MX2013003185A - Precursores novedosos de compuestos analogos de colina radiomarcadores. - Google Patents

Precursores novedosos de compuestos analogos de colina radiomarcadores.

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Eric Ofori Aboagye
Graham Smith
Yongjun Zhao
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Abstract

La presente invención describe intermediarios, pre-cursores, para la preparación de análogos de colina radiomarcados que serán utilizados como trazadores radioactivos para la imagenología de Tomografía de Emisión de Positrón (PET) o Tomografía Computarizada por Emisión de Fotones Individuales (SPECT) de enfermedades.

Description

PRECURSORES NOVEDOSOS DE COMPUESTOS ANALOGOS DE COLINA RADIOMARCADOS Campo de la Invención La presente invención describe trazadores radiactivos novedosos para la Imagenología 'de Tornografía de Emisión de Positrón (PET) o de Tornografía Computarizada por Emisión de Fotones Individuales (SPECT) de estados de enfermedad relacionados con metabolismo alterado de colina (por ejemplo, formación de imágenes de tumor de próstata, mama, cerebro, esófago, ovario, endometrio, pulmón y de próstata - tumor primario, enfermedad nodal o metástasis). ¿' La presente invención también i* describe intermediarios, precursores, composiciones farmacéuticas, métodos para elaboración, y métodos para usar los trazadores radioactivos novedosos.
Descripción de la Técnica Relacionada El producto biosintético de la actividad de la colina quinasa (EC 2.7.1.32), fosfocolina, se eleva en varios cánceres y es un precursor para fosfatidilcolina de la membrana (Aboagye, E.O., et al., Cáncer Res 1999; 59:80-4; Exton, J.H., Biochim Biophys Acta 1994; 1212:26-42; George, T.P., er al., Biochim Biophys Acta 1989; 104:283-91; y Teegarden, D., er al., J. Biol Chem 1990; 265(11 ):6042-7). La sobre-expresión de la colina quinasa y la actividad enzimática incrementada se han reportado en cánceres de próstata, mama, pulmón, ovarlo y colon (Aoyama, C, et al., Prog Lipid Res 2004; 43(3):266-81 ; Glunde, K., er al., Cáncer Res 2004; 64(12):4270-6; Glunde, K., et al., Cáncer Res 2005; 65(23): 11034-43; lorio, E., et al., Cáncer Res 2005; 65(20): 9369-76; Ramírez de Molina, A., et al., Biochem Biophys Res Commun 2002; 296(3): 580-3; y Ramírez de Molina, A., er al., Lancet Oncol 2007; 8(10): 889-97) y son responsables en gran medida de mayores niveles de fosfocolina con transformación y progreso malignos; mayores niveles de fosfocolina en células cancerígenas se deben también a una mayor interrupción mediante fosfolipasa C (Glunde, K., et al., Cáncer Res 2004; 6 ( 12) : 4270-6) .
Debido a este fenotipo, junto con la excreción urinaria reducida, la [11C]colina ha llegado a convertirse en un prominente trazador radiactivo para imagenología de Tomografía de Emisión de Positrón (PET) o de Tomografía Computarizada por PET (PET-CT) de cáncer de próstata, y a una formación de imágenes en menor grado de cáncer de cerebro, esofágico y de pulmón (Hará, T., et al., J Nucí Meó 2000; 41:1507-13; Hará, T., eí al., J Nucí Meó 1998; 39:990-5; Hará, T., er al., J Nucí Med 1997; 38:842-7; Kobori, O., et al., Cáncer Cell 1999; 86:1638-48; Pieterman, R.M., er al., J Nucí Med 2002; 43(2):167-72; y Reske, S.N. Eur J Nucí Med Mol Imaging 2008; 35:1741). La señal específica de PET se debe al transporte y la fosforilación del trazador radioactivo para [11 CJfosfocolina mediante colina quinasa.
Es interesante, sin embargo que la [ 1C]colina (así como el análogo flúor) se oxida a [1 C]betaína mediante colina oxidasa (véase la Figura 1 posterior) (EC 1.1.3.17) principalmente en tejidos de riñon e hígado, con metabolitos detectables en plasma inmediatamente después de la inyección del trazador radioactivo (Roivainen, A., et al., European Journal of Nuclear Medicine 2000; 27:25-32). Esto es distinto de las contribuciones relativas del trazador radioactivo principal y catabolitos difíciles cuando se utiliza un último protocolo de formación de imágenes.
Incorporación de 11C-Colina lina Excreción betaína Figura 1: Estructuras químicas de metabolitos de colina mayores y sus trayectorias. [18F]Fluorometilcolina ([ 8F]FCH): FCH se desarrolló para superar la vida media física corta de carbono-11 (20.4 minutos) (DeGrado, T.R., et al., Cáncer Res 2001; 61 (1 ): 110-7) y se ha publicado un número de estudios de PET y PET-CT con este trazador radioactivo relativamente nuevo (Beheshti, M., et al., Eur J Nucí Meó Mol Imaging 2008;35(10): 1766-74; Cimitan, M . , et al., Eur J Nucí Med Mol Imaging 2006; 33( 12): 1387-98; de Jong, I.J., ef al., Eur J Nucí Med Mol Imaging 2002; 29:1283-8; y Price, D.T., et al., J Urol 2002; 168(1 ):273-80). La vida media prolongada del flúor-18 (109.8 minutos) se consideró potencialmente ventajosa para permitir la última formación de imágenes de tumores cuando ha ocurrido suficiente supresión de trazador parental en la circulación sistémica (DeGrado, T.R., ef al., J Nucí Med 2002; 43(1):92-6).
WO2001/82864 describe análogos de colina 18F-etiquetada, incluyendo [18]Fluorometilcolina ([18F]-FCH) y su uso como agentes de formación de imágenes (por ejemplo, PET) para la detección y ubicación no invasiva de neoplasmas y patofisiologías que afectan el procesamiento de la colina en el cuerpo (Extracto). La WO2001 /82864 también describe análogos de colina di-deuterados tales como [18F]fluorometil-[1-2H2]colina ([18F]FDC)(más adelante referido como "[18F]D2-FCH"): FDC Se ha estudiado la oxidación de colina bajo varias condiciones; incluyendo la estabilidad oxidativa relativa de colina y [1.2-2H4]colina (Fan, F., et al., Biochemistry 2007, 46, 6402-6408; Fan, F., et al., Journal of the American Chemical Society 2005, 127, 2067-2074; Fan, F., et al., Journal of the American Chemical Society 2005, 127, 17954-17961; Gadda, G. Biochimica et Biophysica r Acta 2003, 1646, 112-118; Gadda, G., Biochimia et Biophysica Acta 2003, 1650, 4-9). Teóricamente, se encontró que la sustitución extra de deuterio es insignificante en el contexto de un efecto de isótopo primario de 8-10 ya que el efecto e isótopo ß-secundario es -1.05 (Fan, F., et al., Journal of the American Chemical Society 2005, 127, 17954-17961 ).
La [ 8F]Fluorometilcolina se utiliza ahora ampliamente en la clínica para procesar imágenes del estado del tumor (Beheshti, M., et al., Radiology 2008, 249, 389-90; Beheshti, M . , et al., Eur J Nucí Med Mol Imaging 2008, 35, 1766-74).
La presente invención, como se describe posteriormente, proporciona un compuesto precursor novedoso. Estos compuestos precursores novedosos pueden ser utilizados en la síntesis de, por ejemplo, trazadores radioactivos 18F-radiomarcados, los cuales a su vez pueden ser utilizados para la imagenología PET de metabolismo de colina.
Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 describe las estructuras químicas de metabolitos de colina mayores y sus trayectorias.
La Figura 3 muestra análisis de NMR del precursor de colina tetra-deuterado. Parte superior, espectro de 1H NMR; parte inferior, espectro de 13C NMR. Se adquirieron ambos espectros en CDCI3.
La Figura 4 describe los perfiles de HPLC para la síntesis de tosilato de [18F]fluorometilo (9) y [18F]fluorometil-[1 ,2-2H,]colina (D4-FCH) que muestra (A) un perfil de radio-HPLC para la síntesis de (9) después de 15 minutos; (B) perfil de UV (254 nm) para la síntesis de (9) después de 15 minutos; (C) perfil de radio-HPLC para la síntesis de (9) después de 10 minutos; (D) perfil de radio-HPLC para (9) sin purificar; (E) perfil de radio-HPLC de (9) formulado para inyección; (F) perfil de índice refractivo después de la formulación (modo de detección de catión).
La Figura 5a es una representación de un cásete completamente ensamblado de la presente invención para la producción de [ 8F]fluorometil-[1 ,2-2H4]colina (D4-FCH) mediante un precursor desprotegido.
La Figura 5b es una representación de un cásete completamente ensamblado de la presente invención para la producción de [18F]fluorometil-[1 ,2-2H4]colina (D4-FCH) mediante un precursor protegido con PMB.
La Figura 6 describe análisis de radio-HPLC representativo de un estudio de oxidación de permanganato de potasio. La hilera superior son muestras control para [18F]fluorometilcolina ([18F]FCH) y [18F]fluorometil-[1 ,2-2H4]colina ([ 8F]D4-FCH) , extractos a partir de la mezcla de reacción en el punto cero (0 minutos). La hilera inferior son extractos después del tratamiento durante 20 minutos. El lado izquierdo son para la [ 8F]fluorometilcolina ([ 8F]FCH), el derecho son para [18F]fluorometil-[1 ,2-2H4]colina ([18F]D4-FCH).
La Figura 7 muestra potencial de oxidación química de [18F]fluorometilcolina y [18F]fluorometil-[1 ,2-2H4]colina en presencia de permanganato de potasio.
La Figura 8 muestra un ensayo de estabilidad en la evolución de la [18F]fluorometilcolina y [ 8F]fluorometil-[1 ,2-2H4]colina en presencia de colina oxidasa que demuestra la conversión de compuestos parentales a sus respectivos análogos de betaína.
La Figura 9 muestra análisis de radio-HPLC representativo de un estudio de colina oxidasa. Las hileras superiores son muestras control para [18F]fluorometilcolina y [18F]fluorometil-[1 ,2-2H4]colina, extractos a partir de la mezcla de reacción en el punto cero (0 minutos). Las hileras inferiores son extractos después del tratamiento durante 40 minutos. Los lados izquierdos son de [18F]fluorometilcolina, los derechos son de [ 8F]fluorometil-[1 ,2-2H ]colina.
La Figura 10. Superior: El análisis del metabolismo de [18F]fluorometilcolina (FCH) a [18F]FCH-betaína y [18F]fluorometil-(1 ,2-2H4]colina (D4-FCH) a [ 8F]D4-FCH-betaína mediante radio-HPLC en muestras de plasma en ratones obtenidas 15 minutos después de inyectar los trazadores i.v. en los ratones. Inferior: el í resumen de la conversión de trazadores parentales, [18F]fluorometilcolina (FCH) y [ 8F]fluorometil-[1 ,2-2H4]colina (D4- FCH), para metabolitos, [18F]FCH-betaína (FCHB) y [ 8F]D4-FCH betaína (D4-FCHB), en plasma.
La Figura 11. La evolución de la biodistribución de [ 8F]fluorometilcolina (FCH), [18F]fluorometil-[1 -2H2]colina (D2-FCH) y [18F]fluorometil-[1 ,2-2H4]colina (D4-FCH) en ratones que padecen tumor HCT-116. Inserción: los periodos seleccionados para la evaluación. A) Biodistribución de [18F]fluorometilcolina; B) biodistribución de [18F]fluorometil-[1 -2H2]colina; C)biodistribución de [ 8F]fluorometil-[1 ,2- H4]colina; D) evolución de la incorporación del tumor para [ 8F]fluorometilcolina (FCH), [18F]fluoromet¡l-[1 -2H2]colina (D2-FCH) y [ 18F]f I u oro m et i l-[ 1 , 2 -2H4] co I i n a (D4-FCH) a partir de las gráficas A-C. Aproximadamente 3.7 MBq de f18F]f luorometilcolina (FCH), [18F]fluorometil-[1-2H2]colina (D2-FCH) y [ 8F]fluorometil-[1 ,2- H4]colina (D4-FCH) inyectada en ratones C3H-Hej machos despiertos los cuales fueron sacrificados bajo anestesia con isofluorano en los periodos indicados.
La Figura 12 muestra cromatografías de radio-HPLC que muestran la distribución de metabolitos de trazadores radioactivos de colina en tejido cosechado de ratones blancos normales en 30 minutos p.i. Hilera superior, estándares de trazador radioactivo; hilera media, extractos de riñon; hilera inferior; extractos de hígado. En la izquierda es [ 8F]FCH, en la derecha [18F]D4-FCH.
La Figura 13 muestra cromatogramas de radio-HPLC que muestran la distribución de metabolitos de trazadores radioactivos de colina en tumores HCT116 30 minutos después de la inyección.
Hilera superior, estándares de trazador radioactivo reales; hilera inferior, 30 minutos de extractos tumorales. Lado izquierdo, [ 8F]FCH; parte media, [18F]D4-FCH; derecho, [11C]colina.
La Figura 14 muestra cromatogramas de radio-HPLC para validación de HPLC de fosfocolina utilizando células HCT116. Izquierda, estándar real de [18F]FCH; parte media, incubación de enzima fosfatasa; derecha, incubación control.
La Figura 15 muestra la distribución de radiometabolitos para análogos de [18F]fluorometilcolina: 18F]fluorometilcolina, [18F]fluorometil-[1-2H2]colina y [18F]fluorometil-[1 ,2-2H4]colina en periodos seleccionados.
La Figura 16 muestra el perfil de tejido de [18F]FCH y [18F]D4-FCH. (a) Curva de tiempo contra radiactividad para la incorporación de [18F]FCH en hígado, riñon, orina (vejiga) y músculo derivado de datos PET, y (b) datos correspondientes para [ 8F]D4-FCH. Los resultados son el SE ± de la media; n = 4 ratones. Se han utilizado para barras de error superior e inferior de claridad (SE). (Leyton, et al., Cáncer Res 2009: 69:(19), pp 7721-7727).
La Figura 17 muestra el perfil de tumor de [18F]FCH y [18F]D4-FCH en xenoinjerto de tumor SKMEL28. (a) Imágenes típicas de [18F]FCH-PET y [18F]D4-FCH-PET de ratones que padecen de tumor SKMEL28 que muestran secciones transversales de 0.5 mm a través del tumor y las secciones coronales a través de la vejiga. Para visualízación , se desplegaron datos de imágenes agregados 30 a 60 minutos. Las flechas apuntan a los tumores (T), hígado (L) y vejiga (B). (b). La comparación de curvas de tiempo contra radioactividad para [ 8F]FCH y [18F]D4-FCH en tumores. Para cada tumor, se determinó la radioactividad en cada uno de los 19 periodos de tiempo. Los datos son % ID/vox6o promedio SE ± de la media (n= 4 ratones por grupo), (c) El resumen de variables de formación de imágenes. L os datos son SE ± de la media, n = 4; *P = 0.04. Para claridad se han utilizado barras de error superior e inferior (SE).
La Figura 18 muestra el efecto de PD0325901, un inhibidor de quinasa extracelular mitogénico, en la incorporación de [18F]D4-FCH en tumores y células HCT116. (a) Curvas de tiempo contra radioactividad normalizadas en tumores HCT116 después del tratamiento diario durante 10 días con vehículo o 25 mg/kg de PD0325901. Los datos son el SE ± de la media; n = 3 ratones, (b) Resumen de variables de formación de imágenes % ID/vox6o, % ID/vox6omax, y AUC. Los datos son SE ± promedio; * P = 0.05 (c) Efecto celular intrínseco de PD0325901 (1 µ?) en [18F]D4-FCH de metabolismo de fosfocolina después de tratar células HCT116 durante 1 hora con [18F]D4-FCH en cultivo. Los datos son SE ± promedio; n = 3; * P = 0.03.
La Figura 19 muestra la expresión de la colina quinasa A en tumores HCT116. (a) Una tinción Western típica demuestra el efecto de PD0325901 en la expresión de proteína de colina quinasa A (CHKA) en tumor. Los tumores HCT116 de ratones que fueron inyectados con PD0325901 (25 mg/kg diariamente durante 10 días, en forma oral) o vehículo fueron analizados para expresión CHKA mediante tinción Western. Se utilizó ß-actina como el control de carga, (b) Resumen de mediciones de densitómetro para expresión de CHKA expresada como una relación a ß-actina. Los resultados son las relaciones promedio de SE ±; n = 3, * P = 0.05.
Breve Descripción de la Invención presente invención proporciona un compuesto Fórmula (II): (?) en donde: Ri. 2, R3 y R4 son cada uno independientemente hidrógeno o deuterio (D); R5, e y R7 son cada uno independientemente hidrógeno, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8)2 o -CD(R8)2; R8 es independientemente hidrógeno, -OH, -CH3, -CF3l -CH2OH, -CH2F, -CH2CI, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2CI, CD2Br, CD2I o -C6H5; y m es un número entero de 1-4.
La presente invención además proporciona un método para hacer un compuesto precursor de la Fórmula (II). la presente invención además proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto precursor de la Fórmula (II) y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona un compuesto análogo de colina radioetiquetada novedosa de la fórmula (I): (i) en donde: R i , 21 R3 y son cada uno independientemente hidrógeno o deuterio (D); R5, 6 y R? son cada uno independientemente hidrógeno, R8, -(CH2)mRB, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, -CH(R8)2, o -CD(R8)2; R8 es independientemente hidrógeno, -OH, -CH3l -CF3> -CH2OH, -CH2F, -CH2CI, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, -CD2CI, CD2Br, CD2I o -C6H5; m es un número entero de 1-4; X e Y son cada uno independientemente hidrógeno, deuterio (D) o F; Z es un halógeno seleccionado de F, Cl, Br e I o un radioisótopo; y Q es un contraión aniónico; con la condición de que el compuesto de la fórmula (I) no sea fluorometilcolina, fluorometil-etil-colina, fluorometil-propil-colina, fluorometil-butil- colina, fluorometil-pentil-colina, fluorometil-isopropil-colina, fluorometil-isobutil-colina, fluorometil-sec-butil-colina, fluorometil-dietil-colina, f luorometil-dietanol-colina, fluorometil-bencil-colina, fluorometil-trietanol-colina, 1,1-dideuterofluorometilcolina, 1,1-dideutero fluorometil-etil-colina, 1,1-dideuterofluorometil-propil-colina o un análogo [18F] del mismo.
En una modalidad preferida de la invención, se proporciona un compuesto de la Fórmula (I), en donde: Ri, R2, R3 y R son cada uno independientemente hidrógeno; R5, Re y 7 son cada uno independientemente hidrógeno, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, -CH(R8)2 o -CD(R8)2; R8 es independientemente hidrógeno, -OH, -CH3l -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2CI, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, -CD2F, CD2CI, CD2CI, CD2Br, CD2I o -C6H5; m es un número entero de 1-4; X e Y son cada uno independientemente hidrógeno, deuterio (D) o F; Z es un halógeno seleccionado de F, Cl, Br e I o un radioisótopo; Q es un contraión aniónico; con la condición de que el compuesto de la fórmula (I) no sea fluorometilcolina, fluorometil-etil-colina, fluorometil-propil-colina, fluorometil-butil-colina, fluorometil-pentil-colina, fluorometil- ¡sopropil-colina, fluorometil-isobutil-colina, fluorometil-sec-butil-colina, fluorometil-dietil-colina, fluorometil-dietanol-colina, fluorometil-bencil-colina, fluorometil-trietanol-colina o un análogo de [ 8F) del mismo.
En una modalidad preferida de la invención, se proporciona un compuesto de la Fórmula (I), en donde: R^ y R2 son cada uno hidrógeno; R3 y 4 son cada uno deuterio (D)¡ R5, e y R7 s on cada uno independientemente hidrógeno, R8, -(CH2)mR8, -CH(R8)2 o -CD(R8)2; Ra es independientemente hidrógeno, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2CI, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2CI, CD2Br, CD2I o -C6H5; m es un número entero de 1-4; X e Y son cada uno independientemente hidrógeno, deuterio (D) o F; Z es un halógeno seleccionado de F, Cl, Br e I o un radioisótopo; Q es un contraión aniónico; con la condición de que el compuesto de la fórmula (I) no sea 1,1-dideuterofluorometilcolina, 1,1-dideuterofluorometil-etil-colina, 1 , 1 -dideuterofluorometil-propil-colina o un análogo de [18F] del mismo.
En una modalidad preferida de la invención, se proporciona un compuesto de la Fórmula (I), en donde: R i , R2, 3 y R son cada uno deuterio (D); R5, R6 y R7 son cada uno independientemente hidrógeno, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, -CH(R8)2 o -CD(R8)2; R8 es independientemente hidrógeno, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2CI, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, -CD2CI, CD2Br, CD2I o -C6H5; m es un número entero de 1-4; X e Y son cada uno independientemente hidrógeno, deuterio (D) o F; Z es un halógeno seleccionado de F, Cl, Br e I o un radioisótopo; y Q es un contraión aniónico; De acuerdo con la presente invención, cuando Z de un compuesto de la Fórmula (I) como se describe en la presente es un halógeno, puede ser un halógeno seleccionado de F, Cl, Br e I; de preferencia, F.
De acuerdo con la presente invención, cuando Z de un compuesto de la Fórmula (I) como se describe en la presente es un radioisótopo (más adelante referido como un "compuesto radioetiquetado de la Fórmula (I)"), puede ser cualquier radioisótopo conocido en la técnica. De preferencia, Z es un radioisótopo adecuado para formación de imágenes (por ejemplo, PET, SPECT"). Más preferiblemente Z es un radioisótopo adecuado para formación de imágenes de PET. Aún incluso de preferencia, Z es 8F, 76Br, 1Z3I, 12 o 125l. Incluso más preferiblemente, Z es 18F.
De acuerdo con la presente invención, Q de un compuesto de la Fórmula (I) como se describe en la presente puede ser cualquier contraión aniónico conocido en la técnica adecuado para compuestos de amonio catiónico. Ejemplos adecuados de Q incluyen aniónico: bromuro (Br"), cloruro (CI ), acetato (CH3CH2C(0)0"), o tosilato ("OTos). En una modalidad preferida de la invención, Q es bromuro (Br") o tosilato ("OTos). En una modalidad preferida de la invención, Q es cloruro (CI') o acetato (CH3CH2C(0)0 ). En una modalidad preferida de la invención, Q es cloruro (CI ).
De acuerdo con la invención, una modalidad preferida de un compuesto de la Fórmula (I) es el siguiente compuesto de la Fórmula (la): (la) en donde: Ri, F*2> R3 y R4 son cada uno independientemente deuterio (D); R5, R6 y R7 son cada uno hidrógeno; X e Y son cada uno independientemente hidrógeno; Z es 18F; Q es CI".
De acuerdo con la invención, un compuesto preferido de la Fórmula (la) es [18F]fluorometil-[1 ,2-2H4]-colina ([18F]-D4-FCH). [18F]- D4-FCH es un análogo de fluorocolina metabólicamente estable (FCH). [18F]-D4-FCH ofrece numerosas ventajas sobre el análogo 18F-no-deuterado y/o 18F-di-deuterado correspondiente. Por ejemplo, [18F]-D4-FCH exhibe estabilidad oxidativa química y enzimática incrementada relativa con [18F]fluorometilcolina. [18F]-D4-FCH tiene un perfil in vivo mejorado (es decir, exhibe mejor disponibilidad para formación de imágenes in vivo) con relación dideuterofluorocolina, [18F]fluorometil-[1 -2H2]colina, que está encima y arriba lo que podría predecirse mediante precedencia de literatura y es, de este modo, inesperado. [18F]-D4-FCH exhibe una estabilidad mejorada y por consiguiente permitirá mejorar la formación de imágenes tardía de tumores después de suficiente supresión del trazador radioactivo a partir de la circulación sistémica. [18F]-D4-FCH también mejora la sensibilidad de formación de imágenes de tumor a través de la biodisponibilidad incrementada del sustrato. Estas ventajas se discuten en detalle adicional posteriormente.
La presente invención además proporciona un compuesto precursor de la Fórmula (III): (??) en donde: Ri, R2, R3 y R4 son cada uno independientemente hidrógeno o deuterio (D); R5, Re y 7 son cada uno independientemente hidróg eno , Re, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, -CH(R8)2, o -CD(R8)2; R8 es independientemente hidrógeno, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2CI, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, -CD2CI, CD2Br, CD2I o -C6H5; m es un número entero de 1-4; C* es un radioisótopo de carbono; X, Y y Z son cada uno independientemente hidrógeno, deuterio (D), un grupo halógeno seleccionados de F, Cl, Br e lr alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo; y Q es un contraión aniónico; con la condición de que el compuesto de la Fórmula (III) no sea 11C-colina.
De acuerdo con la invención, C* del compuesto de la fórmula (III) puede ser cualquier radioisótopo del carbono. Ejemplos adecuados de C* incluyen, aunque no se limitan a, 11C, 13C y 4C. Q es como se describe para el compuesto de la Fórmula (I).
En una modalidad preferida de la invención, se proporciona un compuesto de la Fórmula (III) en donde C* es 11C; X e Y son cada uno hidrógeno; y Z es F.
Composición Farmacéutica o Radiofarmacéutica La presente invención proporciona una composición farmacéutica o radiofarmacéutica que comprende un compuesto para la Fórmula (I), incluyendo un compuesto de la Fórmula (la), cada una como se define en la presente junto con un portador, excipiente o portador biocompatible farmacéuticamente aceptable. De acuerdo con la invención, cuando Z de un compuesto de la Fórmula (I) o (la) es un radioisótopo, la composición farmacéutica es una composición radiofarmacéutica.
La presente invención además proporciona una composición farmacéutica o radiofarmacéutica que comprende un compuesto para la Fórmula (I), incluyendo un compuesto de la Fórmula (la), cada uno como se define en la presente junto con un portador, excipiente o portador biocompatible farmacéuticamente aceptable adecuado para administración a mamíferos.
La presente invención proporciona una composición farmacéutica o radiofarmacéutica que comprende un compuesto para la Fórmula (III), como se define en la presente junto con un portador, excipiente o portador biocompatible farmacéuticamente aceptable.
La presente invención además proporciona un compuesto para la Fórmula (III), como se define en la presente junto con un portador, excipiente o portador biocompatible farmacéuticamente aceptable para administración a mamíferos.
Como se entiende por alguien con e xperiencia en la técnica, el portador o excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser cualquier portador o excipiente farmacéuticamente aceptable conocido en la técnica.
El "portador biocompatible" puede ser cualquier fluido, especialmente un líquido, en el cual un compuesto de la Fórmula (I), (la) o (III) puede suspenderse o disolverse, de manera que la composición farmacéutica sea fisiológicamente tolerable, por ejemplo, puede administrarse al cuerpo del mamífero sin toxicidad o molestias indebidas. El portador biocompatible es apropiadamente un líquido portador inyectable tal como agua para inyección libre de pirógenos, estéril, una solución acuosa tal como solución salina (la cual puede equilibrarse ventajosamente de manera que el producto final para inyección es ya sea isotónica o no hipotónica); una solución acuosa de una o más sustancias de ajuste de tonicidad (por ejemplo, sales de cationes de plasma con contraiones biocompatibles), azúcares (por ejemplo, glucosa o sacarosa), alcoholes de azúcar (por ejemplo, sorbitol o manitol), glicoles (por ejemplo, glicerol), u otros materiales de poliol no iónicos (por ejemplo, polietilenglicoles, propilenglicoles y similares). El portador biocompatible puede también comprender solventes orgánicos biocompatibles tal como etanol. Tales solventes orgánicos son útiles para solubilizar compuestos o formulaciones más lipofílicos. De preferencia, el portador biocompatible es agua para inyección libre de pirógenos, solución salina isotónica o una solución de etanol acuoso. El pH del portador biocompatible para inyección intravenosa está apropiadamente en el rango de 4.0 a 10.5.
La composición farmacéutica o radiofarmacéutica puede administrarse parenteralmente, es decir mediante inyección, y de mayor preferencia una solución acuosa. Tal composición puede opcionalmente contener además ingredientes tales como reguladores de pH; solubilizantes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, ciclodextrinas o tensoactivos tales como Pluronic, Tween o fosfolípidos); estabilizadores farmacéuticamente aceptables o antioxidantes (tal como ácido ascórbico, ácido gentísico o ácido para-aminobenzoico). En el caso en donde se proporciona un compuesto de la Fórmula (I), (la) o (III) como una composición radiofarmacéutica, el método para preparación del compuesto puede además comprender las etapas requeridas para obtener una composición radiofarmacéutica, por ejemplo, la remoción de solvente orgánico, la adición de un amortiguador biocom patible y cualquier ingredientes adicionales opcionales. Para administración parenteral, necesitan también incorporarse las etapas para asegurar que la composición radiofarmacéutica sea estéril y apirogénica. Tales etapas son bien conocidas por aquellos con experiencia en la técn ica .
Preparación de un Compuesto de la Invención La presente invención proporciona un método para preparar un compuesto para la Fórmula (I), incluyendo un compuesto de la Fórmula (la), en donde el método comprende la reacción del compuesto precursor de la Fórmula (II) con un compuesto de la Fórmula (Illa) para formar un compuesto de la Fórmula (I) (Esquema A): Esquema A en donde los compuestos de las Fórmulas (I) y (II) son cada uno como se describe en la presente y el compuesto de la Fórmula (Illa) es como sigue: ZXYC-Lg (Illa) en donde X, Y y Z son cada uno como se define en la presente para un compuesto de la Fórmula (I) y "Lg" es un grupo saliente. Ejemplos adecuados de "Lg" incluyen, aunque no se limitan a, bromuro (Br) y tosilato (OTos). Un compuesto de la Fórmula (Illa) puede prepararse mediante cualesquiera medios conocidos en la técnica incluyendo aquellos descritos en la presente.
La síntesis de un compuesto de la Fórmula (Illa) en donde Z es F; X e Y son ambos H y el Lg es OTos (es decir, fluorometiltosilato) puede lograrse como se establece en el Esquema 3 posteriormente: Esquema 3 CH2I2 ! ? CH2OTos2 —? FCH2OTos en donde: i: p-toluensulfonato de plata, MeCN, reflujo, 20 horas; ii: KF, MeCN, reflujo, 1 hora.
De acuerdo con el Esquema 3 anterior: (a) Síntesis de ditosilato de metileno Puede hacerse reaccionar el diyodometano comercialmente disponible con tosilato de plata, utilizando el método de Emmons and Ferris, para proporcionar ditosilato de metileno (Emmons, W.D., et al., "Metathetical Reactions of Silver Salts in Solution. II. The Synthesis of Alkyl Sulfonates", Journal of the American Chemical Society, 1953; 75:225). (b) Síntesis de Fluorometiltosilato frío Puede prepararse el fluorometiltosilato mediante sustitución nucleofílica de ditosilato de metileno a partir de la etapa (a) utilizando fluoruro de potasio/Kryptof ix K222 en acetonitrilo a 80°C bajo condiciones estándares.
Cuando Z es un radioisótopo, el radioisótopo puede introducirse mediante cualesquiera medios conocidos por alguien de experiencia en la técnica. Por ejemplo, el radioisótopo de ion de [ 8F]-fluoruro ( 8F) se obtiene normalmente como una solución acuosa de la reacción nuclear 180(p,n)18F y se vuelve reactivo mediante la adición de un contraión catiónico y la remoción subsiguiente de agua. Los contraiones catiónicos adecuados deben poseer suficiente solubilidad dentro del solvente de reacción anhidra para mantener la solubilidad de 18F". Por lo tanto, los contraiones que se han utilizado incluyen iones metálicos grandes aunque suaves tales como rubidio o cesio, potasio compuesto con un criptandot al como Kryptofix™, o sales, de tetraalquilamonio. Un contraión preferido es potasio combinado con un criptando tal como Kryptofix™ debido a su buena solubilidad en solventes anhidros y mayor reactividad de 18F. 8F puede también introducirse mediante desplazamiento nucleofílico de un grupo saliente adecuado tal como un halógeno o un grupo tosilato. Una discusión más detallada de técnicas de etiquetado de 8F bien conocidas pueden encontrarse en el Capítulo 6 del "Handbook of Radiopharmaceuticals" (2003; John Wiley and Sons: M.J. Welch and C.S. Redvanly, Eds.). Por ejemplo, puede prepararse [18F]Fluorometiltosilato mediante sustitución nucleofílica de ditosilato de metileno con un ión de [18F]-fluoruro en acetonitrilo que contiene 2-10% de agua (véase Neal, T.R., ef al., Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals 2005; 48:557-68).
Síntesis Automatizada En una modalidad preferida, el método para preparar un compuesto para la Fórmula (I), incluyendo un compuesto de la Fórmula (la), es automatizado. Por ejemplo, los trazadores radioactivos [18F] pueden prepararse convenientemente en una forma automatizada por medio de un aparato de radiosintesis automatizado. Existen diversos ejemplos comercialmente disponibles de tal aparato de plataforma, incluyendo TRACERlab™ (por ejemplo, TRACERlab™ MX) y FASTIab™ (ambos de GE Healthcare Ltd.). Tal aparato comúnmente comprende un "cásete", a menudo desechable, en el cual se realiza la radioquímica, la cual se ajusta al aparato con el fin de realizar una radiosíntesis. El cásete normalmente incluye trayectorias de fluido, un recipiente de reacción, y puertos para recibir frascos de reactivos así como cualesquiera cartuchos de extracción en fase sólida utilizados en etapas de limpieza post-radiosintéticas. Opcionalmente, en una modalidad adicional de la invención, el aparato de radiosíntesis automatizado puede ser enlazado a una cromatografía de líquido de alto rendimiento (HPLC).
La presente invención por lo tanto proporciona un cásete para la síntesis automatizada de un compuesto de la Fórmula (I), incluyendo un compuesto de la Fórmula (la), cada uno como se define en la presente, comprende: i) un recipiente que contiene el compuesto precursor de la Fórmula (II) como se define en la presente; y ¡i), medios para eluir los contenidos del recipiente de la etapa (i) con un compuesto de la Fórmula (Illa) como se define en la presente.
Para el cásete de la invención, las modalidades adecuadas y preferidas del compuesto precursor de las Fórmulas (II) y (Illa) son cada una como se define en la presente.
En una modalidad de la invención, se requiere un método para elaborar un compuesto de la Fórmula (I), incluyendo un compuesto de la Fórmula (la), cada uno como se describe en la presente, que es compatible con FASTIab™ a partir de un precursor de etanolamina protegida que no requiere una etapa de purificación de HPLC.
La radiosíntesis de [ 8F]fluorometil-[1 ,2-2H4]colina (1BF-D4-FCH) puede realizarse de acuerdo con los métodos y ejemplos descritos en la presente. La radiosíntesis de 18F-D4-FCH puede también realizarse utilizando plataformas de síntesis comercialmente disponibles incluyendo, aunque sin limitarse a GE FASTIab™ (comercialmente disponible de GE Healthcare Inc.).
Un ejemplo de un proceso radiosintético FASTIab™ para la preparación de [18F]fluorometil-[1 ,2-2H4)colina a partir de un precursor protegido se muestra en el Esquema 5: Esquema 5 8F-, 18FCH2OTs/Ts-[18F]F BF]F" [8F]KF/K222/K2C03 CH2(OTs)2 /PTC / Base 2OTs /Ts-[18F]F en donde: a. Preparación del complejo [18F]KF/K222/ 2C03 como se describe en más detalle posteriormente; b. Preparación de [ 8F]FCH2OTs como se describe en más detalle posteriormente; c. Purificación de SPE de [18F]FCH2OTs como se describe en más detalle posteriormente; d. Radiosíntesis de 0-PMB-[18F]-D4-Colina (0-PMB-[18F]-D4- FCH) como se describe en más detalle posteriormente; y e. Purificación y formulación de [18F]-D4-Colina (18F-D4-FCH) como la sal de clorhidrato como se describe en más detalle posteriormente.
La automatización de [18F]fluoro-[1 ,2-2H ]colina o [18F]fluorocolina (a partir del precursor protegido) implica un proceso automatizado idéntico (y se preparan de la fluorometilación de O- PMB-N,N-dimetil-[1 ,2-2H4]etanolamina y ?-???-?,?- dimetiletanolamina respectivamente).
De acuerdo con una modalidad de la presente invención, la síntesis FASTIab™ de [18F]fluorometil-[1 ,2-2H4]colina o [18F]fluorometilcolina comprende las siguientes etapas secuenciales: (i) Atrapamiento de [18F]fluoruro sobre QMA; (ii) Elución de [18F]f luoruro a partir de QMA; (iii) Radiosíntesis de [18F]FCH2OTs; (iv) Limpieza de SPE de [18F]FCH2OTs; (v) Limpieza del recipiente de reacción; (vi) Secado del recipiente de reacción y tosilato de [18F]fluoromet¡lo retenido en SPE t-C18 plus simultáneamente; (vií) Reacción de alquilación; (víií) Remoción del precursor O-PMB no reactivo; y (ix) Desproteccíón y formulación.
Cada una de las etapas (i)-(ix) se describe en más detalle posteriormente.
En una modalidad de la presente invención, las etapas (i)-(ix) anteriores se realizan en un cásete como se describe en la presente. Una modalidad de la presente invención es un cásete capaz de realizar etapas (i)-(ix) para su uso en una plataforma de síntesis automatizada. Una modalidad de la presente invención es un cásete para la radiosíntesis de [18F]fluorometil-[1 ,2-2H4]colina ([ 8F]-D4-FCH) o [18F]fluorometilcolina a partir del precursor protegido. Un ejemplo de un cásete de la presente invención se muestra en la Figura 5b. (i) Atrapamiento de [18f]fluoruro sobre QMA [18F]fluoruro (típicamente en 0.5 a 5 mi, H2180) se hace pasar a través de un cartucho Waters QMA pre-condicionado. (ii) Elución de [18F]f luoruro a partir de QMA La elución, como se describe en el Cuadro 1 se retira en una jeringa a partir del frasco de eluyente y se hace pasar sobre el Waters QMA dentro del recipiente de reacción. Este procedimiento eluye [18F]fluoruro dentro del recipiente de reacción. Se remueven agua y acetonitrilo utilizando un ciclo de secado bien planeado de "nitrógeno/vacío/calentamiento/enfriamiento". (iii) Radiosíntesis de [18F]FCH2OTs Una vez que el complejo de K[18F]Fluoruro/K222/K2C03 de (ii) se seca, se agrega ditosilato de CH2(OTs)2 metileno en una solución que contiene acetonitrilo y agua al recipiente de reacción que contiene el complejo K[18F]fluoruro/K222/K2C03. La mezcla de reacción resultante se calentará (típicamente a 110°C durante 10 minutos), luego, se enfriará (típicamente a 70°C). (iv) Limpieza de SPE de [18F]FCH2OTs Una vez que la radiosíntesis de [ 8F]FCH2OTs se completa y el recipiente de reacción se enfría, se agrega agua dentro del recipiente de reacción para reducir el contenido de solvente orgánico en el recipiente de reacción aproximadamente 25%. Esta solución diluida se transfiere desde el recipiente de reacción y a través de los cartuchos t-C18-light y t-C 18 plus - estos cartuchos se enjuagan entonces con 12 a 15 mi de una solución de 25% de acetonitrilo/75% de agua. Al final de este proceso: - el ditosilato de metileno permanece atrapado en el t-C18-light y - el [18F]FCH2OTs, tosil-[18F]fluoruro permanece atrapado en el t-C18 plus. (v) Limpieza del recipiente de reacción El recipiente de reacción se limpió (utilizando etanol) antes de la alquilación del tosilato de [18F]fluorofenilo y el precursor O-PMB-DMEA. (vi) Secado del recipiente de reacción de tosilato de [18F]f luorofenilo retenido en SPE t-C18 plus simultáneamente Una vez que la limpieza (v) se completó, el recipiente de reacción y el tosilato de [18F]fluorofenilo retenido en SPE t-C18 plus se secó simultáneamente. (vii) Reacción de alquilación Se eluyó la siguiente etapa (vi), el [18F]FCH2OTs (junto con tos¡l-[,8F]fluoruro) retenido en el t-C18 plus dentro del recipiente de reacción utilizando una mezcla de O-PMB-N, N-dimetil-[1 ,2-2H4]etanolamina (u O-PMB-N, N-dimetiletanolamina) en acetonitrilo.
La alquilación de [18F]FCH2OTs con el precursor O-PMB se logró calentando el recipiente de reacción (típicamente 110°C durante 15 minutos) para producir [18F]fluoro-[1 ,2-2H4]colina (u O-PMB-[18F]fluorocolina). ( v i i i ) Remoción del precursor O-PMB no reactivo Se agregó agua (3 a 4 mi) a la reacción y esta solución se hizo pasar entonces a través de un cartucho CM pre-tratado, seguido por un baño de etanol - típicamente 2 x 5 mi (este remueve O-PMB-DMEA no reactivo) dejando la [18F]fluoro-[1 ,2-2H4]colina "purificada" (u 0-PMB-[ 8F]fluorocolina) atrapada sobre el cartucho CM. (ix) Desprotección y formulación El ácido clorhídrico se hizo pasar a través del cartucho CM en una jeringa: esto resultó en la desprotección de O-PMB-[18F]fluorocolina (la jeringa contiene [18F]fluorocolina en una solución de HCI). Se agregó entonces acetato de sodio a esta jeringa para amortiguar el pH 5 a 8 produciendo [18F]-D4-colina (o [18F]colina) en un regulador de pH de acetato. Esta solución regulada en su pH se transfiere entones a un frasco del producto que contiene un regulador de pH.
El Cuadro 1 proporciona una lista de reactivos y otros componentes requeridos para la preparación de un radiocasete de [18F]fluorometil-[1,2-2H4]colina (D4-FCH) (o [ 8F]fluorometilcolina) de la presente invención: Cuadro 1 De acuerdo con una modalidad de la presente invención, la síntesis FASTIabTM™ d e [18F]fluorometil-[1 ,2-2H4)colina a través de un precursor desprotegido comprende las siguientes etapas secuenciales como se describe en el Esquema 6 posteriormente: Esquema 6 8F-, l8FCH?OTs/Ts-[ BF]F [ aFlKF/K222/K2C03 - CH2(OTs)2 /PTC /Base 2OTs /Ts-[18F]F 1. Recuperación de [18F]fluoruro a partir de QMA; 2 Preparación del complejo K[18F]F/K222/ 2C03; 3 Radiosíntesis de 18FCH2OTs; 4 Limpieza de SPE de 18FCH2OTs¡ 5 Limpieza del cásete del recipiente de reacción y la jeringa; 6 Secado del recipiente de reacción y C18 SepPak; 7 Desactivación de la elución y acoplamiento de 13FCH2OTs con D4-DMEA; 8 Transferencia de la mezcla de reacción sobre el cartucho CM; 9 Limpieza del cásete y la jeringa; 10 Lavado del cartucho CM con solución de amoniaco acuoso diluido, Etanol y agua; 11 Elución de [18F]fluorometil-[1 ,2-2H4)colina a partir del cartucho CM con 0.09% de cloruro de sodio (5 mi), seguido por agua (5 mi).
En una modalidad de la presente invención, se realizan las etapas (1)-(11) anteriores en un cásete como se describe en la presente. Una modalidad de la presente invención es un cásete capaz de realizar las tapas (1)-(11) para su usarse en una plataforma de síntesis automatizada. Una modalidad de la presente invención es un cásete para la radiosíntesis de [18F]fluorometil-[1 ,2-2H4]colina ([18F]-D4-FCH) a partir de un precursor desprotegido. Un ejemplo de un cásete de la presente invención se muestra en la Figura 5a.
El Cuadro 2 proporciona una lista de reactivos y otros componentes requeridos para la preparación de [18F]fluorometil-[1 ,2-2H ]colina (D4-FCH) (o [ 8F]fluorometilcol¡na) mediante un radiocasete precursor desprotegido de la presente invención: Cuadro 2 Método para Formación de Imágenes El compuesto radioetiquetado de la invención, como se describe en la presente, se incorporará en células mediante transportadores celulares o mediante difusión. En las células en donde la colina quinasa se sobre-expresa o activa el compuesto radioetiquetado de la invención, como se describe en la presente, se fosforilará y atrapará dentro de esa célula. Esto formará el mecanismo principal para detectar tejido neoplásico.
La presente invención además proporciona un método para formación de imágenes, que comprende la etapa de administrar un compuesto radioetiquetado de la invención o una composición farmacéutica que comprende un compuesto radioetiquetado de la invención, cada uno como se describe en la presente, a un- sujeto y detectando el compuesto radioetiquetado de la invención en el sujeto. La presente invención además proporciona un método para detectar tejido neoplásico in vivo utilizando un compuesto radioetiquetado de la invención o una composición farmacéutica que comprende un compuesto radioetiquetado de la invención, cada uno como se describe en la presente. Por lo tanto, la presente invención proporciona mejores herramientas para detección y diagnóstico tempranos, así como mayores estrategias y métodos de pronóstico para identificar fácilmente a pacientes que responderán o no a los tratamientos terapéuticos disponibles. Como un resultado de la capacidad de un compuesto de la invención para detectar tejido neoplásico, la presente invención además proporciona un método para monitorear respuesta terapéutica al tratamiento de un estado de la enfermedad asociado con el tejido neoplásico.
En una modalidad preferida de la invención, el compuesto radioetiquetado de la invención para su uso en un método para formación de imágenes de la invención, como se describe en la presente, es un compuesto radioetiquetado de la Fórmula (I).
En una modalidad preferida de la invención, el compuesto radioetiquetado de la invención para su usarse en un método para formación de imágenes de la invención, como se describe en la presente, es un compuesto radioetiquetado de la Fórmula (III).
Como se entiende por alguien de experiencia en la técnica, el tipo de formación de imágenes (por ejemplo, PET, SPECT) será determinado por la naturaleza del radioisótopo. Por ejemplo, si el compuesto radioetiquetado de la Fórmula (I) contiene 18F, éste será adecuado para formación de imágenes de PET.
De este modo, la invención proporciona un método para detectar tejido neoplásico in vivo que comprende las etapas de: i) administrar a un sujeto un compuesto radioetiquetado de la invención o una composición farmacéutica que comprende un compuesto radioetiquetado de la invención, cada uno como se define en la presente; ii) permitir que un compuesto radioetiquetado de la invención se una al tejido neoplásico en el sujeto; iii) detectar señales emitidas por el radioisótopo en el compuesto radioetiquetado unido de la invención; iv) generar una imagen representativa de la ubicación y/o cantidad de las señales; y, v) determinar la distribución y grado de tejido neoplásico en el sujeto.
La etapa para "administrar" un compuesto radioetiquetado de la invención se lleva a cabo de preferencia parentalmente, y de mayor preferencia intravenosamente. La ruta intravenosa representa la forma más eficiente para suministrar el compuesto en todo el cuerpo del sujeto. La administración intravenosa ni representa una intervención física sustancial, ni un riesgo sustancial para la salud del sujeto. El compuesto radioetiquetado de la invención se administra de preferencia como la composición radiofarmacéutica de la invención, como se define en la presente. La etapa de administración no se requiere para una definición completa del método de formación de imágenes de la invención. Como tal, puede entenderse también que el método de formación de imágenes de la invención comprende las etapas definidas anteriormente (ii)-(v) llevadas a cabo en un sujeto a quien se ha pre-administrado un compuesto radioetiquetado de la invención.
Después de la etapa de administración y antes de la etapa de detección, el compuesto radioetiquetado de la invención se permite unir al tejido neoplásico. Por ejemplo, cuando el sujeto es un mamífero intacto, el compuesto radioetiquetado de la invención se moverá dinámicamente a través del cuerpo del mamífero, entrando en contacto con varios tejidos en el mismo. Una vez que el compuesto radioetiquetado de la invención entra en contacto con el tejido neoplásico, éste se unirá al tejido neoplásico.
La etapa de "detección" del método de la invención implica la detección de señales emitidas por el radioisótopo comprendido en el compuesto radioetiquetado de la invención por medio de un detector sensible a tales señales, por ejemplo, una cámara de PET. Esta etapa de detección puede también entenderse como la adquisición de datos de señales.
La etapa de "generación'' del método de la invención se lleva a cabo mediante una computadora la cual aplica un algoritmo de reconstrucción a los datos de señales adquiridas para producir un conjunto de datos. Este conjunto de datos se manipula entonces para generar imágenes que muestran la ubicación y/o la cantidad de señales emitidas por el radioisótopo. Las señales emitidas directamente se correlacionan con la cantidad de enzima o tejido neoplásico de manera que la etapa de "determinación" puede hacerse evaluando la imagen generada.
El "sujeto" de la invención puede ser cualquier sujeto humano o animal. De preferencia, el sujeto de la invención es un mamífero. Más preferiblemente, el sujeto es un cuerpo intacto in vivo de un mamífero. En una modalidad especialmente preferida, el sujeto de la invención es un ser humano.
El "estado de la enfermedad asociado con el tejido neoplásico" puede ser cualquier estado de la enfermedad que resulta a partir de la presencia del tejido neoplásico. Ejemplos de tales estados de la enfermedad incluyen, aunque no se limitan a, tumores, cáncer (por ejemplo, de próstata, mama, pulmón, ovario, pancreático, cerebro y colon). En una modalidad preferida de la invención, el estado de la enfermedad asociado con el tejido neoplásico es cáncer de cerebro, mama, pulmón, esofágico, próstata o pancreático.
Como se entiende por alguien de experiencia en la técnica, el "tratamiento" dependerá del estado de la enfermedad asociado con el tejido neoplásico. Por ejemplo, cuando el estado de la enfermedad asociado con el tejido neoplásico es cáncer, el tratamiento puede incluir, aunque no se limita a, cirugía, quimioterapia o radioterapia. De este modo, puede utilizarse un método de la invención para monitorear la efectividad del tratamiento contra el estado de la enfermedad asociado con el tejido neoplásico.
A diferencia de los neoplasmas, un compuesto radioetiquetado de la invención puede también ser útil en enfermedad hepática, trastornos cerebrales, enfermedad renal y diversas enfermedades asociadas con la proliferación de células normales. Un compuesto radioetiquetado de la invención puede también ser útil para formación de imágenes en inflamación; formación de imágenes del proceso inflamatorio incluyendo artritis reumatoide y sinovitis de rodilla, y formación de imágenes de enfermedad cardiovascular incluyendo placa arteriosclerótica.
Compuesto Precursor La presente invención proporciona un compuesto precursor de la Fórmula (II): (II) como se describió anteriormente.
En una modalidad preferida de la invención, se proporciona un compuesto de la Fórmula (II), en donde: Ri, R2, R3 y R4 son cada uno independientemente hidrógeno; R5, R6 y 7 son cada uno independientemente hidrógeno, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mRB, -(CF2)mR8)2 o -CD(R8)2; R8 es hidrógeno, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2CI, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2CI, CD2Br, CD2I o -C6H5; y m es un número entero de 1-4.
En una modalidad preferida de la invención, se proporciona un compuesto de la Fórmula (II), en donde: R1 y R2 son cada uno hidrógeno; R3 y R son cada uno deuterio (D); R5, R6 7 son cada uno independientemente hidrógeno, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, o -CD(R8)2; R8 es hidrógeno, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2CI, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2CI, CD2Br, CD2I o -C6H5; y m es un número entero de 1-4.
En una modalidad preferida de la invención, se proporciona un compuesto de la Fórmula (II), en donde: Ri. R2, 3 y R4 son cada uno deuterio (D); Re, R6 y R7 son cada uno independientemente hidrógeno, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8. -(CF2) mRe, o -CD(R8)2; R8 es hidrógeno, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2CI, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2CI, CD2Br, CD2I o -C6H5; y m es un número entero de 1-4.
De acuerdo con la invención, el compuesto de la Fórmula (II) es un compuesto de la Fórmula (lia): (Ha) En una modalidad de la invención, se proporciona un compuesto de la Fórmula (Mb): (Il ) en donde: Ri, R2, R3 y R4 son cada uno independientemente hidrógeno o deuterio (D); Rs, Re y R7 son cada uno independientemente hidrógeno, R , -(CH2)mR8, -(CD2)m-R8, -(CF2)mR8, -CH(RB)2 o -CD(R8)2; R8 es independientemente hidrógeno, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2CI, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2CI, CD2Br, CD2I o -C6H5; y m es un número entero de 1-4; y Pg es un grupo de protección de hidroxilo.
En una modalidad preferida de la invención, se proporciona un compuesto de la Fórmula (llb), en donde Pg es un grupo p-metoxibencilo (PMB), trimetilsililo (TMS) o un dimetoxitritilo (DMTr).
En una modalidad preferida de la invención, se proporciona un compuesto de la Fórmula (llb), en donde Pg es un grupo p-metoxibencilo (PMB).
En una modalidad de la invención, se proporciona un compuesto de la Fórmula (He): (He) en donde: i> R2, 3 y 4 son cada uno independientemente hidrógeno o deuterio (D); Rs, 6 y R7 son cada uno independientemente hidrógeno, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)m-R8, -(CF2)mR8, -CH(R8)2 o -CD(R8)2; R8 es independientemente hidrógeno, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2CI, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2CI, CD2Br, CD2I o -C6H5; y m es un número entero de 1-4; con la condición de que cuando R,, R2, R3 y R4 sean cada uno hidrógeno, R5, R6 y R7 no sean cada uno hidrógeno; con la condición de que cuando R,, R2, R3 y R4 sean cada uno deuterio, R5, R6 y R7 no sean cada uno hidrógeno.
En una modalidad preferida de la invención, se proporciona un compuesto de la Fórmula (lie), en donde: ,, R2, R3 y 4 son cada uno independientemente hidrógeno; R5, Re y R7 son cada uno independientemente hidrógeno, R8 -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8 o -CD(R8)2; R8 es hidrógeno, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2CI, -CH2Br, -CH2I, -CD3l -CD2OH, -CD2F, CD2CI, CD2Br, CD2I o -C6H5; y m es un número entero de 1-4; con la condición de que R5, R6 y R7 no sean cada uno hidrógeno.
En una modalidad preferida de la invención, se proporciona un compuesto de la Fórmula (lie), en donde: Ri, R2, R3 y R4 son cada uno deuterio (D); R5, 6 y 7 son cada uno independientemente hidrógeno, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8 o -CD(R8)2; R8 es hidrógeno, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2CI, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2CI, CD2Br, CD2I o -C6H5; y m es un número entero de 1-4; con la condición de que R5, R6 y R7 no sean cada uno hidrógeno.
En una modalidad preferida de la invención, se proporciona un compuesto de la Fórmula (lie), en donde: R y R2 son cada uno hidrógeno; y R3 y R4 son cada uno deuterio (D).
Un compuesto precursor de la Fórmula (II), incluyendo un compuesto de la Fórmula (lia), (llb) y (lie), puede prepararse mediante cualesquiera medios conocidos en la técnica incluyendo aquellos descritos en la presente. Por ejemplo, el compuesto de la Fórmula (lia) puede sintetizarse mediante alquilación de dimetilamina en THF con 2-bromoetanol-1 , 1 ,2,2-d4 en la presencia de carbonato de potasio en el Esquema 1 posteriormente: ESQUEMA 1 en donde i = K2C03, THF, 50°C, 19 horas. El producto tetra-deuterado deseado puede purificarse mediante destilación. El espectro 1H NMR del compuesto de la Fórmula (lia) (Figura 3) en deuterio-cloroformo demostró únicamente los picos asociados con los grupos N, N-d imetilo y el hidroxilo del alcohol; no se observaron picos asociados con los hidrógenos de los grupos metileno de la cadena de alcohol etílico. Consistente con esto, el espectro 3C NMR (Figura 3) demostró la banda individual grande asociado con los carbonos de N, A/-dimetilo; sin embargo, los picos para los carbonos de metileno de alcohol etílico en 60.4 ppm y 62.5 ppm se redujeron sustancialmente en magnitud, sugiriendo la ausencia de mejoramiento de señal asociado con la presencia de una unión de carbono-hidrógeno covalente. Además, los picos de metileno se dividen ambos en bandas múltiples, indicando acoplamiento spin-spin. Ya que 13C NMR se activa típicamente con desacoplamiento 1H, la multiplicidad observada debe ser el resultado de unión de carbono-deuterio. En la base de las observaciones anteriores, se considera que la pureza isotópica del producto deseado es >98% en favor del isótopo 2H (con relación al isótopo 1H).
Un análogo di-deuterado de un compuesto precursor de la Fórmula (II) puede sintetizarse a partir de ?,?-dimetilglicina mediante reducción de hidruro de litio-aluminio como se muestra en el Esquema 2 posteriormente: ESQUEMA 2 en donde i = LiA1D4, THF, 65°C, 24 horas. El análisis de 13C NMR indicó que puede lograrse la pureza isotópica de más de 95% en favor del isómero 2H (con relación al isótopo 1H).
De acuerdo con la invención, el grupo hidroxilo de un compuesto de la Fórmula (II), incluyendo un compuesto de la Fórmula (lia) puede protegerse además con un grupo de protección para proporcionar un compuesto de la Fórmula (llb): (llb) en donde Pg es cualquier grupo de protección de hidroxilo conocido en la técnica. De preferencia, Pg es cualquier grupo de protección de hidroxilo inestable en ácido incluyendo, por ejemplo, aquellos descritos en "Protective Groups in Organic Synthesis", 3a edición, A Wiley Interscience Publication, John Wiley & Sons Inc., Theodora W. Greene and Peter G. M. Wuts, pp 17-200. De preferencia, Pg es un grupo p-metoxibencilo (PMB), trimetilsi li lo (TMS) o un dimetoxitritilo (DMTr). Más preferiblemente, Pg es un grupo p-metoxibencilo (PMB).
Validación de r18F1fluorometil-n .2-2H colina (D4-FCH) Se evaluó la estabilidad a oxidación resultando a partir de la sustitución isotópica en modelos químicos y enzimáticos in vitro utilizando [ 8F]fluorometilcolina como estándar. Se evaluó entonces [18F]fluorometil-[1 ,2-2H ]colina en modelos in vivo y se comparó con [11C]colina, [18F]fluorometilcolina y [ 8F]Fluorometil-[1 -2H2]colina: Ha11^ 11 C-Colina [18F]Fluorometilcolina [18F]Fluorometil-[1-2H2] colina [18F]Fluorometil-[1 ,2-2H2]colina Estudio de oxidación de Permanganato de Potasio Se probó inicialmente el efecto de la sustitución del deuterio en resistencia de unión mediante evaluación del patrón de oxidación química de la [18F]fluorometilcolina y [18F]Fluorometil-[1 ,2-2H4]colina utilizando permanganato de potasio. El Esquema 6 posterior detalla la oxidación de permanganato de potasio catalizado base de [18F]fluorometilcolina y [18F]Fluorometil-[1 ,2-2H ]colina a temperatura ambiente, con alícuotas removidas y se analizó mediante radio-HPLC en periodos pre-seleccionados.
ESQUEMA 6 a) Ri,R2,R3,R4 = H R4 = D Reactivos y Condiciones: i) KMn04, Na2C03, H20, ta.
Los resultados se resumen en las Figuras 6 y 7. El cromatograma de radio-HPLC (Figura 6) demostró una mayor proporción del compuesto parental permaneciendo 20 minutos para [18F]Fluorometil-[1 ,2-2H4]colina. La gráfica en la Figura 7 además demostró un efecto isotópico significativo para el análogo deuterado, [18F]Fluorometil-[1 ,2-2H4]colina, con casi 80% del compuesto parental aún presente 1 hora después del tratamiento con permanganato de potasio, en comparación con menos del 40% del compuesto parental [18F]Fluorometilcolina aún presente en el mismo momento.
Modelo de colina oxidasa Se evaluaron [ 8F]fluorometilcolina y [18F]fluorometil-[1 ,2-2H4]colina en un modelo de colina oxidasa (Roivainen, A., et al., European Journal of Nuclear Medicine 2000; 27:25-32). La representación gráfica en la Figura 8 demuestra claramente que, en el modelo oxidativo enzimático, el compuesto deuterado es significativamente más estable que el compuesto no deuterado correspondiente. A los 60 minutos, la distribución de radio-HPLC de especies de colina reveló que para la [18F]fluorometilcolina se presentó el trazador radioactivo parental en el nivel de 11±8%; a los 60 minutos, se presentó el trazador radioactivo deuterado parental correspondiente [18F]fluorometil-[1 ,2-2H4]colina en 29±4%. Se muestran los cromatogramas de radio-HPLC relevantes en la Figura 9 y se ejemplificó además una mayor estabilidad oxidativa de la [18F]fluorometil-[1 ,2-2H4]-colina con relación a la [18F]fluorometilcolina. Estos cromatogramas de radio-HPLc contienen un tercer pico, marcado como 'desconocido', que se supone es el producto de oxidación intermedio, betaína aldehido.
Análisis de estabilidad in vivo ß La [18F]fluorometil-[1 ,2-2H4]-colina es más resistente a la oxidación in vivo. Los índices relativos de oxidación de las dos especies de colina isotópicamente radioetiquetada, [18F]fluorometilcolina y [18F]fluoromet¡l-[1 ,2-2H4]-colina a sus respectivos metabolitos. [18F]fluorometilcolina-betaína ([F]-FCH-betaína) y [18F]fluorometil-[1 ,2-2H4]-colina-betaína ([18F]-D4-FCH-betaína) se evaluó mediante cromatografía liquida de alto rendimiento (HPLC) en plasma de ratón después de la administración intravenosa (i.v.) de los trazadores radioactivos. Se encontró que la [18F]fluorometil-[1 ,2-2H ]-colina es notablemente más estable a oxidación que la [18F]fluorometilcolina. Como se muestra en la Figura 10, la [18F]fluorometil-[1 ,2-2H4]-colina fue notablemente más estable que la [18F]fluorometilcol¡na con -40% de conversión de la [18F]fluorometil-[1 ,22H4]-colina a la [18F]-D4-FCH-betaína 15 minutos después de la inyección i.v. en ratones en comparación con ~80% de conversión de [18F]fluorometilcolina a [18F]-FCH-betaína. La evolución para oxidación in vivo se muestra en la Figura 10 mostrando estabilidad mejorada total de la [18F]fluorometil-[1 ,2-2H ]-colina sobre [18F]fluorometilcolina.
Biodistribución Biodistribución de la evolución Se llevó a cabo la biodistribución de la evolución para [18F]fluorometilcolina, [18F]fluorometil-[1 -2H2]colina y [18F]fluorometil-[1 ,2-2H4]colina en ratones desnudos que portan xenoinjertos de colon humano HCT116. Se recolectaron los tejidos 2, 30 y 60 minutos después de la inyección y los datos se resumieron en la Figura 11A-C. Los valores incorporados para [18F]fluorometilcolina estuvieron de acuerdo con estudios anteriores (DeGrado, T.R., et al., "Synthesis and Evaluation of 18F-labeled Choline as an Oncologic Tracer for Positrón Emisson Tomography: Initial Findings in Prostate Cáncer", Cáncer Research 2000; 61:110-7). La comparación de los perfiles de incorporación reveló una incorporación reducida de trazador radioactivo en el corazón, pulmón e hígado para compuestos deuterados [18F]fluorometil-[1 -2H2]-colina y [18F]fluorometil-[1 ,2-2H4]-colina. El perfil de incorporación de tumor para los tres trazadores radioactivos se muestra en la Figura 11D y muestra mayor ubicación del trazador radioactivo para los compuestos deuterados con relación a la [18F]fluorometilcolina en todos los periodos. Es evidente un incremento pronunciado en la incorporación de tumores de [18F]fluorometil-[ ,2-2H4]colina en los últimos periodos.
Distribución de metabolitos de colina Se logró también el análisis de metabolitos de tejidos incluyendo hígado, riñon y tumor mediante HPLC. Se muestran en la Figura 12 los cromatogramas típicos de HPLC de [18F]FCH y [18F]D4-FCH y sus respectivos metaboiitos en tejidos. La distribución de tumores de metaboiitos se analizó en una forma similar (Figura 13). La colina y sus metaboiitos carecen de cualquier cromóforo de UV que permita la presentación de cromatogramas del compuesto no etiquetado frío simultáneamente con los cromatogramas de radioactividad. De este modo, la presencia de metaboiitos se validó mediante otros medios químicos y biológicos. Es notable que las mismas condiciones cromatográficas se utilizaron para caracterización de los metaboiitos y los tiempos de retención fueron similares. La identidad de fosfocolina pico se confirmó bioquímicamente mediante incubación de la supuesta fosfocolina formada en células de tumor HCT116 no tratado con fosfatasa alcalina (Figura 14).
Se presentó una alta proporción de radioactividad de hígado como fosfocolina 30 minutos después de la inyección tanto para [ 8F]FCH como para [18F]D4-FCH (Figura 12). Se observó un metabolito desconocido (posiblemente el intermediario aldehido) tanto en muestras de hígado (7.4 ± 2.3%) como de riñon (8.8 ± 0.2%) de ratones tratados con [18F]D4-FCH. En contraste, este metabolito desconocido no se encontró en muestras de hígado de ratones tratados con [ 8F]FCH y solamente a un grado más pequeño (3.3 ± 0.6%) en muestras de riñon. Notablemente 60.6 ± 3.7% de radioactividad de riñon derivada de [18F]D4-FCH fue fosfocolina en comparación con 31.8 ± 9.8% a partir de [18F]FCH (P = 0.03).
Inversamente, la mayoría de la radioactividad derivada de [ 8F]FCH en el riñon, estuvo en la forma de [18F]FCH-betaína; 53.5 ± 5.3% en comparación con 20.6 ± 6.2% para [18F]D4-FCH (Figura 12). Podría argumentarse que los niveles de betaina en plasma reflejaron niveles en tejidos tales como hígado y ríñones. Los tumores mostraron un diferente perfil de HPLC en comparación con hígado y ríñones; los cromatogramas radio-HPLC típicos obtenidos a partir del análisis de muestras de tumor (30 minutos de inyección intravenosa de [18F]FCH, [18F]D4-FCH y [11C]colina) se muestran en la Figura 12. En tumores, la radioactividad estuvo principalmente en la forma de fosfocolina en el caso de [ 8F]D4-FCH (Figura 13). En contraste, [18F]FCH demostró niveles significativos de [18F]FCH-betaína. En el contexto de la formación de imagen final, estos resultados indican que [18F]D4-FCH será el trazador radioactivo superior para formación de imágenes de PET con un perfil de incorporación que es más fácil de interpretar.
Los aspectos adecuados y preferidos de cualquier característica presente en múltiples aspectos de la presente invención son como se definen para tales características en el primer aspecto en el cual se describen en la presente. La invención se ilustra ahora mediante una serie de ejemplos no limitantes.
Análogos de Carbono Colina Isotópicos La presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula (III) como se describe en la presente. Tales compuestos son útiles como agentes de formación de imágenes de PET para formación de imágenes de tumor, como se describe en la presente. En particular, un compuesto de la Fórmula (III), como se describe en la presente, no puede excretarse en la orina y por lo tanto proporciona formación de imágenes más específica de malignidades pélvicas tales como cáncer de próstata.
La presente invención proporciona un método para preparar un compuesto para la Fórmula (III), en donde el método comprende la reacción el compuesto precursor de la Fórmula (II), con un compuesto de la Fórmula (IV) para formar un compuesto de la Fórmula (III) (Esquema A): Esquema A en donde los compuestos de las Fórmulas (I) y (III) son cada uno como se describe en la presente y el compuesto de la Fórmula (IV) es como sigue: ZXYC*-Lg (IV) en donde C*, X, Y y Z son cada uno como se define en la presente para un compuesto de la Fórmula (III) y "Lg" es un grupo saliente. Ejemplos adecuados de "Lg" incluyen, aunque no se limitan a bromo (Br) y tosilato (OTOs). Un compuesto de la Fórmula (IV) puede prepararse por cualesquiera medios conocidos en la técnica incluyendo aquellos descritos en la presente (por ejemplo, comparables a los Ejemplos 5 y 7).
Ejemplos Se adquirieron reactivos y solventes de Sigma-Aldrich (Gillingham, UK) y se utilizaron sin purificación adicional. Se adquirió cloruro de fluorometilcolina (estándar de referencia) de ABCR Gmbh & Co. (Karsruhe, Alemania). Se adquirió solución salina isotónica (0.9% p/v) de Hameln Pharmaceuticals (Gloucester, UK). Se obtuvieron los espectros utilizando ya sea una máquina de NMR Bruker Avance que opera a 400 MHz (1H NMR) y 100 MHz (13C NMR) o 600 MHz (1H NMR) y 150 MHz (13C NMR). Se llevó a cabo la espectroscopia de masa exacta en una máquina Waters Micromass LCT Premier en modo de ionización de electrones positivos (El) o ionización química (Cl). Se llevó a cabo la destilación utilizando un horno de vidrio Büchi B-585 (Büchi, Suiza).
Ejemplo 1. Preparación de N,N-dimetil-[ ,2-2H4]-etanolamina (3) 1 2 3 A una suspensión de K2C03 (10.50 g, 76 mmolesj en THF seco (10 mi) se agregó dimetilamina (2.0 M en THF) (30 mi, 76 mmoles), seguida por 2-bromoetanol-1 , 1 ,2,2-d4 (4.90 g, 38 mmoles) y la suspensión se calentó a 50°C bajo argón. Después de 19 horas, la cromatografía en capas delgadas (TLC) (acetato de etilo/alúmina/l2) indicó la conversión completa de (2) y la mezcla de reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente y se filtró. El solvente a granel se removió entonces bajo presión reducida. La destilación proporcionó el producto deseado (3) como un líquido incoloro, p.e. 78°C/88 mbar (1.93 g, 55%). 1H NMR (CDCI3, 400 MHz) d 3.40 (s, 1H, O 7), 2.24 (s, 6H, N(CH3)2). 13C NMR (CDCI3, 75 MHz) d 62.6 (NCD2CD2OH), 60.4 (NCD2CD2OH), 47.7 (N(CH3)2). NMS (El) = 93.1093 (M + ). C4H72H4NO requiere 93.1092.
Ejemplo 2. Preparación de N,N-dimetil-[1 -2H2]-etanolamina (5) A una suspensión de N, /V-dimetilglicina (0.52 g, 5 mmoles) en THF seco (10 mi) se agregó deuterio de litio-aluminio (0.53 g, 12.5 mmoles) y la suspensión resultante se llevó a reflujo bajo argón. Después de 24 horas, la suspensión se dejó enfriar a temperatura ambiente y se vertió sobre Na2S04 acuoso saturado (15 mi) y se ajustó a pH 8 con 1 M de Na2C03, luego se lavó con éter (3 x 10 mi) y se secó (Na2S04). La destilación proporcionó el producto deseado (5) como un líquido incoloro, p.e. 65°C/26 mbar (0.06 g, 13%). 1H NMR (CDCI3, 400 MHz) d 2.43 (s, 2H, NCtf2CD2), 2.25 (s, 6H, N(CH3)2), 1.43 (s, 1H, OH). 13C NMR (CDCI3, 150 MHz) d 63.7 (NCH2CD2OH), 57.8 (NCH2CD2OH), 45.7 (N(CH3)2).
Ejemplo 3. Preparación de Fluorometiltosilato (8) CH2OTos2 ^ FCH2OTos 7 8 Se preparó el ditosilato de metileno (7) de acuerdo con un procedimiento establecido en la literatura y los datos analíticos fueron consistentes con los valores reportados (Emmons, W.D., et al., Journal of the American Chemical Society, 1953; 75:2257; y Neal, T.R., et al., Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals 2005; 48:557-68). A una solución de ditosilato de metileno (7) (0.67 g, 1.89 mmoles) en acetonitrilo seco (10 mi) se agregó Kryptofix K222 [4,7, 13, 16,21 ,24-hexoxa-1 , 10-diazabiciclo[8.8.8]hexacosano] (1.00 g, 2.65 mmoles) seguido por fluoruro de potasio (0.16 g, 2.83 mmoles). La suspensión se calentó entonces a 110°C bajo nitrógeno. Después de 1 hora, la TLC (7:3 de hexano/acetato de etilo/silice/UV254) indicó conversión completa de (7). La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (25 mi), se lavó con agua (2 x 15 mi) y se secó sobre MgSCv La cromatografía (5 ?> 10% de acetato de etilo/hexano) proporcionó el producto deseado (8) como un aceite incoloro (40 mg, 11%). 1H NMR (CDCI3, 400 Hz) d 7.86 (d, 2H, J = 8 Hz, arilo CH), 7.39 (d, 2H, J = 8 Hz, arilo CH), 5.77 (d, 1H, J = 52 Hz, CH2F), 2.49 (s, 3H, tolilo CH3). 13C NMR (CDCI3) d 145.6 (arilo), 133.8 (arilo), 129.9 (arilo), 127.9 (arilo), 98.1 (d, J = 229 Hz, CH2F), 21.7 (tolilo CH3). HRMS (Cl) = 222.0604 (M + NH4) + . Calculado para C8H13FN03S 222.0600.
Ejemplo 4. Preparación de N,N-Dimetiletanolamina(0-4-metoxibencil)éter (O-PMB-DMEA) N,N-D¡metiletanolam¡na(0-4-metox¡benc¡l(éter) A un matraz seco se agregó dimetietanolamina (4.46 g, 50 mmoles) y DMF seca ( 50 mi). La solución se agitó bajo argón y se enfrió en un baño de hielo. El hidruro de sodio (2.0 g, 50 mmoles) se agregó entonces en porciones durante 10 minutos y la mezcla de reacción se dejó calentar entonces a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, se agregó en gotas cloruro de 4-metoxibencilo (3.92 g, 25 mmoles) durante 10 minutos y la mezcla resultante se dejó agitar bajo argón. Después de 60 horas, GC-MS indicó la terminación de reacción (desaparición de cloruro de 4-metoxibencilo) y le mezcla de reacción se vertió sobre hidróxido de sodio 1 M (100 mi) y se extrajo con diclorometano (DCM) (3 x 30 mi) luego se secó (Na2S04). La cromatografía en columna (0?10% de metanol/(DCM; sílice neutro) proporcionó el producto deseado (O-PMB-DMEA) como un aceite amarillo) (1.46 g, 28 %). 1H NMR (CDCI3, 400 MHz) d 7.28 (d, 2H, J = 8.6 Hz, arilo CH), 6.89 (d, 2H, J = 8.6 Hz, arilo CH), 4.49 (s, 2H, -CH2-), 3.81 (s, 3H, OCH3), 3.54 (t, 2H, J = 5.8, NCH2CH20), 2.54 (t, 2H, J = 5.8, NCH2CH20), 2.28 (s, 6H, N(CH3)2). HRMS (ES) = 210.1497 (M + H + ). C12H20NO2 requiere 210.1494.
Ejemplo 4a. Preparación de Análogos Deuterados de N,N-Dimetiletanolam¡na(0-4-metoxibencil)-éter (0-PMB-DMEA) Los análogos di y tetra-deuterados de N,N-D¡metilaminoetanolamina(0-4-metoxibencil)éter pueden prepararse de acuerdo con el Ejemplo 4 a partir de la dimetiletanolamina di- o tetra-deuterada apropiada.
Ejemplo 5. Preparación de Síntesis de tosilato de [18F]fluorometilo (9) CH2OTos2 ^ 18FCH2OTos 7 9 A un frasco Wheaton que contiene una mezcla de K2C03 (0.5 mg, 3.6 Mmoles, disuelta en 100 µ? de agua), se agregó 18-corona-6 (10.3 mg, 39 moles) y acetonitrilo (500 µ?_) [16F]fluoruro (-20 mCi en 100 µ? de agua). El solvente entones se removió a 110°C bajo una corriente de nitrógeno (100 ml/min). Después de esto, se agregó acetonitrilo (500 µ?) y la destilación continuó hasta sequedad. Este procedimiento se repitió dos veces. Una solución de ditosilato de metileno (7) (6.4 mg, 18 µ?t???ße) en acetonitrilo (250 µ?_) que contiene 3% de agua se agregó entonces a temperatura ambiente seguido por calentamiento a 100°C durante 10-15 minutos, verificando mediante radio-HPLC analítica. La reacción se detuvo mediante la adición de 1:1 acetonitrilo/agua (1.3 mi) y se purificó mediante radio-HPLC semi-preparativa. La fracción del eluyente que contiene tosilato de [ 8F]fluorometilo (9) se recolectó y diluyó a un volumen final de 20 mi con agua, luego se inmovilizó en un cartucho Sep Pak C18 light (Waters, Milford, MA, USA) (pre-acondicionado con DMF (5 mi) y agua (10 mi). El cartucho se lavó con agua adicional (5 mi) y luego el cartucho, con tosilato de [18F]fluorometilo (9) retenido, se secó en una corriente de nitrógeno durante 20 minutos. Un perfil de reacción de HPLC típico para síntesis de [18F](13) se muestra en la Figura 4A/4B posteriormente.
Ejemplo 6. Radiosíntesis de derivados de [18F]f luorometilcolina mediante reacción con [18F]fluorobromometano lia: R,, R2, R3, R4 = H 11b: R,,R2=H;R3,R4 = D 11c: R1? R2, R3, R4 = D Se agregó [18F]fluorobromometano (preparado de acuerdo con ef al (Appl Radiat Isot 2001 ;54(69:927-33)) a un frasco Wheaton que contiene el precursor de amina N,N-dimetiletanolamina (150 µ?_) o N,N-dimetil-[1 ,2-2H4]etanolamina (3) (150 pL) en acetonitrilo seco (1 mi), pre-enfriado a 0°C. El frasco se selló y luego se calentó a 100°C durante 10 minutos. El solvente a granel se removió entonces bajo una corriente de nitrógeno, luego la muestra permanente se volvió a disolver en 5% de etanol en agua (10 mi) y se inmovilizó en un cartucho Sep-Pak CM light (Waters, Milford, MA, USA) (pre-acondicionado con 2 M de HCI (5 mi) y agua (10 mi) para efectuar el intercambio de anión de cloruro. El cartucho se lavó entonces con etanol (10 mi) y agua (10 mi) seguido por la elución del trazador radioactivo (11a) o (11c) utilizando solución salina (0.5-2.0 mi) y pasando a través de un filtro estéril (0.2 µ?t?) (Sartorius, Goettingen, Alemania).
Ejemplo 7. Radiosíntesis de [18F]Fluorometilcolina, [18F]fluorometil-[1-2H2]colina y [18F]fluorometil-[1 ,2-2H4] colina mediante reacción con tosilato de [18F]fluorometilmtilo Se agregó tosilato de [18F]fluorometilo (9) (preparado de acuerdo con el Ejemplo 5) y se eluyó a partir del cartucho Sep-Pak utilizando DMF seca (300 pL) a un frasco Wheaton que contiene uno de los siguientes precursores: ?,?-dimetiletanolamina (150 pL); N,N-dimetil-[1 ,2-2H4]etanolamina (3) (150 pL) (preparada de acuerdo con el Ejemplo 1), o N,N-dimetil-[12H2]etanolamina (5) (150 pl_) (preparada de acuerdo con el Ejemplo 2), y se calentó a 100°C con agitación. Después de 20 minutos, la reacción se extinguió con agua (10 mi) y se inmovilizó en un cartucho Sep Pak CM light (Waters) (pre-acondicionado con 2m de HCI (5 mi) y agua (10 mi)) con el fin de efectuar el intercambió de anión de cloruro y luego se lavó con etanol (5 mi) y agua (10 mi) seguida por la elución del trazador radioactivo [18F]Fluorometilcolina (12a), [ 8F]fluorometil-[1 -2H2]colina (12b) o [ 8F]fluorometil-[1 ,2-2H4]colina [ 8F] (12c) con solución salina isotónica (0.5-1.0 mi).
Ejemplo 8. Síntesis de fluorometiltosilato frío (15) Esquema 3 i ii CH2I2 CH2OTos2 FCH2OTos 13 14 15 i: p-toluensulfonato de plata, MeCN, reflujo, 20 horas; ii: KF, MeCN, reflujo, 1 hora.
De acuerdo con el Esquema 3 anterior: (a) Síntesis de ditosilato de metileno (14) Se hizo reaccionar el diyodometano comercialmente disponible (13) (2.67 g, 10 mmoles) con tosilato de plata (6.14 g, 22 mmoles), utilizando el método de Emmons and Ferris, para proporcionar ditosilato de metileno (10) (0.99 g) en 28% de rendimiento (Emmons, W.D. et al., "Metathetical Reactions of Silver Salts in Solution. II. The Synthesis of Alkyl Sulfonates", Journal of the American Chemical Society, 1953; 75:225). (b) Síntesis de Fluorometiltosilato frío (15) Se preparó fluorometiltosilato (11) (0.04 g) mediante sustitución nucleofílica de ditosilato de metileno (10) (0.67 g, 1.89 mmoles) del Ejemplo 3(a) utilizando fluoruro de potasio (0.16 g, 2.83 mmoles)/Kryptofix K222 (1.0 g, 2.65 mmoles) en acetonitrilo (10 mi) a 80°C para proporcionar el producto deseado en 11% de rendimiento.
Ejemplo 9. Síntesis de [ 8F]fluorobromometano (17) [18F]KF CH2Br2 ? 18FCH2Br 16 17 Adaptando el método de Bergman et al (Appl Radiat Isot 2001; 54(6):927-33), se hizo reaccionar el dibromometano comercialmente disponible (16) con fluoruro de [18F]potasio/Kryptofix K 222 en acetonitrilo a 110°C para proporcionar el [18F]fluorobromometano deseado (17), el cual se purifica mediante cromatografía en gas y se atrapó mediante elución en un frasco pre-enfriado que contiene acetonitrilo y el precursor de colina relevante.
Ejemplo 10. Análisis de pureza radioquímica Se confirmó la pureza radioquímica para [18F]Fluorometilcolina, [ 8F]fluorometil-[1-2H2]colina y [ 8F]fluorometil-[1 ,2-2H4]colina [18F] mediante co-elución con un estándar de cloruro de fluorocolina comercialmente disponible. Se utilizó un sistema de HPLC Agilent serie 1100 equipado con un detector de índice de refracción Agilent G1362A (RID) y un detector de diodo Bioscan Flowcount FC-3400 PIN. Se realizó la separación cromatográfica en una columna de fase inversa Phenomenex Luna Cíe (150 mm x 4.6 mm) y una fase móvil que comprende de ácido heptansulfónico 5 mM y acetonitrilo (90:10 v/v) suministrado a un índice de flujo de 1.0 ml/minutos.
Ejemplo 11. Estudio de oxidación enzimática utilizando colina oxidasa Este método se adaptó a partir de aquel de Roivannen et al (Roivainen, A., et al., European Journal of Nuclear Medicine 2000; 27:25-32). Una alícuota de cualquiera de [18F] Fluorometilcolina o [18F]fluorometil-[1,2-2H4]colina [18F] (100 µ?_, -3.7 MBq) se agregó a un frasco que contiene agua (1.9 mi) para dar una solución madre. Se agregó el amortiguador de fosfato de sodio (0.1 M, pH 7) (10 µ?.) que contiene colina oxidasa (0.05 unidades/uL) a una alícuota de la solución madre (190 uL) y el frasco se dejó reposar a temperatura ambiente, con agitación ocasional. En los periodos seleccionados (5, 20, 40 y 60 minutos) la muestra se diluyó con fase móvil de HPLC (regulador de pH A, 1.1 mi), se filtró (filtro e 0.22 µ??) y luego ~1 mi inyectado mediante un bucle de muestra de 1 mi sobre HPLC para análisis. Se realizó la separación cromatográfica en una columna Waters C18 Bondapak (7.8 x 300 mm) (Waters, Milford, Massachusetts, USA) a 3 ml/min con una fase móvil del regulador de pH A , el cual contenía acetonitrilo, etanol, ácido acético, 1.0 mol/L de acetato de amonio, agua y 0.1 mol/L de fosfato de sodio (800:68:2:3:127:10) [v/v]) y regulador de pH B, el cual contenía los mismos constituyentes aunque en diferentes proporciones (400:68:44:88:400:10 [v/v]). El programa de gradiente comprendió 100% de regulador de pH A durante 6 minutos, 0-100% de regulador de pH B durante 10 minutos, 100-0% B en 2 minutos, luego 0% B durante 2 minutos.
Ejemplo 12. Biodistribución Se hicieron crecer tumores de colon humano (HCT116) en ratones C3H-Hej machos (Harían, Bicester, Reino Unido) como se reportó previamente (Leytpn, J., et al., Cáncer Research 2005; 65(10):4202-10). Se midieron las dimensiones del tumor continuamente utilizando un calibrador y se calcularon los volúmenes del tumor mediante la ecuación: volumen= (p/6) x a x b x c, en donde a, b y c representan tres ejes ortogonales del tumor. Se utilizaron los ratones cuando sus tumores alcanzaron aproximadamente 100 mm3. [18F]Fluorometilcolina, [ 8F]fluorometil-[1 -2H2]colina y [18F]fluorometil-[1 ,2-2H4]colina (-3.7 MBq) se inyectaron cada una a través de la vena de la cola en ratones que padecen tumor no tratado, despiertos. Los ratones se sacrificaron en periodos predeterminados (2, 30 y 60 min) después de la inyección de trazador radioactivo bajo anestesia terminal para obtener sangre, plasma, tumor, corazón, pulmón, hígado, riñon y músculo. Se determinó la radioactividad del tejido en un contador gamma (contador Cobra II Auto-Gamma, Packard Biosciences Co, Pangbourne, UK) y la descomposición se corrigió. Los datos se expresaron como porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido.
Ejemplo 13. Potencial de oxidación de [18F]Fluorometilcolina ([18F]FCH) y [18F]fluorometil-[1 ,2-2H4]colina ([F]D4-FCH) in vivo Se inyectó [18F]FCH o [18F](D4-FCH) (80-100 pCi) a través de la vena de la cola en ratones anestesiados C3H-Hej que no padecen tumor; se utilizó anestesia de isof luorano/02/N20. Las muestras de plasma obtenidas 2, 15, 30 y 60 minutos después de la inyección se congelaron al instante en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C. Para análisis, las muestras se descongelaron y se mantuvieron a 4°C. Se agregó a aproximadamente 0.2 mi de plasma acetonitrilo helado (1.5 mi). La mezcla se centrifugó entonces (3 minutos, 15,493 x g; 4°C). El sobrenadante se evaporó a sequedad utilizando un evaporador giratorio (Heidoloph Instruments GMBH & CO, Schwabach, Alemania) a una temperatura del b año de 45°C. El residuo se suspendió en fase móvil (1.1 mi), se aclaró (filtro de 0.2 W) y se analizó mediante HPLC. Las muestras de hígado se homogenizaron en acetonitrilo helado (1.5 mi) y luego se trataron subsiguientemente como muestras por plasma. Todas las muestras se analizaron en un sistema de HPLC Agilent Serie 1100 equipado con un radiodetector ?-RAM Modelo 3 (IN/US Systems inc, FL., USA). El análisis se basó en el método de Roivannen (Roivainen, A., ef al., European Journal of Nuclear Medicine 2000; 27:25-32) utilizando una columna Phenomenex Luna SCX (10 µ, 250 x 4.6 mm) y una fase móvil que comprende fosfato diácido de sodio 0.25 M (pH 4.8) y acetonitrilo (90:10 v/v) suministrado a un índice de flujo de 2 ml/min.
Ejemplo 14. Distribución de metabolitos de colina Se obtuvieron muestras de hígado, riñon y de tumor en 30 minutos. Todas las muestras se congelaron al instante en nitrógeno líquido. Para análisis, las muestras se descongelaron y se mantuvieron a 4°C inmediatamente antes de su uso. Se agregó al plasma -0.2 mi de metanol helado (1.5 mi). La mezcla se centrifugó entonces (3 min, 15,493 x g, 4jC). El sobrenadante se evaporó hasta sequedad utilizando un evaporador giratorio (Heidoloph Instruments) a una temperatura del baño de 40°C. El residuo se suspendió en una fase móvil (1.1 mi), se clarificó (filtro de 0.2 Am), y se analizó mediante HPLC. Se homogenizaron las muestras de hígado, riñon y tumor en metanol helado (1.5 mi) utilizando un homogeneizador IKA Ultra-Turrax T-25 y se trataron subsiguientemente como muestras por plasma (anterior). Todas las muestras se analizaron mediante radio-HPLC en un sistema de HPLC Agilent serie 1100 (Agilent Technologies) equipado con un ?-detector ?-RAM Modelo 3 (IN/US Systems) y software Laura 3 (Lablogic). La fase estacionaria comprendió una columna de fase inversa Waters Bondapak C18 (300 x 7.8 mm) (Waters, Milford, MA, USA). Las muestras se analizaron utilizando una fase móvil que comprende el solvente A (acetonitrilo/agua/etanol/ácido acético/1.0 ml/L de acetato de amonio/0\1 moles/L fosfato de sodio; 800/127/68/2/3/10) y el solvente B (acetonitrilo/agua/etanol/ácido acético/1.0 moles/L acetato de amonio/0.1 moles/L fosfato de sodio; 400/400/68/44/88/10) con un gradiente de 0% B durante 6 minutos, luego 0 ? 100% B en 10 minutos, 100% B durante 0.5 minutos, 100 ? 0% B en 1.5 minutos, luego 0% B durante 2 minutos, suministrados en un índice de flujo de 3 ml/min.
Ejemplo 15. Metabolismo de [18F]D4-FCH y [18F1FCH mediante células de tumor HCT116.
Se hicieron crecer células HCT116 en frascos T150 por triplicado hasta que fueron 70% confluentes y luego se trataron con vehículo (1% de DMSO en medio de crecimiento) o 1 pmoles/L de PD0325901 en vehículo durante 24 horas. Las células se hicieron vibrar durante 1 hora con 1.1 MBq de cualquier [18F]D4-FCH o [18F]FCH. Las células se lavaron tres veces en solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS) helado, se rasparon en 5 mi de PBS, y se centrifugaron en 500 x g durante 3 minutos y luego se se volvieron a suspender en 2 mi de metanol helado para análisis de HPLC como se describió anteriormente para muestras de tejido. Para proporcionar evidencia bioquímica de que el 5'-fosfato fue el pico identificado en el cromatograma de HPLC, se trataron células cultivadas con fosfatasa alcalina como se describió previamente (Barthel, H., et al., Cáncer Res 2003; 63(13):3791-8). En resumen, las células HCT116 se cultivaron en platos de 100 mm por triplicado y se incubaron con 5.0 MBq [18F]FCH durante 60 minutos a 37°C para formar el supuesto [18F]FCH-fosfato. Las células se lavaron con 5 mi de PBS helada dos veces y luego se rasparon y centrifugaron a 750 x g (4°C, 3 minutos) en 5 mi de PBS. Las células se homogenizaron en 1 mi de 5 mmoles/L de Tris-HCI (pH 7.4) conteniendo 50% (v/v) de glicerol, 0.5 mmoles/L de MgCI2 y 0.5 mmoles/L de ZnCI2 y se incubaron con 10 unidad de fosfatasa alcalina bacteriana (tipo III) (Sigma) a 37°C en un baño acuoso de agitación durante 30 minutos para desfosforilar el [18F]FCH-fosfato. La reacción se terminó agregando metanol helado. Las muestras se procesaron como por plasma anterior y se analizaron mediante radio-HPLC. Los experimentos control se hicieron sin fosfatasa alcalina.
Ejemplo 16. Formación de imágenes de PET de animal pequeño Estudios de formación de imágenes de PET. Se llevaron a cabo barridos de formación de imágenes de [18F]FCH y [18F]D4-FCH dinámicos en un escáner de PET de animal pequeño dedicado, quad-HIDAC (Oxford Positrón Systems). Las características de este instrumento se han descrito previamente (Barthel, H., et al., Cáncer Res 2003; 63(13):3791 -8). Para escanear las venas de la cola, se canularon ratones tratados con vehículo o fármacos después de la inducción de anestesia (isof luorano/02/N20) . Se colocaron a los animales dentro de una plantilla termostáticamente controlada (calibrada para proporcionar una temperatura rectal de ~37°C) y colocada inclinada en el escáner. Se inyectó [18F]FCH o [18F]D4-FCH (2.96-3.7 MBq) mediante cánula en la vena de la cola y el barrido comenzó. Los barridos dinámicos se adquirieron en formato de modo de lista durante un periodo de 60 minutos como se reportó previamente (Leyton, J., et al., Cáncer Research 2006; 66(15):7621-9). Los datos adquiridos se clasificaron en contenedores de fistulografía de 0.5 mm y 19 periodos (0.5 x 0.5 x 0.5 mm voxels; 4 x 15, 4 x 60, y 11 x 300 s) para reconstrucción de imágenes, lo cual se hizo mediante proyección de atrás filtrada utilizando un filtro Hamming bidimensional (corte 0.6). Los conjuntos de datos de las imágenes se visualizaron utilizando el software Analyze (versión 6.0; Biomedical Imaging Resource, Mayo Clinic). Las imágenes acumuladas de 30 a 60 min de datos dinámicos se utilizaron para visualización de la incorporación de trazador radioactiva y a regiones trazadas de interés. Las regiones de interés se definieron manualmente en cinco regiones adyacentes de tumor (cada una de 0.5 mm de espesor). Se promediaron los datos dinámicos de estos cortes para cada tejido (hígado, riñon, músculo, orina y tumor) y en cada uno de los 19 periodos para obtener curvas de tiempo contra radioactividad. Las curvas de tiempo contra radioactividad del cuerpo entero que representan radioactividad inyectada se obtuvieron agregando juntos radioactividad en todos los voxeis reconstruidos de 200 x 160 x 160. La radioactividad de tumor se normalizó para radioactividad de cuerpo entero y se expresó como por ciento de dosis inyectada por voxel (% de ID/vox). La incorporación normalizada del trazador radioactivo en 60 minutos (% de ID/vox60) se utilizó para comparaciones subsiguientes. El promedio de la intensidad de voxel máxima normalizada a través de cinco cortes de tumor % de IDvox60max se utilizó también para la comparación para tener en cuenta la heterogeneidad de tumor y la existencia de regiones necróticas en tumor. El área bajo la curva se calculó como la integral de % de ID/vox de 0 a 60 minutos.
Ejemplo 17. Efecto de tratamiento de PD0325901 en ratones Se eligieron al azar ratones que padecen tumor HCT116 del mismo tamaño para recibir tratamiento diario mediante cebadura oral de vehículo (0.5% de hdiroxipropil metilcelulosa + 0.2% de Tween 80) o 25 mg/kg (0.005 ml/g de ratón) del inhibidor de quinasa extracelular mitogénica, PD0325901, preparada en vehículo. Se hizo el barrido de [18F]D4-FCH-PET después de 10 tratamientos diarios con la última dosis administrada 1 hora antes del barrido. Después de la formación de imágenes, los tumores se congelaron al instante en nitrógeno líquido y se almacenaron a ~80°C para análisis de expresión de colina quinasa A. Los resultados se ilustran en las Figuras 18 y 19.
Esto ejemplifica el uso de [18F]D4-FCH-PET como un biomarcador temprano de respuesta de fármaco. La mayoría de los fármacos actuales en desarrollo para quinasas clave objetivo en cáncer implicadas en proliferación o supervivencia celular. Este ejemplo demuestra que en un modelo de xenoinjerto para el cual el encogimiento de tumor no es significativo, la inhibición de trayectoria de quinasa de receptor-Ras-MAP del factor de crecimiento mediante el inhibidor MEK PD0325901 conduce a una reducción significativa en la incorporación de tumor [18F]D4-FCH lo que representa la inhibición de la trayectoria. La figura también demuestra que la inhibición de la incorporación de [18F]D4-FCH se debe por lo menos en parte a la inhibición de la actividad de la colina quinasa.
Ejemplo 18. Comparación de [18F]FCH y [18F]D4-FCH para Formación de Imágenes Como se ilustra en la Figura 16, [18F]FCH y [18F]D4-FCH se • incorporaron rápidamente en los tejidos y se retuvieron. La radioactividad del tejido se incrementó en el siguiente orden: músculo < orina < riñon < hígado. Dada la predominancia de la fosforilación sobre la oxidación en el hígado (Figura 12), se encontraron pocas diferencias en los niveles totales de radioactividad de hígado entre los dos trazadores radioactivos. La radioactividad de hígado en niveles de 60 minutos después de inyección de [18F]D4-FCH o [ 8F]FCH, % de ID/vox60, fue 20.92 ± 4.24 y 18.75 ± 4.28, respectivamente (Figura 16). Esto se mantiene también con los niveles más bajos de betaína con inyección de [18F]D4-FCH que con inyección de [18F]FCH (Figura 12). De este modo, la farmacocinética de los dos trazadores radioactivos en el hígado determinada por PET (la cual carece de resolución química) fue similar. Los niveles de radioactividad más baja en riñon para [18F]D4-FCH comparada con [18F]FCH (Figura 16), por otro lado, refleja el potencial más bajo de oxidación de [18F]D4-FCH en ríñones. El %/ID/voxeo para [18F]FCH y [18F]D4-FCH fueron 15.97 ± 4.65 y 7.59 ± 3.91, respectivamente en ríñones (Figura 16). La excreción urinaria fue similar entre los trazadores radioactivos. Las regiones de interés (ROIs) que se trazaron sobre la vejiga demostró valores de %ID/vox60 dé 5.20 ± 17.1 y 6.70 ± 0.71 para [18F]D4-FCH y [ 8F]FCH, respectivamente. Los metabolitos urinarios comprenden principalmente los trazadores radioactivos no metabolizados. El músculo demostró los niveles de trazadores radioactivos más bajos de cualquier tejido.
A pesar de la estabilidad sistémica relativamente elevada de [ 8F]D4-FCH y la proporción elevada de metabolitos de fosfocolina, se observó la incorporación del trazador radioactivo en tumor más elevada mediante PET en ratones que se inyectaron con [18F]D4-FCH en comparación con el grupo [18F]FCH. La Figura 17 muestra cortes de imágenes de PET transversales típicos (0.5 mm) que demuestran la acumulación de [18F]FCH y [18F]D4-FCH en xenoinjertos SKMEL-28 de melanoma humano. En este modelo de ratón, el contraste de señal a fondo de tumor fue cualitativamente superior en las imágenes de PET de [18F]D4-FCH en comparación con imágenes de [ 8F]FCH. Ambos trazadores radioactivos tuvieron similares perfiles cinéticos en tumor detectados mediante PET (Figura 17). Las cinéticas se caracterizaron por un influjo rápido de tumor con radioactividad pico en ~1 minuto (Figura 17). Los niveles de tumor se equilibraron entonces hasta ~5 minutos seguidos por una estabilización. El suministro y retención de [18F]D4-FCH fueron cuantitativamente más elevados que aquellos para FCH (Figura 17). El % de ID/vox60 para [ 8F]D4-FCH y [18F]FCH fueron 7.43 ± 0.47 y 5.50 ± 0.49, respectivamente (P = 0.04). Debido a que los tumores a menudo se presentan con población heterogénea de células, se aprovechó otra variable de formación de imágenes que es probablemente menos sensible al ruido experimental - un promedio de pixel máximo % de ID/vox6o a través de 5 cortes (% de I Dvox60max) · Esta variable fue también significativamente más elevada para [18F]D4-FCH (P = 0.05; Figura 17). Además, el área del tumor bajo la curva de tiempo contra la radioactividad (AUC) fue más elevada para ratones D4-FCH que para FCH (P = 0.02). Aunque se seleccionó el periodo de 30 minutos para un análisis más detallado de muestras de tejido, el porcentaje del compuesto parental en plasma fue consistentemente más elevado para [18F]D4-FCH en comparación con [18F]FCH en periodos cortos.
Con respecto a la formación de imágenes, la incorporación de tumor para ambos trazadores radioactivos fue similar a los periodos cortos (15 minutos) y tardíos (60 minutos) (Cuadro Suplementario 1). Los periodos cortos pueden ser apropiados para formación de imágenes pélvica.
Ejemplo 19. Formación de imágenes de respuesta al tratamiento Habiendo demostrado que [18F]D4-FCH fue un análogo de colina fluorado más estable para estudios in vivo, se investigó el uso de este trazador radioactivo para medir la respuesta a terapia. Estos estudios se realizaron en un sistema de modelo de tumor reproducible en los cuales se han caracterizado previamente los resultados del tratamiento, es decir, el xenoinjerto de carcinoma de colon humano HCT116 tratado con PD0325901 diariamente durante 10 días (Leyton, J., et al., "Noninvasive imaging of cell proliferation following mitogenic extracelular kinase inhibition by PD0325901", Mol Cáncer Ther 2008; 7(9):3112-21 ). El tratamiento con fármacos condujo a estasis de tumor (reducción en el tamaño de tumor únicamente por 12.2% en el día 10 en comparación con el grupo de tratamiento); los tumores de ratones tratados con vehículo se incrementaron por 375%. Los niveles de tumor [18F]D4-FCH en ratones tratados con PD0325901 alcanzaron su máximo aproximadamente al mismo tiempo como aquellos de los tratados con vehículo, sin embargo, hubo una marcada reducción en la retención del trazador radioactivo en los tumores tratados (Figura 18). Todas las variables de formación de imágenes disminuyeron después de 10 días de tratamiento con fármacos (P = 0.05, Figura 18). Esto indica que [18F]D4-FCH puede utilizarse para detectar respuesta al tratamiento incluso bajo condiciones en donde no se observan grandes cambios en la reducción del tamaño del tumor (Leyton, J., et al., "Noninvasive imaging of cell proliferation following mitogenic extracelular kinase inhibition by PD0325901", Mol Cáncer Ther 2008; 7(9):3112-21). Para entender los cambios biomarcados, el efecto celular intrínseco de PD0325901 en formación de D4-FCH-fosfocolina se examinó tratando células HCT116 de crecimiento exponencial en cultivo con PD0325901 durante 24 horas y midiendo la incorporación 60 minutos de [16F]D4-FCH in vitro. Como se muestra en la Figura 18, PD0325901 inhibió significativamente la formación de [18F]D4-FCH-fosfocolina en células tratadas con fármaco que demuestran que el efecto del fármaco en tumores se debe probablemente a los efectos celulares en metabolismo de colina en lugar de que con efectos hemodinámicos.
Para entender además los mecanismos que regulan la incorporación de [18F]D4-FCH con tratamiento con fármacos, se evaluaron los cambios en la expresión de CHKA en PD0325901 y tumores tratados con vehículo extirpados después del barrido de PET. Se observó in vivo una reducción significativa en la expresión de proteínas de CHKA en el día 10 (P = 0.03) después del tratamiento de PD0325901 (Figura 19) indicando que la expresión de CHKA reducida contribuyó a la incorporación de [18F]4-FCH más baja en tumores tratados con fármacos. La reducción inducida por fármacos de expresión de CHKA también tuvo lugar in vitro en células de crecimiento exponencial tratadas con PD0325901.
Ejemplo 20. Estadísticas.
Se hicieron los análisis estadísticos utilizando el software GraphPad Prism versión 4 (GraphPad). Se hicieron comparaciones entre el grupo utilizando la prueba Mann-Whitney no paramétrica. P <. 0.05 de dos colas.
Todas las patentes, artículos periodísticos, publicaciones y otros documentos discutidos y/o citados anteriormente se incorporan por consiguiente para referencia.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de la Fórmula (II): (II) en donde: Ri. R2, R3 y R4 son cada uno independientemente hidrógeno o deuterio (D); R5, Re y 7 son cada uno independientemente hidrógeno, R8, -(CH2)mR8 -(CD2)mR8, -(CF2)mR8l -CH(R8)2 o -CD(R8)2; R8 es independientemente hidrógeno, -OH, -CH3, -CF3) -CH2OH, -CH2F, -CH2CI, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2CI, CD2Br, CD2I o -C6H5; y m es un número entero de 1-4.
2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde: Ri, R2. R3 y R4 son cada uno independientemente hidrógeno; R5, R6 y R7 son cada uno independientemente hidrógeno, R8, -(CH2)mR8 -(CD2)mRB, -(CF2)mR8> o -CD(R8)2; R8 es independientemente hidrógeno, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2CI, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2CI, CD2Br, CD2I o -C6H5; y m es un número entero de 1-4.
3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde: Ri y R2 son cada uno hidrógeno; R3 y R4 son cada uno deuterio (D); Rs, Re y R7 son cada uno independientemente hidrógeno, R8, -(CH2)mR8 -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, o -CD(R8)2; R8 es independientemente hidrógeno, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2CI, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2CI, CD2Br, CD2I o -C6H5; y m es un número entero de 1-4.
4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde: R1. R2, 3 y R4 son cada uno deuterio (D); R5, R6 y 7 son cada uno independientemente hidrógeno, R8l -(CH2)mR8 -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, o -CD(R8)2; R8 es independientemente hidrógeno, -OH, -CH3l -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2CI, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2CI, CD2Br, CD2I o -C6H5¡ y m es un número entero de 1-4.
5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 de la Fórmula (Na):
6. compuesto de la Fórmula (llb) se proporciona (Hb) en donde: Ri, R2, R3 y R son cada uno independientemente hidrógeno ( deuterio (D); R5, R6 y R7 son cada uno independientemente hidrógeno, R8 -(CH2)mR8 -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, -CH(R8)2 o -CD(R8)2; R8 es independientemente hidrógeno, -OH, -CH3, -CF3 -CH2OH, -CH2F, -CH2CI, -CH2Br, -CH2I, -CD3l -CD2OH, -CD2F, CD2CI CD2Br, CD2I o -C6H5; y m es un número entero de 1-4; y Pg es un grupo protector hidroxilo.
7. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 6, en donde Pg es un grupo p-metoxibencilo (PMB), trimetilsililo (TMS), o dimetoxitritilo (DMTr).
8. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 6, en donde Pg es un grupo p-metoxibencilo (PMB).
9. Un compuesto de la Fórmula (lie): (lie) en donde: Ri. R2. R3 y R4 son cada uno independientemente hidrógeno o deuterio (D); R5. R6 y R7 son cada uno independientemente hidrógeno, R8, -(CH2)mR8 -(CD2)mRa, -(CF2)mR8, -CH(R8)2 o -CD(R8)2; R8 es independientemente hidrógeno, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2CI, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2CI, CD2Br, CD2I o -C6H5; y m es un número entero de 1-4; con la condición de que cuando R^l R2, R3 y R4 son cada uno hidrógeno, R5, Re y R7 no son cada uno hidrógeno; y con la condición de que cuando R,, R2, R3 y R4 son cada uno deuterio, R5, R6 y R7 no son cada uno hidrógeno.
10. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 9, en donde: Ri. R2] 3 y 4 son cada uno independientemente hidrógeno; con la condición de que R5, R6 y R7 no son cada uno hidrógeno.
11. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 9, en donde: Ri. R2, R3 y R son cada uno deuterio (D); R 5, R6 y R7 no son cada uno hidrógeno.
12. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 9, en donde: R1 y R2 son cada uno hidrógeno; y son cada uno deuterio (D)
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