MX2013001044A - Metodos para purificar polipeptidos o inmunoconjugados activos. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona métodos para aislar un polipéptido o inmunoconjugado activo mediante purificación de una solución que contiene el polipéptido o inmunoconjugado activo y una variante ácida del mismo, tal como una variante desamidada, utilizando cromatografía de intercambio aniónico.

Description

METODO PARA PURIFICAR POLIPEPTIDOS O I MUNOCONJUGADOS ACTIVOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para purificar un polipéptido o inmunoconjugado activo a partir de una solución que contiene el polipéptido o inmunoconjugado y una variante ácida del mismo, en donde la variante ácida es una especie desamidada de el polipéptido o inmunoconjugado . La presente invención también proporciona formulaciones que contienen los polipéptidos o inmunoconjugados purificados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La purificación económica a gran escala de proteínas es un factor para la industria biofarmacéutica . Las proteínas terapéuticas típicamente se producen usando líneas celulares procarióticas o eucarióticas que se genomanipulan para expresar la proteína de interés a partir de un plásmido recombinante que contiene el gen que codifica la proteína. La separación de la proteína deseada de la mezcla de componentes usada para alimentar a las células y de los subproductos celulares hasta una pureza adecuada, por ejemplo, suficiente para uso como producto terapéutico para humanos, representa una gran desafío para los fabricantes de productos biológicos por varios motivos .

Los fabricantes de productos farmacéuticos a base de Ref.:238325 - - proteínas deben cumplir con estándares reglamentarios estrictos, incluidos requisitos de pureza extremadamente rigurosos. Para garantizar la seguridad, las agencias reguladoras, tales como la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos (FDA, por sus siglas en inglés) , exigen que los productos farmacéuticos a base de proteínas estén sustancialmente libres de impurezas, incluidos contaminantes relacionados con el producto tales como agregados , fragmentos y variantes de la proteína recombinante y contaminantes relacionados con el proceso tales como proteínas de célula huésped, componentes de los medios, virus, ADN y endotoxinas . Aunque existen diversos esquemas de purificación proteica y se utilizan ampliamente en la industria biofarmacéutica, típicamente incluyen una etapa de purificación por afinidad, tal como purificación de Proteína A en el caso de anticuerpos, a efectos de alcanzar una grado farmacéuticamente aceptable de pureza.

El desarrollo de un esquema de purificación aplicable a una biomolécula específica o a varias biomoléculas que se pueda ampliar, controlar y que emplee estratégicamente el uso de resinas específicas o una combinación de resinas permitirá su integración en el desarrollo del producto en un etapa muy temprana en el desarrollo general del fármaco. Este enfoque del diseño de un esquema de purificación puede minimizar los cambios costosos en los procesos de fabricación que de otra forma pueden ser necesarios más adelante en el desarrollo del fármaco o, lo que es peor, después de la aprobación. A medida que este proceso se amplía y se acerca a las condiciones de producción GMP (siglas en inglés de buenas prácticas de fabricación), surgen complejidades inherentes adicionales, incluidas las asociadas con el envasado de la resina y la preparación de la solución amor iguadora. El proceso de fabricación y su capacidad pueden mejorarse simplificando el esquema de purificación, eliminando etapas del proceso y maximizando el rendimiento y la productividad, manteniendo al mismo tiempo la integridad y pureza de la molécula que se está purificando. Por lo tanto, sería deseable y ventajoso comenzar con un proceso simple y eficaz que pueda producir un fármaco de gran calidad y seguridad.

Una complejidad asociada con la purificación de un fármaco es la conservación de la potencia a lo largo del proceso de purificación. Muchos factores pueden contribuir a la reducción o inhibición de la potencia, incluida la modificación del fármaco durante el proceso de desarrollo. La modificación puede ocurrir en varias etapas del proceso, por ejemplo, cuando se está expresando la proteína en la célula o cuando una proteína que ha sido aislada de una célula se somete a diversas condiciones o soluciones amortiguadoras. La presente invención proporciona un método para purificar un polipéptido o inmunoconjugado activo a partir de una solución - - que contiene una variante modificada del polipéptido o inmunoconjugado, donde la presencia de esta variante modificada resulta en una inhibición de la potencia del fármaco final.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para purificar un polipéptido de interés a partir de una solución que contiene el polipéptido y una variante acida, tal como una variante desamidada del polipéptido.

En particular, la presente invención proporciona un método para purificar un inmunoconjugado activo, donde el inmunoconjugado está desamidado en uno o más residuos y en donde la desamidación resulta en una inhibición de la potencia de el inmunoconjugado, comprendiendo el método: (a) poner en contacto el inmunoconjugado con una matriz de cromatografía de intercambio aniónico AIEX; y (b) eluir el inmunoconjugado unido de la matriz de cromatografía AIEX con una solución amortiguadora con elevado contenido de sal, separando así el inmunoconjugado activo de la variante desamidada.

La invención también proporciona un método para producir un polipéptido purificado a partir de una solución que comprende el polipéptido y una variante ácida del polipéptido, donde la variante ácida del polipéptido resulta en una inhibición de la potencia del polipéptido, comprendiendo el método: (a) poner en contacto el polipéptido con una matriz de cromatografía de intercambio aniónico (AIEX, por sus siglas en inglés) ; y (b) eluir el polipéptido unido de la matriz de cromatografía AIEX con una solución amortiguadora con elevado contenido de sal, separando así el polipéptido de la variante ácida y produciendo un polipéptido purificado .

La invención además proporciona un método para producir un polipéptido o inmunoconjugado purificado a partir de una solución que comprende el polipéptido y una variante ácida del polipéptido, comprendiendo el método: (a) producir el polipéptido o inmunoconjugado en una célula bacteriana que expresa el polipéptido o inmunoconjugado; (b) aislar cuerpos de inclusión que contienen el polipéptido o inmunoconjugado de las células bacterianas; (c) replegar el polipéptido o inmunoconjugado aislado de los cuerpos de inclusión; (d) poner en contacto la composición que contiene el polipéptido o inmunoconjugado con una matriz de cromatografía AIEX; y (C) eluir el polipéptido o inmunoconjugado unido de la matriz de cromatografía AIEX con una solución amortiguadora con elevado contenido de sal, purificando así el polipéptido o inmunoconjugado de la solución.

En ciertas modalidades, la variante ácida es una variante desamidada. En modalidades adicionales, entre aproximadamente 75 y aproximadamente 99% de la variante ácida o desamidada se elimina durante el proceso de purificación, en particular aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% O 99%.

La matriz AIEX de la invención contiene grupos de intercambio iónico de amina cuaternaria o amina terciaria, un grupo amino cuaternario (Q) . En ciertas modalidades, la matriz AIEX es Q Sepharose .

El polipéptido o inmunoconjugado de la invención se eluye con un gradiente de sal lineal o en etapas . En ciertas modalidades, el gradiente de sal lineal es de aproximadamente 150 mM de NaCl en Tris/HCl, pH 8,0 a aproximadamente 300 mM de NaCl en Tris/HCl, pH 8,0, de aproximadamente 175 mM de NaCl en Tris/HCl, pH 8,0 a aproximadamente 275 mM de NaCl en Tris/HCl, pH 8,0 o de aproximadamente 192 mM de NaCl en Tris/HCl, pH 8,0 a aproximadamente 245 mM de NaCl en Tris/HCl, pH 8,0.

En una modalidad, el polipéptido o inmunoconjugado de la invención comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende un Fab, un Fab1, un F(ab')2, un Fd, un Fv o scFv monocatenario, un Fv enlazado por disulfuro, un dominio V-NAR, un IgNar, un intracuerpo, un IgGA CH2 ,. un minicuerpo, un F(ab')3, un tetracuerpo, un triacuerpo, un diacuerpo, un anticuerpo de dominio simple DVD-Ig, Fcab, mAb2, un (scFv)2 o un scFv-Fc. En ciertas modalidades, el - - anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une a un receptor de superficie celular, tal como el receptor de superficie celular CD22. En modalidades adicionales, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un secuencia VH y VL, donde la secuencia VH se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs : 6-11 y la secuencia VL se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 2 y 12-15.

En otra modalidad, el polipéptido o inmunoconjugado comprende una toxina, donde la toxina se selecciona del grupo que consiste en: exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina, toxina diftérica y subunidades de las mismas, así como las toxinas botulínicas de la A a la F o variantes o derivados de las mismas. En ciertas modalidades, la exotoxina de Pseudomonas o variante de la misma tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 16-22. En una modalidad específica, el inmunoconjugado es la inmunotoxina CAT-8015 que comprende la subunidad VH-PE38 de la SEQ ID NO : 1 y la subunidad VL de la SEQ ID NO : 2.

La invención también proporciona una composición que comprende un inmunoconjugado purificado que tiene menos de entre aproximadamente 25% y aproximadamente 1% de especies desamidadas, en donde el inmunoconjugado se purifica mediante cualquiera de las métodos descritos anteriormente. La composición puede tener menos de aproximadamente 25%, 20%, - - 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1% de especies desanudadas presentes. En ciertas modalidades, la composición es una composición farmacéutica que comprende un polipéptido o inmunoconjugado purificado y un portador farmacéuticamente aceptable.

La invención también proporciona una formulación que comprende 1 mg/mL de CAT-8015 en 25 mM de fosfato de sodio, 4% de sacarosa, 8% de glicina, 0,02% de polisorbato 80 (PS80) , pH 7,4. En modalidades adicionales, la formulación se liofiliza.

La invención también proporciona un método para modificar la bioactividad de una solución polipeptídica que comprende un polipéptido y una variante desamidada, comprendiendo el método separar el polipéptido de la variante desamidada mediante cromatografía AIEX de elución lineal y combinar el polipéptido purificado y la variante desamidada en cantidades fijas para obtener la bioactividad deseada de la solución polipeptídica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Una gráfica que representa un perfil de cromatografía de intercambio iónico (IEC, por sus siglas en inglés) de un estándar de referencia de CAT-8015. El prepico de CAT-8015 representa la mayor parte del CAT-8015 inactivo desamidado o isodesamidado, mientras el pico principal contiene la mayor parte del inmunoconjugado CAT-8015 activo - - intacto .

Figura 2. Una gráfica que representa la correlación entre el porcentaje de potencia relativa' de CAT-8015 y el porcentaje de prepico en la muestra.

Figura 3. Una gráfica que representa un perfil de elución de la purificación a escala experimental de CAT-8015 mediante cromatografía en Q Sepharose HP. El CAT-8015 se purificó utilizando Q Sepharose HP. La mayor parte del CAT-8015 activo intacto se encontraba en las fracciones D5, D7 y D9 (abarcando el pico principal desde D3 a D12 tal como se indica por encima del pico) .

Figura 4. Un análisis SDS-PAGE de muestras de reserva de carga y eluato de QHP (purificación a escala experimental) . La Línea 1 corresponde a la reserva de carga de QHP; la Línea 2 corresponde a la reserva de eluato de QHP; y la Línea 3 corresponde a un estándar de referencia de CAT-8015.

Figura 5. Purificación a gran escala de CAT-8015 mediante cromatografía en Q Sepharose HP. El CAT-8015 se purificó utilizando Q Sepharose HP. Tal como se muestra en la figura y la Tabla 2, la mayor parte del CAT-8015 activo intacto se encontraba en las fracciones 5, 6 y 7.

Figura 6. Un análisis SDS-PAGE de muestras de reserva de carga y eluato de QHP (purificación a gran escala) . La Línea 1 corresponde a la reserva de carga de QHP; y la Línea 2 corresponde a la reserva de eluato de QHP.

- - Figura 7. Una gráfica que representa el porcentaje de prepico en el producto HA como función del pH de solubilización tal como se describe en el Ejemplo 6.

Figura 8. Diagrama de flujo de la producción de CAT-8015.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona métodos para purificar un polipéptido o inmunoconjugado activo a partir de una solución que contiene el polipéptido o inmunoconjugado y una variante acida del mismo. En una modalidad, la variante ácida comprende una forma desamidada del polipéptido o inmunoconjugado . A diferencia del comportamiento de elución esperado en una columna de intercambio aniónico, el volumen de variantes desamidadas se eluye antes que los polipéptidos intactos en condiciones de elución con gradiente de sal. En la presente se proporcionan detalles de los métodos.

Los términos "polipéptido", "péptido" , "proteína" y "fragmento de proteína" se utilizan de forma indistinta en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos corresponden a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como de polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen no natural.

- - El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural y sintético, así como también análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de forma similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son los codificados por el código genético, así como los aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato y 0-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural, por ejemplo, un carbono alfa que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metilsulfonio de metionina. Los análogos pueden tener grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o esqueletos peptídicos modificados, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente a la estructura química general de un aminoácido pero que funcionan de forma similar a un aminoácido de origen natural. Los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico (o aspartato) y ácido glutámico (o glutamato) . Los aminoácidos cargados positivamente incluyen arginina, histidina y lisina.

La "composición" que va a purificarse en la presente comprende el polipéptido de interés y una o más impurezas. La composición puede estar "parcialmente purificada" (es decir, puede haberse sometido a una o más etapas de purificación) tales como cromatografía de no afinidad descrita en la presente, o puede obtenerse directamente de una célula u organismo huésped que produce el polipéptido (por ejemplo, la composición puede comprender fluido de cultivo celular cultivado) .

Las expresiones "polipéptido" o "polipéptido de interés" o "proteína de interés" y "proteína objetivo" o "proteína" se usan de forma indistinta y se refieren a una proteína o polipéptido tal como un anticuerpo o inmunoconjugado (tal como se define en la presente) que va a purificarse mediante un método de la invención a partir de una mezcla de proteínas y otros materiales tales como una variante ácida del polipéptido de interés.

Una "variante ácida" es una variante de un polipéptido o inmunoconjugado que es más ácida (por ejemplo, tal como se determina mediante cromatografía de intercambio catiónico) que el polipéptido de interés. Un ejemplo de una variante ácida es una variante desamidada.

Las proteínas desamidadas son las que tuvieron parte o todos los grupos funcionales de amidas libres hidrolizados en ácidos carboxílieos , tal como una conversión de glutaminas en ácido glutámico. La tasa de esta reacción depende de la secuencia primaria, la estructura tridimensional, el pH, la temperatura, el tipo de solución amortiguadora, la fuerza iónica y otras propiedades de la solución. De forma importante, la reacción de desamidación introduce una carga negativa en la molécula. Tal como se describe adicionalmente más adelante, la desamidación proteica puede tener un impacto negativo sobre la actividad proteica.

Tal como se usan en la presente, los términos "anticuerpo" e " inmunoglobulina" se usan de forma indistinta en el sentido más amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos) , anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecífieos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos siempre que exhiban la actividad biológica deseada) y fragmentos de anticuerpos tal como se describen en la presente. Se pretende que la expresión "anticuerpo biespeexfico" incluya cualquier anticuerpo que tenga dos especificidades de unión diferentes, es decir, el anticuerpo se une a dos epítopos diferentes, que pueden ubicarse en el mismo antígeno objetivo o, más comúnmente, en diferentes antígenos objetivo.

Los anticuerpos e inmunoglobulinas naturales generalmente son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 datones, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas.

Cada cadena ligera se liga a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que la cantidad de ligaduras disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena ligera y pesada tiene también puentes disulfuro dentro de la cadena distanciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por varios dominios constantes . Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácidos específicos forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y pesada (Clothia et al., J. Mol. Biol. 186, 651-66, 1985); Novotny and Haber, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 82, 4592-4596 (1985) ) . Se definen cinco tipos de inmunoglobulinas humanas en base a la composición de su cadena pesada y se denominan IgG, IgM, IgA, IgE e IgD. Los anticuerpos de tipo IgG y tipo IgA se dividen adicionalmente en dos subtipos, a saber, IgGl, IgG2 , IgG3 e IgG4 , e IgAl e IgA2. Las cadenas pesadas en los anticuerpos IgG, IgA e IgD tienen tres dominios de regiones constantes que se denominan CH1, CH2 y CH3, y las cadenas pesadas en los anticuerpos IgM e IgE tienen cuatro dominios de regiones constantes, CH1, CH2, CH3 y CH4. Por consiguiente, las cadenas pesadas tienen una región variable y tres o cuatro regiones constantes. La estructura y función de la inmunoglobulina se describe, por ejemplo, en Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Capítulo 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1988) .

La expresión "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción de un anticuerpo intacto y se refiere a las regiones variables de determinación antigénica de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, a modo no taxativo, Fab, Fab' , F(ab')2, Fv y fragmentos de Fv monocatenarios , anticuerpos lineales, anticuerpos monocatenarios y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y se unen a un único antígeno. Adicionalmente, a diferencia de las preparaciones de anticuerpo policlonal que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) , cada anticuerpo - - monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. Que un anticuerpo "se une selectivamente" o "se une específicamente" significa que el anticuerpo hace reacción o se asocia más frecuentemente, más rápidamente, con mayor duración, con mayor afinidad o con alguna combinación de las anteriores con un epítopo que con sustancias alternativas, incluidas proteínas no relacionadas. Por ejemplo, que "se une selectivamente" o "se une específicamente" significa, por ejemplo, que un anticuerpo se une a una proteína con un KD de al menos aproximadamente 0,1 mM, pero más generalmente de al menos aproximadamente 1 µ?. Algunas veces, que "se une selectivamente" o "se une específicamente" significa que un anticuerpo se une a una proteína con un KD de al menos aproximadamente 0,1 µ? o más y otras veces de al menos aproximadamente 0,01 µ? o más. Debido a la identidad secuencial entre proteínas homologas en diferentes especies, la unión específica puede incluir un anticuerpo que reconoce una proteína marcadora de célula tumoral en más de una especie .

Los anticuerpos en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie específica o que pertenecen a un tipo o subtipo específico de anticuerpo, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es idéntico u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otro tipo o subtipo de anticuerpo, así como fragmentos de los anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (Patente de los Estados Unidos N2 4.816.567; y Morrison et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 51:6851-6855 (1984) ) .

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En gran parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los que residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de regiones marco (FR, por sus siglas en inglés) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Adicionalmente, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno y típicamente dos dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para obtener detalles adicionales, ver Jones et al., iVature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Ver también los siguientes artículos y referencias citados en los mismos: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 2:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).

Un "anticuerpo humano" es el que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o se ha producido usando cualquiera de las técnicas para producir anticuerpos humanos tales como se divulgan en la presente. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.

El término "inmunoconjugado" o "conjugado" o "inmunotoxina" tal como se usa en la presente se refiere a un compuesto o un derivado del mismo que se liga a un agente de unión celular (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD22 o fragmento del mismo) y se define mediante una fórmula genérica: C-L-A, en donde C = citotoxina, L = conector y A = agente de unión celular (por ejemplo, anticuerpo anti-CD22 o fragmento de anticuerpo) . Los inmunoconjugados también pueden definirse mediante la fórmula genérica en orden inverso: A-L-C.

El término "citotoxina" o "agente citotóxico" tal como se usa en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de células y/o provoca la destrucción de células. Se pretende que el término incluya isótopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etoposida) , doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucil, daunorrubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de las mismas tal como enzimas nucleolíticas , antibióticos y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluidos fragmentos y/o variantes de las mismas y los diversos agentes antitumorales o anticancerígenos divulgados más adelante. Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, a modo no taxativo, abrina, ricina, exotoxina de Pseudomonas (PE) , toxina diftérica (DT, - - por sus siglas en inglés) , toxina botulínica o toxinas modificadas de las mismas. Por ejemplo, PE y DT son compuestos altamente tóxicos que típicamente provocan la muerte a través de toxicidad hepática. PE y DT, sin embargo, pueden modificarse en una forma para uso como una inmunotoxina eliminando el componente de direccionamiento natural de la toxina (por ejemplo, dominio la de PE o la cadena B de DT) y reemplazándolo por un resto de direccionamiento diferente, tal como un anticuerpo.

En algunas modalidades, la toxina es exotoxina de Pseudomonas. La exotoxina A de Pseudomonas (PE) es una proteína monomérica extremadamente activa (peso molecular 66 kD) , secretada por Pseudomonas aeruginosa, que inhibe la síntesis proteica en células eucarióticas a través de la inactivación del factor de elongación 2 (EF-2) catalizando su ADP-ribosilación (catalizando la transferencia del resto ADP ribosi1 de NAD oxidado a EF-2) .

La toxina contiene tres dominios estructurales que actúan conjuntamente para provocar la citotoxicidad . El dominio la (aminoácidos 1-252) media la unión celular. El dominio II (aminoácidos 253-364) es responsable de la translocación hacia el citosol y el dominio III (aminoácidos 400-613) media la ADP ribosilación del factor de elongación 2, que inactiva la proteína y provoca la muerte celular. La función del dominio Ib (aminoácidos 365-399) permanece sin definir, aunque gran parte del mismo, aminoácidos 365-380, puede eliminarse sin perder la citotoxicidad. Ver Siegall et al., J. Biol. Chem. 264: 14256-14261 (1989).

Las exotoxinas de Pseudomonas (PE) empleadas en la presente invención incluyen la secuencia natural, fragmentos citotóxicos de la secuencia natural y variantes modificadas de forma conservadora de la PE natural y sus fragmentos citotóxicos. Los fragmentos citotóxicos de PE incluyen aquellos que son citotóxicos con o sin procesamiento proteolítico posterior u otro procesamiento en la célula objetivo (por ejemplo, como una proteína o preproteína) . Los fragmentos citotóxicos de PE incluyen PE40, PE38 y PE35. PE40 es un derivado truncado de PE tal como se describió anteriormente en la técnica. Ver, Pai et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, SS:3358-62 (1991); Kondo et al., J. Biol. Chem. 253:9470-9475 (1988) . PE38 es una PE truncada compuesta por los aminoácidos 253-364 y 381-613 de la PE natural. PE35 es un fragmento de 35 kD del extremo carboxílico de PE compuesto por una Met en la posición 280 seguida por los aminoácidos 281-364 y 381-613 de la PE natural. En una modalidad, se emplea el fragmento citotóxico PE38. PE38 es una proproteína que puede activarse en su forma citotóxica tras el procesamiento dentro de una célula.

Un "inmunocon ugado de PE" o "inmunotoxina de PE" es un inmunoconjugado o inmunotoxina que comprende un anticuerpo o - - fragmento de unión a antígeno del mismo y una toxina PE o variante de la misma.

"Purificar" un polipéptido o inmunoconjugado á partir de una composición que comprende el polipéptido y una o más impurezas significa aumentar el grado de pureza del polipéptido en la composición eliminado (completa o parcialmente) al menos una impureza de la composición. De acuerdo con la presente invención, la purificación se lleva a cabo sin el uso de una etapa de cromatografía de afinidad.

El término "cromatografía" se refiere al proceso mediante el cual un soluto de interés en una mezcla se separa de otros solutos en una mezcla como resultado de diferencias en las tasas en que los solutos individuales de la mezcla migran a través de un medio estacionario por la influencia de una fase en movimiento o en procesos de unión y elución.

La expresión "intercambio iónico" y "cromatografía de intercambio iónico" se refieren al proceso cromatográfico en el que un soluto de interés (tal como una proteína) en una mezcla interactúa con un compuesto cargado ligado (por ejemplo mediante un acoplamiento covalente) a un material de intercambio iónico de fase sólida de forma que el soluto de interés interactúa no específicamente con el compuesto cargado más o menos que las impurezas o contaminantes del soluto en la mezcla. Los solutos contaminantes en la mezcla se eluyen de una columna del material de intercambio iónico - - más rápido o más lento que el soluto de interés o se unen a o se excluyen de la resina relativa al soluto de interés. "Cromatografía de intercambio iónico" incluye específicamente intercambio catiónico, intercambio aniónico y cromatografía de modo mixto .

La expresión "material de intercambio iónico" se refiere a una fase sólida que está cargada negativamente (es decir, una resina de intercambio catiónico) o cargada positivamente (es decir, una resina de intercambio aniónico) . La carga puede proporcionarse acoplando uno o más ligandos cargados a la fase sólida, por ejemplo, mediante ligadura covalente. Alternativamente o adicionalmente , la carga puede ser una propiedad inherente de la fase sólida (por ejemplo, como el caso de la sílice, que tiene una carga negativa general) .

Una "resina de intercambio aniónico" se refiere a una fase sólida que está cargada positivamente, teniendo así uno o más ligandos cargados positivamente acoplados a la misma. Se puede utilizar cualquier ligando cargado positivamente acoplado a la fase sólida adecuado para formar la resina de intercambio aniónico, tal como grupos amino cuaternarios. Las resinas de intercambio aniónico disponibles en el mercado incluyen celulosa DEAE, Poros PI 20, PI 50, HQ 10, HQ 20, HQ 50, D 50 de Applied Biosystems, Sartobind Q de Sartorius, MonoQ, MiniQ, Source 15Q y 30Q, Q, DEAE y A X Sepharose Fast Flow, Q Sepharose High Performance, QAE SEPRADEX™ y FAST Q SEPHAROSE™ (GE Healthcare), WP PEI, WP DEAM, WP QUAT de J. T. Baker, Hydrocell DEAE e Hydrocell QA de Biochrora Labs Inc., UNOsphere Q, Macro-Prep DEAE y Macro-Prep High Q de Biorad, Ceramic HyperD Q, HyperD DEAE cerámica, Trisacryl M y LS DEAE, Spherodex LS DEAE, QMA Spherosil LS, QMA Spherosil M y Mustang Q de Pa.ll Technologies, resinas aniónicas de malla fina de base fuerte tipo I y tipo II DO EX y DOWEX MONOSPHER E 77, anión de base débil de Dow Liquid Separations, membrana Intercept Q, Matrex Cellufine A200, A500, Q500 y Q800 de Millipore, Fractogel EMD TMAE, Fractogel EMD' DEAE y Fractogel EMD DMAE de EMD, intercambiadores aniónicos débiles y fuertes Amberlite tipo I y II, intercambiadores aniónicos débiles y fuertes tipo I y II DOWEX, intercambiadores aniónicos débiles y fuertes tipo I y II Diaion, Duolite de Sigma-Aldrich, TSK gel Q y DEAE 5PW y 5PW-HR, Toyopearl SuperQ-650S, 650M y 650C, QAE-550C y 650S, DEAE-650M y 650C de Tosoh, QA52, DE23, DE32, DE51, DE52, DE53, Express-Ion D y Express-Ion Q de Whatman.

"Fase sólida" significa una matriz no acuosa a la cual pueden adherirse uno o más ligandos cargados. La fase sólida puede ser una columna de purificación, una fase discontinua de partículas diferenciadas, una membrana o filtro, etc. Los ejemplos de materiales para formar la fase sólida incluyen polisacáridos (tales como agarosa y celulosa) ; y otras matrices mecánicamente estables tales como sílice (por - - ejemplo, vidrio poroso controlado) , poli (estirenodivinil) benceno, poliacrilamida, partículas cerámicas y derivados de cualquiera de los anteriores .

La expresión "unión específica" tal como se usa en la presente, tal como para describir interacciones entre una molécula de interés y un ligando unido a una matriz de fase sólida, se refiere a la unión generalmente reversible de una proteína de interés con un ligando a través de los efectos combinados de complementariedad espacial de las estructuras de la proteína y el ligando en un sitio de unión acoplado con fuerzas electrostáticas, puentes de hidrógeno, fuerzas hidrófobas y/o fuerzas de van der aals en el sitio de unión. Cuanto mayor es la complementariedad espacial y más fuertes son las otras fuerzas en el sitio de unión, mayor será la especificidad de unión de una proteína con su respectivo ligando. Ejemplos no taxativos de unión específica incluyen unión anticuerpo-antígeno, unión enzima-sustrato, unión enzima-cofactor, quelación de iones metálicos, proteína de unión a ADN-unión a ADN, interacciones de proteína reguladora-proteína y similares.

La expresión "unión no específica", tal como se usa en la presente, por ejemplo para describir interacciones entre una molécula de interés y un ligando u otro compuesto unido a una matriz de fase sólida, se refiere a la unión de una proteína de interés con el ligando o compuesto en una matriz de fase sólida a través de fuerzas electrostáticas, puentes de hidrógeno, fuerzas hidrófobas y/o fuerzas de van der Waals en un sitio de interacción, pero que carecen de la compleraentariedad estructural que potencia los efectos de las fuerzas no estructurales. Ejemplos de interacciones no específicas incluyen, a modo no taxativo, fuerzas electrostáticas, hidrófobas y de van der Waals, así como puentes de hidrógeno.

Una "sal" es un compuesto formado por la interacción de un ácido y una base. Una sal útil para la invención incluye, a modo no taxativo, acetato (por ejemplo, acetato de sodio) , citrato (por ejemplo, citrato de sodio) , cloruro (por ejemplo, cloruro de sodio) , sulfato (por ejemplo, sulfato de sodio) o una sal de potasio.

El término "detergente" se refiere a tensioactivos iónicos y no iónicos tales como polisorbatos (por ejemplo, polisorbatos 20 u 80) ; poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188) ; Tritón; dodecil sulfato de sodio (SDS) ; lauril sulfato de sodio; octilglucósido de sodio; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sulfobetaína; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sarcosina; linoleil-, miristil- o cetil-betaína; lauroamidopropil- , cocamidopropil- , linoleamidopropil- , miristamidopropil- , palmidopropil- o isostearamidopropil-betaína (por ejemplo, lauroamidopropilo) ; miristamidopropil-, palmidopropil- o isostearamidopropil-dimetilamina; sodio metil cocoil- o disodio metil oleoiltaurato; y la serie MONAQUAT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.). Los detergentes útiles son un polisorbato, tal como polisorbato 20 (TWEEN 20*) o polisorbato 80 (T EEN 80¾) .

Una "solución amortiguadora" utilizada en la presente invención es una solución que resiste los cambios en el pH mediante la adición de ácido o base por la acción de sus componentes conjugados ácido-base. Se pueden emplear varias soluciones amortiguadoras en un método de la presente invención dependiendo del pH deseado de la solución amortiguadora y la etapa específica en el proceso de purificación [ver Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975)]. Ejemplos no taxativos de componentes de solución amortiguadora que pueden usarse para controlar el intervalo de pH deseable para un método de la invención incluyen soluciones amortiguadoras de acetato, citrato, histidina, fosfato, amonio tales como acetato de amonio, succinato, MES, CHAPS, MOPS, MOPSO, HEPES , Tris y similares, así como combinaciones de estos TRIS-ácido málico-NaOH, maleato, cloroacetato, formiato, benzoato, propionato, piridina, piperazina, ADA, PIPES, ACES, BES, TES, tricina, bicina, TAPS, etanolamina, CHES, CAPS, metilamina, piperidina, O-ácido bórico, ácido carbónico, ácido láctico, ácido butanodióico, ácido dietilmalónico, glicilglicina, HEPPS, HEPPSO, imidazol, fenol, POPSO, succinato, TAPS, en base a amina, bencilamina, trimetil o dimetil o etil o fenil amina, etilenodiamina o morfolina. Pueden estar presentes componentes adicionales (aditivos) en una solución amortiguadora según sea necesario, por ejemplo, se pueden usar sales para ajustar la fuerza iónica de la solución amortiguadora, tal como cloruro de sodio, sulfato de sodio y cloruro de potasio; y otros aditivos tales como aminoácidos (tales como glicina e histidina) , caotropos (tales como urea), alcoholes (tales como etanol, manitol, glicerol y alcohol bencílico), detergentes (ver supra.) y azúcares (tales como sacarosa, manitol, maltosa, trehalosa, glucosa y fructosa) . Los componentes y aditivos de la solución amortiguadora y las concentraciones utilizadas pueden variar de acuerdo con el tipo de cromatografía utilizada en la invención.

La "solución amortiguadora de carga" es la que se usa para cargar la composición que comprende la molécula polipeptídica de interés y una o más impurezas en la resina de intercambio iónico. La solución amortiguadora de carga tiene una conductividad y/o pH de forma que la molécula polipeptídica de interés (y generalmente una o más impurezas) se une/n a la resina de intercambio iónica o de forma que la proteína de interés fluye a través de la columna mientras que - - las impurezas se unen a la resina.

La expresión "solución amortiguadora de lavado" tal como se usa en la presente se refiere a una solución amortiguadora usada para lavar o reequilibrar la resina de intercambio iónico, antes de eluir la molécula polipéptidica de interés. De forma conveniente, la solución amortiguadora de lavado y la solución amortiguadora de carga pueden ser la misma, pero esto no es necesario.

La "solución amortiguadora de elución" se usa para eluir el polipéptido de interés de la fase sólida. La conductividad y/o el pH de la solución amortiguadora de elución es/son tal/es que el polipéptido de interés se eluye de la resina de intercambio iónico.

El "pl", siglas en inglés para "punto isoeléctrico" de un polipéptido se refiere al pH en el que la carga positiva del polipéptido se equilibra con su carga negativa. El pl puede calcularse a partir de la carga neta de los residuos de aminoácidos o residuos de ácido siálico de los carbohidratos acoplados del polipéptido o puede determinarse mediante enfoque isoeléctrico.

"Unión" de una molécula a un material de intercambio iónico significa exponer la molécula al material de intercambio iónico en las condiciones apropiadas (pH/conductividad) de forma que la molécula se inmovilice de forma reversible en o sobre el material de intercambio iónico - - en virtud de las interacciones iónicas entre la molécula y un grupo cargado o grupos cargados del material de intercambio iónico.

"Lavar" el material de intercambio iónico significa pasar una solución amortiguadora apropiada a través o sobre el material de intercambio iónico.

"Eluir" una molécula (por ejemplo, polipéptido o impureza) de un material de intercambio iónico significa retirar la molécula del mismo alterando la fuerza iónica de la solución amortiguadora que rodea el material de intercambio iónico de forma que la solución amortiguadora compita con la molécula por los sitios cargados en el material de intercambio iónico.

Tal como se usa en la presente divulgación y reivindicaciones, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen las formas plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Se entenderá que cualquiera sean la modalidades que se describen en la presente con el término "comprende", también se proporcionarán otras modalidades análogas descritas con los términos "consiste en" y/o "consiste esencialmente en".

Se pretende que la expresión "y/o" tal como se usa en una frase tal como "A y/o B" en la presente incluya "A y B", "A o B", "A" y "B" . De forma similar, se pretende que la expresión "y/o" tal como se usa en una frase tal como "A, B y/o C" abarque cada una de las siguientes modalidades: A, B y C; A, B O C; A O C; A O B B o C; A y C; A y B; B y C; A (sola) ; B (sola) ; y C (sola) .

Exotoxina de Pseudomonas y otras toxinas Las toxinas pueden emplearse con anticuerpos de la presente invención para proporcionar inmunotoxinas . Las toxinas ejemplares incluyen ricina, abrina, toxina diftérica y subunidades de las mismas, así como las toxinas botulínicas de la A a la F. Estas toxinas se pueden obtener fácilmente en el mercado (por ejemplo, Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.) . La toxina diftérica se aisla de Corynebacterium diphtheriae. La ricina es la lectina RCA60 de Ricinus co munis (haba de ricino) . El término también se refiere a variantes tóxicas de la misma. Por ejemplo, ver las Patentes de los Estados Unidos N- 5.079.163 y 4.689.401. La aglutinina de Ricinus communis (RCA, por sus siglas en inglés) existe en dos formas denominadas RCA60 y RCAi20 de acuerdo con sus pesos moleculares de aproximadamente 65 y 120 kD, respectivamente (Nicholson & Blaustein, J. Biochem. Biophys . Acta 255:543 (1972) ) . La cadena A es responsable de la inactivación de la síntesis proteica y de matar células. La cadena B une la ricina a los residuos de galactosa en la superficie celular y facilita el transporte de la cadena A hacia el citosol (Olsnes, et al., Nature 245:627-631 (1974) y la Patente de los Estados Unidos N- 3.060.165) .

La abrina incluye lectinas tóxicas de Abrus precatorius . Los principios tóxicos, abrina a, b, c y d, tienen un peso molecular de aproximadamente 63 a 67 kD y están compuestos por dos cadenas polipeptídicas A y B ligadas por disulfuro. La cadena A inhibe la síntesis proteica; la cadena B (abrina-b) se une a los residuos de D-galactosa (ver, Funatsu, et al., Agr. Biol . Chem. 52:1095 (1988); y Olsnes, Methods Enzy ol. 50:330-335 (1978)).

En modalidades preferidas de la presente invención, la toxina es exotoxina de Pseudomonas (PE) . La exotoxina de Pseudomonas (o exotoxina A) es una exotoxina producida por Pseudomonas aerugínosa. La expresión "exotoxina de Pseudomonas" tal como se usa en la presente se refiere a una PE de longitud completa natural (de origen natural) o una PE que ha sido modificada. Las modificaciones pueden incluir, a modo no taxativo, la eliminación del dominio la, diversas supresiones de aminoácidos en los dominios Ib, II y III, sustituciones simples de aminoácidos y la adición de una o más secuencias en el extremo carboxílico tales como KDEL (SEQ ID NO:3) y REDL (SEQ ID NO:4). Ver Siegall, et al., J. Biol. Chem. 254:14256-14261 (1989). En una modalidad preferida, el fragmento citotóxico de PE conserva al menos 50%, preferiblemente 75%, más preferiblemente al menos 90% y más preferiblemente 95% de la citotoxicidad de la PE natural. En una modalidad más preferida, el fragmento citotóxico es más tóxico que la PE natural .

La exotoxina A de Pseudomonas natural (PE) es una proteína raonomérica extremadamente activa (peso molecular 66 kD) , secretada por Pseudomonas aeruginosa, que inhibe la síntesis proteica en células eucarióticas . La secuencia de PE natural se proporciona en la Patente de los Estados Unidos N- 5.602.095, de titularidad compartida incorporada a la presente a modo de referencia. El método de acción es la inactivación de la ADP-ribosilación del factor de elongación 2 (EF-2) . La exotoxina contiene tres dominios estructurales que actúan conjuntamente para provocar la citotoxicidad. El dominio la (aminoácidos 1-252) media la unión celular. El dominio II (aminoácidos 253-364) es responsable de la translocación hacia el citosol y el dominio III (aminoácidos 400-613) media la ADP ribosilación del factor de elongación 2. La función del dominio Ib (aminoácidos 365-399) permanece sin definir, aunque gran parte del mismo, aminoácidos 365-380, puede eliminarse sin perder la citotoxicidad. Ver Siegall, et al., (1989), supra.

La PE empleada en la presente invención incluye la secuencia natural, fragmentos citotóxicos de la secuencia natural y variantes modificadas de forma conservadora de la PE natural y sus fragmentos citotóxicos. Las variantes de PE útiles en la invención se describen en US 7.355.012 y WO 2007/016150 y WO 2009/032954. Los fragmentos citotóxicos de - - PE incluyen aquellos que son citotóxicos con o sin procesamiento proteolítico posterior u otro procesamiento en la célula objetivo (por ejemplo, como una proteína o preproteína) . Los fragmentos citotóxicos de PE incluyen PE40, PE38 y PE35.

En modalidades preferidas, la PE ha sido modificada para reducir o eliminar la unión celular no específica, habitualmente mediante la supresión del dominio la tal como se describe en la Patente de los Estados Unidos N2 4.892.827, aunque esto también puede lograrse, por ejemplo, mutando ciertos residuos del dominio la. La Patente de los Estados Unidos N- 5.512.658, por ejemplo, describe que una PE sometida a mutación en la que el Dominio la está presente pero en la que los residuos básicos del dominio la en la posiciones 57, 246, 247 y 249 se reemplazan por residuos ácidos (ácido glutámico o "E")) exhibe una citotoxicidad no específica considerablemente reducida. Esta forma mutante de PE algunas veces se denomina PE4E.

La PE40 es un derivado truncado de PE tal como se describió previamente en la técnica, con una supresión del dominio la de la molécula de PE natural. Ver, Pai, et al., Proc. Nat ' 1 Acad. Sci . USA 55:3358-62 (1991); y Kondo, et al., J. Biol. Chem. 263:9470-9475 (1988). La PE35 es un fragmento de 35 kD del extremo carboxílico de PE en el que los residuos de aminoácidos 1-279 se han suprimido y la molécula comienza con una Met en la posición 280 seguida por los aminoácidos 281-364 y 381-613 de la PE natural. La PE35 y la PE40 se divulgan, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos N= 5.602.095 y 4.892.827. La PE4E es una forma de PE donde todos los dominios de la PE natural están presentes, pero donde los residuos básicos del dominio la en las posiciones 57, 246, 247 y 249 se reemplazan por residuos ácidos (ácido glutámico o "E" ) .

En algunas modalidades preferidas, se emplea el fragmento citotóxico PE38. La PE38 es una proproteína de PE truncada compuesta por los aminoácidos 253-364 y 381-613 que se activa en su forma citotóxica tras el procesamiento dentro de la célula (ver por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos N- 5.608.039, 7.355.012 y Pastan et al., Biochim. Biophys. Acta 1333 C±-C6 (1997)).

Tal como se indicó anteriormente, parte o todo el dominio Ib puede suprimirse y las porciones restantes pueden unirse mediante un conector o directamente mediante un enlace peptídico. Parte de la porción amino del dominio II puede suprimirse. El extremo C terminal puede contener la secuencia natural de los residuos 609-613 (REDLK) (SEQ ID NO: 5) o puede contener una variación que se descubrió que mantiene la capacidad del constructo para translocarse hacia el citosol, tal como REDL (SEQ ID NO: 4) o KDEL (SEQ ID NO: 3) y repeticiones de estas .secuencias. Ver, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos N2 5.854.044; 5.821.238; y 5.602.095 y O 99/51643. Aunque en modalidades preferidas la PE es PE4E, PE40 o PE38, se puede utilizar cualquier forma de PE en la que la citotoxicidad no específica haya sido eliminada o reducida hasta alcanzar niveles en los que no se produce toxicidad considerable en células no objetivo, en las inmunotoxinas de la presente invención siempre que conserven la capacidad de translocación y ribosilación de EF-2 en una célula objetivo.

Variantes de PE modificadas de forma conservadora Las variantes de PE modificadas de forma conservadora o fragmentos citotóxicos de las mismas tienen al menos 80% de similitud secuencial, preferiblemente al menos 85% de similitud secuencial, más preferiblemente al menos 90% de similitud secuencial y más preferiblemente al menos 95% de similitud secuencial a nivel de aminoácidos con la PE de interés, tal como PE38.

La expresión "variantes modificadas de forma conservadora" se aplica a secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico. Con respecto a secuencias de ácido nucleico específicas, las variantes modificadas de forma conservadora se refieren a aquellas secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias de aminoácido idénticas o esencialmente idénticas o si el ácido nucleico no codifica una secuencia de - - aminoácidos, a secuencias de ácido nucleico esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier polipéptido dado. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Por consiguiente, en cada posición donde una alanina se especifica mediante un codón, el codón puede alterarse por cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Las variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de variación modificada de forma conservadora. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente que codifica un polipéptido también describe cada variación silenciosa posible del ácido nucleico. Un experto en la técnica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es habitualmente el único codón para metionina) puede modificarse para proporcionar una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

Con respecto a las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que las sustituciones, supresiones o adiciones individuales a un ácido nucleico, péptido, polipéptido o secuencia proteica que altera, agrega o suprime un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada de forma conservadora" donde la alteración resulta en la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar.

Las exotoxinas de Pseudo onas empleadas en la invención pueden someterse a ensayo para determinar el nivel deseado de citotoxicidad mediante ensayos conocidos por los expertos en la técnica. Por consiguiente, los fragmentos citotóxicos de PE y variantes modificadas de forma conservadora de los fragmentos pueden someterse a ensayo fácilmente para determinar su citotoxicidad. Una gran cantidad de moléculas de PE candidatas pueden someterse a ensayo simultáneamente para determinar su citotoxicidad mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden someter a ensayo subgrupos de las moléculas candidatas para determinar su citotoxicidad. Los subgrupos de moléculas candidatas que reaccionan positivamente pueden subdividirse continuamente y volver a someterse a ensayo hasta identificar el (los) fragmento (s) citotóxico (s) deseado (s). Los métodos permiten un barrido rápido de grandes cantidades de fragmentos citotóxicos o variantes conservadoras de PE.

Inmunoconjugados anti-CD22/PE En una modalidad, el polipéptido de interés comprende un anticuerpo que se une específicamente a CD22. "CD22" se refiere a un antígeno de célula B con linaje restringido que pertenece a la superfamilia Ig. Se expresa en 60-70% de los - - linforaas de células B y leucemias y no está presente en la superficie celular en las etapas iniciales del desarrollo de células B o en las células madre. Ver, por ejemplo, Vaickus et al., Crit. Rev. Oncol/Hematol . 21:267-297 (1991). En otra modalidad, el polipéptido de interés es un fragmento de anticuerpo que se une a CD22 (por ejemplo, Fab o scFv) .

Tal como se usa en la presente, la expresión "anti-CD22" en referencia a un anticuerpo, se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a CD22 e incluye la referencia a un anticuerpo que se genera contra CD22. En algunas modalidades, el CD22 es un CD22 de primate tal como un CD22 humano. En una modalidad, el anticuerpo se genera contra CD22 humano sintetizado por un mamífero no primate después de la introducción en el animal de ADNc que codifica el CD22 humano. En una modalidad adicional, el polipéptido de interés es un inmunoconjugado de anticuerpo de CD22 que comprende la exotoxina PE38.

Un ejemplo de un inmunoconjugado CD22/PE38 es CAT-8015, descrito en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N WO 98/41641 y WO2003/27135 , las Patentes de los Estados Unidos N- 7.541.034 y 7.355.012 y la Publicación de los Estados Unidos N- 2007/0189962, que se incorporan a la presente a modo de referencia. CAT-8015 es una proteína de inmunotoxina recombinante compuesta por un fragmento de anticuerpo Fv en base al anticuerpo anti-CD22 murino RFB4 - - fusionado a una forma truncada de la proteína de exotoxina de Pseudo onas, PE38. El fragmento Fv de anti-CD22 consiste en dos dominios, un VL y un VH, donde el último se modificó para mejorar la unión al CD22 humano objetivo. La proteína CAT-8015 comprende dos polipéptidos independientes, la cadena VL (SEQ ID NO: 2) y la cadena VH, fusionada en el extremo C terminal al dominio PE38 (VH-PE38) (SEQ ID NO:l). Otras secuencias de VL y VH-PE38 útiles en esta invención se describen en US 7.541.034, 7.355.012 y 2007/0189962. Ambos dominios fueron diseñados para contener cada uno residuos de cisteína genomanipulados que permiten la formación de un enlace disulfuro intermolecular. Esta característica aumenta la estabilidad de la proteína de fusión.

La secuencia de aminoácidos de la subunidad VH-P38 (SEQ ID NO:l) de CAT-8015 es la siguiente: MEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMS VRQTPEKCLEWVAYISSGG GTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGQG TLVTVSAKASGGPEGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYL AARLSWNQVDQVIR ALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEA GAA GPADSGDALLER YPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQN TVERLLQAHRQLEERGYVFV GYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGAL LRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWP LAERTWIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK (SEQ ID NO:l) La secuencia PE38 se muestra en negrita y el conector de - - cinco aminoácidos entre el dominio VH y el dominio PE38 se muestra subrayado.

La secuencia de aminoácidos de la subunidad VL (SEQ ID NO: 2) de CAT-8015 es la siguiente: MDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSILH SGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWTFGCGTKLEIK (SEQ ID NO: 2) En modalidades adicionales, la secuencia de aminoácidos del dominio VH del inmunoconjugado es una de las siguientes: MEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKCLEWVAYISSGG GTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGQG TLVTVSA (SEQ ID NO: 6) MEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKCLEWVAYISSGG GTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHSGYGYNWGVLFAYWGQG TLVTVSA (SEQ ID NO: 7) MEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMS VRQTPEKCLE VAYISSGG GTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHSGYGTT GVLFAYWGQG TLVTVSA (SEQ ID NO: 8) MEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKCLE VAYISSGG GTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHSGYGSTYGVLFAY GQG TLVTVSA (SEQ ID NO: 9) MEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKCLEWVAYISSGG GTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHSGYGTHWGVLFAY GQG TLVTVSA (SEQ ID NO: 10) MEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMS VRQTPEKCLEWVAYISSGG GTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHSGYGSSYGVLFAYWGQG TLVTVSA (SEQ ID N0:11) En modalidades adicionales, la secuencia de aminoácidos del dominio VL del inmunoconj ugado es una de las siguientes: MDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIARYL WYQQKPDGTVKLLIYYTSILH SGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWTFGCGTKLEIK (SEQ ID NO: 12) MDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIHGYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSILH SGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWTFGCGTKLEIK (SEQ ID NO:13) MDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIGRYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSILH SGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWTFGCGTKLEI (SEQ ID NO: 14) MDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRGYLN YQQKPDGTVKLLIYYTSILH SGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWTFGCGTKLEIK (SEQ ID NO: 15) En otras modalidades determinadas, la toxina PE del inmunoconjugado es una PE o una variante de la misma seleccionada de las siguientes: PE natural AEEAFDLWNECAKACVLDLKDGVRSSRMSVDPAIADTNGQGVLHYSMVLEGGNDAL KLAIDNALSITSDGLTIRLEGGVEPNKPVRYSYTRQARGSWSLN LVPIGHEKPSNIKVFI HELNAGNQLSHMSPIYTIE GDELLAKLARDATFFVRAHESNEMQPTIAISHAGVS\A7 AQ TQPRREKRWSEWASGKVLCLLDPLDGVYNYLAQQRCNLDDT EGKIYRVLAGNPAKHDLDI KPTVISHRLHFPEGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRG EQLEQCGYPVQRLVALYLA - - ARLS NQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAG AANGPADSGDALLER YPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVG YHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALL RVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPL AERTWIPSAIPTDPR VGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK (SEQ ID NO: 16) PE40 GGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQV DQVIR ALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAA ADWS LTCPVAAGECAGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLE ERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARG RIR GALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRL ETILGWPLAERTWIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK (SEQ ID NO:17) PE38 GGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLS NQV DQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANGPADS GDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQ WTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEA AQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIR GALLRVYVPRSS LPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILG PLAERTWIP SAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK (SEQ ID NO:18) PE35 MWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQ ARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTR GTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAG - - DPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHP LPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTWIPSAIPTDPR VGGDLDPSSIPDKEQAIS ALPDYASQPGKPPREDLK (SEQ ID N0:19) PE-LR RHRQPRGWEQLPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQ TVERLLQAHRQLEERGYVFVGY HGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLR VYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILG PLA ERTWIPSAIPTDPR VGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK (SEQ ID NO:20) PE-LR-6X RHRQPRG EQLPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEEGGYVFVGY HGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWAGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDAAGRIR GALLR VYVPRSSLPGFYATSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEAGGRLETILGWPLA ERTWIPSAIPTDPR VGGDLDPSSIPDSEQAISALPDYASQPGKPPREDLK (SEQ ID NO:21) PE-38 (CAT-8015) PEGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWN QVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANGPA DSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQ WTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFL EAAQSIVFGGVRARSQDLDAI RGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPR SSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILG PLAERTW IPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK (SEQ ID NO:22) La toxina PE del inmunoconjugado se fusiona o conjuga al dominio VH o VL directamente o a través de un conector en el - - extremo N terminal o C terminal del dominio VH o VL. Un ejemplo de un conector se describió anteriormente para CAT-8015 y corresponde a la secuencia de aminoácidos KASGG (SEQ ID NO: 23) . Se pueden generar conectores adicionales fácilmente mediante técnicas conocidas en la técnica.

Expresión de un inmunoconjugado de PE El inmunoconjugado de PE de la presente invención se expresa en células, tales como células bacterianas y luego se aisla de cuerpos de inclusión. A continuación el inmunoconjugado de PE aislado de los cuerpos de inclusión se purifica adicionalmente utilizando etapas de purificación posteriores .

Se puede utilizar una variedad de sistemas de vectores de expresión en huésped para expresar el inmunoconjugado de PE de la presente invención. Los sistemas de expresión en huésped representan vehículos con los que se pueden producir las secuencias codificantes de interés y purificarse posteriormente, pero también representan células que cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, pueden expresar una molécula de anticuerpo de la invención in situ. Estos incluyen, a modo no taxativo, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN bacteriófago, ADN plásmido o ADN cósmido recombinantes que contienen secuencias codificantes de anticuerpo; levadura - - (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias codificantes de anticuerpo; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias codificantes de anticuerpo; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmido recombinantes que contienen secuencias codificantes de anticuerpo; o sistemas de células de mamíferos (por ejemplo, células COS, CHO, BLK, 293, 3T3) que alojan constructos de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de las células de mamíferos (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7,5K del virus de la viruela) .

El ADN que codifica cada uno de los polipéptidos de la toxina PE VL y VH (por ejemplo, VH-PE38) se introduce en un vector de expresión mediante técnicas conocidas en la técnica.

Un "vector" se refiere a cualquier vehículo para la clonación y/o transferencia de un ácido nucleico a una célula huésped. Un vector puede ser un replicón al cual puede acoplarse otro segmento de ADN de forma que se produzca la - - replicación del segmento acoplado. Un "replicón" se refiere a cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, fago, cósmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de replicación de ADN in vivo, es decir, capaz de replicarse bajo su propio control. El término "vector" incluye vehículos para introducir el ácido nucleico en una célula in vitro, ex vivo o in vivo. Un gran cantidad de vectores conocidos en la técnica pueden utilizarse para manipular ácidos nucleicos, incorporar elementos de respuesta y promotores, tales como promotores inducibles, en genes, etc. Los vectores posibles incluyen, por ejemplo, plásmidos como pBR322 o derivados de plásmido pUC o el vector Bluescript. Por ejemplo, la inserción de los fragmentos de ADN que corresponden a elementos de respuesta y promotores en un vector adecuado puede lograrse ligando los fragmentos de ADN apropiados en un vector elegido que tiene extremos terminales cohesivos complementarios. Alternativamente, los extremos de las moléculas de ADN pueden modificarse enzimáticamente o se puede producir cualquier sitio ligando secuencias de nucleótidos (conectores) en los extremos terminales del ADN. Los vectores pueden genomanipularse para contener genes marcadores seleccionables que proporcionan la selección de células. Los marcadores permiten la identificación y/o selección de células huésped que expresan las proteínas codificadas por el marcador.

La expresión "vector de expresión" se refiere a un vector, plásmido o vehículo diseñado para posibilitar la expresión de una secuencia de ácido nucleico insertada luego de la transformación hacia el huésped. El gen clonado, es decir, la secuencia de ácido nucleico insertada, por ejemplo, un gen que codifica una VH de anti-CD22, VL de anti-CD22 o VH o VL de anti-CD22 fusionada con una toxina PE, generalmente se coloca bajo el control de elementos de control tales como un promotor, un promotor mínimo, un potenciador o similares. Las regiones o promotores de control de iniciación, que son útiles para impulsar la expresión de un ácido nucleico en la célula huésped deseada, son numerosos y conocidos para los expertos en la técnica. Prácticamente cualquier promotor capaz de impulsar la expresión de estos genes puede utilizarse en un vector de expresión, incluidos, a modo no taxativo, promotores virales, promotores bacterianos, promotores animales, promotores mamíferos, promotores sintéticos, promotores constitutivos, promotores específicos de tejido, promotores relacionados con patogénesis o enfermedad, promotores específicos de desarrollo, promotores inducibles, promotores regulados por luz; incluidos, a modo no taxativo, la región promotora (SV40) inicial SV40, el promotor contenido en la repetición terminal larga (LTR, por sus siglas en inglés) 3' del virus del sarcoma de Rous (RSV, por sus siglas en inglés) , el E1A o promotor tardío principal - - (MLP, por sus siglas en inglés) de adenovirus (Ad) , el promotor inicial inmediato del citomegalovirus humano (HCMV, por sus siglas en inglés) , el promotor de timidina cinasa (TK, por sus siglas en inglés) del virus del herpes simple (HSV, por sus siglas en inglés) , el promotor IE1 del baculovirus, el promotor del factor de elongación 1 alfa (EF1) , el promotor de gliceraldehído-3- fosfato deshidrogenasa (GAPDH, por sus siglas en inglés) , el promotor de fosfoglicerato cinasa (PGK) , el promotor de ubiquitina C (Ube) , el promotor de albúmina, las secuencias reguladoras del promotor de metalotioneína-L de ratón y regiones de control transcripcional , los promotores ubicuos (HP T, vimentina, ß-actina, tubulina y similares) , los promotores de los filamentos intermedios (desmino, neurofilamentos , queratina, GFAP y similares) , los promotores de genes terapéuticos (de MDR, CFTR o del factor tipo VIII y similares) , promotores relacionados con la patogénesis o enfermedad. Adicionalmente, estas secuencias de expresión pueden modificarse mediante la adición de secuencias potenciadoras o reguladoras y similares.

El término "expresión" se refiere a la producción biológica de un producto codificado por una secuencia codificante. En la mayoría de los casos, una secuencia de ADN, incluida la secuencia codificante, se transcribe para formar un ARN mensajero (ARNm) . El ARN mensajero a - - continuación se traduce para formar un producto polipeptídico que tiene una actividad biológica relevante. Además, el proceso de expresión puede implicar etapas de procesamiento adicionales al producto de transcripción de ARN, tal como empalme para eliminar intrones y/o procesamiento postranslacional de un producto polipeptídico.

Los polipéptidos VL y VH de PE38 se expresan en células, por ejemplo, células bacterianas, tales como E. coli. Los polipéptidos se expresan, por ejemplo, en células E. coli y se aislan de cuerpos de inclusión. En ciertas modalidades, las subunidades VL y VH de PE38 se expresan en células diferentes. Por ejemplo, la VL se expresa en una célula en un primer vector y la VH de PE38 se expresa en una célula diferente en un segundo vector. Los cuerpos de inclusión de cada línea celular se recogen y solubilizan. En ciertas modalidades, los cuerpos de inclusión se solubilizan a un pH en un intervalo de aproximadamente 9,0 a aproximadamente 10,5. En modalidades adicionales, los cuerpos de inclusión se solubilizan a un pH de 9,0, a un pH de 9,5, a un pH de 10,0 o a un pH de 10,5. Los cuerpos de inclusión VL y VH de PE38 solubilizados se combinan para formar un inmunoconjugado que comprende las subunidades VL y VH de PE38.

En otras modalidades, las subunidades VL y VH de PE38 se expresan en la misma célula en diferentes vectores, por ejemplo, la VL se expresa en una célula en un primer vector y - - la VH de PE38 se expresa en la misma célula en un vector diferente. Los cuerpos de inclusión de la célula se recogen, se solubilizan y las subunidades VL y VH de PE38 se combinan para formar un inmunoconjugado . En ciertas modalidades distintas, las subunidades VL y VH de PE38 se expresan en el mismo vector en la misma célula.

Se utilizan etapas de cromatografía posteriores para purificar adicionalmente este inmunoconjugado.

Condiciones de cromatografía Tal como se conoce en la técnica, las condiciones de carga, lavado y elución para uso en la cromatografía de la invención dependerán de los medios/ligandos de cromatografía específicos utilizados. El proceso de la invención, por supuesto, puede utilizarse . en combinación con otras metodologías de purificación proteica, tales como precipitación de sal, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxiapatita, cromatografía líquida de fase inversa o cualquier otra técnica de purificación proteica utilizada habitualmente . Sin embargo, se contempla que el proceso de la presente invención eliminará o reducirá considerablemente la necesidad de etapas de purificación adicionales .

La cromatografía de intercambio aniónico también se lleva a cabo durante La separación cromatográfica del polipéptido de interés. Tal como se conoce en la técnica, los intercambiadores aniónicos pueden basarse en varios materiales con respecto a la matriz así como a los grupos cargados acoplados. Por ejemplo, pueden utilizarse las siguientes matrices, en las que los materiales mencionados pueden estar más o menos reticulados: a base de agarosa (tal como SEPHAROSE Fast Flow®, tal como Q-SEPHAROSE FF, y SEPHAROSE High Performance*) ; a base de celulosa (tal como DEAE SEPHACEL15) ; a base de sílice y a base de polímero sintético o resinas tales como SuperQ-650 (de TOSOH BIOSEP) y Macro High Q (de BIO-RAD) . Para la resina de intercambio aniónico, los grupos cargados que se acoplan covalentemente a la matriz pueden ser, por ejemplo, dietilaminoetilo (DEAE) , aminoetilo cuaternario (QAE, por sus siglas en inglés) y/o amonio cuaternario (Q) . En ciertas modalidades, la resina se selecciona del grupo que incluye, a modo no taxativo, Q Sepharose High Performance, Q Sepharose Fast Flow, DEAE Sepharose Fast Flow, Capto Q, Capto DEAE, Toyopearls SuperQ 650 (M) , Toyopearls SuperQ 650 (S) , Toyopearls DEAE 650 (M) , Toyopearls DEAE 650 (S) , TSKgel SuperQ-5PW (30), TSKgel SuperQ-5PW (20), TSKgel DEAE-5PW (30), TSKgel DEAE-5P (20), EMD Chemicals: Fractogel EMD DEAE (S) , Fractogel EMD DEAE (M) , Fractogel EMD DMAE (S) , Fractogel EMD DMAE (M) , Fractogel EMD TMAE (S) , Fractogel EMD TMAE (M) y Baker Bond XWP500 PolyQuat-35, SPE. En una modalidad del presente proceso, la resina de intercambio aniónico empleada es Q- - - SEPHAROSE FF* .

Aunque se pueden utilizar cualquiera de estas resinas para la purificación de anticuerpos a pequeña escala, las resinas de cierto tamaño y costo más bajo pueden utilizarse en la separación a escala industrial. Si el tamaño de la resina es demasiado pequeño, se genera una contrapresión considerable en el sistema. Adicionalmente, la cantidad de polipéptido que puede purificarse es limitada. Si es costoso producir o comprar la resina, no es económicamente viable/práctica para uso en la purificación a gran escala.

Por consiguiente, la resina utilizada en la presente invención debe ser de un determinado tamaño para proporcionar una producción aumentada a escala eficiente sin ser prohibitivamente costosa. La "purificación a nivel fabril" significa la purificación de anticuerpos a partir de una preparación recombinante en una escala que satisface la producción a escala comercial. La resina utilizada en la etapa de predeterminación debe ser igUal a la usada en el protocolo final para la purificación a nivel fabril debido a que no se puede predecir fácilmente la variación en las condiciones necesarias para separar los agregados si se cambia la resina. Una resina específica que es útil en la purificación a pequeña escala o a escala experimental puede no ser útil para la purificación a gran escala. Las resinas útiles para la presente invención incluyen, por ejemplo, Q- - - SEPHAROSE HP . Sin embargo, el experto en la técnica reconocerá otras resinas de intercambio aniónico útiles para la producción a escala comercial.

El volumen de resina utilizando cuando se rellena una columna de cromatografía de intercambio aniónico se refleja en las dimensiones de la columna, es decir, el diámetro de la columna y la altura de la resina y varía dependiendo de, por ejemplo, la cantidad de anticuerpo en la solución aplicada y la capacidad de unión de la resina utilizada.

Antes de llevar a cabo una cromatografía de intercambio aniónico, la resina de intercambio puede equilibrarse con una solución amortiguadora. Cualquiera de una variedad de soluciones amortiguadoras son adecuadas para el equilibrio de la resina de intercambio," por ejemplo, acetato de sodio, fosfato de sodio, TRIS (hidroximetil) amino-metano, TRIS, fosfato, bis-TRIS y L-histidina. Los expertos en la técnica apreciarán que muchas otras soluciones amortiguadoras pueden utilizarse para lograr el equilibrio siempre que el pH y la conductividad sean aproximadamente los mismos que para la solución de anticuerpo aplicada. Cuando se lleva a cabo el proceso de "unión- lavado" , las soluciones amortiguadoras de equilibrio y las soluciones amortiguadoras de lavado son las mismas. Cuando se lleva a cabo el proceso de "unión-elución", las soluciones amortiguadoras de elución pueden producirse a partir de una o más sustancias amortiguadoras para controlar - - el H. La sal utilizada es, por ejemplo, un sal altamente soluble, tal como cloruro de sodio o fosfato de potasio, pero puede utilizarse cualquier sal que mantenga la funcionalidad del anticuerpo y permita la separación del monómero de anticuerpo de la resina.

Al llevar a cabo el proceso de "unión-elución" , la elución de los monómeros de anticuerpo de la resina puede llevarse a cabo con una solución amortiguadora sustancialmente no desnaturalizante que tenga un pH y una fuerza iónica suficientes para eluir de forma eficaz el anticuerpo monomérico, recuperando así un eluato que contiene el anticuerpo, mientras los agregados quedan unidos a la resina. En este contexto, una elución eficiente significa que al menos 75%, o al menos 80%, o al menos 85%, o al menos 90%, o al menos 95% del anticuerpo cargado en la resina se recupera. Solo aproximadamente 1,0%, preferiblemente solo 0,5%, más preferiblemente menos de 0,1% de agregados permanecen en la preparación de anticuerpo luego del intercambio iónico.

En una modalidad, la elución se lleva a cabo como una elución de gradiente en etapas. En otra modalidad, la elución se lleva a cabo en un gradiente lineal.

De forma sorprendente, las variaciones desamidadas de las proteínas del inmunoconjugado se eluyeron a una concentración de sal más alta a pasar del aparente aumento neto de la carga negativa debido a la desamidación de un residuo de asparagina. Por lo tanto, estas variantes de potencia reducida se separaron de las proteínas más activas mediante la cromatografía de intercambio iónico descrita en la presente.

En ciertas modalidades de la invención, aproximadamente 75% a aproximadamente 99% de la variante acida o desamidada presente dentro de la muestra inicial del polipéptido o inmunoconjugado se elimina durante el proceso de purificación. En otras modalidades, al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de la variante desamidada se elimina. Por consiguiente, la composición que comprende el polipéptido o inmunoconjugado activo tiene menos de entre aproximadamente 25% y aproximadamente 1% de especies desamidadas, por ejemplo, menos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, menos de 10%, menos de 5%, menos de 4%, menos de 3%, menos de 2% o menos de 1%.

Las variantes desamidadas de la invención incluyen inmunoconjugados que comprenden una toxina PE o variante de la misma, en donde la desamidación ocurre en uno o más residuos dentro del inmunoconjugado, por ejemplo, en uno o más residuos dentro de la toxina PE o variante de la misma. En ciertas modalidades, la desamidación ocurre en los residuos 1, 2 3, 4 o 5 dentro del inmunoconjugado . En otras modalidades, un inmunoconjugado que comprende una toxina PE o - - variante de la misma se desamida en los residuos 1, 2, 3, 4 o 5 dentro de la toxina PE o variante de la misma, por ejemplo en la posición 358 de la SEQ ID NO : 1 , en la posición 495 de la SEQ ID NO: 16, en la posición 243 de la SEQ ID NO: 17, en la. posición 227 de la SEQ ID N0:18, en la posición 200 de la SEQ ID NO: 19, en la posición 212 de la SEQ ID NO: 20, en la posición 212 de la SEQ ID NO: 21 o en la posición 229 de la SEQ ID NO: 22.

En una modalidad, la concentración de sal de la solución amortiguadora de elución es suficientemente alta para desplazar los monómeros del anticuerpo de la resina sin desplazar los agregados. Sin embargo, se contempla que se pueden utilizar un aumento en el pH y una concentración de sal más baja para eluir los monómeros de anticuerpo de la resina.

Cualquiera o todas las etapas cromatográficas de la presente invención pueden llevarse a cabo mediante cualquier medio mecánico. La cromatografía puede llevarse a cabo, por ejemplo, en una columna. La columna puede utilizarse con o sin presión y desde arriba hacia abajo o desde abajo hacia arriba. La dirección de flujo del fluido en la columna puede invertirse durante el proceso de cromatografía. La cromatografía también puede llevarse a cabo utilizando un proceso en lotes en el que los medios sólidos se separan del líquido usado para cargar, lavar y eluir la muestra mediante cualquier medio adecuado, incluidas gravedad, centrifugación o filtración. La cromatografía también puede llevarse a cabo poniendo en contacto la muestra con un filtro que absorbe o retiene algunas moléculas en la muestra de forma más fuerte que otras. En la siguiente descripción, las diversas modalidades de la presente invención se describen en el contexto de una cromatografía llevada a cabo en una columna. Se entenderá, sin embargo, que el uso de una columna es meramente una de las diversas modalidades cromatográficas que pueden utilizarse, y la ilustración de la presente invención utilizando una columna no limita la aplicación de la presente invención a la cromatografía en columna, ya que los · expertos en la técnica pueden aplicar fácilmente los principios a otras modalidades, tales como las que utilizan un proceso en lotes o un filtro.

Se puede utilizar una variedad de condiciones de carga, lavado y elución diferentes, según se desee. En algunas modalidades, las condiciones de carga iniciales se adaptan de forma que la proteína (por ejemplo, anticuerpo) eluida de la columna no HT inicial se aplique directamente a la columna HT.

La elución puede lograrse, por ejemplo, cambiando las condiciones de sal en la fase líquida. Por ejemplo, la sal y/o conductividad de la fase líquida se aumenta (linealmente o en etapas) hasta un punto en que el anticuerpo se eluye. - - Las condiciones de lavado ejemplares incluyen, por ejemplo, 10 mM de fosfato, pH 6,7, logrando la elución al aumentar la concentración de sal (de forma lineal o en etapas) (por ejemplo, hasta alcanzar 10 mM de fosfato, NaCl 1,5M, pH 6,7) . Todas las diversas modalidades u opciones descritas en la presente pueden combinarse en todas y cada una de las variaciones .

Antes de aplicar la muestra en la columna, la misma puede equilibrarse en la solución amortiguadora o sal que se usará para cromatografiar la proteína. Tal como se trata más adelante, la cromatografía (y carga de la proteína que va a purificarse) puede ocurrir en una variedad de soluciones amortiguadoras y sales incluidas sales de sodio, potasio, amonio, magnesio, calcio, cloruro, fluoruro, acetato, fosfato y/o citrato y/o la solución amortiguadora de Tris. Las soluciones amortiguadoras y sales de citrato son las preferidas por los expertos en la técnica por su fácil eliminación. Las soluciones amortiguadoras y sales pueden tener un pH de al menos aproximadamente 5,5. En algunas modalidades, el equilibrio puede alcanzarse en una solución que comprende una solución amortiguadora de Tris o de fosfato de sodio. En algunas modalidades, el equilibrio se alcanza a un pH de al menos aproximadamente 5,5. El equilibrio puede alcanzarse a pHs entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 8,6, preferiblemente a pHs entre aproximadamente 6,5 y 7,5. ás preferiblemente, la solución comprende una solución amortiguadora de fosfato de sodio a una concentración de aproximadamente 25 milimolar y a un pH de aproximadamente 6,8.

El proceso de purificación proteica de la presente invención puede aplicarse para la eliminación de una variante ácida de cualquier proteína. Algunas proteínas contempladas específicamente para usar con la invención incluyen anticuerpos o fragmentos de los mismos. Otras proteínas incluyen, a modo no taxativo, proteínas de fusión recombinantes que comprenden uno o más dominios de inmunoglobulina de anticuerpo constantes, opcionalmente una porción Fe de un anticuerpo y una proteína de interés.

Formulaciones Las formulaciones de los polipéptidos o inmunoconjugados purificados se preparan para almacenamiento y uso combinando un polipéptido o inmunoconjugado purificado de la presente invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, portador, excipiente) (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20a Edición ack Publishing, 2000) . Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, a modo no taxativo, soluciones amortiguadoras no tóxicas tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; sales tales como cloruro de sodio antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (por ejemplo, cloruro de - - octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; alquil parabenos, tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (por ejemplo, menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos) ; proteínas tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; carbohidratos tales monosacáridos , disacáridos, glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína) ; y tensioactivos no iónicos tales como TWEEN o polietilenglicol (PEG) .

Las composiciones de anticuerpo y/o inmunoconjugado de la presente invención (es decir, PE ligado a un anticuerpo) , son particularmente útiles para administración parenteral, tal como administración intravenosa o administración en una cavidad corporal o lumen de un órgano. Las composiciones para administración comúnmente comprenderán una solución del anticuerpo y/o inmunoconjugado disuelto en un portador farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un portador acuoso. Se puede usar una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, solución salina amortiguada y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente libres de materia indeseable. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización conocidas convencionales. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares f rmacéuticamente aceptables según sea necesario para aproximar condiciones fisiológicas tales como ajustar el pH y agentes amortiguadores, agentes de ajuste de la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentración de la proteína de fusión en estas formulaciones puede variar ampliamente y se seleccionará principalmente basándose en los volúmenes de fluidos, viscosidades, peso corporal y similares de acuerdo con el modo específico de administración seleccionado y las necesidades del paciente.

Por consiguiente, una composición de inmunoconjugado farmacéutica típica para administración intravenosa será para un tratamiento total de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 50 µ?/kq por día, en particular 20-50 \iq/kq por día con la dosificación administrada preferiblemente de forma continua o repartida en tres veces por día. Los métodos actuales para preparar composiciones administrables son conocidos o evidentes para los expertos en la técnica y se describen en mayor detalle en publicaciones tales como Remington's Pharmaceutical Science, 19a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1995) .

La composición que incluye el inmunoconjugado de la presente invención puede administrarse para tratamientos terapéuticos. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente que padece una enfermedad, en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr, esto se define como una "dosis terapéuticamente efectiva" . Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado de salud general del paciente.

Se pueden suministar administraciones simples o múltiples de las composiciones dependiendo de la dosificación y frecuencia según sea necesario y tolerado por el paciente. En cualquier caso, la composición debe proporcionar una cantidad suficiente de las proteínas de la presente invención para tratar eficazmente al paciente. La dosificación puede administrarse tres veces al día, día por medio o continuamente, día por medio, durante un ciclo de, por ejemplo, 21 días, pero puede aplicarse periódicamente hasta alcanzar un resultado terapéutico o hasta que los efectos secundarios justifiquen la suspensión de la terapia. Generalmente, la dosis debe ser suficiente para tratar o - - mejorar los síntomas o signos de la enfermedad sin producir una toxicidad inaceptable en el paciente. Una cantidad efectiva del compuesto es la que proporciona un alivio subjetivo de un (os) síntoma (s) o una mejora identificable objetivamente tal como la observada por un médico u otro observador calificado.

En una modalidad, el inmunoconjugado se formula como una composición farmacéutica que comprende al menos un excipiente aceptable. Las formulaciones del inmunoconjugado CAT-8015 farmacéuticamente aceptables incluyen de 0,5 mg/mL a 2,5 mg/mL de CAT-8015, generalmente 1,0 mg/mL, 1,1 mg/mL, 1,2 mg/mL, 1,3 mg/mL, 1,4 mg/mL o 1,5 mg/mL en 25 mM de fosfato de sodio, 4% de sacarosa, 8% de glicina, 0,02% de polisorbato 80 (PS80) , pH 7,4. En modalidades adicionales, el fosfato de sodio puede estar en un intervalo de 20 mM a 100 mM, 25 mM a 50 mM o 25 mM a 35 mM; la sacarosa puede estar a 2%, 3%, 4%, 5% o 6%; la glicina pueden estar en el intervalo de 5-10%, generalmente, 5%, 6% o 7%; el polisorbato 80 puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 1%, generalmente 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04% o 0,05%; con un pH en el intervalo de 6,5 a 8,0, generalmente a pH 7,2, 7,3, 7,4, 7,5 o 7,6. También pueden utilizarse otros agentes amortiguadores conocidos por los expertos en la técnica.

En ciertas modalidades de la invención, la formulación está liofilizada. El término " liofilizada" se refiere a - - cualquier composición o formulación que se prepara en forma seca mediante congelamiento rápido y deshidratación, en el estado congelado a vacío alto. "Liofilizar" o "liofilización" se refiere a un proceso de congelamiento y secado de una solución. Las formulaciones o composiciones liofilizadas frecuentemente están listas para usar o se reconstituyen mediante la adición de agua destilada estéril. En ciertas modalidades, la formulación liofilizada de la invención se reconstituye en un vial.

Para administración intravenosa, una formulación de la invención, tal como una formulación líquida o una formulación reconstituida a partir de una formulación liofilizada se coloca en un vial donde el inmunoconj ugado en la formulación está presente en concentraciones como las descritas anteriormente. Esta formulación se extrae del vial y se agrega a una solución en bolsa para administración intravenosa (IV) , donde la bolsa IV contiene de aproximadamente 30 mL a aproximadamente 100 mL de solución, generalmente 50 mL, 60 mL, 70 mL u 80 mL . También puede agregarse una bolsa IV aparte de "solución protectora" al volumen total de la bolsa IV donde la solución protectora contiene polisorbato 80 en una cantidad tal que el polisorbato 80 presente en la solución de la bolsa IV final está en el intervalo de 0,001% a aproximadamente 3% de polisorbato 80, - - generalmente en el intervalo de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,1% y más generalmente a 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04% o 0,05%. La solución protectora puede preformularse en un vial de forma que el polisorbato 80 esté a una concentración de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 5%, y puede estar a 0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5% o 5,0%. La solución protectora evita la adsorción del inmunoconjugado o fármaco (por ejemplo, CAT-8015) en las superficies de contacto de la bolsa IV, evitando o inhibiendo así que el inmunoconj ugado o fármaco se adhiera a la bolsa IV durante la administración y permitiendo que el paciente reciba la dosificación apropiada del inmunoconj ugado o fármaco. La solución en bolsa IV puede administrarse mediante infusión al paciente durante varias duraciones, generalmente de 30 minutos a 1 hora, generalmente 30 minutos .

Entre los diversos usos de los inmunoconjugados y formulaciones de la presente invención se incluye una variedad de enfermedades provocadas por células humanas específicas que pueden eliminarse mediante la acción tóxica de la proteína. Una aplicación de los inmunoconjugados de la invención es el tratamiento de neoplasias de células B o células B malignas que expresan CD22. Las neoplasias de células B ejemplares incluyen leucemia linfocítica crónica de - - células B (B-CLL, por sus siglas en inglés) , leucemia linfocítica aguda pediátrica (pALL, por sus siglas en inglés) , linfoma folicular, linfoma de células B grandes difuso (DLBCL, por sus siglas en inglés) , linfoma no Hodgkin (NHL, por sus siglas en inglés) y leucemia de células pilosas (HCL, por sus siglas en inglés) .

Todos los documentos, patentes, artículos periodísticos y otros materiales mencionados en la presente solicitud se incorporan a la presente a modo de referencia.

Aunque la presente invención se ha descrito completamente junto con diversas modalidades de la misma con referencia a las figuras adjuntos, se entenderá que varios cambios y modificaciones pueden ser evidentes para los expertos en la técnica. Los cambios y modificaciones debe entenderse que forman parte del alcance de la presente invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas, a menos que se aparten del mismo.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Expresión, recuperación y aislamiento de cuerpos de inclusión de CAT-8015 Se llevó a cabo la fermentación de líneas celulares separadas que contienen vectores de expresión de CAT-8015 VL y CAT-8015 VH-PE38. El termentador se cultivó mediante centrifugación continua. El cultivo del fermentador se pasó a través de una centrífuga continua a 2-8 'C a una tasa de 0,5 a - - 0,8 L por minuto y se centrifugó a una velocidad de aproximadamente 15.000 rpm. Después de la centrifugación la pasta de células se congeló a =-70°C.

Luego de este tratamiento, las pastas de células de VH-PE38 y VL se descongelaron durante 12 a 24 horas a 2-8°C. Estas células se lisaron para liberar los cuerpos de inclusión que contenían los productos de VL y VH-PE38. Los cuerpos de inclusión resultantes posteriormente se solubilizaron y se obtuvieron los productos de VH-PE38 y VL.

El producto se concentró hasta aproximadamente 1 mg/mL (determinado mediante ensayo de proteína total Coomassie) utilizando un cartucho de fibra hueco de ultrafiltración de 30 kDa. La fracción retenida a continuación se diafiltró con 5 a 6 volúmenes de 20 mM de Tris, 100 mM de urea pH 7,4 para alcanzar una conductividad de 2,5 a 3,0 mS/cm. Este producto se almacenó hasta 72 horas a 2-8°C.

Ejemplo 2. Purificación a escala analítica de CAT-8015 activo mediante cromatografía de intercambio aniónico con resinas de alto rendimiento.

La expresión de la subunidad VH-P38 resultó en la formación de una variante desamidada de la subunidad. Se descubrió que la desamidación ocurre en la porción PE38 del inmunoconjugado . Las desamidación de la subunidad VH-P38 resultó en una disminución de la potencia de la proteína CAT-8015. De forma sorprendente, las condiciones cromatográficas descritas más adelante fueron adecuadas para eliminar la variante desamidada, proporcionando así la capacidad de eliminar las especies inactivas durante la purificación. Dado que la desamidacion ocurrió en la porción PE38 del constructo de fusión, las condiciones cromatográficas pueden aplicarse para eliminar cualquier variante desamidada de un conjugado de PE.

La CAT-8015 se renaturalizó a partir de los cuerpos de inclusión aislados y posteriormente se purificó mediante un proceso de 4 columnas. La Figura 8 proporciona una visión global de las operaciones en la unidad de renaturalización y purificación.

La Figura 1 muestra el perfil de cromatografía de intercambio iónico (IEC, por sus siglas en) analítica de una muestra de un estándar de referencia de CAT-8015. Tal como se muestra en el perfil, un prepico emerge antes de la elución del pico principal. Las fracciones individuales eluidas de la IEC se someten a ensayo para determinar la actividad biológica de CAT-8015 con respecto a un estándar de referencia utilizando un bioensayo de apoptosis que mide la capacidad de la muestra de prueba para inducir la muerte apoptótica dependiente de la dosis de la línea celular Daudi que expresa el receptor CD22. Una vez unida a CD22 e internalizada, la CAT-8015 induce la apoptosis de las células Daudi a través de la activación de Caspasa 3/7 que puede - - medirse mediante el sistema de ensayo Caspase-GloTM 3/7. La potencia de la muestra de prueba se determina dividiendo el 50% de la concentración efectiva (CE50) del Estándar de referencia entre el CE50 de la muestra de prueba. Los resultados del bioensayo de apoptosis demostraron que la potencia relativa de CAT-8015 se correlaciona con el porcentaje de prepico de CAT-8015 tal como se presenta en el diagrama de la Figura 1. La Figura 2 muestra la correlación entre esta potencia relativa y el porcentaje de prepico.

Se recogieron las fracciones de prepico y pico principal de múltiples análisis de IEC, se agruparon y se sometieron a un mapeo peptídico y a un análisis de cromatografía liquida-espectrometría de masas/espectrometría de masas (LC-MS/MS) . Los resultados se compararon con los obtenidos en los experimentos de mapeo peptídico y LC-MS/MS de la CAT-8015 purificada. Los análisis del fármaco de CAT-8015 purificada revelaron que Asn-358 se desamidó parcialmente en Asp-358 e iso-Asp-358 (Tabla 1) . Se descubrió que la fracción de prepico estaba considerablemente enriquecida con Asp-358 e iso-Asp358 mientras que la fracción de pico principal estaba enriquecida con CAT-8015 intacta (Tabla 1) . Tomados en conjunto, los resultados demuestran que la desamidación en Asn-358 conduce a una pérdida de la potencia relativa en un bioensayo a base de células. El residuo Asp-358 está presente en la porción de toxina PE del inmunoconjugado, indicando así que un inmunoconj ugado que contiene una toxina PE o variante de la misma en la que Asp-358 está presente probablemente sufrirá desamidación y pérdida de potencia o actividad.

Tabla 1 Distribución del aminoácido 358 en el fármaco de CAT- 8015, fracciones de prepico y pico principal basadas en mapeo peptídico y el análisis LC-MS/MS D358 = Asn-358 desamidado; iso-D358 = iso-Asn-358 desamidado; N358 = Asn-358.

La separación de la CAT-8015 desamidada de la CAT-8015 intacta se logró mediante cromatografía de intercambio aniónico con grupos de intercambio iónico fuertes tales como Q (amino cuaternario) acoplados a resinas de diámetro pequeño tales como Source 15 (diámetro de partícula: 15pm; GE Healthcare) y Sepharose High Performance (diámetro de partícula: 34pm; GE Healthcare) . La aplicación de resinas de - - cromatografía de diámetro pequeño en procesos de biofabricación se complica por la generación de contrapresiones considerables en condiciones de operación típicas tales como las definidas por la geometría de la columna, las tasas de flujo y la composición de la solución amortiguadora. En virtud de estas consideraciones y de la necesidad de una etapa de cromatografía de alta resolución se eligió Q Sepharose High Performance para la separación de la CAT-8015 desamidada de la CAT-8015 intacta. Se desarrollaron condiciones de cromatografía que lograron una alta resolución mientras se mantuvo la operatividad en varias escalas de fabricación .

Ejemplo 3. Purificación a escala experimental de CAT- 8015 La columna se preequilibró primero con 5 volúmenes de columna (CV, por sus siglas en inglés) de Solución amortiguadora C (Solución amortiguadora de preequilibrio/desprendimiento : 10 mM de Tris/HCl, pH 8,0, NaCl 1,0M) y posteriormente se equilibró con 5 CV de Solución amortiguadora A (Solución amortiguadora de equilibrio: 10 mM de Tris/HCl, pH 8,0) a una tasa de flujo lineal de 100cm/hr. La resina de cromatografía fue Q Sepharose High Performance (QHP, GE Healthcare) en una columna Millipore Vantage, 2,2cm x 19,5cm, y se pasó por un AKTA Explorer. La reserva de producto de purificación intermedio se preparó para cargarse en la columna de intercambio aniónico de alto rendimiento mediante diafiltración con 10 volúmenes de Solución amortiguadora A utilizando una membrana MWCO de 10 kDa. La reserva de producto de interacción hidrófoba diafiltrado se cargó en la columna QHP a una tasa de flujo lineal de 100cm/hr, posteriormente se procedió a una etapa de reequilibrio de 2 CV con Solución amortiguadora A a la misma tasa de flujo. La CAT-8015 se eluyó con un gradiente lineal de 10 CV de 35% de Solución amortiguadora B (Solución amortiguadora de elución: 10 mM de Tris/HCl, pH 8,0, 500 mM de NaCl) a 55% de Solución amortiguadora B a una tasa de flujo lineal de 100cm/hr. El producto de elución se monitoreó a 280nm. Las fracciones se recogieron y se analizaron para determinar el % de prepico mediante cromatografía de intercambio iónico (IEC, por sus siglas en inglés) analítica. Las fracciones que contenían menos de 25% de prepico se agruparon. La reserva de QHP se analizó para determinar el % de prepico mediante IEC analítica en una columna de intercambio aniónico fuerte. La potencia relativa se midió mediante un bioensayo de apoptosis tal como se describió anteriormente .

A pH 8,0, la CAT-8015 se unió fuertemente a la resina de intercambio aniónico sin detección de proteína en la fracción de flujo continuo mediante absorbancia a A280. Después de una etapa de lavado inicial con 175 mM de NaCl en Tris/HCl, pH - - 8,0, la CAT-8015 se eluyó de la columna con un gradiente de sal lineal de 35% de B (175 mM de NaCl en Tris/HCl, pH 8,0) a 55% de B (275 mM de NaCl en Tris/HCl, pH 8,0). La CAT-8015 se eluyó de la columna entre 39% de B (192 mM de NaCl en Tris/HCl, pH 8,0) y 49% de B (245 mM de NaCl en Tris/HCl, pH 8,0). La Fig. 3 muestra el perfil de cromatografía QHP de CAT-8015.

Las fracciones se analizaron mediante IEC analítica. La Tabla 2 muestra los resultados para las fracciones eluidas entre 44,5% de B (223mM de NaCl) y 47,2% de B (236mM de NaCl) .

Tabla 2 Análisis IEC de fracciones QHP recogidas a El prepico contiene >90% de CAT-8015 desamidada .

La Tabla 2 demuestra que la cromatografía de intercambio - - aniónico operada en un modo de elución de gradiente de sal lineal es capaz de separar la CAT-8015 desamidada de la CAT 8015 intacta de forma eficaz.

De forma sorprendente, la CAT-8015 intacta se eluyó a una concentración de sal más alta a pesar del aparente aumento neto de la carga negativa debido a la desamidación de un residuo de asparagina. Este resultado es consistente con el perfil de cromatografía observado mediante IEC. Las muestras que contenían CAT-8015 se inyectaron en una columna de intercambio aniónico analítica (PL-SAX, Varían) equilibrada a pH 8,0 con un sistema de solución amortiguadora de Tris/HCl y se eluyeron mediante una combinación de etapas de elución en gradiente y en etapas (Fig.l) .

Las fracciones se combinaron de acuerdo con los criterios de agrupamiento de contenido menor a 25% de prepico. La reserva de QHP se analizó para determinar el % de prepico y la potencia relativa mediante SDS-PAGE, IEC analítica y bioensayo de apoptosis. En análisis SDS-PAGE, tal como se muestra en la Fig. 4, demuestra que la reserva de carga de QHP y las muestras de eluato contenían CAT-8015 altamente purificada. Sin embargo, la reserva de carga de QHP no alcanzó la especificación de pureza objetivo mediante IEC y bioactividad. Las mediciones de pureza y potencia para la reserva de carga de QHP en comparación con la reserva de eluato de QHP, tal como se - - presentan en la Tabla 4 a continuación, demuestran que la etapa de cromatografía de intercambio aniónico con QHP resultó en un aumento considerable en la pureza mediante IEC y la potencia relativa de CAT-8015. La reserva de carga de QHP se generó a partir de la Etapa de purificación intermedia II.

Tabla 3 Pureza de CAT-8015 mediante IEC y Bioactividad Posteriormente, la reserva de producto de QHP se diafiltró en la solución amortiguadora de formulación para generar el fármaco de CAT-8015.

Por consiguiente, la fabricación del fármaco de CAT-8015 requiere la separación de la CAT-8015 desamidada de la CAT- 8015 activa. La capacidad de la cromatografía de intercambio aniónico con resinas de alto rendimiento tales como QHP para separar la CAT-8015 desamidada de la CAT-8015 intacta y para aumentar la bioactividad hasta alcanzar la especificaciones objetivo es un prerrequisito para la fabricación exitosa de un fármaco de CAT-8015.

Ejemplo 4. Purificación a gran escala de CAT-8015 La columna primero se preequilibró con 5 CV de Solución amortiguadora C (Solución amortiguadora de preequilibrio/Desprendimiento : 10 mM de Tris/HCl, pH 8,0, 1,0M de NaCl) a una tasa de flujo lineal de 66cm/hr y posteriormente se equilibró con 5 CV de Solución amortiguadora A a una tasa de flujo lineal de 76cm/hr. La resina de cromatografía fue Q Sepharose High Performance (QHP, GE Healthcare) en un lecho de columna BP300, 30cm x 22cm y se pasó por un instrumento K Prime. La reserva de producto de purificación intermedio se preparó para cargarse en la columna de intercambio aniónico de alto rendimiento mediante diafiltración con 10 volúmenes de solución amortiguadora A (Solución amortiguadora de equilibrio: 10 mM de Tris/HCl, pH 8,0) utilizando una membrana MWCO de 10 kDa. La reserva de producto diafiltrado se cargó en la columna QHP a una tasa de flujo lineal de 64 cm/hr, posteriormente se procedió a una etapa de reequilibrio de 2 CV con Solución amortiguadora A a 76cm/hr. La CAT-8015 se eluyó con un gradiente lineal de 10 CV de 35% de Solución amortiguadora B (Solución amortiguadora de elución: 10 mM de Tris/HCl, pH 8,0, 500 mM de NaCl) a 55% de Solución amortiguadora B a una tasa de flujo lineal de 76 cm/hr. El producto de elución se monitoreó a 280nm. Las - - fracciones se recogieron y se analizaron para determinar el % de prepico mediante cromatografía de intercambio iónico (IEC, por sus siglas en inglés) analítica. Las fracciones que contenían menos de 25% de prepico se agruparon. La reserva QHP se analizó para determinar el % de prepico mediante IEC analítica en una columna de intercambio aniónico fuerte. La potencia relativa se midió mediante un bioensayo de apoptosis .

La cromatografía, de intercambio aniónico a gran escala de CAT-8015 con QHP se llevó a cabo tal como se describió anteriormente. La purificación de QHP se llevó a cabo a tasas de flujo reducidas debido a las limitaciones del equipamiento. La CAT-8015 se eluyó de la columna a conductividades entre 22,3mS/cm y 26,4mS/cm. La Figura 5 muestra el perfil de cromatografía con QHP de CAT-8015 purificada de acuerdo con el método descrito anteriormente.

Las fracciones se analizaron mediante IEC analítica. La Tabla 4 muestra los resultados para las fracciones eluidas a conductividades entre 23,8 y 25,4mS/cm. La Tabla 4 demuestra que la cromatografía de intercambio aniónico operada en un modo de elución de gradiente de sal lineal fue capaz de separar la CAT-8015 desamidada de la CAT 8015 intacta. La separación de la CAT-8015 desamidada de la CAT-8015 intacta se llevó a cabo dentro de un intervalo de conductividad de menos de 2mS/cm.

- - Tabla 4 Análisis IEC de fracciones recogidas para determinar el % de pureza de prepico Las fracciones 4-7 se combinaron de acuerdo con los criterios de agrupamiento de contenido menor a 25% de prepico. La reserva de QHP se analizó para determinar el % de prepico y la potencia relativa mediante SDS-PAGE y SEC, IEC analítica y bioensayo de apoptosis. En análisis SDS-PAGE, tal como se muestra en la Fig. 6, demuestra que la reserva de carga de QHP y las muestras de eluato contenían CAT-8015 altamente purificada. Sin embargo, la reserva de carga de QHP no alcanzó la especificación de pureza objetivo mediante SEC, IEC y potencia relativa. Las mediciones de pureza y potencia para la reserva de carga de QHP en comparación con la reserva de eluato de QHP, tal como se presentan en las Tablas 5 y 6 a - - continuación, demuestran que la etapa de cromatografía de intercambio aniónico con QHP resultó en un aumento considerable en la pureza mediante SEC, IEC y la potencia relativa de CAT-8015. La reserva de carga de QHP se generó a partir de la Etapa de purificación intermedia II.

Tabla 5 Pureza de CAT-8015 mediante SEC - - Tabla 6 Pureza de CAT-8015 mediante IEC y Bioactividad Posteriormente, la reserva de producto de QHP se diafiltró en la solución amortiguadora de formulación para generar el fármaco de CAT-8015.

Los Ejemplos 2-4 demuestran la capacidad de la cromatografía de intercambio aniónico con resinas tales como Q Sepharose High Performance para separar la CAT- 8015 desamidada de la CAT-8015 intacta y para aumentar su potencia relativa para cumplir con las especificaciones objetivo (ver las Tablas 3 y 5) . La CAT-8015 desamidada difiere de la CAT-8015 intacta en una carga negativa adicional. A diferencia del comportamiento de elución esperado en una columna de intercambio aniónico, el volumen de CAT-8015 desamidada eluye antes que la CAT- 8015 intacta en condiciones de elución con gradiente de sal (ver Tablas 2 y 4) . Este patrón de elución inesperado se observó en la cromatografía de intercambio aniónico a escala analítica, escala experimental y a gran escala. Este patrón de elución fue inesperado ya que se esperaría que la solución amortiguadora de elución con elevado - - contenido de sal lineal resultase en una carga negativa más alta de la variante. Por consiguiente, los Ejemplos 2-4 demuestran que usando una solución amortiguadora de elución lineal se pueden eliminar especies desamidadas de un inmunoconjugado activo usando cromatografía de intercambio aniónico. La separación de la CAT-8015 desamidada de la CAT-8015 intacta se llevó a cabo dentro de un intervalo específico de conductividades, recalcando la necesidad de resinas de intercambio aniónico de alta resolución, control cuidadoso de las condiciones de elución y evaluación de fracciones recogidas durante el proceso .

Ejemplo 5. Modificación de la bioactividad de formulaciones de CAT-8015 La potencia de las composiciones de CAT-8015 se calibró mezclando cantidades específicas del prepico desamidado con el pico principal activo. Para obtener composiciones que comprenden una potencia específica de CAT-8015, se combinaron alícuotas de producto de prepico de CAT-8015 con alícuotas de producto de pico principal de CAT-8015 para lograr una composición con una potencia específica de CAT-8015. Al controlar el nivel de potencia de CAT-8015 en la composición, se generó una formulación de CAT-8015 para la administración de un volumen específico de CAT-8015 reconstituida a una dosis deseada.

Ejemplo 6. Resultados del ajuste del pH durante la solubilización en especies con desamidación reducida tal como se midieron después de las etapas de captura y purificación intermedia Si bien las especies desamidadas pueden eliminarse de los inmunoconjugados activos usando las etapas de purificación descritas anteriormente, los niveles de especies desamidadas de CAT-8015 también pueden reducirse eficazmente ajustando el pH en las etapas iniciales del proceso de purificación (es decir, la etapa de repliegue (Etapa 4 de la Tabla 1 anterior) . El procedimiento de repliegue utilizado para lograr un nivel más bajo de especies desamidadas de CAT-8015 incluye las siguientes subetapas: Subetapa de repliegue 1: Solubilización, clarificación y concentración: Los cuerpos de inclusión de VH-PE38 y VL se descongelaron durante 12-24 horas a temperatura ambiente (15-30°C) . Los cuerpos de inclusión de VH-PE38 y VL se combinaron en una relación molar de 1:1 y se ajustaron hasta alcanzar 15% (p/v) de sólidos agregando 50 mM de Tris, 20 mM de EDTA, pH 7,4. Los cuerpos de inclusión se solubilizaron agregando 5 kg de solución amortiguadora de solubilización de cuerpos de inclusión (50 mM de etanolamina, urea 8 M, arginina 0,5 M, 2 mM de EDTA, 10 mM de DTE) por cada kg de suspensión de cuerpos de inclusión sólidos 15% (p/v) . El pH de la solución amortiguadora de solubilización de cuerpos de inclusión varió - - entre H 9,0 y 10,5 en incrementos de 0,5 unidades de pH. La solubilización se llevó a cabo durante 2 horas a temperatura ambiente (15-30°C) con agitación constante. Los cuerpos de inclusión solubilizados se clarificaron mediante filtración de profundidad a través de una serie de filtros. El filtrado clarificado se concentró mediante filtración de flujo tangencial hasta alcanzar 5-6 g/L utilizando una membrana de ultrafiltración de corte de peso molecular ( WCO) de 5 kDa.

Subetapa de repliegue 2: Repliegue: El repliegue de CAT-8015 se inició mediante una dilución de 10 veces del filtrado de cuerpos de inclusión clarificado y concentrado en una solución amortiguadora de repliegue (50 mM de etanolamina, arginina 1 M, 2 mM de EDTA, 0,91 mM de glutatión oxidado, pH 9,5) preénfriada (2-8°C) . La solución de repliegue se mantuvo a 2-8°C durante 48-72 horas con mezcla continua. El repliegue se finalizó llevando la solución de repliegue a temperatura ambiente (15-30°C) antes de la concentración y diafiltración. La solución de repliegue se concentró mediante filtración de flujo tangencial con una membrana MWCO de 10 kDa y se diafiltró con 10 volúmenes de 20 mM de fosfato de potasio, pH 7,4. La solución de repliegue concentrada y diafiltrada se filtró a través de un filtro de 0,2 pm (carga de TMAE) .

Como parte de la etapa de captura (Etapa 5 de la Tabla 1 anterior) , la preparación de CAT-8015 obtenida a partir del procedimiento de repliegue anterior se cargó en una columna - - Fractogel TMAE (EMD Biosciences o equivalente) equilibrada con 20 mM de fosfato de potasio, pH 7.4. Después de la carga, la columna primero se lavó con 20 mM de fosfato de potasio, pH 7,4 y luego con 20 mM de fosfato de potasio, 0,1% (p/p) Tritón X 100, pH 7,4, seguida de un lavado posterior con 20 mM de fosfato de potasio, 100 mM de cloruro de sodio, pH 7,4. El producto se eluyó de la columna en flujo inverso con 20 mM de fosfato de potasio, 200 mM de cloruro de sodio, pH 7 , 4. La columna se desprendió con cloruro de sodio 2 M, se limpió con hidróxido de sodio 1 N y se almacenó en hidróxido de sodio 0 , 1 N a temperatura ambiente .

Como parte de la etapa de purificación intermedia 1, se llevó a cabo una cromatografía de hidroxiapatita. La etapa de cromatografía de hidroxiapatita se ejecutó como una etapa de cromatografía de flujo continuo. El producto obtenido a partir de la etapa de captura anterior se cargó directamente sin ningún ajuste adicional en una columna de hidroxiapatita cerámica (Bio-Rad Laboratories o equivalente) equilibrada con 400 mM de fosfato de potasio, 200 mM de cloruro de sodio, pH 7.4, y posteriormente con 20 mM de fosfato de potasio, 200 mM de cloruro de sodio, pH 7.4. En las condiciones de la cromatografía, el producto se recogió en la fracción de flujo continuo (producto HA) . La columna se desprendió con 400 mM de fosfato de potasio, 200 mM de cloruro de sodio, pH 7.4 , se limpió con hidróxido de sodio 1 N y se almacenó en hidróxido de sodio 0,1 N a temperatura ambiente.

El porcentaje de prepico en el producto de HA de arriba se analizó mediante cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento. La Tabla 7 y la Figura 7 muestran el porcentaje de prepico en el producto de HA como una función del pH de solubilización. Tal como se muestra en la Tabla 7 y la Figura 7, la solubilización de los cuerpos de inclusión de VH-PE38 y VL a un pH más bajo conduce a menos producto de CAT-8015 desamidado. La capacidad de controlar la desamidación de CAT-8015 en una etapa inicial en el proceso de renaturalización y purificación puede aumentar el rendimiento general del proceso mientras se mantiene la calidad del fármaco purificado final.

Tabla 7 Porcentaje de prepico en el producto de HA en función del pH de solubilización Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (54)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para purificar un inmunoconjugado activo, caracterizado porque el inmunoconjugado está desamidado en uno o más residuos, y en donde la desamidación resulta en una inhibición de la potencia de el inmunoconjugado, comprendiendo el método: (a) poner en contacto el inmunoconjugado con una matriz de cromatografía de intercambio aniónico AIEX; y (b) eluir el inmunoconjugado unido de la matriz de cromatografía AIEX con una solución amortiguadora con elevado contenido de sal, separando así el inmunocon ugado activo de la variante desamidada.

2. Un método para producir un polipéptido purificado a partir de una solución caracterizado porque comprende el polipéptido y una variante acida del polipéptido, donde la variante ácida del polipéptido resulta en una inhibición de la potencia del polipéptido, comprendiendo el método: (a) poner en contacto el polipéptido con una matriz de cromatografía de intercambio aniónico (AIEX, por sus siglas en inglés) ; y (b) eluir el polipéptido unido de la matriz de cromatografía AIEX con una solución amortiguadora con elevado contenido de sal, separando así el polipéptido de la variante ácida y produciendo un polipéptido purificado.

3. Un método para producir un polipéptido o inmunoconjugado purificado a partir de una solución caracterizado porque comprende el polipéptido y una variante acida del polipéptido, comprendiendo el método: (a) producir el polipéptido o inmunoconjugado en una célula bacteriana que expresa el polipéptido o inmunoconjugado; (b) aislar cuerpos de inclusión que contienen el polipéptido o inmunoconjugado de las células bacterianas; (c) replegar el polipéptido o inmunoconjugado aislado de los cuerpos de inclusión; (c) poner en contacto la composición que contiene el polipéptido o inmunoconjugado con una matriz de cromatografía AIEX; y (b) eluir el polipéptido o inmunoconjugado unido de la matriz de cromatografía AIEX con una solución amortiguadora con elevado contenido de sal, purificando así el polipéptido o inmunocon ugado de la solución.

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la matriz AIEX contiene grupos de intercambio iónico de amina cuaternaria y amina terciaria.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la matriz AIEX contiene un grupo amino cuaternario (Q) .

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la matriz AIEX es Q Sepharose.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el polipéptido se eluye con un gradiente de sal lineal o en etapas.

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el polipéptido se eluye con un gradiente de sal lineal.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el gradiente de sal lineal es de aproximadamente 150 mM de NaCl en Tris/HCl, pH 8,0 a aproximadamente 300 mM de NaCl en Tris/HCl, pH 8,0.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el gradiente de sal lineal es de aproximadamente 175 mM de NaCl en Tris/HCl, pH 8,0 a aproximadamente 275 mM de NaCl en Tris/HCl, pH 8,0.

11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el gradiente de sal lineal es de aproximadamente 192 mM de NaCl en Tris/HCl, pH 8,0 a aproximadamente 245 mM de NaCl en Tris/HCl, pH 8,0.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11/ caracterizado porque entre aproximadamente 75 a aproximadamente 99% de la variante ácida o desamidada se elimina.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque aproximadamente 80% de la variante ácida o desamidada se elimina.

14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque aproximadamente 85% de la variante acida o desamidada se elimina.

15. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque aproximadamente 90% de la variante ácida o desamidada se elimina.

16. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque aproximadamente 95% de la variante ácida o desamidada se elimina.

17. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque aproximadamente 96%, 97%, 98% o 99% de la variante ácida o desamidada se elimina.

18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizado porque el polipéptido o inmunoconjugado comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un Fab, un Fab1, un F(ab')2, un Fd, un Fv o scFv monocatenario, un Fv enlazado por disulfuro, un dominio V-NAR, un IgNar, un intracuerpo, un IgGACH2, un minicuerpo, un F(ab')3, un tetracuerpo, un triacuerpo, un diacuerpo, un anticuerpo de dominio simple, DVD-Ig, Fcab, mAb2, un (scFv)2 o un scFv-Fc.

20. El método de conformidad con la reivindicación 18 o 19, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une a un receptor de superficie celular.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el receptor de superficie celular es CD22.

22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21, caracterizado porque el polipéptido o inmunoconjugado comprende una toxina.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la toxina se selecciona del grupo que consiste en: exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina, toxina diftérica y subunidades de las mismas, así como las toxinas botulínicas de la A a la F o variantes o derivados de las mismas .

24. El método de conformidad con la reivindicación 22 o 23, caracterizado porque la toxina es una exotoxina de Pseudomonas o una variante de la misma.

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la exotoxina de Pseudomonas o variante de la misma tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs : 16-22.

26. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la exotoxina de Pseudomonas o variante de la misma tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22.

27. El método de conformidad con la reivindicación 18 o 19, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia VH y una VL.

28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la secuencia VH se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 6-11.

29. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la secuencia VL se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NOs : 2 y 12-15.

30. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-29, caracterizado porque el polipéptido o inmunoconjugado comprende un anticuerpo anti-CD22 o fragmento de unión a antígeno del mismo y una PE o variante de la misma.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el inmunoconjugado es la inmunotoxina CAT-8015 que. comprende la subunidad VH-PE38 de la SEQ ID NO:l y la subunidad VL de la SEQ ID NO: 2.

32. Una composición que comprende un inmunoconjugado purificado caracterizada porque tiene menos de entre aproximadamente 25% y aproximadamente 1% de especies desamidadas, en donde el inmunocon ugado se purifica mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-31.

33. La composición de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque menos de aproximadamente 25% de la especie desamidada está presente.

34. La composición de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque menos de aproximadamente 20% de la especie desamidada está presente.

35. La composición de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque menos de aproximadamente 10% de la especie desamidada está presente.

36. La composición de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque menos de aproximadamente 5% de la especie desamidada está presente.

37. La composición de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque menos de aproximadamente 3% de la especie desamidada está presente.

38. La composición de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque menos de aproximadamente 2% de la especie desamidada está presente.

39. La composición de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque menos de aproximadamente 1% de la especie desamidada está presente.

40. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el inmunoconjugado purificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32-39, y un portador farmacéuticamente aceptable.

41. Una composición caracterizada porque comprende un inmunoconjugado purificado que tiene menos de entre aproximadamente 20% y aproximadamente 1% de especies desamidadas, en donde el inmunoconjugado comprende un anticuerpo anti-CD22 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y una toxina PE o variante de la misma.

42. La composición de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque el inmunoconj ugado comprende la subunidad VH-PE38 de la SEQ ID NO:l y la subunidad VL de la SEQ ID NO: 2.

43. La composición de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque el inmunoconjugado purificado tiene menos de 20% de especies desamidadas.

44. Una forma de dosificación unitaria de un inmunoconjugado purificado en el intervalo de 0,1 mg a 6 mg, caracterizada porque el inmunoconj ugado comprende un anticuerpo anti-CD22 o fragmento de unión a antígeno del mismo y una toxina PE o variante de la misma.

45. La forma de dosificación unitaria de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada porque el inmunoconjugado comprende la subunidad VH-PE38 de la SEQ ID NO:l y la subunidad VL de la SEQ ID NO: 2.

46. Una formulación que comprende la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32-43, y al menos un excipiente seleccionado del grupo caracterizada porque consiste en cloruro de sodio, dihidrógeno fosfato de potasio, hidrógeno fosfato de disodio e hidróxido de sodio y agua .

47. Una formulación que comprende la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32-43, caracterizada porque comprende 1 mg/mL de CAT-8015 en 25 mM de fosfato de sodio, 4% de sacarosa, 8% de glicina, 0,02% de polisorbato 80 (PS80) , pH 7,4.

48. La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 43, caracterizada porque adicionalmente se liofiliza.

49. Un método para modificar la bioactividad de una solución polipeptídica que comprende un polipéptido y una variante desamidada, caracterizado porque comprende separar el polipéptido de la variante desamidada mediante cromatografía AIEX de elución lineal y combinar el polipéptido purificado y la variante desamidada en cantidades fijas para obtener la bioactividad deseada de la solución polipeptídica .

50. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-27, caracterizado porque los uno o más residuos desamidados están presentes dentro de la exotoxina de Pseudomonas o variante de la misma.

51. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el inmunoconjugado es codificado por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:l y es desamidado en la posición 358 de la SEQ ID N0:1.

52. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el repliegue del polipéptido o inmunoconjugado aislado de los cuerpos de inclusión comprende la solubilización de los cuerpos de inclusión a un pH en un intervalo de aproximadamente pH 9,0 a aproximadamente pH 10, 5.

53. El método de conformidad con la reivindicación 3 o 52, caracterizado porque el repliegue del polipéptido o inmunoconjugado aislado de los cuerpos de inclusión comprende la solubilización de los cuerpos de inclusión a un pH de 10,5, a un pH de 10,0, a un pH de 9,5 o a un pH de 9,0.

54. El método de conformidad con las reivindicaciones 2 o 3, caracterizado porque la variante de ácido es una variante desamidada.