MX2012006196A - Plantas que se reproducen via gametos no reducidos. - Google Patents

Abstract

La invención describe un sistema, que incluye composiciones y métodos para hacer y utilizar plantas que se reproducen a través de gametos no reducidos.

Description

Plantas que se reproducen vía gametos no reducidos Antecedentes de la invención.

La mayoría de las plantas se reproducen de manera sexual. En la reproducción sexual, la fusión de los gametos masculino y femenino conduce a la formación de semillas que combinan rasgos maternos y paternos.

Si bien predomina la reproducción sexual, existen especies de plantas que se reproducen asexualmente por medio de semillas. Esta reproducción asexual, denominada apomixis, es un proceso de clonación natural por el cual el órgano reproductor femenino de una planta, el óvulo, es capaz de formar la porción embrionaria de semillas, sin que sea necesaria una contribución genética de los gametos masculinos. En particular, un óvulo de una planta apomíctica produce uno o más gametos femeninos no reducidos que se forman sin someterse a meiosis. En consecuencia, cada gameto femenino no reducido mantiene el genotipo somático de la planta madre cuando el gameto se incorpora a una semilla y, finalmente, se desarrolla para formar una planta hija que es un clon de la madre.

La inducción de apomixis en las plantas cultivadas, como los cereales comestibles, constituye uno de los retos más atractivos de la biotecnología agrícola. Actualmente, la mayoría de las semillas mejoradas comerciales son el resultado de un largo proceso de hibridación en el que ciertas plantas que presentan rasgos deseables son seleccionadas y cruzadas a fin de obtener semillas para un híbrido mejorado. Sin embargo, el valor agronómico del híbrido mejorado se mantiene sólo durante un ciclo de cultivo. La sexualidad natural del híbrido hace que la siguiente generación pierda muchas de las características deseables del híbrido a través de la separación de los rasgos genéticos. Como consecuencia de ello, los productores competitivos se ven obligados a comprar semillas año tras año, si quieren mantener un alto rendimiento.

La capacidad de generar variedades de plantas apomíctícas tendría enormes beneficios comerciales. Por ejemplo, la creación de híbridos mejorados que muestran una elevada tasa de apomixis puede, en algunos casos, permitir a los agricultores sembrar recurrentemente la semilla producida por el híbrido mejorado, manteniendo así el valor agronómico de la semilla por varias generaciones (y potencialmente, por tiempo indefinido). Además, al fijar genéticamente el valor agronómico de cualquier cultivo sexual, la capacidad de inducir la apomixis puede alentar a los criadores de plantas a desarrollar variedades de plantas a la medida adaptadas a condiciones ambientales específicas. Además, la inducción de la apomixis ofrece la posibilidad de eliminar el uso de técnicas de cultivo costosas asociadas con la reproducción vegetativa de plantas de cultivo (por ejemplo, patata, agave, fresa, entre otras). La capacidad de inducir la apomixis también puede permitir la conservación de plantas individuales con altos niveles de heterocignosis, como las especies vegetales que se encuentran en peligro de extinción.

Así pues, existe la necesidad de composiciones y métodos para forzar a las plantas a ejecutar uno o más de los pasos de la apomixis, tales como la formación de gametos femeninos no reducidos por una planta madre. La formación de gametos femeninos no reducidos debe evitar la pérdida de alelos deseables durante la reproducción a través de las semillas, porque la composición cromosómica somática (y por tanto, todos los alelos) de la planta madre se transmitiría a la próxima generación.

Breve descripción de la invención.

La presente divulgación presenta un sistema, incluyendo composiciones y métodos para criar y usar plantas que se reproducen vía gametos no reducidos.

Breve descripción de las figuras.

La figura 1 es un diagrama de flujo que ilustra la reproducción de una planta transgénica diploide que ha sido modificada para reducir la actividad de una vía endógena de un ARN pequeño génicamente silenciado, de tal manera que la planta forma gametos diploides femeninos no reducidos y poliploides, de acuerdo con aspectos de la presente divulgación. La figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra un método ejemplar para transmitir, al menos substancialmente completo, un conjunto somático de cromosomas a la siguiente generación de una planta a través de semillas, de acuerdo con los aspectos de la presente divulgación.

La figura 3 es una vista esquemática de un constructor ejemplar de ácido nucleico para promover la formación de gametos femeninos no reducidos en las plantas, de acuerdo con los aspectos de la presente divulgación.

Descripción detallada de la invención.

La presente divulgación proporciona un sistema, incluyendo composiciones y métodos, para criar y usar plantas que se reproducen a través de gametos no reducidos. La presente divulgación demuestra que los mutantes que perturban los ARN pequeños génicamente silenciados, como por ejemplo, las mutaciones en AG04, AG09, NRPD1 , NRPD2, RDR2, RDR6 ó SGS3, promueven la formación de gametos femeninos no reducidos que no han podido someterse a la meiosis. Los gametos no reducidos pueden formarse por medio de aposporía, un componente de reproducción asexual, a través de semillas existentes en especies de floración que producen muchos gametos femeninos no reducidos a partir de células somáticas en el óvulo. En consecuencia, la inducción epigenética de al menos un paso de la apomixis en una planta sexual puede obtenerse con un transgén que reduce específicamente la actividad de un ARN pequeño génicamente silenciado vía el tejido reproductivo (por ejemplo, los óvulos) de la planta. El proceso del pequeño ARN génicamente silenciado puede ser utilizado para atenuar por sí mismo la expresión inhibiendo específicamente al menos un componente del mecanismo de silenciamíento génico.

Se proporciona un ácido nucleico para la transformación de la planta. El ácido nucleico puede comprender un constructor que incluye una secuencia diana y una secuencia promotora operativamente acoplada a la secuencia diana. El constructor también puede comprender cualesquiera otras secuencias apropiadas, tales como al menos un marcador seleccionare adaptado para permitir el crecimiento selectivo de una planta célula/planta y/o una bacteria transportadora del ácido nucleico.

La secuencia diana puede codificar un ARN interferente para reducir específicamente la expresión de un componente de la vía del RNA pequeño génicamente silenciado en una planta. El componente, tal como AG09, puede (o no) ser naturalmente expresado específicamente en el tejido reproductivo de una planta, por ejemplo, en los óvulos, relativo al menos a la mayoría de los demás tejidos de la planta. El ARN interferente puede ser específicamente adaptado para reducir la expresión en una planta de un gene o polipéptido AG04, AG09, NRPD1 , NRPD2, RDR2, RDR6, ó SGS3, o la combinación de estos genes o polipéptidos, entre otros. La secuencia diana puede incluir una secuencia región, tal como una secuencia región de al menos veinte nucleótidos consecutivos, la cual confiere la inhibición de la expresión de un gen o polipéptido de una planta AG04, AG09, NRPD1 , NRPD2, RDR2, RDR6 ó SGS3 (o la combinación de estos genes o polipéptidos) y, opcionalmente, que muestra una identidad de secuencia exacta a un segmento expresado del gene. La secuencia región puede tener una orientación antisentido con respecto a la secuencia promotora y puede formar una parte antisentido de una replicación invertida de la secuencia diana. La replicación invertida puede formar una estructura de horquilla cuando se expresa como ARN. Un bucle de la estructura de horquilla puede ser, por ejemplo, un intrón que se separa por corte y empalme en una célula vegetal.

El constructo puede ser configurado para inhibir suficientemente la vía génicamente silenciada del ARN pequeño a fin de inducir en la planta la formación de uno o más gametos no reducidos. La vía puede ser inhibida específicamente por el constructo en cada óvulo de la planta, con relación al menos a la mayoría de los demás tejidos de la planta. En algunas realizaciones, el constructor puede conferir la expresión del ARN interferente que es condicional (por ejemplo, con una secuencia promotora activable o reprimible), de tal manera que la frecuencia de formación de gametos no reducidos por la planta sea ajustable.

Se proporcionan una planta que se reproduce a través de gametos no reducidos y un método para producir la planta. La planta puede ser transformada por el ácido nucleico descrito anteriormente, de tal manera que la planta sea una planta transgénica. En consecuencia, el ácido nucleico puede ser integrado en el genoma de la planta y/o puede ser heredable de una forma estable. El método puede comprender la obtención de un descendiente de la planta transgénica fundadora, con el descendiente transgénico que contiene el ácido nucleico y la formación de gametos no reducidos.

Se proporciona un método para transferir un conjunto somático de cromosomas a la siguiente generación de una planta. Puede seleccionarse una planta transformada con el ácido nucleico. La planta madre puede ser cultivada de tal manera que la planta madre forme semillas. Las semillas pueden ser cultivadas en una o más plantas cada una, incluyendo un conjunto no reducido (somático) de cromosomas de la planta madre. En algunos casos, el cultivo de la planta madre puede incluir el apareamiento de la planta madre con una segunda planta para unir por lo menos un gameto masculino de la segunda planta con un gameto femenino no reducido de la planta madre. En algunos casos, la segunda planta puede ser configurada para proporcionar al menos sustancialmente una contribución no cromosómica a las plantas hijas, de tal manera que las plantas hijas sean al menos clones sustanciales de las plantas madre. Por Ejemplo, la segunda planta puede incluir una mutación en un gen CENH3. En algunas realizaciones, las plantas hijas pueden tener una ploidía superior a la de la planta madre. La reproducción a través de los gametos no reducidos debe evitar la pérdida de alelos deseables durante la reproducción vía las semillas, porque el conjunto somático de cromosomas (y por tanto, al menos sustancialmente todos los alelos) de la planta madre puede ser transmitido a la próxima generación.

Otros aspectos de la presente divulgación se proporcionan en las siguientes secciones: (I) abreviaturas; (II) definiciones, (III) resumen del sistema; (IV) ácidos nucleicos ejemplares para promover la formación de gametos no reducidos; y (V) ejemplos.

I. Abreviaturas.

Las abreviaturas utilizadas en la presente divulgación generalmente son abreviaturas de términos reconocidos por los expertos en el arte, consistentes con el contexto en que se utiliza cada abreviatura. Sin embargo, las siguientes abreviaturas pueden tener significados adicionales y/o alternativos, como se describe a continuación.

AGO4: ARGONAUTA 4.

AGO9: ARGONAUTA 9.

NRPD1 : RNA POLIMERASA NUCLEAR D 1 (una subunidad catalítica de RNA Pol IV dependiente de ADN).

NRPD2: RNA POLIMERASA NUCLEAR D 2 (una subunidad catalítica de RNA Pol IV dependiente de ADN).

RDR2: RNA POLIMERASA 2 DEPENDIENTE DE RNA.

RDR6: RNA POLIMERASA 6 DEPENDIENTE DE RNA.

SGS3: SUPRESOR DE SILENCIAMIENTO GÉNICO 3.

Una secuencia ejemplar de mRNA {Arabidopsis thaliana) como (ADNc) y la secuencia de polipéptido, respectivamente, para cada uno de los genes anteriores se presenta en el listado de secuencias asociado como SEQ. ID. NOS: 1 y 2 (AGO4), SEQ. ID. NOS. 3 y 4 (AGO9), SEQ. ID. NOS. 5 y 6 (NRPD1 ), SEQ. ID. NOS. 7 y 8 (NRPD2), SEQ. ID. NOS. 9 y 10 (RDR2), SEQ. ID. NOS. 1 1 y 12 (RDR6), y SEQ. ID. NOS. 13 y 14 (SGS3). Las secuencias mRNA ejemplares adicionales (como cDNA) para AGO9 de otras especies de plantas son presentadas como SEQ. ID. NOS. 15-18.

II. Definiciones.

Los diversos términos utilizados en la presente divulgación tienen generalmente cada uno un significado reconocido por los expertos en el arte, consistente con el contexto en que cada término es utilizado. Sin embargo, los siguientes términos pueden tener significados adicionales y/o alternativos, como se describe a continuación.

Gameto no reducido. Una célula reproductiva formada por una planta que tiene la misma ploidía ("no reducida") y/o genotipo como células somáticas (esporofito) de la planta y capaz de contribuir con material genético para la formación de embriones. El gameto puede estar formado y/o presente en un óvulo de la planta y puede ser descrito como un gameto femenino, sea o no el gameto capaz de unirse con un gameto masculino. Una planta diploide produce gametos no reducidos que son diploides; una planta triploide produce gametos no reducidos que son triploides, y así sucesivamente. Un gameto femenino no reducido puede unirse con un gameto masculino para formar un cigoto que se desarrolla en un embrión o, en algunos casos puede convertirse en un embrión sin unirse con un gameto masculino. Un gameto femenino no reducido puede ser descrito como que tiene el mismo genotipo que las células somáticas de la planta, lo que significa que al menos sustancialmente cada alelo de una célula somática está también presente en el gameto. En algunos ejemplos, la constitución cromosómica del gameto (o de una planta hija o de la siguiente generación) puede ser descrita como de constitución somática cromosómica, lo que significa que una copia de cada uno y todos los cromosomas somáticos de la planta madre está presente en el gameto (o planta hija de la siguiente generación), con la vinculación de los alelos en cada cromosoma individual preservado al comparar las células somáticas de la planta madre al gameto (o planta hija de la siguiente generación). Una constitución cromosomática somática puede ser generada en un gameto cuando no ocurre una recombinación entre cromosomas homólogos durante la formación de gametos.

Los gametos femeninos no reducidos pueden estar formados por diplosporía o aposporía, entre otros. El proceso de diplosporía genera un gameto no reducido de un precursor de gametos típico, una célula madre megaspora (MMC), que no se somete a la meiosis. El proceso de aposporía genera un gameto no reducido por derivación directa de una célula somática en un precursor de los gametos, una célula MMC semejante. La célula MMC semejante generalmente se forma en un sitio distinto de la MMC (si está presente). La aposporía puede ocurrir a través de un precursor de los gametos sobrantes, mientras que el precursor de los gametos se somete a la meiosis normal (o apomeiosis).

Los gametos femeninos no reducidos se pueden generar en cualquier frecuencia adecuada con relación al total de los gametos femeninos (no reducidos y reducidos meióticamente). Por ejemplo, la frecuencia de gametos femeninos no reducidos generados por una planta individual puede ser al menos del 1 %, 5%, 10% o 25%, entre otros.

Apomixis. Reproducción clonal a través de semillas. En la apomixis, el embrión de una semilla está formado con un genoma materno no reducido (de un gameto femenino no reducido) y sin genoma paterno. La apomixis crea una o más semillas que germinan para producir uno o más descendientes que son al menos casi idénticos genéticamente a la planta madre. Una planta que se reproduce por apomixis forma semillas apomícticas viables a una frecuencia detectable, con cualquier porcentaje adecuado de sus semillas que son apomícticas, tal como al menos en aproximadamente 1 %, 5%, 10%, 20%, 50% o 100%, entre otros. Una "semilla apomíctica" es una semilla que contiene un embrión viable que es capaz de desarrollarse en una planta que es al menos casi idéntica genéticamente a su progenitora (por ejemplo, la planta madre). Las plantas que son al menos casi idénticas genéticamente unas a otras tienen genotipos respectivos que son indistinguibles unos de otros por lo menos en aproximadamente 95%, 99%, ó 99.9% de los genes de las plantas. El Ejemplo 3 describe un ejemplo de apomixis en el cual un gameto masculino se une con un gameto femenino no reducido pero no hace ninguna contribución genética en el embrión resultante, que se convierte en un clon sustancial de la planta madre.

Interferencia de RNA. Un proceso de inhibición de la expresión genética de una manera específica utilizando mediadores de ARN, que pueden denominarse como RNA interferentes. Los ARN interferentes pueden incluir ARN de doble cadena, RNA de interferencia corta, micro ARN y/o similares. En algunas realizaciones, los RNA de interferencia, tal como se expresa o se presenta, pueden ser un ARN de doble cadena, tales como un ARN con estructura de horquilla, que pueden ser procesados en la célula para formar un ARN pequeño (por ejemplo, un ARN de interferencia corta o un micro ARN). Los ARN pequeños generalmente incluyen RNA de menos de aproximadamente 30 nucleótidos, tales como los ARN de 20, 21 , 22, 23, 24 ó 25 nucleótidos, entre otros. Los ARN interferentes pueden inhibir la expresión génica antes, durante y/o después de la transcripción de un gen (es decir, por una transcripción y/o un mecanismo post-transcripcional), tal como mediante la modificación de genes (por ejemplo, la mutilación del DN histona), la degradación del mRNA, y/o la inhibición de la traducción del mRNA, entre otros.

La interferencia del ARN en plantas está mediada por una vía génicamente silenciada de ARN pequeño que inhibe la expresión de los genes. La vía, en los óvulos de las plantas, se basa en un número de genes/polipéptidos para lograr el silenciamiento génico que estimula la formación de gametos femeninos reducidos. Estos genes/polipéptidos pueden estar involucrados en la formación de ARN pequeños y/o el uso de ARN pequeños como guías para genes blanco particulares y/o ARN (tales como para modificación y/o degradación). Estos genes/polipéptidos pueden incluir un miembro de la familia ARGONAUTA (por ejemplo, AG04 ó AG09, entre otros), NRPD1 , NRPD2, RDR2, RDR6 y/o SGS3, entre otros. La inhibición de la vía génicamente silenciada en el óvulo puede resultar en la formación de uno o más gametos femeninos no reducidos. Polipéptidos ejemplares para AG04, AG09, NRPD1 , NRPD2, RDR2, RDR6 y SGS3 de Arabidopsis thaliana son codificados por SED. ID. NOS. 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 y 13, respectivamente y tienen secuencias codificadas presentadas como SEQ. ID. NOS. 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14, respectivamente. AGO4, AGO9, NRPD1 , NRPD2, RDR2, RDR6 ó SGS3 de otras especies vegetales pueden ser identificadas como el (los) polipéptido(s) en cada una de las especies que tienen la mayor similitud con SEQ. ID. NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12 ó 14, respectivamente, o como un polipéptido que tiene una similitud sustancial y/o identidad a SEQ. ID. NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12 ó 14, respectivamente.

Una cantidad de identidad o similitud entre dos polipéptidos puede ser determinada por el algoritmo blastp (por ejemplo, el programa BLASTP 2.2.18 +), como se describe en las siguientes dos referencias, que son incorporadas aquí por referencia: Stephen F. Altschul, et al. (1997), "Gapped BLAST AND PSI-BLAST: a new generation of proteína datábase search programs", Constructs Res 25:3389-3402; y Stephen F. Altschul et al. (2005) "Protein datábase searches using compositionally adjusted substitution matrices", FEBS J. 272:5101 -5109. Ejemplos de similitud o identidad sustancial incluyen cuando menos 40%, 50%, 60%, 70%, ó 80% aproximadamente de similitud o identidad secuencial, una tasa de similitud de cuando menos aproximadamente 200 o 250 aproximadamente, y/o un E-valor de menos de 1 e-40, 1 e-60 ó 1 e-80 aproximadamente entre otros, utilizando el algoritmo blastp, con alineación óptima y, de ser necesario, introducción de gaps.

Planta. Un miembro del reino Plantae de los organismos eucariotas, que puede ser descrito como un árbol, arbusto, pastos, hierbas, enredadera, musgo, helécho, alga o una combinación de los mismos, entre otros. Una planta puede carecer (o no) de la capacidad de movimiento locomotor y generalmente posee paredes celulares formadas por celulosa. Una planta puede ser capaz de llevar a cabo la fotosíntesis o puede (o no) ser una planta vascular. En algunas realizaciones, la planta puede ser anual o perenne. La planta puede ser planta de floración (una angioesperma), tal como una monocotiledónea o dicotiledónea. En algunas realizaciones, la planta puede producir un grano, tubérculo, fruto, vegetal, nuez, semilla, fibra, aceite o una combinación de los mismos, entre otros. Además, la planta puede ser una planta de cultivo. Plantas de cultivo ejemplares que pueden ser adecuadas para la generación de plantas transgénicas de acuerdo con la presente divulgación incluyen el tabaco, la papa, el maíz, el tomate, el arroz, el trigo, la alfalfa, el frijol de soya y similares.

Planta transqénica. Una planta que incluye un constructo de ácido nucleico. El constructo puede ser integrado al genoma de la planta (es decir, genoma nuclear o plástido), en algunas o al menos sustancialmente en todas las células de la planta. Por ejemplo, el constructo puede estar presente en la línea germinal de la planta. En consecuencia, el constructo puede ser heredable, es decir, heredado por lo menos a uno o más miembros, o al menos sustancialmente a todos los miembros, de una generación posterior de la planta. Una planta transgénica que es "transformada" con un constructo, ha sido modificada para contener el constructo en la generación actual o en cualquier generación o generaciones precedentes de la planta. Ácido nucleico. Un compuesto que comprende una cadena de nucleótidos. Un ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario. Un ácido nucleico puede tener una estructura natural o artificial (es decir, por ingeniería) o la combinación de las mismas.

Gen. Un ácido nucleico o segmento del mismo que proporciona una unidad expresable para la expresión de un polipéptido y/o un ARN funcional (es decir, un ARN ¡nterferente). Un gen puede incluir por lo tanto una región diana (también denominada una secuencia diana) para definir la secuencia del ARN ¡nterferente que es expresada y al menos un promotor transcripcional (también denominado como secuencia promotora) ligada operativamente a la región diana, para controlar (es decir, promover, impulsar y/o regular) la transcripción de la región diana. Un gen opcionalmente puede incluir una o más regiones diferentes de control y(o regiones no traducidas, tales como al menos una secuencia líder 51 , intrón, terminador transcripcional (también denominado como secuencia de terminación) o cualquier combinación de los mismos, entre otros.

Constructo. Un ácido nucleico creado, al menos en parte, fuera de las plantas utilizando técnicas o ingeniería genética. Un gen incluido en un constructo puede ser denominado un transgén.

Expresión. Un proceso por el cual un producto, a saber un ARN y/o un polipéptido, se sintetiza basándose en la información codificada en un ácido nucleico y/o gen, generalmente en forma de ADN (o ARN). En consecuencia, el gen de ácido nucleico/gen puede ser expresado para formar un ARN y/o polipéptido, lo que significa que el ARN y/o polipéptido se expresa del ácido nucleico/gen.

III. Descripción general del sistema.

La figura 1 muestra un diagrama de flujo 20 que ilustra la reproducción de una planta diploide (2n) transgénica 22 construida de acuerdo con los aspectos de la presente divulgación. En otros ejemplos, la planta transgénica puede tener cualquier ploidía adecuado, tal como triploide (3n), tetraploide (4n), 5n, 6n, etc.

La planta 22 ha sido modificada para reducir la actividad de una vía génicamente silenciada de ARN pequeño en los óvulos de la planta. Por ejemplo, la planta puede contener un constructo (un transgén) que expresa un ARN ¡nterferente configurado para reducir específicamente la expresión de un componente de una vía génicamente silenciada de ARN que opera en los óvulos de la planta. El constructo puede ser configurado para inhibir la operación de la vía específicamente en los óvulos con relación cuando menos a la mayoría de los demás tejidos de la planta. Por ejemplo, el ARN interferente puede expresarse del constructo en un patrón óvulo-específico (es decir, expresado a un nivel substancialmente mayor en los óvulos con relación cuando menos a la mayoría de los demás tejidos de la planta). Alternativamente, o adicionalmente, el ARN interferente puede ser configurado para inhibir la expresión de un gen/polipéptido (es decir, AGO9) que normalmente se expresa en un patrón óvulo-específico con relación cuando menos a la mayoría de los demás tejidos en la planta. Restringir la acción silenciadora del transgén al óvulo /y/o al tejido reproductivo) puede ser importante para evitar cambios indeseables a la planta en los tejidos no reproductivos de la planta.

Debido a la inhibición de la vía génicamente silenciada, la planta es alentada a formar gametos femeninos no reducidos 24. En otras palabras, la ploidía de la planta transgénica se mantiene en los gametos no reducidos puesto que no hay reducción del número de cromosomas a través de la meiosis.

Las semillas 26 se generan usando gametos femeninos 24. Las semillas pueden tener la misma ploidía que los gametos 24 y la planta transgénica 22 (es decir, 2n en este caso) o pueden tener una ploidía superior (es decir, 3n, 4n, etc., en este caso). Las semillas pueden desarrollarse de los gametos 24 sin fertilización o como resultado de una fertilización con un gameto masculino de cualquier ploidía adecuada (por ejemplo, 1 n, 2n, 3n, 4n, etc.). El gameto masculino puede ser proporcionado por la planta transgénica individual (auto-fertilización) o de otra planta (fecundación cruzada).

Las plantas de progenie o plantas hijas 28 pueden ser producidas por germinación de las semillas 26. La progenie puede tener la misma ploidía que los gametos 24 y la planta transgénica 22, si no hay contribución paterna al genotipo de la progenie (ver, por ejemplo, el Ejemplo 3) o pueden tener una ploidía superior con una contribución paternal. En todo caso, la progenie puede contener al menos substancialmente la totalidad de los alelos de la planta madre transgénica 22 (en este caso, una contribución materna 2n), puesto que la reducción meiótica no se produjo durante la reproducción. En consecuencia, la combinación de los alelos presentes en la planta madre pueden ser transmitidos a la siguiente generación.

La figura 2 muestra un diagrama de flujo que ilustra un método ejemplar 30 de transmitir al menos substancialmente completo un conjunto somático de cromosomas a una generación subsiguiente de una planta vía las semillas. Los pasos aquí presentados pueden realizarse en cualquier combinación, en un orden, y pueden modificarse por o en combinación con cualquier otro aspecto de la presente divulgación.

Se puede obtener una planta madre transgénica, indicada en 32. La planta transgénica puede portar un transgén que expresa un ARN interferente configurado para inhibir el ARN pequeño génicamente silenciado en los óvulos. La planta puede ser transformada con un ácido nucleico que contenga el transgén y la transformación puede realizarse en la generación actual o en cualquier generación precedente de la planta.

La planta transgénica puede ser cultivada para formar semillas, indicadas en 34. La planta puede formar semillas por apareamiento, indicado en 36, o partogenéticamente, entre otros.

La progenie (plantas hijas) puede ser cultivada de las semillas, indicadas en 38.

Cada planta hija puede incluir un conjunto no reducido de cromosomas de la planta madre.

IV. Ejemplos de ácidos nucleicos para promover la formación de gametos no reducidos. La figura 3 muestra una vista esquemática de un ácido nucleico 40 para promover la apomixis en las plantas. El ácido nucleico 40 puede ser construido al menos parcialmente fuera de las plantas. El ácido nucleico puede ser ADN (o ARN), puede ser de cadena sencilla o de doble cadena, puede ser linear o circular, o una combinación de los mismos. El ácido nucleico 40 puede incluir un gen que comprende una secuencia promotora 42 operativamente acoplada a una secuencia diana 44. El gen puede fomentar la expresión indicada en 46, de la secuencia diana a fin de producir un ARN interferente. El gen puede ser activo en las plantas, esto es, puede ser capaz de causar un nivel suficiente de la expresión del ARN interferente para lograr una consecuencia fenotípica, es decir, la formación de gametos no reducidos. La secuencia promotora puede dirigir la expresión de al menos una expresión sustancialmente ubicua o una expresión específica de los tejidos del ARN en una planta. Entre los ejemplos de secuencias promotoras para la expresión generalizada en una planta incluyen promotores de virus del mosaico de la coliflor (35S), arroz actina, ubiquitina de maíz etc. Los promotores específicos de tejido pueden dirigir selectivamente la expresión en el tejido reproductivo (por ejemplo, los óvulos) de una planta con relación a cuando menos la mayoría de los demás tejidos de la planta. Ejemplos de promotores que pueden ser adecuados incluyen al PFM2 y pNud ((1 ) PCT Solicitud de Publicación de Patente No. WO 2006/049482; (2) Huanca-Mamani W., García- Aguilar M., León -Martínez G. Grossniklaus U, and Vielle-Calzada J-Ph. 2005. CHR1 1 , un factor remodelador de cromatina esencial para la proliferación nuclear durante la gametogénesis femenina en Arabidopsis, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 102, 17231 -17236; cada uno de los cuales es incorporado aquí como referencia). Otor promotor específico de tejido que puede ser adecuado, pFM2, es descrito en el ejemplo 2. Un promotor de secuencia puede proporcionar una expresión condicional (es decir, ¡nducible y/o reprimíble) o una expresión consítutiva de la secuencia diana. Entre los ejemplos de promotores condicionales se encuentran los promotores químicamente inducibles y/o promotores físicamente inducibles (por ejemplo, inducibles mediante una hormona esteroide, la auxina, tetracíclina, el metal, la inanición de azúcar, el etanol, detergentes, cis-jasmona, choque térmico etc.). El uso de un promotor condicional puede ser ventajoso para permitir la reproducción de la planta (reproducción sexual), para generar una planta deseada con un conjunto deseado de rasgos. Una vez que se genera la planta deseada, el promotor condicional puede ser inducido (o desreprimido), de tal manera que el conjunto de rasgos se transmite a una generación posterior a través de los gametos no reducidos.

La secuencia diana 44 puede incluir al menos una región de focalización 48 dispuesta en un antisentido o una configuración de sentido con respecto a la secuencia promotora 42. Por ejemplo, la orientación región 48 puede incluir un par de replicaciones invertidas 50, 52 dispuestas en sentido respectivo y configuraciones antisentido y capaces de formar un ARN de doble cadena cuando se expresa. El ARN de doble cadena puede así formar un tallo de estructura tallo-bucle (una horquilla). En algunas realizaciones, un bucle 54 de la estructura del tallo-bucle puede estar formado por un intrón.

En algunos ejemplos, la secuencia diana 44 puede incluir una región de una planta AG04, AG09, NRPD1 , NRPD2, RDR2, RDR6 ó SGS3 gen y(o mRNA (o cDNA). Ejemplos de secuencias para cada uno de los genes antes mencionados de Arabidopsis thaliana están presentes como SEQ. ID. NOS. 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 y 13, respectivamente. La región puede ser de cualquier longitud adecuada, tal como al menos 20 nucleótidos consecutivos desde el gen y/o su mRNA (por ejemplo, una codificación y(o la región no traducida). La región puede ser de una planta Argonauta 9 gen o mRNA, tal como una región de codificación y/o una región no traducida del gen/mRNA, o similares. Ejemplos de secuencias ARGONAUTA 9 que pueden ser adecuadas para designar una secuencia diana son proporcionadas por Arabidopsis thaliana (por ejemplo, SEQ. ID. NO. 3, Glycine max (soya) (por ejemplo, SEQ. ID. NO. 15), Vitis vinifera (uva) (por ejemplo, SEQ. ID. NO. 16), Populus trichocarpa (álamo) (por ejemplo, SEQ. ID. NO. 17), o Lotus japonicus (una leguminosa) (por ejemplo, SEQ. ID. NO. 18), entre otros.

El ácido nucleico 40 también puede incorporar una secuencia de terminación 56 operativamente acoplada a la secuencia diana y colocada río abajo de la misma, con respecto a la secuencia promotora 42. La secuencia de terminación puede fomentar, y definir un sitio de, procesamiento de la terminación transcripcional y/o post-transcripcional, tal como la poliadenilación, entre otros. Colectivamente, la secuencia promotora 42 y la secuencia diana 44 (y, opcionalmente, el bucle 54 y(o la secuencia de terminación 56) pueden formar un gen quimérico o transgén 58 que expresa el ARN interferente.

El ácido nucleico 40 adicionalmente puede ser equipado con cualesquiera otras secuencias adecuadas, que pueden estar fuera del (o incluidas en) gen quimérico 58. Por ejemplo, el ácido nucleico puede incluir un marcador seleccionare 60, lo que puede permitir la selección de una ventaja de crecimiento de las células vegetales o plantas que contienen el ácido nucleico, en presencia de un agente/medio de selección adecuado. El ácido nucleico puede también o alternativamente comprender un marcador seleccionable 62 para crecimiento en bacterias (por ejemplo, Agrobacterium tumefaciens) y/o una secuencia T-DNA para promover la transformación de la planta cuando se la expone al Agrobacterium portador del ácido nucleico.

V. Ejemplos.

Los ejemplos siguientes describen aspectos seleccionados y realizaciones de la presente divulgación, tales como ejemplos de composiciones y métodos para producir plantas que se reproducen vía gametos no reducidos. Los ejemplos se presentan únicamente a manera de ilustración y no pretenden definir ni limitar el alcance de la presente divulgación.

Ejemplo 1. Promoción de la aposporía por mutación genética.

Este ejemplo presenta y describe los datos ejemplares relacionados con el control de la formación del gameto femenino por una vía génicamente silenciada de un ARN pequeño en Arabidopsis. Los datos demuestran la promoción de la posporía por la mutación de los genes (por ejemplo, AG09, RDR6 y SGS3) que participan en RNA pequeños de silenciamiento génica en el tejido reproductivo de las plantas.

A. Resumen.

En los óvulos de la mayoría de las plantas con floración sexual, la gametogénesis femenina se inicia cuando una célula precursora de gametos es sometida a la meiosis, dando lugar a un producto haploide único y funcional. Aquí mostramos que la proteían Arabidopsis ARGONAUTA 9 (AGO9) controla la gametogénesis femenina al restringir la especificación de los precursores de gametos de una manera dependiente de la dosis y no de manera autónoma de las células. Las mutaciones en AGO9 conducen a la diferenciación de múltiples precursores de gametos femeninos que son capaces de iniciar la gametogénesis. El AGO9 no se expresa en el linaje de los gametos; en vez de ello, se expresa en los focos citoplasmáticos de las células somáticas compañeras. La mutación en el SUPRESOR DE SILENCIAMIENTO GÉNICO 3 y en el ARN-DEPENDIENTE ARN POLIMERASA 6 exhiben un defecto idéntico a los ago9 mutantes, lo que indica que el movimiento de células somáticas compañeras de ARN pequeño de silenciamiento es necesario para controlar la especificación de los gametos precursores. En el óvulo, el AGO9 interactúa preferencialmente con 24 nt ARN pequeñas (sRNAs) derivadas de los elementos de transposición (TES), y su actividad es necesaria para silenciar los episodios de tromboembolia en los gametos femeninos y sus células accesorias. Nuestros resultados muestran que el silenciamiento de los sRNA AGO9-dependientes es crucial para especificar el destino celular en el óvulo Arabidopsis, y que la reprogramación epigenética en las células compañeras es necesaria para el silenciamiento de los sRNA dependientes en los gametos de las plantas.

B. Introducción.

El ciclo de vida de las plantas de floración consiste en una fase diploide (esporofítica) y dos fases haploides morfológicamente diferentes (gametofíticas) que se producen en los órganos reproductivos especializados. A diferencia de los animales donde los productos meióticos se diferencian directamente en células reproductivas funcionales, las plantas de floración requieren varias divisiones mitóticas de los precursores de haploides antes de diferenciarse de sus gametos. En el óvulo joven de Arabidopsis, un solo precursor sub- epidérmico de células germinales (la célula madre megaspora, o MMC) se diferencia y se somete a la meiosis, dando lugar a cuatro productos haploides (las megasporas). Sólo la megaspora más proximal sobrevive y da lugar a 8 núcleos después de 3 divisiones mitóticas. La celularización causa la partición de los 8 núcleos en 7 células: el óvulo y 2 células sinérgicas en el polo distal del gametofito (o megametofito), una célula central binucleada y 3 células antípodas en el polo proximal. Después de la fertilización del óvulo y la célula central por 2 espermatozoides distintos, el óvulo se convierte en una semilla. El establecimiento de la fase gametofítica presenta una oportunidad para que actúe la selección natural sobre el genoma de la planta haploide como una fuerza motriz de la evolución que podría estar en el origen de los mecanismos epigenéticos que garantizan una regulación estricta del desarrollo reproductivo de la planta1. A pesar de esta preción selectiva temprana, existen numerosos ejemplos de alternativas de desarrollo que sugieren un control flexible de regulación de la formación de gametos. Debido a que numerosas especies sexuales y algunos mutantes comúnmente exhiben más de un MMC2"4, y muchas otras son capaces de formar gametos sin meiosis (por apomixis)5, se ha sugerido que un grupo de células somáticas en el óvulo es competente para responder a una señal local que probablemente desempeña una función importante en la determinación6; sin embargo, la base genética y los mecanismos moleculares que controlan la especificación de los precursores de gametos siguen siendo evasivos.

C. Resultados.

Un análisis de transcripción a gran escala por MMP (Massive Parallel Signature Sequencing) mostró que un gen que codifica una proteína ARGONAUTA (AGO) (At5g21 150 ó ARGONAUTA 9) es expresada elevadamente en los óvulos y anteras de Arabidopsis, pero está ausente en otros órganos vegetativos o reproductivos. Los perfiles de expresión microarray ATH1 y PCR transcriptasa inversa (RT-PCR) confirmaron que el ARGONAUTA 9 (AGO9) sólo se expresa en los óvulos y las anteras antes y después de la fertilización. Para determinar el patrón reproductivo de la expresión AGO9, realizamos hibridación in situ en el desarrollo de óvulos y anteras de plantas silvestres que emplean la ginoecia así como inflorescencias completamente seccionadas. AGO9 mRNA estuvo ausente de los tejidos vegetativos (hojas, tallos, raíces) o en vías de desarrollar sépalos o pétalos. Antes de la diferenciación de la MMC, AGO9 mRNA se localiza en abundancia en el primordio del óvulo naciente, incluyendo las células de la capa epidérmica (L1 ), la capa sub-epidérmica (L2) y las capas de células más interiores (L3), y débilmente en el septum. En la meiosis, AG09 mRNA se limita a un grupo de células L1 y L2 localizadas en la parte distal (micropilar) de la región del óvulo en desarrollo, pero estuvo ausente de la MMC o las megasporas. Durante la gametogénesis femenina, AG09 mRNA se localiza en abundancia en el polo distal y proximal del óvulo, pero no en el desarrollo del gametofito femenino. Estos resultados indican que antes de la fertilización, AG09 se expresa en células compañeras esporofíticas femeninas del óvulo en desarrollo, pero no en los gametos femeninos.

Se sabe que tanto en plantas como en animales, las proteínas AGO rompen los mRNA endógenos tanto durante el silenciamiento transcripcional guiado de microRNA (miRNA) como de RNA (siRNA)7. Se unen a los RNA cortos y los microRNA a través de un dominio PAZ conservado, y, en animales, se ensamblan en un complejo multi-subunidad silenciando el RNA inducido (RISC), responsable de degradar un mRNA diana o reprimen su traducción8,9. Para elucidar la función de AG09 en Arabidopsis, los individuos de 3 líneas independientes de inserción de T-ADN que albergan los elementos dentro de la región codificante del gen AG09 fueron analizados fenotípicamente en todas las etapas de desarrollo del óvulo10. Considerando que 94.2% de los óvulos pre-meióticos mostró un único MMC en plantas de tipo silvestre, y 5.8% mostraron 2 MMC, sin embargo, sólo uno de estos últimos se sometió a gametogénesis puesto que nunca se observó que desarrollara dos gametofitos femeninos. Todas las líneas de inserción ago9 fueron fértiles y no mostraron signos de aborto de óvulos o semillas; sin embargo, en contraste con las plantas de tipo silvestre, los primordios del óvulo antes de la meiosis de los heterocigotos ago9/+ individuos - incluyendo el alelo ago9-2 que fue previamente reportado como carente de fenotipo defectuoso11- mostró varias células sub-epidermales anormalmente agrandadas reminiscentes de las células epidérmicas de la MMC. En ago9/ + individuos, los óvulos presentaron hasta 6 células que contienen un núcleo visible y un nucléolo a una frecuencia de 30.29%, lo que indica que los alelos ago9 son dominantes y afectan una diferenciación temprana de la célula al desarrollar el óvulo. En los individuos homocigoto ago9/ago9, el porcentaje de la primordia del óvulo que muestra más de una célula agrandada fue de 37.16% al 47.7%, dependiendo del alelo que fue examinado (tabla 1 ).

Tabla 1. Análisis genético de mutantes de inserción ago9 en Arabidopsis Más de 1 célula Alelo Genotipo Un solo MMC MMC-semejante ago9-3 ago9-3/ago9-3 208 123 (37.16%) ago9-3/+ 214 93 (30.29%) ago9-3wí p\*p 286 47 (14.1 1 %) +m/+ m/ago9-3p 241 74 (23.49%) ago9-4 ago9-4/ago9-4 139 1 18 (45.9%) ago9-2 ago9-2/ago9-2 162 148 (47.7%) tipo silvestre +/+ 292 18 (5.8%) Para determinar si los efectos de dosis podrían ser responsables del fenotipo mutante en las plantas heterocigotos, la presencia de células anormalmente agrandadas se anotó en los individuos F1 resultantes de cruces recíprocos entre los heterocigotos diploides ago9-3/ + y las plantas tipo silvestres tetraploides (4n) (tabla 1 ). Los individuos triploides (3n) que tenían 2 alelos tipo silvestre y uno mutante ago9-3 mostraron 14.1 1 % a 23.49% de óvulos anormales, un valor intermedio entre plantas diploides que portan un solo alelo ago9-3 y de tipo silvestre. Estos resultados sugieren que un mecanismo dependiente de la dosis es responsable por el fenotipo mutante ago9-3/+.

En Arabidpsis, la meiosis femenina se produce ante de la citocinesis y una celularización posterior da lugar a una tétrada de células haploides12. Mientras que 3 de las células derivadas meioticamente se degeneran, la célula más proximal se agrande y finalmente forma un solo gametofito femenino en cada óvulo. Ningún marcador molecular exclusivamente expresado en la MC ha sido reportado, pero el patrón de deposición calosa es un método fiable para determinar la identidad celular en las fases pre-meióticas. Para determinar si una o varias de las células agrandadas presentes en los óvulos ago9-3 son capaces de someterse a la meiosis, analizamos la deposición calosa en más de 100 óvulos despejados tipo silvestre o homocigotos ago9-3 en las fases pre-meiótica, meiótica o post-meiótica y realizamos comparaciones detalladas de la morfología celular sub-epidermal. De acuerdo con descripciones previas, los óvulos tipo silvestre mostraron manchas de calosa en la MMC antes de la iniciación de la meiosis. Después de la meiosis, la calosa se depositó en las paredes transversales entre la megaspora funcional y sus células hermanas degeneradas. En los óvulos pre-meióticos ago9-3, las células anormalmente agrandadas a menudo mostraron manchas de depósitos de calosa reminiscentes de aquellos encontrados en las M C de tipo silvestre. Durante la meiosis, la calosa sólo se detectó en las paredes intermedias de una sola célula y las células vecinas degeneradas, pero no en las células anormalmente agrandadas asociadas cercanas. Este patrón persistió después de la meiosis. Estos resultados muestran que varias células agrandadas en los óvulos ago9-3 adquieren la identidad de un precursor de células germinales, pero una sola es la que se comete a la mieosis y da lugar a una megaspora haploide funcional, lo que indica que la actividad de AGO9 es necesaria para restringir la diferenciación a una sola célula sub-epidermal en el óvulo pre-meiótico.

Después de la meiosis, los óvulos ago9 mostraron la persistencia de los precursores de gametos adyacentes a los productos meióticos, incluyendo las 3 megasporas degeneradas y la megaspora funcional. A fin de determinar la identidad y evaluar el potencial de desarrollo de las células extranumerarias precursoras de gametos en los óvulos mutantes, examinamos la expresión del marcador pFM2, el cual se expresa post-meióticamente inicialmente en la megaspora y subsecuentemente en el desarrollo del gametofito femenino. En contraste con pFM1 que ocasionalmente conduce la expresión débil en las células somáticas que rodean la megaspora funcionan 3, pFM2 es un marcador ideal para caracterizar las células que han adquirido una identidad funcional después de la meiosis debido a que su actividad se limita estrictamente a la megaspora funcional, pero no se expresa en la MMC o en las 3 megasporas degeneradas meióticamente derivadas. En etapas posteriores de desarrollo, pFM2 sólo es activa en el gametofito femenino en desarrollo. En los óvulos ago9-3, la expresión pFM2 se observó inicialmente después de la meiosis en la megaspora funcional pero también en un grupo de células adyacentes que forman el núcleo e incluye los gametos precursores anormales. En todos los óvulos ago9-3 observados, más de 4 células mostraron una fuerte expresión de GUS en etapas post-meióticas, lo que indica que al menos algunas de las células que expresan pFM2 tienen un origen somático. De acuerdo con la deposición de calosa, la expresión pFM2 estuvo ausente en etapas pre-meióticas, lo que indica que los individuos ago9-3 defectuosos diferencian las células MMC semejantes que persisten en el óvulo en desarrollo adyacente a los productos meióticos y, posteriormente, adquieren una identidad de megaspora funcional sin someterse a la meiosis. En etapas subsecuentes de desarrollo y de acuerdo con la presencia de precursores pre-meióticos extranumerarios (tabla 1 ), los individuos ago9-3 mostraron un fenotipo bastante inusual de 2 gametofitos femeninos independientes que se desarrollan en el mismo óvulo a una frecuencia de 44.03% (n=243). Los cruces de plantas ago9-3 con individuos que expresan el marcador pF 2 o pFM2 revelaron que ambos adquieren una identidad de gametofito femenina. Estos resultados sugieren que las células precursoras anormales somáticas son capaces de iniciar la gametogénesis sin someterse a la meiosis.

A fin de determinar el patrón de localización de AG09, generamos un anticuerpo péptido contra un epítope específico de 16 aminoácidos localizados en las posiciones 139 a 154 de la región de la proteína N-terminal. En Western blots, la proteína AG09 del tamaño esperado de 100.5 kDa fue detectado en gionecia de tipo silvestre en desarrollo pero no en plántulas de 1 semana de edad, desarrollando hojas de roseta o silicuas 7 días después de la polinización. Mediante el examen de localización subcelular de AG09 en las primeras etapas de la formación del óvulo, se determinó que AG09 se expresó inicialmente en las células somáticas de la epidermis (L1 ) de la capa situada en la región apical del primordio de pre-meiótica del óvulo, pero no en la MMC. Curiosamente, se observó AG09 en focos citoplásmicos reminiscentes de P-cuerpos o gránulos de estrés presentes en el citoplasma de células animales. Si bien este patrón de actividad persistió a lo largo de la meiosis, unas cuantas células L2 expresaron AG09 después de la degeneración de la megaspora en el inicio de la gametogénesis femenina; sin embargo, AG09 no se localizó en las megasporas habloides ni en el gametofito femenino en desarrollo antes o después de la celularización. En los óvulos que contienen un gametofito femenino en la etapa 4-nuclear, AG09 fue localizado no sólo en las células tegumentarias exteriores, sino también en la periferia del endotelio, en el límite celular esporofito-gametofito. Las células L1 y L2 del tegumento exterior a menudo muestran una localización de AGO9 polarizada, asociada a las paredes celulares transversales. En las anteras, AG09 también fue localizado en el citoplasma de microsporitas después de la meiosis y más tarde, en el citoplasma de la célula vegetativa pero no en las células de esperma. Los óvulos o polen de individuos ago9-3 no mostraron la expresión AG09, lo que confirma que el anticuerpo reconoció exclusivamente al AG09 y no a una proteína diferente de la familia AGO. En general, estos resultados indican que AG09 se expresa preferentemente en las células reproductivas compañeras, pero no en los gametos masculinos o femeninos asociados, o sus precursores.

El patrón epidermal especifico (L1 ) de localización de la proteína en las etapas pre-meióticas combinado con la presencia de precursores sub-epidérmico de células germinales en individuos mutantes sugiere que AG09 actúa en una forma no celular autónoma para reprimir el compromiso de células precursoras germinales en el óvulo. En Arabidopsis, se sabe que solo RNA pequeños interferentes trans-actuadores (ta-s¡RNAs) se mueven en forma de moléculas de señal y ocasionando que el silenciamiento de genes más allá de sus sitios celulares de iniciación14,15, asemejándose a los dos siRNAs viral y del transgén a este respecto16. En cada caso, la biogénesis depende de la transcripción por la RNA-DEPENDIENTE TRNA POLIMERASA 6 (RDR6) que convierte sus precursores RNA de cadena simple en RNA de doble cadena en una vía que es también dependiente de la función de la proteína SUPRESORA PUTATIVA DE UNIÓN AL ARN DE SILENCIAMIENTO GÉNICO 3 (SGS3)17,18. La extensión del movimiento de gen silenciamiento fuera de su sitio de iniciación depende también de la actividad de RDR619. A fin de determinar si la función no celular autónoma de AGO9 podría asociarse con una vía ta-siRNA, caracterizamos el desarrollo del óvulo y la gametogénesis en los individuos homocigotos mutantes sgs3-1 1 y rdr6. Aunque ambos mutantes sgs3 y rdr6 muestran defectos plantulares y florales que se caracterizan por la deformación de las hojas y una elongación limitada del estambre17, su posible rol durante la formación de gametos no ha sido investigado. Ambas plantas sgs3-1 1 y rdr6-1 1 mostraron un fenotipo idéntico a los mutantes ago9 con precursores de células germinales adicionales que se diferencian en el óvulo pre-meiótico. En las plantas rdr6-11 , los óvulos post-meióticos mostraron dos gametofitos femeninos independientes en desarrollo a una frecuencia de 43.3% (n=224). Los cruces de plantas rdr6-1 1 con individuos que expresan el marcador pFM2 indican que las células precursores somáticas anormales también son capaces de formar gametos femeninos. Estos resultados apoyan la hipótesis de que AGO9, SGS3 y RDR6 controlan el compromiso del precursor de células germinales al actuar en la vía dependiente de RNA pequeño autónomo no celular en el óvulo en desarrollo de la Arabidopsis.

A fin de identificar la naturaleza de la interacción de AGO9 con los RNA pequeños y debido a los rendimientos extremadamente bajos de RNA pequeños en los experimentos piloto realiczados con cientos de órganos reproductivos femeninos, se aislaron 12,000 ginoecias de tipo silvestre conteniendo óvulos hasta la etapa 4-nucleada de gametogénesis y se utilizaron para la extracción de proteína total. Para identificar y clasificar la fracción de RNA pequeños asociada con el complejo, RNA pequeños previamente diluidos y purificados en gel fueron ligados con adaptadores en sus extremos 5' y 3, convertidos a productos cDNA y posteriormente clonados y secuenciados por métodos Sanger. Si bien las inmunopurificaciones conducidas con el suero pre-inmune no dieron clones bacterianosque contuvieran secuencias endógenas de Arabidopsis, obtuvimos un total de 2,552 secuencias que representan 344 RNA pequeños distintos de las inmunopurificaciones conducidas con el anticuerpo AG09. Después de la eliminación de los adoptadores, 2,508 secuencias de ARN pequeños (98% del total) pudieron ser asignadas al genoma nuclear de Arabidopsis y categorizadas en base a su localización y función. Aunque la mayoría son de 24nt de longitud (79.1 %), el 8.9% son de 21 a 22 nt de longitud, lo que indica que el óvulo AGO9 también puede interactuar con 21 nt de RNA pequeños de buena fe, incluidos los microRNA (miRNA). La mayoría de las 24 secuencias de nt se derivan de elementos de transposición (TES) que pertenecen a familias distintas de los retrotransposones: Gypsy (23%), Athila (9.3%), CACTA (5.5%9, y con menor frecuencia UNE o Mutator. Considerando que todas las secuencias mapeadas asignadas a las TE Gypsy pertenecen a la subfamilia AtGP1 , 3% representan secuencias mapeadas siRNA que mostraron ser dependientes de RNA Polimerasa IV (Pol IV) para su biogénesis20. Un 17.4% adicional mapea para las firmas genómicas asignadas a otras familias que contienen componentes anidados de Gypsy, Athila o CACTA TEs. En contraste, 21 nt de RNA pequeños preferentemente se derivan de miRNAs previamente caracterizados (3,2%), - incluyendo miR167 que se sabe actúa en el óvulo21 - y los genes que codifican proteínas (14.5%). Estos resultados muestran que el objetivo primario del silenciamiento dependiente de AG09 en el óvulo de Arabidopsis son los TE.

Estudios previos han mostrado que algunos TE que están activos en los granos de polen maduros no se expresan en óvulos de Arabidpsis22 en desarrollo o totalmente diferenciados. Para determinar si AG09 es necesario para la inactivación de estos TE en el óvulo, cruzamos líneas que contenían trampas potenciadoras (ET) que han etiquetado un TE específico para individuos homocigoto ago9. De conformidad con resultados previos, no se observó ninguna expresión GUS en el óvulo o gametofito femenino de las líneas ET presentes en un antecedente genético de tipo silvestre. En contraste, los individuos heterozigoto ago9/+ que contienen un ET dentro de cualquier Athila, LINE o Atlantys retrotransposón mostraron mostraron una intensa tensión de GUS en el óvulo y las células sinérgicas del gametofito femenino maduro antes de la polinización. Estos resultados no sólo confirman que AG09 es necesario para la inactivación de la ET en el óvulo, sino muestran también que uno de sus objetivos es el óvulo y las células sinérgidas del aparato (óvulo) antes de la fertilización.

El descubrimiento de que un mecanismo dependiente de RNA pequeño controla el desarrollo del genotipo femenino en Arabidopsis indica que AGO9 interactúa con una vía SGS3/RDR6 dependiente y es crucial para especificar los precursores de células germinales femeninas en el óvulo. Nuestros resultados sugieren que AG09 actúa en una manera no autónoma de la célula dependiente de la dosis para reprimir el compromiso reproductivo de células somáticas sub-epidermales mediante la inactivación de transcripciones diana, ya sea transcripcional o post-transcripcionalmente23. Al interactuar preferentemente con RNA pequeñas derivadas de los TE y silenciar su actividad en el gametofito femenino, la función AG09 es reminiscente de la subclase PIWI de proteínas ARGONAUTA que son necesarias para mantener el silenciamiento del transposón en el genoma de la línea germinal de invertebrados y mamíferos; en la mayoría de los animales los individuos PIWI defectuosos también se ven afectados en la diferenciación de células germinales24. AGO9 actúa en células vecinas y no directamente en los productos pre-meióticos o meióticos, lo que es grandemente reminiscente de la biogénesis de ARN corto interferente (siRNA) en la biogénesis de los granos de polen y que confirma los resultados anteriores, que muestran que la reprogramacíón epigenética en las células compañeras es un mecanismo preservado para el silenciamiento de RNA pequeño de los TE en ambos gametos femenino y masculino22. Unas 20 secuencias maternales siRNA encontrados en el endosperma y 24 nt siRNA encontrado en el polen22 se asemejan a los sRNA interactuando en AGO9, elevando la posibilidad de que AGO9 pueda también contribuir a estas poblaciones de una manera no autónoma.

Nuestros resultados indican también que los mutantes en esta vía AGO9 dependiente de ta-siRNA permiten que precursores de gametos somáticamente derivados se sometan a la gametogénesis. Este mecanismo es reminiscente de la aposporía, un componente de la reproducción asexual por medio de semillas (apomixis) prevalente en muchas especies de floración que producen gametos femeninos no reducidos a partir de células somáticas en el óvulo5. Nuestros hallazgos abren nuevos espacios para investigar las bases genéticas y los mecanismos moleculares que controlan el destino celular en el óvulo, ofreciendo nuevas posibilidades para explorar la inducción epigenética de la apomixis en plantas sexuales.

D. Materiales v Métodos.

Material y condiciones de crecimiento. Para todos los experimentos utilizamos Arabidopsis thaliana del ecotipo Columbia 0 (Col-0). Las líneas mutantes insercionales fueron ago9-2 (SALK_1 12059), ago9-3 (SAIL_34_G10), ago9-A (SAIL_260_A03) (ago9-1 también fue analizada pero no cuantificada y mostró el mismo fenotipo. Los sitios de inserción fueron verificados y las líneas homozigote fueron seleccionadas por RT-PCR. Para una descripción detallada de las poblaciones de mutantes, las líneas de trampas potenciadoras, las líneas y modelos transgénicos de DN, ver Métodos. Las semillas fueron esterilizadas con etanol al 100% y germinadas a lo largo de un día (16h luz 8h oscuridad) bajo condiciones estables a 22° C. Las plántulas fueron sembradas y cultivadas bajo condiciones controladas de invernadero (24°).

Análisis histiológico. Los óvulos aclarados y el análisis hitoquímico GUS se realizó como se describe25. El análisis de calosa se realizó como se describe26 con modificaciones menores descritas en Métodos.

Inmunoblot e inmunoprecípitación. Un péptido, SSRNHAGNDTNDADRK (SEQ. ID. NO. 19), fue utilizado para generar un anticuerpo AGO9 específico /Invitrogen, Carlsbad CA). La inmunopurificación del complejo de AG09-RNA pequeños fue realizada como se describe27.

Clonación y análisis genómico de los RNA pequeños. Después de la secuenciación, las lecturas de RNA pequeños se filtraron y fueron asignadas a secuencias del genoma de Arabidopsis (http://www.arabidopsis.org).

E. Referencias. 1 . Evans, M.M & Walbot, V. Unique features of the plant life cycle and their consequences. Nat. Rev. Genet. 4, 369-379 (2003). 2. Maheswari, P. An introduction to the embryology of the angiosperms. Published by McGraw-Hill Book Company, New York (1950). 3. Sheridan, WF., Avalkina NA, Shamrov II, Batygina TB, & Golubovskaya IN. The mad gene: controlling the commitment to the meiotic pathway in maize. Genetics 153, 933-941 (1999). 4. Nonomura, K., Miyoshi K., Eiguchi M., Suzuki T., Miyao A., Hirochika H., & Kurata N. The MSP1 gene is necessary to restrict the number of cells entering into male and female sporogenesis and to initiate anther wall formation in rice. Plant Ce// 15, 1728-1739 (2003). 5. Bicknell, R A. & Koltunow, A.M. Understanding apomixis: recent advances and remaining conundrums. Plant Cell 16 Suppl, S228-S245 (2004). 6. Grossniklaus, U. & Schneitz, K. The molecular and genetic basis of ovule and megagametophyte development. Sem. Cell. Dev. Biol. 9, 227-238 (1998). 7. Baumberger, N & Baulcombe, D.C. Arabidopsis ARGONAUTE1 is an RNA Slicer that selectively recruits microRNAs and short interfering RNAs. PAWS 102, 1 1928-1 1933 (2005) 8. Schwarz, D.S., Hutvagner G., Du T., Xu Z., Aronin N. & Zamore PD. Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell 1 15 , 199-208 (2003). 9. Pham J.W., Pellino J.L., Lee Y.S. & Carthew R.W., Sontheimer E.J. A Dicer-2-dependent 80s complex cleaves targeted mRNAs during RNAi in Drosophila. Cell 1 17, 83-94 (2004). 10. Alonso, J.M. et al. Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science 301 , 653-657 (2003). 1 1 . Takeda A., Iwasaki S., Watanabe T., Utsumi M. & Watanabe Y. The mechanism selecting the guide strand from small RNA duplexes is different among argonaute proteins. Plant Cell Physiol. 49, 493-500 (2008). 12. Webb, M.C. & Gunning, B.E.S. Embryo sac development in Arabidopsis thaliana: Megasporogenesis, including the microtubular cytoskeletoin. Sex. Plant Reprod. 3, 244-258 (1990). 13. Huanca-Mamani W., Garcia-Aguilar M., Leon-Martinez G., Grossniklaus U., & Vielle-Calzada JP. CHR1 1 , a chromatin-remodeling factor essential for nuclear proliferation during female gametogenesis in Arabidopsis thaliana. PNAS 102, 17231 - 17236 (2005). 14. Chitwood D.H., Nogueira F ., Howell M.D., Montgomery TA, Carrington J.C., & Timmermans M.C. Pattern formation via small RNA mobility. Genes Dev. 23, 549-554 (2009). 15. Schwab R., Maizel A., Ruiz-Ferrer V., García D., Bayer M., Crespi M., Voinnet O., & Martienssen R.A. Endogenous tasiRNAs medíate non-cell autonomous effects on gene regulation in Arabidopsis thaliana. PLoS One 19, e5980 (2009). 16. Voinnet, O. Non-cell autonomous RNA silencing. , FEBS Lett. 579, 5858-5871 (2005). 17. Peragine A., Yoshikawa M., Wu G., Albrecht H.L., & Poethig R.S. SGS3 and SGS2/SDE1/RDR6 are required for juvenile development and the production of trans-acting siRNAs in Arabidopsis. Genes Dev. 18, 2368-2379 (2004). 8. Yoshikawa, M., Peragine, A., ParkM.Y., & Poethig R.S. A pathway for the biogénesis of trans-acting siRNAs in Arabidopsis. Genes Dev. 15, 2164-2175 (2005). 19. Himber C, Dunoyer P., Moissiard G., Ritzenthaler C, Voinnet O. Transitivity-dependent and -independent cell-to-cell movement of RNA silencing. EMBO J. 22, 4523-4533 (2003). 20. Mosher R.A., Melnyk C.W., Kelly K.A., Dunn R.M., Studholme D.J., Baulcombe D.C. Uniparental expression of PollV-dependent siRNAs ¡n developing endosperm of Arabidopsis. Nature 460, 283-286 (2009). 21 . Wu M.F., Tian Q., & Reed J.W. Arabidopsis microRNAl 67 controls pattems of ARF6 and ARF8 expression, and regulates both female and male reproduction. Development 133, 421 1 -4218 (2006). 22. Slotkin R.K., Vaughn M., Borges F., Tanurdzic M., Becker J.D., Feijo J.A., & Martienssen R.A. Epigenetic reprogramming and small RNA silencing of transposable elements in pollen. Cell 136, 461 -472 (2009). 23. Matzke M, Kanno T, Huettei B, Daxinger L, Matzke AJ. Targets of RNA-directed DNA methylation. Curr Op. Plant Biol. 10, 512-519 (2007). 24. C. Klattenhoff, C. & Theurkauf W. Biogénesis and germline functions of piRNAs. Development 135, 3-9 (2008). 25. Vielle-Calzada, J. P., Baskar, R., & Grossnikiaus, U. Delayed activation of the paternal genome during seed development. Nature 404, 91 -94 (2000). 26. Siddiqi, I., Ganesh, G., Grossnikiaus, U. and Subbiah, V. The dyad gene is required for progresión through female meiosis in Arabidopsis. Development 127, 97-207 (2000). 27. Qi Y., Denli A.M., & Hannon G.J. Biochemical specialization within Arabidopsis RNA silencing pathways. Mol Cell. 19, 421 -428 (2005).

Aspectos adicionales para promover la aposporía se describen en la solicitud de patente provisional US Serie No. 61/283,261 , presentada el 30 de Noviembre de 2009, que se incorpora aquí como referencia.

Ejemplo 2. Promoción de la aposporía mediante la inhibición de la expresión AG09.

Este ejemplo describe datos de ejemplos relacionados con la promoción de la aposporía mediante la inhibición de la expresión AG09 a través de la interferencia de ARN.

A. Resultados.

La aposporía puede ser inducida en cultivos sexuales mediante la inhibición de la expresión del ARGONAUTA 9 (AGO9). La importancia de la función de AGO9 para promover la reproducción sexual puede ser demostrada utilizando un enfoque de interferencia del ARN. Para producir un constructo AG09 de interferencia, se clonó un fragmento de 275 pb de un cDNA AGO9 en un vector pFGC5941 RNAi en ambas orientaciones: sentido y antisentido. (El vector pFGC5941 RNAi se describe en Kerschen et al., 2004, y es un vector públicamente disponible por el grupo de Rich Jorgensen en la Universidad de Arizona).

El constructo AGO9 de interferencia, pFGC5941 que se utilizó para conducir estos experimentos contiene un promotor 35S de virus de mosaico de coliflor (CaMV35S) y fue modificado de tal manera que el promotor 35S impulsa la transcripción de una secuencia parcial de AGO9 clonada tanto en orientación de sentido como antisentido y separada por un intrón del gen de calcona sintasa. Después de la formación de una estructura de horquilla de ARN, las transcripciones resultantes de ARN de doble cadena pueden causar el silenciamiento post-transcripcional de la actividad génica endógena (Waterhouse et al., 1998; Chuang and eyerowitz, 2000; Smith et al., 2000). Un análisis detallado de la actividad del promotor CaMV35S durante el desarrollo del óvalo ha mostrado que este promotor está activo en células esporofíticas (diploide somáticas) de Arabidopsis, pero no en el linaje del gameto (haploide). Nuestro razonamiento fue que las transcripciones AGO9 localizadas en las células esporofíticas puede ser el blanco del silenciamiento RNAi-dependiente impulsado por CaMV35S.

Plantas silvestres de Arabidopsis thaliana del ecotipo Columbia se transformaron con el constructo AG09 interferente. Después de la transformación por inmerción floral, se generaron 45 transformantes primarios, ninguno de los cuales mostró defectos visibles durante el crecimiento vegetativo, desarrollo de las raíces u organogénesis floral. Sin embargo, todos los transformantes T1 adultos mostraron defectos idénticos a los de las plantas ago9 insercionales (ver ejemplo 1 ), pero a frecuencias significativamente más elevadas. El porcentaje de óvulos que muestran células precursoras germinales extranumerarias fue de 70 a 92% en 10 plantas RNAVAG09 T1 que fueron analizadas. Para determinar la posible relación entre una reducción en los niveles de transcripción AG09 y el fenotipo defectuoso, se extrajo el ARN del desarrollo utilizado para experimentos RT-PCR. Todas las 10 plantas analizadas mostraron la ausencia de la expresión AG09 durante el desarrollo del óvulo, lo que indica que el ARN interferente producido por el constructo de AGO9 interferente silenció la expresión AG09 en el óvulo. Los mismos experimentos pueden ser realizados en miembros de la Solanaceae, incluyendo el tabaco y el tomate.

B. Referencias.

Chuang, C.F., and Meyerowitz, E. (2000). Specific and heritable genetic interference by double-stranded RNA in Arabidopsis thaliana. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97, 4985-4990. Kerschen, A., Napoli, C.A., Jorgensen, R.A., and Muller, A.E. (2004). Effectiveness of RNA interference in transgenic plants. FEBS Lett. 566, 223-228.

Smith, NA, Singh, S.P., Wang, M.B., Stoutjesdijk, P.A., Green, A.G., and Waterhouse, P.M. (2000). Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature 407, 319-320.

Waterhouse, P.M., Graham, M.W., and Wang, M.B. (1998). Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95, 13959-13964.

Ejemplo 3. Reproducción clonal sintética a través de semillas usando argonaute9. Este ejemplo describe datos ejemplares relacionados con la reproducción clonal a través de semillas usando una muíante ago9 acoplada con un muíante intercambiada en el exlremo.

A. Resumen.

La clonación a íravés de semillas liene un potencial de aplicaciones en la agricultura porque su introducción en cultivos sexuales permitiría la perpetuatción de cualquier genotipo heterocigoto de élite. La reproducción sexual a través de semillas, o apomixis, da como resultado una progenie que consiste en clones genéticos de la planta madre. Sin embargo, a pesar de la aparición de la apomixis en cientos de especies de plantas, muy pocas especies de cultivo se reproducen vía apomixis y los intentos de introducir esta característica a través del cruce han fracasado. Un enfoque alternativo es de nuevo diseño la producción de semillas clónales1. Hemos mostrado previamente uno de los elementos más importantes de la apomixis, la formación de gametos no reducidos funcionales que son genéticamente idénticos a la planta madre (apeomeiosis) podrían ser inducidos en la planta sexual Arabidopsis thaliana argonauta9 mutantes2. Sin embargo, estos gametos participan en el proceso sexual normal de fertilización, dando lugar a un aumento de la ploidía en la siguiente generación. Aquí demostramos la conversión de gameots apomeioticos en semillas clónales por el cruce con una cepa cuyos cromosomas han sido diseñados para ser eliminados después de la fertilización. Cruzamos plantas argonautas2 con un muíante de cenh3-1 que expresa proteínas CENH3 alteradas3. Un subconjunto de la progenie F1 eran clones de su progenitores, imitando la progenie resultante de la apomixis natural. Estos resultados demuestran que la reproducción clonal a través de semillas se puede lograr en plantas sexuales.

B. Introducción.

El ciclo de vida de las plantas de floración consiste de una fase diploide (esporofítica) y dos fases haploides (gametofíticas) morfológicamente diferentes que se producen en los órganos reproductores especializados. A diferencia de los animales, donde los productos meióticos directamente funcionales se diferencian en células reproductivas, las plantas de floración requieren varias divisiones mitóticas de los precursores de haploides antes de diferenciarse de sus gametos. En el óvulo joven de la Arabidopsis, un solo precursor celular germinal sub-epidermal (la célula madre megaspora, o MMC) se diferencia y se somete a la eiosis, produciendo cuatro productos haploides (las megasporas). Sólo sobrevive la megaspora más proximal y produce 8 núcleos después de 3 divisiones mitóticas. La celularización lleva a cabo las particiones de los 8 núcleos en 7 células: el óvulo y 2 células sinérgicas en el polo distal del gametofito femenino (o megagametofito), una célula central binucleada y 3 células antípodas en el polo proximal. Después de la fecundación del óvulo por 2 espermatozoides distintos, el óvulo se convierte en una semilla. El establecimiento de la fase gametofítica presenta una oportunidad para que la selección natural actúe sobre el genoma de las plantas haploides como una fuerza motriz de la evolución que podría estar en el origen de los mecanismos epigenéticos que garanticen una regulación estricta del desarrollo reproductivo de las plantas1. A pesar de esta presión selectiva de acción temprana, existen numerosos ejemplos de alternativas de desarrollo que sugieren un control regulatorio flexible de la formación de los gametos. Debido a que numerosas especies comúnmente exhiben más de una MMC2,3, y muchas otras son capaces de formar gametos sin meiosis (mediante apomixis diplospora o apospora)4, se ha sugerido que un grupo de células en el óvulo es competente para responder a una señal local que parece jugar una función importante en la determinación5; sin embargo, la base genética y los mecanismos moleculares que controlan la especificación de los gametos precursores sigue siendo difícil de alcanzar. La apomixis es la hipótesis que se originó como una forma modificada de la reproducción sexual que ha sufrido la desregulación de algunos pasos clave, ya sea por mutagénesis o alteraciones epigenéticas. Los modelos funcionales de los genes de apomixis sugieren que éstos son alelos e genes implicados en la reproducción sexual que son activos ectópica o heterocrónicamente como resultado de una mutación o modificaciones epigenéticas con relación al alelo sexual. Actualmente no existe una evidencia directa para apoyar estos modelos en especies sexuales o apomícticas.

C. La vía ARGONAUTA 9 v su relación con apomixis.

Hemos mostrado que la proteína Argonauta (AG09) "rebanadora" de Arabidopsis controla la gametogénesis femenina al restringir la especificación de los gametos precursorese de una manera dependiente de la dosis y no autónoma de la célula (por ejemplo, ver ejemplos 1 y 2). Las mutaciones en AG09 dan lugar a la diferenciación de múltiples precursores de gameots femeninos que son capaces cada uno de iniciar la gametogénesis. El AG09 no se expresa en el linaje de los gametos, sino que se expresa en células somáticas compañeras. Sorprendentemente, las mutaciones en el SUPRESOR DE SILENCIAMIENTO GÉNICO 3 y en la ARN POLIMERASA RNA DEPENDIENTE 6 presentan un defecto idéntico a los mutantes ago9, lo que sugiere que el movimiento de ARN pequeños de silenciamiento de células somáticas compañeras es necesario para controlar la especificación de los precursores de gametos. Aunque en el óvulo AG09 actúa preferentemente con 24 nt de ARN pequeños (sRNAs) derivados de elementos de transposición (TES) y su actividad es necesaria para silenciar los TEs en los gametos femeninos y sus células accesorias, todavía no resulta claro si el silenciamiento RNA-dependiente de elementos replicados está directamente relacionado con el fenotipo ago9, o si este fenotipo es dependiente de otras ARN pequeños que también interactúan con AGO9, tal como los microRNAs uotros 21 nt siRNAs. Nuestros resultados muestran que el silenciamiento sRNA AGO9-dependiente es crucial para especificar el destino de las células en el óvulo de Arabidopsis, y que la reprogramación epigenética en las células compañeras es necesario para el silenciamiento sRNA-dependiente en los gametos de las plantas. También hemos demostrado la presencia de precursores de gametos adicionales con mutantes rdr6, rdr2, sgs3, nprdl y nrpd2.

Hemos ampliado nuestros resultados al mostrar que la mayoría de los 24 nt sRNA interactores de AGO9 se asignan a las regiones pericentroméricas de los 5 cromosomas de la Arabidopsis, lo que indica una posible relación entre la función AG09 y la formación de heterocromatina y tal vez la meiosis (Duran-Figueroa and Vielle-Calzada, Plant Signaling and Behavior Vol.5 Issuel Nov 2010).

También hemos mostrado que las mutaciones en ago9 resultan en una frecuencia significante de gametos femeninos no reducidos viables que preservan la constitución cromosomal materna; esta frecuencia oscila entre 8 y 17%, dependiendo de las variantes alélicas y las condiciones ambientales. La diferenciación de gametofitos femeninos no reducidos viables en estos mutantes es reminiscente de la aposporía en especies apomícticas. En la aposporía, la iniciación de la reproducción sexual es concomitante con la diferenciación de células iniciales aposporas somáticas en la vecindad de una célula derivada sexualmente (la megaspora funcional). Al igual que en la apoporía, los precursores de gametos no recucidos en ago9 pasan por dos mitosis nucleares y una expansión subsecuente antes de diferenciar un gametofito femenino 4-celular que contiene 2 sinérgidos, el óvulo y el núcleo polar único. El grado en que interactúan las vías "apospora-semejantes" sexuales y anormales aún no está claro.

Adicionalmente, una segunda mutación en un gen argonauta diferente (ARGONAUTA 4 ó AGO4) muestra redundancia funcional con AGO9. Los individuos homocigoto ago9 ago4 dobles muestran una exacerbación dramática de la proliferación de los precursores de gametos en el óvulo en desarrollo, con diferenciación anormal megaspora no reducida en la epidermis, así como en las células funiculares del primordio del óvulo. A veses también muestran configuraciones meióticas aberrantes en las que la especificación funcional de la megaspora entre los núcleos haploides derivados parece estar mal regulada.

Como una alternativa para el desarrollo de semillas sin fertilización, llegamos al razonamiento de que los gametos apomeióticos podrían convertirse en semillas mediante la fertilización con una cepa cuyos cromosomas son eliminados de la progenie resultante. La eliminación direccional del genoma ocurre en ciertos cruces amplio (tanto interespecíficos como intergenéricos) y da lugar a la formación de plantas haploides. Se ha mostrado que la alteración del histón centromérico-específico variante CENH3 por la línea denominada "tailswap" en la Arabidopsis da lugar a la eliminación preferencial de cromosomas del progenitor mutante cenh3 después de un cruce con el tipo silvestre3. A medida que las plantas ago9 fueron de un fondo mezclado No-0 y Col-0, y el tailswap fue Col-0 puro, pudimos rastrear el origen de los cromosomas en la progenie F1. Los cruces ago9 x tailswap produjeron un promedio de 14 semillas por fruto, 21 .1 % de ellas diploides totalmente maternas que carecen de la contribución paterna. Con un total de 292 plantas analizadas, los cruces produjeron una tasa de germinación del 92%, una tasa de triploides del 16.6% y una tasa de clones de 21 .1 %. Adicionalmente, estos eliminantes diploides sistemáticamente preservaron la heterocigotosidad de la planta madre en todos los loci evaluados. Para todos los cruces, estos resultados descartan la eliminación duplicando la siguiente fertilización de un gameto haploide y muestran que la eliminación del genoma tuvo lugar después de la fertilización de un gameto femenino no reducido, y que las plantas resultantes fueron clones de la planta madre. En conjunto, estos resultados demuestran la ingeniería de propagación clonal a través semillas de una manera similar a los resultados de la apomixis diplospora o apospora. Nuestros resultados proporcionan una prueba de demostración de principio para la síntesis de la apomixis en una planta sexual.

D. Materiales y métodos.

Material vegetal y condiciones de crecimiento. Las plantas fueron cultivadas en una mezcla de suelo artificial a 20°C bajo iluminación fluorescente. Las cepas tipo silvestre y mutantes de Arabidopsis fueron obtenidas de ABRC, Ohio or NASC, Reino unido. El ago9-3 es un mutante de inserción (SAIL_34_G10). Los ago9-3 se cruzaron con el ecotipo No-0 para generar poblaciones que eran heterocigotos para los marcadores de todo el genoma.

Análisis de la ploidía. El aislamiento de los núcleos para la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) se realizó como se describe4. El análisis de las FACS se llevó a cabo utilizando un control diploide y tetraploide interno para identificar sin ambigüedad las plantas diploides. Los análisis de la ploidía de hijos MiMe y osdl se realizaron por citometría de flujo y extensión de cromosomas.

E. Referencias. 1 . Spillane, C, Curtís, M. D. & Grossniklaus, U. Apomixis technology development-virgin births ¡n farmers' fields? Nat Biotechnol 22, 687-91 (2004). 2. Olmedo-Monfil, V. et al. Control of female gamete formation by a small RNA pathway in Arabidopsis. Nature 464, 628-32 (2010). 3. Ravi, M. & Chan, S. W. Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination. Nature 464, 615-8 (2010). 4. d'Erfurth, I. et al. Turning meiosis into mitosis. PLoS Biol 7, e1000124 (2009).

La divulgación establecida anteriormente puede abarcar múltiples invenciones distintas con utilidad independiente. Aunque cada uno de estos inventos se ha descrito en su(s) realización(es) preferida(s), las realizaciones específicas de los mismos tal como se describen e ¡lustran aquí no deben ser considerados en sentido limitativo, ya que son posibles numerosas variaciones. El objeto de las invenciones incluye todas las combinaciones novedosas y no obvias y las subcombinaciones de los diversos elementos, características, funciones y/o propiedades aquí descritas. Las reivindicaciones que siguen a continuación señalan ciertas combinaciones y subcombinaciones consideradas como novedosas y no obvias. Los inventos contenidos en otras combinaciones y subcombinaciones de rastos, funciones, elementos y/o propiedades pueden ser reclamados en las aplicaciones que reivindican la prioridad de ésta o una aplicación relacionada. Dichas reivindicaciones, ya sea las dirigidas a un invento diferente o al mismo invento, y ya sean más amplias, más estrechas, iguales o diferentes en su alcance a las reivindicaciones originales, también se consideran incluidas dentro del objeto de los inventos de la presente divulgación.

Claims (24)

Reivindicaciones.

1. Un ácido nucleico para la transformación de plantas que comprende un constructo que incluye (a) una secuencia diana que codifica un RNA interferente configurado para reducir específicamente la expresión de un componente de la vía génicamente silenciada de un RNA en una planta; y (b) una secuencia promotora operativamente acoplada a la secuencia diana y activa o activable en un óvulo de la planta, en donde el constructo es configurado para inhibir la vía génicamente silenciada de un RNA pequeño con relación a al menos la mayoría de los demás tejidos de la planta, y para inhibir dicha vía suficientemente a fin de inducir la formación por la planta de uno o más gametos no reducidos.

2. El ácido nucleico de la reivindicación 1 , en donde el constructo es configurado para expresar el RNA interferente específicamente en cada óvulo de una planta con relación a al menos la mayoría de los demás tejidos de la planta.

3. El ácido nucleico de la reivindicación 2, en donde el componente de una vía génicamente silenciada de un RNA pequeño es expresado con una distribución sustancialmente no específica en la planta.

4. El ácido nucleico de la reivindicación 1 , en donde el componente de una vía génicamente silenciada de un RNA pequeño es expresado específicamente en cada óvulo de la planta con relación a cuando menos la mayoría de los demás tejidos de la planta, si la planta no contiene el constructo.

5. El ácido nucleico de la reivindicación 4, en donde el ARGONAUTA polipéptido es GO4 o AGO9.

6. El ácido nucleico de la reivindicación 5, en donde el ARGONAUTA polipéptido es AGO9.

7. El ácido nucleico de la reivindicación 6, en donde el constructo es configurado para expresar el RNA interferente con una distribución substancialmente no específica en la planta.

8. El ácido nucleico de la reivindicación 1 , en donde el RNA interferente es configurado para específicamente reducir un nivel expresado de un AGO4, AGO9, NRPD1 , NRPD2, RDR2, RDR6, ó SGS3 polipéptido, o una combinación de los mismos, con relación a cuando menos la mayoría de los polipéptidos de la planta.

9. El ácido nucleico de la reivindicación 8, en donde la secuencia diana incluye una replicación invertida de una secuencia nucleódica de AG04, AG09, NRPD1 , NRPD2, RDR2, RDR6, ó SGS3, o una combinación de los mismos.

10. El ácido nucleico de la reivindicación 9, donde la secuencia nucleódica es aproximadamente de cuando menos 20 nucleótidos de largo y es proporcionada por AG09.

1 1. El ácido nucleico de la reivindicación 10, en donde la secuencia nucleótica es incluida en al menos uno de los SED. ID. NOS. 3 y 15-18.

12. El ácido nucleico de la reivindicación 1 , en donde la expresión del RNA interferente es condicional, de tal manera que una frecuencia de la formación de gametos no reducidos por la planta es ajustable.

13. Una planta que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1 y que tiene la capacidad conferida por el ácido nucleico para formar gametos no reducidos.

14. Un método para crear una planta transgénica, que comprende: a) Seleccionar una planta progenitora, b) Introducir el ácido nucleico de la reivindicación 2 en la planta progenitora, y c) Obtener un descendiente transgénico de la planta progenitora, conteniendo la planta descendiente el ácido nucleico de la reivindicación 1 y ser capaz de formar gametos no reducidos.

15. El método de la reivindicación 14, en donde el paso de seleccionar una planta progenitora incluye un paso de seleccionar una planta progenitora de una variedad que tiene uno o más rasgos deseables, y en donde el paso de obtener un descendiente transgénico de la planta progenitora incluye un paso de obtener un descendiente transgénico que tiene uno o más rasgos deseables.

16. Un método para transmitir un conjunto somático de cromosomas a una generación subsecuente de una planta, que comprende: a) Seleccionar una planta progenitora transformada con el ácido nucleico de la reivindicación 1 , b) Cultivar la planta progenitora de tal manera que la planta progenitora forme semillas, y c) Cultivar las semillas en una o más plantas hijas incluyendo cada una un conjunto no reducido de cromosomas de la planta progenitora.

17. El método de la reivindicación 16, en donde el paso de cultivo incluye un paso de aparear la planta progenitora con una segunda planta para unir al menos un gameto masculino de la segunda planta con un gameto femenino no reducido de la planta progenitora, y en donde el paso de apareamiento es configurado para proporcionar al menos substancialmente ninguna contribución cromosómica de la segunda planta a las plantas hijas, de tal manera que las plantas hijas son al menos substancialmente clones de la planta progenitora.

18. El método de la reivindicación 17, en la que la segunda planta incluye una mutación del gen CENH3.

19. El método de la reivindicación 16, donde la planta hija tiene una ploidía mayor que la de la planta madre.

20. Un ácido nucleico para la transformación de plantas que comprende un constructo que incluye (a) una secuencia diana que codifica un RNA interferente configurado para reducir específicamente la expresión de al menos una proteína seleccionada del grupo que consiste de AG04, AG09, NRPD1 , NRPD2, RDR2, RDR6 y SGS3 en una planta; y (b) una secuencia promotora operativamente acoplada a la secuencia diana y activa o activable en un óvulo de la planta, en donde el constructo es configurado para inhibir la expresión de al menos un polipéptido específicamente con relación a otros polipéptidos de la planta, y para inhibir dicha expresión suficientemente para inducir la formación, en un óvulo de la planta, de uno o más gametos no reducidos conteniendo cada uno una ploidía de la planta.

21 . El ácido nucleico de la reivindicación 20, en la que el constructo está configurado para inhibir la expresión de por lo menos un polipéptido específicamente en cada óvulo de la planta con relación al menos a la mayoría de los demás tejidos de la planta.

22. El ácido nucleico de la reivindicación 20, en la que el constructo es configurado para promover la formación de gametos no reducidos por medio de aposporía.

23. El ácido nucleico de la reivindicación 20, en la que la secuencia promotora confiere una expresión óvulo-específica del RNA interferente.

24. El ácido nucleico de la reivindicación 20, en la que el RNA interferente es configurado para reducir específicamente la expresión de AGO9.