el crecimiento y/o la formación de biopelícula por las cepas microbianas de la composición. Estos componentes pueden incluir, por ejemplo, vitaminas, metales traza, sales, nitrógeno, fósforo, magnesio, químicos reguladores y/o extracto de levadura.
En una modalidad, las composiciones para mejorar la recuperación de petróleo incluyen uno o más microorganismos adicionales que crecen en presencia del petróleo. Los microorganismos pueden usar un componente del petróleo como fuente de carbono, o cuando usan una fuente de carbono alteARNtiva su crecimiento no es inhibido por la presencia de petróleo. Particularmente útiles son otros microorganismos que tienen propiedades que mejoran la recuperación de petróleo, tales como microorganismos que forman biopelículas o que liberan petróleo de superficies. En una modalidad, un microorganismo adicional en la presente composición es un microorganismo de una especie Shewanella. La Shewanella es un género de bacterias que ha sido establecido, en parte, a través de clasificación filogenética mediante ADNr y está totalmente descrito en la literatura (ver por ejemplo Fredrickson et al., Towards Environmental Systems Biology of Shewanella, Nature Reviews Microbiology (2008), 6(8), 592-603; Hau et al . , Ecology And Biotechnology Of The Genus Shewanella, Annual Review of Microbiology (2007), 61, 237-258).
Hay por lo menos aproximadamente 89 % de identidad de secuencia de secuencias de ADNr 16S entre las especies Shewanella. Las especies Shewanella tienen un ADNr 16S que tiene las secuencias distintivas de las regiones hipervariables 2 (sec. con núms . de ident.:47 y 48 son secuencias dominantes y redundantes, respectivamente), 5 (sec. con núms. de ident.:49 y 50 son secuencias dominantes y redundantes, respectivamente) y 8 (sec. con núms. de ident . : 51 y 52 son secuencias dominantes y redundantes, respectivamente) como se muestra en las Figuras 5A-5C. La combinación de las secuencias distintivas redundantes para cada región define la especie Shewanella, incluidas algunas variaciones de posiciones como se muestra en las Figuras 5A-5C. Así, la Shewanella sp. útil en la presente invención es aquella que comprende dentro del ADNr 16S las secuencias distintivas redundantes según lo establecido en las sec. con núms. de ident. :48, 50 y 52. En una modalidad, la Shewanella sp. útil en la presente invención es aquella que comprende dentro del ADNr 16S las secuencias distintivas dominantes según lo establecido en las sec. con núms. de ident. :47, 49 y 51.
Las secuencias distintivas dominantes en las Figuras 5A-5C son aquellas con las posiciones variables designadas como los nucleótidos hallados con la máxima frecuencia en las especies Shewanella. Las Shewanella son gamma-proteobacterias gram negativas, que tienen la capacidad de reducir metales y, además, pueden reducir un amplio intervalo de aceptores terminales de electrones. Estos microorganismos obtienen energía para soportar el crecimiento anaeróbico mediante el acoplamiento de la oxidación de H2 o materia orgánica con la reducción de una variedad de metales multivalentes , lo cual conlleva a la precipitación, transformación o disolución de minerales .
La capacidad de las especies Shewanella de alterar la humectabilidad de una superficie cubierta de hidrocarburo lleva a una mejora en la recuperación de petróleo se describe en la Publicación núm. 2011/0030956 de solicitud de patente de los Estados Unidos, copendiente, de propiedad mancomunada, la cual se incorpora en la presente descripción como referencia. En una modalidad, un microorganismo adicional es el Shewanella putrefaciens, Shewanella sp LH4:18 (ATCC núm. PTA-8822; descrito en la patente de los Estados Unidos núm. 7,776,795 de propiedad mancomunada), o el Shewanella sp L3 : 3 (ATCC núm. PTA- 10980; descrito en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2011/0030956, copendiente, de propiedad mancomunada).
En una modalidad, el Thauera sp. AL9 : 8 (ATCC núm. PTA-9497) está incluido en la presente composición. El Thauera sp. AL9 : 8 se aisló de muestras de suelo subterráneo y se demostró que es capaz de crecer bajo condiciones desnitrificantes mediante el uso de petróleo o componentes de petróleo como única fuente de carbono. Este microorganismo tiene, además, actividad liberadora de petróleo (patente de los Estados Unidos núm. 7,708,065) .
Métodos para mejorar la recuperación de petróleo Las presentes composiciones para mejorar la recuperación de petróleo se pueden usar para inocular un depósito de petróleo, para generar una mejora en la recuperación de petróleo. Adicionalmente , las composiciones que incluyen por lo menos una cepa perteneciente a Arco±>acter de ciado 1, según lo descrito arriba, y un medio de crecimiento mínimo que incluye por lo menos un aceptor de electrones, se pueden usar para inocular un depósito de petróleo a fin de mejorar la recuperación de petróleo. Típicamente se usan una o más sales iónicas de nitrato y/o nitrito como aceptor de electrones. Los microorganismos del Arcobacter de ciado 1 en la composición incluyen células viables que habitan y crecen en el depósito de petróleo.
Un medio de crecimiento mínimo incluye por lo menos una fuente de carbono, y puede incluir otros componentes tales como vitaminas, metales traza, sales, nitrógeno, fósforo, magnesio, calcio y químicos reguladores. La fuente de carbono puede ser un compuesto simple o complejo que contiene carbono, por ejemplo, 1) petróleo o un componente de petróleo, 2) materia orgánica compleja tal como peptona, licor de maíz macerado o extracto de levadura; o 3) compuestos simples tales como citrato, fumarato, maleato, piruvato, succinato, acetato, formato o lactato.
Se puede usar cualquier cepa perteneciente a Arcobacter de ciado 1, según lo descrito anteriormente, que forme biopelículas obturadoras bajo condiciones desnitrificantes anaeróbicas en presencia del aceite de petróleo. Las cepas de microorganismos pertenecientes a Arcobacter de ciado 1, según lo descrito anteriormente, que se pueden usar en los presentes métodos se pueden identificar mediante sus secuencias de ADNr 16S, que tienen las secuencias distintivas descritas arriba y listadas en la Tabla 6. Además, las cepas pertenecientes al Arcobacter, de ciado 1, según lo descrito anteriormente, que son útiles en los presentes métodos, pueden ser identificadas por un experto en la materia mediante el uso de ensayos de formación de biopelícula, conglomeración de sílice y/o reducción de permeabilidad tales como los descritos en los ejemplos en la presente descripción. Como ejemplos de cepas pertenecientes a Arcojbacter de ciado 1, según lo descrito anteriormente, que son capaces de formar biopelículas obturadoras, estas propiedades de las cepas 97AE3-12 (ATCC núm. PTA-11409), 97AE 3-3 (ATCC núm. PTA-11410) , 97AE3-1, 97AE 4-6, 97AE 4-5, 97AE 3-7 y 97AE 4-1 se demuestran en la presente descripción. En una modalidad, cualquiera de estas cepas se usa en los métodos presentes .
En otra modalidad, uno o más microorganismos, además de cepas pertenecientes a Arcobacter de ciado 1, según lo descrito anteriormente, que crecen en presencia de petróleo bajo condiciones desnitrificantes, se incluyen en una composición usada en el presente método. Los microorganismos de la especie Shewanella, que se describen arriba, son particularmente útiles.
En ciertos depósitos de petróleo que tienen propiedades específicas, las cepas específicas pertenecientes a Arcobacter de ciado 1, según lo descrito anteriormente, se pueden adaptar mejor para su uso en los presentes métodos. Por ejemplo, en los depósitos de petróleo, en donde por lo menos un fluido tal como agua de inyección y/o agua de producción tiene una alta concentración de sal, las cepas pertenecientes a Arcobacter de ciado 1, según lo descrito anteriormente, que crecen y forman biopelículas obturadoras en medios con elevado nivel de sal, son particularmente adecuadas. Específicamente, las cepas de Arcobacter de ciado 1 97AE3-12 (ATCC núm. PTA-11409) , 97AE 3-3 (ATCC núm. PTA-11410) , 97AE3-1, 97AE 4-6, 97AE 4-5, 97AE 3-7 y 97AE 4-1 son particularmente adaptadas a depósitos de petróleo con al menos un fluido que tiene nivel elevado de sal, particularmente, sal de aproximadamente 30 ppt o mayor. La concentración de sal puede ser por lo menos aproximadamente 30 ppt, 35 ppt, 40 ppt, 45 ppt, 50 ppt, 55 ppt, 60 ppt, 65 ppt, 70 ppt o 75 ppt, o más.
Los depósitos de petróleo pueden ser inoculados con composiciones que incluyen una o más cepas pertenecientes a Arcojbacter de ciado 1, según lo descrito anteriormente, y un medio de crecimiento mínimo mediante el uso de cualquier método de introducción conocido por un experto en la materia. Típicamente, la inoculación se lleva a cabo mediante la inyección de una composición en un depósito de petróleo. Los métodos de inyección son comunes y conocidos en la técnica, y se puede usar cualquier método apropiado (ver, por ejemplo, Nontechnical guide to petroleum geology, exploration, drilling, and production, 2.° edición. N. J. Hyne, PennWell Corp. Tulsa, OK, USA, Freethey, G.W., Naftz, D.L., Rowland, R.C., ScDavis, J.A. (2002); Deep aquifer remediation tools: Theory, design, and performance modeling, In: D.L. Naftz, S.J. Morrison, J.A. Davis, & C.C. Fuller (Eds.); y Handbook of groundwater remediation using permeable reactive barriers (págs. 133-161), Amsterdam: Academic Press). La inyección típicamente se lleva a cabo a través de de uno o más pozos de inyección, que están en comunicación subterránea con uno o más pozos de producción de los cuales se recupera petróleo. Recuperación mejorada de petróleo de un depósito de petróleo La recuperación mejorada de petróleo en este contexto puede incluir recuperación secundaria o terciaria de petróleo de hidrocarburos de formaciones subterráneas. Específicamente, los hidrocarburos que se recuperan son aquellos que no se recuperan fácilmente de un pozo de producción mediante inundación con agua u otras técnicas tradicionales secundarias de recuperación de petróleo.
Los métodos de recuperación primaria de petróleo, que usan solamente las fuerzas naturales presentes en un depósito de petróleo obtienen, típicamente, solo una porción menor del petróleo original en el estrato que contiene petróleo de un depósito de petróleo. Los métodos de recuperación secundaria de petróleo, tales como inundación con agua, se pueden mejorar mediante el uso de métodos de la presente invención, que proporcionan microorganismos y medios de cultivo para la formación de biopelículas obturadoras en áreas de formaciones subterráneas en donde hay una alta variación de la permeabilidad. La obturación con biopelículas de las regiones altamente permeables de un depósito redirigen el agua usada en inundaciones con agua hacia áreas menos permeables y más ricas en petróleo. Así, la recuperación mejorada de petróleo se obtiene particularmente de depósitos de petróleo, en donde la eficiencia de barrido es baja debido a, por ejemplo, interspersión en el estrato que contiene petróleo de capas de roca que tienen una permeabilidad sustancialmente mayor en comparación con el resto de las capas de roca. Las capas con mayor permeabilidad canalizarán el agua e impedirán la penetración de agua en las otras partes del estrato que contiene petróleo. La formación de biopelículas obturadoras por microorganismos reducirá esta canalización.
EJEMPLOS La presente invención se define más detalladamente a través de los siguientes ejemplos. Debe entenderse que si bien estos ejemplos indican modalidades preferidas de la invención, estos se proporcionan con fines ilustrativos únicamente. A partir de la descripción anterior y de estos ejemplos, una persona con experiencia en la técnica podrá determinar las características esenciales de esta invención y, sin apartarse del espíritu ni del alcance de ella, podrá introducir varios cambios y modificaciones en la invención para adaptarla a los diversos usos y condiciones.
Métodos Generales El significado de las abreviaturas se usa en esta solicitud de la siguiente forma: "h" significa hora(s), "min" significa minuto(s), "día" significa día(s), "mL" o "mi" significa mililitros, "mg/ml" significa miligramo por mililitro, "1" significa litros, "µ?" significa microlitros, "mM" significa milimolar, "uM" significa micromolar, "nM" significa nanomolar, '^g/l" significa microgramo por litro, "pmol" significa picomol (s) , "°C" significa grados centígrados, "°F" significa grados Fahrenheit, "bp" significa par base, "bps" significa pares base, "ram" significa milímetro, "ppm" significa parte por millón, "g/1" significa gramo por litro, "ml/min" significa mililitro por minuto, "ml/h" significa mililitro por hora, "cfu/ml" significa unidades que forman colonias por mililitro, "g" significa gramo, "mg/1" significa miligramo por litro, "Kev" significa kilo o miles de voltios de electrón, "psi" significa libras (de fuerza) por pulgada cuadrada, "LB" significa caldo de cultivo Luria, "rpm" significa revolución por minuto, "NIC" significa control no inoculado.
Crecimiento de microorganismos Las técnicas para cultivo y mantenimiento de cultivos anaeróbicos se describen en "Isolation of Biotechnological Organisms from Nature", (Labeda, D. P. ed. 117-140, McGraw-Hill Publishers, 1990) . El nitrato, el hierro férrico y el fumarato se usan individualmente como aceptor primario de electrones bajo las condiciones de cultivo usadas en la presente descripción. Bajo desnitrificación, el cultivo anaeróbico se mide por reducción de nitrato del medio de cultivo en el tiempo. La reducción de nitrato a nitrógeno se ha descrito previamente (Moreno-Vivían, C. , et al., J. Bacteriol . , 181, 6573 - 6584, 1999). En algunos casos, los procesos de reducción de nitrato conllevan a acumulación de nitrito, el cual se reduce, posteriormente, adicionalmente , a nitrógeno. De allí, la acumulación y algunas veces la disipación de nitrito por lo tanto también son consideradas evidencia de crecimiento activo y metabolismo por parte de microorganismos.
Determinación de título de célula viable (número más probable) A fin de determinar el título de célula viable, se diluyeron muestras de cultivos o tubos delgados con una dilución serial 1:10 en 8 filas por muestra de una placa de 96 pocilios mediante el uso de caldo de cultivo Luria estándar de Miller o caldo de cultivo Luria con 3.5 % de NaCl agregado. La titulación se realizó por medio del uso de un pipetador robótico automático Biomek200. El crecimiento se determinó por la turbidez visual y se registró para cada una de las 8 filas. El algoritmo de Cochran del número más probable (Biometrics (1950) páginas 105-116) se usó para determinar las células viables/ml y los límites de 95 % de seguridad para este número en la muestra original .
La colocación en placas del método de dilución serial se usa para determinar el título bacteriano de los cultivos. Una serie de diluciones 1:10 de las muestras se coloca en placas y las colonias resultantes se cuentan. El número de colonias en una placa es entonces multiplicado por el factor de dilución (el número de veces que se realizó la dilución 1:10) para esa placa a fin de obtener el conteo de bacterias en la muestra original .
Cromatografía de iones Para cuantificar los iones de nitrato y nitrito en medios acuosos, los solicitantes usaron una unidad de cromatografía ICS2000 (Dionex, Banockburn, IL) . El intercambio de iones se realizó en una columna de intercambio de aniones AS15 mediante el uso de un gradiente de 2 a 50 mM de hidróxido potásico. Se generaron curvas estándar mediante el uso de cantidades conocidas de soluciones de nitrito sódico o nitrato sódico y estas se usaron para calibrar las concentraciones de nitrato y nitrito.
Medición de total de sales disueltas por refractómetro El total de sal disuelta se midió mediante el uso de un refractómetro manual (Modelo RHS 10ATC, Huake Instrument Co. , Ltd) .
Muestras de aguas de inyección y aguas de producción de depósito de petróleo Para este estudio se tomaron muestras de un sistema de pozo de petróleo que se denomina Pozo núm. 2 en el campo < Wainwright en la provincia de Alberta, Canadá. Este pozo tiene una salinidad de aproximadamente dos veces el agua de mar, la cual está en el intervalo de 65 ppt . Se obtuvieron muestras de agua de cabezales de pozos de inyección y de ; producción como líquidos mezclados de petróleo/agua en botellas de vidrio marrón de 1.0 1, llenadas hasta el tope, tapadas y selladas con cinta para impedir la fuga de gas. El gas de los procesos anaeróbicos inherentes fue suficiente para mantener las condiciones anaeróbicas durante el envío. Las botellas se enviaron en grandes enfriadores plásticos con bloques de hielo a las instalaciones de las pruebas en un lapso de 48 horas después de la toma de muestras.
Preparación de ADN para análisis de secuencia El ADN genómico de colonias bacterianas se aisló mediante la dilución de colonias bacterianas en 50 µ? de agua o amortiguador Tris-HCL con pH 7-8. Los ADN de colonias diluidas se amplificaron con polimerasa de ADN Phi 29 antes de la secuenciación (Kit de amplificación GenomiPHI de GE Life Sciences, New Brunswick, NJ) . Una alícuota (1.0 µ?) de una colonia diluida se agregó a 9.0 µ? del reactivo de lisis (del kit de amplificación GenomiPHI) y se calentó a 95 °C durante 3 minutos seguido de enfriamiento inmediato a 4 °C. 9.0 µ? de amortiguador de enzimas y 1.0 µ? de enzima Phi 29 se agregaron a cada muestra sometida a lisis seguido de incubación a 30 °C durante 18 horas. La polimerasa se desactivó mediante calentamiento a 65 °C durante 10 minutos seguido de enfriamiento a 4 °C.
Análisis de secuencia de ADN Las reacciones de secuenciación de ADN se establecieron de la siguiente forma: 8.0 µ? de muestra amplificada de GenomiPHI se agregaron a 8.0 µ? de reactivo de secuenciación BigDye v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) seguido de 3.0 µ? de 10 µ? de iniciadores sec . con núms . de ident.:43, 44, 45 o 46 (preparados por Sigma Genosys, oodlands, TX) , 4.0 µ? de amortiguador de dilución 5X BigDye (Applied Biosystems) y 17 µ? de agua de grado de biología molecular (Mediatech, Inc., Herndon, VA).
Las reacciones de secuenciación se calentaron durante 3.0 minutos a 96 °C seguido de 200 termociclos de (95 °C durante 30 segundos; 55 °C durante 20 segundos; 60 °C durante 2 minutos) y se almacenaron a 4 °C. Los dNTP no incorporados se retiraron mediante el uso de placas de limpieza de Edge Biosystems (Gaithersburg, MD) . Las reacciones amplificadas se colocaron con pipeta en un pocilio de una placa de limpieza precentrifugada de 96 pocilios. La placa se centrifugó durante 5.0 minutos a 5,000x g en un Sorvall RT-7 (Sorvall, Newtown, CT) a 25 °C. Las reacciones limpias se colocaron directamente sobre un secuenciador de ADN Applied Biosystems 3730 y se secuenciaron con llamada automática de bases.
Cada una de las secuencias de ADNr recopiladas se comparó con la base de datos de ADNr del NCBI (aproximadamente 260,000 secuencias de ADNr) mediante el uso del algoritmo BLAST (Altschul et al., JouAJVl of Molecular Biology, 1990). El acierto de identidad de secuencia con la puntuación más alta se usó como identificador de la especie conocida más estrechamente relacionada para la identificación de cepas.
AlteARNtivamente , para generar fragmentos amplificados de ADNr de cepas individuales, escogimos conjuntos de iniciadores de Grabowski et al. (FEMS Microbiology Ecology, 54:427-443 (2005)) . La combinación de iniciador sec . con núm. de ident.:43 e iniciador sec. con núm. de ident.:44 se escogió específicamente para amplificar secuencias de ADNr bacteriano; La mezcla de amplificación de PCR incluyó: 1. OX de amortiguador PCR GoTaq (Promega) , 0.25 mM de dNTPs, 25 pmol de cada iniciador, en un volumen de reacción de 50 µ? . Se agregaron 0.5 µ? de polimerasa GoTaq (Promega) y 1.0 µ? (20 ng) de ADN muestra. El protocolo de termociclo de reacción PCR fue 5.0 minutos a 95 °C seguido de 30 ciclos de: 1.5 minutos a 95 °C, 1.5 minutos a 53 °C, 2.5 minutos a 72 °C y extensión final durante 8 minutos a 72 °C en un termociclador Perkin Elmer 9600 (Waltham, MA) . Los productos de amplificación de par base 1400 se visualizaron en geles de agarosa de 1.0 %. La mezcla de reacción PCR se usó directamente para clonar en un vector pCR -T0P04 mediante el uso del sistema de clonación TOPO TA (Invitrogen) según lo recomendado por el fabricante. El ADN se transformó en células TOP10 químicamente competentes que seleccionan resistencia a la ampicilina. Colonias individuales se seleccionaron y cultivaron en placas de microtítulo para análisis de secuencia. La secuenciación de los fragmentos amplificados y la identificación de cepas fue según lo descrito anteriormente.
Ribotipificación automatizada La ribotipificación automatizada se usó para la identificación concluyente de las cepas seleccionadas con características filogenéticas similares de la secuencia de ARNr 16S (Webster, John A (1988) patente de los Estados Unidos núm. 4,717,653; Bruce, J. L. (1996) Food Techno. 50: 77-81; y Sethi , M. R. (1997) Am. Lab. 5: 31-35). La ribotipificación se realizó según lo recomendado por el fabricante (DuPont Qualicon Inc., Wilmington, DE) . Para estos análisis, se seleccionó una colonia fresca, se suspendió de nuevo en el amortiguador muestra y se agregó al módulo de procesamiento para el paso de tratamiento con calor a 80 °C durante 10 minutos para inhibir enzimas endógenas que degradan el ADN. Después, la temperatura se redujo y se agregaron dos enzimas líticas (lisostafina y N-acetilmuramidasa; proporcionadas por el fabricante) a la muestra. El portador de muestras se colocó, después, en el sistema Riboprinter™ con los otros reactivos comerciales. La digestión de enzimas de restricción del ADN cromosómico de muestra mediante el uso de la enzima EcoRI, la electroforesis con gel y los pasos de transferencia (a una membrana de filtro) fueron completamente automatizados. Brevemente, el ADN bacteriano genómico fue digerido con la enzima de restricción EcoRI y se colocó en un gel de agarosa. Los fragmentos de restricción se separaron mediante electroforesis y se transfirieron, simultáneamente, a una membrana de nailon. Después de un paso de desnaturalización, los ácidos nucleicos se hibridizaron con una sonda de ADN sulfonada que contenía el operón de ARNr del E. Coli, el cual incluye genes para las sub-unidades pequeñas y grandes de ARNr, el gen de ARNr 5S y los espaciadores internos transcritos. La sonda hibridizada se detectó mediante la captura de emisión de luz de un sustrato quimoluminiscente con una cámara de dispositivo de acoplamiento de carga. El resultado consistió en una exploración de huella densitométrica que muestra la distribución de los fragmentos genómicos de restricción de EcoRI que contienen secuencias del operón(es) ribosómico (s) en el genoma, que son separados mediante electroforesis según sus pesos moleculares.
Investigación de cepas para determinar su capacidad de formar biopelículas en filtros de vidrio fritado Se desarrolló un ensayo para investigar cepas que podrían formar biopelículas en superficies de sílice e impedir el flujo de agua a través de espacios de poros de aproximadamente 10 micrones (obturación) , mediante el uso de filtros de vidrio fritado. Se pegaron filtros de vidrio fritado de 25 mm y aspereza media (mercancía núm. 15254, Adams and Chittenden Scientific Glass, Berkeley CA) en la 1 base de sujetadores plásticos diseñados para filtración de membrana. Después del curado, las estructuras del filtro se esterilizaron mediante el uso del autoclave. Los filtros individuales en sujetadores se colocaron en placas de Petri estériles y en la parte superior de los filtros de vidrio se agregaron medios que contenían inoculo de cultivos de una noche de varias cepas. El medio de cultivo para este ensayo de formación/obturación de biopelícula fue según lo indicado en los ejemplos. Las placas se cubrieron e incubaron a temperatura ambiente bajo condiciones anaeróbicas durante una a dos semanas. Los filtros se retiraron del medio de cultivo y la pieza de la parte superior se colocó en su sitio. Una jeringa de 1 mi colocada en el puerto de entrada del sujetador de filtro se llenó con 1.0 mi de agua y el tiempo para drenar el agua en el tubo se midió en segundos.
Los filtros de vidrio fritado se investigaron previamente para determinar la velocidad de flujo antes de la incubación con cultivo y el cambio porcentual en la velocidad de flujo postincubación se determinó al final del experimento.
Investigación de cepas para determinar la conglomeración de sílice Cepas de Arcojacter sp . se sometieron a prueba para determinar su capacidad de conglomerar granos de sílice cristalino. El sílice cristalino representa un sustituto de los granos de arena comunes en muchas formaciones geológicas subterráneas. Una alícuota de 100 µ? de sílice cristalino de 220 g/1, (tamaño de grano en un intervalo de aproximadamente 2-20 micrones Sil-co-Sil 125 producido por U.S. Silica, Berkeley Springs, WV) se agregó a cada tubo muestra. Adicionalmente , se agregó 8 mi de medio y se taparon los tubos para restringir la entrada de oxigeno al medio.
Los tratamientos de prueba vivos (inoculados) duplicados recibieron 200 µ? de reserva congelada de varias cepas como inoculo. Además, se montaron tubos control no inoculados que contenían todos los componentes, excepto el inoculo microbiano. Los tubos se incubaron estáticamente a 30 °C. Los tubos de tratamiento se mezclaron vigorosamente durante 10 segundos mediante el uso de vórtex. La turbidez incrementó dramáticamente debido a la resuspensión del sílice cristalino, que se había asentado en los fondos de los tubos durante la incubación. La disminución de la turbidez debido al asentamiento del sílice cristalino se monitoreó en el tiempo después de mezclar al medir el OD600. El comportamiento asentamiento de las partículas de sílice mostró que algunas cepas podrían formar una fuerte interacción adhesiva con partículas de sílice cristalino adyacentes, para hacer que estas se asienten más rápidamente.
En el campo petrolero, hacer que los granos de arena se adhieran entre sí aumenta la resistencia al flujo de líquido a través de la arena. Esto permite tener control sobre la conformación del flujo, lo cual conlleva a una recuperación de petróleo más eficiente mediante inundación con agua.
Aparato de tubo delgado para ensayo de reducción de permeabilidad Se diseñó un aparato para medir la biotobturación de bultos de arena permeable mediante el uso de tubos delgados.
El procedimiento general para operar el tubo delgado fue : · Llenar dos tubos delgados idénticos con una mezcla de arena producida en un pozo petrolero más Sil-co-Sil 125 según se describe más abajo.
• Inundar cada tubo delgado, bajo presión.
• Determinar la permeabilidad base de los tubos delgados llenos mediante la inundación de Salmuera (Salmuera núm. 1) en los tubos.
La bioobturación exitosa de estos aparatos de tubo delgado mediante el uso de un inoculo de Arcojacter sugiere su utilidad para modificar la permeabilidad de la roca porosa de un depósito de petróleo. Por lo tanto, la aplicación de esta cepa a depósitos de petróleo podría mejorar la recuperación de petróleo al alterar la conformación del flujo de depósitos bajo inundación de agua.
En la Figura 6 se muestra un diagrama esquemático del ajuste experimental del tubo delgado. Todos los números que aparecen en negritas abajo se refieren a la Figura 6.
Una muestra de arena producida de la formación Schrader Bluff en Milne Point Unit de la Vertiente Norte de Alaska se limpió por medio de lavarla con un solvente compuesto de una mezcla 50/50 (volumen/volumen) de metanol y tolueno. Después, el solvente fue drenado y evaporado de la arena para producir arena limpia, seca e inundable. Esta arena se tamizó para retirar partículas de tamaño inferior a un micrómetro. Esta arena se combinó con Sil-co-Sil 125 lavado (U.S. Silica, Berkeley Springs, WV) en una proporción 4:1, y la mezcla se introdujo firmemente en tubos delgados flexibles separados de cuatro pies (121.92 cm) de longitud, de aproximadamente 1 cm de diámetro interno (9a, 9b) y se compactó mediante vibración por medio del uso de un grabador de laboratorio.
Ambos extremos de cada tubo delgado se taparon con accesorios comunes tipo compresión para mantener la mezcla de arena en él . En los accesorios se colocaron tubos flexibles de 0.32 cm (1/8 de pulgada) capaces de soportar las presiones usadas en la prueba. Los tubos delgados se montaron en un vaso de presión, (10) de forma que el tubo pasara a través de los extremos del vaso de presión (11 y 12) por medio del uso de una compuerta de unión con accesorios de presión comúnmente disponibles (0.32 cm (1/8 de pulgada)) (18a, 18b y 21a, 21b) . Se usaron accesorios y tubos adicionales para conectar la entrada de cada tubo delgado a una bomba de presión (13a, 13b) y reservorio de alimentación (14a, 14b). Otros accesorios de compresión comunes, que incluyen juntas de codo y "T"s y tubos, conectaban la entrada de cada tubo delgado a un transductor que medía la presión por encima de la presión atmosférica (calibrador de presión absoluta) (20a, 20b) . La entrada del tubo delgado se conectó, además, mediante el uso de los mismos tipos de tubos y accesorios, al lado de alta presión de un transductor de presión diferencial disponible comercialmente (19a, 19b) . Los accesorios y tubos conectaban la salida de cada tubo delgado al lado de baja presión del transductor de presión diferencial (19a, 19b) y a un regulador de presión posterior (16a, 16b) . Las señales de los transductores de presión diferencial y de presión absoluta se transmitieron, a través de puerto, a una computadora y estas lecturas de presión se monitorearon y se registraron periódicamente. El vaso de presión (10) alrededor de los tubos delgados se llenó con agua, que actuó como fluido hidráulico, a través de un puerto de agua (15) . Esta agua se presurizó lentamente con aire a través del puerto 17 a una presión de aproximadamente 0.74 mega Pascales (107 libras por pulgada cuadrada (psi) ) mientras que el Salmuera núm. 1 (más abajo) de los reservorios de alimentación (14a, 14b) fluía a través de los tubos delgados y salía a través del regulador de presión posterior (16a, 16b) . Esta operación se realizó de forma que la presión en cada tubo delgado fuese siempre 0.034 - 0.137 mega Pascales (5 a 20 psi) por debajo de la presión en el vaso de presión (10) .
Soluciones para experimentos en tubos delgados : Salmuera núm. 1. Agua de inyección usada en un sitio de pozo en Alberta, Canadá. El contenido total de sal disuelta fue aproximadamente 70 ppt . El pH de esta solución se ajustó a aproximadamente 6.2 a 6.4 mediante el uso de HCl o NaOH. Este Salmuera se aplicó a los tubos delgados con y sin esterilización de filtro durante el curso de los experimentos en tubos delgados, como se describe en los ejemplos. Salmuera núm. 2: (alimentación de nutriente por lotes) Diluido 1 parte en 36 de Salmuera núm. 1 Salmuera núm. 3: (alimentación de nutriente continua) Diluido 1 parte en 327 de Salmuera núm. 1.
Salmuera núm. 5: En agua de grifo, 66 ppt NaCl, 1000 ppm Citrato de Na, 3725 ppm Fumarato de Na2, 100 rag/1 NH4C1, 50 mg/1 KH2P04 , 500 mg/1 de extracto de levadura 1900 ppm Ca (5260 ppm CaCl2) Ajustar el pH a ~6.2 a 6.4 con HCl .
Medición de disminución de presión La disminución de presión en los tubos delgados se midió mediante el uso del transductor de presión diferencial descrito más arriba. La disminución de presión se midió a lo largo de cada tubo delgado con varias velocidades de flujo. Esta disminución de presión fue aproximadamente proporcional a la velocidad de flujo. La permeabilidad base del bulto de arena se calculó para cada disminución de presión medida con cada velocidad de flujo.
La disminución de presión por sí sola se puede comparar y usar como una medida del cambio en la permeabilidad entre los tubos delgados puesto que todos los tubos tenían dimensiones similares y recibieron las mismas velocidades de flujo de Salmuera durante las pruebas.
El volumen vacío en los tubos delgados, llamado el volumen de poro, fue 40-50 mi. Este volumen de poro se calculó en base al producto del volumen total del tubo delgado y un cálculo de la porosidad (aproximadamente 40 %) . Cálculo de la permeabilidad base La permeabilidad base de cada tubo se midió mediante el uso de Salmuera núm. 1 que fluía a presión total: aproximadamente 0.665 megapascales (95 psi) en el tubo delgado (controlado en el extremo de salida con el regulador de presión posterior) y aproximadamente 0.758 megapascales (110 psi) en el vaso de presión (fuera del tubo delgado) . La permeabilidad base se calculó mediante el uso de la Ecuación Darcy: k = 4.08*Q*u*L ??*?? ?? = La disminución de presión en una roca o bulto poroso, [=] psi Q = Velocidad de flujo volumétrico en el bulto, [=] cc/h µ = Viscosidad del fluido (una fase) en el bulto [=] centipoise L - Longitud del bulto (paralela al flujo) , [=] cm Ax = Área representativa (normal a flujo) [=] cm2 Je = Permeabilidad [=] miliDarcy 4.08 = una constante de conversión para hacer que las unidades sean compatibles [=] mD-hr-psi/cp/cc2 La permeabilidad base, junto con otras propiedades de cada tubo delgado lleno, se proporcionan en la Tabla 3.
Tabla 3. Propiedades de tubos delgados llenos de arena Ejemplo 1 Enriquecimiento anaeróbico para microbios autóctonos de muestras de depósito de petróleo Para enriquecer especies que podrían reducir el nitrato, fumarato o el ión férrico (Fe (III)) de cualquiera de los aceptores de electrones, inoculamos 1 mi de agua de inyección o agua de producción del Pozo núm. 2, descrito en los Métodos generales, en 9 mi de medio de sales mínimas (Tabla 4) en viales de suero anaeróbico de 20 mi, suplementado con lactato (2000 ppm) como fuente de carbono, cloruro de sodio a 4300 ppm y como aceptor de electrones, bien sea 1.6 g/1 de nitrato sódico, o 3.5 g/1 de fumarato sódico, o 13,000 ppm NaEDTAFe ( III ) . Un cuarto enriquecimiento con un medio rico, caldo de cultivo marino (Difco™ B. D. Diagnostics Sparks MD) , que se suplemento con cloruro sódico a 3900 ppm y lactato a 2000 ppt, se usó para enriquecer microbios que requieren más que un medio mínimo para el crecimiento. El aceptor de electrones en la muestra de caldo de cultivo marino se rescató de entre el Fe (III) , sulfato, nitrato y moléculas orgánicas en la formulación que podían ser usados como aceptores de electrones. Cada muestra de medio se desoxigenó al rociar los viales llenos con una mezcla de nitrógeno y dióxido de carbono seguido de sometimiento a autoclave. Todas las manipulaciones de bacterias se realizaron en una cámara anaeróbica (Coy Laboratories Products, Inc., Grass Lake, MI), y los cultivos se incubaron a temperatura ambiente.
Tabla 4. Medio de sales mínimas El pH del medio se ajustó a 7.3.
Los enriquecimientos que contenían nitrato se monitorearon y se tomaron muestras de ellos de forma regular para la reducción de nitrato y la acumulación de nitrito, o en algunos casos, la reducción de nitrito. Cuando el nitrato se redujo en la muestra (usualmente antes de 14 días) , se agregó lactato y nitrato a las concentraciones finales originales. El lactato y el aceptor de electrones en cada uno de los otros enriquecimientos se agregaron, además, a las concentraciones finales originales. En la muestra marina de enriquecimiento de caldo de cultivo, se agregó lactato para mayor incubación.
Todos los viales se incubaron para adición de 14 a 20 días a temperatura ambiente. En las muestras de viales se observaron cambios que indicaban crecimiento en el lactato y la combinación de aceptor de electrones de cada enriquecimiento. Los cambios incluyeron turbidez visible en el medio y la presencia de biopelículas en los viales de vidrio o en la interfase gas-acuosa, así como una reducción de nitrato y nitrito en viales que contenían nitrato como aceptor de electrones. La turbidez fue similar en cada vial, lo que indica que hubo una población diversa de microorganismos tanto en el agua de inyección como en el agua de producción.
Después de una segunda incubación de 14-20 días a temperatura ambiente, una muestra de 100 µ? de cada enriquecimiento se colocó sobre placas de agar de caldo de cultivo marino (hechas según receta, Difco 2216, Becton-Dickenson, Sparks, MD) y se incubó a temperatura ambiente durante dos días. Se aislaron colonias representativas con morfologías únicas, se colocaron nuevamente sobre placas de agar de caldo de cultivo marino y se cultivaron para purificar aislados. Se analizaron muestras de colonias aisladas para realizar la identificación mediante amplificación de PCR por medio del uso de el análisis directo de ADNr de colonia descrito en los Métodos generales, mediante el uso tanto del iniciador PCR inverso 1492R (sec. con núm. de ident.:43) como del iniciador PCR directo SF(sec. con núm. de ident.:44). La secuenciación y el análisis de ADN descritos en los Métodos generales se usaron para obtener la secuencia de ADNr 16S para identificación microbiana. Los aislados identificados como pertenecientes al Arcobacter se obtuvieron primordialmente de los enriquecimientos de caldo de cultivo marino y de fumarato del agua de producción. Siete aislados se denominaron 97AE 3-12, 97AE3-1, 97AE 3-3, 97AE 3-7, 97AE 4-6, 97AE 4-5 y 97AE4-1. Ejemplo 2 Caracterización de cepas aisladas con respecto al Arcobacter Para determinar la secuencia de ADNr 16S de los siete aislados denominados 97AE 3-12, 97AE3-1, 97AE 3-3, 97AE 3-7, 97AE 4-6, 97AE 4-5 y 97AE4-1 (Ejemplo 1), cada uno de los siete aislados se seleccionó como una sola colonia pura, el ADN se aisló y el gen ADNr 16S se amplificó por PCR mediante el uso de los procedimientos que aparecen en los Métodos generales. Las secuencias amplificadas se clonaron en el vector PCR -T0P04 mediante el uso del sistema de clonación TOPO TA (Invitrogen) , según lo recomendado por el fabricante y, después, se secuenciaron múltiples veces mediante el uso de los iniciadores 1492R, 8F, M13 inverso y M13 directo de las sec. con núms . de ident .: 43-46 , respectivamente, para obtener la secuencia casi completa. Cada secuencia de ADNr 16S de cepa (97AE 3-12: sec. con núm. de ident. :1, 97AE3-1: sec. con núm. de ident. :33, 97AE 3-3: sec. con núm. de ident. :34, 97AE 3-7: sec. con núm. de ident.: 35, 97AE 4-6: sec . con núm. de ident.: 38, 97AE 4-5: sec. con núm. de ident. :37 y 97AE4-1: sec. con núm. de ident. :36) se investigó en la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information - Centro Nacional para Información de Biotecnología) mediante el uso del programa de algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool - Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica) proporcionado por el NCBI (Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol . 215:403-410) para identificar las secuencias de nucleótidos más similares. Esto se ejecutó al comparar la secuencia de búsqueda con secuencias similares de ADNr 16S en la base de datos y determinar una puntuación de identidad porcentual relativa. Todas las secuencias de búsqueda, una para cada una de 97AE 3-12, 97AE3-1, 97AE 3-3, 97AE 3-7, 97AE 4-6, 97AE 4-5 y 97AE4-1, produjeron aciertos de primer lugar como Arcojbacter marinus CL-S1 (sec. con núm. de ident.:4), Arcobacter sp . Solar Lake (sec. con núm. de ident.:2), o Arcobacter sp. YJQ-18 (sec. con núm. de ident.:3) con una identidad igual o mayor que 99 %.
Microbial Rev. 51: 221-271). La secuencia de prueba para la alineación fue de la cepa 97AE3-12 (sec. con núm. de ident.:l) . Esta secuencia era representativa de las otras seis cepas en base a tramos de secuencia (500 -700 bp) que mostraron alta identidad de secuencia entre todas las seis cepas y el Arcobacter marinus CL-S1 (GenBank núm. EU512920) . En base a la identidad inicial del Arcobacter, se seleccionaron 24 secuencias de referencia de ADNr 16S en la base de datos del NCBI del género Arcobacter y 5 secuencias relacionadas. Estas secuencias se listan en la Tabla 1 con las sec. con núms . de ident . : 2-6, 8, 9 y 11-31. Las secuencias de referencia incluían 10 de cepas de Arcobacter (sec. con núms. de ident. :4, 6, 8, 9, 15, 17-21) que representan 12 especies diferentes de Arcobacter (cepas tipo) reconocidas por el Comité InteANcional de Sistemáticos de Procariotas (Lista de nombres procarióticos con Posición en Nomenclatura) . Además, las secuencias de referencia incluían 6 cepas de depósitos de petróleo (sec. con núms . de ident . : 3 , 5, 24, 25, 28 y 31) . Otros aislados y cepas de Arcobacter se incluyeron como secuencias de referencia porque habían sido mencionadas en revistas revisadas por colegas como Arcobacter sp. pero aún no habían sido tipificadas y descritas como especies desde un punto de vista crítico (sec. con núms. de ident. :2, 11-14, 16, 22, 23, 26, 27 y 30). Adicionalmente, la secuencia B de ADNr 16S K12 del E. Coli (posiciones 8-1511; sec. con núm. de ident. :32) se usó para servir como supercóntigo para la alineación de secuencias y paira proporcionar el sistema coordenado base, que está reconocido como el estándar base de posiciones (Brosius, J. , et al. (1981) J. of Molecular Biology, 148 (2) : 107-127 ; Woese, (1987) Bacterial Evolution.
Se creó una alineación global mediante el uso de secuencias de ADNr 16S de longitud casi completa de la sec. con núms. de ident.: 1-6, 8, 9 y 11-32 con el algoritmo de alineación Clustal W (Chenna, R. H., et al, 2005 y Lark, M. A. et al, 2007) . Todas las 24 secuencias de Arcobacter se alinearon y mostraron una distancia significativa en identidad al ADNr 16S K12 del E. Coli con identidad de secuencia de 76 a 78 %. Todas las secuencias demostraron una supresión de 25 bp al ser comparadas con la secuencia K12 del E. Coli en la región variable 3 en las posiciones de coordenadas base 452 a 476. Además, hubo una inserción (WGCT) de 4 bp en la región variable 6 en la posición de coordenadas base 1028 y una supresión de 6 bp en la región variable 9 en las coordenadas base 1451 a 1456. Estos distintivos estructurales son consistentes con el distintivo para la siguiente clasificación filogenética : Bacterias/ Epsilonproteohacteria/ Campylobacterales/ Campylobacteraceae/ Arcobacter. , La alineación produjo las identidades de secuencia más cercanas para la cepa 97AE3-12 de las secuencias del Arcobacter sp. que se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5. 97AE3-12 y secuencias conocidas de ADNr 16S que tienen las identidades de secuencia más cercanas * Repetición de elementos significa la longitud de la secuencia que se repite que se usó para determinar la identidad de porcentaje (incluye discordancias, eliminaciones e inserciones entre extremos fijos) . Esto varía debido a la variabilidad de longitud de secuencia disponible para diferentes secuencias de ADNr 16S.
Se creó un árbol filogenético mediante una alineación realizada con el programa Clustal W con las mismas secuencias de ADNr (sec. con núms . de ident.:l-6, 8, 9, 11-32) , por medio del uso del árbol filogenético y funciones de inicio del programa MegAlign™ en el paquete ADNstar LaserGene (LaserGene™, ADNSTAR, Inc Madison, WI) . El árbol filogenético que se muestra en la Figura 1 detalla todas las cepas de referencia de Arcobacter con la cepa 97AE3-12. Las diez cepas de referencia reconocidas de Arcobacter forman tres ciados (1, 2 y 3) en el análisis filogenético molecular. El A. marinus y el A. halophilus están en el ciado 1, el A. nitrofigillis está en el ciado 2, y todos los patógenos conocidos representados por el A. butzlerii están en el ciado 3. Como se muestra en la Figura 1, la cepa 97AE3-12 cae dentro del Arcobacter de ciado 1 que incluye ál Arcobacter marinus CL-S1 (JCM 15502T) (Kim, H.M. et al Int. J. Syst. Evol . Microbiol. 60:53 (2010) que es la cepa tipo de referencia con la mayor identidad de secuencia en 99.5 %. Otras cepas aisladas y descritas en el ciado 1 incluyen el Arcobacter sp Solar Lake, el Arcobacter halophilus LA31B (ATCC BAA-1022T) (Teske et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:4210; Donachie et al (2005) Int. J. Syst. Evol. Microbiano. 55:1271). Aunque el A. mytili F2075 y el A. nitrofigillis DSM7299 tienen prácticamente el mismo porcentaje de identidad de secuencia de ADNr 16S que la cepa 97AE3-12, las secuencias distintivas del ADNr 16S de estas dos cepas las colocan en los ciados 1 y 2, respectivamente.
El ciado 3 filogenético está sujeto por el Arcobacter butzleri (la especie de Arcobacter más descrita y aislada) . Este ciado contiene, además, Arcobacter skirrowi, Arcobacter thereius, Arcobacter cibarius y Arcobacter cryaerophilus . Todas estas cepas son organismos BSL2.
De la misma forma, se generó un árbol filogenético molecular para mostrar la relación entre las cepas recién aisladas 97AE 3-12, 97AE3-1, 97AE 3-3, 97AE 3-7, 97AE 4-6, 97AE 4-5 y 97AE4-1, y también su relación con un subconjunto de las cepas de referencia usadas arriba. Este árbol que se muestra en la Figura 2 indica la estrecha relación entre las cepas recién aisladas y las cepas conocidas de Arcobacter sp. Solar Lake y Arcobacter s . YJQ-18 que en la Figura 1 se muestran como pertenecientes a Arcobacter de ciado 1.
Con el uso de la misma alineación global de secuencias múltiples descrita anteriormente, se identificaron las posiciones distintivas en las secuencias de ADNr 16S que se pueden usar para distinguir la especie Arcobacter en el ciado 1 de la especie Arcobacter en los ciados 2 y 3 por las secuencias distintivas en estas posiciones. Estas posiciones distintivas se listan en la Tabla 6, con coordenadas de posición de la secuencia de ADNr 16S del E. Coli. Se lista la secuencia consenso para el Arcobacter sp. de ciado 1 en cada una de las posiciones distintivas. En algunas posiciones ocurre un solo nucleótido, mientras en otras posiciones hay redundancia cuando R puede ser A o Gf Y puede ser C o T, M puede ser A o C, K puede ser G o T, S puede ser C o G, W puede ser A o T, B puede ser C, G o T, D puede ser A, G o T, H puede ser A, C o T, V puede ser A, C o G y N es A, C,G o T.
En la Tabla 6 los nucleótidos consenso del Arcoi»acter sp. de ciado 1 en cada posición distintiva se comparan con los nucleótidos consenso de cada posición distintiva del Arcobacter sp . de ciado 2 y ciado 3. Además de los nucleótidos consenso de ciado 1, los nucleótidos presentes en cada posición distintiva en las cepas del ciado 1 97AE3-12, Arcojbacter marinus CL-S1 y Arcobacter halophilus LA31B se muestran en la Tabla 6. Los nucleótidos de todas las posiciones distintivas juntas, para cada una de estas cepas, identifican a estas cepas como ArcoJacter sp. de ciado 1, si bien hay diferencias con los nucleótidos consenso del Arcobacter sp . de ciado 1 entre las posiciones distintivas para las especies de Arcobacter sp de ciado 2 y ciado 3.
La mayoría de las posiciones distintivas identificadas estaban ubicadas en las regiones hipervariables del ADNr 16S, con posiciones designadas por nucleótidos de la secuencia de ADNr 16S del E. Coli: región hipervariable 1 entre las posiciones 44 y 110 región hipervariable 2 entre las posiciones 120 y 300 región hipervariable 3 entre las posiciones 365 y 500 región hipervariable 4 entre las posiciones 574 y 750 región hipervariable 5 entre las posiciones 820 y 880 región hipervariable 6 entre las posiciones 990 y 1050 región hipervariable 7 entre las posiciones 1115 y 1175 región hipervariable 8 entre las posiciones 1240 y 1370 región hipervariable 9 entre las posiciones 1415 y 1465 Las secuencias distintivas identificadas en la secuencia de ADNr 16S se pueden usar para identificar cepas de microorganismos que pertenecen al Arcobacter de ciado 1 a diferencia del Arcobacter sp . de ciado 2 o 3. Una secuencia compuesta redundante de ADNr 16S para el Arcobacter sp. de ciado 1 que contiene todas las secuencias distintivas redundantes en la Tabla 6 es la sec. con núm. de ident.:40. Esta secuencia redundante incluye posiciones de inserción/supresión en la Tabla 6. Las cepas microbianas conocidas o recién aisladas se pueden identificar como pertenecientes al Arcobacter sp . de ciado 1 al tener un ADNr 16S que sea de la sec. con núm. de ident.:40. La secuencia de ADNr 16S más frecuente o consenso dominante para el Arcobacter sp . ciado 1 ADNr 16S es la sec. con núm. de ident.:39. Las secuencias de ADNr 16S que contienen todas las secuencias distintivas en la Tabla 6 para el Arcobacter de ciados 2 y 3 son las sec. con núms . de ident.:41 y 42, respectivamente. En la Figura 3 se muestra una alineación de las secuencias de ADNr 16S para el consenso dominante de Arcobacter de ciado 1, consenso redundante de Arcobacter de ciado 1, cepa 97AE3-12, consenso redundante Arco£>acter de ciado 2 y consenso redundante Arcobacter de ciado 3. Las diferencias entre las secuencias distintivas de ADNr 16S para los ciados 1, 2 y 3 están en negritas y subrayadas.
Explicaciones para las notaciones en la Figura 3A-D: Ningún paréntesis alrededor de "N" o "-" (inserción o supresión, respectivamente) significa que es la secuencia dominante y única (puede ser redundante según lo indique la letra usada) .
[N] significa que el nucleótido existe en más de una secuencia de referencia; es prevaleciente pero también un "-" existe en nuestros aislados y vecinos más cercanos.
(N) significa que el nucleótido solo existe en una secuencia de referencia y es dominado por un "-" en esa posición .
Tabla 6. Secuencias distintivas de ADNr 16S para distinguir Arcobacter de ciado 1 de Arcobacter de ciados 2 y 3, incluidos nucleótidos para secuencias distintivas consenso redundantes y dominantes de Arcobacter de ciado 1 y para cepas 97AE3-12, Arcobacter marinus, y Arcobacter halophilus en las 5 posiciones distintivas mediante el uso de coordenadas de ADNr 16S de E. Coli 10 15 10 15 5 15 5 10 * n.t. es nucleótido Ejemplo 3 Realizar procedimiento Riboprinter para determinar las diferencias de las cepas Las cepas de Arcobacter sp. aisladas en el Ejemplo 1: 97AE3-12, 97AE3-1, 97AE 3-3, 97AE 3-7, 97AE 4-6, 97AE 4-5 y 97AE4-1 fueron sometidas a un análisis automatizado Riboprinter®, según lo descrito en los Métodos generales, para determinar si las cepas aisladas eran únicas con respecto a las demás. En el análisis se incluyó, como cepa de referencia, el Arcobacter halophilus (ATCC cepa BAA-1022), que tiene un ADNr 16S con 96.4 % de identidad de secuencia de la cepa 97AE3-12. Si bien todas estas cepas tienen una significativa identidad de secuencia entre sí en el ADNr 16S, se obtuvieron varios patrones únicos RiboPrint™ de AD r. Como se muestra en la Figura 4, los patrones de fragmentos de restricción EcoRI que hibridizaron a sondas de ADNr 16S y 23S fueron diferentes para las cepas representativas de Arcobacter sp. 97AE3-12 (ATCC núm. PTA-11409) , 97AE3-3 (ATCC núm . PTA-11410) y 97ÁE3-1. Este análisis demostró que las secuencias genómicas alrededor de los genes de ARNr 16S y 23 en estas cepas son diferentes entre sí y también son diferentes de la cepa comparativa sometida a prueba Arcobacter halophilus .
Ejemplo 4 Investigación de aislado bacteriano 97AE3-12 para determinar crecimiento en presencia de petróleo bajo condiciones de sal bajas y altas Cultivos de la cepa 97AE3-12 se hicieron crecer anaeróbicamente en presencia de petróleo mediante el uso de un medio de sales mínimas de sal baja y una formulación de Salmuera sintético de sal alta. El Salmuera sintético de sal alta usado tenía una salinidad de 64 ppt , lo cual es aproximadamente dos veces la salinidad del agua de mar: El Salmuera sintético de sal alta estaba compuesto de lo siguiente: NaCl, 55.0 g/1, NH4Cl, 0.1 g/1, KH2P04, 0.05 g/1, Na2S04, 0.1 g/1, solución de selenita-tungstato [NaOH, 0.5 g/1, Na2Se03.5H20, 6.0 mg/1, Na2 04.2H20, 8.0 mg/1] , 1 ml/1, NaHC03, 0.2 g/1, solución de vitamina [vitamina B12, 100 mg/1, ácido p-aminobenzóico , 80 mg/1, D (+ ) -biotina, 20 mg/1, ácido nicotínico, 200 mg/1, pantotenato cálcico, 100 mg/1, hidrocloruro de piridoxina, 300 mg/1, tiamina-HC1.2 H20, 200 mg/1, ácido alfa-lipóico, 50 mg/1 ], 1 ml/1, solución de metales traza SL-10 [25 % HC1, 10 ml/1, FeCl2.4 H20, 1.50 g/1, ZnCl2, 70 mg/1, MnCl2.4 H20, 100 mg/1, H3B03, 6 mg/1, CoCl2.6 H20, 190 mg/1, CuCl2.2 H20, 2 mg/1, NiCl2-6 H20, 24 mg/1, Na2Mo04.2 H20, 36 mg/1], 1 ml/1, CaCl2.2 H20, 8.8 g/1, NaN03, 2.0 g/1, KCl, 0.86 g/1, MgCl2.6 H20, 6.4 g/1, y suplementado con NaN03 , 2.0 g/1, pH 6.7 y 64 ppt de salinidad.
El medio de sal baja estaba compuesto de NaCl, 10 g/1, NH4CI, 1.0 g/1, KH2PO4, 0.5 g/1, KS04 , 0.1 g/1, solución de selenita-tungstaton [NaOH, 0.5 g/1, Na2Se03.5 H20, 6.0 mg/1, Na2W04.2H20, 8.0 mg/1], 1 ml/1, NaHC03 , 2.5 g/1, solución de vitamina [vitamina B12, 100 mg/1, ácido p-aminobenzóico , 80 mg/1, D ( + ) -biotina , 20 mg/1, ácido nicotínico, 200 mg/1, pantotenato cálcico, 100 mg/1, hidrocloruro de piridoxina, 300 mg/1, tiamina-HCl .2 H20, 200 mg/1, ácido alfa- lipóico , 50 mg/1] , 1 ml/1, solución de metales traza SL-10 [25 % HC1, 10 ml/1, FeCl2.4 H20, 1.50 g/1, ZnCl2, 70 mg/1, MnCl2.4 H20, 100 mg/1, H3BO3, 6 mg/1, CoCl2.6 H20, 190 mg/1, CuCl2.2 H20, 2 mg/1, NiCl2.6 H20, 24 mg/1, Na2Mo04.2 H20, 36 mg/1], 1 ml/1, CaCl2.2 H20, 0.1 g/1, MgCl2.6 H20, 0.2 g/1, extracto de levadura, 0.5 g/1, y NaN03 , 2.0 g/1, pH 6.9 y 15 ppt de salinidad.
Ambos medios de baja y sal altainidad se sometieron a pruebas para determinar su capacidad de soportar el crecimiento de Arcobacter sp. La cepa 97AE3-12 con y sin lactato sódico se agregó como fuente de carbono a aproximadamente 1 g/1 (jarabe 60 % de lactato sódico, 1.3 ml/1) . Se agregó 2 g/1 de nitrato sódico en medios como aceptor de electrones para todas las muestras de prueba. Los medios se desgasificaron y se agregaron 12 mi a viales de suero de 20 mi. A cada vial se agregó 6.0 mi de aceite de petróleo desgasificado y sometido a autoclave del Pozo núm. 2 en el campo Wainwright en la provincia de Alberta, Canadá. Este petróleo era la única fuente de carbono en las muestras que no tenían lactato. 0.45 mi de 97AE3-12 cultivada en un medio indefinido (Sales de mar (Sigma S9883), 60.0 g/1, peptona 5.0 g/1, extracto de levadura 5.0 g/1 casaminoácidos 5.0 g/1, NaFeEDTA 133 mg/1, con pH ajustado entre 6.4-6.6 y esterilizados con filtro) se agregaron como inoculo a los cultivos de prueba anaeróbica en aproximadamente 5 xlO7 células de inoculo por mi de medio. Los cultivos de prueba que contenían el inoculo 97AE3-12 se prepararon en duplicado. Un solo control no inoculado (NIC, por sus siglas en inglés) por medio de prueba se preparó como control abiótico. La reducción de nitrato se analizó como medición del crecimiento celular en cada medio mediante IC según lo descrito en los Métodos generales. La cepa 97AE3-12 redujo 100 % del nitrato proporcionado a nitrito en un lapso de 6 días de incubación a 25 °C en medio de sal baja suplementado con lactato, y redujo 50-77 % del nitrato a nitrógeno en el medio de sal alta suplementado con lactato. Los resultados de la Tabla 7 muestran que la cepa 97AE3-12 de Arcobacter sp . fue capaz de crecer por medio del uso del lactato como fuente de carbono en presencia de petróleo del Pozo Wainwright, en medios tanto de sal baja como de sal alta.
Tabla 7. Reducción de nitrato en cultivos de 97AE3-12 en presencia de petróleo, en medios de sal baja o sal alta Ejemplo 5 Investigación de aislados bacterianos para determinar su capacidad de formar biopelículas y obturar el flujo Las cepas 97AE 3-12, 97AE3-1, 97AE 3-3, 97AE 4-6, 97AE 4-5, 97AE 3-7 y 97AE4-1 de Arcobacter, que se aislaron de un depósito de petróleo canadiense según lo descrito en el Ejemplo 1, se sometieron a pruebas para determinar su capacidad de formar biopelículas para inhibir el flujo en filtros de vidrio fritado de porosidad media (diámetro medio del poro = 10 micrones) según se describe en los Métodos generales. El medio de sal alta usado para las pruebas tenía la siguiente composición: NaCl , 54 g/1, NH4Cl, 0.1 g/1, KH2P04, 0.05 g/1, Na2S04, 0.1 g/1, solución de selenita-tungstato [NaOH , 0.5 g/1, Na2Se03.5 H20, 6.0 mg/1, Na2 04.2 H20, 8.0 mg/1], 1 ml/1, NaHC03, 0.2 g/1, solución de vitamina [vitamina B12, 100 mg/1, ácido p-aminobenzoico, 80 mg/1, D (+) -biotina, 20 mg/1, ácido nicotínico, 200 mg/1, pantotenato cálcico, 100 mg/1, hidrocloruro de piridoxina, 300 mg/1, tiamina-HCl .2 H20, 200 mg/1, ácido alfa-lipóico, 50 mg/1] , 1 ml/1, solución de metales traza SL-10 [25 % HCl, 10 ml/1, FeCl2.4 H20, 1.50 g/1, ZnCl2, 70 mg/1, MnCl2.4 H20, 100 mg/1, H3B03, 6 mg/1, CoCl2.6 H20, 190 mg/1, CuCl2.2 H20, 2 mg/1, NiCl2.6 H20, 24 mg/1, Na2Mo04.2 H20, 36 mg/1], 1 ml/1, CaCl2.2 H20, 8.8 g/1, KC1 , 0.86 g/1, MgCl2.6 H20, 6.4 g/1, fumarato disódico, 3275 g/1, lactato sódico, 1 g/1. Este medio tiene una salinidad de 75 ppt .
Cada cepa de Arcobacter se inoculó en medio de la composición antes indicada y se incubó aeróbicamente durante 48 h. Para iniciar la ejecución de la prueba, se agregó 1 mi de un cultivo de 48 h a 25 mi del mismo medio en triplicado. Las estructuras de filtro en triplicado que contenían los medios inoculados se sellaron individualmente en vasos de incubación de 125 mi bajo condiciones anaeróbicas y se colocaron en una incubadora/agitadora a 28 °C a 100 rpm por 2 semanas. Adicionalmente , se ejecutaron controles no inoculados en triplicado con la misma formulación de medio, pero sin el inoculo de cepa en paralelo con las muestras de prueba inoculadas.
Después de dos semanas, las velocidades de flujo se verificaron al pasar 1 mi de agua desionizada, impulsada por gravedad, a través de los filtros. El tiempo para el paso del agua se midió tres veces sucesivamente para cada uno de los filtros control y de prueba. Las velocidades de flujo se calcularon y los valores posincubación se compararon con los valores pre-incubación para cada filtro. Los resultados en la Tabla 8 muestran que todas las cepas sometidas a pruebas causaron una disminución significativa en la velocidad de flujo en comparación con los controles, que tenían un promedio de 27 % de aumento en la velocidad de flujo. El aumento de la velocidad de flujo fue resultado de una mejor saturación de agua de los poros de frita después de dos semanas de incubación en sumersión. Estos resultados demuestran la capacidad de las cepas aisladas de Arcobacter para formar biopelículas y obturar poros en la arena.
Tabla 8. Cambios en la velocidad de flujo a través de filtros de vidrio de porosidad media después de dos semanas de incubación con aislados de Arcobacter 5 10 10 * 3 mediciones/réplicas sucesivas. 1 Calculado como ((medio posincubación, ml/s/preincubación, ml/s) -1) x 100 Ejemplo 6 Ensayo de biopelícula de cepa 97AE3-12 de arcobacter en medio con baja y elevada sal con lactato como fuente de carbono La cepa 97AE3-12 se sometió a ensayo para determinar la capacidad de formar biopelículas sobre filtros de vidrio fritado según se describe en los Métodos generales mediante el uso de tres medios diferentes con salinidad que varía entre 15 ppt y 68 ppt . La salinidad de cada medio se midió con refractómetro . La cepa 97AE3-12 se hizo crecer anaeróbicamente en medio de crecimiento de las siguientes composiciones : Medio 1: medio de sales mínimas; NaCl , 10 g/1, NH4C1 , 1.0 g/1, KH2P04, 0.5 g/1, KS04 , 0.1 g/1, solución de selenita-tungstato [NaOH, 0.5 g/1, Na2Se03.5 H20, 6.0 mg/1, Na2 04.2H20, 8.0 mg/1], 1 ml/1, NaHC03, 2.5 g/1, solución de vitamina [vitamina B12, 100 mg/1, ácido p-aminobenzóico , 80 mg/1, D (+) -biotina, 20 mg/1, ácido nicotínico, 200 mg/1, pantotenato cálcico, 100 mg/1, hidrocloruro de piridoxina, 300 mg/1, tiamina-HCl .2 H20, 200 mg/1, ácido alf -lipóico, 50 mg/1] , 1 ml/1, solución de metales traza SL-10 [25 % HCl , 10 ml/1, FeCl2.4 H20, 1.50 g/1, ZnCl2, 70 mg/1, MnCl2.4 H20, 100 mg/1, H3BO3, 6 mg/1, CoCl2.6 H20, 190 mg/1, CuCl2.2 H20, 2 mg/1, NiCl2.6 H20, 24 mg/1, Na2Mo04.2 H20, 36 mg/1], 1 ml/1, CaCl2.2H20, 0.1 g/1, MgCl2.6H20, 0.2 g/1, extracto de levadura, 0.025 g/1, NaN03 , 2.0 g/1, jarabe 60 % lactato sódico, 1.3 ml/1, solución de azul de bromotiraol 0.4 %, 3 mi . La salinidad de este medio es 15 ppt.
El Medio 2 es igual al Medio 1 en composición pero con NaCl incrementado a 30 g/1. La salinidad de este medio es 35 ppt.
El Medio 3 es un medio de sales altas que incluye mayores niveles de NaCl y los cationes Ca++ y Mg++: NaCl, 51.5 g/1, NH4C1, 0.1 g/1, KH2P04, 0.05 g/1, Na2S04, 0.1 g/1, solución de selenita-tungstato [NaOH, 0.5 g/1, Na2Se03.5 H20, 6.0 mg/1, Na2W04.2 H20, 8.0 mg/1] , 1 ml/1, NaHC03, 0.2 g/1, solución de vitamina [vitamina B12, 100 mg/1, ácido p-aminobenzóico, 80 mg/1, D (+) -biotina, 20 mg/1, ácido nicotínico, 200 mg/1, Pantotenato cálcico, 100 mg/1, hidrocloruro de piridoxina, 300 mg/1, tiamina-HCl .2 H20, 200 mg/1, ácido alfa-lipóico, 50 mg/1], 1 ml/1, solución de metales traza SL-10 [25 % HCl, 10 ml/1, FeCl2.4 H20, 1.50 g/1, ZnCl2( 70 mg/1, MnCl2.4 H20, 100 mg/1, H3BO3, 6 mg/1, CoCl2.6 H20, 190 mg/1, CuCl2.2 H20, 2 mg/1, NiCl2.6 H20, 24 mg/1, Na2Mo04.2 H20, 36 mg/1], 1 ml/1, CaCl2.2 H20, 8.8 g/1, extracto de levadura, 0.025 g/1, NaN03, 2.0 g/1, jarabe 60 % lactato sódico, 1.3 ml/1, KCl , 0.86 g/1, MgCl2.6 H20, 6.4 g/1, solución de azul de bromotimol, 0.4 %, 1 mi . La salinidad de este medio es 68 ppt.
El experimento y las pruebas de velocidad de flujo después de 2 semanas de incubación se realizaron según se describe en los Métodos generales. Medio inoculado con Arcobacter sp . La cepa 97AE3-12 se preparó en triplicado; los controles no inoculados se prepararon en duplicado. Mientras la velocidad de flujo aumentó en los controles como en el Ejemplo 5, la cepa 97AE3-12 causó una significativa disminución en la velocidad de flujo (Tabla 9) . Las velocidades de flujo en los tratamientos control aumentó en un promedio de 54, 35 y 46 % para los Medios 1, 2 y 3, respectivamente. Los tratamientos de prueba que contienen el inoculo 97AE3-12 mostraron una disminución media de 80, 80 y 46 % en la velocidad de flujo para los medios 1, 2 y 3, respectivamente, que tenían salinidades de 15, 35 y 68 ppt, respectivamente .
Tabla 9. Cambios en la velocidad de flujo a través de filtros de vidrio de porosidad media después de dos semanas de incubación. 5 5 10 15 * 3 mediciones sucesivas 1 Calculado como ( (media posincubación, ml/s/ preincubación, ml/s) -1) x 100 Ejemplo 7 Conglomeración de partículas de sílice La cepa 97AE3-12 de Arcobacter se sometió a pruebas para determinar su capacidad de agregar granos de sílice cristalino según lo descrito en los Métodos generales. El medio usado para las pruebas tenía la siguiente composición: NaCl, 54 g/.l, NH4C1, 0.1 g/1, KH2PO4, 0.05 g/1, Na2S04, 0.1 g/1, solución de selenita-tungstato [NaOH, 0.5 g/1, Na2Se03.5 H20, 6.0 mg/1, Na2W04.2 H20, 8.0 mg/1], 0.5 ml/1, NaHC03, 0.1 g/1, solución de vitaminas [vitamina B12, 100 mg/1, ácido p-aminobenzóico, 80 mg/1, D (+) -biotina, 20.00 mg/1, ácido nicotínico, 200 mg/1, pantotenato cálcico, 100 mg/1, hidrocloruro de piridoxina, 300 mg/1, tiamina-HCl .2 H20, 200 mg/1, ácido alfa-lipóico, 50 mg/1], 1.0 ml/1, solución de metales traza SL-10 [25 % HCl , 10 ml/1, FeCl2.4 H20, 1.50 g/1, ZnCl2, 70 mg/1, MnCl2.4 H20, 100 mg/1, H3B03, 6 mg/1, CoCl2.6 H20, 190 mg/1, CuCl2.2 H20, 2 mg/1, NiCl2.6 H20, 24 mg/1, Na2Mo04.2 H20, 36 mg/1], 1.0 ml/1, CaCl2.2H20, 4.4 g/1, 0.25 g extracto de levadura, 0.5 g peptona de caseína, KCl, 0.86 g/1, MgCl2.6 H20, 6.4 g/1 y citrato de sodio, 1 g/1. El medio separado tenía como aceptor de electrones NaN03, 2 g/1 o Fumarato de Na 3.7 g/ml . La salinidad es 64 ppt .
Muestras duplicadas de cada medio se inocularon con 200 µ? de un cultivo aeróbico de la cepa 97AE3-12. Los tubos control duplicados no se inocularon. Los tubos se incubaron de forma estática durante 7 días a 30 °C. Después de siete días, el medio OD600 de los tubos duplicados e inoculados, y de los tubos control duplicados no inoculados, fue aproximadamente 0.04. Cuando los tubos de tratamiento se mezclaron vigorosamente durante 10 segundos con agitador vórtex, la turbidez aumentó dramáticamente debido la resuspensión del sílice cristalino, que se había asentado en los fondos de los tubos. La disminución de la turbidez debido al asentamiento del sílice cristalino se monitoreó en el tiempo después de mezclar al medir el OD600. Los resultados de la Tabla 10 mostraron que la turbidez disminuyó mucho más rápidamente en los tratamientos no inoculados que en los controles según lo indica la reducción de porcentaje en el OD600 para el cultivo no inoculado en comparación con el control a 1 min y a los 10 min después de mezclar.
Esto fue causado porque las partículas de sílice formaron grandes pedazos, de hasta 100 micrones de diámetro según lo determinado mediante examen microscópico, en los tratamientos inoculados, los cuales se asentaron rápidamente en comparación con las partículas de 2-20 µ dispersas y no conglomeradas en los tubos control no inoculados. El comportamiento contrastante de las partículas de sílice mostró que la cepa 97AE3-12 formó una fuerte interacción adhesiva con las partículas de sílice cristalino adyacentes, lo que originó el amontonamiento de las partículas. La conglomeración ocurrió en los cultivos de la cepa 97AE3-12 tanto en los medios de nitrato como de fumarato, aunque ocurrió más conglomeración con el nitrato como aceptor de electrones.
Tabla 10. Asentamiento de partículas de sílice debido a conglomeración de partículas inducida con microbios.
Ejemplo 8 Mediciones de disminución de presión de tubo delgado control El ajuste del tubo delgado descrito en los Métodos generales se usó para medir cambios de presión de una muestra control de arena durante el tiempo. El Salmuera núm. 1 que había sido esterilizado con filtro se suministró de forma continua por 8 días al tubo delgado 9a al mismo tiempo que se medía la disminución de presión en todo en tubo delgado (día 4 hasta día 12 en la Figura 7) . La disminución de presión permaneció en aproximadamente 0.0207 mega Pascales (3 psi) . Esto ilustra la estabilidad de la arena colocada en el tubo delgado al ser inundada con el Salmuera de la inyección filtrada, puesto que en el experimento no se observó cambio en la disminución de presión en el tubo delgado. Esto contrasta con los tubos delgados tratados descritos abajo en los Ejemplos 9 y 10 que mostraron marcados cambios en la disminución de presión como resultado del tratamiento microbiano.
Ejemplo 9 Inoculado, mediciones de disminución de presión de tubo delgado alimentado por lotes El tubo delgado 9a del Ejemplo 8 se preinoculó con 60 mi de agua fresca de inyección (Salmuera núm. 1 que no se esterilizó con filtro) a una velocidad de 15 ml/hora durante 4 horas. Después de esta preinoculación, se colectó una muestra de efluente del tubo delgado 9a y se midieron los conteos celulares, los cuales se muestran en la Tabla 11 (Conteo celular 1: 9a).
Un día después de la preinoculación con agua fresca de inyección no filtrada (Salmuera núm. 1) , el tubo delgado se inoculó con la cepa 97AE3-12 (ATCC núm. PTA-11409) . Una dilución 1:1 de un cultivo en crecimiento de la cepa 97AE3-12 con agua fresca de inyección no filtrada se cultivó en Salmuera núm. 5 y se incubó a temperatura ambiente durante 48 horas con agitación y, después, se diluyó 1:30 en Salmuera núm. 5 para inocular el tubo delgado 9a. Los conteos celulares de este inoculo se determinaron y se muestran en la Tabla 11 (Conteo celular 2 : 9a) . Un volumen de 50 mi de este inoculo se bombeó hacia el tubo delgado a una velocidad de aproximadamente 0.25 ml/min. El proceso de inoculación del tubo delgado tomó aproximadamente 4 h para ser completado. Después de la inoculación, el tubo delgado se conservó cerrado durante 6 días. Después del período de 6 días de permanencia cerrada se tomó una muestra de efluente y se midieron los conteos celulares, los cuales se muestran en la Tabla 11 (Conteo celular 3: 9a) .
A partir del día 20, después de finalizar el período de envejecimiento, se suministró Salmuera núm. 2 al tubo delgado 9a a un ritmo de 4 a 8 horas a una velocidad de 3.6 ml/hora dos veces a la semana (una vez cada 3 o 4 días) durante aproximadamente 25 días (finalizó el día 45, Figura 8) . La disminución de presión se midió a lo largo del tubo delgado 9a durante todo el régimen de alimentación a intervalos. Los días 20 y 24 se proporcionaron suministros cada cuatro horas. Los días 27, 32, 34, 41 y 44 se proporcionaron suministros cada ocho horas. Entre cada uno de estos suministros de nutrientes se proporcionó Salmuera núm. 1 a una velocidad de 3.6 ml/h. La disminución de presión inicialmente fue aproximadamente 0.0207 mega Paséales (3 psi) . Diez días después de iniciar la alimentación a intervalos en el tubo delgado 9a, hubo un notable aumento de la disminución de presión que se hizo más pronunciado con el tiempo (Figura 8) . Al final del experimento, el día 45, la disminución de presión era casi el triple que el control (Ejemplo 8) . En ese momento se tomó una muestra de efluente y se midieron los conteos celulares, los cuales se muestran en la Tabla 11 (Conteo celular 4: 9a). Este considerable aumento de la presión demuestra el potencial que tiene el Arcobacter sp. 97AE3-12 (ATCC núm. PTA-11409) para modificar de forma efectiva la permeabilidad de roca porosa c ando se alimenta en lotes con nutrientes.
Ejemplo 10 Mediciones de disminución de presión de tubo delgado de arena de núcleo alimentado de forma continua El tubo delgado 9b (Métodos generales) se pre-inoculó con agua fresca de inyección proveniente del sitio del pozo a ser sometido a pruebas (Salmuera núm. 1 no filtrado) , se tomaron muestras para los conteos celulares en el efluente del tubo delgado (Tabla 11, Conteo celular 1: 9b), y se inoculó con la cepa 97AE3-12 como en el Ejemplo 9, excepto que la cepa de Arcobacter sp. 97AE3-12 no se diluyó 1:1 con inyección no filtrada de Salmuera núm. 1. El conteo celular se midió en este inoculo y se muestra en la Tabla 11 (Conteo celular 2: 9b) . Después de la inoculación con la cepa de Arcobacter sp. 97AE3-12 el tubo delgado 9b se añejó durante 6 días según se describió más arriba. Después de la inoculación se tomó una muestra de efluente y se midieron los conteos celulares, los cuales se muestran, en la Tabla 11 (Conteo celular 3: 9b). Al tubo delgado 9b se le proporcionó la alimentación nutriente de Salmuera núm. 2 de forma continua a una velocidad de 3.6 ml/hora por el tiempo de duración del experimento mientras se medía la disminución de presión en el mismo (Figura 9) . Inicialmente , la disminución de presión fue de aproximadamente 0.0137 mega Pascales (2 psi) como se muestra en la Figura 9 (ver el día 20). Para el día 32, la disminución de presión observada para el tubo delgado 9b había aumentado aproximadamente en un factor de 2 a 3 comparado con la disminución de presión inicial el día 20. El día 32.8 se detuvo el suministro de Salmuera núm. 2 debido a una falla de la bomba. Para volver a encender la bomba, esta tuvo que ser imprimada a una alta velocidad de flujo. La operación de imprimado de la bomba al parecer redujo la disminución de presión tal y como se observó después del día 32.8 en la Figura 9. Sin embargo, después del día 33, se suministró nuevamente Salmuera de alimentación nutriente núm. 3 a una velocidad de 3.6 ml/hora y la presión subió de nuevo de forma que fue aproximadamente un factor de 2 más alto al final del experimento el día 45 en comparación con la disminución inicial de presión el día 20. En ese momento se tomó una muestra de efluente y se midieron los conteos celulares, los cuales se muestran en la' Tabla 11 (Conteo celular 4: 9b). Este significativo aumento de presión demuestra el potencial que tiene el Arcobacter sp. 97AE3-12 (ATCC núm. PTA-11409) para modificar de forma efectiva la permeabilidad de roca porosa cuando es alimentado continuamente con nutrientes.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (19)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un método para mejorar la recuperación de petróleo de un depósito de petróleo; caracterizado porque comprende : a) proporcionar una composición que comprende: i) por lo menos una cepa de Arcobacter que pertenece al Arcobacter de ciado 1; y ii) un medio de crecimiento mínimo que comprende por lo menos un aceptor de electrones; b) proporcionar un depósito de petróleo; c) inocular el depósito de petróleo con la composición de (a) de forma que el Arcobacter que contiene la composición habite y crezca en el depósito de petróleo; y d) recuperar petróleo del depósito de petróleo; en donde el crecimiento del Arcobacter en el depósito de petróleo mejore la recuperación de petróleo.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la por lo menos una cepa de Arcobacter que pertenece a Arcobacter de ciado 1 comprende la secuencia consenso redundante de ADNr 16S de la sec . con núm. de ident . : 40.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la por lo menos una cepa de Arcobacter que pertenece a Arcobacter de ciado 1 comprende una secuencia de ADNr 16S que tiene por lo menos aproximadamente 97 % de identidad de secuencia de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la sec . con núms . de ident. :l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 39.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el aceptor de electrones es por lo menos una sal iónica de nitrato.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el aceptor de electrones es por lo menos una sal iónica de nitrito o una combinación de por lo menos una sal de nitrito y por lo menos una sal de nitrato.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el depósito de petróleo comprende por lo menos un fluido que tiene una concentración de sal de por lo menos aproximadamente 30 partes por mil.
7. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 5, caracterizado porque la cepa de ArcoJ acter que pertenece a Arcobacter de ciado 1 comprende una secuencia parcial de ADNr 16S seleccionada del grupo que consiste en la sec. con núms. de ident.;l, 33, 34, 35, 36, 37 y 38.
8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la cepa de Arcobacter que pertenece a Arcobacter de ciado 1 se selecciona del grupo que consiste en 97AE3-3 (ATCC núm. PTA-11410) y 97AE3-12 (ATCC núm. PTA-11409) .
9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición de (a) comprende, además, uno o más microorganismos adicionales que crecen en presencia del petróleo bajo condiciones desnitrificantes.
10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el uno o más microorganismos adicionales comprenden una especie Shewanella o Thauera sp . AL9:8 (ATCC núm. PTA-9497) .
11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la especie Shewanella comprende un ADNr 16S que comprende las secuencias distintivas redundantes de las sec . con núms . de ident. : 48, 50 y 52.
12. Un microorganismo caracterizado porque es aislado de una cepa seleccionada del grupo que consiste en 97AE3-3 (ATCC núm. PTA-11410) y 97AE3-12 (ATCC núm. PTA-11409) .
13. Una composición para mejorar la recuperación de petróleo; caracterizada porque comprende: a) por lo menos una cepa aislada de Arcobacter que comprende una secuencia parcial de ADNr 16S seleccionada del grupo que consiste en la sec. con núms. de ident. ;1, 33, 34, 35, 36, 37 y 38; b) uno o más aceptores de electrones; y c) por lo menos una fuente de carbono.
14. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la cepa de Arcojbacter se selecciona del grupo que consiste en 97AE3-3 (ATCC núm. PTA-11410) y 97AE3-12 (ATCC núm. PTA- 11409) .
15. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la por lo menos una fuente de carbono se selecciona del grupo que consiste en lactato, acetato, formato y succinato.
16. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende uno o más microorganismos adicionales.
17. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el uno o más microorganismos adicionales crecen en presencia de petróleo bajo condiciones desnitrificantes .
18. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el uno o más microorganismos adicionales comprenden una especie Shewanella o Thauera s . AL9:8 (ATCC núm. PTA-949).
19. La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque la especie Shewanella comprende un ADNr 16S que comprende las secuencias distintivas redundantes de las sec . con núms . de ident . : 48, 50 y 52.
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