CN103221507A

CN103221507A - 用于微生物强化采油的方法、菌株和组合物：弓形杆菌分支1

Info

Publication number: CN103221507A
Application number: CN2011800512714A
Authority: CN
Inventors: E.R.亨里克森; S.C.杰克森; A.K.莱克瑞恩
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2010-11-01
Filing date: 2011-11-01
Publication date: 2013-07-24
Also published as: BR112013010686A2; EP2635655A4; CO6801631A2; WO2012061380A3; MX345246B; RU2013125453A; US20120277127A1; EP2635655A2; WO2012061380A2; US9376610B2; MX2013004664A; CA2814403A1

Abstract

本发明提供了方法、微生物和组合物，其中用属于弓形杆菌（Arcobacter）分支1的微生物和包括电子受体的培养基接种油层。弓形杆菌菌株在油层中生长以形成堵塞生物膜，它降低地下构造区域中的渗透性，从而提高波及效率，并且因此强化采油。

Description

用于微生物强化采油的方法、菌株和组合物:弓形杆菌分支1

本专利申请要求2010年11月1日提交的美国临时申请61/408739的优先权，该临时申请全文以引用方式并入本文。

技术领域

本公开涉及环境微生物和利用微生物改变原油井特性的领域。更具体地，提供了改善从地下油层中采油的方法并鉴定了可用于采油的新微生物。

背景技术

在从油层中采油期间，通过仅利用油层中存在的自然力的主要采油方法通常仅采集了含油层中的一小部分原油。为了改善采油，已经使用了多种补充采油技术如注水法，该方法涉及通过井钻孔将水注入油层。当水从注入井流入油层并流过含油岩层时，它使该处的油流到一个或多个生产井处，在生产井处进行采油。注水操作常遇到的一个问题是低下的注水波及效率。当水从注入井流入生产井时，它优先从通道通过油层的高渗透区域，因此绕过低渗透含油层，导致波及效率低下。因此未采收到在低渗透区域的原油。低下的波及效率也可能由水与油的不同移动性引起。

已经使用多种方法，利用微生物来强化从地层中采油，这些方法可改善波及效率和/或促进油释放。例如，可将活体微生物注入油层，在其中它们可生长并粘附到可渗透区域中岩层或砂层内的孔洞和通道表面上以减少水通道，并且因此使注入水定向流向低渗透含油层。通过注入营养液到地层中用于促进原有微生物生长的方法在US4,558,739和US5,083,611中公开。已经公开了将分离自采油位点的微生物与营养液一起注入地层的方法，所述微生物包括恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida）和肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumoniae）（US4,800,959）、分离自自来水的芽孢杆菌（Bacillus）菌株或假单胞菌（Pseudomonas）菌株I-2（ATCC30304）（US4,558,739）、和恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida）、绿脓杆菌（Pseudomonasaeruginosa）、野兔棒状杆菌（Corynebacteriumlepus）、胭脂红分枝杆菌（Mycobacteriumrhodochrous）、和母牛分枝杆菌（Mycobacteriumvaccae）（US5,163,510）。在US5,174,378中公开了注入分离微生物和表面活性剂的方法。

需要用于强化采油的附加的可用微生物菌株和方法以进一步改善从油层中采油。

发明内容

本发明涉及强化从油层中采油的方法，以及可用于强化采油的分离的微生物和组合物。

因此，本发明提供了强化从油层中采油的方法，其包括：

a)提供包含下列的组合物：

i)至少一种属于弓形杆菌（Arcobacter）分支1的弓形杆菌菌株；和

ii)包含至少一种电子受体的基本生长培养基；

b)提供油层；

c)用（a）的组合物接种所述油层，使得所述组合物中包含的弓形杆菌移植到所述油层中并且在所述油层中生长；以及

d)从所述油层中采油；

其中所述弓形杆菌在所述油层中的生长强化采油。

在一个实施例中，所述属于弓形杆菌分支1的弓形杆菌菌株包含16SrDNA简并共有序列SEQIDNO:40。

在另一个实施例中，所述属于弓形杆菌分支1的弓形杆菌菌株包含的16SrDNA序列与选自SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8和39的序列具有至少约97%的序列同一性。

在另一个实施例中，本发明提供了分离的微生物，所述微生物的菌株选自97AE3-3（ATCCNo.PTA-11410）和97AE3-12（ATCCNo.PTA-11409）。

在另一个实施例中，本发明提供了强化采油组合物，其包含：

a)至少一种分离的弓形杆菌菌株，所述弓形杆菌菌株包含选自SEQIDNO:1、33、34、35、36、37和38的部分16SrDNA序列；

b)一种或多种电子受体；和

c)至少一种碳源。

附图和序列简述

通过下面的具体实施方式、附图和随附的序列描述可以更全面地理解本发明，这些详细描述、附图和序列描述形成本专利申请的一部分。

图1示出弓形杆菌菌种和相关细菌基于16SrRNA基因序列（rDNA）的分子系统发育树，其将所述弓形杆菌属（Arcobacterspp.）分成至少三个系统发育分支。

图2示出新分离的弓形杆菌菌种和参照细菌基于16SrRNA基因序列（rDNA）的分子系统发育树。

图3A-D示出弓形杆菌分支1优势共有、弓形杆菌分支1简并共有、菌株97AE3-12、弓形杆菌分支2简并共有、和弓形杆菌分支3简并共有的16SrDNA序列的比对结果。

图4示出多个弓形杆菌属（Arcobactersp）菌株的

分析。

图5示出希瓦氏菌（Shewanella）菌种在rDNA可变区2（A）、5（B）、和8（C）的优势和简并标记序列。下划线标出了可变位点。图例中给出了每个可变位点的可选核苷酸。

图6示出了建立用于测量可渗透填砂模型堵塞程度的细管实验的示意图。

图7示出了通过未接种细管的压降图。

图8示出了通过细管的压降图，所述细管用弓形杆菌属97AE3-12（ATCCNO:PTA-11409）接种并随后定期分批给料。

图9示出了通过细管的压降图，所述细管用弓形杆菌属97AE3-12（ATCCNO:PTA-11409）接种并随后连续给料。

下列序列符合37C.F.R.§§1.821-1.825（“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则”）并且符合世界知识产权组织（WIPO）标准ST.25（2009）和EPO和PCT的序列表要求（规则5.2和49.5（a-bis），以及行政性指示的208节和附录C。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§1.822所示的规定。

表1：弓形杆菌菌株的16SrDNA序列，其包括在大肠杆菌（E.coli） 16SrDNA序列中的核苷酸坐标8至1511。

#分离物是分离自样品的菌落。

*克隆包含由分离自样品的细菌DNA产生的PCR扩增片段，该片段经测序以确定菌群的构成。

SEQIDNO:32是部分大肠杆菌16SrDNA序列，其用于弓形杆菌16SrDNA序列的比对。

SEQIDNO:33是来自弓形杆菌属的部分16SrDNA序列97AE3-1。

SEQIDNO:34是来自弓形杆菌属97AE3-3的部分16SrDNA序列。

SEQIDNO:35是来自弓形杆菌属97AE3-7的部分16SrDNA序列。

SEQIDNO:36是来自弓形杆菌属的部分16SrDNA序列97AE4-1。

SEQIDNO:37是来自弓形杆菌属的部分16SrDNA序列97AE4-5。

SEQIDNO:38是来自弓形杆菌属的部分16SrDNA序列97AE4-6。

SEQIDNO:39是弓形杆菌属分支116SrDNA的优势共有序列。

SEQIDNO:40是弓形杆菌属分支116SrDNA的简并共有序列。

SEQIDNO:41是弓形杆菌属分支216SrDNA的简并共有序列。

SEQIDNO:42是弓形杆菌属分支316SrDNA的简并共有序列。

SEQIDNO:43-46分别是1492R、8F、M13反向、和M13正向引物。

SEQIDNO:47是希瓦氏菌（Shewanella）16SrDNA可变区2的优势标记序列。

SEQIDNO:48是希瓦氏菌16SrDNA可变区2的简并标记序列。

SEQIDNO:49是希瓦氏菌16SrDNA可变区5的优势标记序列。

SEQIDNO:50是希瓦氏菌16SrDNA可变区5的简并标记序列。

SEQIDNO:51是希瓦氏菌16SrDNA可变区8的优势标记序列。

SEQIDNO:52是希瓦氏菌16SrDNA可变区8的简并标记序列。

申请人按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的有关条款进行了以下生物保藏：

表2：保藏菌株信息

具体实施方式

申请人特别在本公开中加入了所有引用的参考文献的全部内容。除非另外指明，否则所有百分数、份数、比率等均按重量计。商标以大写体标示。此外，当数量、浓度或其它数值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，其应理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值和任何范围下限或优选数值的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。除非另行指出，凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围均旨在包含其端点，以及位于该范围内的所有整数和分数。不旨在将本发明的范围限制为限定范围时详述的具体值。

本发明涉及通过用弓形杆菌菌株接种油层来强化从油层中采油的方法：该菌株通过对16SrDNA序列的分子系统发育分析属于弓形杆菌分支1（如本文所定义），并且基本培养基在地下位置中的脱氮条件下维持所述弓形杆菌的生长。所述弓形杆菌在油层中的生长可形成生物膜，其堵塞沙土层或砂岩层中较易渗透的区域，从而使水流向不易渗透的、含油量较高的区域。从而提高了波及效率，导致油采收率提高。

此外，本发明涉及分离自从油层中获取的水样的以前未知的微生物，以及包含这些微生物、或其它弓形杆菌分支1中任一种的组合物，它们可用于采油方法。使用所述方法和微生物改善采油将提高出油油井的产量。

在本专利申请中使用的特定术语和缩写定义如下：

术语“PCR”是指聚合酶链反应。

术语“dNTP”是指脱氧核糖核苷酸三磷酸腺苷。

术语“ASTM”是指美国材料与试验协会（ASTM）。

缩写“NCBI”是指美国国家生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation）。

缩写“BSL”是指生物安全水平（BiosafetyLevel）。

缩写“RNA”是指核糖核酸。

缩写“DNA”是指脱氧核糖核酸。

缩写“ATCC”是指美国典型培养物保藏中心（AmericanTypeCultureCollection）InternationalDepository，Manassas，VA，USA。“ATCCNo.”是指由ATCC保藏的培养物的保藏号。

缩写“CCUG”是指瑞典

大学菌物保藏中心（CultureCollectionoftheUniversityof

，Sweden），它是一个微生物保藏机构。

缩写“DSM”或“DSMZ”是指德国微生物菌种保藏中心（DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH），它是一个德国的微生物和细胞培养物的保藏机构（Braunschweig，Germany）。

术语“油井”、“油层”、和“含油岩层”本文可互换使用，并且是指从中可采油的地下或海底地下构造。所述构造一般来讲是具有足够孔隙率和渗透性以储油并传导油的岩石和土壤构造体。

术语“井钻孔”是指从地表到含油岩层的通道，其尺寸足以允许从地表泵送流体进入含油岩层（注入井）或从含油岩层泵送流体到地表（生产井）。

术语“脱氮的”和“脱氮”是指还原用于呼吸能量产生的硝酸盐。

术语“波及效率”是指已经观察到有流体或水通过其以驱油到生产井中的含油岩层的级分。注水方法可能遇到的一个问题是相对低的水波及效率，即，当水从注入井流向生产井时它可能从通道透过油层的某些部分，从而绕过该油层的其它部分。低波及效率可能是由于例如水的流动性与油的流动性的差异、以及在油层内的渗透性差异，所述渗透性差异使得流体流过油层的某些部分并绕过其它部分。

术语“纯培养物”是指来源于微生物菌种的单细胞分离物的培养物。纯培养物本文具体地指包括在保藏机构中公开可用的那些，以及本文鉴定的那些。

术语“生物膜”是指微生物的膜或“生物质层”。生物膜常常嵌入细胞外聚合物中，该聚合物附着到浸没在或经受含水环境的表面上。生物膜由具有结构异质性的微生物致密团块的基质组成，其可具有遗传多样性、复杂的群落相互作用、和聚合物质的细胞外基质。

术语“堵塞生物膜”是指能够改变多孔材料渗透性、并且因此延迟流体透过与所述生物膜相关联的多孔材料的移动的生物膜。

术语“简单硝酸盐”和“简单亚硝酸盐”分别是指硝酸盐（NO₃ ^-）和亚硝酸盐（NO₂ ^-），因为它们形成离子盐如硝酸钾、硝酸钠、和亚硝酸钠。

术语“注入水”是指注入油层用于二次采油的流体。注入水可来自任何合适的来源，并且可包括例如海水、盐水、生产水、采自地下含水层的水（包括接触所述油的那些含水层）、或者来自溪流、河流、池塘或湖泊的地表水。这一点在本领域中是已知的：在注入一个或多个井钻孔之前从水中除去粒状物质包括尘土、岩石或土壤小块和腐蚀副产物如锈可能是必需的。用于除去此类粒状物质的方法包括过滤、沉淀和离心。

术语“生产水”是指从油井中提取的生产流体中回收的水。生产流体包含用于二次采油的水和从油层中生产的原油。

术语“接种油井”是指将一个或多个微生物或微生物群体或聚生体注入油井或油层，使得微生物在不损失活力的情况下被递送到油井或油层中。

术语“系统发育分型”、“系统发育图谱”、或“系统发育分类”本文可互换使用，并且是指其中根据微生物进化遗传谱系对它们进行分类的分类形式。本文系统发育分型是分离自环境样本的微生物菌株的分型，并且基于16S核糖体RNA（rRNA）编码基因（rDNA）序列进行分型。

如本文所用，术语“高变区”是指在其中核苷酸序列高度可变的16SrRNA基因中的序列区域。在大多数微生物中，16SrDNA序列由九个高变区组成，所述高变区展示出在不同细菌菌属和菌种之间的显著序列多样性，并且可用于菌属和菌种鉴定。

如本文所用，术语“标记序列”是指在特定16SrRNA编码基因（rDNA）位点（标记位点）处的特定核苷酸，它通常出现在高变区内，该区域在不同水平上是微生物间有区别的。在标记位点，在菌种之间不同的核苷酸可为一个或多个特定碱基取代、插入或缺失。当合在一起时，16SrDNA的标记序列可用于描述菌种、菌株或分离物水平上的微生物，并且可用于鉴定微生物。

术语“简并或简并碱基位点”是指其中在DNA或RNA序列的特定位点上可能出现多于一种核苷酸（A、G、C、或T（U））的情况。如果在一个位点上可能仅出现四种可能核苷酸中的两种，则该位点是“双重简并”位点。如果在一个位点上可能出现四种可能核苷酸中的三种，则该位点是“三重简并”位点。如果在一个位点上可能出现所有四种核苷酸，则该位点是“四重简并”位点。

术语“简并标记序列”是指在标记序列中可具有一个或多个可能简并碱基位点的标记序列。

术语“系统发育学”是指研究确认并了解生物之间的进化关系的生物学领域，并且具体地讲分子系统发育学在这个分析中利用DNA序列同源性。具体地讲，利用相似性算法确定的在16S rDNA序列、包括标记序列中的相似性或差异性用于定义系统发育关系。

术语“系统发育树”是指描绘物种间进化关系的分支状图表。本文系统发育树基于16S rDNA的DNA序列同源性（包括16S rDNA中的标记序列），并且示出了本发明菌株与相关菌株和菌种的关系。

术语“系统发育分支”或“分支”是指在系统发育树中的分支。分支包括基于选择的分支点位于分支上的所有相关生物。

术语“基因组型”用于描述一个亚种分类，当菌种的一组菌株通过DNA序列可区分，但是显型上不可区分时，使用该分类。基因组型通过DNA-DNA杂交和/或16SrDNA标记序列进行定义和鉴定。已经使用这种方法描述施氏假单胞菌（Pseudomonasstutzeri），Bennasar等人（（1996）Int.J.ofSyst.Bacteriol.46：200-205）。

术语“核糖分型”是指基因组DNA限制性片段的指纹识别，所述片段包含编码16S和23S核糖体RNA的全部或部分基因。使用DuPont系统进行核糖分型。

术语“RiboPrint^TM”是指特定微生物分离物或菌株的特有基因组指纹，它使用

系统生成。

术语“模式菌株”是指特定菌种的参照菌株，所述菌种的描述用于定义并表征特定菌种。

术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件包括但不限于：GCG程序包（WisconsinPackageVersion9.0，GeneticsComputerGroup（GCG），Madison，WI），BLASTP，BLASTN，BLASTX（Altschul等人，J.Mol.Biol.215，403-410，1990），DNASTAR（DNASTAR，Inc.，Madison，WI），和整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序（Pearson，W.R.，Comput.MethodsGenomeRes.，Proc.Int.Symp，会议日期1992，111-120，编辑：Suhai，Sandor，PlenumPublishing，NewYork，NY，1994）。在本专利申请案的上下文,中应当理解，使用序列,分析软件进行分析时，除非另外指明，否则分析结果将基于所参考程序的“默认值”。在此所用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。

术语“电子受体”是指在细胞呼吸期间接受或接纳电子的化合物。微生物通过从“电子供体”向电子受体传递电子来获取能量用于生长。在这个过程中，电子受体被还原并且电子供体被氧化。电子受体的例子包括氧、硝酸盐、延胡索酸盐、铁（III）、锰（IV）、硫酸盐和二氧化碳。糖、低分子量有机酸、碳水化合物、脂肪酸、氢和原油或其组分如石油烃或多环芳烃是能够用作电子供体的化合物的例子。

“达西”是渗透性单位。渗透性为1达西的介质允许允许许允许粘度为1cP（1mPa·s）的流体在作用于1cm²面积上的1atm/cm压力梯度下以1cm³/s流动。豪达西（mD）等于0.001达西。

分离的微生物

能够在厌氧条件下，在作为电子受体的硝酸盐、延胡索酸盐或三价铁（Fe（III））和作为碳源的乳酸存在的情况下生长的微生物分离自井2的生产和注入水，所述井位于Alberta，Canada的Wainwright油田。井2的生产水和注入水具有约65份每千份（ppt）的盐浓度，该浓度约两倍于海水的盐浓度。

分离的微生物通过分析它们的16S核糖体DNA（rDNA）序列并识别它们的基因组DNA限制性片段的指纹进行表征，所述片段包含编码16S和23S核糖体RNA（rRNA；核糖分型）的全部或部分基因。分离菌株97AE3-12、97AE3-3、97AE3-1、97AE4-6、97AE4-5、97AE3-7、和97AE4-1被鉴定为属于弓形杆菌的新菌株。这些菌株的RiboPrint^TM图谱不同于紧密相关的菌株嗜盐弓形杆菌（Arcobacterhalophilus）（ATCCBAA-1022），该菌株与菌株97AE3-12的16SrDNA（分别是SEQIDNO:6和1）具有超过96%的序列同一性。RiboPrint^TM图谱（图4）指示新分离的菌株形成3个组：1）97AE3-12、97AE4-1和97AE4-5；2）97AE3-3和97AE4-6；以及3）97AE3-7和97AE3-1。菌株97AE3-12和97AE3-3因此分别按照Budapest Treaty以ATCCNo.PTA-11409和ATCCNo.PTA-11410进行保藏。

此外，该菌株被表征为属于弓形杆菌分支1，这由如本文实例2所述对16SrDNA序列的分子系统发育分析确定。该分析产生的系统发育树如图1所示，新分离的菌株用菌株97AE3-12表示。系统发育树示出了由已知弓形杆菌菌种形成的三个分支、或分类，它们在图中被框出。分支3包括病原菌株如布氏弓形杆菌（Arcobacter butzleri）和嗜低温弓形杆菌（Arcobacter cryaerophilus），它们归类为BSL2。分支2包括硝化弓形杆菌（Arcobacter nitrofigilis）。分支1包括已知的菌种海洋弓形杆菌（Arcobacter marinus）、嗜盐弓形杆菌（Arcobacter halophilus）、软体动物弓形杆菌（Arcobacter molluscorum）和贻贝弓形杆菌（Arcobactermythili）。属于分支1的任何弓形杆菌菌株可用于本发明方法。当如本文所述使用16SrDNA序列进行分子系统发育分析时，分支1包括上文列出的菌株、以及属于这些菌种所属的相同分支的任何菌株。

弓形杆菌分支1菌株是本发明方法的菌株，它们还可被定义为其rDNA序列与在图1分支1中示出的那些菌株中的任何一种的16S rDNA序列具有至少约97%、98%、或99%的序列同一性的菌株：弓形杆菌属SolarLake（SEQ ID NO:2）、弓形杆菌属（Arcobacter sp）YJQ-18（未培养的克隆；SEQ ID NO:3）、海洋弓形杆菌（Arcobacter marinus）（SEQ IDNO:4）、H temp Oil reservoir clone EB27（SEQIDNO:5）、嗜盐弓形杆菌（Arcobacter halophilus）（SEQ ID NO:6）、和贻贝弓形杆菌（Arcobacter mytili）（SEQIDNO:8）。此外，本发明方法的菌株包括其具有的rDNA序列与软体动物弓形杆菌（Arcobacter molluscorum）F98-3T（它也属于分支1）的16SrDNA序列（SEQIDNO:7）具有至少约97%、98%、或99%的序列同一性的那些菌株。来自图1中不同分支的菌株的16SrDNA序列具有小于96%的序列同一性。

在图2中，本文制备的分子系统发育树示出了新分离的菌株97AE3-12、97AE3-1、97AE3-3、97AE3-7、97AE4-1、97AE4-5、和97AE4-6彼此之间和与其它分支1菌株之间、以及与分支2和3中每一个的一个菌株之间的关系。所述菌株在分支1的一个分支内彼此紧密相关。这些菌株特征在于它们的rDNA序列：分别是SEQ ID NO:1、33、34、35、36、37和38，因此具有这些新分离物（SEQ ID NO:1、33、34、35、36、37和38）的部分rDNA序列的菌株是本发明方法的弓形杆菌分支1菌株。

按组分析在每个分支1、2、和3中的菌株的16S rDNA序列以鉴定在特定位点的标记序列，它们可用于区分三个分支。如本文实例2所述，在16S rDNA序列中的特定位点具有每个弓形杆菌分支特征性的核苷酸，它们可为固定的或可具有一些简并性，如表6中所列出的那样。此外，在一些位点可存在插入或缺失。在表6中列出的每个弓形杆菌分支的标记序列组（所有位点一起）不同于每个其它弓形杆菌分支的标记序列组。弓形杆菌分支116S rDNA优势（最常见的）共有序列（它可不是全长序列）包含标记序列，它用SEQ ID NO:39表示。已知的或新分离的微生物菌株可鉴定为属于弓形杆菌分支1，并且因此是本发明方法的菌株，因为其具有与SEQ ID NO:39有至少约97%、98%、或99%的序列同一性的16SrDNA。

简并标记序列（包括插入/缺失位点）存在于分支1（SEQ ID NO:40）的简并共有16SrDNA序列、分支2（SEQ ID NO:41）的简并共有16S rDNA序列、和分支3（SEQ ID NO:42）的简并共有16S rDNA序列中。已知的或新分离的微生物菌株可鉴定为属于弓形杆菌分支1，并且因此是本发明方法的菌株，因为其具有为SEQ ID NO:40的16S rDNA。此外，已知的或新分离的微生物菌株可鉴定为属于弓形杆菌分支1，并且因此是本发明方法的菌株，因为其具有包括在表6中列出特定位点的分支1简并标记序列的16SrDNA。

发现弓形杆菌属菌株97AE3-12、97AE3-3、97AE3-1、97AE4-6、97AE4-5、97AE3-7、和97AE4-1如本文实例所示具有特性，指示它们通过生长形成堵塞生物膜来强化采油的能力。所述菌株能够在高盐浓度（75ppt）条件下形成堵塞生物膜。菌株97AE3-12在石油存在的情况下、在低盐浓度（15ppt）和高盐浓度（64ppt）脱氮条件下生长。堵塞生物膜在低盐浓度（15ppt）和高盐浓度（35ppt和68ppt）介质中产生。堵塞生物膜通过分批或连续营养物质给料形成。此外，在高盐浓度（64ppt）介质中显示形成二氧化硅颗粒聚集体。

分离的弓形杆菌分支1菌株的这些特性展示它们在油层的可渗透砂层或岩层中形成生物膜以堵塞高渗透区域的用途。堵塞高渗透区域可使水改道流向不易渗透的、含油量较高的区域，从而提高波及效率，导致油采收率提高。

强化采油组合物

强化采油组合物可包括上述新分离的弓形杆菌菌株97AE3-12（ATCCNo.PTA-11409）、97AE3-3（ATCC No.PTA-11410）、97AE4-6、97AE4-5、97AE3-7、和97AE4-1作为组分，所述组合物是本发明的实施例。因此本发明的组合物包括至少一种弓形杆菌菌株，其具有SEQ ID NO:1、33、34、35、36、37、或38的部分rDNA序列，它们是这些新菌株的rDNA序列。每种所述菌株可在分离的强化采油组合物中，或者多于一种的所述菌株的任何组合可在相同组合物中。

除了一种或多种这些新弓形杆菌分支1菌株之外，本发明的强化采油组合物包括一种或多种电子受体和至少一种碳源。在一个实施例中，电子受体是硝酸盐。在所述弓形杆菌菌株生长期间将硝酸盐还原成亚硝酸盐和/或氮。亚硝酸盐也可用作组合物中的电子受体。在各种实施例中，电子受体是一种或多种硝酸离子盐、一种或多种亚硝酸离子盐、或硝酸离子盐和亚硝酸离子盐的任何组合。

碳源可为简单的或复合的含碳化合物。碳源可为复合有机物质如蛋白胨、玉米浆、或酵母提取物。在另一个实施例中，碳源是简单化合物如柠檬酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、丙酮酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐、甲酸盐或乳酸盐。

强化采油组合物可包括附加组分，所述组分促进组合物的微生物菌株的生长和/或生物膜形成。这些组分可包括例如维生素、痕量金属、盐、氮、磷、镁、化学缓冲剂、和/或酵母提取物。

在一个实施例中，强化采油组合物包括在油存在的情况下生长的一种或多种附加微生物。所述微生物可使用油组分作为碳源，或者当使用替代碳源时它们的生长不受存在的油的抑制。尤其有用的是具有强化采油特性的其它微生物，例如形成生物膜或从表面上释放油的微生物。在一个实施例中，在本发明的组合物中的附加微生物是希瓦氏菌菌种的微生物。希瓦氏菌是部分通过rDNA的系统发育分类已经确定的细菌菌属，并且它在文献中已经得到了充分的描述（参见例如Fredrickson等人，Towards Environmental Systems Biology Of Shewanella，Nature Reviews Microbiology（2008），6（8），592-603；Hau等人，Ecology And Biotechnology Of The Genus Shewanella，Annual Review of Microbiology（2007），61，237-258）。

在希瓦氏菌菌种之间16S rDNA序列有至少约89%的序列同一性。希瓦氏菌菌种具有的16S rDNA有标记序列高变区2（SEQ ID NO:47和48分别是优势和简并序列）、5（SEQ ID NO:49和50分别是优势和简并序列）和8（SEQ ID NO:51和52分别是优势和简并序列），如图5所示。每个区域的简并标记序列的组合定义了希瓦氏菌菌种，包括一些位点变化，如图5所示。因此在本发明中使用的希瓦氏菌属（Shewanella sp.）是在16s rDNA内包含如SEQ ID NO:48、50、和52所示的简并标记序列的那些。在一个实施例中，在本发明中使用的希瓦氏菌属是在16s rDNA内包含如SEQ ID NO:47、49、和51所示的优势标记序列的那些。

在图5中的优势标记序列是具有可变位点的那些，所述标记位点指定为在希瓦氏菌菌种中最频繁发现的核苷酸。希瓦氏菌是革兰氏阴性菌、γ-变形杆菌，其具有还原金属的能力并能够另外还原广泛的末端电子受体。这些微生物通过偶联H₂或有机物质的氧化与多种多价金属的还原获取能量以维持厌氧生长，所述金属的还原导致矿物的沉淀、转化、或溶解。

希瓦氏菌菌种改变烃涂覆表面可润湿性、从而导致采油改善的能力在共有的和共同未决的美国专利申请公布2011/0030956中公开，该文献以引用方式并入本文。在一个实施例中，附加的微生物是腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、希瓦氏菌属LH4:18（ATCC No.PTA-8822；在共有的US7,776,795中描述）、或希瓦氏菌属L3:3（ATCC No.PTA-10980；在共有的和共同未决的美国专利申请公布2011/0030956中描述）。

在一个实施例中，本发明的组合物包括索氏菌属（Thauera sp.）AL9:8（ATCC No.PTA-9497）。索氏菌属AL9:8分离自地下土壤样本并显示能够利用油或油组分作为唯一碳源在脱氮条件下生长。这种微生物也具有油释放活性（US7,708,065）。

强化采油的方法

可使用本发明的强化采油组合物接种油层，导致油采收率提高。此外，可使用如上所述包括至少一种属于弓形杆菌分支1的菌株的组合物、和包括至少一种电子受体的基本培养基接种油层以强化采油。通常将一种或多种硝酸和/或亚硝酸离子盐用作电子受体。在组合物中弓形杆菌分支1的微生物包括移植到油层中并且在油层中生长的活性细胞。

基本培养基包括至少一种碳源，并且可包括其它组分如维生素、痕量金属、盐、氮、磷、镁、钙、和化学缓冲剂。碳源可为简单的或复合的含碳化合物，例如，1）油或油组分；2）复合有机物质如蛋白胨、玉米浆、或酵母提取物；或者3）简单化合物如柠檬酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、丙酮酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐、甲酸盐或乳酸盐。

可使用如上所述属于弓形杆菌分支1的任何菌株，其在石油存在的情况下，在厌氧脱氮条件下形成堵塞生物膜。如上所述在本发明方法中可使用的属于弓形杆菌分支1的微生物菌株可通过它们的16S rDNA序列进行鉴定，其具有如上所述并在表6中列出的标记序列。此外，如上所述在本发明方法中使用的属于弓形杆菌分支1的菌株可由本领域技术人员利用生物膜形成、二氧化硅聚集、和/或渗透性减少测定法，如本文实例中所述的那些方法，进行鉴定。作为如上所述属于弓形杆菌分支1的菌株的例子（它们能够形成堵塞生物膜），本文展示了菌株97AE3-12（ATCC No.PTA-11409）、97AE3-3（ATCC No.PTA-11410）、97AE3-1、97AE4-6、97AE4-5、97AE3-7、和97AE4-1的这些特性。在一个实施例中，本发明方法利用这些菌株中的任何一种。

在另一个实施例中，除了如上所述属于弓形杆菌分支1的菌株之外的一种或多种微生物在油存在的情况下，在脱氮条件下生长，将这些微生物包括在本发明方法使用的组合物中。上文所述的希瓦氏菌菌种的微生物是尤其有用的。

在某些油层中，具有特定特性的特定菌株（如上所述其属于弓形杆菌分支1）可能最适用于本发明方法。例如，在其中至少一种流体如注入水和/或生产水具有高盐浓度的油层中，如上所述在高盐培养基中生长并形成堵塞生物膜的、属于弓形杆菌分支1的菌株是尤其适用的。具体地讲，弓形杆菌分支1菌株97AE3-12（ATCC No.PTA-11409）、97AE3-3（ATCCNo.PTA-11410）、97AE3-1、97AE4-6、97AE4-5、97AE3-7、和97AE4-1尤其适用于具有至少一种高盐、尤其是约30ppt或更高浓度盐的流体的油层。所述盐浓度可为至少约30ppt、35ppt、40ppt、45ppt、50ppt、55ppt、60ppt、65ppt、70ppt、或75ppt、或更高的浓度。

油层可使用本领域技术人员已知的任何导入方法，用如上所述包括属于弓形杆菌分支1的一种或多种菌株的组合物和基本培养基接种。通常接种为将一种组合物注入油层。注入方法是本领域常见的和熟知的，并且可使用任何适用的方法（参见例如Nontechnical guide to petroleum geology， exploration，drilling，and production，第2版，N.J.Hyne，Penn Well Corp.Tulsa，OK，USA，Freethey，G.W.，Naftz，D.L.，Rowland，R.C.和Davis，J.A.（2002）；Deep aquifer remediation tools：Theory，design，and performance modeling，D.L.Naftz，S.J.Morrison，J.A.Davis和C.C.Fuller（编辑）；和Handbook of groundwater remediation using permeable reactive barriers（第133-161页），Amsterdam：AcademicPress）。通常通过一个或多个注入井进行注入，它们在地下与从中采油的一个或多个生产井相连。

强化从油层中采油

在这一上下文中强化采油可包括从来自地下构造的烃中二次或三次采油。具体地讲，烃不易于从生产井中通过注水法或其它传统的二次采油技术采收。

一次采油方法仅利用油层中存在的自然力，它通常仅获得了油层的含油层中的一小部分原油。二次采油方法如注水法可利用本文方法进行改善，本文方法提供微生物和生长培养基以在其中渗透性变化较大的地下构造区域中形成堵塞生物膜。生物膜堵塞油层的高渗透区域使注水法中所用的水改道流向渗透性较低的、含油量较高的区域。因此尤其从其中波及效率低下的油层中实现了强化采油，所述波及效率低下是由于例如在含油岩层中散布着与剩余的岩层相比具有显著更高的渗透性的岩层。渗透性较高的层将使水通过通道并阻止水渗透到含油岩层的其它部分。通过微生物形成堵塞生物膜将减少这种通道。

实例

本发明将在下面的实例中得到进一步阐述。应该理解，这些实例尽管说明了本发明的优选实施例，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实例，本领域的技术人员能够确定本发明的基本特征，并且在不脱离其实质和范围的情况下，能够对本发明做出各种变化和修改以使其适用于各种用法和条件。

一般方法

在本专利申请中使用的缩写的含义如下：“hr”是指小时，“min”是指分钟，“day”是指天，“mL”或“ml”是指毫升，“mg/mL”是指毫克每毫升，“L”是指升，“μL”是指微升，“mM”是指毫摩尔每升，“μM”是指微摩尔每升，“nM”是指纳摩尔每升，“μg/L”是指微克每升，“pmol”是指皮摩尔，“℃”是指摄氏度，“℉”是指华氏度，“bp”是指碱基对，“bps”是指多个碱基对，“mm”是指毫米，“ppm”是指每百万份数，“g/L”是指克每升，“mL/min”是指毫升每分钟，“mL/hr”是指毫升每小时，“cfu/mL”是指菌落形成单位数每毫升，“g”是指克，“mg/L”是指毫克每升，“Kev”是指千或数千电子伏，“psi”是指磅（力）每平方英寸，“LB”是指Luriabroth，“rpm”是指每分钟转数，“NIC”是指未接种对照。

微生物生长

用于培养和维持厌氧培养物的技术在“Isolation of BiotechnologicalOrganisms from Nature”，（Labeda，D.P.编辑，117-140，McGraw-HillPublishers，1990）中进行了描述。硝酸盐、三价铁和延胡索酸在本文所用的生长条件下均被单个利用作为主要的电子受体。在脱氮条件下，通过培养基中的硝酸盐消耗测量厌氧生长。以前已经描述了将硝酸盐还原成氮（Moreno-Vivian，C.等人，J.Bacteriol.，181，6573-6584，1999）。在一些情况下，硝酸盐还原过程导致亚硝酸盐积聚，它们随后被进一步还原成氮。从而，因此也将亚硝酸盐的积聚和有时候发生的消耗认为是微生物活性生长和代谢的证据。

测定存活细胞的滴度（最可能的数目）

为了测定存活细胞的滴度，来自培养物或细管的样品在96孔板中以每个样品8行用标准Miller’sLuriaBroth或加入3.5%氯化钠的Luria broth进行1:10系列稀释。使用自动Biomek200机械臂滴管进行滴定。通过目测浊度测定生长并记录8行中每一行的情况。使用Cochran（Biometrics（1950）第105-116页）的最可能数量算法测定存活细胞数/mL和初始样品中这一数量的95%置信限。

系列稀释方法平板用于测定此类培养物的细菌滴度。此类样品的一系列1:10稀释液置于平板上并且给所得菌落计数。平板上的菌落数然后乘以该平板的稀释因数（进行1:10稀释的次数）以获得初始样品中的细菌数。

离子色谱

为了测定含水介质中的硝酸盐和亚硝酸盐离子，申请人使用ICS2000色谱单元（Dionex，Banockburn，IL）。在AS15阴离子交换柱上使用2至50mM的氢氧化钾梯度完成离子交换。使用已知量的亚硝酸钠或硝酸钠溶液生成标准曲线并用于校准硝酸盐和亚硝酸盐浓度。

通过折射计测量总溶解盐

使用手持式折射计（ModelRHS10ATC，HuakeInstrumentCo.，Ltd）测量总溶解盐。

来自油层生产和注入水的样品

石油井系统取样进行这一研究，其称为在Alberta，Canada的Wainwright油田中的井2。这个井的盐浓度为海水盐浓度的约两倍，在65ppt范围内。水样品获取自生产和注入井井口，其形式为混合油/水液体，置于1.0L棕色玻璃瓶中，充满至瓶顶部，封盖并用胶带密封以防止气体泄漏。来自固有的厌氧过程的气体足以保持运输期间的厌氧条件。玻璃瓶在填充有冰块的大型塑料冷却器中，在取样后48小时内运送到测试机构。

制备DNA用于序列分析

通过在pH7-8的50μL水或Tris-HCL缓冲液中稀释细菌菌落从细菌菌落中分离基因组DNA。在测序前稀释菌落DNA用Phi29DNA聚合酶扩增（GenomiPHI Amplification Kit GE Life Sciences，New Brunswick，NJ）。将稀释菌落的等分试样（1.0μL）加到9.0μL细胞裂解试剂（LysisReagent，购自GenomiPHI Amplification Kit）中并加热到95℃保持3分钟，随后立即冷却至4℃。将9.0μL酶缓冲液和1.0μLPhi29酶加到每个裂解样品中，随后在30℃孵育18小时。通过加热至65℃保持10分钟使聚合酶失活，随后冷却至4℃。

DNA序列分析

如下进行DNA测序反应：将8.0μL GenomiPHI扩增样品加到8.0μLBigDyev3.1 Sequencing试剂（Applied Biosystems，Foster City，CA）中，随后加入3.0μL10μM引物SEQIDNO:43、44、45、或46（由SigmaGenosys，Woodlands，TX制备），4.0μL5X BigDye稀释缓冲液（AppliedBiosystems）和17μL Molecular Biology Grade水（Mediatech，Inc.，Herndon，VA）。

测序反应加热至96℃3.0分钟，随后进行200个热循环（95℃30秒；55℃20秒；60℃2分钟）并贮存在4℃。使用Edge Biosystems（Gaithersburg，MD）清洁平板除去未结合的dNTP。将扩增反应产物用吸移管吸移到预转96孔清洁平板的一个孔中。所述平板在25℃下，以5,000×g在SorvallRT-7（Sorvall，Newtown，CT）中离心5.0分钟。将纯化后的反应物直接置于Applied Biosystems3730DNA测序仪上，并用自动碱基判定测序。

每个装配的rDNA序列使用BLAST算法与NCBIrDNA数据库（约260,000个rDNA序列）比较（Altschul等人，Journal of MolecularBiology，1990）。评分最高的序列同一性hit用作用于菌株鉴定的最密切相关的已知菌种的标识。

作为另外一种选择，为了从单个菌株中产生扩增的rDNA片段，我们选择引物组，参见Grabowski等人（FEMS Microbiology Ecology，54：427-443（2005））。选择引物SEQ ID NO:43和引物SEQ ID NO:44的组合以特异性扩增细菌rDNA序列。

PCR扩增混合物包括：1.0XGoTaqPCR缓冲液（Promega），0.25mMdNTP，25pmol各种引物，反应体积50μL。加入0.5μLGoTaq聚合酶（Promega）和1.0μL（20ng）样品DNA。PCR反应热循环方案为在95℃5.0分钟，随后为30个如下循环：95℃1.5分钟，53℃1.5分钟，72℃2.5分钟，并且最后在72℃延伸8分钟，反应在PerkinElmer9600热循环仪（Waltham，MA）中进行。1400个碱基对的扩增产物在1.0%的琼脂糖凝胶上显现。使用TOPOTA克隆系统（Invitrogen），按照制造商推荐的方法直接将PCR反应混合物克隆进pCR-TOPO4载体中。将DNA转化到TOP10化学感受态细胞中，选择氨苄青霉素抗性。选择单菌落并在微滴定板上生长，用于序列分析。如上所述为扩增片段和鉴定菌株测序。

自动化核糖分型

自动化核糖分型用于最后鉴定具有相似16SrRNA序列系统发育特性的选择菌株（Webster，JohnA（1988），美国专利4,717,653；Bruce，J.L.（1996）FoodTechno.50：77-81；和Sethi，M.R.（1997）Am.Lab.5：31-35）。核糖分型按照制造商的推荐进行（DuPont Qualicon Inc.，Wilmington，DE）。为了进行这些分析，挑取一个新菌落，重悬浮在样品缓冲液中并加到加工模块中进行热处理步骤，在80℃处理10分钟以抑制内源性的DNA-降解酶。然后降温，并且将两种裂解酶（溶葡球菌酶和N-乙酰胞壁质酶；由制造商提供）加到样品中。然后将样品载体与其它商业试剂一起加载到Riboprinter^TM系统上。使用EcoRI酶进行的样品染色体DNA的限制性酶消化、凝胶电泳和印迹步骤是完全自动化的。简而言之，基因组细菌DNA用EcoRI限制性酶消化并加载到琼脂糖凝胶上。限制性片段通过电泳分离并同时转移到尼龙膜上。在变性步骤后，核酸与包含大肠杆菌（E.coli）rRNA操纵子的磺化DNA探针杂交，所述操纵子包括小的和大的rRNA亚基的基因、5SrRNA基因、和内部转录间隔区。通过用电荷耦合器件相机捕集化学发光基质发出的光来检测杂交探针。输出包括光密度指纹扫描，其描绘了包含来自基因组中的核糖体操纵子序列的基因组EcoRI限制性片段的分布，它们根据其分子量而电泳分离。

筛选能够在烧结玻璃过滤器上形成生物膜的菌株

使用烧结玻璃过滤器开发出了一种用于筛选能够在二氧化硅表面上形成生物膜并防止水流过约10微米孔（堵塞）的菌株的测定法。将25mm介质粗度烧结玻璃过滤器（货号15254，Adams and Chittenden ScientificGlass，BerkeleyCA）胶粘到设计用于膜过滤的塑料夹持器的基座上。在固化后，过滤器组件通过高压釜灭菌。在夹持器中的单个过滤器置于无菌Petri板中并将包含来自多个菌株过夜培养物的种菌的培养基加到玻璃过滤器顶部。用于这种生物膜形成/堵塞测定的生长培养基如实例所示。所述平板在室温下，在厌氧条件下封盖并孵育一周至两周。从培养基中移出过滤器并将顶件在适当的位置螺纹连接。将一个1mL注射器附接到过滤器夹持器的进口，所述注射器填充有1.0mL的水，并且测量排干管中水的时间（秒数）。

在用培养物孵育前预筛多孔玻璃过滤器以确定流量，并且在实验末期测定孵育后流量的变化百分比。

筛选聚集二氧化硅的菌株

测试弓形杆菌属菌株聚集结晶二氧化硅晶粒的能力。结晶二氧化硅提供了对多种地下地质构造来说常见的砂粒的替代品。将100μL220g/L的结晶二氧化硅的等分试样（晶粒尺寸范围为约2-20微米；Sil-co-Sil125，由U.S.Silica，Berkeley Springs，WV制备）加到每个样品管中。此外，加入8mL培养基并封盖所述管以限制进入培养基的氧气。

一式两份的、活的（接种的）测试处理接受200μL多种菌株的冷冻原液作为种菌。也制备未接种的对照管，其包含除微生物种菌之外的所有组分。管在30℃下静态孵育。处理管用涡旋剧烈混合10秒。由于结晶二氧化硅的重悬浮，浊度大幅提高，所述结晶二氧化硅在孵育期间沉降在管底部。在混合后通过测量OD600检测由于结晶二氧化硅随时间沉降引起的浊度下降。二氧化硅颗粒的沉降显示一些菌株能够与邻近的结晶二氧化硅颗粒形成强粘附相互作用，导致它们较快速的沉降。在油田中，使砂粒彼此粘附提高对通过砂层的液流的阻力。这允许对流动一致性的控制，其导致经由注水法采油更有效。

用于渗透性降低测定的细管装置

设计一种装置用于利用细管测量可渗透填砂模型的生物堵塞。操作该细管的总体工序是：

●如下所述用从油井中产生的沙土加上Sil-co-Sil125的混合物填充两个相同的细管

●在压力下给每个细管注水

●通过使盐水（盐水1）流入管中测定填料细管的基本渗透性。使用弓形杆菌种菌成功地生物堵塞这些细管装置表明它在改变油层的多孔岩层渗透性方面的作用。施用这种菌株于油层能够通过改变注水法中的油层流动一致性而因此改善采油。

细管实验装置的示意图在图6中示出。参见图6，下方所有数字用粗体字表示。

由在Milne Point Unit of the Alaska North Slope的Schrader Bluff构造产生的沙土样品通过用溶剂洗涤进行清洁，所述溶剂由50/50（体积/体积）的甲醇/甲苯混合物构成。随后排干溶剂，并且随后从沙土中蒸发掉以产生清洁干燥的可流动沙土。这种沙土用筛网过滤以除去尺寸小于一微米的颗粒。这种沙土与洗涤过的Sil-co-Sil125（U.S.Silica，Berkeley Springs，WV）以4:1的比率混合，并且所述混合物被紧密填充到分开的四英尺（121.92cm）长、内径约1cm的柔性细管（9a，9b）中，并使用实验室雕刻机通过振动压实。

每个细管的两端用常见的压缩型配件封端以使沙土混合物保持在其中。柔性的1/8英寸（0.32cm）管能够在该测试中保持压力，该管附接到所述配件上。将细管安放到压力容器中，（10）所述管通过压力容器（11和12）的末端，使用常见的可用压力配件（1/8英寸（0.32cm）穿板接头）（18a，18b和21a，21b）。附加的配件和管用于连接每个细管的入口和压力泵（13a，13b）与进料贮存器（14a，14b）。其它常见的压缩配件包括弯头套管和三通、以及连接每个细管入口与测量高于大气压的压力的换能器的管件（绝对压力表）（20a，20b）。细管的入口也使用相同类型的管件和配件连接到通常可用的压差换能器的高压侧（19a，19b）。配件和管件将每个细管出口连接到压差换能器低压侧（19a，19b）和背压调节器（16a，16b）上。来自压差和绝对压力换能器的信号通过端口输出到计算机并且监控并定期记录这些压力读数。围绕细管的压力容器（10）填充有水，水作为液压流体，通过水端口（15）填充。用空气通过端口17给所述水缓慢加压至约107磅每平方英寸（psi）（0.74兆帕斯卡）的压力，同时来自进料贮存器（14a，14b）的盐水1（见下文）流过细管并通过背压调节器（16a，16b）流出。执行这一操作使得每个细管中的压力一直比压力容器（10）低5至20psi（0.034-0.137兆帕斯卡）。

细管实验的溶液：

盐水1：在Alberta Canada中的油井位点处使用的注入水。总溶解盐含量为约70ppt。使用盐酸或氢氧化钠调节这种溶液的pH到约6.2至6.4。如实例所述，在细管实验期间将这种盐水施用于过滤器经灭菌或不经灭菌的细管。

盐水2：（分批营养物质进料）

将1份稀释在36份盐水1中

盐水3：（连续营养物质进料）

将1份稀释在327份盐水1中

盐水5：

在自来水中，

66ppt氯化钠，

1000ppm柠檬酸钠，

3725ppm延胡索酸钠，

100mg/LNH₄Cl，

50mg/LKH₂PO4，

500mg/L酵母提取物，

1900ppm钙（5260ppmCaCl₂）

用盐酸调节pH到～6.2至6.4。

测量压降

使用上述压差换能器测量细管中的压降。以不同流量通过每个细管测量压降。这种压降大约与流量成比例。对于在每个流量下测量的每个压降，计算填砂模型的基本渗透性。

压降可单独进行比较并用作细管之间渗透性变化的量度，因为所有管具有相似的尺寸并在测试期间接受相同流量的盐水。

细管中的空置体积称为孔体积，为40-50mL。根据细管产物总体积和孔隙率的估计值（约40%）计算这种孔体积。

计算基本渗透性

使用在完全压力下的盐水1流量测量每个管的基本渗透性：在细管中为约95psi（0.665兆帕斯卡）（用背压调节器在出口末端进行控制）并且在压力容器（细管外部）中为约110psi（0.758兆帕斯卡）。使用达西公式计算基本渗透性：

k=4.08*Q*μ*L

A_x*ΔP

ΔP=经过多孔模型或岩层的压降，[=]psi

Q=通过模型的体积流量，[=]cc/hr

μ=通过模型的流体（单相）粘度[=]厘泊

L=模型长度（平行于流向），[=]cm

A_x=横截面积（垂直于流向）[=]cm²

k=渗透性[=]豪达西

4.08=使单位相容的转换常数[=]mD-hr-psi/cp/cc²

每个模型细管的基本渗透性以及其它性能在表3中给出。

表3：填砂模型细管性能

管号	实例号	管ID，cm	长度，L，cm	沙土质量，g	渗透性，达西
						9a	8,9	0.978	121.9	166.4	0.7
9b	10	0.978	121.9	175.6	1.2

实例1

厌氧富集来自油层样品的固有微生物

为了富集能够还原任何电子受体硝酸盐、延胡索酸盐或三价铁离子（Fe（III））的菌种，我们如一般方法所述将来自井2的1mL注入水或生产水接种到在20mL厌氧血清小瓶中的9mL基本盐培养基（表4）中，该培养基补充有作为碳源的乳酸（2000ppm）、4300ppm的氯化钠和作为电子受体的1.6g/L硝酸钠或3.5g/L延胡索酸钠、或13,000ppmNaEDTAFe（III）。具有丰富培养基Marine broth（Difco^TMB.D.Diagnostics SparksMD）的第四富集（其补充有3900ppm的氯化钠和2000ppt的乳酸）用于富集微生物，所述微生物生长需要多于基本培养基的营养物质。在Marinebroth样品中的电子受体选自铁（III）、硫酸盐、硝酸盐和制剂中的有机分子，它们能够用作电子受体。每个培养基样品通过用氮气和二氧化碳的混合物充满小瓶进行脱氧，随后通过高压釜灭菌。所有细菌操纵在厌氧室（Coy Laboratories Products，Inc.，Grass Lake，MI）中实施，并且所述培养物在环境温度下孵育。

表4：基本盐培养基

将培养基的pH调节至7.3。

监测包含硝酸盐的富集并定期取样以监测硝酸盐消耗和亚硝酸盐积聚，或者在一些情况下，监测亚硝酸盐的消耗。当样品中的硝酸盐耗尽时（通常经过14天），加入乳酸和硝酸盐至初始终浓度。也加入在每个其它富集中的乳酸和电子受体至初始终浓度。在marine broth富集样品中，加入乳酸用于进一步孵育。

在室温下孵育所有小瓶附加的14至20天。在小瓶中观察到指示基于乳酸和每个富集的电子受体组合的生长的变化。变化包括培养基中可见的浑浊、和在玻璃小瓶上或在气-水界面上存在的生物膜、以及在包含硝酸盐作为电子受体的小瓶中的硝酸盐和亚硝酸盐减少。在每个小瓶中的浊度相似，指示在注入水和生产水中存在各种不同的微生物群体。

在室温下再孵育14-20天后，将来自每个富集的100μL样品划线接种到Marinebroth琼脂平板（按照配方制备，Difco2216，Becton-Dickenson，Sparks，MD）上并在室温下孵育两天。分离具有独特形态的代表性菌落，将其再次划线接种到Marine broth琼脂平板上，并进行培养以纯化分离物。筛选分离菌落的样品用于通过PCR扩增鉴定，所述PCR使用如一般方法所述的直接菌落rDNA分析，利用反向PCR引物1492R（SEQ ID NO:43）和正向PCR引物8F（SEQ ID NO:44）。如一般方法所述的DNA测序和分析用于获取16S rDNA序列以进行微生物鉴定。经鉴定属于弓形杆菌的分离物主要获取自生产水的延胡索酸盐和marine broth富集。七个分离物被命名为97AE3-12、97AE3-1、97AE3-3、97AE3-7、97AE4-6、97AE4-5、和97AE4-1。

实例2

相对于弓形杆菌属表征分离的菌株

为了测定命名为97AE3-12、97AE3-1、97AE3-3、97AE3-7、97AE4-6、97AE4-5、和97AE4-1（实例1）的七个分离物的16SrDNA序列，七个分离物中的每个均取样作为纯化单菌落、分离DNA并通过PCR、使用一般方法的工序扩增16SrRNA基因。使用TOPOTA克隆系统（Invitrogen），按照制造商推荐的方法将扩增序列克隆进pCR-TOPO4载体中，并且随后使用引物1492R、8F、M13Reverse、和M13Forward（分别是SEQ ID NO:43-46）进行多次测序以获取近乎全长的序列。用每个菌株的16S rDNA序列（97AE3-12：SEQ ID NO:1，97AE3-1：SEQ ID NO:33，97AE3-3：SEQ ID NO:34，97AE3-7：SEQ ID NO:35，97AE4-6：SEQ ID NO:38，97AE4-5：SEQ ID NO:37，和97AE4-1：SEQ ID NO:36）查询NCBI（National Center for Biotechnology Information）数据库，使用BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）算法程序，该程序由NCBI（Altschul等人（1990）J.Mol.Biol.215：403-410）提供以鉴定最相似的核苷酸序列。这通过比较查询序列与数据库中相似的16SrDNA序列并确定相对百分比同一性来进行。所有查询序列（97AE3-12、97AE3-1、97AE3-3、97AE3-7、97AE4-6、97AE4-5、和97AE4-1每个一个）返回tophits，当海洋弓形杆菌（Arcobacter marinus）CL-S1（SEQIDNO:4）、弓形杆菌属Solar Lake（SEQ ID NO:2）、弓形杆菌属YJQ-18（SEQ ID NO:3）大于或等于99%的同一性时。

基于初始弓形杆菌同一性，选择在NCBI数据库中来自弓形杆菌菌属的24个16SrDNA参照序列和5个相关序列。这些序列在表1用列出为SEQIDNO:2-6、8、9、和11-31。参照序列包括10个来自弓形杆菌菌株（SEQIDNO:4、6、8、9、15、17-21）的序列，所述菌株代表12个不同的弓形杆菌菌种（菌株类型），它们得到了International Committee onSystematics of Prokaryotes（List of Prokaryotic names with Standing inNomenclature）认可。参照序列也包括来自油层的6个菌株（SEQIDNO:3、5、24、25、28和31）。包括其它弓形杆菌分离物和菌株作为参照序列，因为它们已经在经同行评议的杂志中被视为弓形杆菌属，但是尚未被正式分型和描述为菌种（SEQ ID NO:2、11-14、16、22、23、26、27和30）。此外，使用大肠杆菌K1216SrDNA B序列（位点8-1511；SEQ IDNO:32）作为序列对比的支架并用于提供碱基坐标系，将其视为碱基位点标准（Brosius，J.等人（1981）J.ofMolecular Biology，148（2）：107-127；Woese，（1987）Bacterial Evolution.Microbial Rev.51：221-271）。用于比对的测试序列来自菌株97AE3-12（SEQ ID NO:1）。这个序列基于序列片段（500-700bp）是其它六个菌株中代表性的序列，所述序列片段在所有六个菌株和海洋弓形杆菌（Arcobacter marinus）CL-S1（GenBank：EU512920）之间显示高序列同一性。

使用SEQ ID NO:1-6、8、9、和11-32近乎全长的16S rDNA序列，利用Clustal W比对算法（Chenna，R.H.等人，2005和Lark，M.A.等人，2007）进行全局比对。全部24个弓形杆菌序列进行比对并显示在同一性上与大肠杆菌K1216SrDNA的显著距离，序列同一性为76至78%。所有序列在与大肠杆菌K12序列可变区3的碱基坐标位点452至476进行比较时展示25bp的缺失。在可变区6的碱基坐标位点1028也存在4bp的插入（WGCT），并且在可变区9的碱基坐标1451至1456存在6bp的缺失。这些结构标记与以下系统发育分类的标记一致：细菌/ε-变形菌纲（Epsilonproteobacteria）/弯曲菌目（Campylobacterales）/弯曲菌科（Campylobacteraceae）/弓形杆菌（Arcobacter）。

所述比对产生菌株97AE3-12与下表5所示的弓形杆菌属序列最接近的序列同一性。

表5：97AE3-12和已知的16SrDNA序列具有最接近的序列同一性

*重叠是指用于测定百分比同一性的重叠序列的长度（包括在固定端的错配、缺失、和插入）。这由于不同16SrDNA序列的可用序列长度的可变性而不同。

系统发育树通过相同rDNA序列（SEQIDNO:1-6、8、9、11-32）的Clustal W比对，使用DNAstar LaserGene软件包（LaserGene^TM，DNASTAR，Inc Madison，WI）的系统发育树和MegAlign^TM程序的自举功能而形成。如图1所示的系统发育树示出了所有弓形杆菌参照菌株与菌株97AE3-12。十个识别的弓形杆菌参照菌株在分子系统发育分析中形成三个分支（1、2、和3）。海洋弓形杆菌（A.marinus）和嗜盐弓形杆菌（A.halophilus）属于分支1，硝化弓形杆菌（A.nitrofigillis）属于分支2，并且由布氏弓形杆菌（A.butzlerii）提供的已知病原体全部属于分支3。如图1所示，菌株97AE3-12属于弓形杆菌分支1，其包括海洋弓形杆菌（Arcobacter marinus）CL-S1（JCM15502^T）（Kim，H.M.等人，Int.J.Syst.Evol.Microbiol.60：53（2010），它是参照菌株类型，具有最高的序列同一性99.5%。分支1中其它分离并描述的菌株包括弓形杆菌属SolarLake、嗜盐弓形杆菌（Arcobacter halophilus）LA31B（ATCCBAA-1022^T）（Teske等人（1996）Appl.Environ.Microbiol.62：4210；Donachie等人（2005）Int.J.Syst.Evol.Microbial.55：1271）。虽然贻贝弓形杆菌（A.mytili）F2075和硝化弓形杆菌（A.nitrofigillis）DSM7299实际上与97AE3-12具有相同百分比的16SrDNA序列同一性，这两种菌株的16SrDNA的标记序列使它们分别属于分支1和2。

系统发育分支3固定为布氏弓形杆菌（Arcobacter butzleri）（描述和分离最多的弓形杆菌菌种）。这个分支也包含斯氏弓形杆菌（Arcobacterskirrowi）、Arcobacter thereius、食物弓形杆菌（Arcobacter cibarius）和嗜低温弓形杆菌（Arcobacter cryaerophilus）。所有这些菌株是BSL2生物。

以相同方式产生一个分子系统发育树以示出新分离的菌株97AE3-12、97AE3-1、97AE3-3、97AE3-7、97AE4-6、97AE4-5、和97AE4-1之间的关系，以及它们与上文使用的参照菌株亚群的关系。如图2所示的这个系统发育树指示新分离菌株和已知菌株弓形杆菌属SolarLake以及弓形杆菌属YJQ-18之间的紧密关系，它们在图1中示出，属于弓形杆菌分支1。

使用上述相同的全局多序列对比，鉴定在16SrDNA序列中的标记位点，它们可用于通过这些位点上的标记序列区分分支1中的弓形杆菌菌种和分支2与3中的弓形杆菌菌种。这些标记位点连同大肠杆菌16SrDNA序列的位点坐标一起在表6中列出。列出了在每个标记位点上的弓形杆菌属分支1的共有序列。在一些位点上存在单核苷酸，同时在其它位点上存在简并性，其中R可为A或G，Y可为C或T，M可为A或C，K可为G或T，S可为C或G，W可为A或T，B可为C、G或T，D可为A、G或T，H可为A、C或T，V可为A、C或G，并且N为A、C、G或T。

在表6中，在每个标记位点上的弓形杆菌属分支1共有核苷酸与弓形杆菌属分支2和分支3的每个标记位点上的共有核苷酸比较。除了分支1的共有核苷酸之外，在分支1的菌株97AE3-12、海洋弓形杆菌（Arcobacter marinus）CL-S1和嗜盐弓形杆菌（Arcobacter halophilus）LA31B中的每个标记位点上存在的核苷酸在表6中示出。这些菌株中的每一个的在全部标记位点上的核苷酸将这些菌株鉴定为弓形杆菌属分支1，同时存在弓形杆菌属分支1共有核苷酸与弓形杆菌属分支2和分支3菌种的标记位点之间的差异。

大部分鉴定的标记位点位于16S rDNA的高变区，所述位点由来自大肠杆菌16SrDNA序列的核苷酸确定：

在位点44和110之间的高变区1

在位点120和300之间的高变区2

在位点365和500之间的高变区3

在位点574和750之间的高变区4

在位点820和880之间的高变区5

在位点990和1050之间的高变区6

在位点1115和1175之间的高变区7

在位点1240和1370之间的高变区8

在位点1415和1465之间的高变区9

在16SrDNA序列中鉴定的标记序列可用于鉴定属于弓形杆菌分支1，而非属于弓形杆菌属分支2或3的微生物菌株。弓形杆菌属分支1的复合简并16SrDNA序列包含所有表6中的简并标记序列，其为SEQIDNO:40。这个简并序列包括表6中的插入/缺失位点。已知的或新分离的微生物菌株可鉴定为属于弓形杆菌属（Arcobacter sp.）分支1，这通过它们具有16S rDNA（SEQ ID NO:40）来鉴定。弓形杆菌属分支116S rDNA最常见的、或优势的共有16S rDNA序列是SEQ ID NO:39。16S rDNA序列包含表6中弓形杆菌分支2和3的所有标记序列，它们分别是SEQ ID NO:41和42。图3示出弓形杆菌分支1优势共有、弓形杆菌分支1简并共有、菌株97AE3-12、弓形杆菌分支2简并共有、和弓形杆菌分支3简并共有的16S rDNA序列的比对结果。分支1、2、和3的16S rDNA标记序列之间的差异用粗体表示并用下划线示出。

在图3A-D中的记号的解释：

无括号围绕的“N”或“-”（分别是插入或缺失）是指优势的和唯一的序列（它可为简并的，如使用的字母所示）。

[N]是指在多于一个参照序列中存在的核苷酸；它是普遍存在的，但是在我们的分离物和最接近的邻接核苷酸中也存在“-”。

（N）是指仅存在于一个参照序列中的核苷酸，并且用在该位点的“-”表示它是优势的。

实例3

RIBOPRINTING以测定菌株差异

分离自实例1的弓形杆菌属菌株：97AE3-12、97AE3-1、97AE3-3、97AE3-7、97AE4-6、97AE4-5、和97AE4-1如一般方法所述进行自动化

分析以确定这些分离菌株是否相对于彼此是独一无二的。作为参照菌株，嗜盐弓形杆菌（Arcobacter halophilus）（ATCC菌株BAA-1022）具有的16SrDNA与菌株97AE3-12具有96.4%的序列同一性，在所述分析中包括该菌株。虽然所有这些菌株彼此的16SrDNA具有显著的序列同一性，但是得到了多个独一无二的rDNARiboPrint^TM图谱。如图4所示，与16S和23S rDNA探针杂交的EcoRI限制性片段的图谱不同于弓形杆菌属代表性菌株97AE3-12（ATCCNo.PTA-11409）、97AE3-3（ATCCNo.PTA-11410）、和97AE3-1。这个分析显示围绕这些菌株的16S和23rRNA基因的基因组序列彼此不同并且也不同于测试的比较菌株嗜盐弓形杆菌（Arcobacter halophilus）。

实例4

筛选在低盐和高盐条件下，在存在油的情况下生长的细菌分离物 97AE3-12

菌株97AE3-12的培养物使用低盐基本培养基和高盐合成盐水制剂在存在油的情况下厌氧生长。使用的高盐合成盐水具有64ppt的盐浓度，该浓度约两倍于海水的盐浓度：高盐合成盐水由以下物质组成：NaCl，55.0g/L，NH₄Cl，0.1g/L，KH₂PO₄，0.05g/L，Na₂SO₄，0.1g/L，亚硒酸盐-钨酸盐溶液[NaOH，0.5g/L，Na₂SeO₃.5H₂O，6.0mg/L，Na₂WO₄.2H₂O，8.0mg/L]，1mL/L，NaHCO₃，0.2g/L，维生素溶液[维生素B12，100mg/L，对氨基苯甲酸，80mg/L，D(+)-生物素，20mg/L，烟酸，200mg/L，泛酸钙，100mg/L，盐酸吡哆素，300mg/L，硫胺素-HCl.2H₂O，200mg/L，α-硫辛酸，50mg/L]，1mL/L，SL-10痕量金属溶液[25%HCl，10mL/L，FeCl₂.4H₂O，1.50g/L，ZnCl₂，70mg/L，MnCl₂.4H₂O，100mg/L，H₃BO₃，6mg/L，CoCl₂.6H₂O，190mg/L，CuCl₂.2H₂O，2mg/L，NiCl₂.6H₂O，24mg/L，Na₂MoO₄.2H₂O，36mg/L]，1mL/L，CaCl₂.2H₂O，8.8g/L，NaNO₃，2.0g/L，KCl，0.86g/L，MgCl₂.6H₂O，6.4g/L，并补充有NaNO₃，2.0g/L，pH6.7，并且盐浓度为64ppt。

低盐培养基由以下物质组成：NaCl，10g/L，NH₄Cl，1.0g/L，KH₂PO₄，0.5g/L，KSO₄，0.1g/L，亚硒酸盐-钨酸盐溶液[NaOH，0.5g/L，Na₂SeO₃.5H₂O，6.0mg/L，Na₂WO₄.2H₂O，8.0mg/L]，1mL/L，NaHCO₃，2.5g/L，维生素溶液[维生素B12，100mg/L，对氨基苯甲酸，80mg/L，D(+)-生物素，20mg/L，烟酸，200mg/L，泛酸钙，100mg/L，盐酸吡哆素，300mg/L，硫胺素-HCl.2H₂O，200mg/L，α-硫辛酸，50mg/L]，1mL/L，SL-10痕量金属溶液[25%HCl，10mL/L，FeCl₂.4H₂O，1.50g/L，ZnCl₂，70mg/L，MnCl₂.4H₂O，100mg/L，H₃BO₃，6mg/L，CoCl₂.6H₂O，190mg/L，CuCl₂.2H₂O，2mg/L，NiCl₂.6H₂O，24mg/L，Na₂MoO₄.2H₂O，36mg/L]，1mL/L，CaCl₂.2H₂0，0.1g/L，MgCl₂.6H₂O，0.2g/L，酵母提取物，0.5g/L，和NaNO3，2.0g/L，pH6.9，并且盐浓度为15ppt。

测试低盐和高盐培养基维持弓形杆菌属97AE3-12在加入和不加入作为碳源的乳酸的情况下生长的能力，乳酸加入浓度为约1g/L（乳酸钠60%糖浆，1.3mL/L）。在培养基中加入2g/L的硝酸钠作为所有测试样品的电子受体。培养基脱气，并且加入12mL到20mL血清小瓶中。将来自Alberta，Canada的Wainwright油田井2的6.0mL脱气的、经高压釜灭菌的石油加到每个小瓶中。这种石油是缺乏乳酸的样品中唯一的碳源。在天然培养基（海盐（SigmaS9883），60.0g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母提取物5.0g/L，酪蛋白氨基酸5.0g/L，NaFeEDTA133mg/L，pH调节至介于6.4-6.6之间，并过滤除菌）中生长的0.45mL97AE3-12作为种菌被加到厌氧测试培养物中，浓度为约5×10⁷个种菌细胞/mL培养基。一式两份地制备包含97AE3-12种菌的测试培养物。制备每个测试培养基的单独未接种对照（NIC），作为非生物对照。通过IC，如一般方法所述分析硝酸盐还原度，其作为在每个培养基中细胞生长的量度。97AE3-12在25℃下，在补充有乳酸的低盐培养基中孵育的6天内将提供的硝酸盐100%还原成亚硝酸盐，并且在补充有乳酸的高盐培养基中将50-77%的硝酸盐还原成氮。在表7中的结果显示弓形杆菌属（Arcobactersp）菌株97AE3-12能够在来自Wainwright油井的石油存在的情况下，在低盐和高盐培养基中利用乳酸作为碳源生长。

表7：在石油存在的情况下，在低盐和高盐培养基中的97AE3-12培养物中的硝酸盐还原

实例5

筛选能够形成生物膜并堵塞液流的细菌分离物

如上文实例1所述，弓形杆菌菌株97AE3-12、97AE3-1、97AE3-3、97AE4-6、97AE4-5、97AE3-7、和97AE4-1分离自Canadian油层，如一般方法所述测试它们形成生物膜以抑制中等孔隙率（孔径中值=10微米）多孔玻璃过滤器中液流的能力。测试使用的高盐培养基具有以下组成：NaCl，54g/L，NH₄Cl，0.1g/L，KH₂PO₄，0.05g/L，Na₂SO₄，0.1g/L，亚硒酸盐-钨酸盐溶液[NaOH，0.5g/L，Na₂SeO₃.5H₂O，6.0mg/L，Na₂WO₄.2H₂O，8.0mg/L]，1mL/L，NaHCO₃，0.2g/L，维生素溶液[维生素B12，100mg/L，对氨基苯甲酸，80mg/L，D(+)-生物素，20mg/L，烟酸，200mg/L，泛酸钙，100mg/L，盐酸吡哆素，300mg/L，硫胺素-HCl.2H₂O，200mg/L，α-硫辛酸，50mg/L]，1mL/L，SL-10痕量金属溶液[25%HCl，10mL/L，FeCl₂.4H₂O，1.50g/L，ZnCl₂，70mg/L，MnCl₂.4H₂O，100mg/L，H₃BO₃，6mg/L，CoCl₂.6H₂O，190mg/L，CuCl₂.2H₂O，2mg/L，NiCl₂.6H₂O，24mg/L，Na₂MoO₄.2H₂O，36mg/L]，1mL/L，CaCl₂.2H₂0，8.8g/L，KCl，0.86g/L，MgCl₂.6H₂O，6.4g/L，延胡索酸二钠，3275g/L，乳酸钠，1g/L。这一培养基具有75ppt的盐浓度。

将每个弓形杆菌菌株接种到上述组成的培养基中，并厌氧孵育48小时。为了启动测试运行，将1mL48小时的培养物一式三份地加到25mL的相同培养基中。一式三份的包含接种培养基的过滤器组件在厌氧条件下分别密封在125mL孵育容器中，并且置于28℃、100rpm的培养箱/摇动器中2周。此外，制备平行于接种的测试样品的一式三份的未接种对照（其具有相同的培养基制剂，但是无接种菌株）。

在两周后，使1mL去离子水在重力作用下通过过滤器来检查流量。每个测试和对照过滤器连续测量三次水通过的时间。计算流量并将每个过滤器孵育后的值与孵育前的值进行比较。表8中的结果显示所有测试菌株与对照相比流量显著降低，对照流量平均提高了27%。流量提高是由于在浸没孵育两周后玻璃料孔的水饱和度更好导致。这些结果展示分离的弓形杆菌菌株形成生物膜并堵塞砂中的孔的能力。

表8：在与弓形杆菌分离物一起孵育两周后通过中等孔隙率玻璃过滤器的流量改变

*3个连续测量/平行测定。

1计算为（（平均孵育后，毫升/秒/孵育前，毫升/秒）-1）×100

实例6

在用乳酸作为碳源的低盐和高盐培养基中的97AE3-12弓形杆菌菌株生物膜测定

如一般方法所述，使用三种不同的培养基测定菌株97AE3-12在孔玻璃过滤器上形成生物膜的能力，所述培养基的盐浓度介于15ppt至68ppt的范围内。通过折射计测量每种培养基的盐浓度。97AE3-12在培养基中厌氧生长，所述培养基具有以下组成：

培养基1：基本盐培养基：NaCl，10g/L，NH₄Cl，1.0g/L，KH₂PO₄，0.5g/L，KSO₄，0.1g/L，亚硒酸盐-钨酸盐溶液[NaOH，0.5g/L，Na₂SeO₃.5H₂O，6.0mg/L，Na₂WO₄.2H₂O，8.0mg/L]，1mL/L，NaHCO₃，2.5g/L，维生素溶液[维生素B12，100mg/L，对氨基苯甲酸，80mg/L，D(+)-生物素，20mg/L，烟酸，200mg/L，泛酸钙，100mg/L，盐酸吡哆素，300mg/L，硫胺素-HCl.2H₂O，200mg/L，α-硫辛酸，50mg/L]，1mL/L，SL-10痕量金属溶液[25%HCl，10mL/L，FeCl₂.4H₂O，1.50g/L，ZnCl₂，70mg/L，MnCl₂.4H₂O，100mg/L，H₃BO₃，6mg/L，CoCl₂.6H₂O，190mg/L，CuCl₂.2H₂O，2mg/L，NiCl₂.6H₂O，24mg/L，Na₂MoO₄.2H₂O，36mg/L]，1mL/L，CaCl₂.2H₂0，0.1g/L，MgCl₂.6H₂O，0.2g/L，酵母提取物，0.025g/L，NaNO₃，2.0g/L，乳酸钠60%糖浆，1.3mL/L，溴百里酚蓝溶液，0.4%，3mL。这种培养基的盐浓度为15ppt。

培养基2的组成与培养基1相同，但是NaCl提高至30g/L。这种培养基的盐浓度为35ppt。

培养基3是高盐培养基，其包括较高水平的NaCl和阳离子Ca++和Mg++：NaCl，51.5g/L，NH₄Cl，0.1g/L，KH₂PO₄，0.05g/L，Na₂SO₄，0.1g/L，亚硒酸盐-钨酸盐溶液[NaOH，0.5g/L，Na₂SeO₃.5H₂O，6.0mg/L，Na₂WO₄.2H₂O，8.0mg/L]，1mL/L，NaHCO₃，0.2g/L，维生素溶液[维生素B12，100mg/L，对氨基苯甲酸，80mg/L，D(+)-生物素，20mg/L，烟酸，200mg/L，泛酸钙，100mg/L，盐酸吡哆素，300mg/L，硫胺素-HCl.2H₂O，200mg/L，α-硫辛酸，50mg/L]，1mL/L，SL-10痕量金属溶液[25%HCl，10mL/L，FeCl₂.4H₂O，1.50g/L，ZnCl₂，70mg/L，MnCl₂.4H₂O，100mg/L，H₃BO₃，6mg/L，CoCl₂.6H₂O，190mg/L，CuCl₂.2H₂O，2mg/L，NiCl₂.6H₂O，24mg/L，Na₂MoO₄.2H₂O，36mg/L]，1mL/L，CaCl₂.2H₂0，8.8g/L，酵母提取物，0.025g/L，NaNO₃，2.0g/L，乳酸钠60%糖浆，1.3mL/L，KCl，0.86g/L，MgCl₂.6H₂O，6.4g/L，溴百里酚蓝溶液，0.4%，1mL。这种培养基的盐浓度为68ppt。

如一般方法所述，在孵育2周后进行实验和流量测试。一式三份地制备接种有弓形杆菌属97AE3-12的培养基；一式两份地制备未接种的对照。虽然在对照中流量如实例5一样提高，菌株97AE3-12引起流量的显著降低（表9）。在对照处理中的流量对于培养基1、2和3分别提高了平均54、35和46%。包含97AE3-12种菌的测试处理显示培养基1、2和3的流量分别降低了平均80、80和46%，所述培养基分别具有15、35和68ppt的盐浓度。

表9：在孵育两周后通过中等孔隙率玻璃过滤器的流量改变。

*3个连续测量

实例7

二氧化硅颗粒的聚集

如一般方法所述测试弓形杆菌菌株97AE3-12聚集结晶二氧化硅的能力。测试使用的培养基具有以下组成：NaCl，54g/L，NH₄Cl，0.1g/L，KH₂PO₄，0.05g/L，Na₂SO₄，0.1g/L，亚硒酸盐-钨酸盐溶液[NaOH，0.5g/L，Na₂SeO₃.5H₂O，6.0mg/L，Na₂WO₄.2H₂O，8.0mg/L]，0.5mL/L，NaHCO₃，0.1g/L，维生素溶液[维生素B12，100mg/L，对氨基苯甲酸，80mg/L，D(+)-生物素，20.00mg/L，烟酸，200mg/L，泛酸钙，100mg/L，盐酸吡哆素，300mg/L，硫胺素-HCl.2H₂O，200mg/L，α-硫辛酸，50mg/L]，1.0mL/L，SL-10痕量金属溶液[25%HCl，10mL/L，FeCl₂.4H₂O，1.50g/L，ZnCl₂，70mg/L，MnCl₂.4H₂O，100mg/L，H₃BO₃，6mg/L，CoCl₂.6H₂O，190mg/L，CuCl₂.2H₂O，2mg/L，NiCl₂.6H₂O，24mg/L，Na₂MoO₄.2H₂O，36mg/L]，1.0mL/L，CaCl₂.2H₂0，4.4g/L，0.25g酵母提取物，0.5g酪蛋白胨，KCl，0.86g/L，MgCl₂.6H₂O，6.4g/L，和柠檬酸钠，1g/L。分离培养基具有作为电子受体的NaNO₃，2g/L或延胡索酸钠，3.7g/mL。盐浓度为64ppt。

每个培养基的一式两份的样品用菌株97AE3-12的200μL有氧培养物接种。一式两份的对照管未被接种。在30℃下静置孵育所述管7天。在七天后一式两份的接种管和一式两份的未接种对照管的平均OD600为约0.04。当处理管涡旋剧烈混合10秒时，由于之前沉降到管底部的结晶二氧化硅的重悬浮，浊度大幅提高。在混合后通过测量OD600检测由于结晶二氧化硅随时间沉降引起的浊度下降。表10中的结果显示在接种处理中的浊度下降要比对照中的浊度下降快得多，这由在混合1分钟和10分钟后接种培养物对对照的OD600减小百分比指示。

这是由于在接种处理中二氧化硅颗粒形成直径高达100微米的大团块导致，其直径通过显微镜检查测定，所述大团块比未接种的对照管中分散的、未聚集的2-20μ颗粒沉降更快。二氧化硅颗粒的对比结果显示菌株97AE3-12与邻近的结晶二氧化硅颗粒形成强粘附相互作用，导致颗粒结块。在硝酸盐和延胡索酸盐培养基中均发生菌株97AE3-12培养物的聚集，然而更多的聚集发生在硝酸盐作为电子受体的情况下。

表10：由于微生物诱导的颗粒聚集导致的二氧化硅颗粒沉降。

实例8

对照细管压降测量

在一般方法中描述的细管装置用于测量对照沙土样品随时间的压力变化。已经过滤除菌的盐水1连续向细管9a进料8天，同时测量经过所述细管的压降（在图7中第4天至第12天）。压降保持为约3psi（0.0207兆帕斯卡）。这示出在细管中填砂、同时灌满过滤过的注入盐水的模型的稳定性，因为实验未观察到通过细管的压降变化。这与下文实例9和10中所述的处理细管形成对比，它们显示由于微生物处理导致的显著压降变化。

实例9

接种的分批给料细管的压降测量

实例8的细管9a用60mL活性注入水（未经过滤除菌的盐水1）以15mL/小时的流量预接种4小时。在经这种预接种后，从细管9a中收集流出样品并测量细胞数，并且在表11中示出（细胞计数1：9a）。

在用未经过滤的活性注入水（盐水1）预接种一天后，细管用菌株97AE3-12（ATCCNO:PTA-11409）接种。用未经过滤的活性注入水1:1稀释的菌株97AE3-12的生长培养物在盐水5中生长并在室温下搅拌孵育48小时，然后在盐水5中1:30稀释以接种细管9a。测定这一种菌的细胞数并在表11中显示（细胞计数2：9a）。以约0.25mL/min的流量将50mL体积的这种种菌泵入细管。细管接种过程需要约4小时来完成。在接种后，细管封闭6天。在封闭6天后采集流出样品，并且测量细胞数并在表11中示出（细胞计数3：9a）。

起始于第20天，当老化期结束时，每周两次（每隔3或4天一次）地以3.6mL/小时的流量、4至8小时的脉冲将盐水2进料到细管9a中，持续约25天（在第45天结束，图8）。通过脉冲给料法，测量通过细管9的压降。在第20和24天进行四小时的脉冲给料。在第27、32、34、41、和44天进行八小时的脉冲给料。在每次这些营养物质脉冲给料之间，以3.6mL/小时的流量进料盐水1。压降初始为约3psi（0.0207兆帕斯卡）。在开始脉冲给料于细管9a后十天，压降有可识别的提高，它变得随时间而较明显的（图8）。在第45天的实验末期，压降几乎3倍于对照（实例8）。在这个时间点采集流出样品并测量细胞数，细胞数在表11中示出（细胞计数4：9a）。压力的这种大幅提高证明弓形杆菌属97AE3-12（ATCCNO:PTA-11409）当以分批补料方式提供营养物质时，有效地改变多孔岩层渗透性的潜力。

实例10

连续补料芯填砂细管和压降测量

细管9b（一般方法）用来自测试井位的活性注入水（未过滤的盐水1）、在细管流出物中的细胞计数样品（表11，细胞计数1：9b）预接种，并用如实例9所述的菌株97AE3-12接种，不同的是弓形杆菌属菌株97AE3-12不用未过滤的注入盐水1进行1:1稀释。在这一种菌中测量细胞数并在表11中示出（细胞计数2：9b）。在用弓形杆菌属菌株97AE3-12接种后，细管9b如上老化6天。采集流出样品并在接种后测量细胞数，细胞数在表11中示出（细胞计数3：9b）。实验期间盐水2营养物质以3.6mL/小时连续进料到细管9b中，同时测量通过其的压降（图9）。初始压降为约2psi（0.0137兆帕斯卡），如图9所示（参见第20天）。到第32天，与在第20天的初始压降相比，观察到的细管9b压降已经提高了约2至3个因数。在第32.8天，由于泵失效，终止了盐水2的给料。为了重启所述泵，已经以高流量灌注了泵。这种泵灌注操作似乎减少了压降，如图9中在第32.8天后所见。然而，在第33天后，再次以3.6mL/小时的流量进行营养物质盐水3进料，并且压降再次攀升，使得与在第20天的初始压降相比，在第45天的实验末期的压降高了约2个因数。在这个时间点采集流出样品并测量细胞数，细胞数在表11中示出（细胞计数4：9b）。压力的这种大幅提高证明弓形杆菌属97AE3-12（ATCCNO:PTA-11409）当以连续补料方式提供营养物质时，有效地改变多孔岩层渗透性的潜力。

表11：在不同细管实验样品中的细胞计数