MX2012009768A - Metodos y composiciones para aumentar la supervivencia del injerto de grasa. - Google Patents

Abstract

Se divulga un método para aumentar la supervivencia de la célula grasa en un sujeto en necesidad del mismo. El método que comprende (a) implantar una población de células grasas en el sujeto; y (b) administrar Eritropoyetina al sujeto, para de esta manera aumentar la supervivencia de la célula grasa en el sujeto.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA AUMENTAR LA SUPERVIVENCIA DEL INJERTO DE GRASA CAMPO Y ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención, en algunas modalidades de la misma, se relaciona a tejido graso y, más particularmente, pero no exclusivamente, a métodos para mejorar el injerto del mismo.

Durante la angiogénesis, las células endoteliales cambian su fenotipo a un fenotipo angiogénico que incluye la producción de proteasas, tales como metaloproteinasas de matriz (MMPs) y la habilidad para migrar y proliferar. Este proceso es dependiente de la actividad de varios factores de crecimiento, tal como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF) y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)-BB.

La Eritropoyetina (EPO) , una hormona de glucoproteina que estimula la eritropoyesis, se ha reportado que posee actividad angiogénica. Ribatti y colaboradores demostraron que la EPO pueden inducir un fenotipo pro-angiogénico en células endoteliales cultivadas y estimular la angiogénesis in vivo [Ribatti y colaboradores, (2003) Eur J Clin Invest 33:891-896]. La EPO también se ha mostrado que estimula indirectamente la angiogénesis en el tejido isquémico al incrementar la expresión de la proteina VEGF y al reclutar células progenitoras endoteliales [Nakano y colaboradores, (2007) Circ Res 100:662-669; Aicher y colaboradores, (2005) Hypertension 45:321-325]. En ratas, la administración de EPO también se han mostrado que moviliza las células progenitoras derivadas de medula ósea [Hamed y colaboradores, (2006) Eur Heart J 27:1876-83] y que incrementa la expresión miocardiaca de VEGF [Westenbrink y colaboradores, (2007) Eur Heart J 28:2018-2027]. Wang y colaboradores demostraron que EPO pueden promover la angiogénesis al estimular la secreción de VEGF de las células progenitoras neutrales y la expresión del receptor de VEGF en células endoteliales cerebrales [Wang y colaboradores, (2008) J Cereb Blood Flow Metab 28:1361-8]. De manera colectiva, estos resultados sugieren que la EPO es un factor angiogénico que actúa indirectamente cuyas acciones son mediadas al estimular la secreción de factores angiogénicos .

La EPO también se ha reportado que posee otros efectos no hematopoyéticos, incluyendo la citoprotección de células endoteliales vasculares [Chong y colaboradores, (2003) Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord 3:141-154] y una acción anti-apoptótica en células del músculo liso vasculares y en células endoteliales [Somervaille y colaboradores, (2001) Blood 98:1374-1381]. Estas acciones anti-apoptóticas incluyen la prevención de la liberación mitocóndrica del citocromo c, supresión de la actividad de caspasa, regulación hacia arriba de la actividad de la ruta de señalización de proteina quinasa B (PKB) y la expresión de la proteina antiapoptotica Bcl-xl.

El trasplante de grasa autólogo es una técnica común e ideal para el acrecentamiento de tejido blando y para rellenar defectos de tejido blando debido al trauma o envejecimiento. La evidencia emergente sugiere que la vascularización temprana y adecuada del injerto de grasa es esencial para su captación y viabilidad. Sin embargo, la velocidad de resorción relativamente alta del injerto de grasa, debido a la muerte de células grasas incrementada después del trasplante, reduce la eficacia de esta técnica [Nishimura y colaboradores, (2000) Laryngoscope 110:1333-1338] . Aunque los factores angiogénicos [Rophael y colaboradores, (2007) Am J Pathol 171:2048-2057; Kuramochi y colaboradores, (2008) Eur J Clin Invest 38:752-759], asi como la terapia de gen VEGF [Lei y colaboradores, (2008) Chin J Traumatol 11:49-53; Lu y colaboradores, (2009) Plast Reconstr Surg 124:1437-1446; Yi y colaboradores, (2007) J Plast Reconstr Aesthet Surg 60:272-278] se han utilizado individualmente para estimular la angiogénesis en injertos de grasa con el fin de aumentar la supervivencia y viabilidad de las célula grasa, el efecto clínico ha sido frustrante [Henry y colaboradores, (2003) Circulation 107:1359-1365]. Por lo tanto, la reducción de la velocidad de resorción de la grasa trasplantada es un reto clínico.

Varios procedimientos para mejorar el injerto se han intentado, algunos se resumen enseguida.

La Publicación de PCT No. 2005/018549 divulga métodos y composiciones para reparación de tejido (por ejemplo hueso, cartílago) . De acuerdo con sus enseñanzas, un injerto de tejido (por ejemplo tejido graso, tejido muscular) se pone en contacto ex vivo con uno o más agentes bioactivos (por ejemplo eritropoyetina) para de esta manera estimular por lo menos una porción de las células en el tejido para diferenciarse en células de un tipo deseado (por ejemplo células óseas) y luego el tejido se implanta en un sujeto.

La Patente Norteamericana No. 7459152 divulga la administración de eritropoyetina para la supervivencia de injerto mejorada. De acuerdo con sus enseñanzas, las células de un injerto de tejido (por ejemplo células de un origen neural o paraneural, tales como células de cromafina adrenal) se tratan con eritropoyetina antes, durante o después del suministro o administración en un sujeto para el tratamiento de enfermedades neurológicas (por ejemplo enfermedad de Párkinson, enfermedad de Alzheimer, lesión de la médula espinal) .

La Patente Norteamericana No. 5,681,561 divulga métodos y composiciones para mejorar el injerto de grasa autólogo. De acuerdo con las enseñanzas de la Patente Norteamericana No. 5,681,561, células grasas autólogas (por ejemplo lipocitos) se inyectan en un paciente junto con una hormona anabólica no esteroidal (por ejemplo, insulina o triyodotironina/tiroxina o ambas) . Las células grasas autólogas además se pueden inyectar en un sujeto con una hormona de crecimiento [por ejemplo factor de crecimiento epitelial (EGF) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ] . Además, las hormonas se combinan con un medio de nutrientes .

La Publicación de PCT No. 2008/019434 divulga el uso de agentes para aumentar la adipogénesis y para mejorar la supervivencia del injerto de grasa. De acuerdo con sus enseñanzas, factores de crecimiento [por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y/o factor de crecimiento de fibroblasto (FGF) ] se suministran mediante la administración local o sostenida para aumentar la angiogénesis en asociación con la adipogénesis y para promover la supervivencia del injerto de grasa.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención, se proporciona un método para aumentar la supervivencia de la célula grasa en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende (a) implantar una población de células grasas en el sujeto; y (b) administrar Eritropoyetina al sujeto, para de esta manera aumentar la supervivencia de la célula grasa en el sujeto.

De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención, se proporciona un método para aumentar la supervivencia de la célula grasa en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende: (a) poner en contacto una población de células grasas con Eritropoyetina; y (b) implantar la población de células grasas en el sujeto, para de esta manera aumentar la supervivencia de la célula grasa en el sujeto.

De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención, se proporciona un uso de Eritropoyetina para la manufactura de un medicamento identificado para tratar un defecto de tejido blando.

De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención, se proporciona un uso de Eritropoyetina para aumentar la supervivencia de la célula grasa .

De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una población de células grasas y Eritropoyetina .

De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el método además comprende poner en contacto las células grasas con Eritropoyetina antes del implante.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el sujeto se trata con Eritropoyetina antes del implante de las células grasas.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el método además comprende administrar Eritropoyetina al sujeto después del implante.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la administración se efectúa después del implante.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la administración se efectúa mediante la inyección directa de Eritropoyetina en la población de células grasas.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la dosis de Eritropoyetina es aproximadamente 1-1000 IU por inyección por 1,000,000 de células grasas.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la administración de la Eritropoyetina se efectúa mediante una ruta sistémica.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la dosis de Eritropoyetina es aproximadamente 10-7500 IU por kg de peso corporal.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la administración se efectúa por lo menos dos veces.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el método comprende administrar al sujeto por lo menos un factor seleccionado del grupo que consiste de un componente de matriz extracelular , un factor de crecimiento, una hormona, un factor angiogénico, un factor de coagulación, una citoquina, una quimioquina, una enzima, un neurotransmisor, una vitamina, un carbohidrato, un ión, un agente quelante de hierro, un ácido graso, un antibiótico y un aminoácido.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el defecto de tejido blando se selecciona del grupo que consiste de una condición de la piel, un trastorno de la piel, una herida, una quemadura, un cáncer, una cirugía, una cirugía de reconstrucción, una depresión de la piel, una malformación congénita y una enfermedad adquirida.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la célula grasa comprende una célula antologa.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la célula grasa comprende una célula no autóloga.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la célula no autóloga es una célula alogenéica.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la célula no autóloga es una célula xenogenéica.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la célula no autóloga se obtiene de un mamífero.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el mamífero se trata con Eritropoyetina antes de la remoción de la célula grasa.

De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la composición farmacéutica comprende por lo menos un factor seleccionado del grupo que consiste de un componente de matriz extracelular, un factor de crecimiento, una hormona, un factor angiogénico, un factor de coagulación, una citoquina, una quimioquina, una enzima, un neurotransmisor, una vitamina, un carbohidrato, un ión, un agente quelante de hierro, un ácido graso, un antibiótico y un aminoácido.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como es comúnmente entendido por uno de habilidad ordinaria en la técnica a la cual la invención pertenece. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes aquellos descritos en la presente se pueden utilizar en la práctica o la prueba de las modalidades de la invención, métodos y/o materiales ejemplares se describen enseguida. En caso de conflicto, la especificación de patente, incluyendo las definiciones, lo controlará. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos únicamente y no se proponen para ser necesariamente limitantes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Algunas modalidades de la invención se describen en la presente, a manera de ejemplo únicamente, con referencia a los dibujos acompañantes. Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se acentúa que los detalles particulares mostrados son a manera de ejemplo y para propósitos de discusión ilustrativa de modalidades de la invención. A este respecto, la descripción tomada con los dibujos hace evidente a aquellos expertos en la técnica de cómo se pueden practicar las modalidades de la invención.

En los dibujos: Las FIGs. 1A-C son fotografías que representan cinco ratones representativos con injertos de grasa al final del período de estudio de 15 semanas. La Figura 1A muestra cinco injertos de grasa tratados con PBS con protuberancias pequeñas que varían en su tamaño en el cuero cabelludo. La Figura IB muestra cinco injertos de grasa tratados con eritropoyetina de alta dosis (100 IU EPO) con protuberancias grandes que son similares en su tamaño en el cuero cabelludo. La Figura 1C muestra injertos de grasa que se disectaron de los ratones 15 semanas después del trasplante. De izquierda a derecha: un injerto de grasa pequeño representativo de un injerto de grasa tratado con PBS, un injerto de grasa tratado con EPO de baja dosis de tamaño intermedio, y un injerto de grasa tratado con EPO de alta dosis grande respectivamente. Barra de escala: 10 mm.

Las FIGs. 2A-C son fotografías que representan secciones histológicas de injertos de grasa que se removieron de los ratones tratados con PBS, tratados con EPO de baja dosis y tratados con EPO de alta dosis 15 semanas después del trasplante de grasa. Las secciones se mancharon con hematoxilina y eosina, y se examinaron bajo microscopio de luz para: (i) el grado de integración, como es evidenciado por el grado de organización de células grasas intactas y nucleadas en la arquitectura del tejido graso injertado; (ii) el grado de fibrosis, como es evidenciado por la cantidad de colágeno y fibrilas elásticas; (iii) la presencia de quistes y vacuolas; y (iiii) la intensidad de la respuesta inflamatoria, como es evidenciado por el grado de infiltración de linfocitos y macrófagos. Cada criterio se gradúo en una escala de 0 a 5 donde 0 = ausencia, 1 = presencia mínima, 2 = presencia mínima moderada, 3 = presencia moderada, 4 = moderada a extensiva y 5 = presencia extensiva. Las micrografías histológicas representativas se muestran como siguen: Figura 2A, un injerto de grasa tratado con PBS en el cual hay degeneración de célula grasa, fibrosis e infiltración de células inflamatorias nucleadas aunque algunas células son todavía viable e intactas; Figura 2B, un injerto de grasa tratado con eritropoyetina (EPO) de baja dosis en el cual las células grasas son bien definidas en el tejido en el cual hay una cantidad moderada de fibrosis; y Figura 2C, un injerto de grasa tratado con EPO de alta dosis en el cual hay células grasas intactas bien definidas, viables con cantidades moderadas de tejido conectivo. Barra de escala: 200pm.

Las FIGs. 2D-F son fotografías gue representan el efecto de la eritropoyetina (EPO) sobre la respuesta inflamatoria en injertos de grasa después del trasplante de grasa. Después del implante en tres grupos de ratones, los injertos de grasa se trataron con ya sea PBS (100 µ?, Figura 2D), 20 IU de EPO/100 µ? de PBS (baja dosis, Figura 2E) o 100 IU de EPO/100 µ? de PBS (alta dosis, Figura 2F) en el día de la inyección de grasa y repetidamente cada tres días durante un total de 18 días. Después de la recolección de los injertos de grasa, las secciones se prepararon para estimar la respuesta inflamatoria como es evidenciado por infiltración de células CD68-positivas . Las flechas están apuntando a las células de CD68-positivas manchadas en café.

Las FIGs. 2G-I son fotografías gue representan el efecto de la eritropoyetina (EPO) sobre la nueva formación de vaso sanguíneo en injertos de grasa después del trasplante de grasa. Después del implante en los tres grupos de ratones, los injertos de grasa se trataron con ya sea PBS (100 µ?, Figura 2G) , 20 IU de EPO/100 µ? de PBS (baja dosis, Figura 2H) , o 100 IU EPO/100 µ? de PBS (alta dosis, Figura 21) en el día de la inyección de grasa y repetidamente cada tres días durante un total de 18 días. Después de la recolección de los injertos de grasa, la sección se prepararon para estimar la densidad microvascular (MVD) . Las flechas están apuntando a las células endotelxales CD31-positivas manchadas en café.

Las FIGs. 2J-L son gráficas que representan el efecto de EPO sobre la respuesta inflamatoria y MVD en los injertos de grasa después del trasplante. La Figura 2J es una gráfica de barras que muestra que el tratamiento de EPO disminuye la severidad de las respuestas inflamatorias en los injertos de grasa. La Figura 2K es una gráfica de barras que muestra que el tratamiento de EPO incrementa la densidad microvascular (MVD) de una manera dependiente de la dosis. Cada barra representa la MVD ± SD de cinco regiones de interés en cada injerto de grasa de cada grupo de tratamiento al final del periodo de 15 semanas. *P<0.05, ***P<0.001, y es el significado de la diferencia entre ya sea los injertos de grasa tratados con EPO de baja dosis o alta dosis y los injertos tratados con PBS. Barra de escala: 50 µp?. La Figura 2L es una gráfica de lineas que muestra la correlación negativa de MVD al grado de infiltración de macrófagos en los injertos de grasa.

Las FIGs 3A-J representan el efecto de EPO sobre los niveles de expresión de factores de crecimiento angiogénicos en los injertos de grasa. Los injertos de grasa de los tres grupos diferentes de ratones se trataron con ya sea PBS (100 µ?) , 20 IU de EPO/100 µ? de PBS (baja dosis) o 100 IU de EPO/100 µ? de PBS (alta dosis) en el día de inyección de grasa, y los tratamientos se repitieron cada tres días durante 18 dias. Las Figuras 3A-I son micrografias histológicas representativas de injertos de grasa tratados con PBS, y EPO de baja dosis y alta dosis (como es indicado) que presenta la expresión de VEGF (Figuras 3A-C) , la expresión de VEGFR-2 (Figuras 3D-F) y expresión de EPOR (Figuras 3G-I) . La Figura 3J es una fotografía que muestra los manchados de western representativos de los niveles de expresión de los factores angiogénicos en los injertos de grasa tratados con PBS y con EPO al final del período de estudio de 15 semanas. bFGF: factor de crecimiento de fibroblasto básico; IGF-1: factor-1 de crecimiento similar a insulina; PDGF-BB: factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB; MMP-2: metaloproteinasa-2 de matriz; PKB: proteína quinasa B; fosfoPKB: PKB fosforilada.

Las FIGs. 4A-F representan el efecto de la eritropoyetina (EPO) sobre los niveles de expresión de factores de crecimiento angiogénicos en los injertos de grasa. Después del implante en los tres grupos de ratones, los injertos de grasa se trataron con ya sea PBS (100 µ?) , 20 IU de EPO/100 µ? de PBS (baja dosis) , o 100 IU de EPO/100 µ? de PBS (alta dosis) en el dia de la inyección de grasa y repetidamente cada tres días durante un total de 18 días. Las gráficas representan el contenido de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) medio (Figura 4A) , la expresión de VEGFR-2 media (Figura 4B) y la expresión de EPOR media (Figura 4C) + SD en los injertos de grasa en cada grupo de tratamiento. Las Figuras 4D-F muestran la correlación entre VEGF y MVD (Figura 4D) y entre la expresión de VEGFR-2 (Figura 4E) y EPOR (Figura 4F) media y la MVD en cada grupo. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 para la diferencia entre ya sea loa injertos de grasa tratados con EPO de baja dosis o de alta dosis y los injertos tratados con PBS. Barra de escala: 200 µp?.

Las FIGs. 5A-B representan los efectos de la eritropoyetina (EPO) sobre el grado de apoptosis en los injertos de grasa. PBS (100 µ?) , 20 IU de EPO/100 µ? de PBS (baja dosis) o 100 IU de EPO/100 µ? de PBS (alta dosis) se inyectaron en injertos de grasa después del implante de los injertos de grasa en tres diferentes grupos de ratones, este tratamiento se repitió cada tres días durante 18 días. La Figura 5A muestra el grado de apoptosis como se midió mediante el ensayo de TUNEL y se expresa como un porcentaje en la presencia del apoptosis en los injertos de grasa tratados con PBS. Cada barra representa el grado medio de apoptosis ± SD de injerto de grasa, en cada grupo de tratamiento, al final del periodo de estudio de 15 semanas. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 y es el significado de la diferencia entre ya sea los injertos de grasa tratados con EPO de baja dosis o de alta dosis y los injertos tratados con PBS) . La Figura 5B muestran los manchados de western representativos de los niveles de expresión de caspasa 3 (Casp 3) y citocromo c (Cyt c) en los injertos de grasa tratados con PBS y con EPO al final del periodo de estudio de 15 semanas.

Las FIGs. 6A-D representan el efecto del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) sobre la densidad microvascular ( VD) y el grado de apoptosis en los injertos de grasa. PBS (100 µ?) o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, 200 ng VEGF/100 µ? PBS) se inyectaron en los injertos de grasa en el día de la inyección de grasa en dos diferentes grupos de ratones y luego repetidamente cada tres días durante 18 días. La Figura 6A es una gráfica de barras que muestra la densidad microvascular media (MVD) ± SD de cinco regiones de interés en cada platina (las platinas se prepararon de los injertos de grasa recolectados de cada grupo de tratamiento al final del período de estudio de 15 semanas) . La Figura 6B es una gráfica de barras que muestra el contenido de VEGF medio ± SD en los injertos de grasa recolectados en cada grupo de tratamiento al final del período después de 15 semanas. La Figura 6C es una gráfica de barras que muestra el grado de apoptosis como se midió mediante el ensayo de TUNEL. Los resultados se expresan como un porcentaje del grado de apoptosis en los injertos de grasa tratados con PBS. Cada barra representa el grado medio de apoptosis ± SD en el injerto de grasa en cada grupo de tratamiento el final del período de estudio de 15 semanas. **P<0.01, y es el significado de la diferencia entre los injertos de grasa tratados con VEGF y los injertos tratados con PBS. La Figura 6D es una fotomicrografía que muestra los manchados de western representativos de los niveles de expresión de caspasa 3 (Casp 3) y citocromo c (Cyt c) en los injertos de grasa tratados con PBS y VEGF al final del período de estudio de 15 semanas.

La FIG. 7A representa el efecto de la eritropoyetina (EPO) sobre la formación de tubo de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) en matrigel. Las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) se trataron con 20 IU/ml o 100 IU/ml de EPO durante 48 horas después de la colocación de las células sobre matrigel. El grado de formación de tubo de HUVEC sobre matrigel se estimó después de 24 horas bajo un microscopio de luz en amplificación de 10 x. Las estructuras tubulares se graduaron semicuantitativamente en una escala de 0 a 5 mediante la evaluación de la presencia relativa y etapas de formación de tubo sobre el matrigel: 0 = células individuales bien separadas, 1 = las células han comenzado a migrar y alinearse por si mismas, 2 = tubos capilares visibles y sin brote, 3 = brote visible de nuevos tubos capilares, 4 = formación temprana de polígonos cerrados, 5 = desarrollo de estructuras complejas similares a malla. Cada barra representa el grado medio de formación de tubo ± SD en el matrigel-. *P<0.05, **P<0.01 y ***P<0.001.

Las FIGs. 7B-H representa el efecto de EPO o VEGF sobre la formación de tubo de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) en matrigel. Las HUVECs se trataron con 100 IU/ml de EPO o 200 ng/???µ? de VEGF en la ausencia o presencia de 0.25 mg/ml de bevacizumab durante 48 horas después de la colocación de las células sobre matrigel. El grado de formación de tubo de HUVEC sobre matrigel se estimó después de 24 horas bajo un microscopio de luz en amplificación de 10 x. La estructura tubulares se graduaron semicuantitativamente en una escala de 0 a 5 mediante la evaluación de la presencia relativa y etapa de formación de tubo sobre el matrigel: 0 = células individuales separadas, 1 = las células han comenzado a migrar y alinearse por si mismas, 2 = tubos capilares visibles y sin brote, 3 = brote visible de nuevos tubos capilares, 4 = formación temprana de polígonos serrados, 5 = desarrollo de estructuras complejas similares a malla. La Figura 7B, las barras blancas representan el grado medio de formación de tubo ± SD en el matrigel de HUVECs no tratadas, HUVECs tratadas con VEGF o EPO. Las barras negras representan el grado medio de formación de tubo ± SD en matrigel de HUVECs no tratadas, HUVECs tratadas con VEGF o EPO que se expusieron a bevacizumab. *P<0.05 y ***P<0.001, y es el significado de la diferencia entre las HUVECs que fueron o no se expusieron a bevacizumab. NS = no significantemente diferente. La Figura 7C representa las HUVECs no tratadas sobre matrigel; la Figura 7D representa las HUVECs tratadas con EPO después de 24 horas de la colocación en placa; la Figura 7E representa las HUVECs tratadas con 24 horas de colocación en placa; la Figura 7F representa las HUVECs no tratadas con bevacizumab; la Figura 7G representa las HUVECs tratadas con EPO después de 24 horas de colocación en placa de bevacizumab; la Figura 7H representa las HUVECs tratadas con VEGF después de 24 horas de la colocación en placa con bevacizumab.

La FIG . 71 representa el efecto de EPO o VEGF sobre la formación de tubo de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) en matrigel. Las HUVECs cultivadas se trataron con o sin 100 IU/ml de EPO en la presencia de ya sea de bevacizumab, PD173074, o tirfostina, una combinación de bevacizumab, PD173074 y tirfostina, o en la presencia de wortmanina. La proliferación de HUVECs se midió mediante la incorporación de [3H] -timidina a DNA. Los conteos de células duplicados se promediaron para 3 experimentos y los datos se expresaron como el porcentaje de control. *P<0.05, **P<0.01 y ***P<0.001 para la diferencia entre las HUVECs no tratadas, o tratadas con EPO que se expusieron a bevacizumab, PD173074, tirfostina o wortmanina. NS = no significantemente diferente. DESCRIPCIÓN DE MODALIDADES ESPECÍFICAS DE LA INVENCIÓN La presente invención, en algunas modalidades de la misma, se relaciona a tejido graso y, más particularmente, pero no exclusivamente, a métodos para mejorar el injerto del mismo. ' Los principios y operación de la presente invención se pueden entender mejor con referencia a los dibujos y las descripciones acompañantes.

Antes de explicar por lo menos una modalidad de la invención en detalle, se va a entender que la invención no está necesariamente limitada en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificada por los ejemplos. La invención es capaz de otras modalidades o de ser practicada o llevada a cabo de varias maneras. También, se va a entender que la fraseología y terminología empleadas en la presente es para propósito de descripción y no deben ser consideradas como limitantes.

Mientras que se reduce la presente invención a la práctica, el presente inventor ha descubierto que el tratamiento del tejido graso injertado con Eritropoyetina (EPO) estimula la liberación de varios factores angiogénicos (por ejemplo VEGF) , promueve la angiogénesis del tejido graso y previene la apoptosis de las células de injerto grasas. Por otra parte, el presente inventor ha mostrado que el tratamiento de los injertos de grasa con EPO conduce a supervivencia a largo plazo de las células grasas injertadas. Tomadas conjuntamente las presentes enseñanzas representan un valor terapéutico para Eritropoyetina y sugieren el uso de la misma en el trasplante de tejido graso.

Como se muestra enseguida en la presente y en la sección de Ejemplos que sigue, el presente inventor ha descubierto a través de la experimentación laboriosa que la EPO es deseable para promover el injerto de tejido graso. El presente inventor ha mostrado específicamente que el tejido graso injertado tratado con EPO exhibió un peso y volumen más altos 15 semanas después del implante de grasa (Figuras 1 A-C y Tabla 2). El grado de integración de tejido fue más alto en tejidos grasos tratados con EPO mientras que el grado de formación de quiste y fibrosis fue menor en estos tejidos (Figuras 2A-C y Tabla 3). Por otra parte, los tejidos grasos tratados con EPO mostraron alta densidad microvascular (MVD) , áreas bien vascularizadas con expresión incrementada de CD31 y numerosas isletas endoteliales (Figuras 2G-I y 2K) y mostraron una respuesta inflamatoria menor después del trasplante (Figuras 2D-F y 2J) . El tratamiento con EPO también condujo a una disminución dependiente de la dosis en la apoptosis de células grasas (Figura 5A) mientras que incrementa la expresión de los factores angiogénicos VEGF, bFGF, IGF-1, PDGF-BB, MMP-2 PKB y fosfoPKB (Figuras 3J y 4A) e incrementa ambas de las expresiones de VEGFR-2 y EPOR de tejido (Figuras 3D-I y 4B-C) en estas células. Tomados conjuntamente, estos resultados sustentan el valor de la EPO en promover el injerto de célula grasa en procedimientos de trasplante .

Asi, de acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona un método para aumentar la supervivencia de célula grasa en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende implantar una población de células grasas en el sujeto y administrar Eritropoyetina al sujeto.

Los términos "célula grasa" o "células grasas" como se utiliza en la presente se refieren a cualquier célula o grupo de células compuestas en un tejido graso, que incluye por ejemplo, lipocitos, adipocitos, precursores de adipocito que incluyen pre-adipocitos y células madre mesenquimales . Será apreciado que de acuerdo con las presentes enseñanzas, las células grasas se pueden dispersar o pueden estar comprendidas en un tejido.

El número de células grasas puede variar sobre una amplia gama y uno de habilidad ordinaria en la técnica reconocerá que este número variará dependiendo del tipo y tamaño del área que es tratada, el grado relativo de vascularización del área que es tratada, la edad del sujeto que es tratado y la viabilidad relativa de las células grasas disponibles para el trasplante. Será apreciado que el número de células grasas trasplantadas se puede ajustar de acuerdo con el procedimiento utilizado, el sitio de inyección y la vascularización relativa del sitio que es inyectado. Uno de habilidad ordinaria en la técnica reconocerá que ciertas condiciones pueden necesitar el ajuste de los números de célula grasa fuera de los intervalos descritos enseguida. De acuerdo con algunas modalidades de la presente invención, el número de células grasas para el intervalo para trasplante varia de aproximadamente 10,000 a aproximadamente 10,000,000 de células grasas por 1 mi. De acuerdo con otra modalidad se trasplantan 0.01 - 2000 mis de tejido graso. Será apreciado que el sujeto se puede administrar con un solo trasplante o varios trasplantes (por ejemplo aproximadamente 2, 5, 10, 20, 50, 100 o más procedimientos de trasplante) , como es descrito en detalle adicional enseguida en la presente.

La frase "supervivencia de célula grasa" como se utiliza en la presente se refiere, a la habilidad de las células grasas para permanecer viables e intactas después del injerto de las mismas. De preferencia, las células grasas sobreviven durante un periodo de unos cuantos días, unas cuantas semanas, unos cuantos meses o unos cuantos años después del injerto de las mismas.

Como se utiliza en la presente, el términos "aumento" con respecto a la supervivencia de célula grasa se refiere a un proceso de incrementar el lapso de vida de la célula grasa en el injerto de grasa y/o disminuir el número de células grasas que se someten a la resorción, apoptosis o muerte celular dentro del injerto de grasa. Asi, en algunas modalidades de la presente invención, el aumento se refiere a por lo menos aproximadamente 10 %, 20 %, 50 %, 80 %, 90 % de incremento en células grasas viables y/o por lo menos aproximadamente 10 %, 20 %, 50 %, 80 %, 90 % de detención en la muerte de célula grasa. Aquellos de habilidad en la técnica entenderán que varias metodologías y ensayos se pueden utilizar para estimar la viabilidad celular, y de manera similar, varias metodologías y ensayos se pueden utilizar para estimar la muerte celular o apoptosis celular (por ejemplo análisis de FACS, ensayo de etiquetación de extremo de muesca de trifosfato de deoxiuridina terminal (TUNEL) , ensayos de viabilidad celular, por ejemplo, Ensayos MultiTox) .

Como es mencionado, el aumento de la supervivencia de célula grasa de acuerdo con las presentes enseñanzas se logra al administrar al sujeto Eritropoyetina (EPO) .

Como se utiliza en la presente el término "Eritropoyetina" se refiere a una proteína de Eritropoyetina (intercambiablemente utilizada con polipéptido) de mamífero, (por ejemplo, humano) o miméticos de la misma tal como se expone en el Acceso de GenBank No. NP_000790. La Eritropoyetina se puede sintetizar utilizando técnicas de DNA recombinantes o tecnología en fase sólida. La Eritropoyetina también es comercialmente disponible (por ejemplo, Cytolab/Peprotech, Rehovot, Israel; Arenesp, Amgen, Thousand Oaks, CA, USA; and Epogen, Amgen, Thousand Oaks, CA, USA, Bristol-Myers Squibb, Roche and Sanofi-Aventis) . La Eritropoyetina se puede utilizar como una glicoproteina completa o como solamente una subunidad de proteina libre del azúcar enlazado. Puesto que la Eritropoyetina de la presente invención se utiliza para aplicaciones clínicas, es de preferencia estéril o se puede purificar de posibles factores contaminantes (por ejemplo, bacterias o componentes bacterianos, tal como mediante un filtro) .

Los sujetos típicos que se pueden tratar de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluyen mamíferos tales como seres humanos o animales domesticados que incluyen, pero no limitados a, caballos, (es decir, equino) , ganado vacuno, cabra, oveja, cerdo, perro, gato, camello, alpaca, llama y yak, macho o hembra, en cualquier edad que esta en necesidad del trasplante de grasa.

En general, el trasplante de grasa se puede utilizar para tratar cualquier defecto de tejido blando, para rellenar cualquier déficit de tejido blando y para el acrecentamiento de superficie externas e internas y estructuras del cuerpo que están perdiéndose debido a la cirugía, como un resultado del envejecimiento de un tejido, o debido a enfermedad, trauma o una lesión. Ejemplos incluyen, pero no están limitados a, cirugías urológicas, cirugías de remoción de tumor, cirugías reconstructivas y cirugías de la piel. Del mimo modo, el trasplante de grasa se puede utilizar como una alternativa a los rellenadores de silicona o de colágeno. El trasplante de grasa se puede utilizar para rellenar depresiones (es decir, áreas del cuerpo que están huecas o contraídas y carecen de la sustancia celular, cuerpo o volumen comparado con la misma área sobre un cuerpo normal) después de la lesión o debido a procedimientos quirúrgicos tal como la cirugía cosmética, que incluye, pero no limitada a, cirugías plásticas faciales, mastectomías o lumpectomías y debido a otro procedimientos, como por ejemplo, la remoción de tejidos cancerosos, especialmente tumores en o cerca de la piel del sujeto. El trasplante de grasa también se puede utilizar en otras numerosos aplicaciones, incluyendo procedimientos urológicos que involucran la acumulación de tejido estructural débil o dañado, en el tratamiento de arrugas, quemaduras, condiciones de la piel, trastornos de la piel y heridas y para aumentar áreas del cuerpo, tal como las nalgas, bíceps, músculos de tríceps, músculos de pantorrilla, senos, manos y pene. Además, el trasplante de grasa se puede utilizar para tratar malformaciones congénitas tal como la microsomia Hemifacial y enfermedades adquiridas tal como la lipodistrofia de Romberg y el síndrome de inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) .

Será apreciado que la célula grasa se puede obtener del cuerpo de un sujeto y utilizar en un aspecto autólogo (es decir trasplantado en el mismo sujeto del cual se obtuvieron las células grasas) . En el caso donde un trasplante de grasa autólogo se lleve a cabo, las células grasas autólogas típicamente se toman de un sujeto para rellenar depresiones o déficit de tejido blando en el cuerpo del mismo sujeto en un área de cuerpo diferente de aquel sitio del cual se removieron las células grasas.

Alternativamente, las células grasas se pueden obtener de un sujeto (un "donador") y trasplantar en un individuo diferente (un "recipiente") en un aspecto no autólogo. En casos donde se lleva a cabo un trasplante de grasa no autólogo, las células grasas se pueden obtener de un sujeto de la misma especie como el sujeto de recipiente (es decir células grasas alogenéicas por ejemplo de un donador humano a un recipiente humano) o de una especie diferente (es decir células xenogenéicas como por ejemplo de un donador porcino a un recipiente humano) . Tales métodos son bien conocidos para uno de habilidad ordinaria en la técnica. De acuerdo con una modalidad de la presente invención, las células no autólogas se obtienen de un mamífero.

De acuerdo con las presentes enseñanzas, las células grasas generalmente se obtienen al remover las mismas (por ejemplo, al succionar) de capas de grasa subcutáneas en el área del estómago, piernas u otras áreas donde se pueden encontrar células grasas significantes. De preferencia, las células grasas de la presente invención están sustancialmente libres de células no relacionadas tales como eritrocitos, otras células sanguíneas, fibroblastos y otras células que pueden contaminar las células grasas. Además, como las células grasas se utilizan para el trasplante, estas células se mantienen en un ambiente estéril hasta que se utilizan para el trasplante.

Será apreciado que las células grasas además pueden ser separadas de otros componentes que se pueden encontrar en la grasa aspirada, tal como, por ejemplo, triglicéridos, lisozomas, otros fragmentos celulares, componente sanguíneos, células sanguíneas y fragmentos de tejido colectivo grandes, entre otros componentes menos deseables, antes del uso. Cualquiera de los métodos conocidos en la técnica se pueden utilizar para separar las células grasas de estos otros componentes, pero de preferencia, se emplea por lo menos una etapa de centrifugación.

De acuerdo con una modalidad, las células grasas se implantan inmediatamente en un sujeto. De preferencia las células grasas se implantan dentro de 30 minutos, dentro de una hora, dentro de dos horas, dentro de tres horas, dentro de cuatro horas o dentro de un día de la recolección (ver por ejemplo, el Ejemplo 1, de la sección de ejemplos que sigue) . Será apreciado que las células grasas de la presente invención se pueden preservar durante periodos de tiempo más largos antes del traslado en, por ejemplo, mediante la congelación en nitrógeno liquido.

El implante de las células grasas de acuerdo con las presentes enseñanzas se puede llevar a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como por ejemplo, por la inyección de las mimas en la ubicación deseada (como es descrito en detalle en el Ejemplo 1, enseguida en la presente) , mediante microcirugia y mediante cirugía en casos donde está siendo trasplantado una cantidad grande de células grasas o tejido graso.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, después del implante de las células grasas, el sujeto se administra con Eritropoyetina .

Será apreciado que la Eritropoyetina se puede administrar por la vía de una administración sistémica o por la vía de una administración local.

Como se utiliza en la presente, la frase "administración sistémica" se refiere a la administración oral, intravenosa, intraperitoneal e intramuscular de Eritropoyetina de la presente invención.

Como se utiliza en la presente, la frase "administración local" se refiere a la aplicación de la Eritropoyetina de la presente invención directamente a las células grasas implantadas o en estrecha proximidad a las células grasas implantadas. De acuerdo con una modalidad ejemplar, la Eritropoyetina en la presente invención se administra directamente a las células trasplantadas por la vía de la inyección.

Será apreciado que de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención la dosis contemplada de Eritropoyetina aplicada para administración local (por ejemplo, para inyección directa en las células grasas implantadas) varia entre 1-1000 IU por inyección por ?,???, ?? de células grasas para administración local. Del mismo modo, la dosis de Eritropoyetina para administración sistémica puede variar entre 10 - 7500 IU por kg de peso corporal para la administración sistémica. La dosis de Eritropoyetina seleccionada para el tratamiento depende del número y concentración de células grasas, el sujeto que es tratado y la ubicación del injerto.

Será apreciado que cuando se utilizan composiciones miméticas las dosificaciones de Eritropoyetina deben de ser calibradas tal como de acuerdo con el valor molar. Tal calibración es un cálculo de rutina para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica.

La administración de Eritropoyetina típicamente se efectúa inmediatamente después del implante de las células grasas. Así, de acuerdo con las presente enseñanzas, la Eritropoyetina se administra al sujeto dentro de unos pocos minutos o dentro de unas pocas horas del implante. De acuerdo con una modalidad específica, la Eritropoyetina se administra al sujeto iniciando en el primer día del trasplante de célula grasa y continuamente se administra hasta que las células grasas se han integrado y vascularizado en el sujeto (por ejemplo, durante por lo menos 5-50 días) .

De acuerdo con una modalidad específica, la presente invención contempla el tratamiento de células grasas con Eritropoyetina antes del implante de las mismas. Esto puede ser además de la administración de Eritropoyetina después del implante o en lugar de la administración de Eritropoyetina después del implante. El tratamiento de la célula grasa se puede llevar a cabo mediante cualquier método conocido para uno de habilidad ordinaria en la técnica como por ejemplo al poner en contacto ex vivo las células grasas con Eritropoyetina en la placa de cultivo de tejido o mediante la inyección de Eritropoyetina directamente en el tejido graso. Alternativamente, las células grasas se pueden exponer a la Eritropoyetina antes de la remoción desde el donador.

Las concentraciones contempladas de Eritropoyetina para tratar células grasas antes del trasplante incluyen una dosis entre 1-1000 IU por inyección por 1,000,000 de células grasas .

El sujeto que es tratado antes del implante puede continuar recibiendo Eritropoyetina después del implante de las células grasas como es representado en detalle anteriormente en la presente.

La Eritropoyetina se puede administrar al sujeto per se o como una composición farmacéutica. Además, las células grasas de la presente invención se pueden administrar per se, o como parte de una composición farmacéutica.

Como se utiliza en la presente, una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de los ingredientes activos descritos en la presente con otros componentes químicos tales como portadores y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de la composición es facilitar la administración de los ingredientes activos (por ejemplo Eritropoyetina) al sujeto.

Como se utiliza en la presente, el término "ingrediente activo" se refiere a Eritropoyetina o las células grasas por si mismas que tienen en cuenta el efecto biológico propuesto (es decir, aumento de la supervivencia de células grasas) .

Después en la presente, la frase "portador fisiológicamente aceptable" y "portador farmacéuticamente aceptable" que se pueden utilizar intercambiablemente se refieren a un portador o un diluyente que no causa irritación significante al sujeto y no anula la actividad biológica y las propiedades de los ingredientes activos administrados. Un adyuvante se incluye bajo estas frases.

En la presente, el término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte adicionada a la composición (composición farmacéutica) para facilitar adicionalmente la administración de un ingrediente activo de la presente invención.

Las técnicas para formulación y administración de fármacos se pueden encontrar en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, más última edición, que es incorporada en al presente por referencia.

Como se mencionó anteriormente en la presente, las rutas adecuadas de administración de Eritropoyetina pueden incluir, por ejemplo, una manera sistémica incluyendo la administración oral, rectal, transmucosal, especialmente transnasal, suministro intestinal o parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas e intramedulares asi como inyecciones intratecales , intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intramusculares, intranasales o intraoculares .

Alternativamente, se puede administrar la composición farmacéutica que comprende Eritropoyetina en una manera local antes que sistémica, por ejemplo, por la vía de la inyección de la composición directamente en la región de implante de célula grasa de un paciente, o por la vía de la aplicación de las composiciones directamente en una región de tejido en proximidad al implante de célula grasa de un paciente. Las rutas adecuadas de administración de las composiciones pueden incluir, por ejemplo, las administraciones tópicas (por ejemplo a un tejido queratinoso, tal como la piel, cuero cabelludo) y mucosales (por ejemplo, oral, vaginal, alojo) .

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden manufacturar por procesos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezclado, disolución, granulación, elaboración de grageas, levigación, emulsificación, encapsulación, atrapamiento o liofilización.

Las composiciones farmacéuticas para el uso de acuerdo con la presente invención asi se pueden formular de manera convencional utilizando uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los ingredientes activos en preparaciones que se pueden utilizar farmacéuticamente. La formulación apropiada es dependiente de la ruta de administración elegida.

Para inyección, los ingredientes activos de la composición farmacéutica se pueden formular en soluciones acuosas, de preferencia en soluciones reguladoras fisiológicamente compatibles tal como la solución de Hank, solución de Ringer o solución reguladora de sal fisiológica.

Para administración trasmucosal, se utilizan penetrantes apropiados para la barrera que es permeada en la formulación. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica.

Para administración oral, la composición farmacéutica se puede formular fácilmente al combinar los compuestos activos con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Tales portadores permiten que la composición farmacéutica sea formulada como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas, suspensiones y los similares, para ingestión oral por un paciente. Las preparaciones farmacológicas para uso oral se pueden hacer utilizando un excipiente sólido, opcionalmente moliendo la mezcla resultante y al procesar la mezcla de gránulos, después de adicionar auxiliares adecuados si es deseado, para obtener tabletas o núcleo de gragea. Los excipientes adecuados son, en particular, rellenadores tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de papa, gelatina, goma de tragacanto, metil celulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, carbometilcelulosa de sodio; y/o polímeros fisiológicamente aceptables tal como polivinilpirrolidona (PVP) . Si es deseado, se pueden adicionar agentes desintegrantes, tal como polivinil pirrolidona reticulada, agar, o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato de sodio.

Los núcleos de grageas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para este propósito, soluciones de azúcar concentradas se pueden utilizar que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco, polivinil pirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, dióxido de titanio, soluciones de laca y solventes orgánicos adecuados o mezclas de solventes. Los materiales colorantes o pigmentos se pueden adicionar a las tabletas o recubrimiento de gragea para la identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuesto activo.

Las composiciones farmacéuticas que se pueden utilizar oralmente, incluyen cápsulas ajustadas por empuje hechas de gelatina asi como cápsulas selladas, blandas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas ajustadas por empuje pueden contener los ingredientes activos en mezcla con rellenador tal como lactosa, aglutinante tales como almidones, lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En cápsulas blandas, los ingredientes activos se pueden disolver o suspender el líquidos adecuados, tales como aceites grasos parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden adicionar estabilizadores. Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosificaciones adecuadas para la ruta de administración elegida.

Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o pastillas formuladas de manera convencional .

Para administración por inhalación nasal, los ingredientes activos para uso de acuerdo con la presente invención se suministran convenientemente en al forma de una presentación de roció en aerosol a partir de un empaque presurizado o un nebulizador con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dicloro-tetrafluoroetano o dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad o dosificación se puede determinar al proporcionar una válvula para suministrar una cantidad dosificada. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para el uso en un dispensador se pueden formular para contener una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

La composición farmacéutica descrita en la presente se puede formular para administración parenteral, por ejemplo, mediante la inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampolletas o en recipientes de multidosis con opcionalmente, un conservador adicionado. Las composiciones pueden ser suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos acuosos, y pueden contener agentes formulatorios tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o de dispersión.

Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas para preparación activa en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de los ingredientes activos se pueden preparar como sea apropiado en suspensiones de inyecciones aceitosas o basadas en agua. Los solventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos tal como aceite de ajonjolí, o ésteres de ácidos grasos sintéticos tal como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias, que incrementan la viscosidad en la suspensión, tal como carboximetil celulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores o agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los ingredientes activos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.

Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para la constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, solución a base de agua libre de pirógeno, estéril, antes del uso.

La composición farmacéutica de la presente invención también se puede formular en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, utilizando, por ejemplo, bases de supositorio convencionales tal como manteca de cacao u otros glicéridos.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso en el contexto de la presente invención incluyen composiciones en donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad efectiva para lograr el propósito propuesto. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente efectiva significa una cantidad de ingredientes activos (por ejemplo, Eritropoyetina) efectiva en aumentar la supervivencia de célula grasa.

La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva está bien dentro de la capacidad de aquellos expertos en la técnica, especialmente en vista de la descripción detallada proporcionada en la presente.

Para cualquier preparación utilizada en los métodos de la invención, la cantidad o dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de ensayos in vitro y de cultivo de células. Por ejemplo, una dosis se puede formular en modelos de animal para lograr una concentración o título deseado. Tal información se puede utilizar para determinar más precisamente dosis útiles en humanos .

La toxicidad y eficacia terapéutica de los ingredientes activos descritos en la presente se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándares in vitro, en cultivos de células o en animales experimentales. Los datos obtenidos de estos ensayos in vitro y de cultivo de células y estudios en animales se pueden utilizar en la' formulación de una gama de dosificación para el uso en el humano. La dosificación puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada. La formulación exacta, ruta de administración y dosificación se pueden elegir por el profesional individual en vista de la condición del paciente (Ver por ejemplo, Fingí, y colaboradores, 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.l).

La cantidad de dosificación e intervalo se puede ajustar individualmente a niveles del ingrediente activo que son suficientes para inducir o suprimir el efecto biológico, concentración efectiva mínima, MEC ) . La MEC variará para cada preparación, pero se puede estimar de datos in vitro. La dosificación necesaria para lograr la MEC dependerá de las características individuales y la ruta de administración. Los ensayos de la detección se pueden utilizar para determinar las concentraciones en el plasma.

Un modelo de animal que se puede utilizar de acuerdo con las presentes enseñanzas para estimar el efecto biológico de las composiciones descritas en la presente incluye ratones SC I D (como es descrito en detalle en la sección de Ejemplos enseguida) .

Dependiendo de la severidad de la condición que es tratada, el número de células grasas que es implantada y la responsividad del sujeto al tratamiento, la dosificación puede ser de una sola o una pluralidad de administraciones, con el curso de tratamiento que dura de varios días a varias semanas- o meses o hasta que se efectúa la curación o hasta que a perdurado el tejido graso amplio.

De acuerdo con algunas modalidades de la presente invención, las composiciones de Eritropoyetina se administran una vez, se administran dos veces, se administran tres veces, se administra cuatro veces, se administran cinco veces, se administran seis veces se administran siete veces se administran ocho veces, se administran nueve veces o se administran diez veces al sujeto con el fin de aumentar la supervivencia de la célula grasa. Será apreciado que si se llevan a cabo múltiples trasplantes de célula grasa, el número de administraciones de Eritropoyetina puede ser vasto y puede ser prolongado por tanto tiempo como sea necesario (como es determinado por uno de habilidad ordinaria en la técnica) . De preferencia, las composiciones de la presente invención se administran por lo menos una vez al dia. Será apreciado que el número de administraciones se puede determinar por uno de habilidad ordinaria en la técnica.

La cantidad de una composición que se puede administrar, por supuesto, será dependiente del sujeto que es tratado, la severidad de la. aflicción, la manera de administración, el buen juicio del facultativo que prescribe, etc .

La determinación de la eficacia de tratamiento se puede determinar al medir el número y viabilidad de las células grasas injertadas (por ejemplo mediante ultrasonido) , al medir el número de células apoptóticas dentro del injerto (por ejemplo mediante PCR) y al evaluar la vascularización de las células grasas tratadas (por ejemplo mediante ultrasonido) .

Las composiciones de la presente invención si se desea, se pueden presentar en un paquete o dispositivo dispensador, tal como un equipo aprobado por la FDA, que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contiene ingrediente activo. El paquete, por ejemplo, puede comprender lámina delgada de metal o plástico, tal como un paquete de ampollas. El paquete o dispositivo dispensador se puede acompañar por instrucciones para la administración. El paquete o dispositivo dispensador también puede ser acompañado por una notificación en una forma prescrita por un agencia gubernamental que regula la manufactura, uso, o venta de sustancias farmacéuticas, la notificación que es reflectiva de la aprobación por la agencia de la forma de las composiciones para administración humana o veterinaria. Tal notificación, por ejemplo, puede incluir la etiquetación aprobada por la U.S. Food y Drug Administration para fármacos de prescripción o de un inserto de producto aprobado. Las composiciones que comprenden la preparación de la invención formulada en un portador farmacéuticamente aceptable también se pueden preparar, colocar en un recipiente apropiado, y etiquetar para el tratamiento de una condición indicada, como es detallado adicionalmente en lo anterior.

Puesto que las composiciones de la presente invención se utilizan in vivo, las composiciones de preferencia son de alta pureza y sustancialmente libres de contaminantes potencialmente peligrosos, por ejemplo por lo menos el grado de Alimento Nacional (NF) , generalmente por lo menos el grado analítico, y de preferencia por lo menos el grado farmacéutico. Al grado que un compuesto dado debe ser sintetizado antes del uso, tal síntesis o purificación subsecuente de preferencia debe dar por resultado un producto que está sustancialmente libre de cualquiera de los agentes tóxicos potencialmente contaminantes que pueden haber sido utilizados durante la síntesis o procedimientos de purificación .

Factores adicionales se pueden incorporar en las composiciones de la presente invención (es decir la Eritropoyetina descrita anteriormente en la presente) para aumentar la supervivencia de la célula grasa. Estos incluyen, pero no están limitados a, componentes de matriz extracelular (por ejemplo vitronectina, laminina, colágeno, elastina) ; factores de crecimiento (por ejemplo FGF 1, FGF 2, IGF 1, IGF 2, PDGF, EGF, KGF, HGF, VEGF, GM-CSF, CSF, G-CSF, TGF alfa, TGF beta, NGF y ECGF) , factores inducibles de hipoxia (por ejemplo HIF-1 alfa y beta y HIF-2), hormonas (por ejemplo, insulina, hormona de crecimiento (GH) , CRH, Leptina, Prolactina y TSH) , factores angiogénicos (por ejemplo, angiogenina y angiopoyetina) , factores de coagulación y anticoagulación [por ejemplo, Factor I, Factor XIII, factor de tejido, calcio, vWF, proteina C, proteina S, proteina Z, fibronectina, antitrombina, heparina, plasminógeno, heparina de bajo peso molecular (Clixan) , quininogeno de alto peso molecular (HMWK) , precalicreina, inhibidor-1 activador de plasminógeno (PAI1) , inhibidor-2 activador de plasminógeno (PAI2) , uroquinasa, trombomodulina, activador de plasminógeno de tejido (tPA) , alfa 2-antiplasmina e inhibidor de proteasa relacionado con Proteina Z (ZPI)], citoquinas (IL-1 alfa, IL- 1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL- 10, IL-11, IL-12, IL-13 y INF-alfa, INF, beta e INF-gama) , quimioquinas (por ejemplo, MCP-1 o CCL2) , enzimas (por ejemplo endoglicosidasas, exoglicosidasas , endonucleasas, exonucleasas, peptidasas, lipasas, oxidasas, decarboxilasas , hidrasas, condroitinasa, condroitinasa ABC, condroitinasa AC, hialuronidasa, queratanasa, heparanasas, variación de empalme de heparanasa, colagenasa, tripsina, catalasas) , neurotransmisores (por ejemplo, acetilcolina y monoaminas) , neuropéptidos (por ejemplo substancia P) , vitaminas (por ejemplo, D-biotina, Cloruro de Colina, ácido Fólico, yo-inositol, Niacinamida, ácido D-Pantoténico, sales de Calcio, Piridoxal . HC1, Pirodixina . HC1, Riboflavina, Tiamina.HCl, Vitamina B12, vitamina E, vitamina C, vitamina D, vitamina Bl-6, vitamina K, vitamina A y vitamina PP) , carbohidratos (por ejemplo Mono/Di/Polisacáridos incluyendo glucosa, mañosa, maltosa y fructosa) , iones, agentes quelantes (por ejemplo agente quelantes de Fe, agentes quelantes de Ca) , antioxidantes (por ejemplo, Vitamina E, Quarcetina, depuradores de superóxido, Superóxido dismutasa) , depuradores de H202, depuradores de radicales libres, depuradores de Fe), ácidos grasos (por ejemplo, Triglicéridos , Fosfolipidos, Colesteroles, ácidos grasos libres y ácidos grasos no libres, alcohol graso, ácido Linoléico, ácido oleico y ácido lipóico), antibióticos (por ejemplo, Penicilinas, Cefalosporinas y Tetraciclinas) , analgésicos, anestésicos, agentes antibacterianos, agentes entilevadura, agentes antufungales, agentes antivirales, agentes pro-bióticos , agentes anti-protozoarios, agentes anti-pruriticos , agentes anti-dermatitis, anti-eméticos, agentes anti-inflamatorios , agentes anti-hiperqueratolíticos, antiperspirantes, agentes anti-psoriáticos, agentes anti-seborreicos , agentes de antihistamina, aminoácidos (por ejemplo, esenciales y no esenciales (de A-Z) especialmente glutamina y arginina) , sales (por ejemplo, sales de prurivat y sales de sulfato) , sulfatos (por ejemplo Sulfato de Calcio) , esteroides (por ejemplo, andrógenos, estrógenos, progestágenos, glucocorticoides y mineralocorticoides) , catecolaminas (por ejemplo, Epinefrina y Norepinefriña) , Nucleosidos y Nucleótidos (por ejemplo, Purinas y Pirimidinas) , Prostaglandinas (por ejemplo Prostaglandina de E2), Leucotrienos, Eritropoyetinas (por ejemplo Trombopoyetina) , Proteoglicanos (por ejemplo sulfato de Heparano, sulfato de queratano) , Hidroxiapatitas [por ejemplo Hidroxiapatita (Ca10(PO4) 6 (OH) 2) ] , Haptoglobinas (Hpl-1, Hp2-2 y Hpl-2), Superóxido dismutasas (por ejemplo SOD 1/2/3), Óxido Nítricos, donadores de Óxido Nítrico (por ejemplo nitroprusido, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA, Glutationa peroxidasas, compuestos de hidratación (por ejemplo vasopresina) , células (por ejemplo Plaquetas), medio de células (por ejemplo M199, DMEM/F12, RP I, Iscovs), suero (por ejemplo suero humano, suero de ternero fetal, suero de bovino fetal), soluciones reguladoras (por ejemplo, HEPES, Bicarbonato de Sodio), detergentes (por ejemplo, Tween) , disinfectantes, hierbas, extractos frutales, extractos vegetables (por ejemplo col, pepino), extractos florales, extractos de plantas, flavinoides (por ejemplo jugo de granada) , especias, hojas (por ejemplo té Verde, Manzanilla) , Polifenoles (por ejemplo Vino Rojo), miel, lectinas, macroparticulas, nanoparticulas, (liposomas), micelas, carbonato de calcio (CaC03, por ejemplo carbonato de calcio precipitado, carbonato de calcio molido/pulverizado, albacar, PCC, GCC) , calcita, piedra caliza, mármol triturado, piedra caliza molida, cal, tiza (por ejemplo tiza blanqueante, tiza champagne, tiza francesa) y co factores tal como BH4 ( tetrahidrobiobterina) .

La presente composición también puede contener ingredientes, sustancias, elementos y materiales que contienen hidrógeno, grupos alquilo, grupos arilo, grupo halo, grupos hidroxi, grupos alcoxi, grupos alquilamina, grupos dialquilamino, grupos acilo, grupos carboxilo, grupos carboamido, grupos sulfonamida, grupos aminoacilo, grupos amida, grupos amina, grupos nitro, compuestos de órgano selenio, hidrocarburos e hidrocarburos cíclicos.

La presente invención se puede combinar con sustancias tal como peróxido de benzol, vasoconstrictores, vasodilatatores, ácido salicílico, ácido retinóico, ácido azeláico, ácido láctico, ácido glicólico, ácido pireúrico, taninos, benzlidencamfor y derivados de los mismos, alfa hidroxis, surfactantes .

Las composiciones de algunas modalidades de la presente invención se pueden bioconjugar con polietilenglicol (por ejemplo PEG, SE-PEG) que conserva la estabilidad (por ejemplo, contra actividades de proteasa) y/o solubilidad (por ejemplo, dentro de un fluido biológico tal como sangre, fluido digestivo) de los ingredientes activos (por ejemplo Eritropoyetina) mientras que conserva su actividad biológica y prolonga su vida media.

Será apreciado que las composiciones de la presente invención se puede utilizar en combinación con otras terapias actualmente practicadas para el trasplante de célula grasa como, sin ser limitado a, el tratamiento del sujeto con factores de crecimiento, trasplante de las células grasas sobre estructuras o trasplantes de las células grasas sobre cuentas de poliéster.

Como es mencionado, las células grasas de la presente invención se pueden derivar de ya sea fuentes autologas o de fuentes no autologas (por ejemplos alogenéicas o xenogeneicas ) . Puesto que las células no autologas son probables que induzcan una reacción inmune cuando se administran al cuerpo varios procedimientos se ha desarrollado para reducir la probabilidad de rechazo de células no autologas. Estos incluyen ya sea suprimir el sistema inmune del recipiente o encapsular las células o tejidos no autólogos en membranas de inmunoaislamiento, semipermeables antes del trasplante.

Las técnicas de encapsulación generalmente se clasifican como microencapsulación, involucran vehículos esféricos pequeños y macroencapsulación, que involucra membranas de lámina plana más grandes y de fibra hueca (Uludag, H. y colaboradores, Technology of mammalian cell encapsulation. Adv Drug Deliv Rev. 2000; 42: 29-64).

Métodos para preparar microcápsulas son conocidos en las técnicas e incluyen por ejemplo aquellos divulgados por Lu MZ, y colaboradores, Cell encapsulation ith alginate y alpha-phenoxycinnamylidene-acetylated poly (allylamine) . Biotechnol Bioeng. 2000, 70: 479-83, Chang TM and Prakash S. Procedures for microencapsulation of enzymes, cells and genetically engineered microorganisms . Mol Biotechnol. 2001, 17: 249-60, y Lu MZ,. y colaboradores,, A novel cell encapsulation method using photosensitive poly (allylamine alpha-cyanocinnamylideneacetate) . J Microencapsul . 2000, 17: 245-51.

Por ejemplo, las microcápsulas se preparan al formar en complejo el colágeno modificado con una cubierta de ter-polímero de metilacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA) , ácido metacrílico (MAA) y metacrilato de metilo (MMA) , dando por resultado un espesor de capsulas de 2-5 µ?t?. Tales microcápsulas además pueden ser encapsuladas con cubiertas de ter-polímero 2-5 µp? adicionales con el fin de impartir una superficie lisa negativamente cargada y para minimizar la absorción de proteína en el plasma (Chía, S.M. y colaboradores, Multi-layered microcapsules for cell encapsulation Biomaterials . 2002 23: 849-56).

Otras microcápsulas se basan en alginato, un polisacárido marino (Sambanis, A. Encapsulated islets in diabetes treatment. Diabetes Thechnol. Ther. 2003, 5: 665-8) o sus derivados. Por ejemplo, las microcápsulas se pueden preparar mediante la formación en complejos de polielectrolito entre los polianiones de alginato de sodio y sulfato de celulosa de sodio con el clorhidrato de policatión de poli (metilen-co-guanidina) en la presencia de cloruro de calcio .

Será apreciado que la encapsulacion de la célula se mejora cuando se utilizan cápsulas más pequeñas. Asi, el control de calidad, estabilidad mecánica, propiedades de difusión y actividades in vitro de células encapsuladas se mejora cuando el tamaño de cápsula se redujo de 1 mm a 400 µp? (Canaple L. y colaboradores, Improving cell encapsulation through size control. J Biomater Sci Polym Ed. 2002; 13: 783-96) . Las biocápsulas nanoporosas con tamaño de poro bien controlado tan pequeño como 7 nm, ajustado a las químicas de superficie y microarquitecturas precisas se encontraron que inmunoaislan exitosamente los microambientes para las células (Williams D. Small is beautiful: microparticle y nanoparticle technology in medical devices. Med Device Technol. 1999, 10: 6-9; Desai, T.A. Microfabrication technology for pancreatic cell encapsulation. Expert Opin Biol Ther. 2002, 2: 633-46) .

Como es mencionado en lo anterior, con el fin de facilitar el injerto de células grasas no autólogas, el método de la presente invención además ventajosamente puede comprender el acondicionamiento de sujeto con régimen inmunosupresor antes de, concomitantemente con, o después del trasplante de las células grasas.

De acuerdo con una modalidad especifica, los métodos de la presente invención requieren un régimen inmunosupresor reducido como es comparado con un sujeto no tratado con Eritropoyetina .

Ejemplos de tipos adecuados de regímenes inmunosupresores incluyen administración de fármacos inmunosupresores y/o irradiación inmunosupresora.

Amplia guía para seleccionar y administrar regímenes inmunosupresores adecuados para el trasplante se proporcionan en la literatura de la técnica (por ejemplo, referirse a: Kirkpatrick CH. and Rowlands DT Jr., 1992. JAMA. 268, 2952; Higgins RM. y colaboradores, 1996. Lancet 348, 1208; Suthanthiran . and Strom TB., 1996. New Engl. J. Med. 331, 365; idthun DE. y colaboradores, 1997. Mayo Clin Proc. 72, 175; Morrison VA. y colaboradores,, 1994. Am J Med. 97, 14; Hanto D ., 1995. Annu Rev Med. 46, 381; Senderowicz AM. y colaboradores, 1997. Ann Intern Med. 126, 882; Vincenti F. y colaboradores, 1998. New Engl. J. Med. 338, 161; Danta! J. y colaboradores, 1998. Lancet 351, 623).

De preferencia, el régimen inmunosupresor consiste de la administración de por lo menos un agente inmunosupresor al sujeto.

Ejemplos de agentes inmunosupresores incluyen, pero no están limitados a, metotrexato, ciclofosfamida, ciclosporina, ciclosporina A, cloroquina, hidroxicloroquina, sulfasalazina ( sulfasalazopirina) , sales de oro, D-penicilamina, leflunomida, azatioprina, anaquinra, infliximab (REMICADE) , etanercept, bloqueadores de TNF.alfa. Un agente biológico que se dirige a una citoquina inflamatoria, Fármaco Antiinflamatorio no Esteroidal (NSAIDs) . Ejemplos de NSAIDs incluye, pero no están limitados a ácido acetil salicilico, salicilato de magnesio de colina, diflunisal, salicilato de magnesio, salsalato, salicilato de sodio, diclofenaco, etodolaco, fenoprofen, flurbiprofen, indometacina, cetoprofen, cetorolac, meclofenamato, naproxeno, nabumetona, fenilbutazona, piroxicam, sulindac, tolmetin, acetaminofen, ibuprofen, inhibidores de Cox-2 y tramadol . Estos agentes se pueden administrar individualmente o en combinación.

De acuerdo con otra modalidad, los métodos de la presente invención requieren un tratamiento antiinflamatorio reducido [por ejemplo, fármacos antiinflamatorios tales como esteroides, fármacos antiinflamatorios no esteroidales o derivados antiinflamatorios inmune selectivos (ImSAIDs)], como es comparado con un sujeto no tratado con Eritropoyetina .

Como se utiliza en la presente, el término "aproximadamente" se refiere a ± 10 %.

Los términos "comprende", "que comprende", "que incluye", "que tiene" y sus conjugados significan "que incluye pero no limitado a".

El término "que consiste de" significa "que incluye y limitado a".

El término "que consiste esencialmente de" significa que la composición, método o estructura puede incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero solamente si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición, método o estructura reclamada.

Como se utiliza en la presente, la forma singular "un" "uno" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente lo dicte de otra manera. Por ejemplo, el término "un compuesto" o "por lo menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.

Por todo esta solicitud, varias modalidades de esta invención se pueden presentar en un formato de intervalo. Se debe entender que la descripción en formato de intervalo es meramente para conveniencia y brevedad y no debe ser considerado como una limitación inflexible sobre el alcance la invención. Por consiguiente, la descripción del intervalo debe ser considerado que tiene divulgado específicamente todos los subintervalos posibles así como valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 debe ser considerado que tiene específicamente divulgado los subintervalos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Esto aplica sin considerar el ancho del intervalo.

Cada vez que un intervalo numérico se indica en la presente, este se propone para incluir cualquier número citado (fraccionario o entero) dentro del intervalo indicado. Las frases "que varía/varía entre" un primer número indicado y un segundo número indicado y "que varía/varía de" un primer número indicado a" un segundo número indicado se utiliza en la presente intercambiablemente y se propone para incluir el primero y el segundo números indicados y todos los números fraccionarios y enteros entre los mismos.

Como se utiliza en la presente, el término "método" se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos para realizar una tarea dada incluyendo, pero no limitado a, aquellas maneras, medios, técnicas y procedimientos ya sea conocidos, o fácilmente desarrollados de maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos por los profesionales de las técnicas químicas, farmacológicas, bioquímicas y médicas.

Como se utiliza en la presente, el término "tratamiento" incluye la anulación, sustancialmente inhibición, o hacer lento o revertir la progresión de una condición, sustancialmente mejorar los síntomas clínicos o estéticos de una condición o sustancialmente prevenir la aparición de síntomas clínicos o estéticos de una condición.

Se aprecia que ciertas características de la invención, que son, por claridad, descritas en el contexto de modalidades separadas, también se pueden proporcionar en combinaciones en una sola modalidad. A la inversa, varias características de la invención, que son, por brevedad, descritas en el contexto de una sola modalidad, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada o como sea adecuado en cualquier otra modalidad adecuada a la invención. Ciertas características descritas en el contexto de varias modalidades no se van a considerar características esenciales de esas modalidades, a menos que la modalidad sea inoperante sin esos elementos.

Varias modalidades y aspectos de la presente invención como son delineados anteriormente en la presente y como son reclamados en la sección de reivindicaciones enseguida encuentran apoyo experimental en los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS La referencia ahora se hace a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores, ilustran la invención en un aspecto no limitante.

Generalmente, la nomenclatura utilizada en la presente y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de DNA recombinantes . Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook y colaboradores, (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel y colaboradores, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley y Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide a Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988) ; Watson y colaboradores, "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren y colaboradores, (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologías como se exponen en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E . , ed. (1994); Stites y colaboradores, (eds), "Basic y Clinical Immunology" (8th Edition) , Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); ishell and Shiigi (eds) , "Selected ethods in Cellular Immunology", w. H. Freeman y Co., New York (1980); inmunoensayos disponibles se describen extensivamente en la literatura de Patentes y Científica, ver, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J. , ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translatxon" Hames, B. D . , y Higgins S. J. , Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells y Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide a Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide a Methods and Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak y colaboradores, "Strategies for Protein Purification y Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todas las cuales se incorporan por referencia como si se expusieran completamente en la presente. Otras referencias generales se proporcionan por todo este documento. Los procedimientos en los mismos se cree que son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para la conveniencia del lector. Toda la información contenida en los mismos se incorpora en la presente por referencia.

EJEMPLO 1 Comparación entre el tratamiento con EFO de baja dosis, EPO de alta dosis y con VEGF en el peso y volumen de injertos de grasa MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Aislamiento y Preparación del Tejido Graso Humano La grasa se recolectó del muslo de una mujer de 40 años de edad mediante la lipectomia asistida con succión bajo anestesia general. La grasa se aspiró bajo anestesia local utilizando una cánula despuntada de calibre 14, y luego se procesó bajo condiciones estériles para el injerto subsecuente en ratones desnudos dentro de dos horas de su recolección de acuerdo con los protocolos previamente publicados [Ullmann y colaboradores, (2005) Dermatol Surg 31:1304-7; Kurita y colaboradores, (2008) Plast Reconstr Surg 121:1033-1041] .

Diseño del Estudio Dos estudios de animales diferentes se condujeron en la presente.

El primer estudio comprendió 30 ratones desnudos CD-1 hembras de siete semanas de edad (Harían, Jerusalem, Israel). Estos ratones se alojaron en jaulas en un cuarto con un ciclo de luz/obscuridad de 12-h artificial a un intervalo de temperatura constante (24 ± 2 °C) y humedad relativa (55 ± 10) . Los ratones se aclimataron durante una semana antes del estudio, y se alimentaron con una comida de laboratorio estándar y agua ad libitum. Los 30 ratones se dividieron aleatoriamente en tres grupos iguales y se trataron como sigue: los ratones del grupo 1 se inyectaron con 1 mi de grasa humana y se trataron con PBS estéril (grupo de control) . Los ratones del grupo 2 se inyectaron con 1 mi de grasa humana y se trataron con 1000 IU/kg de EPO (grupo de EPO de baja dosis). Los ratones del grupo 3 se inyectaron con 1 mi de grasa humana y se trataron con 5000 IU/kg de EPO (grupo de EPO de alta dosis) . La grasa se inyectó subcutáneamente en el cuero cabelludo utilizando una aguja 14G mientras que los animales se restringieron manualmente. Inmediatamente después del trasplante de grasa, los injertos de grasa tratados con PBS se inyectaron con 100 µ? de PBS (grupo de control) y los injertos de grasa tratados con EPO se inyectaron con ya sea 20 IU EPO/100 µ? de PBS (grupo de EPO de baja dosis) o 100 IU de EPO/100 µ? de PBS (grupo de EPO de alta dosis) cada tres días durante 18 días (un total de 6 inyecciones). La EPO se compró como una ampolleta de inyección (ARANESP®, Amgen AG, Zug, Suiza) que contuvo 150 g/ml (18,000 IU) de EPO.

El segundo estudio de animales comprendió 20 ratones desnudos CD-1 hembras de siete semanas de edad, y difirieron del primer estudio en que la grasa se trató con VEGF (2 µ?/p??, Sigma Aldrich, MO, USA) después del implante. 10 ratones se inyectaron con grasa seguido por inyecciones de 200 ng de VEGF/100 µ? de PBS cada tres días para un total de 18 días. Los 10 ratones restantes constituyeron un segundo grupo de control que se trató de una manera idéntica al grupo de control en el primer estudio. Analgésicos y antibióticos post operativos no se administraron a los ratones en los dos experimentos .

Seguimiento y Recolección de Datos La duración del período de estudio de ambos experimentos fue de 15 semanas desde el inicio del trasplante de grasa. Durante este período, cada ratón se pesó; una muestra de sangre de la vena de la cola se recolectó para la determinación del conteo de glóbulos rojos, conteo leucocitos y conteo de plaquetas; y para la medición de hemoglobina en el plasma, VEGF y concentraciones de EPO. Estas mediciones se llevaron a cabo en tres ocasiones diferentes: el día de la inyección de grasa, 18 días después de la inyección de grasa y al final del período de estudio. Las concentraciones de VEGF y EPO se determinaron en materiales homogenizados de muestra de los injertos de grasa utilizando ensayos inmunosorbentes enlazados a enzima comerciales (equipo de inmunoensayo de VEGF Quantikine y Equipo de Eritropoyetina Quantikine® IVD®, R&D Systems, N, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Después de 15 semanas, todos los ratones se sacrificaron humanamente y los injertos de grasa se disectaron cuidadosamente de su cuero cabelludo (Figura 1C) . Cada injerto de grasa se pesó y el volumen de injerto de grasa se midió mediante el método de sobreflujo de liquido como es descrito previamente [Ayhan y colaboradores, (2001) Aesthetic Plast Surg 25:338-342]. Después de la determinación del peso y el volumen, cada injerto de grasa se dividió en dos porciones desde la parte media. Una porción se almacenó a -80 °C para la determinación posterior de concentraciones de EPO, contenido de VEGF, el grado de apoptosis, y los niveles de expresión de los factores angiogénicos, específicamente de bFGF, factor-1 de crecimiento de insulina (IGF-1), PDGF-BB, receptor-2 de VEGF (VEGFR-2), receptor de EPO (EPOR) y MMP-2, el factor de supervivencia PKB y PKB fosforilada, y los factores pro-apoptóticos, específicamente caspasa 3 y citocromo c. La segunda porción se colocó en formalina al 4 % y se utilizó para la determinación de la infiltración de macrófagos, densidad microvascular (MVD) , localización se VEGFR-2 y EPOR y para el examen histológico.

Análisis Estadístico de los Datos Los datos para cada parámetro de estudio de los injertos de grasa tratados con PBS, VEGF o EPO de cada grupo de tratamiento se agruparon, y los resultados se presentaron como media ± desviación estándar (SD) . Los datos exhibieron una distribución normal mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Los datos del primer experimento se analizaron mediante ANOVA y los datos del segundo experimento se analizaron mediante una prueba del Estudiante, utilizando un programa de software estadístico computarizado (Prism versión 5.0, Software GraphPad, Inc, CA, USA). Las diferencias se consideraron estadísticamente significantes cuando P < 0.05. Los valores de kappa para la repetibilidad del intra-examinador de las evaluaciones ciegas de análisis histológicos, MVD, y formación de tubo en matrigel fueron 0.94, 0.89 y 0.93, respectivamente.

RESULTADOS Todos los ratones en todos los grupos de tratamiento en ambos experimentos completaron el período de estudio de 15 semanas. Ellos aparecieron para estar sanos durante el curso del estudio y no hubo evidencia de caquexia al final del período de estudio. No hubo cambio significantes en los conteos de glóbulos rojos, conteos de leucocitos, conteo de plaquetas, concentraciones de hemoglobina y EPO en el plasma en ratones con ya sea injertos de grasa tratados con solución salina reguladora (PBS) o tratados con EPO de baja dosis (Tabla 1, enseguida) . Los conteos de glóbulos rojos, conteo de leucocitos, conteo de plaquetas y concentraciones de EPO en el plasma, pero no las concentraciones de hemoglobina en el plasma, se incrementaron significantemente en los ratones tratados con injertos de grasa tratados con EPO de alta dosis (Tabla 1, enseguida) . Dieciocho días después del trasplante, las concentraciones de VEGF en el plasma se incrementaron significantemente dos grupos de ratones con injertos de grasa tratados con EPO . Al final del periodo de estudio de 15 semanas, las concentraciones de VEGF en el plasma en los dos grupos de ratones con injertos tratados con EPO no fueron significantemente diferentes de los valores de linea de base y aquellos en ratones con injertos de grasa tratados con PBS. Al final del periodo de estudio de 15 semanas, las concentraciones de EPO en los injertos tratados con PBS y con EPO no fueron diferentes de los valores de linea de base, sin embargo, 18 días después de la inyección de grasa ambos de los valores de EPO y VEGF fueron significantemente más altos en ambos de los grupos del tratamiento de baja EPO y alta EPO (Tabla 1, enseguida) .

Tabla 1 : Efecto del tratamiento de EPO en el peso corporal , hematología, concentraciones de EPO en el plasma y en el te ido Control EPO de baja EPO de Alta (n=10) Dosis Dosis (n=10) (n=10) Peso de los 26.7±1.1 25.9+1.1 26.2±1.0 ratones inicial Después del 27.3±1.1 27.9±1.1 28.6±1.2 tratamiento con EPO En la semana 15 28.3±1.1 28.8+1.1 29.0+1.2 Conteo de RBC 7.8+0.9 8.0±1.0 7.9±1.2 inicial (106/mm3) Después del 7.9+0.9 8.0+1.1 8.9±1.0* tratamiento con EPO En la semana 15 7.8±0.9 7.9±1.0 8.1±1.2 Conteo de 10.8±1.2 ll.lil.l 10.9+1.2 leucocitos inicial (lOVmm3) Después del 11.2±1.2 11.4±1.1 13.1±1.3 tratamiento con EPO En la semana 15 11.0+1.1 10.8+1.1 11.4±1.2 Conteo de 593+54 609±63 603+72 plaquetas inicial (103/L) Después del 579+58 621±68 741+81** tratamiento con EPO En la semana 15 593±54 601±57 597164 Concentraciones 14.4+1.3 15.111.4 15.511.4 de hemoglobina iniciales /g/dl) Después del 14.8+1.3 15.711.4 16.4+1.6 tratamiento con EPO En la semana 15 14.811.2 15.111.6 14.911.5 Concentraciones 14.3+1.9 14.611.3 14.2+1.7 de EPO en el plasma inicial (mU/mli) Después del 13.7+1.4 17.6+3.3* 46.7+8.7*** tratamiento con EPO La semana 15 14.3+1.7 14.2+1.3 14.1+1.3 Concentraciones 38.6+3.9 34.8+4.6 39.2+4.8 de VEGF en el plasma inicial (pg/mL) .

Después del 37.1+3.8 51.5+6.6* 8719.2*** tratamiento con EPO En la semana 15 38.0+3.3 36.6+4.9 37.4±5.3 Concentraciones 0.3±0.1 0.3±0.1 0.3±0.1 de EPO en el tejido (mU/mL) Como es notable: los valores se presentan como media + SD; n = número de ratones; RBC = glóbulos rojos; EPO = Eritropoyetina; VEGF = factor de crecimiento endotelial vascular. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 y es la diferencia entre ya sea los injertos tratados con baja dosis o alta dosis de EPO y los injertos tratados con PBS Además, al final del período de estudio de 15 semanas una protuberancia subcutánea bien definida se observó en el cuero cabelludo de cada ratón (Figuras 1A-C) . Los pesos y volúmenes de los injertos tratados con EPO fueron más altos que aquellos de los injertos tratados con PBS (Tabla 2, enseguida). Los pesos y volúmenes de los injertos de grasa tratados con PBS en el primer experimento no fueron diferentes de aquellos en los injertos tratados con PBS y VEGF en el segundo experimento (Tabla 2, enseguida) .

Tabla 2 : Efecto del tratamiento de EPO sobre el peso y volumen del injerto de grasa Como es notable: Los valores se presentan como media + SD n = número de ratones EPO = Eritropoyetina VEGF = factor de crecimiento endotelial vascular **P<0.01, ***P<0..001, y es el significado de la diferencia entre ya sea los injertos de grasa tratados con EPO de baja dosis o de alta dosis y los injertos tratados con PBS.

EJEMPLO 2 Evaluación histológica de los injertos de grasa y el efecto de EPO sobre la respuesta inflamatoria en injertos de grasa MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Aislamiento y Preparación de Tejido Graso Humano Como es Descrito en el Ejemplo 1, anteriormente en la presente.

Diseño del Estudio Como es descrito en el Ejemplo, anteriormente en la presente .

Análisis Histológico Platinas histológicas de las muestras mantenidas en formalina se prepararon y luego se mancharon con hematoxilina y eosina utilizando procedimientos estándares. La inmunohistoquímica se realizó utilizando anticuerpos monoclonales de conejo contra CD31, VEGFR-2 y EPOR de tejido, e IgG policlonal de cabra contra VEGF (R&D Systems, Minneapolis MN, USA) , y CD68 (Dako, Glostrup, Dinamarca) . Las secciones de injerto de grasa incrustadas en parafina se incubaron con los anticuerpos durante la noche a temperatura ambiente seguido por la incubación con anticuerpos secundarios apropiados [Li y colaboradores, (2005) J Cell Biochem 95: 559-570]. En la terminación de las incubaciones, las muestras se contramancharon con hematoxilina. El IgG de ratón se utilizó como un control negativo. Las platinas se examinaron bajo un microscopio del luz para (a) el grado de integración, como es evidenciado por el grado de organización de células grasas intactas y nucleadas, (b) el grado de fibrosis, como es evidenciado por la cantidad de colágeno y fibrilas elásticas, (c) la presencia de quistes y vacuolas, y (d) la intensidad de la respuesta inflamatoria, como es evidenciado por el grado de infiltración de linfocitos y macrófagos. Cada criterio se graduó en una escala de 0 a 5 donde 0 = ausencia, 1 = presencia mínima, 2 = presencia mínima moderada, 3 = presencia moderada, 4 = presencia moderada extensiva y 5 = presencia extensiva.

La cuantificación de la infiltración de macrófagos en los injertos de grasa se estimó al contar el número de células CD68 positivas en cinco campos por injerto de grasa en todas las secciones de injerto de grasa. La densidad microvascular (MVD) en injertos de grasa se determinó en cinco regiones de interés donde la señal de anticuerpo CD31 fue la más intensa en cada sección en todas las secciones de injerto de grasa. El número de macrofagos y vasos sanguíneos en cada región se contó bajo un microscopio de luz en amplificación de 400 x. La estimación en cada injerto de grasa se hizo al calcular el resultado medio en dos secciones diferentes por injerto de grasa y cinco campos diferentes de visión por sección.

RESULTADOS Los criterios histológicos en los injertos de grasa tratados con PBS del primer experimento no fueron diferentes de aquellos en el segundo experimento. El grado de integración fue más alto en los injertos tratados con EPO de alta dosis comparados con los injertos tratados con EPO de baja dosis o tratados con PBS, mientras que, el grado de formación de quiste y fibrosis fue menor en los injertos tratados con EPO de alta dosis comparado con los injertos tratados con EPO de baja dosis o tratados con PBS ( Figuras 2A-C) . La severidad de la respuesta inflamatoria como es evidenciada por la infiltración de células CD68 positivas en injertos de grasa en tanto los injertos de grasa tratados con EPO de baja dosis como de alta dosis fue menor que aquella en los injertos de grasa tratados con PBS (Figuras 2D-F y 23) . La severidad de la respuesta inflamatoria en los injertos tratados con EPO de alta dosis que es significantemente menor que aquella de los injertos tratados con EPO de baja dosis (Figuras 2A-C) . El grado de integración, formación de quiste y fibrosis en los injertos tratados con VEGF no fue diferente de aquellos en los injertos tratados con PBS. Sin embargo, la intensidad de la respuesta inflamatoria en los injertos de grasa tratados con VEGF fue significantemente más alta que aquella observada en los injertos de grasa tratados con PBS (Tabla 3, enseguida) .

Tabla 3: Análisis histológico de los injertos de grasa disectados Como es notable: Los valores se presentan como media i SD n = número de ratones EPO = Eritropoyetina VEGF = factor de crecimiento endotelial vascular **P<0.01, ***P<0.001, y es el significado de la diferencia entre ya sea los injertos de grasa tratados con EPO de baja dosis o de alta dosis y los injertos tratados con PBS .

EJEMPLO 3 El efecto de EPO sobre la densidad microvascular en los injertos de grasa M TERIALES y PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Aislamiento y Preparación de Tejido Graso Humano Como es descrito en el Ejemplos 1, anteriormente en la presente.

Diseño del Estudio Como es descrito en el Ejemplos 1, anteriormente en la presente.

Estimación de la densidad microvascular (MVD) Las secciones de injerto de grasa incrustadas en parafina se incubaron durante la noche a temperatura ambiente con un anticuerpo monoclonal contra CD31 de tejido (R&D Systems, Minneapolis MN, USA) como es descrito previamente [Li y colaboradores,' (2005) J Cell Biochem 95:559-570]. En la terminación de la incubación, las muestras se contramancharon con hematoxilina . IgG de ratón se utilizó como un control negativo. La densidad microvascular (MVD) se determinó en cinco regiones de interés donde la señal de anticuerpos CD31 fue más intensa. El número de vasos sanguíneos en cada región se contó bajo un microscopio de luz en amplificación de 40 x.

RESULTADOS Como se representa en las Figuras 2G-I y 2K, las densidades microvasculares ( VDs) en los dos injertos de grasa tratados con EPO fueron significantemente más altas que aquellas del injerto de grasa tratado con PBS y el efecto de EPO sobre MVD fue dependiente de la dosis. Hubo áreas avasculares, vasos ectáticos con edema y hemorragia perivascular, y una reducción marcada en la ramificación capilar en los injertos de grasa tratados con PBS. En los injertos tratados con EPO, hubo áreas bien vascularizadas con expresión incrementada de CD31, y numerosas isletas endoteliales (Figuras 2G-I y 2K) . El grado de MVD se correlacionó negativamente con el grado de infiltración de macrófagos en los injertos de grasa (Figura 2L) .

EJEMPLO 4 El efecto de EPO sobre el contenido de VEGF y sobre los niveles de expresión de factores angiegénicos y PKB en los injertos de grasa MATERIALES y PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Aislamiento y Preparación de Tejido Graso Humano Como es descrito en el Ejemplo 1, anteriormente en la presente.

Diseño del Estudio Como es descrito en el Ejemplo 1, anteriormente en la presente.

Manchado de Western Los niveles de expresión de los factores angiogénicos, bFGF, IGF-1, PDGF-BB VEGFR-2, EPOR y MMP-2, el factor de supervivencia celular PKB y PKB fosforilada, y los factores pro-apoptóticos caspasa 3 y citocromo c se determinaron en materiales homogenados de los injertos de grasa recolectados mediante el manchado de Western. Brevemente, los materiales homogenizados de muestras de los injertos de grasa se lisaron en solución reguladora RIPA (R&D Systems, MN, USA) . Un alícuota de 40 iq de cada lisado se cargó sobre SDS-PAGE, y luego se transfirió sobre membrana de nitrocelulosa . Las membranas luego se incubaron con anticuerpos monoclonales contra bFGF, IGF-1, PDGF-BB, MMP-2, PKB, fosfoPKB, caspasa 3, y citocromo c (todos comprados de Santa Cruz, CA, USA) , o con anticuerpos monoclonales contra VEGFR-2 y EPOR (R&D systems) , antes de una segunda incubación con un anticuerpo secundario IgG conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) . Un anticuerpo contra ß-actina (Santa Cruz) se utilizó para normalizar la carga de proteína. Las bandas resultantes se cuantificaron mediante la densitometría .

RESULTADOS El contenido de VEGF en los injertos de grasa tratados con EPO de baja dosis y de alta dosis fue significantemente más alto comparado con los injertos de grasa tratados con PBS. El contenido de VEGF en los injertos tratados con EPO de alta dosis fue significantemente más alto que en aquel en el injerto tratado con EPO de baja dosis (Figuras 3A-C y 4A) . El tratamiento con EPO condujo a un incremento dependiente de la dosis en los niveles de expresión de bFGF, IGF-1, PDGF-BB, MMP-2 PKB y fosfoPKB (Figura 3J) . Además, EPO incrementó ambas de las expresiones de VEGFR-2 y EPOR de tejido de una manera dependiente de dosis, como es evidenciado por la localización inmunohistoquimica de ambos factores (Figuras 3D-I) y mediante el análisis de manchado de western (Figura 4B-C) . El contenido de VEGF y los niveles de expresión medios de tanto VEGFR-2 como EPOR se correlacionaron positivamente con VD (Figuras 4D-F) .

EJEMPLO 5 El efecto de EPO sobre el grado de apoptosis en los injertos de grasa MATERIALES y PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Aislamiento y Preparación del Tejido Graso Humano Como es descrito en el Ejemplo 1, anteriormente en la presente.

Diseño del Estudio Como es descrito en el Ejemplo 1, anteriormente en la presente.

Determinación del Grado de Apoptosis en los Injertos de Grasa El grado de apoptosis de todos los injertos de grasa se estimó mediante el ensayo de etiquetacion de extremo de muesca de trifosfato de deoxiuridina terminal (TUNEL) utilizando un equipo comercial (Equipo de Fluoresceina ApopTag® Plus, CHEMICON, CA, USA) , de acuerdo con instrucciones del fabricante. Se llevaron a cabo duplicados para cada muestra y se procesaron mediante la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS, Becton Dickinson, NJ, USA) . Los datos se analizaron utilizando el programa de software Macintosh CELLQuest (Becton Dickinson) .

RESULTADOS El grado de apoptosis en los injertos de grasa tratados con PBS fue más grande que aquel observado en los injertos de grasa tratados con EPO de baja dosis y alta dosis (Figura 5A) . El grado de apoptosis en los injertos de grasa tratados con EPO de alta dosis fue significantemente menor que aquel observado en el injerto tratado con EPO de baja dosis (Figura 5A) . Además, EPO condujo a una disminución dependiente de dosis en los niveles de expresión de caspasa 3 y citocromo c (Figura 5B) .

EJEMPLO 6 El efecto de VEGF sobre la densidad microvascular (MVD) y sobre el grado de apoptosis en los injertos de grasa MATERIALES y PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Aislamiento y Preparación del Tejido Graso Hvmano, Como es descrito en el Ejemplo 1, anteriormente en la presente.

Diserto del Estudio Como es descrito en el Ejemplo 1, anteriormente en la presente.

Estimación de MVD Como es descrito en el Ejemplo 3, anteriormente en la presente Determinación del Grado de Apoptosis en los Injertos de Grasa Como es descrito en el Ejemplo 5, anteriormente en la presente RESULTADOS La MVD y el grado de apoptosis en los injertos de grasa tratados con PBS en el primer experimento fueron similares a aquellos en el segundo experimento. La MVD y el contenido de VEGF en los injertos de grasa tratados con VEGF fueron más altos que, pero no estadísticamente diferentes de, aquellos en los injertos de grasa tratados con PBS (Figuras 6A-B) . Además, hubo formación de vaso no organizado y hemorragia perivascular en los injertos de grasa tratados con VEGF (datos no mostrados) . El grado de apoptosis en los injertos de grasa tratados con VEGF fue más grande que aquel en los injertos de grasa tratados con PBS (Figura 6C) . No hubo diferencias estadísticas en los niveles de expresión de caspasa 3 y citocromo c en los injertos de grasa tratados con PBS y tratados con VEGF (Figura 6D) .

EJEMPLO 7 El efecto de EPO sobre la formación de tubo de célula endotelial sobre matrlgel MATERIALES y PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Aislamiento y preparación del tejido graso humano Como es descrito en el Ejemplo 1, anteriormente en la presente.

Diseño del Estudio Como es descrito en el Ejemplo 1, anteriormente en la presente.

Formación de Tubo In vitro de las HUVECs sobre Matrigel El potencial angiogénico in vitro de VEGF y EPO se midió mediante la estimación de su habilidad para formar tubos de células endoteliales sobre matrigel. Con este fin, células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs, LONZA, USA) primero se cultivaron sobre placas de 6 cavidades recubiertas de fibronectina en el medio basal endotelial-2 (EBM-2 , PromoCell, USA) hasta la confluencia y luego las células se trataron con 0, 20 o 100 IU/ml de EPO durante 48 horas antes de su uso en el ensayo (Figura 7A) . En un segundo experimento (Figura 7B) , las HUVECs se expusieron a 0, 100 IU/ml EPO o 200 ng/ml de VEGF durante 48 horas en EBM-2 con o sin 0.25 mg/ml de bevacizumab (Avastin®, Genentech, San Francisco, CA, USA) , un anticuerpo monoclonal humanizado que antagoniza las acciones de VEGF. Después de 48 horas, las HUVECs, no tratadas, las HUVECs tratadas con VEGF y EPO, y las HUVECs tratadas con VEGF+bevacizumab y con EPO+bevacizumab se desunieron suavemente mediante tripsina al 0.5 /EDTA, y luego se suspendieron en EBM-2. Al mismo tiempo. El matrigel congelado (Sigma Aldrich, St Louis MO, USA) se descongeló, y se extendió sobre placas de 96 cavidades (40 µ?/cavidad) a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir la solidificación. Las HUVECs no tratadas desunidas, HUVECs tratadas con VEGF y EPO, y las HUVECs tratadas con VEGF+bevacizumab y con EPO+bevacizumab (5 x 104 células/150 µ? ???-2/cavidad) se colocaron sobre la superficie de matrigel, y luego se incubaron a 37 °C durante 24 horas en EBM-2. Después de la colocación sobre el matrigel, las HUVECs tratadas con VEGF y con EPO y las HUVECs tratadas con VEGF+bevacizumab y con EPO+bevacizumab se trataron nuevamente con concentraciones idénticas de EPO, VEGF, y bevacizumab, respectivamente. Después de 24 horas, las células no integradas se removieron mediante lavado y la formación de tubo sobre el matrigel se estimó bajo un microscopio de luz en amplificación de 10 x. La estructuras tubulares se graduaron semicuantitativamente al evaluar la presencia y etapa de formación de tubo en una escala de 0 a 5 como sigue: 0 = células individuales bien separadas, 1 = las células han comenzado a migrar y alinearse por si mismas, 2 = tubos capilares visibles y sin brote, 3 = brote visible de nuevos tubos capilares, 4 = formación temprana de polígono cerrados, 5 = desarrollo de estructuras complejas similares a malla. Cuatro campos de alta potencia aleatoria en cada muestra se examinaron. Los resultados de cada examinador luego se agruparon con el fin de calcular el valor medio para cada criterio para cada muestra en cada grupo.

Proliferación de HÜVEC Para investigar la angiogénesis inducida por EPO a través de mecanismos que involucran factores pro-angiogénicos, el presente inventor midió la proliferación de HUVECs tratadas con EPO en la presencia de varios inhibidores de factor pro-angiogénico . Con este fin, las HUVECs (2 x 105 células/cavidad) se cultivaron en placas de 12 cavidades recubiertas de fibronectina en EBM-2. Las HUVECs cultivadas se trataron con o sin 100 IU/ml de EPO durante 48 horas, y luego se expusieron durante 3 horas a (a) 0.25 mg/ml bevacizumab, (b) 100 nM de PD173074; un inhibidor de bFGF (Calbiochem, San Diego, CA) , (c) 20 µ? de tirfostina AG 1296; un inhibidor selectivo de PDGF (Sigma) , (d) una combinación de bevacizumab, PD173074 y tirfostina, y (e) 100 nM de ortmanina; un inhibidor de fosfatidilinositol 3-quinaza (PI 3-K) (Sigma) . En la terminación del experimento, las células se lavaron con PBS y luego se incubaron con 1 µ(?:?/p?1 del medio [3H] -timidina (NEN, Boston, MA, USA) durante 5 h a 37 °C. Después, 0.5 mi de ácido Tricloroacético al 10 % frío (TCA) se adicionó en cada cavidad durante otros 30 min a 4 °C. Para extraer el DNA, marcado con 3H-timidina, 0.5 mi de NaOH 1N se adicionó a cada cavidad durante 10 minutos a temperatura ambiente, y luego 0.5 mi de HC1 1N se adicionó y se mezcló bien. Las muestras de solución de mezcla (0.5 mi) se tomaron de cada cavidad y se adicionaron a frasquitos de centelleó para la medición de la incorporación de [3H]-timidina al DNA (cpm/mg de proteina) . Los conteos de células duplicados se promediaron para 3 experimentos. Los datos se expresaron como el porcentaje de control.

RESULTADOS Como es descrito en la Figura 7A, EPO aumentó la formación de tubo de célula endotelial de vena umbilical humana (HUVEC) en una manera dependiente de dosis. Además, tanto VEGF como EPO significantemente aumentaron la formación de tubo de HUVEC (Figura 7B) . La formación de tubo se redujo sustancialmente en las HUVECs tratadas con VEGF + bevacizumab, pero no en las HUVECs tratadas con EPO + bevacizumab (Figuras 7B-H) .

El inhibidor de VEGF, inhibidor de bFGF y el inhibidor de PDGF cada uno redujo la proliferación de HUVEC significantemente, mientras que ya sea una combinación de los 3 inhibidores conjuntamente o wortmanina sola anuló la proliferación de HUVEC (Figura 71) . EPO normalizó la proliferación de HUVEC en la presencia de cualquiera de los inhibidores, pero no tuvo efecto sobre la proliferación de HUVEC en la presencia de una combinación de los 3 inhibidores conjuntamente o en la presencia de wortmanina sola (Figura 71) .

Aunque la invención se ha descrito en conjunción con modalidades especificas de la misma, es evidente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. Por consiguiente, se propone abarcar todas de tales alternativas, modificaciones y variaciones que caen dentro del espíritu y alcance amplio de las reivindicaciones adjuntas.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación se incorporan en la presente en su totalidad en la especificación, al mismo grado como si cada publicación individual, patente o solicitud de patente fuera específicamente e individualmente indicada que es incorporada en la presente por referencia.

Además, la cita o identificación de cualquier referencia en esta solicitud no debe ser considerada como una admisión de que tal referencia está disponible como la técnica previa para la presente invención. Al grado que se utilizan encabezados de sección, ellos no se deben considerar como necesariamente limitantes.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Uso de Eritropoyetina para aumentar la supervivencia de célula grasa implantada en un sujeto en necesidad de la misma.

2. Uso de Eritropoyetina para aumentar la supervivencia de célula grasa.

3. Uso de Eritropoyetina para tratar un defecto de tejido blando.

4. El uso de conformidad con la reivindicación 1, 2 o 3, caracterizado porque se efectúa ex vivo.

5. El uso de conformidad con la reivindicación 1, 2 o 3, caracterizado porque se efectúa in vivo.

6. El uso de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el defecto de tejido blando se selecciona del grupo que consiste de una condición de la piel, un trastorno de la piel, una herida, una quemadura, un cáncer, una cirugía, una cirugía de reconstrucción, una depresión de la piel, una malformación congénita y una enfermedad adquirida.

7. El uso de conformidad con la reivindicación 1, 2 o 3, caracterizado porque la Eritropoyetina se administra directamente en las células grasas.

8. El uso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque una dosis de la Eritropoyetina es aproximadamente 1-1000 IU por inyección por 1,000,000 de células grasas.

9. El uso de conformidad con la reivindicación 1, 2 o 3, caracterizado porque la Eritropoyetina se formula para una administración sistémica.

10. El uso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque una dosis de la Eritropoyetina es aproximadamente 10-7500 IU por kg de peso corporal.

11. El uso de conformidad con la reivindicación 1, 2 o 3, caracterizado porque además comprende por lo menos un factor seleccionado del grupo que consiste de un componente de matriz extracelular, un factor de crecimiento, una hormona, un factor angiogénico, un factor de coagulación, una citoquina, una quimioquina, una enzima, un neurotransmisor, una vitamina, un carbohidrato, un ión, un agente quelante de hierro, un ácido graso, un antibiótico y un aminoácido.

12. El uso de conformidad con la reivindicación 1, 2 o 3, caracterizado porque la célula grasa comprende una célula no autóloga.

13. El uso de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la célula no autóloga es una célula alogéneica o una célula xenogenéica.

14. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una población de células grasas y Eritropoyetina .

15. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque además comprende por lo menos un factor seleccionado del grupo que consiste de un componente de matriz extracelular, un factor de crecimiento, una hormona, un factor angiogénico, un factor de coagulación, una citoquina, una quimioquina, una enzima, un neurotransmisor, una vitamina, un carbohidrato, un ión, un agente quelante de hierro, un ácido graso, un antibiótico y un aminoácido.

16. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque una dosis de la Eritropoyetina es aproximadamente 1-1000 IU por inyección por 1,000,000 de células grasas.