MX2010011236A - Identificacion, caracterizacion y aplicacion de shewanella putrefaciens (lh4:18), utiles en la liberacion de petroleo incrementada por microbios. - Google Patents
Identificacion, caracterizacion y aplicacion de shewanella putrefaciens (lh4:18), utiles en la liberacion de petroleo incrementada por microbios.Info
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Abstract
La presente descripción se relaciona con el aislamiento, la identificación y la aplicación de la cepa LH4:18 de Shewanella putrefaciens que crece bajo condiciones anaerobias desnitrificantes al petróleo crudo como única fuente de carbono. Este organismo ayuda en la liberación de petróleo del sustrato en simulaciones de reservorios, cuando se cultiva sobre lactato o peptona como fuente de carbono. La cepa LH4:18 de Shewanella putrefaciens puede usarse sola o en combinación con otros microorganismos para mejorar la recuperación de petr6leo.
Description
IDENTIFICACION, CARACTERIZACION Y APLICACION DE SHEWANELLA PUTREFACIENS (LH4:18), UTILES EN LA LIBERACION DE PETROLEO
INCREMENTADA POR MICROBIOS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente descripción se relaciona con el campo de la microbiología ambiental y con la modificación de las propiedades del petróleo crudo pesado mediante el uso de microorganismos. Más específicamente, los microorganismos puros se usan bajo condiciones desnitrificantes para modificar las propiedades del petróleo crudo pesado a fin de mejorar la recuperación de petróleo crudo de su reservorio subterráneo .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El desafío de cumplir con la demanda siempre creciente de petróleo incluye mejorar la recuperación de petróleo crudo de los reservorios subterráneos. Este desafío ha resultado en esfuerzos cada vez mayores para desarrollar procesos de recuperación de petróleo alternativos rentables (Kianipey, S. A. y Donaldson, E. C. 61st Annual Technical Conference and
Exhibition, Nueva Orleans, LA, Estados Unidos, 5-8 de octubre de 1986) . Los hidrocarburos pesados en la forma de depósitos y reservorios de petróleo se encuentran distribuidos por todo el mundo. Estos reservorios de petróleo se miden en los cientos de miles de millones de barriles recuperables. Dado que el
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petróleo crudo pesado tiene una viscosidad relativamente alta, es esencialmente inmóvil y no puede recuperarse fácilmente mediante medios convencionales primarios y secundarios.
La recuperación de petróleo incrementada por microbios (MEOR, por sus siglas en inglés) es una metodología para aumentar la recuperación de petróleo mediante la acción de microorganismos (Brown, L. R., Vadie, A. A,. Stephen, 0. J. SPE 59306, SPE/DOE Improved Oil Recovery Symposium, Oklahoma, 3-5 de abril de 2000) . La investigación y el desarrollo de la MEOR es un esfuerzo constante dirigido a descubrir técnicas de uso de microorganismos a fin de modificar las propiedades del petróleo crudo para beneficiar la recuperación de petróleo (Sunde. E., Beeder, J., Nilsen, R. K. Torsvik, T. , SPE 24204, SPE/DOE 8th Symposium on enhanced Oil Recovery, Tulsa, OK, Estados Unidos, 22-24 de abril de 1992) .
Se han descrito métodos para identificar microorganismos útiles en procesos de MEOR. Estos métodos requieren la identificación de muestras sacadas de un pozo o reservorio de petróleo; los métodos comprenden un consorcio de microorganismos y el enriquecimiento o la evolución de las poblaciones en la muestra bajo condiciones específicas con un medio nutriente definido (solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2007/0092930A1) . Entonces, existe una necesidad de desarrollar métodos para: 1) identificar microorganismos que pueden crecer dentro o sobre petróleo
bajo condiciones desnitrificantes anaerobias por selección de aislados puros de enriquecimiento de microorganismos indígenas; 2) explorar aislados en busca de propiedades que podrían resultar útiles en interacciones o modificación de petróleo y 3) usar los microorganismos identificados, de una manera rentable, para mejorar la recuperación de petróleo.
El organismo LH4:18, descrito en la presente descripción, se identificó mediante homología de ADNr 16S como una cepa de Shewanella putrefaciens . La secuencia de ADNr 16S tiene una homología de 100 % con dos de los ocho genes de ADNr en las cepas de Shewanella putrefaciens CN32 y W3-18-1. La CN32 de Shewanella putrefaciens (Genome Analysis and System Modeling Group of the Life Sciences División of Oak Ridge National Laboratory) y la W3-18-1 de S. putrefaciens (DOE Joint Genome Institute) se aislaron de muestras ambientales y se estudiaron extensamente para la bioremediación de metales pesados. El grupo de Natural and Accelerated Bioremediation Research del DOE estudió la habilidad de la cepa CN32 para reducir metales polivalentes, que incluyen hierro, manganeso, uranio, y cromo (William D. Burgos, W. D., et al., Environ. Eng . Sci., 24, 755-761, 2007; y Liu, C, et al., Biotechnol. Bioeng. 80, 637-649, 2002) . La cepa W3-18-1 se estudió para la remediación de metales y materiales radiactivos, especialmente en climas fríos (Stapleton Jr. , R.D., et al., Aquat . Microb. Ecol .
38:81-91, 2005). Ambas cepas tienen utilidad en la reducción de la solubilidad de los metales y la estabilización de ellos in situ.
Muchas Shewanella putrefaciens pueden reducir óxidos metálicos, pero existen diferencias sutiles en la habilidad de cada cepa que implican variabilidad genética más allá de las homologías de ADNr 16S . Las especies de Shewanella se describen para la remediación de contaminación de metales (patente de los Estados Unidos núm. 6923914B2) , hierro que contiene residuos mezclados (patente de los Estados Unidos núm. 6719902B1) , contaminación de manganeso (patente de los Estados Unidos núm. 6350605B1) y otros contaminantes con la ayuda de butano (patente de los Estados Unidos núm. 6245235B1) . En la patente EP1189845A1, se han reivindicado las especies de Shewanella que pueden utilizar butano en un método de bioremediación de contaminantes de petróleo aeróbicamente . Además, se usó Shewanella complementada con butano para la reducción de la suciedad en los pozos de recuperación e inyección bajo condiciones aeróbicas (patente de los Estados Unidos 6244346B1) . Se conoce que la Shewanella putrefaciens produce biopelículas (D. Bagge, et al., Appl . Environ. Microbiol . , 67, 2319-2325. 2001). Las biopelículas de especies Shewanella tienen potencial para secuestrar gases, en particular C02, en formaciones geológicas subterráneas y prevenir su liberación en la atmósfera (véase la patente de los Estados Unidos núm.
20060216811A1) . Hasta la actualidad, no se ha informado el uso de especies Shewanella en recuperación de petróleo mejorada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La invención se relaciona con la identificación de microorganismos de muestras de agua de producción obtenidas de un reservorio de petróleo. Se desarrolló un protocolo para identificar microbios capaces de crecer bajo condiciones desnitr ficantes mediante el uso de petróleo o componentes del petróleo como única fuente de carbono. Los microbios podrían cultivarse in situ en un reservorio de petróleo para el mejoramiento de la recuperación de petróleo. El cultivo de los microorganismos y, específicamente, los cultivos puros descritos en la presente descripción, en un reservorio o pozo de petróleo mejora la recuperación rentable del petróleo .
Una cepa, designada LH4 : 18 de Shewanella putrefaciens, se identificó por tipificación de ADNr 16S como homologa a la Shewanella putrefaciens (cepa CN32) . La ribot ipificación confirmó que las secuencias genómicas que rodean los genes de ADNr 16S y 23 en la cepa LH4 : 18 son sustancialmente diferentes comparados con otras cepas analizadas de Shewanella putrefaciens y confirmó la unicidad de la cepa LH4:18 de Shewanella putrefaciens.
Por lo tanto, un aspecto se relaciona con un microorganismo aislado designado como aislado bacteriano Shewanella putrefaciens LH4:18 (ATCC núm . PTA-8822).
Otro aspecto se relaciona con una composición para mejorar la recuperación del petróleo que comprende: a) Shewanella putrefaciens LH4:18 (ATCC núm. PTA-8822); b) uno o más aceptores de electrones y c) al menos una fuente de carbono.
Otro aspecto se relaciona con un método para mejorar la recuperación de petróleo de un reservorio de petróleo; el método comprende: a) proporcionar una composición que comprende como aislado bacteriano la Shewanella putrefaciens LH4:18 (ATCC núm. PTA-8822) y medio mínimo que comprende nitratos simples capaces de promover el crecimiento del aislado, y b) inocular el reservorio con la composición de (a); en donde el crecimiento del aislado, bajo condiciones desnitrificantes, en el reservorio de petróleo, promueve la recuperación mejorada de petróleo.
Otro aspecto se relaciona con un método para promover la bioremediación de hidrocarburos; el método comprende aplicar aislado bacteriano Shewanella putrefaciens LH4:18 (ATCC núm. PTA-8822) a un área contaminada con hidrocarburos .
Otro aspecto se relaciona con un método para
promover el mantenimiento de oleoductos; el método comprende aplicar aislado bacteriano Shewanella putrefaciens LH4:18 (ATCC núm. PTA-8822) a un oleoducto.
BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS
Las siguientes secuencias cumplen con 37 C.F.R. §§ 1.821-1.825 ("Requisitos para la solicitud de patentes que contienen secuencias de nucleótidos y/o descripciones de secuencias de aminoácidos: reglas de secuencias") y se ajustan al estándar de la Organización Mundial de Propiedad Intelectual (OMPI) ST.25 (1998) y a los requerimientos de listado de secuencias de EPO y PCT (Reglas 5.2 y 49.5(a-bis), y Sección 208 y Anexo C de las Instrucciones Administrativas. Los símbolos y el formato que se usan para los datos de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos cumplen las reglas que se exponen en 37 C.F.R. §1.822.
Sec . con núm. de ident .1 - 1492R CGGTTACCTTGTTACGACTT
Sec. con núm. de ident .2 - 8F - AGAGTTTGATYMTGGCTCAG Las sec. con núm. de ident. 1 y 2 se usaron para la amplificación de los genes del ADNr bacteriano.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Esquema de un reactor de columna de acrílico para el enriquecimiento de cepas consumidoras de
petróleo .
Figuras 2A-2C. Ensayo de liberación de petróleo de microcolumna de arena que muestra la liberación de gotículas de petróleo. Figura 2A. Testigo (sin liberación); Figura 2B. Gotículas en la superficie (liberación parcial); Figura 2C. Petróleo en cuello de la pipeta (liberación completa) .
Figura 3. Construcción de columna de mini bolsitas de arena para la liberación de petróleo.
Figura 4. Diagrama de aparato de liberación de petróleo de bolsita de arena comprimido.
Figura 5. Gráfico de liberación de petróleo durante el tiempo en una prueba mini bolsita de arena inoculada con aislado bacteriano Shewanella putrefaciens LH4:18.
Figura 6. Gráfico de liberación de petróleo durante el tiempo en una prueba mini bolsita de arena inoculada con aislado bacteriano Shewanella putrefaciens LH4:18 mezclado con aislado bacteriano Pseudomonas stutzeri LH4 : 15.
Figura 7. Resultados del análisis de riboimpresión de cepas Shewanella.
Los solicitantes realizaron los siguientes depósitos biológicos bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para los propósitos del procedimiento en
materia de patentes :
Tabla 1
Información sobre cepas depositadas
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención se relaciona con la identificación de un microorganismo previamente desconocido de muestras de agua de producción obtenidas de un reservorio de petróleo. Se desarrolló un protocolo para identificar microbios capaces de crecer bajo condiciones desnitrificantes mediante el uso de petróleo o componentes del petróleo como única fuente de carbono. Estos microbios podrían cultivarse in si tu en un reservorio de petróleo para el mejoramiento de la recuperación de petróleo
Se proporcionan las siguientes definiciones para los términos y las abreviaturas especiales usadas en esta
solicitud:
La abreviatura "d TPs" se refiere a desoxinucleósido trifosfato .
La abreviatura "ATCC" se refiere a American Type Culture Collection International Depository, Manassas, VA, USA. "ATCC núm." se refiere al número de acceso a los cultivos en depósito en ATCC.
La abreviatura "ASTM" se refiere a American Society for Testing and Materials.
El término "muestra ambiental" significa cualquier muestra expuesta a hidrocarburos, que incluye una mezcla de agua y petróleo. Tal como se usa en la presente, las muestras ambientales incluyen muestras de agua y petróleo que comprenden microorganismos indígenas útiles para el mapeo filogenético de géneros presentes en una zona de muestra dada.
Los términos "pozo de petróleo" y "reservorio de petróleo" podrían usarse en la presente indistintamente y se refieren a una formación subterránea o submarina de la que puede recuperarse petróleo.
El término "mejoramiento de la recuperación de petróleo" se refiere al uso de microorganismos utilizadores de hidrocarburos, que son endémicos en reservorios de petróleo, donde ocurren naturalmente mediante el uso de hidrocarburos como fuente de alimento. Como resultado de este proceso, a través de la excreción de bioproductos tales como alcoholes,
gases, ácidos, tensioactivos y polímeros, los microorganismos utilizadores de hidrocarburos pueden cambiar las propiedades fisicoquímicas del petróleo crudo. Las propiedades fisicoquímicas cambiadas son, por ejemplo, las descritas bajo el término "modificación del ambiente del pozo de petróleo", más abajo.
El término "crecimiento sobre petróleo" se refiere a que las especies microbianas son capaces de metabolizar hidrocarburos u otros componentes orgánicos del petróleo crudo como un nutriente para sostener el crecimiento.
El término "aceptor de electrones" se refiere a una entidad química que acepta electrones transferidos a ella desde otro compuesto. Es un agente oxidante que, en virtud de sus electrones aceptantes, se reduce en el proceso.
Los términos "desnitrificante" y "desnitrificación" significan reducir los nitratos a usar en la generación de energía respiratoria.
El término "eficiencia del barrido" significa la habilidad del agua inyectada para "empujar" el petróleo a través de una formación geológica hacia un pozo productor. Un problema que puede surgir con el proceso de inundación con agua es la eficiencia relativamente pobre del barrido, es decir, el agua puede canalizar a través de ciertas porciones del reservorio a medida que se desplaza desde el pozo o pozos de inyección hacia el pozo o pozos de
producción, por lo tanto, pasa por alto otras porciones del reservorio. La eficiencia pobre del barrido podría deberse, por ejemplo, a diferencias en la movilidad del agua en comparación con la movilidad del petróleo, así como a las variaciones de permeabilidad dentro del reservorio que promueven el flujo a través de ciertas porciones del reservorio y no a través de otras .
El término "cultivo puro" significa un cultivo derivado de un único aislado de célula de una especie microbiana. Los cultivos puros a los que se refiere específicamente la presente incluyen los que se encuentran disponibles públicamente en un depósito. Los cultivos puros adicionales son identificables mediante métodos descritos en la presente descripción.
El término "biopelícula" significa una película o "capa de biomasa" de microorganismos. Las biopelículas se sumergen, generalmente, en polímeros extracelulares que se adhieren a superficies sumergidas en, o sujetas a, ambientes acuáticos.
Los términos "nitratos simples" y "nitritos simples" se refieren a nitrito (N02) y nitrato (N03) .
"Agua de inyección" significa agua usada para inyectar hacia el interior de los reservorios de petróleo para la recuperación secundaria de petróleo.
El término "modificación del ambiente del pozo de petróleo" incluye uno o más de: 1) alterar la distribución de permeabilidad de la formación subterránea (eficiencia de
barrido) , (2) producir biotensioactivos que disminuyen las tensiones interfacial y superficial, (3) mediar cambios en la humectación, (4) producir polímeros que mejoran la relación movilidad de agua/petróleo; (5) generar gases (predominantemente C02) que aumenten la presión de la formación; y (6) reducir la viscosidad del petróleo.
La abreviatura "NCBI" se refiere a National Center for Biotechnology Information.
Los términos "tipificación filogenética" , "mapeo filogenético" o "clasificación filogenética" podrían usarse indistintamente en la presente y se refieren a una forma de clasificación en la que los microorganismos se agrupan de acuerdo a su linaje ancestral. Los métodos de la presente están dirigidos específicamente a la tipificación filogenética en muestras ambientales sobre la base de la secuenciación de ADN ribosómico (ADNr) 16S. En este contexto, una longitud completa de 1400 pares de bases (bp) de la secuencia del gen ADNr 16S se genera mediante le uso de iniciadores identificados en la presente y comparados por homología de secuencias con una base de datos de secuencias conocidas de ADNr de microorganismos conocidos. Luego, esta comparación se usa para la identificación de cultivos puros a usarse en recuperación mejorada de petróleo.
El término "ribotipificación" significa obtener la huella de identificación de fragmentos de restricción de ADN
genómico que contienen todos o parte de los genes que codifican para el ARNr 16S y 23S.
El término "especie microbiana" significa microorganismos definidos identificados sobre la base de su fisiología, morfología y características filogenéticas mediante el uso de secuencias de ADNr 16S.
La abreviatura "ADNr" se refiere a ácido desoxirribonucleico ribosómico.
El término "tipificación de ADNr" significa el proceso de usar la secuencia del gen que codifica para ADNr 16S para obtener las especies microbianas de parentesco más cercano" por homología con secuencias de ADNr mantenidas en varias bases de datos internacionales.
El término "programa de análisis de secuencia" se refiere a cualquier programa de programa o algoritmo de computadora que resulta útil para el análisis de secuencias de aminoácidos o nucleótidos. El "programa de análisis de secuencia" podría estar disponible comercialmente o desarrollarse independientemente. El programa de análisis de secuencias típico incluye, pero no se limita a, el conjunto de programas de GCG (Wisconsin Package Versión 9.0, Genetics Computer Group (GCG) , Madison, WI) , BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410,1990), ADNSTAR (ADNSTAR, Inc., Madison, WI) y el programa FASTA que incorpora el algoritmo Smith- aterman (Pearson, W. R. , Comput. Methods Genome Res.,
Proc. Int. Symp, Meeting Date 1992, 111-120, Ed: Suhai, Sandor, Plenum Publishing, Nueva York, Y, 1994) . Dentro del contexto de esta solicitud, se entenderá que cuando el análisis se realiza con el programa de análisis de secuencias, los resultados del análisis estarán basados en los "valores predeterminados" del programa de la referencia, a menos que se especifique de cualquier otra forma. Como se usa en la presente, "valores predeterminados" se refiere a cualquier conjunto de valores o parámetros que se carga originalmente con el programa la primera vez que se inicia.
Las abreviaturas adicionales que se usan en la presente son: "h" significa hora(s), "min" significa minuto(s), "día" significa día(s), "mi" significa mililitros, mg/ml significa miligramo por mililitro, "1" significa litros, "µ?" significa microlitros, "mM" significa milimolar, "µ?" significa micromolar, "nM" significa nano molar, "pg/l" significa microgramo por litro, "pmol" significa picomolar (es) , "°C" significa grados centígrados, "°F" significa grados Fahrenheit, "bp" significa par de base, "bps" significa pares de bases, "mm" significa milímetro, "ppm" significa parte por millón, "g/1" significa gramo por litro, "ml/min" significa mililitro por minuto, "ml/h" significa mililitro por hora, "cfu/ml" significa unidades formadoras de colonias por mililitro, "g" significa gramo, "mg/1" significa miligramo por litro, "Kev" significa kilo o miles de electrón-voltios, "psig"
significa por pulgada cuadrada por gramo, "LB" significa caldo de cultivo Luria, "rpm" significa revolución por minuto.
Cultivo de microorganismos
Las técnicas para el cultivo y mantenimiento de cultivos anaerobios se describen en "Isolation of Biotechnological Organisms from Nature", (Labeda, D. P. ed. 117-140, McGraw-Hill Publishers, 1990) . El crecimiento anaerobio se mide por la reducción de nitratos en el medio de cultivo durante el tiempo. El nitrato se usa como el aceptor de electrones principal bajo las condiciones de cultivo usadas en la presente. La reducción de nitrato a nitrógeno se ha descrito previamente (Moreno-Vivian, C, et al., J. Bacteriol., 181, 6573 - 6584, 1999). En algunos casos, los procesos de reducción de nitrato llevan a una acumulación de nitritos que, subsiguientemente, se reducen a nitrógeno. Por tanto, la acumulación de nitritos también se considera una prueba del metabolismo y el crecimiento activo por parte de los microorganismos.
Cromatografía de iones
A fin de cuantificar iones de nitrito y nitrato en medios acuosos, los solicitantes usaron un cromatógrafo ICS2000 (Dionex, Banockburn, IL) equipado con una columna de intercambio aniónico AS15 y un gradiente de 2 a 50 mM de hidróxido de potasio. Para calibrar las concentraciones de nitratos y nitritos se generaron y usaron curvas estándar mediante el uso de cantidades conocidas de soluciones de
7
nitrito de sodio o nitrato de sodio.
Análisis para descubrir aislados ambientales capaces de crecer en componentes de petróleo
A continuación se describe la forma en que se implemento un protocolo de exploración para descubrir cultivos puros novedosos capaces de crecer sobre componentes de petróleo y/o modificaciones de estos componentes.
Muestras de agua de producción de reservorio de petróleo
Se obtuvieron muestras de agua de cabezas de pozos de inyección y producción como líquidos de petróleo/agua mezclados en botellas de vidrio color café de 1.0 1, se llenaron hasta arriba, se taparon y se sellaron con cinta para evitar la fuga de gas . El gas de los procesos anaerobios inherentes bastó para mantener las condiciones anaerobias durante el transporte . Las botellas se transportaron en refrigeradores grandes de plástico llenos de bloques de hielo hasta las instalaciones de prueba, dentro de las 48 horas de sacadas las muestras.
Enriquecimiento en columna
Se usaron reactores de columna para desarrollar cultivos enriquecidos a partir de muestras ambientales e industriales a fin de seleccionar una diversidad de organismos que crecerían sobre petróleo para ser usados en MEOR. El uso de reactores de columna se ha informado previamente (Fallón, R. D., et al., Appl . Environ. Microbiol., 57, 1656-1662, 1991). Se usó un reactor de
columna de acrílico (7.62 cm de diámetro por 60.9 cm de largo (3 pulgadas de diámetro por 24 pulgadas de largo) , mostrado en la Figura 1) . La columna tenía 9 puertos laterales (porción E de la Figura 1) , y cada puerto lateral tenía roscas de tubería nacional (NPT, por sus siglas en inglés) hembras de 0.32 cm (1/8 de pulgada) adheridas a él. Se montó un adaptador de conexión de tubo macho de 0.32 cm (1/8 de pulgada) a hembra swagelock (1/8 de pulgada) (Swagelok Company, Solón, Ohio) en el agujero roscado. Se montó un tabique en el extremo de tubo de 0.32 cm (1/8 de pulgada) de esta conexión de manera que pudiera usarse una aguja de jeringa para sacar muestras de la columna más tarde. Este acoplamiento se realizó de forma hermética tal como lo evidencia el hecho de que no existieron fugas de agua cuando la columna se llenó con agua. La columna se montó verticalmente como se indica en la Figura 1. Cada una de las conexiones se ubicó a lo largo de. la parte lateral de la columna, a intervalos de 5.08 cm (2 pulgadas) de altura. En ambos extremos de esta columna se montaron una hoja de malla 80 común y lana de vidrio común, y después se usaron (como se describe a continuación) para contener arena marina en la columna. En la parte superior e inferior de la columna había secciones vacías (porciones C y D de la Figura 1) . Cada una de estas secciones vacías tenía 7.62 cm (3 pulgadas) de largo y 7.62 cm (3 pulgadas) de diámetro. Se
perforaron agujeros en cada una de estas secciones vacías y se realizaron roscas hembras NPT de 0.32 cm (1/8 de pulgada) . Se montó un adaptador de conexión de tubo macho de 0.32 cm (1/8 de pulgada) a hembra 1/8 (Swagelok Company) en el agujero roscado. El puerto de la sección vacía de la parte inferior se conectó a una bomba de jeringa a través de una tubería de acero inoxidable de 0.32 cm (1/8 de pulgada) de diámetro (porción A de la Figura 1) . El puerto de la sección vacía superior desbordó (porción F de la Figura 1) y se conectó a un recipiente de recolección que se cubrió con gas nitrógeno. El espacio de cabeza de esta sección superior se ventiló a un burbujeador purgado con nitrógeno (porciones G y H de la Figura 1) . La sección vacía superior de la columna se quitó temporalmente y se vertió arena marina (SX0076-1, lote núm. 46257714, EMD Chemicals Inc, Gibbstown, NJ) en la columna, de manera que llene aproximadamente 50 % de la columna. La arena se mantuvo en su lugar mediante la lana de vidrio y la hoja de malla 80 descritos anteriormente .
En los Ejemplos 2-5 se usó petróleo crudo de la Pendiente
Norte de Alaska. Este mismo lote de petróleo crudo se destiló mediante el método ASTM 2892 ("Manual on Hydrocarbon Analysis 6th edición", A. W. Drews, editor, Impreso por ASTM, 100 Barr Harbor Drive, West Conshohocken, PA, 19428-2959, 1998) . Se usó una porción de los residuos indestilables recolectados a una
temperatura de >321 °C (610 °F) en una destilación subsiguiente, después del método ASTM 5236 ("Manual on Hydrocarbon Analysis: 6th edition", arriba) . Se disolvieron aproximadamente 400 g de estos residuos indestilables de crudo recolectados a >540.6 °C (>1005 °F) de esta destilación en 100 de tolueno para hacer una solución autodispersable . Esta solución se vertió sobre la arena que estaba cargada en la mitad inferior de la columna. Luego, se adicionó arena marina nueva adicional para llenar la columna y, luego, el residuo indestilable de crudo de >321.1 °C (>610 °F) recolectado de la destilación ASTM 2892 se vertió sobre esta porción de arena nueva. Se reemplazó la sección vacía superior. La tubería de 1/8 adherida a la sección inferior (porción A de la Figura 1) se desconectó de la bomba de jeringa y se conectó a una fuente de nitrógeno de baja presión (34.5 kPa (5 psig) ) . Se insertó nitrógeno a través de esta tubería de 0.32 cm (1/8 de pulgada) adherida a la parte inferior de la columna durante 4 días para evaporar el tolueno. Al final de este período de cuatro días, la tubería de 0.32 cm (1/8 de pulgada) (porción A de la Figura 1) se desconectó de la fuente de nitrógeno y se volvió a colocar la bomba de jeringa. Mediante el uso de la bomba de jeringa y la tubería de 0.32 cm (1/8 de pulgada) adheridas a la parte inferior de la columna se alimentó la columna y se saturó con un medio completo que contenía nitrato con composición esencialmente como en la Tabla 2, excepto que las
sales de base fueron 60 mg/1 CaCl2«2H20; 400 mg/1 MgS04*7H20; 400 mg/1 KCl ; 40 mg/1 NaH2P04; 500 mg/1 NH4Cl ; 2 g/1 NaHC03 ; 400 mg/1 NaN03; y 3 g/1 NaCl . Luego, se inoculó la columna con agua recolectada de los pozos de producción de petróleo y de inyección de agua de los yacimientos petrolíferos de la Pendiente Norte de Alaska. Después de la inoculación, la columna se dejó descansar durante una semana. Después de este período, el medio completo con nitrato se alimentó continuamente a una velocidad de 1 ml/h. Se tomaron muestras periódicamente mediante el uso de perforaciones de jeringas a través de los puertos de muéstreos sellados con tabique (porción E de la Figura 1) descritos anteriormente, a lo largo de la parte lateral de la columna. De esta manera se recolectaron los microbios para usarse en los cultivos enriquecidos subsiguientes. Las mezclas de microorganismos enriquecidas en estos reactores se usaron para aislar cepas que crecen tanto sobre petróleo como en presencia de petróleo. Se derivó el cultivo LH4:18 mediante la extracción de muestras de los puertos inferiores de esta columna 6 meses después de la inoculación, al diluir xl,000 y estriar sobre placas de agar de caldo de cultivo Luria estándar (Teknova, Hollister, CA) . Se seleccionaron las colonias aisladas para una exploración subsiguiente por pruebas de liberación de petróleo y tipificación de ADNr 16S.
Análisis de secuencias del ADNr de colonias directas
Se aisló ADN genómico de colonias bacterianas mediante
2
la dilución de colonias bacterianas en 50 µ? de agua. Los ADN de colonias diluidas se amplificaron con ADN polimerasa Phi
29 antes de la secuenciación (GenomiPHI Amplification Kit GE Life Sciences, New Brunswick, NJ) . Se adicionó una alícuota (1.0 µ?) de la colonia diluida a 9.0 µ? del reactivo de lisis (del estuche de amplificación GenomiPHI) y se calentó a 95 °C durante 3.0 rain seguido por enfriamiento inmediato a 4 °C. Se adicionó 9.0 µ? de tampón de enzima y 1.0 µ? de enzima Phi 29 a cada muestra lisada seguido de incubación a 30 °C durante 18 h. La polimerasa se desactivó mediante calentamiento a 65 °C durante 10 min seguido por enfriamiento a 4 °C.
Las reacciones de secuenciación de ADN se configuraron de la siguiente manera: se adicionaron 8.0 µ? de muestra amplificada por GenomiPHI a 8.0 µ? de reactivo de secuenciación BigDye v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) seguido por 3.0 µ? de iniciadores 10 µ? sec. con núm. de ident . 1 y 2 (preparados por Sigma Genosys, Woodlands, TX) , 4.0 µ? de tampón de dilución 5X BigDye (Applied Biosystems) y 17 µ? de agua grado biología molecular (Mediatech, Inc., Herndon, VA) .
Las reacciones de secuenciación se calentaron durante 3.0 min a 96 °C seguido por 200 termociclos de (95 °C durante
30 s 55 °C durante 20 s; 60 °C durante 2 min) y se almacenaron a 4 °C. Se quitaron los desoxinucleósidos trifosfatos no incorporados mediante el uso de placas de limpieza de Edge Biosystems (Gaithersburg, D) . Las reacciones amplificadas se
colocaron con pipeta en un pozo de una placa de limpieza pre separada de pozo 96. La placa se centrifugó durante 5.0 min a 5,000x g en una Sorvall RT-7 (Sorvall, Newtown, CT) a 25 °C. Las reacciones limpias se colocaron directamente en un secuenciador de ADN 3730 de Applied Biosystems y se secuenciaron con lectura automática de nucleótidos.
Cada una de las secuencias de ADNr reunidas se comparó con la base de datos de ADNr de NCBI (-260,000 secuencias de ADNr) mediante el uso del algoritmo de BLAST (Altschul et al. (más arrijba) ) . La primera coincidencia se usó como un identificador de la identificación de la especie conocida más relacionada. La primera exploración mediante el uso de secuenciación directa de ADNr de colonias redujo 20 veces el número de colonias a las que se le deberá realizar otra exploración. Luego, el único grupo aislado se usó para explorar el crecimiento sobre petróleo como una única fuente de carbono; bajo condiciones desnitrificantes.
Prueba de liberación de petróleo en microcolumna de arena
Se examinaron cepas bacterianas aisladas mediante el uso de un ensayo de microcolumna de arena para visualizar la liberación de petróleo. Una microcolumna de arena consistía de una pipeta de vidrio Pasteur invertida que contenía arena de mar (EMD chemicals, La Jolla, CA) que se había recubierto con petróleo crudo y se había dejado envejecer durante al menos una semana. Específicamente, se combinó 280 mi de
arena estéril y 84 mi de petróleo esterilizado (el mismo petróleo que se usó en los Ejemplos 2 a 5) en un ambiente anaerobio. La mezcla se agitó durante 5 minutos dos veces por día y se dejó añejar durante 6 días bajo nitrógeno. Los cuerpos de las pipetas de vidrio Pasteur se cortaron a media altura y se esterilizaron en autoclave. El extremo cortado de la pipeta se sumergió en la mezcla de arena/petróleo y el núcleo se llenó a aproximadamente 2.54 cm (1.0 pulgada) . Luego, el extremo cortado de la pipeta que contiene mezcla de petróleo/arena se colocó en un tubo de pruebas de vidrio que contenía cultivos microbianos. El aparato se selló dentro de frascos de vidrio en un ambiente anaerobio y se observó la liberación de petróleo de la arena en el extremo cónico de cada pipeta (Figuras 2A-2C) . El petróleo liberado de la arena se juntó en el cuello delgado de las pipetas Pasteur o como gotículas en la superficie de la capa de arena. Se presumió que los cultivos que aumentaron la liberación de petróleo sobre el fondo (medio estéril) alteraron- la interacción del petróleo con la superficie de arena y podían actuar potencialmente para aumentar la recuperación de petróleo en un reservorio de petróleo.
Experimentos con mini bolsitas de arena para observar
liberación de petróleo
Se realizaron experimentos mini bolsitas de arena en paralelo en un aparato con múltiples cavidades similar al
descrito por J.D. Levi, et al. (Intl. BioRes . J., 1, 336, 1985) . Se construyó un aparato con múltiples cavidades (Figura 3) de la siguiente manera: un bloque de aluminio (2) (Figura 3) se perforó con orificios (5) de 12.7 cm (5 pulgadas) de largo, 2.22 cm (7/8 de pulgada) de diámetro (Figura 3) . En la Figura 3 se muestran cuatro de estos orificios, aunque en pruebas subsiguientes se usó un bloque con más orificios. En una placa de aluminio (1) de 2.54 cm (1 pulgada) de espesor (Figura 3) se realizaron a máquina cavidades de 0.64 cm (1/4 de pulgada) de profundidad por 2.54 cm (1 pulgada) de diámetro. Estas cavidades eran concéntricas con los orificios realizados en el bloque de 12.7 cm (5 pulgadas) de espesor. Se realizaron orificios pequeños (8) de 0.32 cm (1/8 de pulgada) de diámetro (Figura 3) bajo las cavidades de 0.64 cm por 2.54 cm (1/4 de pulgada por 1 pulgada) de diámetro y hacia el lado del bloque (1) de 2.54 cm (1 pulgada) de espesor (Figura 3) . Se fabricaron roscas para tubos de 0.32 cm (1/8 de pulgada) en la cara externa del bloque y se montaron conexiones swagelock (Swagelok Company) sobre la parte lateral del bloque para permitir conexiones de tuberías de 0.32 cm (1/8 de pulgada) a estas cavidades. Estos conectores se conectaron a través de tuberías de 0.32 cm (1/8 de pulgada) a una serie de bombas de jeringas: una jeringa conectada a cada orificio. Se realizó lo mismo con un bloque de aluminio (2) de 2.4 cm (1 pulgada)
(Figura 3) . Se cortaron dos placas de hule neopreno (4) de 0.32 cm (1/8 de pulgada) de espesor (Figura 3) del mismo tamaño que los bloques de 2.54 cm (1 pulgada) de espesor y se cortaron orificios de 2.22 cm (7/8 de pulgada) de diámetro con el mismo patrón de orificios que los bloques. En cada placa (1), (32) de 2.54 cm (1 pulgada) de espesor (Figura 3) se montó un filtro de vidrio fritado (6) de 2.54 cm (1 pulgada) de diámetro (Figura 3) (Chemglass Scientific Apparatus, Vineland, N.J) . Este filtro de vidrio poroso se selló a cada placa mediante el uso de una serie de arosellos (7) (Figura 3) (Parker Hannifin Corporation, O-Ring
División, Lexington, KY) . La placa (1) de 2.54 cm (una pulgada) de espesor con las líneas de alimentación de bomba de jeringa (Figura 3) se cubrió con la junta de neopreno (4) (Figura 3), y el bloque (2) de 12.7 cm (5 pulgadas) de espesor (Figura 3) se atornilló a la junta (4) (Figura 3) de manera tal que las cavidades de la placa inferior estuvieran en comunicación con las cavidades del bloque de 12.7 cm (5 pulgadas) de espesor. Todas las placas y el equipamiento se esterilizó por autoclave antes de completar el ensamblaje.
Luego, se compactaron seis cavidades con una mezcla de petróleo/arena añeja de la siguiente manera: se combinaron 403.2 mi de arena marina esterilizada (SX0076-1, lote núm. 46257714, EMD Chemicals Inc., Gibbstown, NJ) con 151.2 mi del mismo petróleo crudo estéril de la Pendiente Norte de Alaska.
Este es el mismo petróleo usado en los Ejemplos 2 a 6. El petróleo y la arena se combinaron bajo una atmósfera de nitrógeno y se mezclaron cuidadosamente. Esta mezcla de arena empapada con petróleo se envejeció durante seis días y se realizó mezclado adicional una o dos veces por día. Luego, esta mezcla se compactó en las seis cavidades (5) (Figura 3) del bloque (2) de 12.7 cm (5 pulgadas) (Figura 3) . La segunda junta de neopreno (4) (Figura 3) se colocó en la parte superior del bloque de 12.7 cm (5 pulgadas) de espesor y la segunda placa (3) de 2.54 cm (1 pulgada) de espesor (Figura 3) con el filtro de vidrio poroso (6) (Figura 3) y los arosellos (7) (Figura 3) como se describió para la otra placa, se atornillaron al bloque de 12.7 cm (5 pulgadas) de manera tal que las cavidades de la placa de 2.54 cm (i pulgada) estaban en comunicación con las cavidades que tenían la arena empapada de petróleo compactada en ellas. De la parte superior de esta segunda placa de 2.54 cm (una pulgada) se perforaron pequeños orificios a través de la parte superior y se conectaron a la tubería (92) de 0.32 cm (1/8 de pulgada) de diámetro (Figura 3) . Esta tubería se llevó directamente a un separador de petróleo-agua simple. Este separador es muy similar al descrito por J.D. Levi , et al., arriba. Consistía en un tubo de 0.32 cm (1/8 de pulgada) de diámetro forzado a través de un reductor de tubo perforado de 0.32 cm por 1.27 cm (1/8 de pulgada por 1/2 pulgada)
(Swagelok Company) . Este tubo de 0.32 cm (1/8 de pulgada) de diámetro se colocó de forma concéntrica en un tubo de teflón de 1.27 cm (½ pulgada) que formaba un pie de apoyo para el separador de petróleo/agua. En la parte inferior del tubo de teflón, pero por debajo del extremo superior del tubo de 0.32 cm (1/8 de pulgada), había una "T". El fluido producido a partir de las bolsitas de arena se dejó fluir hacia arriba a través del tubo de 0.32 cm (1/8 de pulgada) de profundidad pasando más allá de la "T". El petróleo flotaría hacia la parte superior del pie de apoyo que está por encima de la T. El agua del pie de apoyo que se desplazó salió del puerto lateral de la T debajo del petróleo y subió por un tubo flexible de 0.32 cm (1/8 de pulgada) . Este tubo se configuró de manera que llegara a una altura justo debajo de la parte superior del pie de apoyo del petróleo. Luego, este tubo se dirigió a una jarra de recolección de agua separada. Por tanto, la altura total de líquido en el pie de apoyo de petróleo de 1.27 cm (½ pulgada) era fija y el petróleo que se liberaba de— las bolsitas de arena podía medirse como la altura del petróleo en el pie de apoyo de teflón de 1.27 cm (½ pulgada)- de diámetro (tubo vertical que actuaba como recolector de petróleo) .
Análisis de liberación de petróleo con bolsitas de arena
Se usaron microbios seleccionados en una prueba con bolsitas de arena confinada hidráulicamente. Se realizaron
dos pruebas con bolsitas de arena para ilustrar la utilidad y sensibilidad de la presente invención. El Ejemplo 5 ilustra cómo se calibró la bolsita de arena sobre petróleo crudo y una solución de agua que se creó para imitar la composición de la salmuera de inyección usada en inundación con agua del reservorio de petróleo destino. El Ejemplo 6 ilustra la utilización de bolsitas de arena mediante el uso de los mismos fluidos, pero con la adición de microbios después de un período inicial de inundación. La Figura 4 es el diagrama del aparato con bolsitas de arena.
Los equipos de inundación de núcleo o de bolsitas de arena son muy conocidos en la literatura de exploración de petróleo (Petroleum Reservoir Rock and Fluid Properties, Abhijit Y. Dandehar, CRC Press, 2006) . Además, un aparato similar de inundación de núcleo/bolsitas de arena y las técnicas usadas para operarlo se encuentran descritas por Berry et al. (Artículo SPE número 200056, "In-Situ Saturation Measurements Improve Analysis and Interpretat ion of Laboratory Miscible and Immiscible Displacement Processes", SPE Reservoir Engineering, noviembre de 1991, pág. 429). El uso de aparatos y técnicas similares para probar tratamientos microbianos en una bolsita de arena se encuentra descrito por Saikrishna M. et al.
(Artículo SPE número 89473, 2004, "Development of Bio-surfactant Based Microbial Enhanced Oil Recovery Procedure") .
ibotipif icación automática
Se usó ribotipificación automática para la identificación concluyente de cepas seleccionadas con características filogenéticas de secuencia de ADNr 16S similares (Bruce, J. L., 1996. Food Technology, 50, 77-81, 1996 y Sethi, M. R. , Am. Lab. 5, 31-35, 1997). La ribotipificación se realizó tal como lo recomendó el fabricante (DuPont Qualicon Inc., Wilmington, DE). Para estos análisis se tomó una colonia nueva, se resuspendió en el tampón de muestra y se adicionó al módulo de procesamiento para la etapa de tratamiento de calor a 80 °C durante 10 min, a fin de inhibir enzimas endógenas degradantes de ADN. Luego, se redujo la temperatura y se adicionaron a la muestra dos enzimas líticas (lisostafina y N-acetilmuramidasa) (proporcionadas por el fabricante) . Luego, el portador de muestras se cargó sobre el sistema de riboimpresión con los otros reactivos comerciales. Las etapas de digestión de enzima de restricción mediante el uso de enzima EcoRI , electroforesis de gel y transferencia fueron totalmente automáticas. Brevemente, el ADN bacteriano se digirió con enzima de restricción EcoRI y se cargó sobre un gel de agarosa: los fragmentos de restricción se separaron por
electroforesis y se transfirieron simultáneamente a una membrana de nailon. Después de una etapa de desnaturalización, los ácidos nucleicos se hibridizaron con una sonda de ADN sulfonada que albergaba los genes para las subunidades pequeñas y grandes de ARNr de E. coli. La sonda hibridizada se detectó mediante la captura de emisión de luz de un sustrato quimioluminiscente con una cámara de doble carga. La salida consistió en una exploración densitométrica que describía la distribución de los fragmentos de restricción de EcoRI que contenían las secuencias de ADNr 16S o 23S y sus pesos moleculares.
Bioremediación y mantenimiento de oleoductos
La habilidad de la Shewanella putrefaciens LH4:18 para metabolizar hidrocarburos hace que esta cepa resulte útil en la bioremediación de áreas contaminadas con hidrocarburos. Por tanto, también se proporcionan en la presente métodos para descontaminar o remediar áreas contaminadas mediante la aplicación en el/las área/s el aislado bacteriano Shewanella putrefaciens . LH4:18, que después se deja que metabolice o movilice los contaminantes in sifcu. La bioremediación sucede cuando las células de Shewanella putrefaciens LH4:18 se exponen a hidrocarburos para convertirlos en productos tales como, por ejemplo, dióxido de carbono, agua y oxígeno, o cuando el crecimiento de las células de LH4:18 permite la liberación de hidrocarburos de peso molecular alto a la
superficie para la eliminación subsiguiente por procesos de limpieza física. En algunas modalidades, la Shewanella putrefaciens LH4 : 18 puede incubarse en el ambiente a biorremediarse sin ningún cosustrato adicionado u otra fuente de carbono o energía. El proceso de bioremediación puede monitorearse sacando muestras periódicamente del ambiente contaminado, . extrayendo los hidrocarburos y analizando el extracto mediante el uso de métodos conocidos por aquellos con experiencia en la técnica.
Los sustratos contaminados que podrían tratarse con Shewanella putrefaciens LH4:18 incluso, pero sin limitarse a, desechos del dragado del puerto, sedimentos, aguas residuales, agua de mar, suciedad, arena, barro, aire, y desechos de refinería. En otra modalidad, el sustrato contaminado puede ser un oleoducto. La incrustación de hidrocarburos y formación de barro son causas significativas de la reducción en el desempeño del oleoducto y, en última instancia, pueden llevar a que el oleoducto falle. Dada la habilidad de la Shewanella putrefaciens LH4 : 18 de liberar hidrocarburos, la aplicación de LH4:18 a un oleoducto que contiene hidrocarburos incrustados o barro con hidrocarburos puede ser útil en la eliminación de los hidrocarburos indeseados del oleoducto.
En algunas modalidades, puede adicionarse otros agentes eficaces en la bioremediación de hidrocarburos a una composición de bioremediación de Shewanella putrefaciens LH4 : 18. Estos otros agentes podrían incluir un microorganismo o más de un microorganismo, tal como una bacteria, una levadura o un hongo. Los
agentes también podrían incluir un compuesto químico que no es letal para la Shewanella putrefaciens LH4:18, pero que es eficaz para la degradación total o parcial de hidrocarburos y/u otros contaminantes o para la estimulación del crecimiento de la Shewanella L±H4:18 para lograr la liberación de petróleo. En algunas modalidades, el agente adicional es la cepa LH4:15 de Pseudomonas stutzeri que se describe en la solicitud copendiente de propiedad mancomunada con expediente del apoderado núm. CL4096, Estados Unidos NA (Número de serie de Estados Unidos / ) .
Los microorganismos podrían llevarse al sustrato contaminado mediante cualquiera de los métodos muy conocidos que incluyen los descritos en, por ejemplo, Newcombe, D. A., y D. E. Crowley (Appl. Microbiol. Biotechnol. 51:877-82, 1999); Barbeau, C. et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 48:745-52, 1997); patentes de los Estados Unidos núm. 6,573,087, 6, 087, 155 y 5, 877, 014.
EJEMPLOS
La presente invención se define más detalladamente a través de los siguientes ejemplos. Debe entenderse que si bien estos ejemplos señalan las modalidades preferidas de la invención, se aportan—a manera de ejemplo únicamente. A partir de la descripción anterior y de estos ejemplos, una persona con experiencia en la técnica podrá determinar las características esenciales de esta invención y, sin apartarse del espíritu ni del alcance de ella, podrá introducir varios cambios y
modificaciones en la invención para adaptarla a los diversos usos y condiciones.
Ejemplo 1
Crecimiento Anaerobio de aislados bacterianos sobre petróleo como única fuente de carbono
A fin de estudiar el crecimiento de colonias aisladas de cultivos en columna a largo plazo sobre petróleo crudo como única fuente de carbono, bajo condiciones anaerobias, se inocularon aislados purificados en 20 mi de frascos de suero que contenían 10 mi de medio de sales mínimas (Tabla 2) , 1.6 g/1 de nitrato de sodio y 5.0 mi de petróleo crudo esterilizado en autoclave. El medio se desoxigenó mediante el burbujeo de oxígeno de los frascos llenados con una mezcla de nitrógeno y dióxido de carbono, seguido por estirilizado por autoclave. Todas las manipulaciones de bacterias se realizaron en una cámara anaerobia (Coy Laboratories Products, Inc., Grass Lake, MI) . Los cultivos se incubaron a temperatura ambiente con agitación moderada (100 rpm) durante varias semanas y se monitorearon en busca de nitrato, nitrito, turbidez visible y modificaciones visibles en el petróleo. Cuando se redujo el nitrato en cualquiera de los cultivos, se adicionó 50 g/1 de nitrato de sodio para elevar su concentración en el medio hasta 0.4 g/1 de nitrato de sodio.
Tabla 2
Medio de sales mínimas
Componente de Concentración Fuente crecimiento final química
Nitrógeno 18.7 µ? NH4C1
Fósforo 3.7 µ? ??2??4
Magnesio 984 µ? MgCl2«6H20
Calcio 680 µ? CaCL2*2H20
Cloruro de sodio 172 mM NaCl
Metales traza
670 µ? Ácido nitriloacético
15.1 µ? FeCl2«4H20
1.2 µ? CuCl2*2H20
5.1 µ? MnCL2«4H20
12.6 µ? CoCl2«6H20
7.3 µ? ZnCl2
1.6 µ? H3BO3
0.4 µ? Na2Mo04*2H20
7.6 µ? NiCl2«6H20
Tampón de pH (7.5 final) 10 mM Hepes
Selenio-tungstato 22.8 ?? Na2Se03*5H20
24.3 ?? Na2W04«2H20
Bicarbonato 23.8 ?? NaHC03
Componente de Concentración Fuente
crecimiento final química
Vitaminas 100 ug/l Vitamina B12
80 ug/l Ácido p-aminobenzoico
20 ]ig/l Ácido nicotínico
100 ug/l Pantotenato cálcico
300 ug/l Hidrocloruro de
piridoxina
200 ug/l Tiamina-HC1»2H20
50 ug/l Ácido alfa-lipoico
Aceptor de electrones 0.4 g/1 NaN03
El pH del medio se ajustó a 7.5.
La Tabla 3 muestra los resultados de estos estudios de crecimiento. Los cultivos puros que mostraron crecimiento mediante la reducción de nitrato y aumento de la turbidez bajo condiciones desnitrificantes se eligieron como "capaces de crecer sobre petróleo bajo condiciones desnitrificantes" y se sometieron a varias pruebas para analizar el fenómeno de liberación de petróleo, como se describe a continuación. Una cepa, designada LH4:18, se identificó por tipificación de ADNr 16S como homologa a Shewanella putrefaciens (cepa CN32) . Se inoculó una única colonia de este aislado sobre el medio descrito anteriormente que contenía 200 ppm de nitrato. La cepa LH4:18 creció sobre petróleo como única
7
fuente de carbono y redujo 40 ppm de nitrato en 60 días.
Tabla 3
Reducción de nitrato como medida de crecimiento anaerobio con petróleo como única fuente de carbono
Ejemplo 2
Exploración de aislados bacterianos en busca de liberación de petróleo mejorada
En este ejemplo el inoculo se cultivó hasta la turbidez mediante el uso del medio de sales mínimas mostrado en la Tabla 2 con 0.4 % de succinato como fuente de carbono. La concentración de cada especie, enumerada en la Tabla 4 que figura a continuación, se normalizó a una OD6oo de 1.0 o se diluyó 1:10 para una OD60o final de 0.1. Todas las
operaciones para la preparación de las microcolumnas de arena, la inoculación y el cultivo se realizaron mediante el uso de técnicas estériles en una bolsa guante anaerobia. Se adicionaron inóculos (4 mi) de la OD6oo de 1.0 o de la OD6oo de 0.1 a tubos de vidrio pequeños y las columnas de microarena se sumergieron en las mezclas de células/medio con el cuello angosto de las pipetas Pasteur apuntando hacia arriba. Los frascos externos se sellaron en la cámara anaerobia y se dejaron incubar a temperatura ambiente durante 24 h. La Tabla 4 muestra las cepas probadas y las observaciones de liberación de petróleo después de 24 h.
Tabla 4
Liberación de petróleo a partir de columnas de microarena mediante cepas bacterianas aisladas
Inoculo Inoculo
Aislado bacteriano OD600=1 OD600=0.1
Especie desconocida LH : 3 no determinado no determinado
Especie desconocida LH4:4 sin liberación sin liberación
Especie desconocida LH4 : 7 sin liberación sin liberación
Pseudomonas stutzeri liberación de LH4:15 sin liberación petróleo
Shewanella putrefaciens liberación de
LH4:18 petróleo sin liberación
Inoculo Inoculo
Aislado bacteriano ODSOO=1 OD600=0.1
liberación de liberación de
T auera sp . LH4 : 37 petróleo petróleo
Especie desconocida LH4:38 sin liberación sin liberación
Pseudomonas stutzeri MO liberación de LCED3 sin liberación petróleo
Los cultivos se tipificaron ADNr 16S para confirmar la conservación del aislado puro en varios puntos de estos estudios. Los aislados puros que presentaron atributos interesantes en estas pruebas se exploraron aún más en busca de mejoras en la liberación de petróleo en una versión a mayor escala de un modelo de pozo de petróleo, como se describe en los Ejemplos 3, 4, 5 y 6. La LH : 18 resultó positiva en la prueba de liberación de petróleo y se estudió aun más mediante la prueba de columna de bolsita de arena.
Ejemplo 3
Mini bolsitas de arena
Se realizaron tres pruebas de liberación de petróleo de flujo continuo tal como se describieron anteriormente para ilustrar la capacidad de liberación de petróleo de la cepa LH4:18. S Se evaluó una mini bolsita de arena como testigo
no inoculado. Las primeras y segundas mini bolsitas de arena fueron pruebas idénticas inoculadas con la cepa LH4-.18.
Después de la instalación, se inundaron las tres mini bolsitas de arena con una salmuera sintética sin nitrato (Tabla 5) a una velocidad de 0.5 ml/min para 6.6 volúmenes de poros. En ese punto se detuvo la inundación. Se midió la altura del petróleo en los pies de apoyo y se calculó la cantidad de liberación de petróleo comparada con la cantidad original adicionada. En este punto la liberación de petróleo de las mini bolsitas de arena núm. 1, 2 y 3 se determinó a 25 %, 20 % y 25 % respectivamente.
Luego, las bolsitas de arena se inocularon con células o medio estéril como "testigo". La bolsita de arena núm. 1 se inoculó con el medio (Tabla 5) que no contenía nitrato. Las bolsitas de arena núm. 2 y 3 se inocularon con la cepa LH4 : 18 a aproximadamente 10B c£u/ml para 0.3 volúmenes de poros, seguido por 0.3 volúmenes de poros de medio aumentado con nitrato (Tabla 5) . Se detuvieron todos los flujos y los pozos con o sin inoculo se dejaron incubar durante 13 días. Después de 13 días, el medio aumentado con nitrato se bombeó a las mini bolsitas de arena a una velocidad de 0.5 ml/h durante 10 volúmenes de poro adicionales cuando se midió la altura del petróleo en los pies de apoyo y se calculó la cantidad de petróleo liberado en comparación con la cantidad original adicionada. En las mini bolsitas de arena núm. 1 (el testigo inoculado) , se había
liberado 30 % del petróleo original mientras que en las mini bolsitas de arena núm. 2 y 3 se había liberado 37 % y 44 % del petróleo original, respectivamente (Figura 5) . Estas observaciones demostraron la habilidad de la LH4:18 de facilitar la liberación de cantidades significativas de petróleo en un sistema de flujo continuo.
Tabla 5
Composición del medio
Para la preinoculación y la inundación testigo, se usó la siguiente formulación sin NaN03.
Sustancia química Cantidad/litro
Metales traza nuevos (SL-10) de la Tabla I 1 mi
Solución de vitaminas de la Tabla I 1 mi
Solución de selenita-tungstato de la Tabla I 1 mi
CaCl2*2H20 60 mg
MgCl2«6H20 270 mg
MgS04*7H20 80 mg
KC1 400 mg
NaH2P04 40 mg
NH4C1 500 mg
NaHC03 2 g
NaN03 1.6 g
NaCl 10 g
Ejemplo 4
Mini bolsitas de arena con inóculos mezclados
Se realizaron seis pruebas de liberación de petróleo de flujo continuo, como se describió anteriormente, para ilustrar la habilidad de liberación de petróleo de la cepa LH4: 18 en combinación con una segunda cepa aislada LH4:15. La cepa LH4 : 15 se describe en la solicitud copendiente de propiedad mancomunada con expediente del apoderado núm. CL4096, Estados Unidos NA (núm. de serie de Estados Unidos / ) y se identificó como Pseudo onas stutzeri sobre la base del análisis de su secuencia de ADNr 16S. Esta cepa representa una especie predominante que se encuentra en aguas de inyección de reservorios típicas de la Pendiente Norte. Se usaron tres mini bolsitas de arena como testigos no inoculados, mientras que otras tres columnas actuaron como pruebas inoculadas idénticamente mediante el uso de una mezcla de LH4:18 y LH4 : 15 como el inoculo
Las seis mini bolsitas de arena se inundaron con una salmuera sintética 1 (Tabla 6) , a una velocidad de 3.0 ml/min para 6.6 volúmenes de poro, y después se detuvo la inundación. Se midió la altura del petróleo en los pies de apoyo y se calculó la cantidad de liberación de petróleo comparada con la cantidad original adicionada.
Luego, las bolsitas de arena se inocularon con células de LH4:15 más LH4:18 (como se describe más abajo) o con agua de
inyección potable del mismo yacimiento de la Pendiente Norte de Alaska del que se obtuvo el petróleo como testigo. Se inocularon tres mini bolsitas de arena con una mezcla de LH4:18 y LH4:15. Cada cepa pura concentrada se diluyó con agua de inyección esterilizada en filtro de la Pendiente Norte de Alaska a una densidad óptica medida a 600 nm (OD60o) de 0.5. Se combinaron volúmenes iguales de estas dos cepas puras diluidas y el medio se aumentó con 1.6 g/1 de nitrato de sodio. La mezcla se bombeó en tres de las columnas de mini bolsitas de arena para 0.92 volúmenes de poro. Las tres mini bolsitas de arena testigo se inocularon con 0.92 volúmenes de poro de agua de inyección potable de la Pendiente Norte de Alaska que se había aumentado con 1.6 g/1 de nitrato de sodio. Se detuvieron todos los flujos y se dejaron descansar las seis cavidades durante 19 días. Después de los 19 días, se bombeó salmuera 2 (Tabla 6) en las mini bolsitas de arena a una velocidad de 3.0 ml/h para 6.6 volúmenes de poro adicionales. Periódicamente, se midió la altura del petróleo en los pies de apoyo y se calculó la cantidad de liberación de petróleo comparada con la cantidad original adicionada. Se calculó el promedio y el máximo de petróleo liberado después de la inoculación y los resultados se muestran en la Figura 6. Estos resultados demostraron la habilidad de la LH4:18 de facilitar la liberación significativa de petróleo adicional en un experimento de flujo continuo, cuando se combina con la cepa
aislada LH4:15.
Tabla 6
Componentes de salmuera para experimentos con mini bolsitas de arena en el ejemplo 4
Ejemplo 5
Prueba de liberación de petróleo en una columna de bolsita de arena
A fin de probar la cantidad de petróleo residual que queda en una bolsita de arena después de que la bolsita de arena empapada de petróleo se inundó con una solución de agua que simulaba la salmuera inyectada usada en la inundación de un reservorio de petróleo subterráneo, se fabricó la bolsita de arena de conformidad con los métodos estándar descritos por
Abhijit, Y. et al., más arriba. Un aparato similar de inundación de núcleo/bolsitas de arena y las técnicas usadas para operarlo también fueron descritos por Berry et al . , más arriba. El uso de aparatos y técnicas similares para realizar pruebas de tratamientos microbianos en una bolsita de arena fue descrito por Saikrishna M. , et al. Arriba.
La arena lavada se comprimió en un manguito elastomérico Viton® (E.I. du Pont de Nemours & Co . , Wilmington, DE) bajo presión hidráulica de 3.45 MPa (500 psig) . La longitud de la bolsita de arena era de 15.5 cm con un diámetro de 3.8 cm. La bolsita de arena tenía un volumen de poro (volumen de la bolsita de arena que era un espacio libre) de 70 mi. A continuación se describe la calibración del sistema de atenuación de rayos gamma. Los rayos gamma se generaron mediante el uso de una fuente radiactiva de americio 241 (59.5 KeV) . Los rayos gamma se detectaron mediante el uso de un dispositivo detector de rayos gamma común, por ejemplo, un detector de rayos gama de CdTe (telururo de cadmio) en estado sólido XR-100T (Amptek Inc., 14 De Angelo Drive, Bedford, MA) . Se forzó vacío sobre la bolsita de arena y el detector de rayos gamma se colocó en cero para dar la atenuación de rayos gamma mínima absoluta sin petróleo o agua en la bolsita de arena. Luego, el petróleo destino (sin agua presente) se inundó sobre la bolsita de arena a una velocidad de flujo constante de 80 ml/h. Luego de que se bombeó más de un volumen
de poro o 70 mi de petróleo sobre la bolsita de arena, la señal de atenuación de rayos gamma se hizo constante. Esta señal de atenuación de rayos gamma mostró más atenuación debido a la presencia de petróleo. Se usó como punto de calibración para la saturación de petróleo completa (So=l) . El petróleo se quitó mediante una serie de purgas de solvente que incluyeron solventes orgánicos y un lavado final con alcohol. Se forzó vacío sobre la bolsita de arena y se obtuvo nuevamente el punto cero del detector de rayos gamma. Se usó un flujo constante de 80 ml/h de solución de salmuera simulada dopada con 1.0 % de yoduro sódico (Tabla 7) para saturar la columna bajo vacío, a fin de completar la saturación de agua (Sw=l) . Una vez que estuvo completamente saturada de agua, tal como lo indicó una señal constante de atenuación de rayos gamma, el detector de rayos gamma se calibró a esta condición de saturación completa de agua. El yoduro presente en el agua causa una atenuación sustancial de la señal de rayos gamma por encima de la del petróleo. Para dos inundaciones de fluidos inmiscibles (petróleo y salmuera de simulación, Tabla 7) , se usó la señal de atenuación de rayos gamma para medir la cantidad de saturación de agua (Sw) y de saturación de petróleo (So=l-Sw) , dado que la atenuación medida es una combinación lineal de la atenuación a saturación de agua completa (Sw=l) y la saturación de petróleo completa (So=l) . La relación se mantiene sólo si no se genera gas en la bolsita de arena. Por consiguiente, en este
experimento se tuvo mucho cuidado de asegurar que cualquier gas generado por acción microbiana o alimentado en la bolsita de arena se mantuviera disuelto mediante la aplicación de contrapresión sobre el efluente de la bolsita de arena. Esta contrapresión alcanzó 1.38 MPa (200 psig) , pero fue sustancialmente menor que la presión hidráulica limitante en el manguito Viton®. Durante estas operaciones de inundación con petróleo y después agua se midió la presión diferencial de la bolsita de arena y se usó para determinar la permeabilidad de la bolsita de arena al petróleo y al agua.
Después de que se calibró la señal de atenuación de rayos gamma y la bolsita de arena estuvo con saturación de agua completa (Sw=l) , se inundó el petróleo crudo (el mismo petróleo que se usó en los otros ejemplos) sobre la columna, a una velocidad de 400 ml/h para 10 volúmenes de poro, en cuyo punto sólo se producía petróleo en el efluente de la bolsita de arena. La señal de atenuación de rayos gamma dio una medida de saturación de agua inicial (Swi) que era de aproximadamente 0.11 %, o 11 % del volumen hueco. Durante la inundación, se midió la presión diferencial y se usó para determinar la permeabilidad de la bolsita de arena. El flujo de petróleo sobre la bolsita de arena se detuvo y la bolsita de arena se envejeció en contacto con el petróleo crudo durante una semana . Después de este período de envejecimiento, la solución de salmuera dopada con yoduro de sodio se bombeó a una velocidad de 80 ml/h para un
total de 10 volúmenes de poro, después de lo cual el detector de rayos gamma indicó que la saturación de petróleo residual (Sorl) era de 0.2 %, o 20 % del volumen de poro. La bolsita de arena se cerró durante un período de 2 semanas para imitar el período de cierre usado para el crecimiento bacteriano en la prueba con bolsitas de arena inoculada descrita en el Ejemplo 6. Después del período de cierre de 2 semanas, se continuó la inundación de agua (a 80 ml/h) con solución de salmuera durante otros 10 volúmenes de poro. Al final de esta inundación, el detector de rayos gamma indicó que la saturación de petróleo residual (Sor2) había caído a 0.16 %, o 16 % de un volumen de poro, indicando que se produjo un 4 % adicional de un volumen de poro de petróleo, después de este período de cierre testigo.
Tabla 7
Composición de salmuera simulada para pruebas con bolsitas de arena limitadas.
Ejemplo 6
Prueba de liberación de petróleo en una columna de bolsita de arena después de acciones microbianas
El propósito de este ejemplo fue analizar si la adición de la cepa LH4:18 aumentaba la cantidad de petróleo recuperado de la bolsita de arena y si existían otros efectos, específicamente pérdida de permeabilidad dentro de la bolsita de arena, que pudieran resultar en una eficiencia de barrido mejorada por la formación de biopelículas en las zonas más permeables de los reservorios de petróleo. La bolsita de arena usada en el Ejemplo 5 se volvió a inundar con petróleo a 400 ml/h para aproximadamente 15 volúmenes de poro, en cuyo punto no se produjo más petróleo de la bolsita de arena. El detector de rayos gamma se usó para obtener una indicación de la Swi . Luego, la solución de salmuera dopada con yoduro de sodio se bombeó a la columna a una velocidad de 80 ml/h para 10 volúmenes de poro. En este punto se midió la permeabilidad como 1.4 darcies y la saturación de agua residual fue 79 % de
un volumen de poro. Se inoculó la bolsita de arena con 2.8 volúmenes de poro del cultivo de LH4:18 a una densidad de célula de aproximadamente 107 cfu/ml en la misma solución de salmuera que se usó para inundar la columna. El cultivo se cultivó mediante el uso de nutrientes adicionales para aumentar la solución salmuera (Tabla 7) , específicamente, la mezcla de Se/W, vitamina y elementos traza descritos en la Tabla 2; 1200 ppm de nitrato como nitrato de sodio, y 0.5 % de peptona como la fuente de carbono.
Después de la inoculación, la bolsita de arena se cerró durante un período de 2 semanas para permitir que crezcan los microbios en la bolsita de arena. Después del período de 2 semanas, se usó la solución de salmuera para continuar la inundación de agua para otros 10 volúmenes de poro a 80 ml/h. Al final de esta inundación, el detector de rayos gamma indicó que la saturación de agua residual era 86 % de un volumen de poro y la permeabilidad se había reducido a 1.1 darcies.
En comparación con los resultados presentados en el Ejemplo 5, la bolsita de arena tratada con microbios dio un 2 % adicional de liberación de petróleo y redujo la permeabilidad de la bolsita de arena en aproximadamente 25 %. La reducción en la permeabilidad fue significativa dado que este era una bolsita de arena de permeabilidad muy alta e implica la formación de biopelículas beneficiosas.
Estas biopelículas son muy beneficiosas en una roca de formación heterogénea ya que la formación de biopelículas podría servir para tapar las zonas más permeables y, por lo tanto, volver a encausar el agua a través de zonas menos permeables, forzando así que salga más petróleo de estas zonas en una roca de formación heterogénea real.
Ejemplo 7
Riboimpresión para determinar la unicidad de la especie
La secuencia de ADNr 16S que se usó para determinar la taxonomía del aislado LH4:18 fue 100 % homologa a una especie aislada previamente de Shewanella putrefaciens (ATCC BAA453) . A fin de determinar que la cepa LH4:18 de Shewanella putrefaciens era un aislado novedoso, se obtuvieron varias Shewanella putrefaciens de ATCC y se analizaron sus genes de ADNr 16S y 23 por bioimpresión, como se describió anteriormente. Estas cepas eran: Shewanella putrefaciens ATCC 8071 (lista de validación núm. 20. Int. J. Syst . Bacteriol . 36, 354-356, 1986); Shewanella putrefaciens ATCC BAA453 (Stapleton Jr., R.D. , et al., Aquat.- Microb. Ecol . 38, 81-91, 2005); Shewanella putrefaciens ATCC 51753 (Picardal FW, et al. Appl . Environ. Microbiol. 59, 3763-3770, 1993) . La cepa ATCC BAA453 contiene dos de ocho secuencias de genes de ADNr 16S que son 100 % homologas con la secuencia de ADNr 16S de la cepa LH4:18 de Shewanella putrefaciens . Sin embargo, el análisis realizado
mediante el uso del protocolo de riboimpresión (Figura 7) indicó claramente que el patrón de los fragmentos de restricción de EcoRI que hibridizan a sondas de ADNr 16S y 23S era sustancialmente diferente en LH4:18 comparado con BAA453. Además, el patrón del fragmento LH4:18 también era sustancialmente diferente de las otras cepas de Shewanella putrefaciens analizadas. Estos análisis confirmaron que las secuencias genómicas que rodean los genes de ADNr 16S y 23 en la cepa LH4:18 son sustancialmente diferentes comparados con otras cepas analizadas de Shewanella putrefaciens y confirmó la unicidad de la cepa LH4:18 de Shewanella putrefaciens.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (17)
1. Un microorganismo aislado caracterizado porque es designado como aislado bacteriano Shewanella putrefaciens LH4:18 (ATCC núm. PTA-8822) .
2. Una composición para aumentar la recuperación de petróleo, caracterizada porque comprende: a) Shewanella putrefaciens LH4:18 (ATCC núm. PTA- 8822) ; b) uno o más aceptores de electrones; y c) al menos una fuente de carbono.
3. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque además al menos una fuente de carbono comprende petróleo o un componente de petróleo .
4. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque además comprende uno o más microorganismos adicionales.
5. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque además uno o más microorganismos adicionales son capaces de crecer sobre petróleo bajo condiciones desnitrificantes.
6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque además el o los microorganismos comprenden el aislado bacteriano Pseudomonas stutzeri LH4:15 (ATCC No. PTA-8823).
7. Un método para mejorar la recuperación de petróleo de un reservorio de petróleo, caracterizado porque comprende : a) proporcionar una composición que comprende como aislado bacteriano la Shewanella putrefaciens LH4 : 18 (ATCC núm. PTA-8822), y medio mínimo que comprende nitratos simples capaces de promover el crecimiento del aislado; e b) inocular el reservorio con la composición de (a) ; en donde el crecimiento del aislado, bajo condiciones desnitrificantes, en el reservorio de petróleo promueve la recuperación de petróleo mejorada.
8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque además la composición de (a) también comprende uno o más microorganismos adicionales capaces de crecer sobre petróleo bajo condiciones desnitrificantes.
9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque además el o los microorganismos adicionales comprenden el aislado bacteriano Pseudomonas stutzeri LH4:15 (ATCC núm. PTA-8823).
10. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque además la recuperación de petróleo se mejora por el crecimiento del aislado bacteriano Shewanella putrefaciens LH4 : 18 (ATCC núm. PTA-8822) y resulta en uno o más de los siguientes: alteración de la permeabilidad de la formación . subterránea para mejorar la eficiencia de barrido de agua; producción de biotensioactivos que reducen las tensiones interfaciales y superficiales; mediación de cambios en la humectación; producción de polímeros que facilitan la movilidad del petróleo; generación de gases que aumentan la presión de la formación; y reducción de la viscosidad del petróleo.
11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque además los gases de comprenden C02.
12. Un método para promover la biorremediación de hidrocarburos, caracterizado porque comprende aplicar el aislado bacteriano LH4:18 de Shewanella putrefaciens (ATCC núm. PTA-8822) a un área contaminada con hidrocarburos.
13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque además comprende uno o más microorganismos adicionales.
14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque además el o los microorganismos adicionales comprenden el aislado bacteriano Pseudomonas stutzeri LH4:15 (ATCC núm. PTA-8823).
15. Un método para promover el mantenimiento de oleoductos, caracterizado porque comprende aplicar el aislado bacteriano LH4:18 de Shewanella putrefaciens (ATCC núm. PTA-8822) a un oleoducto.
16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque además comprende aplicar uno o más microorganismos adicionales al oleoducto.
17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque además uno o más microorganismos adicionales comprenden el aislado bacteriano LH4:15 de Pseudomonas stutzeri (ATCC núm. PTA-8823) .
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