KR20130122944A - 방사성표지 콜린 유사체 화합물의 신규 전구체 - Google Patents

방사성표지 콜린 유사체 화합물의 신규 전구체 Download PDF

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에드워드 조지 로빈스
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용준 자오
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Abstract

본 발명은 질환의 양전자 방출 단층촬영(PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터화 단층촬영(SPECT) 화상화에 방사성추적자로서 사용될 방사성표지 콜린 유사체의 제조를 위한 중간물(들), 전구체(들)에 대해 기술한다.

Description

방사성표지 콜린 유사체 화합물의 신규 전구체{NOVEL PRECURSORS OF RADIOLABELLED CHOLINE ANALOG COMPOUNDS}
본 발명은 변경된 콜린 대사와 관련된 질환 상태의 양전자 방출 단층촬영(PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터화 단층촬영(SPECT) 화상화(예를 들면, 전립샘암, 유방암, 뇌암, 식도암, 난소암, 자궁내막암, 폐암 및 전립샘암 - 원발성 종양, 결절성 질환 또는 전이의 종양 화상화)를 위한 신규 방사성추적자(들)에 대해 기술한다. 본 발명은 또한 상기 신규 방사성추적자(들)의 중간물(들), 전구체(들), 약제학적 조성물(들), 제조 방법, 및 사용 방법에 대해 기술한다.
콜린 키나제(EC 2.7.1.32) 활성의 생합성 산물인 포스포콜린은 몇 가지 암에서 상승되는, 막 포스파티딜콜린의 전구체이다 (문헌 [Aboagye, E.O., et al ., Cancer Res 1999; 59:80-4]; [Exton, J.H., Biochim Biophys Acta 1994; 1212:26-42]; [George, T.P., et al ., Biochim Biophys Acta 1989; 104:283-91]; 및 [Teegarden, D., et al ., J Biol Chem 1990; 265(11):6042-7]). 콜린 키나제의 과-발현 및 증가된 효소 활성이 전립샘암, 유방암, 폐암, 난소암 및 결장암에서 보고된 바 있으며 (문헌 [Aoyama, C., et al ., Prog Lipid Res 2004; 43(3):266-81]; [Glunde, K., et al ., Cancer Res 2004; 64(12):4270-6]; [Glunde, K., et al ., Cancer Res 2005; 65(23): 11034-43]; [Iorio, E., et al ., Cancer Res 2005; 65(20):9369-76]; [Ramirez de Molina, A., et al ., Biochem Biophys Res Commun 2002; 296(3):580-3]; 및 [Ramirez de Molina, A., et al ., Lancet Oncol 2007; 8(10):889-97]), 악성 전환 및 진행을 동반한 증가된 포스포콜린 수준의 커다란 원인이 되는데; 암 세포에서의 증가된 포스포콜린 수준은 포스포리파제 C를 통한 분해의 증가에 기인하기도 한다 (문헌 [Glunde, K., et al ., Cancer Res 2004; 64(12):4270-6]).
적은 소변 배설량 함께, 이와 같은 표현형으로 인하여, [11C]콜린은 전립샘암을 화상화하고 그보다 덜한 빈도로 뇌암, 식도암 및 폐암을 화상화하는 양전자 방출 단층촬영(PET) 및 PET-컴퓨터화 단층촬영(PET-CT)용의 탁월한 방사성추적자가 되었다 (문헌 [Hara, T., et al ., J Nucl Med 2000; 41:1507-13]; [Hara, T., et al ., J Nucl Med 1998; 39:990-5]; [Hara, T., et al ., J Nucl Med 1997; 38:842-7]; [Kobori, O., et al ., Cancer Cell 1999; 86:1638-48]; [Pieterman, R.M., et al., J Nucl Med 2002; 43(2):167-72]; 및 [Reske, S.N. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2008; 35:1741]). 특유의 PET 신호는 콜린 키나제에 의한 [11C]포스포콜린으로의 방사성추적자의 수송 및 인산화에 기인한다.
그러나, 중요한 것은 [11C]콜린(은 물론, 플루오로-유사체)이 신장 및 간 조직에서는 주로 콜린 옥시다제 (EC 1.1.3.17)에 의해 방사성추적자의 주사 직후 혈장에서 검출가능한 대사물들을 동반하여 [11C]베타인으로 산화된다 (하기 도 1 참조)는 것이다 (문헌 [Roivainen, A., et al ., European Journal of Nuclear Medicine 2000; 27:25-32]). 이는 나중에 화상화 프로토콜이 사용될 때 모(parent) 방사성추적자와 이화대사물의 상대적인 기여도 구별을 어렵게 한다.
Figure pct00001
탄소-11의 짧은 물리적 반감기 (20.4분)를 극복하기 위하여, 하기의 [18F]플루오로메틸콜린 ([18F]FCH)이 개발되었으며:
Figure pct00002
(문헌 [DeGrado, T.R., et al ., Cancer Res 2001; 61(1):110-7]), 이와 같이 상대적으로 새로운 방사성추적자를 사용한 수많은 PET 및 PET-CT 연구들이 발표되었다 (문헌 [Beheshti, M., et al ., Eur J Nucl Med Mol Imaging 2008; 35(10):1766-74]; [Cimitan, M., et al ., Eur J Nucl Med Mol Imaging 2006; 33(12):1387-98]; [de Jong, I.J., et al ., Eur J Nucl Med Mol Imaging 2002; 29:1283-8]; 및 [Price, D.T., et al ., J Urol 2002; 168(1):273-80]). 플루오르-18의 더 긴 반감기 (109.8분)는 체순환에서의 모 추적자의 충분한 청소(clearance)가 이루어질 경우, 나중의 종양 화상화를 가능케 함에 있어서 잠재적으로 유리할 것으로 간주되었다 (문헌 [DeGrado, T.R., et al ., J Nucl Med 2002; 43(1):92-6]).
WO2001/82864호는 [18F]플루오로메틸콜린 ([18F]-FCH)을 포함한 18F-표지 콜린 유사체들, 및 신생물(neoplasm)의 비-침습성 검출 및 위치지정을 위한 조영제(imaging agent)로서의 그의 용도 (예컨대 PET), 그리고 신체에서의 콜린 처리에 영향을 주는 병태생리학에 대해 기술하고 있다 (요약서). WO2001/82864호는 또한 18F-표지된 디-중수소화 콜린 유사체, 예컨대 하기 [18F]플루오로메틸-[1-2H2]콜린 ([18F]FDC) (이하 "[18F]D2-FCH"로 지칭됨)에 대해 기술하고 있다:
Figure pct00003
콜린 및 [1,2-2H4]콜린의 상대적 산화 안정성을 포함하여, 다양한 조건하에서의 콜린의 산화가 연구된 바 있다 (문헌 [Fan, F., et al ., Biochemistry 2007, 46, 6402-6408]; [Fan, F., et al ., Journal of the American Chemical Society 2005, 127, 2067-2074]; [Fan, F., et al ., Journal of the American Chemical Society 2005, 127, 17954-17961]; [Gadda, G. Biochimica et Biophysica Acta 2003, 1646, 112-118]; [Gadda, G., Biochimica et Biophysica Acta 2003, 1650, 4-9). 이론적으로, β-2차 동위원소 효과가 ~1.05이기 때문에, 추가적인 중수소 치환의 효과는 1차 동위원소 효과가 8-10이라는 점에서 무시할 만한 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Fan, F., et al ., Journal of the American Chemical Society 2005, 127, 17954-17961]).
[18F]플루오로메틸콜린은 현재 임상에서 종양 상태를 화상화하는 데에 광범위하게 사용되고 있다 (문헌 [Beheshti, M., et al ., Radiology 2008, 249, 389-90]; [Beheshti, M., et al ., Eur J Nucl Med Mol Imaging 2008, 35, 1766-74]).
하기하는 바와 같이, 본 발명은 신규 전구체 화합물을 제공한다. 이러한 신규 전구체 화합물은 예를 들면 18F-방사성표지된 방사성추적자의 합성에 사용될 수 있으며, 그것은 다시 콜린 대사의 PET 화상화에 사용될 수 있다.
도 1은 주요 콜린 대사물들의 화학 구조 및 그 경로를 도시한다.
도 3은 테트라중수소화 콜린 전구체의 NMR 분석을 도시한다. 상부는 1H NMR 스펙트럼이며; 하부는 13C NMR 스펙트럼이다. 모든 스펙트럼은 CDCl3에서 수득하였다.
도 4는 [18F]플루오로메틸 토실레이트(9) 및 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린 (D4-FCH)의 합성에 대한 HPLC 프로필을 도시하는 것으로써, (A) 15분 후의 (9)의 합성에 대한 방사성-HPLC 프로필; (B) 15분 후의 (9)의 합성에 대한 UV (254 nm) 프로필; (C) 10분 후의 (9)의 합성에 대한 방사성-HPLC 프로필; (D) 조 (9)에 대한 방사성-HPLC 프로필; (E) 주사용의 제제화된 (9)의 방사성-HPLC 프로필; (F) 제제화 후 굴절률 프로필 (양이온 검출 모드)을 도시한다.
도 5a는 비보호 전구체를 통한 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린 (D4-FCH)의 제조를 위한 전체적으로 조립된 본 발명 카세트의 도시이다.
도 5b는 PMB-보호 전구체를 통한 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린 (D4-FCH)의 제조를 위한 전체적으로 조립된 본 발명 카세트의 도시이다.
도 6은 과망간산 칼륨 산화 연구의 대표적인 방사성-HPLC 분석을 도시한다. 상부 열은 [18F]플루오로메틸콜린 ([18F]FCH) 및 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린 ([18F]D4-FCH)에 대한 대조 샘플로써, 시간 0 (0분)에서의 반응 혼합물로부터의 추출물이다. 하부 열은 20분 동안 처리 후의 추출물이다. 좌측편은 [18F]플루오로메틸콜린 ([18F]FCH)에 대한 것이며, 우측은 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린 ([18F]D4-FCH)에 대한 것이다.
도 7은 과망간산 칼륨 존재하에서의 [18F]플루오로메틸콜린 및 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린의 화학적 산화 가능성을 도시한다.
도 8은 콜린 옥시다제 존재하에서의 [18F]플루오로메틸콜린 및 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린의 시간-추이 안정성 분석을 도시하는 것으로서, 모 화합물의 각 해당 베타인 유사체로의 전환을 표시한다.
도 9는 콜린 옥시다제 연구의 대표적인 방사성-HPLC 분석을 도시한다. 상부 열은 [18F]플루오로메틸콜린 및 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린에 대한 대조 샘플로써, 시간 0 (0분)에서의 반응 혼합물로부터의 추출물이다. 하부 열은 40분 동안 처리 후의 추출물이다. 좌측편은 [18F]플루오로메틸콜린의 것이며, 우측은 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린의 것이다.
도 10. 상부: 마우스에 정맥내로 추적자를 주사하고 15분 후에 수득된 마우스 혈장 샘플에서의 방사성-HPLC에 의한, [18F]플루오로메틸콜린 (FCH)의 [18F]FCH-베타인으로의, 그리고 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린 (D4-FCH)의 [18F]D4-FCH-베타인으로의 대사의 분석. 하부: 혈장에서의 [18F]플루오로메틸콜린 (FCH) 및 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린 (D4-FCH)의 대사물인 [18F]FCH-베타인 (FCHB) 및 [18F]D4-FCH 베타인 (D4-FCHB)으로의 것인, 모 추적자의 전환의 개요.
도 11. HCT-116 종양 보유 마우스에서의 [18F]플루오로메틸콜린 (FCH), [18F]플루오로메틸-[1-2H2]콜린 (D2-FCH) 및 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린 (D4-FCH)의 생체분포 시간 추이. 삽입도: 평가에 선택된 시점. A) [18F]플루오로메틸콜린의 생체분포; B) [18F]플루오로메틸-[1-2H2]콜린의 생체분포; C) [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린의 생체분포; D) 차트 A-C로부터의 [18F]플루오로메틸콜린 (FCH), [18F]플루오로메틸-[1-2H2]콜린 (D2-FCH) 및 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린 (D4-FCH)에 대한 종양 흡수의 시간 추이. 대략 3.7 MBq의 [18F]플루오로메틸콜린 (FCH), [18F]플루오로메틸-[1-2H2]콜린 (D2-FCH) 및 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린 (D4-FCH)을 깨어 있는 수컷 C3H-Hej 마우스에 주사한 후, 표시되어 있는 시점에 이소플루오란 마취하에 그것을 희생시켰다.
도 12는 주사 후 30분에 표준 백색 마우스로부터 수확된 조직에서의 콜린 방사성추적자 대사물의 분포를 보여주는 방사성-HPLC 크로마토그램을 도시한다. 상부 열은 방사성추적자 표준이며; 중간 열은 신장 추출물이고; 하부 열은 간 추출물이다. 좌측은 [18F]FCH, 우측은 [18F]D4-FCH이다.
도 13은 주사-후 30분에 HCT116 종양에서의 콜린 방사성추적자의 대사물 분포를 보여주는 방사성-HPLC 크로마토그램을 도시한다. 상부-열은 순수 방사성추적자 표준이며; 하부 열은 30분 종양 추출물이다. 좌측은 [18F]FCH, 중간은 [18F]D4-FCH, 우측은 [11C]콜린이다.
도 14는 HCT116 세포를 사용한 포스포콜린 HPLC 확인을 위한 방사성-HPLC 크로마토그램을 도시한다. 좌측은 순수 [18F]FCH 표준이며; 중간은 포스파타제 효소 인큐베이션이고; 우측은 대조 인큐베이션이다.
도 15는 선택된 시점에서의 [18F]플루오로메틸콜린 유사체인 [18F]플루오로메틸콜린, [18F]플루오로메틸-[1-2H2]콜린 및 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린에 대한 방사성대사물의 분포를 도시한다.
도 16은 [18F]FCH 및 [18F]D4-FCH의 조직 프로필을 도시한다. (a) PET 데이터로부터 유도된, 간, 신장, 소변 (방광) 및 근육에서의 [18F]FCH의 흡수에 대한 시간 대 방사능 곡선이며, (b) [18F]D4-FCH에 대한 상응 데이터이다. 결과는 평균±SE이며; n = 4마리의 마우스이다. 명료성을 위하여 상위 및 하위 오차 막대 (SE)가 사용되었다 (문헌 [Leyton, et al ., Cancer Res 2009: 69:(19), pp 7721-7727]).
도 17은 SKMEL28 종양 이종이식편에서의 [18F]FCH 및 [18F]D4-FCH의 종양 프로필을 도시한다. (a) 종양을 관통하는 0.5 mm 가로 단면 및 방광을 관통하는 관상 단면을 나타내는, SKMEL28 종양-보유 마우스의 통상적인 [18F]FCH-PET 및 [18F]D4-FCH-PET 화상이다. 가시화를 위하여, 30 내지 60분의 합쳐진 화상 데이터를 도시하였다. 화살표는 종양 (T), 간 (L) 및 방광 (B)를 가리킨다. (b) 종양에서의 [18F]FCH 및 [18F]D4-FCH에 대한 시간 대 방사능 곡선의 비교이다. 각 종양에 대하여, 각각 19개 시간 틀에서의 방사능을 측정하였다. 데이터는 평균 %ID/복셀60, 평균±SE이다 (n = 군 당 4마리의 마우스). (c) 화상화 변수의 개요이다. 데이터는 평균±SE, n=4; *P=0.04이다. 명료성을 위하여, 상위 및 하위 오차 막대 (SE)가 사용되었다.
도 18은 HCT116 종양 및 세포에서의 [18F]D4-FCH의 흡수에 대한 미토겐성 세포외 키나제 억제제인 PD0325901의 효과를 도시한다. (a) 비히클 또는 25 mg/kg의 PD0325901을 사용한 10일 동안의 매일 치료 후, HCT116 종양에서의 표준화된 시간 대 방사능 곡선이다. 데이터는 평균±SE, n = 3마리의 마우스이다. (b) 화상화 변수인 %ID/복셀60, %ID/복셀60max, 및 AUC의 개요이다. 데이터는 평균±SE, *P=0.05이다. (c) 배지에서의 [18F]D4-FCH를 사용한 1시간 동안의 HCT116 세포의 처리 후 [18F]D4-FCH 포스포콜린 대사에 대한 PD0325901 (1 μM)의 본질적인 세포 효과이다. 데이터는 평균±SE; n=3; *P=0.03이다.
도 19는 HCT116 종양에서의 콜린 키나제 A의 발현을 도시한다. (a) 종양 콜린 키나제 A (CHKA) 단백질 발현에 대한 PD0325901의 효과를 나타내는 통상적인 웨스턴 블럿(Western blot)이다. PD0325901 (경구로 10일 동안 매일 25 mg/kg) 또는 비히클이 주사된 마우스로부터의 HCT116 종양을 웨스턴 블러팅에 의해 CHKA 발현에 대하여 분석하였다. β-액틴을 적재 대조로서 사용하였다. (b) β-액틴에 대한 비로 나타낸 CHKA 발현에 대한 간략 농도계 측정치이다. 결과는 평균 비±SE; n=3; *P=0.05이다.
[발명의 개요]
본 발명은 하기 화학식 II의 전구체 화합물을 추가 제공한다:
<화학식 II>
Figure pct00004
(식 중:
R1, R2, R3, 및 R4는 각각 독립적으로 수소 또는 중수소 (D)이고;
R5, R6, 및 R7은 각각 독립적으로 수소, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, -CH(R8)2, 또는 -CD(R8)2이고;
R8은 독립적으로 수소, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2Cl, CD2Br, CD2I, 또는 -C6H5이고;
m은 1 내지 4의 정수임).
본 발명은 또한 화학식 II 전구체 화합물의 제조 방법을 제공한다.
추가적으로, 본 발명은 화학식 II의 전구체 화합물, 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 하기 화학식 I의 신규 방사성표지 콜린 유사체 화합물을 제공하되:
<화학식 I>
(식 중:
R1, R2, R3, 및 R4는 각각 독립적으로 수소 또는 중수소 (D)이고;
R5, R6, 및 R7은 각각 독립적으로 수소, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, -CH(R8)2, 또는 -CD(R8)2이고;
R8은 독립적으로 수소, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2Cl, CD2Br, CD2I, 또는 -C6H5이고;
m은 1 내지 4의 정수이고;
X 및 Y는 각각 독립적으로 수소, 중수소 (D), 또는 F이고;
Z는 F, Cl, Br, 및 I에서 선택되는 할로겐, 또는 방사성동위원소이고;
Q는 음이온성 상대이온임),
단, 상기 화학식 I의 화합물이 플루오로메틸콜린, 플루오로메틸-에틸-콜린, 플루오로메틸-프로필-콜린, 플루오로메틸-부틸-콜린, 플루오로메틸-펜틸-콜린, 플루오로메틸-이소프로필-콜린, 플루오로메틸-이소부틸-콜린, 플루오로메틸-sec-부틸-콜린, 플루오로메틸-디에틸-콜린, 플루오로메틸-디에탄올-콜린, 플루오로메틸-벤질-콜린, 플루오로메틸-트리에탄올-콜린, 1,1-디듀테로플루오로메틸콜린, 1,1-디듀테로플루오로메틸-에틸-콜린, 1,1-디듀테로플루오로메틸-프로필-콜린, 또는 이들의 [18F] 유사체는 아니다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서는, 화학식 I의 화합물이 제공되며, 식 중:
R1, R2, R3, 및 R4는 각각 독립적으로 수소이고;
R5, R6, 및 R7은 각각 독립적으로 수소, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, -CH(R8)2, 또는 -CD(R8)2이고;
R8은 독립적으로 수소, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2Cl, CD2Br, CD2I, 또는 -C6H5이고;
m은 1 내지 4의 정수이고;
X 및 Y는 각각 독립적으로 수소, 중수소 (D), 또는 F이고;
Z는 F, Cl, Br, 및 I에서 선택되는 할로겐, 또는 방사성동위원소이고;
Q는 음이온성 상대이온이되,
단, 상기 화학식 I의 화합물이 플루오로메틸콜린, 플루오로메틸-에틸-콜린, 플루오로메틸-프로필-콜린, 플루오로메틸-부틸-콜린, 플루오로메틸-펜틸-콜린, 플루오로메틸-이소프로필-콜린, 플루오로메틸-이소부틸-콜린, 플루오로메틸-sec-부틸-콜린, 플루오로메틸-디에틸-콜린, 플루오로메틸-디에탄올-콜린, 플루오로메틸-벤질-콜린, 플루오로메틸-트리에탄올-콜린, 또는 이들의 [18F] 유사체는 아니다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서는, 화학식 I의 화합물이 제공되며, 식 중:
R1 및 R2는 각각 수소이고;
R3 및 R4는 각각 중수소 (D)이고;
R5, R6, 및 R7은 각각 독립적으로 수소, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, -CH(R8)2, 또는 -CD(R8)2이고;
R8은 독립적으로 수소, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2Cl, CD2Br, CD2I, 또는 -C6H5이고;
m은 1 내지 4의 정수이고;
X 및 Y는 각각 독립적으로 수소, 중수소 (D), 또는 F이고;
Z는 F, Cl, Br, 및 I에서 선택되는 할로겐, 또는 방사성동위원소이고;
Q는 음이온성 상대이온이되,
단, 상기 화학식 I의 화합물이 1,1-디듀테로플루오로메틸콜린, 1,1-디듀테로플루오로메틸-에틸-콜린, 1,1-디듀테로플루오로메틸-프로필-콜린, 또는 이들의 [18F] 유사체는 아니다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서는, 화학식 I의 화합물이 제공되며, 식 중:
R1, R2, R3, 및 R4는 각각 중수소 (D)이고;
R5, R6, 및 R7은 각각 독립적으로 수소, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, -CH(R8)2, 또는 -CD(R8)2이고;
R8은 독립적으로 수소, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2Cl, CD2Br, CD2I, 또는 -C6H5이고;
m은 1 내지 4의 정수이고;
X 및 Y는 각각 독립적으로 수소, 중수소 (D), 또는 F이고;
Z는 F, Cl, Br, 및 I에서 선택되는 할로겐, 또는 방사성동위원소이고;
Q는 음이온성 상대이온이다.
본 발명에 있어서, 여기에서 기술되는 바와 같은 화학식 I 화합물의 Z가 할로겐인 경우, 그것은 F, Cl, Br, 및 I에서 선택되는 할로겐; 바람직하게는 F일 수 있다.
본 발명에 있어서, 여기에서 기술되는 바와 같은 화학식 I 화합물의 Z가 방사성동윈원소인 경우 (이하 "방사성표지된 화학식 I의 화합물"로 지칭됨), 그것은 업계에 알려져 있는 임의의 방사성동위원소일 수 있다. 바람직하게는, Z는 화상화 (예컨대 PET, SPECT)에 적합한 방사성동위원소이다. 보다 바람직하게는, Z는 PET 화상화에 적합한 방사성동위원소이다. 더욱 더 바람직하게는, Z는 18F, 76Br, 123I, 124I, 또는 125I이다. 더욱 더 바람직하게는, Z는 18F이다.
본 발명에 있어서, 여기에서 기술되는 바와 같은 화학식 I 화합물의 Q는 양이온성 암모늄 화합물에 적합한 업계 공지의 임의의 음이온성 상대이온일 수 있다. Q의 적합한 예에는 음이온성인 브로마이드 (Br-), 클로라이드 (Cl-), 아세테이트 (CH3CH2C(O)O-), 또는 토실레이트 (-OTos)가 포함된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, Q는 브로마이드 (Br-) 또는 토실레이트 (-OTos)이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, Q는 클로라이드 (Cl-) 또는 아세테이트 (CH3CH2C(O)O-)이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, Q는 클로라이드 (Cl-)이다.
본 발명에 있어서, 화학식 I 화합물의 바람직한 실시양태는 하기 화학식 Ia의 화합물이다:
<화학식 Ia>
Figure pct00006
(식 중:
R1, R2, R3, 및 R4는 각각 독립적으로 중수소 (D)이고;
R5, R6, 및 R7은 각각 수소이고;
X 및 Y는 각각 독립적으로 수소이고;
Z는 18F이고;
Q는 Cl-임).
본 발명에 있어서, 바람직한 화학식 Ia의 화합물은 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]-콜린 ([18F]-D4-FCH)이다. [18F]-D4-FCH는 대사적으로 더 안정한 플루오로콜린 (FCH) 유사체이다. [18F]-D4-FCH는 상응하는 18F-비-중수소화 및/또는 18F-디-중수소화 유사체에 비해 수많은 장점들을 제공한다. 예를 들면, [18F]-D4-FCH는 [18F]플루오로메틸콜린에 비해 증가된 화학적 및 효소적 산화 안정성을 나타낸다. [18F]-D4-FCH는 디듀테로플루오로콜린인 [18F]플루오로메틸-[1-2H2]콜린에 비해 향상된 생체내 프로필을 가지는데 (즉, 생체내 화상화에 더 우수한 가용성을 나타냄), 그것은 선행 문헌에 의해 예상될 수 있는 것을 초과하여 넘는 예상 밖의 것이다. [18F]-D4-FCH는 향상된 안정성을 나타내며, 그에 따라 나중에 체순환으로부터의 방사성추적자의 충분한 청소 후 종양의 화상화를 더 잘 가능케 하게 된다. [18F]-D4-FCH는 또한 증가된 기질 가용성을 통하여 종양 화상화의 감도를 향상시킨다. 이러한 장점들은 하기에 더욱 상세하게 논의되어 있다.
본 발명은 하기 화학식 III의 화합물을 제공하되:
<화학식 III>
Figure pct00007
(식 중:
R1, R2, R3, 및 R4는 각각 독립적으로 수소 또는 중수소 (D)이고;
R5, R6, 및 R7은 각각 독립적으로 수소, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, -CH(R8)2, 또는 -CD(R8)2이고;
R8은 독립적으로 수소, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2Cl, CD2Br, CD2I, 또는 -C6H5이고;
m은 1 내지 4의 정수이고;
C*는 탄소의 방사성동위원소이고;
X, Y 및 Z는 각각 독립적으로 수소, 중수소 (D), F, Cl, Br, 및 I에서 선택되는 할로겐, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴 기이고;
Q는 음이온성 상대이온임),
단, 상기 화학식 III의 화합물이 11C-콜린은 아니다.
본 발명에 있어서, 화학식 III 화합물의 C*는 탄소의 임의의 방사성동윈원소일 수 있다. C*의 적합한 예에는 11C, 13C, 및 14C가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. Q는 화학식 I의 화합물에 기술되어 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서는, C*가 11C이며; X 및 Y가 각각 수소이고; Z가 F인 화학식 III의 화합물이 제공된다.
약제학적 또는 방사성약제학적 조성물
본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 생체적합성 담체와 함께 화학식 Ia의 화합물을 포함한 화학식 I의 화합물 (각각 본원에서 정의되는 바와 같음)을 포함하는 약제학적 또는 방사성약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 있어서, 화학식 I 또는 Ia 화합물의 Z가 방사성동위원소인 경우, 약제학적 조성물은 방사성약제학적 조성물이다.
본 발명은 또한 포유동물 투여에 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 생체적합성 담체와 함께 화학식 Ia의 화합물을 포함한 화학식 I의 화합물 (각각 본원에서 정의되는 바와 같음)을 포함하는 약제학적 또는 방사성약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 생체적합성 담체와 함께 본원에서 정의되는 바와 같은 화학식 III의 화합물을 포함하는 약제학적 또는 방사성약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 포유동물 투여에 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 생체적합성 담체와 함께 본원에서 정의되는 바와 같은 화학식 III의 화합물을 포함하는 약제학적 또는 방사성약제학적 조성물을 제공한다.
업계 숙련자라면 이해하게 될 바와 같이, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제는 업계에 알려져 있는 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제일 수 있다.
"생제적합성 담체"는 화학식 I, Ia, 또는 III의 화합물이 현탁 또는 용해되어 약제학적 조성물이 생리학적으로 허용가능해질 수 있는, 예를 들면 독성 또는 과도한 불편 없이 포유동물 신체에 투여될 수 있는 임의의 유체, 특히 액체일 수 있다. 생체적합성 담체는 적합하게는 주사가능한 담체 액체, 예컨대 주사용의 멸균된 무-발열원수; 수용액, 예컨대 식염수 (유리하게는 주사용 최종 생성물이 등장성인 것 또는 저장성이 아닌 것 중 어느 하나가 되도록 조정될 수 있음); 1종 이상 장성-조정 물질 (예컨대 생체적합성 상대이온과의 혈장 양이온의 염), 당 (예컨대 글루코스 또는 수크로스), 당 알콜 (예컨대 소르비톨 또는 만니톨), 글리콜 (예컨대 글리세롤), 또는 기타 비-이온성 폴리올 물질 (예컨대 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜 등)의 수용액이다. 생체적합성 담체는 에탄올과 같은 생체적합성 유기 용매를 포함할 수도 있다. 그와 같은 유기 용매는 더 많은 친지질성 화합물 또는 배합물을 가용화하는 데에 유용하다. 바람직하게는, 생체적합성 담체는 주사용 무-발열원수, 등장성 식염수 또는 에탄올 수용액이다. 정맥내 주사용 생체적합성 담체의 pH는 적합하게는 4.0 내지 10.5의 범위이다.
약제학적 또는 방사성약제학적 조성물은 비경구로, 즉 주사에 의해 투여될 수 있으며, 가장 바람직하게는 수용액이다. 그와 같은 조성물은 임의로 버퍼; 약제학적으로 허용가능한 가용화제 (예컨대 시클로덱스트린 또는 계면활성제, 예컨대 플루로닉(Pluronic), 트윈(Tween) 또는 인지질); 약제학적으로 허용가능한 안정화제 또는 항산화제 (예컨대 아스코르브산, 겐티스산 또는 파라-아미노벤조산)와 같은 추가 성분들을 함유할 수 있다. 화학식 I, Ia, 또는 III의 화합물이 방사성약제학적 조성물로서 제공되는 경우, 상기 화합물의 제조 방법은 방사성약제학적 조성물을 수득하는 데에 필요한 단계, 예를 들면 유기 용매의 제거, 생체적합성 버퍼 및 임의의 소정 추가 성분의 첨가를 추가적으로 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위해서는, 방사성약제학적 조성물이 멸균되어 있으며 무발열원성이라는 것을 보장하는 단계를 취할 필요도 있다. 그와 같은 단계들에 대해서는 업계 숙련자에게 잘 알려져 있다.
본 발명 화합물의 제조
본 발명은 화학식 II의 전구체 화합물을 화학식 IIIa의 화합물과 반응시켜 화학식 I의 화합물을 형성시키는 것을 포함하는 (반응식 A), 화학식 Ia의 화합물을 포함한 화학식 I 화합물의 제조 방법을 제공한다:
<반응식 A>
Figure pct00008
(식 중, 화학식 I 및 II의 화합물은 각각 본원에서 기술되는 바와 같고, 화학식 IIIa의 화합물은 하기와 같음:
<화학식 IIIa>
ZXYC-Lg
(식 중, X, Y 및 Z는 각각 화학식 I의 화합물에 대하여 본원에서 정의되는 바와 같고, "Lg"는 이탈 기임). "Lg"의 적합한 예에는 브롬 (Br) 및 토실레이트 (OTos)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 화학식 IIIa의 화합물은 본원에서 기술되는 것들을 포함하여 업계에 알려져 있는 어떠한 수단에 의해서도 제조될 수 있다.
Z가 F이며; X 및 Y가 모두 H이고; Lg가 OTos인 화학식 IIIa 화합물 (즉, 플루오로메틸토실레이트)의 합성은 하기 반응식 3에 제시되어 있는 바와 같이 달성될 수 있다:
<반응식 3>
Figure pct00009
(식 중: i: 은 p-톨루엔술포네이트, MeCN, 환류, 20시간;
ii: KF, MeCN, 환류, 1시간).
상기 반응식 3에 있어서:
(a) 메틸렌 디토실레이트의 합성
에몬스(Emmons) 및 페리스(Ferris)의 방법을 사용하여, 시중에서 구입가능한 디요오도메탄을 은 토실레이트와 반응시킴으로써, 메틸렌 디토실레이트를 생성할 수 있다 (문헌 [Emmons, W.D., et al ., "Metathetical Reactions of Silver Salts in Solution. II. The Synthesis of Alkyl Sulfonates", Journal of the American Chemical Society, 1953; 75:225]).
(b) 냉 플루오로메틸토실레이트의 합성
표준 조건하 80℃에서의 아세토니트릴 중 플루오르화 칼륨/크립토픽스(Kryptofix) K222를 사용한 단계 (a)로부터의 메틸렌 디토실레이트의 친핵성 치환에 의해 플루오로메틸토실레이트가 제조될 수 있다.
Z가 방사성동위원소인 경우, 방사성동위원소는 업계 숙련자에게 알려져 있는 어떠한 수단에 의해서도 도입될 수 있다. 예를 들면, 방사성동위원소 [18F]-플루오라이드 이온 (18F-)은 보통 핵반응 18O(p,n)18F로부터 수용액으로 수득되며, 양이온성 상대이온의 첨가 및 이후의 물의 제거에 의해 반응성이 된다. 적합한 양이온성 상대이온은 무수 반응 용매 중에서 충분한 용해성을 가짐으로써 18F-의 용해성을 유지해야 한다. 이에 따라, 사용되고 있는 상대이온에는 크지만 무른(soft) 금속 이온, 예컨대 루비듐 또는 세슘, 크립토픽스™와 같은 크립탄드(cryptand)와 착물화된 칼륨, 또는 테트라알킬암모늄염이 포함된다. 바람직한 상대이온은 크립토픽스™와 같은 크립탄드와 착물화된 칼륨으로서, 무수 용매 중에서의 그의 우수한 용해성 및 향상되는 18F- 반응성 때문이다. 18F는 할로겐 또는 토실레이트 기와 같은 적합한 이탈 기의 친핵성 치환에 의해 도입될 수도 있다. 잘 알려져 있는 18F 표지 기술에 대한 더 상세한 논의는 문헌 ["Handbook of Radiopharmaceuticals" (2003; John Wiley and Sons: M.J. Welch and C.S. Redvanly, Eds.]의 단원 6에서 찾아볼 수 있다. 예를 들면, [18F]플루오로메틸토실레이트는 2-10 %의 물을 함유하는 아세토니트릴 중의 [18F]-플루오라이드 이온을 사용한 메틸렌 디토실레이트의 친핵성 치환에 의해 제조될 수 있다 (문헌 [Neal, T.R., et al ., Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals 2005; 48:557-68] 참조).
자동화된 합성
바람직한 실시양태에서, 화학식 Ia의 화합물을 포함한 화학식 I 화합물의 제조 방법은 자동화된다. 예를 들면, [18F]-방사성추적자는 자동화된 방사성합성 장치를 이용하여 자동화된 양식으로 편리하게 제조될 수 있다. 트레이서랩(TRACERlab)™ (예컨대 트레이서랩™ MX) 및 패스트랩(FASTlab)™ (모두 GE 헬스케어(Healthcare) Ltd. 사)을 포함하여, 그와 같은 플랫폼 장치의 몇 가지 시중에서 구입가능한 예가 존재한다. 그와 같은 장치는 통상적으로 종종 1회용인 "카세트(cassette)"를 포함하며, 방사성합성을 수행하도록 장치에 최적화된 방사화학을 수행한다. 카세트는 보통 유체 경로, 반응 용기, 및 반응물 바이알을 수용하기 위한 포트는 물론, 방사성합성-후 정화 단계에 사용되는 임의의 고체-상 추출 카트리지를 포함한다. 임의로, 본 발명의 추가의 실시양태에서, 자동화된 방사성합성 장치는 고성능 액체 크로마토그래프 (HPLC)에 연결될 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 하기를 포함하는, 화학식 Ia의 화합물을 포함한 화학식 I 화합물 (각각 본원에서 정의되는 바와 같음)의 자동화된 합성을 위한 카세트를 제공한다:
i) 본원에서 정의되는 바와 같은 화학식 II의 전구체 화합물을 함유하는 용기(vessel); 및
ii) 본원에서 정의되는 바와 같은 화학식 IIIa의 화합물을 사용한 단계 (i)의 용기 내용물의 용리 수단.
본 발명의 카세트에 있어서, 화학식 II 및 IIIa 전구체 화합물의 적합하고도 바람직한 실시양태는 각각 본원에서 정의되는 바와 같다.
본 발명의 일 실시양태에서는, 패스트랩™과 상용성이며, HPLC 정제 단계를 필요로 하지 않는, 보호된 에탄올아민 전구체로부터의 화학식 Ia의 화합물을 포함한 화학식 I 화합물 (각각 본원에서 기술되는 바와 같음)의 제조 방법이 제공된다.
[18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린 (18F-D4-FCH)의 방사성합성은 본원에서 기술되는 방법 및 실시예에 따라 수행될 수 있다. 18F-D4-FCH의 방사성합성은 비제한적으로 GE 패스트랩™ (GE 헬스케어 Inc. 사로부터 시중에서 구입가능)을 포함한 시중에서 구입가능한 합성 플랫폼을 사용하여 수행될 수도 있다.
보호된 전구체로부터의 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린의 제조를 위한 패스트랩™ 방사성합성 공정의 예를 하기 반응식 5에 나타내었다:
<반응식 5>
Figure pct00010
(식 중:
a. 하기에 더욱 상세하게 기술되어 있는 바와 같은 [18F]KF/K222/K2CO3 복합체의 제조;
b. 하기에 더욱 상세하게 기술되어 있는 바와 같은 [18F]FCH2OTs의 제조;
c. 하기에 더욱 상세하게 기술되어 있는 바와 같은 [18F]FCH2OTs의 SPE 정제;
d. 하기에 더욱 상세하게 기술되어 있는 바와 같은 O-PMB-[18F]-D4-콜린 (O-PMB-[18F]-D4-FCH)의 방사성합성;
e. 하기에 더욱 상세하게 기술되어 있는 바와 같은 염산염으로서의 [18F]-D4-콜린 (18F-D4-FCH)의 정제 & 제제화(formulation)임).
[18F]플루오로-[1,2-2H4]콜린 또는 [18F]플루오로콜린의 자동화 (보호된 전구체로부터)는 동일한 자동화된 공정을 포함한다 (그리고, 각각 O-PMB-N,N-디메틸-[1,2-2H4]에탄올아민 및 O-PMB-N,N-디메틸에탄올아민의 플루오로메틸화로부터 제조됨).
본 발명의 일 실시양태에 있어서, [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린 또는 [18F]플루오로메틸콜린의 패스트랩™ 합성은 하기의 순차적인 단계들을 포함한다:
(i) [18F]플루오라이드의 QMA로의 포획(trapping) 단계;
(ii) QMA로부터의 [18F]플루오라이드의 용리(elution) 단계;
(iii) [18F]FCH2OTs의 방사성합성 단계;
(iv) [18F]FCH2OTs의 SPE 정화(clean up) 단계;
(v) 반응 용기 정화 단계;
(vi) 반응 용기 및 SPE t-C18 플러스에 남아 있는 [18F]플루오로메틸 토실레이트를 동시에 건조하는 단계;
(vii) 알킬화 반응 단계;
(viii) 미반응 O-PMB-전구체의 제거 단계; 및
(ix) 탈보호 & 제제화 단계.
단계 (i)-(ix) 각각에 대해서는 하기에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 단계 (i)-(ix)는 본원에서 기술되는 바와 같은 카세트에서 수행된다. 본 발명의 일 실시양태는 자동화된 합성 플랫폼에서 사용하기 위한, 단계 (i)-(ix)를 수행할 수 있는 카세트이다. 본 발명의 일 실시양태는 보호된 전구체로부터의 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린 ([18F]-D4-FCH) 또는 [18F]플루오로메틸콜린의 방사성합성을 위한 카세트이다. 본 발명의 카세트의 예를 도 5b에 도시하였다.
(i) [ 18 F]플루오라이드의 QMA 로의 포획 단계
[18F]플루오라이드 (통상적으로 0.5 내지 5 mL의 H2 18O 중의 것)을 사전-컨디셔닝된 워터스(Waters) QMA 카트리지로 통과시킨다.
( ii ) QMA 로부터의 [ 18 F] 플루오라이드의 용리 단계
표 1에 기술되어 있는 바와 같은 용리액을 용리액 바이알로부터 주사기로 인출한 후, 워터스 QMA를 지나 반응 용기로 통과시킨다. 이와 같은 절차는 [18F]플루오라이드를 반응 용기로 용리시킨다. "질소/진공/가열/냉각"의 우수하게 설계된 건조 주기를 이용하여 물 및 아세토니트릴을 제거한다.
( iii ) [ 18 F] FCH 2 OTs 의 방사성합성 단계
일단 단계 (ii)의 K[18F]플루오라이드/K222/K2CO3 복합체가 건조되고 나면, K[18F]플루오라이드/K222/K2CO3 복합체를 함유하는 반응 용기에 아세토니트릴 및 물을 함유하는 용액 중의 CH2(OTs)2 메틸렌 디토실레이트를 첨가한다. 생성되는 반응 혼합물을 가열 (통상적으로는 110℃로 10분 동안)시킨 다음, 냉각 (통상적으로는 70℃로)시킨다.
( iv ) [ 18 F] FCH 2 OTs 의 SPE 정화 단계
일단 [18F]FCH2OTs의 방사성합성이 완료되고 반응 용기가 냉각되고 나면, 반응 용기에 물을 첨가함으로써, 반응 용기 중의 유기 용매 함량을 대략 25 %로 감소시킨다. 이와 같이 희석된 용액은 반응 용기로부터 이동하여, t-C18-라이트 및 t-C18 플러스 카트리지를 통과하며 - 이후 이들 카트리지는 12 내지 15 mL의 25 % 아세토니트릴/75 % 물 용액을 사용하여 세정된다. 이와 같은 공정 종료시:
- 메틸렌 디토실레이트는 t-C18-라이트에 포획되어 유지되며,
- [18F]FCH2OTs, 토실-[18F]플루오라이드는 t-C18 플러스에 포획되어 유지된다.
(v) 반응 용기 정화 단계
[18F]플루오로에틸 토실레이트 및 O-PMB-DMEA 전구체의 알킬화 전에, 반응 용기를 세척하였다 (에탄올 사용).
( vi ) 반응 용기 및 SPE t- C18 플러스에 남아 있는 [ 18 F] 플루오로메틸 토실레 이트를 동시에 건조하는 단계
일단 정화 (v)가 완료되고 나면, 반응 용기, 및 SPE t-C18 플러스에 남아 있는 [18F]플루오로메틸 토실레이트를 동시에 건조시켰다.
( vii ) 알킬화 반응 단계
단계 (vi) 후, t-C18 플러스에 남아 있는 [18F]FCH2OTs (토실-[18F]플루오라이드와 함께)를 아세토니트릴 중 O-PMB-N,N-디메틸-[1,2-2H4]에탄올아민 (또는 O-PMB-N,N-디메틸에탄올아민)의 혼합물을 사용하여 반응 용기로 용리시켰다.
O-PMB-전구체를 사용한 [18F]FCH2OTs의 알킬화는 반응 용기를 가열하여 (통상적으로 110℃로 15분 동안) [18F]플루오로-[1,2-2H4]콜린 (또는 O-PMB-[18F]플루오로콜린)을 산출하는 것에 의해 달성되었다.
( viii ) 미반응 O- PMB -전구체의 제거 단계
물 (3 내지 4 mL)을 반응물에 첨가한 다음, 이와 같은 용액을 예비-처리된 CM 카트리지로 통과시킨 후, 이어서 에탄올 - 통상적으로 2×5 mL -로 세척함으로써 (이는 미반응 O-PMB-DMEA를 제거함), CM 카트리지에 포획된 "정제된" [18F]플루오로-[1,2-2H4]콜린 (또는 O-PMB-[18F]플루오로콜린)을 산출하였다.
( ix ) 탈보호 & 제제화 단계
염산을 CM 카트리지를 통과하여 주사기로 전달하였는데: 이는 O-PMB-[18F]플루오로콜린의 탈보호를 초래하였다 (주사기는 HCl 용액 중의 [18F]플루오로콜린을 포함함). 다음에, 아세트산 나트륨을 상기 주사기에 첨가하여 pH 5 내지 8로 버퍼링시킴으로써, 아세테이트 버퍼 중의 [18F]-D4-콜린 (또는 [18F]콜린)을 산출하였다. 다음에, 이와 같이 버퍼링된 용액을 적합한 버퍼를 함유하는 생성물 바이알로 이동시킨다.
하기 표 1은 본 발명의 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린 (D4-FCH) (또는 [18F]플루오로메틸콜린) 방사성카세트의 제조에 필요한 반응물 및 기타 성분들의 목록을 제공한다:
Figure pct00011
본 발명의 일 실시양태에 있어서, 비보호 전구체를 통한 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린의 패스트랩TM™ 합성은 하기 반응식 6에 도시되어 있는 바와 같은 순차적인 하기 단계들을 포함한다:
<반응식 6>
Figure pct00012
1. QMA로부터의 [18F]플루오라이드의 회수 단계;
2. K[18F]F/K222/K2CO3 복합체의 제조 단계;
3. 18FCH2OTs의 방사성합성 단계;
4. 18FCH2OTs의 SPE 정화 단계;
5. 반응 용기 카세트 및 주사기의 정화 단계;
6. 반응 용기 및 C18 SepPak의 건조 단계;
7. D4-DMEA를 사용한 18FCH2OTs의 용리 분리 및 커플링 단계;
8. 반응 혼합물의 CM 카트리지로의 이동 단계;
9. 카세트 및 주사기의 정화 단계;
10. 묽은 암모니아 수용액, 에탄올 및 물을 사용한 CM 카트리지의 세척 단계;
11. 0.09 % 염화 나트륨 (5 ml)에 이어지는 물 (5 ml)을 사용한 CM 카트리지로부터의 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린의 용리 단계.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 단계 (1)-(11)은 본원에서 기술되는 바와 같은 카세트에서 수행된다. 본 발명의 일 실시양태는 자동화된 합성 플랫폼에서 사용하기 위한, 단계 (1)-(11)을 수행할 수 있는 카세트이다. 본 발명의 일 실시양태는 비보호 전구체로부터의 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린 ([18F]-D4-FCH)의 방사성합성을 위한 카세트이다. 본 발명의 카세트의 예를 도 5a에 도시하였다.
하기 표 2는 본 발명의 비보호 전구체 방사성카세트를 통한 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린 (D4-FCH) (또는 [18F]플루오로메틸콜린)의 제조에 필요한 반응물 및 기타 성분들의 목록을 제공한다:
Figure pct00013
화상화 방법
본원에서 기술되는 바와 같은 본 발명의 방사성표지 화합물은 세포 수송체를 통하여, 또는 확산에 의해 세포로 흡수되게 된다. 콜린 키나제가 과발현되거나 활성화되는 세포에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 본 발명의 방사성표지 화합물은 인산화되어 그 세포 내에 포획되게 된다. 이는 신생물 조직을 검출하는 주 기작을 형성하게 된다.
본 발명은 추가적으로 각각 본원에서 기술되는 바와 같은 본 발명의 방사성표지 화합물, 또는 본 발명의 방사성표지 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에 투여한 후, 상기 대상체에서 본 발명의 상기 방사성표지 화합물을 검출하는 단계를 포함하는 화상화 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 각각 본원에서 기술되는 바와 같은 본 발명의 방사성표지 화합물, 또는 본 발명의 방사성표지 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 사용하는, 생체내에서의 신생물 조직의 검출 방법을 제공한다. 이에 따라, 본 발명은 조기 검출 및 진단을 위한 우수한 수단은 물론, 가용한 요법 치료에 반응하게 되거나 그렇지 않은 환자를 용이하게 확인하기 위한 개선된 예후 전략 및 방법도 제공한다. 신생물 조직을 검출하는 본 발명의 화합물의 능력의 결과로서, 본 발명은 추가적으로 신생물 조직과 관련된 질환 상태의 치료에 대한 치료 반응의 모니터링 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 본 발명의 화상화 방법에 사용하기 위한 본 발명의 방사성표지 화합물은 화학식 I의 방사성표지 화합물이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 본 발명의 화상화 방법에 사용하기 위한 본 발명의 방사성표지 화합물은 화학식 III의 방사성표지 화합물이다.
업계 숙련자라면 이해될 바와 같이, 화상화의 유형 (예컨대 PET, SPECT)은 방사성동위원소의 특성에 의해 결정되게 된다. 예를 들어, 화학식 I의 방사성표지 화합물이 18F를 함유하는 경우, 그것은 PET 화상화에 적합할 것이다.
이에 따라, 본 발명은 하기의 단계들을 포함하는, 생체내에서의 신생물 조직의 검출 방법을 제공한다:
i) 각각 본원에서 정의되는 바와 같은 본 발명의 방사성표지 화합물, 또는 본 발명의 방사성표지 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계;
ii) 상기 대상체에서 상기 본 발명의 방사성표지 화합물이 신생물 조직에 결합되도록 하는 단계;
iii) 상기 결합된 본 발명의 방사성표지 화합물에서 상기 방사성동위원소에 의해 방출되는 신호를 검출하는 단계;
iv) 상기 신호의 위치 및/또는 양을 나타내는 화상을 생성시키는 단계; 및
v) 상기 대상체에서의 상기 신생물 조직의 분포 및 범위를 측정하는 단계.
본 발명의 방사성표지 화합물을 "투여하는" 단계는 바람직하게는 비경구로, 가장 바람직하게는 정맥내로 수행된다. 정맥내 경로는 대상체의 신체 전체에 걸쳐 화합물을 전달하는 가장 효율적인 방식을 나타낸다. 정맥내 투여는 대상체에 대하여 실질적인 물리적 간섭이나 실질적인 건강상의 위험 중 어느 것도 나타내지 않는다. 본 발명의 방사성표지 화합물은 바람직하게는 본원에서 정의되는 바와 같은 본 발명의 방사성약제학적 조성물로서 투여된다. 투여 단계가 본 발명의 화상화 방법의 완전한 정의일 필요는 없다. 따라서, 본 발명의 화상화 방법은 본 발명의 방사성표지 화합물이 사전-투여된 대상체에서 수행되는 상기-정의된 단계 (ii)-(v)를 포함하는 것으로 이해될 수도 있다.
투여 단계 후 검출 단계에 앞서, 본 발명의 방사성표지된 화합물은 신생물 조직에 결합된다. 예를 들면, 대상체가 무손상의 포유동물인 경우, 본 발명의 방사성 표지 화합물은 포유동물의 신체를 통해 동적으로 이동하여, 그 안의 여러 조직과 접촉하게 된다. 일단 본 발명의 방사성표지 화합물이 신생물 조직과 접촉하고 나면, 그것은 신생물 조직에 결합되게 된다.
본 발명 방법의 "검출" 단계는 해당 신호에 민감한 검출기, 예를 들면 PET 카메라를 이용한, 본 발명의 방사성표지 화합물에 포함되어 있는 방사성동위원소에 의해 방출되는 신호의 검출을 포함한다. 이와 같은 검출 단계는 신호 데이터의 수득으로 이해될 수도 있다.
본 발명 방법의 "생성" 단계는 수득된 신호 데이터에 재구성 알고리즘을 적용하여 데이터세트를 산출하는 컴퓨터에 의해 수행된다. 다음에, 이와 같은 데이터세트는 방사성동위원소에 의해 방출되는 신호의 위치 및/또는 양을 보여주는 화상을 생성시키도록 조작된다. 방출되는 신호는 효소 또는 신생물 조직의 양과 직접적으로 상관되며, 그에 따라 생성되는 화상을 평가하는 것에 의해 "측정" 단계가 이루어질 수 있다.
본 발명의 "대상체"는 임의의 인간 또는 동물 대상체일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 대상체는 포유동물이다. 가장 바람직하게는, 상기 대상체는 무손상 포유동물의 생체내 신체이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 대상체는 인간이다.
"신생물 조직과 관련된 질환 상태"는 신생물 조직의 존재로부터 기인하는 임의의 질환 상태일 수 있다. 그와 같은 질환 상태의 예에는 종양, 암 (예컨대 전립샘암, 유방암, 폐암, 난소암, 췌장암, 뇌암 및 결장암)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 신생물 조직과 관련된 질환 상태는 뇌암, 유방암, 폐암, 식도암, 전립샘암, 또는 췌장암이다.
업계 숙련자라면 이해하게 될 바와 같이, "치료"는 신생물 조직과 관련된 질환 상태에 따라 달라지게 된다. 예를 들면, 신생물 조직과 관련된 질환 상태가 암인 경우, 치료에는 수술, 화학요법 및 방사선요법이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이에 따라, 본 발명의 방법은 신생물 조직과 관련된 질환 상태에 대한 치료의 유효성을 모니터링하는 데에 사용될 수 있다.
신생물 이외에도, 본 발명의 방사성표지 화합물은 간 질환, 뇌 장애, 신장 질환 및 정상 세포의 증식과 관련된 다양한 질환에서 유용할 수도 있다. 본 발명의 방사성표지 화합물은 또한 염증을 화상화하는 것; 류마티스 관절염 및 무릎 윤활막염을 포함한 염증 과정의 화상화; 및 죽상경화판(artherosclerotic plaque)을 포함한 심혈관계 질환의 화상화에 유용할 수 있다.
전구체 화합물
본 발명은 상기한 바와 같은 화학식 II의 전구체 화합물을 제공한다:
<화학식 II>
Figure pct00014
본 발명의 바람직한 실시양태에서는, 화학식 II의 화합물이 제공되며, 식 중:
R1, R2, R3, 및 R4는 각각 독립적으로 수소이고;
R5, R6, 및 R7은 각각 독립적으로 수소, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, 또는 -CD(R8)2이고;
R8은 수소, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2Cl, CD2Br, CD2I, 또는 -C6H5이고;
m은 1 내지 4의 정수이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서는, 화학식 II의 화합물이 제공되며, 식 중:
R1 및 R2는 각각 수소이고;
R3 및 R4는 각각 중수소 (D)이고;
R5, R6, 및 R7은 각각 독립적으로 수소, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, 또는 -CD(R8)2이고;
R8은 수소, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2Cl, CD2Br, CD2I, 또는 -C6H5이고;
m은 1 내지 4의 정수이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서는, 화학식 II의 화합물이 제공되며, 식 중:
R1, R2, R3, 및 R4는 각각 중수소 (D)이고;
R5, R6, 및 R7은 각각 독립적으로 수소, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, 또는 -CD(R8)2이고;
R8은 수소, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2Cl, CD2Br, CD2I, 또는 -C6H5이고;
m은 1 내지 4의 정수이다.
본 발명에 있어서, 화학식 II의 화합물은 하기 화학식 IIa의 화합물이다:
<화학식 IIa>
Figure pct00015
본 발명의 일 실시양태에서는, 하기 화학식 IIb의 화합물이 제공된다:
<화학식 IIb>
Figure pct00016
(식 중:
R1, R2, R3, 및 R4는 각각 독립적으로 수소 또는 중수소 (D)이고;
R5, R6, 및 R7은 각각 독립적으로 수소, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, -CH(R8)2, 또는 -CD(R8)2이고;
R8은 독립적으로 수소, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2Cl, CD2Br, CD2I, 또는 -C6H5이고;
m은 1 내지 4의 정수이고;
Pg는 히드록실 보호 기임).
본 발명의 바람직한 실시양태에서는, 화학식 IIb의 화합물이 제공되며, 식 중 Pg는 p-메톡시벤질 (PMB), 트리메틸실릴 (TMS), 또는 디메톡시트리틸 (DMTr) 기이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서는, 화학식 IIb의 화합물이 제공되며, 식 중 Pg는 p-메톡시벤질 (PMB) 기이다.
본 발명의 일 실시양태에서는, 하기 화학식 IIc의 화합물이 제공된다:
<화학식 IIc>
Figure pct00017
(식 중:
R1, R2, R3, 및 R4는 각각 독립적으로 수소 또는 중수소 (D)이고;
R5, R6, 및 R7은 각각 독립적으로 수소, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, -CH(R8)2, 또는 -CD(R8)2이고;
R8은 독립적으로 수소, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2Cl, CD2Br, CD2I, 또는 -C6H5이고;
m은 1 내지 4의 정수이되;
단, R1, R2, R3, 및 R4가 각각 수소인 경우, R5, R6, 및 R7은 각각 수소가 아니고; R1, R2, R3, 및 R4가 각각 중수소인 경우, R5, R6, 및 R7은 각각 수소가 아님).
본 발명의 바람직한 실시양태에서는, 화학식 IIc의 화합물이 제공되며, 식 중:
R1, R2, R3, 및 R4는 각각 독립적으로 수소이고;
R5, R6, 및 R7은 각각 독립적으로 수소, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, 또는 -CD(R8)2이고;
R8은 수소, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2Cl, CD2Br, CD2I, 또는 -C6H5이고;
m은 1 내지 4의 정수이되;
단, R5, R6, 및 R7은 각각 수소가 아니다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서는, 화학식 IIc의 화합물이 제공되며, 식 중:
R1, R2, R3, 및 R4는 각각 중수소 (D)이고;
R5, R6, 및 R7은 각각 독립적으로 수소, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, 또는 -CD(R8)2이고;
R8은 수소, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2Cl, CD2Br, CD2I, 또는 -C6H5이고;
m은 1 내지 4의 정수이되;
단, R5, R6, 및 R7은 각각 수소가 아니다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서는, 화학식 IIc의 화합물이 제공되며, 식 중:
R1 및 R2는 각각 수소이고;
R3 및 R4는 각각 중수소 (D)이다.
화학식 IIa, IIb 및 IIc의 화합물을 포함한 화학식 II의 전구체 화합물은 본원에서 기술되는 것들을 포함하여 업계에 알려져 있는 임의의 수단에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 화학식 IIa의 화합물은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이 탄산칼륨 존재하에서의 2-브로모에탄올-1,1,2,2-d4를 사용한 THF 중의 디메틸아민의 알킬화에 의해 합성될 수 있다:
<반응식 1>
Figure pct00018
(식 중 i = K2CO3, THF, 50℃, 19시간임). 원하는 테트라-중수소화 생성물은 증류에 의해 정제될 수 있다. 듀테리오클로로포름 중의 화학식 IIa 화합물의 1H NMR 스펙트럼 (도 3)은 N,N-디메틸 기 및 알콜의 히드록실과 관련된 피크만을 나타내었으며; 에틸 알콜 사슬 중 메틸렌 기의 수소와 관련된 피크는 관찰되지 않았다. 이에 부합하여, 13C NMR 스펙트럼 (도 3)은 N,N-디메틸 탄소와 관련하여서는 커다란 단일선을 나타내었으나; 60.4 ppm 및 62.5 ppm에서의 에틸 알콜 메틸렌 탄소에 대한 피크는 크기가 실질적으로 감소됨으로써, 공유 탄소-수소 결합의 존재와 관련된 신호 강화의 부재를 암시하였다. 또한, 메틸렌 피크는 모두 다중선으로 분할됨으로써, 스핀-스핀 커플링을 나타낸다. 13C NMR은 통상적으로 1H 디커플링을 사용하여 전개되기 때문에, 관찰된 다중성은 탄소-중수소 결합의 결과임이 틀림없다. 상기 관찰에 기초할 때, 원하는 생성물의 동위원소 순도는 2H 동위원소 면에서 (1H 동위원소 대비) >98 %인 것으로 생각된다.
화학식 II 전구체 화합물의 디-중수소화 유사체는 하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이 수소화 리튬 알루미늄 환원을 통하여 N,N-디메틸글리신으로부터 합성될 수 있다:
<반응식 2>
Figure pct00019
(식 중 i = LiAlD4, THF, 65℃, 24시간임). 13C NMR 분석은 2H 동위원소 면에서 (1H 동위원소 대비) 95 %를 초과하는 동위원소 순도가 달성될 수 있음을 표시하였다.
본 발명에 있어서, 화학식 IIa의 화합물을 포함한 화학식 II 화합물의 히드록실 기는 추가적으로 보호 기를 사용하여 보호됨으로써, 하기 화학식 IIb의 화합물을 산출할 수 있다:
<화학식 IIb>
Figure pct00020
(식 중 Pg는 업계에 알려져 있는 임의의 히드록실 보호 기임). 바람직하게는, Pg는 예를 들면 문헌 ["Protective Groups in Organic Synthesis", 3rd Edition, A Wiley Interscience Publication, John Wiley & Sons Inc., Theodora W. Greene and Peter G.M. Wuts, pp 17-200]에 기술되어 있는 것들을 포함한 임의의 산 불안정성 히드록실 보호 기이다. 바람직하게는, Pg는 p-메톡시벤질 (PMB), 트리메틸실릴 (TMS), 또는 디메톡시트리틸 (DMTr) 기이다. 더욱 바람직하게는, Pg는 p-메톡시벤질 (PMB) 기이다.
[ 18 F] 플루오로메틸 -[1,2- 2 H 4 ]콜린 ( D4 - FCH )의 확인
[18F]플루오로메틸콜린을 표준으로 사용하여 시험관내 화학 및 효소 모델에서 동위원소 치환으로부터 기인하는 산화에 대한 안정성을 평가하였다. 다음에, 생체내 모델에서 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린을 평가하고, [11C]콜린, [18F]플루오로메틸콜린 및 [18F]플루오로메틸-[1-2H2]콜린과 비교하였다.
Figure pct00021
과망간산 칼륨 산화 연구
과망간산 칼륨을 사용한 [18F]플루오로메틸콜린 및 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린의 화학적 산화 패턴의 평가에 의해, 결합 강도에 대한 중수소 치환의 효과를 최초로 시험하였다. 하기 반응식 6은 분취량을 분리하여 사전-선택된 시점에 방사성-HPLC에 의해 분석하는, 실온에서의 [18F]플루오로메틸콜린 및 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린의 염기 촉매촉진 과망간산 칼륨 산화에 대해 상술하고 있다:
<반응식 6>
Figure pct00022
(반응물 및 조건: i) KMnO4, Na2CO3, H2O, 실온).
결과는 도 6 및 7에 요약하였다. 방사성-HPLC 크로마토그램 (도 6)은 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린에서 20분에 더 큰 비율의 모 화합물이 남아있음을 나타내었다. 또한, 도 7의 그래프는 중수소화 유사체인 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린에 있어서의 상당한 동위원소 효과를 나타내었는데, 과망간산 칼륨을 사용한 처리 1시간 후 거의 80 %의 모 화합물이 아직 존재함으로써, 동일 시점에 40 % 미만의 모 화합물 [18F]플루오로메틸콜린이 아직 존재하는 것과 비교되었다.
콜린 옥시다제 모델
[18F]플루오로메틸콜린 및 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린을 콜린 옥시다제 모델 (문헌 [Roivainen, A., et al ., European Journal of Nuclear Medicine 2000; 27:25-32])에서 평가하였다. 도 8의 도시는, 효소 산화 모델에서 중수소화된 화합물이 상응하는 비-중수소화 화합물에 비해 상당히 더 안정하다는 것을 분명하게 보여준다. 60분 시점에서, 콜린 종들의 방사성-HPLC 분포는 [18F]플루오로메틸콜린의 경우 모 방사성추적자가 11±8 %의 수준으로 존재하며; 60분에, 상응하는 모 중수소화 방사성추적자 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린은 29±4 %로 존재하는 것으로 드러났다. 관련 방사성-HPLC 크로마토그램은 도 9에 도시되어 있는데, [18F]플루오로메틸콜린 대비 증가된 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]-콜린의 산화 안정성을 추가적으로 예시하고 있다. 이러한 방사성-HPLC 크로마토그램은 '미지(unknown)'로 표시되어 있는 중간 산화 생성물인 베타인 알데히드인 것으로 추론되는 제3의 피크를 함유하고 있다.
생체내 안정성 분석
[18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]-콜린은 생체내에서 더 내산화성이다. 방사성추적자의 정맥내 (i.v.) 투여 후 마우스 혈장에서 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해, 2종의 동위원소 방사성표지 콜린 종인 [18F]플루오로메틸콜린 및 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]-콜린의 각 해당 대사물인 [18F]플루오로메틸콜린-베타인 ([18F]-FCH-베타인) 및 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]-콜린-베타인 ([18F]-D4-FCH-베타인)으로의 상대적인 산화율을 평가하였다. [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]-콜린이 [18F]플루오로메틸콜린에 비해 산화에 대하여 현저하게 더 안정한 것으로 밝혀졌다. 도 10에 도시된 바와 같이, [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]-콜린이 [18F]플루오로메틸콜린에 비해 현저하게 더 안정하였는데, 마우스에의 i.v. 주사 후 15분에 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]-콜린 중 ~40 %가 [18F]-D4-FCH-베타인으로 전환됨으로써, [18F]-FCH-베타인으로의 [18F]플루오로메틸콜린의 전환율 ~80 %와 비교되었다. 생체내 산화를 위한 시간 추이를 도 10에 도시하였는데, [18F]플루오로메틸콜린에 비해 전체적으로 향상된 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]-콜린의 안정성을 도시한다.
생체분포
시간 추이 생체분포
HCT116 인간 결장 이종이식편을 보유하는 누드 마우스에서, [18F]플루오로메틸콜린, [18F]플루오로메틸-[1-2H2]콜린 및 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린에 대하여 시간 추이 생체분포를 수행하였다. 조직은 주사-후 2, 30 및 60분에 수집하였으며, 데이터를 도 11의 A 내지 C에 요약하였다. [18F]플루오로메틸콜린에 대한 흡수값은 예전의 연구 (문헌 [DeGrado, T.R., et al ., "Synthesis and Evaluation of 18F-labeled Choline as an Oncologic Tracer for Positron Emisson Tomography: Initial Findings in Prostate Cancer", Cancer Research 2000; 61:110-7])와 광범위하게 일치하였다. 흡수 프로필의 비교는 중수소화된 화합물인 [18F]플루오로메틸-[1-2H2]-콜린 및 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]-콜린에 있어서의 심장, 폐 및 간에서의 방사성추적자의 감소된 흡수를 밝혀내었다. 3종 방사성추적자에 대한 종양 흡수 프로필을 도 11의 D에 도시하였는데, 모든 시점에서 [18F]플루오로메틸콜린 대비 증가된 중수소화 화합물들의 방사성추적자 국소화를 보여준다. 나중 시점에서의 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린의 종양 흡수의 현저한 증가는 분명하다.
콜린 대사물의 분포
HPLC에 의한 간, 신장 및 종양을 포함한 조직들의 대사물 분석도 수행하였다. 조직에서의 [18F]FCH 및 [18F]D4-FCH, 그리고 이들의 각 대사물의 통상적인 HPLC 크로마토그램을 도 12에 도시하였다. 대사물의 종양 분포를 유사한 방식으로 분석하였다 (도 13). 콜린 및 그의 대사물에는 방사능 크로마토그램과 동시에 저온 비표지 화합물의 크로마토그램 제시를 가능케 하는 소정의 UV 발색단이 결핍되어 있다. 따라서, 다른 화학적 및 생물학적 수단에 의해 대사물의 존재를 확인하였다. 중요한 것은 대사물의 특성화에 동일한 크로마토그래피 조건이 사용되었으며, 체류 시간이 유사하였다는 것이다. 포스포콜린 피크의 확인은 알칼리 포스파타제를 사용한 미처리 HCT116 종양 세포에서 형성되는 추정상의 포스포콜린의 인큐베이션에 의해 생화학적으로 확인되었다 (도 14). [18F]FCH 및 [18F]D4-FCH 모두에 있어서, 주사 30분 후 포스포콜린으로서 고비율의 간 방사능이 나타났다 (도 12). [18F]D4-FCH 처리된 마우스의 간 (7.4±2.3 %) 및 신장 (8.8±0.2 %) 샘플 양자에서, 미지 대사물 (아마도 알데히드 중간물)이 관찰되었다. 반면, [18F]FCH 처리된 마우스의 간 샘플에서는 이와 같은 미지 대사물이 발견되지 않았으며, 신장 샘플에서만 유사한 정도 (3.3±0.6 %)로 관찰되었다. 특히, [18F]D4-FCH 유래 신장 방사능의 60.6±3.7 %가 포스포콜린이어서, [18F]FCH로부터의 31.8±9.8 %와 비교되었다 (P=0.03). 반대로, 신장에서의 대부분의 [18F]FCH-유래 방사능은 53.5±5.3 %로 [18F]FCH-베타인의 형태이어서, [18F]D4-FCH에서의 20.6±6.2 %와 비교되었다 (도 12). 혈장에서의 베타인의 농도가 간 및 신장과 같은 조직에서의 농도를 반영한다는 것이 주장될 수 있다. 종양은 간 및 신장과 비교할 때 상이한 HPLC 프로필을 나타내었는데; 종양 샘플의 분석으로부터 수득되는 통상적인 방사성-HPLC 크로마토그램 ([18F]FCH, [18F]D4-FCH 및 [11C]콜린의 정맥내 주사 30분 후)을 도 12에 도시하였다. [18F]D4-FCH의 경우, 종양에서 방사능은 주로 포스포콜린의 형태이었다 (도 13). 반면, [18F]FCH는 상당 수준의 [18F]FCH-베타인을 나타내었다. 나중의 화상화 맥락에서, 이러한 결과는 [18F]D4-FCH가 해석하기가 더 용이한 흡수 프로필을 가지는 뛰어난 PET 화상화용 방사성추적자일 것임을 나타낸다. 본 발명의 다수의 양태들에 존재하는 소정 특징 중 적합하고도 바람직한 양태는 그것이 본원에서 기술되는 첫 번째 양태에서 상기 특징에 대하여 정의되는 바와 같다. 지금부터 일련의 비-제한적인 실시예로서 본 발명을 예시한다.
동윈원소 탄소 콜린 유사체
본 발명은 본원에서 기술되는 바와 같은 화학식 III의 화합물을 제공한다. 본원에서 기술되는 바와 같이, 그와 같은 화합물은 종양 화상화를 위한 PET 조영제로서 유용하다. 특히, 본원에서 기술되는 바와 같은 화학식 III의 화합물은 소변으로 배설되지 않을 수 있으며, 그에 따라 전립샘암과 같은 골반암의 더욱 특이적인 화상화를 제공한다.
본 발명은 화학식 II의 전구체 화합물을 화학식 IV의 화합물과 반응시켜 화학식 III의 화합물을 형성시키는 것을 포함하는 (반응식 A), 화학식 III 화합물의 제조 방법을 제공한다:
<반응식 A>
Figure pct00023
(식 중, 화학식 II 및 III의 화합물은 각각 본원에서 기술되는 바와 같고, 화학식 IV의 화합물은 하기와 같음:
<화학식 IV>
ZXYC*-Lg
(식 중, C*, X, Y 및 Z는 각각 화학식 III의 화합물에 대하여 본원에서 정의되는 바와 같고, "Lg"는 이탈 기임). "Lg"의 적합한 예에는 브롬 (Br) 및 토실레이트 (OTos)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 화학식 IV의 화합물은 본원에서 기술되는 것들을 포함하여 업계에 알려져 있는 어떠한 수단에 의해서도 제조될 수 있다 (예를 들면 실시예 5 및 7과 유사).
실시예
반응물 및 용매는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) 사 (영국 길링햄 소재)로부터 구입하여, 추가적인 정제 없이 사용하였다. 염화 플루오로메틸콜린 (표준 시료)은 ABCR Gmbh & Co. 사 (독일 칼스루헤 소재)로부터 구입하였다. 등장 식염수 (0.9 % w/v)는 하멜른 파마슈티칼즈(Hameln Pharmaceuticals) 사 (영국 글로세스터 소재)로부터 구입하였다. NMR 스펙트럼은 400 MHz (1H NMR) 및 100 MHz (13C NMR), 또는 600 MHz (1H NMR) 및 150 MHz (13C NMR)에서 가동되는 브루커 어밴스(Bruker Avance) NMR 기기 중 어느 하나를 사용하여 수득하였다. 정밀 질량 분광법은 워터스 마이크로매스(Waters Micromass) LCT 프레미어(Premier) 기기에서 양전자 이온화 (EI) 또는 화학적 이온화 (CI) 모드로 수행하였다. 증류는 부치(Buechi) B-585 유리 오븐 (부치(Buechi) 사, 스위스 소재)을 사용하여 수행하였다.
실시예 1. N,N-디메틸-[1,2- 2 H 4 ]- 에탄올아민 (3)의 제조
Figure pct00024
무수 THF(dry THF) (10 mL) 중 K2CO3 (10.50 g, 76 mmol)의 현탁액에, 디메틸아민 (THF 중 2.0 M) (38 mL, 76 mmol)을 첨가한 후, 이어서 2-브로모에탄올-1,1,2,2-d4 (4.90 g, 38 mmol)을 첨가하고, 현탁액을 아르곤하에서 50℃로 가열하였다. 19시간 후, 박층 크로마토그래피 (TLC) (에틸 아세테이트/알루미나/I2)가 (2)의 완전한 전환을 표시하면, 반응 혼합물을 주변 온도로 냉각시키고, 여과하였다. 다음에, 감압하에서 벌크 용매를 제거하였다. 증류로써, 원하는 생성물(3)을 b.p. 78℃/88 mbar인 무색의 액체로서 수득하였다 (1.93 g, 55 %).
Figure pct00025
실시예 2: N,N-디메틸-[1- 2 H 2 ]- 에탄올아민 (5)의 제조
Figure pct00026
무수 THF (10 mL) 중 N,N-디메틸글리신 (0.52 g, 5 mmol)의 현탁액에, 중수소화 리튬 알루미늄 (0.53 g, 12.5 mmol)을 첨가한 후, 생성 현탁액을 아르곤하에서 환류시켰다. 24시간 후, 현탁액을 주변 온도로 냉각시키고, 포화 수성 Na2SO4 (15 mL)에 부은 후, 1 M Na2CO3를 사용하여 pH 8로 조정한 다음, 에테르 (3×10 mL)로 세척하고, 건조 (Na2SO4)하였다. 증류로써, 원하는 생성물(5)을 b.p. 65℃/26 mbar인 무색의 액체로서 수득하였다 (0.06 g, 13 %).
Figure pct00027
실시예 3. 플루오로메틸토실레이트(8)의 제조
Figure pct00028
확립되어 있는 문헌상의 절차에 따라 메틸렌 디토실레이트(7)를 제조하였는데, 분석 데이터가 보고되어 있는 값에 부합하였다 (문헌 [Emmons, W.D., et al ., Journal of the American Chemical Society, 1953; 75:2257]; 및 [Neal, T.R., et al ., Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals 2005; 48:557-68]). 무수 아세토니트릴 (10 mL) 중 메틸렌 디토실레이트(7) (0.67 g, 1.89 mmol)의 용액에, 크립토픽스 K222 [4,7,13,16,21,24-헥사옥사-1,10-디아자비시클로[8.8.8]헥사코산] (1.00 g, 2.65 mmol)을 첨가한 후, 이어서 플루오르화 칼륨 (0.16 g, 2.83 mmol)을 첨가하였다. 다음에, 현탁액을 질소하에서 110℃로 가열하였다. 1시간 후, TLC (7:3 헥산/에틸 아세테이트/실리카/UV254)가 (7)의 완전한 전환을 표시하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (25 mL)로 희석하여, 물 (2×15 mL)로 세척한 후, MgSO4상에서 건조하였다. 크로마토그래피 (5 → 10 % 에틸 아세테이트/헥산)로써, 원하는 생성물(8)을 무색의 오일로서 수득하였다 (40 mg, 11 %).
Figure pct00029
Figure pct00030
실시예 4. N,N- 디메틸에탄올아민(O-4-메톡시벤질)에테르 (O- PMB - DMEA )의 제조
Figure pct00031
건조 플라스크에, 디메틸에탄올아민 (4.46 g, 50 mmol) 및 무수 DMF (50 mL)를 첨가하였다. 용액을 아르곤하에서 교반한 후, 얼음 배스에서 냉각하였다. 다음에, 수소화 나트륨 (2.0 g, 50 mmol)을 10분에 걸쳐 일부씩 첨가한 다음, 반응 혼합물을 실온으로 가온시켰다. 30분 후, 염화 4-메톡시벤질 (3.92 g, 25 mmol)을 10분에 걸쳐 적가하고, 생성 혼합물을 아르곤하에서 교반하면서 방치하였다. 60시간 후, GC-MS가 반응 완료 (염화 4-메톡시벤질의 소멸)를 나타내면, 반응 혼합물을 1 M 수산화 나트륨 (100 mL)에 붓고, 디클로로메탄 (DCM) (3×30 mL)으로 추출한 다음, 건조하였다 (Na2SO4). 컬럼 크로마토그래피 (0 → 10 % 메탄올/DCM; 중성 실리카)로써, 원하는 생성물 (O-PMB-DMEA)을 황색의 오일로서 수득하였다 (1.46 g, 28 %).
Figure pct00032
실시예 4a. N,N- 디메틸에탄올아민(O-4-메톡시벤질)에테르 (O- PMB - DMEA )의 중수소화 유사체 제조
N,N-디메틸에탄올아민(O-4-메톡시벤질)에테르의 디- 및 테트라-중수소화 유사체는 적절한 디- 또는 테트라-중수소화 디메틸에탄올아민으로부터 실시예 4에 따라 제조될 수 있다.
실시예 5. [ 18 F]플루오로메틸 토실레이트(9)의 합성 제조
Figure pct00033
K2CO3 (0.5 mg, 3.6 μmol, 100 μmol의 물 중에 용해), 18-크라운-6 (10.3 mg, 39 μmol) 및 아세토니트릴 (500 μL)의 혼합물을 함유하는 휘튼(Wheaton) 바이알에, [18F]플루오라이드 (100 μL의 물 중 ~20 mCi)를 첨가하였다. 다음에, 질소 스트림 (100 mL/분)하에 110℃에서 용매를 제거하였다. 이후, 아세토니트릴 (500 μL)을 첨가하고, 증류를 계속하여 건조하였다. 이와 같은 절차를 2회 반복하였다. 다음에, 주변 온도에서 3 % 물을 함유하는 아세토니트릴 (250 μL) 중 메틸렌 디토실레이트(7) (6.4 mg, 18 μmol)의 용액을 첨가한 후, 이어서 분석용 방사성-HPLC로 모니터링하면서 100℃에서 10-15분 동안 가열하였다. 1:1 아세토니트릴/물 (1.3 mL)의 첨가에 의해 반응을 켄칭(quenched)하고, 준-정제용 방사성-HPLC에 의해 정제하였다. [18F]플루오로메틸 토실레이트(9)를 함유하는 용리액 분획을 수집한 후, 물을 사용하여 20 mL의 최종 부피로 희석한 다음, Sep Pak C18 라이트 카트리지 (워터스 사, 미국 매사추세츠 밀포드 소재) (DMF (5 mL) 및 물 (10 mL)을 사용하여 사전-컨디셔닝되었음) 상에 고정시켰다. 추가 물 (5 mL)을 사용하여 카트리지를 세척한 다음, [18F]플루오로메틸 토실레이트(9)를 보유하는 카트리지를 질소 스트림 중에서 20분 동안 건조하였다. [18F](13)의 합성에 대한 통상적인 HPLC 반응 프로필을 하기 도 4의 A/4의 B에 도시하였다.
실시예 6. [ 18 F] 플루오로브로모메탄과의 반응에 의한 [ 18 F] 플루오로메틸콜린 유도체의 방사성합성
Figure pct00034
0℃로 사전-냉각된 무수 아세토니트릴 (1 mL) 중 아민 전구체인 N,N-디메틸에탄올아민 (150 μL) 또는 N,N-디메틸-[1,2-2H4]에탄올아민(3) (150 μL)을 함유하는 휘튼 바이알에, [18F]플루오로브로모메탄 (문헌 [Bergman et al (Appl Radiat Isot 2001;54(6):927-33)]에 따라 제조)을 첨가하였다. 바이알을 밀봉한 다음, 100℃로 10분 동안 가열하였다. 다음에, 질소 스트림하에서 벌크 용매를 제거한 다음, 남아있는 샘플을 물 (10 mL) 중의 5 % 에탄올에 재용해시키고, Sep-Pak CM 라이트 카트리지 (워터스 사, 미국 매사추세츠 밀포드 소재) (2 M HCl (5 mL) 및 물 (10 mL)을 사용하여 사전-컨디셔닝되었음) 상에 고정시켜, 클로라이드 음이온 교환을 수행하였다. 다음에, 에탄올 (10 mL) 및 물 (10 mL)을 사용하여 카트리지를 세척한 후, 이어서 식염수 (0.5-2.0 mL)를 사용하여 방사성추적자(11a) 또는 (11c)를 용리하고, 멸균 필터 (0.2 ㎛) (사르토리우스(Sartorius) 사, 독일 괴팅겐 소재)로 통과시켰다.
실시예 7. [ 18 F] 플루오로메틸메틸 토실레이트와의 반응에 의한 [ 18 F] 플루오로메틸콜 린, [ 18 F] 플루오로메틸 -[1- 2 H 2 ]콜린 및 [ 18 F] 플루오로메틸 -[1,2- 2 H 4 ]콜린의 방사성합성
Figure pct00035
하기의 전구체들 중 1종을 함유하는 휘튼 바이알에, [18F]플루오로메틸 토실레이트(9) (실시예 5에 따라 제조되고, 무수 DMF (300 μL)를 사용하여 Sep-Pak 카트리지로부터 용리됨)를 첨가한 후, 교반하면서 100℃로 가열하였다: N,N-디메틸에탄올아민 (150 μL); N,N-디메틸-[1,2-2H4]에탄올아민(3) (150 μL) (실시예 1에 따라 제조); 또는 N,N-디메틸-[1-2H2]에탄올아민(5) (150 μL) (실시예 2에 따라 제조). 20분 후, 물 (10 mL)을 사용하여 반응을 켄칭하고, 클로라이드 음이온 교환을 수행하기 위하여 Sep Pak CM 라이트 카트리지 (워터스 사) (2 M HCl (5 mL) 및 물 (10 mL)을 사용하여 사전-컨디셔닝되었음) 상에 고정시킨 다음, 에탄올 (5 mL) 및 물 (10 mL)로 세척한 후, 이어서 등장 식염수 (0.5-1.0 mL)를 사용하여 방사성추적자인 [18F]플루오로메틸콜린(12a), [18F]플루오로메틸-[1-2H2]콜린(12b) 또는 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린 [18F](12c)을 용리하였다.
실시예 8. 냉 플루오로메틸토실레이트(15)의 합성
<반응식 3>
Figure pct00036
(i: 은 p-톨루엔술포네이트, MeCN, 환류, 20시간;
ii: KF, MeCN, 환류, 1시간)
상기 반응식 3에 있어서:
(a) 메틸렌 디토실레이트(14)의 합성
에몬스(Emmons) 및 페리스(Ferris)의 방법을 사용하여 시중에서 구입가능한 디요오도메탄(13) (2.67 g, 10 mmol)을 은 토실레이트 (6.14 g, 22 mmol)와 반응시킴으로써, 28 % 수율로 메틸렌 디토실레이트(10) (0.99 g)를 수득하였다 (문헌 [Emmons, W.D., et al ., "Metathetical Reactions of Silver Salts in Solution. II. The Synthesis of Alkyl Sulfonates", Journal of the American Chemical Society, 1953; 75:225]).
(b) 냉 플루오로메틸토실레이트(15)의 합성
80℃에서의 아세토니트릴 (10 mL) 중의 플루오르화 칼륨 (0.16 g, 2.83 mmol)/크립토픽스 K222 (1.0 g, 2.65 mmol)를 사용한 실시예 3(a)의 메틸렌 디토실레이트(10) (0.67 g, 1.89 mmol)의 친핵성 치환에 의해 플루오로메틸토실레이트(11) (0.04g)를 제조함으로써, 11 % 수율로 원하는 생성물을 수득하였다.
실시예 9. [ 18 F] 플루오로브로모메탄 (17)의 합성
Figure pct00037
문헌 [Bergman et al (Appl Radiat Isot 2001;54(6):927-33)]의 방법을 변경하여, 시중에서 구입가능한 디브로모메탄(16)을 110℃에서 아세토니트릴 중의 [18F]플루오르화 칼륨/크립토픽스 K222와 반응시킴으로써, 원하는 [18F]플루오로브로모메탄(17)을 수득하고, 기체-크로마토그래피에 의해 그것을 정제한 후, 아세토니트릴 및 관련 콜린 전구체를 함유하는 사전-냉각 바이알로의 용리에 의해 포획한다.
실시예 10. 방사화학적 순도의 분석
시중에서 구입가능한 염화 플루오로콜린 표준을 사용한 공동-용리에 의해, [18F]플루오로메틸콜린, [18F]플루오로메틸-[1-2H2]콜린 및 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린 [18F]에 대한 방사화학적 순도를 확인하였다. 아길렌트(Agilent) G1362A 굴절률 검출기 (RID) 및 바이오스캔 플로우카운트(Bioscan Flowcount) FC-3400 PIN 다이오드 검출기가 장착된 아길렌트 1100 시리즈 HPLC 시스템을 사용하였다. 크로마토그래피 분리는 페노메넥스 루나(Phenomenex Luna) C18 역상 컬럼 (150 mm×4.6 mm), 및 1.0 mL/분의 유량으로 전달되는 5 mM 헵탄술폰산 및 아세토니트릴 (90:10 v/v)로 구성되는 이동상에서 수행하였다.
실시예 11. 콜린 옥시다제를 사용한 효소 산화 연구
본 방법은 문헌 [Roivannen, et al. (Roivainen, A., et al ., European Journal of Nuclear Medicine 2000; 27:25-32)]의 것으로부터 변경되었다. 물 (1.9 mL)을 함유하는 바이알에 [18F]플루오로메틸콜린 또는 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린 [18F] 중 어느 하나의 분취량 (100 μL, ~3.7 MBq)을 첨가하여 모(stock) 용액을 수득하였다. 콜린 옥시다제 (0.05 units/μL)를 함유하는 인산 나트륨 버퍼 (0.1 M, pH 7) (10 μL)를 모 용액의 분취량 (190 μL)에 첨가한 다음, 바이알을 간헐적으로 교반하면서 실온에서 방치하였다. 선택된 시점 (5, 20, 40 및 60분)에, HPLC 이동상 (버퍼 A, 1.1 mL)을 사용하여 샘플을 희석하고, 여과한 (0.22 ㎛ 필터) 다음, 1 mL 샘플 루프를 통하여 분석용 HPLC 상에 ~1 mL를 주사하였다. 아세토니트릴, 에탄올, 아세트산, 1.0 mol/L의 아세트산 암모늄, 물, 및 0.1 mol/L의 인산 나트륨 (800:68:2:3:127:10 [v/v])을 함유하는 버퍼 A, 및 동일 성분들을 상이한 비율로 (400:68:44:88:400:10 [v/v]) 함유하는 버퍼 B의 이동상을 사용하여, 워터스 C18 본다파크(Bondapak) (7.8×300 mm) 컬럼 (워터스 사, 미국 매사추세츠 밀포드 소재) 상에서 3 mL/분으로 크로마토그래피 분리를 수행하였다. 구배 프로그램은 100 % 버퍼 A 6분 동안, 0-100 % 버퍼 B 10분 동안, 2분 이내에 100-0 % B 이후 0 % B 2분 동안으로 구성되었다.
실시예 12. 생체분포
이전에 보고되어 있는 바와 같이 (문헌 [Leyton, J., et al ., Cancer Research 2005; 65(10):4202-10]), 수컷 C3H-Hej 마우스 (할란(Harlan) 사, 영국 비세스터 소재)에서 인간 결장 (HCT116) 종양을 성장시켰다. 캘리퍼를 사용하여 종양 치수를 계속 측정하였으며, 종양 부피는 하기 방정식에 의해 계산하였다: 부피 = (π/6)×a×b×c (식 중 a, b 및 c는 종양의 3개 직교 축을 나타냄). 해당 종양이 대략 100 mm3에 도달하였을 때, 마우스를 사용하였다. 깨어있는 미처리 종양 보유 마우스에 꼬리 정맥을 통하여 [18F]플루오로메틸콜린, [18F]플루오로메틸-[1-2H2]콜린 및 [18F]플루오로메틸-[1,2-2H4]콜린 (~3.7 MBq)을 각각 주사하였다. 방사성추적자 주사 후 사전-결정된 시점 (2, 30 및 60분)에 최종 마취 하에서 마우스를 희생시켜, 혈액, 혈장, 종양, 심장, 폐, 간, 신장 및 근육을 수득하였다. 감마 카운터 (코브라(Cobra) II 오토-감마(Auto-Gamma) 카운터, 패커드 바이오사이언시즈(Packard Biosciences) Co. 사, 영국 팡보른 소재)에서 조직 방사능을 측정하고, 붕괴를 보정하였다. 데이터는 조직 그램 당 % 주사 투여량으로 나타내었다.
실시예 13. 생체내에서의 [ 18 F] 플루오로메틸콜린 ([ 18 F] FCH ) 및 [ 18 F] 플루오로메틸 -[1,2- 2 H 4 ]콜린 ([ 18 F] D4 - FCH )의 산화 가능성
[18F]FCH 또는 [18F](D4-FCH) (80-100 μCi)를 꼬리 정맥을 통하여 마취된 비-종양 보유 C3H-Hej 마우스에 주사하였는데; 이소플루오란/O2/N2O 마취를 사용하였다. 주사 2, 15, 30 및 60분 후에 수득된 혈장 샘플을 액체 질소에서 급속 냉동하여, -80℃에서 저장하였다. 분석시에는, 샘플을 해동하고, 4℃에서 유지하였다. 대략 0.2 mL의 혈장에, 빙냉 아세토니트릴 (1.5 mL)을 첨가하였다. 다음에, 혼합물을 원심분리하였다 (3분, 15,493×g; 4℃). 45℃의 배스 온도에서 회전 증발기 (헤이돌로프 인스트루먼츠(Heidoloph Instruments) GMBH & CO 사, 독일 슈바바흐 소재)를 사용하여, 상청액을 증발시켜 건조하였다. 잔류물을 이동상 (1.1 mL)에 현탁시켜, 정화한 후 (0.2 ㎛ 필터), HPLC로 분석하였다. 간 샘플을 빙냉 아세토니트릴 (1.5 mL) 중에서 균질화한 다음, 이어서 혈장 샘플과 같이 처리하였다. 모든 샘플은 γ-RAM 모델 3 방사성-검출기 (IN/US 시스템즈(Systems) inc. 사, 미국 플로리다 소재)가 장착된 아길렌트 1100 시리즈 HPLC 시스템에서 분석하였다. 분석은 페노메넥스 루나 SCX 컬럼 (10 μ, 250×4.6 mm), 및 2 mL/분의 유량으로 전달되는 0.25 M 나트륨 디히드로젠 포스페이트 (pH 4.8) 및 아세토니트릴 (90:10 v/v)로 구성되는 이동상을 사용하는 문헌 [Roivannen (Roivainen, A., et al ., European Journal of Nuclear Medicine 2000; 27:25-32)]의 방법을 바탕으로 하였다.
실시예 14. 콜린 대사물의 분포
30분에 간, 신장, 및 종양 샘플을 수득하였다. 모든 샘플을 액체 질소에서 급속-냉동하였다. 분석시에는, 사용 직전에 샘플을 해동하여 4℃에서 유지하였다. ~0.2 mL의 혈장에 빙냉 메탄올 (1.5 ml)을 첨가하였다. 다음에, 혼합물을 원심분리하였다 (3분, 15,493×g; 4jC). 40℃의 배스 온도에서 회전 증발기 (헤이돌로프 인스트루먼츠 사)를 사용하여 상청액을 증발 건조하였다. 잔류물을 이동상 (1.1 mL)에 현탁시켜, 정화한 후 (0.2 Am 필터), HPLC로 분석하였다. IKA 울트라-투락스(Ultra-Turrax) T-25 균질화기를 사용하여 간, 신장, 및 종양 샘플을 빙냉 메탄올 (1.5 mL) 중에서 균질화하고, 이어서 (상기) 혈장 샘플과 같이 처리하였다. 모든 샘플은 γ-RAM 모델 3 γ-검출기 (IN/US 시스템즈 사) 및 로라(Laura) 3 소프트웨어 (랩로직(Lablogic) 사)가 장착된 아길렌트 1100 시리즈 HPLC 시스템 (아길렌트 테크놀로지스(Agilent Technologies) 사)에서 방사성-HPLC에 의해 분석하였다. 고정상은 워터스 μ본다파크 C18 역상 컬럼 (300×7.8 mm) (워터스 사, 미국 매사추세츠 밀포드 소재)를 포함하였다. 3 mL/분의 유량으로 전달되며, 0 % B 6분 동안, 다음에 10분 이내에 0→100 % B, 100 % B 0.5 분 동안, 1.5분 이내에 100→0 % B, 다음에 0 % B 2분 동안의 구배를 가지는 용매 A (아세토니트릴/물/에탄올/아세트산/1.0 mol/L 아세트산 암모늄/0.1 mol/L 인산 나트륨; 800/127/68/2/3/10) 및 용매 B (아세토니트릴/물/에탄올/아세트산/1.0 mol/L 아세트산 암모늄/0.1 mol/L 인산 나트륨; 400/400/68/44/88/10)를 포함하는 이동상을 사용하여 샘플을 분석하였다.
실시예 15. HCT116 종양 세포에 의한 [ 18 F] D4 - FCH 및 [ 18 F] FCH 의 대사
HCT116 세포를 그것이 70 % 융합성(confluent)이 될 때까지 T150 플라스크에서 3반복으로 성장시킨 다음, 비히클 (성장 배지 중 1 % DMSO) 또는 비히클 중 1 μmol/L의 PD0325901로 24시간 동안 처리하였다. [18F]D4-FCH 또는 [18F]FCH 중 어느 하나 1.1 MBq를 사용하여 1시간 동안 세포를 펄싱하였다(pulsed). 빙냉 포스페이트 버퍼링된 식염수 (PBS) 중에서 세포를 3회 세척한 후, 5 mL의 PBS에 긁어 넣고, 500×g에서 3분 동안 원심분리한 다음, 조직 샘플에 대하여 상기한 바와 같은 HPLC 분석을 위하여 2 mL의 빙냉 메탄올에 재현탁하였다. 5'-포스페이트가 HPLC 크로마토그램상에서 확인되는 피크라는 생화학적 증거를 제공하기 위하여, 배양된 세포를 이전에 기술된 바와 같이 (문헌 [Barthel, H., et al ., Cancer Res 2003; 63(13):3791-8]) 알칼리 포스파타제로 처리하였다. 간단하게 말하자면, HCT116 세포를 100 mm 접시에서 3반복으로 성장시킨 후, 5.0 MBq의 [18F]FCH와 함께 37℃에서 60분 동안 인큐베이팅하여, 추정상 [18F]FCH-포스페이트를 형성시켰다. 5 mL의 빙냉 PBS로 세포를 2회 세척한 다음, 긁어 5 mL의 PBS 중에서 750 ×g로 (4℃, 3분) 원심분리하였다. 50 % (v/v) 글리세롤, 0.5 mmol/L의 MgCl2, 및 0.5 mmol/L의 ZnCl2를 함유하는 1 mL의 5 mmol/L 트리스-HCl (pH 7.4)에서 세포를 균질화한 후, 진탕수 배스에서 37℃에서 30분 동안 10 단위의 세균성 (유형 III) 알칼리 포스파타제 (시그마 사)와 함께 인큐베이팅함으로써, [18F]FCH-포스페이트를 탈인산화하였다. 빙냉 메탄올을 첨가함으로써 반응을 종료하였다. 상기 혈장과 같이 샘플을 처리하고, 방사성-HPLC에 의해 분석하였다. 알칼리 포스파타제 없이 대조 실험을 수행하였다.
실시예 16. 소형 동물 PET 화상화
PET 화상화 연구. 희사된 소형 동물 PET 스캐너인 쿼드(quad)-HIDAC (옥스포드 포지트론 시스템즈(Oxford Positron Systems) 사)에서 동적 [18F]FCH 및 [18F]D4-FCH 화상화 스캔을 수행하였다. 이 기기의 특징에 대해서는 이전에 기술된 바 있다 (문헌 [Barthel, H., et al ., Cancer Res 2003; 63(13):3791-8]). 꼬리 정맥을 스캐닝하기 위하여, 마취 (이소플루오란/O2/N2O) 유도 후 비히클- 또는 약물-처리된 마우스에 캐뉼러를 처리하였다. 동물을 온도가 자동으로 조절되는 지그(jig) (~37℃의 직장 온도를 제공하도록 보정)에 넣고, 스캐너에 포복 위치시켰다. 꼬리 정맥 캐뉼러를 통하여 [18F]FCH 또는 [18F]D4-FCH (2.96-3.7 MBq)를 주사하고, 스캐닝을 개시하였다. 이전에 보고된 바와 같이 (문헌 [Leyton, J., et al., Cancer Research 2006; 66(15):7621-9]), 60분 기간에 걸쳐 리스트(list) 모드 포맷으로 동적 스캔을 수득하였다. 화상 재구성을 위하여, 수득된 데이터를 0.5 mm 시노그램 빈(sinogram bin) 및 19회 프레임 (0.5×0.5×0.5 mm 복셀(voxel); 4×15, 4×60, 및 11×300초)으로 소팅하였는데, 이는 2-차원 해밍(Hamming) 필터 (컷오프 0.6)를 사용하여 필터링된 백-프로젝션(back-projection)에 의해 수행되었다. 애널라이즈(Analyze) 소프트웨어 (버젼 6.0; 바이오메디칼 이매징 리조스(Biomedical Imaging Resource), 마요 클리닉(Mayo Clinic) 사)를 사용하여 화상 데이터 세트를 가시화하였다. 방사성추적자 흡수를 가시화하고 해당 영역을 도시하는 데에는 30 내지 60분 동적 데이터의 누적 화상을 사용하였다. 해당 영역은 5개의 인접한 종양 영역 (각각 0.5 mm 두께)에서 수동으로 한정되었다. 각 조직 (간, 신장, 근육, 소변, 및 종양)에 대하여 각각 19 시점에 이러한 슬라이스로부터의 동적 데이터를 평균함으로써, 시간 대 방사능 곡선을 수득하였다. 200×160×160개의 재구성 복셀 전체에서의 방사능을 합침으로써, 주사된 방사능을 나타내는 상응 전신 시간 대 방사능 곡선을 수득하였다. 종양 방사능을 전신 방사능에 대하여 표준화하고, 복셀 당 % 주사 투여량 (%ID/복셀)으로 나타내었다. 이후의 비교에는 60분에서의 표준화된 방사성추적자 흡수율 (%ID/복셀60)을 사용하였다. 5개 종양 슬라이스에 걸친 표준화된 최대 복셀 강도의 평균인 %ID복셀60max 역시 종양 이질성 및 종양에서의 괴사 영역의 존재를 밝히기 위한 비교에 사용하였다. 곡선하 면적은 0 내지 60분에서의 %ID/복셀의 적분으로 계산하였다.
실시예 17. 마우스에서의 PD0325901 처리의 효과.
크기를 맞춘 HCT116 종양 보유 마우스를 무작위화하여, 비히클 (0.5 % 히드록시프로필 메틸셀룰로스 + 0.2 % 트윈 80), 또는 비히클 중에 조제된 25 mg/kg (0.005 mL/g마우스)의 미토겐성 세포외 키나제 억제제 PD0325901의 경구 급식(gavage)에 의한 매일 처리를 투여받도록 하였다. 최종 투여분이 스캐닝 1시간 전에 투여된 10회의 매일 처리 후, [18F]D4-FCH-PET 스캐닝을 수행하였다. 화상화 후, 종양을 액체 질소에서 급속-냉동한 후, 콜린 키나제 A 발현의 분석을 위하여 ~80℃에서 저장하였다. 결과를 도 18 및 19에 도시하였다.
이는 약물 반응의 조기 바이오마커로서의 [18F]D4-FCH-PET의 용도를 예시한다. 암용으로 개발된 현행 약물의 대부분은 세포 증식 또는 생존과 연관된 핵심 키나제를 표적으로 하고 있다. 본 실시예는 종양 수축이 유의성이 없는 이종이식편 모델에서, MEK 억제제인 PD0325901에 의한 성장 인자 수용체-Ras-MAP 키나제 경로 억제가 경로의 억제를 의미하는 종양 [18F]D4-FCH 흡수의 상당한 감소로 이어진다는 것을 보여준다. 도면은 또한 [18F]D4-FCH 흡수의 억제가 적어도 부분적으로 콜린 키나제 활성의 억제에 기인하였다는 것을 보여준다.
실시예 18. 화상화에 있어서의 [ 18 F] FCH 와 [ 18 F] D4 - FCH 의 비교
도 16에 도시되어 있는 바와 같이, [18F]FCH 및 [18F]D4-FCH는 모두 조직으로 빠르게 흡수되어 유지된다. 조직 방사능은 하기의 순서로 증가된다: 근육 < 소변 < 신장 < 간. 간에서의 산화에 대비한 인산화의 우세성으로 인하여 (도 12), 2종의 방사성추적자 사이에서 전체적인 간 방사능 수준에는 차이가 거의 발견되지 않았다. [18F]D4-FCH 또는 [18F]FCH 주사 60분 후 수준에서의 간 방사능 %ID/복셀60은 각각 20.92±4.24 및 18.75±4.28이었다 (도 16). 이는 또한 [18F]FCH 주사에서보다 [18F]D4-FCH 주사에서의 더 낮은 수준의 베타인과 함께 유지된다 (도 12). 따라서, PET에 의해 측정된 간에서의 2종 방사성추적자의 약동학 (화학적 해법이 부족함)은 유사하였다. 반면, [18F]FCH에 비해 [18F]D4-FCH에 있어서의 더 낮은 신장 방사능 수준 (도 16)은 신장에서의 [18F]D4-FCH의 더 낮은 산화 가능성을 반영한다. [18F]FCH 및 [18F]D4-FCH에 있어서의 %ID/복셀60은 신장에서 각각 15.97±4.65 및 7.59±3.91이었다 (도 16). 소변 배설은 방사성추적자들간에 유사하였다. 방광상에 도시된 해당 영역 (ROI)은 [18F]D4-FCH 및 [18F]FCH에 있어서 각각 5.20±1.71 및 6.70±0.71의 %ID/복셀60 값을 나타내었다. 소변 대사물은 주로 미대사 방사성추적자로 구성되었다. 근육은 임의 조직의 가장 낮은 방사능추적자 수준을 나타내었다.
[18F]D4-FCH의 상대적으로 높은 전신 안정성 및 포스포콜린 대사물의 높은 비율에도 불구하고, [18F]FCH 군에 비해 [18F]D4-FCH가 주사된 마우스에서의 PET에 의한 더 높은 종양 방사성추적자 흡수율이 관찰되었다. 도 17은 인간 흑색종 SKMEL-28 이종이식편에서의 [18F]FCH 및 [18F]D4-FCH의 축적을 나타내는 통상적인 (0.5 mm) 횡방향 PET 화상 슬라이스를 도시한다. 이와 같은 마우스 모델에서, 종양 신호-대-바탕 대조는 [18F]FCH 화상에 비해 [18F]D4-FCH PET 화상에서 질적으로 뛰어났다. 양 방사성추적자가 PET에 의해 검출되는 유사한 종양의 동역학적 프로필을 가졌다 (도 17). 동역학은 ~1분에 최대 방사능을 가지는 빠른 종양 유입(influx)을 특징으로 하였다 (도 17). 이후, 종양 수준은 ~5분까지 평형화된 후, 이어서 편평해졌다. [18F]D4-FCH의 전달 및 보유율은 FCH의 것에 비해 양적으로 더 컸다 (도 17). [18F]D4-FCH 및 [18F]FCH에 있어서의 %ID/복셀60은 각각 7.43±0.47 및 5.50±0.49이었다 (P=0.04). 종양은 종종 불균질한 세포 군집을 제공하기 때문에, 실험상의 노이즈에 덜 민감할 수 있는 또 다른 화상화 변수를 개발하였다 - 5개 슬라이스에 걸친 최대 픽셀(pixel) %ID/복셀60의 평균 (%ID복셀60max). 이 변수 역시 [18F]D4-FCH에서 상당히 더 높았다 (P=0.05; 도 17). 또한, 시간 대 방사능 곡선하 종양 면적 (AUC)이 FCH에 비해 D4-FCH 마우스에서 더 높았다 (P=0.02). 조직 샘플의 더 상세한 분석을 위하여 30분 시점이 선택되기는 하였지만, 혈장에서의 모 화합물의 백분율은 초기 시점에 [18F]FCH에 비해 [18F]D4-FCH에서 일관되게 더 높았다. 화상화와 관련하여, 양 방사성추적자에서의 종양 흡수율은 초기 (15분) 및 후기 (60분) 시점에서 유사하였다 (부록 표 1). 초기 시점은 골반 화상화에 적절할 수 있다.
실시예 19. 치료에 대한 반응의 화상화
생체내 연구에서 [18F]D4-FCH가 더 안정한 플루오르화-콜린 유사체인 것으로 나타났기 때문에, 치료에 대한 반응을 측정하기 위한 이와 같은 방사성추적자의 용도를 조사하였다. 이와 같은 연구는 치료 결과에 대해 이전에 특성화된 바 있는 재현가능한 종양 모델 시스템, 즉 10일 동안 매일 PD0325901로 처리된 인간 결장 암종 이종이식편 HCT116에서 수행되었다 (문헌 [Leyton, J., et al ., "Noninvasive imaging of cell proliferation following mitogenic extracellular kinase inhibition by PD0325901", Mol Cancer Ther 2008; 7(9):3112-21]). 약물 치료는 종양 정체(stasis)로 이어졌으며 (사전처리된 군에 비해 10일차에 겨우 12.2 %만큼의 종양 크기 감소); 비히클-처리 마우스의 종양은 375 % 증가하였다. PD0325901-처리된 마우스에서의 종양 [18F]D4-FCH 수준은 비히클-처리된 것의 그것과 대략 동일한 시간에 최대였으나, 처리된 종양에서는 방사성추적자 보유의 현저한 감소가 존재하였다 (도 18). 약물 치료 10일 후, 모든 화상화 변수가 감소되었다 (P=0.05, 도 18). 이는 [18F]D4-FCH가 종양 크기 감소의 큰 변화가 보이지 않는 조건하에서도 치료 반응을 검출하는 데에 사용될 수 있다는 것을 나타낸다 (문헌 [Leyton, J., et al ., "Noninvasive imaging of cell proliferation following mitogenic extracellular kinase inhibition by PD0325901", Mol Cancer Ther 2008; 7(9):3112-21]). 바이오마커 변화를 이해하기 위하여, 배지에서 지수적으로 성장하는 HCT116 세포를 24시간 동안 PD0325901로 처리한 후, 시험관 내에서 [18F]D4-FCH의 60-분 흡수율을 측정하는 것에 의해, D4-FCH-포스포콜린 형성에 대한 PD0325901의 본질적 세포 효과를 조사하였다. 도 18에 도시한 바와 같이, PD0325901은 약물-처리된 세포에서 [18F]D4-FCH-포스포콜린 형성을 상당히 억제함으로써, 종양에서의 약물의 효과가 혈류역학적 효과보다는 콜린 대사에 대한 세포 효과에 기인할 가능성이 있음을 나타내었다.
약물 처리를 사용하여 [18F]D4-FCH 흡수를 조절하는 기작을 더 이해하기 위하여, PET 스캐닝 후 절제된 PD0325901 및 비히클-처리 종양에서의 CHKA 발현의 변화를 평가하였다. PD0325901 처리 후 10일차에 (P=0.03), CHKA 단백질 발현의 상당한 감소가 생체내에서 관찰됨으로써 (도 19), 감소된 CHKA 발현이 약물-처리된 종양에서의 더 낮은 D[18F]4-FCH 흡수율에 기여하였다는 것을 표시하였다. CHKA 발현의 약물-유도 감소는 시험관 내의 PD0325901로 처리된 지수 성장 세포에서도 발생하였다.
실시예 20. 통계
소프트웨어 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 버젼 4 (그래프패드(GraphPad) 사)를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 군-간 비교는 비모수(nonparametric) 만-휘트니(Mann-Whitney) 검정을 사용하여 이루어졌다. 양측(two-tailed) P≤0.05가 유의성이 있는 것으로 간주되었다.
상기에서 논의 및/또는 인용된 모든 특허, 잡지 논문, 공개 및 기타 문헌들은 의거 참조로써 개재된다.

Claims (12)

  1. 하기 화학식 II의 화합물:
    <화학식 II>
    Figure pct00038

    (식 중:
    R1, R2, R3, 및 R4는 각각 독립적으로 수소 또는 중수소 (D)이고;
    R5, R6, 및 R7은 각각 독립적으로 수소, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, -CH(R8)2, 또는 -CD(R8)2이고;
    R8은 독립적으로 수소, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2Cl, CD2Br, CD2I, 또는 -C6H5이고;
    m은 1 내지 4의 정수임).
  2. 제1항에 있어서,
    R1, R2, R3, 및 R4가 각각 독립적으로 수소이고;
    R5, R6, 및 R7이 각각 독립적으로 수소, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, 또는 -CD(R8)2이고;
    R8이 수소, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2Cl, CD2Br, CD2I, 또는 -C6H5이고;
    m이 1 내지 4의 정수인 화합물.
  3. 제1항에 있어서,
    R1 및 R2가 각각 수소이고;
    R3 및 R4가 각각 중수소 (D)이고;
    R5, R6, 및 R7이 각각 독립적으로 수소, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, 또는 -CD(R8)2이고;
    R8이 수소, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2Cl, CD2Br, CD2I, 또는 -C6H5이고;
    m이 1 내지 4의 정수인 화합물.
  4. 제1항에 있어서,
    R1, R2, R3, 및 R4가 각각 중수소 (D)이고;
    R5, R6, 및 R7이 각각 독립적으로 수소, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, 또는 -CD(R8)2이고;
    R8이 수소, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2Cl, CD2Br, CD2I, 또는 -C6H5이고;
    m이 1 내지 4의 정수인 화합물.
  5. 제1항에 있어서, 하기 화학식 IIa의 것인 화합물:
    <화학식 IIa>
    Figure pct00039
    .
  6. 하기 화학식 IIb의 화합물:
    <화학식 IIb>
    Figure pct00040

    (식 중:
    R1, R2, R3, 및 R4는 각각 독립적으로 수소 또는 중수소 (D)이고;
    R5, R6, 및 R7은 각각 독립적으로 수소, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, -CH(R8)2, 또는 -CD(R8)2이고;
    R8은 독립적으로 수소, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2Cl, CD2Br, CD2I, 또는 -C6H5이고;
    m은 1 내지 4의 정수이고;
    Pg는 히드록실 보호 기임).
  7. 제6항에 있어서, Pg가 p-메톡시벤질 (PMB), 트리메틸실릴 (TMS), 또는 디메톡시트리틸 (DMTr) 기인 화합물.
  8. 제6항에 있어서, Pg가 p-메톡시벤질 (PMB) 기인 화합물.
  9. 하기 화학식 IIc의 화합물:
    <화학식 IIc>
    Figure pct00041

    (식 중:
    R1, R2, R3, 및 R4는 각각 독립적으로 수소 또는 중수소 (D)이고;
    R5, R6, 및 R7은 각각 독립적으로 수소, R8, -(CH2)mR8, -(CD2)mR8, -(CF2)mR8, -CH(R8)2, 또는 -CD(R8)2이고;
    R8은 독립적으로 수소, -OH, -CH3, -CF3, -CH2OH, -CH2F, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2I, -CD3, -CD2OH, -CD2F, CD2Cl, CD2Br, CD2I, 또는 -C6H5이고;
    m은 1 내지 4의 정수이되;
    단, R1, R2, R3, 및 R4가 각각 수소인 경우, R5, R6, 및 R7은 각각 수소가 아니고; R1, R2, R3, 및 R4가 각각 중수소인 경우, R5, R6, 및 R7은 각각 수소가 아님).
  10. 제9항에 있어서,
    R1, R2, R3, 및 R4가 각각 독립적으로 수소이되;
    단, R5, R6, 및 R7이 각각 수소가 아닌 화합물.
  11. 제9항에 있어서,
    R1, R2, R3, 및 R4가 각각 중수소 (D)이고;
    R5, R6, 및 R7이 각각 수소가 아닌 화합물.
  12. 제9항에 있어서,
    R1 및 R2가 각각 수소이고;
    R3 및 R4가 각각 중수소 (D)인 화합물.
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